ES2255189T3 - Variantes de proteasa con sustituciones multiples con carga neta alterada para usar detergentes. - Google Patents

Abstract

Un método de mejorar la eficiencia de una subtilisina en un sistema con baja concentración de detergente que tiene menos de 800 ppm de componentes detergentes presentes en el agua de lavado, que comprende: a) sustituir un residuo de aminoácido en una o más posiciones en una subtilisina precursora para producir una variante de subtilisina en la cual la sustitución altera la carga en dicha posición haciendo la carga más negativa o menos positiva en comparación con el precursor; y b) ensayar la variante en un sistema con bajo contenido de detergente que tiene menos de 800 ppm de componentes detergentes presentes en el agua de lavado por comparación de la aptitud del precursor y la variante para eliminar una mancha.

Description

Variantes de proteasa con sustituciones múltiples con carga neta alterada para usar en detergentes.

Solicitudes afines

La presente solicitud es una solicitud de continuación en parte de la Solicitud de Patente de los Estados Unidos 08/956.323, presentada el 23 de octubre de 1998, la Solicitud de Patente de los Estados Unidos 08/956.564, presentada el 23 de octubre de 1998, y la Solicitud de Patente de los Estados Unidos 08/956.324, presentada el 23 de octubre de 1998, todas las cuales se incorporan por la presente en esta memoria en su totalidad.

Antecedentes de la invención

Las serina-proteasas son un subgrupo de carbonil-hidrolasas. Las mismas comprenden una clase diversa de enzimas que tienen una extensa gama de especificidades y funciones biológicas. Stroud, R. Sci. Amer., 131: 74-88. A pesar de su diversidad funcional, la maquinaria catalítica de las serina-proteasas ha sido abordada por al menos dos familias de enzimas genéticamente distintas: 1) las subtilisinas y 2) las serina-proteasas de mamífero afines a la quimotripsina y serina-proteasas bacterianas homólogas (v.g., tripsina y S. gresius tripsina). Estas dos familias de serina-proteasas exhiben mecanismos de catálisis notablemente similares. Kraut, J. (1977), Annu. Rev. Biochem., 46: 331-358. Adicionalmente, aunque la estructura primaria no está emparentada, la estructura terciaria de estas dos familias de enzimas reúne una tríada catalítica conservada de aminoácidos constituida por serina, histidina y aspartato.

Las subtilisinas son serina-proteasas (PM aprox. 27.500) que son secretadas en grandes cantidades por una gran diversidad de especies de Bacillus y otros microorganismos. La secuencia proteínica de la subtilisina ha sido determinada a partir de al menos nueve especies diferentes de Bacillus. Markland, F.S., et al. (1983), Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem., 364: 1537-1540. La estructura cristalográfica tri-dimensional de las subtilisinas de Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus licheniformis y varias variantes naturales de B. lentus ha sido consignada. Estos estudios indican que aunque la subtilisina no está emparentada genéticamente con las serina-proteasas de mamífero, tiene una estructura de sitio activo similar. Las estructuras cristalinas de rayos X de inhibidores peptídicos unidos covalentemente que contienen subtilisina (Robertus, J.D., et al. (1972), Biochemistry, 11: 2439-2449) o complejos de productos (Robertus. J.D., et al. (1976), J. Biol. Chem., 251: 1097-1103) han proporcionado también información concerniente al sitio activo y a la hendidura supuesta de unión al sustrato de la subtilisina. Adicionalmente, se han consignado un gran número de estudios de modificación cinética y química para subtilisina; Svendsen, B. (1976). Carlsberg Res. Commun., 41: 237-291; Markland, F.S. id.) así como al menos un informe en el cual la cadena lateral de la metionina en el residuo 222 de la subtilisina se convirtió con peróxido de hidrógeno en metionina-sulfóxido (Stauffer, D.C., et al. (1965), J. Biol. Chem., 244: 5333-5338) y se ha llevado a cabo una mutagénesis orientada extensa (Wells y Estell (1988) TIBS 13: 291-297).

Una cuestión común en el desarrollo de una variante de proteasa para uso en una formulación detergente es la diversidad de condiciones de lavado que incluyen formulaciones detergentes variables en las que podría utilizarse una variante de proteasa. Por ejemplo, formulaciones detergentes utilizadas en diferentes áreas tienen distintas concentraciones de sus componentes relevantes presentes en el agua de lavado. Por ejemplo, un sistema detergente europeo tiene por lo general aproximadamente 450-5000 ppm de componentes detergentes en el agua de lavado, mientras que un sistema detergente japonés tiene por lo general aproximadamente 667 ppm de componentes detergentes en el agua de lavado. En Norteamérica, particularmente en los Estados Unidos, un sistema detergente tiene por lo general aproximadamente 975 ppm de componentes detergentes presentes en el agua de lavado. Sorprendentemente, se ha desarrollado un método para el diseño racional de una variante de proteasa para uso en un sistema de baja concentración detergente, un sistema de alta concentración detergente, y/o un sistema de concentración detergente media así como para el uso en los tres tipos de sistemas de concentración detergente.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona un método de mejora de la eficiencia de una subtilisina en un sistema de baja concentración detergente que tiene menos de 800 ppm de componentes detergentes presentes en el agua de lavado, que comprende:

a)

sustituir un residuo de aminoácido en una o más posiciones en una subtilisina precursora para producir una variante de subtilisina en la cual la sustitución altera la carga en dicha posición haciendo la carga más negativa o menos positiva comparada con el precursor; y

b)

ensayar la variante en un sistema pobre en detergente que tiene menos de 800 ppm de componentes detergentes presentes en el agua de lavado por comparación de la aptitud del precursor y la variante para eliminar una mancha.

La presente invención proporciona también un método de mejora de la eficiencia de una subtilisina en un sistema de alta concentración detergente que tiene más de 2000 ppm de componentes detergentes presentes en el agua de lavado, que comprende:

a)

sustituir un residuo de aminoácido en una o más posiciones en una subtilisina precursora para producir una variante de subtilisina en la cual la sustitución altera la carga en dicha posición haciendo la carga más positiva o menos negativa comparada con el precursor; y

b)

ensayar la variante en un sistema rico en detergente que tiene más de 2000 ppm de componentes detergentes presentes en el agua de lavado por comparación de la aptitud del precursor y la variante para eliminar una mancha.

Se proporciona también un método de producción de una composición detergente que comprende, habiendo mejorado la eficiencia de una subtilisina por producción de una variante de subtilisina por un método de la invención, formular la variante de subtilisina en una composición detergente en polvo o líquida que tiene un pH entre 6,5 y 12,0 a aproximadamente 0,1 hasta 5% en peso.

Breve descripción de los dibujos

Las Figs. 1 A-C representan la secuencia de DNA y de aminoácidos para la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens y un mapa de restricción parcial de este gen.

La Fig. 2 representa los residuos de aminoácidos conservados entre las subtilisinas de Bacillus amyloliquefaciens (BPN') y Bacillus lentus (tipo salvaje).

Las Figs. 3A y 3B representan la secuencia de aminoácidos de cuatro subtilisinas. La línea superior representa la secuencia de aminoácidos de subtilisina de la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens (a la que se hace referencia también en ocasiones como subtilisina BPN'). La segunda línea representa la secuencia de aminoácidos de la subtilisina de Bacillus subtilis. La tercera línea representa la secuencia de aminoácidos de subtilisina de B. licheniformis. La cuarta línea representa la secuencia de aminoácidos de subtilisina de Bacillus lentus (a la que se hace referencia también como subtilisina 309 en el documento PCT WO89/06276). El símbolo designa la ausencia de residuos de aminoácidos específicos en comparación con la subtilisina BPN'.

Descripción detallada de la invención

Como se ha indicado arriba, ciertas geografías tienen ciertas condiciones de lavado y, así, utilizan tipos de detergentes diferentes. Por ejemplo, Japón utiliza un sistema de baja concentración de detergente, mientras que Europa utiliza un sistema de alta concentración de detergente. Como se ha expuesto previamente, los Estados Unidos utilizan un sistema de concentración media de detergente. Los autores de la presente invención han encontrado que diferentes variantes de proteasa se comportan óptimamente en estas formulaciones de detergente diferentes.

Se ha encontrado que, para producir una variante de proteasa que es más eficaz en un sistema de baja concentración de detergente, es necesario reemplazar residuo(s) cargado(s) positivamente con residuo(s) cargado(s) negativamente o residuos neutros y/o residuo(s) neutro(s) con residuo(s) cargado(s) negativamente. En contraste, se ha observado que para producir una variante de proteasa que es más eficaz en un sistema con alta concentración de detergente, es necesario reemplazar residuo(s) cargado(s) negativamente sea con residuo(s) cargado(s) positivamente o residuo(s) neutro(s) y/o residuo(s) neutro(s) con residuo(s) cargado(s) positivamente.

La carga electrostática que cualquier cadena lateral de aminoácido ionizable con una función ácida o básica adquiere en solución acuosa es función del pH. Los residuos ácidos Glu y Asp, en un proceso de equilibrio, pierden un protón por disociación entre pH 3 y 6 adquiriendo con ello una carga negativa. De manera similar, His, Lys, y Arg se desprotonizan gradualmente entre pH 5 y pH 8, pH 8,5 y 11,5, y pH 11 y 14, respectivamente, perdiendo con ello una carga positiva. El protón de TyrOH se disocia crecientemente entre pH 8,5 y 11,5, con lo que Tyr adquiere una carga negativa. El intervalo de disociación para el término carboxi es pH 1 a 4, produciéndose una carga negativa, y para el término amino es pH 8 a 11, acompañado por la pérdida de la carga positiva. Los intervalos de disociación para las cadenas laterales de aminoácidos dados aquí son valores medios para muchas proteínas, pero se sabe que los mismos se ven afectados por configuraciones estructurales anómalas en algunas proteínas.

El efecto acumulativo de todas las cargas determina si una proteína tiene una carga positiva neta o negativa neta a un pH dado. El pH al que las cargas positivas y negativas son igualmente eficaces y transmiten un estado electrostáticamente neutro a una proteína se denomina el punto isoeléctrico (pI). Una proteína perderá o ganará carga cuando cambia el pH o cuando se añade o se elimina un aminoácido con un residuo de cadena lateral ionizable. Un aumento de carga positiva neta puede adquirirse sea por reemplazamiento de un residuo que a un pH dado está cargado negativamente con un residuo sin carga o cargado positivamente, conduciendo a un cambio formal de carga de +1 y +2, respectivamente. Por reemplazamiento de un residuo de cadena lateral sin carga con uno que está protonizado al pH dado, el cambio formal de carga sería +1. Análogamente, puede aumentarse una carga negativa neta reemplazando cadenas laterales cargadas positivamente y sin carga con cadenas laterales cargadas negativamente al pH de observación, conduciendo a una ganancia de aumento formal de carga negativa de -1 y -2, respectiva-
mente.

Un sistema de baja concentración de detergente incluye detergentes en los cuales están presentes menos de aproximadamente 800 ppm de componentes detergentes en el agua de lavado. Los detergentes japoneses se consideran típicamente sistemas de baja concentración de detergente, dado que los mismos tienen aproximadamente 667 ppm de componentes detergentes presentes en el agua de lavado.

Una concentración media de detergente incluye detergentes en los cuales están presentes entre aproximadamente 800 ppm y aproximadamente 2000 ppm de componentes detergentes en el agua de lavado. Los detergentes de Norteamérica están considerados generalmente como sistemas de concentración media de detergente, dado que los mismos tienen aproximadamente 975 ppm de componentes detergentes presentes en el agua de lavado. Brasil tiene por regla general aproximadamente 1500 ppm de componentes detergentes presentes en el agua de lavado.

Un sistema de alta concentración de detergente incluye detergentes en los cuales están presentes más de aproximadamente 2000 ppm de componentes detergentes en el agua de lavado. Los detergentes europeos se consideran generalmente como sistemas de alta concentración de detergente, dado que los mismos tienen aproximadamente 4500-5000 ppm de componentes detergentes en el agua de lavado.

Los detergentes de Latinoamérica son generalmente detergentes con mejoradores de fosfato con altas jabonaduras, y la gama de detergentes utilizada en Latinoamérica puede caer tanto en las concentraciones de detergente medias como altas, dado que las mismas están comprendidas entre 1500 ppm y 6000 ppm de componentes detergentes en el agua de lavado. Como se ha mencionado arriba, Brasil tiene por regla general aproximadamente 1500 ppm de componentes detergentes presentes en el agua de lavado. Sin embargo, otras geografías con detergentes mejoradores de fosfatos con altas jabonaduras, no limitadas a otros países de Latinoamérica, pueden tener sistemas de alta concentración de detergente hasta aproximadamente 6000 ppm de componentes detergentes presentes en el agua de
lavado.

A la vista de lo que antecede, es evidente que las concentraciones de composiciones detergentes en las soluciones típicas de lavado en todo el mundo varían desde menos de aproximadamente 800 ppm de composición detergente ("geografías con baja concentración de detergente"), por ejemplo aproximadamente 667 ppm en Japón, hasta aproximadamente 800 ppm a aproximadamente 2000 ppm ("geografías con concentración media de detergente"), por ejemplo aproximadamente 975 ppm en EE.UU. y aproximadamente 1500 ppm en Brasil, hasta más de aproximadamente 2000 ppm ("geografías con alta concentración de detergente"), por ejemplo aproximadamente 4500 ppm a aproximadamente 5000 ppm en Europa y aproximadamente 6000 ppm en las geografías que emplean mejoradores de fosfato con altas jabonaduras.

Las concentraciones de las soluciones típicas de lavado se determinan empíricamente. Por ejemplo, en los EE.UU., una máquina lavadora típica contiene un volumen de aproximadamente 64,4 l de solución de lavado. De acuerdo con ello, para obtener una concentración de aproximadamente 975 ppm de detergente en la solución de lavado tienen que añadirse aproximadamente 62,79 g de composición detergente a los 64,4 l de solución de lavado. Esta cantidad es la cantidad típica dosificada en el agua de lavado por el usuario que utiliza la copa de dosificación proporcionada con el detergente.

Las proteasas son carbonil-hidrolasas que actúan generalmente para escindir enlaces peptídicos de proteínas o péptidos. Tal como se utiliza en esta memoria, "proteasa" significa una proteasa existente naturalmente o una proteasa recombinante. El término "proteasa" se utiliza intercambiablemente con el término "subtilisina", excepto en los casos en que el contexto exige otra cosa. Las subtilisinas se describen con mayor detalle más adelante.

La presente invención hace uso de enzimas proteasa que son variantes de carbonil-hidrolasa no existentes naturalmente que tienen una diferente actividad proteolítica, estabilidad, especificidad de sustrato, perfil de pH y/o características de eficiencia en comparación con el precursor del que se deriva la secuencia de aminoácidos de la variante. Específicamente, tales variantes de proteasa tienen una secuencia de aminoácidos que no se encuentra en la naturaleza, que se deriva por sustitución de una pluralidad de residuos de aminoácidos de una proteasa precursora con aminoácidos diferentes. La proteasa precursora puede ser una proteasa existente naturalmente o una proteasa recombi-
nante.

Las variantes de proteasa útiles en esta invención abarcan la sustitución de cualquiera de los diecinueve L-aminoácidos existentes naturalmente en las posiciones de los residuos de aminoácidos designadas. Tales sustituciones pueden hacerse en cualquier subtilisina precursora (procariota, eucariota, etc.). A lo largo de esta solicitud se hace referencia a diversos aminoácidos por los códigos comunes de una y tres letras. Dichos códigos están identificados en Dale, M.W. (1989), Molecular Genetics of Bacteria, John Wiley & Sons, Ltd., Apéndice B.

Las variantes de proteasas útiles en esta invención son variantes de subtilisina, y se derivan preferiblemente de una subtilisina de Bacillus. Más preferiblemente, las variantes de proteasas se derivan de subtilisina de Bacillus lentus y/o subtilisina 309.

Las subtilisinas son proteasas bacterianas o fúngicas que actúan generalmente para escindir enlaces peptídicos de proteínas o péptidos. Tal como se utiliza en esta memoria, "subtilisina" significa una subtilisina existente naturalmente o una subtilisina recombinante. Se conocen una serie de subtilisinas existentes naturalmente que son producidas y a menudo secretadas por diversas especies microbianas. Las secuencias de aminoácidos de los miembros de esta serie no son totalmente homólogas. Sin embargo, las subtilisinas de esta serie exhiben el mismo tipo o un tipo similar de actividad proteolítica. Esta clase de serina-proteasas comparte una secuencia de aminoácidos común que define una tríada catalítica que distingue las mismas de la clase de serina-proteasas afines a la quimotripsina. Las subtilisinas y las serina-proteasas afines a la quimotripsina tienen ambas una tríada catalítica que comprende aspartato, histidina y serina. En las proteasas afines a la subtilisina, el orden relativo de estos aminoácidos, leyendo desde el término amino al término carboxi, es aspartato-histidina-serina. En cambio, en las proteasas afines a la quimotripsina, el orden relativo es histidina-aspartato-serina. Por ello, el término subtilisina hace referencia en esta memoria a una serina-proteasa que tiene la tríada catalítica de las proteasas afines a la subtilisina. Ejemplos incluyen, pero sin carácter limitante, las subtilisinas identificadas en la Fig. 3 de esta memoria. Generalmente, y para los propósitos de la presente invención, la numeración de los aminoácidos en las proteasas corresponde a los números asignados en la secuencia de la subtilisina madura de Bacillus amyloliquefaciens presentada en la Fig. 1.

Las expresiones "subtilisina recombinante" o "proteasa recombinante" hacen referencia a una subtilisina o proteasa en la cual la secuencia de DNA que codifica la subtilisina o proteasa está modificada para producir una secuencia variante (o mutante) de DNA que codifica la sustitución, deleción o inserción de uno o más aminoácidos en la secuencia de aminoácidos existente naturalmente. Métodos adecuados para producir dicha modificación, y que pueden combinarse con los expuestos en esta memoria, incluyen los expuestos en los documentos Patente U.S. RE 24.606; Patente U.S. 5.204.015 y Patente U.S. 5.185.258, Patente U.S. 5.700.676; Patente U.S. 5.801.038, y Patente U.S. 5.763.257.

"Subtilisinas no humanas" y el DNA que codifica las mismas se pueden obtener de muchos organismos procariotas y eucariotas. Ejemplos adecuados de organismos procariotas incluyen organismos gram-negativos tales como E. coli o Pseudomonas y bacterias gram-positivas tales como Micrococcus o Bacillus. Ejemplos de organismos eucariotas de los cuales se pueden obtener subtilisina y sus genes incluyen levaduras tales como Saccharomyces cerevisiae y hongos tales como Aspergillus sp.

Una "variante de proteasa" tiene una secuencia de aminoácidos que se deriva de la secuencia de aminoácidos de una "proteasa precursora". Las proteasas precursoras incluyen proteasas existentes naturalmente y proteasas recombinantes. La secuencia de aminoácidos de la variante de proteasa se "deriva" de la secuencia de aminoácidos de la proteasa precursora por la sustitución, deleción o inserción de uno o más aminoácidos de la secuencia de aminoácidos precursora. Dicha modificación es de la "secuencia de DNA precursora" que codifica la secuencia de aminoácidos de la proteasa precursora más bien que de la manipulación de la enzima proteasa precursora per se. Métodos adecuados para dicha manipulación de la secuencia de DNA precursora incluyen métodos descritos en esta memoria, así como métodos conocidos por los expertos en la técnica (véanse, por ejemplo, los documentos EP 0 328299, WO89/06279 y patentes y solicitudes de los EE.UU. a las que se ha hecho referencia anteriormente en esta
memoria).

Estos números de posición de aminoácidos se refieren a los asignados a la secuencia de subtilisina madura de Bacillus amyloliquefaciens presentada en Fig. 1. La invención, sin embargo, no está limitada a la mutación de esta subtilisina particular sino que se extiende a proteasas precursoras que contienen residuos de aminoácidos en posiciones que son "equivalentes" a los residuos particulares identificados en la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens. En una realización preferida de la presente invención, la proteasa precursora es subtilisina de Bacillus lentus y las sustituciones se hacen en las posiciones de los residuos de aminoácidos equivalentes en B. lentus correspondientes a las arriba enumeradas.

Una posición de residuo (aminoácido) de una proteasa precursora es equivalente a un residuo de subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens si la misma es homóloga (es decir, correspondiente en posición en la estructura primaria o terciaria) o análoga a un residuo o porción específico(a) de dicho residuo en la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens (es decir, que tiene la misma o similar capacidad funcional para combinarse, reaccionar, o interaccionar químicamente).

A fin de establecer homología de la estructura primaria, la secuencia de aminoácidos de una proteasa precursora se compara directamente con la secuencia primaria de la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens y particularmente con una serie de residuos que se sabe son invariantes en subtilisinas para las cuales se conoce la secuencia. Por ejemplo, la Fig. 2 de esta memoria muestra los residuos conservados entre subtilisina de B. amyloliquefaciens y B. lentus. Después de la alineación de los residuos conservados, permitiendo las inserciones y deleciones necesarias a fin de mantener la alineación (es decir, evitando la eliminación de residuos conservados por deleción e inserción arbitrarias), se definen los residuos equivalentes a aminoácidos particulares en la secuencia primaria de la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens. La alineación de los residuos conservados debería conservar preferiblemente el 100% de dichos residuos. Sin embargo, la alineación de más de 75% o de una proporción tan pequeña como 50% de los residuos conservados es también adecuada para definir residuos equivalentes. La conservación de la tríada catalítica, Asp32/His64/Ser221 debería mantenerse. Siezen et al. (1991) Protein Eng. 4(7): 719-737 muestra la alineación de un gran número de serina-proteasas. Siezen et al. hacen referencia a la agrupación como subtilasas o serina-proteasas semejantes a subtilisina.

Por ejemplo, en Fig. 3, la secuencia de aminoácidos de subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis (carlsbergensis) y Bacillus lentus están alineadas para proporcionar el grado máximo de homología entre las secuencias de aminoácidos. Una comparación de estas secuencias muestra que hay varios residuos conservados contenidos en cada secuencia. Estos residuos conservados (como entre BPN' y B. lentus) se identifican en Fig. 2.

Así, estos residuos conservados pueden utilizarse para definir los residuos de aminoácidos equivalentes correspondientes de la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens en otras subtilisinas tales como subtilisina de Bacillus lentus (publicación PCT No. WO89/06279 publicada el 13 de julio de 1989), la enzima precursora de proteasas preferida en esta invención, o la subtilisina a la que se hace referencia como PB92 (EP 0 328 299), que es altamente homóloga a la subtilisina preferida de Bacillus lentus. Las secuencias de aminoácidos de algunas de estas subtilisinas se alinean en las Figs. 3A y 3B con la secuencia de la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens para producir la homología máxima de residuos conservados. Como se puede ver, existen varias deleciones en la secuencia de Bacillus lentus en comparación con la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens. Así, por ejemplo, el aminoácido equivalente para Val165 en la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens en las otras subtilisinas es isoleucina para B. lentus y B. licheniformis.

Pueden definirse también "residuos equivalentes" por determinación de homología al nivel de la estructura terciaria para una proteasa precursora cuya estructura terciaria ha sido determinada por cristalografía de rayos X. Los residuos equivalentes se definen como aquéllos para los cuales las coordenadas atómicas de dos o más de los átomos de la cadena principal de un residuo de aminoácido particular de la proteasa precursora y la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens (N sobre N, CA sobre CA, C sobre C y O sobre O) están dentro de 0,13 nm y preferiblemente 0,1 nm después de la alineación. La alineación se consigue después que se ha orientado y posicionado el modelo óptimo para dar la superposición máxima de coordenadas atómicas de los átomos distintos de hidrógeno de las proteínas de la proteasa en cuestión respecto a la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens. El modelo óptimo es el modelo cristalográfico que da el factor R mínimo para datos experimentales de difracción con la resolución más alta posible.

\text{Factor R} = \frac{\sum_{h}|Fo(h)|-|Fc(h)|}{\sum_{h}|Fo(h)|}

Los residuos equivalentes que son funcionalmente análogos a un residuo específico de la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens se definen como aquellos aminoácidos de la proteasa precursora que pueden adoptar una conformación tal que los mismos alteran, modifican o contribuyen a la estructura de la proteína, la fijación de sustrato o la catálisis de una manera definida y atribuida a un sitio específico de la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens. Adicionalmente, los mismos son aquellos residuos de la proteasa precursora (para la cual se ha obtenido una estructura terciaria por cristalografía de rayos X) que ocupan una posición análoga en tal grado que, aunque los átomos de la cadena principal del residuo dado pueden no satisfacer los criterios de equivalencia basados en la ocupación de una posición homóloga, las coordenadas atómicas de al menos dos de los átomos de la cadena lateral del residuo están dentro de 0,13 nm de los átomos correspondientes de la cadena lateral de la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens. Las coordenadas de la estructura tri-dimensional de la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens se exponen en la Publicación EPO No. 0 251 446 (equivalente a la Patente U.S. 5.182.204, cuya descripción se incorpora en esta memoria por referencia) y pueden utilizarse como se ha reseñado anteriormente para determinar residuos equivalentes al nivel de la estructura terciaria.

Algunos de los residuos identificados para sustitución son residuos conservados, mientras que otros no lo son. En el caso de los residuos que no se conservan, la sustitución de uno o más aminoácidos está limitada a sustituciones que producen una variante que tiene una secuencia de aminoácidos que no corresponde a una encontrada en la naturaleza. En el caso de los residuos conservados, dichas sustituciones no deberían dar como resultado una secuencia existente naturalmente. Las variantes de proteasa de la presente invención incluyen las formas maduras de variantes de proteasa, así como las formas pro y prepro de tales variantes de proteasa. Las formas prepro son la construcción preferida, dado que ésta facilita la expresión, secreción y maduración de las variantes de proteasa.

"Prosecuencia" hace referencia a una secuencia de aminoácidos unida a la porción N-terminal de la forma madura de una proteasa que, cuando se separa, da como resultado la aparición de la forma "madura" de la proteasa. Muchas enzimas proteolíticas se encuentran en la naturaleza como productos de traducción proenzimáticos y, en ausencia de procesamiento post-traduccional, se expresan de esta manera. Una prosecuencia preferida para producción de variantes de proteasa es la prosecuencia supuesta de la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens, aunque pueden utilizarse otras prosecuencias de proteasa.

Una "secuencia señal" o "presecuencia" hace referencia a cualquier secuencia de aminoácidos unida a la porción N-terminal de una proteasa o a la porción N-terminal de una proproteasa que puede participar en la secreción de las formas madura o pro de la proteasa. Esta definición de secuencia señal es una definición funcional, que tiene por objeto incluir todas aquellas secuencias de aminoácidos codificadas por la porción N-terminal del gen de proteasa que participan en la realización de la secreción de la proteasa en condiciones naturales. La presente invención utiliza dichas secuencias para efectuar la secreción de las variantes de proteasa como se definen en esta memoria. Una posible secuencia señal comprende los siete primeros residuos de aminoácidos de la secuencia señal de la subtilisina de Bacillus subtilis condensados al resto de la secuencia señal de la subtilisina de Bacillus lentus (ATCC 21536).

Una forma "prepro" de una variante de proteasa está constituida por la forma madura de la proteasa que tiene una prosecuencia enlazada operativamente al término amino de la proteasa y una secuencia "pre" o "señal" enlazada operativamente al término amino de la prosecuencia.

"Vector de expresión" hace referencia a una construcción de DNA que contiene una secuencia de DNA que está enlazada operativamente a una secuencia de control adecuada capaz de efectuar la expresión de dicho DNA en un hospedador adecuado. Tales secuencias de control incluyen un promotor para efectuar la transcripción, una secuencia operadora opcional para controlar dicha transcripción, una secuencia que codifica sitios adecuados de fijación de ribosoma en el mRNA y secuencias que controlan la terminación de la transcripción y la traducción. El vector puede ser un plásmido, una partícula de fago, o simplemente una inserción genómica potencial. Una vez transformado en un hospedador adecuado, el vector puede replicarse y funcionar independientemente del genoma hospedador, o puede, en algunos casos, integrarse en el genoma propiamente dicho. En la presente memoria descriptiva, "plásmido" y "vector" se utilizan en ocasiones de modo intercambiable dado que el plásmido es la forma de vector utilizada más generalmente en la actualidad. Sin embargo, la invención tiene por objeto incluir tales otras formas de vectores de expresión que sirven para funciones equivalentes y que se conocen o puedan llegar a conocerse en la técnica.

Las "células hospedadoras" utilizadas en la presente invención son generalmente hospedadores procariotas o eucariotas que se han manipulado preferiblemente por los métodos descritos en la Patente U.S. RE 34.606 para hacerlos incapaces de secretar endoproteasa enzimáticamente activa. Una célula hospedadora preferida para expresión de proteasa es la cepa BG2036 de Bacillus que es deficiente en proteasa neutra y proteasa alcalina (subtilisina) enzimáticamente activas. La construcción de la cepa BG2036 se describe en detalle en la Patente U.S. 5.264.366. Otras células hospedadoras para la expresión de proteasa incluyen Bacillus subtilis I168 (descrito también en la Patente U.S. RE 34.606 y la Patente U.S. 5.264.366, cuyas descripciones se incorporan en esta memoria por referencia), así como cualquier cepa adecuada de Bacillus tal como B. licheniformis, B. lentus, etc.

Las células hospedadoras se transforman o transfectan con vectores construidos utilizando técnicas de DNA recombinante. Tales células hospedadoras transformadas son capaces de replicar vectores que codifican las variantes de proteasa o expresan la variante de proteasa deseada. En el caso de los vectores que codifican la forma pre o prepro de la variante de proteasa, dichas variantes, cuando se expresan, son secretadas típicamente por la célula hospedadora al medio de la célula hospedadora.

"Enlazado operativamente", cuando describe la relación entre dos regiones de DNA, significa simplemente que las mismas son afines funcionalmente una a otra. Por ejemplo, una presecuencia está enlazada operativamente a un péptido si la misma funciona como una secuencia señal, participando en la secreción de la forma madura de la proteína, lo que implica muy probablemente la escisión de la secuencia señal. Un promotor está enlazado operativamente a una secuencia codificante si el mismo controla la transcripción de la secuencia; un sitio de fijación de ribosoma está enlazado operativamente a una secuencia codificante si el mismo está posicionado de tal modo que permite la traducción.

Los genes que codifican la proteasa precursora existente naturalmente se pueden obtener de acuerdo con los métodos generales conocidos por los expertos en la técnica. Los métodos comprenden generalmente la síntesis de sondas marcadas que tienen secuencias supuestas que codifican regiones de la proteasa de interés, preparación de genotecas genómicas a partir de organismos que expresan la proteasa, y escrutinio de las genotecas respecto al gen de interés por hibridación a las sondas. Los clones que se hibridan positivamente se mapean y secuencian a continuación.

La proteasa clonada se utiliza luego para transformar una célula hospedadora a fin de expresar la proteasa. El gen de proteasa se liga luego a un plásmido de alto número de copias. Este plásmido se replica en hospedadores en el sentido de que contiene los elementos bien conocidos necesarios para replicación del plásmido: un promotor enlazado operativamente al gen en cuestión (que puede ser suministrado como el propio promotor homólogo del gen si el mismo es reconocido, es decir transcrito, por el hospedador), una región de terminación de la transcripción y poliadenilación (necesaria para estabilidad del mRNA transcrito por el hospedador a partir de gen de proteasa en ciertas células hospedadoras eucariotas) que es exógena o es suministrada por la región del terminador endógeno del gen de proteasa y, deseablemente, un gen de selección tal como un gen de resistencia a antibióticos que permite el mantenimiento continuo en cultivo de las células hospedadoras infectadas con el plásmido por crecimiento en medios que contienen antibiótico. Los plásmidos de número de copias alto contienen también un origen de replicación para el hospedador, permitiendo con ello que se generen grandes números de plásmidos en el citoplasma sin limitaciones cromosómicas. No obstante, está dentro del alcance de esta invención la integración de copias múltiples del gen de proteasa en el genoma hospedador. Esto es facilitado por organismos procariotas y eucariotas que son particularmente susceptibles de recombinación homóloga.

El gen puede ser un gen natural de B. lentus. Alternativamente, puede producirse un gen sintético que codifica una proteasa precursora existente naturalmente o mutante. En un enfoque de este tipo, se determina la secuencia de DNA y/o de aminoácidos de la proteasa precursora. Después de ello se sintetizan fragmentos múltiples solapantes de DNA sintético monocatenario que, por hibridación y ligación, producen un DNA sintético que codifica la proteasa precursora. Un ejemplo de construcción de un gen sintético se expone en el Ejemplo 3 de la Patente U.S. 5.204.015, cuya descripción se incorpora en esta memoria por referencia.

Una vez que el gen de la proteasa precursora existente naturalmente o sintético ha sido clonado, se realizan diversas modificaciones para aumentar el uso del gen más allá de la síntesis de la proteasa precursora existente naturalmente. Tales modificaciones incluyen la producción de proteasas recombinantes como se expone en la Patente U.S. RE 34.606 y la Publicación EPO No. 0 251 446, y la producción de las variantes de proteasa descritas en esta memoria.

Se puede utilizar el método siguiente de mutagénesis de casete para facilitar la construcción de las variantes de proteasa de la presente invención, aunque pueden utilizarse otros métodos. En primer lugar, se obtiene el gen existente naturalmente que codifica la proteasa y se secuencia total o parcialmente. Después de ello, se escanea la secuencia en busca de un punto en el cual se desee hacer una mutación (deleción, inserción o sustitución) de uno o más aminoácidos en la enzima codificada. Las secuencias que flanquean este punto se evalúan en cuanto a la presencia de sitios de restricción para reemplazar un segmento corto del gen con una agrupación de oligonucleótidos que, una vez expresada, codificará diversos mutantes. Tales sitios de restricción son preferiblemente sitios singulares dentro del gen de la proteasa a fin de facilitar el reemplazamiento del segmento de gen. Sin embargo, puede utilizarse cualquier sitio de restricción conveniente que no sea excesivamente redundante en el gen de proteasa, con tal que los fragmentos de gen generados por digestión de restricción puedan reensamblarse en la secuencia apropiada. Sí no están presentes sitios de restricción en localizaciones situadas dentro de una distancia conveniente del punto seleccionado (de 10 a 15 nucleótidos), tales sitios se generan por sustitución de nucleótidos en el gen de tal manera que ni el marco de lectura ni los aminoácidos codificados se cambien en la construcción final. La mutación del gen a fin de cambiar su secuencia para adaptarse a la secuencia deseada se realiza por extensión con el iniciador M13 de acuerdo con métodos conocidos generalmente. La tarea de localización de regiones flanqueantes adecuadas y evaluación de los cambios necesarios para llegar a dos secuencias de sitio de restricción convenientes se hace rutinaria por la redundancia del código genético, un mapa de enzimas de restricción del gen y el gran número de enzimas de restricción diferentes. Obsérvese que si está disponible un sitio de restricción flanqueante conveniente, el método anterior precisa ser utilizado sólo en conexión con la región flanqueante que no contiene un sitio.

Una vez que se ha clonado el DNA existente naturalmente o DNA sintético, los sitios de restricción que flanquean las posiciones a mutar se digieren con las enzimas de restricción cognadas y se ligan al gen una pluralidad de casetes de oligonucleótidos complementarias de los términos extremos. Por este método se simplifica la mutagénesis, dado que todos los oligonucleótidos pueden sintetizarse de tal modo que tengan los mismos sitios de restricción, y no son necesarios enlazadores sintéticos en ningún caso para crear los sitios de restricción.

Tal como se utiliza en esta memoria, la actividad proteolítica se define como la tasa de hidrólisis de enlaces peptídicos por miligramo de enzima activa. Existen muchos procedimientos bien conocidos para medir la actividad proteolítica (K.M. Kalisz, "Microbial Proteinases", Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, A. Fiechter, compilador, 1988). Además de o como alternativa a la actividad proteolítica modificada, las enzimas variantes de la presente invención pueden tener otras propiedades modificadas tales como K_{m}, k_{cat}, relación k_{cat}/K_{m} y/o especificidad de sustrato modificada y/o perfil de actividad de pH modificado. Estas enzimas pueden adaptarse para el sustrato particular cuya presencia se anticipa, por ejemplo, en la preparación de péptidos o para procesos hidrolíticos tales como usos de colada.

En un aspecto de la invención, el objetivo es asegurar una proteasa variante que tiene una actividad proteolítica alterada, en comparación con la proteasa precursora, dado que el aumento de dicha actividad (numéricamente mayor) permite el uso de la enzima para actuar más eficientemente sobre un sustrato diana. Son también interesantes enzimas variantes que tienen estabilidad térmica alterada y/o especificidad de sustrato alterada en comparación con el precursor. En algunos casos, puede ser deseable una menor actividad proteolítica; por ejemplo podría ser útil una disminución en la actividad proteolítica en los casos en que se desea actividad de síntesis de las proteasas (como para la síntesis de péptidos). Podría desearse reducir esta actividad proteolítica, que es capaz de destruir el producto de dicha síntesis. Inversamente, en algunos casos puede ser deseable aumentar la actividad proteolítica de la enzima variante frente a su precursor. Adicionalmente, pueden ser deseables aumentos o disminuciones (alteración) de la estabilidad de la variante, sea estabilidad alcalina o térmica,. Los aumentos o disminuciones en k_{cat}, K_{m}, o k_{cat}/K_{m} son específicos para el sustrato utilizado a fin de determinar estos parámetros cinéticos.

En otro aspecto de la invención, se ha encontrado que variantes de proteasa que contienen sustituciones de los aminoácidos en una o más posiciones de residuos de tal modo que la sustitución altera la carga en dicha posición haciendo la carga más negativa o menos positiva en comparación con una proteasa precursora, son más eficaces en una concentración baja de detergente que una proteasa precursora.

En un aspecto adicional de la invención, se ha encontrado que variantes de proteasa que contienen sustituciones de los aminoácidos en una o más posiciones de residuos de tal modo que la sustitución altera la carga en dicha posición haciendo la carga más positiva o menos negativa en comparación con una proteasa precursora son más eficaces en una concentración alta de detergente que una proteasa precursora.

Estas sustituciones se hacen preferiblemente en la subtilisina de Bacillus lentus (recombinante o de tipo nativo), aunque las sustituciones pueden hacerse en cualquier proteasa de Bacillus, preferiblemente subtilisinas de Bacillus.

Basándose en los resultados de escrutinio obtenidos con las proteasas variantes, las mutaciones indicadas en la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens son importantes para la actividad proteolítica, eficiencia y/o estabilidad de estas enzimas y la eficiencia limpiadora o de lavado de tales enzimas variantes.

Las variantes de proteasa descritas son útiles en la formulación de composiciones detergentes.

Cierto número de compuestos conocidos son agentes tensioactivos adecuados en composiciones que comprenden tales mutantes de proteasas. Éstos incluyen detergentes no iónicos, aniónicos, catiónicos, o de ion dipolar, como se describe en los documentos U.S. 4.404.128 concedido a Barry J. Anderson y U.S. 4.261.868 concedido a Jiri Flora, et al. Una formulación detergente adecuada es la descrita en el Ejemplo 7 de la Patente U.S. 5.204.015 (incorporada previamente por referencia). La técnica está familiarizada con las diferentes formulaciones que pueden utilizarse como composiciones de limpieza.

Las variantes descritas exhiben una eficiencia mejorada en una composición detergente (en comparación con el precursor). Tal como se utiliza en esta memoria, la eficiencia mejorada en un detergente se define como el aumento de limpieza de ciertas manchas sensibles a enzimas tales como grasa o sangre, como se determina por evaluación visual después de un ciclo de lavado estándar.

Las proteasas pueden formularse en detergentes conocidos en polvo y líquidos que tienen pH comprendido entre 6,5 y 12,0 a niveles de aproximadamente 0,01 hasta aproximadamente 5% (preferiblemente 0,1% a 0,5%) en peso. Estas composiciones detergentes de limpieza pueden incluir también otras enzimas tales como proteasas, amilasas, celulasas, lipasas o endoglicosidasas conocidas, así como mejoradores y estabilizadores.

La adición de las proteasas a composiciones de limpieza convencionales no crea ninguna limitación especial de uso. Dicho de otro modo, cualesquiera temperaturas y pH adecuados para el detergente son adecuados también para las presentes composiciones con tal que el pH esté dentro del intervalo arriba indicado, y la temperatura sea inferior a la temperatura de desnaturalización de la proteasa descrita. Adicionalmente, las proteasas pueden utilizarse en una composición de limpieza sin detergentes, sea, una vez más, solas o en combinación con mejoradores y estabilizadores.

La presente invención se refiere también a composiciones de limpieza que contienen variantes de proteasa. Las composiciones de limpieza pueden contener adicionalmente aditivos que se utilizan de modo habitual en composiciones de limpieza. Éstos pueden seleccionarse, pero sin carácter limitante, de blanqueantes, agentes tensioactivos, mejoradores, enzimas y catalizadores de blanqueo. Resultaría fácilmente evidente para una persona con experiencia ordinaria en la técnica qué aditivos son adecuados para inclusión en las composiciones. La lista proporcionada en esta memoria no es en modo alguno exhaustiva y debería tomarse sólo como ejemplos de aditivos adecuados. Será también inmediatamente evidente para una persona con experiencia ordinaria en la técnica utilizar sólo aquellos aditivos que son compatibles con las enzimas y otros componentes de la composición, por ejemplo, agentes tensioactivos.

Cuando está presente, la cantidad de aditivo existente en la composición de limpieza es de aproximadamente 0,01% a aproximadamente 99,9%, con preferencia aproximadamente 1% a aproximadamente 95%, y de modo más preferible aproximadamente 1% a aproximadamente 80%.

Una composición detergente producida por los métodos de la presente invención puede utilizarse para tratar por ejemplo seda o lana como se describe en publicaciones tales como los documentos RD 216.034; EP 134.267; U.S. 4.533.359; y EP 344.259.

Lo que sigue se presenta a modo de ejemplo y no debe interpretarse como limitación del alcance de las reivindicaciones.

Ejemplo 1

Se produjeron y purificaron un gran número de variantes de proteasa utilizando métodos bien conocidos en la técnica. Todas las mutaciones se realizaron en la subtilisina GG36 de Bacillus lentus.

Las variantes de proteasa producidas se ensayaron respecto a eficiencia en dos tipos de detergente y condiciones de lavado utilizando un ensayo de ... descrito en "An improved method of assayen for a perferred enzyme and/or prefferred detergent composition", U.S. No. de serie 60/068796.

Las Tablas 1-13 enumeran las variantes de proteasas ensayadas y los resultados de los ensayos en dos detergentes diferentes. Todos los valores se dan como comparación a la primera proteasa que se muestra en la Tabla (es decir, un valor de 1,32 indica una capacidad para eliminar el 132% de la mancha en la posición al 100% de la primera variante incluida en la tabla).

La columna A muestra la diferencia de carga de una variante. Para la columna B, el detergente era 0,67 g/l de Ariel Ultra filtrado (Procter & Gamble, Cincinnati, OH, EE.UU.), en una solución que contenía 51,4 mg/l de dureza mixta Ca^{2+}/Mg^{2+}, y se utilizaron 0,3 ppm de enzima en cada pocillo a 25ºC (sistema con baja concentración de detergente). Para la columna C, el detergente era 3,38 g/l de Ariel Futur filtrado (Procter & Gamble, Cincinnati, OH, EE.UU.), en una solución que contenía 256,8 mg/l de dureza mixta ca^{2+}/Mg^{2+}, y se utilizaron 0,3 ppm de enzima en cada pocillo a 40ºC (sistema con alta concentración de detergente).

TABLA 1

						A	B	C
N76D	S103A	V104I	Q109R				1.00	1.00
N76D	S103A	V1041	Q109R	Q245R		+1	0.48	1.41

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TABLA 2

									A	B	C
V68A	N76D	S103A	V104I	G159D	Q236H	Q245H				1.00	1.00
V68A	N76D	S103A	V1041	G159D	N204D	Q236H	Q245R		-1	1.11	0.03

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TABLA 3

						A	B	C
V68A	N76D	S103A	V104I				1.00	1.00
T22K	V68A	N76D	S103A	V104I		+1	0.74	1.85

\newpage

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
\cr
\cr}

1

2

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\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
\cr}

3

\newpage

Ejemplo 2

Se fabricaron las variantes de proteasa siguientes y se ensayaron como se indica en el Ejemplo 1.

Las variantes indicadas en la Tabla 14 son variantes de proteasa que tienen ambos tipos de sustituciones: aquéllas que alteran la carga en una posición haciendo la carga más negativa o menos positiva, y aquéllas que alteran la carga en una posición haciendo la carga más positiva o menos negativa en comparación con B. lentus GG36, así como sustituciones neutras que no afectan a la carga en una posición de residuo dada. Esto produce variantes de proteasa que se comportan mejor que un estándar tanto en sistemas con baja concentración de detergente (columna A; 0,67 g/l de Ariel Ultra filtrado (Procter & Gamble, Cincinnati, OH, EE.UU.), en una solución que contenía 51,4 mg/litro de dureza mixta Ca^{2+}/Mg^{2+}, y se utilizaron 0,3 ppm de enzima en cada pocillo a 25ºC) y sistemas con alta concentración de detergente (columna B; 3,38 g/l de Ariel Futur filtrado (Procter & Gamble, Cincinnati, OH, EE.UU.), en una solución
que contenía 256,8 mg/litro de dureza mixta Ca^{2+}/Mg^{2+}, y se utilizaron 0,3 ppm de enzima en cada pocillo a 40ºC).

4

Claims (5)

1. Un método de mejorar la eficiencia de una subtilisina en un sistema con baja concentración de detergente que tiene menos de 800 ppm de componentes detergentes presentes en el agua de lavado, que comprende:

a)

sustituir un residuo de aminoácido en una o más posiciones en una subtilisina precursora para producir una variante de subtilisina en la cual la sustitución altera la carga en dicha posición haciendo la carga más negativa o menos positiva en comparación con el precursor; y

b)

ensayar la variante en un sistema con bajo contenido de detergente que tiene menos de 800 ppm de componentes detergentes presentes en el agua de lavado por comparación de la aptitud del precursor y la variante para eliminar una mancha.

2. Un método de mejora de la eficiencia de una subtilisina en un sistema con alta concentración de detergente que tiene más de 2000 ppm de componentes detergentes presentes en el agua de lavado, que comprende:

a)

sustituir un residuo de aminoácido en una o más posiciones en una subtilisina precursora para producir una variante de subtilisina en la cual la sustitución altera la carga en dicha posición haciendo la carga más positiva o menos negativa en comparación con el precursor; y

b)

ensayar la variante en un sistema con alto contenido de detergente que tiene más de 2000 ppm de componentes detergentes presentes en el agua de lavado por comparación de la aptitud del precursor y la variante para eliminar una mancha.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el cual el precursor es una subtilisina de Bacillus.

4. El método de acuerdo con la reivindicación 3, en el cual el precursor es subtilisina de Bacillus lentus.

5. Un método de producción de una composición detergente que comprende, habiendo mejorado la eficiencia de una subtilisina por producción de una variante de subtilisina por un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, formular dicha variante de subtilisina en una composición detergente en polvo o líquida que tiene un pH entre 6,5 y 12,0 para aproximadamente 0,1 hasta aproximadamente 5,0 en peso.