ES2243393T3 - Monitorizacion de la hibridacion durante la pcr. - Google Patents

Monitorizacion de la hibridacion durante la pcr.

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ES2243393T3
ES2243393T3 ES01203467T ES01203467T ES2243393T3 ES 2243393 T3 ES2243393 T3 ES 2243393T3 ES 01203467 T ES01203467 T ES 01203467T ES 01203467 T ES01203467 T ES 01203467T ES 2243393 T3 ES2243393 T3 ES 2243393T3
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Carl T. Wittwer
Kirk M. Ririe
Randy P. Rasmussen
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Abstract

Método de monitorización a tiempo real de la amplificación de una secuencia de ácidos nucleicos diana en una muestra biológica, comprendiendo dicho método las etapas de: la amplificación de la secuencia objetivo por la reacción en cadena de la polimerasa en presencia de una cantidad de SYBR¿ Green I, comprendiendo dicha reacción en cadena de la polimerasa las etapas de adición a la muestra biológica de SYBR¿ Green I, una polimerasa termoestable y cebadores para la secuencia de ácidos nucleicos diana para crear una mezcla de amplificación y el ciclado térmico de la mezcla de amplificación entre, como mínimo, una temperatura de desnaturalización y una temperatura de elongación durante un conjunto de ciclos de amplificación; y la iluminación de la mezcla con una luz a una longitud de onda absorbida por el SYBR¿ Green I en, como mínimo, una parte del conjunto de ciclos de amplificación, y la detección de una emisión fluorescente del SYBR¿ Green I tras la iluminación de la muestra, estando relacionada dicha emisión fluorescente con la cantidad de ácido nucleico diana amplificado en la muestra, o bien, la iluminación de la muestra con una luz a una longitud de onda absorbida por el SYBR¿ Green I posterior a, como mínimo, una parte del conjunto de ciclos de amplificación, y la monitorización de la emisión fluorescente del SYBR¿ Green I en la muestra en función de la temperatura de la muestra para generar una curva de fusión para la secuencia diana amplificada.

Description

Monitorización de la hibridación durante la PCR.
Esta Solicitud Europea es una división de la solicitud de la EP 97931089.
La presente invención se refiere, en general, a la observación de señales de fluorescencia que resultan de la hibridación conjuntamente con la reacción en cadena de la polimerasa. Más específicamente, la presente invención se refiere a la observación de la hibridación con fluorescencia durante y/o inmediatamente después de la PCR y la utilización de esta información para la identificación, la detección de alteraciones de secuencias, y la cuantificación del producto.
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es fundamental para la biología molecular y es la primera técnica molecular práctica para el laboratorio clínico. A pesar de su utilidad y popularidad, la comprensión actual de la PCR no está muy avanzada. Las condiciones adecuadas para amplificaciones satisfactorias se deben encontrar mediante prueba y error y la optimización es empírica. Incluso los entendidos en la materia necesitan utilizar una técnica potente sin una teoría explicativa o predictiva del proceso.
La PCR se consigue mediante el ciclado de temperaturas de la muestra, que provoca la desnaturalización (separación) del ADN, la unión (fijación) de cebadores específicos, y la existencia (extensión) de replicación. Un ciclo de la PCR se realiza habitualmente entre 2 y 8 minutos, requiriendo de 1 a 4 horas para una amplificación de 30 ciclos. La respuesta de la temperatura de la muestra en la mayoría de la instrumentación para PCR es muy lenta en comparación con los tiempos necesarios para la desnaturalización, fijación y extensión. Las reacciones físicas (desnaturalización y fijación) y enzimáticas (extensión) en la PCR tienen lugar muy rápidamente. Los tiempos de amplificación para PCR se pueden reducir desde horas a menos de 15 minutos.
Las técnicas de ciclado rápido son posibles mediante la respuesta rápida de la temperatura y la homogeneidad de temperatura posibles para muestras en contenedores de muestras con una relación de área superficial-volumen elevada, tales como tubos capilares. Para mayor información, véanse también: C.T. Wittwer. G.B. Reed, y K.M. Ririe, Rapid cycle DNA amplification (Amplificación de ADN por ciclado rápido), en K.B. Mullis, F. Ferre, y R.A. Gibbs, The polymerase chain reaction (La reacción en cadena de la polimerasa), Birkhauser, Boston, 174-181 (1994). Una mejor homogeneidad de la temperatura permite que los requerimientos del tiempo y la temperatura de la PCR estén mejor definidos y se entiendan mejor. Una mejor homogeneidad de la temperatura también incrementa la precisión de cualquier técnica analítica utilizada para monitorizar la PCR durante la amplificación.
La fluorimetría es una técnica sensible y versátil con muchas aplicaciones en biología molecular. Durante muchos años se ha utilizado bromuro de etidio para monitorizar la distribución de tamaños de ácidos nucleicos separados por electroforesis en gel. El gel se transilumina habitualmente con luz ultravioleta y se observa la fluorescencia roja del ácido nucleico de doble cadena. Específicamente, el bromuro de etidio se utiliza normalmente para analizar los productos de la PCR después de completar la amplificación. Además, la patente EPA 0 640 828 A1 de Higuchi y Watson da a conocer la utilización de bromuro de etidio durante la amplificación para monitorizar la cantidad de ADN de doble cadena mediante la medición de la fluorescencia en cada ciclo. Se observó que la intensidad de la fluorescencia aumentaba y disminuía inversamente con la temperatura, era máxima a la temperatura de fijación/extensión (50ºC), y mínima a la temperatura de desnaturalización (94ºC). En cada ciclo se obtuvo la máxima fluorescencia como una medida de la cantidad de ADN. La aplicación de Higuchi y Watson no enseña la utilización de la fluorescencia para monitorizar las hibridaciones, ni sugiere la medición de fluorescencia a diferentes temperaturas para seguir la extensión de la hibridación. Además, Higuchi y Watson no enseñan ni sugieren la utilización de la dependencia con la temperatura de la hibridación del producto de la PCR para la identificación o cuantificación de productos de la PCR.
Sin embargo, la aplicación de Higuchi y Watson no menciona la utilización de otros fluoróforos, que incluyen sistemas de sondas doblemente marcadas que generan fluorescencia cuando se hidrolizan mediante la actividad de la 5'-exonucleasa de ciertas polimerasas de ADN, tal como se da a conocer en la Patente de Estados Unidos No. 5.210.015 de Gelfand y otros. La fluorescencia observada a partir de estas sondas depende, principalmente, de la hidrólisis de la sonda entre sus dos fluoróforos. La cantidad de producto de la PCR se estima mediante la medición de la fluorescencia una vez por ciclo. A pesar de que la hibridación de estas sondas parece que es necesaria para que tenga lugar la hidrólisis, la señal de fluorescencia surge, principalmente, de la hidrólisis de las sondas, sin hibridación, en la que una sonda de oligonucleótidos con colorantes fluorescentes en los extremos opuestos del mismo proporciona un sistema de sondas de inhibición útiles para detectar el producto de PCR y la hibridación de ácido nucleico. K.J. Livak y otros, 4 PCR Math. Appl. 357-362 (1995). No se sugiere el seguimiento de la dependencia de la temperatura de la hibridación de la sonda con fluorescencia para identificar las alteraciones de las secuencias en productos de la PCR.
Se ha explotado en muy diferentes formatos la hibridación específica de un ácido nucleico a una cadena complementaria para la identificación. Por ejemplo, después de la digestión de la enzima de restricción, el ADN genómico se puede fraccionar por tamaño e hibridar a sondas mediante una transferencia Southern. Como ejemplo adicional, se pueden detectar mutaciones de bases únicas mediante "transferencias de puntos" con oligonucleótidos específicos de alelo. Habitualmente, la hibridación se realiza durante minutos a horas a una temperatura única para conseguir la discriminación necesaria. Alternativamente, la extensión de la hibridación se puede monitorizar de forma dinámica mientras cambia la temperatura mediante técnicas de fluorescencia. Por ejemplo, para monitorizar la hibridación se han utilizado curvas de fusión por fluorescencia. L.E. Morrison y L.M. Stols, Sensitive fluorescence-based thermodynamic and kinetic measurements of DNA hybridization in solution (Mediciones cinéticas y termodinámicas basadas en la sensibilidad a la fluorescencia de la hibridación de ADN en solución), 32 Biochemistry 3095-3104, 1993). Las velocidades de barrido de temperatura son, habitualmente, de 10ºC/hora o inferior, en parte debido a la elevada masa térmica de la cubeta del fluorímetro.
Los métodos actuales para monitorizar la hibridación requieren mucho tiempo. Si la hibridación se pudiera seguir en segundos en lugar de horas, la hibridación se podría monitorizar durante la amplificación por la PCR, incluso durante una PCR de ciclado rápido. Entre las muchas utilizaciones de la monitorización de la hibridación durante la PCR, tal como se describirá con detalle en la presente, se incluyen la identificación y cuantificación del producto, la detección de alteraciones en las secuencias, y el control automático de los parámetros del ciclado de temperatura mediante retroalimentación de la fluorescencia.
La técnica anterior, tal como se ha explicado anteriormente, lleva a cabo un ciclado de temperaturas de forma lenta y empírica. Cuando se necesita el análisis de los productos de la PCR por hibridación, se requieren etapas adiciones que consumen tiempo. De este modo, sería un gran avance en la técnica proporcionar métodos para monitorizar la hibridación durante la PCR y analizar la reacción mientras tiene lugar, es decir, durante o inmediatamente después del ciclado de temperaturas sin manipular la muestra. Mediante la monitorización de la hibridación durante la PCR, los principios subyacentes que permiten el funcionamiento de la PCR se pueden seguir y utilizar para analizar y optimizar la reacción durante la amplificación.
La Patente EP 0640 828A da a conocer un aparato para monitorizar simultáneamente reacciones múltiples de ácidos nucleicos. Utiliza un ciclador y sensor térmico para detectar la luz emitida en las pausas del ciclador térmico.
Un objetivo de la presente invención es proporcionar un colorante de ADN específico de doble cadena para monitorizar la hibridación del producto durante la PCR.
Otro objetivo de la presente invención es proporcionar un sistema para identificar productos amplificados por la PCR mediante curvas de fusión por fluorescencia.
Es también otro objetivo de la presente invención proporcionar un método para mejorar la sensibilidad de la cuantificación de la PCR con colorantes de ADN específico de doble cadena.
Es aún otro objetivo de la presente invención para determinar la cantidad de producto específico amplificado por la PCR mediante curvas de fusión, corregir la amplificación no específica detectada con el colorante de ADN específico de doble cadena.
Un objetivo adicional de la presente invención es proporcionar un método de cuantificación relativa de productos de la PCR diferentes con colorantes de ADN específico de doble cadena.
Es aún otro objetivo de la presente invención proporcionar un método de cuantificación del producto mediante la cinética de refijación del producto en presencia de un colorante de ADN específico de doble cadena.
Es también un objetivo de la presente invención proporcionar un método para determinar un número de copias de la plantilla inicial mediante el seguimiento de la fluorescencia de una sonda o sondas de hibridación en cada ciclo durante la amplificación por la PCR.
Un objetivo adicional de la presente invención es proporcionar un sistema para la cuantificación relativa de diferentes productos de la PCR mediante curvas de fusión de la sonda.
Es aún otro objetivo de la presente invención proporcionar métodos para determinar el número de copias de la plantilla inicial mediante el ajuste de las curvas de fluorescencia frente al número de ciclos.
Es aún otro objetivo de la presente invención proporcionar un sistema y un método para realizar la PCR, la monitorización de forma rápida y también de forma continua y el ajuste de los parámetros de la reacción mientras tiene lugar la reacción.
Otro objetivo de la presente invención es reemplazar las sondas de ácidos nucleicos por análogos o derivados sintéticos de ácidos nucleicos, por ejemplo, por ácidos nucleicos peptídicos (PNA), con la condición de que se puedan también marcar con compuestos fluorescentes.
Estos y otros objetivos y ventajas de la presente invención quedarán completamente claras a partir de la descripción y reivindicaciones que se indican a continuación, o se pueden aprender mediante la práctica de la presente invención.
La presente invención proporciona un método de monitorización a tiempo real de la amplificación de una secuencia de ácidos nucleicos diana en una muestra biológica, comprendiendo dicho método las etapas de:
la amplificación de la secuencia diana mediante la reacción en cadena de la polimerasa en presencia de una cantidad de SYBR™ Green I, comprendiendo dicha reacción en cadena de la polimerasa las etapas de adición a la muestra biológica de SYBR™ Green I, una polimerasa termoestable, y cebadores para la secuencia de ácidos nucleicos diana para crear una mezcla de amplificación y el ciclado térmico de la mezcla de amplificación entre, como mínimo, una temperatura de desnaturalización y una temperatura de elongación durante un conjunto de ciclos de amplificación; y
la iluminación de la mezcla con una luz a una longitud de onda absorbida por el SYBR™ Green I en, como mínimo, una parte del conjunto de ciclos de amplificación, y la detección de una emisión fluorescente del SYBR™ Green I tras la iluminación de la muestra, estando relacionada dicha emisión fluorescente con la cantidad de ácido nucleico diana amplificado en la muestra,
o bien, la iluminación de la muestra con una luz a una longitud de onda absorbida por el SYBR™ Green I posterior a, como mínimo, una parte del conjunto de ciclos de amplificación, y la monitorización de la emisión fluorescente del SYBR™ Green I en la muestra en función de la temperatura de la muestra para generar una curva de fusión para la secuencia diana amplificada.
La presente invención también proporciona una mezcla de reacción de la PCR para amplificar una secuencia de nucleótidos diana, comprendiendo la mezcla una muestra de ADN que tiene cebadores de oligonucleótidos de la secuencia diana en una cantidad suficiente para la amplificación por PCR, una polimerasa termoestable y SYBR™ Green I en una cantidad capaz de proporcionar una señal de fluorescencia indicativa de la concentración de la secuencia diana en dicha mezcla.
Preferiblemente, la presente invención se caracteriza por la iluminación de la mezcla con una luz a una longitud de onda absorbida por el SYBR™ Green I en, como mínimo, una parte del conjunto de ciclos de amplificación, y la detección de una emisión fluorescente del SYBR™ Green I tras la iluminación de la muestra, estando dicha emisión fluorescente relacionada con la cantidad de ácido nucleico diana amplificado en la muestra, y se caracteriza, además, por la iluminación de la muestra con una luz a una longitud de onda absorbida por el SYBR™ Green I posterior a, como mínimo, una parte del conjunto de ciclos de amplificación, y la monitorización de la emisión fluorescente del SYBR™ Green I en la muestra en función de la temperatura de la muestra para generar una curva de fusión para la secuencia diana amplificada.
El método se puede utilizar para detectar una secuencia de ácidos nucleicos diana en una muestra biológica durante la amplificación utilizando un perfil rápido de ciclos de temperatura.
Preferiblemente, el perfil de ciclos de temperatura tiene una duración inferior a 2 minutos. Para generar una curva de fusión, la muestra se ilumina y se detecta la fluorescencia a medida que se incrementa la temperatura.
La presente invención, particularmente, disminuye el tiempo total necesario para la amplificación y análisis por la PCR respecto a técnicas anteriores, mientras que al mismo tiempo, se permite la opción de incrementar significativamente la calidad de la reacción mediante la optimización de las condiciones de amplificación.
La presente invención proporciona métodos y aplicaciones para una monitorización continua de la fluorescencia de la amplificación del ADN. La instrumentación requerida combina componentes ópticos con estructuras para proporcionar un ciclado rápido de temperaturas para monitorizar de forma continua la amplificación del ADN mediante un conjunto de diferentes técnicas de fluorescencia. En una realización ilustrativa, se adquiere fluorescencia de forma continua a partir de una única muestra o, alternativamente, a partir de muestras múltiples sobre un carrusel rotatorio, sometiendo simultáneamente todas las muestras a un ciclado térmico rápido. En las referencias de las solicitudes de patentes anteriores se puede encontrar información adicional sobre la instrumentación asociada.
Según la presente invención, se monitorizó la fluorescencia durante la amplificación del ADN mediante el colorante específico de doble cadena, SYBR Green I. Los datos de fluorescencia obtenidos una vez en cada ciclo permiten la cuantificación del número de copias de la plantilla inicial.
Además, en comparación con la medición de la fluorescencia una vez por ciclo, se dan a conocer realizaciones de la presente invención que monitorizan la temperatura, el tiempo y la fluorescencia de forma continua a través de cada ciclo, produciendo así una espiral tridimensional. Esta espiral tridimensional se puede reducir a representaciones de temperatura frente a tiempo, fluorescencia frente a tiempo, y fluorescencia frente a temperatura. Se pueden utilizar las representaciones de fluorescencia frente a temperatura de la fluorescencia de las sondas de hibridación para detectar alteraciones de las secuencias en el producto. Estas alteraciones de las secuencias pueden ser naturales, tales como en mutaciones o polimorfismos, o artificiales, tales como en una plantilla diseñada de forma alternativa para una PCR cuantitativa.
Según un aspecto preferido de la presente invención, se utiliza la monitorización de la fluorescencia para obtener las curvas de fusión del producto durante la PCR mediante la monitorización de la fluorescencia con SYBR™ Green I. La representación de la fluorescencia en función de la temperatura a medida que el ciclador térmico calienta a través de la temperatura de disociación del producto permite obtener una curva de fusión del producto de la PCR. La forma y posición de esta curva de fusión del ADN es función de la proporción GC/AT, la longitud, y la secuencia, y se puede utilizar para diferenciar productos de amplificación separados por menos de 2ºC en la temperatura de fusión. Los productos deseados se pueden distinguir de los productos no deseados, incluyendo dímeros de cebadores. El análisis de las curvas de fusión se puede utilizar para ampliar el intervalo dinámico de la PCR cuantitativa y para diferenciar productos diferentes en amplificación múltiples. Con la utilización de colorante, en cada ciclo se pueden seguir la desnaturalización, la refijación y la extensión del producto. La monitorización continua de la fluorescencia permite la obtención de curvas de fusión y curvas de fijación del producto durante el ciclado de temperaturas.
La presente invención proporciona reactivos y métodos para la PCR de ciclo rápido con amplificación y análisis combinados mediante la monitorización de la fluorescencia en menos de treinta minutos, más preferiblemente, en menos de quince minutos, y más preferiblemente, en menos de diez minutos.
Un método de monitorización en tiempo real de una amplificación por la reacción en cadena de la polimerasa de una secuencia de ácidos nucleicos diana en una muestra biológica comprende la amplificación de la secuencia diana mediante la reacción en cadena de la polimerasa en presencia de una cantidad de SYBR™ Green I, comprendiendo dicha reacción en cadena de la polimerasa las etapas de adición a la muestra biológica del SYBR™ Green I, una polimerasa termoestable, y cebadores para la secuencia de ácidos nucleicos diana para crear una mezcla de amplificación y el ciclado térmico de la mezcla de amplificación entre, como mínimo, una temperatura de desnaturalización y una temperatura de elongación durante un conjunto de ciclos de amplificación; y
la iluminación de la mezcla con una luz a una longitud de onda absorbida por el SYBR™ Green I en, como mínimo, una parte del conjunto de ciclos de amplificación, y la detección de una emisión fluorescente del SYBR™ Green I tras la iluminación de la muestra, estando relacionada dicha emisión fluorescente con la cantidad de ácido nucleico diana amplificado en la muestra,
o bien, la iluminación de la muestra con una luz a una longitud de onda absorbida por el SYBR™ Green I, posterior a, como mínimo, una parte del conjunto de ciclos de amplificación, y la monitorización de la emisión fluorescente del SYBR™ Green I en la muestra en función de la temperatura de la muestra para generar una curva de fusión para la secuencia diana amplificada.
Una mezcla de reacción de la PCR para amplificar una secuencia de nucleótidos diana comprende una muestra de ADN que tiene los cebadores de oligonucleótidos diana en una cantidad suficiente para la amplificación por PCR, una polimerasa termoestable y SYBR™ Green I en una cantidad capaz de proporcionar una señal de fluorescencia indicativa de la concentración de la secuencia diana en dicha mezcla.
Un método para analizar una secuencia de ADN diana de una muestra biológica comprende la amplificación de la secuencia diana mediante la reacción en cadena de la polimerasa en presencia de una sustancia fluorescente que se une al ácido nucleico, comprendiendo dicha reacción en cadena de la polimerasa las etapas de adición a la muestra biológica de una polimerasa termoestable y cebadores para la secuencia diana de ácidos nucleicos y el ciclado térmico de la muestra biológica entre, como mínimo, una temperatura de desnaturalización y una temperatura de elongación;
la excitación de la muestra con luz a una longitud de onda absorbida por la sustancia fluorescente que se une al ácido nucleico; y
la monitorización de la fluorescencia dependiente de la temperatura de la sustancia fluorescente que se une al ácido nucleico a medida que cambia la temperatura de la muestra, en la que la sustancia fluorescente que se une al ácido nucleico comprende un colorante fluorescente que se une al ácido nucleico de doble cadena, SYBR™ Green I.
La fluorescencia dependiente de la temperatura se puede utilizar para identificar los productos amplificados, preferiblemente, mediante el análisis de las curvas de fusión. Se pueden determinar las cantidades relativas de dos o más productos amplificados mediante el análisis de las curvas de fusión. Por ejemplo, las áreas bajo las curvas de fusión se encuentran mediante una regresión mínimo-cuadrática no lineal de la suma de gaussianos múltiples.
Breve descripción de las diferentes vistas de los dibujos
Se han eliminado las figuras originales 6-14, 16-18, 33-36 y 46-48.
Las figuras 1A y B son gráficos que representan un paradigma de la PCR de equilibrio (A) y un paradigma de la PCR cinética (B).
La figura 2 muestra fragmentos útiles de temperatura frente a tiempo para la monitorización de la hibridación por fluorescencia.
La figura 3 es una tabla de temperatura frente a tiempo ejemplificante del ciclado rápido de temperaturas para la PCR.
La figura 4 muestra los resultados de cuatro perfiles diferentes temperatura/tiempo (A-D) y sus productos de amplificación resultantes después de treinta ciclos (inserción).
Las figuras 5A, B y C muestran el mecanismo de generación de fluorescencia para tres métodos diferentes de monitorización de la fluorescencia de la PCR: (A) colorante de ADN de doble cadena, sondas de hibridación.
La figura 15 es una representación de la fluorescencia frente al número de ciclos para un número diferente de reacciones de copia de la plantilla inicial monitorizadas con SYBR™ Green I: 0, (\Delta); 1, (\sqbullet); 10, (-); 10^{2} (-); 10^{3}, (+); 10^{4}, (\bullet); 10^{5}, (\lozenge); 10^{6}, (x); 10^{7}, (\blacktriangle); 10^{8}, (\Box); 10^{9}, (\blacklozenge).
Las figuras 19A-C proporcionan una comparación de tres técnicas de monitorización de la fluorescencia para la PCR, que incluyen el colorante de ADN específico de doble cadena, SYBR™ Green I (A), una sonda de hidrólisis de fluoresceína/rodamina doblemente marcada (B), y una sonda de hibridación marcada con fluoresceína con un cebador marcado en la Cy5 (C); la figura 19D muestra el coeficiente de variación para las tres técnicas de monitorización representadas en las figuras 19A-C.
La figura 20 muestra una representación habitual del logaritmo de la fluorescencia frente al número de ciclos de una amplificación estándar monitorizada con SYBR™ Green I.
La figura 21 muestra el ajuste a una curva exponencial para los ciclos 20-27 de los datos de la figura 20.
La figura 22 muestra un ajuste exponencial en una muestra desconocida para determinar el número de copias iniciales a partir de los datos de la amplificación.
La figura 23 muestra una representación habitual de la fluorescencia frente al número de ciclos de cinco estándares monitorizados en cada ciclo con sondas de hibridación adyacentes, en la que los números de copias iniciales se representan tal como se indica a continuación: 10^{3}, (\bullet); 10^{4}, (\lozenge); 10^{5}, (\blacktriangle); 10^{6}, (\Box); 10^{7} (\blacklozenge).
La figura 24 muestra una curva ajustada a los datos estándares de la figura 23.
La figura 25 muestra una representación habitual de la fluorescencia frente al número de ciclos de cinco estándares monitorizados en cada ciclo con una sonda de hidrólisis, en la que los números de copias iniciales se representan tal como se indica a continuación: 1,5, (\bullet); 15, (\lozenge); 150, (\blacktriangle); 1500, (\Box); 15.000, (\blacklozenge).
La figura 26 muestra una curva ajustada a los datos estándares de la figura 25.
La figura 27 muestra una representación habitual del logaritmo de la fluorescencia frente al número de ciclos de tres amplificaciones estándares monitorizadas con SYBR Green I, en la que: (\sqbullet); (\bullet); (\blacktriangle).
La figura 28 muestra diferentes curvas ajustadas a los datos estándares de la figura 27.
Las figuras 29A y B muestran representaciones de (A) el tiempo frente a la fluorescencia y (B) el tiempo frente a la temperatura demostrando la relación inversa entre la temperatura y la fluorescencia.
La figura 30 es una tabla que muestra representaciones en 2 dimensiones de la temperatura frente al tiempo, la fluorescencia frente al tiempo, y la fluorescencia frente a la temperatura, también mostradas como una representación en 3 dimensiones, para la amplificación de un fragmento 180 pares de bases del genoma de la hepatitis B en presencia de SYBR Green I.
La figura 31 es una proyección de la fluorescencia frente a la temperatura para la amplificación de un fragmento de 536 pares de bases del gen de la beta-globina humana en presencia de SYBR Green I.
Las figuras 32A y B proporcionan una representación que muestra (A) un cambio lineal en la proporción de la fluorescencia con la temperatura para sondas de hidrólisis, y (B) un cambio radical con la temperatura para sondas de hibridación.
La figura 37 muestra curvas de fusión para productos amplificados por PCR del virus de la hepatitis B (\bullet; 50% GC, 180 pares de bases); beta-globina (\blacktriangle; 53,2% GC, 536 pares de bases); y antígeno específico de próstata (X; 60,3% GC, 292 pares de bases).
La figura 38 muestra curvas de fusión para el producto amplificado por PCR del virus de la hepatitis B a velocidades de calentamiento de 0,1ºC a 5,0ºC.
La figura 39 muestra curvas de fusión para el producto amplificado por PCR del virus de la hepatitis B a varias concentraciones de SYBR™ Green I.
Las figuras 40A y B muestran (A) curvas de fusión y (B) bandas fraccionadas electroforéticamente de productos de un fragmento de beta-globina amplificado con (a) sin plantilla añadida, (b) 10^{6} copias de la plantilla añadida bajo condiciones poco estrictas, y (c) 10^{6} copias de la plantilla añadida bajo condiciones más estrictas.
Las figuras 41A y B muestran (A) curvas de fusión y (B) picos de la fusión del fragmento del virus de la hepatitis B (HBV), \beta-globina, y una mezcla de los mismos.
Las figuras 42A-D muestran (A) una representación de la fluorescencia relativa frente al número de ciclos para productos amplificados por PCR de varias cantidades de plantilla de \beta-globina, (B) picos de fusión y (C) bandas electroforéticas de los diversos productos, y (D) la fluorescencia corregida de los datos de (A).
Las figuras 43A y B muestran (A) curvas de fusión y (B) picos de fusión de productos amplificados por PCR de una mezcla del gen de la fibrosis cística y el oncógeno c-erbB-2.
La figura 44 muestras los picos de fusión en varios números de ciclos para el gen de la fibrosis cística (CFTR) y el c-erbB-2 (neu).
La figura 45 muestra un gráfico de picos de fusión integrados de productos de la PCR de CFTR y neu.
La figura 49 muestra la forma de las curvas de refijación de productos amplificados de la PCR de \beta-globina de varias cantidades iniciales de plantilla.
La figura 50 muestra la determinación de una constante de velocidad de segundo orden para determinar la concentración inicial de plantilla.
La figura 51 muestra un diagrama de bloques para controlar el ciclado térmico a partir de los datos de fluorescencia.
Las figuras 52A y B muestran (A) una representación de la temperatura frente al tiempo obtenida después de 20 ciclos y (B) una representación de la fluorescencia frente al tiempo obtenida después de 25 ciclos en la que el ciclado térmico se controló a partir de los datos de fluorescencia.
En la descripción y las reivindicaciones de la presente invención, se utilizará la siguiente terminología según las definiciones establecidas posteriormente.
Tal como se utiliza en la presente, "ácido nucleico", "ADN", y términos similares que también incluyen análogos de ácidos nucleicos, es decir, análogos que tienen un esqueleto diferente a un esqueleto fosfodiéster. Por ejemplo, los denominados "ácidos nucleicos peptídicos", que son conocidos en la técnica y que tienen enlaces peptídicos en lugar de enlaces fosfodiéster en el esqueleto, se consideran dentro del alcance de la presente invención.
Tal como se utiliza en la presente, la "monitorización continua" y términos similares se refieren a la monitorización en repetidas veces durante un ciclo de la PCR, preferiblemente durante las transiciones de temperatura, y más preferiblemente, obteniendo, como mínimo, un punto en cada transición de la temperatura.
Tal como se utiliza en la presente, la monitorización "ciclo por ciclo" significa la monitorización de la reacción de la PCR una vez por ciclo, preferiblemente, durante la fase de fijación de la PCR.
Tal como se utiliza en la presente, una "cantidad eficaz" significa una cantidad suficiente para producir un efecto seleccionado. Por ejemplo, una cantidad eficaz de cebadores de la PCR es una cantidad suficiente para amplificar un segmento de ácido nucleico mediante la PCR siempre que también se proporcionen una ADN polimerasa, una disolución tampón, una plantilla, y otras condiciones, incluyendo condiciones de temperatura, conocidas en la técnica y que sean necesarias para realizar la PCR.
La PCR requiere la desnaturalización de la plantilla repetitiva y la fijación de cebadores. Estas transiciones de hibridación dependen de la temperatura. Los ciclos de temperatura de la PCR que rigen la amplificación desnaturalizan de forma alternativa el producto acumulado a una temperatura elevada y fijan cebadores al producto a una temperatura inferior. Las temperaturas de transición de la desnaturalización del producto y la fijación de los cebadores dependen, principalmente, del contenido y la longitud de GC. Si se diseña una sonda para hibridarse de forma interna al producto de la PCR, la temperatura de fusión de la sonda también depende del contenido de GC, la longitud, y el grado de complementariedad a la diana. Las sondas de fluorescencia compatibles con la PCR pueden monitorizar la hibridación durante la amplificación.
Según la presente invención, que se utiliza preferiblemente junto con el ciclado rápido (descrito completamente en el No. de Serie de Estados Unidos 08/658.993, archivado el 4 de junio de 1996, titulado "System and Method For Monitoring PCR Processes" ("Sistema y Método para la Monitorización de Procesos de la PCR"), y el No. de Serie de Estados Unidos 08/537.612, archivado el 2 de octubre de 1995, titulada "Method For Rapid Thermal Cycling of Biological Simples" ("Método Para el Ciclado Térmico Rápido en Muestras Biológicas"), mencionados anteriormente), un paradigma cinético es apropiado para la PCR. En lugar de pensar en la PCR como tres reacciones (desnaturalización, fijación, extensión) que tienen lugar a tres temperaturas diferentes durante tres períodos de tiempo (figura 1A), es más útil un paradigma cinético para la PCR (figura 1B). Con un paradigma cinético, la curva de la temperatura frente al tiempo consiste en transiciones continuas entre reacciones solapadas. La desnaturalización y la fijación son tan rápidas que no es necesario mantener una temperatura particular durante un cierto tiempo. La extensión tiene lugar siempre en un intervalo de temperaturas a velocidades variantes. Un análisis completo necesitaría el conocimiento de todas las constantes de velocidad pertinentes sobre todas las temperaturas. Si se conocieran las constantes de velocidad de todas las reacciones, se podría desarrollar una "descripción físico-química de la PCR". La determinación de estas velocidades necesitaría un control preciso de la temperatura de la muestra y se simplifica ampliamente mediante la monitorización de la reacción durante el ciclado de temperaturas.
La figura 2 muestra fragmentos útiles de la temperatura frente al tiempo para la monitorización de la hibridación por fluorescencia. Las curvas de fusión de los productos se obtienen durante un incremento lento de la temperatura hasta la desnaturalización. Mediante el descenso rápido de la temperatura tras la desnaturalización hasta una temperatura constante, se puede seguir, opcionalmente, la fijación del producto, la sonda, o el cebador. Las curvas de fusión de la sonda se obtienen mediante el calentamiento lento a lo largo de temperaturas alrededor de la temperatura de fusión de la sonda. La realización representada en la figura 2 proporciona todos los análisis durante el ciclado de temperaturas con una exposición inmediata a tiempo real. Las sondas fluorescentes se incluyen como parte de la solución de amplificación para la monitorización continua del cebador, la sonda, o la hibridación del producto durante el ciclado de temperaturas.
Las técnicas de hibridación por fluorescencia contenidas en la presente se basan en el ciclado rápido, con ventajas en la velocidad y la especificidad.
En la figura 3 se muestra un perfil de temperatura de la muestra durante la PCR de ciclo rápido. En estas figuras, la desnaturalización y la fijación aparecen como "picos" de temperatura, en oposición al plateau amplio del ciclado de temperaturas convencionales para PCR, por ejemplo, la figura 1A. En la figura 4, el ciclado rápido de temperaturas se compara con el ciclado convencional de temperaturas, y en la que se muestra que en 15 minutos se pueden completar 30 ciclos de la amplificación y que los productos resultantes de la PCR contienen muchos menos productos secundarios. De este modo, con el ciclado rápido, los tiempos necesarios para la amplificación se reducen, aproximadamente, 10 veces, y se mejora la especificidad.
Ejemplo 1
La figura 4 muestra los resultados de cuatro perfiles diferentes de temperatura/tiempo (A-D) y sus productos de amplificación resultantes después de treinta ciclos (A-D). Los perfiles A y B de la figura 4 se obtuvieron utilizando un dispositivo de bloque calentador de la técnica anterior que utiliza un tubo de microfuga de la técnica anterior. Tal como se puede observar en la figura 4, las transiciones entre temperaturas son lentas y en los perfiles A y B se observan muchas bandas no específicas. El perfil B muestra la mejora en la eliminación de algunas de las bandas no específicas (en comparación con el perfil A) mediante la limitación del tiempo que cada muestra permanece a cada temperatura, indicando así que a tiempos más cortos se consiguen resultados más deseables.
Los perfiles C y D se obtuvieron utilizando un ciclador rápido de temperatura. Tal como se puede observar en la figura 4, la amplificación es específica y, aunque el rendimiento es máximo con tiempos de elongación de 60 segundos (C), es aún completamente adecuado con tiempos de elongación de 10 segundos (D).
Se determinaron también los tiempos y temperaturas óptimas para la amplificación de un fragmento de 536 pares de bases de beta-globina de ADN genómico humano. Los rendimientos de la amplificación y la especificad de los productos fueron óptimos cuando la desnaturalización (93ºC) y la fijación (55ºC) fueron inferiores a 1 segundo. No se encontró ninguna ventaja cuando se alargaron los tiempos de desnaturalización o fijación. El rendimiento se incrementó con tiempos de elongación más largos a 77ºC, pero hubo poco cambio con tiempos de elongación más largos de 10-20 segundos. Estos resultados inesperados indican que los dispositivos disponibles previamente utilizados para la amplificación del ADN no maximizan las condiciones necesarias para optimizar los requerimientos físicos y enzimáticos de la reacción.
Se puede obtener información adicional de: C.T. Wittwer y otros, "Rapid Cycle Allele-Specific Amplification with Cystic Fibrosis delta F(508) Locus" ("Amplificación Específica de Alelo de Ciclo Rápido con el Locus delta F(508) de la Fibrosis Cística"), 39 Clinical Chemistry 804 (1993) y C.T. Wittwer y otros, "Rapid DNA Amplification" ("Amplificación rápida del ADN"), THE POLIMERASE CHAIN REACTION 174 (1994). La instrumentación utilizada para la adquisición de fluorescencia y el ciclado rápido de temperaturas se describe en profundidad en el No. de Serie 08/537.612, véase anteriormente.
Tal como se ha indicado anteriormente, la reacción en cadena de la polimerasa se puede realizar rápidamente. Además de facilitar la transferencia rápida de calor, la utilización de tubos capilares óptimamente transparentes permite la monitorización continua por fluorescencia de la amplificación del ADN según la presente invención.
Las sondas fluorescentes se pueden utilizar para detectar y monitorizar la amplificación del ADN. Entre las sondas útiles se incluyen colorantes de ADN específico de doble cadena y sondas específicas de secuencia.
En la figura 5A, la fluorescencia depende de la hibridación del producto de la PCR, tal como se detecta con un colorante de ADN específico de doble cadena.
El método de la figura 5A no es específico de la secuencia, a pesar de que la especificidad del producto se puede determinar mediante curvas de fusión, un aspecto de la presente invención.
Selección del colorante de ADN específico de doble cadena. Los técnicos en la materia conocerán la utilización de bromuro de etidio en técnicas de fluorescencia. Cuando se utiliza un colorante fluorescente específico de doble cadena durante la amplificación, la fluorescencia aumenta, generalmente, a medida que se produce más producto de doble cadena, véase R. Higuchi y otros, "Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences" ("Amplificación y detección simultánea de las secuencias de ADN específicas"), 10 Bio/Technology 413-417 (1992). En la técnica se conoce también un ensayo de la PCR por fluorescencia para el ARN de la hepatitis C que utiliza el intercalador YO-PRO-1. Véase T. Ishiguro y otros, "Homogeneous quantitative assay of hepatitis C virus RNA by polimerase chain reaction in the presence of a fluorescent intercalater" ("Ensayo cuantitativo homogéneo del ARN del virus de la hepatitis C mediante la reacción en cadena de la polimerasa de un intercalador fluorescente"), 229 Anal. Biochem. 207-213 (1995). Se prefiere que el SYBR™ Green I, que se conoce bien en la técnica y está disponible en Molecular Probes of Eugene, Oregón, se utilice como colorante específico de doble cadena. La estructura molecular de este colorante es un secreto comercial, pero está recomendado por el fabricante como un colorante específico de doble cadena más sensible para la detección de ADN en geles. Sin embargo, el SYBR™ Green I es termolábil y, de este modo, no es útil para la monitorización de la fluorescencia de la PCR según los métodos convencionales en los que la temperatura de la mezcla de reacción se mantiene en las temperaturas de fusión durante períodos prolongados de tiempo. Debido a esta labilidad con el calor, no se esperaba descubrir que el SYBR™ Green I se pudiera utilizar para monitorizar las reacciones PCR cuando las temperaturas de fusión no se mantienen durante períodos prolongados, es decir, cuando la PCR se lleva a cabo mediante ciclado rápido según el paradigma cinético descrito
anteriormente.
Ejemplo 2
Se compararon diferentes colorantes de ADN específicos de doble cadena mediante la monitorización de la amplificación de un fragmento de 110 pares de bases de la pareja de cebadores PCO3/PCO4 del gen de la beta-globina humana de 10.000 copias de la platilla. Los cebadores se sintetizaron mediante la química estándar de la fosforamidita tal como se conoce en la técnica, es decir, utilizando la Pharmacia Biotech Gene Assembler Plus (Piscataway, New Jersey). Los cebadores PCO3/PCO4 de la beta-globina humana (110 pares de bases) se describen en C.T. Wittwer y otros, "Automated polymerase chain reaction in capillary tubes with hot air" ("Reacción en cadena de la polimerasa automatizada en tubos capilares con aire caliente"), 17 Nucl. Acids. Res. 4353-4357 (1989), que se incorpora en la presente por referencia. La amplificación del ADN se realizó en Tris 50 mM, pH 8,5 (25ºC), MgCl_{2} 3 mM, albúmina de suero bovino 500 \mug/ml, 0,5 \muM de cada cebador, 0,2 mM de cada desoxinucleósido trifosfato y 0,2 U de Taq polimerasa por cada 5 \mul de muestra a menos que se afirme lo contrario en los siguientes ejemplos. El producto de la amplificación purificado se utilizó como plantilla del ADN y se obtuvo mediante extracción con fenol/cloroformo y precipitación en etanol, véase D.M. Wallace, "Large- and small-scale phenol extractions and precipitation of nucleic acids" ("Extracciones con fenol y precipitación de ácidos nucleicos a pequeña y gran escala"), 152 Methods in Enzimology 33-48 (1987), seguidas por la eliminación de los cebadores mediante lavados repetidos a través de un microconcentrador Centricon 30 (Amicon, Danvers, Massachusetts). Las concentraciones de las plantillas se determinaron mediante la absorbancia a 260 nm. Las proporciones A(260):A(280) de las plantillas eran superiores a 1,7.
El SYBR™ Green I (Molecular Probes, Eugene, Oregon) se utilizó en una dilución 1:10.000, el bromuro de etidio en una concentración de 5 \mug/ml, y naranja de acridina en una concentración de 3 \mug/ml. Se determinó que estas concentraciones eran las concentraciones óptimas para maximizar la señal de fluorescencia observada durante la amplificación para cada colorante. La excitación se realizó a través de un filtro de interferencia a 450-490 nm a partir de una fuente de arco de xenón, a excepción del bromuro de etidio, en el que se utilizó una excitación a 520-550 nm. Para el SYBR™ Green I, se monitorizó la emisión a 520-550 nm. La fluorescencia del bromuro de etidio se observó a través de un paso de banda de 580-620 nm. La señal del naranja de acridina se recogió como la proporción de la fluorescencia verde (520-550 nm) con respecto a la roja (>610 nm). La fluorescencia de la muestra antes de la amplificación se comparó con la fluorescencia después de 35 ciclos (94ºC máximo, 60ºC durante 20 segundos) a 60ºC. El incremento de la fluorescencia fue de 5,3 veces para el SYBR™ Green I, de 1,7 veces para el bromuro de etidio, y de 1,2 veces para el naranja de acridina. En experimentos separados, la fluorescencia del SYBR™ Green I fue estable durante más de 30 minutos a 70ºC. Se excita también de forma conveniente con luz visible y se constata que es menos mutágeno que el bromuro de etidio. La fluorescencia de fondo, en todos los casos, surge principalmente de los cebadores.
El SYBR™ Green I es el colorante específico de doble cadena para monitorizar por fluorescencia la PCR, según la presente invención, principalmente, debido a la sensibilidad superior, que resulta de una mayor discriminación entre los ácidos nucleicos de cadena doble y de cadena simple. El SYBR™ Green I se puede utilizar en cualquier amplificación y no es caro. Además, la especificidad del producto se puede obtener mediante el análisis de curvas de fusión, tal como se describirá inmediatamente.
Fluorescencia ciclo por ciclo. El análisis convencional del punto final de la amplificación de ADN mediante electroforesis en gel identifica el tamaño del producto y estima la pureza. Sin embargo, dado que la amplificación es inicialmente estocástica, a continuación exponencial, y finalmente estagnante, la utilidad del análisis del punto final se limita a la cuantificación. Un aspecto de la presente invención incluye la monitorización ciclo por ciclo con sondas de hibridación para la cuantificación del número de copias de la plantilla inicial. Tal como se apreciará por los técnicos en la materia, la monitorización de una vez por ciclo de muestras múltiples que experimentan la amplificación del ADN es una potente herramienta cuantitativa. La monitorización ciclo por ciclo se consigue mediante la adquisición de fluorescencia durante la extensión o la fase combinada de fijación/extensión de cada ciclo y relacionando la fluorescencia con la concentración del producto.
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Ejemplo 3
La monitorización ciclo por ciclo de la PCR se realizó mediante tres técnicas de fluorescencia diferentes. La fluorescencia se monitorizó mediante (i) el colorante específico de doble cadena, SYBR™ Green I (ii) una disminución en la inhibición de la fluoresceína por rodamina tras la división de exonucleasa de una sonda de hidrólisis doblemente marcada y (iii) la transferencia de energía de resonancia de la fluoresceína a la Cy5 mediante sondas de hibridación adyacentes. Sin embargo, la presente invención sólo incluye la monitorización de la fluorescencia mediante el colorante específico de doble cadena, SYBR™ Green I.
Los reactivos y las condiciones de amplificación fueron las descritas en el Ejemplo 2. Los cebadores RS42/KM29 (536 pares de bases) y PC03/PC04 (110 pares de bases) de la beta-globina humana se describen en C.T. Wittwer y otros, "Automated polymerase chain reaction in capillary tubes with hot air" ("Reacción en cadena de la polimerasa automatizada en tubos capilares con aire caliente"), 17 Nucl. Acids. Res. 4353-4357 (1989), que se incorpora en la presente por referencia. El ciclado de temperaturas para la beta-globina fue de 95ºC como máximo, 61ºC como mínimo, 15 segundos a 72ºC y una velocidad promedio entre temperaturas de 5,2ºC/s. Los cebadores de beta-actina y la sonda dual de fluoresceína/rodamina se obtuvieron de Perkin Elmer (no. N808-0230). El ciclado de temperaturas para la beta-actina fue de 94ºC como máximo, 15 segundos a 60ºC con una velocidad promedio entre temperaturas de 6,2ºC/s. Las sondas marcadas individualmente 5'-CAAACAGACA CCATGGTGCA CCTGACTCCT GAGGA-fluoresceína-3' (Secuencia de Identificación (SEQ ID No:3) y 5'-Cy5-AAGTCTGCCG TTACTGCCCT GTGGG
GCAAGp (SEQ ID No:4) se sintetizaron como en el Ejemplo 3. Estas sondas adyacentes se hibridan de forma interna a la pareja de cebadores de la beta-globina PC03/PC04 en la misma cadena de ADN y están separadas por una pareja de bases. El ciclado de temperaturas fue de 94ºC como máximo, 20 segundos a 59ºC con una velocidad promedio entre temperaturas de 7,0ºC/s. Las sondas de hibridación (beta-actina y beta-globina) se utilizaron cada una en una concentración de 0,2 \muM.
Cuando se monitorizan muestras múltiples una vez por ciclo con SYBR™ Green I, se puede distinguir un intervalo de 10^{7} a 10^{8} de concentración inicial de plantilla, tal como se representa en la figura 15. Esta amplificación es de un fragmento de 536 pares de bases del gen de la beta-globina, con SYBR™ Green I como colorante específico de doble cadena. Cuando se normalizaron los datos como el porcentaje de fluorescencia máxima de cada muestra, se separaron claramente cien copias iniciales de diez copias. Sin embargo, la diferencia entre una y diez copias era marginal, y no se observó diferencia entre cero y una copia de promedio por muestra.
La señal de fluorescencia de las sondas de hibridación no es acumulativa y desarrolla una nueva señal durante cada fase de fijación. La fluorescencia es una medida directa de la concentración del producto debido a que la hibridación es una reacción de pseudo primer orden. Dado que la concentración de la sonda es mucho mayor que la del producto, la fracción de producto hibridado a la sonda es independiente de la concentración de producto. Estas características indican que la utilización de una sonda individual de hibridación junto con un cebador marcado proporcionará una monitorización superior de la acumulación de producto para su cuantificación. La varianza inherente de las diferentes técnicas de fluorescencia durante la monitorización ciclo por ciclo es también importante para la cuantifica-
ción.
Ejemplo 4
Se realizó la amplificación del ADN, según el Ejemplo 2, para cada uno de los tres métodos diferentes de monitorización de la fluorescencia. Se utilizó SYBR™ Green I en una dilución 1:10.000 en la amplificación de un fragmento de 205 pares de bases de beta-globina humana a partir de los cebadores KM29 y PC04. La sonda y las condiciones de hidrólisis son las especificadas en el Ejemplo 7. La sonda de hibridación, TCTGCCGTTA CTGCCCTGTG GGGCAAG-fluoresceína (SEQ ID No: 5) se utilizó con KM29 y el cebador marcado en Cy5 CAACTTCATCCACGTT*CACC (SEQ ID No: 6), en la que T* era una base T marcada en Cy5, que se sintetizó como en el ejemplo 8. Todas las amplificaciones se realizaron en diez replicados con 15.000 copias de la plantilla (50 ng de ADN genómico humano/10 \mul). Los ciclos de temperatura fueron de 31 segundos de duración (máximo de 94ºC, 60ºC durante 20 segundos, velocidad promedio entre temperaturas de 6,2ºC/s). La fluorescencia se adquirió para cada muestra entre los segundos 15 y 20 de la fase de fijación/extensión.
La figura 19A permite la comparación de tres técnicas de monitorización de la fluorescencia para la PCR. Las sondas de fluorescencia son el colorante de ADN de doble cadena, SYBR™ Green I (figura 19A), una sonda de hidrólisis de fluoresceína/rodamina doblemente marcada (figura 19B), y una sonda de hibridación marcada con fluoresceína con un cebador marcado en Cy5 (figura 19C). Todas las sondas tenían casi la misma sensibilidad con la fluorescencia detectable que tenía lugar alrededor del ciclo 20. Con la amplificación extendida, la señal siguió incrementándose con la sonda de hidrólisis, se niveló con el SYBR™ Green I, y disminuyó ligeramente con la sonda de hibridación. La precisión de las tres técnicas de monitorización de la fluorescencia se comparan en la figura 19D. Para cada punto se indican la media +/- la desviación estándar. Los datos están representados como el coeficiente de variación (desviación estándar/media) de la proporción de la fluorescencia sobre la línea base (tomada como el promedio de los ciclos 11-15).
A pesar de que el cambio en la proporción de fluorescencia de la sonda de hidrólisis es mayor que la de la sonda de hibridación (figuras 19B y 19C), el coeficiente de variación de la fluorescencia de las sondas de hidrólisis es superior (figura 19D). Es decir, la fluorescencia resultante del método con la sonda de hibridación es más precisa que el que utiliza una sonda de hidrólisis, aunque los niveles absolutos de la señal son inferiores. Ésta es una ventaja inesperada de las sondas de hibridación sobre las sondas de hidrólisis doblemente marcadas más habituales.
Cuantificación del número de copias iniciales de la plantilla. La PCR cuantitativa se ha convertido en una importante técnica tanto en la investigación biomédica como en el laboratorio clínico. El proceso de cuantificación incluye frecuentemente la elaboración de una curva estándar de muestras que contienen números de copias conocidos de la secuencia diana. El número de copias de una muestra desconocida se determina por extrapolación entre los valores conocidos. Cuando se monitoriza ciclo por ciclo una curva de amplificación completa utilizando fluorescencia, radioactividad o cualquier otro método que proporciona una señal proporcional a la cantidad de ADN presente, se dispone de muchos puntos para el análisis y no está claro qué valor elegir para representar una muestra estándar o desconocida. La técnica anterior se utiliza para elegir una "valor umbral" de la señal y, a continuación, utilizar el número de ciclos cuando la muestra estándar o desconocida traspasa ese umbral como valor representativo (véase Higuchi y Watson, EPA 0 640 828 A1). Esta aproximación utiliza una cantidad muy pequeña de los datos disponibles en una curva de amplificación. Además, la asignación del valor umbral es altamente subjetiva y está sometido a una desviación consciente o inconsciente. En una curva de amplificación se podrían utilizar objetivamente más de los datos disponibles mediante la aplicación de técnicas de ajuste de curvas no lineales a los datos. Preferiblemente, se podrían encontrar ecuaciones que describen la forma de las curvas de amplificación mediante factores de modelación del proceso subyacente.
Se podrían utilizar un conjunto de diferentes ecuaciones para ajustar los datos obtenidos durante la amplificación. Las amplificaciones de ADN tienen, habitualmente, un fragmento logarítmico lineal y los datos en este fragmento se pueden ajustar a una ecuación que describe un incremento exponencial como el esperado en una amplificación de ADN. La parte logarítmica lineal de una amplificación de ADN se puede describir mediante la siguiente ecuación:
y = A*[ADN]*(1+E)^{n}
en la que A es un factor de escala que convierte unidades de señal en unidades de ADN; [ADN] es la concentración inicial de ADN en la reacción; E es la eficacia de la reacción; y n es el número de ciclos.
Un proceso de cuantificación implicaría: (1) el ajuste de los estándares conocidos a esta ecuación permitiendo la flotación de los parámetros A y E, y (2) el ajuste de las muestras desconocidas a la ecuación utilizando los valores de A y E a partir de los estándares y permitiendo la flotación de [ADN]. Esta técnica utiliza muchos más datos y utiliza la parte de los datos, la parte logarítmica lineal, que probablemente es más informativa. Las figuras 20, 21 y 22 muestran un ejemplo de esta aproximación. Se amplificaron diluciones de diez veces de un producto de PCR purificado como una curva estándar y se utilizó un estándar de ADN genómico humano "desconocido". La figura 20 muestra que la parte logarítmica lineal es identificada fácilmente por el usuario o bien, mediante software. La figura 21 muestra un ajuste de la ecuación y = A*[ADN]*(1+E)^{n} al estándar de 10^{4} copias. La figura 22 utiliza valores promedio de los estándares para A y E y ajusta la [ADN]. El valor de ajuste de 16.700 está muy próximo al valor teórico para un gen copia único en el ADN genómico (15.000 copias).
La utilización de todos los datos en una curva de amplificación incluiría el nivel de fondo y el valor del plateau. Mientras que con un número de copias el valor del plateau no es informativo, con un número bajo de copias es frecuentemente proporcional al número de copias iniciales. El nivel de fondo podría ser útil en la determinación del primer punto que muestra un incremento significativo de la señal. En este punto no se conocen todos los factores implicados en la forma de la curva de amplificación del ADN, así que una aproximación es describir la forma de la curva. La figura 23 muestras las curvas de amplificación que utilizan sondas de hibridación fluorescentes para detectar rangos de magnitud de quinto orden de las concentraciones de la plantilla de ADN. Cada curva se ajusta a la ecuación:
y = ((as*x+ab)-(ds*x+db))/(1+(x/c)^{\wedge}b)+(ds*x+db)
en la que "as" es el fondo de la línea inclinada, "ab" es la intersección de y con la línea de fondo, "ds" es la pendiente de la línea plateau, "db" es la intersección de y con la línea inclinada, "c" es el número de ciclo en el que la reacción está a medio camino entre el fondo y la línea plateau (A_{50}), y "b" es la pendiente de la parte logarítmica lineal de la amplificación.
Esta ecuación proporciona buenos ajustes a estos datos de amplificación, y la figura 24 muestra que el valor de la A_{50} se correlaciona bien con el logaritmo del número de copias iniciales a lo largo de siete órdenes de magnitud. La figura 25 muestra la misma ecuación ajustada a los datos de amplificaciones que utilizaron una sonda de hidrólisis para detectar una plantilla de ADN sobre un rango de 5 órdenes de magnitud. Esta ecuación proporciona buenos ajustes a estos datos de amplificación, y la figura 26 muestra que el valor de la A_{50} se correlaciona bien con el logaritmo del número de copias iniciales. Esto demuestra la flexibilidad de la aproximación completa del ajuste de la curva ya que la ecuación ha proporcionado buenos ajustes tanto a los plateaus estrechos de las curvas de amplificación con sondas de hibridación como a los "plateaus" de incremento estable de las curvas con sondas de hidrólisis.
Los ajustes totales de las curvas no se limitan a esta ecuación. La figura 27 muestra una amplificación de tres concentraciones de la plantilla de ADN ajustada a la ecuación:
y = (((as*x+ab)-(dmax*x/dd+x))/(1+(x/c)^{\wedge}b))+(dmax*x/dd+x),
que es similar a las primeras ecuaciones de 6 parámetros excepto que el plateau se define mediante una curva hiperbólica en lugar de mediante una línea. La figura 28 muestra que la A_{50} para esta ecuación se correlaciona bien con el número de copias iniciales.
Aunque la A_{50} se ha utilizado en estos ejemplos, se podía elegir el nivel entre el fondo y el plateau si una técnica particular es más robusta, inferior o superior en el perfil de amplificación. Por ejemplo, se evalúa la mejor correlación entre el número de copias iniciales y la A_{10}, la A_{20}, la A_{30}, la A_{40} y la A_{50} en un conjunto de curvas estándar de amplificación. Se determina el nivel de amplificación que mejor se correlaciona con el número de copias iniciales conocidas. Esto será diferente para los diferentes sistemas de detección. La figura 19 muestra el coeficiente de variación para varios sistemas de detección. El nivel de amplificación que es el mejor indicador es probable que sea el nivel con el coeficiente de variación más bajo.
Dado que la reacción de amplificación de ADN se entiende mejor por sí misma, se podrían utilizar otras ecuaciones que tienen parámetros que reflejan los procesos físicos. El plateau de la curva de amplificación del ADN tiene diferentes causas en diferentes reacciones. Frecuentemente es debido a la incapacidad de los cebadores de competir con el producto en la refijación en los últimos ciclos. Este efecto se podría capturar con un parámetro que depende del cuadrado de la concentración del producto en la reacción (ya que la velocidad de refijación es proporcional al cuadrado de la concentración de producto). Otra causa del plateau puede ser la depleción de los cebadores. Las reacciones limitadas por los cebadores tienen una forma característica, tienen un plateau estrecho que se puede reconocer. Los ajustes de la reacción limitada por los cebadores incluirán parámetros que definen este máximo estrecho. Las reacciones limitadas por las enzimas tienen un plateau redondo que se puede ajustar adecuadamente. Se pueden idear factores del peso de manera que reflejen los coeficientes de variación conocidos para el sistema dado cuanto mayor es el peso, más fiables son los puntos de los datos. Mediante el ajuste de más puntos en un perfil de amplificación, se pueden obtener estimaciones más precisas y robustas de un número inicial de copias. Se pueden utilizar uno o más de los parámetros de estos ajustes para estimar el número inicial de copias de muestras desconocidas.
Monitorización continua de la fluorescencia de la PCR. A continuación, se describirá la característica de la presente invención de monitorización continua, es decir, la monitorización de forma repetida dentro de cada ciclo de la PCR. Aunque la monitorización de la fluorescencia durante la PCR se puede realizar una vez en cada ciclo a una temperatura constante, la presente invención proporciona la ventaja importante de proporcionar una monitorización continua a lo largo del ciclo de la PCR. La temperatura es importante porque la fluorescencia cambia a medida que cambia la temperatura. Las figuras 29A y B muestran la relación inversa entre la temperatura y la fluorescencia para el SYBR™ Green I. Este es un efecto desconcertante durante el ciclado de temperaturas que se elimina, habitualmente, considerando la fluorescencia sólo una vez por ciclo a una temperatura de extensión constante. Sin embargo, según la presente invención, la monitorización de la fluorescencia durante los cambios de temperatura es muy informativa. Anteriormente a la presente invención, no se ha realizado la monitorización continua de la fluorescencia dentro de cada ciclo, en oposición a una vez por cada ciclo. Según la presente invención, se obtienen datos de tiempo, temperatura y fluorescencia cada segundo, cada 200 ms, cada 100 ms o incluso a una frecuencia mayor. Dichos datos pueden revelar detalles exactos de la desnaturalización, refijación y extensión del producto, y la fijación y fusión de la sonda durante el ciclado rápido, que no están disponibles en los métodos disponibles previamente.
Ejemplo 5
Se amplificó un fragmento de 180 pares de bases del gen del antígeno de superficie de la hepatitis B a partir de 10^{6} copias del producto purificado de la PCR utilizando cebadores 5'-CGTGGTGGAC TTCTCTCAAT-3' (SEQ ID No: 1), y 5'-AGAAGATGAG GCATAGCAGC-3' (SEQ ID No: 2) (Secuencia HVHEPB del Banco de Genes). Se siguieron las condiciones de amplificación del Ejemplo 2, a excepción de que la reacción contenía una dilución 1:20.000 del SYBR™ Green I y MgCl_{2} 2 mM. Cada ciclo de temperaturas fue de 27 segundos (máximo de 92ºC, mínimo de 59ºC, 5 s a 70ºC, velocidad promedio entre temperaturas de 3,0ºC/s). Se adquirieron datos de tiempo, temperatura, y 2 canales de fluorescencia cada 200 ms y se mostró de forma continua como las representaciones de la fluorescencia frente al número de ciclos y la fluorescencia frente a la temperatura. La figura 30 muestra un rastreo tridimensional de la temperatura, el tiempo y la fluorescencia para los ciclos 10 a 34. Esta curva tridimensional también se proyecta en la figura 30 como representaciones bidimensionales de la temperatura frente al tiempo, la fluorescencia frente al tiempo, y la fluorescencia frente a la temperatura. La proyección de la temperatura frente al tiempo de la figura 30 se repite para cada ciclo y proporciona, esencialmente, la misma información que la establecida en la figura 3. Dado que la fluorescencia varía de forma inversa con la temperatura, la proyección de la fluorescencia frente al tiempo mostrada en la figura 30 en los ciclos iniciales es una imagen especular a escala de la representación de la temperatura frente al tiempo (véase la figura 29). A medida que se acumula el producto, la fluorescencia aumenta a cualquier temperatura con el producto de doble cadena. Sin embargo, a temperaturas de desnaturalización, la fluorescencia vuelve a la línea base ya que sólo está presente ADN de cadena única. La proyección de la fluorescencia frente a la temperatura de los colorantes de doble cadena mostrada en la figura 30 elimina el eje del tiempo y muestra la dependencia con la temperatura del tipo de cadena durante la amplificación del ADN.
Ejemplo 6
Se amplificó un fragmento de 536 pares de bases del gen de la beta-globina humana a partir de 25 ng de ADN genómico y una dilución 1:10.000 del SYBR™ Green I en un volumen de 5 \mul. Cada ciclo de temperaturas fue de 28 segundos (máximo de 95ºC, mínimo de 61ºC, 15 s a 72ºC con una velocidad promedio entre temperaturas de 5,2ºC/s). El resto de condiciones son las mismas que las descritas en la figura 30. Se muestran los ciclos 15-40. La dependencia con la temperatura del tipo de cadena del producto durante la PCR se observa mediante las representaciones de la fluorescencia frente a la temperatura que se utilizan tal como se describe en la figura 31. Los ciclos iniciales representados aparecen idénticos, con un incremento no lineal de la fluorescencia a temperaturas inferiores. A medida que se lleva a cabo la amplificación, los ciclos de temperaturas aparecen como bucles ascendentes entre las temperaturas de fijación y desnaturalización. A medida que la muestra se calienta, la fluorescencia es elevada hasta que tiene lugar la desnaturalización. A medida que se enfría la muestra, la fluorescencia aumenta, reflejando la refijación del producto. Cuando la temperatura es constante durante la extensión, el incremento de la fluorescencia se correlaciona con la síntesis de ADN adicional.
Tal como se valorará del entendimiento de esta descripción, la monitorización continua dentro de un ciclo puede proporcionar elementos para comprender la mecánica de la amplificación de ADN que no estaba disponible previamente en la técnica. Utilizando la presente invención, se entienden muchos aspectos de la amplificación de ADN que hasta ahora no se habían entendido demasiado. Por ejemplo, la amplificación de ciclo rápido constata la desnaturalización del producto en menos de un segundo, mientras que la técnica anterior utiliza de diez segundos a un minuto de desnaturalización. La observación de la fusión del producto mediante la monitorización de la fluorescencia a tiempo real con colorantes de doble cadena, según la presente invención (figuras 30 y 31), muestra que la utilización de tiempos más cortos de desnaturalización es eficaz. Como otro ejemplo, se han propuesto muchas causas del conocido "efecto plateau", pero se disponen de muy pocos datos para distinguir entre las alternativas. Tal como se muestra en la figura 31, la refijación del producto es muy rápida. De hecho, durante los ciclos posteriores de la amplificación, la mayor parte del producto se refija en cada ciclo durante el enfriamiento antes de alcanzar la temperatura de fijación del cebador. Esto tiene lugar con velocidades de enfriamiento de 5-10ºC/s en la instrumentación de ciclo rápido. La refijación del producto será más lenta, los cicladores de temperatura de la técnica anterior serán más extensos y este efecto indeseable será superior. La refijación del producto parece ser una causa principal, o quizás la única, del "efecto plateau".
Ahora se considera la monitorización continua de las sondas específicas de secuencia. Tal como se valorará del entendimiento de esta descripción, la monitorización continua dentro de un ciclo puede identificar la naturaleza de la fluorescencia de la sonda.
Ejemplo 7
Se realizó la monitorización continua de la amplificación cada 200 ms con una sonda de hidrólisis doblemente marcada (beta-actina) y sondas de hibridación adyacentes (beta-globina), tal como en el Ejemplo 3. En la figura 32A, se muestran los ciclos 20-45 de una reacción monitorizada con la sonda de hidrólisis. Las sondas de hidrólisis muestran un cambio lineal en la proporción de fluorescencia con la temperatura y un incremento paralelo en la fluorescencia a medida que se hidrolizan más sondas. En cambio, la proporción de fluorescencia de las sondas de hibridación varía de forma radical con la temperatura (figura 32B, ciclos 20-40). Durante la fase de fijación/extensión, las sondas se hibridan al producto de cadena única y aumenta la proporción de fluorescencia (Cy5/fluoresceína). Durante el calentamiento hasta las temperaturas de desnaturalización del producto, las sondas se disocian alrededor de los 70ºC, y la proporción de la fluorescencia vuelve a los niveles de fondo.
La combinación de (1) la monitorización continua de la fluorescencia dentro de cada ciclo de temperaturas y (2) el análisis de la dependencia con la temperatura y el tiempo de la hibridación, de la presente invención, proporciona ventajas que no son obtenibles de otras maneras. La figura 2 muestra que la información que previamente no se podía obtener, se puede extraer mediante la monitorización continua durante todo el ciclo. La monitorización continua de la fluorescencia durante la fase de fusión del producto del ciclo proporciona información útil sobre la pureza, la identidad, y la cantidad de ADN presente durante ese ciclo.
A medida que se calienta la reacción de la PCR desde la temperatura de extensión hasta la temperatura de desnaturalización, cualquier ADN de la muestra se funde hasta cadenas únicas. Esta desnaturalización se puede observar como una gota en la fluorescencia del SYBR™ Green I. Para productos de la PCR pequeños, la transición de fusión tiene lugar sobre un intervalo de temperaturas pequeño y el punto medio de ese intervalo de fusión se refiere como la Tm. De forma similar a la medición del tamaño por electroforesis en gel, el análisis de los picos de fusión mide una característica fundamental del ADN y se puede utilizar para identificar productos amplificados. A diferencia de la electroforesis en gel, el análisis de la curva de fusión puede distinguir productos de la misma longitud pero de diferente proporción GC/AT. Además, dos productos con la misma longitud y contenido de GC, pero que difieren en la distribución de GC (por ejemplo, distribuido a partes iguales frente a una abrazadera de GC en un extremo), tendrían curvas de fusión muy diferentes.
La temperatura a la que los productos de la PCR se funden varía sobre un intervalo amplio. Utilizando fórmulas empíricas conocidas en la técnica, el efecto del contenido de GC en la temperatura de fusión (Tm) del ADN predice que un 0% de dúplex GC se fundiría 41ºC por debajo de un 100% de dúplex GC. Para un mismo contenido de GC, un dímero de cebadores de 40 pares de bases se fundiría 12ºC por debajo de un producto de 1000 pares de bases. Por lo tanto, el intervalo de Tm para productos potenciales de la PCR abarca, como mínimo, 50ºC. Este intervalo amplio permite diferenciar la mayoría de productos de la PCR mediante curvas de fusión. De este modo, la combinación de la monitorización de la fluorescencia de la PCR con el análisis de las curvas de fusión proporciona la amplificación, detección, y diferenciación simultánea de los productos de la PCR.
Ejemplo 8
Se obtuvieron curvas de fusión de ADN para tres productos diferentes de la PCR en un fluorímetro microvolumétrico integrado con un ciclador térmico de 24 muestras con instrumentación óptica para la fluorescencia del SYBR™ Green I (LightCycler LC24, Idaho Technology, Idaho Falls, Idaho). Los cebadores para la amplificación de las 180 pares de bases del gen del antígeno de superficie de la hepatitis B fueron 5'-CGTGGTGGAC TTCTCTCAAT-3' (SEQ ID No: 1) y 5'-AGAAGATGAG GCATAGCAGC-3' (SEQ ID No: 2). Los cebadores para la amplificación de las 292 pares de bases del gen del antígeno específico de próstata (PSA) fueron 5'-CTGTCCGTGA CGTGGATT-3' (SEQ ID No: 7) y 5'-AAGTCCTCCG AGTATAGC-3' (SEQ ID No: 8). La amplificación de las 536 pares de bases del gen de la beta-globina humana se realizó como en el Ejemplo 3, la PCR se llevó a cabo tal como se describe en el Ejemplo 2. Los productos de amplificación se purificaron por extracción con fenol/cloroformo y precipitación con etanol, seguidas por lavados repetidos a través de un microconcentrador Centricon 30 (disponible en Amicon de Danvers, Massachusetts). Las concentraciones de las plantillas se determinaron mediante la absorbancia a 260 nm y se obtuvieron proporciones A(260)/A(280) superiores a 1,7.
Se pipetearon cincuenta ng de ADN purificado en Tris 50 mM, pH 8,5, MgCl_{2} 2 mM, y 250 \mug/ml de albúmina de suero bovino y un volumen de 5 \mul en el depósito de plástico abierto de los tubos de reacción de vidrio compuesto/plástico, se centrifugó a una velocidad baja para situar la muestra en la punta del capilar de vidrio, y se selló el interior con un tapón de plástico. Se adquirieron los datos de fluorescencia para las curvas de fusión mediante la integración de la señal sobre 0,25-2,0 segundos durante una transición lineal de temperatura hasta 95ºC a 0,1-10,0ºC/s. Se adquirieron de forma continua datos de fluorescencia y se mostraron en representaciones de fluorescencia frente a temperatura en el entorno de programación LabView (Nacional Instrument, Austin, TX). La figura 37 muestra las curvas de fusión de los tres productos purificados de la PCR.
Las Tms de los tres productos de la figura 37 abarcan sólo 6 grados y dos de las curvas están separadas por sólo 2 grados. Esta pequeña separación es suficiente para permitir la fácil diferenciación de los productos. La importancia del porcentaje de GC sobre la longitud en la Tm se muestra mediante la fusión del producto PSA de 292 pares de bases a una temperatura mayor que el fragmento más largo de 536 pares de bases de la beta-globina. Las curvas de fusión se obtienen frecuentemente a velocidades de 0,5ºC/minuto para asegurar el equilibrio. Además, a medida que disminuye la velocidad de calentamiento, las curvas de fusión se desplazan a temperaturas más bajas y se estrechan (figura 38; fragmento de hepatitis B). Sin embargo, hay que apuntar que las curvas de fusión de la figura 37 se obtuvieron durante una velocidad de calentamiento de 0,2ºC/segundo (12ºC/minuto) y se pueden diferenciar productos que se diferencian en la Tm por 2ºC o inferior.
La Tm aparente de los productos de la PCR también depende de la concentración del colorante de ADN específico de doble cadena (figura 39, fragmento de hepatitis B). Concentraciones superiores de colorante incrementan la estabilidad del dúplex de ADN y la Tm observada.
Para monitorizar las curvas de fusión con el SYBR™ Green I, las condiciones preferidas son una dilución de 1:7.000-1:30.000 de SYBR™ Green I con velocidades de calentamiento de 0,1-0,5ºC/segundo. Estas condiciones permiten la fácil diferenciación de productos que difieren en la Tm en 2ºC.
Un control más preciso de la temperatura y un software para el análisis de los picos de fusión reducirá la diferencia detectable en la Tm hasta una fracción de un grado. Esto permitirá la diferenciación de la mayoría de los productos de la PCR. Sin embargo, no todos los productos se pueden diferenciar mediante la Tm, pues al ser posible malinterpretar los resultados de la electroforesis debido a la comigración de dos o más productos, es posible que alguno de los productos que se funden en el intervalo esperado no sea el productos deseado. Sin embargo, si no hay un ADN que se funda en el intervalo del producto esperado, se puede concluir que ninguno de los productos esperados se encuentra presente.
Otra forma para diferenciar los productos disponible con el análisis de las curvas de fusión son los patrones distintivos de fusión de dominios observados en productos más largos de la PCR. Aunque los productos cortos (< 300 pares de bases) se funden habitualmente en una transición, los productos más largos pueden tener dominios de fusión internos que proporcionan curvas de fusión con una forma compleja distintiva. Estas curvas de fusión complejas se pueden utilizar como una huella dactilar para la identificación del producto.
El análisis de las curvas de fusión se puede utilizar para diferenciar el producto deseado de productos no específicos, tales como dímeros de cebadores. Los dímeros de cebadores se funden en un intervalo amplio de temperaturas bajas; muy diferente de las curvas de fusión estrechas de los productos específicos de la amplificación por la PCR. Los productos heterogéneos más largos que surgen después de realizar muchos ciclos en unas condiciones de fijación poco severas tienen curvas de fusión más bajas y anchas en comparación con el producto puro de la PCR.
Ejemplo 9
Se realizó la amplificación del fragmento de 536 pares de bases del gen de la beta-globina, según el Ejemplo 3, con una dilución 1:30.000 de SYBR™ Green I, a excepción de que se variaron las condiciones. En la reacción A (figura 40), no se añadió ninguna plantilla y la reacción se desarrolló en un ciclo a 94ºC durante 0 s, 60ºC durante 0 s, y 72ºC durante 10 s durante 30 ciclos para producir productos pequeños no específicos de amplificación. En B, la amplificación de 10^{6} copias iniciales de la plantilla purificada en condiciones poco severas (94ºC durante 0 s, 50ºC durante 0 s, y 72ºC durante 10 s) durante 55 ciclos mostró un intervalo amplio de tamaños de los productos de amplificación en electroforesis en gel y se funden a lo largo de un intervalo amplio de temperaturas. En C, 10^{6} copias iniciales de la plantilla purificada se introdujeron en un ciclo a 94ºC durante 0 s, 60ºC durante 0 s, y 72ºC durante 10 s durante 30 veces y se muestra una banda única destacada y se funden en una transición estrecha. La velocidad de la transición de la temperatura fue 0,2ºC/s. Se utilizó la digestión con Hind III del ADN del fago \lambda (M) como marcador.
La figura 40 muestra curvas de fusión que reflejan de forma precisa la especificidad de una reacción PCR. La curva de fusión C estrecha y de temperatura elevada corresponde a una banda única en un gel. La curva de fusión A ancha y de temperatura baja proviene del análisis de un control sin plantilla que muestra únicamente dímeros de cebadores. La sobreamplificación del producto en C proporciona la curva de fusión intermedia B, aún claramente diferenciable del producto específico.
Las curvas de fusión observadas, por ejemplo, en la figura 37, se pueden cuantificar mejor mediante la consideración, en primer lugar, de la derivada de la fluorescencia (F) respecto a la temperatura (T). Esta derivada se representa como -dF/dT frente a T y convierte las curvas de fusión en picos de fusión.
Ejemplo 10
Los fragmentos purificados del gen de la hepatitis B y la beta-globina del Ejemplo 8 se fundieron de forma individual y conjunta con una velocidad de transición de temperatura de 0,2ºC/s y otras condiciones, tal como se especifica en el Ejemplo 8 (figura 41). La determinación un poco subjetiva de la Tm a partir de las curvas de fusión (superior) es fácil visualmente a partir de los picos de fusión (inferior). El área bajo los picos de fusión también se puede cuantificar mediante la integración del área bajo las curvas. La línea base de fluorescencia se extrajo en primer lugar de la representación -dF/dT frente a T suponiendo que la magnitud de la línea base varía como el área por debajo de la curva. A continuación, los picos se ajustaron a gaussianos mediante regresión mínimo-cuadrática no lineal con la media, desviación estándar, y altura del pico como parámetros de ajuste. El área por debajo de cada gaussiano se tomó como el área del pico. Todos los cálculos se realizaron en el entorno de programación LabView (National Instruments, Austin, TX). La figura 41 muestra un ejemplo de esta conversión de las curvas de fusión en picos de fusión. El código para estos cálculos se incluye como el apéndice A.
La capacidad para distinguir el producto específico del dímero de cebadores y de otros componentes de la reacción mejora la utilización de los colorantes de ADN específico de doble cadena en la cuantificación de un número de copias iniciales bajo. Se han cuantificado un número de copias iniciales de la plantilla relativamente grandes utilizando bromuro de etidio (Higuchi y Watson, véase anteriormente). Sin embargo, en un número de copias iniciales bajo, la amplificación de fondo de los dímeros de cebadores y otros componentes de la amplificación interfieren con la señal de amplificación específica. Con la capacidad de la presente invención para diferenciar productos específicos de componentes no específicos, se pueden utilizar colorantes de ADN específico de doble cadena para cuantificar el bajo número de copias iniciales de la plantilla. Esto es ventajoso debido a la simplicidad de utilización de estos colorantes. Los colorantes de ADN específico de doble cadena se pueden utilizar en cualquier amplificación y no son necesarios oligonucleótidos habituales marcados por fluorescencia. La cuantificación de un número de copias bajo con colorantes de ADN específico de doble cadena requiere una especificidad de amplificación muy buena o, tal como se proporciona en la presente invención, un medio para diferenciar el producto deseado de la amplificación no específica.
Ejemplo 11
La aproximación de la presente invención para la determinación de la pureza del producto se utilizó para mejorar la PCR cuantitativa basada en la monitorización de una vez por ciclo de la fluorescencia de los colorantes de ADN específico de doble cadena. Los datos de fluorescencia se adquirieron una vez por ciclo después de la extensión de la polimerasa del producto para un conjunto de reacciones que varían en la concentración inicial de la plantilla de beta-globina purificada (véase la figura 42A). La plantilla de la beta-globina y las condiciones de amplificación fueron tal como se describen en el Ejemplo 3. El incremento logarítmico lineal sobre la fluorescencia de fondo empezó en un número de ciclo dependiente de la concentración de platilla inicial. Las representaciones de las cinco reacciones que varían de 10^{6} a 10^{2} copias por reacción se separaron mediante, aproximadamente, cuatro ciclos. La muestra con un promedio de 10^{2} copias por reacción mostró una disminución en la eficacia de la reacción, y las reacciones con un número de copias iniciales por debajo de 100 dieron perfiles de fluorescencia que eran menos útiles. Los perfiles de fluorescencia para las reacciones que contenían 10 y 1 copias (de promedio) aumentan en orden inverso, y el control negativo mostró una amplificación después de, aproximadamente, 30 ciclos. Esto es debido a la amplificación de los dímeros de cebadores y otros productos de amplificación no específicos que no se pueden distinguir del producto deseado mediante la monitorización una vez por ciclo de la fluorescencia de colorantes de ADN específico de doble cadena.
Los picos de fusión se obtuvieron para cada muestra (figura 42B) y se encontró que se correlacionaban bien con los resultados de la electroforesis (figura 42C). La reacción que contenía un promedio de copias iniciales de plantilla de cero y una no produjo una banda de electroforesis discernible en la posición de las 536 pares de bases. Las reacciones que contenían 10 y 100 copias iniciales de la plantilla mostraron bandas de electroforesis débiles. Esto concordaba con el análisis de los picos de fusión, que no mostró fusión del ADN en el intervalo del producto deseado (90-92ºC) para las reacciones que contenían cero y una copias iniciales y mostró picos pequeños en este intervalo de temperaturas para 10 y 100 copias. Las bandas de electroforesis intensas para las reacciones que contenían 10^{3}-10^{6} copias iniciales se correlacionan bien con los picos de fusión amplios en el intervalo esperado de 90-92ºC.
La proporción del producto deseado con respecto al producto total, determinada mediante la integración de los picos de fusión, variaba de 0,28 para 10^{5} copias a 0,0002 para cero copias iniciales de la plantilla. Cada valor de fluorescencia en la figura 41A se multiplicó por la proporción adecuada para proporcionar la representación corregida (designada como "fluorescencia corregida" en la figura 42D). Este procedimiento extendió el intervalo dinámico eficaz de cuantificación entre 10 y 1 copias iniciales de la plantilla.
Los picos de fusión pueden distinguir productos específicos de productos no específicos (figura 40) y pueden distinguir dos productos purificados de la PCR mezclados conjuntamente (figura 41), de manera que podrían ser útiles para distinguir dos productos específicos amplificados juntos en un único tubo de reacción. Las curvas de fusión obtenidas por monitorización continua de las reacciones PCR, según la presente invención, son útiles en la PCR multiplex.
Ejemplo 12
En este ejemplo, se amplificaron simultáneamente dos fragmentos de genes a partir de ADN genómico y se monitorizaron con la fluorescencia del SYBR™ Green I. Durante cada ciclo de amplificación, se desnaturalizan diferentes productos de amplificación a temperaturas de fusión dependientes de la longitud del producto, la proporción de GC; y otros factores bien conocidos en la técnica. La temperatura a la que cada producto se funde se puede monitorizar con el colorante específico de doble cadena, SYBR™ Green I. Se amplificó un fragmento de 81 pares de bases del gen de la fibrosis cística utilizando los cebadores descritos en la presente como SEQ ID No: 14 y SEQ ID No: 15 junto con un fragmento de 98 pares de bases del oncógeno c-erB-2 (HER2/neu) utilizando los cebadores descritos en la presente como SEQ ID No: 16 y SEQ ID No: 17.
Las reacciones de amplificación estaban comprendidas de Tris-HCl 50 mM, pH 8,3, MgCl_{2} 3 mM, 500 \mug/ml de albúmina de suero bovino, 200 \muM de cada dNTP, y 0,5 \muM de los cebadores de la fibrosis cística, 0,3 \muM de los cebadores HER2/neu, una dilución 1:30.000 de SYBR™ Green I, 1 U de AmpliTaq Gold ADN polimerasa (Perkin Elmer, Foster City, CA), y 50 ng de ADN genómico humano en 10 \mul.
Después de la activación de la polimerasa a 95ºC durante 30 minutos, las muestras se sometieron a un ciclo a 94ºC durante 0 segundos (pendiente = 20), 55ºC durante 0 segundos (pendiente = 20), y 70ºC durante 10 segundos (pendiente = 20) durante 35 ciclos. Las muestras se enfriaron hasta 70ºC, y se adquirieron los valores de fluorescencia de forma continua durante un gradiente de 0,2ºC/s hasta 94ºC. Las curvas de fusión (figura 43) mostraron claramente dos productos diferentes que funden a 78ºC (CFTR) y 88ºC (neu). Los dos productos difieren en la Tm en, aproximadamente, 10ºC y son fácilmente distinguibles.
La amplificación multiplex es útil en los casos en que se necesita un control interno durante la amplificación. Por ejemplo, muchas translocaciones son detectables mediante la PCR colocando cebadores a cada lado del punto de ruptura. Si no tiene lugar la amplificación, no habrá translocación, siempre y cuando el ADN esté intacto y no esté presente ningún inhibidor. Estas posibilidades se pueden descartar amplificando un locus de control positivo en la misma mezcla de reacción. Dichas amplificaciones de control se realizan mejor como controles internos con una amplificación y detección simultánea.
Ejemplo 13
En este ejemplo, se siguió el procedimiento del Ejemplo 12 a excepción de que después de la activación de la polimerasa a 95ºC durante 30 minutos, las muestras se sometieron a un ciclo a 94ºC durante 0 segundos (pendiente = 20), 55ºC durante 0 segundos (pendiente = 20), y 70ºC durante 10 segundos (pendiente = 20) durante 20 ciclos, seguido de 94ºC durante 0 segundos (pendiente = 1), 55ºC durante 0 segundos (pendiente = 20), y 70ºC durante 20 segundos (pendiente = 20) durante 15 ciclos. Para los ciclos 26-31, se adquirieron valores de fluorescencia de forma continua durante cada transición de 1ºC/s desde 70ºC hasta 94ºC. Las curvas de fusión se transformaron en picos de fusión y se mostraron (figura 44).
Hay que apuntar que la eficacia de la amplificación del fragmento de CFTR aparece más grande que la del fragmento de neu. La eficacia de la amplificación se puede determinar de forma rigurosa integrando los datos de los picos de fusión, tal como se indica en el Ejemplo 10.
Este tipo de datos cuantitativos referidos a un control tiene muchas aplicaciones. Por ejemplo, ciertos oncógenos, tales como HER2/neu, se amplifican in vivo en muchos tumores. Es decir, los genes se replican en el ADN genómico, algunas veces con muchas réplicas. Frecuentemente, el comportamiento clínico del tumor depende del grado de replicación del oncógeno. La amplificación del oncógeno y una plantilla de control permiten la evaluación cuantitativa del número de copias relativo. A modo de ejemplo adicional, la cuantificación de la carga viral en pacientes infectados con VIH o hepatitis C es importante en la prognosis y la terapia. Utilizando una plantilla de control y monitorizando la eficacia de la amplificación de las plantillas, tanto de control como naturales, durante la amplificación, se consigue una cuantificación exacta del número de copias iniciales de las plantillas.
La característica de la presente invención de utilizar curvas de fusión para la cuantificación relativa se explicará a continuación. Según la presente invención, una utilización adicional de las curvas de fusión es la PCR cuantitativa. La figura 42 mostró que había una correlación entre el área bajo el pico de fusión y la cantidad de producto específico. La cuantificación relativa de dos productos de la PCR sería posible si los dos productos se amplificaran con una eficacia similar (o si se conocieran las diferencias en las eficacias y se compensaran). La cuantificación relativa de dos productos integrando las áreas de los picos de fusión (véase el Ejemplo 10) es una aspecto de la presente invención.
Ejemplo 14
Se amplificaron y purificaron los fragmentos de los genes de la fibrosis cística y HER2-neu del Ejemplo 12, tal como se indica en el Ejemplo 2 y se ajustaron a 175 \mug/ml. Las muestras se mezclaron en varias proporciones (total de 8 \mul) y se añadieron a una solución tampón (1 \mul) y SYBR™ Green I (1 \mul). Las concentraciones finales fueron Tris 50 mM, pH 8,3, MgCl_{2} 3 mM, albúmina de suero bovino 250 \mug/ml, y una dilución 1:30.000 de SYBR™ Green I. Las curvas de fusión se obtuvieron a 0,2ºC/s, se extrajo la fluorescencia de fondo y se integraron los picos, tal como se describe en el Ejemplo 10. Los resultados se muestran en la figura 45. Se encontró una correlación excelente entre las áreas relativas bajo los picos de fusión y las cantidades relativas de los dos productos.
La cuantificación relativa de los dos productos de la PCR es importante en muchas aplicaciones cuantitativas de la PCR. La amplificación multiplex de dos o más productos seguida de la integración de las áreas bajo los picos de fusión será extremadamente útil en estas áreas. El ARNm se cuantifica frecuentemente en relación con la cantidad de ARNm de un gen doméstico.
Otra utilización importante de la cuantificación relativa se encuentra en la PCR cuantitativa competitiva. Habitualmente, se sintetiza un competidor que tiene los mismos puntos de cebado, pero que difiere en la longitud de la secuencia diana original. Se añaden cantidades conocidas del competidor a una muestra desconocida y se realiza la cuantificación relativa. Los competidores se pueden producir de manera que difieran de la secuencia diana en la Tm en lugar de la longitud. Las cantidades relativas de los productos se pueden cuantificar comparando las áreas bajo sus puntos de fusión. Dado que se conoce la cantidad de uno de los productos, se puede obtener la cantidad de la diana original. La utilización del método de los picos de fusión es significativamente más fácil que los métodos utilizados actualmente que implican múltiples tubos en funcionamiento para cada muestra desconocida y, frecuentemente, sacando tubos en varios números de ciclos durante la reacción para encontrar la parte logarítmica lineal de la reacción. A continuación, se deben determinar las cantidades relativas de los dos productos. Habitualmente, esto se realiza marcando uno de los dNTPs con un radioisótopo y, a continuación, se cuantifica la cantidad de marcador incorporado en cada banda después de la electroforesis en gel de agarosa. En comparación, la presente invención permite la monitorización continua de la reacción, de manera que la parte logarítmica lineal de la amplificación se puede identificar fácilmente. La cuantificación relativa se puede realizar rápidamente mediante la integración de los picos de fusión. Un proceso de un día de duración se reduce a menos de una hora.
A partir de la discusión anterior, se valorará que la monitorización de la fluorescencia durante la amplificación de ADN es una técnica analítica extraordinariamente poderosa. Cuando se desean la detección y la cuantificación específicas de una secuencia, se pueden utilizar sondas de transferencia de energía de resonancia en lugar de colorantes de ADN específico de doble cadena. La Tm de las sondas de hibridación se desplaza, aproximadamente, 4-8ºC si se encuentra presente una base individual que no se apareja bien. Si se coloca una sonda de hibridación en un sitio de mutación, las mutaciones de bases individuales son detectables como un desplazamiento en la temperatura de fusión de la sonda.
Concentración absoluta del producto mediante la cinética de la refijación del producto. Las determinaciones de la concentración de producto se llevan a cabo también de forma ventajosa utilizando la presente invención. La monitorización continua de la formación de ADN de doble cadena permite la cuantificación del ADN en cualquier ciclo de la amplificación mediante la cinética de la refijación. La temperatura de la muestra se disminuye rápidamente desde la temperatura de desnaturalización y se mantiene constante a una temperatura inferior que aún es suficientemente elevada para evitar la fijación del cebador (figura 2). La velocidad de refijación del producto sigue una cinética de segundo orden (véase B. Young y M. Anderson, "Quantitative analysis of solution hybridation" ("Análisis cuantitativo de la hibridación de la solución"), En: "Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach" ("Hibridación de ácidos nucleicos: una aproximación práctica") 47-71 (B. Hames y S. Higgins, eds. (1985)).
Para cualquier temperatura y producto de la PCR dados, se puede medir una constante de velocidad de segundo orden. Una vez se conoce la constante de velocidad, se puede determinar cualquier concentración de ADN desconocida a partir de los datos experimentales de refijación. El enfriamiento nunca es instantáneo, y parte de la refijación puede tener lugar antes de que se alcance una temperatura constante. Un enfriamiento rápido maximizará la cantidad de datos disponibles para la determinación de la constante de velocidad y la concentración de ADN. La técnica requiere el producto de la PCR puro, pero eso se puede asegurar mediante las curvas de fusión obtenidas también durante el ciclado de temperaturas que utiliza la presente invención. Este método de cuantificación de la presente invención es, de forma ventajosa, independiente de cualquier variación de la intensidad de la señal entre las muestras.
Ejemplo 15
Se amplificó un fragmento de 536 pares de bases del gen de la beta-globina del ADN genómico humano (Ejemplo 3) y se purificó (véase el Ejemplo 2). Se mezclaron diferentes cantidades del ADN purificado con una dilución 1:30.000 de SYBR™ Green I en 5 \mul de Tris 50 mM, pH 8,3 y MgCl_{2} 3 mM. Las muestras se desnaturalizaron a 94ºC y, a continuación, se enfriaron rápidamente hasta 85ºC. Se monitorizó con el tiempo la fluorescencia a 520-500 nm a 85ºC. Cuando se probaron diferentes concentraciones de ADN, la forma de la curva de refijación era característica de la concentración de ADN (véase la figura 49). Para cualquier temperatura y producto de la PCR dados, se puede determinar una constante de velocidad de segundo orden. La figura 50 muestra la determinación de una constante de velocidad de la refijación de segundo orden para 100 ng del fragmento de 536 pares de bases en 5 \mul a 85ºC. La curva se ajustó mediante una regresión mínimo-cuadrática no lineal con F_{max}, F_{min}, t_{o} y k como parámetros de flotación utilizando la ecuación de velocidad de segundo orden mostrada en la figura 50. Los programas de análisis para este tipo de ajuste de curvas son bien conocidos en la técnica (por ejemplo, el usuario definió el ajuste de la curva de Delta Graph, DeltaPoint, Inc, Monteray, CA). Una vez se conoce la constante de velocidad, se puede determinar cualquier concentración de ADN desconocida a partir de los datos experimentales de refijación.
Con la constante de velocidad (k) definida, se determinan las concentraciones de ADN en las muestras desconocidas. Las curvas de la fluorescencia frente al tiempo de las muestras desconocidas se ajustan mediante una regresión mínimo-cuadrática no lineal, preferiblemente, durante el ciclado de temperatura en tiempo real (por ejemplo, utilizando el método no lineal de Levenberg-Marquardt descrito en el entorno de programación LabView, Nacional Instruments, Austin, TX). Para este ajuste, F_{max}, F_{min}, t_{o}, y la [ADN] son los parámetros de flotación y k es constante.
Dado que algunos colorantes fluorescentes afectan a la refijación dependiente de alguna manera de la concentración, la suposición de la cinética de segundo orden para la refijación del producto se comprueba mediante la determinación de la constante de velocidad a diferentes concentraciones estándares de ADN. Se define la relación y se incorporan como necesarias las fórmulas alternativas para el ajuste.
Las velocidades de fijación de la sonda se utilizan para determinar la concentración de producto de forma similar al método descrito anteriormente para determinar la concentración del producto mediante la refijación del producto. Las etapas se resumen, tal como se indica a continuación: (1) elección de la ecuación de velocidad adecuada para el sistema, (2) análisis de estándares de ADN conocidos para determinar la constante de velocidad, (3) comprobación de la validez de la ecuación de velocidad comparando las diferentes constantes de velocidad derivadas de las diferentes concentraciones, y (4) utilización de las constantes de velocidad para determinar la concentración de ADN de muestras desconocidas a partir de sus datos de fijación de la sonda.
Retroalimentación de la fluorescencia para el control del ciclado de temperaturas. En comparación con el análisis de punto final y ciclo por ciclo, la presente invención también puede monitorizar la fluorescencia a lo largo de cada ciclo de temperaturas. Se puede utilizar la monitorización continua de la fluorescencia para controlar los parámetros del ciclado de temperaturas. La presente invención utiliza la retroalimentación de la fluorescencia para el control a tiempo real y la optimización de la amplificación. Se puede utilizar la monitorización continua de la fluorescencia de las muestras de la PCR que contienen un colorante de ADN específico de doble cadena o sondas de oligonucleótidos marcados de forma fluorescente, para monitorizar la hibridación y la fusión durante los ciclos de amplificación individual. Este información se puede utilizar mediante los algoritmos de control de temperatura en los aparatos de ciclado de temperaturas para mejorar y normalizar las condiciones de ciclado térmico. La PCR convencional se realiza programando todos los parámetros del ciclado antes de la amplificación. Con una monitorización continua, la determinación de los requerimientos para el ciclado de temperaturas puede tener lugar durante la amplificación, basándose en la observación continua de la fijación, extensión, y desnaturalización. Entre las ventajas potenciales de la utilización de la información de hibridación para controlar el ciclado de temperaturas se incluyen:
1. Asegurar la desnaturalización completa del producto de la PCR en cada ciclo:
a.
Minimizando la exposición a temperaturas de desnaturalización excesivamente elevadas, evitando así el daño inducido por el calor en los productos de amplificación y la polimerasa. La limitación del tiempo que el producto está expuesto a las temperaturas de desnaturalización es especialmente útil para la amplificación de productos largos.
b.
Incrementando la especificidad de la reacción minimizando la temperatura de desnaturalización. Esto se selecciona frente a productos con una Tm superior a la del producto de amplificación deseado.
2. Maximizar la eficacia de la amplificación asegurando el tiempo adecuado para la fijación del cebador en cada ciclo:
a.
Minimizando la cantidad de tiempo necesario para la amplificación sin permitir más tiempo del necesario para alcanzar una cierta eficacia de fijación del cebador.
b.
Aumentando la especificidad de la reacción minimizando el tiempo en la temperatura de fijación.
3. Maximizar la eficacia de la amplificación asegurando el tiempo adecuado para la extensión del producto en cada ciclo:
a.
Minimizando la cantidad de tiempo necesario para la amplificación sin permitir más tiempo del necesario para completar la extensión del producto.
b.
Aumentando la especificidad de la reacción seleccionando frente a productos más largos que el producto de amplificación deseado. Esto requeriría más tiempo que el asignado para completar la extensión del producto.
4. Iniciar los cambios del ciclado térmico dependientes del nivel de fluorescencia obtenido o de la eficacia actual de la amplificación. Por ejemplo, se pueden minimizar la sobreamplificación y los productos de reacción no específicos finalizando el ciclado térmico cuando la eficacia disminuye hasta un cierto nivel. En otro ejemplo, el ciclado de temperaturas se puede modificar para iniciar gradientes de temperaturas más lentos para la adquisición de curvas de fusión cuando se puede detectar la fluorescencia. Esto ahorra tiempo ya que los gradientes más lentos no son necesarios en los ciclos iniciales. Otros cambios deseables pueden resultar evidentes en la práctica continua de la presente invención.
El control está basado en una estimación de los parámetros de reacción a partir de los datos de fluorescencia. Los datos originales de fluorescencia se adquieren como un cambio de la fluorescencia con el tiempo (velocidades específicas de las temperaturas de desnaturalización, fijación, y extensión), un cambio en la fluorescencia con la temperatura (Tm del producto o la sonda), o un cambio en la extensión de la amplificación (rendimiento y eficacia de la amplificación). Estas velocidades, Tms y su primera y segunda derivada se utilizan para determinar los parámetros de reacción óptimos que incluyen la temperatura de desnaturalización y el tiempo, la temperatura de fijación del cebador y el tiempo, la temperatura de fijación de la sonda y el tiempo, la temperatura de extensión de la enzima y el tiempo, y el número de ciclos.
Los colorantes de ADN específico de doble cadena se utilizan para el control de la desnaturalización, el control de la extensión, y para iniciar los cambios de ciclado térmico en un cierto nivel de amplificación o eficacia.
Ejemplo 16
Se modificó un ciclador térmico comercial de monitorización de la fluorescencia (LC24 LightCycler, Idaho Technology Inc., Idaho Falls, Idaho), de manera que no se programa el software con los puntos de entrada temperatura/tiempo, pero se programa para obtener valores de fluorescencia y, a continuación, utilizar estos valores para el control del ciclador térmico.
Tal como se representa en el Diagrama de Bloques Funcional (figura 51), el Programa Ejecución-Tiempo se comunica a través de interfaces en serie y tablero DAQ con el LightCycler. Esto permite un nivel de acceso elevado a los datos de temperatura o fluorescencia y se puede utilizar por el software del nivel del Tablero para el control de la temperatura. Sin embargo, en la presente realización del instrumento, sólo los datos de temperatura se transforman en forma digital en el nivel de hardware controlador. Los datos de la fluorescencia se envían de forma análoga a través del tablero interfaz de adquisición digital, se analiza mediante el Programa Ejecución-tiempo, y se devuelve al software del nivel del tablero a través de la interfaz en serie.
Control de la fusión del producto
Se adquirió un pico de fusión para el producto de la PCR deseado y se adquirió una fluorescencia de línea base para la muestra que contiene la mezcla de reacción a la temperatura a la que el producto se fundió completamente.
A continuación, cada ciclo de la reacción utilizó este valor de fluorescencia como un objetivo. La aproximación a la desnaturalización del producto se realizó en dos etapas para superar el lapso de tiempo debido a la necesidad de enviar el valor de fluorescencia a un ordenador remoto para el análisis, y, a continuación, devolver la instrucción de que el valor ha sido alcanzado. Con cada etapa de fusión del producto, la temperatura se incrementó hasta que la fluorescencia alcanzó un valor intermedio, a continuación, se redujo el poder de calefacción, de manera que una velocidad de gradiente de temperatura de, aproximadamente, 3ºC/s proporcionó al ordenador el tiempo para analizar la fluorescencia y señalar al ciclador térmico que había tenido lugar la desnaturalización del producto.
La representación temperatura/tiempo resultante (figura 52) muestra un incremento característico en la temperatura de fusión después del ciclo 20 a medida que aumenta la concentración del producto de amplificación. La Tm del producto es función de la concentración del producto.
Fijación/Extensión del producto
Durante la extensión constante a una temperatura de fijación/extensión combinada, se monitorizó la fluorescencia y esta información se utilizó para asegurar que se había permitido un tiempo adecuado, pero no excesivo, para la extensión del producto. La fluorescencia se monitorizó en intervalos de 10 segundos, si la fluorescencia aumentaba más que una proporción establecida (habitualmente, 1,00-1,05), a continuación, se continuaba la etapa de fijación/extensión. De lo contrario, se iniciaba la siguiente etapa de fusión del producto. El intervalo de 10 segundos se eligió para proporcionar un mínimo de 20 segundos en la temperatura de fijación/extensión.
La representación fluorescencia/tiempo resultante (figura 52) muestra un incremento característico en el tiempo de residencia a la temperatura de fijación/extensión combinada a medida que aumenta la concentración del producto de amplificación. A medida que la concentración del cebador y la polimerasa se hace limitante, se necesita más tiempo para completar la extensión del producto con cada ciclo.
Plateau de amplificación
Al final de cada etapa de fijación/extensión, se adquirió el valor de la fluorescencia y se guardó. Cuando este valor había aumentado hasta 1,2 veces el valor más bajo de la fluorescencia del final del ciclo y, posteriormente, se había parado el incremento por debajo de una proporción establecida por el usuario (habitualmente, 1,00-1,02), se terminó el ciclado térmico. Alternativamente, se inició la etapa de obtención de la curva de fusión introduciendo un segundo gradiente lento de temperaturas de 0,1-0,2ºC/s a lo largo de la Tm del producto y monitorizando de forma continua la fluorescencia de la muestra.
La representación fluorescencia/tiempo resultante (figura 52) muestra que después de veinticinco ciclos de amplificación, la proporción del crecimiento de la fluorescencia ciclo por ciclo cayó por debajo de 1,00 y se terminó la reacción.
En una realización de la presente invención, se utiliza la detección del plateau de amplificación para obtener curvas de fusión de elevada resolución para cada muestra en un proceso de muestras múltiples en el ciclo de temperatura óptima para cada muestra. A medida que la muestra alcanza su plateau de amplificación, se obtiene una curva de fusión para esa muestra, a continuación, el ciclado regular de temperaturas se reanuda hasta que otra reacción alcanza su plateau de amplificación.
Resumen
A partir de la discusión anterior, se valorará que la monitorización continua de la fluorescencia durante la amplificación de ADN para monitorizar la hibridación es una técnica analítica extraordinariamente poderosa. Utilizando los métodos descritos en la presente y dependiendo del número de copias iniciales de las plantillas presentes, se puede conseguir la identificación y cuantificación del producto en cinco a veinte minutos después del inicio del ciclado de temperaturas. La presente invención consiguió varias ventajas no disponibles hasta la fecha en la técnica. Por ejemplo, la presente invención proporciona métodos de fluorescencia de un único color para monitorizar la pureza del producto, la cuantificación relativa mediante la PCR multiplex o la PCR competitiva, la cuantificación absoluta del producto mediante la cinética de refijación, y un método mejorado para la cuantificación de la plantilla inicial mediante representaciones de la fluorescencia frente al número de ciclos.
La siguiente tabla describe colorantes de ADN específico de doble cadena útiles en la monitorización continua de la PCR. La fluorescencia de los colorantes de ADN específico de doble cadena depende del estado de la cadena del ADN.
Resumen de sondas fluorescentes para la monitorización continua de la PCR
Hibridación Colorante de dsADN
Mecanismo Estado de la cadena
Síntesis de la sonda Innecesario
Especificidad Tm del producto
Análisis de fusión Sí
Análisis multicolor No
Según la presente invención, el tiempo, la temperatura y la fluorescencia se adquieren de 1-10 veces cada segundo y los detalles exactos de la hibridación del producto y/o la sonda se observan durante el ciclado de temperaturas. Con el colorante de ADN específico de doble cadena SYBR™ Green I, se utiliza la hibridación del producto con respecto a la temperatura para identificar los productos mediante curvas de fusión. Además, la cuantificación relativa del producto se consigue mediante la amplificación multiplex de dos o más productos diferentes que difieren en la Tm. Además, la PCR competitiva se realiza alterando la secuencia interna en los cebadores comunes, de manera que dos o más productos tienen Tms diferentes. La cuantificación absoluta del producto se obtiene enfriando rápidamente el producto desnaturalizado y observando la cinética de refijación. La sensibilidad de la cuantificación de la plantilla inicial con las representaciones de la fluorescencia frente al número de ciclos se incrementa mediante el análisis de las curvas de fusión del producto para controlar la amplificación no específica y los algoritmos de ajuste de las curvas. Finalmente, la retroalimentación inmediata de la fluorescencia para controlar las condiciones de desnaturalización, los tiempos de elongación y el rendimiento del producto se obtienen monitorizando el estado de la cadena del producto con colorantes de ADN específico de doble cadena.
Cuando se desea el análisis multiplex en una reacción PCR, es una práctica común utilizar diferentes marcadores fluorescentes con un espectro de emisión distinguible para identificar los múltiples productos. El análisis es complicado por el número limitado de fluoróforos disponibles y el solapamiento de los espectros de emisión de estos fluoróforos que están disponibles (ver HM Shapiro, véase anteriormente). El análisis de la hibridación de la sonda o el producto con las curvas de fusión es otro método para distinguir múltiples productos de la PCR. Siguiendo la hibridación durante el ciclado de temperaturas, se puede minimizar el número de sondas y/o colores espectrales necesarios para distinguir los múltiples productos.
En las siguientes páginas se encuentra el código de programación para llevar a cabo la curva de fusión y otros análisis.
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(1) INFORMACIÓN GENERAL
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(i)
SOLICITANTE: Wittwer, Carl T.
\hskip3.9cm
Ririe, Kirk M. 
\hskip3.9cm
Rasmussen, Randy P. 
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Monitorización de la hibridación durante la PCR
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 27
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Thorpe, North and Western, L.L.P.
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(B)
CALLE: 9035 South 700 East, Suite 200
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Sandy
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(D)
ESTADO: Utah
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: Estados Unidos
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CP: 84070
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
FORMATO DE LECTURA EN EL ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO DE MEDIO: Disquete, 3,5 pulgadas, capacidad 1,44 Mb
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: Toshiba T2150CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: Windows 95
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
SOFTWARE: Word Perfect 7.0
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD:
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(B)
FECHA DE REGISTRO:
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
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(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/658.993
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE REGISTRO: 4-JUNIO-96
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/818.267
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE REGISTRO: 17-MARZO-97
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(viii)
INFORMACIÓN DEL APODERADO/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Alan J. Howarth
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(B)
NÚMERO DE REGISTRO: 36.553
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(C)
NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 8616.CIP7
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
INFORMACIÓN POR TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TELÉFONO: (801)566-6633
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TELEFAX: (801)566-0750
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 1
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 pares de bases
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(B)
TIPO: Ácido nucleico
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(C)
CADENAS: Una
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(D)
TOPOLOGÍA: Lineal
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(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CGTGGTGGAC TTCTCTCAAT 
\hfill
20 
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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 2
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(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
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(A)
LONGITUD: 20 pares de bases
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(B)
TIPO: Ácido nucleico
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(C)
CADENAS: Una
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(D)
TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AGAAGATGAG GCATAGCAGC 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 3
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 35 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENAS: Una
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CAAACAGACA CCATGGTGCA CCTGACTCCT GAGGA 
\hfill
35 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 4
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENAS: Una
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AAGTCTGCCG TTACTGCCCT GTGGGGCAAG 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 5
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENAS: Una
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TCTGCCGTTA CTGCCCTGTG GGGCAAG 
\hfill
27 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 6
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENAS: Una
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CAACTTCATC CACGTNCACC 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 7
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENAS: Una
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTGTCCGTGA CGTGGATT 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 8
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENAS: Una
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AAGTCCTCCG AGTATAGC 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 9
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 46 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENAS: Una
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TAATCTGTAA GAGCAGATCC CTGGACAGGC GAGGAATACA GGTATT 
\hfill
46 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 10
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 46 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENAS: Una
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TAATCTGTAA GAGCAGATCC CTGGACAGGC AAGGAATACA GGTATT 
\hfill
46 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 11
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENAS: Una
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TAATCTGTAA GAGCAGATCC 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 12
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENAS: Una
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TGTTATCACA CTGGTGCTAA 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 13
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENAS: Una
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AATACCTGTA TTCCTCGCCT GTC 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 14
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENAS: Una
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ATGCCTGGCA CCATTAAAGA 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 15
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENAS: Una
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCATGCTTTG ATGACGCTTC 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 16
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENAS: Una
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CGGATCTTCT GCTGCCGTCG 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 17
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENAS: Una
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCTCTGACGT CCATCATCTC 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 18
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 31 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENAS: Una
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GAAGTCTGCC GTTACTGCCC TGTGGGGCAA G 
\hfill
31 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 19
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENAS: Una
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTGCCGTACT GCCCTGTGGG GCAAGG 
\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 20
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENAS: Una
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ATGCCCTCCC CCATGCCATC CTGCGT 
\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 21
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENAS: Una
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CAACTTCATC CACGTTCACC 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 22
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENAS: Una
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GTCTGCCGTT ACTGCCCTGT GGGGCAA 
\hfill
27 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 23
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 32 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENAS: Una
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCTCAAACAG ACACCATGGT GCACCTGAGT CC 
\hfill
32 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 24
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENAS: Una
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GAAGTCTGCC GTTACTGCCC TGTGGGGCAA 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 25
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENAS: Una
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TGAAGGAGAA GGTGTCTGCG GGA 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 26
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENAS: Una
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCTCGGCTAA ATAGTAGTGC GTCGA 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 27
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENAS: Una
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AGGACGGTGC GGTGAGAGTG 
\hfill
20

Claims (6)

1. Método de monitorización a tiempo real de la amplificación de una secuencia de ácidos nucleicos diana en una muestra biológica, comprendiendo dicho método las etapas de:
la amplificación de la secuencia objetivo por la reacción en cadena de la polimerasa en presencia de una cantidad de SYBR™ Green I, comprendiendo dicha reacción en cadena de la polimerasa las etapas de adición a la muestra biológica de SYBR™ Green I, una polimerasa termoestable y cebadores para la secuencia de ácidos nucleicos diana para crear una mezcla de amplificación y el ciclado térmico de la mezcla de amplificación entre, como mínimo, una temperatura de desnaturalización y una temperatura de elongación durante un conjunto de ciclos de amplificación; y
la iluminación de la mezcla con una luz a una longitud de onda absorbida por el SYBR™ Green I en, como mínimo, una parte del conjunto de ciclos de amplificación, y la detección de una emisión fluorescente del SYBR™ Green I tras la iluminación de la muestra, estando relacionada dicha emisión fluorescente con la cantidad de ácido nucleico diana amplificado en la muestra,
o bien, la iluminación de la muestra con una luz a una longitud de onda absorbida por el SYBR™ Green I posterior a, como mínimo, una parte del conjunto de ciclos de amplificación, y la monitorización de la emisión fluorescente del SYBR™ Green I en la muestra en función de la temperatura de la muestra para generar una curva de fusión para la secuencia diana amplificada.
2. Método, según la reivindicación 1, caracterizado por la iluminación de la mezcla con una luz a una longitud de onda absorbida por el SYBR™ Green I en, como mínimo, una parte del conjunto de ciclos de amplificación, y la detección de una emisión fluorescente del SYBR™ Green I tras la iluminación de la muestra, estando relacionada dicha emisión fluorescente con la cantidad de ácido nucleico diana amplificado en la muestra, y caracterizado además por la iluminación de la muestra con una luz a una longitud de onda absorbida por el SYBR™ Green I posterior a, como mínimo, una parte del conjunto de ciclos de amplificación, y la monitorización de la emisión fluorescente del SYBR™ Green I en la muestra en función de la temperatura de la muestra para generar una curva de fusión para la secuencia diana amplificada.
3. Método, según las reivindicaciones 1 ó 2, para detectar una secuencia de ácidos nucleicos diana en una muestra biológica durante la amplificación utilizando un perfil de ciclado rápido de temperaturas.
4. Método, según la reivindicación 3, en el que cada ciclo del perfil de ciclado rápido de temperaturas tiene una duración de menos de 2 minutos.
5. Método, según la reivindicación 3, en el que la muestra se ilumina y se detecta la fluorescencia a medida que aumenta la temperatura, para generar una curva de fusión.
6. Mezcla de reacción de la PCR para amplificar una secuencia de nucleótido diana, comprendiendo la mezcla una muestra de ADN que tiene los cebadores del oligonucleótido de la secuencia diana en una cantidad suficiente para la amplificación por PCR, una polimerasa termoestable y el SYBR™ Green I en una cantidad capaz de proporcionar una señal de fluorescencia indicativa de la concentración de la secuencia diana en dicha mezcla.
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