ES2241117T3 - Biblioteca de expresion de peptidos o proteinas in vitro. - Google Patents

Abstract

Un método para producir una biblioteca de expresión de péptidos o proteínas, que presenta una población diversa de péptidos o proteínas, en la que los péptidos o proteínas están asociados de manera específica con el DNA que los codifica a través de uniones covalentes proteína:DNA, comprendiendo dicho método al menos las etapas de: 1) preparar una biblioteca genética amplificable de moléculas de DNA que contienen: (i) una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos, en la que la secuencia de aminoácidos se une de manera específica a la secuencia que la codifica a través de uniones covalentes proteína:DNA (resto de unión), y (ii) una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que va a ser presentada (resto de presentación), y 2) expresar la biblioteca genética así formada, en la que dicha molécula de DNA cuando se expresa produce un producto resultante de la traducción que contiene el resto de presentación y el resto de unión, y en la que dichamolécula de DNA contiene al menos un sitio de unión para el resto de unión.

Description

Biblioteca de expresión de péptidos o proteínas in vitro.

La presente invención se refiere a métodos para producir una biblioteca de expresión de péptidos o proteínas in vitro, que presenta una población diversa de péptidos o proteínas, la biblioteca de expresión así producida y el uso de la biblioteca para identificar péptidos o proteínas que exhiben propiedades deseadas. La invención también se refiere a secuencias de DNA específicas que incluyen la región codificadora de los péptidos o las proteínas y que se unen de manera específica al producto resultante de su traducción a través de uniones covalentes.

Del mismo modo que las bibliotecas proveen al lector de una vasta colección de libros diversos que son recuperables, así también una biblioteca molecular provee a un banco de referencia de moléculas que se pueden seleccionar y recuperar. Esas bibliotecas pueden contener material genético, por ejemplo fragmentos de secuencias de DNA en un plásmido o bacteriófago, o pueden expresar péptidos o proteínas codificados por el material genético de la biblioteca. En este último caso, para permitir la selección del miembro relevante de la biblioteca, el péptido o la proteína expresado debe estar necesariamente asociado con el material genético que lo codifica. En la actualidad, esto se consigue de varias maneras diferentes.

En primer lugar, los péptidos se pueden presentar en las superficies externas de empaquetamientos genéticos tales como células, virus y esporas, en particular bacteriófagos, bacterias o levaduras, en forma de partes fusionadas de una proteína de presentación. El resto invariable de la proteína de presentación de una biblioteca particular se selecciona de modo que presente la característica de que se expresa en la superficie del empaquetamiento genético, por ejemplo una célula o virión, y está asociado de manera estable con la célula o virión de manera que los empaquetamientos genéticos que expresan la proteína o el péptido diana se pueden recuperar.

Smith y Scott (Smith (1985), Science, 228, 1315-1316; Scott y Smith (1990), Science, 249, 386-390) describen el uso del bacteriófago Fd como vector del sistema de presentación de una secuencia aleatoria de péptidos expuestos sobre la superficie del virión. El documento US-A-5223409 de Ladner describe la expresión de familias de dominios de unión potenciales sobre la superficie externa de células bacterianas o de bacteriófagos. Otros investigadores de muchos laboratorios han usado de manera similar esos empaquetamientos genéticos para generar bibliotecas de expresión. Muchos de estos trabajos se han realizado en fagos filamentosos como el M13 que han demostrado ser un sistema robusto y relativamente fácil de manejar.

Sin embargo, esta tecnología aún adolece de algunos inconvenientes, como el tiempo y el esfuerzo requeridos para construir una biblioteca que sea lo suficientemente grande como para producir variantes suficientes para la selección. De manera adicional, los empaquetamientos genéticos usados hasta la fecha deben ser mantenidos en un estado viable que permita tanto la expresión de la proteína o del péptido codificado como también la propagación del empaquetamiento genético durante las sucesivas etapas de escrutinio. Además, el polipéptido presentado debe ser compatible con su salida del organismo y con el ensamblaje de un miembro de una pareja de fusión dentro de la estructura apropiada sobre el organismo. Asimismo, debido a que la síntesis de proteínas tiene lugar in vivo, solamente aquellas modificaciones que el hospedador que ejecuta la traducción pueda realizar, pueden ser incorporadas en la secuencia presentada.

El tiempo invertido en la propagación de los empaquetamientos genéticos seleccionados durante el protocolo de escrutinio representa también una carga de tiempo importante para el investigador. Además, en la biblioteca de presentación de péptidos in vivo actualmente utilizada, es necesario transfectar un hospedador con el material genético de la biblioteca para permitir su replicación y su expresión, y se sabe que la transformación es un procedimiento no eficiente que por ello reduce el número de miembros que pueden estar presentes en una biblioteca de expresión.

En fechas más recientes, se han descrito bibliotecas de expresión in vitro que solucionan algunas de las limitaciones de las bibliotecas de expresión in vivo, anteriormente mencionadas. Por ejemplo, se ha descrito un sistema de presentación en polisomas en el que una proteína completa y correctamente plegada, que porta diferentes péptidos de presentación en diferentes miembros de la biblioteca, y el mRNA que la codifica, permanecen ambos unidos a los ribosomas. Esto se consigue garantizando que la cadena de la proteína no abandona el ribosoma y que el mRNA no abandona el ribosoma (es decir, no hay ningún codón de terminación y los ribosomas están estabilizados). Estas bibliotecas de expresión son el asunto de varias solicitudes de patentes, por ejemplo, las publicadas en el documento WO92/02536 (The Regents of the University of Colorado), en el documento WO93/03172 (University Research Corporation) y en el documento WO91/05058 (Kawasaki).

Las bibliotecas en polisomas adolecen de algunas limitaciones. El RNA es muy sensible a las RNasas y por ello es difícil trabajar con él. Mantener la unión de los ribosomas requiere la presencia continuada de iones de magnesio lo cual crea problemas en la etapa de escrutinio y en otras etapas en las que deben estar siempre presentes. Y lo que es más importante, todas las etapas posteriores a la traducción, especialmente durante el escrutinio y el procedimiento de selección, no se deben realizar con reactivos rigurosos ya que la unión polisoma:RNA se debe mantener.

Una biblioteca diferente de expresión in vitro que ha sido sugerida, implica el uso de proteínas de unión a DNA. Estas proteínas se expresan en una bacteria o en otro organismo delimitado por una membrana, usando un plásmido que contiene un sitio de unión para la proteína de unión a DNA. El polipéptido y el ácido nucleico que lo codifica se encuentran ligados operativamente ya que la proteína se asocia de manera transitoria con el ácido nucleico que la codifica. Las secuencias de la biblioteca se introducen en el polipéptido sin que se afecte la unión al DNA mediante la inserción del resto de presentación para producir una proteína de fusión. Estas bibliotecas se encuentran descritas, por ejemplo, en la solicitud de patente internacional publicada en el documento WO93/08278 (Affymax Technologies NV).

Aunque estas bibliotecas in vitro tienen la ventaja de que el escrutinio se puede realizar in vitro, debido a que la proteína de fusión codificada no reconoce únicamente a su propio DNA codificador (sino que reconoce y se asocia con su sitio de unión sobre el DNA dondequiera que éste aparece), al menos la traducción se debe realizar in vivo con sólo un único miembro de la biblioteca por célula hospedadora u organismo hospedador. Esto restringe seriamente la complejidad que la biblioteca puede alcanzar. Por eso son aplicables algunas de las limitaciones de las bibliotecas de expresión in vivo, tales como la no eficiencia de la transformación. Además, la asociación entre las proteínas de unión a DNA y sus sitios de unión sobre el DNA es no covalente, y existe por ello un OFF-TIME tiempo de poca producción asociado con la interacción que puede ser del orden de solamente 30 minutos. Por ello el tiempo empleado para realizar las etapas de escrutinio después de la traducción debe mantenerse lo más corto posible y las condiciones de escrutinio se deben seleccionar de manera que el OFF-RATE índice de poca producción no aumente más. Por lo tanto existen todavía limitaciones restrictivas con las bibliotecas de expresión de la técnica anterior.

Se ha descubierto ahora de manera sorprendente que se puede generar una biblioteca de expresión de péptidos o proteínas en la que los productos específicos resultantes de la traducción del material genético en la biblioteca están directamente unidos y por enlaces covalentes a la secuencia de DNA que los codifica. Esto obvia por lo tanto el uso de empaquetamientos genéticos celulares, con sus limitaciones inherentes, durante la construcción y el escrutinio de la biblioteca de expresión. Este avance permite un escrutinio rápido de los péptidos o proteínas deseados con ciclos de selección, de amplificación del DNA y de expresión. Aunque la amplificación del DNA puede implicar su autorreplicación, ésta puede realizarse en lugar de ello de manera conveniente y rápida usando técnicas estándar de amplificación, por ejemplo, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) como se describirá con más detalle más adelante.

Las bibliotecas de expresión de la invención, que implican uniones covalentes DNA:proteína, se han hecho posibles por la inclusión de una secuencia dentro del material genético que codifica una proteína o una de sus porciones que se une covalentemente a su propio DNA codificador, y que incluye, o se solapa, o está adyacente a, la secuencia que codifica el péptido o la proteína que va ser presentado. Cuando ha tenido lugar la expresión, la proteína de unión al DNA y el péptido o la proteína de presentación, constituyen un único polipéptido, que se une covalentemente al DNA codificador. Se advertirá que esta unión será posible solamente si el material genético y el producto resultante de su traducción están accesibles el uno al otro. Así pues, el material genético preferiblemente debe estar desprovisto de secuencias que codifican de manera efectiva péptidos o proteínas que interfirieran con la interacción proteína:DNA.

Además, como se advertirá a partir del comentario que viene más adelante, en determinados casos la proteína de unión al DNA escindirá el DNA al que se une. En estas circunstancias, dependiendo de la construcción de las moléculas de DNA de la biblioteca y de la colocación de las secuencias de la biblioteca dentro de ellas, la proteína de unión al DNA puede estar unida covalentemente a un fragmento de DNA que no contiene las secuencias de la biblioteca debido a la escisión entre el fragmento y el resto de la molécula de DNA. Sin embargo, dependiendo de las condiciones de hibridación que se usen, la cadena molde conservará los fragmentos complementarios de las dos cadenas codificadoras y por ello la proteína de unión al DNA permanece asociada con el DNA que la codifica a través del intermediario de un enlace covalente DNA:proteína. La referencia a una unión "directa", según aquí se utiliza, tiene la intención de incluir esta posibilidad. Además, en este caso está claro que la proteína de unión a DNA está unida a un fragmento del DNA que la codifica. Esta posibilidad queda abarcada sin embargo por la expresión "específicamente asociadas con el DNA que las codifica", según aquí se utiliza.

Contemplado de este modo desde uno de los aspectos, la presente invención proporciona un método para producir una biblioteca de expresión de péptidos o proteínas, que presenta una población diversa de péptidos o proteínas, en la que los péptidos o proteínas están asociados de manera específica con el DNA que los codifica a través de uniones covalentes proteína:DNA, comprendiendo dicho método al menos las siguientes etapas:

1) preparar una biblioteca genética amplificable de moléculas de DNA que contienen:

(i)

una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos, en la que la secuencia de aminoácidos se une específicamente a la secuencia que la codifica a través de uniones covalentes proteína:DNA (resto de unión), y

(ii)

una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que va a ser presentada (resto de presentación), y

2) expresar la biblioteca genética así formada, en la que dicha molécula de DNA cuando se expresa produce un producto resultante de la traducción que contiene el resto de presentación y el resto de unión, y en la que dicha molécula de DNA contiene al menos un sitio de unión para el resto de unión.

Así, se puede realizar la creación de una multitud de productos de traducción diferentes que se unen covalentemente al material genético específico que los codifica. Este descubrimiento se ha utilizado para la formación de la biblioteca de expresión de péptidos o proteínas aquí descrita. Esta biblioteca difiere de bibliotecas previas in vivo que usan células u organismos unicelulares para expresar los péptidos, ya que el péptido o la proteína que se va a presentar, se presenta directamente sobre el material genético que lo codifica y no sobre la superficie de una membrana o pared celular.

Además, generalmente se puede conseguir una presentación monovalente o divalente y este método permite la expresión de diversidades extremadamente elevadas en la biblioteca. De manera adicional, cuando se ha de realizar una amplificación por PCR del material genético que codifica un miembro de la biblioteca que exhibe las propiedades deseadas, esto se puede ejecutar in situ sobre el DNA de ese miembro de la biblioteca de péptidos, ya que el DNA se encuentra libremente accesible libremente para unirse a los cebadores apropiados y no requiere una extracción o elución previa de los materiales utilizados durante su selección o de porciones no genéticas del conjugado de la biblioteca de péptidos o proteínas. Esto simplifica y agiliza el procedimiento de manera significativa. Además, el tratamiento riguroso, p. ej., un pH bajo, normalmente requerido para la elución del material genético de células o de viriones que se unen a una diana, antes de la amplificación, no es necesario.

De manera adicional, a diferencia de las bibliotecas de expresión in vitro de la técnica anterior, la unión covalente entre el DNA y el polipéptido codificado significa que el péptido o la proteína presentado no se desprenderá del DNA por acción de las condiciones iónicas y de los disolventes que romperían los bacteriófagos, las interacciones proteína de unión a DNA:DNA o los ribosomas. Además, la unión covalente permite que la selección se lleve a cabo en un intervalo de temperaturas más amplio y con etapas intermedias de congelación. Por ello de este modo la selección es mucho más conveniente y potencialmente mucho menos rigurosa.

Según aquí se utiliza, la expresión "que se une específicamente a dicha secuencia codificadora" quiere indicar que la secuencia de aminoácidos, aunque puede no reconocer exclusivamente al DNA que la codifica si se aísla y se introduce en una serie de secuencias de DNA diferentes, se unirá a su propia secuencia codificadora cuando es producida a partir de su DNA codificador mediante transcripción y traducción. Esta especificidad se puede conseguir de varios modos según se describe más adelante. Según aquí se denomina, DNA "codificador" quiere indicar la molécula de DNA que cuando se expresa produce un producto de la traducción que contiene la proteína o el péptido de presentación y el resto de unión a DNA. La región del DNA a la que se une el resto de unión a DNA no está sin embargo necesariamente dentro de la región que codifica el resto de presentación o el resto de unión, sino que está presente simplemente en la misma molécula de DNA.

Las proteínas que interaccionan in vitro con la secuencia de DNA que las codifica se conocen aquí como "proteínas que actúan en cis" (también denominadas "proteínas cis") y establecen un enlace covalente con sus DNA moldes propios. "Proteínas que actúan en pseudo-cis" se consideran aquí aquellas proteínas que actúan de la manera en cis (es decir, que se unen al DNA que las codifica) en condiciones apropiadas.

Una biblioteca de expresión de péptidos o proteínas pseudo-cis se puede crear mediante el uso de un resto de unión a DNA que se une covalentemente al DNA que lo codifica en condiciones apropiadas. Por ejemplo, esto se puede conseguir realizando la etapa de la traducción dentro de los confines de una célula u organismo, en el que cada célula contiene el DNA que codifica solamente un único miembro de la biblioteca.

En este caso, debido a que el resto de unión al DNA tendrá solamente un único sitio de reconocimiento y unión disponible (aunque puede haber más de una copia del DNA), se unirá a su propio DNA codificador (acción en pseudo-cis). Esto proporciona así un enlace operacional entre el DNA codificador y el péptido o la proteína expresado, unido a través de un enlace covalente. Según aquí se utiliza, el "sitio de unión" incluye el sitio de reconocimiento con el que el resto de unión al DNA se asocia antes de la unión covalente, es decir, esta expresión se refiere a la secuencia de nucleótidos requerida para conseguir la unión covalente de la proteína de unión al DNA.

De este modo la invención proporciona en un aspecto preferido, un método para producir una biblioteca de expresión de péptidos o proteínas según se ha definido en lo que antecede, en la que la expresión del material genético se realiza in vivo con un único miembro de la biblioteca, opcionalmente presente en más de una copia, expresado por célula hospedadora u organismo hospedador.

Proteínas pseudo-cis apropiadas son todas las proteínas que reconocen sitios de unión específicos (sitios de unión) sobre el DNA y que dan lugar a un enlace covalente DNA:proteína. Como ejemplos se incluyen proteínas terminales, proteínas que intervienen en la replicación y otras proteínas que intervienen en el cebado. Además, se pueden usar fragmentos, variantes o derivados funcionalmente equivalentes de proteínas conocidas de unión covalente al DNA. Se advertirá que las proteínas de unión que actúan en cis que se describen más adelante se pueden también usar en el método anteriormente descrito.

Las proteínas que actúan de verdad en cis ofrecen ventajas particulares para preparar bibliotecas de expresión in vitro. Ejemplos de proteínas que actúan en cis incluyen las proteínas que están implicadas en la iniciación de la replicación. El tipo de replicación en círculo rodante se usa comúnmente entre replicones circulares de diferentes orígenes, por ejemplo fagos que portan DNA monocatenario (ss) (del inglés. " single stranded") y bicatenario (ds) (del inglés, " double stranded") (Van Mansfield y col., (1984), Adv. Exp. Med. Biol., 179, 221-230; Baas y Jansz (1988), Cur. Topics Microbiol. Immunol., 136, 31-70), plásmidos que portan ssDNA (Gruss y Ehrlich (1989); Microbiol. Rev., 53, 231-241; Novick (1989), Ann. Rev. Microbiol., 43, 537-565), virus de plantas que portan ssDNA (Stenger y col. (1991), PNAS, 88, 8025-8033); Saunders y col., (1991), Nucl. Acids Res., 19, 2325-2330), virus animales que portan ssDNA y dsDNA (Berns (1990), Microbiol. Rev., 54, 316-329; Dasgupta y col., (1992), J. Mol. Biol., 228, 1-6) y plásmidos bacterianos que portan dsDNA (Kham, 1997, Microbiol. Molec. Biol. Rev., 61(4), 445-455). En los sistemas estudiados, las proteínas que intervienen en la iniciación poseen actividad de cerrar melladuras y actividad similar a la de las topoisomerasas. El sistema mejor estudiado es el del fago \phiX174 que porta ssDNA, en el que la proteína A hace una mella NICKS en el sitio del ori en la cadena vírica de la forma replicativa y establece un enlace covalente con el extremo 5' de la cadena cortada. El extremo 3' se extiende después de esto por acción de la polimerasa del hospedador, desplazando la cadena vírica 5', y después de una ronda de replicación la cadena vírica parental se religa y la proteína A se transfiere a la cadena de la progenie para iniciar un nueva ronda de replicación (Baas y Jansz, 1988, supra). Se ha descubierto también que la proteína A de P2 corta el sitio del ori en la región codificadora del gen A, en un sitio que está desprovisto de estructura secundaria y se une al extremo 5' de la cadena cortada (Liu y Hagg\ring{a}rd-Ljungquist (1994), Nucl. Acids Res., 22, 5204-5210).

Esta acción en cis se ha descrito que actúa in vivo y por ello la etapa de la traducción se puede realizar in vivo, pero con más de un único miembro de la biblioteca expresándose por célula, antes de que la célula se rompa para producir la biblioteca del sistema de presentación. El procedimiento que permite a la proteína cis exhibir una acción en cis a pesar de la presencia de otros sitios de unión apropiados sobre otras moléculas de DNA también contenidas en la célula o el organismo no es conocido, aunque se ha sugerido que durante la traducción se produce una compartimentalización o que las proteínas cis no difunden con facilidad en la célula.

Así, en un aspecto más preferido, la presente invención proporciona un método para producir una biblioteca de expresión de péptidos o proteínas según se ha definido en lo que antecede, en la que dicha secuencia de aminoácidos que se une de manera específica a dicha secuencia codificadora, deriva de una proteína que actúa en cis o de uno de sus fragmentos, derivados o variantes funcionalmente equivalente, y la expresión del material genético se realiza in vivo con al menos un miembro de la biblioteca, opcionalmente presente en más de una copia, expresado por célula hospedadora u organismo hospedador.

Proteínas que actúan en cis apropiadas y que siguen actuando en cis in vitro incluyen la familia de proteínas que intervienen en la replicación que incluye P2A, que están relacionadas por su secuencia (preferiblemente que exhiben una identidad de las secuencias del 60%, más preferiblemente del 70%, 80% o 90%), por su organización y por su modo de replicación; tales como las proteínas equivalentes procedentes del fago 186 (Sivaprasad y col., 1990., J. Mol. Biol., 213, 449-463), HP1 (Esposito y col., 1996, Nucl. Acids Res., 24, 2360-2368) y PSP3 (Bullas y col., 1991, Virology, 185, 918-921) y sus fragmentos, derivados y variantes funcionalmente equivalentes. Las proteínas que actúan en cis y que actúan en cis in vivo exhiben propiedades de replicación en círculo rodante y una organización similares a las de P2A. Estas proteínas incluyen por ejemplo la proteína A de \phiX174 según se ha mencionado anteriormente. Las proteínas pseudo-cis apropiadas están relacionadas con P2A, tal como proteínas terminales, por ejemplo, procedentes de diferentes organismos.

El uso de las bibliotecas anteriormente mencionadas permite un aumento en la diversidad de la biblioteca y una reducción en la relación señal-ruido debida al bajo número de células hospedadoras u organismos hospedadores requerido en comparación con las bibliotecas de expresión in vivo conocidas.

Siempre se ha supuesto que las proteínas que actúan en cis actúan solamente in vivo, y una acción correspondiente in vitro no ha sido ni sugerida ni observada. De manera sorprendente, se ha encontrado sin embargo que la acción en cis está conservada incluso cuando la traducción se realiza in vitro.

Como se advertirá, numerosas ventajas dimanan de este descubrimiento. En primer lugar, la formación de un enlace covalente tiene varias ventajas según se ha mencionado previamente. Además, debido a que las proteínas codificadas son capaces de encontrar el DNA que las codifica a pesar de la presencia de cadenas de DNA próximas que exhiben un sitio de unión apropiado, la preparación completa de la biblioteca y su escrutinio se pueden realizar in vitro. Esto reduce radicalmente el tiempo y el esfuerzo invertidos en los procedimientos de generación y escrutinio, y se evitan muchas de las limitaciones de las bibliotecas in vivo. Por ejemplo, se pueden ahorrar al menos 12 horas por ronda de expresión, escrutinio y amplificación. Ya que se puede prescindir por completo de células hospedadoras u organismos hospedadores, la biblioteca puede tener hasta 10^{12} miembros diferentes.

La traducción in vitro permite la incorporación de muchas modificaciones co-traduccionales y post-traduccionales (que se pueden hacer por métodos químicos o enzimáticos, durante o después de la etapa de traducción), algunas de las cuales no eran posibles con anterioridad cuando la traducción se realizaba in vivo. Por ejemplo, se pueden realizar fosforilación o sulfatación, formación de enlaces disulfuro, glicosilación o isomerización. (Estas etapas también se podrían realizar en miembros de la biblioteca una vez expresados in vivo y luego soltados). Estas reacciones se pueden llevar a cabo in vitro complementando el extracto con la enzima responsable de la modificación. También se pueden introducir aminoácidos no naturales, por ejemplo, cargando químicamente un t-RNA o modificando el aminoácido que está sobre un t-RNA cargado.

De este modo en un aspecto especialmente preferido, la presente invención proporciona un método para producir una biblioteca de expresión de péptidos o proteínas según se ha definido en lo que antecede, en el que dicha secuencia de aminoácidos que se une de manera específica a dicha secuencia codificadora, deriva de una proteína que actúa en cis o de uno de sus fragmentos, derivados o variantes funcionalmente equivalente, y la expresión del material genético se realiza in vitro.

Según aquí se utiliza, fragmentos, derivados y variantes "funcionalmente equivalentes" definen a péptidos o proteínas relacionadas con, o que derivan de, una proteína natural según aquí se ha definido (p. ej., una proteína que actúa en cis), en los que la secuencia de aminoácidos ha sido modificada con una o múltiples sustituciones, adiciones y/o deleciones de aminoácidos, que pueden de manera alternativa o de manera adicional incluir aminoácidos que han sido modificados químicamente, p. ej., mediante desglicosilación o glicosilación, pero que no obstante conservan la funcionalidad deseada, p. ej., exhiben propiedades cis o pseudo-cis de unión a DNA. De manera conveniente, esos derivados o variantes pueden tener una identidad de la secuencia del 80% o 90% con respecto a la proteína natural de la que derivan. Variantes funcionalmente equivalentes incluyen variaciones biológicas naturales (p. ej., variantes alélicas o variaciones geográficas dentro de una especie) y derivados preparados usando técnicas conocidas. Por ejemplo, se pueden preparar péptidos o proteínas funcionalmente equivalentes o por síntesis química o en forma recombinante usando las técnicas conocidas de mutagénesis dirigida a un sitio específico, mutagénesis aleatoria, o escisión enzimática y/o ligamiento de ácidos nucleicos.

Se advertirá que las proteínas que actúan en cis o sus fragmentos, variantes o derivados, se pueden utilizar para generar bibliotecas de la invención conforme a los métodos descritos para las proteínas que actúan en pseudo-cis, que se describirán con más detalle más adelante.

Convenientemente, las proteínas cis, de uso en los métodos de la invención, derivan del sistema de iniciación de la replicación del DNA del fago P2. La proteína A de P2 reconoce una secuencia del iniciador definida, localizada dentro del gen A de P2 sobre la mismísima molécula de DNA que la codifica (acción en cis) y hace una mella específicamente en una de las cadenas mientras forma un enlace covalente con una de las bases del extremo libre en el sitio de la mella (Liu y Hagg\ring{a}rd-Ljungquist, 1994, supra). Ese complejo proteína-DNA constituye un conjugado genético que se puede usar para los fines de la presentación de péptidos. La secuencia del gen A de P2 ha sido publicada (Liu y col. (1993). J. Mol. Biol., 231, 361-374).

Se sabe que la proteína A de P2 es capaz de tolerar alteraciones de aminoácidos (véase por ejemplo Liu y col., 1993, supra) y por ello péptidos o proteínas de la presentación se pueden introducir en ella sin pérdida de función. La propiedad de acción en cis de A permite construcciones in vitro de bibliotecas de péptidos o proteínas, sometiendo a una biblioteca de DNA moldes (con secuencias que codifican diferentes péptidos A o proteínas A híbridos que van a ser presentados, un promotor apropiado para transcribir el gen A y el sitio al que P2A se une) a una etapa de transcripción/traducción acopladas en un extracto libre de células. Esto da como resultado péptidos A o proteínas A híbridos que se unen covalentemente a sus propios DNA moldes.

Los conjugados híbridos A:DNA constituyen una biblioteca in vitro de péptidos o proteínas que presenta los diferentes péptidos A o proteínas A híbridos que pueden ser sometidos a una técnica de revestimiento de una superficie (del inglés, "panning") frente a una diana o que pueden ser analizados con respecto a una actividad deseada. Los conjugados híbridos específicos A:DNA que se unen a la diana o que exhiben una propiedad deseada, se pueden recuperar, en caso necesario, y el material genético se puede luego amplificar, por ejemplo mediante PCR, y someter a una etapa de transcripción/traducción acopladas en un extracto libre de células. Este ciclo se puede luego repetir a conveniencia para obtener un clon híbrido individual A:DNA. El seguimiento de este procedimiento se puede realizar mediante secuenciación del DNA hasta que se obtienen un número apropiado de secuencias de DNA. Técnicas de escrutinio apropiadas se describen con más detalle más adelante.

Según aquí se utiliza con referencia a la biblioteca de expresión de péptidos o proteínas que presenta una población diversa de péptidos o proteínas, la expresión "péptido o proteína" quiere abarcar una secuencia de aminoácidos que contiene al menos una secuencia de presentación (el resto de presentación) (que puede estar contenida dentro de, solapada con, o ser distinta de, la secuencia que se une al DNA que la codifica), que varía en los diferentes miembros de la biblioteca y que puede ser seleccionada a través de procedimientos de selección apropiados. Cada uno de los miembros de la biblioteca de expresión contiene también como parte del polipéptido expresado, una secuencia invariable (que puede ser una parte o la totalidad de la secuencia) que es responsable de la unión del péptido o de la proteína resultante de la expresión al DNA codificador (el resto de unión). Necesariamente, tanto el resto de unión como el resto de presentación son expresados en un solo péptido o proteína.

Cuando el resto de presentación es más grande que un péptido (y aquí se denomina proteína de presentación), es probable que diferentes aminoácidos de la proteína sean invariables, tal como cuando una proteína se usa como andamiaje, y que los miembros de la biblioteca difieran sólo en algunas regiones de la proteína de presentación.

Las secuencias de DNA que codifican los péptidos o proteínas para su expresión en las bibliotecas de la invención, que contienen secuencias que codifican el resto de presentación y los restos de unión, y al menos uno de los sitios de unión para el resto de unión, en las que las moléculas de ácido nucleico incluyen moléculas con secuencias degeneradas y/o funcionalmente equivalentes, constituyen un aspecto más de la invención. Las moléculas de ácido nucleico funcionalmente equivalentes incluyen fragmentos, derivados y variantes, por ejemplo secuencias sustancialmente homólogas y que hibridan, que codifican péptidos o proteínas como los que aquí se han definido, que presentan la funcionalidad requerida, p. ej., la acción de unión en cis.

Por "sustancialmente homólogas" se indican secuencias que presentan una homología de la secuencia de al menos el 60%, preferiblemente de al menos el 70% o el 80%. Las secuencias que hibridan incluidas dentro del alcance de la invención son aquellas secuencias que se unen en condiciones no rigurosas (SSC 6X/formamida al 50% a temperatura ambiente) y lavado en condiciones de baja rigurosidad (SSC 2X, temperatura ambiente, más preferiblemente SSC 2X, 42ºC, o en condiciones de mayor rigurosidad p. ej. SSC 2X, 65ºC (en donde SSC = NaCl 0,15 M, citrato sódico 0,015 M, pH 7,2), así como las secuencias que se hibridarían en las condiciones anteriormente mencionadas, sino fuera por la degeneración del código.

Se advertirá que mediante la producción de una biblioteca de secuencias de DNA (que llevan asociadas las proteínas o péptidos que codifican), la presente invención también proporciona una biblioteca de presentación de DNA. Esta biblioteca bifuncional está preparada para poder realizar la selección de sus miembros sobre la base de los restos de presentación de péptidos/proteínas o de DNA.

La invención se lleva a cabo convenientemente usando como el resto de unión la proteína A de P2 o uno de sus fragmentos, derivados o variantes funcionalmente equivalentes. La secuencia de nucleótidos relevante para la unión al resto de unión a DNA debe también proporcionarse en un sitio adecuado, aunque este sitio puede encontrarse desplazado de la posición en la que se encuentra presente en la naturaleza. En el caso de P2A por ejemplo, al menos la secuencia TCGGA, que aparece por ejemplo en la secuencia GCGCCTCGGAGTCCTGTCAA, debe estar incluida en el DNA que codifica los péptidos o las proteínas de la biblioteca de expresión, o uno de sus fragmentos, derivados o variantes funcionalmente equivalentes, secuencia que es reconocida por el resto de unión al DNA y forma un enlace covalente con el DNA. Convenientemente la secuencia que codifica el resto de presentación está insertada en, solapada con, o adyacente a, la secuencia que codifica el extremo N- terminal de la proteína A de P2.

Las moléculas de DNA usadas para generar la biblioteca pueden estar provistas de medios tanto para la amplificación como para la transcripción. Las moléculas de DNA adecuadas con medios para la amplificación incluyen DNA bicatenario con un origen de replicación, por ejemplo plásmidos autorreplicantes que pueden por ello replicarse in vitro en, por ejemplo, extractos libres de células, o in vivo si están presentes células hospedadoras. Cuando el DNA no es capaz de autorreplicarse, esto puede solucionarse en casos apropiados mediante la inclusión de un origen de replicación. Por ejemplo, determinadas proteínas aquí descritas, tales como P2A, se unen a sus propios orígenes de replicación. Si la proteína no se suelta del origen (tal como sucede cuando se utilizan los mutantes aquí descritos), la replicación de la molécula de DNA que contiene el gen del resto de unión al DNA se inhibe. En estos casos puede incluirse un segundo origen de replicación. Según convenga, las moléculas de ácido nucleico encargadas de generar la biblioteca, están en forma de vectores, de plásmidos o de DNA lineal.

Como alternativa, el DNA se puede amplificar mediante una intervención técnica, por ejemplo, proveyendo al DNA de sitios apropiados para que se unan los cebadores en una reacción de amplificación, por ejemplo PCR, que permite realizar una amplificación in vitro. Evidentemente esos sitios estarían presentes en la mayoría de los casos de manera inherente en todas las moléculas de DNA, de manera que la elección apropiada de los cebadores facilitaría la amplificación.

Los medios para la transcripción incluyen la provisión de la secuencia de un promotor. Si se usa un gen de tipo salvaje, o una de sus secuencias degeneradas, o uno de sus fragmentos, derivados o variantes funcionalmente equivalentes, el promotor puede estar presente de manera constitutiva. Si no es el caso, se puede incluir un promotor inducible o no inducible. En los casos en los que el producto de la traducción inhibiera la transcripción (como cuando se usa una P2A mutante según aquí se describe) es aconsejable usar un promotor inducible, que puede estar activado solamente durante la etapa de la transcripción/traducción. Como alternativa en esta caso, se puede usar un promotor no inducible si éste actúa con efectividad de modo inducible, p. ej., con un nivel de transcripción muy bajo en las condiciones apropiadas (p. ej., un promotor de T7 en hospedadores bacterianos que contienen un gen regulado de la polimerasa de T7 o mediante el suministro de un promotor en un momento apropiado, p. ej., mediante una infección vírica). Si de todas maneras se usa un promotor no inducible, y si durante el transcurso del escrutinio de la biblioteca se ha de realizar la traducción en un hospedador bacteriano, un gen inducible de polimerasa debe estar presente en la bacteria o se debe introducir mediante infección.

Los ejemplos de promotores inducibles apropiados incluyen AraB, el promotor lambda (en células que expresan un represor sensible a la temperatura, tal como N4830-1), o un promotor de TAC o LAC combinado con una secuencia eficiente del LAC O. Los promotores no inducibles adecuados incluyen el promotor de T7 o los promotores de SP6 o de dT3. El promotor debe estar situado aguas arriba del polipéptido que ha de ser expresado, pero esto se puede conseguir cuando el promotor está situado aguas abajo mediante circularización del DNA lineal.

Las moléculas de DNA de uso en la preparación de la biblioteca deben también contener necesariamente diversas secuencias codificadoras de los péptidos o proteínas de la presentación para obtener una biblioteca de los diferentes péptidos o proteínas que van a ser presentados. Esas secuencias diferentes se pueden introducir, por ejemplo, mediante aleatorización como se describe en la literatura usando secuencias de cebadores aleatorizados en PCR (Schmidt y Skerra (1993), Protein Engineering, 6, 109-122) según se describe con más detalle más adelante. Las secuencias de cebadores aleatorizados se pueden producir usando una síntesis química estándar con sintetizadores de DNA comerciales, o se pueden adquirir comercialmente. Como alternativa, especialmente cuando la variación se ha de hacer en aminoácidos no contiguos, se pueden producir megacebadores y modificarse por mutagénesis.

Las moléculas de DNA con las características necesarias para la generación de una biblioteca constituyen un aspecto más de la invención.

La expresión del material genético de la biblioteca se puede realizar según se describe con más detalle más adelan-
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Contemplada desde un nuevo aspecto, la invención proporciona una biblioteca de expresión in vitro de péptidos o proteínas que presenta una población diversa de péptidos o proteínas, en la que los péptidos o proteínas están asociados de manera específica con el DNA que los codifica a través de uniones covalentes proteína:DNA, y en la que dicha secuencia codificadora la porta una molécula de DNA que contiene una secuencia que codifica una secuencia de aminoácidos que se une específicamente a dicha secuencia codificadora (resto de unión), una secuencia que codifica una secuencia de aminoácidos que va a ser presentada (resto de presentación), y al menos un sitio de unión para el sitio de unión.

Como resultará evidente a partir de lo anteriormente expuesto, la invención proporciona muchos tipos diferentes de bibliotecas y métodos para generarlas. Aunque los métodos para la preparación de estas bibliotecas estarían dentro del alcance del destinatario experto, lo que se expone a continuación se aporta para ilustrar algunos tipos de bibliotecas y cómo éstas se podrían crear, haciendo referencia particular al uso del gen que codifica P2A como ejemplo de proteína que actúa en cis.

Se puede crear una biblioteca en la que los péptidos o proteínas que van a ser presentados exhiben una variación aleatoria, pseudo-aleatoria, parcialmente aleatoria o una variación dispersa y la totalidad o una parte del material genético que codifica los miembros de la biblioteca, se puede sintetizar por métodos químicos o pueden derivar de secuencias genómicas/codificadoras procedentes de diferentes organismos. Las regiones modificadas pueden estar contiguas o no contiguas. Bibliotecas combinatorias (en las que las regiones modificadas están contiguas) generalmente consisten en menos de 20 aminoácidos debido al número posible de permutaciones. Es por lo tanto apropiado usar regiones no contiguas de variación para extensiones de aminoácidos más largas. Así por ejemplo, en un péptido de presentación de 40 residuos, se podrían generar permutaciones de solamente 13 de estos aminoácidos. Esto tiene la ventaja de disminuir el número total de permutaciones (de miembros de la biblioteca) con respecto a una biblioteca en la que todas las posiciones se habían modificado. El uso de secuencias en las que determinados residuos son invariables proporciona una estructura (invariable) de andamiaje en la que se han modificado algunas regiones contenidas dentro del andamiaje o sostenidas por el andamiaje.

Estas estructuras de andamiaje pueden existir de manera inherente en las proteínas en las que las bibliotecas se podrían usar para aislar variantes de las proteínas que exhibieran propiedades deseadas, sobre la base de la variación de residuos seleccionados. Así por ejemplo, la especificidad o la estabilidad térmica de una enzima se podría variar si la enzima original se usara como andamiaje. Como alternativa, las secuencias de andamiaje se pueden introducir adyacentes al sitio de unión al DNA, o dentro de él, para la presentación de un péptido o proteína de presentación discontinuo. Las secuencias de andamiaje pueden estar localizadas en uno o en más sitios en cualquier parte dentro de la secuencia del péptido o de la proteína que se une al DNA que lo codifica, con la condición de que la secuencia(s) de andamiaje no interfiera con la unión covalente del péptido o proteína codificado a su DNA.

Como se ha mencionado previamente, el material genético que codifica los diferentes miembros de la biblioteca se puede generar mediante el uso de cebadores en los que una porción del cebador se ha modificado (para generar un conjunto de cebadores) para producir las permutaciones anteriormente descritas. De esta manera se pueden crear hasta 10^{12}-10^{14} miembros de la biblioteca. En el caso de los productos codificados (tal como P2A y sus fragmentos, derivados o variantes funcionalmente equivalentes) que se unen al DNA que los codifica a través de la cadena codificadora, para permitir la transcripción de la cadena molde y la unión de P2A a la cadena codificadora, es necesario en el caso de los productos finales resultantes de la generación y amplificación (si esta última se realiza) ser al mismo tiempo cadenas molde y cadenas codificadoras. Esto se puede conseguir mediante el uso, por ejemplo, de cebadores de la cadena molde que contienen secuencias de la biblioteca (es decir, un conjunto reunido de cebadores modificados), que adicionalmente contienen un sitio de unión para el cebador de la cadena molde, para permitir una posterior amplificación si ésta se requiere. Este sitio se puede usar además como identificador único para la selección (y amplificación) post-escrutinio. Una vez se ha generado un grupo de cadenas molde que incluyen las secuencias de la biblioteca, un cebador adecuado que se une a la cadena molde se puede usar para producir cadenas codificadoras que contienen las secuencias de la biblioteca.

La generación de las moléculas de ácido nucleico para la preparación de la biblioteca y/o para la amplificación de las mismas se puede realizar fácilmente usando una mezcla de estos cebadores de manera simultánea o consecutiva. Si la amplificación se va a realizar al mismo tiempo que la generación de la biblioteca, se puede usar un cebador único para realizar una serie a amplificaciones lineales, seguido del uso del segundo cebador, o ambas reacciones se pueden realizar a la vez. Los cebadores pueden estar compuestos por bases nucleotídicas que pueden estar en forma de derivados (p. ej., con un resto para la inmovilización), o por constituyentes alternativos apropiados, tales como constituyentes derivados de PNA, o por sus combinaciones.

Las moléculas de ácido nucleico que codifican los diferentes miembros de la biblioteca o sus partes variables, se pueden generar como alternativa por mutación o clonación, opcionalmente en combinación con técnicas de amplificación. Así por ejemplo, se puede crear una biblioteca inicial por clonación y se puede usar como molde inicial que se puede después modificar usando un conjunto de cebadores con secuencias de la biblioteca y/o por mutagénesis aleatoria.

De primordial importancia en las moléculas de ácido nucleico utilizadas para preparar las bibliotecas de expresión de la invención es la región que codifica el resto de unión al DNA. Según se ha mencionado previamente, esta región incluye cualquier proteína de unión a DNA o sus fragmentos, derivados o variantes funcionalmente equivalentes, que forma un enlace covalente con el material genético que la codifica, para formar un enlace operativo. Dependiendo de si la etapa de la traducción se va a tener lugar in vitro o in vivo, con un miembro único o con múltiples miembros de la biblioteca por célula hospedadora u organismo hospedador, el resto de unión al DNA puede actuar de la manera en cis o de la manera en pseudo-cis. Un ejemplo de un resto de unión a DNA que actúa en cis, que es apropiado para usar en la invención, es la proteína P2A o sus fragmentos, derivados o variantes funcionalmente equivalentes.

Un fragmento apropiado que comprende al menos la región de la proteína de unión al DNA que es necesaria para conseguir una unión covalente con el DNA, debe estar presente en las moléculas de ácido nucleico usadas para constituir la biblioteca. Por ejemplo, en el caso de P2A, debe estar presente el gen que codifica la proteína o una de sus secuencias degeneradas o uno de sus fragmentos, variantes o derivados funcionalmente equivalentes, que tiene propiedades apropiadas de unión a DNA. Este gen se puede modificar mediante la adición o deleción de secciones del gen si el péptido expresado o la proteína expresada resultante conserva su actividad funcional, es decir, sigue produciendo un enlace covalente con el DNA. Por ejemplo, el sitio de unión del péptido/proteína sobre el DNA (sitio de unión) puede ser desplazado o se puede introducir un sitio de unión adicional (por ejemplo, si el sitio de unión de tipo salvaje es afuncional debido a la variación p. ej. mediante mutación). Esto es particularmente importante para asegurar que el péptido o la proteína de presentación queda unido al DNA que lo codifica cuando el resto de unión al DNA que se usa produce adicionalmente la melladura del DNA.

Además, la región que codifica el péptido o la proteína de presentación (resto de presentación) puede estar insertada dentro de, estar situada adyacente a, o estar fuera de, la región que codifica el resto de unión al DNA, con la condición de que el resto de presentación una vez expresado se una covalentemente al resto de unión al DNA, es decir, sea parte del mismo péptido o proteína expresado. Esto puede requerir mover el codón de terminación en dirección aguas abajo de la región que codifica el resto de presentación. Al igual que sucedía con la ubicación sobre el DNA del sitio de unión a la proteína, se debe garantizar mediante la ubicación apropiada de la región que codifica el resto de presentación, que el resto de presentación queda unido al DNA que lo codifica, especialmente cuando la melladura de la cadena codificadora de DNA está implicada. Esto se puede conseguir de varias maneras diferentes.

La melladura tiene lugar en la cadena codificadora y el péptido o la proteína de unión al DNA (unido al péptido o a la proteína de presentación) está unido covalentemente al extremo 5' creado durante el procedimiento de melladura. De este modo se debe garantizar que el material genético que codifica el resto de presentación lo porta la parte de la cadena codificadora que está unida covalentemente al péptido expresado o a la proteína expresada, o que queda asociada con ella. Si el DNA sigue estando en forma bicatenaria después de la traducción y durante la selección, la cadena molde garantizará que ambas cadenas codificadoras estén asociadas con el resto de unión al DNA.

Como alternativa, para la traducción se puede usar un DNA circular que dará como resultado, después de la melladura (en condiciones de no hibridación), una cadena codificadora lineal que comprende la cadena codificadora completa delante de la melladura. Si como alternativa no se usa ni DNA circular ni condiciones que favorecen la hibridación, el sitio de unión de la proteína y el sitio de las secuencias de la biblioteca se elegirán de manera que el resto de unión al DNA se una covalentemente a la parte de la cadena codificadora que codifica el resto de presentación. Esto se puede conseguir mediante la inserción de la región que codifica el resto de presentación en el lado terminal que codifica el extremo carboxilo del sitio de unión (en cuyo caso éste último puede también estar desplazado de su posición natural). Esto se consigue de la manera más sencilla haciendo la inserción en dirección aguas abajo del sitio de unión presente en la naturaleza, es decir, en el extremo que codifica el extremo carboxilo. Sin embargo, la región que codifica el resto de presentación se puede introducir en el extremo amino si el sitio de unión está también desplazado aguas arriba.

En caso necesario, el sitio de unión se puede desplazar para que preceda a la región codificadora completa. Cuando la región que codifica el resto de presentación se ha de insertar en el extremo amino, para garantizar la transcripción, si las secuencias de la biblioteca son introducidas por cebadores, se deben utilizar megacebadores que comprenden de manera adicional al menos un promotor apropiado y un codón de iniciación que preceden a las secuencias de la biblioteca.

Las secuencias de la biblioteca se pueden insertar dentro de la región codificadora, en lugar de en el extremo amino o en el extremo carboxilo, mediante por ejemplo amplificación de un DNA circularizado usando cebadores que se hibridan a la secuencia codificadora pero que adicionalmente comprenden secuencias de la biblioteca en una porción que no se hibrida. Después de una extensión usando uno de estos cebadores, se puede seleccionar un cebador apropiado para producir una cadena hibridadora en la que las cadenas terminales del producto bicatenario resultante de la extensión (después de la hibridación) son romas o después de una digestión con una endonucleasa de restricción apropiada exhiben extremos protuberantes de manera que se puede realizar una ligación para producir moléculas de DNA con secuencias de la biblioteca insertadas internamente.

Si las proteínas han de ser presentadas, p. ej., en forma de andamiaje, se advertirá que la proteína de presentación se debe de insertar en la secuencia codificadora u en el sitio relevante, y posteriormente se debe modificar en residuos específicos o en regiones específicas para producir la biblioteca.

De manera adicional, la ubicación de la región que codifica el resto de presentación se debe determinar por la tolerancia del péptido o proteína codificado, en particular la del resto de unión al DNA, a las inserciones o sustituciones en ese sitio.

Las moléculas de ácido nucleico de la invención pueden comprender adicionalmente otras características tales como marcadores de resistencia a antibióticos. Por ejemplo, el gen de la \beta-lactamasa se puede incluir cuando las etapas de amplificación y/o traducción/transcripción y/o escrutinio y/o aislamiento, pudieran implicar una transformación, para permitir la identificación y la selección (por medio de su resistencia a los antibióticos) de los transformantes apropiados.

Las moléculas pueden contener marcadores alternativos o moléculas de reporte (por ejemplo nucleótidos marcados radiactivamente o uno de los miembros de una pareja de unión tal como estreptavidina:biotina) de manera que se pueda determinar la presencia o identidad de dichas moléculas de ácido nucleico. También se pueden usar marcadores o moléculas de reporte como herramienta para la inmovilización y/o purificación de las moléculas de ácido nucleico, por ejemplo en el caso de usar un marcador biotina, se pueda usar una columna que lleva estreptavidina para recoger las moléculas. De manera adicional, las moléculas de ácido nucleico que codifican la biblioteca pueden incluir nucleótidos no naturales o bases metiladas, especialmente en las secuencias flanqueantes, para estabilizar el DNA de los lisados celulares y/o durante la selección.

Por motivos de conveniencia, cualquiera de los cebadores utilizado en los métodos anteriormente descritos puede también llevar unido un resto encargado de la inmovilización, tal como biotina, que permite que los productos resultantes de la extensión de esos cebadores (el material genético que codifica la biblioteca) sean aislados con facilidad en etapas posteriores. Además, cuando así convenga, los cebadores pueden ir provistos de características que han de ser incorporadas en las moléculas de ácido nucleico resultantes, p. ej., secuencias de promotores, secuencias de terminación, genes requeridos para conferir resistencia a antibióticos.

Una vez que se han creado las moléculas de ácido nucleico que codifican la biblioteca, la biblioteca se puede generar mediante las etapas de (i) amplificación del material genético, (ii) transcripción y (iii) traducción, en las que las dos últimas etapas normalmente irán acopladas. Dependiendo de si se utiliza una función cis o pseudo-cis de la proteína de unión al DNA, estas etapas se pueden realizar in vitro o in vivo. Cuando se usan proteínas de unión que actúan en cis, cada una de las etapas se puede realizar in vitro o in vivo. Cuando se usan proteínas de unión que actúan en pseudo-cis, la amplificación se puede realizar in vitro o in vivo, pero la transcripción y la traducción se deben realizar in vivo.

La amplificación se puede realizar in vitro durante la generación del material genético de la biblioteca si, por ejemplo, se usan cebadores y PCR para generar las moléculas. Como alternativa, o de manera adicional, las moléculas de ácido nucleico se pueden amplificar mediante métodos convencionales de amplificación in vitro tales como PCR, NASBA (también conocida como 3SR) (véase Malek y col. (1994), Methods. Mol. Biol., 28, 253-260; Gebinoga y Oehlenschlager (1996), Eur. J. Biochem. 235, 256-261; y Ehritch y col. (1997), Eur. J. Biochem., 243, 358-364) o mediante una amplificación lineal. Como alternativa la replicación se puede realizar in vitro usando extractos libres de células (véase por ejemplo Kool, 1996, Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct. USA, 25, 1-28) o in vivo después de la inserción de las moléculas de ácido nucleico en células hospedadoras o en organismos hospedadores, por ejemplo, mediante transfección.

Si la replicación se realiza in vitro, el extracto libre de células se debe elegir adecuadamente, por ejemplo, debe contener los dNTP. La circularización se debe realizar antes de la transfección o de la replicación cuando sea necesario. Además, según se menciona más adelante, para evitar que el desprendimiento de la proteína de unión al DNA tenga lugar durante la replicación, se puede requerir un mutante que no se desprenda. Las moléculas de ácido nucleico pueden ya existir en las células hospedadoras o en los organismos hospedadores si su generación se hizo por mutación.

La generación de la biblioteca que expresa el péptido de presentación se puede realizar in vivo cultivando células transformadas u organismos transformados. Los organismos apropiados para este fin incluyen bacterias (tales como E. coli), virus, bacteriófagos y células tales como levaduras, o células procariotas, células eucariotas o arquebacterias. Para liberar la biblioteca de expresión, las células u organismos se deben entonces lisar para liberar las unidades de expresión formadas por proteína/péptido:DNA y/o el material genético que codifica la biblioteca, y se deben de purificar (p. ej., plásmido o minicromosoma) antes de la transcripción/traducción. Sin embargo según aquí se utiliza, el término "biblioteca" quiere abarcar una colección de miembros de la biblioteca aún contenidos dentro de sus células hospedadoras u organismos hospedadores cuando se crea in vivo, así como los miembros de la biblioteca después de liberados, si se produce in vivo, o si se crea in vitro.

In vitro, la transcripción/traducción acopladas se pueden realizar en extractos libres de células. Se puede realizar convenientemente en extractos libres de células procedentes de procariotas o de eucariotas, por ejemplo, de E. coli (Nevin y Pratt (1991), FEBS, 291, 259-263). Extractos libres de células procedentes de procariotas (p. ej., de E. coli, S-30 o S-135) y procedentes de eucariotas (p. ej., de germen de trigo o de reticulocitos) se encuentran comercialmente disponibles (Amersham/Promega). Dependiendo de la construcción de las moléculas de DNA y de si una proteína que interviene en la melladura es codificada, puede ser necesario circularizar el DNA antes de la traducción para garantizar que el resto de presentación queda asociado con el DNA que lo codifica.

Ya se lleve a cabo in vivo o in vitro, cuando se ha usado un promotor inducible, el procedimiento de la transcripción debe ser inducido.

Se ha encontrado que la unión de determinadas proteínas de unión a DNA (p. ej., P2A se puede mejorar in vitro, por ejemplo, alterando las propiedades del sitio de unión. Como alternativa, se pueden requerir cofactores específicos (p. ej. proteínas específicas del hospedador) para aumentar la unión y la actividad de las proteínas de unión al DNA. Preferiblemente, el sitio de unión debe ser monocatenario. Esto se puede conseguir de varias maneras diferentes, por ejemplo, cuando se usa un DNA bicatenario, se puede introducir un bucle o abertura en el sitio de unión. Un oligonucleótido con desapareamientos se puede incluir durante la reacción de traducción, el cual se hibrida con la cadena codificadora en ambos de los lados adyacentes al sitio de la unión. En la región que contiene el sitio de unión en la cadena codificadora, la porción correspondiente del oligonucleótido con desapareamientos no es capaz de hibridarse haciendo de este modo que la cadena codificadora sea efectivamente monocatenaria a lo largo de esta región. El uso de un cebador con desapareamientos constituye un aspecto preferido de la invención.

Esta región de desapareamiento se puede extender por la longitud de la región de unión o se puede extender más allá de esta región, por ejemplo puede presentar desapareamientos a lo largo de una región de 10 nucleótidos. Por ejemplo, en el caso del sitio de unión de P2A (TCGGA, presente en la secuencia

5'-AGCGGCATCGCCGCGCCTCGGAGTCCTGTC-3') se puede usar un oligonucleótido con desapareamientos que contiene una secuencia tal como

3'-TCGCCGTAGCGGCGTAAGATTCTAGGACAG-5' en la que la región de desapareamiento está subrayada.

Como alternativa, se pueden usar cebadores apropiados para generar el material de ácido nucleico que codifica la biblioteca y/o su amplificación para introducir una región monocatenaria en el sitio de unión. Esto se puede realizar, por ejemplo, usando un cebador que lleva una región de desapareamiento en el sitio de la unión. Si el sitio de unión está dentro de la región codificadora del resto de unión a DNA, en ese caso la secuencia del desapareamiento se debe seleccionar de manera que no se afecte la secuencia de aminoácidos codificada por el DNA y debe por lo tanto ser una variación silente, es decir, una variación del codón en la tercera posición, pero que codifica el mismo aminoácido. Los autores de la presente invención han encontrado que se observaba una unión mejorada cuando un desapareamiento estaba presente en la cadena molde correspondiente al sitio de unión sobre la cadena codificadora.

Si como alternativa el sitio de unión está situado en el extremo de la región codificadora y se usa un cebador con desapareamientos, después de la etapa de escrutinio se pueden seleccionar cebadores apropiados de manera que durante la amplificación el sitio de unión se restablece.

Como alternativa, si el sitio de unión se forma en el extremo del DNA, el DNA bicatenario de esta región puede hacerse monocatenario mediante digestión con una endonucleasa de restricción que deja una extensión 5' que contiene la totalidad o parte del sitio de unión. Por ejemplo, la enzima HgaI deja una protuberancia de 5 bases en 5', a 5 nucleótidos desde el sitio de reconocimiento de HgaI. Si esta región es demasiado pequeña, en ese caso una región más grande puede hacerse monocatenaria mediante la incorporación de bases no naturales en uno de los cebadores de la amplificación (p. ej. desoxiuridinas) seguido del uso de enzimas de reparación del DNA tales como la uracil-DNA-glicosilasa o la endonucleasa de T4 para cortar por nucleótidos específicos dejando una región monocatenaria (Watson y Bennet (1997), BioTechniques, 23, 858-864).

Cuando la invención se realiza usando determinadas proteínas de unión que actúan en cis, tales como P2A, o sus fragmentos, derivados o variantes funcionalmente equivalentes, siempre que el resto de unión al DNA esté asociado covalentemente con el DNA que lo codifica, éste representa un intermediario cinético y si la replicación está teniendo lugar, el péptido o la proteína se religarán a la cadena codificadora y se soltarán de esta cadena pasando a una nueva secuencia codificadora con un sitio de unión intacto. La replicación puede evitarse in vitro, pero esta transferencia representa un problema potencial en los casos en los que la traducción se lleva a cabo in vivo.

Para evitar esto, se puede usar un mutante que no se suelte. El uso de un resto de unión modificado que permanece unido covalentemente al DNA que lo codifica en métodos de la invención, constituye un aspecto preferido de la invención. En el caso de P2A por ejemplo, se puede usar Y450F, que comprende una sustitución de la tirosina situada en la posición del aminoácido 450 de la proteína A con fenilalanina. Debe de observarse sin embargo que cuando la reacción de traducción se realiza in vitro, con la condición de que la replicación no tenga lugar, (p. ej. garantizando que no se encuentren presentes los dNTP), la proteína de tipo salvaje permanecerá asociada con el DNA que la codifica, permitiendo que el escrutinio se realice.

Una biblioteca generada según aquí se describe, se puede usar en cualquiera de las aplicaciones para las que se usan las bibliotecas de sistemas de presentación convencionales in vivo o in vitro de la técnica. Estos usos se encuentran perfectamente documentados en la literatura. Por ejemplo, la biblioteca de la invención se puede usar para identificar un péptido o una proteína que se une de manera específica a una molécula diana.

Es un hecho conocido en la técnica que péptidos de tamaño diferente se pueden ordenarse en una estructura terciaria apropiada para producir un dominio con características estéricas y de carga particulares. Este dominio puede, en virtud de su ordenación terciaria específica, reconocer específicamente una molécula diana particular o unirse específicamente a ella. Ejemplos de estos péptidos incluyen, pero no se limitan a ellos, las regiones de unión de proteínas y las regiones variables de unión de los anticuerpos. Incluso péptidos pequeños, sin una estructura terciaria definida pueden también presentar propiedades de unión a dianas específicas. Los péptidos que las bibliotecas de la invención presentan pueden ser por lo tanto péptidos pequeños, por ejemplo de hasta 40 residuos de aminoácidos, p. ej. de 5 a 30, preferiblemente de 7 a 20 y más preferiblemente de 10 a 15 residuos de aminoácidos, que no tienen una estructura terciaria fija, o pueden ser péptidos de mayor tamaño que forman una estructura terciaria fija.

Como alternativa, la biblioteca puede expresar proteínas de presentación (que forman parte del polipéptido que contiene el resto de unión al DNA) en las que solamente algunos residuos están modificados en los diferentes miembros de la biblioteca. Por ejemplo, una proteína con una especificidad definida, tal como un anticuerpo o un receptor, puede constituir la base de una biblioteca, en la que varias, por ejemplo de 5 a 30, preferiblemente de 7 a 20 posiciones de aminoácidos están modificadas en la biblioteca y se pueden seleccionar proteínas de presentación que exhiben una especificidad alterada.

Las moléculas diana pueden incluir compuestos químicos de pequeño tamaño, por ejemplo heterociclos o compuestos farmacéuticos, polipéptidos, proteínas, polinucleótidos o cualquier entidad que presente características distintivas en su superficie que pueden ser reconocidas de manera específica. Así, por ejemplo, se pueden identificar péptidos o proteínas de unión a dianas específicas, que tendrían utilidad en ensayos diagnósticos, por ejemplo en procedimientos clínicos para determinar los niveles de moléculas biológicas o no biológicas en el organismo humano o en muestras, extractos o materiales derivados de ellos, o en ensayos que determinan los niveles de materiales biológicos o no biológicos en otros materiales no derivados de muestras biológicas.

Las bibliotecas conforme a la invención también presentan utilidad en protocolos de escrutinio para identificar compuestos con propiedades bioquímicas, biológicas o estructurales apropiadas, por ejemplo, para identificar péptidos o proteínas que presentan una determinada actividad bioquímica en un ensayo definido. Mediante este método, se pueden identificar péptidos o proteínas que presentan propiedades enzimáticas, inhibidoras o estimuladoras, los cuales pueden tener utilidad, por ejemplo, en el campo farmacéutico. Por ejemplo, se puede realizar el escrutinio de actividades enzimáticas realizando el seguimiento, por ejemplo, de una actividad aumentada o disminuida tal como quimiofluorescencia, actividad de nucleasa, actividad de fosfotransferasa, inhibición, etc. Si se usan polipéptidos de andamiaje con una actividad conocida, variantes con propiedades alteradas o con una actividad alterada se pueden seleccionar en la biblioteca.

Esos polipéptidos o proteínas una vez identificados en la biblioteca, se pueden usar para la preparación de compuestos con la actividad particular, por ejemplo, inhibidores, activadores, o catalizadores de determinadas reacciones o interacciones.

En general, los péptidos o proteínas de interés se identifican en la biblioteca conforme al siguiente protocolo que incluye las etapas de: (i) escrutinio, (ii) aislamiento y/o purificación, (iii) evolución, (iv) amplificación, (v) preparación de una biblioteca de re-escrutinio (incluyendo transcripción y traducción), (vi) re-escrutinio (y siguiendo a continuación las etapas de (ii) a (vi) tantas veces como sea necesario), y (vii) aislamiento del material genético de interés. Las etapas (ii) y/o (iii) y/o (iv) pueden sin embargo no aplicar según convenga).

Independientemente de si las proteínas actúan en cis o actúan en pseudo-cis, las etapas de escrutinio y aislamiento se deben realizar in vitro. Si se utilizan proteínas de unión que actúan en cis o sus fragmentos, derivados o variantes funcionalmente equivalentes, las etapas restantes se deben realizar in vitro o in vivo. Sin embargo, si se usan proteínas que actúan en pseudo-cis o sus fragmentos, derivados o variantes funcionalmente equivalentes, al menos parte de la etapa (v), en concreto la transcripción y la traducción, se deben realizar in vivo.

El escrutinio, que se debe realizar in vitro, implica el uso de un ensayo apropiado, tal como un ensayo de unión por afinidad, un ensayo de reparto en fases o un ensayo enzimático para identificar péptidos o proteínas de interés de la presentación, según se describe en adelante con más detalle. El ensayo de reparto en fases (véase por ejemplo Garg y col., 1994, Biotech. Appl. Biochem. 20 119-215) tiene aplicaciones particulares para identificar péptidos/proteínas de presentación que se reparten en las fases orgánicas (p. ej. Tritón X-114) como resultado de la variación existente en la biblioteca. Este método tiene una mejor aplicabilidad general si la fase orgánica, p. ej., un detergente, se modifica para que porte un miembro de una pareja de unión apropiada para el péptido o proteína diana de la presentación, p. ej. un anticuerpo o un antígeno.

La identificación de propiedades enzimáticas alteradas se basa en propiedades físicas alteradas, p. ej. la unión a un sustrato o la exposición a un sitio previamente inaccesible, p. ej. mediante una actividad de proteasa o mediante fosforilación.

La unión del péptido o de la proteína de presentación a un miembro de una pareja de unión apropiado se puede identificar mediante cualquiera de los medios apropiados, por ejemplo, mediante unión por afinidad y elución, o mediante evidencia de la actividad enzimática, p. ej. la producción del producto de la reacción. Por lo tanto, las bibliotecas de la invención se pueden usar para identificar miembros de parejas de unión en los que el péptido o la proteína expresado es uno de los miembros de la pareja de unión. De esta manera las bibliotecas de la invención proporcionan alternativas totalmente in vitro a técnicas tales como el sistema de los dos híbridos. En este sistema, se crean dos moléculas híbridas cada una de las cuales porta uno de los miembros de una pareja de unión (tal como una enzima y su sustrato). Cuando estos miembros de las parejas de unión se unen, las otras partes funcionales de las proteínas de fusión se reúnen. Mediante una selección apropiada de estos restos funcionales de las proteínas de fusión, se puede identificar una interacción detectable.

Este tipo de sistema se encuentra descrito por ejemplo en Field y Song (1989, Nature, 340, 245-246), y en él las proteínas de fusión contienen diferentes partes de GAL4 de Saccharomyces cerevisiae, cuyos componentes se reúnen mediante la unión de los miembros de la pareja de unión expresados en las proteínas de fusión, reconstituyen GAL4 de manera que se puede observar su actividad de activación transcripcional. Esto indica por lo tanto que ha tenido lugar la unión entre los miembros de la pareja de unión de las proteínas de fusión. Gyuris y col., 1993, Cell, 75, 791-803, describe de manera similar la complementación de los componentes de un activador de la transcripción. Además, Rossi y col. (1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 8405-8410) han descrito una complementación utilizando mutantes de \beta-galactosidasa por deleción. También se puede conseguir una complementación en la que la segunda proteína de fusión es una entidad más compleja pero que posee las características anteriormente descritas, es decir, un miembro de la pareja de unión y un resto funcional que interacciona con un resto funcional presente en la primera proteína de fusión. Un ejemplo de esto se proporciona en Krebber y col., (1997, J. Mol. Biol., 268, 607-618) en el que un fago no infeccioso se hace infeccioso uniendo una proteína de fusión a través de los miembros de una pareja de unión apropiados. Aronheim y col. (1997, Mol. Cell Biol., 17, 3094-3102) describen un sistema en el que el equivalente de la segunda proteína de fusión lleva un miembro de la pareja de unión que tiene naturaleza de ácido nucleico y el resto funcional es una proteína presente en la membrana plasmática a la que el miembro del par de unión se une.

De esta manera la biblioteca de la invención puede expresar una proteína de fusión que contiene un resto responsable de una interacción de unión (la totalidad o una parte del péptido o de la proteína de presentación) y un segundo resto implicado en la complementación. Una segunda proteína de fusión (o una entidad apropiada) que porta el miembro de la pareja de unión y el componente requerido para la complementación, puede formar parte de la biblioteca o puede adicionarse a la biblioteca. El miembro de la pareja de unión de una o de ambas de las proteínas de fusión puede estar modificado en la biblioteca.

Dependiendo de la construcción de las moléculas de ácido nucleico de la invención, según se ha mencionado anteriormente, puede ser necesario realizar el escrutinio en condiciones de hibridación.

La biblioteca puede ser modificada antes del escrutinio, por ejemplo, modulando el plegamiento del péptido o proteína presentado mediante la adición de enzimas tales como chaperonas (por ejemplo, hsp70) o modificadores del plegamiento tales como la proteína disulfuro-isomerasa, agentes oxidantes, o enzimas que alteran la actividad oxidante del citoplasma bacteriano o de los extractos en los que tiene lugar la traducción. Además, se puede realizar el escrutinio de proteínas tanto homo-oligoméricas como hetero-oligoméricas. Por ejemplo, el receptor de la partícula de reconocimiento de señal (SR) es un heterodímero de subunidades denominadas SR-alfa y SR-beta, y se puede obtener la expresión de una biblioteca que exprese variantes de sólo una de las subunidades. Las variantes se pueden luego ensayar con respecto a una propiedad deseada que es independiente de la otra subunidad, o con respecto a una propiedad dependiente antes de la heterodimerización con la otra subunidad.

Un ejemplo clásico de heterodimerización es el proporcionado por las cadenas ligera y pesada de un anticuerpo. En este caso por ejemplo solamente una de las cadenas podría encontrarse presente en la biblioteca y la otra cadena podría ser aportada durante el ensayo. Además de un polipéptido, en la etapa de escrutinio se pueden añadir metales, porfirinas, cofactores, DNA, RNA y otras moléculas, para alterar las propiedades del péptido o de la proteína de presentación.

Después del escrutinio, los péptidos o proteínas de interés, del sistema de presentación, se deben de separar del conjunto reunido de la biblioteca (aislamiento) y opcionalmente purificarse. En determinados casos esto se habrá realizado durante el escrutinio, por ejemplo durante el uso de columnas de afinidad.

Se puede realizar una evolución de las moléculas de DNA seleccionadas para generar nuevas variaciones en la biblioteca que pueden exhibir las propiedades deseadas en mayor medida. Esto se ha realizado en la técnica anterior para obtener por evolución una fucosidasa a partir de una galactosidasa (véase Zhang y col. (1997), PNAS USA, 94, 4504-4509) o para alterar una función enzimática específica (véase Crameri y col., (1997), Nature Biotechnology, 15, 436-438; You y Arnold (1996), Protein Eng., 9, 77-83).

La evolución se puede realizar mediante la introducción de nuevas mutaciones adicionales en localizaciones aleatorias usando químicamente uno cualquiera de los varios procedimientos conocidos en la técnica; usando genéticamente cepas mutadoras de bacterias (Dengen y Cox (1974), J. Bact., 117, 477-487), cepas bacterianas que introducen sustituciones de aminoácidos usando tRNA supresores (Markiewicz y col., (1984), J. Mol. Biol., 240, 421-433), mediante técnicas de PCR mutagénica tales como la aleatorización de codones regionales (Cormack y Struhl (1993), Science, 262, 244-248) o usando uno de los métodos estándar para disminuir la fidelidad de la polimerasa usada en una reacción de PCR o de la transcriptasa inversa en NASBA. Se pueden usar cebadores con desapareamientos o bibliotecas con megacebadores para introducir sustituciones en localizaciones definidas. Los miembros de la biblioteca seleccionados que contienen diferentes variaciones independientes se pueden también recombinar usando la tecnología de mezclado de DNA (del inglés, "DNA shuffling") (Stemmer (1994), Nature, 370, 389-391) o mediante métodos de clonación más convencionales.

Después del aislamiento o de la evolución si ésta se realiza, los miembros de la biblioteca seleccionados o los miembros de la biblioteca obtenidos por evolución se amplifican (en caso necesario) y se prepara una biblioteca para el re-escrutinio usando cualquiera de los procedimientos anteriormente descritos para la generación de la biblioteca. Como consecuencia de que un péptido o una proteína esté unido al material genético de la biblioteca, para obtener el material genético en una forma adecuada para las etapas posteriores, p. ej. transformación, puede ser necesario extraer la región codificadora en una molécula de DNA diferente, tal como un vector. El re-escrutino se puede entonces realizar tantas veces como convenga para estabilizar la población seleccionada, aumentando opcionalmente la rigurosidad del escrutinio o introduciendo nuevas variaciones (p. ej., evolución in vitro).

Una vez completado el escrutinio, el material genético que codifica el péptido o proteína seleccionado se puede aislar, por ejemplo, mediante purificación del plásmido o del minicromosoma. Opcionalmente, los miembros de la biblioteca seleccionados se pueden amplificar antes del aislamiento, por ejemplo, mediante transformación y cultivo o mediante PCR.

De lo anteriormente expuesto resultará evidente que se pueden usar varios métodos para generar y escrutar la biblioteca de la invención. Sin embargo, se prefieren los siguientes esquemas. Cuando se usan proteínas de unión que actúan en cis o sus fragmentos, derivados o variantes funcionalmente equivalentes, para permitir que tenga lugar el protocolo más rápido y eficiente (según se ha descrito previamente) todas las etapas se deben realizar in vitro. Ya que en esos casos no se requieren organismos vivos, se observará que el procedimiento completo es susceptible a una automatización. Además, no es necesario utilizar condiciones o procedimientos que se seleccionan para garantizar la viabilidad de los organismos.

Preferiblemente, las construcciones genéticas usadas para crear la biblioteca de expresión se construyen usando cebadores (con secuencias de la biblioteca) que se reasocian a las secuencias de la biblioteca y las insertan en el extremo carboxilo del resto de unión al DNA. Esto evita el requerimiento de condiciones de hibridación durante la traducción o de circularización antes de la traducción cuando se usan restos de unión al DNA que se comportan de manera similar a P2A.

Se prefiere además, cuando se usan proteínas de unión al DNA o sus fragmentos, variantes o derivados funcionalmente equivalentes que tienen tendencia a soltarse del DNA que los codifica, mutar la proteína de unión a DNA, p. ej., Y450F según aquí se ha descrito, de manera que la proteína o sus fragmentos, variantes o derivados se unan a éste pero que no se suelten (manteniéndose así el enlace operacional entre el DNA y el producto que éste codifica. De manera adicional, puede requerirse un sitio de ori adicional para permitir que tenga lugar la replicación. La construcción debe contener además promotores inducibles.

Preferiblemente, el resto de unión a DNA deriva de la proteína P2A o de uno de sus fragmentos, variantes o derivados funcionalmente equivalentes. Durante la traducción, el uso de un oligonucleótido con desapareamientos puede ser conveniente. La presencia de al menos un marcador de resistencia a antibióticos se prefiere también para la transformación final de las células hospedadoras una vez aisladas, con la secuencia de ácido nucleico seleccionada.

Cuando se utilizan proteínas de unión que actúan en pseudo-cis o sus fragmentos, derivados o variantes funcionalmente equivalentes para generar la biblioteca, la amplificación del material genético se realiza preferiblemente in vitro mediante técnicas apropiadas tales como PCR. Las construcciones preferidas son aquellas en las que las secuencias de la biblioteca aparecen en el extremo carboxilo de la región que codifica el resto de unión al DNA, para evitar el uso de megacebadores y de problemas en el caso de que se produzca la melladura de la cadena de DNA. También se prefiere la presencia de genes que codifican marcadores de resistencia a antibióticos y un promotor inducible. Durante el escrutinio, se prefiere que la amplificación se realice también in vitro.

Así contemplada desde un nuevo aspecto, la invención proporciona un método para identificar y/o purificar un miembro de una biblioteca que exhibe propiedades deseadas, a partir de una biblioteca de expresión de péptidos o proteínas según se ha definido en lo que antecede, comprendiendo dicho método al menos las etapas de a) someter a escrutinio una biblioteca de la invención y b) seleccionar y aislar el miembro de la biblioteca relevante. El método se puede extender al aislamiento del péptido o de la proteína que exhibe la propiedad deseada o del DNA que lo codifica, mediante la etapa adicional de aislar el péptido, la proteína o el DNA que lo codifica a partir del miembro de la biblioteca aislado.

En los casos en los que la propiedad deseada es la capacidad para unirse a una diana, se pueden usar moléculas diana, preferiblemente en forma purificada, para seleccionar un conjugado genético que porta un péptido o una proteína de unión específica a una diana en la biblioteca de varias maneras diferentes. De manera conveniente, la diana puede estar unida a un soporte sólido y se puede usar como una matriz de afinidad. Numerosos soportes sólidos y métodos para la unión de moléculas directa o indirectamente, de manera covalente o no covalente (p. ej., mediante un acoplamiento biotina-estreptavidina o IgG-proteína A) se conocen muy bien en la técnica y se encuentran ampliamente descritos en la literatura.

Así por ejemplo, se pueden usar soportes en forma de pocillos de microtitulación, tubos, varillas, partículas, fibras o capilares. Ventajosamente, el soporte puede comprender partículas magnéticas, p. ej. las bolitas supermagnéticas producidas por Dynal AS (Oslo, Noruega y comercializadas con la marca comercial de DYNABEADS).

Para la selección, la biblioteca de expresión se puede poner en contacto con la diana unida a un soporte sólido. El soporte se puede lavar para retirar los miembros de la biblioteca que no se unen a la diana o se puede extraer de la biblioteca de expresión de una manera apropiada para el soporte que se ha usado. Los conjugados seleccionados formados por péptido/proteína:DNA se pueden luego desprender del soporte sólido, en caso necesario, mediante ruptura de la unión entre las moléculas diana y el soporte sólido, o entre las moléculas diana y los conjugados formados por péptido/proteína:DNA, para la subsiguiente amplificación o aislamiento del material genético. Como alternativa, la amplificación se puede realizar in situ sin ruptura de la unión de la diana al conjugado formado por péptido/proteína:DNA, o sin desprender el material genético del conjugado.

La molécula diana se puede también usar en forma de un agente libre en ausencia de un soporte. La selección se puede luego realizar retirando los conjugados no unidos, por ejemplo usando anticuerpos dirigidos a una región del péptido o de la proteína expresado que está presente en todos los miembros de la biblioteca y que está accesible solamente cuando no se encuentra unida a moléculas diana. Las moléculas diana, como alternativa, pueden estar provistas de un medio para la inmovilización de manera que esto se puede usar para separar la diana y los conjugados péptido/proteína DNA unidos después de mezclar la diana y la biblioteca. Este medio de inmovilización puede por ejemplo constituir uno de los miembros de una pareja de acoplamiento, p. ej. estreptavidina-biotina, unido a la molécula diana, y el otro miembro unido a un soporte que va a usarse para la recuperación.

Así contemplado desde otro aspecto más, la invención proporciona un método para identificar un péptido o una proteína de unión específica a una diana, comprendiendo dicho método al menos las etapas de a) someter a escrutinio una biblioteca de la invención con moléculas diana y b) seleccionar y aislar un miembro de la biblioteca que se une a dicha molécula diana, y c) aislar el péptido o la proteína que se une específicamente a dicha molécula diana. También se proporciona un método para aislar un DNA que codifica un péptido o una proteína de unión específica a una diana, en el que después de la anterior etapa b), se aísla el DNA que expresa el péptido o la proteína que se une de manera específica a dicha molécula diana.

Puede ser necesario realizar más de un único ciclo de escrutinio y selección para obtener un péptido o una proteína de unión a una diana, de la especificidad deseada.

De manera similar, la biblioteca se puede someter a escrutinio para identificar una proteína o un péptido con atributos funcionales particulares, p. ej., una actividad enzimática.

Un péptido o una proteína seleccionado, unido al DNA que lo codifica, se puede aislar separándolo del material genético, se puede sintetizar mediante transcripción y traducción del material genético que puede ser amplificado, o se puede sintetizar por métodos químicos después de secuenciar la secuencia de DNA apropiada que lo codifica, o de secuenciar directamente el péptido o la proteína. La síntesis química del péptido o de la proteína se puede realizar con métodos muy conocidos en la técnica que implican series cíclicas de reacciones de desprotección selectiva de los grupos funcionales de un aminoácido terminal y acoplamiento de residuos de aminoácidos protegidos de manera selectiva, seguidos finalmente por la desprotección completa de todos los grupos funcionales. La síntesis se puede realizar en una disolución o en un soporte sólido usando fases sólidas adecuadas, conocidas en la técnica.

Preferiblemente, si la afinidad del péptido o de la proteína seleccionado por la molécula diana o la actividad del péptido o de la proteína no se afecta de manera significativa, solamente se puede sintetizar el resto de presentación del péptido o proteína expresado. De manera opcional, puede ser necesario o preferible producir el péptido o la proteína en la forma en la que aparece en el polipéptido que contiene el resto de unión al DNA, generando una parte o la totalidad de la secuencia del resto de unión al DNA y/o otras regiones del péptido o proteína expresado. Esto es especialmente cierto cuando se ha producido una biblioteca de andamiaje.

Los conjugados apropiados formados por péptido/proteína de unión a una diana:DNA pueden estar provistos de una molécula de reporte para uso en ensayos cualitativos o cuantitativos para determinar la presencia o ausencia de moléculas diana.

Por lo tanto, contemplado desde aún otro aspecto más, la invención proporciona un método para realizar un ensayo de la presencia de una molécula diana en una muestra, comprendiendo dicho método (a) poner en contacto dicha muestra (p. ej., de un material biológico, derivada de un material biológico o de un material no biológico) con una sonda molecular que comprende (i) un resto de unión a una diana, de un péptido o de una proteína, capaz de unirse de manera selectiva a dicha molécula diana, que lleva unido el DNA que lo codifica, el resto de DNA, seleccionado en la biblioteca de la invención y (ii) un resto de reporte; y (b) determinar directa o indirectamente la sonda unida a la diana.

Sondas moleculares bifuncionales (que comprenden (i) y (ii) según se han descrito anteriormente), de uso en el ensayo, constituyen un aspecto más de la invención.

En este método analítico, la determinación de la unión del compuesto bifuncional a cualquiera de las dianas frente a las que es específico, que está presente en la muestra, puede ser directo o indirecto. Las determinaciones directas e indirectas son muy conocidas en el campo de los ensayos diagnósticos. Estos procedimientos pueden implicar la separación del compuesto bifuncional unido (o no unido), cualquiera de los cuales puede servir como analito. La determinación del conjugado formado por molécula diana:compuesto bifuncional puede ser cualitativa o, más preferiblemente, cuantitativa, y podrá implicar la determinación directa o indirecta del resto de reporte.

El ensayo se puede dirigir a la determinación de una segunda diana con la primera diana, en la que el resto de reporte presente en una sonda dirigida a la segunda diana es reconocido por el compuesto bifuncional. De esta manera un compuesto bifuncional puede estar dirigido a una sonda, preferiblemente molecular, que reconoce a otra diana, en cuyo caso se permite que la sonda se una a la otra diana en condiciones adecuadas antes de la adición del compuesto bifuncional según se ha mencionado anteriormente.

Para proporcionar la sonda, los conjugados formados por péptido/proteína de unión específica a una diana:DNA pueden incorporar un resto de reporte, o se pueden conjugar con él, de manera que se puede determinar y/o cuantificar la presencia de la diana de interés en la muestra del ensayo.

El resto de unión del péptido o de la proteína a una diana en el compuesto bifuncional se une a la diana en virtud de una región de unión a la diana que constituye algunos o todos los residuos de aminoácidos del péptido o de la proteína expresados. Generalmente, esto corresponderá al menos a una porción del resto de presentación según se ha definido previamente.

El resto de reporte puede ser cualquier resto capaz de una detección directa o indirecta, p. ej., en virtud de sus propiedades enzimáticas, emisión de radiación, propiedades de dispersión o absorción, de sus propiedades magnéticas, o de su capacidad para cooperar con un agente de complementación, o de unirse a él, para producir un efecto detectable, p. ej., interaccionar con una enzima para producir una señal, desprendimiento de un gas, emisión de luz, cambio de color, turbidez, precipitación, etc. El resto de reporte puede ser, de manera alternativa, cualquier parte del conjugado formado por péptido/proteína:DNA que sea reconocible y que se pueda unir a otra molécula que pueda producir directa o indirectamente una señal. Así por ejemplo, se puede utilizar un anticuerpo dirigido contra una región particular del material genético o del péptido/proteína. Los restos anteriormente mencionados son muy conocidos dentro del campo de los ensayos diagnósticos.

El resto de reporte en los compuestos bifuncionales de la invención se puede incorporar en, o se puede conjugar con, el resto de péptido/proteína o el resto de DNA. Así, a modo de ejemplo, se pueden usar aminoácidos o nucleótidos marcados radiactivamente en la construcción del péptido/proteína o del DNA que lo codifica, actuando en ese caso los radioisótopos como restos de reporte integrados en las estructuras del péptido/proteína o del ácido nucleico. Esos constituyentes marcados se pueden incorporar durante la preparación de la biblioteca progenitora o durante las posteriores etapas de escrutinio o amplificación cuando éstas se realicen.

Como alternativa, una molécula de reporte se puede conjugar con el péptido/proteína o con el DNA que directa o indirectamente permite la detección o medida de la presencia de la diana a la que el péptido o la proteína es capaz de unirse. Esas moléculas de reporte incluyen por ejemplo, marcadores radiactivos, marcadores químicos, por ejemplo, cromóforos o fluoróforos (p. ej., colorantes como la fluoresceína y la rodamina) o reactivos de alta densidad electrónica tales como la ferritina, hemocianina u el oro coloidal.

Como alternativa, la molécula de reporte puede ser una enzima, por ejemplo, peroxidasa o fosfatasa alcalina, en cuyo caso la presencia de la enzima se visualiza mediante su interacción con un resto adecuado, por ejemplo, un sustrato. La actividad enzimática la puede proporcionar la proteína o el péptido expresado, inclusive la entidad de unión a la diana del péptido o de la proteína, si la diana a la que éste/a se une es por ejemplo un receptor para la enzima o es un sustrato para la enzima. El acoplamiento de enzimas a péptidos o a proteínas se puede obtener utilizando técnicas convencionales, p. ej., usando una enzima activada tal como una fosfatasa alcalina activada (Boehringer Mannheim Biochemicals).

El resto de reporte también puede formar parte de una pareja de señalización en la que el otro miembro de la pareja se encuentra en, o está en estrecha proximidad a, la diana a la que se une el péptido o la proteína, por ejemplo, un compuesto fluorescente y un sustrato desactivador de la fluorescencia. Como se ha mencionado con anterioridad, el péptido/proteína o el DNA también se pueden detectar mediante la asociación con, o la unión de, otra molécula que reconozca su identidad, por ejemplo, un anticuerpo dirigido contra parte de la secuencia que puede constituir la región de unión a la diana del péptido o proteína o una región del péptido o de la proteína no implicada en la unión a la diana, que se puede añadir opcionalmente para fines de reconocimiento, o en el caso de un DNA, que se puede dirigir contra motivos específicos de naturaleza ácido nucleica. De este modo, la región de unión específica a una diana puede estar dentro un péptido o una proteína de mayor tamaño, en cuyo caso las porciones del péptido o de la proteína no implicadas en la unión a la diana pueden prestar un papel estructural o funcional para el péptido o la proteína expresado, p. ej., como secuencia de andamiaje, o pueden actuar como un resto de reporte, o como un grupo enlazador que enlaza la región de unión específica a una diana, a un resto de reporte o a otro componente de la sonda, p. ej., una molécula de transporte o una macromolécula.

Los compuestos bifuncionales útiles de acuerdo con la invención se pueden producir conjugando una molécula de reporte al péptido o proteína apropiado resultante, ya sea directamente o a través de un resto enlazador. Generalmente esto se puede hacer mediante reacción con una funcionalidad carboxilo o una funcionalidad amina opcionalmente activada que se encuentra en el péptido o en la proteína. Estas reacciones de conjugación se encuentran dentro de la capacidad de un químico de experiencia ordinaria.

Como alternativa, la molécula de reporte se puede introducir utilizando un aminoácido marcado apropiadamente, en la construcción del péptido o de la proteína.

Los compuestos bifuncionales que hacen de sonda se pueden usar para reconocer dianas específicas de interés en diferentes sistemas conocidos en la técnica, que incluyen ensayos diagnósticos como se ha mencionado con anterioridad.

Los siguientes Ejemplos se proporcionan únicamente a modo de ilustración, con referencia a los dibujos en los que:

La Figura 1 muestra la construcción de las construcciones pEN21 y pEN24, y

La Figura 2 muestra la producción de moléculas de DNA que contienen una región aleatorizada de 30 pares de bases generados por PCR, en la que la pista 1 es un marcador (\lambda, HindIII) y la pista 2 es el producto de la PCR.

Ejemplo 1 Metodología general para generar una biblioteca de péptidos in vitro y técnica de revestimiento de una superficie con un ligando (del inglés, "panning") para unir una diana Materiales

A. Un plásmido o un fragmento de PCR que contiene el promotor de T7, un sitio de unión al ribosoma, el gen A de P2 y el terminador de T7. Plásmidos de este tipo han sido descritos por Liu y Hagg\ring{a}rd-Ljungquist (1994, supra) o se pueden obtener procedentes de Biotechnology Centre de Oslo, Universidad de Oslo (BiO).

B. Un cebador (cebador de la biblioteca) que contiene las siguientes secuencias complementarias a las del plásmido/fragmento:

-

promotor de T7,

-

sitio de unión al ribosoma,

-

30 nucleótidos aleatorios (XXT/G) detrás del primer codón de iniciación ATG, y como alternativa, un codón de cisteína detrás del primer codón de iniciación y detrás de la secuencia aleatoria (en el caso de las bibliotecas constreñidas de péptidos).

-

aproximadamente 20 nucleótidos en dirección aguas abajo desde el primer codón de iniciación, complementarios a la secuencia codificadora correspondiente al gen A de P2.

Los cebadores deben ser sintetizados a medida o se deben obtener procedentes de BiO.

C. Un cebador de PCR para la región del promotor de T7 (BiO).

D. Un cebador de PCR para la región del terminador de T7 (en sentido contrario al de las agujas del reloj) (BiO).

E. Una diana unida a un soporte sólido. A conveniencia, esto se puede realizar usando una diana biotinilada y uniendo esta diana a estreptavidina o avidina dispuesta sobre un soporte sólido. Como alternativa, la propia avidina puede ser la "diana" si se buscan péptidos que se unen a avidina. Streptavidina unida a pocillos de microtitulación o estraptavidina unida a partículas magnéticas o Avidin-Resin se puede adquirir procedente de Dynal (Noruega) o Promega (EE.UU.), respectivamente.

F. Un extracto S30 de T7 correspondiente a la transcripción/traducción acopladas in vitro de moldes lineales se puede obtener procedente de Promega (EE.UU.)

* El resto del material necesario es material considerado estándar por toda persona que trabaje con técnicas de biología molecular.

Métodos

1. Comenzando con un plásmido o de un fragmento de PCR según se ha mencionado en el apartado A, se realiza una PCR lineal añadiendo el cebador de la biblioteca mencionado en el apartado B. El montaje exacto de esta reacción es dependiente del cebador y las mismas consideraciones que se aplican a una PCR o a una secuenciación por ciclos también se aplican en este caso. Esto generará una biblioteca de hasta de 10^{12} a 10^{13} moléculas, dependiendo de la efectividad de la PCR. Para evitar una competición entre cebadores en la etapa siguiente, los cebadores de la biblioteca restantes se deben retirar preferiblemente en este momento mediante el uso de una columna de Centricon-100 (Amicon).

2. Para amplificar este material, se realizan 5-7 ciclos de PCR con los cebadores de los apartados C y D. Esta PCR se realiza usando el DNA extendido por el cebador de la biblioteca, separado en cinco partes alícuotas.

3. Una porción del material procedente de la biblioteca generada (ex. una quinta parte) se añade a un extracto S30 para fragmentos lineales que contiene RNA-polimerasa de T7 (F), según se describe en el manual de Promega. La reacción se incuba durante 30-60 min a 37ºC y después se detiene colocando el tubo(s) en hielo.

4. La diana va unida directamente a un soporte sólido por medio del sistema de biotina-estreptavidina. La avidina acoplada a la matriz Resin o a bolitas magnéticas de estreptavidina se puede obtener comercialmente procedente de Promega y Dynal respectivamente.

5. El extracto S30 se diluye en proporción 1:10 en el tampón de unión conveniente (Sambrook y col. (1989), en Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.), y la biblioteca de péptidos en el extracto S30 se deja interaccionar con la diana durante 1-3 horas (o durante toda la noche). Los compuestos no unidos se retiran mediante lavados 5X con PBS 1X + Tween-20 (Sigma) al 0,5% durante 5 minutos. El complejo unido péptido-proteína A-DNA se eluye de la diana con el diluyente conveniente, por ejemplo biotina si la diana es avidina y se busca un péptido de unión a avidina. También se puede realizar una elución con dH_{2}O hirviente para desprender el complejo de la diana y desprender simultáneamente el material genético del material no genético.

6. El DNA eluido se concentra antes de entrar en la siguiente ronda de PCR. Esto se realiza de la manera más conveniente usando una columna Centricon-100 y siguiendo las recomendaciones del fabricante. El volumen final del DNA eluido es 50 \mul. Como alternativa, el complejo se puede purificar antes de la PCR sin separación del material genético y del material no genético.

7. Se prepara una nueva reacción de PCR usando los cebadores de los apartados C y D con 30-40 ciclos.

8. El procedimiento completo desde la etapa 3 hasta la etapa 7 se realiza de nuevo de cuatro a cinco veces.

9. Después del último ciclo de elución y PCR los fragmentos necesitan ser clonados con el fin de aislar y estudiar los fragmentos individuales para determinar sus secuencias. Esto se realiza digiriendo el fragmento de la última PCR con XbaI y BamHI y ligando el resultado al vector pET-3a (Novagene) (A) digerido con las mismas enzi-
mas.

10. El vector ligado se utiliza luego para transformar E. coli. Debido a que hay muchas copias de la misma secuencia, la eficiencia de la transformación no es crítica.

11. Se escogen los clones individuales y el DNA plasmídico se aísla mediante protocolos estándar. Se realiza una ronda final con el extracto S30 y selección (etapas de 3 a 7) para prevenir la presencia de compuestos de unión que solamente actúan de manera cooperativa (junto con otros compuestos de unión).

12. El producto de la última PCR se secuencia a lo largo de la región variable, y se obtiene una secuencia consenso. Con el fin de obtener una buena secuencia consenso, se deben secuenciar hasta 50 clones.

13. La secuencia peptídica deducida se sintetiza y se somete a ensayos independientes con respecto a sus propiedades de unión.

Ejemplo 2

Se obtiene una población de la biblioteca usando un cebador de bases aleatorizadas para la amplificación del gen A. El módulo de presentación que corresponde a aproximadamente 3.000 pares de bases se muestra de manera esquemática de la siguiente manera en el caso del plásmido pEE709 linearizado (el gen A insertado en pET8C = pET3d en el sitio NcoI después de rellenar).

1

En el que:

T7p = promotor \diameter10 de T7

T7t = terminador de T7

RBS = sitio de unión al ribosoma

AUG = codón de iniciación para la proteína A

A = proteína A

P = péptido/proteína presentado

B = cebador de la cadena de la biblioteca que contiene una secuencia aleatoria (L) según se ha definido en el Ejemplo 1

C = cebador de PCR (T7p)

D = cebador de PCR (T7t)

En el diagrama anterior el inserto del gen A comienza con GCC (el segundo codón) y finaliza con GCA (bases 3.427-3.429). (Véase la secuencia de DNA de Liu y col., 1993, supra).

Los cebadores usados en el Ejemplo son de la siguiente manera:

2

1. Generación de una biblioteca de péptidos

Una población de fragmentos de DNA con un grupo SET de bases aleatorizadas se obtiene de la siguiente manera:

Se realiza una amplificación lineal (o extensión del cebador) sobre el plásmido pEE709) linearizado (HindIII) con el cebador B de la biblioteca. La mezcla de reacción de 100 \mul contiene: 0,3 \mug de DNA plasmídico (aproximadamente 6 x 10^{10} moléculas o 0,1 pmoles), 5 \mug de DNA cebador de la biblioteca (aproximadamente 7 x 10^{13} moléculas o 125 pmoles) y el resto de los componentes como los que se describen para la reacción de PCR más adelante. La mezcla se somete a 5 ciclos de PCR como se describe más adelante. El cebador de la biblioteca se retira preferiblemente usando Centricon-100. El DNA extendido del cebador de la biblioteca (biblioteca) se diluye y se subdivide en cinco partes alícuotas de 100 \mul (volumen final) y se somete a una PCR limitada (5 ciclos) usando los cebadores C y D. Cada una de las mezclas de reacción contiene: 0,6 \mug de DNA de cebador de la biblioteca extendido, 125 pmoles de los respectivos cebadores C y D, un concentración 0,2 mM de cada uno de los dNTP, KCl 50 mM, MgCl_{2} 4 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 9,0 a 25ºC), Tritón X-100 al 0,1% y 2,5 U de Taq-DNA-polimerasa (Promega) en un volumen final de 100 \mul. La mezcla se somete a 35 ciclos de 1 minuto a 94ºC, 2 minutos a 42ºC y 3 minutos a 72ºC en un termociclador (Perkin Elmer modelo PCR1000). El producto de la PCR se purifica mediante la retirada de los cebadores (Centricon-100) tratamiento con fenol y precipitación en etanol. En este punto la biblioteca debe comprender de 10^{12} a 10^{13} moléculas de DNA.

Una estrategia alternativa para generar la biblioteca sería simplemente ejecutar ciclos de PCR sobre el fragmento de DNA del vector usando los cebadores B y D de la biblioteca para dirigir la PCR.

2. Traducción in vitro y escrutinio de un péptido de unión a avidina

A. Una mezcla de extracto S30 de T7 y de extracto S30 para moldes lineales, de Promega, se usa para una transcripción/traducción acopladas de moldes de DNA lineales. La transcripción del gen A está dirigida por la RNA-polimerasa de T7 desde el promotor \diameter10 de T7. Uno de los cinco grupos de la biblioteca de DNA, que se ha tratado con fenol y precipitado en etanol, se resuspende en 9 \mul de agua destilada. A este volumen se añaden los componentes (5 \mul de la mezcla de aminoácidos, 20 \mul de la pre-mezcla de S30, 1 \mul de S30 de T7 y 15 \mul de S30 para moldes lineales) del protocolo que utiliza S30 (Promega) hasta constituir un volumen final de 50 \mul. El procedimiento de transcripción/traducción acopladas se deja que tenga lugar durante 60 minutos (o durante el tiempo que se requiera) a 37ºC.

B. La mezcla de reacción (50 \mul) se añade a 50 \mul de SoftLink Avidin Resin (Promega) y se deja que se mezclen durante 2 horas a temperatura ambiente para el revestimiento de la superficie (del inglés, "panning") con los péptidos que se unen a Avidina. La Resina se sedimenta por centrifugación (10.000 rev/min durante 5 minutos) y se lava (cinco veces con PBS, Na_{2}HPO_{4} 20 mM, NaCl 100 mM, pH 7,5). Los compuestos potenciales de unión a avidina se eluyen con biotina 5 mM o simplemente sometiendo el complejo avidina-Resina completo a una PCR con los cebadores C y D según se ha descrito en el apartado 1A. El producto de la PCR se separa de la avidina-Resina por centrifugación, se trata con fenol y se precipita en etanol antes de ser sometido a un nuevo ciclo de transcripción/traducción acopladas y de revestimiento de una superficie. Los ciclos de presentación de péptidos y revestimiento de una superficie se pueden repetir hasta que se alcanza el enriquecimiento en péptidos previsto. Se pueden usar anticuerpos policlonales específicos para proteína A, para vigilar la presencia y el aumento de la proteína A de soporte durante el revestimiento de la superficie. Después de la cuarta ronda de revestimiento de una superficie, el producto final de la PCR se corta con las enzimas de restricción XbaI y BamHI y se inserta en pET-3a (cortado con las mismas enzimas) mediante una ligación. Después de las transformaciones, las colonias individuales se aíslan y los plásmidos se extraen para la determinación de la secuencia del inserto con el fin de obtener la secuencia de aminoácidos del péptido.

Ejemplo 3

Se prepara una biblioteca de péptidos y se somete a escrutinio según se describe en el Ejemplo 2, pero antes de la traducción (etapa 2), las moléculas de DNA se purifican y luego se circularizan con la DNA-ligasa de T4 (New England Biolabs), conforme a las instrucciones del fabricante y de acuerdo con protocolos estándar (véase Sambrook, 1989, supra).

En este caso, no es necesario mantener condiciones de hibridación durante el escrutinio y éste se puede por lo tanto realizar, por ejemplo, en Tritón X-100 al 1%, KOAc 0,5 M o en Tritón X-100 al 1%, NaCl 350 mM, glicerol al 5%, que son condiciones adecuadas de escrutinio en el caso de la heterodimerización de receptores SRP, o en Tritón X-100 al 1%, urea 2 M, NaCl 100 mM, Tris-HCl 50 mM, pH 5 o en Tritón X-100 al 1%, SDS al 0,1%, NaCl 100 mM, Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, condiciones que son adecuadas para el escrutinio de interacciones de antígeno:anticuerpo.

Ejemplo 4 Demostración de la acción en cis in vitro de la proteína A de iniciación a la replicación del DNA de P2

Experimento 1

Una cantidad igual de DNA de dos plásmidos que portan el gen A de P2 (pEE709; también porta un gen de resistencia a amp, Liu y Hagg\ring{a}rd-Ljungquist, 1994, supra) y el gen A de P2 fusionado a una extensión de seis histidinas justo en el extremo N-terminal de A (pEE711; también porta un gen de resistencia a amp, Liu y Hagg\ring{a}rd-Ljungquist, 1994, supra), se sometieron a una reacción de transcripción/traducción acopladas en un extracto S30-T7 (Promega, EE.UU.). La presencia de la extensión de histidina transforma la proteína A en una proteína de unión a Ni. Por lo tanto el plásmido pEE711 que expresa His::A debe unirse de manera selectiva a un soporte sólido que contenga Ni si la proteína A está actuando en cis en el extracto S30-T7.

En las dos construcciones de estos plásmidos, la construcción del gen A está bajo el control del promotor \diameter10 del fago T7. Después de la traducción se determinó el grado de unión a una columna que contiene Ni.

Materiales y métodos

Un microgramo del DNA del plásmido pEE709 y del plásmido pEE711 respectivamente se añadieron al kit del extracto de transcripción/traducción acopladas (20 \mul de pre-mezcla para S30, 5 \mul de la mezcla de aminoácidos y 15 \mul del sistema del extracto S30 de T7 en E. coli para DNA circular, (Promega, EE.UU.). Se dejó que la transcripción/traducción tuviera lugar durante 60 minutos a 37ºC. La mezcla que contiene el extracto se diluyó 12 veces en tampón de lavado (Qiagen; Tampón 11 - fosfato sódico 50 mM pH 8,0, NaCl 300 mM, imidazol 20 mM, PMSF 1 mM) y se sometió a una selección con Ni mediante adición a una columna para centrifugación que contiene Ni-NTA (Qiagen, Alemania) equilibrada con el Tampón 1 (fosfato sódico 50 mM pH 8,0, NaCl 300 mM, imidazol 20 mM) en condiciones no desnaturalizantes. El lavado se realizó tres veces con 600 \mul de Tampón 11 y la elución se realizó dos veces con 250 \mul de Tampón 111 (fosfato sódico 50 mM pH 8,0, NaCl 300 mM, imidazol 250 mM) según lo recomendado por el fabricante (véase el protocolo del kit Ni-NTA Spin, Qiagen, Alemania, primavera de 1994). Se utilizó una centrífuga de mesa estándar para centrifugar las columnas que contienen Ni durante 2 minutos a 2.000 rpm durante los lavados y la elución. Células competentes JM109 de alta eficiencia (Promega, EE.UU.) se transformaron con una porción del eluyente y se les asignó una puntuación con respecto a las colonias resistentes a ampicilina. Los plásmidos de las colonias individuales se aislaron y se caracterizó su tipo mediante electroforesis en gel de agarosa.

Para determinar la distribución (proporción) de los tipos de plásmido en el eluyente, la presencia de los plásmidos se midió mediante la transformación de la cepa JM 109 (Promega) con respecto a la resistencia a amp. Se escogieron las colonias y se analizaron con respecto al tipo de plásmido que presentaban (diferenciados por tamaño) después de la extracción de los plásmidos seguida de electroforesis en gel de agarosa. También se determinó la proporción de pEE711 (His::A) con respecto a pEE709 (A) en ausencia de la selección en la columna que contiene Ni.

Resultados

Los resultados que se obtuvieron se muestran en la Tabla de abajo:

\begin{minipage}[t]{47mm} Proporción de plásmidos que portan His:A/A en ausencia de la selección con Ni\end{minipage}	\begin{minipage}[t]{47mm} Proporción de plásmidos que portan His:A/A después de la selección con Ni (media de 4 experimentos)\end{minipage}	\begin{minipage}[t]{48mm} Enriquecimiento del plásmido que porta His:A en comparación con el plásmido que porta A después de la selección con Ni\end{minipage}
0,7	9,3	13,3

Experimento 2

En el segundo experimento, dos nuevas construcciones de plásmidos, pEN21 (una construcción que porta el gen A con un gen de resistencia a amp, véase la Figura 1) y pEN24 (una construcción que porta His::gen A con una etiqueta de seis residuos de histidina y un gen de resistencia a kanamicina, véase la Figura 1) se sometieron al mismo tipo de experimento que el anterior experimento 1, con las modificaciones que se indican en la sección de materiales y métodos más adelante. Utilizando esta resistencia diferencial a antibióticos es posible asignar una puntuación a los tipos individuales de plásmidos directamente como colonias bacterianas.

Materiales y métodos

Los plásmidos pEN21 y pEN24 derivan de pET21a y de pET24a (Novagen Inc. EE.UU.). Los vectores pET21a y pET24a difieren únicamente su marcador seleccionable (resistencia a ampicilina y a kanamicina respectivamente). Los plásmidos pEN21 y pEN24 se construyeron mediante cortes de restricción de pEE709 y pEE711 con XbaI y BlpI que corta OUT OF del gen A y de regiones flanqueantes. pET21a y pET24a se cortaron con las mismas enzimas de restricción. Los fragmentos que portan el gen A y fragmentos de los nuevos vectores se aislaron en un gel de agarosa después de una electroforesis, mediante el uso de columnas SpinBind (FMC). El fragmento que porta A procedente de pEE709 se clonó en el vector pET21a y el fragmento que porta His-A se clonó en el vector pET24a.

Los plásmidos se incubaron durante 30 minutos en los extractos S30 y a los tipos de plásmidos se les asignó una puntuación mediante su resistencia diferencial a antibióticos utilizando placas con ampicilina (pEN21) y kanamicina (pEN24) después de la transformación de la cepa BK2118 de E. coli por electroporación. El tampón 11 se modificó en este caso para que contuviera imidazol 1 mM en lugar de imidazol 20 mM y se omitió el inhibidor de proteasas PMSF, y se denominó tampón 11*). La columna para centrifugación que contiene Ni-NTA se equilibró con tampón de lavado (Tampón 11*, condiciones no desnaturalizantes). Los lavados se realizaron tres veces con 600 \mul de Tampón 11* y la elución se realizó dos veces con 250 \mul de Tampón 111 de la manera recomendada por el fabricante (véase el protocolo del kit Ni-NTA Spin, Qiagen, Alemania, primavera de 1994). Una mezcla de los plásmidos, de cantidades iguales de DNA de pEN21 y pEN24, que no se había expuestos al extracto S30, se sometió a la selección con Ni como control.

Resultados

Los resultados se muestran en la Tabla que viene a continuación.

\begin{minipage}[t]{47mm} Proporción de los plásmidos que portan His:A/A en el extracto antes de la selección con Ni (media de 10 experimentos)\end{minipage}	\begin{minipage}[t]{47mm} Proporción de los plásmidos que portan His:A/A después de la selección con Ni (media de 10 experimentos)\end{minipage}	\begin{minipage}[t]{48mm} Enriquecimiento del plásmido que porta His:A en comparación con el plásmido que porta A después de la selección con Ni\end{minipage}
0,5	3,4	6,8

En el caso en el que el extracto S30 se omitió y la mezcla de plásmidos puros se sometió a la columna que contiene Ni, no se observó enriquecimiento.

Conclusiones

Como era de esperar, en todos los experimentos la proporción de los plásmidos His:A/A en ausencia de la selección con Ni fue aproximadamente 1. En contraste, la proporción de los plásmidos His::A (A después de la selección con Ni (aproximadamente 9,3 y 3,4) produjo un enriquecimiento de los plásmidos His::A de aproximadamente 13 y 7 respectivamente. Para determinar si estas cifras demuestran una eficiente acción en cis de la proteína A de P2 etiquetada con HIS in vitro, es necesario comparar estos valores de enriquecimiento con el enriquecimiento que podría obtenerse teóricamente usando las condiciones experimentales anteriormente empleadas. Para permitir hacer una comparación de los datos experimentales con los valores teóricos, se midió el fondo inespecífico en las fracciones eluyentes y se estimó la cantidad de His::A sintetizada en la reacción de transcripción/traducción. El fondo inespecífico que queda en las muestras se midió realizando una selección en una columna que contiene níquel sobre los plásmidos sin traducción en el lisado de E. coli. Un tercio del eluyente se utilizó para transformar E. coli y se hizo el recuento de las colonias resultantes. Usando la eficiencia de transformación medida en las células de E. coli utilizadas, se calculó luego que el eluyente contiene 0,3 fmoles de cada uno de los plásmidos en ausencia de proteína A de P2 etiquetada con His.

Se estima que aproximadamente 5 fmoles (3 x 10^{9} moléculas) de proteína A se sintetizaron en la reacción estándar. Suponiendo por lo tanto que todas las moléculas de His::A sintetizadas estaban unidas a una molécula de DNA codificador, el enriquecimiento obtenido sería (5 + 0,3)/0,3 = 18. El enriquecimiento medio obtenido en los dos experimentos fue (13 + 7)/2 = 10. Por lo tanto, se interpreta que estos resultados indican que la proteína A de P2 es capaz de actuar eficientemente en cis in vitro, así como de presentar una extensión de seis histidinas fusionadas justo en su extremo N-terminal. A pesar de la escasa eficiencia de la traducción en los presentes experimentos, se espera que se puede obtener una biblioteca de 10^{12} miembros. Se prevé además que lavados adicionales o más enérgicos mejorarán el enriquecimiento, ayudando con ello a la producción de las bibliotecas de la invención.

Experimento 5

Se prepararon moléculas de DNA para ser utilizadas en la expresión de una biblioteca de péptidos de la invención.

Materiales y métodos

Se prepararon moléculas de DNA para ser utilizadas en la expresión de una biblioteca de presentación de péptidos in vitro, por medio de la amplificación del gen A procedente del plásmido pEN21 linearizado (véase la Figura 1 y el Ejemplo 4) usando los siguientes cebadores:

3

[144 nucleótidos, con una región de 30 bases aleatorizadas y un sitio único XbaI (letras minúsculas), que corresponde al cebador B del Ejemplo 2 con la adición de 9 nucleótidos en 5'].

4

[Cebador de 40 bases, complementario al área en dirección aguas arriba del plásmido pEN21, que cubre el promotor de T7 así como bases en dirección aguas arriba del promotor de T7, que corresponde al cebador C del Ejemplo 2 con la adición de 15 nucleótidos en 5'].

D: 5' CAA AAA ACC CCT CAA GAC CCG 3'

[Cebador de 21 bases, complementario a una secuencia en dirección aguas abajo del terminador de T7, y que corresponde al cebador D del Ejemplo 2].

Los cebadores se sintetizaron en un sintetizador de DNA/RNA Applied Biosystems 394 y se comprobaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida. El cebador de la biblioteca manifestó heterogeneidad en el gel debido a su naturaleza aleatorizada.

Los cebadores B y D se usaron para preparar las moléculas de DNA de la biblioteca en una reacción de PCR (realizada de manera similar a la reacción de PCR descrita en el Ejemplo 2) usando 5 \mul de tampón para polimerasa (Tampón Vent pol. 10X, New England Biolabs), 50 pmoles del cebador B, 20 pmoles del cebador D, 10 ng de DNA molde (pEN21), 1 \mul de mezcla de los dNTP (10 mM, New England Biolabs), 1 \mul de Deep Vent polymerase (New England Biolabs), todo ello en un volumen total de 50 \mul, con un arranque en caliente a 94ºC durante 5 minutos, una temperatura de reasociación de 55ºC durante 30 segundos (reasociaciones posteriores a 58ºC durante 2 minutos), una temperatura de polimerización de 74ºC durante 2 minutos (polimerizaciones posteriores a 74ºC durante 7 minutos) durante 25 rondas.

El cebador C se usa para amplificar de nuevo la biblioteca (y retirar las moléculas de los heterodúplex) en ausencia del cebador B de la biblioteca. Es aconsejable retirar el cebador B mediante purificación antes de esta etapa de amplificación.

Resultados

Se produjo un módulo de presentación de DNA de aproximadamente 3.000 pares de bases con una secuencia aleatorizada de 30 bases en el extremo 5' del gen A (detrás del codón de iniciación ATG). El producto de PCR que constituye la biblioteca se muestra en la Figura 2.

Claims (18)

1. Un método para producir una biblioteca de expresión de péptidos o proteínas, que presenta una población diversa de péptidos o proteínas, en la que los péptidos o proteínas están asociados de manera específica con el DNA que los codifica a través de uniones covalentes proteína:DNA, comprendiendo dicho método al menos las etapas de:

1) preparar una biblioteca genética amplificable de moléculas de DNA que contienen:

(i)

una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos, en la que la secuencia de aminoácidos se une de manera específica a la secuencia que la codifica a través de uniones covalentes proteína:DNA (resto de unión), y

(ii)

una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que va a ser presentada (resto de presentación), y

2) expresar la biblioteca genética así formada, en la que dicha molécula de DNA cuando se expresa produce un producto resultante de la traducción que contiene el resto de presentación y el resto de unión, y en la que dicha molécula de DNA contiene al menos un sitio de unión para el resto de unión.

2. Un método según la reivindicación 1, en el que la expresión del material genético es una expresión celular in vitro con un único miembro de la biblioteca, opcionalmente presente en más de una copia, expresado por una célula hospedadora o un organismo hospedador.

3. Un método según la reivindicación 1, en el que dicha secuencia de aminoácidos que se une de manera específica a la secuencia que la codifica, es una proteína que actúa en cis, que interacciona in vitro con la secuencia de DNA que la codifica y que establece un enlace covalente con su propio DNA molde, y la expresión del material genético es una expresión celular in vitro con al menos un único miembro de la biblioteca, opcionalmente presente en más de una copia, expresado por célula hospedadora u organismo hospedador.

4. Un método según la reivindicación 1, en el que dicha secuencia de aminoácidos que se une a la secuencia que la codifica, deriva de una proteína que actúa en cis, que interacciona in vitro con la secuencia de DNA que la codifica y que establece un enlace covalente con su propio DNA molde, y la expresión del material genético es una expresión in vitro en un extracto libre de células.

5. Un método según la reivindicación 3 ó 4, en el que dicha proteína que actúa en cis es la proteína A del bacteriófago P2 (P2 A).

6. Un método según la reivindicación 4 ó 5, en el que dicha expresión se realiza en presencia de un oligonucleótido con desapareamientos que se hibrida con el DNA adyacente al sitio de unión por ambos lados pero que no se hibrida en la región que corresponde al sitio de unión.

7. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 6, en el que dicha secuencia de aminoácidos que va a ser presentada tiene hasta 40 residuos de aminoácidos.

8. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 7, en el que dicha secuencia de aminoácidos que va a ser presentada se genera por clonación, o comprende fragmentos de DNA procedentes de una clonación.

9. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 8, en el que dicho resto de unión se modifica de manera que el resto de unión queda unido covalentemente a dicho DNA codificador.

10. Un método según la reivindicación 9, en el que dicho resto de unión deriva de la proteína A del bacteriófago P2 (P2 A), que se ha modificado sustituyendo la tirosina situada en la posición del aminoácido 450 con fenilalanina.

11. Una biblioteca de expresión de péptidos in vitro, producida conforme al método de una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 10.

12. Una molécula de DNA que contiene una secuencia de DNA que codifica un péptido o una proteína para su expresión en una biblioteca conforme a la reivindicación 11, que contiene:

(i) una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos, en la que la secuencia de aminoácidos se une de manera específica a la secuencia que la codifica a través de uniones covalentes proteína:DNA (resto de unión), y

(ii) una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que va a ser presentada (resto de presentación), en la que dicha molécula de DNA cuando se expresa produce un producto de la traducción que contiene el resto de presentación y el resto de unión, y en la que dicha molécula de DNA contiene al menos un sitio de unión para el resto de unión.

13. Un vector de DNA que contiene una secuencia de DNA según la reivindicación 12.

14. Un método para identificar y/o purificar un miembro de una biblioteca que exhibe propiedades deseadas, en una biblioteca de expresión de péptidos o proteínas como la definida en la reivindicación 11, que comprende al menos las etapas de a) someter a escrutinio una biblioteca como la definida en la reivindicación 11, y b) seleccionar y aislar el miembro relevante de la biblioteca.

15. Un método para identificar un péptido o una proteína de unión específica a una diana, comprendiendo dicho método al menos las etapas de a) someter a escrutinio una biblioteca según la reivindicación 11 con moléculas diana, b) seleccionar y aislar un miembro de la biblioteca que se une a dicha molécula diana, y c) aislar el péptido o la proteína que se une de manera específica a dicha molécula diana.

16. Un método según la reivindicación 15, en el que de manera adicional se aísla el DNA que expresa el péptido o la proteína que se une de manera específica a dicha molécula diana.

17. Un método de ensayo para determinar la presencia de una molécula diana en una muestra, comprendiendo dicho método (a) poner en contacto dicha muestra con una sonda molecular que comprende (i) un resto de unión a la diana contenido en un péptido o en una proteína, capaz de unirse de manera selectiva a dicha molécula diana, que está unido al DNA codificador, el resto de DNA, seleccionado en la biblioteca según la reivindicación 11, y (ii) un resto de reporte; y (b) determinar directa o indirectamente diana unida a la sonda.

18. Una sonda molecular bifuncional para usar en el método de ensayo según la reivindicación 17, que comprende (i) un resto de un péptido o de una proteína capaz de unirse selectivamente a una molécula diana, que está unido al DNA codificador, el resto de DNA, seleccionado en la biblioteca según la reivindicación 11, y (ii) un resto de reporte.