ES2537106T3 - Mutantes termoestables de la glucosa deshidrogenasa dependiente de quinona de pirroloquinolina - Google Patents

Abstract

Proteína mutante de s-GDH dependiente de QPQ caracterizada por que en por lo menos una de las posiciones 122 y 124 se encuentra presente el aminoácido lisina, en la que dichas posiciones corresponden a las posiciones aminoácidas conocidas de la GDH de secuencia de tipo salvaje de A. calcoaceticus (SEC ID nº 2, en la que dicho mutante presenta una mayor estabilidad que la proteína que no presenta dichas sustituciones y en la que dicha proteína es por lo menos 90% idéntica a SEC ID nº 2.

Description

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18-05-2015

Deben seleccionarse condiciones de ensayo estandarizadas y bien definidas con el fin de evaluar (las mejoras de) la especificidad de sustrato. La actividad enzimática de la s-GDH para la glucosa como sustrato, así como para otros sustratos azúcar seleccionados, se mide tal como se describe en la sección de Ejemplos.

Basándose en dichas mediciones de la actividad enzimática para la glucosa o para un azúcar diferente seleccionado, preferentemente la maltosa, se evalúa la reactividad cruzada (y las mejoras de la misma).

La reactividad (cruzada) de la s-GDH para un azúcar seleccionado en porcentaje se calcula como:

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Se determinó como aproximadamente 105% la reactividad (cruzada) para la maltosa de la s-GDH de tipo salvaje según la fórmula anteriormente indicada (ver el Ejemplo 7).

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En comparación con el enzima de tipo salvaje, una forma de s-GDH con una mejora de por lo menos 10 veces de especificidad para la glucosa frente a la maltosa (maltosa/glucosa) con maltosa como sustrato presenta, de acuerdo con lo anterior, como máximo 10,5% de la actividad medida con glucosa como sustrato. Alternativamente, en el caso de que, por ejemplo, una s-GDH mutante presente una reactividad cruzada para la maltosa de 20% (determinada y calculada tal como se ha indicado anteriormente), dicho mutante en comparación con la s-GDH de tipo salvaje presenta, por lo tanto, una especificidad de sustrato (maltosa/glucosa) mejorada en 5,25 veces.

La expresión “actividad específica” para un sustrato es bien conocida de la técnica, preferentemente se utiliza para describir la actividad enzimática por unidad de cantidad de proteína. Diversos métodos son conocidos de la técnica para la determinación de la actividad específica de las moléculas de GDH, utilizando glucosa u otros azúcares como sustratos (Igarashi S. et al., supra, 1999). Un método preferente disponible para dicha medición se describe en detalle en el Ejemplo 8.

Aunque resulta posible seleccionar muchas moléculas de azúcar diferentes e investigar la especificidad para la glucosa de la sGDH en comparación con cualquiera de dichas moléculas de azúcar seleccionadas, resulta preferente seleccionar una molécula de azúcar clínicamente relevante para dicha comparación. Los azúcares seleccionados preferentes se seleccionan de entre el grupo que consiste de manosa, alosa, galactosa, xilosa y maltosa. Preferentemente, se selecciona la maltosa o la glucosa y se somete a ensayo una s-GDH mutante para especificidad de sustrato mejorada para la glucosa en comparación con la galactosa o la maltosa. En una realización adicionalmente preferente, el azúcar seleccionado es la maltosa.

En una realización preferente, una proteína mutante de la s-GDH dependiente de QPQ según la presente invención comprende una lisina en la posición 122 y/o 124 y además una o más sustituciones de aminoácido en una o más posiciones seleccionadas de entre el grupo que consiste de las posiciones 16, 22, 65, 76, 116, 120, 127, 143, 168, 169, 171, 177, 224, 227, 230, 231, 245, 246, 255, 277, 287, 294, 295, 299, 302, 305, 307, 308, 317, 321, 323, 341, 348, 349, 354, 355, 364, 378, 422, 425, 428 y 438. La mayoría de las posiciones anteriormente indicadas se ha demostrado previamente que influyen sobre la especificidad de la s-GDH para la glucosa en comparación con otros azúcares seleccionados, especialmente en comparación con el sustrato maltosa. La exposición total de la patente WO nº 02/34919 se incluye en la presente memoria como referencia.

Tal como se describe en el documento nº WO 02/34919, una sustitución del aminoácido en la posición 348 de la secuencia de la s-GDH correspondiente a la secuencia de tipo salvaje aislada a partir de A. calcoaceticus, puede utilizarse para mejorar significativamente la especificidad para la glucosa de la s-GDH. En una realización especialmente preferente, la presente invención se refiere a una s-GDH mutante que comprende una lisina en la posición 122 y/o 124 y una sustitución de aminoácido en la posición 348. Preferentemente, el residuo treonina en la posición 348 se sustituye por un residuo aminoácido seleccionado de entre el grupo que consiste de alanina, glicina y serina. En una realización más preferente, se utiliza glicina para sustituir la treonina en la posición 348. El término T348G es conocido por el experto en la materia e indica que la treonina en la posición 348 ha sido sustituida por glicina.

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almacenaron a -20ºC.

Ensayo enzimático y determinación de proteínas de s-GDH de tipo salvaje purificada y variante, respectivamente.

5 Se llevó a cabo la determinación de proteínas utilizando el reactivo de ensayo de proteínas nº 23225 de Pierce (curva de calibración con BSA, 30 min. a 37ºC).

Las muestras de s-GDH se diluyeron a 1 mg de proteína/ml con quinona de pirroloquinolina (QPQ) 0,0556 mM, Hepes 50 mM, CaCl2 15 mM, pH 7,0, y se incubaron a 25ºC durante 30 minutos para la reconstitución o activación.

10 Tras la activación, las muestras se diluyeron con Hepes 50 mM, CaCl2 15 mM, pH 7,0, hasta aproximadamente 0,02 U/ml y se añadieron 50 μl de cada muestra diluida a 1.000 μl de una solución de tampón citrato 0,2 M (pH 5,8, a 25ºC) que contenía 0,315 mg de (4-(dimetilfosfinilmetil)-2-metil-pirazolo[1.5a]-imidazol-3-il)-(4-nitrosofenil)-amina (ver la patente US nº 5.484.708)/ml como mediador y azúcar 30 mM).

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Se realizó un seguimiento de la extinción a 620 nm durante los primeros 5 minutos a 25ºC.

Una actividad enzimática de una unidad corresponde al a conversión de 1 mmol de mediador/min. bajo las

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Se llevó a cabo el ensayo con glucosa y maltosa (Merck, Alemania), respectivamente.

25 Resultados:

Enzima

M/G (30 mM de azúcar, en %) U/mg de proteína Intercambios de aminoácidos

Tipo salvaje

105 % 800 -

B/2

4 % 106 N122K+S124K+Y171G+E245D+M341V+ T348G+in429P

C/0

2 % 435 Y171G+E245D+M341V+ T348G+A426S+N428P+Q430M

C/2

2 % 450 N122K+S124K+Y7G+E245D+M34IV+ T348G+A426S+N428P+Q430M

D/2

4 % 441 N122K+S124K+Y171G+E245D+Q246H+M 341V+ T348G+T425V+N428P

Ejemplo 9:

30 Estabilidad térmica comparativa de mutantes purificados con y sin los intercambios de aminoácidos N122K y S124K

Las muestras de s-GDH purificadas de tipo salvaje, y mutantes C/0 y C/2 (Ejemplo 8) se sometieron a un modelo de estrés térmico alternativo que imitaba las condiciones de estrés térmico de producción y/o transporte. Se prepararon

35 soluciones de 1 mg de proteína enzima/fosfato potásico 20 mM, pH 7,0, 0,016 mg de QPQ/ml con el fin de activar las s-GDHs. Tras la incubación durante 30 minutos a temperatura ambiente, se determinó la actividad inicial hacia la glucosa (ver el Ejemplo 8) y se incubaron las muestras en el baño de agua a 48ºC. Tras 30 minutos de estrés térmico, se midió la actividad restante y se calculó en porcentaje (en comparación con la actividad inicial).

40 Resultados:

Enzima

Actividad restante

Tipo salvaje

99 %

C/0

66 %

C/2

94 %

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Claims (1)

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