JP2000509608A - Ｐｃｒ中のハイブリダイゼーションのモニタリング - Google Patents

Ｐｃｒ中のハイブリダイゼーションのモニタリング

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Abstract

(57)【要約】 ポリメラーゼ・チェーン・リアクション中のハイブリダイゼーションをモニタする方法を開示する。本法は高速熱サイクルと二重鎖ＤＮＡ染料又は特異性ハイブリダイゼーション・プローブの使用で実現される。蛍光共鳴エネルギー転移対はフルオレセインとＣｙ５又はＣｙ５．５を含む。増幅ＤＮＡを定量し純度を判定するための方法は溶解及び徐冷復元曲線の分析により行なわれる。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称 ＰＣＲ中のハイブリダイゼーションのモニタリング 関連出願への相互参照 自動ポリメラーゼ連鎖反応装置と題する１９９０年６月４日付米国特許出願第 ０７／５３４，０２９号（現在は破棄されている）の部分継起出願である高速熱 サイクル装置と題する１９９２年１月２日付米国特許出願第０７／８１５，９６ ６号（現在は破棄されている）の部分継起出願である高速熱サイクル装置と題す る１９９４年１月１０日付米国特許出願第０８／１７９，９６９号（現在の米国 特許第５，４５５，１７５号）の部分継起出願である生物学的サンプルの高速熱 サイクルのための方法と題する１９９５年１０月２日付米国特許出願第０８／５ ３７，６１２号の部分継起出願であるＰＣＲ処理をモニタするためのシステム及 び方法と題する１９９６年６月４日付米国特許出願第０８／６５８，９９３号の 部分継起出願である第Ｖ因子ライデン変異を検出するための方法と題する１９９ ７年３月１７日付米国特許出願第０８／８１８，２６７号。上記出願の各々はそ の全体で本明細書において参照として個別に各々含まれる。生物学的処理を実施 しモニタするためのシステム及びその方法と題し、ユタ大学研究財団が出願人で カール・Ｔ・ウィットワー、カーク・Ｍ・ライリー、ランディ・Ｐ・ラスムッセ ン、デビッド・Ｒ・ヒルヤードを米国における発明者兼出願人とする同時出願中 の１９９７年６月４日付米国事務局（ＲＯ／ＵＳ）受付ＰＣＴ出願出願番号ＰＣ Ｔ／ＵＳ９７／＿＿もその全体を本明細書の参照に含む。 発明の背景 本発明は一般にポリメラーゼ連鎖反応に関連したハイブリダイゼーションによ り得られる蛍光信号を観察することに関する。さらに詳しくは、本発明はＰＣＲ 実施中および／または直後に蛍光によるハイブリダイゼーションの観察及びこの 情報を生成物の同定、配列変化検出及び定量に使用することに関する。 ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は分子生物学の基本であり臨床検査的に第１ の実用分子技術である。その有用性や一般性にもかかわらず、ＰＣＲについての 現在の理解は非常に進んでいるとはいえない。増幅が成功するのに充分な条件は 試行錯誤によって見つけ出す必要があり最適化は経験に頼つている。当業者であ っても工程についての分かり易い又は予測的理論なしで強力な技術を使用する必 要がある。 ＰＣＲはサンプルの熱サイクルによって行なわれ、ＤＮＡを変性（分離）し、 特定プライマーを付着（アニーリング）し、複製を行なわしめる（拡張）。ＰＣ Ｒの１サイクルは一般に２から８分で行なわれ、３０サイクルの増幅には１から ４時間を必要とする。大抵のＰＣＲ装置におけるサンプル温度応答は変性、アニ ーリング、拡張に必要な時間に比べれば非常に遅い。ＰＣＲでの物理的（変性及 びアニーリング）及び酵素的（拡張）反応は非常に迅速に起こる。ＰＣＲの増幅 時間は数時間から１５分以内に減少可能である。本明細書において参照に含まれ る１９９５年１０月２日付米国特許出願第０８／５３７，６１２号では、このよ うな高速サイクル・システムを開示している。高速サイクル技術は表面積対容積 比が大きなサンプル容器たとえば毛細管のサンプルで可能な高速温度応答及び温 度均一性によって可能になる。さらに詳しい情報については、Ｋ．Ｂ．ムリス、 Ｆ．フェレ、Ｒ．Ａ．ギブス著、ポリメラーゼ連鎖反応、バークハウザー出版（ １９９４年）、１７４〜１８１ページの、Ｃ．Ｔ．ウィットワー、Ｇ．Ｂ．リー ド、Ｋ．Ｍ．ライリー共著、高速サイクルＤＮＡ増幅も参照のこと。温度均一性 の改善によりＰＣＲの時間及び温度条件は良く定義され理解されるようになる。 温度均一性の改善は増幅中のＰＣＲをモニタするために使用される分析技術の精 度も向上させる。 フルオロメトリは分子生物学に多くの用途を持つ高感度で汎用の技術である。 臭化エチジウムはゲル電気泳動により分離される核酸のサイズ分布を視覚化する ために長年の間使用されてきた。通常はゲルを紫外光で透過照明すると二重鎖核 酸の赤色蛍光が観察される。さらに詳しくは、臭化エチジウムは増幅が完了した 後でＰＣＲの生成物を分析するために共通に使用される。さらに、本明細書で参 照に含まれるヒグチ＆ワトソンのＥＰＡ特許出願第０６４０８２８Ａ１号では増 幅中に臭化エチジウムを使用して各サイクルで蛍光を測定することによる二重鎖 ＤＮＡの量をモニタする方法を開示している。蛍光強度は温度に逆比例して上下 し、アニーリング／拡張温度（５０℃）で最大、また変性温度（９４℃）で最低 だったと記載された。最大の蛍光は各サイクルでＤＮＡ量の尺度として取得され た。ヒグチ＆ワトソンの出願はハイブリダイゼーション発生をモニタするために 蛍光を使用することを教示しておらず、ハイブリダイゼーションの範囲を追跡す るため異なる温度での蛍光を観察することも示唆していない。さらに、ヒグチ＆ ワトソンはＰＣＲ生成物の同定又は定量のためにＰＣＲ生成物ハイブリダイゼー ションの温度依存性を使用することも教示又は示唆し得なかった。 しかしヒグチ＆ワトソン出願は、ゲルファンドらへの米国特許第５、２１０， ０１５号に開示されているように、ある種のＤＮＡポリメラーゼの５’エクソヌ クレアーゼ活性で水解される場合に蛍光を発生する二十標識プローブ・システム を含む他の蛍光を使用する方法を記述している。これらのプローブから観察され る蛍光は主として二つの蛍光物質の間でプローブの水解に依存する。ＰＣＲ生成 物の量は各サイクル毎に１回蛍光を測定することで推定される。これらのプロー ブのハイブリダイゼーションは水解が発生する必要があるように見えるが、蛍光 信号は主としてプローブの水解から得られるもので、ハイブリダイゼーションに よるものではなく、対向する端部に蛍光染料を付けたオリゴヌクレオチド・プロ ーブはＰＣＲ生成物と核酸ハイブリダイゼーションを検出するために有用な消光 プローブ・システムを提供する（Ｋ．Ｊ．リバックら、4 PCR Meth．Appl．357- 362(1995)）。蛍光でプローブハイブリダイゼーションの温度依存に追従しＰＣ Ｒ生成物の配列変化を同定することにはなんの示唆もされていない。 同定のための相補鎖に対する核酸の特異的ハイブリダイゼーションは多くの異 なるフォーマットで開発されてきた。たとえば、制限酵素による消化の後で、ゲ ノムＤＮＡをサイズ的に分割ハイブリッド化してサザンブロッティングのプロー ブとすることができる。別の例として、単一の塩基変異が対立遺伝子特異性オリ ゴヌクレオチドによる「ドット・ブロット」で検出できる。通常、ハイブリダイ ゼーションは単一温度で数分から数時間にわたって実施し必要な弁別を行なう。 これ以外に、蛍光技術を用いることで温度を変化させながらハイブリダイゼーシ ョン範囲を動的にモニタすることができる。たとえば、蛍光溶解曲線はハイブリ ダイゼーションをモニタするために使用されてきた。Ｌ．Ｅ．モリソン＆Ｌ．Ｍ ．ストールス、Sensitive fluorescence-based thermodynamic and kineticmeas urements of DNA hybridization in solution，32 Biochemistry 3095-3104，(1 993)。温度スキャン・レートは一般に毎時１０℃またはそれ以下で、一部には蛍 光光度計キュベットの熱容量が大きいことによる。 ハイブリダイゼーションをモニタするための現行方法は多くの時間を必要とす る。ハイブリダイゼーションが数時間ではなく数秒で起これば、高速サイクルＰ ＣＲの最中であってもハイブリダイゼーションはＰＣＲ増幅中にモニタできる。 ＰＣＲ中のハイブリダイゼーションモニタリングの多くの用途は、本明細書で完 全に開示するように、生成物の同定と定量、配列変化の検出、蛍光フィードバッ クによる温度サイクル・パラメータの自動制御を含む。 前述のように、従来技術では温度サイクルをゆっくりとまた経験的に行なって きた。ハイブリダイゼーションによるＰＣＲ生成物の分析が必要な場合、さらに 時間のかかるステップが必要である。つまり、ＰＣＲ中のハイブリダイゼーショ ンをモニタし、反応が行なわれている最中につまりサンプル操作なしで温度サイ クルの最中又は直後に反応を分析する方法を提供するのは当該技術における大き な進歩である。ＰＣＲ中のハイブリダイゼーションをモニタすることで、ＰＣＲ が機能することのできる基本原理に追従しまた使用して増幅中の反応を分析し最 適化することができる。 発明の簡単な概要 本発明の目的はＰＣＲ中の生成物ハイブリダイゼーションをモニタするための 二重鎖特異性DＮA染料を提供することである。 本発明の別の目的は蛍光溶解曲線によるＰＣＲ増幅生成物を同定するためのシ ステムを提供することである。 本発明のさらなる目的は二重鎖特異性ＤＮＡ染料によるＰＣＲ定量感度の改善 のための方法を提供することである。 本発明のさらに別の目的は溶解曲線によりＰＣＲで増幅された特定生成物の量 を決定して二重鎖特異性ＤＮＡ染料により検出された非特異的増幅を補正するこ とである。 本発明のさらに別の目的は二重鎖特異性ＤＮＡ染料による異なったＰＣＲ生成 物の相対的定量の方法を提供することである。 本発明の別の目的は二重鎖特異性ＤＮＡ染料の存在下に生成物のアニーリング 動態による生成物定量の方法を提供することである。 本発明のさらに別の目的はプライマーおよび／またはプローブのハイブリダイ ゼーションをモニタするための新規な共鳴エネルギー転移対を提供することであ る。 本発明のさらに別の目的は共鳴エネルギー転移対を使用する生成物に対するプ ローブのアニーリング動態による生成物定量の方法を提供することである。 本発明の目的はＰＣＲ増幅中に各サイクルのハイブリダイゼーション・プロー ブ又はプローブ群の蛍光を追跡することにより初期テンプレート・コピー数を決 定する方法を提供することである。 本発明の別の目的はＰＣＲプライマーと中間部でハイブリダイゼーションする 二つの標識プローブの間での共鳴エネルギー転移によるＰＣＲ生成物の均質な検 出のためのシステムを提供することである。 本発明のさらに別の目的は１つの標識プライマーとＰＣＲプライマーに中間部 でハイブリダイゼーションする１つの標識プローブの間の共鳴エネルギー転移に よりＰＣＲ生成物の均質な検出のためのシステムを提供することである。 本発明のさらなる目的は共鳴エネルギー転移とプローブ溶解曲線によるＰＣＲ プライマーへの中間部配列変化の検出のためのシステムを提供することである。 本発明のさらなる目的はプローブ溶解曲線による異なったＰＣＲ生成物の相対 定量のためのシステムを提供することである。 本発明のさらに別の目的は蛍光対サイクル数プロットを曲線適合することで初 期テンプレートのコピー数を決定するための方法を提供することである。 本発明のさらに別の目的はＰＣＲを高速で行なうためと反応を連続的にモニタ し反応が進行中に反応パラメータを調節するためのシステム及びその方法を提供 することである。 本発明のさらに別の目的は合成核酸アナログ又は誘導体による、たとえばペプ チド核酸（ＰＮＡ）により、蛍光化合物でこれらも又標識できる場合に核酸プロ ーブを置き換えることである。 本発明の上記及びその他の目的と利点は後述の詳細な説明と請求項とからさら に完全に明らかになるか、または本発明の実施により学習されよう。 本発明はＰＣＲ増幅と分析に必要な総時間数を従来技術に比べてとくに減少す る一方で同時に増幅条件を最適化することにより反応量を有意に増加するオプシ ョンを可能にするものである。 本発明はＤＮＡ増幅の連続的蛍光モニタのための方法とその応用を提供する。 必要とされる機材は光学的構成要素と構造を組み合わせて高速温度サイクルを提 供し各種の異なる蛍光技術によるＤＮＡ増幅を連続的にモニタする。１つの図示 した実施例において、蛍光は単一サンプルから連続的に、又はこれ以外ではサン プル全部に同時に高速熱サイクルが行なわれるようにした回転カローセル上の多 数サンプルから連続的に取得する。関連装置についてのさらなる情報は上記で参 照した米国特許出願に見ることができる。 本発明の１つの側面において、ＤＮＡ増幅中の蛍光は、１）二重鎖特異性染料 ＳＹＢＲTMグリーンＩ、及び２）ハイブリダイゼーション・プローブ付きＣｙ５TM 及びＣｙ５．５TMへのフルオレセインの共鳴エネルギー転移によりモニタされ た。サイクル毎に１回取得した蛍光データで初期テンプレート・コピー数の定量 が行なえる。 さらに、サイクルあたり１回の蛍光測定とは対照的に、各サイクルの間中連続 的に温度、時間、蛍光をモニタし、三次元螺旋を作成する本発明の実施例が開示 される。この三次元螺旋は温度対時間、蛍光対時間、蛍光対温度プロットに還元 可能である。ハイブリダイゼーション・プローブからの蛍光の蛍光対温度プロッ トは生成物の配列変化を検出するために使用できる。これらの配列変化は突然変 異又は多形性等では自然的、定量ＰＣＲの工学的変更テンプレート等では人工的 なものである。 本発明の別の側面において、蛍光モニタリングを用いて二重鎖特異性ＤＮＡ特 異的染料による蛍光モニタリングによるＰＣＲ中の生成物溶解曲線を取得する。 熱サイクラが生成物分解温度を通して過熱する際に温度の関数として蛍光をプロ ットすることで、ＰＣＲ生成物溶解曲線を得る。このＤＮＡ溶解曲線の形状と位 置はＧＣ／ＡＴ比及び配列の関数であり、溶解温度２℃以内で分離された増幅生 成物を区別するために使用できる。所望する生成物は、プライマー・ダイマーを 含む所望しない生成物から識別できる。溶解曲線の分析を用いると定量ＰＣＲの ダイナミックレンジを拡大し、また多重増幅での異なる生成物を識別することが できる。二重鎖染料、生成物変性、アニーリング、拡張の使用は各サイクル内で 継続できる。蛍光の連続モニタリングによって温度サイクル中の溶解曲線と生成 物アニーリング曲線の取得ができるようになる。 本発明は３０分以内での、さらに望ましくは１５分以内で、またもっとも望ま しくは1０分以内で、蛍光モニタリングによる増幅と分析を組み合わせた高速サ イクルＰＣＲのための試薬ならびに方法を提供する。 生物学的サンプルの標的ＤＮＡ配列を分析するための方法は、 前記標的配列の隣接領域にハイブリダイゼーションする２種類の核酸プローブ の存在下でポリメラーゼ連鎖反応法により前記標的配列を増幅し、前記プローブ の一方は受容体蛍光物質で標識し前記プローブの他方は蛍光エネルギー転移対の 供与体蛍光物質で標識して前記２種類のプローブと前記標的配列とのハイブリダ イゼーション時に前記供与体と受容体蛍光物質は互いに２５核酸以内にあり、前 記ポリメラーゼ連鎖反応には前記標的核酸配列に対する熱安定性ポリメラーゼ及 びプライマーを前記生物学的サンプルに添加するステップと、少なくとも変性温 度と拡張温度との間で前記生物学的サンプルを熱サイクルするステップとを含む 増幅ステップと、 前記供与体蛍光物質によって吸収される波長の光で前記生物学的サンプルを励 起して前記蛍光エネルギー転移対からの放射を検出するステップと、 を含むことを特徴とする。 生物学的サンプルの標的ＤＮＡ配列を分析するための方法は、 前記標的配列の隣接領域にハイブリダイゼーションする２種類の核酸プローブ の存在下でポリメラーゼ連鎖反応法により前記標的配列を増幅し、前記プローブ の一方は受容体蛍光物質で標識し前記プローブの他方は蛍光エネルギー転移対の 供与体蛍光物質で標識して前記２種類のプローブと前記標的配列とのハイブリダ イゼーション時に前記供与体と受容体蛍光物質は互いに２５核酸以内にあり、前 記ポリメラーゼ連鎖反応には前記標的核酸配列に対する熱安定性ポリメラーゼ及 びプライマーを前記生物学的サンプルに添加するステップと、少なくとも変性温 度と拡張温度との間で前記生物学的サンプルを熱サイクルするステップとを含む 増幅ステップと、 前記供与体蛍光物質によって吸収される波長の光で前記生物学的サンプルを励 起するステップと、 前記蛍光エネルギー転移対からの温度依存性蛍光をモニタするステップと、 を含むことを特徴とする。 生物学的サンプルの標的核酸配列のポリメラーゼ連鎖反応増幅をリアルタイム でモニタする方法は、 （ａ）前記生物学的サンプルに２種類の核酸プライマーと核酸プローブとの有 効量を添加し、前記プライマーの一方と前記プローブは各々が受容体蛍光物質と 供与体蛍光物質とを含む蛍光エネルギー転移対の一方の構成要素で標識され、前 記標識されたプローブは前記標識されたプライマーの１５ヌクレオチド以内の標 的核酸配列の増幅コピーとハイブリダイゼーションするステップと、 （ｂ）ポリメラーゼ連鎖反応により前記標的核酸配列を増幅するステップと、 （ｃ）前記供与体蛍光物質によって吸収される選択波長の光で前記生物学的サ ンプルを照明するステップと、 （ｄ）前記サンプルの蛍光放射を検出するステップと、 を含むことを特徴とする。 生物学的サンプルの標的核酸配列を増幅する方法の改良は、 （ａ）前記生物学的サンプルに核酸結合性蛍光体の有効量を添加するステップ と、 （ｂ）ポリメラーゼ連鎖反応を用いて前記標的核酸配列を増幅するステップで あって、初期の所定温度と時間パラメータを用いて前記生物学的サンプルを熱サ イクルし、さらに （ｉ）前記ポリメラーゼ連鎖反応中の蛍光体によって吸収される光の選択波長 で前記生物学的サンプルを照明するステップと、 （ｉｉ）前記サンプルからの蛍光をモニタして前記ポリメラーゼ連鎖反応の最 適温度及び時間パラメータを決定するステップと、 （ｉｉｉ）前記蛍光により前記初期温度及び時間を調節するステップと を含むことを特徴とする。 図示した１つの実施例において、蛍光体は二重鎖特異性ＤＮＡ結合染料を含み 、別の図示した実施例においては蛍光体は標的核酸配列にハイブリダイゼーショ ンする蛍光標識オリゴヌクレオチド・プローブを含む。 生物学的サンプルの標的核酸配列を検出するための方法は、 （ａ）前記生物学的サンプルに前記標的核酸配列とハイブリダイゼーションす るオリゴヌクレオチド・プローブの対の有効量を添加し、前記プローブの一方は 受容体蛍光物質で標識され、他方のプローブは蛍光エネルギー転移対の供与体蛍 光物質で標識され、前記供与体蛍光物質の放射スペクトルと前記受容体蛍光物質 の吸収スペクトルは２５％未満で重なり合い、前記受容体蛍光物質は１００，０ ００Ｍ-1ｃｍ-1より大きいピーク吸光係数を有し２種類のプローブのハイブリダ イゼーション時には前記供与体蛍光物質と受容体蛍光物質は互いに２５ヌクレオ チド以内にあるステップと、 （ｂ）前記供与体蛍光物質によって吸収される光の選択波長で前記生物学的サ ンプルを照明するステップと、 （ｃ）前記生物学的サンプルの放射を検出するステップと、 を含むことを特徴とする。 図示した共鳴エネルギー転移対は供与体としてフルオレセイン、又受容体とし てＣｙ５又はＣｙ５．５を含む。 生物学的サンプルの標的核酸配列のポリメラーゼ連鎖反応増幅をリアルタイム でモニタする方法は、 前記標的配列の隣接領域とハイブリダイゼーションする２種類の核酸プローブ の存在下でポリメラーゼ連鎖反応により前記標的配列を増幅し、前記プローブの 一方は受容体蛍光物質で標識され前記他方のプローブは蛍光エネルギー転移対の 供与体蛍光物質で標識されて、前記２種類のプローブと前記標的配列のハイブリ ダイゼーション時に、前記供与体蛍光物質と前記受容体蛍光物質は互いに２５ヌ クレオチド以内にあり、前記ポリメラーゼ連鎖反応は前記標的核酸配列の熱安定 性ポリメラーゼとプライマーを前記生物学的サンプルに添加するステップと、少 なくとも変性温度と拡張温度の問で前記生物学的サンプルを熱サイクルするステ ップとを含むステップと、 前記供与体蛍光物質により吸収される波長の光で前記生物学的サンプルを励起 して前記生物学的サンプルからの放射を検出するステップと、 前記蛍光エネルギー転移対からの温度依存性蛍光をモニタするステップと を含むことを特徴とする。 生物学的サンプルにおける標的核酸配列のポリメラーゼ連鎖反応増幅をリアル タイムでモニタする方法は、 ＳＹＢＲTMグリーンＩの存在下にポリメラーゼ連 鎖反応により前記標的配列を増幅し、前記ポリメラーゼ連鎖反応は前記標的核酸 配列の熱安定性ポリメラーゼとプライマーとを前記生物学的サンプルに添加する ステップと、少なくとも変性温度と拡張温度の間で前記生物学的サンプルを熱サ イクルするステップを含むステップと、 前記ＳＹＢＲTMグリーンＩによって吸収される波長の光で前記生物学的サンプ ルを励起して前記生物学的サンプルからの放射を検出するステップと、 前記ＳＹＢＲTMグリーンＩからの温度依存性蛍光をモニタするステップとを含 むことを特徴とする。望ましくは、前記モニタするステップは前記増幅された標 的配列の溶解プロファイルを決定するステップを含む。 生物学的サンプルの標的ＤＮＡ配列を分析するための方法は、 （ａ）２種類の核酸プライマーと核酸プローブとの有効量を前記生物学的サン プルに添加し、前記プライマーの一方と前記プローブは各々が受容体蛍光物質と 供与体蛍光物質からなる蛍光エネルギー転移対の一方の構成要素で標識され、前 記標識されたプローブは前記標識されたプライマーから１５ヌクレオチド以内の 前記標的核酸配列の増幅コピーとハイブリダイゼーションするステップと、 （ｂ）ポリメラーゼ連鎖反応により前記標的核酸配列を増幅するステップと、 （ｃ）前記供与体蛍光物質によって吸収される選択波長の光で前記生物学的サ ンプルを照明して前記サンプルの蛍光放射を検出するステップとを含むことを特 徴とする。別の図示した実施例において、本方法はさらに、望ましくは前記増幅 した標的配列の溶解温度を決定することによって、前記サンプルの温度依存性蛍 光をモニタするステップを含む。 第１の核酸において選択した配座での相違を第２の核酸と比較して検出する方 法は、 （ａ）ポリメラーゼ連鎖反応により、前記第１の核酸の選択したセグメントと 前記第２の核酸のこれに対応するセグメントとを増幅するように構成したオリゴ ヌクレオチド・プライマーの対を提供し、前記選択したセグメントとこれに対応 するセグメントは各々が前記選択した配座を含み、前記選択した配座のコピーを 含む増幅生成物が得られるようにするステップと、 （ｂ）オリゴヌクレオチド・プローブの対を提供し、前記プローブの一方は受 容体蛍光物質で標識し前記プローブの他方は蛍光共鳴エネルギー転移対の供与体 蛍光物質で標識しておき前記２種類のプローブと前記増幅生成物のハイブリダイ ゼーション時に前記供与体蛍光物質と受容体蛍光物質が共鳴エネルギー転移の関 係にあるようにし、前記プローブの一方は前記増幅生成物とハイブリダイゼーシ ョンするように構成されて前記プローブの前記一方が前記選択された配座にまた がり前記第１の核酸において前記第２の核酸の溶解プロファイルとは識別可能な 差が存在する場合に溶解プロファイルを示すようにするステップと、 （ｃ）前記第１の核酸の前記選択したセグメントと前記第２の核酸の前記これ に対応するセグメントとを有効量のプローブの存在下にポリメラーゼ連鎖反応に よって増幅し、増幅された選択セグメントと増幅された対応セグメントが得られ るようにし、その少なくとも一部分は共鳴エネルギー転移関係にある蛍光共鳴エ ネルギー転移対でこれらにハイブリダイゼーションされた両方のプローブを有す るステップと、 （ｄ）ハイブリダイゼーションされたプローブを有する前記増幅された選択セ グメントと前記増幅された対応セグメントとを選択された波長の光で照明して前 記蛍光共鳴エネルギー転移対による蛍光を顕在化させるステップと、 （ｅ）温度の関数として蛍光放射を測定して第１の核酸の前記増幅選択セグメ トから溶解する前記一方のプローブの第１の溶解プロファイルと第２の核酸の前 記増幅対応セグメトから溶解する前記一方のプローブの第２の溶解プロファイル において決定するステップと、 （ｆ）前記第１の溶解プロファイルを前記第２の溶解プロファイルと比較し、 ここでの相違が前記サンプル核酸における相違の存在を示すようにするステップ と、 を含むことを特徴とする。 第１の核酸において第２の核酸と比較して選択した配座での相違を検出する方 法は、 （ａ）ポリメラーゼ連鎖反応により、前記第１の核酸の選択されたセグメント と前記第２の核酸のこれに対応するセグメントとを増幅するように構成したオリ ゴヌクレオチド・プライマーの対を提供し、前記選択セグメントと対応セグメン トの各々が前記選択された配座を含み、前記選択された配座のコピーを含む増幅 生成物を得るようにするステップと、 （ｂ）オリゴヌクレオチド・プローブを提供し、前記プライマーの一方と前記 プローブとが各々供与体蛍光物質と受容体蛍光物質とを含む蛍光エネルギー転移 対の一方の構成要素で標識され、前記標識されたプローブと標識されたプライマ ーは前記増幅生成物とハイブリッド化して前記供与体蛍光物質と受容体蛍光物質 とが共鳴エネルギー転移関係に置かれるようにし、前記プローブは前記増幅生成 物とハイブリッド化するように構成されて前記プローブは前記選択された配座に またがり前記第２の核酸の溶解プロファイルから識別できる前記第１の核酸に相 違が存在する場合には溶解プロファイルを示すステップと、 （ｃ）前記第１の核酸の選択セグメントと前記第２の核酸のこれに対応するセ グメントとをポリメラーゼ連鎖反応により有効量のプライマー及びプローブの存 在下にて増幅し増幅された選択セグメントと増幅された対応セグメントを得るよ うにし、その少なくとも一部分は共鳴エネルギー転移関係にある前記蛍光共鳴エ ネルギー転移対によりこれらにハイブリダイゼーションされた標識プライマー及 びプローブを有するステップと、 （ｄ）前記標識プライマー及びプローブがハイブリッド化された前記増幅選択 セグメントと前記増幅対応セグメントを選択した波長で照明して前記蛍光共鳴エ ネルギー転移対による蛍光を顕在化するステップと、 （ｅ）前記第１の核酸の前記増幅選択セグメントから溶解する前記プローブの 第１の溶解プロファイルと前記第２の核酸の前記増幅対応セグメントから溶解す る前記プローブの第２の溶解プロファイルとを決定するステップと、 （ｆ）前記第１の溶解プロファイルと前記第２の溶解プロファイルとを比較し て、相違が前記サンプル核酸に置ける相違の存在を表わすステップと、 を含むことを特徴とする。 個人のゲノムにおいて選択された配座でのヘテロ接合性を検出する方法であっ て、前記ゲノムは突然変異性対立遺伝子とこれに対応する基準対立遺伝子とを含 み、その各々が選択された配座を含み、 （ａ）前記個人からサンプルとなるゲノムＤＮＡを採得するステップと、 （ｂ）ポリメラーゼ連鎖反応により前記突然変異対立遺伝子の第１の選択した セグメントと前記これに対応する基準対立遺伝子の第２の選択したセグメントを 増幅するように構成されたオリゴヌクレオチド・プライマーの対を提供し、前記 第１と第２の選択されたセグメントとの両方ともが前記選択された配座を含むス テップと、 （ｃ）オリゴヌクレオチド・プローブの対を提供し、前記プローブの一方は受 容体蛍光物質で標識し前記プローブの他方は蛍光共鳴エネルギー転移対の供与体 蛍光物質で標識して前記増幅した第１と第２の選択セグメントと前記２種類のプ ローブのハイブリダイゼーション時に前記プローブの一方は前記選択された配座 にまたがり前記増幅された第２の選択セグメントによる第２の溶解プロファイル から識別可能な前記増幅された第１の選択セグメントによる第１の溶解プロファ イルを示すようにするステップと、 （ｄ）ポリメラーゼ連鎖反応により有効量のプローブの存在下でサンプル・ゲ ノムＤＮＡの前記第１と第２の選択セグメントを増幅して増幅された第１と第２ の選択セグメントを得るようにし、少なくともその一部分が両方とも共鳴エネル ギー転移関係にある蛍光共鳴エネルギー転移対によりこれらにハイブリダイゼー ションされたプローブを有するステップと、 （ｅ）選択した波長の光によりハイブリダイゼーションされたプローブを有す る前記増幅された第１と第２の選択セグメントを照明して、前記供与体と受容体 による蛍光を顕在化するステップと、 （ｆ）温度の関数として蛍光放射を測定して、前記増幅した第１の選択セグメ ントから溶解する前記一方のプローブの第１の溶解プロファイルと前記増幅した 第２の選択セグメントから溶解する前記一方のプローブの第２の溶解プロファイ ルとを決定するステップと、 （ｇ）前記第１の溶解プロファイルと前記第２の溶解プロファイルとを比較し て、識別可能な溶解プロファイルが前記サンプル・ゲノムＤＮＡのヘテロ接合性 を表わすようにするステップと、 を含むことを特徴とする。 個人のゲノムにおいて選択された配座でのヘテロ接合性を検出する方法であっ て、前記ゲノムは突然変異対立遺伝子とこれに対応する基準対立遺伝子とを含み 、各々が選択された配座を含み、 （ａ）前記個人からサンプル・ゲノムＤＮＡを採得するステップと、 （ｂ）ポリメラーゼ連鎖反応によって前記突然変異対立遺伝子の第１の選択さ れたセグメントと前記これに対応する基準対立遺伝子の第２の選択されたセグメ ントを増幅するように構成されたオリゴヌクレオチド・プライマーの対を提供し 、前記第１と第２の選択セグメントにはどちらも前記選択された配座を含むステ ップと、 （ｃ）オリゴヌクレオチド・プローブを提供し、前記プライマーの一方と前記 プローブは各々供与体蛍光物質と受容体蛍光物質とを含む蛍光エネルギー転移対 の一方の構成要素で標識され、前記標識されたプローブと標識されたプライマー は前記増幅された第１と第２の選択セグメントにハイブリダイゼーションして前 記プローブの一方が前記選択された配座にまたがり前記増幅された第２の選択セ グメントによる第２の溶解プロファイルから識別可能な前記増幅された第１の選 択セグメントによる第１の溶解プロファイルを示すようにするステップと、 （ｄ）有効量のプライマー及びプローブの存在下でポリメラーゼ連鎖反応によ りサンプル・ゲノムＤＮＡの第１と第２の選択されたセグメントを増幅して増幅 された第１と第２の選択セグメントを得るようにし、少なくともその一部分は共 鳴エネルギー転移関係にある蛍光共鳴エネルギー転移対によりこれらにハイブリ ダイゼーションされた標識プライマー及びプローブを有するようにするステップ と、 （ｅ）前記標識したプライマーとプローブがハイブリダイゼーションされてい る前記増幅した第１と第２の選択セグメントを選択した波長の光で照明して前記 供与体及び受容体による蛍光を顕在化するステップと、 （ｆ）温度の関数として蛍光放射を測定して前記増幅した第１の選択セグメン トから溶解する前記プローブの第１の溶解プロファイルと前記増幅した第２の選 択セグメントから溶解する前記プローブの第２の溶解プロファイルとを決定する ステップと、 （ｇ）前記第１の溶解プロファイルと前記第２の溶解プロファイルを比較し、 識別可能な溶解プロファイルは前記サンプル・ゲノムＤＮＡのヘテロ接合性を表 わすステップと、 を含むことを特徴とする。 （１）核酸、ただし前記核酸又はそのポリメラーゼ連鎖反応増幅した生成物が ２種類の異なった相補鎖から構成され、（２）前記核酸の選択したセグメントを ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅して増幅生成物を得るように構成された２種 類のオリゴヌクレオチド・プライマー、（３）前記ポリメラーゼ連鎖反応を触媒 するためのＤＮＡポリメラーゼを含むポリメラーゼ連鎖反応混合物においてポリ メラーゼ連鎖反応の完了を決定する方法は、 （ａ）前記混合物に（１）蛍光共鳴エネルギー転移対の共鳴エネルギー転移供 与体又は共鳴エネルギー転移受容体で標識され、選択された温度条件と単価イオ ン強度で前記増幅生成物にハイブリダイゼーションするように構成された有効量 のオリゴヌクレオチド・プローブと、（２）前記供与体又は前記受容体で標識さ れ、前記プローブと基準オリゴヌクレオチドの間で一方が前記供与体で標識され 他方が前記受容体で標識され、前記基準オリゴヌクレオチドは前記選択された温 度及び単価イオン強度の条件下で前記増幅生成物にハイブリダイゼーションする ように構成されて前記プローブと前記基準オリゴヌクレオチドが両方とも前記増 幅生成物にハイブリダイゼーションする場合前記供与体及び前記受容体が共鳴エ ネルギー転移関係にあるようにする有効量の基準オリゴヌクレオチドとを添加す るステップと、 （ｂ）前記核酸の選択セグメントをポリメラーゼ連鎖反応によって増幅して前 記増幅生成物を得るようにし、少なくともその一部分は共鳴エネルギー転移関係 にある蛍光共鳴エネルギー転移対によりこれらにハイブリダイゼーションされた 前記プローブと前記基準オリゴヌクレオチドの両方を有するようにするステップ と、 （ｃ）選択した波長の光でハイブリダイゼーションされたプローブと基準オリ ゴヌクレオチドとを有する前記増幅生成物を照明して前記蛍光共鳴エネルギー対 による蛍光を顕在化させ、蛍光放射をモニタして、前記蛍光放射が前記反応の完 了を表わすプラトー・フェーズに達した時点でサイクルを決定するステップと、 を含むことを特徴とする。 （１）核酸、ただし前記核酸又はそのポリメラーゼ連鎖反応増幅した生成物は ２種類の異なった相補鎖から構成され、（２）前記核酸の選択したセグメントを ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅して増幅生成物を得るように構成された２種 類のオリゴヌクレオチド・プライマー、（３）前記ポリメラーゼ連鎖反応を触媒 するためのＤＮＡポリメラーゼを含むポリメラーゼ連鎖反応混合物におけるポリ メラーゼ連鎖反応の完了を決定する方法は、 （ａ）前記混合物に有効量の核酸結合蛍光染料を添加するステップと、 （ｂ）前記核酸結合蛍光染料が添加された前記混合物でポリメラーゼ連鎖反応 により前記選択した核酸セグメントを増幅して核酸結合蛍光染料が結合した前記 増幅生成物を得るステップと、 （ｃ）核酸結合蛍光染料が結合している増幅生成物に選択した波長の光を照明 してここからの蛍光を顕在化し、蛍光放射をモニタして、前記蛍光放射が前記反 応の完了を表わすプラトー・フェーズに達した時点でサイクルを決定するステッ プと、 を含むことを特徴とする。望ましくは、核酸結合蛍光染料はＳＹＢＲTMグリー ンＩ、臭化エチジウム、ピコグリーン、アクリジン・オレンジ、チアゾール・オ レンジ、ＹＯ−ＰＲＯ−１、クロモマイシンＡ３から構成されるグループから選 択した構成要素とし、さらに望ましくはＳＹＢＲTMグリーンＩとする。 二重鎖特異性蛍光染料を含むポリメラーゼ連鎖反応混合物のアニーリング、延 長、変性フェーズの反復サイクルを含むポリメラーゼ連鎖反応の温度サイクル・ パラメータを制御する方法であって、前記パラメータは前記アニーリング・フェ ーズの持続時間と、前記変性フェーズの持続時間と、サイクル数とを含み、 （ａ）選択した波長の光で前記反応を照明して前記蛍光染料からの蛍光を顕在 化させ前記反復アニーリング、拡張、変性フェーズの間に蛍光を連続モニタする ステップと、 （ｂ）少なくとも、 （ｉ）前記拡張フェーズの間に蛍光が増加を停止する持続時間、又は （ｉｉ）前記変性フェーズの間に前記蛍光が基線レベルまで減少する持続時 間、又は （ｉｉｉ）前記拡張フェーズの間に前記蛍光が所定のレベルに達した回数 を決定するステップと、 （ｃ）前記拡張フェーズの間に蛍光が増加を停止する時間の長さに基づいた前 記拡張フェーズの長さ、前記変性フェーズの間に蛍光が前記基線レベルまで減少 した時間の長さに基づいた前記変性フェーズの長さ、又は前記拡張フェーズの間 に蛍光が前記所定レベルに達したサイクル数に基づくサイクル数を調節するステ ップと、 を含むことを特徴とする。 選択したポリメラーゼ連鎖反応混合物における増幅生成物の濃度を決定する方 法は、 （ａ）前記増幅生成物の既知の濃度のハイブリダイゼーションのレートをモニ タすることにより選択した温度と反応条件での前記増幅生成物での２次速度定数 を決定するステップと、 （ｂ）前記増幅生成物の未知の濃度でのアニーリング速度を決定するステップ と、 （ｃ）前記アニーリング速度と前記２次速度定数から前記増幅生成物の濃度を 計算するステップと、 を含むことを特徴とする。望ましくは、アニーリング速度は多数の増幅サイク ルの後で決定される。２次速度定数を決定する１つの代表的な方法は、既知の濃 度の前記増幅生成物と有効量の二重鎖特異性蛍光染料とを含む第１のポリメラー ゼ連鎖反応混合物の温度を、前記増幅生成物の変性温度以上に上昇して変性増幅 生成物を得るステップと、 前記既知の量の変性増幅生成物を含む前記第１のポリメラーゼ連鎖反応混合物 の温度を、前記増幅生成物の変性温度以下の選択した温度まで急冷すると同時に 時間の関数として前記第１のポリメラーゼ連鎖反応混合物の蛍光を連続モニタす るステップと、 極大蛍光、極小蛍光、極小蛍光の時間、及び増幅生成物の既知 の濃度での２次速度定数を決定するため、式： ただしＦは蛍光、Ｆmaxは極大蛍光、Ｆminは極小蛍光、ｋは２次速度定数、ｔ0 はＦminでの時間、［ＤＮＡ］は前記増幅生成物の既知の濃度とするから時間の 関数として蛍光をプロットするステップと、 を含むことを特徴とする。 競合的定量ポリメラーゼ連鎖反応による選択した核酸テンプレートの濃度を決 定する方法は （ａ）（ｉ）ポリメラーゼ連鎖反応において前記選択したテンプレートの選択 したセグメントと相補的テンプレートのこれに対応する選択したセグメントを増 幅してこれらの増幅生成物を得るように構成したオリゴヌクレオチド・プライマ ーの対の各々の有効量と、 （ｉｉ）蛍光共鳴エネルギー転移対の共鳴エネルギー転移供与体又は共鳴エ ネルギー転移受容体で標識された有効量のオリゴヌクレオチド・プローブであっ て、前記プローブが前記競合的テンプレートの増幅生成物から溶解する溶解温度 から識別可能な溶解温度での前記選択したテンプレートの増幅生成物から溶解す るように前記増幅生成物にハイブリダイゼーションするように構成されている前 記プローブと、 （ｉｉｉ）前記プローブと転移オリゴヌクレオチドの間で一方が前記供与体 により標識され他方が前記受容体により標識されているとして、前記供与体又は 前記受容体で標識された有効量の基準オリゴヌクレオチドであって、前記基準オ リゴヌクレオチドは前記プローブと前記基準オリゴヌクレオチドの両方が前記増 幅生成物にハイブリダイゼーションする場合に前記供与体と前記受容体が共鳴エ ネルギー転移関係になるように前記増幅生成物にハイブリダイゼーションするよ う構成されたオリゴヌクレオチドと、 を含む反応混合物において、ポリメラーゼ連鎖反応により、未知の量の選択し たテンプレートと既知の量の前記競合的テンプレートを増幅して前記増幅生成物 を得るステップと、 （ｂ）前記反応混合物を選択した波長の光で照明して蛍光共鳴エネルギー転移 対による蛍光を顕在化させ、反応混合物の温度が変化して前記選択したテンプレ ートの前記増幅生成物から溶解する前記プローブの第１の溶解曲線と前記競合的 テンプレートから溶解する前記プローブの第２の溶解曲線とを得る場合に温度の 関数として蛍光放射を決定するステップと、 （ｃ）前記第１と第２の溶解曲線から第１と第２の溶解溶解ピークに変換して 当該溶解ピークから前記選択したテンプレートと前記競合的テンプレートの相対 量を決定するステップと、 （ｄ）前記既知の量の前記競合的テンプレートと、前記選択したテンプレート 及び競合的テンプレートの相対量とに基づいて前記選択したテンプレートの濃度 を計算するステップと、 を含むことを特徴とする。 蛍光共鳴エネルギー転移対はフルオレセインとＣｙ５、又はＣｙ５．５からな る。 ポリメラーゼ連鎖反応において選択した核酸テンプレートの濃度を決定する方 法は、 （ａ）（ｉ）ポリメラーゼ連鎖反応において前記選択したテンプレートの選択 した第１のセグメントを増幅して増幅した第１の生成物を得るように構成された 第１の対のオリゴヌクレオチド・プライマーの各々の有効量と、 （ｉｉ）ポリメラーゼ連鎖反応において基準テンプレートの選択した第２の セグメントを増幅して増幅した第２の生成物を得るように構成された第２の対の オリゴヌクレオチド・プライマーの各々の有効量と、 （ｉｉｉ）核酸結合蛍光染料の有効量と、 を含む反応混合物において、 ポリメラーゼ連鎖反応により、未知の量の前記選択したテンプレートを増幅し て前記増幅した第１の生成物を得る及び既知の量の前記基準テンプレートを増幅 して前記増幅した第２の生成物を得るステップと、 （ｂ）選択した波長の光で前記反応混合物を照明して核酸結合蛍光染料による 蛍光を顕在化させ、温度の関数として放射された蛍光を連続的にモニタして第１ の生成物と第２の生成物が異なる温度で溶解するような前記増幅生成物の溶解曲 線を得るステップと、 （ｃ）前記溶解曲線を溶解溶解ピークに変換して当該溶解ピークから前記選択 したテンプレートと前記基準テンプレートの相対量を決定するステップと、 （ｄ）前記既知の量の前記基準テンプレートと選択したテンプレート及び基準 テンプレートの相対量とに基づいて前記選択したテンプレートの濃度を計算する ステップと、 を含むことを特徴とする。 陽性対照テンプレートも含むポリメラーゼ連鎖反応において選択したテンプレ ートの増幅をモニタする方法は、 （ａ）（ｉ）ポリメラーゼ連鎖反応において前記選択したテンプレートの選択 した第１のセグメントを増幅して増幅された第１の生成物を得るように構成され たオリゴヌクレオチド・プライマーの第１の対の各々の有効量と、 （ｉｉ）ポリメラーゼ連鎖反応において、陽性対照テンプレートの選択され た第２のセグメントを増幅して増幅された第２の生成物を得るように構成された オリゴヌクレオチド・プライマーの第２の対の各々の有効量と、 （ｉｉｉ）有効量の核酸結合蛍光染料と、 を含む反応混合物において、 前記選択したテンプレートと前記陽性対照テンプレートをポリメラーゼ連鎖反 応によって増幅するための条件に前記選択したテンプレートと前記陽性対照テン プレートをさらすステップと、 （ｂ）前記反応混合物を選択した波長の光で照明して核酸結合蛍光染料による 蛍光を顕在化し、前記ポリメラーゼ連鎖反応の増幅サイクル中に温度の関数とし て放射される蛍光を連続的にモニタして前記選択したテンプレートが増幅される 場合前記増幅された第１の生成物の第１の溶解ピークを、また前記陽性対照テン プレートが増幅される場合前記増幅された第２の生成物の第２の溶解ピークを取 得するステップとを含み、 前記第２の溶解曲線の取得はポリメラーゼ連鎖反応が作用したことを表わし、 前記第１の溶解曲線の取得は前記選択した第１のセグメントが増幅可能であるこ とを表わし、前記第１の溶解曲線が欠如していることは前記選択した第１のセグ メントが増幅不可能であることを表わすことを特徴とする。 個人の第Ｖ因子ライデン変異を検出する方法であって、第Ｖ因子ライデン変異 は野生型と比較して第Ｖ因子ライデン変異配座での単一塩基変化で構成され、 （ａ）前記個人からサンプル・ゲノムＤＮＡを採得するステップと、 （ｂ）対照として野生型ゲノムＤＮＡを提供するステップと、 （ｃ）前記サンプル・ゲノムＤＮＡと前記野生型ゲノムＤＮＡの選択したセグ メントをポリメラーゼ連鎖反応によって増幅するように構成されたオリゴヌクレ オチド・プライマーの対を提供し、前記選択したセグメントは第Ｖ因子ライデン 変異配座を含み、第Ｖ因子ライデン変異配座のコピーを含む増幅生成物を得るス テップと、 （ｄ）蛍光共鳴エネルギー転移対の共鳴エネルギー転移供与体又は共鳴エネル ギー転移受容体で標識されたオリゴヌクレオチド・プローブを提供し、前記プロ ーブは前記増幅された生成物にハイブリダイゼーションするように構成されて前 記プローブが前記変異配座にまたがり前記サンプル・ゲノムＤＮＡに前記野生型 ゲノムＤＮＡの溶解プロファイルから区別できる第Ｖ因子ライデン変異が存在す る場合溶解プロファイルを示すステップと、 （ｅ）共鳴エネルギー転移供与体又は共鳴エネルギー転移受容体で標識された 転移オリゴヌクレオチドを提供し、前記プローブと転移オリゴヌクレオチドの間 で一方が共鳴エネルギー転移供与体で標識され他方が共鳴エネルギー転移受容体 で標識されているとして、前記転移オリゴヌクレオチドは前記増幅生成物にハイ ブリダイゼーションするように構成して前記プローブと前記転移オリゴヌクレオ チドの両方が前記増幅生成物にハイブリダイゼーションする場合に共鳴エネルギ ー転移供与体と共鳴エネルギー転移受容体が共鳴エネルギー転移関係にあるよう にするステップと、 （ｆ）有効量のオリゴヌクレオチド・プローブと転移オリゴヌクレオチドの存 在下でサンプル・ゲノムＤＮＡと野生型ゲノムＤＮＡの前記選択したセグメント をポリメラーゼ連鎖反応により増幅して、増幅された選択セグメントを得るよう にし、少なくともその一部分は共鳴エネルギー転移関係にある蛍光共鳴エネルギ ー転移対によりこれらにハイブリダイゼーションされた前記プローブと前記転移 オリゴヌクレオチドの両方を有するようにするステップと、 （ｇ）前記ポリメラーゼ連鎖反応の増幅サイクルの間の温度の関数として蛍光 を測定してサンプル・ゲノムＤＮＡの前記増幅セグメントから溶解する前記プロ ーブの溶解プロファイルと前記野生型ゲノムＤＮＡの増幅セグメントから溶解す る前記プローブの溶解プロファイルとを取得するステップと、 （ｈ）前記サンプル・ゲノムＤＮＡについての前記溶解プロファイルを前記野 生型ゲノムＤＮＡについての前記溶解プロファイルと比較し、これらの差が前記 サンプル・ゲノムＤＮＡにおける第Ｖ因子ライデン変異の存在を表わすステップ と、 を含むことを特徴とする。 核酸ハイブリダイゼーションを分析するための方法は （ａ）分析すべき核酸サンプルと核酸結合蛍光体とを含む混合物を提供するス テップと、 （ｂ）温度を≧毎秒０．１℃の速度で変化させながら蛍光をモニタするステッ プと、 を含むことを特徴とする。 未知の量の核酸を含むサンプルの初期コピー数を定量する方法は、 （ａ）ポリメラーゼ連鎖反応により既知の濃度の少なくとも一つの標準を、前 記標準と核酸結合蛍光体とを含む混合物中で増幅するステップと、 （ｂ）サイクル数の関数として蛍光を測定して一組のデータ点を得るステップ と、 （ｃ）初期核酸濃度とサイクル数の関数として蛍光を記述する任意の所定の式 に前記データ点を当てはめるステップと、 （ｄ）前記サンプルと前記核酸結合蛍光体とを含む混合物中で未知の量の核酸 を含む前記サンプルを増幅してこれの蛍光をモニタするステップと、 （ｅ）ステップ（ｃ）で求めた式から初期核酸濃度を決定するステップと、 を含むことを特徴とする。 蛍光共鳴エネルギー転移対が開示され、前記対は放射スペクトルを有する供与 体蛍光物質と、吸収スペクトルを有し消光係数が１００，０００Ｍ-1ｃｍ-1より 大きい受容体蛍光物質とを含む含み、前記供与体蛍光物質の放射スペクトルと前 記受容体蛍光物質の吸収スペクトルは２５％未満でオーバラップする。本明細書 で説明される１つの代表的な蛍光共鳴エネルギー転移対は供与体蛍光物質がフル オレセインであり受容体蛍光物質がＣｙ５又はＣｙ５．５である。 生物学的サンプルの標的ＤＮＡ配列を分析するための方法は、核酸結合蛍光体 の存在下でポリメラーゼ連鎖反応により前記標的配列を増幅し、前記ポリメラー ゼ連鎖反応には前記標的とされる核酸配列に対する熱安定性ポリメラーゼ及びプ ライマーを前記生物学的サンプルに添加して少なくとも変性温度と伸長温度の間 で前記生物学的サンプルを熱サイクルするステップを含むステップと、 前記核酸結合蛍光体により吸収される波長の光によって前記サンプルを励起す るステップと、 前記サンプルの温度が変化する際に前記核酸結合蛍光体からの温度依存性蛍光 をモニタするステップとを含むことを特徴とする。望ましくは、核酸結合蛍光体 には二重鎖核酸結合蛍光染料たとえばＳＹＢＲTMグリーンＩ等を含む。温度依存 性蛍光は、望ましくは溶解曲線分析によって、増幅生成物を識別するために使用 できる。２種類又は３種類以上の増幅生成物の相対量を溶解曲線の分析で求める ことができる。たとえば、溶解曲線より下の領域は多重ガウス分布の和の非線形 最小自乗法回帰で見付けられる。 図面の簡単な説明 図１Ａ及び図１Ｂは平衡ＰＣＲパラダイム（Ａ）と動的ＰＣＲパラダイム（Ｂ ） を表わすグラフである。 図２は蛍光ハイブリダイゼーションモニタリングに有用な温度対時間セグメン トを表わす。 図３はＰＣＲの高速温度サイクルで代表的な温度対時間のチャートである。 図４は４種類の異なる温度／時間プロファイル（Ａ〜Ｄ）の結果と、これらか ら得られた３０サイクル後の増幅生成物である。 図５Ａ、図５Ｂ、図５ＣはＰＣＲの蛍光をモニタする３種類の異なる方法での 蛍光生成メカニズムを示し、（Ａ）二重鎖ＤＮＡ染料、（Ｂ）水解プローブ、（ Ｃ）ハイブリダイゼーション・プローブである。 図６はＣｙ５TMの一価Ｎ−ハイドロキシサクシニミド・エステルの化学構造を 表わす。 図７はＣｙ５．５TMの一価Ｎ−ハイドロキシサクシニミド・エステルの化学構 造を表わす。 図８はフルオレセイン（実線）の放射スペクトルとＣｙ５（破線）の励起スペ クトルを表わす。 図９はＰＣＲ中の各サイクルでフルオレセインとＣｙ５で標識した隣接するハ イブリダイゼーション・プローブの間に発生する共鳴エネルギー転移を示す。 図１０はＰＣＲ中に生成される共鳴エネルギー転移信号においてＣｙ５プロー ブとフルオレセイン・プローブの比を変化させる効果を示す。 図１１はＰＣＲ中に生成される共鳴エネルギー転移信号において任意のプロー ブ比でのプローブ濃度を変化させる効果を示す。 図１２はＰＣＲ中に生成される共鳴エネルギー転移信号において標識オリゴヌ クレオチドの間の間隔の効果を示す。 図１３はＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ｅｘｏ+；実線）とＴａｑＤＮＡポリメ ラーゼのＳｔｏｆｆｅｌ分画（ｅｘｏ-；点線）を用いた増幅３０サイクル直後 の、隣接するハイブリダイゼーション・プローブによるＰＣＲ中の蛍光発生に対 する温度サイクルおよびポリメラーゼの種類の蛍光エネルギー転移による隣接プ ローブ・ハイブリダイゼーションの時間経過を示す。温度は太線で図示されてい る。 図１４はＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ｅｘｏ+；実線）と、ＴａｑＤＮＡポリ メラーゼのＳｔｏｆｆｅｌ分画（ｅｘｏ-；破線）とＫｌｅｎＴａｑＤＮＡポリ メラーゼ（ｅｘｏ-；点線）による増幅での蛍光比対サイクル数のプロットであ る：上部パネル―サイクルは９４℃と６０℃の間で２０秒間６０℃で保持、中央 パネル―サイクルは９４℃と６０℃の間で１２０秒間６０℃で保持、下部パネル ―サイクルは９４℃と６０℃の間で６０℃から７５℃までゆっくりと温度上昇。 図１５はＳｙｂｒTMグリーンＩを用いてモニタした多数の異なる初期テンプレ ート・コピー反応での蛍光体サイクル数のプロットである：０，（△）；１,（ ■）；１０，（−）１０2，（−）；１０3，（＋）；104，（●）、105，（◇） ；106，（×）；107，（▲）；108，（□）；109，（◆）。 図１６は２重標識水解プローブを用いてモニタした多数の異なる初期テンプレ ート・コピー反応での蛍光比対サイクル数のプロットである：０，（−）；１， （▲）；１０，（○）；102，（*）；103，（●）；104，（□）；105，（＋） ；106，（■）；107，（◇）；108，（×）；109，（◆）。 図１７は隣接ハイブリダイゼーション・プローブでモニタした多数の異なる初 期テンプレート・コピ一反応での蛍光比対サイクル数のプロットである：０，（ ―）；１，（▲）；１０，（○）；102，（*）；103，（●）；104，（□）；105 ，（＋）；106，（■）；107，（◇）；108，（×）；109，（◆）。 図１８は共鳴エネルギー転移によりモニタされる２種類のハイブリダイゼーシ ョン・プローブ設計を区別する蛍光比対サイクル数のプロットである：（◇）は 各々フルオレセインとＣｙ５で標識した２種類のハイブリダイゼーション・プロ ーブ；（◆）はＣｙ５で標識したプライマーとフルオレセインで標識したプロー ブである。 図１９Ａから図１９Ｃは、ＰＣＲでの３種類の蛍光モニタリング技術の比較を 提供し、二重鎖特異性ＤＮＡ染料SＹＢＲグリーンＩ（Ａ）、２重標識フルオレ セイン／ローダミン水解プローブ（Ｂ）、Ｃｙ５標識プライマーとフルオレセイ ン標識ハイブリダイゼーション・プローブ（Ｃ）を含む；図１９Ｄは図１９Ａか ら図１９Ｃまでに表わされている３種類のモニタリング技術の変動係数を示す。 図２０はＳＹＢＲグリーンＩでモニタされる標準増幅の代表的対数蛍光対サイ クル数のプロットを示す。 図２１は図２０のデータのサイクル２０〜２７に適合させた双曲線を示す。 図２２は増幅データから初期コピー数を決定するため未知サンプルに適合させ た双曲線を表わす。 図２３は各サイクル隣接ハイブリダイゼーション・プローブでモニタされる５ 種類の標準の代表的な蛍光対サイクル数のプロットで、初期コピー数は次のよう に表わしてある：103，（●）；104，（◇）；105，（▲）；106，（□）；107 ，（◆）。 図２４は図２３の標準データに適合させた曲線を示す。 図２５は各サイクル水解プローブでモニタされる５種類の標準の代表的な蛍光 対サイクル数のプロットを示し、初期コピー数は次のように表わしてある：１． ５，（●）；１５，（◇）；１５０，（▲）；１５００，（□）；１５，０００ ，（◆）。 図２６は図２５の標準データに適合させた曲線を示す。 図２７はＳＹＢＲグリーンＩでモニタされる３種類の標準増幅の代表的対数蛍 光対サイクル数のプロットを示し、ここでは（■）；（●）；（▲）である。 図２８は図２７の標準データに適合させた異なる曲線を示す。 図２９Ａ及び図２９Ｂは時間対蛍光（Ａ）と時間対温度（Ｂ）のプロットで温 度と蛍光の間の逆比例関係を明示している。 図３０は温度対時間、蛍光対時間、蛍光対温度の２Ｄプロットを示すチャート でＳＹＢＲグリーンＩの存在下におけるhepatitis B（Ｂ型肝炎）ゲノムの１８ ０塩基対フラグメントの増幅について３Ｄプロットとしても図示してある。 図３１はＳＹＢＲグリーンＩの存在下でヒトβグロブリン遺伝子の５３６塩基 対フラグメントの増幅についての蛍光対温度投影図である。 図３２Ａ及び図３２Ｂは水解プローブについての温度による蛍光比の直線性変 化(Ａ)とハイブリダイゼーション・プローブでの温度によるラジカルな変化(Ｂ) とを示すプロットを提供する。 図３３は隣接ハイブリダイゼーション・プローブの存在下にｅｘｏ-ポリメラ ーゼによる増幅の蛍光比対温度プロットを示す。 図３４は隣接ハイブリダイゼーション・プローブの存在下でｅｘｏ+ポリメラ ーゼによる増幅の蛍光比対温度プロットを示す。 図３５は隣接ハイブリダイゼーション・プローブの存在下にｅｘｏ-ポリメラ ーゼによる増幅中の温度、時間、蛍光の三次元プロットを示す。 図３６は隣接ハイブリダイゼーション・プローブの存在下にｅｘｏ+ボリメラ ーゼによる増幅中の温度、時間、蛍光の三次元プロットを示す。 図３７はhepatitis B（Ｂ型肝炎）ウィルス（●；５０％ＧＣ、１８０ｂｐ） 、βグロブリン（▲；５３．２％ＧＣ、５３６ｂｐ）、前立腺特異抗原（×；６ ０．３％ＧＣ、２９２ｂｐ）のＰＣＲ増幅生成物での溶解曲線を示す。 図３８は０．１℃から５．０℃の加熱レートにおけるhepatitis B（Ｂ型肝炎 ）ウィルスのＰＣＲ増幅生成物の溶解曲線を示す。 図３９はＳＹＢＲTMグリーンＩの各種濃度におけるhepatitis B（Ｂ型肝炎） ウィルスのＰＣＲ増幅生成物の溶解曲線を示す。 図４０Ａ及び図４０Ｂは（ａ）追加テンプレートなし、（ｂ）低厳密度条件下 で１０の６乗コピーの追加テンプレート、（ｃ）高厳密度条件下での１０の６乗 コピーの追加テンプレートで増幅したβグロブリン分画生成物についての、(Ａ) 溶解曲線と、（Ｂ）電気泳動分画バンドを示す。 図４１Ａ及び図４１Ｂはhepatitis Bウィルス分画（ＨＢＶ）、βグロブリン 、及びこれらの混合物の（Ａ）溶解曲線と、（Ｂ）溶解ピークを示す。 図４２Ａから図４２Ｄは（Ａ）様々な量のβグロブリン・テンプレートからＰ ＣＲ増幅した生成物についての相対蛍光対サイクル数のプロット、各種生成物の （Ｂ）溶解ピークと（Ｃ）電気泳動バンド、（Ｄ）（Ａ）のデータの補正蛍光を 示す。 図４３Ａ及び図４３Ｂは嚢胞性線維症遺伝子及びｃ−ｅｒｂＢ−２オンコジー ンの混合物のＰＣＲ増幅生成物からの（Ａ）溶解曲線と、（Ｂ）溶解ピークを示 す。 図４４は嚢胞性線維症遺伝子（ＣＦＴＲ）とｃ−ｅｒｂＢ−２（ｎｅｕ）につ いて様々なサイクル数での溶解ピークを示す。 図４５はＣＦＴＲとｎｅｕＰＣＴ生成物の積分溶解ピークのグラフである。 図４６Ａ及び図４６Ｂは第Ｖ因子ライデン変異ヘテロ接合性のヒト（実線）、 第Ｖ因子ライデン変異ホモ接合性のヒト（点線）、野生型ホモ接合性（破線）、 ＤＮＡ対照なし（一点鎖線）のＰＣＲ生成物についての（Ａ）溶解曲線と、（Ｂ ）溶解ピークを示す。 図４７は第Ｖ因子ライデン変異ホモ接合性サンプル（実線）、第Ｖ因子ライデ ン変異ヘテロ接合性（点線）、野生型ホモ接合性（一点鎖線）のＰＣＲ生成物の ４０サイクル中の連続モニタの蛍光比対温度のプロットを示す。 図４８はメチレンテトラヒドロ葉酸遺伝子のホモ接合型突然変異（実線）、野 生型ホモ接合性（破線）、ヘテロ接合突然変異（点線）、ＤＮＡ対照なし（一点 鎖線）の溶解ピークを示す。 図４９は各種の初期テンプレート量から増幅したβグロブリンＰＣＲ生成物の アニーリング曲線の形状を示す。 図５０は初期テンプレート濃度を決定するための２次速度定数の決定を示す。 図５１は蛍光データから熱サイクルを制御するためのブロック図である。 図５２Ａ及び図５２Ｂは（Ａ）２０サイクル後に取得した温度対時間のプロッ トと、（Ｂ）２５サイクル後に取得した蛍光対時間のプロットを示し、熱サイク ルは蛍光データから制御した。 詳細な説明 ＰＣＲ中のハイブリダイゼーションをモニタする本発明の方法を開示し説明す る前に、本発明は本明細書で開示される特定の構成、処理ステップ、材料に制限 されるものではなく、こうした構成、処理ステップ、材料は何らか変化すること があることを理解されるべきである。また本発明の範囲は付録の請求項及びその 等価物によってのみ制限されるものであるから本明細書で用いられている術語は 特定の実施例を説明する目的でのみ用いられていることも理解されて然るべきで ある。 本明細書及び付録の請求項で用いられているように、単数形表現“a”“aｎ” “tｈｅ”はコンテクストでとくに何らか明言していない限り複数対象も含むこ とには注意すべきである。 本発明の説明と請求において、以下の術語は以下に明示した定義にしたがって 用いられる。 本明細書で用いている「核酸」「ＤＮＡ」及び類似の術語も核酸アナログ、即 ちリン酸ジエステル骨格以外を有する類似物も含む。たとえば、いわゆる「ペプ チド核酸」は従来技術で公知となっているが骨格においてリン酸ジエステル結合 の代わりにペプチド結合を有しており、本発明の範囲内に含まれるものと解釈さ れる。 本明細書で用いている「連続モニタリング」及び類似の術語はＰＣＲのサイク ルの間の多数の時刻でモニタし、望ましくは温度遷移中、又さらに望ましくは各 温度遷移において少なくとも一つのデータ点を取得することを表わす。 本明細書で用いている「サイクル毎」モニタリングは各サイクル毎に１回、望 ましくはＰＣＲのアニーリング相の間に、ＰＣＲ反応をモニタすることを意味す る。 本明細書で用いている「蛍光共鳴エネルギー転移関係」及び類似の術語は、供 与体蛍光物質が共鳴エネルギーを受容体蛍光物質に転移して受容体蛍光物質が測 定可能な蛍光放射を発生することができるようにするように、供与体蛍光物質で 標識されたオリゴヌクレオチドと受容体蛍光物質で標識されたオリゴヌクレオチ ドとの核酸に対する隣接ハイブリダイゼーションを表わす。供与体蛍光物質と受 容体蛍光物質があまり遠すぎる距離に離れていると、受容体蛍光物質が測定可能 な蛍光を放射できるように受容体蛍光物質へ共鳴エネルギーを転移することがで きず、したがって供与体蛍光物質と受容体蛍光物質は共鳴エネルギー転移関係に はない。望ましくは、２種類の標識されたオリゴヌクレオチドが両方ともプロー ブであり、どちらもＰＣＲプライマーとして機能しない場合、（「プローブープ ローブ」）供与体蛍光物質と受容体蛍光物質はおよそ０〜２５ヌクレオチド以内 であり、さらに望ましくは０〜５ヌクレオチド以内、また最も望ましいのは０〜 ２ヌクレオチド以内である。特に好適な間隔は１ヌクレオチドである。標識オリ ゴヌクレオチドの一方がＰＣＲプライマーとしても機能する（「プローブ−プラ イマー」）場合、供与体蛍光物質と受容体蛍光物質はおよそ０〜１５ヌクレオチ ド以内が望ましく、およそ４〜６ヌクレオチド以内がさらに望ましい。 本明細書で用いている「有効量」は選択した効果を発生するのに充分な量を表 わす。たとえば、ＰＣＲプライマーの有効量は、ＤＮＡポリメラーゼ、バッファ 、テンプレート及び温度条件を含めてＰＣＲを実施するのに必要であることが従 来技術で知られているその他の条件も提供されている場合にＰＣＲによって核酸 のセグメントを増幅するのに充分な量である。 ＰＣＲは反復的テンプレート変性とプライマーのアニーリングを必要とする。 これらのハイブリダイゼーション遷移は温度依存である。増幅を進めるＰＣＲの 温度サイクルは、高温で生成物の変性蓄積と低温での生成物へのプライマー付着 （アニーリング）を交互に行なう。生成物の変性とプライマー・アニーリングの 遷移温度播種としてＧＣ成分と長さに依存する。プローブがＰＣＲ生成物に中間 部でハイブリダイゼーションするように設計されている場合、プローブの溶解温 度もまたＧＣ成分、長さ、及び標的に対する相補性の度合に依存する。ＰＣＲで 互換性のある蛍光プローブは増幅中のハイブリダイゼーションをモニタできる。 高速サイクルとの関連で使用されるのが望ましい（１９９６年６月４日付でＰ ＣＲ処理をモニタするためのシステム及びその方法と題する前述の米国特許出願 番号第０８／６５８，９９３号、及び１９９５年１０月２日付で生物学的サンプ ルの高速熱サイクルのための方法と題する米国特許出願番号第０８／５３７，６ １２号に完全に説明されている）本発明によれば、ＰＣＲの動態パラダイムが適 切である。ＰＣＲについて３種類の反応（変性、アニーリング、拡張）が３つの 時間間隔の間に３つの異なる温度で起こると考えるのではなく（図１Ａ）、ＰＣ Ｒの動的パラダイムがもっと有用である（図１Ｂ）。動態パラダイムでは、温度 対時間曲線はオーバラップする反応の間の連続遷移から構成される。変性とアニ ーリングは非常に高速で特定温度での保持時間は必要としない。拡張は変化する 速度である温度範囲にわたって起こる。完全な分析には全ての温度にわたる全部 の関連速度定数についての知識が必要であろう。全反応の速度定数が分かってい れば、「ＰＣＲの物理化学的説明」が発達する。これらの速度を決定するには正 確な温度制御が必要であり温度サイクル中の反応モニタリングによって大幅に簡 略化される。 図２は蛍光ハイブリダイゼーション・モニタリングでの有用な温度対時間セグ メントを示している。生成物溶解曲線はゆっくりと変性へ向かう温度上昇中に得 られる。変性後に一定温度へ温度を急激に下げることによって、生成物、プロー ブ、又はプライマーのアニーリングがオプションとして後続できる。プローブ溶 解曲線はプローブＴｍ付近の温度を通ってゆっくりと過熱すると得られる。図２ に図示してある実施例は温度サイクル中の全分析をすぐリアルタイムの表示で提 供する。蛍光プローブは温度サイクル中のプライマー、プローブ、又は生成物ハ イブリダイゼーションの連続モニタリングのために増幅溶液の一部分として含め てある。 本発明に含まれる蛍光ハイブリダイゼーション技術は高速サイクルに基づくも ので、速度と特異性を利点とする。 高速サイクルＰＣＲ中のサンプル温度プロファイルを図３に図示してある。変 性とアニーリングは、従来のＰＣＲの温度サイクルたとえば図１Ａでの広い平坦 域とは対向して、これらの図面では温度「スパイク」として現われている。高速 温度サイクルは図４の従来の温度サイクルと対照され、３０サイクルの増幅が１ ５分で完了し得られたＰＣＲ生成物はかなり少ない副生成物しか含まないことが 示されている。つまり、高速サイクルによると必要とされる増幅時間はおよそ１ ０分の１に減少し、特異性が向上する。 実施例１ 図４は４種類の異なる温度／時間プロファイル（Ａ〜Ｄ）の結果と３０サイク ル後にそれらで得られた増幅生成物（Ａ〜Ｄ）を示す。図４のプロファイルＡと Ｂは従来技術の微量遠沈管を使用する従来技術の過熱ブロック装置を用いて得ら れた。図４から分かるように、温度間の遷移はゆっくりでプロファイルＡとＢに は多数の非特異性バンドが存在する。プロファイルＢは各々のサンプルが各々の 温度に留まる時間を制限することによって非特異性バンド（プロファイルＡとは 対照的に）の幾つかを排除する点で改善を示している、つまり短時間ではさらに 望ましい結果が発生することを表わしている。 プロファイルＣとＤは高速温度サイクラを使用して得られた。図４から分かる ように、増幅は特異的であり、収量は６０秒の拡張時間（Ｃ）で最大となるが、 １０秒の拡張時間（Ｄ）でも全体として充分である。 ヒトゲノムＤＮＡ由来のβグロブリン５３６ｂｐフラグメントの増幅に最適な 時間と温度も決定された。増幅収量と生成物の特異性は変性（９３℃）とアニー リング（５５℃）が１秒未満の場合に最適だった。変性又はアニーリング時間が 長くても何らの利点は見られなかった。収量は７７℃で長い拡張時間だと増加し たが、１０〜２０秒より長い拡張時間ではほとんど変化が見られなかった。この ように予想しなかった結果は、ＤＮＡ増幅のために用いられる従来利用可能な装 置が物理的酵素的な反応条件を最適化するのに必要とされる条件を最大にしてい ないことを表わしている。 さらに詳しい情報は、Ｃ．Ｔ．ウィットワーら、嚢胞性線維症デルタＦ（５０ ８）配位での高速サイクル対立遺伝子特異性増幅、(C．T．Wittwer et al.,Rapi d Cycle Allele-Specific Amplification with Cystic Fibrosis deltaF(508)Lo cus，39，Clinical Chemistry 804(1993))及びＣ．Ｔ．ウィットワーら、高速Ｄ ＮＡ増幅、(C．T．Wittwer et al.，Rapid DNA Amplification，The Polymerase Chain Reaction 174(1994)に解説されており、これらはどちらも本明細書で参 照に含まれる。蛍光観察と高速温度サイクルに用いられる機材は前述の米国特許 出願第０８／５３７，６１２号に完全に開示されている。 先に述べたように、ポリメラーゼ連鎖反応は高速で実行できる。急速熱伝導を 容易にすることに加えて光学的に透明な毛細管を使用すると本発明によるＤＮＡ 増幅の連続的蛍光モニタリングが可能になる。 蛍光プローブはＤＮＡ増幅を検出しモニタするために使用できる。有用なプロ ーブとしては、二重鎖ＤＮＡ特異性染料や配列特異性プローブが挙げられる。Ｄ ＮＡ増幅を追跡するための３種類の異なる蛍光技術を図５で比較している。図５ Ａでは、蛍光は二重鎖特異性ＤＮＡ染料で検出されるＰＣＲ生成物のハイブリダ イゼーションに依存している。図５Ｂにおいて、蛍光は５’−エクソヌクレアー ゼ消光プローブの水解に依存しており、これは前述のように従来技術で周知とな っている。図５Ｃでは２つの隣接プローブにおける蛍光物質間の共鳴エネルギー 転移に基づいたハイブリダイゼーション方式を図示している。図５Ａの方法は配 列特異性ではないが、生成物の特異性は溶解曲線によって決定でき、これは本発 明の１つの側面である。図５Ｂ及び図５Ｃは両方とも配列特異性である。しかし 該ハイブリダイゼーション法は溶解曲線による分析を可能にし、これは本発明の 別の側面である。 図５Ｂに図示したように水解プローブが関係する反応からと図５Ｃに図示した ようにハイブリダイゼーション・プローブが関係する反応からの蛍光をモニタす る際、供与体蛍光物質と受容体蛍光物質両方から放射される蛍光を測定するのが 有利である。具体的には、水解プローブによって放射される蛍光の大半は供与体 蛍光物質からのもので、ハイブリダイゼーション・プローブによって放射される 蛍光の大半は受容体蛍光物質からのものである。 二重鎖特異性ＤＮＡ染料の選択。蛍光技術に臭化エチジウムを用いるのが当業 者には馴染み深いであろう。二重鎖特異性蛍光染料が増幅中に存在する場合、二 重鎖生成物が多く作られる程蛍光は一般に増加する。Ｒ．ヒグチら、特定ＤＮＡ 配列の同時増幅と検出、（R．higuchi et al.，Simultaneous amplification an ddetection of specific DNA sequences，10 Bio/Technology 413-417(1992)） 参照。インターカレータＹＯ−ＰＲＯ−１を用いたhepatitis C（Ｃ型肝炎）Ｒ ＮＡの蛍光ＰＣＲアッセイも従来技術で公知である。Ｔ．イシグロら、蛍光イン ターカレータ存在下のポリメラーゼ連鎖反応によるhepatitis CウィルスＲＮＡ の均質定量アッセイ(T．Ishiguro et al., Homogenenous quantitative assay o fhepatitis C virus RNA by polymerase chain reaction in the presence of a fluorescent intercalater，229 Anal．Biochem．207‐213(1995))参照。従来 技術で公知であり、米国オレゴン州ユージーンにあるモレキュラー・プローブズ 社（Molecular Probes of Eugene，Oregon）から入手できるＳＹＢRTMグリーン Ｉを二重鎖特異性染料として使用するのが好適である。この染料の分子構造は企 業秘密であるが、ゲル上でのＤＮＡ検出用にさらに高感度の二重鎖特異性染料と してメーカーから推奨されている。ＳＹＢＲTMグリーンＩは熱安定性が悪いが、 しかしそのために長い時間間隔にわたって反応混合物の温度が溶解温度に維持さ れるような従来方によるポリメラーゼ連鎖反応の蛍光モニタリングには有用では ない。この熱不安定性のため、溶解温度が長時間にわたって維持されない場合、 即ちＰＣＲが前述した動態パラダイムにしたがって高速サイクルにより行なわれ る場合に、ＳＹＢＲTMグリーンＩがＰＣＲ反応をモニタするために使用できるこ とが発見されたのは予想外だった。 実施例２ １０，０００テンプレートコピーからのヒトβグロブリン遺伝子のＰＣＯ３／ ＰＣＯ４プライマー対からの１１０塩基対分画の増幅をモニタすることにより異 なった二重鎖特異性ＤＮＡ染料を比較した。プライマーは従来技術で公知の通り に標準的ホスホラミダイト化学によって、即ちファルマシア・バイオテック遺伝 子アセンブラ・プラス（Pharmacia Biotech Gene Assembler Plus）（ニュージ ャージー州ピスカタウェイ）を使用して合成された。ヒトβグロブリン・プライ マーＰＣ０３／ＰＣ０４（１１０塩基対）はＣ．Ｔ．ウィットワーら、熱気によ る毛細管内自動ポリメラーゼ連鎖反応(C．T．Wittwer et al.，Automated polym erase chain reaction in capillary tubes with hot air，17 Nucl．Acids．Re s．4353‐4357(1989))に説明されており、本明細書で参照に含まれる。ＤＮＡ増 幅は、以下の実施例で特に記載していない限り、５０ｍＭトリス、ｐＨ８． ５（２５℃），３ｍＭＭｇＣｌ2，５００μｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、０． ５μＭの各プライマー、０．２ｍＭの各デオキシヌクレオシド三リン酸、５μｌ サンプルあたり０．２単位のＴａｑポリメラーゼで行なった。精製した増幅生成 物をＤＮＡテンプレートとして使用し、フェノール／クロロホルム抽出とエタノ ール沈殿法で得られた。Ｄ．Ｍ．ウォーレス、核酸の大規模及び小規模フェノー ル抽出及び沈殿法（D．M．Wallace，Large-and Small-scale phenol extraction s apd precipitation of nucleic acids，152 Methods in Enzymology 33-48(19 87)）参照。これに続けてセントリコン３０マイクロコンセントレータによる反 復洗浄でプライマーの除去を行なった（アミコン社、マサチューセッツ州ダンバ ース）。テンプレート濃度は２６０ナノメートルの吸光度で求めた。テンプレー トのＡ(２６０)：Ａ（２８０）比は１．７以上だった。 ＳＹＢＲTMグリーンＩ（モレキュラー・プローブズ社、オレゴン州ユージーン ）を１：１０，０００倍希釈、臭化エチジウムは５μｇ／ｍｌ、アクリジン・オ レンジは３μｇ／ｍｌで用いた。これらの濃度は各々の染料で増幅中に観察され る蛍光信号が最大になる最適濃度となるように決定した。励起はキセノン・アー ク光源から４５０〜４９０ナノメートル干渉フィルタを通したが、臭化エチジウ ムでは５２０〜５５０ナノメートル励起を使用した。ＳＹＢＲTMグリーンＩでは 、５２０〜５５０ナノメートルの放射をモニタした。臭化エチジウム蛍光は５８ ０〜６２０ナノメートル・バンドパスフィルタ経由で観察した。アクリジン・オ レンジの信号は緑色（５２０〜５５０ナノメートル）の赤色（＞６１０ナノメー トル）蛍光に対する比として取った。増幅前のサンプルの蛍光を３５サイクル後 の蛍光（最高９４℃、６０℃で２０秒）と６０℃で比較した。蛍光の増加はＳＹ ＢＲTMグリーンＩで５．３倍、臭化エチジウムで１．７倍、アクリジン・オレン ジで１．２倍だった。別の実験で、ＳＹＢＲTMグリーンＩからの蛍光は７０℃で ３０分以上にわたり安定していた。また便利なことに可視光で励起され臭化エチ ジウムより変異原物質になりにくいと主張されている。全例でのバックグラウン ド蛍光は主としてプライマーから発していた。 ＳＹＢＲTMグリーンＩは主として二重鎖と一重鎖核酸の間の優れた識別能に由 来する高感度のため、ＰＣＲの蛍光モニタリングに適した二重鎖特異性染料であ る。ＳＹＢＲTMグリーンＩはあらゆる増幅で使用できかつ安価である。さらに、 後述するように溶解曲線の分析で生成物特異性を得ることができる。 ハイブリダイゼーション・プローブ用の共鳴エネルギー転移染料選択。蛍光共 鳴エネルギー転移は２つの蛍光物質が物理的に接近し一方の蛍光物質の放射スペ クトルが他方の励起スペクトルとオーバラップしている場合に発生し得る。蛍光 共鳴エネルギー転移の導入理論は多くの最近の紹介論文に見ることができる。共 鳴エネルギー転移のレートは： （８．７８５Ｅ−５）（ｔ-1）（ｋ2）（ｎ-4）（ｑD）（Ｒ-6）（ＪDA） ただし、 ｔ＝受容体欠如時の供与体の励起状態寿命 ｋ2供与体と受容体の間の指向性係数 ｎ＝介在する媒体の可視光反射率 ｑD＝受容体欠如時の供与体量子効率 Ｒ＝供与体と受容体の間の距離（オングストローム単位） ＪDA＝オーバラップする全波長に対して（ＦD）（ｅA）（Ｗ4）の積分 ここでＦD＝供与体のピーク正規化蛍光スペクトル またｅA＝受容体の分子吸光係数（Ｍ-1ｃｍ-1） Ｗ＝波長（ナノメートル）とする。 何らかの任意の供与体と受容体で、５０％共鳴エネルギー転移が発生する距離 を計算することができこれをＲ0で表わす。共鳴エネルギー転移のレートは供与 体と受容体の間の距離の６乗に比例するので、ＲがＲ0から移動すると共鳴エネ ルギー転移は急激に変化する。２Ｒ0では、非常に僅かな共鳴エネルギー転移し か発生せず、０．５Ｒ0では他の形の脱励起（即ち衝突消光）が優勢でない限り 転移効率はほぼ完全である。多様な供与体と受容体の対でのＲ0の値が集積され ており２２から７２オングストロームの間で変化している。 二重螺旋ＤＮＡでは、１０塩基が約３４オングストロームは離れている。供与 体蛍光物質又は受容体蛍光物質でＤＮＡの塩基を標識することによって、ＤＮＡ の螺旋構造を観察するためのスペクトル的定規として共鳴エネルギー転移を使用 し４種類のＤＮＡ結合の構造を分析できる。共鳴エネルギー転移はハイブリダイ ゼーションのモニタとしても使用できる。標識したオリゴヌクレオチドが標識テ ンプレート鎖にハイブリダイゼーションされると、ＲはＲ0より相当大きな値か らＲ0以下に移動し、共鳴エネルギー転移が急激に増加する。これ以外にも、２ 種類の標識プローブを同じテンプレート鎖にハイブリダイゼーションして蛍光エ ネルギー転移に同様の変化を起こすことができる。 ハイブリダイゼーションをモニタするために実際に共鳴エネルギー転移を使用 するのは、要求される感度とどの程度の時間が使えるかによって変わる。１ナノ モル標識プローブでの競合ハイブリダイゼーション技術を使用すると、ＰＣＲ増 幅ＤＮＡは４０℃で１５分後に検出された。もっと高速の信号生成が望ましい。 ハイブリダイゼーションに秒単位しか必要でないなら、ＰＣＲ生成物は増幅の各 サイクルで便利に定量できる。さらには、プローブハイブリダイゼーションの範 囲を温度サイクル内でモニタできる。 ハイブリダイゼーションは秒単位の処理である（Ｂ．ヤング＆Ｍ．アンダーソ ン、溶液ハイブリダイゼーションの定量分析（B．Young & M．Anderson,Quantit ative analysis of solution hybridization，In:Nucleic AcidHybridization:A Practical Approach 47-71，（B．Hames，S．Higginseds.,1985))参照）。プロ ーブの濃度が標的濃度より大幅に高い場合、ハイブリダイゼーション・レートは プローブ濃度に逆比例する。たとえば、プローブ濃度を２倍にするとハイブリダ イゼーション時間は半分に減少する。ハイブリダイゼーションはハイブリダイゼ ーション部位がポリメラーゼ延長で被覆される前に起こる必要があるため、高い プローブ濃度がＰＣＲ中のサイクル後とモニタリングに必要である。 ＰＣＲ中のハイブリダイゼーション・モニタリングに必要な高いプローブ濃度 はユニークな特性の共鳴エネルギー転移対を要求する。供与体(Ｄ)と受容体(Ａ) の対の光による励起を考えてみる。直接励起されたＤとＡの蛍光の数は励起波長 での各蛍光物質の消光係数（ｅ）に比例することになる、即ち、 直接励起されたＤ分子数＝（Ｋ）（ｅD） 直接励起されたＡ分子数＝（Ｋ）（ｅA） ここでＫは比例定数である。供与体の脱励起は、蛍光、共鳴エネルギー転移、 その他の熱的消光と要約される過程によって発生する。ＰF＝共鳴エネルギー転 移の確率、ＰTD＝供与体の熱的消光の確率、とすると、供与体蛍光の確率は １−ＰF−ＰTD また蛍光を発する供与体分子数は （Ｋ）（ｅD）（１−ＰF−ＰTD） である。供与体放射ウィンドウ（たとえばバンドパスフィルタ・ウィンドウ） 内での供与体放射を検出する確率をＰDDとすると、観察される供与体放射個数は （ＰDD）（Ｋ）（ｅD）（１−ＰF−ＰTD） ここで、励起された受容体蛍光物質数が直接励起された受容体と共鳴エネルギ ー転移により励起された受容体の和であるので、 （Ｋ）（ｅA）＋（Ｋ）（ｅD）（ＰF） ＰTA＝受容体の熱的消光の確率とすると、受容体蛍光の確率は１−ＰTAまた蛍 光を発する受容体分子の個数は ［（Ｋ）（ｅA）＋（Ｋ）（ｅD）（ＰF）］［１−（ＰTA）］ また受容体放射ウィンドウ内で受容体放射を検出する確率をＰAAとすると、観 察される受容体放射の個数は （ＰAA）［（Ｋ）（ｅA）＋（Ｋ）（ｅD）（ＰF）］［１−（ＰTA）］ 最後に、受容体放射ウィンドウ内で供与体放射を観察する確率をＰDAとした場 合に、受容体放射ウィンドウ内で観察される（ＤとＡの両方の）放射の個数は （ＰAA）［（Ｋ）（ｅA）＋（Ｋ）（ｅD）（ＰF）］［１−（ＰTA）］＋ （ＰDA）（Ｋ）（ｅD）（１−ＰF−ＰTD） 蛍光測定は相対的でありＫが全ての項で存在することから、Ｋを除外して式を 組み立て直すと、供与体ウィンドウで観察される強度は（供与体励起）−（エネ ルギー転移）に比例し： １）（ｅD）（ｐDD）（１−ＰTD）−（ｅD）（ＰDD）（ＰF） また受容体ウィンドウで観察される強度は（受容体励起）＋（エネルギー転移 ）＋（受容体ウィンドウでの供与体放射）に比例するから、 ２）（ｅA）（ＰAA）（１−ＰTA）＋（ｅD）（ＰDD）（ＰF）（１−ＰTA） ＋（ｅD）（ＰDA）（１−ＰTD−ＰF） 共鳴エネルギー転移が増加すると、供与体信号が減少して受容体信号が増加す る。百分率信号変化は各ウィンドウ内のバックグラウンド光強度に依存する。プ ローブの濃度が高いと、バックグラウンド光強度が高い。ＰＣＲ中、標的（生成 物）濃度変化をモニタする必要がある場合、供与体濃度を標的濃度と一致させる ことは可能ではない。過剰な供与体分子が供与体及び受容体ウィンドウの両方で のバックグラウンド光強度に関係し部分的にエネルギー転移現象を隠蔽する。受 容体ウィンドウでのバックグラウンド光は受容体ウィンドウ内での供与体放射だ けではなく受容体の直接励起からも発生する。このバックグラウンドはｅAが低 くＰDAも低いと最少にできる。 フルオレセイン／ローダミン蛍光エネルギー転移対は、核酸検出に共通に使用 され、高いバックグラウンド蛍光を有している。直接受容体励起（ｅA、ほぼ１ ０％ｅmax）と、受容体放射（ＰDA、ほぼ２０％ピーク放射）を検出するために 使用される波長での供与体放射の双方が高い。この対はプローブ濃度が標的濃度 に近くハイブリダイゼーションを完了するのに充分な時間が与えられている場合 にハイブリダイゼーションをモニタするために使用できる。高いプローブ濃度が 必要とされＰＣＲでのテンプレート濃度が連続的に変化することから、ＰＣＲの 連続モニタでは蛍光体の有用な対ではない。 ハイブリダイゼーションによるＰＣＲ中の生成物濃度のモニタリングは、受け 入れ可能な共鳴エネルギー転移対が見付からなかったため過去においては不可能 だった。共鳴エネルギー転移を直接「非競合的」ハイブリダイゼーション検出に 使用する試みが幾つかなされてきた。たとえば、米国特許第５，５６５，３２２ 号では「受容体による再放射に関して観察されるエネルギー転移効率は比較的低 い」と述べている。有意なハイブリダイゼーションが秒単位で起こせる程にまで 充分に高いプローブ濃度では、バックグラウンド蛍光が高すぎる。 フルオレセインは恐らくもっとも広範に使用されている蛍光物質である。これ の消光係数と量子効率は高く、顕微鏡下、イムノアッセイ、フローサイトメトリ ーで広く使用されている。これはローダミンと併せて共通に使用される共鳴エネ ルギー転移対での供与体である。Ｃｙ５は一般的な赤色発光蛍光物質で消光係数 が非常に高い。Ｃｙ５のＮ−ハイドロキシサクシニミド・エステルの構造を図６ に図示し、関連した染料であるＣｙ５．５の構造を図７に図示してある。これら の染料はインドジカルボシアニン染料で、フローサイトメトリーや自動蛍光シー ケンサで共通に使用されており、アマシャム（ペンシルバニア州ピッツバーグ） から入手できる。フルオレセインとＣｙ５はどちらもオリゴヌクレオチドへの直 接自動組み込み用にアミダイトとして商業的に利用できる。しかし、Ｃｙ５はフ ルオレセインとの共鳴エネルギー転移対として報告されたことがない。直感的に 理解されるようにフルオレセイン放射とＣｙ５吸収は共鳴エネルギー転移を考慮 するには充分にオーバラップしていない。フルオレセインの放射スペクトルとオ リゴヌクレオチドに付着したＣｙ５の吸収スペクトルは図８に図示してある。曲 線の下側の領域を正規化すると、技術的スペクトルからのオーバラップは１９％ である。Ｃｙ５．５の励起は約２５ナノメートルだけ赤色に変移しており、フル オレセイン放射とのオーバラップは約１５％にまで減少する。スペクトルの赤色 、赤外領域での作業は測定機材の光学部品を選択する際に有利である。照明用に レーザーダイオードを使用でき、フォトダイオード検出器は優れた感度を有して おり、大半の材料は関係のあるスペクトル領域で自発蛍光が最少である。 スペクトル的なオーバラップが低いにもかかわらず、フルオレセインとＣｙ５ 又はＣｙ５．５の一方とがＰＣＲ中のハイブリダイゼーションモニタリングに優 れた共鳴エネルギー転移対を構成することが発見された。 実施例３ 中間部プローブＣＡＡＡＣＡＧＡＣＡ ＣＣＡＴＧＧＴＧＣＡ ＣＣＴＧＡＣ ＴＣＣＴ ＧＡＧＧＡフルオレセイン（配列ＩＤ No．３）とCy５−ＧＡＡＧＴ ＣＴＧＣＣ ＣＴＴＡＣＴＧＣＣＣ ＴＧＴＧＧＧＧＣＡＡ Ｇ−ｐ（配列ＩＤ No.１８）それぞれ０．２μモルと０．８単位ＫｌｅｎＴａｑ１ポリメラーゼ（ Ｔａｑポリメラーゼの５’−エクソヌクレアーゼ欠乏性亜種―米国特許第５，４ ３６，１４９号）を１０μｌ反応で用いた実施例２の手順にしたがって、１１０ ｂｐβグロブリン・フラグメントを５０ｎｇヒトゲノムＤＮＡから増幅した。プ ローブは同一鎖でプライマーに中間部ハイブリダイゼーションし何らかの介在塩 基なしにすぐ隣接していた。 プローブとプライマーは、従来技術で公知のように標準的ホスホラミダイト化 学により、即ちファルマシア・バイオテック遺伝子アセンブラ・プラス(Pharmac ia Biotech Gene Assembler Plus）（ニュージャージー州ピスカタウェイ）を使 用して合成した。３’−フルオレセイン標識したプローブはフルオレセイン標識 したＣＰＧカセット（グレン・リサーチ社、バージニア州スターリング）上で最 終トリチル−ＯＮをＣ１８逆相ＨＰＬＣ精製の補佐に用いて合成した。遅い溶出 ピークを回収し、トリチル残基をポリパック（グレン・リサーチ社）で除去した 。フルオレセイン標識オリゴヌクレオチドは５０％アセトニトリルで溶出しＣ１ ８逆相ＨＰＬＣでもう一度精製した。５’−Ｃｙ５−標識プローブは３’末端の 化学的リン酸化剤（グレン・リサーチ社）を用い、トリチル−ＯＦＦ合成中にＣ ｙ５アミダイト（ファルマシア社）を５’末端に追加して合成した。失敗した配 列はＣ１８逆相ＨＰＬＣで除去した。プローブ純度はポリアクリルアミド電気泳 動と染料及びオリゴヌクレオチドの吸光度でチェックした。 ＨＰＬＣは４×２５０ｍｍ Ｈｙｐｅｒｓｉｌ ＯＤＳカラム（ヒューレットパ ッカード社）で０．１Ｍトリエタノールアミン：酢酸移動相とアセトニトリル・ グラジエントを用い１ｍｌ／分で行なった。溶出は吸光度（Ａ260）と蛍光（フ ルオレセインでは４９０ｎｍ励起、５２０ｎｍ放射、またＣｙ５については６５ ０ｎｍ励起、６７０ｎｍ放射）をモニタした。トリチレート及びフルオレセイン 標識オリゴヌクレオチドは１０〜２０％のアセトニトリル・グラジエントに溶出 し、Ｃｙ５標識オリゴヌクレオチドは１０〜４０％アセトニトリル・グラジエン トに溶出した。 温度サイクルは、２０℃／毎秒のプログラム式アプローチ速度で９４℃０秒、 アプローチ速度２０℃／毎秒で６０℃２０秒、また１℃／毎秒のアプローチ速度 で７５℃０秒とし毛細管蛍光高速温度サイクラによった。温度サイクル中、フル オレセインとＣｙ５の蛍光はアニーリング・伸長セグメントの終りで各サイクル で取得した。共鳴エネルギー転移は増幅サイクル２６あたりで始まったフルオレ セイン蛍光の減少とＣｙ５蛍光の増加の両方として観察された（図９）。一般に 、フルオレセイン蛍光に対するＣｙ５の蛍光比は好適である。 フルオレセイン／Ｃｙ５対で予想しない良好な結果について、少なくとも部分 的には説明を付けることができる。オーバラップ積分ＪDAはスペクトルのオーバ ラップだけでなく、受容体の消光係数にも依存し（Ｃｙ５は６５０ｎｍで２５０ ，０００Ｍ-1ｃｍ-1の消光係数を有する）、波長の４乗で変化する。これらの要 素のどちらも、スペクトル的オーバラップが低いとしてもＣｙ５で高いＪDAに有 利である。最近、フィコエリスリンとＣｙ７は、スペクトル・オーバラップが低 いにもかかわらず、免疫蛍光に有効なタンデム・プローブであると示された。後 者の例で、ハイブリダイゼーション・プローブの標識としてのフルオレセインと Ｃｙ５．５の有用性が示されている。蛍光共鳴エネルギー転移は相互作用する染 料がスペクトル的に低いオーバラップを有している場合でも核酸ハイブリダイゼ ーションをモニタするために使用することができる。フルオレセインとＣｙ５， Ｃｙ５．５，及びその他の赤色又は赤外放射線量をハイブリダイゼーションのモ ニタリング用共鳴エネルギー転移対として使用することは従前には認識されて来 なかった。フルオレセインは６００ｎｍ、７００ｎｍに及ぶ長い放射「尾部」を 有し遠赤色や赤外染料を励起するのに使用できる範囲を越えている。エネルギー 転移レートはオーバラップ積分に依存するが、これも蛍光物質間の距離の６乗で 起こる。共鳴エネルギー転移染料が接近するようにプローブが設計されている場 合、転移レートは高い。少なくともフルオレセイン／Ｃｙ５，フルオレセイン／ Ｃｙ５．５，及び同様の対で、蛍光物質が介在塩基なしに隣接プローブに付着さ れる 上記実施例と同様に蛍光物質どうしが接近している場合に、共鳴エネルギー転移 は衝突消光やその他の形のエネルギー損失より優位であるように見える。 ハイブリダイゼーション・プローブとしての共鳴エネルギー転移対の潜在的有 用性は極小及び極大共鳴エネルギー転移での供与体及び受容体の光強度比の変化 を観察することにより判定することができる。極小及び極大の転移を得る１つの 方法としては、両方の蛍光物質を同一オリゴヌクレオチドに付着させホスホジエ ステラーゼによる消化の前後で蛍光比を測定することが挙げられる。 実施例４ ２重標識フルオレセイン／Ｃｙ５プローブCy５−ＣＴＧＣＣＧ−Ｆ−ＴＡＣＴ ＧＣＣＣＴＧＴＧＧＧ ＧＣＡＡＧＧｐ（配列ＩＤ No.１９）を標準ホスホラ ミダイト化学で合成した。ここでｐは末端３’リン酸（化学的リン酸化剤、グレ ン・リサーチ社）、Ｆは２−アミノブチル−１，３−プロパンジオール骨格を有 するアミダイトとして自然の３炭素ヌクレオチド間リン酸ジエステル距離を保つ ために導入したフルオレセイン残基（クロンテック社、カリフォルニア州パロア ルト）、Ｃｙ５はアミダイトとして添加（ファルマシア社）した。０．１Ｍトリ スｐＨ８．０でのフルオレセイン蛍光に対するＣｙ５の比はホスホジエステラー ゼ（シグマ、モンタナ州セントルイス）による完全水解の前後に得られた。蛍光 比の変化は水解後に２２０倍だった。２重標識フルオレセイン／ローダミン・プ ローブＦ−ＡＴＧＣＣＣＴ*ＣＣＣ ＣＣＡＴＧＣＣＡＴＣ ＣＴＧＣＧＴｐ（ 配列ＩＤ No.２０）をパーキン・エルマー社（カリフォルニア州フォスターシテ ィ）から購入した。ここでＦはフルオレセイン、*はアミノ・リンカー腕で改変 Ｔ残基に付着させたローダミンである。蛍光比の（フルオレセインに対するロー ダミンの）変化はホスホジエステラーゼによる水解後に２２倍だった。 フルオレセイン／Ｃｙ５対からの潜在的信号はフルオレセイン／ローダミン対 のそれより１０倍だった。 実施例５ ＰＣＲ中のフルオレセイン及びＣｙ５で標識した隣接ハイブリダイゼーション ・プローブの比率、濃度、間隔の影響について研究した。βグロブリン配位と実 施例３のプローブ対の増幅を用いCY５のフルオレセインに対する蛍光比の最大変 化を観察した。極大信号はＣｙ５のフルオレセイン標識プローブに対する比が２ ：１の場合に発生した（図１０）。２：１の比では、最良の信号は、フルオレセ イン・プローブ濃度０．２μモル、Ｃｙ５標識プローブ濃度０．４μモルで発生 した（図１１）。ＰＣＲ中に隣接ハイブリダイゼーション・プローブの間で最適 な介在塩基数も決定した。長さが同じでハイブリダイゼーション位置が僅かに変 移している数種類のプローブを実施例３にしたがって合成し、βグロブリン標的 にハイブリダイゼーションした場合に、プローブ間に０，１，２，３，４，又は ６塩基が残るようにした。ＰＣＲ中で最高の信号は介在塩基数１で発生した（図 １２）。ある程度の共鳴エネルギー転移が１５塩基の間隔又２５塩基でも検出さ れたが、もっと良好な転移は０〜５塩基で発生した。 ヘラーら（米国特許第４，９９６，１４３号）は、蛍光物質間のヌクレオチド 数が４から０ユニットに減少するとエネルギー転移効率が減少することを発見し た。対照的にフルオレセイン／Ｃｙ５対による最高のエネルギー転移は介在ヌク レオチド数が０から２で見られた。 ハイブリダイゼーション・プローブ法。標的に隣接してハイブリダイゼーショ ンする２つのプローブを合成し各々を共鳴エネルギー転移対の一方の蛍光物質で 標識した場合、共鳴エネルギー転移はハイブリダイゼーションが起こった場合に 増加する（図５Ｃ）。フルオレセイン／ローダミン対は核酸検出でもっとも共通 に使用されている。 本発明の１つの側面はＰＣＲ生成物の検出のために配列特異性の均質ハイブリ ダイゼーション法を提供することである。どのようにすればこれを実現できるか は明らかではない。増幅中にハイブリダイゼーション・プローブを使用するのは 直感的に分かり辛い。プローブのハイブリダイゼーションとポリメラーゼ延長が 両方とも起こり得るとは思われない。配列特異性の蛍光を得るためには、プロー ブをハイブリダイゼーションする必要があるが、ポリメラーゼがプライマー延長 を完了し指数関数的にＤＮＡを増幅すべき場合にはプローブはハイブリダイゼー ションできない。 この問題に対する１つの解決策は、２重標識した単一のプローブを使用し、共 通の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの５’−エクソヌクレアーゼ活性を用いて延長 中のプローブを割断し、これによって２つの蛍光物質を分離することである。こ の場合、蛍光信号はプローブ水解時に共鳴エネルギー転移対の分離から発生し( 図５Ｂ)、隣接ハイブリダイゼーションによる蛍光物質の接近によるものではな い（図５Ｃ）。しかし、２重標識プローブは作成が困難で、オリゴヌクレオチド へ少なくとも一つの蛍光物質を用手的に追加する必要があり、一般に相当以上の 精製を必要とする。プローブは高価であり、２種類の２重標識プローブが標的の 競合的定量又は突然変異検出に必要である。さらに問題なのは観察される蛍光が 水解されたプローブの累積量によって変化することで、何らか任意のサイクルに 存在する生成物の量に直接依存しないことである。これによってＰＣＲのプラト ー域に達した後でも蛍光が連続的に増加する。最後に又もっとも重要なことに、 プローブの水解はポリメラーゼ延長中に必ず発生するわけではなく、この効果は 良く理解されていない。たとえば、実施例４の２重標識フルオレセイン／Ｃｙ５ プローブは、プライマーによって挟まれた場合にＰＣＲ中に非常に乏しい水解を 示した。実際、数種類の２重標識フルオレセイン／Ｃｙ５プローブが、末端標識 したプローブを含めて作成され、その全てが乏しい水解と増幅中の信号精製を示 した。 隣接ハイブリダイゼーション・プローブのあるＰＣＲ生成物の均一な検出は５ ’−エクソヌクレアーゼ系に見られる問題の多くを解決する。隣接ハイブリダイ ゼーション・プローブの合成は、フルオレセインとＣｙ５両方のアミダイトが自 動合成中の直接組み込み用に入手できるためと１つのプローブの２重標識化が必 要とされないため、比較的簡単である。水解ではなくハイブリダイゼーション から蛍光が得られるので、プローブ蛍光の温度依存性を変移検出と定量に用いる ことができる。しかし、ＰＣＲ生成物の均一検出に隣接ハイブリダイゼーション ・プローブを用いることはこれまで報告されていない。驚くべきことに、信号精 製のためのハイブリダイゼーションとプローブによってブロックされた領域を通 るポリメラーゼ延長による増幅がどちらも起こり得る。 実施例６ １１０ｂｐβグロブリンフラグメントを、実施例３に記載した隣接フルオレセ イン及びＣｙ５標識プローブを用いてゲノムＤＮＡから増幅した。１０μｌ反応 に０．４Ｕ（Ｔａｑ）又は０．８Ｕ（Ｓｔｏｆｆｅｌフラグメント、パーキン・ エルマー社、又はＫｌｅｎＴａｑ１）いずれか一方の酵素を使用した。特に示し ていない限り、温度サイクルはプログラム式アプローチ速度２０℃／毎秒で９４ ℃０秒、アプローチ速度２０℃／毎秒で６０℃２０秒、アプローチ速度１℃／毎 秒で７５℃０秒とした。図１３は３０サイクルにわたってテンプレートを増幅し た直後での２種類の隣接ハイブリダイゼーション・プローブによる蛍光の発生を 示す。短時間の９４℃での変性後、温度を６０℃まで下げ約２０秒にわたり蛍光 が増加した。信号強度は５’−エクソヌクレアーゼ活性を含む自然のＴａｑポリ メラーゼよりもエクソヌクレアーゼ欠乏ポリメラーゼ（Ｓｔｏｆｆｅｌフラグメ ント）のほうが大きかった。約２０秒後、ポリメラーゼがプローブを移動および ／または水解すると蛍光は低下する。蛍光の相対的低下は、ポリメラーゼが５’ −エクソヌクレアーゼ活性を有する場合（ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ）のほうが この活性を欠く場合（Ｓｔｏｆｆｅｌフラグメント）より僅かに早い。 図１４（上部パネル）において、９４℃と６０℃の間で温度をサイクルし６０ ℃で２０秒保持している。蛍光が最大になる２０秒の終りで蛍光を採取する。Ｔ ａｑ（ｅｘｏ+）では良好な増幅が見られるが、蛍光の発生とアガロースゲル（ ゲルは図示していない）両方で確認されるようにＳｔｏｆｆｅｌフラグメント（ ｅｘｏ-）では発生しない。しかし、６０℃での時間を２０秒から１２０秒に延 長すると（図１４，中央パネル）、ｅｘｏ-ポリメラーゼも良好に増幅する。ｅ ｘ ｏ-ポリメラーゼによるプローブ移動速度が遅いことは、見かけ上ｅｘｏ+ポリメ ラーゼより効率的な増幅に６０℃でさらに時間を必要とする。ｅｘｏ-ポリメラ ーゼに必要な時間は６０℃から７５℃へ温度をゆっくりと上げることによって減 少できる（図１４，下部パネル）。ポリメラーゼはプローブに到達すると停止す る。しかし、プローブ溶解温度では、プローブがテンプレートを溶解しポリメラ ーゼは鎖の重合完了まで妨害されずに進行する。重合はプローブ溶解後に温度が あまり急速に上昇しない限り完了する。図１４は（下部パネル）ｅｘｏ+ポリメ ラーゼ１種類（Ｔａｑ）とｅｘｏ-ポリメラーゼ２種類（Ｓｔｏｆｆｅｌフラグ メントとＫｌｅｎＴａｑ１）を示す。 エクソヌクレアーゼ活性が存在する場合、幾つかのプローブは大幅増幅による 蛍光の減少によって明らかになるように各サイクルで水解されている。これは図 １３及び図１４（中央と下部のパネル）で観察されるが、ｅｘｏ-ポリメラーゼ では発生しない。蛍光が大幅増幅で安定していることから、ＫｌｅｎＴａｑ１な どのｅｘｏ-ポリメラーゼが適当である。 隣接ハイブリダイゼーション・プローブを使用してのＰＣＲのモニタリングが 成功するかどうかは幾つかの要因によって決まる。共鳴エネルギー転移は隣接ハ イブリダイゼーション・プローブ間に０から２個の介在塩基が存在する場合に最 大になる。プライマーがプローブ・ハイブリダイゼーション領域で拡張する前に プローブにハイブリダイゼーションする鎖の一部を増加させるには、プローブ溶 解温度をプライマー溶解温度より高くすべきである（望ましくは＞５℃）。 サイクル毎の蛍光。ゲル電気泳動によるＤＮＡ増幅における従来のエンドポイ ント分析では生成物のサイズを同定して純度を推定している。しかし、増幅は最 初は確率論的に、次に指数関数的に、最後には停滞的に行なわれるので、エンド ポイント分析の使用は定量に限られる。本発明の１つの側面には、ハイブリダイ ゼーション・プローブによる初期テンプレートのコピー数の定量のためのサイク ル毎のモニタリングが含まれる。当業者には理解されるように、ＤＮＡ増幅を行 なっている多数サンプルのサイクルあたり１回のモニタリングは強力な定量ツー ルである。サイクル毎モニタリングは各サイクルの拡張又はアニーリング／拡張 組み合わせフェーズの間に蛍光を観察し蛍光を生成物濃度と相関することによっ て実現される。 実施例７ ３種類の異なる蛍光技術によりＰＣＲのサイクル毎モニタリングを行なった。 蛍光は、（ｉ）二重鎖特異性染料であるＳＹＢＲTMグリーンＩ、（ｉｉ）２重標 識水解プローブのエクソヌクレアーゼ開裂後のローダミンによるフルオレセイン 消光の減少、（ｉｉｉ）隣接ハイブリダイゼーション・プローブによるフルオレ セインからＣｙ５への共鳴エネルギー転移、によりモニタした。増幅試薬及び条 件は実施例２に記載した通りとした。ヒトβグロブリン・プライマーであるＲＳ ４２／ＫＭ２９（５３６塩基対）とＰＣ０３／ＰＣ０４（１１０塩基対）につい てはＣ．Ｔ．ウィットワーら、熱気による毛細管内自動ポリメラーゼ連鎖反応(C ．T．Wittwer et al.,Automated polymerase chain reaction in capillary tub es with hot air，17 Nucl．Acids．Res．4353‐4357(1989))に説明されており 、本明細書で参照に含まれる。βグロブリンの温度サイクルは最高９５℃、最低 ６１℃、７２℃１５秒間で温度間の平均レートは５．２℃／秒だった。βアクチ ン・プライマーとフルオレセイン／ローダミン２重標識プローブはパーキン・エ ルマー（番号Ｎ８０８−０２３０）から入手した。βアクチンの温度サイクルは 最高９４℃、６０℃１５秒間で温度間平均レートは６．２℃／秒だった。単一標 識プローブである５’−ＣＡＡＡＣＡＧＡＣＡ ＣＣＡＴＧＧＴＧＣＡＣＣＴＧ ＡＣＴＣＣＴ ＧＡＧＧＡ−フルオレセイン−３’（配列ＩＤ No.３）と５’− Ｃｙ５−ＡＡＧＴＣＴＧＣＣＧ ＴＴＡＣＴＧＣＣＣＴ ＧＴＧＧＧＧＣＡＡＧ ｐ（配列ＩＤ No.４）を実施例３の通りに合成した。これらの隣接プローブは同 一ＤＮＡ鎖のＰＣ０３／ＰＣ０４βグロブリン・プライマー対と中間部ハイブリ ダイゼーションし塩基対１個で隔てられる。温度サイクルは最高９４℃、５９℃ ２０秒間で温度間平均レートは７．０℃／秒だった。ハイブリダイゼーシ ョン・プローブ（βアクチンとβグロブリン）は各々０．２μモルで使用した。 ＳＹＢＲTMグリーンＩにより多数サンプルを各サイクルで一度にモニタする場 合、１０の７乗から１０の８乗の初期テンプレート濃度範囲が図１５に図示して あるように識別できる。この増幅は２重特異性染料としてＳＹＢＲTMグリーンＩ を用いたβグロブリン遺伝子の５３６塩基対フラグメントによるものである。各 サンプルのパーセント最大蛍光でデータを正規化した場合、初期１００コピーが １０コピーから明らかに分離した。しかし、１と１０コピーの間の相違は微妙（ marginal）であり、サンプルあたり０及び１平均コピー間での相違は観察されな かった。 これとは対照的に、配列特異性プローブは同様のダイナミックレンジを有する が、陰性対照から単一の初期テンプレートコピーでさえ識別するように見える。 ５’−エクソヌクレアーゼ・プローブ（βアクチン・フラグメント、図１６）の 信号生成はＤＮＡ合成に依存する他、２重標識プローブの蛍光物質間のハイブリ ダイゼーションと水解を必要とする。この水解は消光を減少させ、フルオレセイ ンのローダミン放射に対する蛍光比が増加する。二重鎖染料からの蛍光が過剰サ イクルでレベル低下する一方（図１５）、エクソヌクレアーゼ・プローブからの 信号は各サイクルで増加し続ける（図１６）。実質生成物が合成されていないと してもプローブのハイブリダイゼーションと水解は起こり続ける。テンプレート のコピー数が１０の３乗未満に減少すると、信号強度は減少するものの、陰性対 照信号が安定していることから少ないコピー数をまだ定量することができる。 図１７において、増幅は隣接ハイブリダイゼーション・プローブを用いてモニ タしておりＣｙ５のフルオレセイン蛍光に対する比率として表現している。蛍光 比の変化は大半が共鳴エネルギー転移からのＣｙ５蛍光の増加によるものである （図９）。２重標識水解プローブとは対照的に、ハイブリダイゼーション・プロ ーブの蛍光信号はポリメラーゼがエクソヌクレアーゼ活性を含む場合高いサイク ル数で減少する（図１４も参照）。 ＰＣＲ中のハイブリダイゼーションの共鳴エネルギー転移検出に２種類の異な る方法を用いる本発明の実現可能性をここで示すことにする。第一の方法は、一 方が３’末端にフルオレセイン、他方が５’末端にＣｙ５を標識してある２種類 の隣接ハイブリダイゼーション・プローブを使用する。ＰＣＲ中に生成物が多く なると、プローブは各サイクルのアニーリング・セグメントの間に互いに隣接し てハイブリダイゼーションする。第２の方法はＣｙ５を標識したプライマーと単 一のハイブリダイゼーション・プローブを使用する。標識プライマーは増幅中に ＰＣＲ生成物に組み込まれ単一のハイブリダイゼーションしか必要としない。 実施例８ Ｃｙ５標識プライマーとフルオレセイン標識ハイブリダイゼーション・プロー ブの間の共鳴エネルギー転移によるＰＣＲのサイクル毎モニタリングを行なった 。これを、隣接Ｃｙ５／フルオレセイン・ハイブリダイゼーション・プローブに よるモニタリングと比較した。Ｃｙ５標識プライマーはＣＡＡＣＴＴＣＡＴＣ ＣＡＣＧＴ*ＴＣＡＣＣ（配列ＩＤ No.２１）、ただしＴ*はＣｙ５を付着させた 改変Ｔ塩基、またこれに対応するプローブはＧＴＣＴＧＣＣＧＴＴ ＡＣＴＧＣ ＣＣＴＧＴ ＧＧＧＧＣＡＡ−フルオレセイン（配列ＩＤ No.２２）だった。隣 接ハイブリダイゼーション・プローブはＣＣＴＣＡＡＡＣＡＧ ＡＣＡＣＣＡＴ ＧＧＴ ＧＣＡＣＣＴＧＡＣＴＣＣ−フルオレセイン（配列ＩＤ No.２３）、及 びＣｙ５−ＧＡＡＧＴＣＴＧＣＣ ＧＴＴＡＣＴＧＣＣＣ ＴＧＴＧＧＧＧＣＡ Ａｐ（配列ＩＤ No.２４）だった。ハイブリダイゼーション・プローブは実施例 ３にしたがって合成し０．２μモルで使用した。Ｃｙ５標識プライマーは２ステ ップで合成した。自動合成を用いて所望するＴ位置にアミノ・モディファイアＣ ６ｄＴ（グレン・リサーチ社）を組み込んだ。次に、Ｃｙ５の１価Ｎ−ハイドロ キシサクシニミド・エステル（図６）をメーカー指示（アマシャム）にしたがっ てアミノ・リンカに用手的に結合した。ＨＰＬＣ精製は実施例３に説明した通り に行なった。 Ｃｙ５標識プライマー（０．５μモル）をＰＣＯ４の代わりに使用して、実施 例３と同様にヒト・ゲノムＤＮＡから１１０塩基対βグロブリンフラグメントを 増幅したが、１０μｌあたりＴａｑポリメラーゼ０．４単位を使用した点が異な る。隣接ハイブリダイゼーション・プローブでも同一のβグロブリン・フラグメ ントの増幅をモニタした。温度サイクルは９４℃０秒及び６０℃２０秒で行なっ た。蛍光は各サイクルとも１回アニーリング／拡張区間の終りにモニタした。両 方法において、Ｃｙ５の共鳴エネルギー転移はハイブリダイゼーションで増加し ており、Ｃｙ５のフルオレセイン蛍光に対する比としてプロットしてある（図１ ８）。 追加の実験において、Ｃｙ５標識とフルオレセイン標識を隔てている塩基数を 変化させた。最高の蛍光共鳴エネルギー転移は蛍光物質間の約４〜６塩基で観察 されたが、信号は少なくとも１５塩基まで検出可能だった。 水解プローブとは対照的に、ハイブリダイゼーション・プローブからの蛍光信 号は累積したものではなく、各アニーリング・フェーズの間に新規に発生してい る。ハイブリダイゼーションは疑似一次反応であるため蛍光が生成物濃度の直接 的指標である。プローブ濃度が生成物より大幅に高いことからプローブにハイブ リダイゼーションした生成物の一部分は生成物濃度に依存しない。こうした特性 は標識プライマーと一緒に単一のハイブリダイゼーション・プローブを使用する ことで定量のために生成物堆積の優れたモニタを提供し得るであろうことを示し ている。サイクル毎モニタリング中の異なる蛍光技術に固有の変動も定量には重 要である。 実施例９ ３種類の異なる蛍光モニタリング方の各々について実施例２にしたがってＤＮ Ａ増幅を実施した。プライマーＫＭ２９とＰＣ０４からの２０５塩基対ヒトβグ ロブリン・フラグメントの増幅においてＳＹＢＲTMグリーンＩを１：１０，００ ０倍希釈で使用した。水解プローブと条件は実施例７に指定したものである。ハ イブリダイゼーション・プローブＴＣＴＧＣＣＧＴＴＡ ＣＴＧＣＣＣＴＧＴＧ ＧＧＧＣＡＡＧ−フルオレセイン（配列ＩＤ No.５）をＫＭ２９、またＣｙ５標 識プライマーＣＡＡＣＴＴＣＡＴＣＣＡＣＧＴＴ*ＣＡＣＣ（配列ＩＤ No.６） と用い、ここでＴ*は実施例８と同様に合成したＣｙ５標識Ｔ塩基とした。全て の増幅は１５，０００テンプレート・コピーによる１０複製（ヒトゲノムＤＮＡ50 ｎｇ／１０μｌ）で行なった。温度サイクルは長さ３１秒（最高９４℃、６０ ℃２０秒間、温度間平均レート６．２℃／秒）だった。蛍光はアニーリング／拡 張フェーズの１５秒目から２０秒目の間で各サンプルについて観測した。 図１９ではＰＣＲについて３種類の蛍光モニタリング技術を比較できる。蛍光 プローブは二重鎖ＤＮＡ染料ＳＹＢＲTMグリーンＩ（図１９Ａ）２重標識フルオ レセイン／ローダミン水解プローブ（図１９Ｂ）、フルオレセイン標識ハイブリ ダイゼーション・プローブとＣｙ５標識プライマー（図１９Ｃ）である。全部の プローブがサイクル２０付近で発生する検出可能な蛍光に対してほとんど同じ感 度を有していた。増幅を延長すると、信号は水解プローブに併せて増加を続け、 ＳＹＢＲTMグリーンＩで同等、またハイブリダイゼーション・プローブで僅かに 減少した。３種類の蛍光モニタリング技術の精度は図１９Ｄで比較している。平 均±標準偏差が各点についてプロットしてある。データは基線以上の蛍光比（サ イクル１１〜１５の平均として取った）の変動係数（標準偏差／平均）としてプ ロットした。 水解プローブからの蛍光比変化はハイブリダイゼーション・プローブからのそ れより大きい（図１９Ｂ及び図１９Ｃ）が、水解プローブからの蛍光の変動係数 の方が大きい（図１９Ｄ）。つまり、ハイブリダイゼーション・プローブ法から 得られる蛍光は、絶対信号レベルが低いとしても、水解プローブを用いるより正 確である。これは一般的な２重標識水解プローブに勝るハイブリダイゼーション ・プローブの予期しなかった利点である。 初期テンプレート・コピー数の定量。 定量ＰＣＲは医生物学的研究と臨床検査の双方で重要な技術となった。定量処 理は標的配列の既知のコピー数を含むサンプルの標準曲線を作ることを含む。未 知のサンプルのコピー数は既知の値の間に外挿することで決定される。完全な増 幅曲線が存在するＤＮＡ量に比例した信号をもたらす蛍光、放射線、又は何らか の他の方法を用いてサイクル毎にモニタされる場合、分析には多くのデータ点を 利用でき、標準又は未知を表わすのにどの値を選択するかは明確ではない。従来 技術では信号の「閾値」を選択して標準又は未知が代表的な値としてその閾値と 交差する時のサイクル数を使用している（ヒグチ＆ワトソンのＥＰＡ０ ６４０ ８２８ Ａ１出願を参照）。このアプローチは増幅曲線で利用可能なデータのう ちの非常に少ない量を使用するものである。さらに、閾値の割り当ては非常に主 観的であり意識的又は無意識的な偏倚を受ける。非線形カーブフィッティング技 術を増幅曲線のデータに適用することによりもっと多くの利用可能なデータを客 観的に使用することができる。望ましくは、基本となる過程の要因をモデル化す ることによって増幅曲線の形状を記述する式を見付けるのが良い。 多数の異なる式を用いて増幅中に作成したデータをカーブフィッティングする ことができる。ＤＮＡ増幅は代表的には対数線形セグメントを有するのでこのセ グメントのデータをＤＮＡ増幅で想定したのと同様の指数関数的増加を記述する 式に当てはめることができる。ＤＮＡ増幅の対数線形部分は次式によって記述で きる： ｙ＝Ａ*［ＤＮＡ］*（１＋Ｅ）n ここでＡは信号の単位をＤＮＡの単位に変換する倍率係数、［ＤＮＡ］は反応 におけるＤＮＡの開始濃度、Ｅは反応の効率、ｎはサイクル数である。 定量処理は、（１）既知の標準をこの式に当てはめてパラメータＡとＥが浮動 するようにし、（２）標準からＡとＥの値を用いて未知のサンプルを式に当ては め［ＤＮＡ］が浮動するようにする。この技術はもっと多くのデータを使用して おり、もっとも情報量が豊富であろうと思われるデータの一部である対数線形部 分を使用している。図２０，図２１，図２２はこのアプローチの例を示す。精製 ＰＣＲ生成物の１０倍希釈を標準曲線として増幅し「未知の」ヒトゲノムＤＮＡ 鎖を用いた。図２０は対数線形部分が使用者又はソフトウェアどちらかによって 簡単に同定されることを示している。図２１は１０の４乗コピー標準への式ｙ＝ Ａ*［ＤＮＡ］*（１＋Ｅ）nの適用を示す。図２２はＡとＥについて数個の標準 からの平均値を使用し［ＤＮＡ］を適用する。適用した値１６，７００はゲノム ＤＮＡの単一コピー遺伝子についての理論値（１５，０００コピー）に非常に近 い。 増幅曲線のデータ全部を使用するとバックグラウンド・レベルとプラトー値が 含まれる。高いコピー数ではプラトーが情報量豊富でないものの、低いコピー数 では開始コピー数に比例することが多い。バックグラウンド・レベルは信号の有 意な増加を示す最初の点を決定するのに有用であろう。この時点でＤＮＡ増幅曲 線の形状に関係する全ての要因が既知ではないので、１つのアプローチで曲線の 形状を記述する。図２３は蛍光ハイブリダイゼーション・プローブを用いてＤＮ Ａテンプレート濃度の５桁の大きさ範囲を検出する増幅曲線を示す。各々の曲線 は次式にフィッティングする： ｙ＝｛（ａｓ*ｘ＋ａｂ）ー（ｄｓ*ｘ＋ｄｂ） ｝／（１＋（ｘ／ｃ）＾ｂ）＋（ｄｓ*ｘ＋ｄｂ） ここで「ａｓ」は傾斜線のバックグラウンド、「ａｂ」はバックグラウンド線 のｙ切片、「ｄｓ」はプラトー線の傾き、「ｄｂ」は傾斜線のｙ切片、「ｃ」は サイクル数で、反応はバックグラウンドからプラトーの中央（Ａ50）である。ま た「ｂ」は増幅の対数線形部分の傾きである。 この式はこの増幅データに良好なカーブフィッティングを示し、図２４はＡ50 の値が７桁の大きさにわたる開始コピー数の対数と良く相関していることを示す 。図２５は水解プローブを用いて５桁の大きさ範囲にわたるＤＮＡテンプレート を検出した増幅からのデータに適用した同じ式を示す。この式はこの増幅データ に良好なカーブフィッティングを示しており、図２６はＡ50の値が開始コピー数 の対数と良く相関していることを示している。これは式がハイブリダイゼーショ ン・プローブ増幅曲線のシャープなプラトー群と水解プローブ曲線の安定的に増 加する「プラトー」群の双方に対して良好なカーブフィッティングを与えること から全カーブフィッティング・アプローチの柔軟性を明示している。 全カーブフィッティングはこの式に限定されない。図２７は次式への３種類の 濃度のＤＮＡテンプレート・フィッティングの増幅を示している： ｙ＝（（（ａｓ*ｘ＋ａｂ）−（ｄｍａｘ*ｘ／ｄｄ＋ｘ）／（１＋（ｘ／ｃ） ＾ｂ））＋（ｄｍａｘ*ｘ／ｄｄ＋ｘ） これは最初の６パラメータの式と似ているが直線ではなく双曲線によってプラ トーが定義されている点が異なっている。図２８はこの式についてのＡ50が開始 コピー数に良く相関することを示す。 Ａ50を上記実施例では用いたが増幅プロファイルにおいて特定の技術がもっと 頑丈に低いか又は高い場合にバックグラウンドとプラトーの間のレベルを選択で きる。たとえば一連の増幅標平曲線を開始コピー数とＡ50、Ａ４０，Ａ３０，Ａ20 ，Ａ10の間の最高の相関について評価する。既知の開始コピー数と最も良く相 関する増幅のレベルが決定される。これは違う検出系では異なったものになる。 図１９は各種検出システムでの変動係数を示す。最も良く予測している増幅レベ ルは変動係数が最低のレベルになり易いと思われる。 ＤＮＡ増幅反応自体が良く理解されるようになると、物理的処理を反映するパ ラメータを有する他の式を用いることができる。ＤＮＡ増幅曲線のプラトーは異 なる反応で異なった原因を有している。これはプライマーが後の方のサイクルで 生成物アニーリングを完了できないことに由来することが多い。この効果は反応 生成物濃度の自乗に依存するパラメータで捕捉できる（アニーリング・レートは 生成物濃度の自乗に比例する）。プラトーの別の原因はプライマーの欠乏であり 得る。プライマーで制限される反応は特徴的な形状を有し、識別し得る非常にシ ャープなプラトーを有している。プライマーで制限される反応のフィッティング はこのシャープな頂点を定義するパラメータを含む。酵素制限反応は非常に丸い プラトーを有しておりこれに合わせたカーブフィッティングができる。重み付け 因子は任意のシステムで既知の変動係数を反映して信頼性の高いデータ点程重く なるように重み付けする工夫ができる。増幅プロファイルのより多くの点をカー ブフィッティングすることにより、開始コピー数のより正確で頑丈な推定を得る ことができる。１つまたはそれ以上のこれらのカーブフィッティング・パラメー タを用いて未知のサンプルの開始コピー数を推定することができる。 ＰＣＲの連続蛍光モニタリング。本発明の特徴である連続モニタリング、即ち 各ＰＣＲサイクル内での多数回モニタリングについてここで議論する。ＰＣＲ中 の蛍光モニタリングは一定温度で各サイクル中に１回ずつ行なうことができるが 、本発明はＰＣＲサイクル全体を通しての連続モニタを提供することの重要な利 点を提供する。蛍光が温度変化につれて変化することから温度は重要である。図 ２９Ａと図２９ＢはＳＹＢＲTMグリーンＩについて温度と蛍光の間の逆比例関係 を示している。これは温度サイクル中の困惑するような作用で、一定の拡張温度 でサイクルあたり１回蛍光を考慮することで通常なら排除される。しかし、本発 明によれば、温度変化中の蛍光をモニタするのは非常に情報量が豊富である。本 発明以前には、各サイクル１回ずつに対向する各サイクル内の連続的な蛍光モニ タリングは実施されていない。本発明によれば、時間、温度と蛍光を毎秒、２０ ０ミリ秒毎、１００ミリ秒毎、又はもっと高頻度で取得する。このようなデータ からは生成物の変性、アニーリング、拡張についてと従来利用できた方法では入 手できなかった高速サイクル中のプローブ・アニーリング及び溶解についての細 かな詳細を見つけ出すことができる。 実施例１０ プライマー５’−ＣＧＴＧＧＴＧＧＡＣ ＴＴＣＴＣＴＣＡＡＴ−３’（配列 ＩＤ no.１）及び５’−ＡＧＡＡＧＡＴＧＡＧ ＧＣＡＴＡＧＣＡＧＣ−３’（ 配列ＩＤ no.２）（ジーンバンク配列ＨＶＨＥＰＢ）を使用して精製ＰＣＲ生成 物の１０の６乗個コピーからhepatitis BB型肝炎ウィルス表面抗原遺伝子の１８ ０塩基対フラグメントを増幅した。実施例２の増幅条件にしたがつたが、反応に は１：２０，０００倍希釈したＳＹＢＲTMグリーンＩと２ミリモルのＭｇＣｌ2 を含んでいた点が異なる。各温度サイクルは長さ２７秒(最高９２℃、最低５９ ℃、７０℃５秒間、温度間平均レート３．０℃／秒)とした。時間、温度、２チ ャンネルの蛍光を２００ミリ秒毎に測定し蛍光対サイクル数及び蛍光対温度プロ ットとして連続表示した。図３０はサイクル１０からサイクル３４までの温度、 時間、蛍光の三次元プロットを示す。またこの３Ｄ曲線は温度対時間、蛍光対時 間、蛍光対温度の２次元プロットとして図３０に投影されている。図３０の温度 対時間 投影図は各サイクル毎に反復して基本的に図３で説明したのと同じ情報を提供す る。蛍光が温度に逆比例して変化しているので、図３０に図示してある初期サイ クルでの蛍光対時間投影は温度対時間プロット（図２９参照）を伸縮した鏡像に なっている。生成物が蓄積してくると、二重鎖生成物により蛍光が全ての温度で 増加する。しかし変性温度では一重鎖ＤＮＡしか存在していないため蛍光は基線 レベルに戻る。図３０に図示したに重鎖染料の蛍光対温度投影は時間軸を省いて ありＤＮＡ増幅中の鎖の状態の温度依存性を示している。 実施例１１ ヒトβグロブリン遺伝子の５３６塩基対フラグメントを５μｌ容量で２５ｎｇ のゲノムＤＮＡと１：１０，０００希釈ＳＹＢＲTMグリーンＩから増幅した。各 温度サイクルは長さ２８秒（最高９５℃、最低６１℃、７２℃１５秒間、温度間 平均レート５．２℃／秒）だった。他の条件は図３０において説明したのと同じ である。サイクル１５からサイクル４０を表示した。ＰＣＲ中の生成物鎖状態の 温度依存性は図３１に図示してあるように蛍光対温度プロットを用いて明らかに した。図示した初期サイクルは同一に見え、低い温度での蛍光の非線形的増加が あった。増幅が進むにつれ、温度サイクルはアニーリング及び変性温度の間のル ープが上昇するように見える。サンプルを加熱すると、変性が起こるまで蛍光は 強い。サンプルが冷えると、蛍光が増加し、生成物アニーリングを反映している 。温度が拡張中に一定の時、蛍光の増加は追加ＤＮＡ合成と相関する。 本開示の理解によって明らかになるように、サイクル内の連続モニタは従来技 術ではこれまで利用できなかったＤＮＡ増幅の機構に対する洞察を提供できる。 本発明を用いると、これまではほとんど理解されていなかったＤＮＡ増幅の多く の態様が識別可能である。たとえば、高速サイクル増幅は１秒未満で生成物変性 が起こることを主張しているが、一方で従来技術は１０秒から１分間の変性を使 用している。本発明による二重鎖染料を用いてリアルタイムで蛍光モニタするこ とにより生成物の溶解を観察すると（図３０及び図３１）、短い変性時間を用い るのが効果的であることが示される。別の例として、既知の「プラトー効果」の 多くの原因が示唆されているが、それらの間での識別にはほとんど利用できるデ ータがない。図３１に図示してあるように、生成物のアニーリングは非常に高速 である。実際、増幅サイクルの後の方では、冷却中に、プライマー・アニーリン グ温度に達する前に、生成物の大半が各サイクルでアニーリングしている。これ は高速サイクル装置で５〜１０℃／秒の冷却レートとした時に発生する。もっと 緩徐な、従来技術の温度サイクラによる生成物のアニーリングはさらに広範囲に なるのでこの望ましくない効果が大きくなる。生成物アニーリングが主要な、そ して恐らくは唯一の、「プラトー効果」の原因であるように思われる。 ここで排列特異性プローブの連続モニタリングについて考察してみる。本開示 の理解によって分かるように、サイクル内の連続モニタリングはプローブ蛍光の 性質を同定できる。 実施例１２ ２重標識水解プローブ（βアクチン）及び隣接ハイブリダイゼーション・プロ ーブ（βグロブリン）を実施例７と同様に用いて２００ミリ秒毎の増幅連続モニ タリングを実施した。図３２Ａには、水解プローブでモニタした反応のサイクル ２０〜サイクル４５を図示してある。水解プローブは多くのプローブが水解され るにつれて温度による蛍光比の線形変化、及び蛍光の平行的な増加を示す。これ とは対照的に、ハイブリダイゼーション・プローブからの蛍光比は温度でラジカ ルに変化する（図３２Ｂ、サイクル２０〜サイクル４０）。アニーリング／拡張 フェーズでは、プローブは一本鎖生成物にハイブリダイゼーションし、蛍光比( Ｃｙ５／フルオレセイン)が増加する。生成物変性温度までの加熱中に、プロー ブは約７０℃で解離し、バックグラウンド・レベルまで蛍光比が戻る。 実施例１３ １１０塩基対βグロブリン・フラグメントを４０μｌ容量で５０ｎｇのゲノム ＤＮＡから増幅した。実施例３の増幅条件と隣接ハイブリダイゼーション・プロ ーブにしたがい０．４単位のＴａｑボリメラーゼ又は０．８単位のＫｌｅｎＴａ ｑ１どちらかを用いた。蛍光は１００ミリ秒毎にモニタした。ＫｌｅｎＴａｑ１ （図３３）とＴａｑ（図３４）を用いた蛍光対温度プロットは約７０℃でのプロ ーブ溶解を示している。Ｔａｑのエクソヌクレアーゼ活性のため、ＫｌｅｎＴａ ｑ１での極大信号はＴａｑの信号より大きい。Ｔａｑを用いた後の方のサイクル では、未反応プローブの濃度が減少するにつれて各サイクルの蛍光が減少し始め る。温度、時間、蛍光の三次元プロットを図３５（ＫｌｅｎＴａｑ１）と図３６ （Ｔａｑ）について示してある。 本発明による（１）各温度サイクル内での連続的蛍光モニタリングと（２）ハ イブリダイゼーションの温度及び時間依存性の分析の組み合わせは他では得られ ない利点を提供する。図２はこれまで得られなかった情報がサイクル全体を通し ての連続モニタリングによって抽出され得ることを示している。サイクルの生成 物溶解フェーズ中の連続蛍光モニタリングはそのサイクル中に存在するＤＮＡの 純度、同一性、量について有用な情報を提供する。 ＰＣＲ反応を拡張温度から変性温度まで過熱すると、サンプル中のＤＮＡが一 本鎖に溶解する。この変性はＳＹＢＲTMグリーンＩの蛍光の急降下として観察で きる。少量のＰＣＲ生成物では、溶解遷移は狭い温度範囲で発生し、この溶解範 囲の中点をＴｍで表わす。ゲル電気泳動によるサイジングと同様に、溶解ピーク 分析ではＤＮＡの基本的特性を測定しし増幅生成物の同定に使用できる。ゲル電 気泳動とは異なり、溶解曲線分析では同じ長さでＧＣ／ＡＴ比が異なる生成物を 区別できる。さらに、同じ長さで同じＧＣ含量だが、ＧＣ分布の異なる（たとえ ば等しく分布しているものに対して一方の末端にＧＣクランプしているもの）２ 種類の生成物は溶解曲線が非常に違うものになる。 ＰＣＲ生成物が溶解する温度は広範囲にわたって変化する。従来技術で公知の 経験的公式を用いると、ＤＮＡの溶解温度TMにおけるＧＣ含量の影響はＧＣデュ プレックス０％はＧＣデュプレックス１００％より４１℃低い温度で溶解すると 予言している。同じＧＣ含量とすると、４０塩基対プライマー・ダイマーは１０ ００塩基対生成物より１２℃低い温度で溶解することになる。よって考えられる ＰＣＲ生成物でのＴｍ範囲は少なくとも５０℃にわたる。この広い範囲のためＰ ＣＲ生成物を溶解曲線で区別することができる。つまり、ＰＣＲの連続蛍光モニ タリングと溶解曲線分析の組み合わせでＰＣＲ生成物の同時的な増幅、検出、分 別を提供する。 実施例１４ ３種類の異なるＰＣＲ生成物について、ＳＹＢＲTMグリーンＩ蛍光用の光学系 （ライトサイクラＬＣ２４、アイダホ・テクノロジー社製、アイダホ州アイダホ ・フォールズ）を備えた２４サンプル熱サイクラに組み込まれた微量蛍光計によ りＤＮＡ溶解曲線を取得した。１８０塩基対のhepatitis BB型肝炎ウィルス表面 抗原遺伝子増幅のためのプライマーは５’−ＣＧＴＧＧＴＧＧＡＣ ＴＴＣＴＣ ＴＣＡＡＴ−３’（配列ＩＤ no.１）及び５’−ＡＧＡＡＧＡＴＧＡＧ ＧＣＡ ＴＡＧＣＡＧＣ−３’（配列ＩＤ no.２）とした。２９２塩基対前立腺特異性抗 原（ＰＳＡ）遺伝子増幅のためのプライマーはは５’−ＣＴＧＴＣＣＧＴＧＡ ＣＧＴＧＧＡＴＴ−３’（配列ＩＤ no.７）と５’−ＡＡＧＴＣＣＴＣＣＧ Ａ ＧＴＡＴＡＧＣ−３’（配列ＩＤ no.８）とした。５３６塩基対ヒトβグロブリ ン遺伝子増幅は実施例７と同様に行なった。ＰＣＲは実施例２に記載した通りに 実施した。増幅生成物はフェノール／クロロホルム抽出及びエタノール沈殿によ って精製した後、セントリコン３０マイクロコンセントレータ（マサチューセッ ツ州ダンバースのアミコン社から入手）により反復洗浄した。テンプレート濃度 は２６０ナノメートルの吸光度で決定し、１．７以上のＡ（２６０）／Ａ（２８ ０）比を有していた。 精製ＤＮＡ50ｎｇを、５０ｍＭトリスｐＨ８．５、２ｍＭＭｇＣｌ2、２５０ μｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、５μｌ容量で、ガラス／プラスチック複合材料 試験管の開放プラスチック容器にピペット採取し、ガラス毛細管先端にサンプル がくるように低速で遠沈し、プラスチック栓で内側封止した。溶解曲線の蛍光デ ータは、０．１〜１０．０℃／秒で９５℃までの直線的温度変化中に０．２５〜 ２．０秒にわたる信号の積分により取得した。蛍光を連続的に計測してＬａｂＶ ｉｅｗプログラミング環境（ナショナル・インストルメント社、テキサス州オー スチン）において蛍光対温度プロットとして表示した。図３７は３種類の精製Ｐ ＣＲ生成物の溶解曲線を示す。 図３７で３種類の生成物のＴｍは６度だけ広がっており２つの曲線は２度だけ 離れている。この小さな隔たりは生成物の容易な識別を行なうには充分である。 Ｔｍの長さにわたるＧＣ百分率の重要性は、もっと長い５３６塩基対βグロブリ ン・フラグメントよりも高温で溶解する２９２塩基対ＰＳＡ生成物で示されてい る。溶解曲線は平衡を確実にするため０．５℃／分のレートで得ることが多い。 さらに、過熱レートが低下すると、溶解曲線はもっと低温側にシフトしてシャー プになる（図３８、hepatitis Bフラグメント）。しかし、図３７の溶解曲線は ０．２℃／秒（１２℃／分）の加熱レートの間に得たものであり２℃又はそれ以 下のＴｍ差のある生成物を区別できる。 ＰＣＲ生成物の見掛けのＴｍもまた二重鎖特異性ＤＮＡ染料の濃度に依存して いる（図３９、hepatitis Bフラグメント）。染料濃度が高くなるとＤＮＡデュ プレックスの安定性が向上し、ひいては観察されるＴｍが増加する。 ＳＹＢＲTMグリーンＩによる溶解曲線のモニタリングでは、好適条件はＳＹＢ ＲTMグリーンＩを１：７，０００〜３０，０００倍希釈、加熱レート０．１〜０ ．５℃／秒である。これらの条件では２℃だけＴｍが異なる生成物を容易に識別 できる。 もっと正確な温度制御と溶解ピーク分析用ソフトウェアで数分の一度まで検出 可能なＴｍの差を引き下げられる。これにより大半のＰＣＲ生成物の識別ができ る。しかし全ての生成物をＴｍで識別できるわけではなく、２種類又はそれ以上 の生成物の同時移動による電気泳動の結果を読み値が得ることが考えられるよう に、想定した範囲で溶解する生成物の幾つかが意図した生成物ではない可能性が ある。しかし、想定した生成物の範囲でＤＮＡが溶解しない場合、結果論的に想 定した生成物が何も存在していないということはできる。 溶解曲線分析で利用可能な生成物識別の別の態様はもっと長いＰＣＲ生成物で 見られるドメイン溶解のはっきりとしたパターンである。短い生成物（＜３００ 塩基対）は通常１つの遷移で溶解するが、長い生成物は複雑な、目立つ形状の溶 解曲線を描く中間溶解ドメインを有することがある。これらの複雑な溶解曲線は 生成物同定のための指紋として使用できる。 溶解曲線分析を用いて非特異性生成物たとえばプライマー・ダイマーなどから 意図した生成物を区別することができる。プライマー・ダイマーは低温で広い範 囲にわたって溶解し、特異的ＰＣＲ増幅生成物のシャープな溶解曲線とは非常に 異なる。アニーリング厳密度が低い多数サイクルを実施することで得られたもっ と大きなヘテロ接合性生成物は純粋ＰＣＲ生成物と比較した場合に低く広い溶解 曲線を有している。 実施例１５ ５３６βグロブリン遺伝子フラグメントの増幅を、実施例７と同様の１：３０ ，０００倍希釈したＳＹＢＲTMグリーンＩで、条件を変化させて実施した。反応 Ａ（図４０）では、テンプレートを添加せず反応は９４℃０秒、６０℃０秒、７ ２℃１０秒で３０サイクルにわたり反復して小さい非特異性増幅生成物を作成し た。Ｂでは、低厳密度で精製テンプレートの初期コピー１０の６乗個（９４℃０ 秒、５０℃０秒、７２℃１０秒）を５５サイクルして、ゲル電気泳動上で増幅生 成物が広い範囲を示し、広い温度範囲にわたって溶解する。Ｃでは、１０の６乗 個の精製テンプレート初期コピーを９４℃０秒、６０℃０秒、７２℃１０秒で３ ０回サイクルしており、単一の明るいバンドを示し、シャープな遷移で溶解する 。温度遷移レートは０．２℃／秒だった。λファージＤＮＡ（Ｍ）のＨｉｎｄＩ ＩＩ消化をマーカとして使用している。 図４０は溶解曲線がＰＣＲ反応の特異性をどのように正確に反映するかを示し ている。シャープな、高温の溶解曲線Ｃはゲル上の単一バンドに対応する。低温 で広範囲に溶解する曲線Ａはテンプレート対照なしの分析によるものでプライマ ー・ダイマーだけを示している。Ｃでの生成物の過剰増幅は中間溶解曲線Ｂとな るが特異性生成物とは明らかに識別できる。 たとえば図３７に見られる溶解曲線は温度（Ｔ）に対する蛍光（Ｆ）の導関数 を最初に取ることによってより良く定量できる。この導関数が−ｄＦ／ｄＴ対Ｔ としてプロットしてあり溶解曲線を溶解ピークに変換している。 実施例１６ 実施例１４の精製hepatitis B及びβグロブリン遺伝子フラグメントを個別に また一緒に温度変化レート０．２℃／秒で溶解し、他の条件は実施例１４で指定 した通りとした（図４１）。溶解曲線（上部）からの幾らか主観的なＴｍの決定 は溶解ピーク（下部）から目視で簡単に行なえる。溶解ピークより下の領域も曲 線より下の面積の積分によって定量できる。基線の大きさが曲線より下の範囲と して変化するものと仮定して、最初に蛍光基線を−ｄＦ／ｄＴ対Ｔプロットから 減算する。次に、カーブフィッティング・パラメータとしてピークの平均、標準 偏差、高さを用いてガウス曲線への非線形最小自乗法回帰により当てはめた。各 々のガウス曲線より下の領域はピーク領域として取った。全ての計算はＬａｂＶ ｉｅｗプログラミング環境（ナショナル・インストルメント社、テキサス州オー スチン）で実施した。図４１は溶解曲線から溶解ピークへの変換の一例を示す。 これらの計算のためのコードが付録Ａに含めてある。 プライマー・ダイマーやその他の反応アーチファクトから特異性生成物を識別 できる能力は初期コピー数が低い定量での二重鎖特異性ＤＮＡ染料の使用を改善 する。比較的大きな初期テンプレート・コピー数は臭化エチジウムを用いて定量 されている（ヒグチ＆ワトソン、前出）。しかし、低い初期コピー数では、プラ イマー・ダイマーやその他の増幅アーチファクトのバックグラウンド増幅が特異 性増幅信号に干渉する。非特異性アーチファクトから特異性生成物を区別できる 本発明の能力では、二重鎖特異性ＤＮＡ染料を用いて低初期テンプレート・コピ ー数を定量できる。これらの染料を用いる簡便性のため有利である。二重鎖特異 性ＤＮＡ染料は全ての増幅で使用でき、カスタム的に蛍光標識したオリゴヌクレ オチドは必要としない。二重鎖特異性ＤＮＡ染料による超低コピー数の定量には 非常に良好な増幅特異性か又は、本発明で提供されるように非特異性増幅から所 望の生成物を区別するための手段を必要とする。 実施例１７ 本発明による生成物純度決定のアプローチを用いて二重鎖特異性ＤＮＡ染料蛍 光のサイクルあたり１回モニタリングに基づく定量ＰＣＲを改良した。蛍光は精 製βグロブリン・テンプレートの初期濃度を変化させた一連の反応について（図 ４２Ａ参照）生成物のポリメラーゼ拡張後に各サイクル毎１回計測した。βグロ ブリン・テンプレートと増幅条件は実施例７に示した通りとした。バックグラウ ンド蛍光以上の対数直線性増加は初期テンプレート濃度によって変化するサイク ル数で始まった。反応あたり１０の６乗から１０の２乗コピーまでの５種類の反 応のプロットがおよそ４サイクルだけ隔たっている。反応あたり平均１０の２乗 個のコピーのサンプルは反応効率の低下を示し、初期コピー数１００未満の反応 はあまり有用でない蛍光プロファイルを示した。１０及び１（平均）コピーを含 む反応での蛍光プロファイルは逆の順番で増加し、陰性対照は約３０サイクル後 に増幅を示した。これはプライマー・ダイマーの増幅やその他非特異性増幅生成 物に由来するもので二重鎖特異性ＤＮＡ染料のサイクルあたり１回の蛍光モニタ リングでは意図した生成物から識別することができない。 各サンプルについて溶解ピークを計測し（図４２Ｂ）たところ電気泳動の結果 と良く相関することが分かった(図４２Ｃ)。ゼロ及び１平均初期テンプレート・ コピー数を含む反応は予想される５３６塩基対のロケーションに識別可能な電気 泳動バンドを作らなかった。１０及び１００初期コピー・テンプレートを含む反 応は弱い電気泳動バンドを示した。これは、ゼロ及び１初期コピーを含む反応で 意図した生成物範囲（９０〜９２℃）でのＤＮＡ溶解なし、また１０及び１００ コピーでこの温度範囲に弱いピークを示した溶解ピーク分析と良く一致している 。 １０の３乗から１０の６乗初期コピーを含む反応での強い電気泳動バンドは想定 した９０〜９２℃範囲での大きな溶解ピークと良く相関している。 溶解ピーク積分によって求めた、全生成物に対する意図した生成物の比は１０ の５乗コピーでの０．２８からゼロ初期テンプレート・コピーでの０．０００２ までに広がっている。図４１Ａの各々の蛍光値は適当な比率で乗算して補正プロ ットを得た（図４２Ｄの「補正蛍光」で示す）。この手順は１０及び１初期テン プレート・コピーの間まで定量の有効ダイナミック・レンジを拡大した。 溶解ピークは非特異性生成物から特異性生成物を識別でき（図４０）一緒に混 合された２種類の精製ＰＣＲ生成物を識別できるので、単一の試験管内で一緒に 増幅された２種類の特異性生成物の識別にも有用なはずである。本発明によるＰ ＣＲ反応の連続モニタリングによって得られた溶解曲線は多重ＰＣＲで有用であ る。 実施例１８ 本実施例では、ゲノムＤＮＡから２種類の遺伝子フラグメントを同時に増幅し ＳＹＢＲTMグリーンＩ蛍光でモニタした。各増幅サイクルの間、異なった増幅生 成物が生成物の長さ、ＧＣ比、及びその他従来技術で周知の要因に依存する溶解 温度で変性する。各生成物が溶解する温度は二重鎖特異性ＤＮＡ染料であるＳＹ ＢＲTM“゛グリーンＩでモニタできる。嚢胞性線維症遺伝子からの８１塩基対フ ラグメントは本明細書で配列ＩＤ No.１４及び配列ＩＤ No.１５として記載した プライマーを用いて増幅し、これに併せて本明細書で配列ＩＤ No.１６及び配列 ＩＤ No.１７として記載したプライマーを用いたｃ−ｅｒｂＢ−２（ＨＥＲ２／ ｎｅｕ）オンコジーンの９８塩基対フラグメントを増幅した。 増幅反応は５０ｍＭトリスＨＣｌｐＨ８．３、３ｍＭＭｇＣｌ2、５００μｇ ／ｍｌウシ血清アルブミン、各２００μＭのｄＮＴＰ、０．５μＭ嚢胞性線維症 プライマー、０．３μＭのＨＥＲ２／ｎｅｕプライマー、１：３０，０００倍希 釈ＳＹＢＲTMグリーンＩ、１単位ＡｍｐｌｉＴａｑゴールドＤＮＡポリメラーゼ （パーキン・エルマー社、カリフォルニア州フォスターシティ）、５０ｎｇのヒ トゲノムＤＮＡを１０μｌに含有していた。 ９５℃３０分でポリメラーゼの活性化後、サンプルは９４℃０秒（傾き＝２０ ）、５５℃秒（傾き＝２０）、７０℃１０秒（傾き＝２０）で３５回サイクルし た。サンプルを７０℃に冷却し、０．２℃／秒の傾斜で９４℃までの間蛍光を連 続計測した。溶解曲線（図４３）は７８℃（ＣＦＴＲ）と８８℃（ｎｅｕ）で溶 解する２種類の別個の生成物を明確に示した。２種類の生成物はＴｍにおいてお よそ１０℃だけ異なっており容易に識別できる。 多重増幅は増幅中の内部制御が必要とされる場合に有用である。たとえば、多 くの転位はブレークポイントの各々の側にプライマーを配置することによりＰＣ Ｒで検出できる。増幅が起こらない場合、ＤＮＡが無傷で阻害剤が存在していな い限り転位は存在しない。これらの可能性は同じ反応混合物で陽性対照配位を増 幅することにより除外できる。このような制御増幅は同時的な増幅と検出の内部 制御として最も良く行なわれる 実施例１９ 本実施例では、実施例１８の手順にしたがうが９５℃３０分でのポリメラーゼ 活性化後に、９４℃０秒（傾き＝２０）、５５℃０秒（傾き＝２０）、７０℃１ ０秒（傾き＝２０）で２０サイクル、これに続けて９４℃０秒（傾き＝１）、５ ５℃０秒（傾き＝２０）、７０℃２０秒（傾き＝２０）で１５サイクルにわたり サンプルをサイクルした。サイクル２６〜３１では、７０℃から９４℃までの１ ℃／秒の各遷移中に蛍光を連続的に計測した。溶解曲線は溶解ピークに変換して 表示した（図４４）。ＣＦＴＲフラグメントの増幅効率がｎｅｕフラグメントよ り大きく見えることに注意されたい。増幅効率は溶解ピークデータを実施例１６ と同様に積分することで厳密に決定できる。 対照を参照したこの種の定量データは多くの応用を有している。たとえば、あ る種のオンコジーン、たとえばＨＥＲ２／ｎｅｕは多くの腫瘍では生体内増幅し ている。つまり、遺伝子がゲノムＤＮＡ内で、時には数倍に複製されている。し ばしば腫瘍の臨床的挙動はオンコジーン複製の度合に依存する。オンコジーンと 制御テンプレートの増幅により相対的コピー数の定量評価ができる。さらに別の 例として、ＨＩＶ又はhepatitis ＣＣ型肝炎に感染した患者でのウィルス負荷の 定量は予後と治療の面で重要である。制御テンプレートを使用し対照と自然テン プレート両方の増幅中の増幅効率をモニタすることで初期テンプレート・コピー 数の正確な定量が実現される。 相対的定量に溶解曲線を使用する本発明の特徴についてここで説明する。本発 明によれば、溶解曲線のさらなる用途が定量ＰＣＲである。図４２は溶解ピーク の下側部分と特異的生成物の量の間に相関があることを示した。２種類のＰＣＲ 生成物の相対的定量は２種類の生成物が同様の効率で増幅された場合（又は異な る効率が既知であり補償される場合）に可能である。溶解ピーク面積の積分によ る（実施例１６参照）２種類の生成物の相対的定量は本発明の側面である。 実施例２０ 実施例１８の嚢胞性線維症遺伝子及びＨＥＲ−２−ｎｅｕ遺伝子フラグメント を実施例２と同様に増幅精製し、１７５μｇ／ｍｌに調製した。サンプルを様々 な比率（合計８μｌ）で混合しバッファ（１μｌ）とＳＹＢＲTMグリーンＩ（１ μｌ）に添加した。終濃度は５０ｍＭトリスｐＨ８．３、３ｍＭＭｇＣｌ2、２ ５０μｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、１：３０，０００倍希釈ＳＹＢＲTMグリー ンＩだった。溶解曲線は０．２℃／秒で計測し背景蛍光を減算しピークは実施例 １６で説明したように積分した。結果を図４５に示す。溶解ピークの下の相対面積と２種類の生成物の相対量の間には優れた相関が見られた。 ２種類のＰＣＲ生成物の相対的定量は多くの定量ＰＣＲ応用で重要である。２ 種類又はそれ以上の生成物の多重増幅とそれに続く溶解ピーク以下の面積の積分 はこうした分野できわめて有用である。ｍＲＮＡはハウスキーピング遺伝子のｍ ＲＮＡ量に対して相対定量されることが多い。 相対的定量の別の重要な用途は競合的定量ＰＣＲにある。代表的には同じプラ イミング部位を有しているがオリジナル標的配列からの長さが異なる競合遺伝子 を合成する。既知の量の競合遺伝子を未知のサンプルにスパイクし相対的定量を 行なう。長さよりＴｍで標的遺伝子と異なる競合遺伝子を作ることができる。生 成物の相対量は溶解ピーク下側の面積を比較することで定量できる。生成物の一 方の量が分かっている場合、オリジナルの標的の量を得ることができる。溶解ピ ーク方を用いることで未知のサンプル各々に付いて多数の試験管で増幅し反応中 の様々なサイクル数で試験管を抜き取って反応の対数直線性部分を見つけ出すこ とによる現在使用されている方法より有意に簡単になる。２種類の生成物の相対 量を決定しなければならない。通常これはｄＮＴＰの一方を放射性同位元素で標 識しておきアガロースゲル電気泳動後に各バンドに含まれる標識の量を定量する ことで行なっている。これに比較すると、本発明によれば反応を連続的にモニタ できるので増幅の対数直線性部分は簡単に同定できる。溶解ピークの積分によっ て相対的定量は迅速に行なうことができる。終日処理は１時間以内にまで短縮さ れる。 前述の議論から、ＤＮＡ増幅中の蛍光もいたりングは非常に強力な分析技術で あることが理解されよう。配列特異性の検出と定量が望まれる場合、共鳴エネル ギー転移プローブを二重鎖特異性ＤＮＡ染料の代わりに使用できる。ハイブリダ イゼーション・プローブのＴｍは単一塩基の不整合が存在する場合に約４〜８℃ シフトする。ハイブリダイゼーション・プローブが突然変異部位に配置された場 合単一塩基の変移はプローブ溶解温度のシフトとして検出できる。 実施例２１ 第Ｖ因子ライデン変移はアミノ酸基５０６（Ｒ５０６Ｑ）でグルタミン基をア ルギニン基に置換する単一塩基変化（ＧからＡ）である。さらに詳しくは、Ｒ． Ｍ．バーティナら、活性タンパクＣ抵抗性の関与する血液凝固第Ｖ因子突然変異 (R．M．Bertina et al.，Mutation in Blood Coagulation Factor V Associated with Resistance to Activated Protein C，369 Nature 64-67(1994))及びＪ． ヴォアベルグら、特発性静脈塞栓症と第Ｖ因子Ａｒｇ506のシングルポイント変 異の 関連性(J．Voorberg et al.，Association of Idiopathic VenousThromboemboli sm with a Single Point-Mutation at Arg 506 of Factor V，343Lancet 1535-3 6(1994))を参照されたい。どちらも本明細書で参照に含まれる。本明細書で用い られる「第Ｖ因子ライデン変異部位」は野生型のグアニン塩基が第Ｖ因子ライデ ン変異種ではアデニン塩基で置き換えられている第Ｖ因子遺伝子のヌクレオチド 位置を表わす。配列ＩＤ no．９は野生型第Ｖ因子遺伝子、配列ＩＤ no．１０は 第Ｖ因子ライデン遺伝子の対応する部分を示し、各々の場合で遺伝子座３１に関 連ヌクレオチドがある。第Ｖ因子遺伝子の完全なヌクレオチド配列は、本発明で 参照に含まれるＲ．Ｊ．ジェニーらヒト第Ｖ因子の完全なｃＤＮＡと誘導アミノ 酸配列順序(R．J．Jenny et al.，Complete cDNA and Derived AminoAcid Seque nce of Human Factor V，84 Proc．Nat'l Acad．Sci．USA4846-50(1987))に記載 されており、配列はジーンバンク遺伝子座ＨＵＭＦ１０で得ることもできる。突 然変異第Ｖ因子タンパクのアミノ酸変化はこの凝固因子を分解抵抗性にし凝固及 び血栓の傾向を増加させる。先天性血栓症のもっとも共通の原因として、この突 然変異が臨床分子遺伝学研究室で行なわれる共通のラボテストの標的である。 第Ｖ因子ライデン変異分析の標準法はＰＣＲによる遺伝子セグメントを増幅し てから、野生型配列は切断するが突然変異種は切断しない制限酵素エンドヌクレ アーゼで得られた増幅生成物を消化し、ゲル電気泳動により消化された野生型と 未消化の変異生成物とを識別する。（Ｒ．Ｍ．バーティナら、前出）これは定義 された突然変異に付いての分析のための従来技術で周知の方法である。このよう な試験は、通常約４時間かかり、これにはＰＣＲ増幅（２時間）、酵素消化（１ 時間）、電気泳動（１時間）を含む。増幅後のステップにはサンプル試験管を開 き、酵素を追加し、消化されたサンプルを電気泳動装置へ移し換えるステップが 含まれる。増幅後処理は最終生成物の汚染の危険を増加し用手的操作はサンプル のラベル間違いを防ぐ注意が必要である。点突然変異を同時に増幅分析する方法 ではこれらの配慮が不要になる。 同じ装置内で３０分以内に第Ｖ因子ライデン変異の増幅と分析を完了する方法 は変異遺伝子座を含むヒトゲノムＤＮＡサンプルの一部を非対称的に増幅し、続 けて増幅ＤＮＡの溶解曲線を採取し分析するステップを含む。ゲノムＤＮＡは従 来技術で周知の方法、たとえば本明細書で参照に含めるＪ．サムブルックら、分 子クローニング：検査マニュアル(J．Sambrook et al.，Molecular Cloning:ALa boratory Manual(2nd ed.，1989))にしたがって調製する。望ましくは、溶解曲 線を蛍光性ハイブリダイゼーション・プローブによる前述の共鳴エネルギー転移 法によって取得する。このようなアッセイではホモ接合性野生型、ホモ接合正変 異種、ヘテロ接合性遺伝子型を容易に判別する。好適実施例において、オリゴヌ クレオチド・プローブはフルオレセインで３’末端標識し共鳴エネルギー転移で のＣｙ５標識プライマーに近い増幅ＤＮＡとハイブリダイゼーションするように 設計される。本法は定義されている突然変異に応用可能である。 プローブ・オリゴヌクレオチドは長さ約１５〜４０ヌクレオチド残基が望まし い。プローブは約１０ヌクレオチド程度にまで少ない残基を含むのが良いと考え られるが、こうした短鎖オリゴヌクレオチドに考えられる欠点としては特異性の 低さ、低い溶解温度、バックグラウンドの増加が挙げられる。４０残基より大き いオリゴヌクレオチドも使用できるが不必要に高価である。つまりプローブ・オ リゴヌクレオチドのサイズ上の制約は機能によって課せられる制約だけである。 プローブ・オリゴヌクレオチドは突然変異部位にまたがるべきだが、変異はプロ ーブの５’−又は３’−末端ヌクレオチド残基どちらかに対応しないのが望まし い。本発明は溶解曲線に基づくものであるので、また末端での塩基対の欠如は中 間部でよりも溶解性に対する影響が少ないことが知られているので、プローブは 突然変異が中間部位で発生するように設計すべきである。 選択した突然変異部位の増幅のためのオリゴヌクレオチドは長さ約１５〜３０ 残基が望ましい。好適範囲より短いプライマーも使用できるが所望する程の特性 にはならない。同様に、好適範囲より長いプライマーも使用できるが、不必要に 高価である。つまりＰＣＲプライマーのサイズに関する制約は機能によって課せ られる制約だけである。 共鳴エネルギー転移対間の距離も本発明の正しい機能性に重要である。共鳴エ ネルギー転移対間の最適距離は約５ヌクレオチドである。約２から８ヌクレオチ ドの距離が好適だが、約１０〜１５ヌクレオチドまでの距離が機能する。隣接ヌ クレオチドに共鳴エネルギー転移対を有するのは共鳴エネルギー転移対間の距離 がＤＮＡらせん上の配位によって影響されるため必ずしも有益ではない。 本実施例において、ＰＣＲ増幅は５０ｍＭトリスｐＨ８．３、３ｍＭＭｇＣｌ2 、５００μｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、各２００μＭのｄＮＴＰ、０．５μ ＭＣｙ５標識プライマー（配列ＩＤ no．１１）、０．２μＭ未標識対立プライ マー（配列ＩＤ no.１２）、０.１μＭフルオレセイン標識プローブ(配列ＩＤ n o．１３）、０．４単位Ｔａｑポリメラーゼ、５０ｎｇヒトゲノムＤＮＡを含む １０μｌ反応混合物で実施した。４種類の異なるＤＮＡサンプルを試験した：第 Ｖ因子ライデン変異がホモ接合性のヒト由来のヒトゲノムＤＮＡ、ヘテロ接合性 のヒト由来のヒトゲノムＤＮＡ、野生型第Ｖ因子対立遺伝子ホモ接合型のヒト由 来のヒトゲノムＤＮＡ、ＤＮＡなしの陰性対照である。Ｃｙ５標識プライマー、 フルオレセイン標識プローブ、突然変異部位（*印で表わす）の方向性は以下に 示す通りである： 未標識対立プライマーの配列はＴＧＴＴＡＴＣＡＣＡＣＴＧＧＴＧＣＴＡＡ（ 配列ＩＤ no.１２）で増幅生成物は長さ１８６塩基対だった。Ｃｙ５標識プライ マーは実施例８の通りに取得した。サイクル条件は９４℃０秒（傾き＝２０）、 ５０℃１０秒、７２℃０秒（傾き＝１）で５０サイクル、これに続けて４５℃ま で冷却し、溶解曲線について９４℃まで０．２℃／秒の傾きで連続蛍光モニタリ ングした。遅い温度遷移レート（０．２℃／秒―図４６）では増幅の終りに最高 品質の溶解曲線が得られたが、５０℃と９４℃の間を１℃／秒で各サイクル中モ ニタリングしても明らかな遺伝子型同定が提供された（図４７）。溶解曲線は温 度について蛍光の負の導関数対温度（−ｄＦ／ｄＴ対Ｔ）をプロットすることに より視覚化するのがもっとも簡単である。このようなプロットでは生の蛍光デー タから全ての考えられる遺伝子型の容易な視覚的同定が可能である。 プライマーの３’−末端にＣｙ５標識が近付く程、共鳴エネルギー転移信号は 大きくなる。しかし、３’−末端はポリメラーゼ延長のための自由３’−ハイド ロキシル基を有していなければならずＣｙ５の配置が３’−末端に近すぎると（ ３’又は次体塩基どちらかへ）ポリメラーゼ付着と延長を阻害する。３’−フル オレセイン・プローブはできる限りプライマーに近くハイブリダイゼーション すべきで（１〜３塩基の僅かなオーバラップは許容され得る）突然変異部位はプ ローブ中央に近くあるべきである。ハイブリダイゼーションした蛍光物質間の５ 塩基の隔たりと２３ｍｅｒプローブの８番塩基での突然変異が突然変異遺伝子と 野生型配列の間に８℃の溶解曲線シフトをもたらした（図４６）。 プローブ溶解による突然変異の検出は１つの標識プローブと１つの標識プライ マーの代わりに２種類の標識プローブで行なうこともできる。本実施例において 、一方のプローブはＣｙ５で５’に標識し他方のプローブはフルオレセインで３ ’に標識する。これらの蛍光プローブはどちらもアミダイトから直接合成できる ので、プライマー／プローブ計のような用手的合成ステップは比つようとされな い。フルオレセイン標識プローブは、突然変異部位がフルオレセイン標識プロー ブの中央付近にくるように設計すべきである。Ｃｙ５標識プローブの長さは変異 部位にまたがるフルオレセイン標識プローブより高い温度で（＞５℃）溶解する ように設計すべきである。フルオレセインからのバックグラウンドはＣｙ５から のバックグラウンドよりも問題になるので、Ｃｙ５標識プローブの濃度は望まし くはフルオレセイン標識プローブの２〜５バイトすべきである。２種類のプロー ブは同一鎖のゲノムＤＮＡにハイブリダイゼーションするはずで共鳴エネルギー 転移対は約０から５ヌクレオチド残基離れるはずである。これ以外に、突然変異 部位にまたがるプローブをＣｙ５で標識し、もう一方のプローブをフルオレセイ ンで標識しても良い。 第Ｖ因子ライデン変異の検出のために本明細書で開示した特定のプローブ及び プライマーは単に説明のためのものであり、本明細書に記載した原理及びガイド ラインにしたがうことにより当業者が不当な実験なしで突然変異のための他のプ ローブ及びプライマーを設計することができるであろうことは理解されよう。ま た本発明はゲノムＤＮＡにおける単一塩基の突然変異の検出に関して記載してい るが、同じ原理をｃＤＮＡの変異の検出に応用できることも又理解されよう。さ らに、同じ技術を用いて、突然変異又は多形性が存在する場合に溶解温度が変化 するようにハイブリダイゼーション・プローブを設計することにより挿入及び削 除を検出できる。本発明はプローブが野生型に対して突然変異遺伝子にハイブリ ダイゼーションした場合に溶解温度に相違が出るように設計できる既知のあらゆ る突然変異を検出するために使用できる。 前述の実施例ではフルオレセインとＣｙ５を共鳴エネルギー転移標識として使 用したが、他の受容体たとえばＣｙ５．５などもフルオレセインとともに使用で きる。 実施例２２ 実施例２１の第Ｖ因子配位を前出の通りだがプライマーをＣｙ５の代わりにＣ ｙ５．５で標識して増幅した。Ｃｙ５．５の放射は６８３ナノメートル・ロング パス・ダイクロイックと６８３〜７０３ナノメートル・バンドパス干渉フィルタ を介して観察した。Ｃｙ５．５のフルオレセインに対する比はほぼサイクル３０ でバックグラウンド以上に増加し非対称増幅の５０サイクルでおよそ比率が２倍 になった。野生型ＤＮＡで増幅した場合、プローブＴｍは溶解ピークで判定する と６５〜６６℃だった。 単一塩基突然変異を検出する別の実施例を掲載する。 実施例２３ アラニンをバリン残基に変換し易熱性酵素が得られるメチレンテトラハイドロ 葉酸（ＭＴＨＦＲ）レダクターゼ遺伝子（Ｃ677Ｔ）の共通点突然変異が存在す る。この突然変異はＭＴＨＦＲ活性を減少し、従来技術で公知の通り若年性血管 障害や血栓症の独立した危険因子であるとされてきたホモシステイン血漿レベル を増加させることがある。プライマーの一方をＣｙ５で標識した（ＴＧＡＡＧＧ ＡＧＡＡＧＧＴＧＴＣＴ*ＧＣＧＧＧＡ）（配列ＩＤ no.２５）。ここでＴ*はＣ ｙ５に結合した改変Ｔ残基を表わす（合成と精製については実施例９を参照）。 プローブ配列はフルオレセイン−ＣＣＴＣＧＧＣＴＡＡＡＴＡＧＴＡＧＴＧＣＧ ＴＣＧＡ（配列ＩＤ no.２６）また他方のプライマーはＡＧＧＡＣＧＧＴＧＣＧ ＧＴＧＡＧＡＧＴＧ（配列ＩＤ no.２７）だった。ＭＴＨＦＲ遺伝子の１９８塩 基対フラグメントを、１０μｌあたり５０ｍＭトリスｐＨ８．３、２ｍＭＭｇＣ ｌ2、５００μｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、各２００μＭのｄＮＴＰ、０．５ μＭのＣｙ５標識プライマー、０．１μＭ対立プライマー、０．１μＭフルオレ セイン標識プローブ、０．４単位Ｔａｑポリメラーゼ、でヒトゲノムＤＮＡ50ｎ ｇから増幅した。各サイクルは長さ３０秒で９４℃での変性に続けて２０秒６０ ℃での組み合せアニーリング／拡張ステップから構成された。６０サイクル後、 次のように溶解曲線を測定した：０．５℃／秒で５０〜６５℃、０．１℃／秒で ６５〜７５℃、０．５℃／秒で７５〜９４℃まで加熱した。基線減算と溶解ピー クへの変換後に、全ての考えられる遺伝子型が容易に識別された（図４８）。 ハイブリダイゼーション・プローブの識別力を多重又は競合ＰＣＲの大きな利 点にも使用した。たとえば、単一の中間部塩基変化を伴うように人工テンプレー トを設計しハイブリダイゼーション・プローブは実施例２１及び２３のように基 線変化をカバーするように設計する。競合遺伝子及び天然テンプレートの相対的 増幅は実施例１６のように溶解ピークを測定積分することで決定される。これ以 外に、異なる温度で異なる標的から順番に溶解する多重検出プローブを使用する 場合、同じ分析によって相対的定量が実現される。一般に、二重鎖特異性ＤＮＡ 染料について前述した全ての定量技術をハイブリダイゼーション・プローブによ る配列特異性にすることができる。 生成物アニーリング動態による絶対生成物濃度 生成物濃度の決定はまた本発明を用いると有利に実施される。二重鎖ＤＮＡ形 成の連続モニタリングによりアニーリング動態による増幅の全てのサイクルでの ＤＮＡ定量ができる。サンプル温度を変性温度から急速に低下させ、もっと低い がプライマーのアニーリングを防止するのには未だ充分に高い温度で一定に維持 する（図２）。生成物アニーリング速度は秒単位動態にしたがう（本明細書で参 照に含めるＢ．ヤング＆Ｍ．アンダーソン、溶液ハイブリダイゼーションの定量 分析(B．Young & M．Anderson，Quantitative analysis of solution hybridiza tion，In:Nucleic Acid Hybridization:A Practical Approach 47-71，(B．Hame s，S． Higgins eds.,1985))参照）。何らかの任意のＰＣＲ生成物と温度について、二 次速度定数を測定できる。速度定数が分かると、未知のＤＮＡ濃度は実験的アニ ーリング・データから求めることができる。冷却は瞬間的になることはなく、一 定温度に到達する前に何らかのアニーリングが発生する。急冷は速度定数とＤＮ Ａ濃度決定に利用できるデータ量を最大化する。本技術は純粋なＰＣＲ生成物を 要求するが、これは本発明を用いる温度サイクル中にも得られる溶解曲線によっ て保証できる。本発明によるこの定量法はサンプル間のあらゆる信号強度変化と は有利にも無関係である。 実施例２４ βグロブリン遺伝子の５３６塩基対フラグメントをヒトゲノムＤＮＡ（実施例 ７）から増幅して精製（実施例２参照）した。異なる量の精製ＤＮＡを５μｌの ５０ｍＭトリスｐＨ８．３、３ｍＭのＭｇＣｌ2中の１：３０，０００倍希釈Ｓ ＹＢＲTMグリーンＩに混和した。サンプルは９４℃で変性させた後８５℃まで急 冷した。５２０〜５５０ナノメートルの蛍光を時間経過に併せて８５℃でモニタ した。異なる濃度のＤＮＡを調べた時、アニーリング曲線の形状はＤＮＡ濃度に 特徴的だった（図４９参照）。任意のＰＣＲ生成物と温度で、二次速度定数を決 定できる。図５０は５μｌ中の５３６塩基対フラグメント１００ｎｇについて８ ５℃での二次アニーリング速度定数の決定を示す。図５０に図示した二次速度式 を用い、曲線はＦmax、Ｆmin、ｔ0及びｋを浮動パラメータとして非線形最小自 乗法か域により適合させた。この種の曲線適合のための分析プログラムは従来技 術で周知である（たとえば、カリフォルニア州モントレーのデルタポイント社製 ＤｅｌｔａＧｒａｐｈのユーザ定義曲線適合）。速度定数が分かると、未知のＤ ＮＡ濃度は実験的アニーリング・データから求めることができる。 速度定数（ｋ）を定義すると、未知のサンプルについてＤＮＡ濃度を決定でき る。未知のサンプルの蛍光対時間曲線を非線形最小自乗法回帰式で、望ましくは リアルタイムでの温度サイクル中に（たとえば、ＬａｂＶｉｅｗプログラミング 環境（ナショナル・インストルメント社、テキサス州オースチン）において非線 形Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ法と説明されている方法を用いるこ とで）適合させる。この適合では、Ｆmax、Ｆmin、ｔ0、（ＤＮＡ）は浮動パラ メータ、またｋは定数である。 ある種の蛍光染料は濃度依存的にアニーリングに悪影響することから、異なる 標準ＤＮＡ濃度での速度定数を決定することによって、生成物アニーリングにつ いての二次動態を調べる。関連性を定義し適合のための別の式も必要に応じて組 み込む。 また本発明の範囲内にはプローブ・アニーリング速度を用いて生成物濃度を決 定することが含まれる。蛍光共鳴エネルギー転移の速度はプライマー・アニーリ ング温度より高いプローブ・アニーリング温度まで急降下した後の時間経過にし たがう（図２）。標識プライマーと１種類の標識プローブによる増幅の場合、ア ニーリング速度（及び蛍光の発生）は２次である。２種類の標識プローブを使用 する場合、蛍光発生速度は３次である。これら２種類の構成を図１８に図示して ある。プローブの濃度が生成物濃度より大幅に高い場合、可能性を記述するのに は疑似一次式及び疑似二次式で充分である。これらの異なる条件での近似速度式 は従来技術で公知となっている（Ｂ．ヤング＆Ｍ．アンダーソン、前掲書）。本 発明の目的では、実験的に調べられており必要な場合には補正される近似速度式 を従来技術で示唆していることで充分である。 プローブ・アニーリング速度を用いて生成物濃度を決定する場合、考えられる 干渉作用としては生成物のアニーリング（分岐移動によるプローブの移動）とプ ローブを介したプライマーのアニーリング及び拡張が含まれる。後者はプローブ のＴｍがプライマーのＴｍより高くプローブのアニーリング温度がプライマー・ アニーリングを最小限に押えるように選択されている場合には細小になる。図１ ３は拡張が起こった場合でも蛍光が約２０秒にわたり時間とともに増加すること を示している。この期間中、蛍光の増加は生成物濃度に依存する。 プローブアニーリング速度は生成物アニーリングによって生成物濃度を決定す る前述の方法と同様に生成物濃度を決定するために使用される。ステップを要約 すると次のようになる：（１）系の適当な速度平衡を選択する、（２）既知のＤ ＮＡ標準を測定して速度定数を決定する、（３）異なる濃度からも止めた異なる 速度定数を比較することで速度平衡の変化を調べる、（４）速度定数を用いて未 知試料のＤＮＡ濃度をプローブ・アニーリング・データから決定する。 温度サイクル制御のための蛍光フィードバック。エンドポイント分析やサイク ル毎分析とは対照的に、本発明では各温度サイクル全体を通しての蛍光もモニタ できる。連続蛍光モニタリングは温度サイクル・パラメータの制御に使用できる 。本発明はリアルタイム制御と増幅最適化のために蛍光フィードバックを使用す る。二重鎖特異性ＤＮＡ染料又は蛍光標識オリゴヌクレオチド・プローブを含む ＰＣＲサンプルの連続蛍光モニタリングは、個別の増幅サイクル中のハイブリダ イゼーション及び溶解をモニタするために使用できる。この情報を温度サイクル 装置内部の温度制御アルゴリズムで使用して熱サイクル条件を改善しカスタマイ ズすることができる。従来のＰＣＲは増幅前に全てのサイクル・パラメータをプ ログラミングして実施している。連続モニタリングでは、アニーリング、拡張、 変性の連続観察に基づいて、熱サイクル条件の決定を増幅中に行なうことができ る。ハイブリダイゼーション情報を用いて温度サイクルを制御することで考えら れる利益としては： １．各サイクルでＰＣＲ生成物の完全な変性を保証でき、同時に ａ．過剰に高い変性温度への暴露を最小限に抑さえる、つまり増幅生成物及び ポリメラーゼの熱による損傷を回避できる。生成物が変性温度に暴露される時間 を制限するのは長い生成物の増幅でとくに有用である。 ｂ．変性温度を最小限に抑さえることにより反応特異性が増加する。これは意 図している増幅生成物よりＴｍが高い生成物に対抗して選択する。 ２．各サイクルでプライマー・アニーリングに充分な時間を保証することによ って増幅効率を最大にすることができ、同時に ａ．ある程度の効率でプライマー・アニーリングに達するのに必要とされる以 上に長引かせないことにより増幅に必要な時間量を最小限に抑さえる。 ｂ．アニーリング温度での時間を最小限に抑さえることにより反応特異性を拡 大する。 ３．各サイクルの生成物拡張に充分な時間を保証することにより増幅効率を最 大にすることができ、同時に ａ．生成物拡張を完了するのに必要とされる以上に長引かせないことにより増 幅に必要とされる時間量を最小限に抑さえる。 ｂ．意図した増幅生成物より長い生成物に対抗して選択することにより反応特 異性を拡大する。 ４．得られた蛍光レベル又は増幅の現在の効率に依存した熱サイクル変化を開 始する。たとえば、過剰増幅及び非特異性反応生成物は効率がある程度のレベル にまで落ちた時点で熱サイクルを終了することによって最小限に抑さえることが できる。別の例として、蛍光が検出可能になった時点で溶解曲線取得のためにゆ っくりした温度傾斜を開始するように温度サイクルを変更することができる。こ れはゆっくりした温度傾斜を初期サイクルで使用する必要がないので時間を節約 できる。本発明の継続的実施でその他の望ましい変化が明らかになるであろう。 制御は蛍光データからの反応パラメータ推定に基づいている。オリジナルの蛍 光データは時間に対する蛍光の変化として測定したか（変性、アニーリング、拡 張の温度特異性速度）、温度に対する蛍光の変化として測定したか（生成物又は プローブＴｍ）、又は増幅範囲の変化として測定したか（増幅収量と効率）のい ずれかである。これらの速度、Ｔｍとその一次及び二次導関数を使用して変性温 度及び時間、プライマー・アニーリング温度及び時間、プローブ・アニーリング 温度及び時間、酵素拡張温度及び時間、サイクル数を含む反応の最適パラメータ を決定する。 二重鎖特異性ＤＮＡ染料は変性の制御、拡張の制御、及びある程度の増幅レベ ル又は効率で熱サイクル変化を開始するために使用する。共鳴エネルギー転移染 料は以下の実施例の後で説明するようにアニーリングの制御に使用する。 実施例２５ 市販の蛍光モニタリング熱サイクラ（ライトサイクラＬＣ２４、アイダホ・テ クノロジー社製、アイダホ州アイダホ・フォールズ）を変更してソフトウェアが 温度／時間セットポイントでプログラムされず、蛍光値を測定してからこれらの 値を熱サイクラ制御に使用するようにした。 機能ブロック図に図示してあるように（図５１）、ランタイム・プログラムは シリアル及びＤＡＱボード・インタフェース経由でライトサイクラと通信する。 これによって温度又は蛍光データのいずれかへの高レベルのアクセスが可能にな り、いずれかを温度制御用にボード・レベル・ソフトウェアで使用できる。しか し、装置の本実施例において、制御装置・ハードウェア・レベルでは温度データ だけをデジタル形状に変換している。蛍光データはアナログ形状のままデジタル 測定ボード・インタフェース経由で送出され、ランタイム・プログラムによって 分析され、シリアル・インタフェース経由でボード・レベル・ソフトウェアに送 り返される。 生成物溶解制御： 意図したＰＣＲ生成物についての溶解ピークを測定し、基線レベル蛍光は生成 物が完全に溶解した温度で反応カクテルを含むサンプルで測定した。 次に反応の各サイクルではこの蛍光値を目標として使用した。生成物変性への アプローチは２段階で行ない蛍光値を遠隔計算機へ分析のために送信し値に到達 したことの指示が返される要件によるタイムラグを克服した。各生成物の溶解ス テップでは、蛍光が中問値に達するまで温度を増加し、次いで加熱出力を低減し ておよそ３℃／秒の温度傾斜速度とすることで、蛍光を分析する時間と生成物変 性が発生したことを熱サイクラに通知する時間を計算機に与えるようにした。 得られた温度／時間プロット（図５２）は増幅生成物の濃度が上昇するとサイ クル２０以降で溶解温度における特徴的増加を示している。生成物Ｔｍは生成物 濃度の関数である。 生成物アニーリング／拡張： アニーリング／拡張を組み合せた温度での延長維持中に蛍光をモニタし、この 情報を使用して充分だが過剰にならない時間が生成物拡張に与えられることを保 証するようにした。蛍光は１０秒間隔でモニタし、蛍光が設定可能な比率（代表 的には１．００〜１．０５）以上で増加した場合にはアニーリング／拡張ステッ プが継続された。それ以外の場合には次の生成物溶解ステップを開始した。１０ 秒の間隔はアニーリング／拡張温度に最小限２０秒の時間を与えられるように選 択した。 得られた蛍光／時間プロット（図５２）は増幅生成物の濃度が増加するとアニ ーリング／拡張組み合せ温度でのドエル時間における特徴的増加を示している。 プライマー濃度とポリメラーゼが限界になると各サイクルで生成物拡張を完了す るのにはさらに多くの時間が必要とされる。 増幅プラトー： 各アニーリング／拡張ステップの終りで、蛍光値を計測して格納した。この値 が最低のエンドサイクル蛍光値の１．２倍に増加してからユーザ設定可能な比率 （代表的には１．００〜１．０５）未満で増加が停止した時点で、熱サイクルを 終了した。これに代わり、生成物Ｔｍによるゆっくりした０．１〜０．２℃／秒 の温度傾斜を入力してサンプル蛍光を連続モニタすることによりようか委曲栓塞 呈ステップを開始した。 得られた蛍光／時間プロット（図５２）では２５サイクルの増幅後にサイクル 毎蛍光比の増加が１．００未満に落ち反応が終了したことを示している。 本発明の１つの実施例において、増幅プラトー検出を用いて多重サンプル・ラ ンでの各サンプルについて各サンプルに最適な温度で高解像度溶解曲線を採取す る。サンプルが増幅プラトーに達すると、そのサンプルについて溶解曲線を取得 し、次いで、別の反応が増幅プラトーに達するまで通常の温度サイクルを再開す る。 拡張から区別されるアニーリングのリアルタイム・モニタリング及び制御も本 発明により提供される。プライマーの一方がＣｙ５で３’末端標識してある場合 には、拡張は発生し得ない。しかし、標識プライマー（１〜１０％）が未標識プ ライマー（９０〜９９％）と混合されている場合、増幅効率は僅かに減少するこ とになるが、アニーリングは二重鎖特異性ＤＮＡ染料からＣｙ５への蛍光エネル ギー転位として観察可能である。Ｔｍが最低のプライマー（従来技術で周知のよ うに最も近い隣接熱動力学により決定される）はＣｙ５で標識しＳＹＢＲTMグリ ーンＩは二重鎖特異性ＤＮＡ染料として含まれる。これ以外に、等価の相補オリ ゴヌクレオチドによりプライマー・アニーリングを間接的にモニタすることがで きる。長さとＴｍが最低の溶解プライマーと同じＯｎは増幅配列に対して相補性 を持たないように設計される。このオリゴヌクレオチドはＣｙ５で５’標識しこ れの補体はフルオレセイン又は何らかの他の共鳴エネルギー転移対で３’標識す る。これらのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは共鳴エネルギー転 移が後続する。一方のプローブの濃度は最低のＴｍのプライマーの濃度と同じに し、他方のプローブの濃度はこれより大幅に低くして生成物にアニーリングする プライマーの疑似一次動態を近似する疑似一次動態を得るようにする。アニーリ ングの効率をモニタしこれらの方法の１つによるアニーリング温度及び時間の制 御に使用する。 温度と時間のセットポイントを蛍光フィードバック制御で完全に置き換えるこ とも本発明の範囲に含まれる。たとえば、３種類のサンプルがフィードバック機 能のある蛍光温度サイクラに配置される。サンプルは、 １．増幅生成物とＳＹＢＲTMグリーンＩを含む無反応サンプル。 ２．Ｔｍが最低のプライマーと等しいＴｍを有し前述の濃度の相補的に蛍光標 識したプライマーを含む無反応サンプル。 ３．増幅すべきサンプルとＳＹＢＲTMグリーンＩ。 増幅の各サイクルで、生成物の変性は温度が増加するのに併せてサンプル１を モニタすることで保証される。溶解曲線はリアルタイムで求まりサンプルが変性 した時点で、アニーリング・ステップへの移行が開始される。プライマー・アニ ーリングはサンプル２の２種類の相補的プライマーのハイブリダイゼーションに より間接的にモニタされる。プライマーの一方はフルオレセインで３’標識され 他方のプライマーはＣｙ５又は同様の染料で５’標識される。サンプル２が６７ ０／５４０ナノメートルでの蛍光比の増加によって表わされるプライマー・ハイ ブリダイゼーションを示すまで温度を下げる。この比は、蛍光対がハイブリダイ ゼーションにより接近する時に蛍光体間の共鳴エネルギー転移により増加する。 生成物拡張に続けて実施例２５に示したように１つまたはそれ以上の実際のサン プルの蛍光をモニタリングする。 概要 前述の議論から、ハイブリダイゼーションをモニタするためのＤＮＡ増幅中の 連続蛍光モニタリングがきわめて強力な分析技術であることが理解されよう。本 明細書に記載した方法を使用し存在する初期テンプレート・コピー数に依存する と生成物の同定及び定量は温度サイクルの開始後５乃至２０分で実現できる。本 発明は従来技術においてこれまで利用できなかった幾つかの利点を実現する。た とえば、本発明は生成物純度、多重ＰＣＲ又は競合的ＰＣＲによる相対的定量、 アニーリング動態による絶対生成物定量をモニタするための単色蛍光法と蛍光体 サイクル数プロットによる初期テンプレート定量法の改良とを提供するものであ る。本発明はまた、配列変化検出、多重ＰＣＲ又は競合的ＰＣＲによる相対的定 量、プローブ・アニーリング動態による生成物定量、蛍光体サイクル数プロット による初期テンプレート定量のための２色配列特異的方法も提供する。 以下の表はＰＣＲの連続モニタリングに有用な二重鎖特異性ＤＮＡ染料、水解 プローブ、ハイブリダイゼーション・プローブを比較したものである。二重鎖特 異性ＤＮＡ染料の蛍光はＤＮＡの鎖状態に依存する。２重標識水解プローブはプ ローブが水解される時に無傷の供与体蛍光が増加する一方で消光する。ハイブリ ダイゼーション・プローブはハイブリダイゼーションが２つの蛍光物質を互いに 近付ける場合共鳴エネルギー転移の増加に依存する。ＰＣＲの連続モニタのための蛍光プローブの概要 蛍光プローブ ハイブリダイ 二重鎖ＤＮＡ染料 水解 ゼーション メカニズム 鎖状態 消光 転移 プローブ合成 不必要 困難 簡単 特異性 生成物Ｔｍ 配列 配列 溶解分析 Ｙｅｓ Ｎｏ Ｙｅｓ 多色分析 Ｎｏ Ｙｅｓ Ｙｅｓ 本発明によれば、時間、温度、蛍光を毎秒１〜１０回取得し生成物および／ま たはプローブ・ハイブリダイゼーションの詳細を温度サイクル中に観察する。二 重鎖特異性ＤＮＡ染料により温度に対する生成物のハイブリダイゼーションを用 いて溶解曲線で生成物を同定する。さらに、相対的生成物定量はＴｍが異なる２ 種類又はそれ以上の異なる生成物の多重増幅により実現される。さらに、競合的 ＰＣＲは２種類又はそれ以上の生成物が異なるＴｍを有するように共通プライマ ーに対する中間部配列を変更することで行なわれる。絶対生成物定量は変性した 生成物を急冷しアニーリング動態を観察することで得られる。蛍光体サイクル数 のプロットによる初期テンプレート定量の感度は生成物溶解曲線の分析によって 増加し非特異性増幅及びカーブフィッティング・アルゴリズム制御を行なう。最 後に、変性条件、延長時間、及び生成物終了の制御のための即時的蛍光フィード バックは生成物の鎖状態を二重鎖特異性ＤＮＡ染料によりモニタすることで得ら れる。 温度サイクル中の蛍光でプローブ・ハイブリダイゼーションをモニタする能力 は強力なツールである。本発明はＰＣＲ中の配列特異性検出及び定量でプローブ ・ハイブリダイゼーション（水解ではない）に依存する２色蛍光法を提供する。 ハイブリダイゼーション・プローブのアニーリング動態及び溶解は蛍光物質間の エクソヌクレアーゼ水解に頼るプローブでは得られない情報を提供する。配列特 異性プローブのハイブリダイゼーションの連続モニタリングは温度変化につれて 共鳴エネルギー転移へ続く。プローブの溶解は配列と生成物への相補性によって 決定される特性温度で発生する。本発明による２種類のスキーム（１）２種類の 隣接ハイブリダイゼーション・プローブ、及び（２）標識プライマーを取り込む 一本鎖ＰＣＲ生成物にハイブリダイゼーションする１種類の標識プローブを詳解 した。配列特異性プローブの溶解温度はＰＣＲ中の生成物を同定し識別できる。 ＤＮＡ多形性又は単一塩基突然変異を含む突然変異はプローブのＴｍシフトによ り検出される。さらに、相対的生成物定量は各々の生成物から異なる温度で溶解 する１種類又はそれ以上のプローブを用いて少なくとも２種類の生成物の多重増 幅により実現される。さらに、競合ＰＣＲは１種類又はそれ以上のプローブが基 ゅ号遺伝子及び自然のテンプレートに異なるＴｍでハイブリダイゼーションする ようにプライマーに対する中間部配列を改変することにより実施される。これ以 外にも相対又は競合ＰＣＲはプローブにことなる蛍光物質たとえばＣｙ５やＣｙ ５.５などで標識した多色分析によって行なわれる。絶対生成物濃度はプローブ ・アニーリング動態の分析により求められる。初期テンプレート・コピー数はカ ーブフィッティング・アルゴリズムにより蛍光体サイクル数のプロットから求め られる。 １回のＰＣＲ反応で多重分析を所望する場合、識別可能な放射スペクトルを有 する異なった蛍光標識を使用して複数生成物を同定するのが共通の技術である。 分析は利用できる蛍光物質の限られた数と利用できるこれらの蛍光物質の放射ス ペクトルがオーバラップしていることで複雑になる（Ｈ．Ｍ．シャピロら、前出 ）。溶解曲線で生成物又はプローブ・ハイブリダイゼーションの分析は多数ＰＣ Ｒ生成物を識別する別の方法である。温度サイクル中にハイブリダイゼーション を追跡することにより、多数生成物を識別するのに必要とされるプローブ個数お よび／またはスペクトルの色を最小限に抑さえることができる。本発明はその精 神又は基本的特徴から逸脱することなくその他の特定の態様で実現することもで きる。詳述した実施例はすべての点で図示を目的とするのみであって制限的な意 味合い に見なすべきものではない。したがって本発明の範囲は前述の説明によってでは なく後述の請求項によって示される。請求項の等価物の意味及び範囲内に納まる 全ての変化は本発明の範囲内に包含されるべきものである。 溶解曲線及びその他の分析を実行するためのプログラミング・コードを以下の ページに掲載する。
【手続補正書】 【提出日】平成１１年１月１９日（１９９９．１．１９） 【補正内容】 （１）請求の範囲を別紙の通り差し替える。 （２）明細書第２９頁第２３行目に「図５３〜１０５は本発明に従って使用可能 なプログラミングを示す図である。」を挿入する。 （３）明細書第８７頁第４行目から第５行目の「以下のページ」とあるを、「図 ５３〜１０５」と訂正する （４）明細書第８８頁〜第１４０頁を削除する。 （５）第５３図〜第１０５図を別紙の通り追加する。 請求の範囲 １．生物学的サンプルの標的ＤＮＡ配列を分析するための方法であって、 標的配列の隣接部分にハイブリダイゼーションする２種類の核酸プローブ存在 下に標的配列をポリメラーゼ連鎖反応により増幅するステップであって、前記プ ローブの一方は蛍光エネルギー転移対の受容体蛍光物質で標識され、前記プロー ブの他方は供与体蛍光物質で標識されて、前記標的配列と前記２種類のプローブ のハイブリダイゼーション時に前記供与体蛍光物質及び受容体蛍光物質が互いに ２５ヌクレオチド以内にあるようにし、前記ポリメラーゼ連鎖反応には前記標的 核酸配列に対する熱安定性ポリメラーゼとプライマーを前記生物学的サンプルに 添加するステップと少なくとも変性温度と延長温度との間で前記生物学的サンプ ルを熱サイクルするステップとを含むステップと、 前記供与体蛍光物質によって吸収される波長の光で前記生物学的サンプルを励 起して前記蛍光エネルギー転移対からの放射を検出するステップと、 を含むことを特徴とする方法。２ ．生物学的サンプルの標的核酸配列を増幅する改良された方法であって、 （ａ）前記生物学的サンプルに核酸結合蛍光体の有効量を添加するステップと 、 （ｂ）前記標的核酸配列についての熱安定性ポリメラーゼ及びプライマーを前 記生物学的サンプルに添加するステップと、少なくとも変性温度と延長温度の間 で 前記生物学的サンプルを熱サイクルするステップとを含み、所定の初期温度及 び時間パラメータを用いるポリメラーゼ連鎖反応によって前記標的核酸配列を増 幅し、 （ｉ）前記ポリメラーゼ連鎖反応中に前記蛍光体によって吸収される、選択 した波長の光 で前記生物学的サンプルを照明するステップと、 （ｉｉ）前記サンプルからの蛍光をモニタして前記ポリメラーゼ連鎖反応に 最適な温度及び時間パラメータを決定するステップと、 （ｉｉｉ）前記検出された蛍光に基づき前記ポリメラーゼ連鎖反応中に前記 初期温度及び時間パラメータを調節するステップと、 を含む前記標的核酸配列を増幅するステップと、 を含むことを特徴とする方法。３ ．前記蛍光体は二重鎖特異性核酸結合染料を含むことを特徴とする請求項２に 記載の方法。４ ．前記蛍光体は前記標的核酸配列にハイブリダイゼーションする蛍光標識オリ ゴヌクレオチド・プローブを含むことを特徴とする請求項２に記載の方法。５ ．前記蛍光体はオリゴヌクレオチド・プローブの対を含み、前記プローブの一 方は蛍光エネルギー転移対の受容体蛍光物質で標識され、前記プローブの他方は 供与体蛍光物質で標識されることを特徴とする請求項２に記載の方法。６ ．前記共鳴エネルギー転移対は供与体としてフルオレセイン又受容体としてＣ ｙ５又はＣｙ５．５を含むことを特徴とする請求項５に記載の方法。７ ．フルオレセインで標識した第１のプローブとＣｙ５又はＣｙ５．５で標識し た第２のプローブを含むことを特徴とする蛍光エネルギー転移対。８ ．生物学的サンプルにおける標的核酸配列のポリメラーゼ連鎖反応増幅をリア ルタイムでモニタする方法であって、 ＳＹＢＲTMグリーンＩ存在下にポリメラーゼ連鎖反応により前記標的配列を増 幅し、前記ポリメラーゼ連鎖反応には前記標的核酸配列に対する熱安定性ポリメ ラーゼとプライマーを前記生物学的サンプルに添加するステップと少なくとも変 性温度と延長温度の間で前記生物学的サンプルを熱サイクルするステップとを含 むステップと、 ＳＹＢＲTMグリーンＩにより吸収される波長の光で前記生物学的サンプルを励 起して前記生物学的サンプルからの放射を検出するステップと、 前記ＳＹＢＲTMグリーンＩからの温度依存性蛍光をモニタするステップと、 を含むことを特徴とする方法。９ ．前記モニタするステップは前記増幅した標的配列の溶解プロファイルを決定 するステップを含むことを特徴とする請求項８に記載の方法。１０ ．生物学的サンプルの標的ＤＮＡ配列を分析するための方法であって、 （ａ）２種類の核酸プライマーと核酸プローブの有効量を前記生物学的サンプ ルに添加し、前記プライマーの一方と前記プローブは各々受容体蛍光物質と供与 体蛍光物質を含む蛍光エネルギー転移対の一方の構成要素で標識され、前記標識 されたプローブが前記標識されたプライマーの１５ヌクレオチド以内の前記標的 核酸配列の増幅コピーとハイブリダイゼーションするステップと、 （ｂ）ポリメラーゼ連鎖反応により前記標的核酸配列を増幅するステップと、 （ｃ）前記供与体蛍光物質によって吸収される選択した波長の光で前記生物学 的サンプルを照明して前記サンプルの蛍光放射を検出するステップと、 を含むことを特徴とする方法。１１．前記ポリメラーゼ連鎖反応の総熱サイクル数は、前記サンプルからの蛍光 放射をモニタし、反応完了を表わすプラトー・フェーズに前記蛍光放射が達した 時点でサイクルを決定し、前記プラトー・フェーズに達した後で反応を停止する ことによって求められる ことを特徴とする請求項２に記載の方法。１２ ．前記核酸結合蛍光体はＳＹＢＲTMグリーンＩ、臭化エチジウム、ピコグリ ーン、アクリジン・オレンジ、チアゾール・オレンジ、ＹＯ−ＰＲＯ−１、クロ モマイシンＡ３から構成されるグループから選択される構成要素とすることを特 徴とする請求項１１に記載の方法。１３ ．前記ポリメラーゼ連鎖反応の温度サイクル・パラメータを制御するステッ プをさらに含み、前記生物学的サンプルを熱サイクルするステップはアニーリン グ、延長、変性フェーズの反復サイクルを含み、前記核酸結合蛍光体は二重鎖特 異性蛍光染料であり、前記サイクル・ パラメータは前記アニーリング・フェーズ の持続時間と、前記変性フェーズの持続時間と、サイクル数とを含み、 （ａ）選択した波長の光で前記反応を照明して前記蛍光染料からの蛍光を顕在 化させ前記反復アニーリング、拡張、変性フェーズの間に蛍光を連続モニタする ステップと、 （ｂ）少なくとも、 （ｉ）前記拡張フェーズの間に蛍光が増加を停止する持続時間、又は （ｉｉ）前記変性フェーズの間に前記蛍光が基線レベルまで減少する持続時 間、又は （ｉｉｉ）前記拡張フェーズの間に前記蛍光が所定のレベルに達した回数を 決定するステップと、 （ｃ）前記拡張フェーズの間に蛍光が増加を停止する時間の長さに基づいて前 記拡張フェーズの長さを調節する、又は 前記変性フェーズの間に蛍光が前記基線 レベルまで減少した時間の長さに基づいて前記変性フェーズの長さを調節する、 又は前記拡張フェーズの間に蛍光が前記所定レベルに達したサイクル数に基づい て サイクル数を調節するステップと、 を含むことを特徴とする請求項２に記載の方法。１４ ．前記二重鎖特異性蛍光体はＳＹＢＲTMグリーンＩ、臭化エチジウム、ピコ グリーン、アクリジン・オレンジ、チアゾール・オレンジ、ＹＯ−ＰＲＯ−１、 クロモマイシンＡ３で構成されるグループから選択される構成要素とすることを 特徴とする請求項１３に記載の方法。１５ ．選択したポリメラーゼ連鎖反応混合物における増幅生成物の濃度を決定す る方法であって、 （ａ）前記増幅生成物の既知の濃度のハイブリダイゼーションのレートをモニ タすることにより選択した温度と反応条件での前記増幅生成物での２次速度定数 を決定するステップと、 （ｂ）前記増幅生成物の未知の濃度でのアニーリング速度を決定するステップ と、 （ｃ）前記アニーリング速度と前記２次速度定数から前記増幅生成物の濃度を 計算するステップと、 を含むことを特徴とする方法。１６ ．前記アニーリング速度は多数サイクルの増幅後に決定されることを特徴と する請求項１５に記載の方法。１７．増幅生成物の２次速度定数を決定して前記増幅生成物の濃度を求めるため の方法であって、 既知の濃度の前記増幅生成物と有効量の二重鎖特異性蛍光染料とを含む第１の ポリメラーゼ連鎖反応混合物の温度を、前記増幅生成物の変性温度以上に上昇さ せて 変性増幅生成物を得るステップと、 前記既知の量の変性増幅生成物を含む前記第１のポリメラーゼ連鎖反応混合物 の温度を、前記増幅生成物の変性温度以下の選択した温度まで急速に下げながら 、 時間の関数として前記第１のポリメラーゼ連鎖反応混合物の蛍光を連続モニタ するステップと、 時間の関数として蛍光をプロットし、前記既知の濃度の増幅生成物についての 極大蛍光、極小蛍光、極小蛍光での時間、２次速度定数を、 Ｆ は蛍光、Ｆ maxは極大蛍光、Ｆ minは極小蛍光、ｋは２次速度定数、ｔ0は Ｆ minでの時間、［ＤＮＡ］は前記増幅生成物の既知の濃度とする式： から求めるステップと、 を含むことを特徴とする方法。１８ ．前記二重鎖特異性蛍光染料はＳＹＢＲTMグリーンＩ、臭化エチジウム、ピ コグリーン、アクリジン・オレンジ、チアゾール・オレンジ、ＹＯ−ＰＲＯ−１ 、クロモマイシンＡ３から構成されるグループから選択される構成要素とするこ とを特徴とする請求項１７に記載の方法。１９ ． 競合的定量ポリメラーゼ連鎖反応による選択した核酸テンプレートの濃 度を決定する方法であって、 （ａ）（ｉ）ポリメラーゼ連鎖反応において前記選択したテンプレートの選択 したセグメントと競合的テンプレートのこれに対応する選択したセグメントを増 幅してこれらの増幅生成物を得るように構成したオリゴヌクレオチド・プライマ ーの対の各々の有効量と、 （ｉｉ）蛍光共鳴エネルギー転移対の共鳴エネルギー転移供与体又は共鳴エ ネルギー転移受容体で標識された有効量のオリゴヌクレオチド・プローブであっ て、前記プローブが前記競合的テンプレートの増幅生成物から溶解する溶解温度 から識別可能な溶解温度での前記選択したテンプレートの増幅生成物から溶解す るように前記増幅生成物にハイブリダイゼーションするように構成されている前 記プローブと、 （ｉｉｉ）前記プローブと転移オリゴヌクレオチドの間で一方が前記供与体 により標識され他方が前記受容体により標識されているとして、前記供与体又は 前記受容体で標識された有効量の基準オリゴヌクレオチドであって、前記基準オ リゴヌクレオチドは前記プローブと前記基準オリゴヌクレオチドの両方が前記増 幅生成物にハイブリダイゼーションする場合に前記供与体と前記受容体が共鳴エ ネルギー転移関係になるように前記増幅生成物にハイブリダイゼーションするよ う構成されたオリゴヌクレオチドと、 を含む反応混合物において、 ポリメラーゼ連鎖反応により、未知の量の選択したテンプレートと既知の量の 前記競合的テンプレートを増幅して前記増幅生成物を得るステップと、 （ｂ）前記反応混合物を選択した波長の光で照明して蛍光共鳴エネルギー転移 対による蛍光を顕在化させ、反応混合物の温度が変化して前記選択したテンプレ ートの前記増幅生成物から溶解する前記プローブの第１の溶解曲線と前記競合的 テンプレートから溶解する前記プローブの第２の溶解曲線とを得る場合に温度の 関数として蛍光放射を決定するステップと、 （ｃ）前記第１と第２の溶解曲線から第１と第２の溶解溶解ピークに変換して 当該溶解ピークから前記選択したテンプレートと前記競合的テンプレートの相対 量を決定するステップと、 （ｄ）前記既知の量の前記競合的テンプレートと、前記選択したテンプレート 及び競合的テンプレートの相対量とに基づいて前記選択したテンプレートの濃度 を計算するステップと、 を含むことを特徴とする方法。２０ ． ポリメラーゼ連鎖反応において選択した核酸テンプレートの濃度を決定 する方法であって、 （ａ）（ｉ）ポリメラーゼ連鎖反応において前記選択したテンプレートの選択 した第１のセグメントを増幅して増幅した第１の生成物を得るように構成された 第１の対のオリゴヌクレオチド・プライマーの各々の有効量と、 （ｉｉ）ポリメラーゼ連鎖反応において基準テンプレートの選択した第２の セグメントを増幅して増幅した第２の生成物を得るように構成された第２の対の オリゴヌクレオチド・プライマーの各々の有効量と、 （ｉｉｉ）核酸結合蛍光染料の有効量と、 を含む反応混合物において、 ポリメラーゼ連鎖反応により、未知の量の前記選択したテンプレートを増幅し て前記増幅した第１の生成物を得る及び既知の量の前記基準テンプレートを増幅 して前記増幅した第２の生成物を得るステップと、 （ｂ）選択した波長の光で前記反応混合物を照明して核酸結合蛍光染料による 蛍光を顕在化させ、温度の関数として放射された蛍光を連続的にモニタして第１ の生成物と第２の生成物が異なる温度で溶解するような前記増幅生成物の溶解曲 線を得るステップと、 （ｃ）前記溶解曲線を溶解溶解ピークに変換して当該溶解ピークから前記選択 したテンプレートと前記基準テンプレートの相対量を決定するステップと、 （ｄ）前記既知の量の前記基準テンプレートと選択したテンプレート及び基準 テンプレートの相対量とに基づいて前記選択したテンプレートの濃度を計算する ステップと、 を含むことを特徴とする方法。２１ ．前記核酸結合蛍光染料はＳＹＢＲTMグリーンＩ、臭化エチジウム、ピコグ リーン、アクリジン・オレンジ、チアゾール・オレンジ、ＹＯ−ＰＲＯ−１、ク ロモマイシンＡ３から構成されるグループから選択されることを特徴とする請求 項２０に記載の方法。２２ ．陽性対照テンプレートも含むポリメラーゼ連鎖反応において選択したテン プレートの増幅をモニタする方法であって、 （ａ）（ｉ）ポリメラーゼ連鎖反応において前記選択したテンプレートの選択 した第１のセグメントを増幅して増幅された第１の生成物を得るように構成され た第１の対のオリゴヌクレオチド・プライマーの各々の有効量と、 （ｉｉ）ポリメラーゼ連鎖反応において、陽性対照テンプレートの選択され た第２のセグメントを増幅して増幅された第２の生成物を得るように構成された 第２の対のオリゴヌクレオチド・プライマーの各々の有効量と、 （ｉｉｉ）有効量の核酸結合蛍光染料と、 を含む反応混合物において、 前記選択したテンプレートと前記陽性対照テンプレートをポリメラーゼ連鎖反 応によって増幅するための条件に前記選択したテンプレートと前記陽性対照テン プレートをさらすステップと、 （ｂ）前記反応混合物を選択した波長の光で照明して核酸結合蛍光染料による 蛍光を顕在化し、前記ポリメラーゼ連鎖反応の増幅サイクル中に温度の関数とし て放射される蛍光を連続的にモニタして前記選択したテンプレートが増幅される 場合前記増幅された第１の生成物の第１の溶解ピークを、また前記陽性対照テン プレートが増幅される場合前記増幅された第２の生成物の第２の溶解ピークを取 得するステップとを含み、 前記第２の溶解曲線の取得はポリメラーゼ連鎖反応が作用したことを表わし、 前記第１の溶解曲線の取得は前記選択した第１のセグメントが増幅可能であるこ とを表わし、前記第１の溶解曲線が欠如していることは前記選択した第１のセグ メントが増幅不可能であることを表わす ことを特徴とする方法。２３ ．前記核酸結合蛍光染料はＳＹＢＲTMグリーンＩ、臭化エチジウム、ピコグ リーン、アクリジン・オレンジ、チアゾール・オレンジ、ＹＯ−ＰＲＯ−１、ク ロモマイシンＡ３から構成されるグループから選択されることを特徴とする請求 項２２に記載の方法。２４ ． 個人の第Ｖ因子ライデン変異を検出する方法であって、第Ｖ因子ライデ ン変異は野生型と比較して第Ｖ因子ライデン変異配座での単一塩基変化で構成さ れ、 （ａ）前記個人からサンプル・ゲノムＤＮＡを採得するステップと、 （ｂ）対照として野生型ゲノムＤＮＡを提供するステップと、 （ｃ）前記サンプル・ゲノムＤＮＡと前記野生型ゲノムＤＮＡの選択したセグ メントをポリメラーゼ連鎖反応によって増幅するように構成されたオリゴヌクレ オチド・プライマーの対を提供し、前記選択したセグメントは第Ｖ因子ライデン 変異配座を含み、第Ｖ因子ライデン変異配座のコピーを含む増幅生成物を得るス テップと、 （ｄ）蛍光共鳴エネルギー転移対の共鳴エネルギー転移供与体又は共鳴エネル ギー転移受容体で標識されたオリゴヌクレオチド・プローブを提供し、前記プロ ーブは前記増幅された生成物にハイブリダイゼーションするように構成されて前 記プローブが前記変異配座にまたがり前記サンプル・ゲノムＤＮＡに前記野生型 ゲノムＤＮＡの溶解プロファイルから区別できる第Ｖ因子ライデン変異が存在す る場合溶解プロファイルを示すステップと、 （ｅ）共鳴エネルギー転移供与体又は共鳴エネルギー転移受容体で標識された 転移オリゴヌクレオチドを提供し、前記プローブと転移オリゴヌクレオチドの間 で一方が共鳴エネルギー転移供与体で標識され他方が共鳴エネルギー転移受容体 で標識されているとして、前記転移オリゴヌクレオチドは前記増幅生成物にハイ ブリダイゼーションするように構成して前記プローブと前記転移オリゴヌクレオ チドの両方が前記増幅生成物にハイブリダイゼーションする場合に共鳴エネルギ ー転移供与体と共鳴エネルギー転移受容体が共鳴エネルギー転移関係にあるよう にするステップと、 （ｆ）有効量のオリゴヌクレオチド・プローブと転移オリゴヌクレオチドの存 在下でサンプル・ゲノムＤＮＡと野生型ゲノムＤＮＡの前記選択したセグメント をポリメラーゼ連鎖反応により増幅して、増幅された選択セグメントを得るよう にし、少なくともその一部分は共鳴エネルギー転移関係にある蛍光共鳴エネルギ ー転移対によりこれらにハイブリダイゼーションされた前記プローブと前記転移 オリゴヌクレオチドの両方を有するようにするステップと、 （ｇ）前記ポリメラーゼ連鎖反応の増幅サイクルの間の温度の関数として蛍光 を測定してサンプル・ゲノムＤＮＡの前記増幅セグメントから溶解する前記プロ ーブの溶解プロファイルと前記野生型ゲノムＤＮＡの増幅セグメントから溶解す る前記プローブの溶解プロファイルとを取得するステップと、 （ｈ）前記サンプル・ゲノムＤＮＡについての前記溶解プロファイルを前記野 生型ゲノムＤＮＡについての前記溶解プロファイルと比較し、これらの差が前記 サンプル・ゲノムＤＮＡにおける第Ｖ因子ライデン変異の存在を表わすステップ と、 を含むことを特徴とする方法。２５ ． 核酸ハイブリダイゼーションを分析するための方法であって、 （ａ）分析すべき核酸サンプルと核酸結合蛍光体とを含む混合物を提供するス テップと、 （ｂ）温度を≧毎秒０．１℃の速度で変化させながら蛍光をモニタするステッ プと、 を含むことを特徴とする方法。２６ ．前記核酸結合蛍光染料がＳＹＢＲTMグリーンＩであることを特徴とする請 求項２５に記載の方法。２７ ．前記核酸結合蛍光体はオリゴヌクレオチド・プローブの対を含み、前記プ ローブの一方が蛍光共鳴エネルギー転移対の供与体で標識され前記プローブの他 方が受容体で標識されることを特徴とする請求項２５に記載の方法。２８ ．未知の量の核酸を含むサンプルの初期コピー数を定量する方法であって、 （ａ）ポリメラーゼ連鎖反応により既知の濃度の少なくとも一つの標準を、前 記標準と核酸結合蛍光体とを含む混合物中で増幅し、ここで前記核酸結合蛍光体 は一対のオリゴヌクレオチド・プローブを含み、その一方は蛍光共鳴エネルギー 転移対の供与体で標識され、他方は受容体で標識される ステップと、 （ｂ）サイクル数の関数として蛍光を測定して一組のデータ点を得るステップ と、 （ｃ）初期核酸濃度とサイクル数の関数として蛍光を記述する所定の式に前記 データ点を当てはめるステップと、 （ｄ）前記サンプルと前記核酸結合蛍光体とを含む混合物中で未知の量の核酸 を含む前記サンプルを増幅してその蛍光をモニタするステップと、 （ｅ）ステップ（ｃ）で求めた式から初期核酸濃度を決定するステップと、 を含むことを特徴とする方法。２９ ． 生物学的サンプルの標的ＤＮＡ配列を分析するための方法であって、 核酸結合蛍光体の存在下にポリメラーゼ連鎖反応によって前記標的配列を増幅 し、前記ポリメラーゼ連鎖反応には前記標的とされる核酸配列に対する熱安定性 ポリメラーゼ及びプライマーを前記生物学的サンプルに添加して少なくとも変性 温度と延長温度の間で前記生物学的サンプルを熱サイクルするステップを含むス テップと、 前記核酸結合蛍光体により吸収される波長の光によって前記サンプルを励起す るステップと、 前記サンプルの温度が変化する際に前記核酸結合蛍光体からの温度依存性蛍光 をモニタするステツプと、 を含むことを特徴とする方法。３０ ．前記核酸結合蛍光体は二重鎖核酸結合蛍光染料を含むことを特徴とする請 求項２９に記載の方法。３１ ．前記二重鎖核酸結合蛍光染料がＳＹＢＲTMグリーンＩであることを特徴と する請求項３０に記載の方法。３２ ．前記温度依存性蛍光を用いて前記増幅生成物を同定することを特徴とする 請求項３１に記載の方法。３３ ．前記増幅生成物が溶解曲線の分析によって同定されることを特徴とする請 求項３２に記載の方法。３４ ．２種類又はそれ以上の増幅生成物の相対量を溶解曲線の分析によって求め ることを特徴とする請求項３３に記載の方法。３５ ．溶解曲線より下の領域が多重ガウス曲線の和の非線形最小自乗法回帰で見 付けられることを特徴とする請求項３３に記載の方法。 【図５３】【図５４】【図５５】【図５６】【図５７】【図５８】【図５９】【図６０】【図６１】【図６２】【図６３】【図６４】【図６５】【図６６】【図６７】【図６８】【図６９】【図７０】【図７１】【図７２】【図７３】【図７４】【図７５】【図７６】【図７７】【図７８】【図７９】【図８０】【図８１】【図８２】【図８３】【図８４】【図８５】【図８６】【図８７】【図８８】【図８９】【図９０】【図９１】【図９２】【図９３】【図９４】【図９５】【図９６】【図９７】【図９８】【図９９】【図１００】【図１０１】【図１０２】【図１０３】【図１０４】【図１０５】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ， ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ， ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＸ，Ｎ Ｏ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ， ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者 ラスマッセン，ランディ，ピー. アメリカ合衆国・ユタ州 84102―3418・ ソルト レイク シティ・サウス 900 イースト 601

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．生物学的サンプルの標的ＤＮＡ配列を分析するための方法であって、 標的配列の隣接部分にハイブリダイゼーションする２種類の核酸プローブ存在 下に標的配列をポリメラーゼ連鎖反応により増幅するステップであって、前記プ ローブの一方は蛍光エネルギー転移対の受容体蛍光物質で標識され、前記プロー ブの他方は供与体蛍光物質で標識されて、前記標的配列と前記２種類のプローブ のハイブリダイゼーション時に前記供与体蛍光物質及び受容体蛍光物質が互いに ２５ヌクレオチド以内にあるようにし、前記ポリメラーゼ連鎖反応には前記標的 核酸配列に対する熱安定性ポリメラーゼとプライマーを前記生物学的サンプルに 添加するステップと少なくとも変性温度と延長温度との間で前記生物学的サンプ ルを熱サイクルするステップとを含むステップと、 前記供与体蛍光物質によって吸収される波長の光で前記生物学的サンプルを励 起して前記蛍光エネルギー転移対からの放射を検出するステップと、 を含むことを特徴とする方法。 ２．生物学的サンプルの標的ＤＮＡ配列を分析するための方法であって、 標的配列の隣接部分にハイブリダイゼーションする２種類の核酸プローブ存在 下に標的配列をポリメラーゼ連鎖反応により増幅するステップであって、前記プ ローブの一方は蛍光エネルギー転移対の受容体蛍光物質で標識され、前記プロー ブの他方は供与体蛍光物質で標識されて、前記標的配列と前記２種類のプローブ のハイブリダイゼーション時に前記供与体蛍光物質及び受容体蛍光物質が互いに ２５ヌクレオチド以内にあるようにし、前記ポリメラーゼ連鎖反応には前記標的 核酸配列に対する熱安定性ポリメラーゼとプライマーを前記生物学的サンプルに 添加するステップと少なくとも変性温度と延長温度との間で前記生物学的サンプ ルを熱サイクルするステップとを含むステップと、 前記供与体蛍光物質によって吸収される波長の光で前記サンプルを励起するス テップと、 前記蛍光エネルギー転移対からの温度依存性蛍光をモニタするステップと、 を含むことを特徴とする方法。 ３．前記供与体蛍光物質と前記受容体蛍光物質が約０〜５ヌクレオチドの距離に あることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の方法。 ４．前記供与体蛍光物質と前記受容体蛍光物質が約０〜２ヌクレオチドの距離に あることを特徴とする請求項３に記載の方法。 ５．前記供与体蛍光物質と前記受容体蛍光物質が１ヌクレオチドの距離にあるこ とを特徴とする請求項４に記載の方法。 ６．生物学的サンプルにおける標的核酸配列のポリメラーゼ連鎖反応増幅をリア ルタイムでモニタする方法であって、 （ａ）前記生物学的サンプルに２種類の核酸プライマーと核酸プローブの有効 量を添加し、前記プライマーの一方と前記プローブは各々受容体蛍光物質と供与 体蛍光物質を含む蛍光エネルギー転移対の１つの構成要素で標識され、前記標識 されたプローブは前記標識されたプライマーの１５ヌクレオチド以内の前記標的 核酸配列の増幅されたコピーにハイブリダイゼーションするステップと、 （ｂ）ポリメラーゼ連鎖反応により前記標的核酸配列を増幅するステップと、 （ｃ）前記供与体蛍光物質によって吸収される選択した波長の光で前記生物学 的サンプルを照明するステップと、 （ｄ）前記サンプルの蛍光放射を検出するステップと、 を含むことを特徴とする方法。 ７．前記サンプルの温度依存性蛍光をモニタするステップをさらに含むことを特 徴とする請求項６に記載の方法。 ８．前記供与体蛍光物質と前記受容体蛍光物質は互いから約４〜６ヌクレオチド の距離にあることを特徴とする請求項６に記載の方法。 ９．生物学的サンプルの標的核酸配列を増幅する方法の改良であって、 （ａ）前記生物学的サンプルに核酸結合蛍光体の有効量を添加するステップと 、 （ｂ）ポリメラーゼ連鎖反応を用い、初期の所定の温度と時間パラメータを用 いて前記生物学的サンプルを熱サイクルし、次いで （ｉ）前記ポリメラーゼ連鎖反応中に前記蛍光体によって吸収される光の選 択した波長で前記生物学的サンプルを照明するステップと、 （ｉｉ）前記サンプルからの蛍光をモニタして前記ポリメラーゼ連鎖反応に 最適な温度及び時間パラメータを決定するステップと、 （ｉｉｉ）前記蛍光にしたがって前記初期温度及び時間パラメータを調節す るステップと、 を含む前記標的核酸配列を増幅するステップと、 を含むことを特徴とする改良。 １０．前記蛍光体は二重鎖特異性核酸結合染料を含むことを特徴とする請求項９ に記載の方法。 １１．前記蛍光体は前記標的核酸配列にハイブリダイゼーションする蛍光標識オ リゴヌクレオチド・プローブを含むことを特徴とする請求項９に記載の方法。 １２．前記蛍光体はオリゴヌクレオチド・プローブの対を含み、前記プローブの 一方は蛍光エネルギー転移対の受容体蛍光物質で標識され、前記プローブの他方 は供与体蛍光物質で標識されることを特徴とする請求項９に記載の方法。 １３．前記供与体蛍光物質放射と前記受容体蛍光物質吸収のスペクトルが２５％ 未満でオーバラップし、前記受容体蛍光物質は１００，０００Ｍ-1ｃｍ-1以上の ピーク吸光係数を有し前記２種類のプローブのハイブリダイゼーション時に前記 供与体蛍光物質と受容体蛍光物質は互いから１５ヌクレオチド以内にあることを 特徴とする請求項１２に記載の方法。 １４．前記共鳴エネルギー転移対は供与体としてフルオレセイン又受容体として Ｃｙ５又はＣｙ５．５を含むことを特徴とする請求項１３に記載の方法。 １５．生物学的サンプルの標的核酸配列を検出するための方法であって、 （ａ）前記生物学的サンプルに前記標的核酸配列とハイブリダイゼーションす るオリゴヌクレオチド・プローブ対の有効量を添加し、前記プローブの一方は蛍 光エネルギー転移対の受容体蛍光物質で標識され、前記プローブの他方は供与体 蛍光物質で標識され、前記供与体蛍光物質の放射スペクトルと前記受容体蛍光物 質の吸収スペクトルが２５％未満でオーバラップし、前記受容体蛍光物質は１０ ０，０００Ｍ-1ｃｍ-1以上のピーク吸光係数を有し前記２種類のプローブのハイ ブリダイゼーション時に前記供与体蛍光物質と受容体蛍光物質が互いの２５ヌク レオチド以内にあるようにするステップと、 （ｂ）前記供与体蛍光物質によって吸収される光の選択した波長で前記生物学 的サンプルを照明するステップと、 （ｃ）前記生物学的サンプルの放射を検出するステップと、 を含むことを特徴とする方法。 １６．前記共鳴エネルギー転移対は供与体としてフルオレセインを含むことを特 徴とする請求項１５に記載の方法。 １７．前記共鳴エネルギー転移対は受容体としてＣｙ５又はＣｙ５．５を含むこ とを特徴とする請求項１６に記載の方法。 １８．前記供与体蛍光物質と前記受容体蛍光物質は前記２種類のプローブの前記 標的核酸配列とのハイブリダイゼーション時に互いに約０〜５ヌクレオチド以内 にあることを特徴とする請求項１５に記載の方法。 １９．前記供与体蛍光物質と前記受容体蛍光物質は互いの約０〜２ヌクレオチド 以内にあることを特徴とする請求項１８に記載の方法。 ２０．前記供与体蛍光物質と前記受容体蛍光物質は互いの１ヌクレオチド以内に あることを特徴とする請求項１９に記載の方法。 ２１．フルオレセインで標識した第１のプローブとＣｙ５又はＣｙ５．５で標識 した第２のプローブを含むことを特徴とする蛍光エネルギー転移対。 ２２．生物学的サンプルにおける標的核酸配列のポリメラーゼ連鎖反応増幅をリ アルタイムでモニタする方法であって、 標的配列の隣接部分にハイブリダイゼーションする２種類の核酸プローブ存在 下に標的配列をポリメラーゼ連鎖反応により増幅するステップであって、前記プ ローブの一方は蛍光エネルギー転移対の受容体蛍光物質で標識され、前記プロー ブの他方は供与体蛍光物質で標識されて、前記標的配列と前記２種類のプローブ のハイブリダイゼーション時に前記供与体蛍光物質及び受容体蛍光物質が互いに ２５ヌクレオチド以内にあるようにし、前記ポリメラーゼ連鎖反応には前記標的 核酸配列に対する熱安定性ポリメラーゼとプライマーを前記生物学的サンプルに 添加するステップと少なくとも変性温度と延長温度との間で前記生物学的サンプ ルを熱サイクルするステップとを含むステップと、 前記供与体蛍光物質によって吸収される波長の光で前記生物学的サンプルを励 起して前記生物学的サンプルからの放射を検出するステップと、 前記蛍光エネルギー転移対からの温度依存性蛍光をモニタするステップと、 を含むことを特徴とする方法。 ２３．前記共鳴エネルギー転移対は供与体としてフルオレセイン又受容体として Ｃｙ５又はＣｙ５．５を含むことを特徴とする請求項２２に記載の方法。 ２４．前記供与体蛍光物質と前記受容体蛍光物質は互いの約０〜５ヌクレオチド 以内にあることを特徴とする請求項２２に記載の方法。 ２５．前記供与体蛍光物質と前記受容体蛍光物質は互いの約０〜２ヌクレオチド 以内にあることを特徴とする請求項２４に記載の方法。 ２６．前記供与体蛍光物質と前記受容体蛍光物質は互いの１ヌクレオチド以内に あることを特徴とする請求項２５に記載の方法。 ２７．前記モニタするステップは前記標的配列から溶解する前記プローブの溶解 プロファイルを決定するステップを含むことを特徴とする請求項２２に記載の方 法。 ２８．生物学的サンプルにおける標的核酸配列のポリメラーゼ連鎖反応増幅をリ アルタイムでモニタする方法であって、 ＳＹＢＲTMグリーンＩ存在下にポリメラーゼ連鎖反応により前記標的配列を増 幅し、前記ポリメラーゼ連鎖反応には前記標的核酸配列に対する熱安定性ポリメ ラーゼとプライマーを前記生物学的サンプルに添加するステップと少なくとも変 性温度と延長温度の間で前記生物学的サンプルを熱サイクルするステップとを含 むステップと、 ＳＹＢＲTMグリーンＩにより吸収される波長の光で前記生物学的サンプルを励 起して前記生物学的サンプルからの放射を検出するステップと、 前記ＳＹＢＲTMグリーンＩからの温度依存性蛍光をモニタするステップと、 を含むことを特徴とする方法。 ２９．前記モニタするステップは前記増幅した標的配列の溶解プロファイルを決 定するステップを含むことを特徴とする請求項２８に記載の方法。 ３０．生物学的サンプルの標的ＤＮＡ配列を分析するための方法であって、 （ａ）２種類の核酸プライマーと核酸プローブの有効量を前記生物学的サンプ ルに添加し、前記プライマーの一方と前記プローブは互いに受容体蛍光物質と供 与体蛍光物質を含む蛍光エネルギー転移対の一方の構成要素で標識され、前記標 識されたプローブが前記標識されたプライマーの１５ヌクレオチド以内の前記標 的核酸配列の増幅コピーとハイブリダイゼーションするステップと、 （ｂ）ポリメラーゼ連鎖反応により前記標的核酸配列を増幅するステップと、 （ｃ）前記供与体蛍光物質によって吸収される選択した波長の光で前記生物学 的サンプルを照明して前記サンプルの蛍光放射を検出するステップと、 を含むことを特徴とする方法。 ３１．前記サンプルの温度依存性蛍光をモニタするステップをさらに含むことを 特徴とする請求項３０に記載の方法。 ３２．前記モニタするステップは前記増幅した標的配列の溶解プロファイルを決 定するステップを含むことを特徴とする請求項３１に記載の方法。 ３３．前記共鳴エネルギー転移対は供与体としてフルオレセインを又受容体とし てＣｙ５又はＣｙ５．５を含むことを特徴とする請求項３０に記載の方法。 ３４．前記供与体蛍光物質と前記受容体蛍光物質は互いから約４〜６ヌクレオチ ド以内にあることを特徴とする請求項３０に記載の方法。 ３５．第２の核酸と比較して第１の核酸における選択した配座での相違を検出す る方法であって、 （ａ）ポリメラーゼ連鎖反応により前記第１の核酸の選択したセグメントと前 記第２の核酸のこれに対応するセグメントとを増幅するように構成したオリゴヌ クレオチド・プローブの対を提供し、前記選択したセグメントとこれに対応する セグメントは各々が前記選択した配座を含み、前記選択した配座のコピーを含む 増幅生成物を得るステップと、 （ｂ）オリゴヌクレオチド・プローブの対を提供し、 前記プローブの一方は蛍光エネルギー転移対の受容体蛍光物質で、また前記プ ローブの他方は供与体蛍光物質で標識して、前記供与体蛍光物質と受容体蛍光物 質が前記２種類のプローブと前記増幅生成物とのハイブリダイゼーション時に共 鳴エネルギー転移関係になるようにし、前記プローブの一方は前記増幅生成物に ハイブリダイゼーションするように構成して前記一方のプローブが前記選択した 配座にまたがり前記第１の核酸において前記第２の核酸の溶解プロファイルから 識別可能な相違が存在する場合に溶解プロファイルを示すようにするステップと 、 （ｃ）前記第１の核酸の選択したセグメントと前記第２の核酸の対応するセグ メントとを有効量のプローブの存在下においてポリメラーゼ連鎖反応により増幅 して増幅された選択セグメントと増幅された対応セグメントとを得て、少なくと もこれらの一部分が共鳴エネルギー転移関係にある蛍光共鳴エネルギー転移対に よりこれらにハイブリダイゼーションされた両方のプローブを有するようにする ステップと、 （ｄ）前記プローブをハイブリダイゼーションした前記増幅した選択セグメン ト及び前記増幅した対応セグメントを、蛍光共鳴エネルギー転移対によって蛍光 が顕在化するように選択した波長の光で照明するステップと、 （ｅ）温度の関数として蛍光放射を測定し前記第１の核酸の増幅された選択セ グメントから溶解する前記プローブの一方の第１の溶解プロファイルと前記第２ の核酸の増幅された対応セグメントから溶解する前記プローブの一方の第２の溶 解プロファイルを決定するステップと、 （ｆ）前記第１の溶解プロファイルを前記第２の溶解プロファイルと比較し、 これらの相違が前記サンプル核酸における相違の存在を示すようにするステップ と、 を含むことを特徴とする方法。 ３６．前記共鳴エネルギー転移対が供与体としてフルオレセインを又受容体とし てＣｙ５及びＣｙ５．５から構成されるグループから選択した構成要素を含むこ とを特徴とする請求項３５に記載の方法。 ３７．前記供与体と前記受容体がプローブに結合され、両方のプローブが前記増 幅した選択セグメント又は前記増幅した対応セグメントにハイブリダイゼーショ ンした場合前記供与体と前記受容体が約２５ヌクレオチド残基以上離れないよう にすることを特徴とする請求項３５に記載の方法。 ３８．前記供与体と前記受容体がプローブに結合され、前記プローブが前記増幅 した選択セグメント又は前記増幅した対応セグメントにハイブリダイゼーション した場合前記供与体と前記受容体が約０〜５ヌクレオチド残基だけ離れるように することを特徴とする請求項３７に記載の方法。 ３９．前記共鳴エネルギー転移供与体と前記共鳴エネルギー転移受容体が前記プ ローブに結合され、前記プローブが前記増幅した選択セグメント又は前記増幅し た対応セグメントにハイブリダイゼーションした場合前記供与体と前記受容体が 約０〜２ヌクレオチド残基だけ離れるようにすることを特徴とする請求項３８に 記載の方法。 ４０．前記共鳴エネルギー転移供与体と前記共鳴エネルギー転移受容体が前記プ ローブに結合され、前記プローブが前記増幅した選択セグメント又は前記増幅し た対応セグメントにハイブリダイゼーションした場合前記受容体と前記供与体が １ヌクレオチド残基だけ離れるようにすることを特徴とする請求項３９に記載の 方法。 ４１．第２の核酸と比較して第１の核酸における選択した配座での相違を検出す る方法であって、 （ａ）ポリメラーゼ連鎖反応により前記第１の核酸の選択したセグメントと前 記第２の核酸の対応するセグメントとを増幅するように構成したオリゴヌクレオ チド・プローブの対を提供し、前記選択したセグメントとこれに対応するセグメ ントは各々が前記選択した配座を含み、前記選択した配座のコピーを含む増幅生 成物を得るステップと、 （ｂ）オリゴヌクレオチド・プローブを提供し、前記プライマーの一方と前記 プローブが各々供与体蛍光物質と受容体蛍光物質を含む蛍光エネルギー転移対の 一方の構成要素で標識され、前記標識したプローブと標識したプライマーを前記 増幅生成物にハイブリダイゼーションして前記供与体と前記受容体が共鳴エネル ギー転移関係にあるようにし、前記プローブは前記増幅生成物とハイブリダイゼ ーションするように構成して前記プローブが前記選択した配座にまたがり前記第 １の核酸において前記第２の核酸の溶解プロファイルから識別可能な相違が存在 する場合溶解プロファイルを示すようにするステップと、 （ｃ）有効量のプライマーとプローブの存在かにおいてポリメラーゼ連鎖反応 により前記第１の核酸の選択セグメントと前記第２の核酸のこれに対応するセグ メントとを増幅して増幅された選択セグメントと増幅された対応セグメントとを 得て、少なくともこれらの一部が共鳴エネルギー転移関係にある蛍光共鳴エネル ギー転移対によりこれらにハイブリダイゼーションされた前記標識プライマー及 びプローブを両方とも有するようにするステップと、 （ｄ）前記標識プライマー及びプローブがハイブリダイゼーションしている前 記増幅した選択セグメントと前記増幅した対応セグメントを選択した波長の光で 照明して蛍光共鳴エネルギー転移対による蛍光を顕在化するステップと、 （ｅ）温度の関数として蛍光放射を測定して第１の核酸の前記増幅選択セグメ ントから前記一方のプローブ溶解の第１の溶解プロファイルと第２の核酸の前記 増幅対応セグメトから前記一方のプローブ溶解の第２の溶解プロファイルにおい て決定するステップと、 （ｆ）前記第１の溶解プロファイルを前記第２の溶解プロファイルと比較し、 ここでの相違が前記サンプル核酸における相違の存在を示すようにするステップ と、 を含むことを特徴とする方法。 ４２．前記共鳴エネルギー転移対は供与体としてフルオレセインを又受容体とし てＣｙ５及びＣｙ５．５から構成されるグループから選択した構成要素を含むこ とを特徴とする請求項４１に記載の方法。 ４３．前記供与体と前記受容体が前記標識したプライマー及びプローブに結合さ れ、前記標識したプローブ及びプライマーが前記増幅した選択セグメント又は前 記増幅した対応セグメントにハイブリダイゼーションする場合に前記供与体と前 記受容体が約１５ヌクレオチド残基以上離れないようにすることを特徴とする請 求項４１に記載の方法。 ４４．前記供与体と前記受容体が前記標識したプライマー及びプローブに結合さ れ、前記標識したプローブ及びプライマーが前記増幅した選択セグメント又は前 記増幅した対応セグメントにハイブリダイゼーションする場合に前記供与体と前 記受容体が約４〜６ヌクレオチド残基だけ離れるようにすることを特徴とする請 求項４３に記載の方法。 ４５．個人のゲノムの選択された配位でのヘテロ接合を検出する方法であって、 前記ゲノムは突然変異性対立遺伝子とこれに対応する基準対立遺伝子とを含み、 その各々が選択された配位を含み、 （ａ）前記個人からサンプルとなるゲノムＤＮＡを採得するステップと、 （ｂ）ポリメラーゼ連鎖反応により前記突然変異対立遺伝子の第１の選択した セグメントと前記これに対応する基準対立遺伝子の第２の選択したセグメントを 増幅するように構成されたオリゴヌクレオチド・プライマーの対を提供し、前記 第１と第２の選択されたセグメントとの両方ともが前記選択された配位を含むス テップと、 （ｃ）オリゴヌクレオチド・プローブの対を提供し、前記プローブの一方は受 容体蛍光物質で標識し前記プローブの他方は蛍光共鳴エネルギー転移対の供与体 蛍光物質で標識して前記増幅した第１と第２の選択セグメントと前記２種類のプ ローブのハイブリダイゼーション時に前記プローブの一方は前記選択された配位 にまたがり前記増幅された第２の選択セグメントによる第２の溶解プロファイル から識別可能な前記増幅された第１の選択セグメントによる第１の溶解プロファ イルを示すようにするステップと、 （ｄ）ポリメラーゼ連鎖反応により有効量のプローブの存在下でサンプル・ゲ ノムＤＮＡの前記第１と第２の選択ヤグメントを増幅して増幅された第１と第２ の選択セグメントを得るようにし、少なくともその一部分が共鳴エネルギー転移 関係にある蛍光共鳴エネルギー転移対によりこれらにハイブリダイゼーションさ れたプローブを両方とも有するようにするステップと、 （ｅ）前記標識したプライマーとプローブがハイブリダイゼーションされてい る前記増幅した第１と第２の選択セグメントを選択した波長の光で照明して前記 供与体及び受容体による蛍光を顕在化するステップと、 （ｆ）温度の関数として蛍光放射を測定して、前記増幅した第１の選択セグメ ントから溶解する前記一方のプローブの第１の溶解プロファイルと前記増幅した 第２の選択セグメントから溶解する前記一方のプローブの第２の溶解プロファイ ルとを決定するステップと、 （ｇ）前記第１の溶解プロファイルと前記第２の溶解プロファイルとを比較し 、識別可能な溶解プロファイルが前記サンプル・ゲノムＤＮＡのヘテロ接合性を 表わすようにするステップと、 を含むことを特徴とする方法。 ４６．前記蛍光共鳴エネルギー転移対が、供与体としてフルオレセインを又受容 体としてＣｙ５又はＣｙ５．５を含むことを特徴とする請求項４５に記載の方法 。 ４７．前記供与体と前記受容体が前記プローブに結合され前記プローブと基準オ リゴヌクレオチドが前記増幅された第１の選択セグメント又は前記増幅された第 ２の選択セグメントにハイブリダイゼーションされる場合前記供与体と前記受容 体が２５ヌクレオチド残基以上に離れないようにすることを特徴とする請求項４ ５に記載の方法。 ４８．前記供与体と前記受容体が前記プローブに結合され前記プローブが前記増 幅された第１の選択セグメント又は前記増幅された第２の選択セグメントにハイ ブリダイゼーションされる場合前記供与体と前記受容体が約０〜５ヌクレオチド 残基だけ離れるようにすることを特徴とする請求項４７に記載の方法。 ４９．前記供与体と前記受容体が前記プローブに結合され前記プローブが前記増 幅された第１の選択セグメント又は前記増幅された第２の選択セグメントにハイ ブリダイゼーションされる場合前記供与体と前記受容体が約０〜２ヌクレオチド 残基だけ離れるようにすることを特徴とする請求項４８に記載の方法。 ５０．前記供与体と前記受容体が前記プローブに結合され前記プローブが前記増 幅された第１の選択セグメント又は前記増幅された第２の選択セグメントにハイ ブリダイゼーションされる場合前記供与体と前記受容体が１ヌクレオチド残基だ け離れるようにすることを特徴とする請求項４９に記載の方法。 ５１．個人のゲノムにおいて選択された配座でのヘテロ接合性を検出する方法で あって、前記ゲノムは突然変異性対立遺伝子とこれに対応する基準対立遺伝子と を含み、その各々が選択された配座を含み、 （ａ）前記個人からサンプルとなるゲノムＤＮＡを採得するステップと、 （ｂ）ポリメラーゼ連鎖反応により前記突然変異対立遺伝子の第１の選択した セグメントと前記これに対応する基準対立遺伝子の第２の選択したセグメントを 増幅するように構成されたオリゴヌクレオチド・プライマーの対を提供し、前記 第１と第２の選択されたセグメントとの両方ともが前記選択された配座を含むス テップと、 （ｃ）オリゴヌクレオチド・プローブの対を提供し、前記プライマーの一方と 前記プローブが各々供与体蛍光物質と受容体蛍光物質とを含む蛍光エネルギー転 移対の一方の構成要素で標識され、前記標識されたプローブと標識されたプライ マーが前記増幅された第１と第２の選択セグメントにハイブリダイゼーションし て前記プローブの一方が前記選択した配座にまたがり前記増幅された第２の選択 セグメントによる第２の溶解プロファイルから識別可能な前記増幅された第１の 選択セグメントによる第１の溶解プロファイルを示すようにするステップと、 （ｄ）ポリメラーゼ連鎖反応により有効量のプローブ及びプライマーの存在下 でサンプル・ゲノムＤＮＡの前記第１と第２の選択セグメントを増幅して増幅さ れた第１と第２の選択セグメントを得るようにし、少なくともその一部分が両方 とも共鳴エネルギー転移関係にある蛍光共鳴エネルギー転移対によりこれらにハ イブリダイゼーションされたプローブを有するステップと、 （ｅ）選択した波長の光によりハイブリダイゼーションされたプローブを有す る前記増幅された第１と第２の選択セグメントを照明して、前記供与体と受容体 による蛍光を顕在化するステップと、 （ｆ）温度の関数として蛍光放射を測定して、前記増幅した第１の選択セグメ ントから溶解する前記一方のプローブの第１の溶解プロファイルと前記増幅した 第２の選択セグメントから溶解する前記一方のプローブの第２の溶解プロファイ ルとを決定するステップと、 （ｇ）前記第１の溶解プロファイルと前記第２の溶解プロファイルとを比較し て、識別可能な溶解プロファイルが前記サンプル・ゲノムＤＮＡのヘテロ接合性 を表わすようにするステップと、 を含むことを特徴とする方法。 ５２．前記共鳴エネルギー転移対は供与体としてフルオレセインを又受容体とし てＣｙ５又はＣｙ５．５を含むことを特徴とする請求項５１に記載の方法。 ５３．前記供与体と前記受容体が前記標識プライマー及びプローブに結合され、 前記標識プライマー及びプローブが前記増幅された第１の選択セグメント又は前 記増幅された第２の選択セグメントにハイブリダイゼーションする場合前記供与 体と前記受容体が約１５ヌクレオチド残基以上離れないようにすることを特徴と する請求項５１に記載の方法。 ５４．前記供与体と前記受容体が前記標識プライマー及びプローブに結合され、 前記標識プライマーとプローブが前記増幅された第１の選択セグメント又は前記 増幅された第２の選択セグメントにハイブリダイゼーションされる場合前記供与 体と前記受容体が４〜６ヌクレオチド残基だけ離れるようにすることを特徴とす る請求項５３に記載の方法。 ５５．（１）核酸、ただし前記核酸又はそのポリメラーゼ連鎖反応増幅した生成 物が２種類の異なった相補鎖から構成され、（２）前記核酸の選択したセグメン トをポリメラーゼ連鎖反応によって増幅して増幅生成物を得るように構成された ２種類のオリゴヌクレオチド・プローブ、（３）前記ポリメラーゼ連鎖反応を触 媒するためのＤＮＡポリメラーゼを含むポリメラーゼ連鎖反応混合物においてポ リメラーゼ連鎖反応の完了を決定する方法であって、 （ａ）前記混合物に（１）蛍光共鳴エネルギー転移対の共鳴エネルギー転移供 与体又は共鳴エネルギー転移受容体で標識され、選択された温度条件と単価イオ ン強度で前記増幅生成物にハイブリダイゼーションするように構成された有効量 のオリゴヌクレオチド・プライマーと、（２）前記供与体又は前記受容体で標識 され、前記プローブと基準オリゴヌクレオチドの間で一方が前記供与体で標識さ れ他方が前記受容体で標識され、前記基準オリゴヌクレオチドは前記選択された 温度及び単価イオン強度の条件下で前記増幅生成物にハイブリダイゼーションす るように構成されて前記プローブと前記基準オリゴヌクレオチドが両方とも前記 増幅生成物にハイブリダイゼーションする場合前記供与体及び前記受容体が共鳴 エネルギー転移関係にあるようにする有効量の基準オリゴヌクレオチドとを添加 するステップと、 （ｂ）前記核酸の選択セグメントをポリメラーゼ連鎖反応によって増幅して前 記増幅生成物を得るようにし、少なくともその一部分は共鳴エネルギー転移関係 にある蛍光共鳴エネルギー転移対によりこれらにハイブリダイゼーションされた 前記プローブと前記基準オリゴヌクレオチドの両方を有するようにするステップ と、 （ｃ）選択した波長の光でハイブリダイゼーションされたプローブと基準オリ ゴヌクレオチドとを有する前記増幅生成物を照明して前記蛍光共鳴エネルギー対 による蛍光を顕在化させ、蛍光放射をモニタして、前記蛍光放射が前記反応の完 了を表わすプラトー・フェーズに達した時点でサイクルを決定するステップと、 を含むことを特徴とする方法。 ５６．前記蛍光共鳴エネルギー転移対はフルオレセインと、Ｃｙ５及びＣｙ５． ５から構成されるグループから選択した構成要素であることを特徴とする請求項 ５５に記載の方法。 ５７．（１）核酸、ただし前記核酸又はそのポリメラーゼ連鎖反応増幅した生成 物が２種類の異なった相補鎖から構成され、（２）前記核酸の選択したセグメン トをポリメラーゼ連鎖反応によって増幅して増幅生成物を得るように構成された ２種類のオリゴヌクレオチド・プライマー、（３）前記ポリメラーゼ連鎖反応を 触媒するためのＤＮＡポリメラーゼを含むポリメラーゼ連鎖反応混合物における ポリメラーゼ連鎖反応の完了を決定する方法は、 （ａ）前記混合物に有効量の核酸結合蛍光染料を添加するステップと、 （ｂ）前記核酸結合蛍光染料が添加された前記混合物でポリメラーゼ連鎖反応 により前記選択した核酸セグメントを増幅して核酸結合蛍光染料が結合した前記 増幅生成物を得るステップと、 （ｃ）核酸結合蛍光染料が結合している増幅生成物に選択した波長の光を照明 してここからの蛍光を顕在化し、蛍光放射をモニタして、前記蛍光放射が前記反 応の完了を表わすプラトー・フェーズに達した時点でサイクルを決定するステッ プと、 を含むことを特徴とする方法。 ５８．前記核酸結合蛍光染料はＳＹＢＲTMグリーンＩ、臭化エチジウム、ピコグ リーン、アクリジン・オレンジ、チアゾール・オレンジ、ＹＯ−ＰＲＯ−１、ク ロモマイシンＡ３から構成されるグループから選択される構成要素とすることを 特徴とする請求項５７に記載の方法。 ５９．前記核酸結合蛍光染料はＳＹＢＲTMグリーンＩであることを特徴とする請 求項５８に記載の方法。 ６０.二重鎖特異性蛍光染料を含むポリメラーゼ連鎖反応混合物のアニーリング 、延長、変性フェーズの反復サイクルを含むポリメラーゼ連鎖反応の温度サイク ル・パラメータを制御する方法であって、前記パラメータは前記アニーリング・ フェーズの持続時間と、前記変性フェーズの持続時間と、サイクル数とを含み、 （ａ）選択した波長の光で前記反応を照明して前記蛍光染料からの蛍光を顕在 化させ前記反復アニーリング、拡張、変性フェーズの間に蛍光を連続モニタする ステップと、 （ｂ）少なくとも、 （ｉ）前記拡張フェーズの間に蛍光が増加を停止する持続時間、又は （ｉｉ）前記変性フェーズの間に前記蛍光が基線レベルまで減少する持続時 間、又は （ｉｉｉ）前記拡張フェーズの間に前記蛍光が所定のレベルに達した回数 を決定するステップと、 （ｃ）前記拡張フェーズの間に蛍光が増加を停止する時間の長さに基づいた前 記拡張フェーズの長さ、前記変性フェーズの間に蛍光が前記基線レベルまで減少 した時間の長さに基づいた前記変性フェーズの長さ、又は前記拡張フェーズの間 に蛍光が前記所定レベルに達したサイクル数に基づくサイクル数を調節するステ ップと、 を含むことを特徴とする方法。 ６１．前記核酸結合蛍光染料はＳＹＢＲTMグリーンＩ、臭化エチジウム、ピコグ リーン、アクリジン・オレンジ、チアゾール・オレンジ、ＹＯ−ＰＲＯ−１、ク ロモマイシンＡ３から構成されるグループから選択される構成要素とすることを 特徴とする請求項６０に記載の方法。 ６２．前記核酸結合蛍光染料はＳＹＢＲTMグリーンＩであることを特徴とする請 求項６１に記載の方法。 ６３．選択したポリメラーゼ連鎖反応混合物における増幅生成物の濃度を決定す る方法であって、 （ａ）前記増幅生成物の既知の濃度のハイブリダイゼーションのレートをモニ タすることにより選択した温度と反応条件での前記増幅生成物での２次速度定数 を決定するステップと、 （ｂ）前記増幅生成物の未知の濃度でのアニーリング速度を決定するステップ と、 （ｃ）前記アニーリング速度と前記２次速度定数から前記増幅生成物の濃度を 計算するステップと、 を含むことを特徴とする方法。 ６４．前記アニーリング速度は多数サイクルの増幅後に決定されることを特徴と する請求項６３に記載の方法。 ６５．前記二次速度定数を決定するステップは、 既知の濃度の前記増幅生成物と有効量の二重鎖特異性蛍光染料とを含む第１の ポリメラーゼ連鎖反応混合物の温度を、前記増幅生成物の変性温度以上に上昇し て変性増幅生成物を得るステップと、 前記既知の量の変性増幅生成物を含む前記第１のポリメラーゼ連鎖反応混合物 の温度を、前記増幅生成物の変性温度以下の選択した温度まで急冷すると同時に 時間の関数として前記第１のポリメラーゼ連鎖反応混合物の蛍光を連続モニタす るステップと、 極大蛍光、極小蛍光、極小蛍光の時間、及び増幅生成物の既知の濃度での２次 速度定数を決定するため、式： ただしＦは蛍光、Ｆmaxは極大蛍光、Ｆminは極小蛍光、ｋは２次速度定数、ｔ0 はＦminでの時間、［ＤＮＡ］は前記増幅生成物の既知の濃度とする から時間の関数として蛍光をプロットするステップと、 を含むことを特徴とする請求項６３に記載の方法。 ６６．前記核酸結合蛍光染料はＳＹＢＲTMグリーンＩ、臭化エチジウム、ピコグ リーン、アクリジン・オレンジ、チアゾール・オレンジ、ＹＯ−ＰＲＯ−１、ク ロモマイシンＡ３から構成されるグループから選択される構成要素とすることを 特徴とする請求項６５に記載の方法。 ６７．前記核酸結合蛍光染料はＳＹＢＲTMグリーンＩであることを特徴とする請 求項６６に記載の方法。 ６８． 競合的定量ポリメラーゼ連鎖反応による選択した核酸テンプレートの濃 度を決定する方法であって、 （ａ）（ｉ）ポリメラーゼ連鎖反応において前記選択したテンプレートの選択 したセグメントと相補的テンプレートのこれに対応する選択したセグメントを増 幅してこれらの増幅生成物を得るように構成したオリゴヌクレオチド・プライマ ーの対の各々の有効量と、 （ｉｉ）蛍光共鳴エネルギー転移対の共鳴エネルギー転移供与体又は共鳴エ ネルギー転移受容体で標識された有効量のオリゴヌクレオチド・プローブであっ て、前記プローブが前記競合的テンプレートの増幅生成物から溶解する溶解温度 から識別可能な溶解温度での前記選択したテンプレートの増幅生成物から溶解す るように前記増幅生成物にハイブリダイゼーションするように構成されている前 記プローブと、 （ｉｉｉ）前記プローブと転移オリゴヌクレオチドの間で一方が前記供与体 により標識され他方が前記受容体により標識されているとして、前記供与体又は 前記受容体で標識された有効量の基準オリゴヌクレオチドであって、前記基準オ リゴヌクレオチドは前記プローブと前記基準オリゴヌクレオチドの両方が前記増 幅生成物にハイブリダイゼーションする場合に前記供与体と前記受容体が共鳴エ ネルギー転移関係になるように前記増幅生成物にハイブリダイゼーションするよ う構成されたオリゴヌクレオチドと、 を含む反応混合物において、 ポリメラーゼ連鎖反応により、未知の量の選択したテンプレートと既知の量の 前記競合的テンプレートを増幅して前記増幅生成物を得るステップと、 （ｂ）前記反応混合物を選択した波長の光で照明して蛍光共鳴エネルギー転移 対による蛍光を顕在化させ、反応混合物の温度が変化して前記選択したテンプレ ートの前記増幅生成物から溶解する前記プローブの第１の溶解曲線と前記競合的 テンプレートから溶解する前記プローブの第２の溶解曲線とを得る場合に温度の 関数として蛍光放射を決定するステップと、 （ｃ）前記第１と第２の溶解曲線から第１と第２の溶解溶解ピークに変換して 当該溶解ピークから前記選択したテンプレートと前記競合的テンプレートの相対 量を決定するステップと、 （ｄ）前記既知の量の前記競合的テンプレートと、前記選択したテンプレート 及び競合的テンプレートの相対量とに基づいて前記選択したテンプレートの濃度 を計算するステップと、 を含むことを特徴とする方法。 ６９．前記基準オリゴヌクレオチドはオリゴヌクレオチド・プライマーの対の一 方であることを特徴とする請求項６８に記載の方法。 ７０．前記共鳴エネルギー転移対は供与体としてフルオレセイン又受容体として Ｃｙ５又はＣｙ５．５を含むことを特徴とする請求項６９に記載の方法。 ７１．前記供与体と前記受容体は前記プローブ及び基準オリゴヌクレオチドに結 合され、前記プローブと基準ヌクレオチドが前記増幅ヤグメントにハイブリダイ ゼーションした場合に前記供与体と前記受容体が約２５ヌクレオチド残基以上離 れないようにすることを特徴とする請求項６９に記載の方法。 ７２．前記供与体と前記受容体は前記プローブ及び基準オリゴヌクレオチドに結 合され、前記プローブと基準ヌクレオチドが前記増幅セグメントにハイブリダイ ゼーションした場合に前記供与体と前記受容体が約０〜５ヌクレオチド残基だけ 離れるようにすることを特徴とする請求項７１に記載の方法。 ７３．前記供与体と前記受容体は前記プローブ及び基準オリゴヌクレオチドに結 合され、前記プローブとトランスファヌクレオチドが前記増幅セグメントにハイ ブリダイゼーションした場合に前記供与体と前記受容体が約０〜２ヌクレオチド 残基だけ離れるようにすることを特徴とする請求項７２に記載の方法。 ７４．前記供与体と前記受容体は前記プローブ及び基準オリゴヌクレオチドに結 合され、前記プローブとトランスファヌクレオチドが前記増幅セグメントにハイ ブリダイゼーションした場合に前記供与体と前記受容体が１ヌクレオチド残基だ け離れるようにすることを特徴とする請求項７３に記載の方法。 ７５．前記基準ヌクレオチドが前記オリゴヌクレオチド・プライマーの一方では ないことを特徴とする請求項６８に記載の方法。 ７６．前記共鳴エネルギー転移対は供与体としてフルオレセイン又受容体として Ｃｙ５又はＣｙ５．５を含むことを特徴とする請求項７５に記載の方法。 ７７．前記供与体と前記受容体は前記プローブ及び基準オリゴヌクレオチドに結 合され、前記プローブと基準ヌクレオチドが前記増幅セグメントにハイブリダイ ゼーションした場合に前記供与体と前記受容体が約１５ヌクレオチド残基以上離 れないようにすることを特徴とする請求項７６に記載の方法。 ７８．前記供与体と前記受容体は前記プローブ及び基準オリゴヌクレオチドに結 合され、前記プローブと基準ヌクレオチドが前記増幅セグメントにハイブリダイ ゼーションした場合に前記供与体と前記受容体が約４〜６ヌクレオチド残基だけ 離れるようにすることを特徴とする請求項７７に記載の方法。 ７９．フルオレセインとＣｙ５からなることを特徴とする蛍光共鳴エネルギー転 移対。 ８０．フルオレセインとＣｙ５．５からなることを特徴とする蛍光共鳴エネルギ ー転移対。 ８１． ポリメラーゼ連鎖反応において選択した核酸テンプレートの濃度を決定 する方法であって、 （ａ）（ｉ）ポリメラーゼ連鎖反応において前記選択したテンプレートの選択 した第１のセグメントを増幅して増幅した第１の生成物を得るように構成された 第１の対のオリゴヌクレオチド・プライマーの各々の有効量と、 （ｉｉ）ポリメラーゼ連鎖反応において基準テンプレートの選択した第２の セグメントを増幅して増幅した第２の生成物を得るように構成された第２の対の オリゴヌクレオチド・プライマーの各々の有効量と、 （ｉｉｉ）核酸結合蛍光染料の有効量と、 を含む反応混合物において、 ポリメラーゼ連鎖反応により、未知の量の前記選択したテンプレートを増幅し て前記増幅した第１の生成物を得る及び既知の量の前記基準テンプレートを増幅 して前記増幅した第２の生成物を得るステップと、 （ｂ）選択した波長の光で前記反応混合物を照明して核酸結合蛍光染料による 蛍光を顕在化させ、温度の関数として放射された蛍光を連続的にモニタして第１ の生成物と第２の生成物が異なる温度で溶解するような前記増幅生成物の溶解曲 線を得るステップと、 （ｃ）前記溶解曲線を溶解溶解ピークに変換して当該溶解ピークから前記選択 したテンプレートと前記基準テンプレートの相対量を決定するステップと、 （ｄ）前記既知の量の前記基準テンプレートと選択したテンプレート及び基準 テンプレートの相対量とに基づいて前記選択したテンプレートの濃度を計算する ステップと、 を含むことを特徴とする方法。 ８２．前記核酸結合蛍光染料はＳＹＢＲTMグリーンＩ、臭化エチジウム、ピコグ リーン、アクリジン・オレンジ、チアゾール・オレンジ、ＹＯ−ＰＲＯ−１、ク ロモマイシンＡ３から構成されるグループから選択されることを特徴とする請求 項８１に記載の方法。 ８３．前記核酸結合蛍光染料はＳＹＢＲTMグリーンＩであることを特徴とする請 求項８２に記載の方法。 ８４．陽性対照テンプレートも含むポリメラーゼ連鎖反応において選択したテン プレートの増幅をモニタする方法であって、 （ａ）（ｉ）ポリメラーゼ連鎖反応において前記選択したテンプレートの選択 した第１のセグメントを増幅して増幅された第１の生成物を得るように構成され た第１の対のオリゴヌクレオチド・プライマーの各々の有効量と、 （ｉｉ）ポリメラーゼ連鎖反応において、陽性対照テンプレートの選択され た第２のセグメントを増幅して増幅された第２の生成物を得るように構成された 第２の対のオリゴヌクレオチド・プライマーの各々の有効量と、 （ｉｉｉ）有効量の核酸結合蛍光染料と、 を含む反応混合物において、 前記選択したテンプレートと前記陽性対照テンプレートをポリメラーゼ連鎖反 応によって増幅するための条件に前記選択したテンプレートと前記陽性対照テン プレートをさらすステップと、 （ｂ）前記反応混合物を選択した波長の光で照明して核酸結合蛍光染料による 蛍光を顕在化し、前記ポリメラーゼ連鎖反応の増幅サイクル中に温度の関数とし て放射される蛍光を連続的にモニタして前記選択したテンプレートが増幅される 場合前記増幅された第１の生成物の第１の溶解ピークを、また前記陽性対照テン プレートが増幅される場合前記増幅された第２の生成物の第２の溶解ピークを取 得するステップとを含み、 前記第２の溶解曲線の取得はポリメラーゼ連鎖反応が作用したことを表わし、 前記第１の溶解曲線の取得は前記選択した第１のセグメントが増幅可能であるこ とを表わし、前記第１の溶解曲線が欠如していることは前記選択した第１のセグ メントが増幅不可能であることを表わす ことを特徴とする方法。 ８５．前記核酸結合蛍光染料はＳＹＢＲTMグリーンＩ、臭化エチジウム、ピコグ リーン、アクリジン・オレンジ、チアゾール・オレンジ、ＹＯ−ＰＲＯ−１、ク ロモマイシンＡ３から構成されるグループから選択されることを特徴とする請求 項８４に記載の方法。 ８６．前記核酸結合蛍光染料がＳＹＢＲTMグリーンＩであることを特徴とする請 求項８５に記載の方法。 ８７． 個人の第Ｖ因子ライデン変異を検出する方法であって、第Ｖ因子ライデ ン変異は野生型と比較して第Ｖ因子ライデン変異配座での単一塩基変化で構成さ れ、 （ａ）前記個人からサンプル・ゲノムＤＮＡを採得するステップと、 （ｂ）対照として野生型ゲノムＤＮＡを提供するステップと、 （ｃ）前記サンプル・ゲノムＤＮＡと前記野生型ゲノムＤＮＡの選択したセグ メントをポリメラーゼ連鎖反応によって増幅するように構成されたオリゴヌクレ オチド・プライマーの対を提供し、前記選択したセグメントは第Ｖ因子ライデン 変異配座を含み、第Ｖ因子ライデン変異配座のコピーを含む増幅生成物を得るス テップと、 （ｄ）蛍光共鳴エネルギー転移対の共鳴エネルギー転移供与体又は共鳴エネル ギー転移受容体で標識されたオリゴヌクレオチド・プローブを提供し、前記プロ ーブは前記増幅された生成物にハイブリダイゼーションするように構成されて前 記プローブが前記変異配座にまたがり前記サンプル・ゲノムＤＮＡに前記野生型 ゲノムＤＮＡの溶解プロファイルから区別できる第Ｖ因子ライデン変異が存在す る場合溶解プロファイルを示すステップと、 （ｅ）共鳴エネルギー転移供与体又は共鳴エネルギー転移受容体で標識された 転移オリゴヌクレオチドを提供し、前記プローブと転移オリゴヌクレオチドの間 で一方が共鳴エネルギー転移供与体で標識され他方が共鳴エネルギー転移受容体 で標識されているとして、前記転移オリゴヌクレオチドは前記増幅生成物にハイ ブリダイゼーションするように構成して前記プローブと前記転移オリゴヌクレオ チドの両方が前記増幅生成物にハイブリダイゼーションする場合に共鳴エネルギ ー転移供与体と共鳴エネルギー転移受容体が共鳴エネルギー転移関係にあるよう にするステップと、 （ｆ）有効量のオリゴヌクレオチド・プローブと転移オリゴヌクレオチドの存 在下でサンプル・ゲノムＤＮＡと野生型ゲノムＤＮＡの前記選択したセグメント をポリメラーゼ連鎖反応により増幅して、増幅された選択セグメントを得るよう にし、少なくともその一部分は共鳴エネルギー転移関係にある蛍光共鳴エネルギ ー転移対によりこれらにハイブリダイゼーションされた前記プローブと前記転移 オリゴヌクレオチドの両方を有するようにするステップと、 （ｇ）前記ポリメラーゼ連鎖反応の増幅サイクルの間の温度の関数として蛍光 を測定してサンプル・ゲノムＤＮＡの前記増幅セグメントから溶解する前記プロ ーブの溶解プロファイルと前記野生型ゲノムＤＮＡの増幅セグメントから溶解す る前記プローブの溶解プロファイルとを取得するステップと、 （ｈ）前記サンプル・ゲノムＤＮＡについての前記溶解プロファイルを前記野 生型ゲノムＤＮＡについての前記溶解プロファイルと比較し、これらの差が前記 サンプル・ゲノムＤＮＡにおける第Ｖ因子ライデン変異の存在を表わすステップ と、 を含むことを特徴とする方法。 ８８．前記転移オリゴヌクレオチドはオリゴヌクレオチド・プライマーの対の一 方であることを特徴とする請求項８７に記載の方法。 ８９．前記共鳴エネルギー転移対はフルオレセインとＣｙ５又はＣｙ５．５を含 むことを特徴とする請求項８８に記載の方法。 ９０.前記オリゴヌクレオチド・プライマーが配列ＩＤ no:１１及び配列ＩＤ no :１２であることを特徴とする請求項８９に記載の方法。 ９１．配列ＩＤ no:１１はＣｙ５又はＣｙ５．５で標識されることを特徴とする 請求項９０に記載の方法。 ９２．前記オリゴヌクレオチド・プローブが配列ＩＤ no:１３であることを特徴 とする請求項９０に記載の方法。 ９３．配列ＩＤ no:１３がフルオレセインで標識されることを特徴とする請求項 ９０に記載の方法。 ９４．前記共鳴エネルギー転移供与体及び共鳴エネルギー転移受容体がヌクレオ チド残基に結合されて、前記プローブと転移オリゴヌクレオチドが前記増幅セグ メントにハイブリダイゼーションされる場合約１５ヌクレオチド残基以上離れな いようにすることを特徴とする請求項８７に記載の方法。 ９５．前記共鳴エネルギー転移供与体及び共鳴エネルギー転移受容体がヌクレオ チド残基に結合されて、前記プローブと転移オリゴヌクレオチドが前記増幅セグ メントにハイブリダイゼーションされる場合約４〜６ヌクレオチド残基だけ離れ るようにすることを特徴とする請求項９４に記載の方法。 ９６．前記転移オリゴヌクレオチドは前記オリゴヌクレオチド・プライマーの一 方ではないことを特徴とする請求項８６に記載の方法。 ９７．前記共鳴エネルギー転移対はフルオレセインとＣｙ５又はＣｙ５．５を含 むことを特徴とする請求項９６に記載の方法。 ９８．前記オリゴヌクレオチド・プライマーが配列ＩＤ no:１１と配列ＩＤ no: １２であることを特徴とする請求項９７に記載の方法。 ９９．前記オリゴヌクレオチド・プローブが配列ＩＤ no:１３であることを特徴 とする請求項９８に記載の方法。 １００．配列ＩＤ no:１３がフルオレセインで標識されることを特徴とする請求 項９９に記載の方法。 １０１．前記転移オリゴヌクレオチドがＣｙ５又はＣｙ５．５で標識されること を特徴とする請求項１００に記載の方法。 １０２．前記共鳴エネルギー転移供与体及び前記共鳴エネルギー転移受容体がヌ クレオチド残基に結合され、前記プローブと転移オリゴヌクレオチドが前記増幅 セグメントにハイブリダイゼーションされる場合に２５ヌクレオチド残基以上離 れないようにすることを特徴とする請求項１０１に記載の方法。 １０３．前記共鳴エネルギー転移供与体及び前記共鳴エネルギー転移受容体がヌ クレオチド残基に結合され、前記プローブと転移オリゴヌクレオチドが前記増幅 セグメントにハイブリダイゼーションされる場合に約０〜５ヌクレオチド残基以 上離れないようにすることを特徴とする請求項１０２に記載の方法。 １０４．前記共鳴エネルギー転移供与体及び前記共鳴エネルギー転移受容体がヌ クレオチド残基に結合され、前記プローブと転移オリゴヌクレオチドが前記増幅 セグメントにハイブリダイゼーションされる場合に約０〜２ヌクレオチド残基以 上離れないようにすることを特徴とする請求項１０３に記載の方法。 １０５．前記共鳴エネルギー転移供与体及び前記共鳴エネルギー転移受容体がヌ クレオチド残基に結合され、前記プローブと転移オリゴヌクレオチドが前記増幅 セグメントにハイブリダイゼーションされる場合に１ヌクレオチド残基だけ離れ るようにすることを特徴とする請求項１０４に記載の方法。 １０６．溶解プロファイルにおける相違が少なくとも約２℃の熱溶解温度におけ る相違を表わすことを特徴とする請求項８７に記載の方法。 １０７．配列ＩＤ no:１１のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチド。 １０８．配列ＩＤ no:１２のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチド。 １０９．配列ＩＤ no:１３のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチド。 １１０． 核酸ハイブリダイゼーションを分析するための方法であって、 （ａ）分析すべき核酸サンプルと核酸結合蛍光体とを含む混合物を提供するス テップと、 （ｂ）温度を≧毎秒０．１℃の速度で変化させながら蛍光をモニタするステッ プと、 を含むことを特徴とする方法。 １１１．前記核酸結合蛍光染料がＳＹＢＲTMグリーンＩであることを特徴とする 請求項１１０に記載の方法。 １１２．前記核酸結合蛍光体はオリゴヌクレオチド・プローブの対を含み、前記 プローブの一方が蛍光共鳴エネルギー転移対の供与体で標識され前記プローブの 他方が受容体で標識されることを特徴とする請求項１１０に記載の方法。 １１３．前記プローブの一方がポリメラーゼ連鎖反応増幅用のプライマーである ことを特徴とする請求項１１２に記載の方法。 １１４． 未知の量の核酸を含むサンプルの初期コピー数を定量する方法であっ て、 （ａ）ポリメラーゼ連鎖反応により既知の濃度の少なくとも一つの標準を、前 記標準と核酸結合蛍光体とを含む混合物中で増幅するステップと、 （ｂ）サイクル数の関数として蛍光を測定して一組のデータ点を得るステップ と、 （ｃ）初期核酸濃度とサイクル数の関数として蛍光を記述する任意の所定の式 に前記データ点を当てはめるステップと、 （ｄ）前記サンプルと前記核酸結合蛍光体とを含む混合物中で未知の量の核酸 を含む前記サンプルを増幅してこれの蛍光をモニタするステップと、 （ｅ）ステップ（ｃ）で求めた式から初期核酸濃度を決定するステップと、 を含むことを特徴とする方法。 １１５．前記核酸結合蛍光染料がＳＹＢＲTMグリーンＩであることを特徴とする 請求項１１４に記載の方法。 １１６．前記核酸結合蛍光体はオリゴヌクレオチド・プローブの対を含み、その 一方が蛍光共鳴エネルギー転移対の供与体で標識され他方が受容体で標識される ことを特徴とする請求項１１４に記載の方法。 １１７．前記プローブの一方が増幅用プライマーであることを特徴とする請求項 １１６に記載の方法。 １１８．放射スペクトルを有する供与体蛍光物質と吸収スペクトルを有し消光係 数が１００，０００Ｍ-1ｃｍ-1より大きい受容体蛍光物質とを含み、前記供与体 蛍光物質の放射スペクトルと前記受容体蛍光物質の吸収スペクトルが２５％以下 でオーバラップすることを特徴とする蛍光共鳴エネルギー転移対。 １１９．前記供与体蛍光物質がフルオレセインであり前記受容体蛍光物質がＣｙ ５又はＣｙ５．５であることを特徴とする蛍光共鳴エネルギー転移対。 １２０． 生物学的サンプルの標的ＤＮＡ配列を分析するための方法であって、 核酸結合蛍光体の存在下にポリメラーゼ連鎖反応によって前記標的配列を増幅 し、前記ポリメラーゼ連鎖反応には前記標的とされる核酸配列に対する熱安定性 ポリメラーゼ及びプライマーを前記生物学的サンプルに添加して少なくとも変性 温度と延長温度の間で前記生物学的サンプルを熱サイクルするステップを含むス テップと、 前記核酸結合蛍光体により吸収される波長の光によって前記サンプルを励起す るステップと、 前記サンプルの温度が変化する際に前記核酸結合蛍光体からの温度依存性蛍光 をモニタするステップと、 を含むことを特徴とする方法。 １２１．前記核酸結合蛍光体は二重鎖核酸結合蛍光染料を含むことを特徴とする 請求項１２０に記載の方法。 １２２．前記二重鎖核酸結合蛍光染料がＳＹＢＲTMグリーンＩであることを特徴 とする請求項１２１に記載の方法。 １２３．前記温度依存性蛍光を用いて前記増幅生成物を同定することを特徴とす る請求項１２２に記載の方法。 １２４．前記増幅生成物が溶解曲線の分析によって同定されることを特徴とする 請求項１２３に記載の方法。 １２５．２種類又はそれ以上の増幅生成物の相対量を溶解曲線の分析によって求 めることを特徴とする請求項１２４に記載の方法。 １２６．溶解曲線より下の領域が多重ガウス曲線の和の非線形最小自乗法回帰で 見付けられることを特徴とする請求項１２４に記載の方法。
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