ES2320101T3 - Eritropoyetina conjugada con mono-peg. - Google Patents
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Abstract
Una eritropoyetina conjugada con mono-PEG aislada (EPO) que comprende eritropoyetina derivada de orina humana o una eritropoyetina humana recombinante que tiene las mismas cadenas de azúcar que la eritropoyetina derivada de ser humano, conjugada químicamente con polietilen glicol (PEG) en el grupo amino del radical lisina en la posición 52, teniendo dicho PEG un peso molecular de 10 a 30 kDa, y un peso molecular aparente de dicha EPO conjugada con mono-PEG en un medio acuoso de 150 a 650 kDa por molécula, según se mide por cromatografía de columna de filtración de gel, y excluyéndose una emzcla de diferentes EPO conjugadas con mono-PEG.
Description
Eritropoyetina conjugada con
mono-PEG.
La presente invención se refiere a
eritropoyetina conjugada con mono-PEG que tiene una
molécula de PEG unida al radical lisina en la posición 52, que se
obtiene por reacción de eritropoyetina derivada de orina humana o
eritropoyetina humana recombinante (rhEPO) que tiene las mismas
cadenas de azúcar como la eritropoyetina de origen humano producida
en células huésped animales con un derivado reactivo animal de PEG,
teniendo dicho PEG un peso molecular de 10 a 30 kDa y siendo el
peso molecular aparente de dicha EPO conjugada con monoPEG en un
medio acuoso de 150 a 650 kDa por molécula, tal como se mide por
cromatografía de columna de gel y excluyéndose la mezcla de
diferentes EPO conjugadas con mono-PEG; una
composición que comprende el conjugado y una formulación de
eritro-
poyetina de acción sostenida que comprende el conjugado o una composición del mismo como ingrediente activo.
poyetina de acción sostenida que comprende el conjugado o una composición del mismo como ingrediente activo.
La eritropoyetina (EPO) es un polipéptido rico
en cadenas de azúcar que se produce predominantemente en los
riñones y actúa sobre células precursoras de tejido hematopoyético
para estimular su diferenciación y proliferación en eritrocitos. La
EPO está disponible actualmente en el comercio como EPO humana
producida por recombinación en células huésped animales, y su uso
principal es como agente terapéutico en diferentes tipos de
anemias, incluyendo la anemia renal causada por la infraproducción
de EPO como resultado de una nefropatía.
Tal como se utiliza aquí, el término "EPO
nativa" pretende abarcar la EPO derivada de orina humana, como
por ejemplo la que se extrae, aísla y purifica a través de diversas
técnicas, así como EPO humana recombinante (rhEPO) que tiene las
mismas cadenas de azúcar que la EPO de origen humano, como por
ejemplo las que se producen por recombinación en células huésped
animales (v.g., células CHO, células COS), así como sus variantes
modificadas para incluir sustitución o supresión de uno o más
aminoácidos que constituyen dichas EPO o modificadas para incluir
adición de uno o más aminoácidos.
La EPO que se utiliza actualmente se administra,
v.g., por vía intravenosa, subcutánea o intramuscular. El
porcentaje de reticulocitos (precursores de eritrocito) en el total
de eritrocitos puede utilizarse como indicador de la actividad de
EPO. La actividad de EPO nativa observada como el porcentaje de
reticulocitos alcanza un pico de 3 a 5 días después de la
administración a través de cualquiera de las rutas que se han
mencionado, seguido de un rápido descenso. Por lo tanto, la EPO
nativa deberá inyectarse dos o tres veces a la semana para asegurar
unos efectos terapéuticos suficientes en los pacientes con anemia.
Esto no solamente causa dolor en los pacientes, sino que también
supone una sobrecarga para los médicos y otros miembros del
personal médico que están ya sobrecargados de trabajo. Por otra
parte, el menor numero de inyecciones que se requiere dentro de un
período de tiempo fijo supondrá un ahorro de los costes médicos.
Por otra parte, existen informes sobre proteínas
o glucoproteínas conjugadas con polímeros hidrosolubles (v.g., PEG)
que tienen una fracción hidrazida u oxilamina que puede unirse
covalentemente a través de la reacción química con un grupo
funcional oxidable como polialcohol, lactol, amina, ácido
carboxílico o derivado de ácido carboxílico en las proteínas o
glucoproteínas (ver, v.g.,
JP-7-196925 A). De acuerdo con este
informe, se puede unir un polímero hidrosoluble, como PEG, a varios
radicales libres en aminoácidos o radicales de azúcar que
constituyen una proteína o una glucoproteína para dar lugar a un
producto de acoplado con 6 a 34 moléculas PEG (peso molecular: 2000
a 12000) por molécula de proteína. En dicha proteína conjugada con
PEG o glucoproteína con muchas moléculas PEG, es difícil controlar
las posiciones y el número de moléculas PEG unidas a la proteína o
glucoproteína y resulta difícil obtener una proteína o glucoproteína
conjugada con PEG uniforme. Por consiguiente, existe un problema
cuando la proteína o glucoproteína conjugada con PEG así preparada
se formula en productos farmacéuticos.
Existe también un informe en el que se describe
un polímero activado con éster de sulfonato (v.g., PEG activado con
éster de sulfonato) y que propone un método en el que se hace
reaccionar dicho polímero activado con éster de sulfonato con un
material diana (v.g., una proteína o una glucoproteína) para
preparar un material diana conjugado con polímero (ver JP
9-504515 A). Entre los ejemplos de grupo reactivo en
un material diana, que reacciona con este polímero activado con
éster de sulfonato se incluyen un grupo amino primario o secundario,
un grupo tiol y un grupo hidroxilo aromático. En dicho polímero
activado con éster de sulfonato capaz de reaccionar con diversos
grupos reactivos, se considera por tanto difícil de controlar el
número y las posiciones de moléculas de polímero que se pueden
conjugar que se introducen. Por otra parte, dicho polímero tiene
claramente la posibilidad de formar amida de sulfonato, que da
cabida a una heterogeneidad mucho más alta para los productos.
Asimismo, existe un informe sobre un polímero
ramificado (v.g., PEG ramificado) que se une al material diana
(v.g., una proteína o glucoproteína) para dar un conjugado de
polímero ramificado del material diana (ver JP
9-504299 A). A pesar de que este material diana
conjugado con polímero ramificado también sostiene con éxito su
eficacia, ha sido deseable desarrollar EPOs conjugadas con polímero
con una eficacia más firme.
Asimismo, se creía que la conjugación con PEG de
peso molecular más alto tendría como resultado una eficacia más
firme.
La conjugación con PEG de peso molecular más
alto causará un gran descenso de la actividad in vitro de
EPO. No obstante, se cree que EPO conjugada con PEG de peso
molecular más alto podría presentar una retención en plasma
significativamente mejorada y, por lo tanto, una actividad in
vivo sostenida, con el resultado de una actividad mayor y más
sostenida con un aumento del peso molecular de PEG (proteínas
farmacéuticas conjugadas con polietilen glicol; PSTT vol., 1, Nº 8,
1998, 352-356). Por ejemplo, en el caso de un
conjugado con PEG de G-CSF mutalina, se sabe que su
actividad in vivo aumenta en proporción con el peso molecular
de PEG calculado en el intervalo comprendido entre aproximadamente
10 kDa (WO 00/44875).
En US 4.904.584 se describe una proteína
modificada de forma homogénea que tiene uno o más radicales lisina
seleccionados que se dan de forma natural, reemplazados por un
aminoácido adecuado, o que tiene uno o más radicales lisina
sustituidos por otros aminoácidos o insertados en una secuencia de
polipéptido, dejando radicales de lisina seleccionados que tienen
grupos \varepsilon-amina en la proteína y
acoplando compuestos reactivos de amina con radicales lisina
seleccionados.
Se han designado conjugados de PEG
convencionales de EPO para que tengan muchas moléculas PEG con un
peso molecular relativamente bajo de entorno a 5 kDa con el fin de
sostener su eficacia. No obstante, en EPO rica en cadenas de
azúcar, la conjugación está limitada exclusivamente a radicales de
aminoácido no glucosilados que participan en la unión de receptor,
haciendo imposible evitar el descenso de la actividad in vivo
y difícil encontrar el equilibrio entre una eficacia sostenida y un
descenso de la actividad in vivo. Asimismo, incluso en el
caso de que se conjuguen grupos amino o cadenas de azúcar con PEG de
más de 10 kDa, tal como se ha señalado antes, se ha topado con la
dificultad en la práctica de formular EPO conjugada con PEG en
fármacos, ya que sigue pendiente el problema de controlar el número
de moléculas PEG.
Por estas razonas, para conseguir una eficacia
más sostenida sin perder la actividad fisiológica de EPO, una
glucoproteína rica en cadenas de azúcar, es necesario desarrollar
una EPO conjugada con PEG con una eficacia significativamente
sostenida introduciendo un número controlado de moléculas PEG en las
posiciones controladas.
Tal como se ha señalado anteriormente, se ha
reconocido de manera general la relación entre el peso molecular de
PEG utilizado para la conjugación y la actividad in vivo de
EPO de modo que EPO conjugada con un PEG de peso molecular más alto
presenta una mejor retención en plasma y, por lo tanto, una eficacia
mayor y más sostenida. No obstante, los autores de la presente
invención han aclarado que este hecho reconocido de manera general
no se aplica a la conjugación de PEG para EPO nativa (recombinante)
con cadenas de azúcar ya que la conjugación con PEG de peso
molecular extremadamente alto también reduce la actividad in
vivo de EPO. Como resultado, han observado que el PEG de peso
molecular más alto no siempre produce un mejor resultado, sino
que, más bien, existe un intervalo óptimo para el peso molecular de
PEG para alcanzar un equilibrio entre la eficacia sostenida y la
actividad in vivo, y además han llegado a la conclusión de
que un número de moléculas PEG en particular supone la eficacia
sostenida máxima. Estas conclusiones han llevado a completar la
presente invención.
Los autores de la presente invención han
preparado ahora una EPO conjugada con PEG haciendo reaccionar EPO
humana recombinante que tiene las mismas cadenas de azúcar que la
eritropoyetina derivada del ser humano con un derivado de
polietilen glicol (PEG) que tiene un éster activo en uno de los
extremos, como por ejemplo éster de ácido graso inferior de
metoxi-PEG-succinimidilo. Dicha EPO
conjugada con PEG comprende una composición de conjugados que tiene
1 molécula PEG lineal por cada molécula de rhEPO. Un conjugado
mono-metoxi PEG-EPO
(mono-mPEG-EPO) tiene una molécula
PEG lineal por cada molécula rhEPO, que se une al grupo
\varepsilon-amino del radical lisina en la
posición 52 de rhEPO. Tal como se describirá más adelante, los
autores de la presente invención han confirmado por primera vez que
la EPO conjugada con PEG de la presente invención presentaba una
eficacia significativamente sostenida en comparación con la EPO
nativa sin conjugar.
Por otra parte, los autores de la presente
invención han determinado el peso molecular aparente de EPO
conjugada con PEG por cromatografía de columna de filtración de gel
en un medio acuoso utilizando proteínas globulares como marcadores
del peso molecular, tal como se describe en detalle en el ejemplo 2,
con el fin de predecir el comportamiento del tamaño aparente in
vivo de moléculas EPO conjugada con PEG. Como resultado, se ha
observado de manera sorprendente que los conjugados de PEG de EPO
nativa rica en cadenas de azúcar tenían un peso molecular aparente
que excedía 100 kDa, y más específicamente que el conjugado de PEG
de EPO nativa preparado utilizando PEG ramificado de 40 kDa tenía
un peso molecular aparente de aproximadamente 800 kDa o más. En
vista de este valor sorprendentemente alto del peso molecular
aparente que es el punto de mira de la invención, junto con el
hecho de que el receptor que se une a la EPO nativa se limitaba a
las fracciones estructurales de la proteína expuesta como
consecuencia de las abundantes cadenas e azúcar de EPO, los autores
de la presente invención han llegado a la conclusión de que la
conjugación de PEG con EPO nativa debería optimizarse para
conseguir eficacia controlando el peso molecular y el número de
moléculas PEG utilizadas para la conjugación.
Por consiguiente, los autores de la presente
invención han preparado además un conjugado
mono-metoxi PEG-EPO
(mono-mPEG-EPO) que tiene una
molécula PEG lineal de 10 kDa, 15 kDa, 20 kDA o 30 kDA por cada
molécula de EPO nativa, y un conjugado mono-metoxi
PEG ramificado-EPO
(mono-mPEG2-EPO) que tiene una
molécula PEG ramificada doble de 10 kDa, 2 kDa por cada molécula
EPO nativa. Tal como se describirá más adelante en los ejemplos a
continuación, una comparación entre estos tres tipos de EPO
conjugadas con PEG indicó que la retención en plasma era más
prolongada en los conjugados di-metoxi
PEG-EPO
(di-mPEG-EPO) y el
mono-metoxi PEG ramificado-EPO
(mono-mPEG2-EPO) que en el conjugado
mono-metoxi PEG-EPO y, en cambio, el
efecto eritropoyético in vivo era mayor en el conjugado
mono-metoxi PEG-EPO. Esto corrobora
el punto de vista de los autores de la invención antes mencionado
de que hay un intervalo óptimo para la conjugación de PEG con EPO
nativa.
La figura 1 presenta un patrón
SS-PAGE de las EPO conjugadas con PEG
(mono-mPEG-EPO y
di-mPEG-EPO) preparadas en la
presente invención, EPO sin conjugar y otras.
La figura 2 presenta un patrón cromático del
conjugado mono-mPEG-EPO con arreglo
a la presente invención, que se digiere con endoproteasa
Lys-C y que se realizó el mapeo por cromatografía de
líquidos.
La figura 3 presenta gráficamente la actividad
de crecimiento celular de células dependientes de EPO en presencia
de EPOs conjugadas con PEG incluyendo el conjugado mono-
mPEG-EPO con arreglo a la presente inven-
ción.
ción.
La figura 4 presenta gráficamente el transcurso
de tiempo de los recuentos de reticulocitos periféricos tras la
administración de EPOs conjugadas con PEG incluyendo el conjugado
mono-mPEG-EPO con arreglo a la
presente invención.
La figura 5 presenta gráficamente el transcurso
de tiempo de los niveles de hemoglobina tras la administración de
EPOs conjugadas con PEG incluyendo el conjugado
mono-mPEG-EPO con arreglo a la
presente invención.
La figura 6 presenta gráficamente el transcurso
de tiempo de recuentos de reticulocitos periféricos tras la
administración de EPOs conjugadas con PEG incluyendo los conjugados
mono-mPEG-EPO y mPEG
mono-ramificado-EPO con arreglo a
la presente invención.
La figura 7 presenta gráficamente el transcurso
de tiempo de los niveles de hemoglobina tras la administración de
EPOs conjugadas con PEG incluyendo los conjugados
mono-mPEG-EPO y mPEG
mono-ramificado-EPO con arreglo a
la presente invención.
La figura 8 presenta gráficamente la dependencia
de dosis de conjugado mono-mPEG-EPO
(PEG(1)-EPO) con arreglo a la presente
invención, tal como se determina según su nivel de hemoglobina.
La figura 9 presenta gráficamente la comparación
entre la inyección continua durante 5 días de EPO y una inyección
única de conjugado mono-mPEG-EPO
(PEG(1)-EPO) con arreglo a la presente
invención.
La figura 10 presenta gráficamente la actividad
del crecimiento celular sobre células dependientes de EPO en
presencia de EPO conjugadas con PEG incluyendo los conjugados
mono-mPEG10K-EPO,
mono-mPEG15-EPO, y
mono-mPEG20K con arreglo a la presente
invención.
La figura 11 presenta gráficamente la actividad
del crecimiento celular en células dependientes de EPO en presencia
de EPOs conjugadas con PEG incluyendo conjugados
mono-mPEG5K-EPO,
mono-mPEG20k-EPO y
mono-mPEG30K-EPO con arreglo a la
presente invención.
La figura 12 representa gráficamente el
transcurso del tiempo de los recuentos de reticulocitos tras la
administración de EPOs conjugadas con PEG incluyendo conjugados
mono-mPEG5K-EPO,
mono-mPEG10K-EPO,
mono-mPEG15K-EPO,
mono-mPEG20k-EPO y
mono-mPEG30K-EPO con arreglo a la
presente invención.
La figura 13 representa gráficamente el
transcurso del tiempo de los niveles de hemoglobina tras la
administración de EPOs conjugadas con PEG incluyendo conjugados
mono-mPEG5K-EPO,
mono-mPEG10K-EPO,
mono-mPEG15K-EPO,
mono-mPEG20k-EPO y
mono-mPEG30K-EPO con arreglo a la
presente invención.
La figura 14 presenta gráficamente el área bajo
la curva de los recuentos de reticulocitos periféricos tras la
administración de EPOs conjugadas con PEG incluyendo conjugados
mono-mPEG5k-EPO,
mono-mPEG10-EPO,
mono-mPEG15-EPO,
mono-mPEG20-EPO y
mono-mPEG30k-EPO según la presente
invención.
Teniendo en cuenta lo anterior, por ejemplo, un
conjugado mono-metoxiPEG-EPO
altamente purificado (mono-mPEG-EPO)
que tiene una molécula PEG unida principalmente al grupo amino del
radical lisina en la posición 52 de la EPO nativa, es deseable para
su uso en la formulación de la EPO conjugada con PEG de la presente
invención para dar lugar a productos farmacéuticos. La presente
solicitud describe asimismo, mono-metoxi
PEG-EPO
(mono-mPEG-EPO) como principal
componente, junto con sus productos secundarios de actividad
relacionada generados durante la conjugación (v.g., conjugado
di-metoxi PEG-EPO
(di-mPEG-EPO).
\newpage
Se pretende que EPO disponible para su uso en la
conjugación de PEG de la presente invención abarque EPOs humanas
recombinantes disponibles en el comercio producidas en células
huésped animales que tienen las mismas cadenas de azúcar que la
eritropoyetina derivada del ser humano.
En la presente invención, se puede utilizar
cualquier derivado de PEG que tenga un extremo metoxilado para la
conjugación con PEG. Por otra parte, el otro extremo sin metoxilar
de dicho derivado de PEG puede convertirse en un éster de ácido
graso inferior de succinimidilo, preferiblemente propionato de
succinimidilo o butirato de succinimidilo (SPA-PEG
o SBA-PEG, respectivamente) para la reacción con un
grupo amino de EPO. Estos derivados PEG pueden proporcionar
conjugados de PEG estables ya que no tienen ninguna fracción éster
en su cadena principal, a excepción de su extremo activado para la
reacción.
Para que EPO nativa se una a los receptores de
EPO en las células precursoras de eritrocito y transmita señale que
llevan diferenciación a las células para convertirse en eritrocitos,
se deberán exponer las regiones estructurales de proteína
esenciales para este propósito. No obstante, en EPO nativa, las
regiones esenciales para la unión de receptor y la transducción de
señal están localizadas en pequeñas fracciones de proteína
expuestas ya que la EPO nativa tiene un contenido en azúcar mucho
más alto que las otras proteínas farmacéuticas recombinantes. Por
lo tanto, cuando tiene lugar la conjugación, en particular con un
compuesto de polímero, en dichas fracciones de proteína expuestas
limitadas, la conjugación reduce la actividad de EPO y, en último
término, no se consigue el objetivo inicial de desarrollar fármacos
de acción sostenida.
En la presente invención, sus autores
completaron la misma determinando el peso molecular deseado y el
sitio para la conjugación en PEG con el fin de proporcionar EPO
nativa en condiciones particulares, tal como se ha mencionado
anteriormente, con una mayor eficacia in vivo y más sostenida
que las conseguidas con EPO nativa, si bien se vio afectada
ligeramente la actividad de EPO al nivel de unión al receptor.
Aunque EPO nativa contiene varios radicales
lisina como radicales de aminoácido con capacidad de conjugación
con PEG, se prefiere en particular una EPO conjugada con PEG en la
que tiene lugar la conjugación con PEG en el grupo amino del
radical de lisina en la posición 52. Uno de los aspectos de la
presente invención abarca una composición de EPOs conjugadas con
PEG teniendo lugar la conjugación con PEG en el grupo amino del
radical lisina en posición 52.
En este caso, la composición de EPO conjugada
con PEG comprende una EPO conjugada con mono-PEG
teniendo lugar la conjugación de PEG en el grupo amino del radical
lisina en la posición 52.
La EPO conjugada con PEG contenida en esta
composición tiene preferiblemente una molécula de PEG por cada
molécula de EPO. Dicha composición de EPO conjugada con PEG
comprende preferiblemente una EPO conjugada con
mono-PEG teniendo lugar la conjugación de PEG en el
grupo amino del radical de lisina en la posición 52.
El peso molecular de PEG utilizado para la
conjugación puede cambiarse según sea apropiado según el grado de
eficacia requerido de la EPO conjugada con PEG resultante, el grado
de disminución de la actividad de EPO, etc. El peso molecular de
una molécula de PEG es de 10 a 30 kDa, preferiblemente de 20 a 30
kDa y es preferible PEG lineal frente al PEG, si tienen el mismo
peso molecular. El peso molecular aparente de EPO conjugada con PEG
en un medio acuoso es de 150 a 650 kDA, preferiblemente de 400 a 650
kDA, según se mide por cromatografía de columna de filtración de
gel en las mismas condiciones que las que se han descrito en el
ejemplo 2.
Las moléculas PEG utilizadas para la conjugación
tienen preferiblemente la forma lineal, pero es posible utilizar
moléculas PEG en forma de estrella o ramificadas siempre y cuando el
peso molecular aparente de la EPO conjugada con PEG resultante se
encuentre dentro del intervalo mencionado. En el caso de PEG en
forma de estrella o ramificado, la conjugación con PEG tiene lugar
también en los mismos radicales de aminoácido que se han mencionado
antes.
Las técnicas para la purificación de EPO
conjugada con PEG incluyen el reparto en dos fases PEG/dextrano, la
cromatografía de filtración de gel, la cromatografía de intercambio
iónico, la cromatografía de interacción hidrófoba, la cromatografía
en fase inversa y la cromatografía de afinidad.
En lo que se refiere a las actividades
fisiológicas y la eficacia sostenida de las EPOs conjugadas con PEG
preparadas en la presente invención, se llevó a cabo una prueba
comparativa de los puntos que se exponen a continuación, entre el
vehículo y las EPOs conjugadas con PEG, incluyendo EPO nativa sin
conjugar, di-metoxi PEG-EPO y PEG
mono ramificado-EPO lo que confirmó que las EPO
conjugadas con PEG de la presente invención tenían una eficacia
mayor y más sostenida in vivo en comparación con la EPO
nativa sin conjugar. Por otra parte, se confirmó la eficacia mayor
y más sostenida in vivo en un conjugado
mono-metoxi PEG-EPO con un peso
molecular aparente de 400 a 650 kDa (ver ejemplos 2 y 9)
produciéndose la conjugación de PEG principalmente en el grupo
amino del radical lisina en la posición 52 utilizando PEG lineal de
20 a 30 kDa.
Más específicamente, se sometieron a ensayo EPO
nativa sin conjugar y EPOs conjugadas con PEG según la presente
invención para determinar su retención en plasma en ratas tras una
inyección única en la vena de la cola, lo que indicó que se obtenía
una retención en plasma más prolongada con EPO conjugada con PEG
que tenía un mayor número de moléculas PEG de peso molecular más
alto y que tenía un peso molecular aparente más alto, según lo
normalmente esperado.
Por otra parte, se sometieron a ensayo las EPO
conjugadas con PEG para determinar su actividad de crecimiento
celular in vitro en células dependientes de EPO (células
BaF/EpoR), lo que indicó que las EPOs conjugadas con PEG de la
presente invención seguían reteniendo la actividad de crecimiento
celular in vitro si bien presentaron cierto descenso en la
actividad en comparación con la EPO nativa sin conjugar. Esto
sugiere que la conjugación con PEG afecta a la afinidad de unión
con el receptor, pero no bloquea completamente la región que se une
directamente con el receptor. Entre las EPOs conjugadas con PEG de
la presente invención, EPO conjugada con
mono-metoxi PEG presentó una actividad mucho más
alta que otras EPOs conjugadas con PEG (ver ejemplo 4).
Por otra parte, se realizó una prueba in
vivo en ratas para llevar un seguimiento de los cambios en los
recuentos de reticulocitos y los niveles de hemoglobina tras una
inyección única en la vena de la cola de EPO nativa sin conjugar o
cada una de las EPO conjugadas con PEG de la presente invención, lo
que confirmó que las EPO conjugadas con PEG de la presente
invención producían buenos resultados tanto en los recuentos de
reticulocitos como en los niveles de hemoglobina. Se ha confirmado
que, al contrario que las proteínas conjugadas con PEG comunes, la
EPO conjugada con PEG de la presente invención produce unos
resultados extremadamente buenos, en particular, cuando la
conjugación con PEG tiene lugar principalmente en el grupo amino del
radical lisina en la posición 52 utilizando PEG de
10-30 kDA para dar un conjugado de EPO con
mono-metoxi PEG con un peso molecular aparente de
150 a 650 kDa, tal como lo demuestran los datos de los recuentos de
reticulocitos y los niveles de hemoglobina (ver los ejemplos 5 y
11).
El uso de EPOs conjugadas con PEG
(preferiblemente, mono-metoxi
PEG-EPO) con arreglo a la presente invención
permite un extendido intervalo para la administración de
eritropoyetina. Por ejemplo, el intervalo se puede extender a una
vez a la semana desde 2-3 veces a la semana, o se
puede extender a una vez cada 10 días o una vez cada 2 semanas
desde una vez cada semana. Por consiguiente, no solamente es posible
facilitar la carga física y de tiempo para los pacientes al reducir
el número de visitas al hospital y las inyecciones dolorosas, sino
que también es posible ahorrar gastos médicos reduciendo también la
tarea de los miembros del personal médico.
La dosis variará dependiendo de distintos
factores y deberá ajustarse según sea apropiado según la causa y la
gravedad de la anemia, la edad y la sensibilidad a eritropoyetina de
cada paciente en particular, etc. Por ejemplo, para una inyección
intravenosa una vez a la semana, la dosis estará comprendida entre 1
y 100 \mug, preferiblemente entre 5 y 50 \mug por adulto.
La EPO conjugada con PEG de la presente
invención se puede administrar a los pacientes a través de diversas
rutas como por ejemplo inyección intravenosa, infusión por goteo
intravenoso, inyección subcutánea, aplicación transmucosal (v.g.,
transpulmonar, transnasal) y aplicación percutánea.
Dependiendo de la ruta de administración
empleada, la EPO conjugada con PEG de la presente invención puede
formularse en la forma de dosis deseada como, por ejemplo
soluciones, preparaciones liofilizadas, jeringuilla
pre-cargada, aguja indolora y sistemas sin aguja
para administración subcutánea, o preparaciones de liberación
sostenida para implantación intracutánea (v.g., microcápsulas,
micelos poliméricos, preparaciones gelationosas a base de polímero,
liposomas), que tienen como resultado formulaciones de EPO más
estables que la eritropoyetina nativa. Las preparaciones de
liberación sostenida de EPO conjugada con PEG son más ventajosas que
las de eritropoyetina nativa, ya que la conjugación con PEG
estabiliza la actividad de eritropoyetina en las preparaciones de
liberación sostenida y porque la eritropoyetina conjugada con PEG
presenta una retención en plasma más prolongada que la
eritropoyetina nativa.
La presente invención quedará descrita con mayor
detalle con los siguientes ejemplos, no pretendiéndose que limiten
el alcance de la invención.
Se añadió a una solución de rhEPO (en tampón
fosfato 100 mM, pH 8,0), propionato de metoxi
PEG-succinimidilo (PEG Mw: aproximadamente 20 kDA,
Shearwater Polymers, Inc) (en adelante denominado
mPEG-SPA) y se agitó a temperatura ambiente durante
30 minutos. Se añadieron 1/10 volúmenes de una solución de glicina
100 mM y se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos más
para desactivar el éster activo. Se llevaron a cabo cuatro
reacciones de esta misma manera. En la tabla 1 se muestra la
concentración y el volumen de la solución de rhEPO y la relación
molar de mPEG-SPA añadido a la rhEPO en cada
reacción. Se concentró cada una de las soluciones de reacción a
través de un Centricon-50 (Millipore)
simultáneamente con el reemplazamiento del disolvente con tampón
fosfato 20 mM-NaCl 150 mM (pH 7,4).
Se purificó cada una de las soluciones
concentradas por filtración de gel sobre Superdex 200 HR 10/30
(Pharmacia Biotech) para recoger fracciones tanto de
mono-mPEG-EPO como de
di-mPEG-EPO, siempre y cuando se
usara la solución concentrada de la reacción 1 en la tabla 1 como
tal para la purificación, al mismo tiempo que las otras se
purificaron con 2 a 4 porciones divididas. En el caso de las
reacciones 2 y 4, se recogió una fracción intermedia que incluía
mono-mPEG-EPO y
di-mPEG-EPO que se eluyó como una
mezcla de ambos conjugados, por separado, y se purificó de nuevo
sobre Superdex 200 HR 10/30 para separar las fracciones de
mono-mPEG-EPO y
di-mPEG-EPO. Se combinaron
respectivamente las fracciones obtenidas a través de una serie de
etapas de purificación para cada conjugado para recoger
mono-mPEG-EPO (3,8 mg) y
di-PEG-EPO (1,6 mg). Se filtraron la
mono-mPEG-EPO y la
di-mPEG-EPO recogidas a través de un
filtro Milex de 0,22 \mum (Millipore) para dar
di-mPEG-EPO esterilizado (1,6 mg) y
mono-mPEG-EPO (3,8 mg). Se
sometieron a electroforesis SDS-PAGE cada una de
estas muestras (aproximadamente 0,75 mg/mL, 1 \muL de cada una
cargado en un pocillo de muestra de un gel electroforético) en un
Gradiente 4-15 PastGel (Pharmacia Biotech) y se
mancharon con Azul R PhastGel (Pharmacia Biotech) (ver figura 1, en
la que se pretende que cada EPO signifique rhEPO).
En este ejemplo, se cuantificaron las EPOs
conjugadas con PEG y rhEPO en cuanto a su absorbancia a una
longitud de onda de 279 nm, dado que un 1 mg/mL de solución de rhEPO
tenía una absorbancia de 0,93 a una longitud de onda de 279 nm
(encontrado en el Biochemical Data Book). En otros ejemplos, se
llevó a cabo la cuantificación, dado que 1 mg/mL de solución de
rhEPO tenía una absorbancia de 1,31 a 281 nm.
Se añadió a una solución de rhEPO (960 \mul,
0,49 mg/mL en tampón fosfato 100 mM, Ph 8,0),
mPEG-SPA (5,32 mg, PEG Mw: aproximadamente 20 kDA,
mPEG-SPA/rhEPO = 10,2 (mol/mol)) y se agitó
suavemente a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de la
adición de una solución de glicina 1M (100 \muL), se diluyó la
solución de reacción en PBS (500 \muL) y se concentró a 390
\muL a través de un Centricon-50. Se aplicó la
solución concentrada a dos columnas Superose 6 HR 10/30 (1,0 x 30
cm, volumen del lecho: 24 mL, Pharmacia Biotech) en serie y se
eluyó con PBS para recoger fracciones tanto de di como de
mono-mPEG-EPO.
Se concentró cada una de las fracciones di- y
mono-mPEG-EPO resultantes a través
de Centricon-50 simultáneamente con el
reemplazamiento del disolvente por agua Milli-Q. A
continuación, se calibró el peso molecular de cada uno de los
conjugados a partir de patrones BSA en análisis
ToF-MS utilizando ácido sinapínico/MeCN 50% (4,05
mg/405 \muL) como matriz y a una relación de muestra/matriz de 5
\mu/5 \muL.
Para su uso en la determinación del peso
molecular por filtración de gel, se diluyó cada una de las
soluciones de muestra proporcionadas para el análisis
ToF-MS (30-35 \muL) en PBS (200
\muL), se aplicó a dos columnas Superose 6 HR 10/30 (1,0 x 30 cm,
volumen de lecho: 24 mL, Pharmacia Biotech) en serie y a
continuación se eluyó con PBS para medir los tiempos de elución
correspondientes de rhEPO sin conjugar y di- y
mono-mPEG-EPOs. Se utilizó un equipo
de calibración del peso molecular para filtración de gel (Amersham
Pharmacia Biotech) para preparar las siguientes soluciones patrón
mixtas: (i) Tiroglobulina (Mw 669000), Aldolasa (Mw 158000) y
quimotripsinogeno A (Mw 25000) y (ii) Ferritina (Mw 440000) y
ovalbúmina (Mw 43000), que fueron sometidas a filtración de gel en
las mismas condiciones. Se preparó una curva de calibración a partir
de los tiempos de elución de cada patrón individual y se utilizaron
para determinar los pesos moleculares correspondientes de rhEPO y
di- y mono-mPEG-EPOs (Preparación y
determinación de peso molecular de EPOs conjugadas con PEG
ramificado).
Se añadió a una solución de rhEPO (500 \muL,
2,27 mg/mL en tampón fosfato 100 mM, pH 8,0),
mPEG2-NHS ramificado (5,32 mg, PEG Mw:
aproximadamente 40 kDA (20 kDa x 2), mPEG2-NHS/rhEPO
ramificado = 2,99 (mol/mol)) y se agitó suavemente a temperatura
ambiente durante 30 minutos. Tras la adición de una solución de
glicina 1 M (50 \muL, en Tris-HCl 20 mM, pH 8,0)
se continuó agitando a temperatura ambiente durante 30 minutos más.
Se reemplazó el disolvente por Tris-HCl 20 mM (pH
8,0) a través de un Centricon-50 y se ajustó a un
volumen final de 750 \muL. Se aplicó la solución resultante a
cromatografía de intercambio de iones en Resourse Q (1 mL,
Pharmacia Biotech) y se eluyó con un gradiente de
0-50% eluyente B (pH 8,0, Tris-HCl
20 mM, NaCl 0,5 M) en eluyente A (pH 8,0, Tris-HCl
20 mM) para recoger fracciones que contenían EPOs conjugadas con PEG
ramificadas que, se concentraron a continuación a 375 \mul a
través de Centricon-50. Tras la adición de PBS (25
\muL), se aplicó la solución a dos columnas Superose 6 HR 10/30
(1,0 x 30 cm, volumen de lecho: 24 mL, Pharmacia Biotech) en serie
y después se eluyeron con PBS para recoger fracciones de
di-mPEG2-EPO
(di-mPEG-EPO ramificada) y
tri-mPEG2-EPO
(tri-mPEG-EPO ramificada) así como
una fracción de mono-mPEG2-EPO
(mono-mPEG-EPO ramificada). Se
concentró cada una de las dos fracciones resultantes a través de
Centricon-50 simultáneamente con el reemplazamiento
del disolvente por agua Mill-Q. A continuación, se
calibró el peso molecular de cada conjugado a partir de patrones
BSA en análisis ToF-MS utilizando ácido
sinapínico/50% MeCN (4,05 mg/405 \muL) como matriz y a una
relación de muestra/matriz de 5 \muL/5 \muL.
Para su uso en la determinación del peso
molecular por cromatografía de filtración de gel, se diluyó cada
una de las soluciones de muestras proporcionadas para el análisis
ToF-MS en PBS (200 \muL, para di-/tri-, 150
\muL para mono-) aplicado a dos columnas Superose 6 HR 10/30 (1,0
x 30 cm, volumen de lecho: 24 mL, Pharmacia Biotech) en serie y
después se eluyeron con PBS para medir los tiempos de elución
correspondientesde rhEPO sin conjugar y di- y
mono-mPEG-EPOs. Se utilizó un equipo
de calibración del peso molecular para filtración de gel (Amersham
Pharmacia Biotech) para preparar las siguientes soluciones patrón
mixtas: (i) Tiroglobulina (Mw 669000), Aldolasa (Mw 158000) y
quimotripsinogeno A (Mw 25000) y (ii) Ferritina (Mw 440000) y
ovalbúmina (Mw 43000), que fueron sometidas después a filtración de
gel en las mismas condiciones. Se preparó una curva de calibración
a partir de los tiempos de elución de cada patrón individual y se
utilizaron para determinar los pesos moleculares correspondientes
de mono-mPEG2-EPO
(mono-mPEG ramificado-EPO).
En la tabla 2 se muestran los pesos moleculares
de rhEPO, di- y mono-mPEG-EPO y
mono-mPEG2-EPO
(mono-mPEG-EPO ramificado) (en la
tabla, se pretende que EPO, lineal y ramificado signifiquen rhEPO,
lineal y ramificado respectivamente).
Se analizó la EPO conjugada con PEG
(mono-mPEG-EPO) del ejemplo 1 para
identificar su sitio para la conjugación con PEG.
Se digirieron
mono-mPEG-EPO (representada como
PEG(1)-EPO en la figura 2) y rhEPO sin
conjugar (representada como EPO intacta en la figura 2) con
endoproteasa Lys-C, seguido del mapeo de péptido en
columna RP/C18.
Se utilizaron
mono-mPEG-EPO (786 \mug/mL, PEG
Mw: aproximadamente 20 kDa) y rhEPO (1 mg/mL) como muestras.
La solución de desnaturalización consistió en
tampón fosfato 300 mM (pH 8,0)/hidrocloruro de guanadina 6M/
EDTA 6 mM. Se añadieron cinco volúmenes de solución de desnaturalización a cada una de las muestras (50 \mug como EPO) para desnaturalizar y reducir EPO durante toda la noche a temperatura ambiente en presencia de DTT (1,5 \mumoles, 50 veces más que Cys). Tras la adición de ácido monoyodoacético (3,15 \mumoles, 2,1 veces más que DTT), se carboximetiló la mezcla de reacción en la oscuridad a temperatura ambiente durante 45 minutos y después se dializó contra Tris-HCl 50 mM (pH 8,5). Se llevó a cabo la digestión durante toda la noche a 37ºC en presencia de Lys-C (1 \mug, sustrato: enzima = 50:1), seguido de la adición de 1/10 volúmenes de TFA 10% para el mapeo con péptido.
EDTA 6 mM. Se añadieron cinco volúmenes de solución de desnaturalización a cada una de las muestras (50 \mug como EPO) para desnaturalizar y reducir EPO durante toda la noche a temperatura ambiente en presencia de DTT (1,5 \mumoles, 50 veces más que Cys). Tras la adición de ácido monoyodoacético (3,15 \mumoles, 2,1 veces más que DTT), se carboximetiló la mezcla de reacción en la oscuridad a temperatura ambiente durante 45 minutos y después se dializó contra Tris-HCl 50 mM (pH 8,5). Se llevó a cabo la digestión durante toda la noche a 37ºC en presencia de Lys-C (1 \mug, sustrato: enzima = 50:1), seguido de la adición de 1/10 volúmenes de TFA 10% para el mapeo con péptido.
Se utilizó una columna Vydac C18 (218TP52, 2,1
mm x 250 mm) como columna y un sistema SMART (Pharmacia) para LC.
Se estableció la velocidad de flujo en 100 \muL/minuto y se llevó
a cabo la detección a 220 nm y 280 nm. Se ajustaron el disolvente y
el gradiente para elución del siguiente modo:
Disolvente A: 0,1% de TFA
Disolvente B: 90% MeCN/0,1% TFA
Gradiente: 5% B/15 min, 5-100%,
B/85 min, 100% B/10 min.
\vskip1.000000\baselineskip
La figura 2 presenta el patrón cromático
obtenido.
Una comparación entre
mono-mPEG-EPO (representado como
PEG(1)-EPO en la figura 2) y rhEPO sin
conjugar (representado como EPO intacto en la figura 2) indica una
pérdida sustancial de L4 y una disminución significativa de L3
(pico L3 & L6 en la figura 2). Esto sugiere que es más probable
que tenga lugar la conjugación con PEG en Lys52 en la frontera
entre L3 y L4. Por otra parte, aparece un nuevo pico entre L5 y L4,
que puede ser relevante para el péptido conjugado con PEG. Por otra
parte, teniendo en cuenta el hecho de que L4 no desaparece
completamente y L1 disminuye ligeramente, existe una especie
molecular potencial en la que tiene lugar la conjugación con PEG en
el N-terminal (Ala 1) indicado por L1. El patrón
cromático sugiere que tiene lugar entre 70% y 80% de conjugación
con PEG en Lys52.
Se lavaron células BaF/EpoR que presentaban
crecimiento dependiente de EPO (Blood, 90, 1867- 1997, PNAS, 93,
9471-1996) repitiendo 4 ciclos de resuspensión en
RPMI que contenía FCS al 2% y centrifugado. A continuación, se
suspendieron las células en RPMI que contenía FCS al 10% a una
densidad de 1 x 10^{6} células/10 mL y se dispensaron en cada uno
de los pocillos de placas de 96 pocillos en un volumen de 50 \muL
por pocillo. Al mismo tiempo, se prepararon muestras de ensayo
utilizando RPMI que contenía FCS al 10% como diluyente para dar la
serie de dilución de EPO correspondiente así como
mono-mPEG-EP,
di-mPEG-EPO y
mono-mPEG ramificado-EPO preparadas
en los ejemplos 1 y 2. Se añadió cada solución de muestra (50
\mul/pocillo, n=3) y se mezcló con células BaF/EpoR en placas de
96 pocillos, seguido de incubación a 37ºC bajo una atmósfera
humificada de CO_{2} al 5% durante 24 horas. Se suplementó cada
pocillo con 10 \muL de Reactivo de recuento de células SF
(Nacalai Tesque, Inc.) y se midió para determinar su absorbancia a
longitudes de onda de 450 nm y 620 nm, que se definió como el valor
en el tiempo 0. Se dejaron en reposo las muestras a temperatura
ambiente durante 6 horas más, seguido de la medida de la
absorbancia a longitudes de onda de 450 nm y 620 nm para hacer el
gráfico de los datos en un formato de gráfico (ver figura 3, en el
que se pretende que mono-, di- ramificado y EPO signifiquen
mono-mPEg-EPO,
di-mPEG-EPO,
mono-mPEG ramificado-EPO y rhEPO,
respectivamente). Entre los datos obtenidos, se analizaron 3 puntos
que presentaban la relación de respuesta a dosis lineal por
regresión lineal para determinar ED_{50} para cada muestra y su
intervalo de confianza al 95% utilizando un programa SAS. En la
tabla 3 se resumen los resultados (en la que
m-PEG-EPO ramificada representa
mPEG-EPO ramificada).
Se utilizaron
mono-mPEG-EPO (786 \mug/mL, que
tenía una molécula mPEG por cada molécula rhEPO) y
di-mPEG-EPO (640 \mug/mL; que
tenía dos moléculas mPEG por molécula rhEPO) preparados en el
ejemplo 1 como materiales de ensayo. Cada uno de ellos fue
PEGlicolado añadiendo aproximadamente 20 mDa de mPEG, que había
sido activado con éster en uno de los extremos, en un grupo amino en
rhEPO, seguido de la purificación por cromatografía de filtración
de gel.
Se diluyó cada EPO conjugada con PEG o rhEPO a
12,5 \mug/mL en solución salina fisiológica que contenía 0,05% de
albúmina de suero de rata y 0,05% de Tween 20. La administración de
medio (vehículo) en solitario fue definida como control negativo.
Se prepararon estas soluciones de administración el primer día de
administración. En este ejemplo, se proporcionaron ratas macho
Slc:SD (Japan SLC; Inc) para el experimento cuando tenían 7 semanas
de vida. El día de la administración del material de ensayo se
dividió a las ratas en 4 grupos de 4 ratas de manera que todos los
grupos tuvieran sustancialmente el mismo recuento de
eritrocitos.
Estos 4 grupos de 4 ratas fueron establecidos
del siguiente modo: grupo de vehículo, grupo rhEPO, grupo
mono-mPEG-EPO y grupo
di-mPEG-EPO. Cada rata recibió una
sola inyección en la vena de la cola de 2 mL/kg (concentración de
muestra: 25 \mug/kg).
El primer día de la administración, y 2, 4, 7,
10, 14, 17, 21, 25, 29, 32, 35 y 39 días después de la
administración, se fijó a cada una de las ratas en un retenedor
anestesiadas y se extrajeron muestras de sangre de una herida
realizada con un pinchazo con una aguja de inyección en la vena de
la cola. Se ensayó cada muestra de sangre para determinar el
recuento de reticulocitos y el nivel de hemoglobina. Se determinó
el nivel de hemoglobina utilizando un micro contador de células
(Sysmex F-800, Toa Medical Electronics Co.,
Ltd.).
En puntos de tiempo individuales, se compararon
el nivel de hemoglobina y el recuento de reticulocitos entre el
grupo de vehículo y el grupo rhEPO,
mono-mPEG-EPO o
di-mPEG-EPO según el ensayo de
comparación múltiple de Dunnett a un nivel de importancia de 5%
para verificar la importancia de loas diferencias en los valores
medios.
En la figura 4 se muestran los resultados (curso
de tiempo del recuento de reticulocitos periféricos) y en la figura
5 (el curso de tiempo de los niveles de hemoglobina). Por otra
parte, en la tabla 4 se muestra el período sostenido de
estimulación de eritropoyesis.
El día 2 tras la administración, todos los
grupos de ensayo presentaron un significativo aumento de los
recuentos de reticulocitos en comparación con el grupo vehículo. En
el grupo rhEPO, el recuento de reticulocitos alcanzó un pico el día
4 tras la administración, y disminuyó por debajo del grupo vehículo
el día 7 tras la administración. En contraste, los grupos
mono-mPEG-EPO y
di-mPEG-EPO presentaron un valor
significativamente más alto que el grupo vehículo el día 10 y el
día 7 tras la administración, respectivamente.
El nivel de hemoglobina del grupo rhEPO alcanzó
un pico el día 4 tras la administración y disminuyó sustancialmente
al mismo nivel que el grupo de vehículo el día 7 tras la
administración. En contraste, los grupos
mono-mPEG-EPO y
di-mPEG-EPO presentaron un pico el
día 14 y el día 10 tras la administración, respectivamente. Estos
grupos también presentaron un nivel significativamente más alto que
el grupo de vehículo el día 25 y el día 21 tras la administración,
respectivamente. El período, durante el cual el grupo de ensayo
presentó un nivel más alto significativamente que el grupo de
control fue solamente un día (día 4) en el grupo rhEPO, mientras
que fue 22 días (días 4-25) y 18 días (día
4-21) en los grupos mono-mPEGEPO y
di-mPEG-EPO, respectivamente (tabla
4).
Se repitió el mismo experimento comparativo que
el que se ha mostrado en el ejemplo 5, a excepción del punto que se
señala a continuación. Se comparó el efecto eritropoyético entre los
siguientes conjugados cuando las ratas recibieron una única
inyección en la vena de la cola de 5 ó 1 \mug/kg:
mono-PEG ramificado-EPO
(br-mPEG-EPO, que tenía una molécula
PEG ramificada) preparado a través de la reacción entre un derivado
activado con éster (Metoxi PEG 20000)_{2} de
aproximadamente 40 kDa ((mPEG)2-propionato de
succinimidilo) y un grupo amino en rhEPO; y
mono-PEG-EPO lineal
(mono-mPEG-EPO, que tenía una
molécula PEG lineal) preparada a través de la reacción de un
derivado de mPEG activado con éster de aproximadamente 20 kDA
(mPEG-propionato de succinimidilo) y un grupo amino
en rhEPO. El día de la administración del material de ensayo, se
dividió a las ratas en grupos de cinco de manera que todos los
grupos tuvieran sustancialmente el mismo nivel de hemoglobina.
El primer día de administración y los días 2, 4,
7, 10, 14, 21, 28 y 35 tras la administración, se fijó cada una de
las ratas anestesiadas y se extrajeron muestras de sangre de una
herida hecha con un pinchazo con una aguja de inyección en la vena
de la cola.
Los resultados se muestran en la tabla 6 (curso
de tiempo de recuento de reticulocitos periféricos) y en la figura
7 (curso de tiempo de los niveles de hemoglobina). Por otra parte,
en la tabla 5 se resume el período sostenido de estimulación de
eritropoyesis. En las figuras 6, 7 y en la tabla 5,
br-mPEG-EPO representa
mono-mPEG ramificado-EPO.
El día 2 tras la administración, todos los
grupos de ensayo presentaron recuentos de reticulocitos
significativamente mayores en comparación con el grupo de vehículo,
y se observó un pico el día 4 tras la administración en cada grupo.
Cuando se comparó el recuento de reticulocitos pico entre los tres
grupos, el grupo mono-mPEG-EPO (5
\mug/kg) fue el más alto de todos, el grupo
mono-mPEG ramificado-EPO (5
\mug/kg) y el grupo mono-mPEG-EPO
(1 \mug/kg) fueron del mismo nivel, y el grupo
mono-mPEG-EPO (1 \mug/kg) fue el
más bajo. El período, durante el cual el grupo de ensayo presentó
recuentos de reticulocitos significativamente más altos que el
grupo vehículo, fue 6 días (días 2-7) en los grupos
5 \mug/kg tanto para mono-mPEG-EPO
como para mono-mPEG ramificado-EPO,
mientras que fue 3 días (días 2-4) en los grupos 1
\mug/kg (figura 6).
El nivel de hemoglobina del grupo
mono-mPEG-EPO (5 \mug/kg) alcanzó
un pico el día 7 tras la administración, y el período durante el
cual el grupo presentó un significativo aumento con respecto al
grupo de vehículo fue 13 días (días 2-14). El grupo
mono-mPEG ramificado-EPO (5
\mug/kg) y el grupo mono-mPEG-EPO
(1 \mug/kg) presentaron ambos un pico el día 4 después de la
administración, y el período durante el cual los grupos presentaron
un aumento significativo con respecto al grupo de vehículo fue 11
días (días 4-14) y 8 días (día
7-14), respectivamente. En contraste, el grupo
mono-mPEG ramificado-EPO (1
\mug/kg) no presentó ninguna diferencia significativa con
respecto al grupo de vehículo a lo largo del período del
experimento. (Figura 7, Tabla 5).
Se verifica la eficacia de
mono-mPEG-EPO preparada en el
ejemplo 1 a dosis de 25 \mug/kg o menos, en combinación con una
comparación entre una sola inyección en la vena de la cola de
mono-mPEg-EPO y una inyección
continua en la vena de la cola de EPO sin conjugar.
Se examinó la eficacia de
mono-mPEG-EPO según el tiempo y la
dependencia de dosis de su efecto eritropoyético cuando se
administró a ratas macho de ocho semanas de vida (n = 5) una única
inyección en la vena de la cola del conjugado a dosis de 25
\mug/kg, 5 \mug/kg, 1 \mug/kg y 0,2 \mug/kg.
En la figura 8 se muestran los cambios de los
niveles de hemoglobina de las ratas que recibieron una única
inyección en la vena de la cola de
mono-mPEg-EPO a dosis de 25
\mug/kg de 25 \mug/kg, 5 \mug/kg, 1 \mug/kg y 0,2 \mug/kg
(en la figura, mono-mPEG-EPO se
representa como PEG(1)-EPO). Cuando se
observó el día 28 después de la administración, se observó que
mono-mPEG-EPO proporcionaba
sustancialmente el mismo nivel de hemoglobina pico y una eficacia
sostenida en los grupos de 25 \mug/kg y 5 \mug/kg, mientras que
los grupos 1 \mug/kg y 0,2 \mug/kg presentaron disminuciones
dependientes de la dosis en el nivel de hemoglobina y una eficacia
sostenida pico.
Se realizó una comparación de la eficacia entre
una única inyección en la vena de la cola de
mono-mPEG-EPO y una inyección
continua en la vena de la cola durante 5 días de rhEPO. En la figura
9 se muestran los resultados obtenidos (en la figura,
mono-mPEG-EPO se representa como
PEG(1)-EPO). Una comparación entre una sola
inyección de mono-mPEG-EPO (5
\mug/kg) y la inyección continua de 5 días de EPO-(1 \mug/kg por
día, 5 \mug/kg en total) indicó que el grupo
mono-mPEG-EPO (5 \mug/kg,
inyección única) presentaba un pico del nivel de hemoglobina más
alto y una eficacia más sostenida. En contraste, una comparación
entre una inyección única de
mono-mPEG-EPO (1 \mug/kg) y la
inyección continua de EPO durante 5 días (0,2 \mug/kg al día, 1
\mug/kg en total) indicó que ambos grupos presentaban
sustancialmente los mismos cambios en los niveles de hemoglobina.
Esto sugiere firmemente que
mono-mPEG-EPO podría administrarse
con menos frecuencia que rhEPO.
Se añade EPO (1,3 mL, 2,27 mg/mL en tampón
fosfato 100 mM, pH 8,0) a mPEG5K-SPA (3,38 mg,
PEG/EPO = 4,09 (mol/mol) y se agitó suavemente a temperatura
ambiente durante 30 minutos. Tras la adición de una solución de
glicina 1 M en agua (130 \muL), se continuó agitando a temperatura
ambiente durante 30 minutos más para desactivar el éster activo. Se
diluyó la solución de reacción en PBS (550 \muL) y se concentró a
325 \muL a través de Centricon-50. Tras la
adición de PBS (150 \muL), se purificó la solución por filtración
de gel en dos columnas Superdex 200 HR 10/30 en serie para recoger
tres fracciones potenciales predominantemente ricas en
mono-mPEG5K-EPO,
di-mPEG5K-EPO y una mezcla de ellas.
Se concentró cada una de las fracciones a través de
Centricon-50 y se volvieron a someter a filtración
de gel en las mismas condiciones para separar las fracciones de
mono-mPEG5K-EPO y
di-mPEG5K-EPO, que se combinaron
después respectivamente para cada uno de los conjugados para dar
mono-mPEG5K-EPO (210 \mug) y
di-mPEG5K-EPO (218 \mug). Se llevó
a cabo SDS-PAGE para confirmar que se correspondía
el peso molecular entre los productos de reacción y las muestras
recogidas.
A continuación, se describen los procedimientos
para la preparación, resumiéndose los detalles de las condiciones
de reacción ((i) a (iv)) en la tabla 6.
Se añadió el volumen (ii) indicado de una
solución EPO (en un tampón fosfato 100 mM, pH 8,0) en la
concentración indicada (i) al volumen indicado (iii) de
mPEG-SPA (lineal) o
br-mPEG-NHS (ramificado) en la
relación PEG/EPO indicada (iv) y se agitaron suavemente a
temperatura ambiente durante 30 minutos. Tras la adición de
volúmenes 1/10 (en función de la solución de EPO proporcionada para
la reacción) de solución de glicina 1M en agua, se continuó
agitando a temperatura ambiente durante 30 minutos más para
desactivar el éster activo. Se reemplazó el disolvente por Tris 20
mM (pH 8,0) a través de Centricon-50. Se aplicó la
solución resultante a cromatografía de intercambio iónico en
RESOURCE Q (1 mL) y se eluyó con un gradiente de
0-100% del mismo eluyente B que el utilizado en el
ejemplo 2 para recoger las fracciones correspondientes que contenían
EPO conjugada con PEG y EPO, seguido del reemplazamiento del
disolvente por PBS a través de Centricon-50. Se
sometió cada una de las soluciones a filtración de gel en las mismas
condiciones que las que se han descrito para la preparación de
mPEG5K-EPO, a excepción de que se utilizaron dos
columnas Superose 6 HR 10/30 (1,0 cm x 30 cm, Pharmacia Biotech) en
serie esta vez en la preparación de
mPEG-15K-EPO,
mPEG30K-EPO y
br-mPEG20K-EPO. Se recogieron las
fraccione que según las previsiones tuvieran contenido en EPO
conjugada con una o dos moléculas de mPEG o br-mPEG
y se concentraron. Las fracciones que contenían
mPEG-EPO mixto con diferentes patrones de
conjugación con PEG fueron concentradas de nuevo y sometidas después
a filtración de gel para recoger
mono-mPEG-EPO y
di-mPEG-EPO.
Se realizó SDS-PAGE para
confirmar que se correspondía el peso molecular entre los productos
de reacción y las muestras recogidas. Estos rendimientos de las
muestras resultantes fueron los que se muestran en la tabla 7.
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Se concentraron varias soluciones de EPO
conjugada con PEG preparadas como se ha descrito en el ejemplo 8
(Preparación de EPOs conjugadas con PEG) a través de
Centricon-50 simultáneamente con el reemplazamiento
del disolvente por agua Milli-Q. Se llevó a cabo el
análisis MALDI-ToF-MS en las mismas
condiciones que las que se han señalado en el ejemplo 2. Asimismo,
se diluyó en PBS cada residuo de muestra proporcionado para el
análisis ToF-MS y se sometió a filtración de gel en
las mismas condiciones que las que se han descrito para el ejemplo
2. En las mismas condiciones que las descritas para mPEG 10K y mPEG
15K en el ejemplo 8, se llevó a cabo la cromatografía de columna de
filtración de gel (GPC) en cada muestra para medir el tiempo de
elución.
En el caso de mPEG30K-EPO, se
dividió su solución concentrada en dos partes alícuotas, una de las
cuales sirvió para el análisis ToF-MS y la otra
para GPC. En el caso de las br-mPEG
10K-EPO y
br-mPEG20K-EPOs, se recogió la
fracción en el tiempo de elución en GPC y sirvió para el análisis
MALDI-ToF-MS tras el reemplazamiento
del disolvente por agua Milli-Q. En la tabla 8 se
muestran los resultados obtenidos.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se lavaron células BaF/EpoR que presentaban
crecimiento dependiente de EPO (Blood, 90, 1867-, 1997, PNAS, 93,
9471-1996) repitiendo 2 ciclos de resuspensión de
RPMI que contenía FCS al 1% y centrifugado. A continuación, se
suspendieron las células en RPMI que contenía FCS al 10% a una
densidad de 1 x 10^{5} células/20 mL y se dispensaron en cada uno
de los pocillos de placas de 96 pocillos en un volumen de 50 \muL
por pocillo. Al mismo tiempo se prepararon muestras de ensayo
utilizando RPMI que contenía FCS al 10% y un diluyente para dar la
serie de diluciones correspondiente de EPO y
mono-mPEG-EPOs. Se añadió cada una
de las soluciones de muestra (50 \muL/pocillo, n = 3) y se mezcló
con las células BaF/EpoR en placas de 96 pocillos, seguido de
incubación a 37ºC en una atmósfera humidificada de CO_{2} al 5%
durante 24 horas. Se suplementó cada pocillo con 10 \muL de
reactivo de recuento de células SF (Nacalai Tesque, Inc.) y se midió
para determinar su absorbancia a longitudes de onda de 450 nm y 620
nm, que se definió como el valor en el tiempo 0. Se dejó en reposo
las placas a temperatura ambiente durante 5 horas más, seguido de la
medida de la absorbancia a longitudes de onda de 450 nm y 620 nm
para representar los datos en formato gráfico (ver figuras 10 y 11,
en las que se pretende que mono y EPO signifiquen
mono-mPEG-EPO y rhEPO,
respectivamente). Entre los datos obtenidos, se analizaron 2 puntos
que emparedaban el punto de 50% de actividad en la relación de
respuesta a dosis por regresión lineal para determinar la ED50 para
cada una de las muestras. En las tablas 9 y 10 se resumen los
resultados.
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\vskip1.000000\baselineskip
Se diluyó cada EPO conjugada con PEG o rhEPO a
2,5 \mug/mL en solución salina fisiológica que contenía 0,05% de
albúmina de suero de rata y 0,05% de Tween 20. La administración del
medio (vehículo) en solitario se definió como el control negativo.
Se prepararon estas soluciones de administración el primer día de la
administración. En este ejemplo, se proporcionaron para el
experimento ratas macho Slc:SD (Japan SLC; Inc.) de
7-8 semanas de vida. El día de la administración del
material, se dividió a las ratas en 7 grupos de 5 ratas de manera
que todos los grupos tuvieran sustancialmente el mismo recuento de
eritrocitos.
Estos 7 grupos de 5 ratas fueron establecidos
del siguiente modo: grupo de vehículo, grupo rhEPO, grupo
mono-mPEG5K-EPO, grupo
mono-mPEG10K-EPO, grupo
mono-mPEG15K-EPO, grupo
mono-mPEG20K-EPO y grupo
mono-mPEG30K-EPO. Cada rata recibió
una única inyección en la vena de la cola de 2 mL/kg (concentración
de muestra: 5 \mug/kg).
El primer día de administración y 2, 4, 5, 7,
10, 15, 21, 29 y 35 días después de la administración, se fijó a
cada una de las ratas en un retenedor sin anestesiar y se extrajeron
muestras de sangre a partir de una herida hecha con un pinchazo con
una aguja de inyección en la vena de la cola. Se sometió a ensayo
cada una de las muestras de sangre para determinar el recuento de
reticulocitos y el nivel de hemoglobina. Se determinó el nivel de
hemoglobina utilizando un micro contador de células (Sysmex
F-800, Toa Medical Electronics Co., Ltd.).
Asimismo, se calculó como indicador de la
eficacia que reflejaba tanto un aumento del recuento de
reticulocitos como un período durante el que se observó el aumento,
la AUC de los recuentos de reticulocitos (Reti-AUC)
el día 15 tras la administración utilizando la regla trapezoidal
para cada grupo.
En la figura 12 se muestran los resultados
(curso de tiempo de recuentos de reticulocitos periféricos), la
figura 13 (curso de tiempo de niveles de hemoglobina) y en la figura
14 (recuento de reticulocitos).
Para conseguir una eficacia más sostenida sin
perder las actividad fisiologicas de EPO nativa, una glucoproteína
rica en cadenas de azúcar, se desarrolló una EPO conjugada con PEG
con una significativa eficacia sostenida, preparada por
introducción de una molécula de PEG en el radical de lisina en la
posición 52 de eritropoyetina derivada de orina humana o
eritropoyetina humana recombinante que tiene las mismas cadenas de
azúcar que la eritropoyetina de origen humano. La capacidad de esta
EPO conjugada con EPO para proporcionar una eficacia más sostenida
sin afectar al efecto eritropoyético inherente de la EPO nativa
permite, por ejemplo, una disminución significativa del número de
administraciones a los pacientes, una disminución del dolor asociado
con la administración a los pacientes, una disminución de la
sobrecarga física y de tiempo para los pacientes enfermos al
reducirse el número de visitas al hospital, así como una disminución
de la sobrecarga y las horas de trabajo para los miembros del
personal médico, que incluye doctores, enfermeras y farmacéuticos,
que trabajan en unas condiciones extremadamente duras. Por
consiguiente, EPO conjugada con PEG supone un ahorro de los costes
médicos en todos los sentidos.
Claims (4)
1. Una eritropoyetina conjugada con
mono-PEG aislada (EPO) que comprende eritropoyetina
derivada de orina humana o una eritropoyetina humana recombinante
que tiene las mismas cadenas de azúcar que la eritropoyetina
derivada de ser humano, conjugada químicamente con polietilen glicol
(PEG) en el grupo amino del radical lisina en la posición 52,
teniendo dicho PEG un peso molecular de 10 a 30 kDa, y un peso
molecular aparente de dicha EPO conjugada con
mono-PEG en un medio acuoso de 150 a 650 kDa por
molécula, según se mide por cromatografía de columna de filtración
de gel, y excluyéndose una emzcla de diferentes EPO conjugadas con
mono-PEG.
2. La EPO conjugada con mono-PEG
de la reivindicación 1 siendo el PEG, PEG lineal.
3. Una composición de EPO conjugada con
mono-PEG que comprende la EPO conjugada con
mono-PEG con arreglo a la reivindicación 1 ó 2.
4. Una formulación de eritropoyetina de acción
sostenida, que comprende la composición de EPO conjugada con PEG
con arreglo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 como
ingrediente activo.
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