ES2330115T3 - Composicion antibacteriana, mas particilarmente contra las bacterias gram-negativas, que comprende un peptido y un agente antibacteriano ventajosamente hidrofobo. - Google Patents

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Abstract

La utilización de al menos un péptido de 10 a 25 residuos de aminoácido unido por covalencia a un compuesto antibacteriano, comprendiendo dicho péptido o péptidos: i) dos dominios cargados positivamente a pH neutro constituidos cada uno por 3 a 9 residuos de aminoácido, de los cuales al menos dos tercios son aminoácidos catiónicos, ii) entre dichos dominios cargados positivamente, un grupo de dos a tres residuos de aminoácido no catiónico, iii) en uno y/u otro de los extremos N o C terminales del péptido, un grupo de 0 a 10 residuos de aminoácido elegidos del grupo que comprende los aminoácidos no hidrófobos y los aminoácidos cargados positivamente, pero en el caso de un residuo de aminoácido cargado positivamente éste no es directamente adyacente a los dominios cargados positivamente. para la preparación de una composición farmacéutica destinada al tratamiento de una infección causada por las bacterias Gram-negativas.

Description

Composición antibacteriana, más particularmente contra las bascterias Gram-negativas, que comprende un péptido y un agente antibacteriano ventajosamente hidrófobo.
La presente invención se refiere al campo de los tratamientos antibacterianos y más particularmente de las composiciones para tratar las infecciones causadas por las bacterias Gram-negativas en el hombre, los animales o las plantas.
Se han descrito en la técnica anterior péptidos capaces de destruir las bacterias (Park CB, Kim HS, Kim SC. Biochem Biophys Res Commun. 1998 Mar 6; 244 (1): 253-7). Igualmente, en la solicitud de patente internacional PCT No. WO 01/64738, se han descrito péptidos capaces de reaccionar con los aminoglicanos y de transportar en las células eucariotas o procariotas las moléculas de interés.
La cantidad de moléculas de antibióticos que penetran en la bacteria depende de su estructura y de los mecanismos implicados en el transporte de sustratos. Las bacterias Gram-negativas se distinguen estructuralmente de las bacterias Gram-positivas por la presencia de dos membranas que constituyen la envoltura bacteriana. Si todas las bacterias tienen una membrana interna, las bacterias Gram-negativas tienen una membrana externa única suplementaria. Esta membrana externa hidrófoba constituye una barrera semipermeable que se opone a la penetración de los antibióticos, aunque las porinas, proteínas que forman los canales, permiten la entrada de pequeños solutos hidrófilos como los elementos nutritivos y los antibióticos de la familia de las penicilinas y tetraciclinas, pero excluyen la penetración de las moléculas grandes hidrófilas y de los antibióticos de la familia de los macrólidos/cetólidos.
Una causa importante de los fracasos terapéuticos contra las bacterias Gram-negativas es la aparición de cepas resistentes. Ciertas resistencias están ligadas a una reducción de la permeabilidad de las membranas bacterianas (modificaciones cuantitativas/cualitativas de porinas). Otras resistencias se basan en la presencia de una proteína membranal que provoca el rechazo del antibiótico por un mecanismo de eflujo activo. El desarrollo de nuevos tipos de moléculas antibacterianas o la utilización de antibióticos comerciales no activos sobre las bacterias Gram-negativas requiere su entrada y su liberación a través de membranas bacterianas selectivas.
La presente invención tiene precisamente por objetivo ofrecer nuevas composiciones que permiten tratar eficazmente las infecciones causadas por las bacterias Gram-negativas incluso cuando han desarrollado una resistencia a los antibióticos.
Este objetivo se alcanza gracias a la utilización de péptidos capaces de atravesar la membrana externa de las bacterias Gram-negativas y, por medio de esta traslocación a través de la membrana, liberar las moléculas de interés que de otro modo, no podrían penetrar en el interior de las bacterias, debido a sus propiedades físico-químicas.
Se entiende por penetración al interior de las bacterias, el hecho de que los péptidos de la invención facilitan o permiten la penetración de las moléculas de interés en las bacterias. Les términos penetración e internalización serán utilizados como sinónimos de aquí en adelante.
Los trabajos realizados en el marco de la presente invención se refieren al Bodipy y a la Tetrametilrodamina que son las moléculas fluorescentes hidrófobas excluidas por la membrana externa de las bacterias Gram-negativas. Estos marcadores fluorescentes han sido elegidos con el fin de evaluar las propiedades de internalización de los péptidos de la invención unidos químicamente a las moléculas hidrófobas. La traslocación de los marcadores fluorescentes a las bacterias Gram-negativas ha sido evaluada cualitativamente sobre Escherichia coli y Pseudomonas aeruginosa.
La presente invención tiene por objeto, ante todo, una composición antibacteriana, más particularmente dirigida contra las bacterias Gram-negativas, que comprende la asociación de:
a) al menos un péptido de 10 a 25 residuos de aminoácido que comprende:
i)
dos dominios cargados positivamente a pH neutro constituidos cada uno por 3 a 9 residuos de aminoácido de los cuales al menos dos tercios son aminoácidos catiónicos,
ii)
entre dichos dominios cargados positivamente, un grupo de dos a tres residuos de aminoácido no catiónico,
iii)
en uno y/u otro de los extremos N o C terminales del péptido, un grupo de 0 a 10 y con preferencia de 0 a 5 residuos de aminoácido elegidos del grupo que comprende los aminoácidos no hidrófobos y los aminoácidos cargados positivamente, pero en el caso de un residuo de aminoácido cargado positivamente éste no es directamente adyacente a los dominios cargados positivamente.
b) al menos un compuesto antibacteriano.
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Así, los péptidos de la invención son particularmente útiles para la preparación de una composición farmacéutica destinada al tratamiento de una infección, más particularmente de una infección causada por las bacterias Gram-negativas, en la que dicho péptido atraviesa la membrana de las bacterias para liberar en el interior de éstas un compuesto antibacteriano al que está asociado en dicha composición.
De forma ventajosa, en los péptidos de la invención mencionados, los aminoácidos catiónicos de los dos dominios cargados positivamente se eligen del grupo que comprende la arginina y la lisina.
Se prefiere en los péptidos de la invención mencionados, que los aminoácidos no catiónicos del grupo de los citados dominios cargados positivamente sean estos aminoácidos:
-
aminoácidos no hidrófobos, elegidos por ejemplo del grupo que comprende: el ácido glutámico, la serina, la glicina, y la glutamina, o
-
la leucina (aminoácido hidrófobo).
La orientación de las secuencias de aminoácido según la invención es típicamente de N-terminal hacia C-terminal. Sin embargo, según otro modo de realización, la orientación puede ser invertida, es decir que las secuencias de aminoácidos estén orientadas de C-terminal hacia N-terminal.
Los péptidos preferidos para las composiciones según la invención se eligen del grupo que comprende las siguientes secuencias (orientación N-terminal hacia C-terminal):
- DPV3: Arg Lys Lys Arg Arg Arg Glu Ser Arg Lys Lys Arg Arg Arg Glu Ser (SEQ ID NO. 1)
- DPV3.10: Arg Lys Lys Arg Arg Arg Glu Ser Arg Arg Ala Arg Arg Ser Pro Arg His Leu (SEQ ID N0. 2)
- DPV6: Gly Arg Pro Arg Glu Ser Gly Lys Lys Arg Lys Arg Lys Arg Leu Lys Pro (SEQ ID NO. 3)
- DPV7: Gly Lys Arg Lys Lys Lys Gly Lys Leu Gly Lys Lys Arg Asp Pro (SEQ ID NO. 4)
- DPV7b: Gly Lys Arg Lys Lys Lys Gly Lys Leu Gly Lys Lys Arg Pro Arg Ser Arg (SEQ ID NO. 5)
- DPV15: Leu Arg Arg Glu Arg Gln Ser Arg Leu Arg Arg Glu Arg Gln Ser Arg (SEQ ID NO. 6)
- DPV15b: Gly Ala Tyr Asp Leu Arg Arg Arg Glu Arg Gln Ser Arg Leu Arg Arg Arg Glu Arg Gln Ser Arg
(SEQ ID NO. 7)
- DPV1047: Val Lys Arg Gly Leu Lys Leu Arg His Val Arg Pro Arg Val Thr Arg Met Asp Val
(SEQ ID NO. 8)
- DPV11: Ala Lys Thr Gly Lys Arg Lys Arg Ser Gly (SEQ ID NO. 9)
- DPV1121: Val Lys Arg Gly Leu Lys Leu Arg Gln Lys Tyr Asn Lys Arg Ala Met Asp Tyr
(SEQ ID NO. 11) 
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Entre estos, la invención se refiere muy especialmente a los siguientes péptidos: DPV3, DPV3.10, DPV6, DPV7, DPV7b, DPV15 y DPV15b.
El alineamiento de las secuencias anteriores demuestra la existencia de los dominios cargados positivamente de las siguientes secuencias:
- Arg Lys Lys Arg Arg Arg (SEQ ID NO. 13)
- Arg Pro Arg (SEQ ID NO. 14)
- Lys Arg Lys Lys Lys Gly Lys (SEQ ID No. 15)
- Arg Arg Glu Arg (SEQ ID NO. 16)
- Arg Arg Arg Glu Arg (SEQ ID NO. 17)
- Arg Arg Ala Arg Arg Ser Pro Arg (SEQ ID NO. 18)
- Lys Lys Arg Lys Arg Lys Arg Leu Lys (SEQ ID NO. 19)
- Lys Lys Arg (SEQ ID NO. 20)
- Lys Lys Arg Pro Arg Ser Arg (SEQ ID NO. 21)
- Arg Leu Arg Arg Glu Arg (SEQ ID NO. 22)
- Arg Leu Arg Arg Arg Glu Arg (SEQ ID NO. 23) 
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Con preferencia, los dominios de las secuencias SEQ ID NO. 13 a 17 están en el lado del extremo N terminal del péptido, mientras que los dominios de las secuencias SEQ ID NO. 18 a 23 están en el lado del extremo C terminal del péptido.
El alineamiento de las secuencias anteriores también ha demostrado la existencia de grupos de dos a tres residuos de aminoácido no catiónico entre los dominios cargados positivamente de las siguientes secuencias:
Glu Ser, Glu Ser Gly, Leu Gly, Gln Ser
\vskip1.000000\baselineskip
Los compuestos antibacterianos presentes en las composiciones según la invención, se eligen con preferencia entre los que presentan propiedades físico-químicas que les hacen incapaces de atravesar la membrana de las bacterias Gram-negativas. Muy preferiblemente, se trata de compuestos antibacterianos hidrófobos. A título de ejemplos de tales compuestos, se pueden citar los antibióticos de la familia de los macrólidos, los cetólidos como la eritromicina, la claritromicina, la azitromicina, la telitromicina.
Los compuestos antibacterianos pueden ser también oligonucléotidos antisentido.
La evaluación de los péptidos DPV anteriores consiste en demostrar su capacidad para atravesar las membranas de las bacterias Gram-negativas E. coli o P. aeruginosa y de liberar el Bodipy en la bacteria, aunque éste sea una molécula hidrófoba normalmente excluida por la membrana externa de las bacterias Gram-negativas que representa una barrera semipermeable. Además, parece que estos péptidos tienen la capacidad de atravesar la membrana externa de las dos cepas de bacterias Gram-negativas y de acumularse en el citoplasma bacteriano por un mecanismo no dependiente de la energía y no tóxico para la bacteria.
Los trabajos realizados en el marco de la invención, han demostrado algunas diferencias de internalización entre las dos cepas de bacterias P. aeruginosa y E. coli. Así, parece que el péptido DPV7b es más internalizante en P. aeruginosa que en E. coli. Se podría explicar esta diferencia por las diferencias de estructuras de la membrana externa entre las dos cepas de bacterias.
Estos péptidos son por tanto útiles para la preparación de composiciones farmacéuticas antibacterianas, más particularmente contra las bacterias Gram-negativas, en las que están asociados con uno o varios agentes antibacterianos.
Las composiciones de la invención son útiles tanto a título preventivo como curativo.
Las composiciones según la invención comprenden igualmente de forma ventajosa uno o varios vehículos, diluyentes o excipientes farmacéuticamente aceptables generalmente utilizados con este tipo de agentes.
Los péptidos de la invención se pueden preparar por síntesis química o por ingeniería genética en una célula procariota como una bacteria, en una célula eucariota como una levadura, una célula CHO (ovario de hámster chino), una célula NSO (células de mieloma de ratón), en un animal transgénico, por ejemplo en la leche de conejo, de cabra, de oveja, de vaca, etc... transgénicos, o en una planta transgénica como, por ejemplo, en las plantas de tabaco, etc....
La invención se refiere también a los equivalentes funcionales de los péptidos definidos antes, tales como los péptidos que comprenden modificaciones derivadas de procesos post-traduccionales como la glicosilación o de modificaciones químicas tales como el acoplamiento con lípidos, azúcares, secuencias de nucleótidos ya que estas modificaciones no cambian la actividad antibacteriana y/o antifúngica de dichos péptidos conforme a los ensayos descritos en la parte experimental de esta memoria, más adelante. Los equivalentes funcionales comprenden también los péptidos en los que uno o varios aminoácidos son aminoácidos de conformación D. La invención cubre igualmente los retro-péptidos y los retro-inverso-péptidos.
\newpage
La asociación de las composiciones según la invención puede estar constituida por uno o varios péptidos descritos antes y por uno o varios compuestos antibacterianos, también salvo indicación contraria, y el singular empleado para la definición de los agentes activos (péptido y compuesto antibacteriano) de la composición cubre también el
plural.
La composición según la invención puede ser realizada por la asociación de uno o más péptidos y de uno o más compuestos antibacterianos en mezcla, o por un producto en el cual uno o varios péptidos idénticos o diferentes están unidos por covalencia a uno o varios compuestos idénticos o diferentes, eventualmente por intermedio de un brazo espaciador. Tales productos son especialmente los productos de la fórmula (I) que serán descritos más adelante.
En el caso de la administración del péptido y del compuesto antibacteriano en mezcla, estos dos agentes activos de la composición antibacteriana de la invención pueden estar presentes de forma separada, cada uno bajo una forma farmacéutica apropiada, y reunidos en un mismo envase final. Sin embargo, para facilitar la administración simultánea de los agentes activos, se prefiere generalmente preparar el medicamento bajo una sola forma farmacéutica que contenga los dos ingredientes activos en mezcla, así como eventualmente un excipiente farmacéutico apropiado.
Naturalmente, se debe considerar que un producto constituido por un péptido unido directa o indirectamente a un compuesto antibacteriano, constituye por sí solo una asociación según la invención y que puede ser utilizado como ingrediente activo único.
Por ejemplo, un péptido y un compuesto antibacteriano se pueden combinar estableciendo una unión química entre ellos. Especialmente, se puede amidificar una función amina del péptido, o esterificar una o varias funciones alcohol del péptido, con un grupo ácido presente en un compuesto antibacteriano o derivado de éste. Se obtiene así un producto de amidificación que constituye el producto activo de la composición de la invención. Se puede añadir igualmente a uno y/u otro de los extremos N y/o C terminales del péptido, un residuo de aminoácido cuya cadena lateral permita el acoplamiento con un compuesto antibacteriano, como por ejemplo un residuo de cisteína cuyo grupo SH es reactivo. Ejemplos de tales productos son los de la fórmula (I) que se describen más adelante.
En efecto, la invención tiene igualmente por objeto nuevos productos en los que el péptido y el compuesto antibacteriano están unidos uno a otro por covalencia, eventualmente por intermedio de al menos un brazo espaciador.
Tales productos son especialmente los que responden a la fórmula (I) siguiente:
(I)(A-)_{m}(X)_{p}(-P)_{n}
en la que: A es el resto de un compuesto antibacteriano, P es el resto de un péptido, tales como se han definido precedentemente, y X representa o bien un enlace covalente entre A y P, o bien un brazo espaciador que une al menos un resto A con al menos un resto P, m es un número entero que puede ir de 1 a 3, n es un número entero que puede ir de 1 a 3, y p representa cero o un número entero que como máximo es igual o mayor que los números m y n.
Se puede en efecto, o bien fijar uno o varios restos A y/o P sobre un solo brazo espaciador, o bien fijar uno o varios grupos A-X sobre un resto P (y entonces m = p y n = 1), o bien fijar uno o varios grupos X-P sobre un resto A (y entonces n = p y m = 1). Cuando p = cero, o bien uno o varios restos A se unen directamente a un resto P (y n = 1), o bien uno o varios restos P se unen directamente a un resto A (y m = 1).
Los productos de la fórmula (I) se pueden utilizar en forma de sales, en particular en forma de sales de metales alcalinos tales como las sales de sodio o de potasio; estas sales son por ejemplo las de los grupos fosfatos, si están presentes, de los grupos fenólicos (caso del ácido salicílico), etc. Se pueden utilizar igualmente los productos de la fórmula (I), según el caso, bajo forma de sales de adición (por ejemplo bajo forma de hidrocloruro) cuando estos productos contienen un grupo amina.
Los enlaces entre el brazo espaciador y los restos A y P o directamente entre A y P son enlaces covalentes. Estos enlaces covalentes se pueden formar, como se ha indicado antes, entre los grupos de éster carboxílico, amido-carboxílico, éster tiocarboxílico o amido-tiocarboxílico.
Los restos de compuesto antibacteriano (A) y de péptido (P) son derivados del compuesto antibacteriano o del péptido, de los cuales uno o varios grupos químicos han sido o bien suprimidos o bien modificados de forma que se permita la formación de enlaces covalentes directamente entre A y P o indirectamente por intermedio de un brazo espaciador.
Se puede tratar de funciones acilos de compuestos antibacterianos que tienen un grupo carboxílico capaz de formar un enlace con el brazo espaciador o con el péptido, teniendo este último una amina primaria o un grupo hidroxilo apto para formar un enlace covalente con el brazo espaciador o con el compuesto antibacteriano.
Los brazos espaciadores pueden ser especialmente restos bivalentes de compuestos alifáticos bi-funcionales, como los compuestos que tienen en cada uno de sus extremos, grupos funcionales reactivos que permiten a cada uno formar enlaces covalentes con A y con P. Estos compuestos pueden ser por ejemplo compuestos que tienen a la vez un grupo amino y un grupo carboxílico (o tiocarboxílico), o incluso compuestos que tienen a la vez un grupo amino y un grupo hidroxilo.
En la fórmula (I), el grupo X (haciendo abstracción de sus grupos funcionales de los extremos) representa especialmente un grupo alifático divalente eventualmente interrumpido por uno o varios heteroátomos -O- o -S- o por uno o varios grupos heteroatómicos -NH- o -CO-NH-.
Los compuestos capaces de dar, después de reacción con el péptido y con el compuesto antibacteriano o sus derivados, los productos de la fórmula (I) en los cuales A y P están unidos por brazos espaciadores, son por ejemplo los ácidos alfa-, beta- o gamma-aminoalcanocarboxílicos, en particular los alfa-aminoácidos naturales tales como la glicina, alanina, valina o leucina, o incluso los péptidos, especialmente los dipéptidos o los tripéptidos. Como se indica en los ejemplos, se puede tratar ventajosamente de un residuo de cisteína.
Los agentes espaciadores pueden ser igualmente ácidos hidroxi-carboxílicos tales como los ácidos láctico, glicólico, los ácidos aldónicos (glucónico, manónico, galactónico, ribónico, arabinónico, xilónico y eritrónico) y las lactonas o dilactonas correspondientes (por ejemplo lactida, glicolida, delta-glucolonactona, delta-valeronactona), o incluso los ácidos aldáricos.
Los grupos funcionales eventualmente presentes sobre el brazo espaciador y no implicados en el enlace con A o P pueden ser utilizados para fijar otros restos A y/o P de forma que se obtengan compuestos de la fórmula (I) para los cuales m y/o n son superiores a 1. Este es el caso, por ejemplo, de los grupos hidroxilos de los hidroxiácidos, del segundo grupo carboxílico de los aminoácidos di(ácido carboxílico), del segundo grupo amino de los aminoácidos diaminados, del grupo hidroxilo de los aminoácidos hidroxilados, etc.
El brazo espaciador puede estar ventajosamente constituido por una molécula de enlace apta para permitir la liberación retardada de uno y/u otro de los restos A o P, especialmente protegiéndoles de una degradación después de la administración. El brazo espaciador puede estar constituido también por una molécula de vectorización que permite definir como objetivo un órgano o tejido particular para la liberación de los restos de compuesto antibacteriano.
Para preparar los compuestos de la fórmula (I), se utilizan los métodos clásicos de la síntesis orgánica. Por ejemplo, para preparar las amidas o los ésteres, se puede hacer reaccionar un compuesto carboxílico bajo la forma de un halogenuro de ácido carboxílico (o tiocarboxílico), o bajo la forma de un anhídrido mixto, o bajo la forma de un éster activado, por ejemplo un éster de p-nitrofenilo. Se puede activar igualmente el ácido con ayuda de un agente de acoplamiento tal como la diciclohexilcarbodiimida.
Como los compuestos de la fórmula (I) comprenden restos de péptido, se les puede preparar utilizando en particular los métodos conocidos en la química de los péptidos.
Naturalmente, cuando los compuestos de los que se derivan A, P o X de la fórmula (I), comprenden varias funciones susceptibles de reaccionar, conviene operar o bien utilizando los reactivos en proporciones estequiométricas (según el número de productos precursores de A y/o de P que se quiere hacer reaccionar), o bien protegiendo temporalmente las funciones reactivas que no se desea que reaccionen. Se utilizan para esto métodos de protección temporal de dichas funciones reactivas. Estos métodos de protección temporal son bien conocidos, especialmente aquellos que han sido desarrollados durante las investigaciones relativas a la síntesis de los péptidos. Por ejemplo, los grupos
-NH_{2} pueden ser protegidos por grupos carbobenzoxi, ftaloilo, t-butoxicarbonilo, trifluoroacetilo, toluenosulfonilo; los grupos carboxílicos pueden ser protegidos bajo la forma de ésteres bencílicos, de ésteres de tetrahidropiranilo o de ésteres de t-butilo; los alcoholes pueden ser protegidos bajo la forma de ésteres (por ejemplo acetatos), bajo la forma de éteres de tetrahidropiranilo, de éteres bencílicos o de éteres de tritilo, o incluso bajo la forma de acetales (comprendidos bajo la forma de acetónidos en el caso de los glicoles vecinales). Las reacciones de protección y de desprotección eventual de diversos grupos químicos son conocidas y están descritas en la bibliografía.
Las reacciones de fosfatación o de desfosfatación del alcohol primario de los nucleótidos o nucleósidos se pueden llevar a cabo utilizando enzimas naturales (por ejemplo fosfatasas, fosfoquinasas).
Las composiciones antibacterianas de la invención, y especialmente aquellas que comprenden un compuesto de la fórmula (I), pueden ser administradas por uno cualquiera de los modos de administración aceptados para los agentes terapéuticos y naturalmente, por vía oral, sublingual, nasal, pulmonar, rectal o parenteral (por ejemplo intravascular, intramuscular, transcutánea, intra-articular). Se pueden citar también la administración sistémica, tópica o incluso central, por ejemplo por vía quirúrgica intracraneana o incluso la administración intra-ocular. Se puede citar también la implantación subcutánea de implantes biodegradables.
A este efecto, las composiciones se pueden presentar en cualquier forma que permita la administración por:
-
vía oral (en particular en forma de cápsulas, soluciones o emulsiones bebibles, polvos, geles, granulados, pastillas o comprimidos), comprimidos, cápsulas, cápsulas blandas, y comprende las formulaciones de liberación retardada o prolongada, píldoras, polvos, gránulos, elixires, tinturas, suspensiones, jarabes y emulsiones. Esta forma de presentación está más particularmente adaptada al paso de la barrera intestinal y a la utilización más común de los compuestos antibacterianos y/o antifúngicos.
-
vía parenteral, generalmente por inyección intramuscular o intravenosa por perfusión. Las composiciones inyectables pueden ser preparadas en las formas clásicas, ya sea en suspensión o en solución líquida o ya sea en una forma sólida conveniente para una disolución extemporánea en un líquido adecuado, y comprenden las formulaciones de liberación retardada o prolongada como la inclusión de los péptidos en micropartículas o nanopartículas biodegradables de formulación lipídica o de formulación de dextrano o incluso de PLGA o equivalentes. Esta forma de presentación está más particularmente adaptada al paso de la barrera hemato-encefálica y a la utilización hospitalaria de los compuestos antibacterianos y/o antifúngicos.
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Una posibilidad para la administración parenteral utiliza la implantación de un sistema de liberación lenta o de liberación prolongada que asegura el mantenimiento de un nivel constante de dosis.
Otra posibilidad consiste en fijar por adsorción u otro sistema los péptidos de la invención sobre un soporte, como un catéter, una prótesis o una cola biológica.
-
vía nasal (por ejemplo las soluciones a administrar en forma de gotas o de pulverizaciones),
-
vía pulmonar (soluciones en frasco presurizado para aerosoles),
-
vía rectal (supositorios),
-
vía cutánea (por ejemplo cremas, pomadas o dispositivos transdérmicos, también llamados sellos o parches),
-
vía transmucosal como por ejemplo por vía sublingual (soluciones en frasco presurizado, o comprimidos para disgregación bucal).
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Estas formas farmacéuticas se preparan de la forma usual y pueden contener excipientes y vehículos clásicos apropiados.
Otras preparaciones tópicas habituales comprenden las cremas, pomadas, lociones, geles y las pulverizaciones de aerosoles. Estas últimas están más particularmente adaptadas para el tratamiento de las infecciones bronco-pulmonares bacterianas y/o fúngicas.
Las composiciones de la invención se pueden utilizar también en el campo cosmético, a título esencialmente preventivo, y consisten entonces en cremas, esmalte de uñas, productos de higiene de los órganos genitales, pastas dentífricas, soluciones de higiene bucal o para incluir en las micropartículas de difusión lenta, en fase acuosa, incluidas por ejemplo en los pañales, bastoncillos, vendas, algodón para desmaquillar, compresas o incluso camas para animales.
En función del modo de administración, los compuestos pueden estar en forma sólida, semisólida o líquida.
Para las composiciones sólidas, tales como comprimidos, píldoras, polvos o granulados en estado libre o incluso en cápsulas, la asociación puede estar combinada con:
-
diluyentes, por ejemplo lactosa, dextrosa, sacarosa, manitol, sorbitol, celulosa y/o glicina;
-
lubrificantes, por ejemplo sílice, talco, ácido esteárico, su sal de magnesio o de calcio y/o el polietilenglicol;
-
aglutinantes, por ejemplo silicato de magnesio y de aluminio, pasta de almidón, gelatina, goma tragacanto, metilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica y/o polivinilpirrolidona; según el caso,
-
disgregantes, por ejemplo almidón, agar, ácido algínico o su sal de sodio, o mezclas efervescentes; y/o
-
absorbentes, colorantes, aromatizantes y edulcorantes. Los excipientes pueden ser por ejemplo manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, talco, celulosa, glucosa, sacarosa, carbonato de magnesio y los análogos de calidad farmacéutica.
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Para las composiciones semisólidas, tales como los supositorios, el excipiente puede ser, por ejemplo, una emulsión o suspensión grasa, o una base de polialquilenglicol, tal como el polipropilenglicol.
Las composiciones líquidas, en particular inyectables o para incluir en una cápsula blanda, se pueden preparar por ejemplo por disolución, dispersión, etc. del principio activo en un disolvente farmacéuticamente puro tal como, por ejemplo, agua, suero fisiológico, dextrosa acuosa, glicerol, etanol, un aceite y los análogos.
Las composiciones según la invención se pueden administrar igualmente bajo la forma de sistemas de liberación del tipo liposomas, tales como bajo la forma de pequeñas vesículas unilamelares, de grandes vesículas unilamelares y de vesículas multilamelares. Los liposomas se pueden formar a partir de una diversidad de fosfolípidos, que contienen colesterol, estearilamina o fosfatidilcolinas. En una forma de realización, una película de componentes líquidos puede ser hidratada con una solución acuosa del medicamento para formar una capa lipídica que encapsula el medicamento.
Las composiciones según la invención pueden ser esterilizadas y/o contener adyuvantes y sustancias auxiliares no tóxicas tales como agentes de conservación, de estabilización, de humectación o de emulsión, agentes que favorecen la disolución, sales para regular la presión osmótica y/o tampones. Además, pueden contener igualmente otras sustancias que presentan un interés terapéutico. Las composiciones se preparan, respectivamente, por los procedimientos clásicos de mezcla, granulación o recubrimiento y contienen aproximadamente de 0,1 a 75%, con preferencia aproximadamente de 1 a 50%, de principio activo.
Los péptidos y los agentes antibacterianos de la asociación de la composición según la invención, pueden estar igualmente acoplados con polímeros solubles tales como los soportes de los medicamentos objetivos. Tales polímeros pueden comprender la polivinilpirrolidona, el copolímero pirano, el polihidroxipropil-metacrilamida-fenol, el polihidroxi-etil-aspanamida-fenol o el poli(óxido de etileno)-polilisina sustituido con residuos palmitoilo, y el dextrano. Además, los compuestos según la presente invención pueden estar acoplados a una clase de polímeros biodegradables útiles para realizar una liberación controlada de un medicamento, por ejemplo, el poli(ácido láctico), la poli(epsilon-caprolactona), el poli(ácido hidroxibutírico), los poliortoésteres, los poliacetales, los polidihidropiranos, los policianoacrilatos y los copolímeros de hidrogel de secuencias reticuladas o anfipáticas.
La posología para la administración de las composiciones según la invención se elige en función de numerosos factores que comprenden el tipo, la especie, la edad, el peso, el sexo y el estado de salud del sujeto, la gravedad de la afección a tratar, la vía de administración; el estado de las funciones renal y hepática del sujeto y la naturaleza del compuesto particular, o sal, empleado. Un médico o un veterinario con experiencia normal determinará fácilmente, y prescribirá, la cantidad eficaz para prevenir, combatir o parar el progreso de la afección médica a tratar.
Una composición según la invención puede contener de 0,1 a 99%, con preferencia de 1 a 70% de principio activo.
A título de ejemplos, las posologías orales de las composiciones según la invención estarán comprendidas entre aproximadamente 0,5 y 1 mg/día por vía oral y, con preferencia suministradas bajo la forma de comprimidos que contienen 0,5, 1, 2,5, 5, 10, 15, 25, 50, 100, 250, 500 y 1.000 mg de principio activo. Las concentraciones plasmáticas eficaces se obtendrán a partir de una posología que va de 0,002 mg a 50 mg por kg de peso corporal y por día.
Las composiciones de la invención se pueden administrar en forma de dosis diarias únicas, o en dos, tres o cuatro dosis al día.
Otras ventajas y características de la invención aparecerán en los ejemplos que siguen, dados a título ilustrativo, y en los cuales se hará referencia a los dibujos del anexo, en los que:
La figura 1 representa la fórmula del Bodipy® FL N- (2-aminoetil)maleimida.
La figura 2 representa la fórmula de la Tetrametilrodamina-6-maleimida.
La figura 3 representa la internalización de los conjugados DPV-Bodipy en E. coli.
La figura 4 representa el inmunomarcado de la membrana externa después de internalización del conjugado DPV3-Bodipy.
La figura 5 representa la internalización de los conjugados DPV-Bodipy en P. aeruginosa.
La figura 6 representa las imágenes de microscopía confocal de P. aeruginosa.
La figura 7 representa la internalización del conjugado DPV3-TMR en E. coli.
I- Materiales y Métodos I.1) Marcadores fluorescentes
-
Bodipy® FLN-(2-aminoetil)maleimida (Bodipy) (Molecular Probes Cat# B-10250), cuya fórmula molecular es C_{20}H_{21}BF_{2}N_{4}O_{3}. El peso molecular es de 414,22 Da, la absorbancia de 504 nm y la emisión de 510 nm (fluorescencia verde), y la fórmula desarrollada se da en la figura 1.
-
Tetrametilrodamina-6-maleimida (TMR) (Molecular Probes Cat# T-6028), cuya fórmula molecular es C_{28}H_{23}N_{3}O_{5}, el peso molecular es de 481,51 Da, la absorbancia de 541 nm y la emisión de 567 nm (fluorescencia roja) y la fórmula desarrollada se da en la figura 2.
Estas dos moléculas fluorescentes contienen un grupo reactivo maleimida que permite el acoplamiento químico sobre la función tiol de la cisteína del péptido.
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I.2) Los vectores peptídicos (DPVs)
Se han utilizado los péptidos de las siguientes secuencias:
-
DPV3: Arg Lys Lys Arg Arg Arg Glu Ser Arg Lys Lys Arg Arg Arg Glu Ser (SEQ ID NO. 1) con un residuo Cys (Cisteína) en su extremo C terminal,
-
DPV3.10: Arg Lys Lys Arg Arg Arg Glu Ser Arg Arg Ala Arg Arg Ser Pro Arg His Leu (SEQ ID NO. 2) con un residuo Cys en su extremo C terminal,
-
DPV6: Gly Arg Pro Arg Glu Ser Gly Lys Lys Arg Lys Arg Lys Arg Leu Lys Pro (SEQ ID NO. 3) con un residuo Cys en su extremo C terminal,
-
DPV7: Gly Lys Arg Lys Lys Lys Gly Lys Leu Gly Lys Lys Arg Asp Pro (SEQ ID NO. 4) con un residuo Cys en su extremo C terminal,
-
DPV7b: Gly Lys Arg Lys Lys Lys Gly Lys Leu Gly Lys Lys Arg Pro Arg Ser Arg (SEQ ID NO. 5) con un residuo Cys en su extremo C terminal,
-
DPV15: Leu Arg Arg Glu Arg Gln Ser Arg Leu Arg Arg Glu Arg Gln Ser Arg (SEQ ID NO. 6) con un residuo Cys en su extremo C terminal,
-
DPV15b: Gly Ala Tyr Asp Leu Arg Arg Arg Glu Arg Gln Ser Arg Leu Arg Arg Arg Glu Arg Gln Ser Arg (SEQ ID NO. 7) con un residuo Cys en su extremo N terminal,
-
DPV1047: Val Lys Arg Gly Leu Lys Leu Arg His Val Arg Pro Arg Val Thr Arg Met Asp Val (SEQ ID NO. 8) con un residuo Cys en su extremo N terminal,
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DPV11: Ala Lys Thr Gly Lys Arg Lys Arg Ser Gly (SEQ ID NO. 9) con un residuo Cys en su extremo C terminal,
-
DPV12: Gln Gly Lys Ser Lys Arg Glu Lys Lys Asp Arg Val Phe (SEQ ID NO. 10) con un residuo Cys en su extremo C terminal,
-
DPV1121: Val Lys Arg Gly Leu Lys Leu Arg Gln Lys Tyr Asn Lys Arg Ala Met Asp Tyr (SEQ ID NO. 11) con un residuo Cys en su extremo N terminal,
-
DPV19: Asn Pro Gly Val Ser Thr Val Val Leu Gly Ala Tyr Asp Leu Arg Arg Arg Glu Arg Gln Ser Arg (SEQ ID NO. 12) con un residuo Cys en su extremo N terminal.
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Las síntesis peptídicas se han realizado según las técnicas conocidas por los expertos en este campo. Los péptidos son solubles en agua.
Los péptidos tienen un residuo de cisteína en la posición N- o C-terminal a fin de permitir la conjugación con el marcador fluorescente.
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I.3) Los productos controles
Bodipy y TMR se acoplan químicamente a un residuo de cisteína y sirven de referencia negativa de internalización.
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I.4) Método de acoplamiento químico
Las soluciones de Bodipy o TMR se preparan a una concentración final 50 mM en dimetilformamida (DMF). Las soluciones de DPV se preparan a una concentración final 10 mM en DMF. Se mezclan 200 \mul de la solución de Bodipy o de TMR con 700 \mul de la solución de DPV. Después de una incubación de 2 horas a temperatura ambiente, en la oscuridad, se añaden 2 ml de H_{2}O y 8 ml de diclorometano (DCM). Se mezcla la solución en vortex y se centrifuga durante 2 minutos a 3000 g. Se recoge la fase acuosa y se conserva. Se realizan cuatro extracciones sucesivas con DCM. Se reúnen las fases acuosas en un frasco de vidrio y se ponen durante 1 hora a -80ºC antes de ser liofilizadas como mínimo en 18 horas. El polvo obtenido se conserva bajo argón a -20ºC protegido de la luz.
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I.5) Conservación de los conjugados en solución
Los conjugados DPV-Bodipy y DPV-TMR se conservan diluidos a concentración 3 mM en H_{2}O a -20ºC, protegidos de la luz.
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I.6) Análisis por HPLC de los conjugados
-
Para los conjugados Bodipy:
Columna Luna 100 \ring{A} 3 \mu C18 100x4,6 mm
Disolvente A: TFA al 0,1% en H_{2}O
Disolvente B: TFA al 0,1% en acetonitrilo (CAN)
Gradiente: 5% de B hasta 60% en 10 min, 60% de B hasta 90% en 1 min, 90% de B durante 3 min, 5% de B durante 2 min
Caudal: 1,2 ml/min; volumen inyectado: 10 \mul; la concentración de la muestra inyectada es de 1 mg/ml en TFA al 0,1%
Detector: DAD: 214 nm, 300 nm.
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-
Para los conjugados TMR:
Columna Luna 100\ring{A} 3 \mu C18 100x4,6 mm
Disolvente A: TFA al 0,1% en H_{2}O
Disolvente B: TFA al 0,1% en acetonitrilo (CAN)
Gradiente: 5% de B hasta 60% en 10 min, 60% de B hasta 90% en 1 min, 90% de B durante 3 min, 5% de B durante 2 min
Caudal: 1,2 ml/min; volumen inyectado: 20 \mul; la concentración de la muestra inyectada es de 1 mg/ml en TFA al 0,1%
Detector: DAD: 220 nm.
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I.7) Cepas bacterianas
-
Escherichia coli ATCC 25922
-
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853
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I.8) Protocolo de internalización I.8.a) Evaluación de la penetración de los conjugados en la bacteria a 37ºC
Las bacterias en fase exponencial de cultivo se centrifugan y se lavan 3 veces con el tampón fosfato de sodio 10 mM, pH 7,4 (tampón NAPB). La concentración bacteriana se ajusta a 1x10^{6} ufc/ml (Unidades Formadoras de Colonias) en el tampón NAPB. Se depositan 50 \mul de la suspensión bacteriana sobre una lámina de poli-L-Lisina. Después de una incubación de 30 minutos a 37ºC en cámara húmeda, las bacterias inmovilizadas sobre la lámina se enjuagan 3 veces con el tampón NAPB. Se depositan 50 \mul de solución de conjugado DPV-Bodipy o DPV-TMR o producto control sobre las bacterias. Después de una incubación de 30 minutos a 37ºC en cámara húmeda y protegida de la luz, se enjuagan las láminas 3 veces con el tampón NAPB. Las bacterias se pueden fijar sobre la lámina por una incubación de 20 minutos a 37ºC, protegida de la luz. Se deposita una gota de PBS/glicerol al 50% sobre la lámina y se recubre con una laminilla de vidrio. Después de sellado de la laminilla sobre la lámina, se observa la fluorescencia de las bacterias con el microscopio óptico de epifluorescencia Leica (objetivo 40X o 63X en inmersión). Las imágenes se toman con la cámara numérica Nikon Coolpix con zoom máximo y con el adaptador 0,63 X. Se realiza un análisis más detallado con el microscopio confocal Bio-rad MRC 600 (BIO-RAD Microscience Ltd., Hemel Hempstead, England), equipado con un microscopio óptico invertido y con un objetivo de inmersión X100. Se visualizan las bacterias por su fluores-
cencia después de excitación por un láser de Kriptón/Argón. Se realizan varios cortes de bacterias de 0,1-0,2 \mum.
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I.8.b) Evaluación de la penetración de los conjugados en la bacteria a +4ºC
El método descrito precedentemente (I.8.a) ha sido modificado como sigue. Las bacterias inmovilizadas sobre la lámina de poli-L-Lisina y enjuagadas 3 veces con el tampón NAPB se incuban durante 24 horas a +4ºC antes de la adición de los conjugados DPV fluorescentes preincubados a +4ºC. Todas las etapas siguientes se realizan a +4ºC con las soluciones frías.
I.9) Inmunomarcado de la membrana externa de las bacterias: inmunofluorescencia indirecta
Las bacterias inmovilizadas sobre la lámina de poli-L-Lisina se enjuagan 3 veces con el tampón NAPB y se incuban 30 minutos a la temperatura del laboratorio con una solución NAPB/SAB al 0,05% (seroalbúmina bovina). Las bacterias se incuban 30 min a la temperatura del laboratorio con el anticuerpo monoclonal de ratón anti-endotoxina (Biovalley Cat# C55157; lote# 212529) diluido en NAPB/SAB al 0,05%, se lavan varias veces con NAPB/SAB al 0,05% y después se incuban 30 minutos a la temperatura del laboratorio, protegidas de la luz, con un segundo anticuerpo: anticuerpo policlonal de conejo anti-ratón conjugado con la tetrametilrodamina (TRITC) (Jackson ImmunoResearch Cat# 315-026-003, lote# 47511) o con la fluoresceína (FITC) ( (Jackson ImmunoResearch Cat# 715- 095-150, lote# 51038). Después de varios lavados con el tampón NAPB, se deposita una gota de PBS/glicerol al 50% sobre la lámina y se recubre con una laminilla de vidrio. Después de sellado de la laminilla sobre la lámina, se observa la fluorescencia de las bacterias con el microscopio confocal como se ha descrito precedentemente (\NAK I.8.a).
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I.10) Evaluación de la actividad antibacteriana de los conjugados
Las concentraciones mínimas inhibidoras (CMI) se determinan por el método de microdilución en medio líquido (NCCLS M7A5) para el conjunto de las especies bacterianas en placa de poliestireno de 96 pocillos.
Una colonia aislada de la bacteria E. coli ATCC 25922 o P. Aeruginosa ATCC 27853 se pone en suspensión en 3 a 5 ml de medio de cultivo Mueller-Hinton (MH) y se incuba a 37ºC durante una noche con agitación. A partir de este cultivo de la noche, se realiza un cultivo en fase exponencial de crecimiento de la cepa; se siembra el medio MH al 1/50 con el cultivo de la noche y se incuba 2 horas a 37ºC con agitación. La concentración bacteriana se ajusta a 1x10^{6} ufc/ml (Unidades Formadoras de Colonias) en el medio MH.
Se distribuyen 50 \mul de inóculo bacteriano por pocillo que contiene un volumen igual de la solución de conjugado diluida a la mitad en el medio de cultivo adecuado (0 a 1 \muM). Los cultivos se incuban a 37ºC en aire ambiente durante 16 a 20 horas.
La CMI expresada en \muM es la primera concentración que no presenta crecimiento bacteriano.
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II- Resultados II.1) Internalización de los conjugados DPV-Bodipy en la bacteria Gram-negativa II.1.a) Evaluación cualitativa de la internalización de los conjugados DPV-Bodipy - Evaluación cualitativa en la bacteria E. coli
La figura 3 representa la internalización de los conjugados DPV-Bodipy en E. coli.
Las bacterias inmovilizadas sobre la lámina de poli-L-Lisina se incuban con una concentración 1 \muM de conjugado DPV-Bodipy durante 30 minutos a 37ºC. Las imágenes de microscopía (microscopio óptico de epifluorescencia, objetivo X 63 de inmersión) muestran la penetración del conjugado DPV-Bodipy en las bacterias vivas. A: DPV3, B: DPV3.10; C: DPV6; D: DPV7; E: DPV7b; F: DPV15; G: DPVl5b; H: DPV1047; I: DPV11; J: DPV12; K: DPV1121; L: DPV19.
Las bacterias E. coli se incuban 30 minutos a 37ºC con una concentración 1 \muM del conjugado DPV-Bodipy como se ha descrito en el epígrafe I.8.a. La internalización de los conjugados DPV-Bodipy fluorescentes en las bacterias no fijadas se visualiza con microscopio de epifluorescencia. No se detecta ninguna fluorescencia con el conjugado control Cys-Bodipy. Como se muestra en la figura 3, varios conjugados DPV-Bodipy atraviesan las membranas bacterianas de la bacteria E. coli para acumularse en el citoplasma bacteriano. Los péptidos DPV3.10 (Fig. 3B), DPV3 (Fig. 3A), DPV6 (Fig. 3C) y DPV15 (Fig. 3F) son fuertemente penetrantes e internalizantes de moléculas hidrófobas. Con los péptidos DPV11 y DPV12 (Fig. 31 y 3J), se obtienen niveles de fluorescencia heterogéneos en una misma población bacteriana. Las propiedades de internalización de estos péptidos son más débiles. El péptido DPV19 no penetra en las bacterias. (Fig. 3L).
Un perfil idéntico de internalización de los conjugados DPV-Bodipy se observa después de fijación de las bacterias.
La figura 4 representa el inmunomarcado de la membrana externa después de internalización del conjugado DPV3-Bodipy.
Las bacterias E. coli inmovilizadas sobre la lámina de poli-L-Lisina se incuban con una concentración 3 \muM del conjugado DPV3-Bodipy a 37ºC durante 30 minutos. Después de internalización, la membrana externa de las bacterias vivas es detectada por inmunomarcado utilizando un anticuerpo monoclonal de ratón anti-endotoxina y un anticuerpo policlonal de conejo anti-Ig G de ratón acoplado a la TRITC. La localización del conjugado DPV3-Bodipy (fluorescencia verde) y el inmunomarcado de la membrana externa (fluorescencia roja) se observan al microscopio confocal. A: Tamaño original de la imagen; B y D: Dos ampliaciones de las bacterias de la imagen A.
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Con el fin de confirmar la localización de los conjugados DPV-Bodipy en el citoplasma bacteriano, las bacterias E. coli se incuban con una concentración 3 \muM del conjugado DPV3-Bodipy como se ha descrito en el epígrafe I.8 y la membrana externa de las bacterias vivas se visualiza por inmunomarcado específico como se ha descrito en el epígrafe I.9. La endotoxina es un constituyente específico de la membrana externa de las bacterias Gram-negativas. La fluorescencia de las bacterias se visualiza con el microscopio confocal (Figura 4). La internalización del Bodipy se visualiza por una fluorescencia verde y la membrana externa se identifica por una fluorescencia roja. El análisis de estas imágenes muestra claramente que el péptido DPV3 atraviesa las membranas externa e interna de la bacteria Gram-negativa E. coli y permite la acumulación del Bodipy en el citoplasma bacteriano.
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- Evaluación cualitativa en la bacteria P. aeruginosa
La figura 5 representa la internalización de los conjugados DPV-Bodipy en P. aeruginosa.
Las bacterias inmovilizadas sobre la lámina se incuban con una concentración 1 \muM del conjugado DPV-Bodipy durante 30 minutos a 37ºC. Las imágenes de microscopía (microscopio óptico de epifluorescencia, objetivo X 63 de inmersión) muestran la penetración del conjugado DPV-Bodipy en las bacterias vivas. A: DPV3, B: DPV3.10; C: DPV6; D: DPV7; E: DPV7b; F: DPV15; G: DPV15b; H: DPV1047; I: DPV11; J: DPV12; K: DPV1121; L: DPV19.
La figura 6 representa las imágenes de microscopía confocal de P. aeruginosa.
Las bacterias son inmovilizadas sobre la lámina de poli-L-Lisina y se incuban con una concentración 3 \muM de conjugado DPV3-Bodipy (A) o de conjugado DPV7-Bodipy (B) a 37ºC durante 30 min y después se fijan sobre la lámina. Las bacterias se observan con el microscopio confocal. Se presenta una ampliación de la imagen original de las bacterias.
La misma evaluación cualitativa se realiza sobre P. aeruginosa. La figura 5 muestra la internalización de los conjugados en las bacterias después de 30 minutos de incubación. Las propiedades de internalización de los DPV son idénticas a las observadas para E. coli excepto para los péptidos DPV7b y DPV6 que parecen ser más internalizantes en P. aeruginosa. La observación al microscopio confocal (Figura 6) de las bacterias incubadas con los péptidos DPV3 o DPV7b demuestra que estos péptidos tienen la capacidad de atravesar la membrana externa y permitir la acumulación del Bodipy en el citoplasma bacteriano.
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II.1.b) Clasificación de los DPV
Como se muestra en las figuras 3 y 5, el nivel de acumulación de los conjugados DPV-Bodipy en el citoplasma bacteriano es variable según el DPV y según la cepa de bacteria. De forma general, la internalización de los DPV es casi idéntica para las dos cepas de bacterias estudiadas. Los péptidos DPV se pueden clasificar en tres grupos principales:
-
DPV3, DPV3.10: internalización elevada
-
DPV6, DPV7, DPV7b, DPV15: internalización media
-
DPV15b, DPV1047, DPV1121: internalización débil
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Los péptidos DPV3.10, DPV3, DPV6, DPV7 y DPV7b han sido descritos precedentemente como péptidos de localización citoplásmica en las células eucariotas (solicitud de patente internacional PCT publicada bajo el No. WO 01/64738) cuando están acoplados químicamente a la proteína peroxidasa o a las IgG. Por el contrario, los péptidos DPV15, DPV15b, DPV1047 y DPV1121 han sido descritos como péptidos de localización nuclear. Es importante observar que el nivel de internalización de los DPV "nucleares" es más débil que el de los DPV "citoplásmicos". Los péptidos que tienen un tropismo citoplásmico son los más internalizantes en la bacteria.
Como se indica en la tabla 1 más adelante, los péptidos DPV19, DPV11 y DPV12 no tienen la propiedad de internalización en la célula eucariota. La misma propiedad se observa con las células procariotas, como las bacterias Gram-negativas.
TABLA 1 Evaluación cualitativa de la internalización de los conjugados DPV-Bodipy en la bacteria Gram-negativa
5 
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II.1.c) Estudio del efecto de la poli-L-Lisina (soporte de las bacterias) sobre la internalización
Con el fin de confirmar los resultados precedentes y de evaluar una eventual interferencia de la poli-L-Lisina con la internalización de los conjugados, se incuban las bacterias E. coli con los conjugados DPV-Bodipy durante 30 minutos a 37ºC y después se lavan de forma extensiva con el tampón NAPB antes de ser inmovilizadas y fijadas o no sobre la lámina de poli-L-Lisina. La localización de los conjugados se visualiza con el microscopio óptico de epifluorescencia o confocal. Las propiedades de internalización de los diferentes DPV no difieren de los resultados obtenidos precedentemente. La poli-L-Lisina no tiene efecto sobre la capacidad del DPV para atravesar las membranas bacterianas y para penetrar en la bacteria.
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II.1.d) Influencia de la temperatura sobre el nivel de internalización
Con el fin de explicar el mecanismo de internalización observado precedentemente, se ha analizado la capacidad de los DPV para internalizar a +4ºC. Las bacterias E. coli en fase exponencial de crecimiento son inmovilizadas sobre la lámina de poli-L-Lisina y después se incuban durante 24 horas a +4ºC con el fin de abolir el metabolismo energético de la bacteria. Las bacterias se incuban a continuación con una concentración 3 \muM de DPV7Bodipy o de Cyst-Bodipy (control) durante 30 minutos a +4ºC como se ha descrito en el epígrafe I.8.b) y se lavan de manera extensiva antes de ser visualizadas al microscopio óptico de epifluorescencia y al confocal. Para comparar los niveles de internalización a 37ºC y a +4ºC, se realiza el mismo experimento a 37ºC como se ha descrito en el epígrafe I.8.a.
El nivel de internalización del DPV7 en la bacteria es idéntico cualquiera que sea la temperatura del experimento. Parece por tanto que la internalización del conjugado DPV7-Bodipy en E. coli no es un mecanismo dependiente de la energía. El fenómeno es probablemente una traslocación pasiva a través de las membranas bacterianas.
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II. 2) Internalización del conjugado DPV3-TMR en E. coli
Se ha demostrado que ciertos péptidos DPV pueden atravesar la membrana externa de las bacterias Gram-negativas y penetrar en la bacteria para internalizar un compuesto hidrófobo como el Bodipy que está normalmente excluido por esta membrana externa.
Con el fin de validar los resultados obtenidos precedentemente y excluir cualquier influencia del marcador fluorescente Bodipy sobre la internalización, se han realizado experimentos idénticos con un segundo marcador fluorescente hidrófobo, la TMR. La TMR difiere del Bodipy por propiedades físico-químicas como su estructura o la presencia de una carga positiva (Fig. 2).
La figura 7 representa la internalización del conjugado DPV3-TMR en E. coli.
Las bacterias E. coli son inmovilizadas sobre la lámina de poli-L-Lisina y se incuban con una concentración 1 \muM del conjugado DPV3-TMR a 37ºC durante 30 min. Después de la internalización, la membrana externa de las bacterias vivas es detectada por inmunomarcado utilizando un anticuerpo monoclonal de ratón anti-endotoxina y un anticuerpo policlonal de conejo anti-Ig G de ratón acoplado a la FITC. La localización del conjugado DPV3-TMR (fluorescencia roja) y el inmunomarcado de la membrana externa (fluorescencia verde) son observados al microscopio confocal. A: Tamaño original de la imagen; B y D: Dos ampliaciones de las bacterias de la imagen A.
La internalización del conjugado DPV3-TMR se evalúa sobre las bacterias E. coli inmovilizadas sobre la lámina de poli-L-Lisina o en suspensión. Las bacterias se incuban con una concentración 1 \muM del conjugado DPV3-TMR o del control Cyst-TMR durante 30 minutos a 37ºC, después se fijan o no sobre la lámina antes de ser visualizadas con el microscopio óptico de epifluorescencia. Cualquiera que sea el protocolo de internalización utilizado, no se detecta ninguna fluorescencia con el conjugado control mientras que el conjugado DPV3-TMR se visualiza por la fluorescencia roja de la bacteria.
Con el fin de confirmar la internalización del conjugado DPV3-TMR, las bacterias se inmovilizan sobre la lámina de poli-L-Lisina y se incuban con una concentración 1 \muM del conjugado a 37ºC durante 30 minutos. El inmunomarcado de la membrana externa se realiza utilizando el anticuerpo monoclonal de ratón anti-endotoxina y un anticuerpo policlonal de conejo anti-IgG de ratón acoplado a la FITC. La localización del conjugado DPV3-TMR se observa al microscopio confocal (Figura 7). El conjugado DPV3-TMR atraviesa la membrana externa, penetra en la bacteria y se acumula en el citoplasma. Este resultado es idéntico a los obtenidos con el marcador fluorescente Bodipy.
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II.3) Actividad antibacteriana de los conjugados DPV
Con el fin de determinar que la internalización de los conjugados DPV no induce la muerte de las bacterias, se ensayan los 12 conjugados DPV-Bodipy y el conjugado DPV3-TMR en cuanto a su actividad antibacteriana como se ha descrito en el epígrafe I.10). Ninguno de los conjugados ensayados ha mostrado una actividad antibacteriana sobre E. coli a las concentraciones utilizadas en los experimentos de internalización. Este experimento demuestra que la internalización de los conjugados no afecta a la viabilidad bacteriana. El mecanismo de internalización en la bacteria no es tóxico.
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III- Internalización de un conjugado DPV-Antibiótico (ejemplo: DPV-Eritromicina) III.1) Síntesis de un conjugado DPV-Antibiótico III.1.a) Activación de la eritromicina por un agente reticulante heterobifuncional
Una solución de ácido maleimidocaproico (MIC) (2,8 equivalentes) y de diciclohexilcarbodiimida (DCC) (2,8 equivalentes) en dimetilformamida (DMF), se agita durante la noche a 0ºC bajo argón y protegida de la luz. Se elimina por filtración el precipitado formado (diciclohexilurea), se lava con DMF y después se filtra de nuevo. Una solución de antibiótico (1,0 equivalente) y de piridina (5,0 equivalentes) en DMF se agita hasta disolución completa. Se añade a esta solución el filtrado obtenido antes; se agita la mezcla durante 1 hora a temperatura ambiente.
Se recoge la solución en agua destilada, se lava 4 veces con diclorometano (DCM). Las fases orgánicas obtenidas se reúnen y se lavan sucesivamente con ácido clorhídrico (HCl) 0,1 N, dos veces con carbonato de disodio (Na_{2}CO_{3}), tres veces con agua (H_{2}O). Después de secado sobre sulfato de magnesio (MgSO_{4}) y concentración, el producto de la reacción bruto se purifica por cromatografía rápida sobre sílice (eluyente CH_{2}Cl_{2}/MeOH).
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III.1.b) Acoplamiento de la eritromicina activada con un péptido penetrante DPV
Un péptido penetrante (1,0 equivalente) en una solución tampón de fosfato de sodio (NaH_{2}PO_{4}/Na_{2}HPO_{4}) a concentración 10 mM y pH 7,1, se agita durante cinco minutos a temperatura ambiente bajo argón y protegido de la luz. Después, se añade el antibiótico activado (1,5 a 2,0 equivalentes), disuelto en el mínimo de DMF. Se agita la solución hasta transformación completa del péptido (seguida por HPLC). Se añade a continuación agua destilada y se extrae la fase acuosa tres veces con el mismo volumen de diclorometano con el fin de eliminar el exceso de antibiótico activado. A continuación se liofiliza la fase acuosa y el sólido obtenido se purifica por HPLC preparativa. Se aísla así el con-
jugado antibiótico-péptido penetrante con rendimientos comprendidos entre 45 y 100% y purezas superiores al 90%.
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III.2) Evaluación de la actividad antimicrobiana de los conjugados DPV-Eritromicina
Las concentraciones mínimas inhibidoras (CMI) de los conjugados se determinan por el método de microdilución en medio líquido según las normas NCCLS-M7A5 (National Committee for Clinical Laboratory Standards-Document M7A5) para el conjunto de las especies bacterianas en placa de poliestireno de 96 pocillos.
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Protocolo
Una colonia aislada de una bacteria (por ejemplo E. coli o P. aeruginosa) se pone en suspensión en 3 a 5 ml de medio de cultivo Mueller-Hinton (MH) y se incuba a 37ºC durante una noche con agitación. A partir de este cultivo de la noche, se realiza un cultivo en fase exponencial de crecimiento de la cepa; se siembra el medio MH al 1/50 con el cultivo de la noche y se incuba 2 horas a 37ºC con agitación. La concentración bacteriana se ajusta a 1x10^{6} ufc/ml (Unidades Formadoras de Colonias) en el medio MH.
Se distribuyen 50 \mul de inóculo bacteriano por pocillo que contiene un volumen igual de la solución de conjugado diluida a la mitad en el medio de cultivo adecuado (512 a 0,5 pg/ml). Los cultivos se incuban a 37ºC en aire ambiente durante 16 a 20 horas.
La CMI expresada en \mug/ml (Unidades Internacionales) es la primera concentración que no presenta crecimiento bacteriano. La determinación de la concentración mínima bactericida (CMB) se realiza después de la lectura de las placas de CMI. La CMB es la concentración más débil de conjugado que inhibe todo crecimiento bacteriano sobre la gelosa de repicado (< 0,1% de supervivientes).
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IV- Evaluación de la actividad antibacteriana de la asociación de un péptido DPV y eritromicina A por el método llamado del tablero de ajedrez IV-1) Materiales y Métodos
Péptidos elegidos: DPV3 y DPV3.10
Compuesto antibacteriano: Eritromicina (Sigma E0774)
Cepas bacterianas: E. coli ATCC 25922 y P. aeruginosa ATCC 27853.
Este método se realiza en microplacas de poliestireno de 96 pocillos en el medio de cultivo Mueller-Hinton (MH) y consiste en exponer una suspensión bacteriana a diferentes concentraciones de péptido DPV y de eritromicina, empleados solos o en asociación.
Las concentraciones finales elegidas de eritromicina y de péptido se escalonan respectivamente de 256 a 4 \mug/ml y de 256 a 2 \mug/ml. Las series de diluciones se preparan según una progresión geométrica de razón 2.
Se distribuyen en los pocillos según el esquema que sigue (tabla 2), 25 \mul de las soluciones de los productos en medio MH cuya concentración es cuatro veces más elevada que la concentración final deseada o 25 \mul de medio MH (para la fila 0), con el fin de obtener un volumen final de 50 \mul por pocillo:
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TABLA 2 Distribución de las soluciones de producto en medio MH (los pocillos marcados con X no han sido utilizados)
6 
\newpage
Una colonia aislada de la bacteria E. coli ATCC 25922 o P. aeruginosa ATCC 27853 se pone en suspensión en 3 a 5 ml de medio de cultivo MH y se incuba a 37ºC durante una noche con agitación. A partir de este cultivo de la noche, se realiza un cultivo en fase exponencial de crecimiento de la cepa; se siembra el medio MH al 1/50 con el cultivo de la noche y se incuba 2 horas a 37ºC con agitación. La concentración bacteriana se ajusta a 1x10^{6} ufc/ml (Unidades Formadoras de Colonias) en el medio MH. Se distribuyen 50 \mul de inóculo bacteriano por pocillo que contiene un volumen igual de la solución de péptido y/o de eritromicina. La CMI del péptido y de la eritromicina se determina como la concentración más débil que provoca la ausencia de crecimiento de las bacterias (ausencia de turbidez) después de 18 horas de cultivo en una estufa a 37ºC. La CMI se expresa en \mug/ml (mg/l). Para cada fila de pocillos, los primeros pocillos que contienen la asociación del péptido DPV y la eritromicina y no presentan ningún crecimiento visible, se anotan con el fin de calcular para cada uno el índice de fracción de la concentración inhibidora (FIC) utilizando la siguiente fórmula:
FIC = (CMI del péptido con la eritromicina/CMI del péptido solo) + (CMI de la eritromicina con el péptido/CMI de la eritromicina sola).
Este índice permite cuantificar la asociación. Un índice inferior o igual a 0,5 indica una sinergia, un índice superior a 2 un antagonismo. Un efecto de adición está indicado por una FIC comprendida entre 0,5 y 1, y un efecto de indiferencia, por una FIC cuyos valores están comprendidos entre 1 y 2.
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IV. 2) Resultados
Las bacterias Gram-negativas tales como E. coli y P. aeruginosa son resistentes a los antibióticos de la familia de los macrólidos tales como la eritromicina, debido al hecho de la no penetración de estos antibióticos a través de la membrana externa de la bacteria. Con el fin de evaluar las propiedades internalizantes de los péptidos DPV demostradas precedentemente y su capacidad para facilitar la penetración de un antibiótico de la familia de los macrólidos, se ha evaluado la actividad antibacteriana de la eritromicina sobre las bacterias E. coli y P. aeruginosa en asociación con el péptido DPV3 o DPV3.10 según el método llamado del tablero de ajedrez.
El efecto sinérgico de la asociación de los péptidos DPV3 y 3.10 con la eritromicina, se muestra en las tablas 3 y 4. En presencia del DPV3, únicamente se ha observado un efecto sinérgico con la eritromicina sobre E. coli lo que demuestra que este péptido permite la entrada de la eritromicina en E. coli. La asociación DPV3.10 con la eritromicina es sinérgica sobre las dos cepas bacterianas. El péptido DPV3.10 en la concentración no tóxica de 32 \mug/ml permite la penetración (la internalización) de la eritromicina.
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TABLA 3 Determinación de las CMI y FIC de la eritromicina en asociación con el DPV3
7 
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TABLA 4 Determinación de las CMI y FIC de la eritromicina en presencia del péptido DPV3.10
8 
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<110> DATOS
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<120> COMPOSICIÓN ANTIBACTERIANA, MÁS PARTICULARMENTE CONTRA LAS BACTERIAS GRAM NEGATIVAS, QUE COMPRENDE UN PÉPTIDO Y UN AGENTE ANTIBACTERIANO VENTAJOSAMENTE HIDRÓFOBO
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<130> 33356/PCT
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<140> PCT/FR04/xxx
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<141> 2004-08-13
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<150> FR03/09962 y EP 03292030.8
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 2003-08-14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 23
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\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.1
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
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<211> 16
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\hskip1cm
9 
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<210> 2
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<211> 18
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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<400> 2
\hskip1cm
10 
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<210> 3
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<211> 17
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\hskip1cm
11 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
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<211> 15
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
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\hskip1cm
12 
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<210> 5
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<211> 17
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
14 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
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<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
15 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
16 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
17 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211>10
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
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\hskip1cm
18 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
19 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
20 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
21 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>13
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
22 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
23 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
24 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
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\hskip1cm
25 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 17
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\hskip1cm
26 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
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<211> 8
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
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\hskip1cm
27 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
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\hskip1cm
28 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
29 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
30 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
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\hskip1cm
31 
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<210> 23
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<211> 7
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
32

Claims (14)

1. La utilización de al menos un péptido de 10 a 25 residuos de aminoácido unido por covalencia a un compuesto antibacteriano, comprendiendo dicho péptido o péptidos:
i)
dos dominios cargados positivamente a pH neutro constituidos cada uno por 3 a 9 residuos de aminoácido, de los cuales al menos dos tercios son aminoácidos catiónicos,
ii)
entre dichos dominios cargados positivamente, un grupo de dos a tres residuos de aminoácido no catiónico,
iii)
en uno y/u otro de los extremos N o C terminales del péptido, un grupo de 0 a 10 residuos de aminoácido elegidos del grupo que comprende los aminoácidos no hidrófobos y los aminoácidos cargados positivamente, pero en el caso de un residuo de aminoácido cargado positivamente éste no es directamente adyacente a los dominios cargados positivamente.
para la preparación de una composición farmacéutica destinada al tratamiento de una infección causada por las bacterias Gram-negativas.
2. La utilización según la reivindicación 1, en la que dicho péptido está unido al agente antibacteriano por intermedio de un brazo espaciador.
3. La utilización según las reivindicaciones 1 o 2, en la que dicho péptido comprende en uno y/u otro de los extremos N o C terminales del péptido, un grupo de 0 a 5 residuos de aminoácido elegidos del grupo que comprende los aminoácidos no hidrófobos y los aminoácidos cargados positivamente, pero en el caso de un residuo de aminoácido cargado positivamente éste no es directamente adyacente a los dominios cargados positivamente.
4. La utilización según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, de al menos un péptido en el cual
(i)
los aminoácidos catiónicos de los dos dominios cargados positivamente se eligen del grupo que comprende la arginina y la lisina, y en el cual
(ii)
los aminoácidos no catiónicos del grupo de dichos dominios cargados positivamente son aminoácidos no hidrófobos, elegidos por ejemplo del grupo que comprende: el ácido glutámico, la serina, la glicina, y la glutamina.
5. La utilización según una de las reivindicaciones 1 a 4, en la que el péptido se elige del grupo que comprende las siguientes secuencias: SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO. 9, SEQ ID NO. 11.
6. La utilización según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que el péptido se elige del grupo que comprende las siguientes secuencias: SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 7.
7. La utilización según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que el compuesto antibacteriano se elige entre los que presentan propiedades físico-químicas que les hacen incapaces de atravesar la membrana de las bacterias Gram-negativas.
8. La utilización según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que el compuesto antibacteriano es hidrófobo.
9. La utilización según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que el compuesto antibacteriano se elige del grupo que comprende los siguientes compuestos: los antibióticos de la familia de los macrólidos, los cetólidos como la eritromicina, la claritromicina, la azitromicina, la telitromicina
10. La utilización según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la que la composición farmacéutica antibacteriana comprende un producto de la siguiente fórmula (I):
(I)(A-)_{m} (X)_{p}(-P)_{n}
en la que: A es el resto de un compuesto antibacteriano, P es el resto de un péptido, tal como se ha definido en las reivindicaciones precedentes, y X representa o bien un enlace covalente entre A y P, o bien un brazo espaciador que une al menos un resto A con al menos un resto P, m es un número entero que puede ir de 1 a 3, n es un número entero que puede ir de 1 a 3, y p representa cero o un número entero que como máximo es igual o mayor que los números m y n.
\newpage
11. Una composición antibacteriana caracterizada porque comprende al menos un péptido unido por covalencia a un compuesto antibacteriano, eventualmente por intermedio de un brazo espaciador, y en la que dicho péptido o péptidos se eligen del grupo que comprende las siguientes secuencias: SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO. 9, SEQ ID NO. 11.
12. La composición antibacteriana según la reivindicación 11, en la que la composición comprende la asociación de al menos un péptido y un compuesto antibacteriano unidos por covalencia, eventualmente por intermedio de un brazo espaciador, siendo elegido dicho péptido del grupo que comprende las siguientes secuencias: SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 7.
13. Un producto de la siguiente fórmula (I):
(I)(A-)_{m} (X)_{p}(-P)_{n}
en la que A, X, m, p y n se definen como en la reivindicación 10, y P es el resto de un péptido elegido del grupo que comprende las siguientes secuencias: SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO. 9, SEQ ID NO. 11.
14. Un producto de la siguiente fórmula (I), según la reivindicación 13:
(I)(A-)_{m} (X)_{p}(-P)_{n}
en la que A, X, m, p y n se definen como en la reivindicación 10, y P es el resto de un péptido elegido del grupo que comprende las siguientes secuencias: SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 7.
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