ES2621780T3

ES2621780T3 - Procedimiento de fabricación de vacunas

Info

Publication number: ES2621780T3
Application number: ES10179820.5T
Authority: ES
Inventors: Ralph Leon Biemans; Pierre Duvivier
Original assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Current assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Priority date: 2005-06-27
Filing date: 2006-06-23
Publication date: 2017-07-05
Anticipated expiration: 2026-06-23
Also published as: IL188045A0; US20130004532A1; WO2007000322A1; PL1896062T3; HRP20100211T1; EP1896065B2; HRP20110567T4; KR101351873B1; AR056397A1; PT1896065E; ES2377075T5; PL1896063T3; AU2006263965B2; BRPI0612655B1; SI1896062T1; WO2007000342A2; MA29569B1; JP2008543907A; ES2340711T3; CN102218138A

Abstract

Un procedimiento para conjugar un sacárido a una proteína vehículo mediante química de condensación de la carbodiimida, en el que el sacárido comprende (por ejemplo, como parte de su unidad de repetición), o se ha derivatizado para comprender, grupos amino y/o carboxilo, y en el que la proteína vehículo comprende, o se ha derivatizado para comprender, grupos amino y/o carboxilo, que comprende las etapas de: I) - si la proteína vehículo comprende tanto grupos amino como carboxilo y el sacárido comprende bien grupos amino o bien carboxilo: a) mezclar el sacárido y la alícuota de carbodiimida necesaria para llevar a cabo la conjugación, y b) añadir la alícuota de proteína vehículo necesaria durante un período de 5 minutos a 6 horas, en el que al menos un cuarto de la alícuota se añade durante la primera mitad del período y al menos un cuarto de la alícuota en la segunda mitad del período; II) - si el sacárido comprende tanto grupos amino como carboxilo y la proteína vehículo comprende bien grupos amino o bien carboxilo: a) mezclar la proteína vehículo y la alícuota de carbodiimida requerida para llevar a cabo la conjugación, y b) añadir la alícuota de sacárido necesaria durante un período de 1 minuto a 6 horas, en el que al menos un cuarto de la alícuota se añade durante la primera mitad del período y al menos un cuarto de la alícuota en la segunda mitad del período; III) - si el sacárido comprende tanto grupos amino como carboxilo y la proteína vehículo comprende tanto grupos amino como carboxilo: a) mezclar la proteína vehículo y el sacárido, y b) añadir la alícuota de carbodiimida necesaria para llevar a cabo la conjugación en un período de 1 minuto a 6 horas, en el que al menos un cuarto de la alícuota se añade durante la primera mitad del período y al menos un cuarto de la alícuota en la segunda mitad del período; y en el que: la alícuota de carbodiimida es de 0,01 a 3 mg de carbodiimida / mg de sacárido; el sacárido está presente en una concentración final de 0,5-50 mg/ml en la etapa b); la proteína vehículo está presente en una concentración final de 1-50 mg/ml en la etapa b); la relación inicial de proteína vehículo a sacárido es de 4:1 a 1:1 (p:p); el pH de la reacción en la etapa b) se mantiene a pH: 4,5-6,5, o pH: 4,5-7,5 si en la etapa b) está presente un compuesto que mantiene el intermedio de reacción estable; y la temperatura de la reacción en la etapa b) se mantiene a 4-37 ºC.

Description

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DESCRIPCION

Procedimiento de fabricacion de vacunas

La presente invencion se refiere a procedimientos mejorados para llevar a cabo reacciones de condensacion de carbodiimida. En particular, se refiere a la conjugacion de sacaridos y protemas usando condensacion de carbodiimida.

El uso de polisacaridos capsulares bacterianos se ha usado ampliamente en inmunologfa durante muchos anos para la prevencion de enfermedades bacterianas. Un problema con un uso tal, sin embargo, es la naturaleza T independiente de la respuesta inmune. Estos antigenos son muy poco inmunogenicos en ninos pequenos. Este problema se ha superado por medio de la conjugacion de los antigenos de polisacaridos a una protema vehnculo (una fuente de epttopos de linfocitos T ayudantes) que puede entonces utilizarse para provocar una respuesta inmune T dependiente, incluso en el primer ano de vida.

En la tecnica se conocen diversas tecnicas de conjugacion. Los conjugados pueden prepararse mediante procedimientos de aminacion reductora directa como se describe en los documentos US 4365170 (Jennings) y US 4673574 (Anderson). En los documentos EP-0-161-188, EP-208375 y EP-0-477508 se describen otros procedimientos. El procedimiento de conjugacion puede depender alternativamente de la activacion de los grupos hidroxilo del sacarido con tetrafluoroborato de 1-ciano-4-dimetilamino piridinio (CDAP) para formar un ester de cianato. De esta manera el sacarido activado puede acoplarse directamente o a traves de un grupo espaciador (conector) a un grupo amino en la protema vetnculo. Por ejemplo, el ester de cianato puede acoplarse con hexanodiamina o dihidrazida de acido adfpico (ADH o AH) y el sacarido derivado con un grupo amino se conjuga a la protema vehnculo usando qmmica de la carbodiimida (por ejemplo, EDAC o EDC) a traves de un grupo carboxilo en la protema vehnculo. Tales conjugados se describen en la solicitud PCT publicada WO 93/15760 de la Universidad de Servicios Uniformados y en los documentos WO 95/08348 y WO 96/29094. Vease tambien Chu C. y col. Infect. Immunity, 1983, 245-256.

En general, pueden usarse los siguientes tipos de grupos qmmicos en una protema vehnculo para acoplamiento / conjugacion:

A) Carboxilo (por ejemplo a traves de acido aspartico o acido glutamico) que puede conjugarse a grupos amino naturales o derivatizados en restos sacarido por medio de qmmica de la carbodiimida;

B) Grupo amino (por ejemplo a traves de lisina) que puede conjugarse a grupos carboxilo naturales o derivatizados en restos sacarido por medio de qmmica de la carbodiimida;

C) Sulfhidrilo (por ejemplo a traves de cistema);

D) Grupo hidroxilo (por ejemplo a traves de tirosina);

E) Grupo imidazolilo (por ejemplo a traves de histidina);

F) Grupo guanidilo (por ejemplo a traves de arginina); y

G) Grupo indolilo (por ejemplo a traves de triptofano).

En un sacarido, en general pueden utilizarse los siguientes grupos para un acoplamiento: OH, COOH o NH2. Los grupos aldehndo pueden generarse tras utilizar diferentes tratamientos conocidos en la tecnica tales como: peryodato, hidrolisis acida, peroxido de hidrogeno, etc.

Aproximaciones de acoplamiento directo:

Sacarido-OH + CNBr o CDAP ^ ester de cianato + NH2-Prot ^ conjugado

Sacarido-aldehndo + NH2-Prot ^ base de Schiff + NaCNBH3 ^ conjugado Sacarido-COOH + NH2-Prot + EDAC ^ conjugado

Sacarido-NH2 + COOH-Prot + EDAC ^ conjugado

Aproximaciones de acoplamiento indirecto por medio de un espaciador (conector)

Sacarido-OH + CNBr o CDAP ^ ester de cianato + NH2—NH2 ^ sacarido—NH2 + COOH-Prot + EDAC ^ conjugado

Sacarido-OH + CNBr o CDAP ^ ester de cianato + NH2----SH ^ sacarido—SH + SH-Prot (Protema nativa con

una cistema expuesta u obtenida tras la modificacion de grupos amino de la protema por SPDP, por ejemplo) ^ sacarido-S-S-Prot

Sacarido-OH + CNBr o CDAP ^ ester de cianato + NH2—SH ^ sacarido—SH + maleimida-Prot (modificacion de grupos amino) ^ conjugado

Sacarido-COOH + eDaC + NH2----NH2 ^ sacarido------NH2 + EDAC + COOH-Prot ^ conjugado

Sacarido-COOH + EDAC+ NH2—SH ^ sacarido—SH + SH-Prot (Protema nativa con una cistema expuesta u obtenida tras la modificacion de grupos amino de la protema por SPDP, por ejemplo) ^ sacarido-S-S-Prot Sacarido-COOH + EDAC+ NH2—SH ^ sacarido—SH + maleimida-Prot (modificacion de grupos amino) ^ conjugado

Sacarido-aldehndo + NH2----NH2 ^ sacarido—NH2 + EDAC + COOH-Prot ^ conjugado

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Como puede observarse la qmmica de la carbodiimida (por ejemplo, utilizando EDAC) es muy conveniente para las reacciones de conjugacion ya que hace uso de grupos en los sacaridos y/o protemas que pueden estar presentes de manera natural o pueden insertarse facilmente por derivatizacion. Tambien une de manera conveniente restos a traves de un enlace peptfdico.

Las carbodiimidas (RN=C=NR') son compuestos insaturados con una estructura de aleno (Nakajima e Ikada, 1995, Bioconjugate Chem. 6: 123-130; Hoare y Koshland, 1967, JBC 242: 2447-2453). El compuesto qmmico es relativamente inestable a su pH de reaccion (4,5-6,5), y por lo tanto en la tecnica suelen anadirse todos los componentes de la reaccion de conjugacion de sacarido/protema/carbodiimida juntos.

Los presentes inventores han encontrado que dependiendo de la naturaleza del sacarido y la protema a conjugar, se pueden lograr mejores caractensticas del conjugado final para el uso en vacunas mediante la adicion lenta de un componente determinado de la reaccion a la mezcla. Al hacerlo pueden obtenerse uno o mas beneficios/mejoras tales como: rendimiento del sacarido en el conjugado, capacidad de filtrado esteril del conjugado, mejor control de la conjugacion, mayor facilidad de reproducibilidad, y/o prevencion de la formacion de enlaces de reticulacion intra- resto.

Por consiguiente, en una realizacion se proporciona un procedimiento para conjugar un sacarido a una protema vehmulo mediante qmmica de condensacion de la carbodiimida, en el que el sacarido comprende (por ejemplo, como parte de su unidad de repeticion), o se ha derivatizado para comprender, grupos amino y/o carboxilo, y en el que la protema vehmulo comprende, o se ha derivatizado para comprender, grupos amino y/o carboxilo, que comprende las etapas de:

I) - si la protema vehmulo comprende tanto grupos amino como carboxilo y el sacarido comprende grupos amino o bien carboxilo:

a) mezclar el sacarido y la almuota de carbodiimida necesaria para realizar la conjugacion, y

b) anadir la almuota de protema vehmulo necesaria durante un penodo de 5 minutos a 6 horas;

II) - si el sacarido comprende tanto grupos amino como carboxilo y la protema vehmulo comprende grupos amino o bien carboxilo:

a) mezclar la protema vehmulo y la almuota de carbodiimida necesaria para realizar la conjugacion, y

b) anadir la almuota de sacarido necesaria durante un penodo de 1 minuto a 6 horas;

III) - si el sacarido comprende tanto grupos amino como carboxilo y la protema vehmulo comprende tanto grupos amino como carboxilo:

a) mezclar la protema vehmulo y el sacarido, y

b) anadir la almuota de carbodiimida necesaria para llevar a cabo la conjugacion en un penodo de 1 minuto a 6 horas.

y en el que:

la almuota de carbodiimida es de 0,01 a 3 mg de carbodiimida / mg de sacarido; el sacarido esta presente en una concentracion final de 0,5-50 mg/ml en la etapa b); la protema vehmulo esta presente en una concentracion final de 1-50 mg/ml en la etapa b); la relacion inicial de protema vehmulo a sacarido es de 4:1 a 1:1 (p:p);

el pH de la reaccion en la etapa b) se mantiene a pH 4,5-6,5, o pH: 4,5-7,5 si en la etapa b) esta presente un compuesto que mantiene el intermedio de reaccion estable; y la temperatura de la reaccion en la etapa b) se mantiene a 4-37 °C.

Descripcion detallada

Puede utilizarse cualquier carbodiimida adecuada con la condicion de que sea capaz de conjugar sacaridos y protemas en un medio acuoso. En una realizacion, la carbodiimida puede ser EDAC (1-etil-3-(3-dimetil-aminopropil) carbodiimida) [tambien conocida como EDC] o puede ser una carbodiimida diferente de EDAC.

El termino “sacarido” en toda la presente memoria descriptiva puede indicar polisacaridos u oligosacaridos e incluye ambos. Puede indicar lipopolisacarido (LPS) o lipooligosacarido (LOS). Antes de su uso, los polisacaridos (tales como los polisacaridos bacterianos) pueden aislarse de una cepa fuente (por ejemplo, de bacterias) o pueden aislarse a partir de la cepa fuente y se clasifican por tamanos en algun grado mediante procedimientos conocidos (vease, por ejemplo, documentos EP 497524 y EP 497525; Shousun Chen Szu y col., Carbohydrate Research Vol. 152, paginas 7-20 (1986)) por ejemplo por microfluidizacion. Los polisacaridos pueden clasificarse por tamanos para reducir la viscosidad en las muestras de polisacaridos y/o mejorar la capacidad de filtracion de los productos conjugados. Los oligosacaridos tienen una serie baja de unidades de repeticion (normalmente 5-30 unidades de repeticion) y normalmente son polisacaridos hidrolizados.

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El termino “protema vehmulo” se refiere tanto a pequenos peptidos como a polipeptidos grandes (> 10 kDa). Los polipeptidos claramente grandes tienen mas probabilidades de contener tanto grupos amino como carboxilo reactivos sin ninguna derivatizacion.

Para los fines de la presente invencion, “polisacarido nativo” se refiere a un sacarido que no se ha sometido a ningun procedimiento, cuyo fin sea reducir el tamano del sacarido. Se puede reducir ligeramente el tamano de un polisacarido durante los procedimientos normales de purificacion. Tales sacaridos son todavfa nativos. Solo si el polisacarido ha sido sometido a tecnicas de alteracion del tamano, el mismo no sera considerado nativo.

Para los fines de la presente invencion “clasificado por tamano por un factor de hasta x2” significa que el sacarido se somete a un procedimiento previsto para reducir el tamano del sacarido pero para retener un tamano superior a la mitad del tamano del polisacarido nativo. X3, x4, etc. se deben interpretar de la misma forma, es decir, el sacarido se somete a un procedimiento previsto para reducir el tamano del sacarido, pero para retener un tamano superior a un tercio, un cuarto, etc., del tamano del polisacarido nativo.

El penodo de tiempo en la etapa b) del procedimiento para la adicion de la almuota completa del componente final puede ser de 1 minuto a 4 horas, de 2 minutos a 3 horas, de 3 minutos a 2 horas, de 4 a 60 minutos, de 5 a 50 minutos, de 6 a 40 minutos, de 7 a 30 minutos o de 8 a 20 minutos. Puede ser de 1 minuto a 5 horas, de 10 minutos a 4 horas, de 20 minutos a 3 horas, de 30 minutos a 2 horas, de 40 a 90 minutos, o de 50 a 70 minutos. Este tiempo puede ajustarse segun el sacarido y la protema espedficos que se conjugan.

En una realizacion la almuota del componente final (por ejemplo, de carbodiimida, sacarido o protema) se anade a la mezcla de reaccion a una velocidad constante durante el penodo de tiempo (esto se logra de manera conveniente mediante una bomba que funciona a una velocidad constante). Como alternativa, puede anadirse en etapas durante el penodo de tiempo. Aunque esto puede hacerse de muchas maneras, en general deben anadirse partes de la almuota durante todo el penodo. Por ejemplo al menos un cuarto de la almuota puede anadirse durante la primera mitad del penodo y al menos un cuarto de la almuota en la segunda mitad del penodo. La cantidad total de la almuota 'a' medida, por ejemplo, en ml o mg puede anadirse en 4-100 fases (T) durante todo el penodo. En una realizacion, las etapas se organizan de tal modo que una cantidad exacta (a/f) se introduce en todas las fases. En una realizacion las fases son espaciadas uniformemente durante todo el penodo 'p' (en segundos). Por consiguiente, si una fase tiene lugar en el tiempo cero del penodo 'p', entonces cada etapa posterior tendra lugar en un tiempo que es p/(f-1). El volumen de la almuota del componente final anadido en la etapa b) puede ajustarse en terminos de facilidad de adicion de la almuota a la reaccion en el plazo de tiempo deseado. La carbodiimida puede anadirse en forma de una solucion acuosa (normalmente, tamponada a pH 7,5 antes de anadirse a la reaccion) o como un polvo solido (EDAC, por ejemplo, es muy soluble en medios acuosos). Por supuesto, si la carbodiimida es el ultimo componente anadido a la reaccion (situacion III, etapa b)), puede utilizarse una carbodiimida de solucion lenta, de manera que toda la almuota de polvo se anade a la reaccion a la vez, pero se disuelve a una velocidad coherente con el penodo deseado durante el cual la almuota se pone a disposicion de la reaccion.

Si la protema y/o el sacarido no tiene grupos amino o carboxilo (o solo tiene uno de estos), los mismos pueden ser derivados para incorporarles uno (o para incorporarles el otro si aun no lo tienen). Por ejemplo, para un sacarido que solo comprende grupos hidroxilo reactivos (por ejemplo, el sacarido capsular del meningococo serogrupo A), se debe utilizar tal grupo para derivarlo y convertirlo en grupos amino o carboxilo para que la condensacion con EDAC pueda llevarse a cabo. Esto puede tener lugar dentro de una subunidad de repeticion, o puede ser un grupo que solo esta presente al final de la molecula de sacarido.

Cabe senalar que cuando tiene lugar la derivatizacion, puede resultar beneficioso derivar solo parcialmente el resto. Para sacaridos con subunidades de repeticion, el epftopo diana puede estar presente en cada repeticion. Por lo tanto, si tiene lugar la derivatizacion parcial (por esto se entiende que se derivatiza realmente el 0,5-20, el 1-15, el 312 o el 5-1 0 % de los grupos reactivos diana) esta puede tener la ventaja de conservar la mayona de los epftopos y evitar demasiada reticulacion.

Si un sacarido o protema ya tiene grupos amino o carboxilo unicamente (por ejemplo, el sacarido Vi de Salmonella typhi que naturalmente tiene grupos carboxilo pero no tiene grupos amino), la derivatizacion puede tener lugar para incorporarle el otro tipo de grupo (es decir, grupos amino para Vi). Debe senalarse, no obstante, que como la derivatizacion puede ser parcial, esta accion puede cambiar la reaccion preferida de la invencion de una tipo I a una tipo III. Por ejemplo, si se conjuga el sacarido Vi a un protema vehmulo que comprende tanto grupos amino como carboxilo, la situacion I anade la almuota de protema lentamente en la etapa b). Si el grupo carboxilo del sacarido Vi se derivatiza parcialmente con grupos amino, tendra tanto grupos carboxilo como amino, por consiguiente la situacion III de anadir lentamente la almuota de carbodiimida en la etapa b) pasa a ser mas relevante.

La derivatizacion puede producirse mediante la adicion de un conector hetero- u homo-bifuncional. Puede tener lugar con la qrnmica similar a la descrita anteriormente para la etapa de conjugacion de sacarido y protema (por ejemplo, qrnmica del CDAP o de la carbodiimida). El conector puede tener entre 4 y 20, 4 y 12, o 5 y 10 atomos de carbono. Puede tener dos grupos amino reactivos, dos grupos carboxilo reactivos, o uno de cada uno (por ejemplo, hexano diamina, acido 6-aminocaproico o dihidrazida del acido adfpico). Normalmente, la derivatizacion tiene lugar a traves de la reaccion de un exceso del conector con el sacarido y/o la protema vehmulo a derivatizar. Esto permite

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que la derivatizacion tenga lugar con minima reticulacion intra-resto (que de otro modo podna ser posible si por ejemplo la derivatizacion de un grupo carboxilo de un sacarido se estuviera llevando a cabo con grupos amino mediante condensacion de la carbodiimida). El exceso de conector se retira facilmente utilizando tecnicas tales como la diafiltracion.

En una realizacion, el sacarido comprende un grupo hidroxilo reactivo como parte de su unidad de repeticion que se derivatiza parcialmente a traves de un grupo amino del conector (por ejemplo, con la qmmica del CDAP). En otra realizacion, el sacarido comprende un grupo reactivo amino como parte de su unidad de repeticion que se derivatiza parcialmente a traves de un grupo carboxilo del conector (por ejemplo, con la qmmica de la carbodiimida). En una realizacion mas, el sacarido comprende un grupo reactivo carboxilo como parte de su unidad de repeticion que se derivatiza parcialmente a traves de un grupo amino del conector (por ejemplo, con la qmmica de la carbodiimida).

La almuota de carbodiimida necesaria para realizar la conjugacion (si esta presente en la etapa a) o b) de la reaccion de la invencion) es de 0,01 a 3, de 0,05 a 2 o de 0,09 a 1 mg de carbodiimida/mg de sacarido. Aunque estos numeros se calcularon con respecto a EDAC siendo la carbodiimida, estos numeros pueden ajustarse si se utiliza cualquier otra carbodiimida multiplicando los numeros del intervalo por: (peso molecular de otra carbodiimida)/(peso molecular de EDAC).

El sacarido esta presente en los procedimientos de la invencion en una concentracion final de 0,5-50 mg/ml en la etapa b). Esto dependera del tamano y de la naturaleza del sacarido, y del alcance de cualquier derivatizacion. Por ejemplo, para los oligosacaridos sera necesaria una mayor concentracion, pero para los polisacaridos grandes resultara mas apropiada una concentracion mucho menor. Si esta presente hacia el extremo superior del parcialmente derivatizado con grupos amino o carboxilo, puede ser adecuada una concentracion mas pequena para reducir la posibilidad de reticulacion. La protema vehmulo esta presente en una concentracion final de 1-50 mg/ml en la etapa b).

La relacion inicial de protema vehmulo a sacarido en los procedimientos de la invencion es de 4:1 a 1:1 o de 3:1 a 2:1 (p/p). Nuevamente, esto dependera del tamano y de la naturaleza del sacarido y del alcance de cualquier derivatizacion.

Las condiciones de salinidad (por ejemplo, NaCl) tambien pueden variar de acuerdo con la naturaleza del sacarido y de la protema. Por lo general, puede estar presente NaCl alrededor de 0,2 M en la etapa b) de los procedimientos de la invencion, pero puede ser de 0-2, de 0,1-1 o de 0,2-0,5 M.

En terminos de pH en la etapa b) de los procedimientos de la invencion, el pH de la reaccion puede ser pH de 4,56,5, 4,7-6,0 o 5-5,5. Este pH normalmente se mantiene a lo largo de la reaccion por medio de la adicion de acido/base segun sea necesario. EDAC es generalmente estable a pH 7,5, aunque si es necesario realizar la conjugacion a compuestos de pH superiores, que se sabe que mantienen el intermedio de reaccion estable (tal como N-hidroxisuccinimida), tambien puede estar presente en la reaccion en la etapa b), en cuyo caso el pH de la reaccion en la etapa b) se mantiene en un pH de 4,5-7,5.

La temperatura de reaccion durante la etapa b) de los procedimientos de la invencion es de 4-37, 10-32, 17-30 o 2227 °C, y normalmente se mantiene a lo largo de la reaccion.

En los procedimientos de la invencion, una vez que se ha anadido toda la almuota en la etapa b) la reaccion se mantiene normalmente durante otros 10 minutos a 72 horas, 20 minutos a 48 horas, 30 minutos a 24 horas, 40 minutos a 12 horas, 50 minutos a 6 horas, o 1-3 horas. Una vez finalizada la reaccion se ajusta el pH hasta 7,5-9 (hacia el extremo superior de este si esta presente N-hidroxisuccinimida) para volver al intervalo de pH en el que es estable la carbodiimida.

Una vez conjugado, el conjugado de sacarido-protema puede purificarse de: componentes sin reaccionar, sacaridos libres, etc. mediante la inyeccion del mismo en una columna de cromatograffa de exclusion por tamano (por ejemplo, Sephacryl S400HR, Pharmacia). Esto se realiza normalmente a 2-8 °C. El conjugado puede filtrarse esteril y puede almacenarse. Finalmente, puede formularse una dosis eficaz (por ejemplo 1-20, 2-15 o 3-10 |jg de sacarido/dosis) del conjugado de sacarido-protema con un excipiente farmaceuticamente aceptable (por ejemplo, una sal o adyuvante) para la fabricacion de una composicion inmunogenica o vacuna.

En terminos de los sacaridos de la invencion, puede conjugarse cualquier sacarido de origen vmco, fungico, bacteriano o eucariota por medio de los procedimientos de la invencion. Puede ser el sacarido Vi de Salmonella typhi, o un sacarido diferente de Vi. Puede ser el sacarido capsular Hib de H. influenzae tipo b, o puede ser un sacarido diferente de Hib. En una realizacion, el sacarido es un sacarido capsular bacteriano, por ejemplo derivado de una bacteria seleccionada de una lista que consiste en: N. meningitidis serogrupo (MenA), B (MenB), C (MenC), W135 (MenW) o Y (MenY), Streptococcus pneumoniae serotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6b, 7F, 8, 9N, 9v, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17, 18 C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F o 33F, Grupo B de Streptococcus grupos la, Ib, II, III, IV, V, VI o VII, Staphylococcus aureus tipo 5, Staphylococcus aureus tipo 8, Salmonella typhi (sacarido Vi), Vibrio cholerae o H. influenzae tipo b.

El peso molecular promedio en peso del sacarido puede ser de 1000-2000000, 5000-1000000, 10000-500000, 50000-400000, 75000-300000 o 100000-200000. El peso molecular o peso molecular promedio de un sacarido en el presente documento se refiere al peso molecular promedio en peso (Mw) del sacarido medido antes de la conjugacion y se mide por medio de MALLS. La tecnica de MALLS es muy conocida en la tecnica y se suele llevar a 5 cabo como se describe en el ejemplo 2. Para los analisis por MALLS de sacaridos, se pueden usar dos columnas (TSKG6000 y 5000PWxl) en combinacion y los sacaridos se eluyen en agua. Los sacaridos se detectan usando un detector de dispersion de luz (por ejemplo, Wyatt Dawn DSP equipado con un laser de argon de 10 mW a 488 nm) y un refractometro inferometrico (por ejemplo Wyatt Otilab DSP equipado con una celula P100 y un filtro rojo a 498 nm). En una realizacion, la polidispersidad del sacarido es de 1-1,5, 1-1,3, 1-1,2, 1-1,1 o 1-1,05 y despues de la 10 conjugacion a una protema vehnculo, la polidispersidad del conjugado es de 1,0-2,5, 1,0-2,0, 1,0-1,5, 1,0-1,2, 1,5-2,5, 1,7-2,2 o 1,5-2,0. Todas las mediciones de polidispersidad se realizan por MALLS.

El sacarido puede ser o bien un polisacarido nativo o pueden haber sido clasificado por tamano por un factor de no mas de 2, 4, 6, 8, 10 o 20 veces (por ejemplo, por microfluidizacion [por ejemplo, por medio del aparato Emulsiflex C-50] u otra tecnica conocida [por ejemplo por procedimientos de calor, qrnmicos, de oxidacion, de someter a 15 ultrasonidos]). Los oligosacaridos pueden haber sido clasificados por tamano considerablemente mas [por ejemplo, por procedimientos conocidos de calor, qrnmicos o de oxidacion].

Se conocen las estructuras de la mayona de estos sacaridos (y por lo tanto, si tienen naturalmente cualquier grupo amino o carboxilo para la qrnmica de la carbodiimida, o cualquier otro grupo reactivo que pueda ser derivado con grupos amino o carboxilo (vease la tabla a continuacion).

: Grupo NH2 natural Grupo COOH natural Otro grupo reactivo

S. aureus

PS5: No Si OH

PS8: No Si OH

N. meningitidis

MenA: No No OH

MenC: No Si OH

MenW135: No Si OH

MenY: No Si OH

MenB: No (se puede generar por des-N-acetilacion) Si OH / N-propilo

Grupo B de Streptococcus

la, lb: No Si OH

II: No Si OH

Ill: No Si OH

IV: No Si OH

V: No Si OH

VI: No Si OH

VII: No Si OH

S. typhi

Vi: No Si No

S. pneumoniae

PS1: Si Si OH

PS3, 4, 5, 8, 9, 12F: No Si OH

Vibrio cholerae

Sacarido capsular: Si No OH

Hib de H. influenzae B: No No OH

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El sacarido puede ser un lipooligosacarido o lipopolisacarido bacteriano (vease la tabla anterior), por ejemplo procedente de una bacteria seleccionada de una lista que consiste en: Neisseria meningitidis, H. influenzae, E. coli, Salmonella o M. catarrhalis. El LOS puede ser de meningoco, del inmunotipo L2, L3 o L10. Se puede destoxificar por tratamiento alcalino de su resto ftpidos A.

En una realizacion, el sacarido capsular MenA, esta al menos parcialmente O-acetilado de modo que al menos el 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o 98 % de las unidades de repeticion estan O-acetiladas en al menos una posicion. La O-acetilacion esta presente por ejemplo al menos en la posicion O-3 de al menos el 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o 98 % de las unidades de repeticion. En una realizacion, el sacarido capsular MenC, esta al menos parcialmente O-acetilado de modo que al menos el 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o 98 % de las unidades de repeticion NeuNAc unidas por (a2 ^-9) estan O-acetiladas en al menos una o dos posiciones. La O-acetilacion esta presente por ejemplo en la posicion O-7 y/o en O-8 de al menos un 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o 98 % de las unidades de repeticion. En una realizacion, el sacarido capsular MenW, esta al menos parcialmente O-acetilado de modo que al menos el 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o 98 % de las unidades de repeticion estan O-acetiladas en al menos una o dos posiciones. La O-acetilacion esta presente por ejemplo en la posicion O-7 o en O-9 de al menos un 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o 98 % de las unidades de repeticion. En una realizacion, el sacarido capsular MenY, esta al menos parcialmente O- acetilado de modo que al menos el 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o 98 % de las unidades de repeticion estan O-acetiladas en al menos una o dos posiciones. La O-acetilacion esta presente en la posicion 7 y/o 9 de al menos el 20 %, 30 %, 40 %, 50 %. 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o 98 % de las unidades de repeticion. El porcentaje de O-acetilacion se refiere al porcentaje de unidades de repeticion que contienen O-acetilacion. Esto puede medirse en el sacarido antes de la conjugacion y/o despues de la conjugacion.

La protema vehmulo puede ser cualquier peptido o protema. Puede comprender uno o mas epftopos de linfocitos T ayudantes. En una realizacion de la invencion, la protema vehmulo se selecciona del grupo que consiste en: TT, DT, CRM197, fragmento C de TT, protema D de H. influenzae, PhtD del neumococo, y neumolisina del neumococo. Una protema vehmulo puede ser el toxoide del tetanos (TT), el fragmento C del toxoide del tetanos, mutantes no toxicos del a toxina del tetanos [notese que todas esas variantes de TT son consideradas el mismo tipo de protema vehftculo a los efectos de la presente invencion], el toxoide de la difteria (DT), CRM 191, otros mutantes no toxicos de la toxina de la difteria [tales como CRM 176, CRM 197, CRM 228, CrM 45 (Uchida y col. J. Biol. Chem. 218; 38383844, 1973); CRM 9, CRM 45, CRM 102, CRM 103 y CRM 107 y otras mutaciones descritas por Nicholls y Youle en Genetically Engineered Toxins, Ed: Frankel, Maecel Dekker Inc, 1992; deleciones o mutaciones de la Glu-148 a Asp, Gln o Ser y/o Ala 158 a Gly y otras mutaciones dadas a conocer en el documento US 4709017 o US 4950740; la mutacion de al menos uno o mas residuos de Lys 516, Lys 526, Phe 530 y/o Lys 534 y otras mutaciones dadas a conocer en el documento US 5917017 o US 6455673; o un fragmento dado a conocer en el documento US 5843711] (notese que todas esas variantes de DT son consideradas el mismo tipo de protema vehftculo a los efectos de la presente invencion), la neumolisina de neumococo (Kuo y col. (1995) Infect Immun 63; 2706-2713), la OMPC (protema de la membrana externa de meningococo - normalmente extrafda del serogrupo B de N. meningitidis - documento EP 0372501), peptidos sinteticos (documentos EP 0378881, EP 0427347), protemas de choque termico (documentos WO 93/17712, WO 94/03208), protemas de pertussis (documentos WO 98/58668, EP 0471177), citocinas, linfocinas, factores de crecimiento u hormonas (documento WO 91/01146), protemas artificiales que comprenden multiples epftopos de celulas T CD4+ humanas procedentes de antfgenos derivados de diversos patogenos (Falugi y col. (2001) Eur J Immunol 31; 3816-3824) tales como la protema N19 (Baraldoi y col. (2004) Infect Immun 72; 4884-4887), la protema superficial de neumococo PspA (documento WO 02/091998), protemas de captacion de hierro (documento Wo 01/72337), toxina A o B de C. difficile (documento WO 00/61761), protema D de H. influenzae (documentos EP 594610 y WO 00/56360), PhtA del neumococo (WO 98/18930, tambien denominada Sp36), PhtD del neumococo (dada a conocer en el documento WO 00/37105, y tambien se denomina Sp036D), PhtB del neumococo (dada a conocer en el documento WO 00/37105, y tambien se denomina Sp036B) o PhtE (dada a conocer en el documento WO 00/30299 y se denomina BVH-3).

En un aspecto adicional divulgado se proporciona un conjugado de sacarido y protema vehftculo (o una composicion inmunogenica o vacuna) obtenido o que puede obtenerse por el procedimiento de la invencion.

Ademas se proporciona un uso de la composicion inmunogenica o vacuna desveladas en la fabricacion de un medicamento para la prevencion o el tratamiento de enfermedades y un procedimiento para prevenir o tratar la enfermedad que comprende la etapa de administrar una dosis eficaz de la composicion inmunogenica o vacuna de la invencion a un paciente que necesita la misma. El uso o el procedimiento pueden ser tales que la enfermedad este causada por una bacteria seleccionada de una lista que consiste en: Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, M. catarrhalis, Grupo B de Streptococcus, Staphylococcus aureus, Salmonella typhi, Vibrio cholerae, E. coli y H. influenzae.

Las composiciones inmunogenicas desveladas tambien pueden comprender una vacuna DTPa o DTPw (por ejemplo una que contiene DT, TT y una vacuna de celulas completas de pertussis (Pw) o una vacuna acelular de pertussis (Pa) (que comprende por ejemplo toxoide de pertussis, FHA, pertactina y, opcionalmente, aglutinogenos 2 y 3). Tales combinaciones tambien pueden comprender una vacuna contra la hepatitis B (por ejemplo puede comprender antfgeno de superficie de la hepatitis b [HepB], opcionalmente adsorbido en fosfato de aluminio). En una realizacion, la composicion inmunogenica de la invencion comprende conjugados de sacaridos Hib, MenA y MenC, conjugados

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de sacaridos Hib y MenC, o conjugados de sacaridos Hib, MenC y MenY, o conjugados de sacaridos MenA, MenC, MenW y MenY, en la que al menos uno, dos o todos los conjugados de sacaridos se generan segun el procedimiento desvelado.

Las composiciones inmunogenicas desveladas comprenden opcionalmente antigenos vmcos adicionales que confieren proteccion contra la enfermedad causada por el sarampion, las paperas y/o la rubeola y/o la varicela. Por ejemplo, la composicion inmunogenica de la invencion contiene antigenos de sarampion, paperas y rubeola (MMR) o de sarampion, paperas, rubeola y varicela (MMRV). En una realizacion, estos antigenos virales estan presentes de manera opcional en el mismo recipiente que el conjugado o conjugados de sacaridos de meningoco y/o Hib presentes en la composicion. En una realizacion, estos antfgenos vmcos estan liofilizados.

La composicion inmunogenica desvelada comprende ademas un antfgeno de N. meningitidis serogrupo B. El antfgeno es opcionalmente una preparacion de vesmulas de membrana externa de N. meningitidis serogrupo b como se describe en los documentos EP301992, WO 01/09350, WO 04/14417, WO 04/14418 y WO 04/14419.

En general, la composicion inmunogenica de la invencion puede comprender una dosis de cada conjugado de sacarido de entre 0,1 y 20 |jg, 2 y 10 |jg, 2 y 6 |jg o 4 y 7 |jg de sacarido.

“En torno” o “aproximadamente” se definen como dentro del 10 % superior o inferior de la cifra dada, para los efectos de la invencion.

En una realizacion, la composicion inmunogenica se ajusta o se tampona a, o se ajusta a entre pH 7,0 y 8,0, pH 7,2 y 7,6 o aproximada o exactamente a pH 7,4.

La composicion inmunogenica o vacunas opcionalmente se liofilizan en presencia de un agente estabilizante por ejemplo un poliol tal como sacarosa o trehalosa.

Opcionalmente, la composicion inmunogenica o vacuna contiene una cantidad de un adyuvante suficiente para potenciar la respuesta inmunitaria al inmunogeno. Los adyuvantes adecuados incluyen, pero no estan limitados a, sales de aluminio (fosfatos de aluminio o hidroxido de aluminio), mezclas de escualeno (SAF-1), peptido de muramilo, derivados de saponina, preparaciones de la pared celular de micobacterias, monofosforil lfpido A, derivados del acido micolico, tensioactivos de copolfmeros en bloque no ionicos, Quil A, subunidad B de la toxina del colera, polifosfaceno y derivados, y complejos inmunoestimuladores (ISCOM) tales como los descritos por Takahashi y col. (1990) Nature 344: 873-875.

Para combinaciones de N. meningitidis o de HibMen, puede ser ventajoso no utilizar ningun adyuvante de sal de aluminio o ningun adyuvante en general.

Como ocurre con todas las composiciones inmunogenica o vacunas, las cantidades inmunologicamente eficaces de los inmunogenos se deben determinar empmcamente. Los factores a considerar incluyen la inmunogenicidad, si el inmunogeno se complejara, o se unira covalentemente a un adyuvante o protema vehmulo u otro vehmulo, o no, la via de administracion y el numero de dosificaciones inmunizadoras a administrar.

El agente activo puede estar presente en concentraciones variables en la composicion farmaceutica o vacuna de la invencion. Normalmente, la concentracion minima de la sustancia es una cantidad necesaria para conseguir su uso previsto, mientras que la concentracion maxima es la cantidad maxima que permanecera en solucion o suspendida de manera homogenea dentro de la mezcla inicial. Por ejemplo, la cantidad minima de un agente terapeutico es opcionalmente una que proporcionara una unica dosificacion terapeuticamente eficaz. Para sustancias bioactivas, la concentracion minima es una cantidad necesaria para la bioactividad tras la reconstitucion y la concentracion maxima se encuentra en el punto en el que no se puede mantener una suspension homogenea. En el caso de unidades de monodosis, la cantidad es la de una sola aplicacion terapeutica. Generalmente, se espera que cada dosis comprenda 1-100 |jg de antfgeno de protema, opcionalmente 5-50 |jg o 5-25 |jg. Por ejemplo, las dosis de sacaridos bacterianos son de 10-20 jig, 10-5 jig, 2,5-5 jig o 1-2,5 jig de sacarido en el conjugado.

Las preparaciones de vacuna de la presente invencion se pueden usar para proteger o tratar a un mairnfero (por ejemplo, un paciente humano) susceptible de infeccion, por medio de la administracion de dicha vacuna a traves de una via sistemica o de mucosa. Un paciente humano es opcionalmente un bebe (menor de 12 meses de edad), un nino pequeno (de 12-24, 12-16 o 12-14 meses de edad), un nino (de 2-10, de 3-8 o de 3-5 anos de edad), un adolescente (de 12-21, de 14-20 o de 15-19 anos de edad) o un adulto. Estas administraciones pueden incluir la inyeccion a traves de las vfas intramuscular, intraperitoneal, intradermica o subcutanea; o mediante administracion por una via de mucosa en los tractos oral/alimentario, respiratorio, genitourinario. Resulta de preferencia la administracion por via intranasal de vacunas para el tratamiento de neumoma u otitis media (puesto que se puede prevenir mas eficazmente el transporte nasofarmgeo de neumococos, atenuando asf la infeccion en su fase mas temprana). Aunque la vacuna de la invencion se puede administrar en forma de dosificacion unica, sus componentes tambien se pueden coadministrar juntos al mismo tiempo o en momentos diferentes (por ejemplo, si los sacaridos estan presentes en una vacuna, estos se pueden administrar por separado al mismo tiempo o 1-2 semanas despues de la administracion de una vacuna de protemas bacterianas para la coordinacion optima de las respuestas inmunitarias entre sf). Ademas de una sola via de administracion, se pueden usar dos vfas de administracion

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diferentes. Por ejemplo, los antigenos virales se pueden administrar ID (por v^a intradermica), mientras que las protemas bacterianas se pueden administrar IM (por via intramuscular) o IN (por via intranasal). Si estan presentes los sacaridos, se pueden administrar IM (o ID) y las protemas bacterianas se pueden administrar IN (o ID). Ademas, las vacunas de la invencion se pueden administrar IM para primeras dosis e IN para dosis de refuerzo.

La preparacion de vacuna se describe de manera general en Vaccine Design (“The subunit and adjuvant approach” (eds. Powell M.F. y Newman M.J.) (1995) Plenum Press Nueva York). El encapsulamiento dentro de liposomas esta descrito por Fullerton, Patente de EE.UU. N.° 4.235.877.

Un aspecto de la invencion es un procedimiento para generar la composicion inmunogenica o vacuna de la invencion, que comprende la etapa de mezclar los sacaridos MenA y MenC de la invencion producidos por el procedimiento de la invencion, con MenW y MenY que no se han producido segun la invencion, y con un excipiente farmaceuticamente aceptable.

La invencion se ilustra en los ejemplos acompanantes. Los ejemplos siguientes se llevaron a cabo usando tecnicas habituales, que son muy conocidas y rutinarias para los expertos en la materia, excepto cuando se describa en detalle de otra manera. Los ejemplos son ilustrativos, pero no limitan la invencion.

Ejemplos

Ejemplo 1 - Preparacion de conjugados de polisacaridos

Ejemplo 1a - Preparacion de conjugado de polisacarido capsular de meningococo MenA y MenC de acuerdo con la invencion

Los conjugados MenC-TT se produjeron usando polisacaridos nativos (de mas de 150 kDa segun la medicion por medio de MALLS) o se microfluidizaron ligeramente. Los conjugados MenA-TT se produjeron usando polisacarido nativo o polisacarido ligeramente microfluidizado de mas de 60 kDa segun la medicion por medio del procedimiento MALLS del ejemplo 2. La clasificacion por tamanos fue por microfluidizacion usando un aparato homogenizador Emulsiflex C-50. A continuacion los polisacaridos se filtraron a traves de un filtro de 0,2 pm.

Para conjugar el polisacarido capsular MenA al toxoide del tetanos a traves de un espaciador, se uso el siguiente procedimiento. La union covalente del polisacarido y el espaciador (ADH) se llevo a cabo mediante qmmica de acoplamiento por la que el polisacarido se activa en condiciones controladas mediante un agente cianilante, tetrafluoroborato de 1-ciano-4-dimetilamino piridinio (CDAP). El espaciador reacciona con el PS cianilado a traves de los grupos hidrazino, para formar un enlace isourea estable entre el espaciador y el polisacarido.

Se trato una solucion de 10 mg/ml de MenA (pH 6,0) [3,5 g] con una solucion de 100 mg/ml recien preparada de CDAP en acetonitrilo/agua (50/50 (v/v)) para obtener una relacion CDAP/MenA de 0,75 (p/p). Despues de 1,5 minutos, el pH se incremento hasta pH 10,0. Tres minutos mas tarde, se anadio ADH para obtener una relacion de ADH/MenA de 8,9. El pH de la solucion se redujo hasta 8,75 y la reaccion prosiguio durante 2 horas manteniendo este pH (manteniendo la temperatura en 25 °C).

La solucion PSAah se concentro hasta un cuarto de su volumen inicial y a continuacion se diafiltro con 30 volumenes de NaCl 0,2 M usando una membrana Filtron Omega con un lfmite de filtracion de 10 kDa, y se filtro el retenido.

Antes de la reaccion de conjugacion (condensacion de la carbodiimida), la solucion de TT purificada y la solucion de PSAah se diluyeron hasta alcanzar una concentracion de 10 mg/ml para el PSAah y 10 mg/ml para la Tt.

Se anadio EDAC (1-etil-3-(3-dimetil-aminopropil) carbodiimida) a la solucion de PSah (2 g de sacarido) para alcanzar una relacion final de 0,9 mg de EDAC/mg de PSAah. El pH se ajusto a 5,0. El toxoide del tetanos purificado se anadio con una bomba peristaltica (en 60 minutos) hasta alcanzar los 2 mg de TT/mg de PSAah. La solucion resultante se dejo 60 minutos a 25 °C en agitacion para obtener un periodo de acoplamiento final de 120 minutos. La solucion se neutralizo anadiendo Tris-HCl 1 M pH 7,5 (1/10 del volumen final) y se dejo 30 minutos a +25 °C y a continuacion durante la noche a una temperatura de +2 °C a +8 °C.

El conjugado se clarifico usando un filtro de 10 pm y se purifico usando una columna de Sephacryl S400HR (Pharmacia, Suecia). La columna se equilibro en Tris-HCl 10 mM (pH 7,0), NaCl 0,075 M y el conjugado (aproximadamente 660 ml) se cargo en la columna (+2 °C a + 8 °C). La combinacion de elucion se selecciono en funcion de la densidad optica a 280 nm. La recogida comenzo cuando la absorbancia aumento hasta 0,05. La recogida continuo hasta que Kd alcanzo el valor 0,30. El conjugado se esterilizo por filtracion a +20 °C, a continuacion se almaceno a una temperatura de +2 °C a +8 °C. El conjugado resultante tema una relacion de polisacarido:protema de 1:2-1:4 (p/p).

Para conjugar el polisacarido capsular MenC al toxoide tetanico a traves de un espaciador, se utilizo el siguiente procedimiento. La union covalente del polisacarido y el separador (ADH) se llevo a cabo por una qmmica de acoplamiento por la que se activo el polisacarido bajo condiciones controladas por medio de un agente de cianilacion, tetrafluoroborato de 1-ciano-4-dimetilamino-piridinio (CDAP). El espaciador reacciono con el PS cianilado

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a traves de sus grupos hidrazino, formando un enlace de isourea estable entre el espaciador y el polisacarido.

Se trato una solucion de 20 mg/ml de MenC (pH 6,0) (3,5 g) con una solucion recien preparada de 100 mg/ml de CDAP en acetonitrilo/agua (50/50 (v/v)) para obtener una relacion de CDAP/MenC de 1,5 (p/p). Despues de 1,5 minutos, el pH se elevo hasta pH 10,0. En el pH de activacion se anadio NaCl 5 M hasta lograr una concentracion final de NaCl 2 M. Tres minutos mas tarde, se anadio ADH para obtener una relacion de ADH/MenC de 8,9. El pH de la solucion se redujo hasta 8,75 y la reaccion prosiguio durante 2 horas (mantenida a 25 °C).

La solucion de PSCah se concentro hasta un mmimo de 150 ml y, a continuacion, se diafiltro con 30 volumenes de NaCl 0,2 M utilizando una membrana Filtron Omega con un lfmite de filtracion de 10 kDa y se filtro el retenido.

Antes de la reaccion de conjugacion, se diluyo la solucion purificada de TT y la solucion PSCAH (escala de 2 g) en NaCl 0,2 M para llegar a una concentracion de 15 mg/ml para PSCah y de 20 mg/ml para TT.

Se anadio el toxoide tetanico purificado a la solucion de PSCah para llegar a 2 mg de TT/mg de PSCah. El pH se ajusto a 5,0. Se anadio EDAC (16,7 mg/ml en Tris 0,1 M, pH 7,5) con una bomba peristaltica (en 10 minutos) hasta llegar a una relacion final de 0,5 mg de EDAC/mg de PSCah. La solucion resultante se dejo durante 110 minutos a + 25 °C con agitacion y regulacion del pH para obtener un tiempo de acoplamiento final de 120 minutos. A continuacion se neutralizo la solucion por la adicion de Tris-HCl 1 M, pH 9,0 (1/10 del volumen final) y se dejo 30 minutos a + 25 °C y durante la noche a una temperatura de + 2 °C a + 8 °C. El conjugado se clarifico usando un filtro de 10 pm y se purifico usando una columna de Sephacryl S400HR (Pharmacia, Suecia). La columna se equilibro en Tris-HCl 10 mM (pH 7.0), NaCl 0,075 M y el conjugado (aproximadamente 460 ml) se cargo en la columna (+2 °C a + 8 °C). La combinacion de elucion se selecciono en funcion de la densidad optica a 280 nm. La recogida comenzo cuando la absorbancia aumento hasta 0,05. La recogida continuo hasta que Kd alcanzo el valor 0,20. El conjugado se esterilizo por filtracion a +20 °C, a continuacion se almaceno a una temperatura de +2 °C a +8 °C. El conjugado resultante tema una relacion de polisacarido:protema de 1:2-1:4 (p/p)

Se realizaron diversos experimentos anadiendo EDAC durante 10-45 minutos - en todos los casos el resultado fueron conjugados de MenC de buena calidad. Sin embargo, si se anadfa el vehfculo de TT ultimo y lentamente a la mezcla de MenC-ADH + EDAC se obtema un gel - un conjugado que no podfa ser purificado.

Tambien se realizaron experimentos anadiendo la EDAC toda a la vez en la reaccion pero la relacion final de TT/PS (2,7/1) (p/p) del conjugado fue inferior a la del conjugado obtenido a traves de la reaccion en la que la EDAC se anadio durante 10 minutos (3,3/1); ademas, tanto la antigenicidad de aTT como la de aPS fue inferior a la medida en comparacion con el conjugado obtenido por la reaccion en la que la EDAC se anadio durante 10 minutos.

Nota sobre el % aproximado de derivatizacion de los polisacaridos

MenCAH: tras el tratamiento con CDAP y con ADH aproximadamente el 3,47 % de los grupos hidroxilo fueron derivados con ADH (con una estimacion de dos grupos hidroxilo disponibles por subunidad de repeticion). Para MenA: aproximadamente el 11,5 % de los grupos hidroxilo fueron derivados con ADH (considerando que solo hay un grupo hidroxilo disponible por unidad de repeticion).

Ejemplo 1b - preparacion del conjugado de polisacarido capsular de neumococo PS 3 1) Procedimiento de PS03-TTah: PS03-TTah208 Clasificacion por tamanos por medio de Emulsiflex

Se peso el PS sobre la base de un contenido de humedad teorico del 10 %. Se disolvio el PS nativo durante la noche en NaCl 2 M a una concentracion inicial de 3 mg/ml. Antes de la clasificacion por tamano, se clarifico la solucion de PS nativo en un filtro con lfmite de filtracion de 5 pm.

Se utilizo un aparato homogenizador EMULSIFLEX C-50 para reducir el peso molecular y la viscosidad del polisacarido antes de la etapa de activacion. La eficiencia de la clasificacion por tamanos depende de la presion del circuito, la presion de alimentacion del embolo y del numero total de ciclos. A fin de mejorar la eficiencia de la clasificacion por tamanos (y por consiguiente reducir el numero total de ciclos), se sustituyo la celda de homogenizacion del Emulsiflex con una celda con una geometna fijada (Microfluidics F20Y- camara de interaccion de 0,75 pm). El objetivo de la clasificacion por tamanos era reducir el peso molecular y la viscosidad del PS sin una disminucion importante de su antigenicidad.

La reduccion de tamano se realizo a 408 ± 34 atm (6000 ± 500 psi) y se hizo el seguimiento intra procedimiento por medio de la medicion de la viscosidad. La clasificacion por tamanos se detuvo cuando se alcanzo el objetivo de 2,0 ± 0,2 cP.

Filtracion del PS clasificado por tamano en 0,22 pm

El PS clasificado por tamano se filtro en una membrana Millipak (lfmite de filtracion de 0,22 mm) a un caudal de 10 ml/min.

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Derivatizacion de TT

La etapa de derivatizacion se realizo a 25 °C bajo agitacion continua en un bano de agua de temperatura controlada. El TT se diluyo en NaCl 0,2 M para obtener una concentracion final de TT de 25 mg/ml. Se anadio la ADH en forma solida a la solucion de TT hasta llegar a una concentracion final de 0,2 M. Despues de la solucion completa de ADH, se ajusto el pH de la solucion en pH 6,2 +/- 0,1 con HCl.

A continuacion, se anadio EDAC a la solucion de TT/ADH para llegar a una concentracion final de 0,02 M. El pH se ajusto en 6,2 +/- 0,1 con HCl y se mantuvo bajo regulacion del pH durante 1 hora.

Despues de la etapa de derivatizacion, el pH se elevo hasta pH 9,5 con NaOH para detener la reaccion. La solucion se dejo durante 2 horas bajo regulacion de pH antes de la etapa de diafiltracion.

Diafiltracion

El derivado TTah se diafiltro para eliminar la ADH sin reaccionar y los subproductos de EDAC. La diafiltracion se realizo en una membrana Centramate (0,09 m2, lfmite de filtracion de 10 kDa). La solucion se dializo contra 20 volumenes de NaCl 0,2 M.

El seguimiento de la etapa de diafiltracion se realizo por medio de una cuantificacion de ADH (ensayo TNBS) en el permeado despues de 5, 10, 15 y 20 volumenes de diafiltracion.

Filtracion en 0,22 pm

El TTah finalmente se filtro en la membrana de lfmite de filtracion de 0,22 pm (Millipack 40) a un caudal de 10 ml/min. A continuacion el TTah filtrado se almaceno a -70 °C.

Conjugado de PS3-TTah

Las condiciones del procedimiento fueron las siguientes:

Una concentracion inicial de PS3 de 2 mg/ml en NaCl 2 M, una relacion inicial de TTah/PS3 de 1,5/1 (p/p), una concentracion de EDAC de 0,5 mg/mg PS y una concentracion de TT de 10 mg/ml en NaCl 0,15 M.

Se diluyeron 50 mg de PS3 en NaCl 2 M para obtener una concentracion final de PS de 2 mg/ml. La solucion purificada de TTah se diluyo en NaCl 0,2 M hasta llegar a una concentracion de 10 mg/ml. Se ajusto el pH de la solucion de PS3 a pH 5 con HCl.

Se anadio la EDAC en forma solida a la solucion de PS3 para llegar a una concentracion final de 0,5 mg de EDAC/mg de PS. El pH se ajusto a 5,0 ± 0,05 con HCl y se anadio TTah manualmente en 11 minutos (alfcuotas/min). La solucion resultante se incubo durante 109 minutos a + 25 °C con agitacion y regulacion del pH para obtener un tiempo de acoplamiento final de 120 minutos. A continuacion, se neutralizo la solucion por medio de la adicion de Tris-HCl 1 M, pH 7,5 y se dejo 30 minutos a + 25 °C. Finalmente se clarifico el conjugado en una membrana de 5 pm y se inyecto en una columna de Sephacryl S400HR.

2) Procedimiento de PS03-TTah : PS03ah-TT215

Clasificacion por tamanos por de Emulsiflex

Como anteriormente.

Filtracion del PS clasificado por tamano en 0,22 pm

Como anteriormente.

Derivatizacion de PS3

La etapa de derivatizacion se realizo a 25 °C bajo agitacion continua en un bano de agua de temperatura controlada. Se diluyo el PS3 en NaCl 2 M para obtener una concentracion final de PS de 3 mg/ml. La solucion de PS se ajusto a pH 6,0 antes de la adicion de CDAP (PS 0,25 mg/mg, solucion a 100 mg/ml de una mezcla de acetonitrilo/WFI). El pH se aumento a pH 9,5 con NaOH antes de la adicion de ADH (8,9 mg de ADH/mg PS, solucion a 100 mg/ml en NaCl 0,2 M). El pH se mantuvo en 9,5 y se regulo durante 60 minutos. El porcentaje de derivatizacion correspondio al 2,4 % (2,4 mg de ADH/100 mg de PS). Esto puede medirse con tecnicas conocidas: TNBS para la estimacion de ADH; y DMAB o resorcinol (Monsigny y col., (1988) Anal. Biochem. 175, 525-530) para la cuantificacion de PS. En este caso, la determinacion de TNBS fue de 228 pg/ml y PS: 5250 pg/ml.

Dado que el Mw de ADH es de 174,2 y el Mw de la unidad de repeticion de PS3 es 338,27 (con 1 grupo COOH y 4 grupos OH), hay 1,3 pmoles de ADH / 15,52 pmoles de unidad de repeticion, o 1,3 pmoles de ADH / 62,08 pmoles de grupo reactivo hidroxilo. El 2,09 % de los grupos hidroxilo de PS3 eran grupos hidroxilo derivados con ADH.

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Diafiltracion

El derivado PS3ah se diafiltro para eliminar la ADH sin reaccionar y los subproductos de CDAP. La diafiltracion se realizo en una membrana UFP-30-C-H24LA (42 cm2, Kmite de filtracion de 30 kDa). La solucion se dializo contra 20 volumenes de NaCl 0,2 M.

Filtracion en 0,22 pm

El PSah finalmente se filtro en la membrana de lfmite de filtracion 0,22 pm (Millipack 40) a un caudal de 10 ml/min. A continuacion, el PS3ah filtrado se almaceno a 4 °C.

Conjugado PS3ah-TT

Las condiciones del procedimiento fueron las siguientes:

Una concentracion inicial de PS3 de 2 mg/ml en NaCl 2 M, una relacion inicial de TT/PS3ah de 1,5/1 (p/p), una concentracion de EDAC de 0,5 mg/mg de PS y una concentracion de TT de 10 mg/ml en NaCl 0,15 M.

Se diluyeron 50 mg de PS3ah en NaCl 0,2 M para obtener una concentracion final de PS de 2 mg/ml. La solucion de TT purificada se diluyo en NaCl 0,2 M hasta llegar a una concentracion de 10 mg/ml.

Se ajusto el pH de la solucion de PS3ah a pH 5 con HCl.

Se anadio la EDAC en forma solida a la solucion de PS3ah para llegar a una concentracion final de 0,5 mg de EDAC/mg de PS. El pH se ajusto a 5,0 ± 0,05 con HCl y se anadio la TT en 10 minutos usando una bomba peristaltica. La solucion resultante se incubo durante 110 minutos a + 25 °C con agitacion y regulacion del pH para obtener un tiempo de acoplamiento final de 120 minutos. A continuacion, se neutralizo la solucion por medio de la adicion de Tris-HCl 1 M, pH 7,5 y se dejo 30 minutos a + 25 °C. Finalmente se clarifico el conjugado en una membrana de 5 pm y se inyecto en una columna de Sephacryl S400HR.

3) Procedimiento de PS03ah-TT: PS3ah-TT217

Clasificacion por tamanos por de Emulsiflex

Como anteriormente.

Filtracion del PS clasificado por tamano en 0,22 pm

Como anteriormente.

Derivatizacion de PS3 Como para el conjugado 215.

Diafiltracion

Como para el conjugado 215.

Filtracion en 0,22 pm Como para el conjugado 215.

Conjugado PS3ah-TT

Las condiciones del procedimiento fueron las siguientes:

Se mezclaron las disoluciones de PS3ah y TT y se ajusto el pH a 5 con HCl.

Se disolvio la EDAC en un tampon Tris 1 M, pH 7,5. Se anadieron 40 pl de EDAC cada minuto (10 minutos para llegar a la relacion de EDAC/PS (0,5 mg de EDAC/mg de PS)). La solucion resultante se incubo durante 110 minutos a + 25 °C bajo agitacion y regulacion del pH para obtener un tiempo de acoplamiento final de 120 minutos. A continuacion, se neutralizo la solucion por medio de la adicion de Tris-HCl 1 M, pH 7,5 y se dejo 30 minutos a + 25

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°C. Finalmente, se clarifico el conjugado en una membrana de 5 pm y se inyecto en una columna de Sephacryl S400HR.

4) Procedimiento de PS03ah-TT: PS3ah-TT218 Clasificacion por tamanos por Emulsiflex

Como anteriormente.

Filtracion del PS clasificado por tamano en 0,22 pm

Como anteriormente.

Derivatizacion de PS3

La etapa de derivatizacion se realizo a 25 °C bajo agitacion continua en un bano de agua de temperature controlada. Se diluyo el PS3 en NaCl 2 M para obtener una concentracion final de PS de 3 mg/ml. Se anadio la EDAC en forma solida hasta llegar a una relacion de EDAC/PS de 0,1 mg/mg de PS. Tras completarse la solucion, se ajusto el pH de la solucion a 5. A continuacion se anadio ADH (8,9 mg de ADH/mg PS, solucion a 100 mg/ml en NaCl 0,2 M) usando una bomba peristaltica en 44 minutos (aunque de ese modo estaba presente un exceso de ADH, la adicion directa tambien habna sido aceptable). El pH se mantuvo en 5,0 +/- 0,1 y se regulo durante 120 minutos (44' + 76'). La reaccion se detuvo al aumentar el pH hasta 7,5 usando hidroxido de sodio. El porcentaje de derivatizacion correspondio al 3,7 % (mg de ADH/mg de PS). La determinacion de TNBS fue de 220 pg/ml y la determinacion de PS fue de 5902 pg/ml, por consiguiente hay 1,26 pmoles de ADH / 17,44 pmoles de unidad de repeticion (= pmoles de grupos reactivos COOH). Por consiguiente, el 7,22 % de los grupos carboxilo de PS3 eran grupos COOH modificados con ADH.

Diafiltracion

El derivado PS3ah se diafiltro para eliminar la ADH sin reaccionar y los subproductos de EDAC. La diafiltracion se realizo en una membrana UFP-30-C-H24LA (42 cm2, lfmite de filtracion de 30 kDa). La solucion se dializo contra 23 volumenes de NaCl 0,2 M

Filtracion en 0,22 pm

Conjugado PS3ah-TT

Las condiciones del procedimiento fueron las siguientes:

Una concentracion inicial de PS3ah de 2 mg/ml en NaCl 2 M, una relacion inicial de TT/PS3ah de 1,5/1 (p/p), una concentracion de EDAC de 0,5 mg/mg de PS y una concentracion de TT de 10 mg/ml en NaCl 0,15 M.

Se mezclaron juntas las disoluciones de PS3ah y TT.

Se ajusto el pH a 5,0 ± 0,05 con HCl y se anadio la EDAC manualmente en 10 minutos (se anadieron alfcuotas iguales cada minuto). La solucion resultante se incubo durante 110 minutos a + 25 °C con agitacion y regulacion del pH para obtener un tiempo de acoplamiento final de 120 minutos. A continuacion, se neutralizo la solucion por medio de la adicion de Tris-HCl 1 M, pH 7,5 y se dejo 30 minutos a + 25 °C. Finalmente se clarifico el conjugado en una membrana de 5 pm y se inyecto en una columna de Sephacryl S400HR.

Conclusiones:

Se produjeron diferentes conjugados mediante la qmmica de la carbodiimida en la etapa de conjugacion. El ultimo componente anadido en la solucion de reaccion puede ser la protema TT o el reactivo EDAC. El tiempo de adicion puede tener un efecto sobre los conjugados resultantes.

Conjugados PS3ahTT215 y 217:

Se utilizaron los mismos componentes y las mismas condiciones para preparar ambos conjugados. La forma en que se anadio el ultimo componente fue diferente. El conjugado PS3ahTT217 dio lugar a un producto que cumplio los criterios in vitro. Este se preparo mediante la adicion de EDAC en 10 minutos. El conjugado pS3ahTT215, sin

embargo, no pudo ser filtrado en la membrana esteril. Para este, el ultimo componente anadido en el medio de reaccion fue la TT (en 10 minutos).

Las relaciones finales de TT/PS fueron muy diferentes para ambos conjugados. (0,98/1 frente a 0,50/1). Si se anade EDAC primero al PSah (teniendo ambos grupos reactivos amino y carboxilo), esto puede dar lugar a reticulacion 5 interna de los grupos carboxflico e hidrazina presentes en los polisacaridos, por consiguiente podna dar lugar a un conjugado mas reticulado con una relacion final mas debil tras la adicion de tT en 10 minutos.

Este efecto no se observa para el conjugado PS3ahTT217. La incorporacion de TT funciono mejor mediante la adicion de EDAC en 10 minutos, tal vez debido a la menor reticulacion interna y a la mejor reticulacion entre los grupos de hidrazina del PS3AH y los grupos carboxflico de la protema.

10 En el caso del conjugado 218, como la derivatizacion de PS3 con EDAC solo modifica parcialmente el polisacarido (para mantener la mayona de los epftopos del polisacarido intactos), nuevamente estan presentes ambos grupos reactivos, amino y carboxilo, es por ello que la adicion lenta de EDAC en una etapa final de conjugacion tambien es beneficiosa.

La lenta incorporacion de TT en la etapa final de conjugacion fue beneficiosa (sin embargo) para el conjugado 208 15 en el que la Tt fue derivada por medio de ADH (y comprende grupos amino y carboxilo), mientras que el PS3 se dejo con sus grupos reactivos-OH y -COOH nativos como parte de su subunidad de repeticion. La adicion de EDAC al PS3 no tuvo el efecto de reticulacion anterior, y la lenta incorporacion de la TT derivada dio un conjugado con buenas caractensticas in vitro - vease a continuacion.

Caracterizacion in-vitro:

Conj.: Derivatizacion/Qmmica Conjugacion/Qmmica Adicion del componente final

208: TT/ADH ^ EDAC PS-TTah ^ EDAC TTah anadido en 11 minutos

215: PS3/ ADH ^ CDAP PSah -TT ^ EDAC TT anadido en 10 minutos

217: PS3/ ADH ^ CDAP PSah -TT ^ EDAC EDAC anadido en 10 minutos

218: PS3/ ADH ^ EDAC PSah -TT ^ EDAC EDAC anadido en 10 minutos

20

Conj.: PS [PS] (mg/ml) [TT] (mg/ml) Relacion inicial TT/PS (p/p) [EDAC] (mg/mg de PS) Tiempo de acoplamiento (min)

208: C6302 2,0 10 (TTah), bomba 1,5/1 0,5/1 120

215: 3ah001 (CDAP) 2,0 10 bomba 1,5/1 0,5/1 120

217: 3ah001 (CDAP) 2,0 10 1,5/1 0,5/1 (Fracciones) 120

218: 3ah002 (CDAP) 2,0 10 1,5/1 0,5/1 (Fracciones) 120

Conj.: Relacion final TT/PS (p/p) Rendimiento de PS rec (%) Rendimiento filtrado rec (%) PS libre (%) Antigenicidad aPS/aPS (%) Antigenicidad aTT/aPS (%)

208: 1,84/1 69 95 10,2 99 103 100*

215: 0,50/1 17 27 - - -

217: 0,98/1 66 100 0,7 17 103 100*

218: 0,88/1 74 101 11,0 34 222 216*

* en comparacion con el conjugado 208

Ejemplo 1c - preparacion del conjugado de polisacarido Vi de S. typhi Vi de la invencion Clasificacion por tamanos por Emulsiflex

25 Se peso el PS sobre la base de un contenido de humedad teorico del 15 %. Se disolvio el PS nativo durante la noche en WFI a una concentracion inicial de 7 mg/ml. Antes de la clasificacion por tamano, se clarifico la solucion de PS nativo en un filtro con lfmite de filtracion de 10 pm a un caudal de 50 ml/min.

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La reduccion de tamano se realizo a 103,42 ± 3,44 MPa y se hizo el seguimiento intra procedimiento por medio de la medicion de la viscosidad. La clasificacion por tamanos se detuvo cuando se alcanzo el objetivo de 5,0 ± 0,3 cP.

Filtracion del PS clasificado por tamano en 0,22 pm

El PS clasificado por tamano se filtro en una membrana Millipak 40 (lfmite de filtracion de 0,22 mm) a un caudal de 10 ml/min. El PS clasificado por tamano se almaceno a -20 °C.

Derivatizacion del polisacarido Vi

Se disolvieron 1,5 g de PS Vi clasificado por tamano a 25 °C en EPI bajo agitacion (5 mg/ml). Se anadieron 13,35 g de ADH (8,9 mg de ADH/mg de PS) a la solucion de PS. Despues de la solucion completa, se ajusto el pH a 5,0 ± 0,05 con HCl 1N. Se anadio la EDAC (0,1 mg/mg de PS) en forma solida. La solucion se dejo 60 minutos a 25 °C. A continuacion, se neutralizo la solucion por medio de la adicion de Tris-HCl 1 M, pH 7,5 y se dejo al menos 30 minutos a 25 °C (como maximo 2 horas). Se estimo que el nivel de derivatizacion era del 4,55 % con la determinacion de TNBS (mg de ADH/100 mg de PS). La determinacion de TNBS fue de 200 pg/ml y la determinacion de PS fue de 4034 pg/ml; por consiguiente, 0,0697 pmoles de ADH/16,46 pmoles de unidad de repeticion (Mw 245). 1,3 pmoles de ADH / 16,46 pmoles de grupo reactivo COOH en Vi, por consiguiente el 7 % de los grupos COOH de Vi eran grupos COOH derivados con ADH.

Diafiltracion

El derivado PSViAH se diafiltro para eliminar la ADH sin reaccionar y los subproductos de EDAC. La diafiltracion se realizo en una membrana Centramate (0,09 m2, lfmite de filtracion de 10 kDa). La solucion se dializo contra 20 volumenes de NaCl 0,2 M.

El seguimiento de la etapa de diafiltracion se realizo por medio de una cuantificacion de ADH (ensayo TNBS) en el permeado despues de 3, 5, 10 y 20 volumenes de diafiltracion.

Filtracion en 0,22 pm

El PSViAH finalmente se filtro en la membrana de lfmite de filtracion 0,22 pm (Millipack 40) a un caudal de 10 ml/min. A continuacion, el PSViAH filtrado se almaceno a +2/+8 °C durante un maximo de 4 dfas.

Conjugados PSViAH-TT

Las condiciones del procedimiento fueron las siguientes:

Una concentracion inicial de PSViAH de 2 mg/ml en NaCl 0,2 M, una relacion inicial de TT/PSViAH de 2,5/1 (p/p), una concentracion de EDAC de 0,25 mg/mg de PS y una concentracion de TT de 10 mg/ml en NaCl 0,2 M.

Se diluyo 1 g de PSViAH en NaCl 0,2 M para obtener una concentracion final de PS de 2 mg/ml (determinacion por medio de acido uronico). La solucion de TT purificada se diluyo en NaCl 0,2 M hasta llegar a una concentracion de 10 mg/ml.

Se anadio la TT a la solucion de PSViAH para llegar a una relacion final de 2,5 mg de TT / mg de PS El pH se ajusto a 5,0 ± 0,05 con HCl 1N. La solucion de EDAC (7,5 mg/ml en Tris 0,1 M, pH 7,5) se anadio a continuacion (en 10 minutos con una bomba peristaltica) para llegar a 0,25 mg de EDAC/mg de PSViAH. La solucion resultante se incubo durante 50 minutos a + 25 °C con agitacion y regulacion del pH para obtener un tiempo de acoplamiento final de 60 minutos. A continuacion, se neutralizo la solucion por medio de la adicion de Tris-HCl 1 M, pH 7,5 y se dejo 30 minutos a + 25 °C. El conjugado se transfirio a 4 °C y se dejo durante la noche bajo agitacion continua lenta antes de la etapa de cromatograffa.

Purificacion

Antes a la elucion en Sephacryl S400HR, el conjugado se clarifico por medio de un filtro Kleenpak de 10 pm. El caudal se fijo en 100 ml/min. A continuacion, se inyecto el conjugado en la columna de Sephacryl S400HR y la combinacion de recogida se baso en un valor de Kd. Se utilizo el siguiente criterio para la combinacion de recogida: la recogida se inicio desde una DO = 0,05 a 280 nm y termino cuando Kd = 0,22.

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Esterilizacion por filtracion

Antes de la filtracion, la mayor parte del producto se llevo nuevamente a temperatura ambiente. Posteriormente, el conjugado se filtro en una membrana de esterilizacion Opticap de 10,2 cm. El caudal se fijo en 30 ml/min.

Datos analiticos

El conjugado resultante tema una relacion final de TT/PS (p/p) de 2,44/1, un contenido de PS libre del 3,7 % y una antigenicidad de aPS/aPS del 58 %

Ejemplo 1d - preparacion de otros conjugados de polisacaridos

La union covalente del polisacarido PRP de Haemophilus influenzae (Hib) a TT se llevo a cabo mediante una qmmica de acoplamiento desarrollada por Chu y col. (Infection and Immunity 1983, 40 (1); 245-256). El polisacarido PRP de Hib se activo anadiendo CNBr e incubando a pH 10,5 durante 6 minutos. El pH se redujo hasta pH 8,75 y se anadio la dihidrazida del acido adfpico (ADH) y se prosiguio con la incubacion durante 90 minutos mas. El PRP activado se acoplo al toxoide del tetanos purificado mediante la condensacion con carbodiimida usando 1-etil-3-(3- dimetilaminopropil) carbodiimida (EDAC). La EDAC se anadio al PRP activado hasta alcanzar una relacion final de 0,6 mg de EDAC/mg de PRP activado. El pH se ajusto a 5,0 y se anadio al toxoide del tetanos purificado hasta alcanzar los 2 mg de TT/mg de PRP activado. La solucion resultante se dejo durante tres dfas con agitacion suave. Despues de la filtracion a traves de una membrana de 0,45 pm, el conjugado se purifico sobre una columna de Sephacryl S500HR (Pharmacia, Suecia) equilibrada en NaCl 0,2 M.

Los conjugados MenC-TT se produjeron usando polisacaridos nativos (de mas de 150 kDa segun la medicion por medio de MALLS) o se microfluidizaron ligeramente. Los conjugados MenA-TT se produjeron usando polisacarido nativo o polisacarido ligeramente microfluidizado de mas de 60 kDa segun la medicion por medio del procedimiento MALLS del ejemplo 2. Los conjugados MenW y MenY-TT se produjeron usando polisacaridos clasificados por tamano en torno a 100-200 kDa segun la medicion por medio de MALLS (vease ejemplo 2). La clasificacion por tamanos fue por microfluidizacion usando un aparato homogenizador Emulsiflex C-50. A continuacion los polisacaridos se filtraron a traves de un filtro de 0,2 pm.

La activacion y el acoplamiento directo se llevaron a cabo como se describe en los documentos WO 96/29094 y WO 00/56360. Resumiendo, el polisacarido a una concentracion de 10-20 mg/ml en NaCl 2 M a pH 5,5-6,0 se mezclo con una solucion de CDAP (100 mg/ml recien preparada en acetonitrilo/WFI, 50/50) hasta una relacion final de CDAP/polisacarido de 0,75/1 o 1,5/1. Despues de 1,5 minutos, el pH se incremento con hidroxido de sodio hasta pH 10,0. Despues de tres minutos se anadio el toxoide del tetanos hasta alcanzar una relacion de protema/polisacarido de 1,5/1 para MenW, 1,2/1 para MenY, 1,5/1 para MenA o 1,5/1 para MenC. La reaccion prosiguio durante una a dos horas.

Despues de la etapa de acoplamiento, se anadio glicina hasta una relacion final de glicina/PS (p/p) de 7,5/1 y el pH se ajusto a pH 9,0. La mezcla se dejo durante 30 minutos. El conjugado se clarifico usando un filtro Kleenpak de 10 pm y a continuacion se cargo sobre una columna de Sephacryl S400HR usando un tampon de elucion de NaCl 150 mM o Tris 5 mM a pH 7,5. Los lotes clmicos se filtraron sobre una membrana de esterilizacion Opticap 4. Los conjugados resultantes teman una relacion promedio de polisacarido:protema de 1:1-1:5 (p/p).

Ejemplo 2 - Determinacion del peso molecular usando MALLS

Los detectores se acoplaron a una columna de HPLC de exclusion por tamanos desde la que se eluyeron las muestras. Por una parte, el detector de dispersion de luz laser midio las intensidades luminosas dispersadas en 16 angulos por la solucion macromolecular y por otra parte, un refractometro interferometrico situado en lmea permitio la determinacion de la cantidad de muestra eluida. A partir de estas intensidades, se puede determinar el tamano y la forma de las macromoleculas en solucion.

El peso molecular promedio en peso (Mw) se define como la suma de los pesos de todas las especies multiplicado por sus respectivos pesos moleculares y dividido por la suma de pesos de todas las especies.

a) Peso molecular promedio en peso: -Mw -

imagen1

b) Peso molecular promedio en numero: -M,

In -

M

n

imagen2

5

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35

c) Ra^z cuadrada del radio medio: -Rw- y R2w es el radio al cuadrado definido por:

(r2)w

Hmi

(-mi- es la masa de un centro de dispersion i, y -n- es la distancia entre el centro de dispersion i y el centro de gravedad de la macromolecula).

d) La polidispersidad se define como la relation -Mw/ Mn-.

Los polisacaridos de meningococos se analizaron por MALLS cargando en dos columnas de HPLC (TSKG6000 y 5000PWxl) usadas en combination. Se cargaron 25 ^l de polisacaridos en la columna y se eluyo con 0,75 ml de agua filtrada. Los polisacaridos se detectaron usando un detector de dispersion de luz (Wyatt Dawn DSP equipado con un laser de argon de 10 mW a 488 nm) y un refractometro inferometrico (Wyatt Otilab DSP equipado con una celula P100 y un filtro rojo a 498 nm).

Las polidispersidades de pesos moleculares y las recuperaciones de todas las muestras se calcularon mediante el metodo de Debye usando un ajuste polinomico de orden 1 en el software Astra 4.72.

Ejemplo 3 - Ensayo cllnico para evaluar el efecto de un conector en MenA en una vacuna de conjugado MenACWY

Se administro una unica dosis de diferentes formulaciones de vacuna MenACWY a adolescentes de 15 a 19 anos de edad en 5 grupos de 25 sujetos en una prueba aleatorizada 1:1:1:1:1. Las formulaciones ensayadas fueron:

F1 - MenACWY conjugada con toxoide tetanico conteniendo el conjugado MenA un espaciador de AH (ADH) (preparado segun el ejemplo 1) - 5/5/5/5 ^g

F2 - MenACWY conjugada con toxoide tetanico conteniendo el conjugado MenA un espaciador de AH (preparado segun el ejemplo 1) - 2,5/5/2,5/2,5 ^g

F3 - MenACWY conjugada con toxoide tetanico conteniendo el conjugado MenA un espaciador de AH (preparado segun el ejemplo 1) - 5/5/2,5/2,5 ^g

F4 - MenACWY conjugada con toxoide tetanico sin ningun espaciador en ningun conjugado - 5/5/5/5 ^g grupo de control - ACWY Mencevax™

En el dia 30 despues de la inoculation, se extrajo una muestra de sangre de los pacientes.

Las muestras de sangre se utilizaron para calcular el porcentaje de pacientes con respuesta a los ensayos con suero bactericida ESB-MenA, ESB-MenC, ESB-MenW 135 y ESB-MenY un mes despues de la dosis de la vacuna. Una respuesta a la vacuna se definio como: 1) para pacientes inicialmente seronegativos - un valor de anticuerpos posterior a la vacunacion > 1/32 en 1 mes o 2) para pacientes inicialmente seropositivos - un valor de anticuerpos de > 4 veces el valor de anticuerpos previo a la vacunacion.

Resultados

Como se muestra en la siguiente tabla, el uso de un espaciador en el conjugado de MenA dio lugar a una mayor respuesta inmune contra MenA. El porcentaje de pacientes con respuesta paso del 66 % al 90-95 % cuando se anadio el espaciador de AH. Esto se reflejo en un aumento en MGV EsB (del ingles, SBA GMT) de 4335 a 10000 y un aumento de la media geometrica de la concentration MGC (del ingles, GMC) de 5 a 20-40. Sorprendentemente, el uso de un espaciador de AH tambien dio lugar a una mayor respuesta inmune contra MenC, segun puede verse por un aumento en el porcentaje de pacientes con respuesta y un aumento de la MGV ESB. Tambien se pudo ver un aumento en la MGV ESB contra MenY (6742-7122) y contra MenW (4621-5418) cuando se introdujo un espaciador.

Formulation: Pacientes con respuesta a ESB MenA % MGV ESB-MenA MGC anti-PSA ^g/ml ELISA

F1 5AH/5/5/5: 90,9 9805 20,38

F2 2,5AH/5/2,5/2,5: 75 8517 29,5

F3 5AH/5/2,5/2,5: 95,5 10290 47,83

F4 5/5/5/5: 66,7 4335 5,46

Mencevax™: 85,7 8022 27,39

Formulacion: Pacientes con respuesta a ESB MenC % MGV ESB-MenC MGC anti-PSC ^g/ml ELISA

F 1 5AH/5/5/5: 69,6 3989 12,11

F2 2,5AH/5/2,5/2,5: 81,8 3524 12,78

F3 5AH/5/2,5/2,5: 81,8 3608 8,4

5

10

15

20

25

(continuacion)

Formulacion: Pacientes con respuesta a ESB MenA % MGV ESB-MenA MGC anti-PSA jg/ml ELISA

F4 5/5/5/5: 73,9 2391 8,84

Mencevax™: 90,0 5447 38,71

Formulacion: Pacientes con respuesta a ESB MenW % MGV ESB-MenW MGC anti-PSW jg/ml ELISA

F 1 5AH/5/5/5: 95 5418 9,65

F2 2,5AH/5/2,5/2,5: 85 4469 14,55

F3 5AH/5/2,5/2,5: 95,5 4257 6,39

F4 5/5/5/5: 95,5 4621 10,7

Mencevax™: 86,4 2714 13,57

Formulacion: Pacientes con respuesta a ESB MenW % MGV ESB-MenW MGC anti-PSY jg/ml ELISA

F 1 5AH/5/5/5: 91,3 7122 16,3

F2 2,5AH/5/2,5/2,5: 87,5 5755 12,52

F3 5AH/5/2,5/2,5: 80 5928 8,88

F4 5/5/5/5: 91,3 6742 13,88

Mencevax™: 91,7 4854 21,02

Ejemplo 4 - Ensayo clinico para evaluar el efecto de un conector en conjugados MenA y MenC en una vacuna de conjugado MenACWY

F1 - MenACWY conjugada con toxoide tetanico conteniendo los conjugados MenA y MenC un espaciador de AH (preparado segun el ejemplo 1) - 2,5/2,5/2,5/2,5 |jg

F2 - MenACWY conjugada con toxoide tetanico conteniendo los conjugados MenA y MenC un espaciador de AH (preparado segun el ejemplo 1) - 5/5/2,5/2,5 jg

F3 - MenACWY conjugada con toxoide tetanico conteniendo los conjugados MenA y MenC un espaciador de AH (preparado segun el ejemplo 1) - 5/5/5/5 jg

F4 - MenACWY conjugada con toxoide tetanico conteniendo el conjugado MenA un espaciador de AH (preparado segun el ejemplo 1) - 5/5/5/5 jg Grupo de control - ACWY Mencevax™

En el dfa 30 despues de la inoculacion, se extrajo una muestra de sangre de los pacientes.

Resultados

La introduccion de un espaciador de AH en el conjugado MenC dio lugar a un aumento en la respuesta inmune contra MenC como se muestra en la siguiente tabla. Esto queda demostrado por un aumento en la MGV ESB de 1943 a 4329 y un aumento en la MGC de anti-PSC de 7,65 a 13,13. Se mantuvieron buenas respuestas inmunes contra MenA, MenW y MenY.

F1 2,5AH/2,5AH/2,5/2,5: 75 8417 20,23

F2 5AH/5AH/2,5/2,5: 72 6299 16,07

F3 5AH/5AH/5/5: 87 9264 27,26

F4 5AH/5/5/5: 77,3 9632 20,39

Mencevax™: 78,3 8284 12,93

(continuacion)

Formulacion: Pacientes con respuesta a ESB MenC % MGV ESB-MenC MGC anti-PSC Mg/ml ELISA

F1 2,5AH/2,5AH/2,5/2,5: 88 3619 12,82

F2 5AH/5AH/2,5/2,5: 88 2833 13,32

F3 5AH/5AH/5/5: 95,8 4329 13,13

F4 5AH/5/5/5: 95,8 1943 7,65

Mencevax™: 91,7 1567 16,55

Formulacion: Pacientes con respuesta a ESB MenC % MGV ESB-MenC MGC anti-PSW Mg/ml ELISA

F1 2,5AH/2,5AH/2,5/2,5: 100 5656 7

F2 5AH/5AH/2,5/2,5: 96 4679 5,4

F3 5AH/5AH/5/5: 91,3 4422 4,45

F4 5AH/5/5/5: 88 4947 7,67

Mencevax™: 96 3486 11,93

Formulacion: Pacientes con respuesta a ESB MenY % MGV ESB-MenY MGC anti-PSY Mg/ml ELISA

F1 2,5AH/2,5AH/2,5/2,5: 75 3891 17,81

F2 5AH/5AH/2,5/2,5: 92 3968 11,96

F3 5AH/5AH/5/5: 79,2 2756 9,51

F4 5AH/5/5/5: 80 3914 16,76

Mencevax™: 88 3056 21,41

Claims

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento para conjugar un sacarido a una protema vehmulo mediante qmmica de condensacion de la carbodiimida, en el que el sacarido comprende (por ejemplo, como parte de su unidad de repeticion), o se ha derivatizado para comprender, grupos amino y/o carboxilo, y en el que la protema vehmulo comprende, o se ha derivatizado para comprender, grupos amino y/o carboxilo, que comprende las etapas de:

I) - si la protema vehmulo comprende tanto grupos amino como carboxilo y el sacarido comprende bien grupos amino o bien carboxilo:

a) mezclar el sacarido y la almuota de carbodiimida necesaria para llevar a cabo la conjugacion, y

b) anadir la almuota de protema vehmulo necesaria durante un penodo de 5 minutos a 6 horas, en el que al menos un cuarto de la almuota se anade durante la primera mitad del penodo y al menos un cuarto de la almuota en la segunda mitad del penodo;

II) - si el sacarido comprende tanto grupos amino como carboxilo y la protema vehmulo comprende bien grupos amino o bien carboxilo:

a) mezclar la protema vehmulo y la almuota de carbodiimida requerida para llevar a cabo la conjugacion, y

b) anadir la almuota de sacarido necesaria durante un penodo de 1 minuto a 6 horas, en el que al menos un cuarto de la almuota se anade durante la primera mitad del penodo y al menos un cuarto de la almuota en la segunda mitad del penodo;

III) - si el sacarido comprende tanto grupos amino como carboxilo y la protema vehmulo comprende tanto grupos amino como carboxilo:

a) mezclar la protema vehmulo y el sacarido, y

b) anadir la almuota de carbodiimida necesaria para llevar a cabo la conjugacion en un penodo de 1 minuto a 6 horas, en el que al menos un cuarto de la almuota se anade durante la primera mitad del penodo y al menos un cuarto de la almuota en la segunda mitad del penodo;

y en el que:

la almuota de carbodiimida es de 0,01 a 3 mg de carbodiimida / mg de sacarido; el sacarido esta presente en una concentracion final de 0,5-50 mg/ml en la etapa b); la protema vehmulo esta presente en una concentracion final de 1-50 mg/ml en la etapa b); la relacion inicial de protema vehmulo a sacarido es de 4:1 a 1:1 (p:p);

el pH de la reaccion en la etapa b) se mantiene a pH: 4,5-6,5, o pH: 4,5-7,5 si en la etapa b) esta presente un compuesto que mantiene el intermedio de reaccion estable; y la temperatura de la reaccion en la etapa b) se mantiene a 4-37 °C.
2. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que en la etapa b) el penodo es de 1 minuto a 4 horas, de 2 minutos a 3 horas, de 3 minutos a 2 horas, de 4 a 60 minutos, de 5 a 50 minutos, de 6 a 40 minutos, de 7 a 30 minutos o de 8 a 20 minutos.
3. El procedimiento de la reivindicacion 1 o 2, en el que la carbodiimida es EDAC (1-etil-3-(3-dimetil-aminopropil) carbodiimida).
4. El procedimiento de las reivindicaciones 1-3, en el que el sacarido y/o la protema vehmulo se han derivatizado para comprender grupos amino o carboxilo.
5. El procedimiento de las reivindicaciones 1-4, que comprende una etapa c) posterior, en la que el conjugado de sacarido-protema se purifica en una columna de cromatograffa de exclusion por tamanos.
6. El procedimiento de las reivindicaciones 1-5, que comprende una etapa d) posterior, en la que el conjugado de sacarido-protema se esteriliza por filtracion.
7. El procedimiento de las reivindicaciones 1-6, en el que el sacarido es un sacarido capsular bacteriano, por ejemplo derivado de una bacteria seleccionada de una lista que consiste en: N. meningitidis serogrupos A, B, C, W135 o Y, Streptococcus pneumoniae serotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F o 33F, Grupo B de Streptococcus grupos Ia, Ib, II, III, IV, V, VI o VII, Staphylococcus aureus tipo 5, Staphylococcus aureus tipo 8, Salmonella typhi (sacarido Vi), Vibrio cholerae o H. influenzae tipo b.
8. El procedimiento de las reivindicaciones 1-6, en el que el sacarido es un lipooligosacarido o lipopolisacarido bacteriano, por ejemplo derivado de una bacteria seleccionada de una lista que consiste en: N. meningitidis, H. influenzae, E. coli, Salmonella o M. catarrhalis.
9. El procedimiento de las reivindicaciones 1-8, en el que la protema vehmulo comprende uno o mas epftopos de linfocitos T ayudantes.
10. El procedimiento de las reivindicaciones 1-9, en el que la protema vehmulo se selecciona del grupo que consiste en: TT, DT, CRM197, fragmento C de TT, protema D de H. influenzae, PhtD del neumococo y neumolisina del

5 neumococo.
11. Un conjugado sacarido-protema vehmulo obtenible por el procedimiento de las reivindicaciones 1-10, en el que el sacarido es un sacarido capsular bacteriano, por ejemplo derivado de una bacteria seleccionada de una lista que consiste en: N. meningitidis serogrupo A, B, C, W135 o Y, Streptococcus pneumoniae serotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6b, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F o 33F, Grupo B de Streptococcus grupos

10 la, Ib, II, III, IV, V, VI o VII, Staphylococcus aureus tipo 5, Staphylococcus aureus tipo 8, Salmonella typhi (sacarido Vi) o Vibrio cholerae, o en el que el sacarido es un lipooligosacarido o lipopolisacarido bacteriano, por ejemplo derivada de una bacteria seleccionada de una lista que consiste en: N. meningitidis, H. influenzae, E. coli, Salmonella o M. catarrhalis.