ES2322324T3 - Inmumoglobulinas desprovistas de cadenas ligeras. - Google Patents

Abstract

Procedimiento para la preparación de inmunoglobulinas o fragmentos de las mismas dirigidos contra antígenos determinados, que comprende las etapas de: - clonar en vectores, especialmente en fagos y más particularmente en bacteriofagos filamentosos, la secuencia de ADN o de ADNc obtenida a partir de los linfocitos de Camélidos previamente inmunizados con determinados antígenos, capaces de producir una inmunoglobulina o un fragmento de la misma, dicha inmunoglobulina comprendiendo dos cadenas polipeptídicas pesadas, estando cada cadena pesada capaz de reconocer y unirse a un antígeno, conteniendo dicha inmunoglobulina una región variable (VHH) y una región constante, estando dicha región constante desprovista de primer dominio constante C H1, en el que la inmunoglobulina está desprovista de cadenas polipeptídicas ligeras, - transformar las células procarióticas con los vectores anteriores en condiciones que permitan la producción de inmunoglobulinas o fragmentos de las mismas, - seleccionar la inmunoglobulina apropiadas o un fragmento de las mismas, sometiendo las células transformadas a selección por afinidad al antígeno, - recuperar las inmunoglobulinas o fragmentos de las mismas que tienen la especificidad deseada.

Description

Inmunoglobulinas desprovistas de cadenas ligeras.

La invención se refiere a nuevas inmunoglobulinas aisladas que están desprovistas de cadenas polipeptídicas ligeras. Estas inmunoglobulinas no consisten en los productos de degradación de las inmunoglobulinas compuestas tanto de cadenas polipeptídicas pesadas como de cadenas polipeptídicas ligeras, sino que por el contrario, la invención define un nuevo miembro de la familia de las inmunoglobulinas, especialmente un nuevo tipo de moléculas capaces de estar implicadas en el reconocimiento inmune. Tales inmunoglobulinas pueden usarse para varios propósitos, especialmente para propósitos de diagnóstico o terapéuticos, incluyendo la protección frente a los agentes patológicos o la regulación de la expresión o la actividad de las proteínas.

Hasta ahora, la estructura propuesta para las inmunoglobulinas consiste en un modelo de cuatro cadenas que se refiere a la presencia de dos cadenas polipeptídicas ligeras idénticas (cadenas ligeras) y dos cadenas polipeptídicas pesadas idénticas (cadenas pesadas) unidas mediante puentes disulfuro para formar macromoléculas con forma de Y o de T. Estas cadenas están compuestas por una región constante y una región variable, estando la región constante subdividida en varios dominios. Las dos cadenas polipeptídicas pesadas se unen normalmente mediante puentes disulfuro en una denominada "región bisagra" situada entre el primer y segundo dominios de la región constante.

Entre las proteínas que forman la clase de las inmunoglobulinas, la mayoría de ellas son anticuerpos y en consecuencia, presentan un sitio de unión al antígeno o varios sitios de unión al antígeno.

Según el modelo de cuatro cadenas, el sitio de unión al antígeno de un anticuerpo se localiza en los dominios variables de cada una de las cadenas pesada y ligera y requiere la asociación de los dominios variables de las cadenas pesada y ligera.

Para la definición de estas inmunoglobulinas de modelo de cuatro cadenas, se hace referencia a Roitt. 1 et al. (Immunology-second-Edition Gower Medical Publishing USA, 1989). La referencia se hace especialmente a la parte concerniente a la definición de las inmunoglobulinas de cuatro cadenas, a sus estructuras polipeptídicas y genéticas, a la definición de sus regiones variables y constantes y a la obtención de los fragmentos producidos por la degradación enzimática según técnicas bien conocidas.

Los inventores han establecido sorprendentemente que pueden aislarse moléculas diferentes a partir de animales que las producen naturalmente, moléculas que tienen propiedades funcionales de inmunoglobulinas, estando esas funciones relacionadas en algunos casos con elementos estructurales que son distintos de los implicados en la función de las inmunoglobulinas de cuatro cadenas debido, por ejemplo, a la ausencia de cadenas ligeras.

La invención se refiere a inmunoglobulinas del modelo de dos cadenas que no corresponden ni con los fragmentos obtenidos por ejemplo mediante la degradación, en particular la degradación enzimática, de una inmunoglobulina del modelo de cuatro cadenas, ni corresponde con la expresión en las células huésped del ADN que codifica para la región constante o la variable de una inmunoglobulina natural del modelo de cuatro cadenas o con una parte de estas regiones, ni corresponde con los anticuerpos producidos en las linfopatías, por ejemplo, en ratones, ratones, ratas o
humanos.

E.S. Ward et al. (1) ha descrito algunos experimentos realizados en los dominios variables de las cadenas polipeptídicas pesadas (V_{H}) o/y en las cadenas polipeptídicas ligeras (V_{K}/F_{v}) para probar la capacidad de estos dominios variables para unir antígenos específicos. Para este propósito, se preparó una librería de genes V_{H} a partir del ADN genómico del bazo del ratón inmunizado previamente con estos antígenos específicos.

Ward et al han descrito en su publicación que los dominios V_{H} son relativamente adhesivos, presumiblemente debido a la superficie hidrófoba expuesta, normalmente tapada por los dominios V_{K} o V_{\lambda}. Por consiguiente, ellos se imaginaron que debería ser posible diseñar dominios V_{H} que tuvieran propiedades mejoradas y además, que los dominios V_{H} con actividades de unión pudieran servir como los componentes básicos para fabricar fragmentos variables (fragmentos F_{V},) o anticuerpos completos.

La publicación de Blier P.R. et al (The Journal of Immunology, vol. 139, 3996-4006, nº 12, 15 de diciembre de 1987) describe la siguiente secuencia de aminoácidos: QVQLQQPGABLGKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWV
KQRPGRGREWIGRIDPNSGGTKYNEKFKSKATLTVDKPBSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAR.

La invención no parte de la idea de que los diferentes fragmentos (cadenas ligeras y pesadas) y los diferentes dominios de estos fragmentos de la inmunoglobulina del modelo de cuatro cadenas pueda modificarse para definir sitios de unión al antígeno nuevos o mejorados o una inmunoglobulina del modelo de cuatro cadenas.

Los inventores han determinado que las inmunoglobulinas pueden tener una estructura diferente al modelo conocido de cuatro cadenas y que tales inmunoglobulinas diferentes ofrecen nuevos medios para la preparación de reactivas de diagnóstico, agentes terapéuticos o cualquier otro reactivo para su uso en investigación o para propósitos industriales.

Por tanto, la invención proporciona nuevas inmunoglobulinas que son capaces de mostrar propiedades funcionales de las inmunoglobulinas del modelo de cuatro cadenas, aunque su estructura parezca ser más apropiada en muchas circunstancias para su uso, su preparación y en algunos casos, para su modificación. Además, estas moléculas pueden considerarse como estructuras principales para la modificación de otras inmunoglobulinas. Las ventajas proporcionadas por estas inmunoglobulinas comprenden la posibilidad de prepararlas con una mayor facilidad.

De acuerdo con esto, la invención se refiere a inmunoglobulinas caracterizadas porque comprenden dos cadenas polipeptídicas pesadas suficientes para la formación de un sitio completo de unión al antígeno o de varios sitios de unión al antígeno, estando además estas inmunoglobulinas desprovistas de cadenas polipeptídicas ligeras. Estas inmunoglobulinas se caracterizan además por el hecho de que son el producto de la expresión en una célula huésped procariótica o eucariótica, de un ADN o de un ADNc que tiene la secuencia de una inmunoglobulina desprovista de cadenas ligeras, obtenible a partir de linfocitos o de otras células de camélidos.

Las inmunoglobulinas de la invención pueden obtenerse, por ejemplo, a partir de las secuencias que se describen en la figura 7.

Las inmunoglobulinas de la invención, que están desprovistas de cadenas ligeras, están de manera que los dominios variables de sus cadenas pesadas tengan propiedades que difieren de las de los VH de la inmunoglobulina de cuatro cadenas. El dominio variable de una inmunoglobulina de cadena pesada de la invención no tiene sitios de interacción normales con el dominio V_{I}, ni con el C_{H}1 que no existe en las inmunoglobulinas de cadena pesada. Por lo tanto, es un fragmento novedoso en muchas de sus propiedades, tal como la solubilidad y la posición del sitio de unión. Por razones de claridad, lo llamaremos VHH en este texto para distinguirlo de los VH clásicos de las inmunoglobulinas de cuatro cadenas.

Por "un sitio de unión al antígeno completo" se quiere decir, de acuerdo con la invención, un sitio que permitirá por sí solo el reconocimiento y la unión completa de un antígeno. Esto podría verificarse mediante cualquier método conocido con respecto a los ensayos de la afinidad de la unión.

Algunas veces serán denominadas "inmunoglobulinas de cadenas pesadas" en las siguientes páginas. Preferiblemente estas inmunoglobulinas están en una forma pura.

Las inmunoglobulinas son obtenidas en células procarióticas, especialmente en células de E. coli por un proceso que comprende los pasos de:

a)

clonar en un vector Bluescript una secuencia de ADN o ADNc que codifica para el dominio V_{HH} de una inmunoglobulina desprovista de cadena ligera obtenida por ejemplo a partir de linfocitos o Camellos,

b)

recuperar el fragmento clonado después de la amplificación usando un cebador 5' que contiene un sitio Xho y un cebador 3' que contiene el sitio Spe que tiene la siguiente secuencia

TC TTA ACT AGT GAG GAG ACG GTG ACC TG,

c)

clonar el fragmento recuperado en fase en el vector inmuno PBS después de la digestión del vector con las enzimas de restricción Xho y Spe,

d)

transformar las células hospederas, especialmente de E. coli por transfección con el vector inmuno PBS recombinante del paso c;

e)

recuperar el producto de expresión de la secuencia de codificación de V_{HH}, por ejemplo usando anticuerpos cultivados contra el dominio V_{HH} del dromedario.

Las inmunoglobulinas pueden ser inmunoglobulinas heteroespecíficas obtenidas por un proceso que comprende los pasos de:

- obtener una primera secuencia de ADN o ADNc que codifica para un dominio V_{HH} o parte del mismo que tiene una especificidad determinada contra un antígeno dado y comprendido entre los sitios Xho y Spe,

- obtener una segunda secuencia de ADN o ADNc que codifica para un dominio V_{HH} o parte del mismo, que tiene una especificidad determinada diferente de la especificidad de la primera secuencia de ADN o ADNc y comprendida entre los sitios Spe y EcoRI,

- digerir un vector inmuno PBS con las enzimas de restricción EcoRI y XhoI,

- ligar las secuencias obtenidas de ADN o de ADNc que codifican para los dominios V_{HH,} de manera que las secuencias de ADN o de ADNc se donen en serie en el vector,

- transformar una célula huésped, especialmente la célula E. coli, mediante transfección y recuperar las inmunoglobulinas obtenidas.

En una realización, las inmunoglobulinas son obtenibles mediante un proceso que comprende las etapas de:

- obtener una secuencia de ADN o de ADNc que codifique para un dominio V_{HH} o para una parte del mismo, que tenga un determinado sitio específico de unión al antígeno,

- amplificar el ADN o el ADNc obtenido usando un cebador 5' que contenga un codón de iniciación y un sitio HindIII, y un cebadar 3' que contenga un codón de terminación que tenga un sitio XhoI, recombinar el ADN o el ADNc amplificado en los sitios HindIII (posición 2650) y XhoI (posición 4067) de un plásmido pMM984,

- transfectar las células permisivas, especialmente las células NB-E, con el plásmido recombinante,

- recuperar los productos obtenidos.

La expresión correcta puede verificarse con anticuerpos dirigidos contra una región de un dominio V_{HH}, especialmente mediante un ensayo ELISA.

De acuerdo con otra realización particular de este proceso, las inmunoglobulinas se donan en un parvovirus.

En otro ejemplo, estas inmunoglobulinas son obtenibles mediante un proceso que comprende la donación adicional de una segunda secuencia de ADN o de ADNc que tiene otro sitio determinado de unión al antígeno, en el plásmido pMM984.

Tal inmunoglobulina puede caracterizarse además porque es obtenible mediante un proceso en el que el vector es Yep 52 y la célula recombinante transformada es una levadura, especialmente S. cerevisiae.

Una inmunoglobulina particular se caracteriza porque tiene una actividad catalítica, especialmente porque está dirigida contra un antígeno que imita un estado activado de un sustrato dado. Estos anticuerpos catalíticos pueden modificarse en el nivel de su sitio de unión, mediante mutagénesis al azar o dirigida, con el fin de incrementar o modificar su función catalítica. Puede hacerse referencia a la publicación de Lerner et al (TIBS, noviembre de 1987, 427-430) para la técnica general para la preparación de tales inmunoglobulinas catalíticas.

De acuerdo con un ejemplo preferido, las inmunoglobulinas se caracterizan porque sus regiones variables contienen, en la posición 45, un aminoácido que es diferente de un residuo de leucina, prolina o glutamina.

Además, las inmunoglobulinas de cadena pesada no son productos característicos de los linfocitos de los animales ni de los linfocitos de un paciente humano que sufre de linfopatías. Tales inmunoglobulinas producidas en las linfopatías son monoclonales en su origen y resultan de mutaciones patogénicas en el nivel genómico. Aparentemente no tienen sitio de unión al antígeno.

Las dos cadenas polipeptídicas pesadas de estas inmunoglobulinas pueden unirse mediante una región bisagra, de acuerdo con la definición de Roitt et al.

En un ejemplo particular, las inmunoglobulinas correspondientes a las moléculas definidas anteriormente son capaces de actuar como anticuerpos.

El sitio(s) de unión al antígeno de las inmunoglobulinas de la invención se localizan en la región variable de la cadena pesada.

En un grupo particular de estas inmunoglobulinas, cada cadena polipeptídica pesada contiene un sitio de unión al antígeno en su región variable, y estos sitios corresponden con la misma secuencia de aminoácidos.

En un ejemplo adicional, las inmunoglobulinas se caracterizan porque sus cadenas polipeptídicas pesadas contienen una región variable (V_{HH}) y una región constante (C_{H}), de acuerdo con la definición de Roitt et al, pero están desprovistas del primer dominio de su región constante. Este primer dominio de la región constante se denomina C_{H}1.

Estas inmunoglobulinas que no tienen el dominio C_{H}1 están de manera que la región variable de sus cadenas se una directamente a la región bisagra en la parte C-terminal de la región variable.

Las inmunoglobulinas del tipo descrito anteriormente en este documento pueden comprender las inmunoglobulinas de tipo G y especialmente, las inmunoglobulinas que se definen como inmunoglobulinas de clase 2 (IgG2) o inmunoglobulinas de clase 3 (IgG3).

La ausencia de cadena ligera y del primer dominio constante conduce a una modificación de la nomenclatura de los fragmentos de inmunoglobulinas obtenidos por digestión enzimática, de acuerdo con Roitt et al.

Los términos Fc y pFc por una parte, y Fc' y pFc' por la otra, correspondientes respectivamente a los fragmentos de la digestión de papaina y pepsina, se mantienen.

Los términos Fab, F(ab)_{2}, F(ab')2, Fabc, Fd y Fv ya no son aplicables en su sentido original, ya que estos fragmentos tienen, o bien una cadena ligera, la parte variable de la cadena ligera o el dominio C_{H}1.

Los fragmentos obtenidos por la digestión de papaína y compuestos por el dominio VHH de la región bisagra, se denominarán FV_{HH}h o F(V_{HH}h)_{2}, dependiendo de si permanecen o no unidos mediante puentes disulfuro.

Las inmunoglobulinas que responden a las definiciones dadas anteriormente en este documento pueden originarse a partir de animales, especialmente a partir de animales de la familia de los camélidos. Los inventores han encontrado que las inmunoglobulinas de cadena pesada que están presentes en los camélidos no están asociadas con una situación patológica que induciría a la producción de anticuerpos anormales con respecto a las inmunoglobulinas de cuatro cadenas. Partiendo de la base de un estudio comparativo de camélidos del viejo mundo (Camelus bactrianus y Camelus dromedarius) y de camélidos del nuevo mundo (por ejemplo Lama Paccos, Lama Glama y Lama Vicugna), los inventores han demostrado que las inmunoglobulinas de la invención, que están desprovistas de cadenas polipeptidicas ligeras, se encuentran en todas las especies. No obstante, las diferencias pueden ser evidentes en el peso molecular de estas inmunoglobulinas, dependiendo de los animales. En especial, el peso molecular de una cadena pesada contenida en estas inmunoglobulinas puede ser desde aproximadamente 43 kd hasta aproximadamente 47 kd, en particular,
45 kd.

Ventajosamente, las inmunoglobulinas de cadena pesada de la invención se secretan en la sangre de los camélidos.

Las inmunoglobulinas de acuerdo con este ejemplo particular son obtenibles mediante purificación a partir de suero de camélidos, y un proceso para la purificación se describe en detalle en los ejemplos. En el caso en el que las inmunoglobulinas se obtienen a partir de los Camélidos, las inmunoglobulinas no están en su entorno biológico natural.

La inmunoglobulina IgG2 como obtenible mediante purificación a partir del suero de los camélidos puede caracterizarse porque:

- no se adsorbe mediante cromatografía en columna de Sepharosa Proteína G

- se adsorbe mediante cromatografía en columna de Sepharosa Proteína A

- tiene un peso molecular de alrededor de 100 kd tras la elución con un tampón de pH 4,5 (NaCl 0,15 M, ácido acético al 0,58%), ajustado a pH 4,5 mediante NaOH),

- consiste en cadenas polipeptídicas pesadas \gamma2 de un peso molecular de alrededor de 46 kd, preferiblemente de 45 tras reducción.

Otro grupo de inmunoglobulinas correspondientes a IgG3, obtenibles mediante purificación a partir del suero de los Camélidos, se caracteriza porque la inmunoglobulina:

- se adsorbe mediante cromatografía en una columna de Sepharosa Proteína A,

- tiene un peso molecular de alrededor de 100 kd tras la elución con un tampón de pH 3,5 (NaCl 0,15 M, ácido acético al 0,58%),

- se adsorbe mediante cromatografía en una columna de Sepharosa Proteína G y se eluye con un tampón a pH 3,5 (NaCl 0,15 M, ácido acético al 0,58%),

- consiste en cadenas polipeptídicas pesadas \gamma3 de un peso molecular de alrededor de 45 kd, en particular entre 43 y 47 kd tras reducción.

Las inmunoglobulinas de la invención que están desprovistas de cadenas ligeras, comprenden no obstante en sus cadenas pesadas, una región constante y una región variable. La región constante comprende diferentes dominios.

La región variable de las inmunoglobulinas de la invención comprende estructuras (FW) y regiones que determinan la complementaridad (CDR), especialmente 4 estructuras y 3 regiones de complementaridad. Se distingue de las inmunoglobulinas de cuatro cadenas, especialmente por el hecho de que esta región variable puede contener por sí misma uno o varios sitios de unión al antígeno, sin contribución de la región variable de una cadena ligera que está ausente.

Las secuencias de aminoácidos de las estructuras 1 y 4 comprenden, entre otros, secuencias de aminoácidos respectivamente que pueden seleccionarse de los siguientes:

\newpage

\global\parskip0.900000\baselineskip

para el dominio de la estructura 1

1

para el dominio de la estructura 4

2

para el dominio CDR3

3

Tal como se ha afirmado anteriormente, las inmunoglobulinas de la invención están preferiblemente desprovistas de la totalidad de su dominio C_{H}1.

Tales inmunoglobulinas comprenden los dominios C_{H}2 y C_{H}3 en la región C-terminal con respecto a la región bisagra.

La región constante de las inmunoglobulinas comprende los dominios C_{H}2 y C_{H}3 que comprenden una secuencia de aminoácidos seleccionada de las siguientes:

para el dominio C_{H}2:

4

para el dominio C_{H}3:

5

Resulta interesante que los inventores han demostrado que la región bisagra de las inmunoglobulinas de la invención puede presentar longitudes variables. Cuando estas inmunoglobulinas actúen como anticuerpos, la longitud de la región bisagra participará de la determinación de la distancia separando los sitios de unión al antígeno.

Preferiblemente, una inmunoglobulina de acuerdo con la invención se caracteriza porque su región bisagra comprende desde 0 hasta 50 aminoácidos.

Las secuencias particulares de la región bisagra de las inmunoglobulinas de la invención son las siguientes:

GTNEVCKCPKCP

o,

EPKIPQPQPKPQPQPQPQPKPQPKPEPECTCPKCP

La región bisagra corta corresponde a una molécula de IgG3 y la secuencia bisagra larga corresponde a una molécula IgG2.

Los V_{HH} aislados derivados de las inmunoglobulinas de cadena pesada o de las librerías de V_{HH} correspondientes a las inmunoglobulinas de cadena pesada, pueden distinguirse de la clonación de los V_{HH} de las inmunoglobulinas modelo de cuatro cadenas partiendo de la base de las características de la secuencia que caracteriza las inmunoglobulinas de cadena pesada.

La región V_{HH} de la inmunoglobulina de cadena pesada del camello muestra varias diferencias con las regiones V_{HH} derivadas de las inmunoglobulinas de 4 cadenas de todas las especies examinadas. A los niveles de los residuos implicados en las interacciones V_{HH}/V_{L}, se observa una diferencia importante a nivel de la posición 45 (FW) que es leucina prácticamente siempre en las inmunoglobulinas de 4 cadenas (98%), siendo los otros aminoácidos en esta posición prolina (1%) o glutamina (1%).

En la inmunoglobulina de cadena pesada del camello, en las secuencias examinadas en la actualidad, la leucina en la posición 45 sólo se encuentra una vez. Podría originarse a partir de una inmunoglobulina de cuatro cadenas. En otros casos, se sustituye por un residuo de arginina, cisteína o ácido glutámico. La presencia de aminoácidos cargados en esta posición debe contribuir a hacer que el V_{HH} sea más soluble.

La sustitución por residuos específicos del camélido, tales como aquellos de la posición 45, parece ser interesante para la construcción de las regiones VHH diseñadas derivadas del repertorio de V_{HH} de las inmunoglobulinas de 4 cadenas.

\global\parskip1.000000\baselineskip

Una segunda característica específica del dominio VHH del camélido es la presencia frecuente de una cisteína en la región CDR_{3} asociada con una cisteína en la posición 31 ó 33 del CDR_{1} o la región FW2 en la posición 45. La posibilidad de establecer un puente disulfuro entre la región CDR_{3} y el resto del dominio variable contribuiría a la estabilidad y la colocación del sitio de unión.

Con la excepción de una proteína única del mieloma patogénico (DAW), tal puente disulfuro nunca se ha encontrado en las regiones V de la inmunoglobulina derivada de las inmunoglobulinas de 4 cadenas.

Las inmunoglobulinas de cadena pesada tienen la ventaja particular adicional de no ser adhesivas. De acuerdo con esto, estas inmunoglobulinas que están presentes en el suero, se agregan mucho menos que las cadenas pesadas aisladas de una inmunoglobulina de cuatro cadenas. Las inmunoglobulinas de la invención son solubles a una concentración superior a 0,5 mg/ml, preferiblemente superior a 1 mg/ml y más ventajosamente por encima de 2 mg/ml.

Estas inmunoglobulinas llevan además un amplio repertorio de unión al antígeno y sufren maduración de afinidad y especificidad in vivo. De acuerdo con esto, permiten el aislamiento y la preparación de anticuerpos que tienen especificidad definida por lo que se refiere a antígenos determinados.

Otra propiedad interesante de las inmunoglobulinas es que pueden modificarse y adaptarse especialmente a los humanos. Especialmente, es posible sustituir toda o parte de la región constante de estas inmunoglobulinas mediante toda o parte de una región constante de un anticuerpo humano. Por ejemplo, los dominios C_{H}2 y/o C_{H}3 de la inmunoglobulina podrían sustituirse por los dominios C_{H}2 y/o C_{H}3 de la inmunoglobulina IgG \gamma3 humana.

En tales anticuerpos adaptados a los humanos, también es posible sustituir una parte de la secuencia variable, particularmente uno o más de los residuos de estructura que no intervienen en el sitio de unión, por residuos humanos de estructura, o por una parte de un anticuerpo humano.

A la inversa, las características (especialmente los fragmentos peptídicos) de las regiones V_{HH} de la inmunoglobulina de cadena pesada podrían introducirse en las regiones V_{H} o V_{L} derivadas de las inmunoglobulinas de cuatro cadenas con, por ejemplo, la finalidad de lograr una mayor solubilidad de las inmunoglobulinas.

La invención se refiere además a un fragmento de una inmunoglobulina que se ha descrito anteriormente en este documento y especialmente a un fragmento seleccionado del grupo siguiente:

- un fragmento que corresponde a una cadena polipeptídica pesada de una inmunoglobulina desprovista de cadenas ligeras,

- los fragmentos obtenidos por la digestión enzimática de las inmunoglobulinas de la invención, especialmente aquellos obtenidos por la digestión parcial con papaína que conduce al fragmento Fc (fragmento constante) y que conduce al fragmento FV_{HH}h (que contiene los sitios de unión al antígeno de las cadenas pesadas) o su dimero F(V_{HH}H)_{2}, o un fragmento obtenido mediante la digestión adicional con papaína del fragmento Fc, que conduce al fragmento pFc correspondiente a la parte C-terminal del fragmento Fc,

- los fragmentos homólogos obtenidos con otras enzimas proteolíticas,

- un fragmento de al menos 10, y preferiblemente 20, aminoácidos de la región variable de la inmunoglobulina, o la región variable completa, especialmente un fragmento correspondiente a los dominios V_{HH} aislados o a los dímeros V_{HH} unidos al disulfuro de la bisagra,

- un fragmento que corresponde a la región bisagra de la inmunoglobulina, o a al menos 6 aminoácidos de esta región bisagra,

- un fragmento de la región bisagra que comprende una secuencia repetida de Pro-X,

- un fragmento que corresponde a al menos 10, y preferiblemente 20, aminoácidos de la región constante o a la región constante completa de la inmunoglobulina.

La invención también se refiere a un fragmento que comprende una secuencia repetida, Pro-X, secuencia repetida que contiene al menos 3 repeticiones de Pro-X, siendo X cualquier aminoácido y preferiblemente Gln (glutamina), Lys (lisina) o Glu (ácido glutámico); un fragmento particular repetido está compuesto por una repetición de 12 veces la secuencia Pro-X.

Tal fragmento puede usarse ventajosamente como un vínculo entre los diferentes tipos de moléculas.

Los aminoácidos de la secuencia Pro-X se escogen entre cualquier aminoácido natural o no natural.

Los fragmentos pueden obtenerse por degradación enzimática de las inmunoglobulinas. También pueden obtenerse por la expresión en células u organismos de la secuencia de nucleótidos que codifica para las inmunoglobulinas, o pueden sintetizarse químicamente.

La invención también se refiere a anticuerpos antiidiotipo que pertenecen a las clases de inmunoglobulina de cadena pesada. Tales anti-idiotipos pueden producirse frente a idiotipos humanos o animales. Una particularidad de estos antiidiotipos es que pueden usarse como vacunas idiotípicas, en particular para la vacunación frente a glicoproteínas o glicolípidos y donde el carbohidrato determina el epítopo.

La invención también se refiere a anti-idiotipos capaces de reconocer idiotipos de inmunoglobulinas de cadena pesada.

Tales anticuerpos anti-idiotipo pueden ser anticuerpos singeneicos o alogénicos o xenogeneicos.

La invención también concierne a secuencias de nucleótidos que codifican para toda o parte de una proteína cuya secuencia de aminoácidos comprende una secuencia peptídica seleccionada de las siguientes:

6

700

o

8

Tales secuencias de nucleótidos pueden deducirse de las secuencias de aminoácidos, teniendo en cuenta la degeneración del código genético. Pueden sintetizarse o aislarse a partir de las células que producen las inmunoglobulinas de la invención.

Un procedimiento para la obtención de tales secuencias de ADN se describe en los ejemplos.

La invención también contempla el ARN, especialmente las secuencias de ARNm que corresponden a esas secuencias de ADN y que también corresponden a las secuencias de ADNc.

Las secuencias de nucleótidos de la invención pueden usarse además para la preparación de cebadores apropiados para la detección en las células o la selección de las librerías de ADN o ADNc para aislar las secuencias de nucleótidos que codifican para las inmunoglobulinas de la invención.

Tales secuencias de nucleótidos pueden usarse para la preparación de vectores recombinantes y la expresión de estas secuencias contenidas en los vectores por células huéspedes, especialmente células procarióticas como las bacterias, o también células eucarióticas y, por ejemplo, células CHO, células de insectos, células de simios como las células Vero, o cualquier otra célula de mamífero. Especialmente, el hecho de que las inmunoglobulinas de la invención estén desprovistas de cadenas ligeras, permite secretarias en las células eucarióticas, puesto que no hay necesidad de tener recursos para la etapa que consiste en la formación de la proteína BIP que se requiere en las inmunoglobulinas de cuatro cadenas.

Las inadecuaciones de los métodos conocidos para producir anticuerpos monoclonales o inmunoglobulinas mediante tecnología de ADN recombinante vienen de la necesidad, en la inmensa mayoría de los casos, de clonar simultáneamente los dominios V_{H} y V_{L} que corresponden a los sitios de unión específicos de las inmunoglobulinas de 4 cadenas. Los animales, y especialmente los camélidos, que producen inmunoglobulinas de cadena pesada de acuerdo con la invención, y posiblemente otras especies de vertebrados, son capaces de producir inmunoglobulinas de cadena pesada de las cuales, el sitio de unión se localiza exclusivamente en el domino V_{HH}. A diferencia de las pocas inmunoglobulinas de cadena pesada producidas en otras especies mediante separación de cadenas o mediante clonación directa, las inmunoglobulinas de cadena pesada de los camélidos han sufrido una amplia maduración in vivo. Además, su región V ha evolucionado naturalmente para funcionar en ausencia de la V_{L}. Por tanto, son ideales para producir anticuerpos monoclonales mediante tecnología de ADN recombinante. Como la obtención de los clones específicos de unión al antígeno no depende de un proceso estocástico que necesite un gran número de células recombinantes, esto permite también un examen mucho más amplio del repertorio.

Esto puede hacerse a nivel del repertorio de V_{HH} no reconfigurado, usando ADN derivado de un tejido o célula tipo escogidos arbitrariamente, o a nivel del repertorio de V_{HH} no reconfigurado, usando ADN obtenido a partir de los linfocitos B. Sin embargo, resulta más interesante transcribir el ARNm a partir de las células que producen anticuerpos y clonar el ADNc con o sin amplificación anterior en un vector adecuado. Esto dará como resultado la obtención de anticuerpos que ya han sufrido maduración de afinidad.

El examen de un gran repertorio debe demostrar que es particularmente útil en la búsqueda de anticuerpos con actividades catalíticas.

Por tanto, la invención proporciona librerías que pueden generarse en una forma que incluya parte de la secuencia bisagra. La identificación es simple ya que la bisagra está unida directamente al dominio V_{HH}.

Estas librerías pueden obtenerse mediante clonación del ADNc a partir de células linfoides con o sin amplificación anterior por PCR. Los cebadores de PCR se localizan en las secuencias promotora, líder o de estructura del V_{HH} para el cebador 5' y en la región no traducida bisagra, CH_{2}, CH_{3} y 3' o cola de poliA para el cebadar 3'. Una selección del tamaño del material amplificado permite la construcción de una librería limitada a las inmunoglobulinas de cadena pesada.

En un ejemplo particular, el siguiente cebador 3' en el que se ha construido un sitio KpnI y que corresponde a los aminoácidos 313 a 319 (CGC CAT CAA GGT AAC AGT TGA) se utiliza conjuntamente con los cebadores _{VHH} de ratón descritos por Sestry et al y que contienen un sitio Xho

AG GTC CAG CTG CTC GAG TCT GG

AG CTC CAG CTG CTC GAG TCT GG

AG GTC CAG CTT CTC GAG TCT GG

{}\hskip4,5cm Sitio XhoI

Estos cebadores producen una librería de inmunoglobulinas de cadena pesada de camélido que comprenden la región V_{HH} (relacionada con el subgrupo III de ratón o de humano), la bisagra y una sección del CH_{2}.

En otro ejemplo, el ADNc se poliadenila en su extremo 5' y los cebadores de V_{HH} específicos de ratón se sustituyen por un cebador de poliT con un sitio XhoI no construido, al nivel del nucleótido 12.

CTCGACT_{12}.

Se utiliza el mismo cebador 3' con un sitio KpnI.

Este método genera una librería que contiene todos los subgrupos de inmunoglobulinas.

Parte del interés en clonar una región que abarca la unión bisagra-CH_{2}, es que tanto en \gamma2 como en \gamma3, está presente un sitio Sac inmediatamente después de la bisagra. Este sitio permite injertar la secuencia que codifica para el VHH y la bisagra dentro de la región Fc de otras inmunoglobulinas, en particular la IgG_{1} y la IgG_{3} humanas que tienen la misma secuencia de aminoácidos en este sitio (Glu_{246} Leu_{247}).

Como un ejemplo, la invención contempla una librería de ADNc compuesto por secuencias de nucleótidos que codifican para una inmunoglobulina de cadena pesada, tal como la obtenida realizando las etapas siguientes:

a) tratar una muestra que contiene células linfoides, especialmente linfocitos periféricos, células del bazo, ganglios linfáticos u otro tejido linfoide procedente de un animal sano, especialmente seleccionado a partir de los Camélidos, con el fin de separar las células linfoides,

b) separar el ARN poliadenilado de otros ácidos nucleicos y componentes de las células,

c) hacer reaccionar el ARN obtenido con una transcriptasa inversa, con el fin de obtener el ADNc correspondiente,

d) poner en contacto el ADNc de la etapa c) con los cebadores 5' correspondientes al dominio V_{H} del ratón de las inmunoglobulinas de cuatro cadenas, cebador que contiene un sitio de restricción determinado, por ejemplo un sitio XhoI y con los cebadores 3' que corresponden a la parte N-terminal de un dominio C_{H}2 que contiene un sitio KpnI,

e) amplificar el ADN,

f) clonar la secuencia amplificada en un vector, especialmente en un vector Bluescript,

g) recuperar los clones hibridando con una sonda correspondiente a la secuencia que codifica para un dominio constante a partir de una inmunoglobulina aislada de cadena pesada.

\newpage

Esta clonación da origen a clones que contienen secuencias de ADN, incluyendo la secuencia que codifica para la bisagra. Por tanto, permite la caracterización de la subclase de inmunoglobulinas y el sitio SacI útil para injertar el FV_{HH}h en la región Fc.

La recuperación de las secuencias que codifican para las inmunoglobulinas de cadena pesada también puede lograrse mediante la selección de los clones que contienen secuencias de ADN que tienen un tamaño compatible con la falta de dominio C_{H}1.

Es posible, de acuerdo con otra realización de la invención, añadir las siguientes etapas entre las etapas c) y d) del procedimiento anterior:

- en presencia de una ADN polimerasa y de trifosfatos de desoxirribonucleótidos, poner en contacto dicho ADNc con cebadores degenerados de oligonucleótido, cuyas secuencias son capaces de codificar para la región bisagra y el dominio V_{HH} N-terminal de una inmunoglobulina, siendo capaces los cebadores de hibridar con el ADNc y capaces de iniciar la extensión de una secuencia de ADN complementaria al ADNc usado como molde,

- recuperar el ADN amplificado.

Los clones pueden expresarse en varios tipos de vectores de expresión. Como un ejemplo que usa un vector Immuno PBS disponible comercialmente (Huse et al: Science (1989) 246, 1275), los clones producidos en Bluescript® de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente, se recuperan por PCR usando el mismo XhoI que contiene el cebador 5' y un nuevo cebador 3', que corresponde a los residuos 113-103 en la estructura de las inmunoglobulinas, en que se ha construido un sitio Spe: TC TTA ACT AGT GAG GAG ACG GTG ACC TG. Este procedimiento permite la clonación del V_{HH} en el sitio Xho/Spe del ventor Immuno PBS. Sin embargo, el extremo 3' del gen no está en fase con el "marcador" de identificación y el codón de terminación del vector. Para lograr esto, el constructo se corta con Spe y los salientes de 4 bases se completan, usando el fragmento Klenow, tras lo cual se vuelve a ligar el vector. Un perfeccionamiento adicional consiste en sustituir el marcador con una poli-histidina, de manera que pueda llevarse a cabo la purificación metálica del VHH clonado. Para lograr eso, se construye primero un oligonucleótido de doble hebra Spe/EcoRI que codifica para 6 histidinas y para un codón de terminación, mediante la síntesis de ambas hebras seguida por calentamiento y templado:

CTA GTG CAC CAC CAT CAC CAT CAC TAA* TAG*

{}\hskip1cm AC GTG GTG GTA GTG GTA GTG ATT ATC TTA A

El vector que contiene el inserto se digiere entonces con SpeI y EcoRI para eliminar la secuencia marcadora residente que puede sustituirse por la secuencia poli-His/terminación. El V_{HH} producido puede detectarse igualmente usando anticuerpos surgidos contra las regiones V_{HH} del dromedario. Bajo condiciones de laboratorio, las regiones V_{HH} se producen en el vector Immuno PBS en cantidades de mg por litro.

La invención también se refiere a una librería de ADN compuesta de secuencias de nucleótidos que codifican para una inmunoglobulina de cadena pesada, tal como la obtenida a partir de las células con genes reconfigurados de inmunoglobulina.

En una realización preferida de la invención, la librería se prepara a partir de células de un animal previamente inmunizado contra un antígeno determinado. Esto permite la selección de anticuerpos que tengan una especificidad preseleccionada para el antígeno usado para la inmunización.

En otra realización de la invención, la amplificación del ADNc no se realiza antes de clonar el ADNc.

La cadena pesada de las inmunoglobulinas de cuatro cadenas permanece secuestrada en la célula por una proteína chaperonina (BIP) hasta que se ha combinado con una cadena ligera. El sitio de unión para la proteína chaperonina es el dominio C_{H}1. Puesto que este dominio está ausente de las inmunoglobulinas de cadena pesada, su secreción es independiente de la presencia de la proteína BIP o de la cadena ligera. Además, los inventores han demostrados que las inmunoglobulinas obtenidas no son adhesivas y de acuerdo con eso, no se agregarán anormalmente.

La invención también se refiere a un proceso para la preparación de un anticuerpo monoclonal dirigido contra un antígeno determinado, consistiendo el sitio de unión al antígeno del anticuerpo en cadenas polipeptídicas pesadas y anticuerpo que está además desprovisto de cadenas polipeptídicas ligeras, proceso que comprende:

- la inmortalización de los linfocitos, obtenidos por ejemplo de la sangre periférica de los Camélidos previamente inmunizados con un antígeno determinado, con una célula inmortal y preferiblemente con células de mieloma, con el fin de formar un hibridoma,

- el cultivo de las células inmortalizadas (hibridoma) formadas y la recuperación de las células que producen los anticuerpos que tienen la especificidad deseada.

\newpage

La preparación de los anticuerpos también puede llevarse a cabo sin una inmunización previa de los Camélidos.

Según otro proceso para la preparación de anticuerpos, no se requiere el recurso de la técnica de la célula hibridoma.

Según tal proceso, los anticuerpos se preparan in vitro y pueden obtenerse mediante procesos que comprenden las etapas de:

- clonar en vectores, especialmente en fagos y más particularmente en bacteriofagos filamentosos, las secuencias de ADN o de ADNc obtenidas a partir de los linfocitos, especialmente los PEL de los Camélidos previamente inmunizados con determinados antígenos,

- transformar las células procarióticas con los vectores anteriores en condiciones que permitan la producción de anticuerpos,

- seleccionar los anticuerpos por su estructura de cadena pesada y adicionalmente sometiéndolos a la selección por afinidad al antígeno,

- recuperar los anticuerpos que tienen la especificidad deseada.

En otra realización de la invención, la clonación se realiza en vectores, especialmente en plásmidos que codifican para proteínas de membranas bacterianas. Las células procarióticas se transforman entonces con los vectores anteriores en condiciones que permiten la expresión de anticuerpos en su membrana.

Las células positivas se seleccionan adicionalmente mediante selección de afinidad al antígeno.

Los anticuerpos de cadena pesada que no contienen el dominio C_{H}1 presentan una clara ventaja a este respecto. En efecto, el dominio C_{H}1 se une a las proteínas acompañantes de tipo BIP presentes dentro de los vectores eucarióticos y las cadenas pesadas no se transportan fuera del retículo endoplasmático a menos que las cadenas ligeras estén presentes. Esto significa que en las células eucariótica, la clonación eficaz de las inmunoglobulinas de 4 cadenas en células no mamíferas, tales como células de levaduras, puede depender de las propiedades de la acompañante residente de tipo BIP y por tanto, puede ser muy difícil de lograr. A este respecto, los anticuerpos de cadena pesada de la invención que carecen de dominio CH_{1} presentan una ventaja distintiva.

En una realización preferida de la invención, la clonación puede realizarse en levaduras, o bien para la producción de anticuerpos, o para la modificación del metabolismo de la levadura. Como ejemplo, puede utilizarse el vector Yep 52. Este vector tiene el origen de replicación (ORI) 2 \mu de la levadura junto con un marcador de selección Leu 2.

El gen clonado está bajo el control del promotor de la bilis y por consiguiente es inducible por galactosa. Además la expresión puede estar reprimida por la glucosa, lo que permite la obtención de concentración muy elevada de células antes de la inducción.

La clonación entre los sitios BamHi y SalI usando la misma estrategia de producción de genes mediante PCR que la descrita anteriormente, permite la clonación de los genes de la inmunoglobulina de camélido en E. coli. Como ejemplo de modulación metabólica que puede obtenerse mediante anticuerpos y propuesta para la levadura, se puede situar la clonación de anticuerpos dirigida contra las ciclinas, que son proteínas implicadas en la regulación del ciclo celular de la levadura (TIBS 16 430 J.D. Me Kinney, N. Heintz 1991). Otro ejemplo es la introducción mediante ingeniería genética de un anticuerpo dirigido contra el CD_{28}, anticuerpo que sería inducible (por ejemplo, mediante bilis), dentro del genoma de la levadura. El CD_{28} está implicado en el nivel de la iniciación de la división celular y, por tanto, la expresión de anticuerpos contra esta molécula permitiría un control eficaz de la multiplicación de las células y la optimización de los métodos para la producción en biorreactores o mediante medios de células
inmovilizadas.

Todavía en otra realización de la invención, el vector de clonación es un plásmido o un vector eucariótico de virus y las células que han de transformarse son células eucarióticas, especialmente células de levaduras, células de mamíferos, por ejemplo las células CHO, o células de simios tales como las células Vero, células de insectos, células de plantas o células de protozoos.

Para más detalles con respecto al procedimiento que ha de aplicarse en cada caso, se hace referencia a la publicación de Marks et al, J. Mol. Biol. 1991, 222:581-597.

Además, a partir de las inmunoglobulinas, o a partir de fragmentos de las mismas, pueden prepararse nuevas inmunoglobulinas o derivados.

De acuerdo con esto, pueden prepararse inmunoglobulinas que respondan a las definiciones facilitadas anteriormente, contra determinados antígenos. En especial, la invención proporciona anticuerpos monoclonales o policlonales desprovistos de cadenas polipeptídicas ligeras o antisuero que contiene tales anticuerpos y dirigidos contra determinados antígenos y, por ejemplo, contra los antígenos de agentes patológicos, tales como las bacterias, los virus o los parásitos. Como ejemplo de antígenos o de determinantes antigénicos contra los que pueden prepararse anticuerpos, pueden citarse las glicoproteínas de la cubierta de los virus o los péptidos de las mismas, tal como la glicoproteína de la cubierta externa de un virus VIH o el antígeno de superficie del virus de la hepatitis B.

Las inmunoglobulinas también pueden dirigirse contra una proteína, hapteno, carbohidrato o ácido nucleico.

Anticuerpos particulares de acuerdo con la invención se dirigen contra el epitopo galactosil \alpha-1-3-galactosa.

Las inmunoglobulinas permiten además la preparación de productos combinados, tal como la combinación de la inmunoglobulina de cadena pesada o de un fragmento de la misma, con una toxina, una enzima, un fármaco o una hormona.

Como ejemplo, puede prepararse la combinación de una inmunoglobulina de cadena pesada que lleve un sitio de unión al antígeno que reconozca un epítopo de inmunoglobulina de mieloma con la toxina abrina o la de lectina del muérdago. Tal constructo tendría sus usos en la terapia específica del paciente.

Otra combinación ventajosa es la que puede prepararse entre inmunoglobulinas de cadena pesada que reconocen un antígeno intestinal de los insectos con una toxina específica para los insectos, tal como las toxinas de los distintos serotipos del Bacillus thuringiensis o del Bacillus sphaericus. Tal constructo clonado en las plantas puede usarse para incrementar la especificidad o la variedad de huéspedes de las toxinas bacterianas existentes.

La invención también propone anticuerpos que tienen diferentes especificidades en cada cadena polipeptídica pesada. Estos anticuerpos multifuncionales, especialmente bifuncionales, podrían prepararse por combinación de dos cadenas pesadas de las inmunoglobulinas de la invención o una cadena pesada de una inmunoglobulina de la invención con un fragmento de una inmunoglobulina modelo de cuatro cadenas.

La invención también proporciona anticuerpos heteroespecíficos que pueden usarse para la selección de la diana de fármacos o de cualquier sustancia biológica, como las hormonas. En particular, pueden usarse para seleccionar selectivamente la diana de hormonas o citoquinas para una categoría limitada de células. Los ejemplos son una combinación de un anticuerpo murino o humano surgido contra la interleuquina 2 (IL_{2}) y un anticuerpo de cadena pesada surgido contra las células CD_{4}. Esto podría usarse para reactivar las células CD_{4} que han perdido su receptor de la
IL_{2}.

Las inmunoglobulinas de cadena pesada también pueden usarse para la preparación de anticuerpos heteroespecíficos. Estos pueden lograrse, o bien de acuerdo con el método descrito anteriormente mediante la reducción de los puentes entre las diferentes cadenas y la reoxidación, de acuerdo con las técnicas usuales, de dos anticuerpos que tienen especificidades diferentes, pero también puede lograrse por clonación seriada de dos anticuerpos, por ejemplo, en el vector Immuno pBS.

En tal caso, se prepara un primer gen correspondiente al dominio V_{HH} comprendido entre el sitio Xho y el sitio Spe, tal como se ha descrito anteriormente. Un segundo gen se prepara después mediante una forma análoga, usando como extremidad 5' un cebador que tienen el sitio Spe y como extremidad 3' un cebador que contiene un codón de terminación y un sitio EcoRI. El vector se digiere entonces con EcoRI y XhoI y además, ambos genes Vim se digieren respectivamente por Xho/Spe y Spe/EcoRI.

Tras la unión, ambos genes de la inmunoglobulina se clonan seriadamente. La separación entre ambos genes puede aumentarse por la introducción de codones de adición dentro del cebador 5' SpeI.

En un ejemplo particular, la región bisagra de las inmunoglobulinas IgG2 de acuerdo con la invención es semirrígida y por tanto, es apropiada para acoplarse a las proteínas. En tal aplicación, las proteínas o los péptidos pueden unirse a diversas sustancias, especialmente a ligandos, a través de la región bisagra usada como espaciadora. Ventajosamente, el fragmento comprende al menos 6 aminoácidos.

Es interesante usar una secuencia que comprenda una secuencia repetida Pro-X, siendo X cualquier aminoácido y preferiblemente, Gln, Lys o Glu, especialmente un fragmento compuesto por al menos una repetición de 3 veces y preferiblemente, por una repetición de 12 veces, para acoplar las proteínas al ligando o para ensamblar diferentes dominios de proteínas.

La región bisagra o un fragmento del mismo también puede usarse para acoplar proteínas a ligandos o para ensamblar diferentes dominios de proteínas.

Las técnicas usuales para el acoplamiento son apropiadas y puede hacerse referencia especial a la técnica de ingeniería de proteínas mediante el ensamblaje de secuencias donadas.

Los anticuerpos de acuerdo con esta invención podrían usarse como reactivos para el diagnóstico in vitro o mediante técnicas de imagen. Las inmunoglobulinas de la invención podrían marcarse con radioisótopos, marcadores químicos o enzimáticos o marcadores quimioluminiscentes.

\newpage

Como ejemplo, y especialmente en el caso de la detección o la observación de inmunoglobulinas mediante técnicas de imagen, un marcador como el tecnecio, especialmente el tecnecio al 99%, es ventajoso. Este marcador puede usarse para el marcaje directo mediante un procedimiento de acoplamiento con las inmunoglobulinas o con fragmentos de las mismas, o por marcaje indirecto tras una etapa de preparación de un complejo con el tecnecio.

Otros marcadores radiactivos interesantes son, por ejemplo, el indio y especialmente el indio III, o el yodo, especialmente el I^{121,} I^{125} e I^{123}.

Para la descripción de estas técnicas, se hace referencia a la solicitud de patente FR publicada con el número 2649488.

En estas aplicaciones, el pequeño tamaño del fragmento V_{HH} es una ventaja definitiva para la penetración dentro del tejido.

La invención también se refiere a los anticuerpos monoclonales que reaccionan con los antiidiotipos de los anticuerpos descritos anteriormente.

La invención también se refiere a las células o a los organismos en los que se han clonado las inmunoglobulinas de cadena pesada. Tales células u organismos pueden usarse para el propósito de producir inmunoglobulinas de cadena pesada que tengan una especificidad deseada preseleccionada, o que correspondan a un repertorio particular. También pueden producirse para el propósito de modificación del metabolismo de la célula que las expresa. En el caso de la modificación del metabolismo de las células transformadas con las secuencias que codifican para las inmunoglobulinas de cadena pesada, estas inmunoglobulinas producidas de cadena pesada se usan como ADN antisentido. El ADN antisentido está implicado normalmente en el bloqueo de la expresión de ciertos genes, tal como por ejemplo, en el antígeno de superficie variable de los tripanosomas o de otros patógenos. Asimismo, la producción de la actividad de ciertas proteínas o enzimas podría inhibirse mediante los anticuerpos que se expresan contra esta proteína o enzima dentro de la misma célula.

La invención también se refiere a una inmunoglobulina modificada de 4 cadenas o a fragmentos de las mismas, cuyas regiones V_{H} se han sustituido parcialmente por secuencias específicas o aminoácidos de inmunoglobulinas de cadena pesada, especialmente por secuencias del dominio V_{HH}. Un dominio V_{H} particular y modificado de una inmunoglobulina de cuatro cadenas, se caracteriza porque la leucina, la prolina o la glutamina de la posición 45 de las regiones V_{H} se ha sustituido por otros aminoácidos y preferiblemente por arginina, ácido glutámico o
cisteína.

Un dominio V_{H} o V_{L} adicional modificado de una inmunoglobulina de cuatro cadenas se caracteriza por la unión de los bucles CDR o de las regiones FK mediante la introducción de cisteínas apareadas, seleccionándose la región CDR entre la CDR_{1} y la CDR_{3}, siendo la región FW la región FW_{2} y, especialmente, porque una de las cisteínas introducidas está en la posición 31, 33 de la FR_{2} o en la 45 de la CDR_{2} y la Otra en la CDR_{3}.

Especialmente, la introducción de cisteínas apareadas es de manera que el bucle del CDR_{3} esté unido al dominio FW_{2} o al CDR1 y más especialmente, la císteína del CDR3 del V_{H} está unida a una cisteína en la posición 31 ó 33 del FW2 o en la posición 45 del CDR2.

En otro ejemplo, células de plantas pueden modificarse mediante las inmunoglobulinas de cadena pesada, con el fin de que adquieran nuevas propiedades o propiedades incrementadas.

Las inmunoglobulinas de cadena pesada pueden usarse para la terapia genética del cáncer, por ejemplo mediante la utilización de anticuerpos dirigidos contra las proteínas presentes en las células tumorales.

En tal caso, la expresión de uno o dos genes V_{HH} puede obtenerse mediante la utilización de vectores derivados de parvovirus o adenovirus. Los parvovirus se caracterizan por el hecho de que están desprovistos de patogenicidad o casi no son patogénicos para las células humanas normales y por el hecho de que son capaces de multiplicarse fácilmente en las células cancerígenas (Russel S.J. 1990, Immunol. Today II. 196-200).

Las inmunoglobulinas de cadena pesada se clonan, por ejemplo, dentro de los sitios HindIII/XbaI del plásmido infeccioso del virus MVM murino (pMM984). (Merchlinsky et al, 1983, J. Virol. 47, 227-232) y luego se sitúan bajo el control del promotor MVM38.

El gen del dominio VHH se amplifica por PCR mediante el uso de un cebador 5' que contiene un codón de iniciación y un sitio HindIII, el cebador 3' que contiene un codón de terminación y un sitio XbaI.

El constructo se inserta entonces entre las posiciones 2650 (HindIII) y 4067 (XbaI) dentro del plásmido.

La eficacia de la clonación puede comprobarse mediante transfección. El vector que contiene el anticuerpo se introduce entonces en las células permisivas (NB-E) mediante transfección.

\newpage

Las células se recuperan tras dos días y la presencia de regiones VHH se determina con un ensayo ELISA usando antisuero de conejo que reacciona con la parte V_{HH}.

La invención permite además la preparación de anticuerpos catalíticos mediante formas diferentes. La producción de anticuerpos dirigidos contra los componentes que imitan los estados activados de los sustratos (como ejemplo, el vanadato como componente que imita el estado activado del fosfato con el fin de producir sus actividades fosfoesterasas, el fosfato como compuesto que imita la unión peptídica para producir proteasas) permite obtener anticuerpos que tienen una función catalítica. Otra forma de obtener tales anticuerpos consiste en realizar una mutagénesis aleatoria en los clones de anticuerpos, por ejemplo mediante PCR, introduciendo bases anormales durante la amplificación de los clones. Estos fragmentos amplificados obtenidos por PCR se introducen entonces dentro de un vector apropiado para clonación. Su expresión en la superficie de la bacteria permite la detección por el sustrato de los clones que tienen la actividad enzimática. Naturalmente, estos dos enfoques pueden combinarse. Finalmente, partiendo de la base de los datos disponibles sobre la estructura, por ejemplo los datos obtenidos por cristalografía de rayos X o RMN, las modificaciones pueden dirigirse. Estas modificaciones pueden realizarse mediante técnicas usuales de ingeniería genética o mediante síntesis completa. Una ventaja del VHH de las inmunoglobulinas de cadena pesada de la invención es el hecho de que son suficientemente solubles.

Las inmunoglobulinas de cadena pesada de la invención pueden producirse además en células de plantas, especialmente en plantas transgénicas. Como ejemplo, las inmunoglobulinas de cadena pesada pueden producirse en plantas usando el plásmido pMon530 (Roger et al. Meth Enzym 153 1566 1987), vector de expresión constitutivo de plantas, tal como se ha descrito para los anticuerpos clásicos de cuatro cadenas (Hiat et al. Nature 342 76-78, 1989) usando una vez más los cebadores apropiados de PCR, tal como se ha descrito anteriormente, para generar un fragmento de ADN en la fase correcta.

Otras ventajas y características de la invención se harán evidentes en los ejemplos y figuras siguientes.

\vskip1.000000\baselineskip

Figuras Figura 1 Caracterización y purificación de la IgG del camello mediante cromatografía de afinidad en Sepharosa Proteína A y Proteína G (Pharmacia).

(A) muestra, tras la reducción, el perfil de proteínas de SDS-PAGE de las fracciones adsorbidas y no adsorbidas del suero de Camelus dromedarius. La fracción adsorbida en la Proteína A y eluída con NaCl 0,15 M, ácido acético al 0,58%, muestra bajo reducción (carril c) tres componentes de cadena pesada de 50, 46 y 43 kd, respectivamente, y la cadena ligera (IgG del conejo en el carril a). Las fracciones adsorbidas en un derivado de Sepharosa Proteína G (Pharmacia), que se ha diseñado para suprimir la región de unión a la albúmina (carril e) y eluído con gly HCl 0,1M, pH 2,7, carecen de la cadena pesada de 46 kd que se recupera en la fracción no adsorbida (carril f). Ninguno de estos componentes está presente en la fracción no adsorbida en la Proteína A (carril d). El carril b contiene los marcadores de peso molecular.

(B) y (C). Mediante elusión diferencial, las fracciones de inmunoglobulinas que contienen la cadena pesada de 50 y 43 kd, pueden separarse. Se adsorben 5 ml del suero de C. dromedarius en una columna de Sepharosa Proteína G de 5 ml y la columna se lava exhaustivamente con tampón fosfato 20 mM, pH 7,0. Bajo elución con tampón a pH 3,5 (NaCl 0,15 M, ácido acético al 0,58%), se eluye un componente de 100 kd que da, bajo reducción, una cadena pesada de 43 kd, (carril 1). Una vez que la absorbancia del eluente de la columna ha caído hasta el nivel previo, puede eluirse un segundo componente de la inmunoglobulina de 170 kd con tampón a pH 2,7 (glicina HCl al 0,1 M). Esta fracción, bajo reducción, da una cadena pesada de 50 kd y una amplia banda de cadena ligera (carril 2).

La fracción no adsorbida sobre la Proteína G se lleva entonces sobre una columna de Sepharosa Proteína A de 5 ml. Tras lavar y eluir con tampón a pH 3,5 (NaCl 0,15 M, ácido acético al 0,58%), se obtiene una tercera inmunoglobulina de 100 kd que consta únicamente de las cadenas pesadas de 46 kd (carril 3).

\vskip1.000000\baselineskip

Figura 2 Inmunoglobulinas de Camelus bactrianus, Lama vicugna, Lama glama y Lama pacos a la Proteína A (carriles A) y a la Proteína G (carriles G) analizadas sobre SDS-PAGE antes (A) y después (B) de la reducción.

Se añadieron 10 \mul de suero obtenido a partir de diferentes especies a tubos Eppendorf® que contenían 10 mg de Sepharosa Proteína A o Proteína G suspendidos en 400 \mul de tampón de inmunoprecipitación a pH 8,3 (NaCl 0,2 M, Tris 0,01 M; EDTA 0,01 M, Triton X100 _al 1%, ovoalbúmina al 0,1%). Los tubos se hicieron girar lentamente durante 2 horas a 4ºC. Tras la centrifugación, se lavaron los aglomerados 3 veces en el tampón y una vez en el tampón en el que se han suprimido el Triton y la ovoalbúmina. Los aglomerados se resuspendieron entonces en la disolución de la muestra de SDS-PAGE, 70 \mul por aglomerado, con o sin ditiotreitol como reductor. Tras hervir durante 3 minutos a 100ºC, los tubos se centrifugaron y se analizaron los sobrenadantes.

En todas las especies examinadas las fracciones no reducidas (A) contienen además de las moléculas de aproximadamente 170 Kd también componentes principales menores de aproximadamente 100 Kd. En la muestra reducida (B) las cadenas ligera y pesada constituyentes son detectadas. En todas las especies un componente de cadena pesada (marcado con un asterisco *) está presente en el material eluido de la Proteína A pero ausente en el material eluido de la Proteína G.

\vskip1.000000\baselineskip

Figura 3 Las IgG_{1}, IgG_{2} e IgG_{3} fueron preparadas a partir de suero obtenido de Camelus dromedarius saludables o infectados con Trypanosama evansi (título CATT 1/160 (3) y analizados por radioinmunoprecipitación o Western Blotting para la actividad anti-tripanosoma.

(A) lisado de antígenos de Trypanosama evansi marcado con ^{35}S metionina (recuento de 500.000) fue añadido a tubos Eppendorf conteniendo 10 \mul de suero o, 20 \mul de IgG_{1}, IgG_{2} o IgG_{3} en 200 \mul de tampón de inmunoprecipitación a pH 8.3 conteniendo 0.1 M TLCK como inhibidor de proteinasa y se hicieron girar lentamente a 4ºC durante una hora. Los tubos fueron luego suplementados con 10 mg de Sepharosa Proteína A suspendida en 200 \mul del mismo tampón a pH 8.3 e incubados a 4ºC durante una hora adicional.

Después del lavado y la centrifugación a 15000 rpm durante 12 s, cada aglomerado fue resuspendido en 75 \mul de la solución muestra SDS-PAGE conteniendo DTT y se calentó durante 3 min. a 100ºC. Después de la centrifugación en una minifuga Eppendorf a 15000 rpm durante 30 s, 5 \mul del sobrenadante fueron salvados para la determinación de la radioactividad y el resto fue analizado por DSD-PAGE y fluorografía. Los recuentos/5 \mul de muestra fueron inscritos para cada carril.

(B) 20 \mul de IgG_{1}, IgG_{2} e IgG_{3} de animales saludables e infectados con tripanosoma fueron separados mediante SDS-PAGE sin reducción o calentamiento previos. Las muestras separadas fueron entonces electrotransferidas a una membrana de nitrocelulosa, una parte de la membrana fue teñida con Rojo de Ponceau para localizar el material proteico y el resto fue incubado con ovoalbúmina 1% en tampón TST (Tris 10 mM, NaCl 150 mM, Tween 0.05%) para bloquear los sitios de unión a la proteína.

Tras el bloqueo, la membrana se lavó exhaustivamente con el tampón TST y se incubó durante 2 horas con el antígeno de tripanosoma marcado con ^{35}S. Tras el lavado exhaustivo, la membrana se secó y se analizó mediante autorradiografía. Para evitar la unión previa e inespecífica, el lisado marcado de tripanosoma se filtró a través de un filtro millipore de 45 \mu y se incubó con inmunoglobulina y ovoalbúmina de camello sano adsorbida sobre una membrana de nitrocelulosa.

\vskip1.000000\baselineskip

Figura 4 La IgG3 purificada del camello por cromatografía de afinidad en Sepharosa Proteína A, se digiere parcialmente con papaína y se separa en Sepharosa Proteína A.

Se disolvieron 14 mg de IgG3 purificada en tampón fosfato 0,1 M a pH 7,0 que contenía EDTA 2 mM. Se digirieron mediante 1 hora de incubación a 37ºC con mercuriopapaína (enzima al 1% en proporción de proteína) activada mediante cisteína 5.10^{4}M. La digestión se bloqueó por la adición de yodoacetamida en exceso (4.10^{2}M) (13). Tras la centrifugación del digerido en una centrífuga Eppendorf durante 5 min a 15.000 rpm, los fragmentos de papaína se separaron en una columna de Sepharosa Proteína A en las fracciones de unión (B) y de no unión (NB). La fracción de unión se eluyó de la columna con tampón glicina HCl 0,1 M a pH 1,7.

\vskip1.000000\baselineskip

Figura 5 Presentación esquemática de un modelo para las moléculas de IgG3 desprovistas de cadenas ligeras. Inmunoglobulinas que tienen cadenas ligeras.

\vskip1.000000\baselineskip

Figura 6

\bulletRepresentación esquemática de inmunoglobulinas que tienen cadenas polipeptídicas pesadas y están desprovistas de cadenas ligeras, con respecto a la inmunoglobulina convencional del modelo de cuatro cadenas.

\bulletRepresentación de una sección bisagra.

\vskip1.000000\baselineskip

Figura 7 Alineación de 17 secuencias de ADN de V_{HH} de las inmunoglobulinas de cadena pesada de camello.

\vskip1.000000\baselineskip

Figura 8 Expresión y purificación de la proteína V_{HH}21 del camello a partir de E. coli.

\vskip1.000000\baselineskip

I Anticuerpos de cadena pesada en los camélidos

Cuando se adsorbe el suero de Camelus dromedarius en Sepharosa Proteína G, una cantidad apreciable (25-35%) de inmunoglobulinas (1g) permanece en disolución que puede entonces recuperarse mediante cromatografía de afinidad en Sepharosa Proteína A (fig. 1A). La fracción adsorbida en la Proteína G puede eluirse diferencialmente en una fracción de unión estrecha (25%) que consta de moléculas de un peso molecular (PM) aparente no reducido de 170 kd, y en una fracción de unión más débil (30-45%) que tiene un peso molecular aparente de 100 kd (fig. 15). El componente de 170 kd, cuando se reduce, da cadenas pesadas de 50 kd y cadenas ligeras grandes de 30 kd. La fracción de 100 kd está totalmente desprovista de cadenas ligeras y parece estar compuesta únicamente por cadenas pesadas que, tras la reducción, tienen un PM aparente de 43 kd (Fig. IC). La fracción que no se une a la Proteína G puede purificarse por afinidad y eluirse de una columna de Proteína A como un segundo componente de 100 kd que, tras la reducción, parece estar compuesto únicamente por cadenas pesadas de 46 kd.

Las inmunoglobulinas de cadena pesada carecen de cadenas ligeras totales hasta el 75% de las moléculas que se unen a la proteína A.

Como las tres inmunoglobulinas se unen a la Proteína A, nos referiremos a ellas como IgG: particularmente, IgG_{1} (cadena ligera y cadena pesada \gamma1 (50 kd) que se unen a la Proteína G), IgG_{2} (cadena pesada \gamma2 (46 kd) que no se une a la proteína G) e IgG_{3} (cadena pesada \gamma3 (43 kd) que se une a la proteína G). Hay una posibilidad de que estas tres sub(clases) pueden subdividirse adicionalmente.

Un estudio comparativo de los camélidos del viejo mundo (Camelus bactrianus y Camelus dromedarius) y de los camélidos del nuevo mundo (Lama pacos, Lama glama, Lama vicugna) mostraron que las inmunoglobulinas de cadena pesada se encontraron en todas las especies examinadas, a pesar de con diferencias menores en el peso molecular aparente y en la proporción. Los camélidos del nuevo mundo difieren de los camélidos del viejo mundo en que tienen una molécula más grande de IgG_{3} (inmunoglobulina de cadena pesada que se une a la Proteína G) en que las cadenas pesadas constituyentes tienen un peso molecular aparente de 47 kd (fig. 2).

La abundancia de inmunoglobulinas de cadena pesada en el suero de los camélidos hace plantearse la pregunta de cuál es su papel en la respuesta inmune y en particular, si llevan especificidad de unión al antígeno y si es así, cómo es de amplio su repertorio. Esta pregunta podría responderse examinando las inmunoglobulinas de los camellos infectados por Tripanosoma evansi (Camelus dromedarius).

Para este propósito, las fracciones correspondientes de IgG_{1}, IgG_{2}, IgG_{3} se prepararon a partir del suero de un camello sano y a partir del suero de camellos con un título elevado de antitripanosoma, medido mediante el Ensayo de Aglutinación (3). En radioinmunoprecipitación, se demostró que la IgG_{1}, la y la IgG_{3} derivadas del camello infectado, que indican amplia heterogeneidad y complejidad de repertorio (Fig. 3A), se unen a un gran número de antígenos presentes en un lisado de tripanosoma marcado por ^{35}S metionina.

En los experimentos de inmunotransferencia, el lisado de tripanosoma marcado con ^{35}S metionina se une a IgG_{i}, IgG_{2}, IgG_{3} separadas por SDS-PAGE, obtenidas a partir de animales infectados (Fig. 3B).

Esto lleva a concluir que las cadenas pesadas del camélido IgG_{2} e IgG_{3} son auténticos anticuerpos que unen antígenos.

Un paradigma inmunológico establece que un repertorio amplio de anticuerpos se genera por la combinación de los repertorios de la región variable V de la cadena ligera y la cadena pesada (6). Las inmunoglobulinas de cadena pesada del camello parecen contradecir este paradigma.

Las inmunoglobulinas se caracterizan por un patrón complejo de IEF (isoelectroenfoque) que refleja su heterogeneidad extrema. Para determinar si las dos cadenas pesadas que constituyen la IgG_{2} y la IgG_{3} son o no idénticas, se observó el patrón de isoelectroenfoque (I.E.F) antes y después de la separación de la cadena mediante reducción y alquilación usando yodoacetamida como agente alquilante.

Como este agente alquilante no introduce cargas adicionales en la molécula, los monómeros resultantes de la reducción y la alquilación de una cadena homodímera pesada tendrá prácticamente el mismo punto isoeléctrico que el dinero, mientras que si se derivan de un heterodímero de cadena pesada, en la mayoría de los casos los monómeros diferirán suficientemente en el punto isoeléctrico para generar un patrón diferente en I.E.F.

Bajo reducción y alquilación por yodoacetamida, el patrón observado no está modificado para la IgG_{2} y la IgG_{3} de Camelus dromedarius, indicando que estas moléculas están compuestas de dos cadenas pesadas idénticas que migran a la misma posición que la molécula no reducida a partir de la que se han originado.

Por el contrario, el patrón de T.E.F. de la IgG_{1} se modifica completamente tras la reducción, ya que el punto isoeléctrico de cada molécula se determina por la combinación de los puntos isoeléctricos de las cadenas ligera y pesada, que tras la separación, migrarán a posiciones diferentes.

Estos hallazgos indican que las cadenas pesadas solas pueden generar un amplio repertorio y cuestionan la contribución de la cadena ligera al repertorio útil del anticuerpo. Si esta necesidad se anula, ¿qué otro papel desempeña la cadena ligera?

Normalmente, la cadena pesada aislada de las inmunoglobulinas de mamífero tienden a agregarse considerablemente, pero sólo se solubilizan mediante las cadenas ligeras (8, 9) que se unen al dominio C_{H}1 de la cadena pesada.

En humanos y ratones, varios mielomas espontáneos o inducidos producen una inmunoglobulina patológica compuesta únicamente por cadenas pesadas (enfermedad de la cadena pesada). Estas cadenas pesadas proteicas del mieloma llevan deleciones en los dominios C_{H}1 y V_{HH} (10). La razón por la que las cadenas pesadas de longitud completa no dan lugar a cadenas pesadas secretadas en tales inmunoglobulinas patológicas, parece provenir del hecho de que la síntesis de Ig implica una proteína chaperonina, la proteína de unión a la cadena pesada de la inmunoglobulina o BIP (11), que normalmente está sustituida por la cadena ligera (12). Es posible que el papel primordial de la cadena ligera en las inmunoglobulinas del modelo de cuatro cadenas es el de un acompañante asignado a la cadena pesada y que la aparición de los repertorios de cadena ligera sólo ha sido una ventaja evolutiva.

Las cadenas \gamma2 y \gamma3 son considerablemente más cortas que la cadena y normal de mamífero. Esto sugeriría que se han producido deleciones en el dominio C_{H}1. Las diferencias en los tamaños de las inmunoglobulinas \gamma2 y \gamma3 de los camélidos del viejo y del nuevo mundo, sugieren que las deleciones se produjeron en varias etapas evolutivas, especialmente en el dominio C_{H}1.

\vskip1.000000\baselineskip

II Las inmunoglobulinas de cadena pesada de los camélidos carecen del dominio C_{H}1

La estrategia seguida para investigar la estructura primaria de la inmunoglobulina de cadena pesada es una combinación de proteína y secuenciación de ADNc; la secuenciación de la proteína es necesaria para identificar las flexibilidades de secuencia características de cada inmunoglobulina. El extremo N--terminal de la inmunoglobulina que se deriva del repertorio de la región variable de la cadena pesada sólo da información sobre los subgrupos de V_{HH} (región variable de la cadena pesada) y no puede usarse para la identificación de clase o de subclase. Esto significa que los datos de la secuencia han de obtenerse a partir de los sitios internos de división enzimática o química.

Una combinación de digestión de papaína y cromatografía de afinidad a la Proteína A permitieron la separación de varios fragmentos que dan información sobre la estructura general de la IgG3.

La IgG3 del camello (Camelus dromedarius) purificada mediante cromatografía de afinidad en Sepharosa Proteína A se digirió parcialmente con papaína y el digesto se separó en Sepharosa Proteína A en fracciones de unión y de no unión. Estas fracciones se analizaron mediante SDS-PACE bajo condiciones de reducción y no reducción (fig 4).

La fracción unida contenía dos componentes, uno de 28 kd y uno de 14,4 kd, además de material no dividido o parcialmente dividido. Se separaron bien mediante electroforesis en gel (a partir de geles preparativos de SDSPAGE al 19%) bajo condiciones no reductoras, y se purificaron adicionalmente por electroelución (en bicarbonato de amonio 50 nM, SDS al 0,1% (p/v) usando un electroeluidor). Tras la liofilización de estas fracciones electroeluidas, el SDS restante se eliminó mediante precipitación de la proteína a través de la adición de etanol al 90%, mezclando e incubando la mezcla durante la noche a -20ºC (14). La proteína precipitada se recogió en un aglomerado mediante centrifugación (15.000 rpm, 5 min) y se usó para la secuenciación de la proteína. La secuenciación del extremo N-terminal se llevó a cabo usando las química automatizada de Edman de un secuenciador líquido de proteínas mediante impulsos de Applied Biosystem 477A. Los aminoácidos se identificaron como sus derivados de feniltiohidantoína (PTH) usando un analizador de PTH de Applied Biosystem 120. Todos los productos químicos y los reactivos se compraron de Applied Biosystems. Los análisis de los datos cromatográficos se llevaron a cabo usando el software de Applied Biosystems versión 1.61. En cada caso, el análisis de la secuencia dirigido por ordenador se confirmó por inspección directa de los cromatogramas a partir del analizador de PTH. Las muestras de la secuenciación de la proteína se disolvieron o bien en ácido trifluoroacético (TFA) al 50% (v/v) (fragmento de 28 kd) o en TFA al 100% (fragmento de 14 kd). Las muestras de la proteína disuelta equivalentes a 2000 pmol (fragmento de 28 kd) o a 500 pmol (fragmento de 14 kd) se aplicaron a discos de fibra de vidrio tratados con TFA. Los discos de fibra de vidrio se recubrieron con BrioBrene (3 mg) y se preciclaron una vez antes de usarlos.

La secuenciación del extremo N-terminal del fragmento de 28 kd da una secuencia homóloga a la parte N-terminal del dominio C_{H}2 de \gamma y por tanto, al extremo N-terminal del fragmento Fe. La secuencia N-terminal del fragmento de 14,4 kd corresponde a la última lisina de un C_{H}2 de \gamma y al extremo N-terminal de un dominio C_{H}3 de \gamma (Tabla 1). El peso molecular (PM) de los fragmentos de papaína y la identificación de sus secuencias N-terminales llevaron a concluir que los dominios C_{H}2 y C_{H}3 de las cadenas pesadas \gamma3 son normales en tamaño y que la deleción debe producirse, o bien en el dominio C_{H}1, o en el V_{HH} para generar la cadena \gamma3 más corta. Las fracciones que no se unen a la Sepharosa Proteína A contienen dos bandas de 34 y 17 kd que están más difusas en SDE-PAGE, indicando que se originan a partir de la parte variable N-terminal de la molécula (fig 4).

Bajo reducción, se encuentra una única banda difusa de 17 kd, indicando que la de 34 kd es un dimero unido por un puente disulfuro del componente de 17 kd. El fragmento de 34 kd contiene aparentemente la bisagra y el dominio V_{HH} del extremo N-terminal.

Los datos de la secuencia de proteínas también puede usarse para construir cebadores degenerados de oligonucleótidos que permiten la amplificación de PCR del ADNc o del ADN genómico.

Se ha demostrado que las células procedentes de las células marcadas del bazo del camello reaccionaban con sueros de anti-inmunoglobulina de conejo y camello y que por tanto, el bazo fue un sitio de síntesis de al menos una clase de inmunoglobulina. Por consiguiente, el ADNc se sintetizó a partir del ARNm del bazo del camello. Las condiciones para el aislamiento del ARN fueron las siguientes: el ARN total se aisló a partir del bazo del dromedario mediante el método del isotiocianato de guanidio (15). El ARNm se purificó con perlas paramagnéticas de oligo T.

La síntesis de ADNc se obtiene usando un molde de ARNm de 1 \mug, un cebador de oligo dT y transcriptasa inversa (BOERHINGER MAN). La segunda hebra del ADNc se obtiene usando ARNasa H y ADN polimerasa de E. coli, de acuerdo con la condición dada por el proveedor.

Las secuencias relevantes se amplificaron por PCR: 5 ng de ADNc se amplificaron por PCR en una mezcla de reacción de 100 \mul (Tris-HCl 10 mM a pH 8,3, KCl 50 mM, MgCl_{2} 15 mM, gelatina al 0,01% p/v), 200 \muM de cada dNTP y 25 pmoles de cada cebador) cubierto con una capa de aceite mineral (Sigma).

Los cebadores degenerados contienen sitios EcoRI y KpnI y que además están clonados en pUC 18. Tras una ronda de desnaturalización y templado (94ºC durante 5 min y 54ºC durante 5 min), se añadieron 2 unidades de Marcador ADN polimerasa a la mezcla de la reacción antes de someterlo a 35 ciclos de amplificación: 1 min a 94ºC (desnaturalizar) 1 min a 54ºC (templar), 2 min a 72ºC (alargar). Para amplificar las secuencias de ADN entre los dominios V_{HH} y C_{H}2, (# 72 clones), se llevó a cabo la PCR en las mismas condiciones, con la excepción de que la temperatura de templado se incrementó hasta 60ºC.

Un clon examinado (#56/36) tenía una secuencia correspondiente a la parte N-terminal de un dominio C_{H}2 idéntico a la secuencia del fragmento de 28 kd. La disponibilidad de estos datos de secuencia permitieron la construcción de un cebador 3' exacto y la clonación de la región entre el extremo N-terminal del dominio V_{HH} y el C_{H}2.

Los cebadores 5' correspondientes al V_{HH} (16) del ratón y que contenían un sitio de restricción XhoI se usaron junto con el cebador 3' en el que se había insertado un sitio KpnI y las secuencias amplificadas se clonaron en pBluescript®. El clon #56/36 que presentaba dos sitios HaeIII internos, se digirió con esta enzima para producir una sonda para identificar los clones positivos de la PCR.

Tras la amplificación, los productos de la PCR se comprobaron en un gel de agarosa al 1,2% (p/v). El aclaramiento de los productos de la PCR incluyó una extracción de fenol-cloroformo, seguida por purificación adicional por HPLC (columna GEN-PAC FAX, Waters) y finalmente usando el kit MERMAID o GENECLEAN II, BIO 101, Inc) según fuese apropiado. Tras estas etapas de purificación, el ADNc amplificado se digirió entonces con EcoRI y KpnI para los clones de la serie #56 y con XhoI y KpnI para los clones de la serie #72. Una extracción final con fenol-cloroformo precedida por la ligación en pUC 18 (clones de la serie #56) o en pBluescript® (clones de la serie #72).

Todos los clones obtenidos fueron más pequeños de 860 pares de base de lo que se esperaba si poseían una región completa V_{HH} y C_{H}1. Los datos parciales de la secuencia correspondientes al N'-terminal de la región V_{HH} revelan que de entre 20 clones, 3 fueron idénticos y posiblemente no independientes. Las secuencias obtenidas se asemejan al subgrupo III humano y a los subgrupos murinos IIIa y IIIb (Tabla 2).

Se obtuvieron los clones correspondientes a dos juegos diferentes de secuencias proteicas C_{H}2. Un primer juego de secuencias (#72/41) tenía una región C_{H}2 N-terminal idéntica a la obtenida mediante secuenciación de proteínas de los fragmentos de papaína de 28 kd de la cadena pesada \gamma3, una corta región bisagra que contenía 3 cisteínas y una región variable correspondiente a los residuos de la estructura (FR4) codificada por los minigenes J que se adhieren a la bisagra. El dominio C_{H}1 falta por completo. Este ADNc corresponde a la cadena \gamma3 (Tabla 4).

En una secuencia estrechamente relacionada (#72/1), la prolina de la posición 259 está sustituida por treonina.

La secuencia correspondiente al C_{H}3 y a la parte restante del C_{H}2 se obtuvo por PCR del ADNc usando como cebador KpnI, un poliT en el que el sitio de restricción KpnI se había insertado en el extremo 5'. La secuencia total de la cadena \gamma3 corresponde con un peso molecular (PM) que está en concordancia con los datos obtenidos a partir de la electroforesis en SDS-PAGE.

\newpage

La secuencia de esta cadena \gamma3 presenta similitudes con otras cadenas \gamma, excepto que carece del dominio C_{H}1, siendo el dominio V_{HH} adyacente a la bisagra.

Una o las tres cisteínas podrían ser probablemente responsables de mantener a las dos cadenas \gamma3 juntas.

Los resultados han permitido definir un modelo para la molécula IgG3 basado en la secuencia y en la rotura por papaína (fig. 5).

La papaína puede romper la molécula a cada lado de los disulfuros de la bisagra y también entre C_{H}2 y C_{H}3. Bajo condiciones no reductoras, los dominios V_{HH} de la IgG3 pueden aislarse como dímero unido por disulfuro o como monómero, dependiendo del sitio de rotura de la papaína.

Un segundo juego de clanes #72/29 tenía una secuencia ligeramente diferente para el C_{H}2 y se caracterizaba por una bisagra muy larga precedida inmediatamente por el dominio variable. Esta región bisagra tiene 3 cisternas en su extremo C-terminal en una secuencia homóloga a la bisagra de \gamma3. Tal segundo juego de clones podría representar la subclase IgG2. Para la parte constante de la \gamma3 y también para la supuesta \gamma2, la mayoría de los clones son idénticos, mostrando las secuencias específicas de \gamma2 o \gamma3. Sin embargo, algunos clones, tales como #72/1, muestran diferencias menores. Por ejemplo, en el caso de los clones #72/1 se detectan diferencias en dos nucleótidos.

Varios ADNc de las regiones V_{HH} se han secuenciado ahora total o parcialmente, con excepción de una corta región en el extremo N-terminal que se deriva del cebador.

En la traducción, la mayoría muestra las secuencias características Ser_{21}, Cys_{22} y Tyr_{90} Tyr_{91} Cys_{92}, del puente disulfuro intra-región V_{HH} que une los residuos 22 y 92. Todos estos clones tienen una secuencia que corresponde con los residuos de la estructura 4 (FR4) de la región variable que precede inmediatamente la secuencia bisagra postulada (Tabla 3). Esta secuencia se genera por los minigenes J y en la mayoría de los casos es similar a la secuencia codificada por los minigenes J de humano y ratón. La longitud de la secuencia entre la Cys_{92} de la región y el extremo C-terminal de las regiones V_{HH} es variable y, en las secuencias determinadas, oscila desde 25 hasta 37 aminoácidos, como se podría esperar a partir de las reconfiguraciones de los minigenes J y D que varían en longitud.

Surgen varias preguntas importantes por la existencia exclusiva de estas inmunoglobulinas de cadena pesada en una situación no patológica. En primer lugar, ¿son anticuerpos auténticos? Las inmunoglobulinas de cadena pesada obtenidas a partir de los camellos infectados por tripanosoma, reaccionan con un gran número de antígenos de parásitos, tal como se muestra en la parte I de estos ejemplos. Esto implica que el sistema inmune del camélido genera un amplio número de sitios de unión compuestos por dominios V_{HH} únicamente. Esto se confirma por la diversidad de las regiones VHH de las inmunoglobulinas de cadena pesada obtenidas por POR.

La segunda pregunta es "¿cómo se secretan?". La secreción de las cadenas pesadas de las inmunoglobulinas que componen las inmunoglobulinas del modelo de cuatro cadenas no se produce bajo condiciones normales. Una proteína chaperonina, la proteína de unión a la cadena pesada, o proteína BIP, evita que las cadenas pesadas se secreten. Es sólo cuando la cadena ligera desplaza a la proteína BIP en el retículo endoplasmático cuando puede producirse la secreción (13).

El dímero de cadenas pesadas encontrado en el suero de humano o ratón con la denominada "enfermedad de la cadena pesada", carece de los dominios C_{H}1 que se piensa que albergan el sitio BIP (14). En ausencia de este dominio, la proteína BIP puede que no se una más y que no evite el transporte de las cadenas pesadas.

La presencia en los camellos de una clase IgG1 compuesta por cadenas pesadas y ligeras que constituyen entre el 25% y el 50% de las moléculas totales de IgG, también plantea el problema de cómo se produce la maduración y el intercambio de clase y de cuál es el papel de la cadena ligera. La cadena ligera del camélido parece inusualmente grande y heterogénea cuando se examina en SDS-PAGE.

La mayor dimensión de un dominio aislado es de 40 \ring{A} y la máxima extensión obtenible entre los sitios de unión de una IgG convencional con C_{H}1 y V_{HH} será del orden de 160 \ring{A} (2V_{HH} + 2C_{H}1) (19). La deleción del dominio C_{H}1 en los dos tipos de anticuerpos de cadena pesada desprovistos de cadenas ligeras, ya secuenciados, tiene como resultado una modificación de esta extensión máxima (fig. 6). En la IgG3, la enorme distancia entre las extremidades de las regiones V_{HH} será del orden de 80 \ring{A} (2V_{HH}). Esto podría ser una grave limitación para la aglutinación o el entrecruzamiento. En la IgG2 esto se compensa por la región extremadamente larga de la bisagra, compuesta por una repetición de 12 veces de la secuencia Pro-X (en la que X es Gin, Lys o Glu) y localizada en posición N-terminal con respecto a los puentes disulfuro de la bisagra. Por el contrario, en la IgG3 humana, la bisagra muy grande que también surge aparentemente como resultado de la duplicación de la secuencia, no contribuye a incrementar la distancia que se extiende a lo largo de los dos sitios de unión cuando esta bisagra se intercala con los puentes disulfuro.

El único dominio VHH también podría permitir probablemente la libertad rotacional considerable del sitio de unión frente al dominio Fc.

\newpage

A diferencia de las cadenas pesadas del mieloma que probablemente resultan de la deleción de C_{H}1 en una única célula que produce anticuerpos, o los anticuerpos de cadena pesada producidos por la donación de expresión (15), los anticuerpos de cadena pesada del camélido (desprovistos de cadenas ligeras) han aparecido en un entorno inmunológico normal y se espera que habrán sufrido refinamiento selectivo en la especificidad y la afinidad que acompaña a la maduración de las células B.

\vskip1.000000\baselineskip

Expresión y purificación de la proteína V_{HH}21 de camello (DR21 en la figura 7) a partir de E. coli

Los clones pueden expresarse en varios tipos de vectores de expresión. Como un ejemplo que usa un vector comercialmente disponible Immuno PBS (Huse et al: Science (1989) 246, 1275), los clones producidos en Bluescript® de acuerdo con el procedimiento anteriormente descrito, se han recuperado por PCR usando el mismo XhoI que contiene el cebador 5' y un nuevo cebador 3' que corresponde a los residuos 113-103 en la estructura de las inmunoglobulinas, en las que se ha construido un sitio Spe: TC TTA ACT AGT GAG GAG ACG GTG ACC TG. Este procedimiento permitió la clonación de V_{HH} en el sitio Xho/Spe del vector Immuno PBS. Sin embargo, el extremo 3' del gen no estaba en fase con el "marcador" de identificación y el codón de terminación del vector. Para lograr eso, el constructo se cortó con Spe y los salientes de 4 bases se completaron usando el fragmento Klenow tras lo cual se volvió a ligar el vector.

- El vector de expresión plásmido ipBS (immunopBS) (Stratacyte) contiene una secuencia líder pel B que se usa para la expresión de la cadena de inmunoglobulina en E. coli bajo el control del promotor pLAC, un sitio de unión al ribosoma y codones de terminación. Además, contiene una secuencia para un marcador decapéptido C-terminal.

- E. coli JM101 que alberga el plásmido ipBS-V_{HH}2l se hizo crecer en 1 l de medio TB con 100 \mug/m1 de ampicilina y glucosa al 0,1% a 32ºC. La expresión se indujo por la adición de IPTG 1 mM (concentración final) a una DO_{550} de 1,0. Tras la inducción durante la noche a 28ºC, las células se recogieron mediante centrifugación a 4.000 g durante 10 min (4ºC) y se resuspendieron en 10 ml de tampón TES (Tris-HCl 0,2 M, pH 8,0, EDTA 0,5 mM, sacarosa 0,5 M). La suspensión se mantuvo en hielo durante 2 horas. Las proteínas periplasmáticas se eliminaron por choque osmótico mediante la adición de 20 ml de tampón TES diluido 1:4 v/v con agua, se mantuvieron en hielo durante una hora y posteriormente se centrifugaron a 12.000 g durante 30 min a 4ºC. La fracción periplasmática del sobrenadante se dializó contra Tris-HCl a pH 8,8, NaCl 50 mM, se aplicó en una columna de flujo rápido Q Sepharosa (Pharmacia), se lavó con el tampón anterior y se eluyó con un gradiente lineal de NaCl de 50 mM a 1 M en tampón.

Las fracciones que contenían la proteína V_{HH} se purificaron adicionalmente en una columna Superdex 75 (Pharmacia) equilibrada con tampón PBS (fosfato 0,01 M a pH 7,2, NaCl 0,15 M). El rendimiento de la proteína V_{HH} purificada varía desde 2 hasta 5 mg/l por cultivo celular.

Las fracciones se analizaron por SDS-PAGE(I). La identificación positiva del fragmento VHH del anticuerpo del camello se hizo mediante análisis de Western Blot usando anticuerpo producido en conejos contra la IgGH_{3} purificada del camello y un conjugado anti-IgG del conejo - fosfatasa alcalina (II).

Como patrones de la proteína (Pharmacia), se usaron proteínas periplasmáticas preparadas a partir de 1 ml de IPTGJM101 inducida/ipBS-V_{HH}21. La Figura 8 muestra: C,D: fracciones a partir de la cromatografía rápida en columna de S Sepharosa (C:Eluído en NaCl 650 mM, D:Eluído en NaCl 700 nM), E,F:fracciones a partir de la cromatografía en columna Superdex 75.

Como puede observarse, la principal impureza se elimina por la cromatografía de intercambio jónico y la mayoría de las impurezas que quedan se eliminan mediante filtración en gel.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(Tabla pasa a página siguiente)

9

10

TABLA 3 Comparación de algunos residuos de la Estructura 4 encontrados en la región V_{HH} del Camello con los residuos de la Estructura 4 correspondientes a la región consenso de los minigenes J de Humano y Ratón

\vskip1.000000\baselineskip

11

12

\newpage

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
\+\cr
\+\cr}

13

\newpage

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
\+\cr
\+\cr}

14

\newpage

Bibliografía

1. Ward, E.S., Güssow, D., Griffits, A.D., Jones, P.T. y Winter G., Nature 341, 544-546 (1989).

2. Ungar-Waron H., Eliase E., Gluckman A. y Trainin Z., Isr. J. Vet. Med. 43, 198-203 (1987).

3. Bajyana Songa E. y Hamers R., Ann. Soc. Beige Med. trop. 68, 233-240 (1988).

4. Edelman G.M., Olins D.E., Gally J.A. y Zinder N.D., Proc. Nat. Acad. Sc. 50, 753 (1963).

5. Franek P. y Nezlin R.S., Bickhimiya 28, 193, (1963).

6. Roitt I.M., Brostof J. y Male D.K., Immunology, Gower Med. Pub. London, New-York, S. 9.2. (1985).

7. Schiffer M., Girling R.L., Ely K.R. y Edmyson B., Biochemistry 12, 4620-4631 (1973).

8. Fleischman J.B., Pain R.H. y Porter R.R., Arch. Biochem. Biophys, Suppl. 1, 174 (1962).

9. Roholt O., Onoue K. y Pressman D., PNAS 51, 173-178 (1964).

10. Seligmann M., Mihaesco E., Preud'homme J.L., Danon P. y Brouet J.C., Immunological Rev. 48, 145-167 (1979).

11. Henderschot L., Bole D., Köhler G. y Kearney J.F., The Journal of Cell Biology 104, 761-767 (1987).

12. Henderschot L.M., The Journal of Cell Biology 111, 829-837 (1990).

13. Hamers-Casterman, C., E. Wittouck, W. Van der Loo y R. Hamers, Journal of Immunogenetics 6, 373-381 (1979).

14. Applied Biosystems - Ethanol Precipitation of Electro Eluted Electrodialysed Sample. Ausgabe Nr. 27.

15. Maniatis, T., E.F. Fritsch y J. Sambrook, Molecular Cloning. A Laboratory Manual (1988).

16. Sastry et al., PNAS 86, 5728, (1989).

17. Sanger, F., S. Nickien y A.R. Coulson, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 74, 5463-5467 (1977).

18. Kabat E.A., Tai Te Wu, M. Reid-Miller, H.M. Perry y K.S. Gottesman, U.S. Dpt of Health and Human Services, Public Health Service, National Institutes of Health (1987).

19. Valentine, R.C. y N.M. Geen, J.M.B. 27, 615-617 (1967).

Claims (19)

1. Procedimiento para la preparación de inmunoglobulinas o fragmentos de las mismas dirigidos contra antígenos determinados, que comprende las etapas de:

- clonar en vectores, especialmente en fagos y más particularmente en bacteriofagos filamentosos, la secuencia de ADN o de ADNc obtenida a partir de los linfocitos de Camélidos previamente inmunizados con determinados antígenos, capaces de producir una inmunoglobulina o un fragmento de la misma, dicha inmunoglobulina comprendiendo dos cadenas polipeptídicas pesadas, estando cada cadena pesada capaz de reconocer y unirse a un antígeno, conteniendo dicha inmunoglobulina una región variable (V_{HH}) y una región constante, estando dicha región constante desprovista de primer dominio constante C_{H}1, en el que la inmunoglobulina está desprovista de cadenas polipeptídicas ligeras,

- transformar las células procarióticas con los vectores anteriores en condiciones que permitan la producción de inmunoglobulinas o fragmentos de las mismas,

- seleccionar la inmunoglobulina apropiadas o un fragmento de las mismas, sometiendo las células transformadas a selección por afinidad al antígeno,

- recuperar las inmunoglobulinas o fragmentos de las mismas que tienen la especificidad deseada.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el vector de clonación es un plásmido o un virus eucariótico y la célula transformada es una célula eucariótica, especialmente una célula de levadura, una célula de mamífero, una célula de planta o una célula de protozoo.

3. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el vector de clonación es un plásmido capaz de expresar la inmunoglobulina o un fragmento de la misma en la membrana bacteriana.

4. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el vector de clonación es un plásmido capaz de expresar la inmunoglobulina o un fragmento de la misma como una proteína secretada.

5. Procedimiento según la reivindicación 1, con la condición de que el Camélido no esté previamente inmunizado con antígenos determinados.

6. Secuencia de nucleótidos isolada que codifica para una inmunoglobulina o un fragmento de la misma, formando un sitio determinado de unión al antígeno, comprendiendo dicha inmunoglobulina dos cadenas polipeptídicas pesadas capaces de reconocer y unirse a uno o varios antígenos, conteniendo dicha inmunoglobulina una región variable (V_{HH}) y una región constante, estando dicha región constante desprovista de un primer dominio (C_{H}1), estando dicha inmunoglobulina desprovista de cadenas polipeptídicas ligeras, fragmento que forma un sitio determinado de unión al antígeno.

7. Secuencia de nucleótidos isolada según la reivindicación 6, en la que el fragmento comprende la región V_{HH} de dicha inmunoglobulina.

8. Vector recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 7.

9. Vector recombinante según la reivindicación 8, que es un plásmido, un fago, un virus, un YAC, un cósmido.

10. Vector recombinante según la reivindicación 9, en el que el fago es un bacteriofago.

11. Célula u organismo recombinante que está modificado por un vector según una cualquiera de las reivindicaciones 8-10.

12. Célula u organismo recombinante según la reivindicación 11, que es E. Coli, una célula de levadura, una célula de mamífero, una célula de insecto, una célula de planta o una célula de protozoo.

13. Una librería de ADNc compuesta por secuencias de nucleótidos según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 7, la librería de ADNc estando obtenida llevando a cabo las siguientes etapas:

a) tratar una muestra que contiene células linfoides procedente de un animal sano, seleccionado entre los Camélidos, con el fin de separar las células linfoides,

b) separar el ARN poliadenilado de otros ácidos nucleicos y componentes de las células,

c) hacer reaccionar el ARN obtenido con una transcriptasa inversa, con el fin de obtener el ADNc correspondiente,

d) poner en contacto el ADNc con los cebadores 5' que se localizan en las secuencias promotora, líder o de la estructura de la secuencia V_{HH} de una inmunoglobulina de cadena pesada, cebador que contiene un sitio de restricción determinado y con los cebadores 3' que se localizan en la región no traducida bisagra, C_{H}2, C_{H}3 y 3' o cola de poliA,

e) amplificar el ADN,

f) clonar el ADN amplificado en un vector, y

g) recuperar los clones obtenidos.

14. Una librería de ADNc compuesta por secuencias de nucleótidos según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 7, la librería de ADNc estando obtenida llevando a cabo las siguientes etapas:

a) tratar una muestra que contiene células linfoides, procedente de un animal sano, seleccionado entre los Camélidos, con el fin de separar las células linfoides,

b) separar el ARN poliadenilado de otros ácidos nucleicos y componentes de las células,

c) hacer reaccionar el ARN obtenido con una transcriptasa inversa, con el fin de obtener el ADNc correspondiente,

d) poner en contacto el ADNc con los cebadores 5' correspondientes al dominio V_{H} del ratón de las inmunoglobulinas de cuatro cadenas, cebador que contiene un sitio de restricción determinado y con los cebadores 3' que corresponden a la parte N-terminal de un dominio C_{H}2 que contiene un sitio KpnI,

e) amplificar el ADN,

f) clonar el ADN amplificado en un vector, y

g) recuperar los clones obtenidos.

15. Librería de ADNc según una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 14, en la que las células linfoides de la etapa (a) están obtenidas de un animal previamente inmunizado contra un antígeno determinado y los clones recuperados en la etapa (g) codifican para cadenas polipeptídicas que tienen una especificidad preseleccionada para el antígeno que se usa para inmunización.

16. Librería de ADNc según una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, en la que dichas células linfoides están seleccionadas del grupo que consiste de linfocitos periféricos, células del bazo, ganglios linfáticos u otro tejido linfoide.

17. Librería de ADNc según una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16, en la que en la etapa (d) dicho sitio de restricción es un sitio XhoI.

18. Librería de ADNc según una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16, en la que en la etapa (f) dicho vector es un vector Bluescript^{TM}.

19. Librería de ADNc según una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 18, en la que la amplificación del ADNc no se realiza antes de la clonación del ADNc.