ES2377075T5

ES2377075T5 - Composición inmunogénica

Info

Publication number: ES2377075T5
Application number: ES06754599.6T
Authority: ES
Inventors: Ralph L. Biemans; Dominique Boutriau; Carine Capiau; Philippe Denoel; Jan Poolman
Original assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Current assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Priority date: 2005-06-27
Filing date: 2006-06-23
Publication date: 2016-04-29
Anticipated expiration: 2026-06-23
Also published as: TW200730187A; SI2283857T1; AU2006263965B2; BRPI0612655B1; AU2006263964B2; KR20130122810A; EP2201961A1; AU2006263936A1; US20190298822A1; EA012528B1; EP2878307B1; ES2741529T3; EP2351578B1; SI1896065T2; US10245317B2; AU2006263944A1; HUE031380T2; PE20110072A1; CA2612980C; BRPI0612655A2

Description

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En una realización los sacáridos de N. meningitidis se dimensionan mediante escisión mecánica, por ejemplo mediante microfluidización o sonicación. La microfluidización y la sonicación tienen la ventaja de reducir el tamaño de los polisacáridos nativos más grandes lo suficiente para proporcionar un conjugado filtrable.

En una realización, la polidispersidad del sacárido es 1-1,5, 1-1,3, 1-1,2, 1-1,1 ó 1-1,05 y después de la conjugación a una proteína transportadora, la polidispersidad del conjugado es 1,0-2,5, 1,0-2,0, 1,0-1,5, 1,0-1,2, 1,5-2,5, 1,7-2,2 ó 1,5-2,0. Todas las mediciones de polidispersidad se hacen mediante MALLS.

Para el análisis MALLS de sacáridos meningocócicos, se pueden usar dos columnas (TSKG6000 y 5000PWxl TOSOH Bioscience) en combinación y los sacáridos se eluyen en agua. Los sacáridos se detectan usando un detector de dispersión de luz (por ejemplo Wyatt Dawn DSP provisto de un láser de argón de 10 mW a 488 nm) y un refractómetro inferométrico (por ejemplo Wyatt Otilab DSP provisto de una celda P100 y un filtro rojo a 498 nm).

En una realización, el sacárido MenA, cuando está presente está al menos parcialmente O-acetilado de forma que al menos el 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o el 98% de las unidades de repetición están O-acetiladas en al menos una posición. La O-acetilación está, por ejemplo, presente al menos en la posición O-3.

En una realización, el sacárido MenC, cuando está presente está al menos parcialmente O-acetilado de forma que al menos el 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o el 98% de las unidades de repetición de NeuNAc enlazadas a (2 →9) están O-acetiladas en al menos una o dos posiciones. La O-acetilación está, por ejemplo presente en la posición O-7 y/u O-8.

En una realización, el sacárido MenW, cuando está presente está al menos parcialmente O-acetilado de forma que al menos el 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o el 98% de las unidades de repetición están O-acetiladas en al menos una o dos posiciones. La O-acetilación está presente, por ejemplo en la posición O-7 y/u O-9.

En una realización, el sacárido MenY, cuando está presente está al menos parcialmente O-acetilado de forma que al menos el 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o el 98% de las unidades de repetición están O-acetiladas en al menos una o dos posiciones. La O-acetilación está presente en la posición 7 y/o 9.

El porcentaje de O-acetilación se refiere al porcentaje de las unidades de repetición que contienen O-acetilación. Esto se puede medir en el sacárido antes del conjugado y/o después de la conjugación.

Un aspecto adicional de la invención es una vacuna que comprende la composición inmunogénica de la invención y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

Opcionalmente, la composición inmunogénica o vacuna contiene una cantidad de un adyuvante suficiente para potenciar la respuesta inmune al inmunógeno. Los adyuvantes adecuados incluyen, pero sin limitación, sales de aluminio (fosfato de aluminio o hidróxido de aluminio), mezclas de escualeno (SAF-1), muramil péptido, derivados de saponina, preparaciones de pared celular de micobacteria, monofosforil lípido A, derivados de ácido micólico, tensioactivos de copolímero de bloque no iónicos, Quit A, subunidad B de toxina de cólera, polifosfaceno y derivados y complejos inmunoestimuladores (ISCOM) tales como aquellos descritos por Takahashi y col. (1990) Nature 344: 873-875.

Para las combinaciones de HibMen descritas anteriormente, puede ser provechoso para los conjugados de Hib y sacárido Men no adsorberse en adyuvantes de sal de aluminio o ningún adyuvante en absoluto.

En una realización, la composición inmunogénica no tiene adyuvante. Con el fin de la invención, “sin adyuvante” significa que un componente adyuvante que no es un componente antigénico en sí mismo no está presente en la composición inmunogénica.

En una realización de la invención HepB se adsorbe en fosfato de aluminio (documento WO 93/24148).

En una realización, la composición inmunogénica comprende un sacárido Hib conjugado con toxoide tetánico a través de un engarce y sacárido MenC conjugado con toxoide tetánico directamente o a través de un engarce y sacárido MenA conjugado con toxoide tetánico directamente o a través de un engarce.

En una realización, la composición inmunogénica de la invención está tamponada a, o ajustada a, pH entre 7,0 y 8,0, pH 7,2 y 7,6 o aproximadamente o exactamente pH 7,4.

La composición inmunogénica o vacunas de la invención opcionalmente se liofilizan en presencia de un agente estabilizante por ejemplo un poliol tal como sacarosa o trehalosa.

Al igual que con todas las composiciones inmunogénicas o vacunas, las cantidades inmunológicamente eficaces de los inmunógenos se tienen que determinar empíricamente. Los factores que se tienen que considerar incluyen la inmunogenicidad, si el inmunógeno estará o no en complejo con o unido covalentemente a un adyuvante o proteína transportadora u otro vehículo, las vías de administración y el número de dosis de inmunización que se tienen que administrar. Tales factores se conocen en la técnica de vacunas y está dentro de la especialidad de los inmunólogos el realizar tales determinaciones sin experimentación excesiva.

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El agente activo puede estar presente en concentraciones variables en la composición farmacéutica o vacuna de la invención. Típicamente, la concentración mínima de la sustancia es una cantidad necesaria para conseguir su uso pretendido, mientras que la concentración máxima es la cantidad máxima que permanecerá en solución o suspendida de forma homogénea dentro de la mezcla inicial. Por ejemplo, la cantidad mínima de un agente terapéutico es opcionalmente una que proporcionará una dosis terapéuticamente eficaz única. Para sustancias bioactivas, la concentración mínima es una cantidad necesaria para bioactividad tras la reconstitución y la concentración máxima está en el punto en el que una suspensión homogénea no se puede mantener. En el caso de unidades de dosis única, la cantidad es la de una aplicación terapéutica única. En general, se espera que cada dosis comprenda 1-100 g de antígeno de proteína, opcionalmente 5-50 g o 5-25 g. Las preparaciones de vacuna de la presente invención se pueden usar para proteger o tratar a un mamífero (por ejemplo a un paciente humano) sensible a infección, por medio de la administración de dicha vacuna a través de la vía sistémica o mucosal. Un paciente humano es opcionalmente un bebé (menor de 12 meses), un niño pequeño (12-24, 12-16 ó 12-14 meses), un niño (2-10, 3-8 ó 3-5 años), un adolescente (12-25, 14-21 ó 15-19 años) o un adulto (cualquier edad por encima de 12, 15, 18 ó 21). Esas administraciones pueden incluir inyección a través de las vías intramuscular, intraperitoneal, intradérmica o subcutánea; o a través de administración mucosal a los tractos oral/alimentario, respiratorio, genitourinario. Se prefiere la administración intranasal de vacunas para el tratamiento de neumonías u otitis media (ya que el transporte nasofaríngeo de neumococos se puede prevenir más eficazmente, atenuando de ese modo la infección en su etapa más temprana). Aunque la vacuna de la invención se puede administrar como una dosis única, los componentes de la misma también se pueden co-administrar juntos al mismo tiempo o en momentos diferentes (por ejemplo si están presentes sacáridos en una vacuna éstos se podrían administrar por separado en el mismo momento o 1-2 semanas después de la administración de una vacuna de proteína bacteriana para coordinación óptima de las respuestas inmunes con respecto el uno con el otro). Adicionalmente a una vía de administración única, se pueden usar 2 vías de administración diferentes. Por ejemplo, se pueden administrar antígenos virales ID (intradérmico), mientras que las proteínas bacterianas se pueden administrar IM (intramuscular)

o IN (intranasal). Si los sacáridos están presentes, los mismos se pueden administrar IM (o ID) y las proteínas bacterianas se pueden administrar IN (o ID). Adicionalmente, las vacunas de la invención se pueden administrar IM para dosis de sensibilización e IN para dosis de refuerzo.

La preparación de vacuna se describe en general en Diseño de Vacuna ("The subunit and adjuvant approach" (eds Powell M.F. & Newman M.J.) (1995) Plenum Press Nueva York). La encapsulación con liposomas se describe por Fullerton, Patente de Estados Unidos Nº 4.235.877.

Un aspecto adicional de la invención es un kit de vacuna para administración simultánea o secuencial que comprende dos composiciones inmunogénicas multivalentes para conferir protección en un huésped frente a la enfermedad causada por Bordetella pertussis, Clostridium tetani, Corynebacterium diphtheriae, Haemophilus influenzae y Neisseria meningitidis. Por ejemplo, el kit comprende opcionalmente un primer recipiente que comprende uno o más de:

toxoide tetánico (TT)

toxoide de difteria (TD), y

componentes de pertussis de célula completa y

opcionalmente que comprende además antígeno de superficie de Hepatitis B

y un segundo recipiente que comprende:

conjugado de sacárido Hib, y

al menos, uno, dos, tres o cuatro conjugado o conjugados de sacáridos de N. meningitidis,

en el que la dosis de sacárido del conjugado de Hib es menor de 5 g o 4 g, o 1-4 g o -13 g, o 2-4 g o 2-3 g o aproximadamente o exactamente 2,5 g y opcionalmente la dosis de sacárido del o de cada uno del al menos o exactamente uno, dos, tres o cuatro conjugado o conjugados de sacárido bacteriano adicional (por ejemplo, conjugado o conjugados de sacárido de N. meningitidis) es menor de 10 g, 9 g, 8 g, 7 g, 6 g, 5 g o 4 g, o entre 1-10 g, 1-8 g, 1-6 g, 1-5 g, 1-4 g, 1-3 g, o 2-4 g o 2-3 g o aproximadamente o exactamente 2,5 g.

Los ejemplos del conjugado de Hib y el al menos un conjugado o conjugados de sacárido bacteriano adicional (por ejemplo sacárido de N. meningitidis) son como se ha descrito anteriormente. Cualquiera de las propiedades de los conjugados descritos anteriormente puede estar presente en un kit de vacuna.

Opcionalmente, los kits de vacuna de la invención comprenden un tercer componente. Por ejemplo, el kit comprende opcionalmente un primer recipiente que comprende uno o más de:

toxoide tetánico (TT)

toxoide de difteria (TD), y

componentes de pertussis de célula completa y

opcionalmente comprende un antígeno de superficie de Hepatitis B

y un segundo recipiente que comprende:

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uno o más conjugados de una proteína transportadora y un sacárido capsular de Streptococcus pneumoniae [donde el sacárido capsular es opcionalmente a partir de un serotipo neumocócico seleccionado entre el grupo que consiste en 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F y 33F].

y un tercer recipiente que comprende:

conjugado de sacárido Hib, y

al menos un conjugado o conjugados de sacárido de N. meningitidis,

en el que la dosis de sacárido del conjugado de Hib es menor de 5 g o 4 g, o 1-4 g o 1-3 g, o 2-4 g o 2-3 g o aproximadamente o exactamente 2,5 g y opcionalmente la dosis de sacárido del o de cada uno del al menos o exactamente uno, dos, tres o cuatro conjugado o conjugados de sacárido bacteriano adicional (por ejemplo conjugado o conjugados de sacáridos de N. meningitidis) es menor de 10 g, 9 g, 8 g, 7 g, 6 g, 5 g o 4 g, o entre 1-10 g, 1-8 g, 1-6 g, 1-5 g, 1-4 g, 1-3 g, o 2-4 g o 2-3 g o aproximadamente o exactamente 2,5 g.

Las composiciones inmunogénicas que comprenden conjugados meningocócicos, por ejemplo HibMenC, HibMenAC, HibMenAW, HibMenAY, HibMenCW, HibMenCY, HibMenWY, MenAC, MenAW, MenAY, MenCW, MenCY, MenWY o MenACWY, incluyendo kits de composición similar a los descritos anteriormente, comprenden opcionalmente antígenos de sarampión y/o paperas y/o rubéola y/o varicela. Por ejemplo, la composición inmunogénica meningocócica contiene antígenos de sarampión, paperas y rubéola o sarampión, paperas, rubéola y varicela. En una realización, estos antígenos virales están presentes opcionalmente en el mismo recipiente que el conjugado o conjugados meningocócicos y/o el sacárido Hib. En una realización, estos antígenos virales están liofilizados.

Un aspecto adicional de la invención es un procedimiento para preparar la composición inmunogénica de la invención, que comprende la etapa de mezclar un conjugado de sacárido Hib con al menos un conjugado o conjugados de sacárido bacteriano adicional (por ejemplo N. meningitidis) y un antígeno adicional seleccionado entre el grupo que consiste en pertussis de célula completa y antígeno de superficie de hepatitis B para formar una composición en la que la dosis de sacárido del conjugado de Hib es menor de 5 g o 4 g, o entre 1-4 g o 1-3 g, o 2-4 g o 2-3 g o aproximadamente o exactamente 2,5 g y opcionalmente la dosis de sacárido del o de cada uno del al menos o exactamente uno, dos, tres o cuatro conjugado o conjugados de sacárido bacteriano adicional (por ejemplo N. meningitidis) es menor de 10 g, 9 g, 8 g, 7 g, 6 g, 5 g o 4 g, o entre 1-10 g, 1-8 g, 1-6 g, 1-5 g, 1-4 un g, 1-3 g, o 2-4 g o 2-3 g o aproximadamente o exactamente 2,5 g.

Un aspecto adicional de la divulgación es un procedimiento de inmunización de un huésped humano frente a enfermedad causada por Haemophilus influenzae y opcionalmente infección por N. meningitidis que comprende administrar al huésped una dosis inmunoprotectora de la composición inmunogénica o vacuna o el kit de la invención.

Un aspecto adicional de la invención es una composición inmunogénica de la invención para su uso en el tratamiento o la prevención de enfermedad causada por Haemophilus influenzae y/o N. meningitidis.

Un aspecto adicional de la invención es el uso de la composición inmunogénica o vacuna o kit de la invención en la preparación de un medicamento para tratamiento o prevención de enfermedades causadas por Haemophilus influenzae y/o N. meningitidis.

Los términos “que comprende”, “comprenden” y “comprende” en el presente documento tienen por objeto de acuerdo con los inventores ser opcionalmente sustituibles por los términos “que consiste en”, “consisten en” y “consiste en”, respectivamente, en cada caso.

La invención se ilustra en los ejemplos adjuntos. Los ejemplos más adelante se llevan a cabo usando técnicas convencionales, que se conocen bien y son de rutina para los expertos en la materia, excepto cuando se describa de otra manera en detalle. Los ejemplos son ilustrativos, pero no limitan la invención.

Ejemplos

Ejemplo 1 -preparación de conjugados de polisacárido

La unión covalente del polisacárido PRP de Haemophilus influenzae (Hib) a TT se llevó a cabo mediante una química de acoplamiento desarrollada por Chu y col (Infection and Immunity 1983, 40 (1); 245-256). El polisacárido PRP Hib se activó añadiendo CNBr e incubando a pH 10,5 durante 6 minutos. El pH se redujo a pH 8,75 y se añadió dihidrazida de ácido adípico (ADH) y la incubación continuó durante 90 minutos adicionales. El PRP activado se acopló a toxoide tetánico purificado a través de condensación de carbodiimida usando 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDAC). Se añadió EDAC al PRP activado para alcanzar una proporción final de 0,6 mg de EDAC/mg de PRP activado. El pH se ajustó a 5,0 y se añadió toxoide tetánico purificado para alcanzar 2 mg de TT/mg de PRP activado. La solución resultante se dejó durante tres días con agitación suave. Después de filtración a través de una membrana de 0,45 m, el conjugado se purificó en una columna sephacryl S50HR (Pharmcia,

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Suecia) equilibrada en NaCl 0,2 M.

Los conjugados de MenC-TT se produjeron usando polisacáridos nativos (de más de 150 kDa medido por MALLS) o se microfluidizaron ligeramente. Los conjugados de MenA-TT se produjeron usando polisacárido nativo o polisacárido ligeramente microfluidizado de más de 60 kDa medido por el procedimiento MALLS del ejemplo 2. Los conjugados de MenW y MenY-TT se produjeron usando polisacáridos dimensionados de aproximadamente 100-200 kDa medido por MALLS (véase el ejemplo 2). El ajuste de tamaño se realizó mediante microfluidización usando un aparato homogeneizador Emulsiflex C-50. Los polisacáridos después se filtraron a través de un filtro de 0,2 m.

La activación y el acoplamiento se realizaron como se ha descrito en los documentos WO96/29094 y WO 00/56360. En resumen, el polisacárido a una concentración de 10-20 mg/ml en NaCl 2 M pH 5,5-6,0 se mezcló con solución de CDAP (100 mg/ml recién preparado en acetonitrilo/WFI, 50/50) a una proporción final de CDAP/polisacárido de 0,75/1 ó 1,5/1. Después de 1,5 minutos, el pH se elevó con hidróxido de sodio a pH 10,0. Después de tres minutos se añadió toxoide tetánico para alcanzar una proporción de proteína/polisacárido de 1,5/1 para MenW, 1,2/1 para MenY, 1,5/1 para MenA o 1,5/1 para MenC. La reacción continuó durante una a dos horas.

Después de la etapa de acoplamiento, se añadió glicina a una proporción final de glicina/PS (p/p) de 7,5/1 y el pH se ajustó a pH 9,0. La mezcla se dejó durante 30 minutos. El conjugado se aclaró usando un filtro Kleenpak de 10 m y después se cargó en una columna Sephacryl S400HR usando un tampón de elución de NaCl 150 mM, Tris 10 mM o 5 mM pH 7,5. Los lotes clínicos se filtraron en una membrana de esterilización Opticap 4. Los conjugados resultantes tenían una proporción de polisacárido:proteína promedio de 1:1-1:5 (p/p).

Con el fin de conjugar polisacárido capsular MenA a toxoide tetánico a través de un espaciador, se usó el siguiente procedimiento. La unión covalente del polisacárido y del espaciador (ADH) se lleva a cabo mediante una química de acoplamiento mediante la cual el polisacárido se activa en condiciones controladas mediante un agente cianilante, tetrafluoroborato de 1-ciano-4-dimentilamino-piridinio (CDAP). El espaciador reacciona con el PS cianilado a través de sus grupos hidrazino, para formar un enlace de isourea estable entre el espaciador y el polisacárido.

Una solución de 10 mg/ml de MenA se trató con una solución recién preparada de 100 mg/ml de CDAP en acetonitrilo/agua (50/50 (v/v)) para obtener una proporción de CDAP/MenA de 0,75 (p/p). Después de 1,5 minutos, el pH se elevó a pH 10,0. Tres minutos más tarde, se añadió ADH para obtener una proporción de ADH/MenA de 8,9. El pH de la solución se redujo a 8,75 y la reacción progresó durante 2 horas.

Antes de la reacción de conjugación, la solución de TT purificada y la solución de PSAAH se diluyeron para alcanzar una concentración 10 mg/ml para PSAAH y 10 mg/ml para TT.

Se añadió EDAC a la solución de PSAAH con el fin de alcanzar una proporción final de 0,9 mg de EDAC/mg de PSAAH. El pH se ajustó a 5,0. El toxoide tetánico purificado se añadió con una bomba peristáltica (en 60 minutos) para alcanzar 2 mg de TT/mg de PSAAH. La solución resultante se dejó 60 min a +25º C en agitación para obtener un tiempo de acoplamiento final de 120 min. El conjugado se aclaró usando un filtro de 10 m y se purificó usando una columna Sephacryl S400HR.

Ejemplo 2 – determinación de peso molecular usando MALLS

Se acoplaron detectores a una columna de exclusión por tamaño de HPLC a partir de la cual se eluyeron las muestras. Por una parte, el detector de dispersión de luz láser midió las intensidades de luz dispersas en 16 ángulos por la solución macromolecular y por otra parte, un refractómetro interferométrico colocado en línea permitió la determinación de la cantidad de muestra eluida. A partir de estas intensidades, se puede determinar el tamaño y la forma de las macromoléculas en solución.

El peso molecular promedio en peso (Pm) se define como la suma de los pesos de todas las especies multiplicadas por sus pesos moleculares respectivos y divididos entre la suma de los pesos de todas las especies.

a) Peso molecular promedio en peso: -Pm

Wi  Mi mPm 2 Wi m1

b) Peso molecular promedio en número: -Mn

N  Mm

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Mn Ni m0

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c) Radio cuadrático medio: -Rw-y R2w es el radio cuadrado definido por:

m  r2

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R w o (r )w 

m

i

(-mi-es la masa del centro de dispersión i y –ri-es la distancia entre el centro de dispersión i y el centro de gravedad de la macromolécula).

d) La polidispersidad se define como la proporción –Pm / Mn-.

Los polisacáridos meningocócicos se analizaron mediante MALLS mediante la carga en dos columnas de HPLC (TSKG6000 y 5000PWxl TOSOH Bioscience) usadas en combinación. 25 l del polisacárido se cargaron en la columna y se eluyeron con 0,75 ml de agua filtrada. Los polisacáridos se detectan usando un detector de dispersión de luz (Wyatt Dawn DSP provisto de un láser de argón de 10 mW a 488 nm) y un refractómetro inferométrico (Wyatt Otilab DSP provisto de una celda P100 y un filtro rojo a 498 nm).

Las polidispersidades y recuperaciones de peso molecular de todas las muestras se calcularon mediante el método de Debye usando un orden de ajuste polinomial de 1 en el software Astra 4.72.

Ejemplo 3 Ensayo clínico de Fase II en vacuna de conjugado HibMenAC – TT mezclada con DTPwHepB

Diseño de estudio: estudio de centro único abierto, aleatorizado (1:1:1:1:1) con cinco grupos. Los cinco grupos recibieron el siguiente régimen de vacunación respectivamente a 6, 10 y 14 semanas de edad.

 Tritanrix™-HepB/Hib-MenAC 2,5/2,5/2,5: denominado en lo sucesivo en el presente documento 2,5/2,5/2,5  Tritanrix™-HepB/Hib-MenAC 2,5/5/5: denominado en lo sucesivo en el presente documento 2,5/5/5  Tritanrix™-HepB/Hib-MenAC 5/5/5: denominado en lo sucesivo en el presente documento 5/5/5  Tritanrix™-HepB + Hiberix™: denominado en lo sucesivo en el presente documento Hiberix  Tritanrix™-HepB/Hiberix™ + Meningitec™: denominado en lo sucesivo en el presente documento Meningitec

Las muestras de sangre se tomaron en el momento de la primera dosis de vacuna (Pre) y un mes después de la tercera dosis de vacuna (Post-dosis 3).

Tritanrix™ es una vacuna de DTPw comercializada por GlaxoSmithKline Biologicals S.A.

Se usaron 105 sujetos en cada uno de los cinco grupos dando un total de 525 sujetos en el estudio.

Tabla 1

Componentes por dosis (0,5 ml): 2,5/2,5/2,5* 2,5/5/5 5/5/5

Polisacárido capsular PRP Hib conjugado con toxoide tetánico (TT): 2,5 g 2,5 g 5 g

Polisacárido capsular A de Neisseria meningitidis (PSA) conjugado con TT: 2,5 g 5 g 5 g

Polisacárido capsular C de Neisseria meningitidis (PSC) conjugado con TT: 2,5 g 5 g 5 g

*La vacuna 2,5/2,5/2,5 fue una dilución de dosis de la vacuna Hib-MenAC 5/5/5 de GSK Biologicals que contiene 2,5 g de cada uno de PRP-TT, MenA-TT y MenC-TT.

Las formulaciones de vacuna de Hib-MenAC se mezclaron de forma improvisada con Tritanirix-HepB. La vacuna combinada de difteria-tétano-Bordetella pertussis de célula entera – hepatitis B (DTPw-HB) de GSK Biologicals (Tritanrix-HepB) contiene no menos de 30 Unidades Internacionales (UI) de toxoide de difteria, no menos de 60 UI de toxoide tetánico, no menos de 4 UI de Bordetella pertussis muerta y 10 g de antígeno de superficie de hepatitis B recombinante.

Terapia de referencia, dosis, modo de administración, Nº de lote:

Programa/sitio de vacunación: Un grupo recibió vacuna Tritanrix-HepB por vía intramuscular en el muslo izquierdo e Hiberix™ por vía intramuscular en el muslo derecho a 6, 10 y 14 semanas de edad. Otro grupo recibió vacuna Tritanrix™-HepB/Hiberix™ por vía intramuscular en el muslo izquierdo y vacuna Meningitec™ por vía intramuscular en el muslo derecho a 6, 10 y 14 semanas de edad.

Vacuna/composición/dosis/número de lote: La vacuna Tritanrix™-HepB usada fue como se ha descrito anteriormente.

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Conclusión

Las tablas 2f y 2g demuestran que, cuando se mezcla HibMenAC con DTPwHepB en una vacuna, una dosis de 2,5/2,5/2,5 de Hib/MenA/MenC proporciona una respuesta inmune más elevada frente a toxoide de pertussis y antígeno de superficie de Hepatitis que una dosis de 2,5/5/5 la cual, a su vez, genera una respuesta inmune más

5 elevada frente a toxoide de pertussis y antígeno de superficie de Hepatitis B que una dosis de 5/5/5. Las Tablas 2a-e demuestran que una dosis baja de HibMenA y MenC aún consigue una respuesta inmune frente a Hib, MenA y MenC con el 99-100% de los pacientes consiguiendo una respuesta inmune por encima de los umbrales elegidos.

Ejemplo 4 Ensayo Clínico de HibMenAC – sensibilización con conjugados de HibMenAC

Se llevó a cabo un estudio de fase II, abierto, aleatorizado para evaluar la memoria inmune inducida por curso de

10 vacunación primaria de vacuna Tritanrix™-HepB/HibMenAC y para evaluar la inmunogenicidad y reactogenicidad de una dosis de refuerzo de la vacuna Tritanrix™-Hepb de GSK Biologicals mezclada con vacuna conjugada de Hib-MenAC de GSK Biologicals o vacuna Hib2,5 de GSK Biologicals a los 15 a 18 meses de edad en sujetos sensibilizados con Tritanrix™-HepB/Hib-MenAC. Cinco grupos recibieron los regímenes de vacunación primaria a las 6, 10 y 14 semanas de edad como se presenta en la tabla 3.

15 Tabla 3

Vacunación primaria: Grp A 10 meses de edad A 15 a 18 meses de edad

Grupos de tratamiento

Tritanrix™-HepB/Hib-MenAC 2,5/2,5/2,5: 1 1/5ª dosis de Mencevax™ AC (10 g de MenA y 10 g de MenC) y 10 g Tritanrix™-HepB/Hib2,5

2: - Tritanrix™-HepB/Hib2,5

Tritanrix™-HepB/Hib-MenAC 5/5/5: 3 1/5ª dosis de Mencevax™ AC (10 g de MenA y 10 g de MenC) y 10 g de PRP Simple Tritanrix™-HepB/Hib2,5

4: - Tritanrix™-HepB/Hib2,5

Tritanrix™-HepB/Hib-MenA 2,5/5/5: 5 1/5ª dosis de Mencevax™ AC (10 g de MenA y 10 g de MenC) y 10 g de PRP Simple Tritanrix™-HepB/Hib2,5

6: - Tritanrix™-HepB/Hib2,5

Grupos de control

Tritanrix™-HepB + Hiberix™: 7 1/5ª dosis de Mencevax™ AC (10 g de MenA y 10 g de MenC) y 10 g de PRP Simple Tritanrix™-HepB/Hib-MenAC

8: - Tritanrix™-HepB/Hib-MenAC

Tritanrix™-HepB I Hiberix™ + Meningitec™: 9 1/5ª dosis de Mencevax™ AC (10 g de MenA y 10 g de MenC) y 10 g de PRP Simple Tritanrix™-HepB/Hib-MenAC

10: - Tritanrix™-HepB/Hib-MenAC

Se tomaron muestras de sangre de los Grupos 1, 3, 5, 7 y 9 en el momento del refuerzo con polisacárido simple (PS) (es decir, Pre-PS – Mes 10) y un mes después del refuerzo con polisacárido simple (es decir Post-PS-Mes 11).

Nota: Se han presentado los resultados de inmunogenicidad obtenidos en los cinco grupos que recibieron el 20 refuerzo de polisacárido (es decir, los Grupos 1, 3, 5, 7 y 9).

Número de sujetos: Planificados: 450 (45 sujetos por grupo)

Inscritos: En los Grupos 1, 3, 5, 7 y 9 que recibieron el refuerzo de polisacárido simple se inscribió un total de 193 sujetos (42 en el Grupo 1, 39 en el Grupo 3, 37 en el Grupo 5, 36 en el Grupo 7 y 39 en el Grupo 9). Completado: No aplicable.

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Tabla 4a

Anticuerpo: Grupo Momento IC 95% (LI, LS) CMG/TMG IC 95% (LI, LS)

Anti-PRP (%  0,15 g/ml): 2,5/2,5/2,5 PIII(M3) PRE-PS POST-PS 100,0 97,5 100,0 91,6 86,8 91,6 100,00 99,9 100,0 17,872 6,940 66,510 11,358 4,402 38,690 28,123 10,941 114,334

5/5/5: PIII(M3) PRE-PS POST-PS 100,0 94,9 100,0 91,0 82,7 91,0 100,0 99,4 100,0 17,306 4,520 44,418 11,477 2,946 26,595 26,095 6,937 74,186

2,5/5/5: PIII(M3) PRE-PS POST-PS 100,0 100,0 100,0 90,5 89,7 90,5 100,0 100,0 100,0 22,848 5,092 54,244 15,217 3,290 32,251 33,223 7,883 91,234

Hiberix™: PIII(M3) PRE-PS POST-PS 100,0 100,0 100,0 90,3 90,3 90,3 100,0 100,0 100,0 30,106 5,105 37,049 18,316 3,238 21,335 49,485 8,049 64,336

Meningitec™: PIII(M3) PRE-PS POST-PS 100,0 100,0 100,0 91,0 91,0 91,0 100,0 100,0 100,0 12,257 4,227 24,354 8,234 2,804 15,308 18,246 6,372 38,747

SBA-MenA (%1:8): 2,5/2,5/2,5 PIII(M3) PRE-PS POST-PS 97,1 91,1 100,00 84,7 77,5 88,4 99,9 98,2 100,0 342,3 161,9 737,2 230,7 93,9 577,3 507,9 279,1 941,4

5/5/5: PIII(M3) PRE-PS POST-PS 100,00 94,3 96,7 90,0 80,8 82,8 100,0 99,3 99,9 394,6 193,2 720,8 297,8 126,7 479,8 523,0 294,7 1082,7

2,5/5/5: PIII(M3) PRE-PS POST-PS 100,0 88,2 100,0 90,0 72,5 88,4 100,0 96,7 100,0 385,8 162,7 929,9 285,9 95,8 718,4 520,5 276,2 1203,6

Hiberix™: PIII(M3) PRE-PS POST-PS 10,0 72,7 100,0 2,1 54,5 89,4 26,5 86,7 100,0 6,6 96,9 631,8 3,7 46,0 475,5 11,7 204,1 839,4

Meningitec™: PIII(M3) PRE-PS POST-PS 6,9 80,0 92,1 0,8 63,1 78,6 22,8 91,6 98,3 4,8 119,7 449,9 3,6 62,7 271,7 6,4 228,3 745,0

SBA-MenC (%1:8): 2,5/2,5/2,5 PIII(M3) PRE-PS POST-PS 100,0 90,5 100,0 91,6 77,4 91,6 100,0 97,3 100,0 3342,3 322,3 2713,5 2466,9 190,2 1909,4 4528,3 546,1 3856,2

(continuación)

Anticuerpo: Grupo Momento IC 95% (LI, LS) CMG/TMG IC 95% (LI, LS)

5/5/5: PIII(M3) PRE-PS POST-PS 100,0 97,3 100,0 91,0 85,8 91,0 100,0 99,9 100,0 3863,1 463,9 2377,3 3025,9 292,9 1665,4 4932,1 734,7 3393,4

2,5/5/5: PIII(M3) PRE-PS POST-PS 100,0 94,6 100,0 90,5 81,8 90,3 100,0 99,3 100,0 5339,0 451,4 2824,7 3829,4 281,7 2048,1 7443,6 723,5 3895,8

Hiberix™: PIII(M3) PRE-PS POST-PS 2,8 5,7 17,6 0,1 0,7 6,8 14,5 19,2 34,5 4,5 4,8 9,8 3,6 3,6 4,8 5,7 6,4 19,7

Meningitec™: PIII(M3) PRE-PS POST-PS 100,0 97,4 100,0 91,0 86,5 91,0 100,0 99,9 100,0 4557,8 347,7 1557,7 3539,3 221,6 1090,8 5869,5 545,4 2224,4

IC 95%: intervalo de confianza del 95%; LI: Límite Inferior; LS: Límite Superior; CMG/TMG: Concentración Media Geométrica/Título Medio Geométrico PIII(M3): Muestra de sangre post-vacunación obtenida un mes después de la tercera dosis de la vacunación primaria de tres dosis PRE-PS: Muestra de sangre obtenida antes del refuerzo de polisacárido simple en el Mes 10 POST-PS: Muestra de sangre obtenida un mes después del refuerzo de polisacárido simple

Tabla 4b

Anticuerpo: Grupo Momento IC 95% (LI, LS) CMG/TMG IC 95% (LI, LS)

Anti-PSA (%  0,3 g/ml): 2,5/2,5/2,5 PIII(M3) PRE-PS POST-PS 100,0 92,5 100,0 91,6 79,6 91,6 100,00 98,4 100,0 17,64 1,79 23,58 13,52 1,22 16,76 23,02 2,62 33,17

5/5/5: PIII(M3) PRE-PS POST-PS 100,0 97,4 100,0 91,0 86,5 91,0 100,0 99,9 100,0 26,06 2,25 24,13 20,30 1,60 17,64 33,45 3,18 33,01

2,5/5/5: PIII(M3) PRE-PS POST-PS 100,0 91,2 100,0 90,3 76,3 90,5 100,0 98,1 100,0 24,03 1,47 22,68 18,84 0,99 15,81 30,65 2,19 32,54

Hiberix™: PIII(M3) PRE-PS POST-PS 0,0 5,6 75,8 0,0 0,7 57,7 10,3 18,7 88,9 0,15 0,16 1,03 0,15 0,15 0,55 0,15 0,17 1,93

(continuación)

Anticuerpo: Grupo Momento IC 95% (LI, LS) CMG/TMG IC 95% (LI, LS)

Meningitec™: PIII(M3) PRE-PS POST-PS 2,6 7,7 66,7 0,1 1,6 49,8 13,8 20,9 80,9 0,16 0,16 0,84 0,14 0,15 0,49 0,17 0,18 1,42

Anti-PSC (%  0,3 g/ml): 2,5/2,5/2,5 PIII(M3) PRE-PS POST-PS 100,00 100,00 100,00 91,6 91,2 91,2 100,00 100,00 100,00 48,45 7,11 21,55 39,65 5,69 17,24 59,20 8,89 26,94

5/5/5: PIII(M3) PRE-PS POST-PS 100,00 100,00 100,00 91,0 91,0 90,0 100,00 100,00 100,00 56,42 8,32 22,32 48,16 6,74 18,21 66,11 1028 27,36

2,5/5/5: PIII(M3) PRE-PS POST-PS 100,00 100,00 100,00 90,3 89,7 90,5 100,00 100,00 100,00 76,98 8,64 24,75 62,69 6,93 19,37 94,53 10,77 31,61

Hiberix™: PIII(M3) PRE-PS POST-PS 6,1 0,0 100,00 0,7 0,0 90,3 20,2 9,7 100,0 0,16 0,15 8,05 0,15 0,15 5,73 0,18 0,15 11,3

Meningitec™: PIII(M3) PRE-PS POST-PS 100,00 100,00 100,00 91,0 91,0 90,7 100,00 100,00 100,00 59,05 7,33 17,13 48,16 5,51 13,38 72,41 9,75 21,94

Conclusión

La formulación de vacuna conjugada de HibMenAC 2,5/5/5 que contiene una cantidad más baja de Hib tuvo

5 tendencia a proporcionar una respuesta de memoria inmune mejor a MenA y MenC en ensayos SBA que las formulaciones de vacunas que contienen cantidades iguales de los tres conjugados. Esto se puede observar a partir de una comparación de las lecturas POST-PS. Por lo tanto, el uso de la formulación 2,5/5/5 en sensibilización da como resultado una mejor respuesta de memoria inmune.

Observando los datos de PIII(M3), se observaron lecturas superiores para la formulación 2,5/5/5 para Hib (22,5 v 17) 10 y MenC (76 v 48 ó 56 y 5339 v 3342 ó 3863 mediante SBA) .

Ejemplo 5a: Ensayo clínico usando HibMenCY proporcionado simultáneamente con Infanrix penta y Prevenar en bebés a 2, 4 y 6 meses

Diseño de estudio: Estudio multicéntrico controlado de Fase II, abierto (parcialmente doble-ciego*), aleatorizado

(1:1:1:1) con cinco grupos paralelos que recibieron vacunas simultáneas de la forma siguiente como un curso de 15 vacunación primaria de 3 dosis a las edades de 2, 4 y 6 meses:

Grupo Hib-MenCY 2,5/5/5 : Hib-MenCY (2,5/5/5) + Infanrix penta + Prevenar

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Tabla 6: Formulación de vacuna candidata y números de lote

Vacuna: Formulación: contenido/dosis Presentación Nº de lote (nº de lote de diluyente)

Hib-MenCY 2,5/5/5: 2,5 g de polirribosil ribitol (PRP) polisacárido capsular de tipo b de H. influenzae conjugado con toxoide tetánico (TT); 5 g de polisacárido capsular de serogrupo C de N. meningitidis (PSC) conjugado con TT; 5 g de de polisacárido capsular de serogrupo Y de N. meningitidis (PSY) conjugado con TT Sedimento liofilizado en vial monodosis (0,5 ml después de reconstitución con diluyente de solución salina) DCYH003A48 (01B20/22A)

Hib-MenCY 5/10/10: 5 g de PRP conjugado con TT; 10 g de PSC conjugado con TT; 10 g de PSY conjugado con TT Sedimento liofilizado en vial monodosis (0,5 ml después de reconstitución con diluyente de solución salina) DCYHO02A48 (01 B20/22A)

Hib-MenCY 5/5/5: 5 g de PRP conjugado con TT; 5 g de PSC conjugado con TT; 5 g de PSY conjugado con TT Sedimento liofilizado en vial monodosis* DCYHO02A48 (01 B20/22A)

* El Hib-MenCY 5/5/5 se preparó disolviendo formulación de Hib-MenCY 10/10/10 con 1,0 ml de diluyente; se administraron 0,5 ml y los 0,5 ml restantes se descartaron.

Criterios de evaluación:

Inmunogenicidad: Medición de títulos/concentraciones de anticuerpo frente a cada antígeno de vacuna antes de la

5 primera dosis (Mes 0) y aproximadamente un mes después de la tercera dosis (Mes 5) en todos los sujetos. La determinación de títulos de anticuerpo bactericidas frente a serogrupos C e Y de N. meningitidis (SBA-MenC y SBA-MenY) mediante un ensayo bactericida (puntos de corte de ensayo: una dilución de 1:8 y 1:128) y medición de ELISA de anticuerpos frente a serogrupos C e Y de N. meningitidis (anti-PSC y anti-PSY, puntos de corte de ensayo  0,3 g/ml y  0,2 g/ml), el PRP de polisacárido Hib (anti-PRP, puntos de corte de ensayo  0,15 g/ml y  1,0

10 g/ml), los tres antígenos de pertussis (anti-PT, anti-FHA, anti-PRN, punto de corte de ensayo  5 EL.U/ml), anticuerpos frente a antígeno de superficie de hepatitis B (anti-HBs, punto de corte de ensayo  10 mUI/ml), toxoides de difteria y tetánico (anti-difteria y anti-tétano, punto de corte de ensayo 0,1 UI/ml); anti-poliovirus de tipos 1, 2 y 3 (punto de corte de ensayo 1:8); siete serotipos neumocócicos anti-4, anti-6B, anti-9V, anti-14, anti-18C, anti-19F, anti-23F (punto de corte de ensayo 0,05 g/ml).

15 La respuesta de vacuna primaria a los antígenos de pertussis se definió como seropositividad (anticuerpos detectables) después de la tercera dosis en sujetos con anticuerpos previamente indetectables o al menos mantenimiento de concentración prevacunación de anticuerpo en sujetos que inicialmente eran seropositivos.

Seguridad (Criterios de evaluación): seguimiento de 8-días (Días 0 a 7), después de la administración de cada dosis de vacuna, de síntomas locales (dolor, enrojecimiento, inflamación) y generales (mareos, fiebre, irritabilidad y

20 pérdida del apetito) solicitados registrados en tarjetas diarias por los padres/tutores de los sujetos; seguimiento de 31 días (Días 0 a 30), después de cada dosis de vacuna, de acontecimientos adversos no graves no solicitados y de acontecimientos adversos graves (AAG) durante todo el periodo de estudio.

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**Menjugate™ fue la vacuna que se administró a todos los sujetos en el grupo. Vacunación a +/-2, 3, 4 meses de edad (Mes de Estudio 0, Mes 1 y Mes 2) y muestras de sangre (3,5 ml) de todos los sujetos antes de y un mes después de la vacunación primaria (Mes de Estudio 0 y Mes 3).

Vacuna de estudio, dosis, modo de administración, número de lote: Tres dosis se inyectaron por vía intramuscular a intervalos de un mes, a aproximadamente 2, 3 y 4 meses de edad de la manera siguiente:

Tabla 8: Vacunas administradas (estudio y control), grupo, programa/sitio y dosis

Grupo: Programa (meses de edad) Dosis de vacuna administrada Sitio-Muslo superior izquierdo Vacuna simultánea administrada Sitio Muslo superior derecho

Hib-MenCY 2,5/5/5: 2, 3 y 4 Hib (2,5 g)-MenC-TT (5 g)-MenY-TT (5 g) DTPa-HBV-IPV (Infanrix™ penta)

Hib-MenCY 5/10/10: 2, 3 y 4 Hib (5 g)-MenC-TT (10 g)-MenY-TT (10 g) DTPa-HBV-IPV (Infanrix™ penta)

Hib-MenCY 5/5/5: 2, 3 y 4 Hib (5 g)-MenC-TT (5 g)-MenY-TT (5 g) DTPa-HBV-IPV (Infanrix™ penta)

Hib-MenC: 2, 3 y 4 Hib (5 g)-Men C (5 g) DTPa-HBV-IPV (Infanrix™ penta)

Menjugate™: 2, 3 y 4 Menjugate™ DTPa-HBV-IPV (Infanrix™ hexa)

Inmunogenicidad: Medición de títulos/concentraciones de anticuerpo frente a cada antígeno de vacuna:

Antes de la primera dosis (Mes 0) y aproximadamente un mes después de la tercera dosis (Mes 3) en todos los sujetos para: SBAMenC y SBA-MenY, anti-PSC y anti-PSY, anti-PRP, anti-T, anti-FHA, anti-PRN y anti-PT. Uso de actividad bactericida en suero frente a serogrupos C e Y de N. meningitidis (punto de corte de SBA-MenC y SBA-MenY: 1:8 y 1:128); ensayos de ELISA con puntos de corte: 0,3 g/ml y 2 g/ml para anti-polisacáridos de serogrupos C e Y de N. meningitidis (anti-IgG de PSC y anti-IgG de PSY); 0,15 g/ml y 1,0 g/ml para polirribosil-ribitol-fosfato polisacárido de Hib (anti-IgG de PRP); 5 EL.U/ml para anti-FHA, anti-PRN, anti-PT;  0,1 UI/ml de anti-toxoide tetánico (anti-TT). Únicamente a un mes después de la tercera dosis (Mes 3) en todos los sujetos para: anti-D, anti-HBs y anti-polio 1, 2 y 3. Uso de ensayos de ELISA con puntos de corte: 0,1 UI/ml para anti-difteria (anti-D); 10 mUI/ml para antihepatitis B (anti-HBs); y punto de corte de ensayo de microneutralización: 1:8 para anti-polio de tipo 1, 2 y 3 (anti-polio 1, 2 y 3).

Métodos estadísticos:

Los índices de seroprotección/seropositividad y concentraciones/títulos medios geométricos (CMG/TMG) con intervalos de confianza del 95% (IC 95%) se calcularon por grupo para SBA-MenC, anti-PSC, SBA-MenY, anti-PSY, anti-PRP, anti-Tétano, anti-PT, anti-FHA y anti-PRN antes de y un mes después de la vacunación; para anti-Difteria, anti-HBs, anti-Polio 1, anti-Polio 2 y anti-Polio 3 un mes después de vacunación. La respuesta de vacuna (aparición de anticuerpos en sujetos inicialmente seronegativos o al menos el mantenimiento de concentraciones de anticuerpo en sujetos inicialmente seropositivos) con IC del 95% para anti-PT, anti-PRN y anti-FHA también se calcularon un mes después de la vacunación. También se presentaron las curvas acumulativas inversas para cada anticuerpo el Mes 3. Las diferencias entre los grupos de Hib-MenCY y Hib-MenC, en comparación con el grupo de control Menjugate™ se evaluaron de una manera exploratoria para cada anticuerpo, excepto para SBA-MenY y anti-PSY, en términos de (1) la diferencia entre el grupo Menjugate™ (menos) los grupos Hib-MenCY y Hib-MenC para el porcentaje de sujetos por encima de los puntos de corte especificados o con una respuesta de vacuna con sus IC del 95% asintóticos estandarizados, (2) las proporciones de CMG o TMG del grupo Menjugate™ con respecto a los grupos Hib-MenCY y Hib-MenC con sus IC del 95%. Las mismas comparaciones se realizaron para evaluar la diferencia entre cada par de formulaciones de Hib-MenCY para anticuerpos anti-PRP, SBA-MenC, anti-PSC, SBA-MenY, anti-PSY y anti-TT.

Las incidencias globales de síntomas solicitados locales y generales se calcularon por grupo de acuerdo con el tipo síntoma, su intensidad y relación con la vacunación (como porcentajes de sujetos que informaban síntomas generales, locales y de cualquier tipo solicitados dentro de los 8 días a continuación de la vacunación y su IC del 95% exactamente). Las incidencias de síntomas no solicitados se calcularon por grupo. Para los síntomas de Grado

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