PT805853E

PT805853E - Indução controlada pela linhagem da diferenciação em células estaminais do mesênquima humano.

Info

Publication number: PT805853E
Application number: PT96903358T
Authority: PT
Inventors: Arnold I Caplan; Scott P Bruder; Stephen E Haynesworth
Original assignee: Univ Case Western Reserve
Priority date: 1995-01-24
Filing date: 1996-01-05
Publication date: 2007-06-27
Also published as: EP0805853A4; JP4454697B2; WO1996023059A1; DE69636979D1; EP1717310A1; CA2211120C; US5736396A; MX9705612A; AU4746996A; JPH10512756A; CA2211120A1; JP5173982B2; ES2285710T3; US5942225A; AU719098B2; DE69636979T2; ATE357508T1; EP0805853B1; EP0805853A1; JP2010012331A

Description

DESCRIÇÃO "INDUÇÃO CONTROLADA PELA LINHAGEM DA DIFERENCIAÇÃO EM CÉLULAS ESTAMINAIS DO MESÊNQUIMA HUMANO" A presente invenção proporciona métodos para levar células estaminais do mesênquima cultivadas in vitro a diferenciarem-se numa linha celular especifica antes ou na altura da sua implantação para o tratamento terapêutico de estados patológicos em humanos e outras espécies.

As células estaminais do mesênquima (MSC) são as células do tipo blastos ou embrionárias pluripotentes formativas encontradas na medula óssea, sangue, derme e periósteo que são capazes de se diferenciarem em tipos específicos de tecidos de mesênquima ou conjuntivos, incluindo os tecidos adiposo, ósseo, cartilaginoso elástico, muscular e conjuntivos fibrosos. A via específica de diferenciação que estas células iniciam depende de várias influências a partir de influências mecânicas e/ou factores endógenos bioactivos, tais como factores de crescimento, citocinas e/ou condições microambientais locais estabelecidas por tecidos hospedeiros. Embora estas células estejam normalmente presentes em frequências muito baixas na medula óssea, um processo para isolar, purificar e mitoticamente expandir a população destas células em cultura de tecidos é reportado em Caplan et al. Patentes U.S. N° 5197985 e 5226914.

Em organismos pré-natais, a diferenciação de MSC em células de tecido conjuntivo especializadas está bem estabelecida; por 1 exemplo, células do mesênquima de gémula de limbo de pinto, murganho ou humanas embrionárias diferenciam-se em cartilagem, osso e outros tecidos conjuntivos (1-5). Adicionalmente, uma linha celular calvária clonal de feto de rato demonstrou diferenciar-se em músculo, gordura, cartilagem e osso (6) . A existência de MSC em organismos pós-natais não foi estudada exaustivamente com o objectivo de demonstrar a diferenciação de células pós-embrionárias em vários fenótipos mesodérmicos. Os poucos estudos que foram realizados envolvem a formação de osso e cartilagem pelas células da medula óssea após o seu encaixotamento em câmaras de difusão e transplantação in vivo (7, 8). Recentemente, células derivadas de medula óssea de coelhos jovens (800-1000 g) demonstraram formar células adipociticas e osteogénicas in vivo (9) e células clonadas de estroma de medula óssea de murganhos pós-natais demonstraram formar células de adipócitos e osteogénicas (10) . De igual modo, foram isoladas células de periósteo de galinha expandidas em cultura e em condições de elevada densidade in vitro, demonstraram diferenciar-se em cartilagem e osso (11) . Células do mesênquima derivadas de medula óssea de rato demonstraram possuir a capacidade para se diferenciarem em osteoblastos e condrócitos quando implantadas in vivo (12, 6). Células de várias fontes de medula de organismos pós-natais nunca demonstraram exibir propriedades miogénicas, sendo a aparência multinuclear a caracteristica mais facilmente reconhecida em cultura.

Num primeiro aspecto, a invenção proporciona um método para realizar a indução controlada pela linhagem de células estaminais do mesênquima humanas isoladas expandidas por cultura, que compreende colocar em contacto células estaminais do mesênquima ex vivo com um factor bioactivo ou combinação de 2 factores eficazes para induzir a sua diferenciação in vitro numa linhagem do mesênquima condrogénico. As células são colocadas em contacto ex vivo com um ou mais factores bioactivos neste aspecto, proporcionando assim um método livre de quaisquer riscos que possam ser associados com a administração in vivo de quaisquer factores bioactivos.

Noutro aspecto, o método da invenção proporciona ainda administrar, a um indivíduo em sua necessidade, células estaminais do mesênquima humanas isoladas expandidas em cultura e um factor bioactivo eficaz para induzir a diferenciação dessas células numa linhagem de mesênquima condrogénico. De um modo preferido, as células estaminais do mesênquima e factor bioactivo são administrados em conjunto ou podem, alternativamente ser administradas separadamente. Particularmente este aspecto do método compreende administrar o factor bioactivo a um indivíduo ao qual foi está a ser ou será administrada uma preparação compreendendo células estaminais do mesênquima humanas isoladas autólogas.

Noutro aspecto, a invenção proporciona um método para induzir a produção in vivo de citocinas humanas num indivíduo em sua necessidade, que compreende administrar ao indivíduo células estaminais do mesênquima humanas isoladas expandidas em cultura e um factor bioactivo eficaz para induzir essas células a diferenciarem-se numa linhagem de mesênquima produtora de citocina descendente nesse indivíduo. De um modo preferido, as células estaminais do mesênquima e o factor bioactivo são administrados em conjunto ou podem, alternativamente, ser administrados separadamente. 3

Em exemplos específicos preferidos destes aspectos, o factor bioactivo é uma proteína morfogenética de osso e os MSC humanos são dirigidos à linhagem condrogénica. A Figura 1 ilustra, num diagrama, o processo mesengénico pelo qual as células estaminais do mesênquima se diferenciam em várias vias de linhagem. A Figura 2 ilustra, num diagrama, a via de diferenciação osteogénica. A Figura 3 demonstra graficamente o aumento na actividade de fosfatase alcalina como uma função do tempo em culturas, nos estudos iniciais relatados no Exemplo de Referência 1. A Figura 4 apresenta os resultados dos estudos subsequentes relatados no Exemplo de Referência 1. A Figura 5 ilustra em diagrama, a via de diferenciação condrogénica. A Figura 6 apresenta a extensão da expressão da citocina de células estaminais do mesênquima humanas, com e sem estimulação de interleucina-1, com base nas experiências no Exemplo de Referência 4.

Figuras 7A e 7B. (A) Micrografia de contraste de fase de cultura viva de MSC apresentando células multinucleadas derivadas após exposição a 5-aza-CR. Esta micrografia apresenta uma cultura de 2 semanas após tratamento com 10 μΜ de 4 5-aza-CR. Podem ser observados muitos núcleos (setas) na célula, mas as estrias não são perceptiveis. (B) Micrografia de contraste de fase de culturas vivas de células normais de músculo de rato fetal, preparadas a partir dos membros traseiros de fetos de rato com 17 dias de idade. Tal como com os miotubos derivados de MSC de medula óssea, não foram notadas estrias perceptiveis. Barra de escala 50 pm.

Figura 8: Coloração de imunofluorescência para miosina especifica de músculo em miotubos derivados de MSC de medula óssea de rato após exposição a 5-aza-CR. Os anticorpos de miosina não visualizam estrias cruzadas, mas os anticorpos iluminam claramente fibras longitudinais. Barra de escala 30 pm.

Figuras 9A-9D: Miotubos derivados de MSC de medula óssea de rato 2 semanas [ (A) e (B) ] e 5 semanas [ (C) e (D) ] após exposição a 5-aza-CR. Micrografia de contraste de fase [ (A) e (C)] e coloração de imunofluorescência para miosina [(B) e (D)]. (A) e (B), (C) e (D) são os mesmos campos visuais. Os miotubos 2 semanas após exposição a 5-aza-CR são corados com anticorpo anti-miosina, mas as de 5 semanas após exposição não são. Barra de escala 50 pM.

Figuras 10A-10B: Micrografia dos MSC tratados com 5-aza-CR contendo gotículas no seu citoplasma; esta cultura foi corada com Negro do Sudão. (A) Foram observados aglomerados de adipócitos (setas); barra de escala 200 pM. (B) Gotículas são coradas de castanho a preto (setas), o que sugere que estas gotículas sejam lípidos; barra de escala 100 pM. 5

Figura 11: Micrografia de contraste de fase de culturas vivas de células miogénicas derivadas de MSC de medula óssea de rato após exposição a 5-aza-CR. Após exposição a 5-aza-CR estas células foram cultivadas com 4 ng/mL de bFGF durante 10 dias. Podem ser observados miotubos grandes; barra de escala 300 pm.

As Figuras 12A-12D ilustram graficamente a expressão de G-CSF, GM-CSF, M-CSF e SCF, respectivamente, observada nas experiências relatadas no Exemplo de Referência 6.

As Figuras 13A-13C ilustram graficamente a expressão de LIF, IL-6 e IL-11, respectivamente, observadas nas experiências relatadas no Exemplo de Referência 6. A Figura 14 ilustra graficamente a indução de IL-la dependente da dose da expressão de GM-CSF, observada nas experiências relatadas no Exemplo de Referência 6.

Esta invenção possui múltiplas utilizações e vantagens . A primeira reside na capacidade para dirigir e acelerar a diferenciação de MSC antes da implantação de volta aos hospedeiros autólogos. Por exemplo, as MSC que são dirigidas in vitro para se tornarem células osteogénicas irão sintetizar matriz do osso num local de implante mais rapidamente e uniformemente do que as MSC que devem, primeiro, ser recrutadas na linhagem e, depois, progredir através dos passos de diferenciação chave. Um tal tratamento ex vivo também proporciona a aplicação uniforme e controlada de factores bioactivos para MSC purificados, conduzindo ao compromisso de diferenciação da linhagem uniforme. A disponibilidade de 6 factores endógenos bioactivos in vivo não pode ser prontamente assegurada ou controlada. Um passo de pré-tratamento, tal como é aqui revelado, ultrapassa isto. Adicionalmente, pré-tratando as MSC antes da implantação, são evitados efeitos colaterais potencialmente prejudiciais associados à administração sistémica ou local de factores bioactivos exógenos. Outra utilização desta técnica reside na capacidade para dirigir a regeneração de tecidos com base no estádio de diferenciação em que as células estão no momento da implantação. Isto é em relação ao osso e cartilagem, o estádio das células na implantação pode controlar o tipo de tecido final que se forma. Os condrócitos hipertróficos irão mineralizar a sua matriz e eventualmente, facilitar o caminho para a invasão vascular que resulta, finalmente, na formação de osso novo. Claramente, MSC implantadas com o objectivo de restaurar cartilagem hialina normal não devem prejudicar a linhagem total. Todavia, os implantes que são designados para reparar os defeitos na superfície articular e no osso sub-condral subjacente iriam beneficiar de um sistema de dois componentes em que as células na área do futuro osso são dirigidas ex vivo para se tornarem condrócitos hipertróficos enquanto as células na área da futura superfície de articulação são dirigidas apenas para se tornarem condroblastos. Na área da reconstituição do estroma, o controlo da diferenciação ex vivo pode optimizar as populações de células de MSC para a elaboração de requisitos de citocinas especificas para o estádio, para as necessidades do indivíduo. A morfogénese do músculo pode, de modo semelhante, ser dirigida para criar fibras de contracção rápida ou lenta, dependendo da indicação. 7

Isolamento e Purificação de Células Estaminais Humanas do

Mesênquima

As células estaminais do mesênquima humanas isoladas e purificadas como aqui descrito podem ser derivadas, por exemplo, da medula óssea, sanque, derme ou periósteo. Quando obtidas da medula óssea esta pode ser medula de uma variedade de fontes diferentes, incluindo rolhões de bocados de osso canceloso da cabeça do fémur, obtidas de doentes com doença deqenerativa da articulação durante cirurqia de substituição da anca ou joelho, ou de medula aspirada, obtidas de dadores normais e doentes de oncologia a quem foi recolhida medula para futura transplantação de medula óssea. A medula recolhida é então, preparada para cultura de células. 0 processo de isolamento envolve a utilização de um meio especialmente preparado que contém agentes que permitem não apenas o crescimento de células estaminais do mesênquima sem diferenciação, mas também a aderência directa apenas das células estaminais do mesênquima à superfície de plástico ou vidro do frasco de cultura. Criando um meio que permite a ligação selectiva das células estaminais do mesênquima desejadas que estavam presentes nas amostras de tecido de mesênquima em várias quantidades diminutas, tornou-se então possível separar as células estaminais do mesênquima das outras células (i. e. células de glóbulos vermelhos e brancos, outras células do mesênquima diferenciadas etc.) presentes no tecido do mesênquima de origem. A medula óssea é o tecido mole que ocupa as cavidades medulares dos ossos longos, alguns canais haversianos e espaços entre as trabéculas de osso canceloso ou esponjoso. A medula óssea é de dois tipos: vermelha, que se encontra em todos os ossos na vida precoce e em localizações restritas na vida adulta (i. e. no osso esponjoso) e está relacionada com a produção de células de glóbulos vermelhos (i. e. hematopoiese) e hemoglobina (consequentemente, a cor vermelha); e amarela, que consiste em grande parte em células gordas (consequentemente, a cor amarela) e tecido conjuntivo.

Como um todo, a medula óssea é um tecido complexo compreendido por células hematopoiéticas, incluindo as células estaminais hematopoiéticas e células de glóbulos vermelhos e brancos e seus precursores; e um grupo de células incluindo células estaminais do mesênquima, fibroblastos, reticulócitos, adipócitos e células endoteliais que contribuem para a rede de tecido conjuntivo denominada "estroma". As células do estroma regulam a diferenciação de células hematopoiéticas através da interacção directa via proteínas da superfície celular e a secreção de factores de crescimento e estão envolvidas na fundação e apoio da estrutura do osso. Estudos utilizando modelos animais sugeriram que a medula óssea contém células "pré-estroma" que possuem a capacidade para se diferenciarem em cartilagem, osso e outras células de tecido conjuntivo. (Beresford, J.N.: Osteogenic Stem Cells and the Stromal System of Bone and Marrow, Clin. Orthop., 240:270, 1989). Resultados recentes indicam que estas células, denominadas células estaminais pluripotentes do estroma ou células estaminais do mesênquima, possuem a capacidade para se desenvolverem em vários tipos diferentes de linhas celulares (i. e., osteócitos, condrócitos, adipócitos etc.) após activação, dependendo da influência de uma variedade de factores bioactivos. Todavia, as células estaminais do mesênquima estão presentes no tecido em várias quantidades diminutas, com uma vasta variedade de outras células (i. e. eritrócitos, plaquetas, neutrófilos, linfócitos, monócitos eosinófilos, basófilos, adipócitos etc.). 9

Como resultado, foi desenvolvido um processo para isolar e purificar células estaminais do mesênquima humanas do tecido antes da diferenciação e, depois da cultura expandir as células estaminais do mesênquima para produzir uma ferramenta valiosa para terapêutica do músculo esquelético. 0 objectivo dessa manipulação é o de aumentar fortemente o número de células estaminais do mesênquima e utilizar estas células para redireccionar e/ou reforçar a capacidade reparadora normal do corpo. As células estaminais do mesênquima são expandidas até números elevados e aplicadas a áreas de lesão do tecido conjuntivo, para aumentar ou estimular o crescimento in vivo para regeneração e/ou reparação, para melhorar a adesão do implante para vários dispositivos prostéticos através da activação e diferenciação subsequentes, ou aumentar a produção de células hemopoiéticas etc.

Ao longo destas linhas estão contemplados vários processos para transferir, imobilizar e activar as células estaminais do mesênquima expandidas em cultura, purificadas no local para reparação, implantação etc., incluindo injectar as células no sitios de uma deficiência esquelética, incubando as células com uma prótese e implantar a prótese etc. Assim, isolando, purificando e expandindo fortemente o número de células antes da diferenciação e depois controlando activamente o processo de diferenciação em virtude do seu posicionamento no sitio da lesão do tecido ou pré-tratando in vitro antes da sua transplantação, as células estaminais do mesênquima expandidas por cultura podem ser utilizadas para vários objectivos terapêuticos, tais como para aliviar distúrbios celulares, moleculares e genéticos num grande número de doenças metabólicas do osso, displasias esqueléticas, defeitos de cartilagem, lesões do ligamento e dos 10 tendões e outros distúrbios do músculo esquelético e tecido conjuntivo.

Foram preparados vários meios que são particularmente bem adequados para a liqação selectiva desejada e são aqui referidos como "Meios Completos" quando suplementados com soro, como descrito abaixo. Um desses meios é uma versão melhorada do Meio de Eagle Modificado por Dulbecco-Baixa Glucose (DMEM-LG), que é bem conhecido e prontamente disponível comercialmente. A formulação comercial é suplementada com 3700 mg/L de bicarbonato de sódio e 10 mL/L de de antibiótico-antimicótico lOOx contendo 10000 unidades de penicilina (base), 10 000 pg de estreptomicina (base) e 25 pg de anfotericina B/mL utilizando penicilina G (sal de sódio), sulfato de estreptomicina e anfotericina B como FUNGIZONE® em soro fisiológico a 0,85%. O meio descrito acima é preparado e armazenado em 90 mL ou 450 mL por frascos de 100 mL ou de 500 mL a 4 °C até estarem prontos para utilização. Para utilização, é adicionado 10 mL ou 50 mL de soro bovino fetal (de lotes seleccionados) aos frascos de meios para proporcionar um volume final de soro a 10%. O meio é aquecido até 37 °C antes da utilização. A este respeito, também se verificou que o meio BGJb (Gibco, Grand Island, NY) com lotes testados e seleccionados de soro bovino fetal a 10% (J.R. Scientific, Woodland, CA, ou outros fornecedores) era bem adequado para utilização na invenção. Este meio, que também era um "Meio Completo", continha factores que também estimularam o crescimento de células estaminais do mesênquima sem diferenciação e permitiu a ligação selectiva através de sítios de ligação a proteína específicos etc. apenas 11 das células estaminais do mesênquima para as superfícies de plástico de placas de Petri.

Adicionalmente, verificou-se que o meio Mistura de Nutrientes F-12 (Ham) (Gibco, Grand Island, NY) exibiu as propriedades desejadas para a separação de células estaminais do mesênquima selectivas.

Como indicado acima, o meio completo pode ser utilizado num número de processos de isolamento diferentes, dependendo do tipo especifico de processos de recolha iniciais utilizados de modo a preparar a medula óssea recolhida para separação de culturas de células. A este respeito, quando os rolhões da medula óssea cancelosa foram utilizados, a medula foi adicionada ao meio completo e agitada em vórtice para formar uma dispersão que foi então centrifugada para separar as células da medula de pedaços de osso etc. As células da medula (consistindo predominantemente em células de glóbulos vermelhos e brancos e uma quantidade muito diminuta de células estaminais do mesênquima etc.) foram então dissociadas em células únicas passando sequencialmente o meio completo contendo as células da medula através de seringas ajustadas a uma série de agulhas de calibre 16, 18 e 20.

Acredita-se que a vantagem produzida através da utilização do processo de separação mecânica em oposição a qualquer processo de separação enzimática, foi que o processo mecânico produziu pouca alteração celular enquanto que um processo enzimático pode produzir lesão celular, particularmente para os sitios de ligação à proteína necessários para aderência de culturas e separação selectiva e/ou para os sítios de proteína necessários para a produção de anticorpos monoclonais específicos para as referidas células estaminais do mesênquima. A suspensão de células únicas (que foi preparada a partir de aproximadamente 12 50-100 χ 106 células nucleadas) foi, então, plaqueada subsequentemente em placas de 100 mm para o objectivo de separar selectivamente e/ou isolar as células estaminais do mesênquima a partir das células restantes encontradas na suspensão.

Quando foi utilizada medula aspirada como a fonte das células estaminais do mesênquima humanas, as células estaminais da medula (que continham poucas ou nenhumas lascas de osso mas uma grande quantidade de sangue) foram adicionadas ao meio completo e fraccionadas com gradientes de Percoll (Sigma, St. Louis, MO) mais particularmente descritos abaixo no Exemplo de Referência 1. Os gradientes de Percoll separaram uma grande percentagem das células de glóbulos vermelhos e as células hematopoiéticas mononucleadas da fracção de plaquetas de baixa densidade que continham as células estaminais do mesênquima derivadas da medula. A este respeito, a fracção de plaquetas, que continha aproximadamente 30-50 χ 106 células foi preparada a partir de uma quantidade indeterminada de plaquetas, 30-50 χ 106 células nucleadas e apenas cerca de 50-500 células estaminais do mesênquima dependendo da idade do dador de medula. A fracção de plaquetas de baixa densidade foi então plaqueada na placa de Petri para separação selectiva com base na aderência das células. A este respeito, as células da medula obtidas quer do osso canceloso ou do aspirado do iliaco (i. e., as culturas primárias) foram cultivadas em meio completo e deixadas aderir à superfície das placas de Petri durante um a sete dias, de acordo com as condições apresentadas abaixo no Exemplo de Referência 1. Uma vez que se observou uma ligação às células mínima após o terceiro dia, foi escolhido três dias como o período de tempo convencional no qual as células não aderentes foram removidas 13 das culturas substituindo o meio completo original com meio completo fresco. Foram realizadas alterações de meio subsequentes a cada quatro dias até que as placas de cultura se tornassem confluentes, o que normalmente necessitaria de 14-21 dias. Isto representou um aumento de 103-104 vezes no número de células estaminais do mesênquima humanas indiferenciadas.

As células foram então separadas das placas de cultura utilizando um agente de libertação, tal como tripsina com EDTA (ácido etilenodiaminatetra-acético) (tripsina a 0,25%, EDTA a 1 mM (IX), Gibco, Grand Island, NY) . O agente de libertação foi então inactivado e as células estaminais do mesênquima separadas cultivadas de forma indiferenciada, foram lavadas com meio completo para utilização subsequente. A capacidade destas células indiferenciadas para entrar em vias de linhagem discreta é referida como o processo mesengénico e é representado no diagrama da Figura 1. No processo mesengénico, as MSC são recrutadas para entrar nas vias especificas de linhagem de passos múltiplos que eventualmente, produzem tecidos funcionalmente diferenciados, tal como osso, cartilagem, tendão, músculo, derme, medula óssea estroma e outros tecidos conjuntivos do mesênquima. Por exemplo, um esquema detalhado para a via de diferenciação das células que formam o osso é apresentado na Figura 2. Este mapa de linhagem implica a existência do indivíduo que controla os elementos que recrutam as MSC na linhagem osteogénica, promove a replicação pré-osteoblasto e dirige a diferenciação passo a passo em todo o processo até ao estádio de osteócito terminal. Foi relatado trabalho substancial que apoia a visão de que cada passo desta via complexa é controlada por diferentes factores bioactivos. 14

Foi desenvolvido um diagrama de linhagem semelhante para a diferenciação de condrócitos e é proporcionado na Figura 5. Novamente, a progressão de cada passo de linhagem está sob o controlo de factores bioactivos únicos incluindo, mas não estando limitado à família de proteínas morfogenéticas do osso. Cada modulador do processo de diferenciação, seja no osso, cartilagem, músculo, ou qualquer outro tecido de mesênquima, pode afectar a taxa de progressão da linhagem e/ou pode afectar especificamente os passos do indivíduo ao longo da via. Isto é, se uma célula que está desde o início comprometida com uma linhagem específica está num estado biossinteticamente activo, ou progride para um fenótipo de estádio final irá depender da variedade e escolha do momento certo de factores bioactivos no ambiente local.

Os potenciais da linhagem do osso e cartilagem (i. e., potencial osteocondrogénico) das células estaminais do mesênquima humanas frescas e expandidas foram determinados utilizando dois ensaios diferentes in vivo em murganhos sem pêlo. Um ensaio envolveu a implantação subcutânea de cerâmicas de fosfato de cálcio poroso carregados com células estaminais do mesênquima cultivadas; o outro envolveu implantação peritoneal de câmaras de difusão inoculadas com células estaminais do mesênquima cultivadas. Os gradientes de Percoll da medula total e de fracções de aspirado separadas também foram analisados nestes ensaios in vivo. A avaliação histológica demonstrou a formação de osso e cartilagem nas cerâmicas implantadas com as células estaminais do mesênquima cultivadas, derivadas da cabeça do fémur e da cristã do ilíaco. As cerâmicas carregadas com células estaminais do mesênquima humanas a 5xl06 células/mL formaram osso nos poros enquanto que as cerâmicas carregadas com

células estaminais do mesênquima humanas a 10xl06 células/mL 15 formaram cartilagem nos poros. Embora a medula total não tenha demonstrado formar osso quando colocada como um enxerto de compósito com cerâmicas num sitio subcutâneo em murganhos sem pêlo, a quantidade de osso produzida é substancialmente menor do que a que se observa quando são utilizadas as células estaminais do mesênquima derivadas de medula, expandidas em cultura.

Estes resultados indicaram que, em certas condições, as células estaminais do mesênquima expandidas em cultura possuem a capacidade para se a diferenciarem em osso ou cartilagem quando incubadas como um enxerto em cerâmicas de fosfato de cálcio poroso. Os factores ambientais que influenciam as células estaminais do mesênquima a diferenciarem-se em células de osso ou cartilagem parecem em parte, ser a acessibilidade directa das células estaminais do mesênquima a factores de crescimento e nutrientes fornecidos pela vasculatura em cerâmicas de fosfato de cálcio poroso; células que estão intimamente associadas com a diferenciação da vasculatura em células de osso enquanto que as células que são isoladas a partir da vasculatura se diferenciam em células da cartilagem. A exclusão da vasculatura dos poros de cerâmicas carregadas com células estaminais do mesênquima humanas concentradas preveniu a diferenciação osteogénica e proporcionaram condições permissivas para a condrogénese.

Como um resultado, as células estaminais do mesênquima isoladas e expandidas em cultura podem ser utilizadas em certas condições especificas e/ou sob a influência de certos factores, a diferenciar-se e produzir o fenótipo celular desejado necessário para a reparação do tecido conjuntivo ou regeneração e/ou para a implantação de vários dispositivos prostéticos. Por exemplo, utilizando cubos de cerâmica porosa cheios com células estaminais do mesênquima humanas expandidas em cultura, a 16 formação do osso dentro dos poros das cerâmicas foi criada após incubações subcutâneas em hospedeiros imunocompativeis. Num estudo recente (13), foi utilizada medula de rato num enxerto de compósito com cerâmica porosa para encher um defeito de segmento no fémur do rato. 0 osso demonstrou encher os poros da cerâmica e ancorar o enxerto cerâmica-medula ao osso hospedeiro.

Factores que estimulam a osteogénese (i. e. são osteoindutivas) a partir de células estaminais do mesênquima humanas isoladas estão presentes em várias classes de moléculas, incluindo as seguintes: proteínas morfogénicas do osso, tais como BMP-2 (14) e BMP-3 (15); factores de crescimento, tais como o factor de crescimento básico de fibroblastos (bFGF); glucocorticóides, tal como dexametasona (16); e prostaglandinas, tal como prostaglandina EI (22). Outro ácido ascórbico e seus análogos, tais como ácido ascórbico-2-fosfato (17) e fosfatos de glicerol, tal como β-glicerofosfato (18) são factores adjuntos eficazes para diferenciação avançada embora isoladamente não induzam diferenciação osteogénica.

Os factores que possuem actividade condroindutiva em MSC humanas estão também presentes em várias classes de moléculas, incluindo os seguintes: compostos dentro da superfamília do factor-β de crescimento de transformação (TGF-b), tais como (i) TGF-βΙ (19), (ii) Inibina A (20), (iii) factor da actividade de estimulação condrogénica (CSA) (21) e (iv) proteínas morfogénicas do osso, tal como BMP-4 (22) ; moléculas de matriz de colagénio extracelular, incluindo colagénio de tipo I, particularmente como um gel (23); e análogos da vitamina A, tais como ácido retinóico (24). 17

Factores que possuem actividade indutiva estromagénica em MSC humanas também estão presentes em várias classes de moléculas especialmente as interleucinas, tais como IL-Ia (25) e IL-2 (26).

Factores que possuem actividade indutiva miogénica em MSC humanas também estão presentes em várias classes de moléculas especialmente análogos de citidina, tais como 5-azacitidina e 5-aza-2'-desoxicitidina. 0 efeito destes factores de modulação em MSC humanas é aqui revelado pela primeira vez. Esta não representa uma listagem totalmente exaustiva de factores de modulação potencialmente úteis para induzir a diferenciação numa linhagem particular, mas ilustra a variedade de compostos que possuem actividade biológica útil para o objectivo de promover a progressão passo-a-passo da diferenciação de células estaminais do mesênquima humanas isoladas.

Exemplo de Referência 1

Diferenciação Osteogénica Induzida de MSC In Vitro 0 objectivo das experiências descritas neste exemplo foi demonstrar que as células estaminais do mesênquima (MSC) foram dirigidas, ao longo da via de linhagem osteogénica, in vitro, proporcionando factores bioactivos apropriados no meio de cultura de tecidos. Este conjunto de experiências ilustra apenas um exemplo sobre como as MSC podem ser dirigidas ao longo da linhagem osteogénica. 18

Estudo Inicial

As MSC humanas foram recolhidas e isoladas da medula óssea como descrito acima. Estas células foram expandidas por cultura em meio DMEM-LG contendo soro bovino fetal pré-seleccionado a 10% (Meio Completo). O Meio Completo fresco foi substituído a cada 3-4 dias até que as culturas estivessem próximo da confluência, altura em que as células foram libertadas das placas com tripsina e re-semeadas em novas placas a aproximadamente 40% de confluência (400000 células por placa de 100 mm) . Estas MSC replaqueadas foram deixadas a ligar durante a noite, após o que o Meio Completo foi substituído por um meio composto por DMEM-LG, soro bovino fetal a 10% e quer dexametasona a 100 nM isoladamente, ou dexametasona a 100 nM com ácido ascórbico-2-fosfato a 50 μΜ e 10 mM β-glicerofosfato (Suplemento Osteogénico). O Suplemento Osteogénico foi substituído a cada 3 dias. As células foram examinadas diariamente para alterações morfológicas. As placas foram então analisadas para actividade de fosfatase alcalina na superfície celular (AP) , um marcador para células que entraram na linhagem osteogénica. São estas células que foram subsequentemente responsáveis por sintetizar a matriz osteóide. Foram utilizados reagentes enzimáticos convencionais de histoquímica e bioquímica para demonstrar a actividade desta proteína de superfície celular. Foram avaliados espécimes adicionais para a presença de nódulos de matriz extracelular mineralizada que estão correlacionados com a diferenciação continuada e expressão fenotípica de uma população de osteoblastos madura. A precipitação do nitrato de prata em cristais de fosfato de cálcio no nódulo do osso foi alcançada através da técnica de coloração de Von Kossa convencional. 19

Os resultados indicam que após apenas três dias de exposição a dexametasona, as MSC em cultura já tinham começado a expressar fosfatase alcalina na sua superfície. Aos seis dias de cultura, aproximadamente 80% das células foram positivas para AP. A organização grosseira da placa de cultura alterou-se desde espirais quase confluentes de células tipo fibroblasto ao dia 1, até numerosas áreas de células poligonais que se foram empilhando umas em cima das outras. Pelo dia 9, muitos nódulos pequenos da matriz extracelular bi-refringente estavam associados com estes focos de células poligonais dispostas em camadas. Estas áreas foram coradas positivamente pelo método de Von Kossa para minerais. As culturas de controlo alimentadas apenas com Meio Completo nunca desenvolveram estes nódulos de osso mineralizado e apenas raramente contiveram células positivas para AP. Em contraste, as MSC tratadas com Suplemento Osteogénico adquiriram uniformemente actividade de AP e sintetizaram nódulos de matriz extracelular mineralizada ao longo da placa. Embora não sejam eles próprios osteoindutivos, a presença de ácido ascórbico-2-fosfato e β-glicerofosfato no Suplemento Osteogénico completo apoia ainda a maturação da matriz extracelular e a deposição mineral, respectivamente. A Figura 3 demonstra graficamente o aumento em actividade da enzima fosfatase alcalina como uma função do tempo em cultura. Ao dia 8 e para além deste, observa-se substancialmente mais actividade enzimática em células expostas a Suplementos Osteogénicos (OS) do que nas cultivadas com meio de controlo.

Considerados em conjunto estes estudos demonstram que as MSC podem ser estimuladas rapidamente e uniformemente a diferenciarem-se ao longo da linhagem osteogénica in vitro. Para além disso, não são apenas recrutadas as MSC para os passos precoces na linhagem evidenciado pela expressão de AP, mas as 20 MSC progridem através da linhagem para se tornarem osteoblastos maduros que segregam e mineralizam uma matriz extracelular tipo osso. Resultados adicionais para isto surgem da observação de que quando as MSC de galinha são tratadas com Suplemento Osteogénico, progridem ao longo dos estádios da linhagem osteogénica apresentados na Figura 2, como determinado pela coloração de anticorpos monoclonais contra antigénios de superfície celular específicos para o estádio.

Estudo Subsequente foram contados os números de nódulos mineralizados por poço. Os ensaios foram realizados a cada 4 dias durante o período de 16 dias da cultura. Foi realizado o Teste t de duas amostras emparelhadas em amostras seleccionadas. Os resultados na Figura 4 representam um doente embora tenham sido obtidos resultados semelhantes de todos os espécimes.

As MSC ligadas uniformemente às placas, assumiram a sua morfologia característica em forma de fuso e proliferaram para atingir a confluência dentro de 8 dias. Durante este período e particularmente para além deste, as células tratadas com OS desenvolveram uma morfologia cúbica como a sua densidade aumentada, formando camadas múltiplas. Para clareza, apenas aspectos seleccionados dos parâmetros acima descritos são representados graficamente na Figura 4. Todos os espécimes cultivados em BGJb+OS morreram no espaço de 3 dias enquanto que as culturas em BGJb sobreviveram durante a duração do protocolo. Por esta razão, todos os resultados com BGJb foram omitidos dos gráficos. As características principais do estudo demonstram substancialmente maior proliferação em aMEM em comparação com DMEM/F-12 ou DMEM isoladamente (i. e., p<0,01 e p<0,05 ao dia 16) . A adição de OS a culturas de aMEM inibiram a proliferação aos dias 8 e 12 (p<0,04 e p<0,03), mas não ao dia 16 (p>0,05) . αΜΕΜ+OS também estimula uma proporção significativa das células para expressarem AP na sua superfície quando comparada com MSC mantidas em DMEM (p<0,02 ao dia 8. p<0,01 ao dia 16). Todavia, não se observa diferença significativa na percentagem de células AP aMEM com e sem OS (p>0,2 ao dia 8, p>0,05 ao dia 16). Especialmente, αΜΕΜ+OS induz mais actividade de AP do que qualquer outro meio ao longo do período de cultura, incluindo aMEM ou DMEM (i. e., p<0,004 e p<0,002 ao dia 16). Todavia, não houve diferença na actividade de AP entre aMEM e DMEM+OS ao 22 longo do período do estudo (i. e., p>0,2 ao dia 16). De todos os meios testados, o número de nódulos mineralizados pelo dia 16 é maior em DMEM+OS (p<0,02 em comparação com DMEM).

Estas investigações demonstram que MSC humanas purificadas expandidas em cultura podem ser induzidas na linhagem osteogénica in vitro estabelecendo desse modo um modelo para a diferenciação de osteoblastos humanos. Precocemente no período de cultura (dia 8) apenas αΜΕΜ+OS induziu recrutamento osteoblástico de MSC substancial (>50%) , como observado pela coloração de AP na superfície celular. Pelo dia 16, todavia, todas as culturas excepto DMEM, continham >60% de células coradas com AP. Em todos os meios estudados, a adição de OS origina maior actividade de AP para além dos 4 dias. Embora uma grande percentagem de células na maioria dos meios fossem coradas com AP até ao dia 16, as diferenças substanciais no ensaio de actividade de AP reflecte, provavelmente, a quantidade de enzima na superfície celular e daí, o grau de progressão na linhagem osteoblástica. No mínimo, OS são capazes de regular positivamente a expressão deste marcador celular osteoblástico de superfície. De um modo interessante, apesar de menos actividade de AP, as células em DMEM+OS criaram mais nódulos mineralizados do que em αΜΕΜ+OS. Esta observação pode sugerir que dentro de um período de cultura de 16 dias, DMEM+OS apoia mais diferenciação osteogénica de MSC do que αΜΕΜ+OS. É possível que, dando mais tempo, as αΜΕΜ+OS fossem conter ainda mais focos mineralizados do que as de DMEM+OS. As diferenças nos meios que favorecem a manutenção do fenótipo MSC (DMEM) evidenciadas pela imunocoloração específica para MSC, ou o recrutamento máximo e indução para a linhagem osteogénica (αΜΕΜ+OS), observada pela percentagem de células positivas para AP e actividade de AP, são

inerentemente interessantes e garantem exame posterior. A 23 utilização de vários anticorpos monoclonais e policlonais contra componentes específicos para a célula e a matriz durante este fenómeno indutivo está presentemente a decorrer e irá proporcionar maior conhecimento sobre a natureza molecular do processo de diferenciação in vitro.

Exemplo de Referência 2 A Formação de Anticorpos Monoclonais Contra Células Osteogénicas Humanas Revela a Formação de Osso Embrionário In Vivo e a Diferenciação de Células Estaminais do Mesênquima Purificadas In Vitro

Foi bem estabelecido que as células progenitoras do mesênquima derivadas da medula óssea são capazes de se diferenciar em osteoblastos. Adicionalmente estas células estaminais do mesênquima (MSC) também deram origem a cartilagem, tendão, ligamento , músculo e outros tecidos. Todavia, o conhecimento dos passos envolvidos no compromisso e diferenciação de MSC ao longo destas várias linhagens foi restringida em parte, pela ausência de sondas especificas para as células em vários estádios nas vias de diferenciação osteogénicas ou outras. Uma vez que os anticorpos monoclonais foram sondas úteis para estudar a diferenciação, imunizaram-se murganhos com preparações de células vivas intactas de MSC derivadas de medula óssea humana induzidas na linhagem osteogénica in vitro. Rastrearam-se colónias de hibridoma contra MSC purificadas, MSC a sofrer diferenciação osteogénica e secções congeladas de membros humanos embrionários em que os ossos longos se desenvolvem em redor do rudimento da cartilagem.

Este protocolo de rastreio favorece a selecção de anticorpos que 24 reagem com MSC que estão a sofrer diferenciação in vitro e células humanas osteogénicas in vivo. Utilizando esta abordagem, criaram-se anticorpos monoclonais contra antigénios de superfície específicos para o estádio da linhagem em células osteogénicas derivadas de MSC de medula humana.

Utilizando técnicas publicadas, as MSC foram purificadas de 5 doentes diferentes (idades 28-46) expandidas em cultura (29) e cultivadas em DMEM-LG com FBS a 10% e "Suplementos Osteogénicos" (dexametasona a 100 nM, ácido ascórbico-2-fosfato a 50 μΜ e β-glicerofosfato a 10 mM (28) . Aos dias 3 e 6 da cultura, precocemente durante a expressão da fosfatase alcalina e antes da formação do nódulo mineralizado (30), as células foram libertadas das placas com EGTA a 5 mM. Aproximadamente 4 milhões de células aos dias 3 e 6 foram reunidas para cada uma de cinco imunizações semanais em murganhos Balbc/J. Utilizando técnicas convencionais, foram produzidos hibridomas monoclonais e os sobrenadantes da cultura foram rastreados por uma ELISA semiquantitativa contra MSC purificadas e MSC cultivadas durante 3 ou 6 dias com Suplementos Osteogénicos. Resumidamente, as MSC foram plaqueadas em placas de cultura de 96 poços expostas a Suplementos Osteogénicos e depois feitas reagir com sobrenadantes da cultura seguido por IgG anti-murganho de cabra conjugado com peroxidase de rábano. O anticorpo secundário foi lavado e foi adicionado substrato o-fenilenodiamina às placas. A ligação ao anticorpo monoclonal de murganho principal foi avaliada pela reacção colorimétrica quantificada por rastreio dos poços a 490 nm num leitor de placas de ELISA. As colónias de interesse foram seleccionadas com base na ligação diferencial para MSC de controlo e células osteogénicas derivadas de MSC. As colónias seleccionadas foram ainda rastreadas por imunofluorescência em secções congeladas não fixadas de membros 25 embrionários humanos. As colónias de hibridoma de interesse foram clonadas e foram realizadas análises imunocitoquimicas numa variedade de tecidos normais e derivados experimentalmente de fontes humanas, de rato, coelho, galinha e bovinas.

Perto de 10000 colónias de hibridoma foram rastreadas pelo protocolo de ELISA modificado acima descrito. Com base na ligação diferencial a MSC purificadas, ou MSC cultivadas durante 3 e 6 dias com Suplementos Osteogénicos, foram seleccionadas 224 colónias para rastreio por imunofluorescência contra membros embrionários humanos de 55-60 dias. A maioria destas 224 colónias ou reagiram com múltiplos tipos de tecido presentes no membro em desenvolvimento, ou não foram detectadas no osso em desenvolvimento. Até esse momento, tinham sido identificadas 9 colónias que demonstram imunorreactividade especifica em células da linhagem osteogénica. Os padrões de reactividade variam; alguns sobrenadantes de hibridoma reagem com uma grande população de células no colar osteogénico e periósteo contendo osteoprogenitor enquanto que outras reagem apenas com as células que parecem estar envolvidas activamente na síntese da matriz. Duas colónias de hibridoma parecem reagir com células osteogénicas assim como com condrócitos hipertróficos. Os resultados estão sumariados na Tabela 1. 26

Tabela 1

Linha de Células MSC de Cultura OS Cultura OS de de Hibridoma Controlo de 3 dias 6 dias 20E8 0 1 8 13C9 0 1 3 5D9 0 1 2 18H4 0 3 5 18D4 0 2 4 10F1 0 0 2 13B12 0 4 2

A Tabela 1 apresenta a imunorreactividade de colónias de hibridoma seleccionadas contra MSC não tratadas, ou MSC cultivadas com Suplementos Osteogénicos (OS) durante 3 ou 6 dias. Os números reflectem a quantidade relativa de anticorpo ligado no ensaio de ELISA acima descrito.

Estas investigações indicam a presença de marcadores de diferenciação da superfície celular específicos para o estádio osteogénico da linhagem humana, semelhantes aos detalhados para células osteogénicas de aves (31). A coloração de células osteogénicas nos membros em desenvolvimento suporta o ponto de vista de que as MSC cultivadas com Suplementos Osteogénicos se tornam "autênticos" osteoblastos em cultura. A diferenciação osteogénica in vitro é assim confirmada por sondas moleculares que se estendem para além dos critérios tradicionais da

expressão de AP e formação de nódulos mineralizados. A correlação de observações detalhadas in vitro com análises in vivo da expressão de antigénios será útil em futuros estudos de osteogénese. A caracterização dos elementos de cultura de 27 tecidos específicos, i. e., factores bioactivos, que promovem a progressão das células através dos passos da linhagem osteogénica será crucial. A identificação de antigénios da matriz da superfície celular osteogénica e/ou extracelular deve proporcionar maior conhecimento sobre a fisiologia celular do osso. Estes e outros anticorpos monoclonais presentemente sob investigação irão demonstrar utilidade em estudos futuros de diferenciação de MSC.

Exemplo 3

Diferenciação Condrogénica Induzida de MSC In Vitro 0 objectivo da experimentação descrita neste exemplo foi demonstrar que as células estaminais do mesênquima (MSC) foram dirigidas ao longo da via de linhagem condrogénica in vitro proporcionando factores bioactivos apropriados no meio da cultura de tecidos. Este conjunto de experiências representa apenas um exemplo de como as MSC podem ser dirigidas ao longo da linhagem condrogénica. As MSC humanas foram recolhidas e isoladas da medula óssea como descrito acima. As células foram expandidas em cultura em meio DMEM-LG contendo soro bovino fetal pré-seleccionado a 10% (Meio completo). O meio fresco foi substituído a cada 3-4 dias até que as culturas estivessem próximo da confluência em cuja altura as células foram libertadas das placas com tripsina e re-semeadas em novas placas a aproximadamente 50% de confluência (500000 células por placa de 100 mm). Estas MSC replaqueadas foram deixadas a ligar durante a noite, após o que o Meio Completo foi substituído por DMEM-LG com soro bovino fetal a 10% e 5 mg/mL de Proteína

Morfogénica de osso parcialmente purificada (Suplemento 28

Condrogénico), fornecido por Dr. Marshall R. Urist. Este Suplemento Condrogénico foi substituído a cada 3 dias. As células foram examinadas diariamente para as alterações morfológicas. As placas seleccionadas foram então analisadas imuno-histoquimicamente por CSPG-M, um marcador para células que tenham entrado na linhagem condrogénica. São estas células que foram então actuadas para sintetizar a matriz de colagénio de Tipo II da cartilagem. Foram utilizados reagentes de imuno-histoquímica convencionais para demonstrar a presença desta proteína da matriz extracelular. Foram avaliados espécimes adicionais para a presença de nódulos corados com Toluidina Azul que os correlacionava com a diferenciação continuada e expressão fenotípica de uma população de condrócitos maduros. A coloração de Von Kossa para a presença de nódulos mineralizados de condrócitos hipertróficos foi negativa.

Os resultados indicaram que após apenas três dias de exposição ao Suplemento Condrogénico, as MSC em cultura já tinham começado a expressar CSPG-M na sua matriz extracelular. A organização grosseira da placa de cultura tinha alterado de espirais de células do tipo fibroblastos ao dia 1, para numerosos focos de células de multi-camada redondas ou poligonais rodeadas por uma fina camada de células fibroblásticas assemelhando-se a um pericôndrio. A matriz extracelular destes nódulos foi fortemente imunorreactiva para colagénio de Tipo II. As culturas de controlo alimentadas apenas com Meio Completo nunca desenvolveram estes nódulos de cartilagem. Tomados em conjunto estes estudos demonstram que as MSC tinham sido estimuladas para se diferenciarem ao longo da linhagem condrogénica in vitro. Para além disso, as MSC não foram apenas recrutadas para os passos precoces na linhagem evidenciado pela expressão de CSPG-M, mas as MSC progrediram ao 29 longo da linhagem para se tornarem condrócitos maduros que segregaram matriz extracelular rica em colagénio de Tipo II. Até aqui, a diferenciação terminal de condrócitos derivados de MSC evidenciado por células hipertróficas numa matriz calcificada, não foi observada in vitro. Esta descoberta reflecte a necessidade para conceber um Suplemento Condrogénico especificamente dirigido para promover este passo de diferenciação terminal. Num facto interessante, Pacifici e seus colaboradores (32) criaram um meio contendo ácido retinóico que estimula a diferenciação terminal de condrócitos de galinha in vitro. 0 aditivo para o Meio completo que constitui o Suplemento Condrogénico no exemplo acima é apenas um dos factores conhecidos por estimularem a diferenciação celular condrogénica ou proliferação in vitro.

Exemplo de Referência 4

Diferenciação Induzida de Células do Estroma da Medula de MSC in vitro 0 objectivo da experimentação descrita neste exemplo foi demonstrar que as MSC humanas derivadas da medula foram dirigidas ao longo da via da linhagem estromagénica in vitro proporcionando factores bioactivos apropriados no meio de cultura. As MSC humanas derivadas da medula foram isoladas da medula óssea e expandidas em cultura como descrito acima. De modo a demonstrar a capacidade de MSC humanas para serem induzidas ao longo da linhagem de células de estroma da medula, a expressão de citocina especifica foi medida como um marcador 30 de diferenciação. As MSC foram cultivadas em condições que favorecem a proliferação de MSC sem diferenciação, utilizando meio consistindo em DMEM-LG contendo soro bovino fetal pré-seleccionado a 10% (Meio Completo), ou condições que favorecem a expressão e diferenciação no fenótipo do estroma da medula, utilizando meio compreendendo Meio Completo mais 10 U/mL de Interleucina-ΐα (IL-la) (Suplemento Estromagénico (SS)) . Os meios de cultura condicionados destas populações de cultura de tecidos foram analisados para a presença de citocinas utilizando bioensaios de ELISA em sanduíche comerciais (Sistemas R&D).

As citocinas que foram ensaiadas são aquelas que são conhecidas por serem segregadas por células do estroma e que influenciam a hematopoiese. Estas incluem interleucina-3 (IL-3), interleucina-6 (IL-6), factor de estimulação de colónias de granulócitos (G-CSF), factor de estimulação de colónias de granulócitos-macrófagos (GM-CSF), factor de células estaminais (SCF), factor de inibição de leucemia (LIF) e factor-beta-2 de transformação de crescimento (TGF-p2). Em cada caso, as MSC de segunda passagem foram plaqueadas em placas de cultura de 35 mm a uma densidade de aproximadamente 30% de confluência (30000 células por placa de 35 mm) . Após permitir ligação das células durante a noite, os meios de cultura foram removidos e substituídos com Meio Completo ou com Meio Completo mais Suplemento Estromagénico. A Figura 6 ilustra a expressão de citocina de MSC humanas nas duas condições de plaqueamento. Na ausência de IL-Ια, as MSC expressaram G-CSF, GM-CSF, LIF e SCF em níveis muito baixos, mas expressam IL-6 em elevada abundância. Em comparação, após 3 dias de estimulação de IL-la, foram detectados níveis dramaticamente mais elevados de citocinas para todas as espécies acima. As MSC não expressaram IL-3 ou TGF-p2 em nenhuma das duas condições de cultura. Estes 31 resultados demonstram que a IL-I-oc aumenta a expressão por MSC de um perfil de citocina que foi documentado como apoiando a diferenciação da célula estaminal hematopoiética e que é caracteristica de células diferenciadas do estroma da medula.

Exemplo de Referência 5

Diferenciação Miogénica Induzida de MSC In Vitro 0 objectivo do estudo descrito neste exemplo foi demonstrar que a 5-azacitidina induz as células estaminais do mesênquima (MSC) a diferenciarem-se ao longo da linhagem miogénica. 0 composto, 5-azacitidina (5-aza-CR; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) , um análogo da citidina, provoca hipometilação de alguma citosina no ADN que pode estar envolvido na activação de genes específicos para o fenótipo. As linhas celulares embrionárias de murganho, C3H/10T1/2 C18 e Swiss 3T3, após exposição a 5-aza-CR, demonstraram ser convertidas em 3 linhagens de células da mesoderme diferentes, mioblastos, adipócitos e condrócitos (33-34) . Em parte, parece que o mecanismo pelo qual 5-aza-CR activa os genes miogénicos envolve MyoDl (35-36) . Com o exposto acima em mente expuseram-se MSC derivados de medula óssea de rato a 5-aza-CR e focou-se a análise na sua conversão em fenótipos miogénicos.

0 fémur e a tíbia de ratos Fisher machos (Charles River, Indianapolis, IN) com um peso corporal médio de 100 g foram recolhidos e os tecidos moles aderentes foram removidos. Vários isolados de células de medula foram de ratos de 250 g. A dissecação meticulosa dos ossos longos para remover tecido mole 32 foi realizado para assegurar que os precursores miogénicos não foram realizados na preparação da medula. A este respeito, as células miogénicas nunca foram observadas em culturas de MSC não tratadas. Ambas as extremidades dos ossos foram cortadas e removidas das diáfises com tesouras de osso. Os rolhões de medula óssea foram expelidos hidrostaticamente dos ossos por inserção de agulhas de calibre 18, aplicados a seringas de 10 mL cheias com Meio Completo consistindo em DMEM contendo lotes seleccionados de soro de vitela fetal a 10% (FCS; IR Scientific Inc., Woodland, CA), soro de cavalo a 5% (HS; Hazleton Biologics Inc., Lenexa, KS) e antibióticos (Gibco Laboratories; penicilina G, 100 U/mL; estreptomicina, 100 pg/mL; anfotericina B, 0,25 pg/mL). As agulhas foram inseridas nas extremidades distais do fémur e extremidades proximais das tíbias e os rolhões de medula expelidos das extremidades opostas. Os rolhões de medula foram desagregados por passagem sequencial através de agulhas de calibre 18, calibre 20 e calibre 22 e estas células dispersas foram centrifugadas e ressuspensas duas vezes em Meio Completo. Após as células terem sido contadas num hemocitómetro, 5xl07 células em 7-10 mL de meio completo foram introduzidas em placas de petri de 100 mm. Três dias mais tarde, o meio foi mudado e as células não aderentes foram eliminadas. O meio foi completamente substituído a cada 3 dias. Aproximadamente 10 dias após a sementeira, as placas tornaram-se quase confluentes e as células aderentes foram libertadas das placas com tripsina a 0,25% em EDTA de sódio a 1 mM (Gibco Laboratories, Grand Island, NY), separação a 1:3 e semeadas em placas frescas. Após estas células de uma passagem se terem tornado quase confluentes foram recolhidas e utilizadas para as experiências descritas abaixo. Referem-se estas células como MSC derivadas da medula de rato. No total, foram utilizadas neste estudo 8 preparações separadas de MSC derivadas de medula de rato. As células foram cultivadas 33 de rotina em Meio Completo a 37 °C numa atmosfera humidificada de CO2 a 5%.

As MSC passadas duas vezes foram semeadas em placas de 35 mm a três densidades de células, 500, 5000 e 50000 células/placa. Começando a 24 h após a sementeira estas culturas foram tratadas durante 24 h com Meio Miogénico consistindo em meio completo contendo várias concentrações de 5-aza-CR. Após as culturas terem sido lavadas duas vezes solução de sais equilibrada de Tyrode (Sigma Chemical Co.), o meio foi mudado para meio completo sem 5-aza-CR adicionado e subsequentemente mudado duas vezes por semana até a experiência ter terminado, 40 dias após o tratamento. Como descrito em detalhe nos resultados, foram testadas várias condições de cultura para tentar optimizar os efeitos de 5-aza-CR especialmente para optimizar a miogénese.

Foram semeadas MSC de medula óssea de rato passadas duas vezes em placas de 35 mm a 5 000 células/placa e tratadas com quatro concentrações (0,1 μΜ, 0,3 μΜ, 1 μΜ e 10 μΜ) de 5-aza-2'-desoxicitidina (5-aza-dCR; Sigma Chemical Co.) do mesmo modo que descrito acima para 5-aza-CR. A vários tempos durante o tratamento, a morfologia das culturas foi observada.

As culturas vivas foram examinadas todos os dias com um microscópio de contraste de fase (Olympus Optical Co., Ltd., Tóquio, Japão) e eventualmente algumas das culturas foram fixadas para histologia ou imuno-histoquimica. As células de músculo foram primeiro identificadas morfologicamente em contraste de fase pela presença de miotubos multinucleados e subsequentemente imuno-histoquimicamente pela presença da

proteína específica do músculo esquelético, miosina. A contracção das células de músculo putativas foi estimulada por 34 uma gota de acetilcolina a 1 mM (Sigma Chemical Co.) em solução de Tyrode. Para imuno-histoquímica, as células cultivadas foram fixadas com metanol a -20 °C (Fisher Scientific Co., Fair Lawn, NJ) durante 10 min e incubadas com um anticorpo monoclonal de murganho contra miosina esquelética de contracção rápida de rato (Sigma Chemical Co.; fluido ascitico, diluição 1/400) em PBS (solução salina tamponada com fosfato, pH 7,4) contendo BSA a 0,1% (albumina de soro bovino; Sigma Chemical Co.). O segundo anticorpo foi IgG anti-murganho de ovelha conjugado com biotina (Organon Teknika Corp., West Chester, PA; diluição 1/50) seguido por tratamento com avidina conjugada com vermelho do Texas (Organon Teknika Corp.; diluição de 1/4000). Todas as incubações foram de 30 min à temperatura ambiente, cada um precedido por bloqueamento durante 5 min com PBS contendo BSA a 1%, seguido por duas lavagens de 5 min em PBS. As células foram montadas em Fluoromount-G (Fisher Biotech, Pittsburgh, PA) e observadas com um microscópio Olympus (BH-2) equipado para fluorescência e fotografadas com película Kodak TMAX 400.

As MSC de medula óssea de rato de segunda passagem foram plaqueadas em placas de 96 poços à diluição limitante de uma célula/poço; as células foram plaqueadas em meio consistindo em 50% de Meio Completo e 50% de meio condicionado que foi obtido de células da medula óssea de rato perto da confluência cultivadas em Meio completo durante 2 dias. De um total de 384 poços, foram detectadas 50 colónias; estas foram subcultivadas, mantidas e eventualmente 4 sobreviveram. Estes 4 clones foram tratados com 5-aza-CR como mencionado acima e classificados para morfologias miogénicas ou adipocíticas. Células da medula óssea de rato da primeira passagem foram expostas a 10 μΜ de 5-aza-CR durante 24 h e plaqueados em placas 35 de 96 poços a diluição limitante de uma célula/poço como acima. FOI determinado o número de clones que apresentaram adipócitos (positivos para Negro do Sudão) ou morfologias de células miogénicas multinucleadas.

Para comparar a capacidade de conversão de MSC de medula óssea para vários fenótipos de mesoderme com a de fibroblastos puros expuseram-se fibroblastos de cérebro de rato a 5-aza-CR ou a 5-aza-CdR. A massa encefálica total dos cérebros dos três ratos Fisher machos foi recolhida do interior dos crânios e cortada em pedaços pequenos com um bisturi afiado. Estes pedaços foram transferidos para um tubo de centrífuga cónico de 50 mL, centrifugados a 500 x g durante 10 min, ressuspensas em 10 mL de solução de sais equilibrada de Tyrode e homogeneizadas com um homogeneizador Dounce de ajuste lasso. O homogenato foi incubado com colagenase a 0,1% (CLS2, 247 U/mg; Worthington Biochemical Co., Freehold, NJ) a 37 °C durante 3 h, durante as quais foram agitadas em vórtice durante 30 seg a cada 30 min. Após tratamento, as células libertadas foram passadas através de um filtro Nitex de 110 pm, centrifugadas, ressuspensas em 10 mL de DMEM-LG de baixa glucose (Gibco Laboratories) contendo FCS a 10% e cultivadas em três placas de cultura de 100 mm a 37 °C numa incubadora de CO2. O meio foi mudado duas vezes por semana e as células foram cultivadas até que as placas atingissem a confluência.

Fibroblastos de cérebro de rato de terceira passagem foram semeados em placas de 35 mm a uma densidade de

50000 células/placa e tratadas com 1 μΜ, 3 μΜ ou 10 μΜ de 5-aza-CR ou 0,1 μΜ, 0,3 μΜ ou 1 μΜ de 5-aza-CdR do mesmo modo que MSC de medula de rato. Após 24 h, o meio foi mudado para DMEM-LG contendo FCS a 10%, HS a 5% e hidrocortisona a 50 nM sem 5-aza- 36 CR ou 5-aza-CdR adicionado e subsequentemente mudado duas vezes por semana até que a experiência tivesse terminado. Células miogénicas derivadas de MSC de medula óssea de rato foram comparadas com células miogénicas de rato fetal normal, uma vez que existe uma base de dados substancial para estas últimas. As células de músculo foram dissociadas dos músculos do membro traseiro de fetos de rato Fisher com 17 dias de idade com tripsina a 0,2% (Sigma Chemical Co.) em meio Tyrode sem cálcio e magnésio durante 35 min a 37 °C com agitação ocasional. Após terem sido passadas através de um filtro Nitex de 110 μιη, a concentração de fibroblastos foi reduzida incubando suspensões de células durante 30 min em placas de plástico Falcon, que resulta numa ligação preferencial dos fibroblastos. Uma suspensão de 5xl05 células únicas que não se ligaram à placa não revestida foi plaqueada numa placa de cultura de plástico revestida com colagénio (1,5 mL de gelatina a 0,14%, J.T.Baker Chemical Co., Phillipsberg, NJ) contendo 2 mL de DMEM a 79%, FCS a 10%, HS a 10% e aminoácidos não essenciais a 1% (Gibco Laboratories) . As células foram cultivadas a 37 °C numa atmosfera humidificada de C02 a 5%.

As culturas de MSC derivadas de medula óssea de rato (5 000 células/placa de 35 mm) foram expostas a várias concentrações de 5-aza-CR (0, 1, 3, 10, 20 e 50 μΜ) 24 h após semear as células nas placas de cultura. O meio contendo o 5-aza-CR foi removido após o período de exposição de 24 h e substituído com meio sem 5-aza-CR. Sete dias após esta exposição, foram observadas células compridas multinucleadas em algumas das placas tratadas com mais do que 5-aza-CR a 3 μΜ (Figura 7A) ; as células nestas culturas estavam aproximadamente a 80% de confluência. O número dessas células multinucleadas aumentou como colónias isoladas ou 37 agrupamentos e alcançou um máximo (9 colónias em 10 das placas de 35 mm) 2 semanas após o tratamento inicial. O número dessas células diminuiu (6 colónias em 10 das placas de 35 mm) durante 5 semanas após o tratamento; 7 desapareceram provavelmente devido à sua contracção e destacamento das placas e surgiram 4 novas colónias durante este período de tempo; uma proporção substancial das células multinucleadas permaneceu até 40 dias após a exposição inicial, que foi o período de observação mais longo. A morfologia das células multinucleadas, observadas por microscopia de contraste de fase das culturas vivas (Figura 7A), foi semelhante a do músculo de rato em cultura. Não se observaram estrias perceptíveis, como são observados em rotina em células miogénicas de galinha embrionária em cultura embora os miotubos derivados das células miogénicas obtidos a partir de membros de rato fetal normais também não apresentam estrias (Figura 7B). Assim, nem os miotubos derivados de MSC nem aqueles obtidos de embriões de ratos normais apresentam estrias nas condições empregues nestes estudos. Foram observadas ondas de contracções espontâneas ou contorções de algumas destas células multinucleadas quando visualizadas as culturas vivas. A contracção destas células também pode ser estimulada colocando uma gota de uma solução de acetilcolina nestas células, o que é uma indicação adicional que estas células são miogénicas.

Para confirmar ainda a identidade destas células multinucleadas, o anticorpo contra miosina específica do músculo esquelético foi apresentada a uma preparação fixada destas culturas. A Figura 8 apresenta um miotubo corado positivamente com o anticorpo anti-miosina; novamente, as estrias cruzadas não puderam ser observadas. Também se coraram miotubos 2 semanas e 5 semanas após tratamento de 5-aza-CR com anticorpo anti-miosina.

Os miotubos 2 semanas após tratamento foram fortemente corados 38 positivos (Figura 9A e 9B) embora essas 5 semanas após tratamento foram fracamente coradas (Figura 9C e 9D). 0 efeito de 5-aza-CR pareceu estar dependente da concentração apresentada a MSC. Não se encontraram miotubos em placas tratadas com 5-aza-CR a 0 ou 1 μΜ, mas nessas tratadas com 5-aza-CR a 3-50 μΜ, os miotubos foram observados com incidência comparável (Tabela 2). TABELA 2 Número de Agrupamentos de Miotubos ou Adipócitos Encontrados Por Cultura para MSC Expostas a Diferentes Concentrações de 5-aza-CR Cone. [5-aza-CR] Miotubos Adipócitos SI* 0 μΜ 0/12 3/12 27% 1 μΜ 0/12 19/12 21% 3 μΜ 3/12 16/12 15% 10 μΜ 4/9 19/9 12% 20 μΜ 2/5 9/5 7% 50 μΜ 2/5 8/5 6%

As culturas secundárias de células da medula óssea de rato foram plaqueadas a 5000 células por placa de 35 mm, tratadas com a concentração indicada de 5-aza-CR e observada 14 dias após tratamento. Os números para a incidência de miotubos e adipócitos indicam o número total de agrupamentos perceptiveis fenotipicamente observados e o número total de placas de cultura examinadas. 39

Para medir o índice de Sobrevivência (SI*) na presença de 5-aza-CR, as MSC foram semeados a 200 células/placa de 35 mm e tratadas com 5-aza-CR 24 h após plaqueamento. Após 14 dias, as colónias contendo mais do que 10 células foram contadas e este número foi multiplicado por 100% e dividido por 200 para obter a percentagem.

Quando as células foram tratadas com concentrações superiores de 5-aza-CR, o número de células na placa diminuiu, com 10 μΜ parecendo ser a concentração mais eficaz em relação ao número máximo de células miogénicas e sobrevivência de células (eficiência de plaqueamento da Tabela 2). Assim, todas as experiências subsequentes foram realizadas com 5-aza-CR a 10 mM.

Para examinar o efeito de 5-aza-2'-desoxicitidina (5-aza- dCR), um análogo desoxilo da 5-aza-CR, as MSC de medula óssea de ratos foram tratadas com 5-aza-dCR a 0,3 μΜ, 1 μΜ e 10 μΜ do mesmo modo que para 5-aza-CR. Das concentrações testadas, 5-aza-CdR a 0,3 μΜ produziu a incidência mais elevada de conversão miogénica e a incidência observada foi muito superior do que para as células expostas a 10 μΜ de 5-aza-CR (Tabela 3). 40 TABELA 3 Número de Agrupamentos de Miotubos Encontrados Por Cultura para MSC Expostas a Diferentes Concentrações de 5-aza-CdR e 5-aza-CR Análogo de Citidina Cone. Miotubos SI* 5-aza-CdR 0,1 μΜ 10/10 16% 5-aza-CdR 0,3 μΜ 24/10 10% 5-aza-CdR 1,0 μΜ 3/10 3% 5-aza-CdR 10 μΜ 1/10 1% 5-aza-CR 10 μΜ 7/10 14% *índice de Sobrevivência

As culturas secundárias de células da medula óssea de rato foram plaqueadas a 5000 células por placa de 35 mm, tratadas com a concentração indicada de 5-aza-dCR ou 5-aza-CR e observadas 14 dias após tratamento. Os números para a incidência de miotubos indicam o número total de agrupamentos fenotipicamente perceptiveis observados e o número total de placas de cultura examinados.

Para medir o índice de Sobrevivência na presença de 5-aza-CdR ou 5-aza-CR, foram semeadas MSC a 200 células/placa de 35 mm e tratadas com 5-aza-dCR ou 5-aza-CR 24 h após plaqueamento. Após 14 dias, as colónias contendo mais do que 10 células foram contadas e este número foi multiplicado por 100% e dividido por 200 para obter a percentagem.

Para eliminar a possibilidade de contaminação por mioblastos derivados do músculo circundante no momento da recolha da medula óssea, MSC da medula óssea de rato da segunda passagem foram 41 clonados como aqui descrito. Quatro clones de morfologias indistinguíveis foram obtidos a partir deste processo e foram expostos a 5-aza-CR durante 24 h; para ênfase, nenhuma célula nestes clones exibiu características tipo músculo ou imunocoloração positiva para miosina específica de músculo antes da exposição a 5-aza-CR. Dos 4 clones expostos a 5-aza-CR, um clone exibiu a morfologia distintiva de miotubos e adipócitos, que são interpretados para indicar que as células que não de músculo foram convertidas em ou influenciadas para se tornarem mioblastos ou adipócitos.

As MSC derivadas de medula óssea de rato de primeira passagem foram expostas a 10 μΜ de 5-aza-CR durante 24 h e clonadas. De um total de 768 poços, foram detectadas 136 colónias. Destas 136 colónias, 7 (5%) exibiram um fenótipo miogénico, 27 (20%) exibiram um fenótipo adipocítico e as outras colónias não têm morfologias obviamente relacionadas com fenótipos perceptíveis.

Para testar o efeito de 5-aza-CR e 5-aza-dCR em preparações de não MSC, foram expostos fibroblastos de cérebro para estes mesmos reagentes. Os fibroblastos de cérebro de rato foram semeados em placas de 35 mm a uma densidade de 50 000 células/placa e tratadas com 1 μΜ, 3 μΜ ou 10 μΜ de 5-aza-CR ou 0,1 μΜ, 0,3 μΜ ou 1 μΜ de 5-aza-dCR no mesmo modo que para as MSC de rato. Cada grupo tinha 9 placas e as células foram monitorizadas até 14 dias após exposição. Ao dia 7, todas as placas atingiram a confluência excepto para o grupo tratado com 10 μΜ de 5-aza-CR. Não foram encontradas células gordas nem miotubos em qualquer uma das placas durante o período de observação. 42

As MSC foram recolhidas da medula óssea de ratos dadores jovens (4 semanas de idade, 100 g) e adultos (3 meses de idade, 250 g) e passados e o número de colónias de fenótipo miogénico após exposição a 5-aza-CR foram comparados (Tabela 4). TABELA 4 Número de Agrupamentos de Miotubos Por Cultura de MSC Expostas a 5-aza-CR FCS HS HC Miotubos 10% 5% + 11/5 10% 5% - 8/5 10% 0% + 2/5 10% 0% 0/5 5% 0% + 0/5 5% 0% - 0/5 0% 5% + 0/5 0% 5% - 0/5

Culturas secundárias de MSC de medula óssea de rato foram plaqueadas a 5 000 células por placa de 35 mm, tratadas com μΜ de 5-aza-CR e 24 h mais tarde mudadas para DMEM com níveis diferentes de FCS, HS, ou HC a 50 μΜ e observadas 14 dias após a exposição a 5-aza-CR ter terminado. Os números para a incidência de miotubos indicam o número total de placas de cultura examinadas.

As MSC de ratos dadores jovens tinham mais colónias miogénicas do que as de ratos adultos. As culturas de segunda passagem de MSC de dadores jovens expostas a 5-aza-CR produziram 43 mais colónias miogénicas comparadas com MSC de dadores mais velhos testados em culturas da primeira à quarta passagem.

Foram testadas várias condições de cultura para tentar optimizar a expressão do fenótipo miogénico de MSC cultivadas expostas a 5-aza-CR. As células expostas foram cultivadas em meio contendo várias concentrações de FCS, HS, factor de crescimento de fibroblasto básico (bFGF) e hidrocortisona. A Tabela 4 demonstra que o meio contendo FCS a 10%, HS a 5% e hidrocortisona pareceu ser um meio óptimo para a expressão de MSC de propriedades miogénicas. O meio contendo bFGF pareceu aumentar a expressão do fenótipo miogénico (Tabela 5) embora isto possa estar relacionado com um aumento no número de mioblastos devido à divisão de mioblastos em oposição à conversão aumentada das células progenitoras. TABELA 5

Comparação de Miotubos Induzidos por 5-aza-CR por MSC de Medula Óssea de Ratos Jovens e Velhos com Cada Passagem Número de Células Iniciais Primeira Segunda Terceira Quarta Jovem (100 g) 50 000/placa +bFGF 3/5 9/5 3/5 0/5 50 000/placa -bFGF 3/5 16/15 2/5 1/5 5 000/placa +bFGF 1/5 10/5 2/5 2/5 5 000/placa -bFGF 3/5 13/15 2/5 5/5 velho (250 g) 50 000/placa +bFGF 1/5 0/5 2/5 0/5 50 000/placa -bFGF 0/5 0/5 0/5 0/5 5 000/placa +bFGF 1/5 0/5 1/5 3/5 5 000/placa -bFGF 0/5 0/5 0/5 2/5 44

As células foram cultivadas em DMEM com FCS a 10%, HS a 5% e HC a 50 μΜ, com ou sem bFGF. Os números para a incidência de miotubos indicam o número total de colónias fenotipicamente perceptiveis ou agrupamentos observados e o número total de placas de cultura examinadas. As MSC foram obtidas de ratos jovens (100 g) ou velhos (250 g).

Adicionalmente, as MSC derivadas da medula óssea foram plaqueadas a 500 células/placa, 5 000 células/placa e 50000 células/placa e depois expostas a 5-aza-CR. Às 500 células/placa, as células miogénicas foram primeiro observadas aos 20 dias após tratamento, com as células a tornarem-se confluentes 25 dias após tratamento; foram observados 2 agrupamentos de células miogénicas em 5 placas 29 dias após tratamento. Às 5 000 células/placa, as células miogénicas foram primeiro observadas aos 7 dias, com as células a tornarem-se confluentes 10 dias após tratamento; foram observados 3 agrupamentos em 4 placas 14 dias após tratamento. Às 50 000 células/placa, as células miogénicas foram observadas aos 6 dias, com as células a tornarem-se confluentes aos 7 dias após tratamento; foram observados 10 agrupamentos em 5 placas 14 dias após tratamento.

As observações aqui apresentadas indicam que as MSC da medula óssea de rato possuem a capacidade para se diferenciarem na linhagem miogénica in vitro após uma breve exposição a 5-aza-CR. As células miogénicas observadas exibiram a morfologia característica multinucleadas dos miotubos, contrairam-se espontaneamente, contrairam-se quando expostas a acetilcolina e corada positivamente com um anticorpo monoclonal contra miosina especifica do músculo esquelético embora estes miotubos nunca tenham exibido estrias aparentes. Todavia, os mioblastos de 45 ratos normais recolhidos de músculo de rato fetal não, no presente trabalho, formam miotubos obviamente estriados em cultura. Foi tentado excluir a possibilidade de contaminação por células miogénicas comprometidas por remoção meticulosa do tecido mole dos ossos no momento da recolha da medula óssea. Muito importante, nunca foram observados miotubos em qualquer cultura de MSC de medula óssea de rato em centenas de preparações excepto para aquelas expostas a concentrações suficientes de 5-aza-CR. Adicionalmente, um clone de MSC da medula óssea de ratos foi convertido em ambos os fenótipos miogénicos e adipociticos após tratamento com 5-aza-CR, que são interpretados para significar que as células progenitoras de não músculo foram convertidos nestes dois fenótipos. Uma vez que o músculo esquelético não foi observado na medula óssea, Pensa-se que a 5-aza-CR converte estas MSC derivadas da medula nas células miogénicas.

Exemplo de Referência 6

Expressão de Citocina por Células Estaminais do Mesênquima Derivadas da Medula Humana In Vi tro: Efeitos de IL-l<x e Dexametasona 0 objectivo do presente estudo foi ainda estabelecer as caracteristicas fenotipicas de MSC cultivadas através da identificação de um perfil de expressão de citocinas. Foram utilizadas ELISA comerciais para identificar e medir os niveis de expressão de citocinas que são conhecidos por serem importantes na regulação da divisão celular, diferenciação ou expressão de uma variedade de fenótipos de mesênquima. Foi identificada a expressão de citocina de MSC em condições de 46 cultura que foram previamente relatadas, permitem que as MSC se expandam mitoticamente sem diferenciação (meio de expansão de cultura constitutiva). Adicionalmente, foi ensaiada a expressão de citocina por MSC no meio de cultura suplementada com dexametasona ou IL-Ια. A dexametasona foi relatada como induzindo a diferenciação de osteo-progenitores em osteoblastos. Em contraste, IL-Ια, que é segregado no microambiente medular por uma variedade de células durante a resposta inflamatória, foi referido aumentar a capacidade do estroma da medula óssea para apoiar a hematopoiese e desse modo desempenhar um papel no controlo da diferenciação e/ou expressão de fibroblastos do estroma da medula óssea.

Os resultados destas análises demonstram que as MSC cultivadas expressam um perfil de citocina único. Adicionalmente, a dexametasona e IL-Ια alteram o perfil de expressão de citocina de MSC em diferentes vias. Estes resultados ajudam ao entendimento do perfil fenotipico único de MSC e também identificam macromoléculas cuja expressão é regulada no desenvolvimento na medida em que as MSC diferenciam ou modulam o seu fenótipo em direcção à linhagem osteogénica ou fenótipo de estroma de medula.

MATERIAIS E MÉTODOS

Isolamento de MSC e Expansão de Culturas A medula óssea foi obtida de seis dadores humanos, 3 machos e 3 fêmeas de diversas idades (Tabela 6). 47

Tabela 6

Características do Dador Dador # Idade do Dador Cond. Clin. Género 1 39 NHL* F 2 58 Cancro da mama F 3 38 mielodisplasia F 4 3 meduloblastoma M 5 28 Linfoma de Hodgkin M 6 47 AML* M *NHL = linfoma de não Hodgkin; AML = leucemia mielógena aguda

Cada dador estava em remissão de cancro e estava a sofrer recolha de medula para futura transplantação de medula óssea autóloga. Aproximadamente 10 mL de medula óssea não fraccionada foram obtidos da recolha e utilizada nos ensaios deste estudo. As MSC foram purificadas e cultivadas por uma modificação de métodos previamente relatados. Resumidamente, os aspirados da medula óssea foram transferidos das suas seringas para tubos cónicos de 50 mL contendo 25 mL de meio completo consistindo em Meio de Eagles Modificado por Dulbecco suplementados com soro de bovino fetal (FBS) de lotes seleccionados, para um volume final de 10%. Os tubos foram centrifugados numa centrífuga de bancada Beckman a 1200 rpm num rotor de recipientes basculantes GS-6 durante 5 min para sedimentar as células. A camada de gordura que se forma no topo das amostras e os sobrenadantes foram aspirados utilizando uma pipeta serológica e removidos. Os sedimentos celulares foram ressuspensos num volume de 5 mL com Meio Completo e depois transferidos para o topo de gradientes 48 pré-formados de Percoll a 70%. As amostras foram aplicadas num rotor de ângulo fixo Sorvall GS-34 e centrifugadas numa

Centrífuga Sorvall de Velocidade Elevada a 460 x g durante 15 min. A fracção de baixa densidade de aproximadamente 15 mL (densidade reunida = 1,03 g/mL) foi recolhida de cada gradiente e transferida para tubos cónicos de 50 mL para os quais foram adicionados 30 mL de Meio Completo. Os tubos foram centrifugados a 1200 rpm para sedimentar as células. Os sobrenadantes foram removidos e as células foram ressuspensos em 20 mL de Meio Completo e contados com um hemocitómetro após lisar as células de glóbulos vermelhos com ácido acético a 4%. As células foram ajustadas para um concentrado de 5xl07 células por 7 mL e semeadas em placas de cultura de 100 mm a 7 mL por placa.

Cultura e Passagem de MSC derivadas da Medula

As MSC derivadas de medula foram cultivadas em Meio Completo a 37 °C numa atmosfera humidificada contendo 95% de ar e 5% de C02, com mudanças de meio a cada 3-4 dias. Quando as placas de cultura primárias ficaram próximo da confluência, as células foram deslocadas com 0,25% de tripsina contendo EDTA a 1 mM (GIBCO) durante 5 min a 37 °C. A actividade enzimática de tripsina foi parada adicionando 1/2 volume de FBS. As células foram contadas, divididas 1:3 e replaqueadas em 7 mL de Meio Completo. Estas células de primeira passagem foram deixadas dividir durante 4-6 dias até que fiquem próximo da confluência. As células próximo da confluência de primeira passagem foram tripsinizadas e replaqueadas nos formatos de ensaio como descrito abaixo. 49 ELISA Quantitativa

Os níveis de expressão de citocina por MSC foram medidos utilizando ELISA quantitativa. Foram adquiridos os kits de ELISA (R&D Systems, Minneapolis MN) com especificidades de anticorpo para as citocinas seguintes; interleucina-3 (IL-3), interleucina-β (IL-6), interleucina-11 (IL-11), factor de estimulação de colónias de granulócitos (G-CSF), factor de estimulação de colónias de granulócitos-macrófagos (GM-CSF), actividade de estimulação de colónias de macrófagos (M-CSF), factor de células estaminais (SCF), factor de inibição da leucemia (LIF) e factor-beta-2 de crescimento de transformação (TGF-p-2). MSC próximo da confluência, da primeira passagem foram replaqueadas em placas de 35 mm a 50 000 células por placa e deixadas a ligar durante a noite. As condições de cultura foram então alteradas para uma das três condições de teste: Meio Completo fresco; Meio Completo com Suplemento Osteogénico; e Meio Completo com Suplemento Estromagénico. As culturas foram deixadas a incubar em meios de teste durante 24 ou 48 horas, altura em que os sobrenadantes foram recolhidos, congelados rapidamente em gelo seco-etanol e armazenados a -70 °C num congelador Revco até que todas as amostras estivessem preparadas para serem analisadas em conjunto. Os ensaios foram realizados aplicando 100 pL de sobrenadante da cultura nos poços da placa de ELISA seguido por processamento das placas pelas instruções do fabricante. As curvas padrão foram criadas utilizando citocinas convencionais fornecidas com os kits e diluídas para as concentrações apropriadas. Em alguns casos (particularmente para o ensaio de IL-6), os sobrenadantes tiveram que ser diluídos substancialmente para criar medições de absorvência suficientemente baixas que podem ser quantificadas rigorosamente a partir das curvas padrão. 50

Quantificação do Número de Células

RESULTADOS

Condição de Cultura Constitutiva - Meio de Expansão

Estavam presente níveis detectáveis de seis das nove citocinas ensaiadas após 24 horas de exposição a condições de cultura constitutiva-expansão. Ver Figuras 12A-12D e 13A-13C e ver Tabelas 7-10 abaixo). TABELA 7 Níveis de Citocina Detectados (24 horas) Dador G-CSF 24 h GM-CSF 24 h SCF 24 h T.IF 24 h Controlo 1 15 3 56 52 2 4 0 53 107 3 3 0 28 134 4 0 0 16 7 5 0 0 30 40 6 37 0 26 119 Média 10 1 35 66 Desvio Pad. 14 1 16 51 OS 1 22 0 80 11 2 0 1 61 20 3 6 0 34 44 4 1 0 17 11 51 (continuação) Níveis de Citocina Detectados (24 horas) Dador G-CSF 24 h GM-CSF 24 h SCF 24 h T.IF 24 h 5 4 0 22 11 6 0 0 34 87 Média 6 0 41 31 Desvio Pad. 8 0 24 30 ValorP com:OS 0,5464 0,5761 0,1900 0,0274 valorP OS:SF 0,0358 0,0054 0,4714 0,0176 IL-1 1 322 527 66 644 2 966 741 83 622 3 1266 413 43 1008 4 143 198 28 152 5 410 307 0 191 6 164 210 69 338 Média 545 399 48 493 Desvio Pad. 463 209 31 327 ValorP Com:SS 0,038 0,0054 0,2434 0,0180 TABELA 8 Níveis de Citocina Detectados (24 horas) Dador M-CSF 24 h IL-11 24 h IL-6 24 h TGF-β 24 h Controlo 1 200 830 7547 0 2 233 741 9887 0 3 303 659 6962 0 52 (continuação) Níveis de Citocina Detectados (24 horas) Dador M-CSF 24 h IL-11 24 h IL-6 24 h TGF-β 24 h 4 132 144 6987 0 5 130 509 5384 0 6 134 343 7761 0 Média 178 538 7421 0 Desvio Pad. 70 259 1467 0 OS 1 548 0 1714 0 2 345 0 338 0 3 550 52 1842 0 4 73 0 650 0 5 162 9 1111 0 6 170 0 919 0 Média 308 9 1096 0 Desvio Pad. 206 21 591 0 ValorP com:OS 0,1119 0,0038 0,0004 valorP OS:SF 0,0123 0,0375 0,0065 SS 1 1222 3583 216666 0 2 1355 4277 255555 0 3 2099 7351 340540 0 4 290 355 76033 0 5 753 1189 109473 0 6 589 1226 122666 0 Média 1051 2997 186822 0 Desvio Pad. 648 2620 101604 0 ValorP 0,0149 0,0569 0,0074 53 (continuação)

Níveis de Citocina Detectados (24 horas) Dador M-CSF 24 h IL-11 24 h IL-6 24 h TGF-β 24 h Com:SS TABELA 9 Níveis de Citocina Detectados (48 horas) Dador G-CSF 48 h GM-CSF 48 h SCF 48 h LIF 48 h Controlo 1 2 0 112 92 2 0 0 129 123 3 0 0 41 142 4 0 0 67 45 5 0 0 27 28 6 5 2 38 74 Média 1 0 69 84 Desvio Pad. 2 1 42 44 OS 1 7 0 98 43 2 0 0 76 22 3 2 0 29 26 4 10 0 100 40 5 2 0 29 0 6 0 0 17 8 Média 4 0 58 23 Desvio Pad. 4 0 38 17 ValorP com:OS 0,3053 0,3632 0,3901 0,0171 valorP OS:SS P,0115 0,0027 0,1276 0,0040 SS 1 452 348 144 841 54 (continuação) Níveis de Citocina Detectados (48 horas) Dador G-CSF 48 h GM-CSF 48 h SCF 48 h LIF 48 h 2 989 564 162 795 3 1214 291 53 866 4 143 198 28 152 5 410 307 0 191 6 164 210 69 338 Média 545 399 48 493 Desvio Pad. 463 209 31 327 ValorP Com:SS 0,038 0,0054 0,2434 0,0180 TABELA 10 Níveis de Citocina Detectados (48 horas) Dador M-CSF 48 h IL-11 48 h IL-6 48 h TGF-β 48 h Controlo 1 975 1414 11707 0 2 451 905 10598 0 3 632 761 10691 0 4 337 225 4878 0 5 279 561 4814 0 6 222 467 5645 0 Média 483 722 8056 0 Desvio Pad. 282 413 3261 0 OS 1 867 184 1730 0 2 530 0 493 0 3 655 52 1395 0 4 305 0 1090 0 55 (continuação) Níveis de Citocina Detectados (48 horas) Dador M-CSF 48 h IL-11 48 h IL-6 48 h TGF-β 48 h 5 361 9 1134 0 6 264 0 357 0 Média 497 31 950 0 Desvio Pad. 233 75 422 0 ValorP com:OS 0,6513 0,0049 0,0029 valorP OS:SS 0,0114 0,0167 0,0152 SS 1 1188 4735 182352 0 2 1416 5500 36666 0 3 1847 7351 349629 0 4 290 355 76033 0 5 753 1189 109473 0 6 589 1226 122666 0 Média 1051 2997 186822 0 Desvio Pad. 648 2620 101604 0 ValorP Com:SS 0,0149 0,0569 0,0074

As citocinas expressas em termos de pg/10000 células em 24 ou 48 horas, da mais baixa para a mais elevada foram: G-CSF, SCF, LIF, M-CSF, IL-11 e IL-6. Três citocinas não foram detectadas nos sobrenadantes em condições de expansão de culturas constitutivas: GM-CSF, IL-3 e TGF-p2. Foram observadas grandes diferenças na expressão média de citocina de cada citocina em comparação com os níveis médios de expressão de outras citocinas. Nos extremos, o nível média detectável da expressão de G-CSF (10 pg/10000 células/24 horas) foi superior a 56 700 vezes mais baixa do que o nível de expressão médio de IL-6 (7421 pg/10000 células/24 horas).

Condições de Cultura de Suplemento Osteogénico A adição dos Suplementos Osteogénicos ao Meio Completo não resultaram em alterações detectáveis em G-CSF, M-CSF e SCF em relação ao controlo (Figuras 12A-12D e 13A-13B; Tabelas 7-10) . Em contraste, o meio OS regula negativamente de forma significativa a expressão de LIF (p<0,01), IL-β (p<0,001) e IL-11 (p<0,005) em relação à expressão destas citocinas em condições de meio de expansão de culturas constitutivas às 24 horas. Estes níveis permaneceram estatisticamente mais baixas do que os níveis de citocina em condições de meio de expansão de culturas constitutivas às 48 horas (Figuras 12A-12D e 13A-13C; Tabelas 7-10) . A quantidade de inibição mediada pelo meio OS variou para as três citocinas; no ponto de tempo das 24 horas o nível médio de expressão de citocina em meio OS em relação a condições de meio de expansão de culturas constitutivas foi como se segue; expressão de LIF 55% ± 54%, IL-6 16% ± 9% e IL-11 1% ± 3%. O desvio padrão na alteração da percentagem de LIF foi devido principalmente às medições de um dador (dador #4) em que o nível de expressão de LIF foi na verdade superior nas condições de meio OS em relação às condições de expansão de cultura constitutiva (Tabela 7) . Para um dado dador, a percentagem de inibição de uma citocina em relação ao nível médio absoluto de inibição dessa citocina, foi independente da percentagem de inibição das outras duas citocinas em relação aos seus níveis médios absolutos de inibição (Tabelas 7-10). Adicionalmente, para cada uma das citocinas, a percentagem de inibição para uma dada citocina entre os seis indivíduos na 57 população, foi independente dos níveis iniciais de expressão nas condições de expansão de cultura constitutiva (Figuras 12A-12D e 13A-13C; Tabelas 7-10).

Condições de Cultura em Suplemento Estromagénico O meio SS aumentou a expressão de várias citocinas por MSC de um modo dependente da concentração. A Figura 14 ilustra a resposta de 24 horas das MSC de segunda passagem para concentrações crescentes de IL-Ια em termos de expressão de GM-CSF. Existe um aumento quase linear no nível de secreção de GM-CSF pelas MSC, com níveis crescentes de IL-Ια no meio de cultura entre 0,1-10,0 U/mL. Aumentos log adicionais em IL-la para o meio de cultura resulta num pequeno aumento adicional na expressão de GM-CSF. Estes resultados foram utilizados para identificar a concentração de IL-Ια para suplementar ao meio de cultura nas experiências descritas abaixo. Para todos os ensaios subsequentes, foram adicionadas 10 U/mL IL-Ια aos meios de cultura. O meio de cultura suplementado com 10 U/mL de IL-Ια induziu uma regulação positiva estatisticamente significativa na expressão de G-CSF (P<0,05), M-CSF (p<0,02), LIF (p<0,02), IL-6 (p<0,01-) e IL-11 (p<0,06) em relação a células cultivadas no meio de expansão de cultura constitutiva. Adicionalmente, o IL-Ια induziu a expressão de GM-CSF que não foi detectável no meio de expansão de cultura constitutiva. Em contraste, IL-la não teve um efeito estatisticamente significativo na expressão de SCF em relação ao nivel de expressão em condições de meio de expansão de cultura constitutiva. O aumento em número de vezes na resposta a IL-Ια variou dependendo da citocina. IL-β (aumento 58 de 25,1 +/- 13,4 vezes) foi estimulada até à maior extensão, seguido por LIF (9,2 ± 6,9 vezes), M-CSF (5,2 + 1,7 vezes) e IL-11 (4,9 ± 3,3 vezes). 0 aumento médio em número de vezes para G-CSF e GMCSF não foi calculado, uma vez que estas citocinas não foram detectadas em algumas ou todas as culturas de expansão de cultura constitutivas.

DISCUSSÃO

As análises continuadas de MSC neste estudo foram dirigidas para a identificação de caracteristicas fenotipicas adicionais e para a determinação de como este fenótipo está alterado quando as MSC são expostas a moléculas reguladoras que causam diferenciação ou modulação fenotipica. Neste estudo, utilizaram-se ensaios ELISA para caracterizar a expressão de citocina de MSC sob condições de cultura-expansão constitutivas e na presença de OS ou SS.

As MSC expressam um perfil único de citocinas que incluem G-CSF, M-CSF, SCF, LIF, IL-6 e IL-11 sob condições de cultura-expansão constitutivas. Estas não expressam GM-CSF, IL-3 e TGF-p2 sob estas condições. OS sub-regula a expressão de LIF, IL-6 e IL-11 embora não afecte a expressão das outras citocinas expressas sob condições constitutivas de cultura. Não foi observado que OS sobre-regulasse a expressão de qualquer das citocinas ensaiadas neste estudo. Em contraste, SS sobre-regula a expressão de G-CSF, M-CSF, LIF, IL-6 e IL-11 e induz a expressão de GM-CSF que não foi detectada sob condições constitutivas de cultura-expansão. SS não produziu efeito na expressão de SCF e não se verificou que sub-regula qualquer das citocinas ensaiadas neste estudo. Através destes dados, foi 59 produzido um perfil de expressão de citocinas único que podem auxiliar na distinção das MSC de outros fenótipos do mesênquima. A identidade do perfil de citocinas deve proporcionar pistas para determinar o papel que estas células desempenham no microambiente da medula óssea que proporcionam informação de indução e de regulação que apoia a hematopoiese. Adicionalmente, as alterações neste perfil de citocinas em resposta a OS e SS, identificam as citocinas especificas cujos níveis de expressão se alteram à medida que as MSC se diferenciam ou modulam o seu fenótipo em resposta a moléculas reguladoras. A IL-Ια, que é libertada no microambiente da medula através de uma variedade de tipos celulares durante as respostas inflamatórias, induz as MSC a sobre-regular a expressão de citocinas que apoia a diferenciação granulocítica (G-CSF e GM-CSF), monocítica/osteoclástica (GM-CSF, LIF, M-CSF, IL-6) e megacariocítica (IL-11). A IL-Ια mostrou proteger a medula óssea da radio- e da hemo-ablação. A sobre-regulação induzida por IL-Ια, da expressão da citocina pelas MSC, desempenha provavelmente um papel nos mecanismos dos efeitos protectores de IL-Ια. A dexametasona, que induz a diferenciação de MSC em osteoblastos, atenua a expressão de citocinas de apoio monocíticas/osteoclásticas (LIF, IL-6) e megacariocíticas (IL-11) e não produz efeitos na expressão de citocinas que apoiam os progenitores granulocíticos (G-CSF, GM-CSF). As três citocinas inibidas por dexametasona têm interesse porque cada uma medeia o seu sinal através de um receptor que utiliza gpl30 na sua via de sinalização. 60

Literatura citada 1. Caplan AI, In: 39th Annual Symposium of the Society for Developmental Biology ed por S. Subtelney e U Abbott, pp 3768. Nova Iorque, Alan R Liss Inc, 1981. 2. Elmer et al., Teratology, 24: 215-223, 1981. 3. Hauschka SD, Dev Biol, 37: 345-368, 1974. 4. Solursh et al., Dev Biol, 83: 9-19, 1981. 5. Swalla et al., Dev Biol, 116: 31-38, 1986. 6. Goshima et al., Clin Orthop Rei Res, 269: 274-283, 1991. 7. Ashton et al., Clin Orthop Rei Res, 151: 294-307, 1980. 8. Bruder et al., Bone Mineral, 11: 141-151, 1990. 9. Bennett et al., J Cell Sei, 99: 131-139, 1991. 10. Benayahu et al., J Cell Physiol, 140: 1-7, 1989. 11. Nakahara et al. exp Cell Res, 195: 492-503, 1991. 12. Dennis et al., Cell Transpl, 1: 2332, 1991. 13. Ohgushi et al., Acta Scandia., 60: 334-339, 1989. 14. Wang et al., Growth Factors, 9: 57, 1993. 15. Vukicevic et al., PNAS, 86: 8793, 1989. 16. Cheng et al. endocrinology, 134: 277, 1994. 17. Tenenbaum et al., Calcif. Tissue Int., 34: 76, 1982. 18. Bruder et al., Trans. Ortho. Res. Soc., 16: 58, 1991. 19. Leonard et al., Devi. Biol., 145: 99, 1991. 20. Chen et al. exp. Cell Res., 206: 199, 1993. 21. Syftestad et al., Differentiation, 29: 230, 1985. 22. Chen et al. exp. Cell Res., 195: 509, 1991. 23. Kimura et al., Biomed. Res., 5: 465, 1984. 24. Langille et al., Differentiation, 40: 84, 1989. 61 25. Russell et al. exp. Hematol., 20: 75-79, 1992. 26. Brenner et al., Brit. J. of Haem., 77: 237-244, 1991. 27. Haynesworth et al., Bone, 13: 81-88, 1992. 28. Grigoriadis et al., J. Cell Biol., 106: 2139-2151 1988. 29. Haynesworth et al., Bone, 13: 69-80, 1992. 30. Bruder & Haynesworth em preparação. 31. Bruder & Caplan, Dev. Biol., 141: 319-329, 1990. 32. Pacifici et al. exp. Cell Res., 195: 38, 1991. 33. Constantinides et al., Nature, 267: 364-366, 1977 34. Taylor et al., Cell, 17: 771-779, 1979. 35. Konieczny et al., Cell, 38: 791-800, 1984. 36. Lassar, Cell, 47: 649-656, 1986.

Lisboa, 18 de Junho de 2007

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Método para efectuar a indução dirigida pela linhagem de células estaminais do mesênquima humanas isoladas e cultivadas que compreende o contacto ex vivo das células estaminais do mesênquima com um factor bioactivo eficaz para induzir a sua diferenciação in vitro numa linhagem de mesênquima condrogénico.
2. Método da reivindicação 1, em que as células são colocadas em contacto com o factor bioactivo num recipiente rígido poroso.
3. Método da reivindicação 2, em que o recipiente rígido poroso é um cubo de cerâmica.
4. Método da reivindicação 1, em que as células são colocadas em contacto com o factor bioactivo num recipiente de cultura.
5. Método da reivindicação 4, em que o recipiente de cultura é formado de um material seleccionado do grupo consistindo em vidro e plástico.
6. Método da reivindicação 1, em que as células são colocadas em contacto com o factor bioactivo num líquido injectável.
7. Método da reivindicação 6, em que o líquido é adequado para injecção intramuscular, intravenosa ou intra-articular. 1
8. Método da reivindicação 1 que compreende a indução condrogénica e o factor bioactivo é um factor condro-indutivo.
9. Método da reivindicação 8, em que o factor condro-indutivo é um membro da superfamilia do factor de crescimento β transformante.
10. Método da reivindicação 9, em que o membro da superfamilia do factor de transformação do crescimento β é uma proteína morfogénica do osso.
11. Método da reivindicação 10, em que a proteína morfogénica do osso é BMP-4.
12. Método da reivindicação 9, em que o membro da superfamilia do factor de transformação do crescimento β é TGF-βΙ.
13. Método da reivindicação 9, em que o membro da superfamilia do factor de transformação do crescimento β é inibina A.
14. Método da reivindicação 9, em que o membro da superfamilia do factor de transformação do crescimento β é o factor estimulante de actividade condrogénica.
15. Método da reivindicação 8, em que o factor condro-indutivo é um componente da matriz extracelular colagenosa.
16. Método da reivindicação 15, em que o componente da matriz extracelular colagenosa é colagénio I. 2
17. Método da reivindicação 16, em que o colagénio I está na forma de um gel.
18. Método da reivindicação 8, em que o factor condro-indutivo é um análogo da vitamina A.
19. Método da reivindicação 18, em que o análogo da vitamina A é ácido retinóico. Lisboa, 18 de Junho de 2007 3