ES2541142T3

ES2541142T3 - Composiciones y métodos para anticuerpos dirigidos contra la proteína C5 del complemento

Info

Publication number: ES2541142T3
Application number: ES09737379.9T
Authority: ES
Inventors: Beate Diefenbach-Streiber; Adina Eberth; Braydon Charles Guild; Yong-In Kim; Michael Roguska; Igor Splawski
Original assignee: Novartis AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 2008-08-05
Filing date: 2009-08-03
Publication date: 2015-07-16
Anticipated expiration: 2029-08-03
Also published as: HUE026179T2; CU20110029A7; CR20160206A; DK2328616T3; US20130064836A1; US20160031975A1; CR20110035A; EP2328616B1; HK1157663A1; EP2328616A1; IL210768B; JP2016020345A; EP2815766B1; WO2010015608A1; TW201010723A; US20170260260A1; EP2837388A1; JO3118B1; AR072897A1; ECSP11010805A

Abstract

Un anticuerpo monoclonal aislado dirigido contra la proteína C5 humana, o un fragmento del mismo que se enlaza al antígeno, que comprende (i) una CDR1 de cadena pesada que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 1; una CDR2 de cadena pesada que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 2; y una CDR3 de cadena pesada que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 3; y (ii) una CDR1 de cadena ligera que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 4; una CDR2 de cadena ligera que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 5; y una CDR3 de cadena ligera que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 6, en donde dicho anticuerpo o fragmento del mismo que se enlaza al antígeno se enlaza a la proteína C5 humana con una KD de 10-10 M o menos de acuerdo a lo medido por resonancia de plasmón superficial.

Description

Composiciones y métodos para anticuerpos dirigidos contra la proteína C5 del complemento

1.: Introducción

La presente invención se refiere a anticuerpos que se dirigen a la proteína C5 del complemento, y a composiciones y métodos para el uso de los mismos.

2.: Antecedentes de la invención

El papel normal del complemento, que es parte del sistema inmunitario innato, está en la defensa del huésped. El complemento defiende contra una infección bacteriana, vincula la inmunidad adaptativa e innata, y dispone los complejos inmunes y los productos de una lesión inflamatoria.

Las funciones de defensa se llevan a cabo mediante productos biológicamente activos generados en el transcurso de la activación del complemento, que opsonizan a los agentes infecciosos, promueven la inflamación, o lisan los objetivos susceptibles (Marzari y colaboradores, Eur. J. Immunol. 32: 2773 - 2782 (2002)). El sistema del complemento consiste en aproximadamente 25 - 30 proteínas de plasma que juegan un papel en el sistema inmune. La cascada del complemento se activa mediante al menos tres rutas principales. La ruta clásica típicamente es activada por complejos inmunes, la ruta alternativa puede ser activada por las superficies celulares no protegidas, y la ruta de la lectina que se enlaza a manosa (LEM) es iniciada por el enlace de LEM a los carbohidratos de la superficie de la célula (Trendelenburg, Swiss Med WkIy 137: 413 - 417 (2007)).

Las tres rutas conducen a la escisión de C5 mediante la C5 convertasa. EI resultado de esta escisión es la liberación de un fragmento C5a, una potente molécula inflamatoria, y C5b, que inicia al complejo de ataque de la membrana (CAM). Los productos del complemento, una vez liberados, no diferencian entre los objetivos extraños y los propios, y, si no se regulan estrechamente, con frecuencia provocan un daño extenso de las células y tejidos espectadores en condiciones clínicas asociadas con la activación del complemento sin restricciones (Marzari y colaboradores, 2002).

C5 se expresa intracelularmente como un solo péptido pro-C5 de 1.676 aminoácidos, que consiste en una secuencia señal de 18 residuos y una secuencia enlazadora rica en Arg (RPRR) situada entre la cadena β N-terminal madura y la cadena α C-terminal. EI C5 maduro tiene un peso molecular de aproximadamente 190 kDa, y consiste en dos cadenas de polipéptido (α, de 115 kDa, y β, de 75 kDa), que están conectadas mediante enlaces de disulfuro. La C5 convertasa escinde a C5 entre los residuos 74 y 75 de la cadena alfa para liberar al péptido C5a de 74 aminoácidos y al fragmento C5b que es posteriormente incorporado en el complejo de ataque de la membrana (CAM).

La degeneración macular es una condición médica que se encuentra predominantemente en la ancianidad, en donde el centro del revestimiento interno del ojo, conocido como el área de la mácula de la retina, sufre adelgazamiento, atrofia, y en algunos casos, hemorragia. Esto puede dar como resultado la pérdida de la visión central, lo cual implica una incapacidad para ver los detalles finos, para leer, o para reconocer las caras. La patogénesis de la nueva formación de vasos coroideos es pobremente entendida, pero se piensa que son importantes factores tales como inflamación, isquemia, y la producción local de factores angiogénicos.

A pesar de las opciones de tratamiento actuales para tratar las enfermedades y trastornos asociados con las rutas de componentes clásicos o alternativos, en particular DME, sigue existiendo la necesidad por encontrar agentes específicos que conduzcan a tratamientos que sean efectivos y bien tolerados.

La solicitud estadounidense de patente No. 2006/0115476 A1 (Tedesco y Marzari) describe anticuerpos recombinantes de origen humano específicos para el componente C5 del complemento activado. Los anticuerpos se caracterizan por su capacidad para inhibir la conversión de la cadena alfa de C5 en C5a y C5b. La solicitud estadounidense de patente No.2006/0115476 A1 divulga además secuencias de nucleótidos que codifican para tales anticuerpos y para uso terapéutico tanto de secuencias de polipéptidos como de nucleótidos, en particular para la terapia de enfermedades que implican daño tisular derivado de activación incontrolada del sistema del complemento.

3. Resumen de la invención

Las realizaciones de la invención se definen mediante las reivindicaciones.

La presente invención proporciona moléculas aisladas que se enlazan a la C5 del complemento (por ejemplo, anticuerpos que se enlazan a C5 o fragmentos de los mismos que se enlazan con el antígeno), composiciones farmacéuticas que comprenden tales moléculas, métodos para la elaboración de tales moléculas y composiciones, y métodos de uso de las mismas.

En algunas realizaciones, la presente invención proporciona anticuerpos aislados o fragmentos de los mismos que se enlazan al antígeno que se enlazan específicamente a una proteína C5, en donde dicho anticuerpo tiene una constante de afinidad (KA) de al menos 1010 M-1,o 1011 M-1.

En algunas realizaciones, la presente invención proporciona anticuerpos aislados o fragmentos de los mismos que se enlazan al antígeno, que se enlazan específicamente a una proteína C5, y que inhiben la ruta completa alternativa, como se mide mediante un ensayo hemolítico in vitro, con un intervalo de IC50 de aproximadamente 20 pM hasta aproximadamente 200 pM.

En algunas realizaciones, la presente invención proporciona anticuerpos aislados o fragmentos de los mismos que se enlazan al antígeno, que se enlazan específicamente a una proteína C5, y compiten en forma cruzada con un anticuerpo descrito en la Tabla 1 que se presenta más adelante. En algunas realizaciones, la presente invención proporciona anticuerpos aislados o fragmentos de los mismos que se enlazan al antígeno, que se enlazan al mismo epítopo de la proteína C5 que un anticuerpo descrito en la Tabla 1 más adelante.

En algunas realizaciones, los anticuerpos de la invención son anticuerpos monoclonales aislados que se enlazan específicamente a una proteína C5. En algunas realizaciones, los anticuerpos de la invención son anticuerpos monoclonales humanos o humanizados aislados que se enlazan específicamente a esa proteína. En algunas realizaciones, los anticuerpos de la invención son anticuerpos quiméricos aislados que se enlazan específicamente a una proteína C5. En algunas realizaciones, los anticuerpos de la invención comprenden una región constante de cadena pesada humana y una región constante de cadena ligera humana.

En algunas realizaciones, la presente invención proporciona anticuerpos aislados o fragmentos de los mismos que se enlazan al antígeno, que se enlazan específicamente a una proteína C5, en donde dichos anticuerpos son anticuerpos de una sola cadena. En algunas realizaciones, los anticuerpos de la invención son fragmentos Fab. En algunas realizaciones, los anticuerpos de la invención son scFv.

En algunas realizaciones, la presente invención proporciona anticuerpos aislados o fragmentos de los mismos que se enlazan al antígeno, que se enlazan específicamente tanto a C5 humana como a C5 de cinomólogo. En algunas realizaciones, los anticuerpos de la invención son un isotipo de IgG.

En un aspecto de la divulgación, se proporcionan anticuerpos aislados o fragmentos de los mismos que se enlazan al antígeno, los cuales comprenden una estructura en la cual se han sustituido aminoácidos en la estructura del anticuerpo a partir de las respectivas secuencias de la línea germinal de VH o VL humana.

En un aspecto de la divulgación, se proporcionan anticuerpos monoclonales aislados o fragmentos de los mismos que se enlazan al antígeno, que se enlazan específicamente a una proteína C5, en donde dichos anticuerpos comprenden al menos una secuencia que determina la complementariedad (CDR) que tiene una identidad de secuencia de al menos el 90%, 95%, 97%, 98%, o al menos el 99% con las SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 49, 50, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 77, 78, 89, 95, 101, 107, 113, 119, 120, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 209, 226, 235, 236, 237, 238, 239, o 240.

En un aspecto de la divulgación, se proporcionan anticuerpos monoclonales aislados o fragmentos de los mismos que se enlazan al antígeno, que se enlazan específicamente a una proteína C5, en donde dichos anticuerpos comprenden al menos una secuencia de la CDR de cadena pesada que es idéntica a las SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 17, 18, 19, 33, 34, 35, 49, 61, 62,63, 77, 77, 95, 107, 113,119, 132, 131,133, 145, 146, 147, 159, 160, 161, 173, 174, 175, 195, 196, 197, 226, 235, 236, o 237.

En un aspecto de la divulgación, se proporcionan anticuerpos monoclonales aislados o fragmentos de los mismos que se enlazan al antígeno, que se enlazan específicamente a una proteína C5, en donde dichos anticuerpos comprenden al menos una secuencia de la CDR de cadena ligera que es idéntica a las SEQ ID NOs: 4, 5, 6, 20, 21, 22, 36, 37,38. 50,64, 65, 66,78, 89, 101, 120, 134, 135, 136, 148, 149, 150, 162, 163, 164, 176, 177, 178, 198, 199, 200, 209, 238, 239, o 240.

En un aspecto de la divulgación, se proporcionan anticuerpos monoclonales aislados o fragmentos de los mismos que se enlazan al antígeno, que se enlazan específicamente a una proteína C5, en donde dichos anticuerpos comprenden una CDR 1 de cadena pesada seleccionada a partir del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 1, 17, 33, 61, 131, 145, 159, 173, 195, y 235; una CDR2 de cadena pesada seleccionada a partir del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 2, 18, 34, 49, 62, 77, 95, 107, 113, 119, 132, 146, 160, 174, 196, 226, y 236; y una CDR3 de cadena pesada seleccionada a partir del grupo que consiste de las SEQ lD NOs: 3, 19, 35, 63, 133, 147, 161, 175, 197, y 237. En algunas realizaciones, tales anticuerpos o fragmentos de los mismos que se enlazan al antígeno, comprenden además una CDR1 de cadena ligera seleccionada a partir del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 4, 20, 36, 64, 134, 148, 162, 176, 198, y 238; una CDR2 de cadena ligera seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 5, 21, 37, 65, 135, 149, 163, 177, 199, y 239; y una CDR3 de cadena ligera seleccionada a partir del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 6, 22, 38, 50, 66, 78, 89, 101, 120, 136, 150, 164, 178, 200, 209, y 240.

En un aspecto de la divulgación, se proporcionan anticuerpos monoclonales aislados o fragmentos de los mismos que se enlazan al antígeno, que se enlazan específicamente a una proteína C5, en donde dichos anticuerpos comprenden una CDR 1 de cadena ligera seleccionada a partir del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 4, 20, 36, 64, 134, 148, 162, 176, 198, y 238; una CDR2 de cadena ligera seleccionada a partir del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 5, 21, 37, 65, 135, 149, 163, 177, 199, y 239; y una CDR3 de cadena ligera seleccionada a partir del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 6, 22, 38, 50, 66, 78, 89, 101, 120, 136, 150, 164, 178, 200, 209, y 240.

En un aspecto de la divulgación, se proporcionan anticuerpos monoclonales aislados o fragmentos de los mismos que se enlazan al antígeno, que se enlazan específicamente a una proteína C5, en donde dichos anticuerpos comprenden una región variable de cadena pesada que tiene al menos una identidad de secuencia de al menos el 90%, 95%, 97%, 98% o al menos el 99% con las SEQ ID NOs: 7, 23, 39, 51, 67, 79, 96, 108, 114, 121, 137, 151, 165, 179, 187, 201, 210, 218, 227, 241, 253, 257, 273, 277, o 281. En otro aspecto de la divulgación, tales anticuerpos o fragmentos que se enlazan al antígeno, comprenden además una región variable de cadena ligera que tiene al menos una identidad de secuencia de al menos el 90%, 95%, 97%, 98%, o al menos el 99% con las SEQ ID NOs: 8, 24, 40, 52, 68, 80, 90, 102, 122, 138, 152, 166, 180, 188, 202, 211, 219, 228, 242, 261, 265, 269, 285, y

289.

En un aspecto de la divulgación, se proporcionan anticuerpos monoclonales aislados o fragmentos de los mismos que se enlazan al antígeno, que se enlazan específicamente a una proteína C5, en donde dichos anticuerpos comprenden una región variable de cadena liviana que tiene al menos una identidad de secuencia de al menos el 90%, 95%, 97%, 98%, o al menos el 99% con las SEQ ID NOs: 8, 24, 40, 52, 68, 80, 90, 102, 122, 138, 152, 166, 180, 188, 202, 211, 219, 228, 242, 261, 265, 269, 285, y 289.

En un aspecto de la divulgación, se proporcionan anticuerpos monoclonales aislados o fragmentos de los mismos que se enlazan al antígeno, que se enlazan específicamente a una proteína C5, en donde dichos anticuerpos comprenden una cadena pesada que tiene al menos una identidad de secuencia de al menos el 90%, 95%, 97%, 98%, o al menos el 99% con las SEQ ID NOs: 9, 25, 41, 53, 69, 81, 97, 109, 115, 123, 139, 153, 167, 181, 189, 203, 212, 220, 229, 243, 249, 254, 258, 274, 278, o 282. En otro aspecto de la divulgación, tales anticuerpos comprenden además una cadena ligera que tiene una identidad de secuencia de al menos el 90%, 95%, 97%, 98%, o al menos el 99% con las SEQ lD NOs: 10, 26, 42, 54, 70, 82, 91, 103, 124, 140, 154, 168, 182, 190, 204, 213, 221, 230, 244, 251, 262, 266, 270, 286, o 290.

En un aspecto de la divulgación, se proporcionan anticuerpos monoclonales aislados o fragmentos de los mismos que se enlazan al antígeno, que se enlazan específicamente a una proteína C5, en donde dichos anticuerpos comprenden una cadena liviana que tiene al menos una identidad de secuencia de al menos el 90%, 95%, 97%, 98%, o al menos el 99% con las SEQ ID NOs: 10, 26, 42, 54, 70, 82, 91, 103, 124, 140, 154, 168, 182, 190, 204, 213, 221, 230, 244, 251, 262, 266, 270, 286, o 290.

La presente invención también comprende composiciones farmacéuticas que comprenden una o más moléculas de la invención que se enlazan a C5 (por ejemplo, anticuerpos que se enlazan a C5 o fragmentos de los mismos que se enlazan al antígeno), y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En un aspecto de la divulgación, se proporcionan ácidos nucleicos que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una región variable de cadena pesada que tiene una identidad de secuencia de al menos el 90%, 95%, 97%, 98%, o al menos el 99% con las SEQ ID NOs: 7, 23, 39, 51, 67, 79, 96, 108, 114, 121, 137, 151, 165, 179, 187, 201, 210, 218, 227, 241, 253, 257, 273, 277, o 281.

En un aspecto de la divulgación, se proporcionan ácidos nucleicos que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una región variable de cadena ligera que tiene una identidad de secuencia de al menos el 90%, 95%, 97%, 98%, o al menos el 99% con las SEQ ID NOs: 8, 24, 40, 52, 68, 80, 90, 102, 122, 138, 152, 166, 180, 188, 202, 211, 219, 228, 242, 261, 265, 269, 285, y 289.

La presente invención también proporciona vectores y células huésped que comprenden estos ácidos nucleicos. En una realización, la presente invención proporciona células huésped aisladas que comprenden: (1) un segmento de ADN recombinante que codifica una cadena pesada de los anticuerpos de la invención, y (2) un segundo segmento de ADN recombinante que codifica una cadena ligera de los anticuerpos de la invención; en donde dichos segmentos de ADN están respectivamente operativamente enlazados a un primero y un segundo promotor, y son capaces de ser expresados en dicha célula huésped. En otro aspecto de la divulgación, la presente invención proporciona células huésped aisladas que comprenden un segmento de ADN recombinante que codifica una cadena pesada, y una cadena ligera de los anticuerpos de la invención, respectivamente, en donde dicho segmento de ADN está operativamente enlazado a un promotor, y es capaz de ser expresado en dichas células huésped. En algunas realizaciones, las células huésped son una línea celular de mamífero no humano. En algunas realizaciones, los anticuerpos o fragmentos de los mismos que se enlazan al antígeno son un anticuerpo monoclonal humano, o un fragmento del mismo que se enlaza al antígeno.

La presente invención proporciona además moléculas que se enlazan a C5 (por ejemplo, anticuerpos que se enlazan de C5 o fragmentos de los mismos que se enlazan al antígeno) de la invención, para uso en métodos de tratamiento o de diagnóstico. En una realización, la presente invención proporciona un anticuerpo o un fragmento del mismo que se enlaza al antígeno de la invención para uso en el tratamiento de degeneración macular relacionada con la edad.

En otro aspecto de la divulgación, la presente invención proporciona un fragmento del mismo que se enlaza al antígeno de la invención para uso en el tratamiento de una enfermedad, en donde dicha enfermedad es asma, artritis, enfermedad cardíaca autoinmune, esclerosis múltiple, enfermedad inflamatoria del intestino, lesiones por isquemia-reperfusión, síndrome de Barraquer-Simons; hemodiálisis, lupus sistémico, lupus eritematoso, soriasis, esclerosis múltiple, trasplante, enfermedad de Alzheimer, glomerulonefritis, o MPGN II.

La presente invención también proporciona un anticuerpo o un fragmento del mismo de enlazamiento al antígeno de la invención para uso en el tratamiento de hemoglobinuria nocturna paroxismal (PNH).

La presente invención proporciona además un anticuerpo o un fragmento del mismo de enlazamiento al antígeno de la invención para uso en el alivio de un síntoma asociado con la circulación extracorpórea, que comprende administrar a un sujeto que Io necesite, una cantidad efectiva de una composición que comprende un anticuerpo o un fragmento del mismo que se enlaza al antígeno de la invención.

3.1 Definiciones

A menos que se definan de otra manera, los términos técnicos y científicos utilizados en la presente invención tienen el mismo significado que es entendido comúnmente por aquellos ordinariamente capacitados en la materia a la que pertenece esta invención.

El término "anticuerpo", como se utiliza en la presente invención, incluye anticuerpos enteros y cualquier fragmento que se enlaza al antígeno (es decir, "porción que se enlaza al antígeno") o cadenas individuales de los mismos. Un "anticuerpo" de origen natural es una glicoproteína que comprende al menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces de disulfuro. Cada cadena pesada consta de una región variable de cadena pesada (abreviada aquí como VH), y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada consta de tres dominios, CH1 CH2, y CH3. Cada cadena ligera consta de una región variable de cadena ligera (abreviada aquí como VL), y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera consta de un dominio, CL. Las regiones VH y VL se pueden subdividir adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, denominadas como regiones determinantes de complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas como regiones de estructura (FR). Cada VH y VL está compuesta de tres CDR y cuatro FR dispuestas desde el terminal amino hasta el terminal carboxilo en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera contienen un dominio de enlazamiento que interactúa con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar el enlazamiento de la inmunoglobulina a los tejidos o factores del huésped, incluyendo diferentes células del sistema inmunitario (por ejemplo, las células efectoras), y el primer componente (Clq) del sistema clásico del complemento.

El término "porción de enlazamiento al antígeno" de un anticuerpo, como se utiliza en la presente invención, se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo intacto, que retienen la capacidad para enlazarse específicamente a un antígeno dado (por ejemplo, C5). Las funciones de enlazamiento al antígeno de un anticuerpo se pueden llevar a cabo mediante los fragmentos de un anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de enlazamiento abarcados dentro del término "porción de enlazamiento al antígeno" de un anticuerpo incluyen un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios de VL, VH, CL, y CH1; un fragmento F(ab)2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab enlazados por un puente de disulfuro a la región de bisagra; un fragmento Fd que consiste en los dominios de VH y CH1; un fragmento Fv que consiste en los dominios de VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo; un fragmento de anticuerpo de un solo dominio (dAb) (Ward y colaboradores, 1989 Nature 341: 544 - 546), que consiste en un dominio VH; y una región aislada determinante de complementariedad (CDR).

Adicionalmente, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, son codificados por genes separados, se pueden unir, empleando métodos recombinantes, mediante un enlazador peptídico artificial, que permite que ellos se formen como una sola cadena de proteína, en la cual se emparejan las regiones VL y VH para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv de una sola cadena (scFv); véanse, por ejemplo, Bird y colaboradores, 1988 Science 242: 423 - 426; y Huston y colaboradores, 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 5879 - 5883). Estos anticuerpos de una sola cadena incluyen una o más "porciones de enlazamiento al antígeno" de un anticuerpo. Estos fragmentos de anticuerpo se obtienen empleando las técnicas convencionales conocidas por los expertos en este campo, y los fragmentos se seleccionan para determinar su utilidad de la misma forma que los anticuerpos intactos.

Las porciones de enlazamiento al antígeno también se pueden incorporar en anticuerpos de un solo dominio, maxicuerpos, minicuerpos, intracuerpos, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, v-NAR y bis-scFv (véase, por ejemplo, Hollinger y Hudson, 2005, Nature Biotechnology, 23, 9,1126 - 1136). Las porciones de enlazamiento al antígeno de los anticuerpos se pueden injertar en andamiajes basados en polipéptidos, tales como fibronectina tipo III (Fn3) (véase la patente de los Estados Unidos de Norteamérica No. 6.703.199, que describe monocuerpos del polipéptido de fibronectina).

Las porciones de enlazamiento al antígeno se pueden incorporar en las moléculas de una sola cadena que comprenden un par de segmentos Fv en tándem (VH-CH1-VH-CH1) que, junto con los polipéptidos de cadena ligera complementarios, forman un par de regiones de enlazamiento al antígeno (Zapata y colaboradores, 1995 Protein Eng. 8(10): 1057 - 1062; y la patente de los Estados Unidos de Norteamérica No. 5.641.870).

Como se utiliza en la presente invención, el término "afinidad" se refiere a la fuerza de interacción entre el anticuerpo y el antígeno en los sitios antigénicos individuales. Dentro de cada sitio antigénico, la región variable del "brazo" del anticuerpo interactúa a través de fuerzas no covalentes débiles con el antígeno en numerosos sitios; mientras más interacciones haya, más fuerte será la afinidad.

Como se utiliza en la presente invención, el término "Avidez" se refiere a una medida informativa de la estabilidad o fuerza total del complejo anticuerpo-antígeno. Se controla mediante tres factores principales: afinidad del epítopo del anticuerpo; la valencia tanto del antígeno como del anticuerpo; y la disposición estructural de las partes que interactúan. Finalmente, estos factores definen la especificidad del anticuerpo, es decir, la probabilidad de que el anticuerpo particular se enlace a un epítopo preciso del antígeno.

El término "aminoácido" se refiere a los aminoácidos de origen natural y sintético, así como a los análogos de aminoácidos y a los miméticos de aminoácidos que funcionan de una forma similar a los aminoácidos de origen natural. Los aminoácidos de origen natural son aquéllos codificados por el código genético, así como aquellos aminoácidos que son modificados posteriormente, por ejemplo, hidroxiprolina, y carboxiglutamato, y O-fosfoserina. Análogos de aminoácidos se refieren a los compuestos que tienen la misma estructura química básica que un aminoácido de origen natural, es decir, un carbono alfa que se enlaza a un hidrógeno, un grupo carboxilo, un grupo amino, y un grupo R, por ejemplo, homoserina, norleucina, sulfóxido de metionina, metil sulfonio de metionina. Estos análogos tienen grupos R modificados (por ejemplo, norleucina), o cadenas peptídicas principales modificadas, pero retienen la misma estructura química básica que un aminoácido de origen natural. Miméticos de aminoácidos se refiere a los compuestos químicos que tienen una estructura que es diferente de la estructura química general de un aminoácido, pero que funcionan de una forma similar a un aminoácido de origen natural.

El término "especificidad de enlazamiento", como se utiliza en la presente invención, se refiere a la capacidad de un sitio de combinación de un anticuerpo individual para reaccionar solamente con un determinante antigénico. EI sitio de combinación del anticuerpo se localiza en la porción Fab de la molécula, y se construye a partir de las regiones hipervariables de las cadenas pesada y ligera. La afinidad de enlazamiento de un anticuerpo es la fuerza de la reacción entre un solo determinante antigénico y un solo sitio de combinación sobre el anticuerpo. Es la suma de las fuerzas de atracción y de repulsión que operan entre el determinante antigénico y el sitio de combinación del anticuerpo.

El enlazamiento especifico entre dos entidades significa un enlace con una constante en equilibrio (KA) de al menos 1 x 107 M-1, 108 M-1, 109 M-1, 1010 M-1, o 1011 M-1. La frase "se enlaza específicamente (o selectivamente)" a un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo que se enlaza a C5), se refiere a una reacción de enlazamiento que es determinativa de la presencia de un antígeno relacionado (por ejemplo, un C5 humano o un C5 de cinomólogo) en una población heterogénea de proteínas y otros compuestos biológicos. Además de la constante en equilibrio (KA) mencionada anteriormente, un anticuerpo de enlazamiento de C5 de la invención típicamente también tiene una constante del índice de disociación (Kd) de aproximadamente 1 x 10-2 s-1, 1 x 10-3 s-1, 1 x 10-4 s-1, 1 x 10-5 s-1, o más baja, y se enlaza a C5 con una afinidad que es al menos dos veces mayor que su afinidad por el enlazamiento con un antígeno no específico (por ejemplo, C3, C4, BSA). Las frases "un anticuerpo que reconoce un antígeno" y "un anticuerpo específico para un antígeno" se utilizan de una manera intercambiable en la presente invención con el término "un anticuerpo que se enlaza específicamente a un antígeno".

El término "anticuerpo quimérico" es una molécula de anticuerpo en la que: (a) la región constante, o una porción de la misma, es alterada, reemplazada, o intercambiada, de tal manera que el sitio de enlazamiento del antígeno (región variable) se enlaza a una región constante de una clase, función efectora, y/o especie diferente o alterada, o una molécula completamente diferente que confiere nuevas propiedades al anticuerpo quimérico, por ejemplo, una enzima, toxina, hormona, factor de crecimiento, fármaco, etc.; o (b) la región variable, o una porción de la misma, es alterada, reemplazada, o intercambiada con una región variable que tiene una especificidad antigénica diferente o alterada. Por ejemplo, un anticuerpo de ratón se puede modificar reemplazando su región constante con la región constante de una inmunoglobulina humana. Debido al reemplazo con una región constante humana, el anticuerpo quimérico puede retener su especificidad en el reconocimiento del antígeno, aunque tiene una antigenicidad reducida en el ser humano, comparado con el anticuerpo de ratón original.

Los términos "proteína C5 del complemento" o "C5" se utilizan de una manera intercambiable, y se refieren a la proteína C5 en diferentes especies. Por ejemplo, la C5 humana tiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 296, la C5 de cinomólogo tiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 297 (Macaca fascicularis) (véase la Tabla 1). La C5 humana se puede obtener a través de Quidel (Número de catálogo A403). La C5 de cinomólogo puede ser producida como se ilustra en la sección de Ejemplos más adelante.

El término "variante conservadoramente modificada" se aplica tanto a las secuencias de aminoácidos como de ácidos nucleicos. Con respecto a las secuencias de ácidos nucleicos particulares, las variantes conservadoramente modificadas se refieren a aquellos ácidos nucleicos que codifican secuencias de aminoácidos idénticas o esencialmente idénticas, o en donde el ácido nucleico no codifica una secuencia de aminoácidos, hasta secuencias esencialmente idénticas. Debido a la degeneración del código genético, un gran número de ácidos nucleicos funcionalmente idénticos codifican cualquier proteína dada. Por ejemplo, los codones GCA, GCC, GCG y GCU codifican todos al aminoácido alanina. Por consiguiente, en cada posición en donde una alanina es especificada por un codón, el codón puede ser alterado hasta cualquiera de los codones correspondientes descritos, sin alterar el polipéptido codificado. Tales variaciones de ácidos nucleicos son "variaciones silenciosas", que son una especie de variaciones conservadoramente modificadas. Cada secuencia de ácido nucleico de la presente invención que codifica un polipéptido, también describe cada posible variación silenciosa del ácido nucleico. Un experto reconocerá que cada codón en un ácido nucleico (con la excepción de AUG, que ordinariamente es el único codón para metionina, y TGG, que ordinariamente es el único codón para triptófano), puede ser modificado para proporcionar una molécula funcionalmente idéntica. De conformidad con lo anterior, cada variación silenciosa de un ácido nucleico que codifica un polipéptido está implícita en cada secuencia descrita.

Para las secuencias de polipéptidos, las "variantes conservadoramente modificadas" incluyen sustituciones, supresiones, o adiciones individuales a una secuencia de polipéptido, que dan como resultado la sustitución de un aminoácido con un aminoácido químicamente similar. Las tablas de sustitución conservadora que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares son bien conocidas en el arte. Tales variantes conservadoramente modificadas son adicionales a, y no excluyen, las variantes polimórficas, los homólogos entre especies, y los alelos de la invención. Los siguientes ocho grupos contienen los aminoácidos que son sustituciones conservadoras unas de otras: 1) Alanina (A); Glicina (G); 2) Ácido aspártico (D), Ácido glutámico (E); 3) Asparagina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Lisina (K); 5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptófano (W); 7) Serina (S), Treonina (T); y 8) Cisteína (C), Metionina (M) (véase, por ejemplo, Creighton, Proteins (1984)). En algunas realizaciones, el término "modificaciones conservadoras de secuencias", se utiliza para referirse a las modificaciones de aminoácidos que no afectan o alteran de una manera significativa las características de enlazamiento del anticuerpo que contiene la secuencia de aminoácidos.

Los términos "bloqueo cruzado", "bloqueado en forma cruzada", y "bloquear en forma cruzada", se utilizan de manera intercambiable en la presente invención, para significar la capacidad de un anticuerpo u otro agente de enlazamiento para interferir con el enlazamiento de otros anticuerpos o agentes de enlazamiento con C5, en un ensayo de enlazamiento competitivo convencional.

La capacidad o el grado hasta el cual un anticuerpo u otro agente de enlazamiento es capaz de interferir con el enlazamiento de otro anticuerpo o molécula de enlazamiento con C5, y por consiguiente, si se puede decir que bloquea en forma cruzada de acuerdo con la invención, se puede determinar empleando ensayos de enlazamiento competitivo convencionales. Un ensayo adecuado involucra el uso de la tecnología Biacore (por ejemplo, utilizando el instrumento BIAcore 300 (Biacore, Uppsala, Suecia)), que puede medir el grado de las interacciones utilizando la tecnología de resonancia de plasmón superficial. Otro ensayo para medir el bloqueo cruzado utiliza un enfoque basado en ELISA.

El término "epítopo" significa un determinante de proteína capaz de enlazarse específicamente a un anticuerpo. Los epítopos normalmente consisten en agrupaciones se superficie químicamente activa de moléculas tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcar, y usualmente tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga especificas. Los epítopos conformacionales y no conformacionales se distinguen porque se pierde el enlace con el anterior pero no con el posterior en presencia de solventes desnaturalizantes.

Como se utiliza en la presente invención, el término "alta afinidad" por un anticuerpo de lgG, se refiere a un anticuerpo que tiene una KD de 10-8 M o menos, de 10-9 M o menos, o de 10-10 M, o de 10-11 M o menos, por un antígeno objetivo. Sin embargo, el enlace de "alta afinidad" puede variar para otros isotipos de anticuerpos. Por ejemplo, el enlace de "alta afinidad" por un isotipo de IgM se refiere a un anticuerpo que tiene una KD de 10-7 M o menos, o de 10-8 M o menos.

EI término "anticuerpo humano", como se utiliza en la presente invención, pretende incluir los anticuerpos que tienen regiones variables en las cuales tanto la región de estructura como CDR se derivan de secuencias de origen humano. Adicionalmente, si el anticuerpo contiene una región constante, la región constante también se deriva de tales secuencias humanas, por ejemplo, las secuencias de línea germinal humana, o las versiones mutadas de las secuencias de línea germinal humana. Los anticuerpos humanos de la invención pueden incluir residuos de aminoácidos no codificados por secuencias humanas (por ejemplo, mutaciones introducidas mediante mutagénesis aleatoria o específica del sitio in vitro, o mediante mutación somática in vivo).

El término "anticuerpo monoclonal humano" se refiere a los anticuerpos que exhiben una sola especificidad de enlazamiento, que tienen regiones variables en las cuales tanto las regiones de estructura como CDR se derivan de secuencias humanas. En una realización, los anticuerpos monoclonales humanos son producidos por un hibridoma, el cual incluye una célula B obtenida a partir de un animal no humano transgénico, por ejemplo, un ratón transgénico, que tenga un genoma que comprenda un transgén humano de cadena pesada, y un transgén de cadena ligera fusionados a una célula inmortalizada.

Un anticuerpo "humanizado" es un anticuerpo que retiene la reactividad de un anticuerpo no humano, aunque es menos inmunogénico en los seres humanos. Esto se puede lograr, por ejemplo, reteniendo las regiones CDR no humanas, y reemplazando las partes restantes del anticuerpo con sus contrapartes humanas (es decir, la región constante así como las porciones de estructura de la región variable). Véanse, por ejemplo, Morrison y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 81: 6851 - 6855, 1984; Morrison y Oi, Adv. lmmunol., 44: 65 - 92, 1988; Verhoeyen y colaboradores, Science, 239: 1534 - 1536, 1988; Padlan, Molec. Immun., 28: 489 - 498, 1991; y Padlan, Molec. Immun., 31: 169 - 217, 1994. Otros ejemplos de la tecnología de ingeniería humana incluyen, pero no se limitan a, la tecnología Xoma que se da a conocer en la patente de los Estados Unidos de Norteamérica No.

5.766.886.

Los términos "idéntica" o porcentaje de "identidad", en el contexto de dos o más secuencias de ácidos nucleicos o de polipéptidos, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales. Dos secuencias son "sustancialmente idénticas" si las dos secuencias tienen un porcentaje especificado de residuos de aminoácidos o nucleótidos que son iguales (es decir, identidad del 60%, opcionalmente identidad del 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, o 99% sobre una región especificada, o, cuando no se especifica, sobre toda la secuencia), cuando se comparan y alinean para una máxima correspondencia sobre una ventana de comparación, o la región designada medida utilizando uno de los siguientes algoritmos de comparación de secuencias, o mediante alineación manual e inspección visual. Opcionalmente, la identidad existe sobre una región que es de al menos aproximadamente 50 nucleótidos (o 10 aminoácidos) de longitud, o más preferiblemente, sobre una región que es de 100 a 500 o 1.000 o más nucleótidos (o 20, 50, 200 o más aminoácidos) de longitud.

Para la comparación de secuencias, típicamente una secuencia actúa como una secuencia de referencia, con la cual se comparan las secuencias de prueba. Cuando se utiliza un algoritmo de comparación de secuencias, se introducen las secuencias de prueba y de referencia en un ordenador, se designan las coordenadas de las subsecuencias, si es necesario, y se designan los parámetros del programa de algoritmos de secuencias. Se pueden utilizar los parámetros del programa por defecto, o se pueden designar parámetros alternativos. El algoritmo de comparación de secuencias calcula entonces el porcentaje de identidad de secuencia para las secuencias de prueba en relación con la secuencia de referencia, con base en los parámetros del programa.

Una "ventana de comparación", como se utiliza en la presente invención, incluye la referencia a un segmento de cualquiera cantidad de posiciones contiguas seleccionadas a partir del grupo que consiste de 20 a 600, usualmente de aproximadamente 50 hasta aproximadamente 200, más usualmente de aproximadamente 100 hasta aproximadamente 150, en la cual se puede comparar una secuencia con una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas después de que se alinean óptimamente las dos secuencias. Los métodos de alineación de secuencias para comparación son bien conocidos en el arte. La alineación óptima de secuencias por comparación se puede realizar, por ejemplo, por medio el algoritmo de homología local de Smith y Waterman (1970) Adv. Appl. Math. 2: 482c, por medio del algoritmo de alineación de homología de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol.

48: 443, 1970, por el método de búsqueda de similitudes de Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 85: 2444, 1988, mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA en el paquete de software de Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), o mediante alineación manual e inspección visual (véase, por ejemplo, Brent y colaboradores, Current Protocols in Molecular Bilogy, John Wiley & Sons, Inc. (ringbou ed., 2003)).

Dos ejemplos de algoritmos que son adecuados para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y la similitud de secuencia son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, que se describen en Altschul y colaboradores, Nuc. Acids es. 25: 3389 - 3402, 1997; y Altschul y colaboradores, J. Mol. Biol. 215: 403 - 410, 1990, respectivamente. El software para la realización de los análisis por BLAST se encuentra públicamente disponible a través del National Center for Biotechnology Information. Este algoritmo implica identificar primero pares de secuencias de alta puntuación (los HSP) mediante la identificación de palabras cortas de longitud W en la secuencia de consulta, que o bien coincide o satisface algún puntaje de umbral valorado como positivo T cuando se alinea con una palabra de la misma longitud en una secuencia de una base de datos. T se refiere al umbral de puntuación de la palabra vecina (Altschul y colaboradores, ver más arriba). Estos aciertos iniciales de la palabra vecina actúan como semillas para iniciar las búsquedas con el fin de encontrar HSP más largos que las contengan. Los aciertos de palabras se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia para hasta donde se puede aumentar el puntaje de alineación acumulativo. Los puntajes acumulativos se calculan utilizando, para las secuencias de nucleótidos, los parámetros M (puntaje de recompensa para un par de residuos emparejados; siempre >0), y N (puntaje de penalización para los residuos mal emparejados; siempre <0). Para las secuencias de aminoácidos, se utiliza una matriz de puntuación para calcular el puntaje acumulativo. La extensión de los aciertos de palabra en cada dirección se detienen cuando: el puntaje de alineación acumulativo cae en una cantidad X desde su máximo valor alcanzado; el puntaje acumulativo llega a cero o menos, debido a la acumulación de una o más alineaciones de residuos de puntuación negativa; o se llega al final de cualquiera de las secuencias. Los parámetros W, T, y X del algoritmo BLAST determinan la sensibilidad y velocidad de la alineación. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) utiliza como predeterminados una longitud de palabra (W) de 11, una expectativa (E) de 10, M = 5, N = 4, y una comparación de ambas cadenas. Para las secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP utiliza como predeterminados una longitud de palabra de 3, y una expectativa (E) de 10, y la matriz de puntuación BLOSUM62 (véase Henikoff y Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 89: 10915, 1989) alineaciones (B) de 50, expectativa (E) de 10, M = 5, N = -4, y una comparación de ambas cadenas.

EI algoritmo BLAST también lleva a cabo un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias (véase, por ejemplo, Karlin y Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 90: 5873 - 5787, 1993). Una medida de similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma más pequeña (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad por la cual se presentaría por azar un emparejamiento entre dos secuencias de nucleótidos o de aminoácidos. Por ejemplo, un ácido nucleico se considera similar a una secuencia de referencia si la probabilidad de suma más pequeña en una comparación del ácido nucleico de prueba con el ácido nucleico de referencia es aproximadamente menor a 0,2, más preferiblemente aproximadamente menor a 0,01, y de una manera muy preferible aproximadamente menor a 0,001.

El porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos también se puede determinar utilizando el algoritmo de E. Meyers y W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4: 11 - 17, 1988), que se ha incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0), utilizando una tabla de residuos ponderados PAM120, una penalización por longitud de espacio de 12, y una penalización por espacio de 4. Además, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se puede determinar utilizando el algoritmo de Needleman y Wunsch (J. Mol, Biol. 48: 444 - 453, 1970), que se ha incorporado en el programa GAP en el paquete de software de GCG (disponible en www.gcg.com), utilizando ya sea una matriz BLOSUM62 o bien una matriz PAM250, y un peso por espacio de 16, 14, 12, 10, 8, 6, o 4, y un peso por longitud de 1,2,3, 4, 5, o 6.

Diferente al porcentaje de identidad de secuencias observado anteriormente, otra indicación de que dos secuencias de ácidos nucleicos o polipéptidos son sustancialmente idénticas, es que el polipéptido codificado por el primer ácido nucleico reacciona inmunológicamente en forma cruzada con los anticuerpos surgidos contra el polipéptido codificado por el segundo ácido nucleico, como se describe más adelante. Por consiguiente, un polipéptido típicamente es sustancialmente idéntico a un segundo polipéptido, por ejemplo, cuando los dos polipéptidos difieren solamente por sustituciones conservadoras. Otra indicación de que dos secuencias de ácidos nucleicos son sustancialmente idénticas, es que las dos moléculas o sus complementos hibridan entre sí bajo condiciones rigurosas, como se describe más adelante. Aún otra indicación de que dos secuencias de ácidos nucleicos son sustancialmente idénticas, es que se pueden utilizar los mismos cebadores para amplificar la secuencia.

El término "anticuerpo aislado" se refiere a un anticuerpo que está sustancialmente libre de otros anticuerpos que tienen diferentes especificidades antigénicas (por ejemplo, un anticuerpo aislado que se enlaza específicamente a C5 está sustancialmente libre de anticuerpos que se enlacen específicamente con antígenos diferentes a C5). Un anticuerpo aislado que se enlaza específicamente a C5 puede, sin embargo, tener reactividad cruzada con otros antígenos. Más aún, un anticuerpo aislado puede estar sustancialmente libre de otro material celular y/o de compuestos químicos.

El término "isotipo" se refiere a la clase de anticuerpos (por ejemplo, IgM, lgE, IgG, tal como IgG1 o IgG4), que es proporcionada por los genes de región constante de cadena pesada. Un isotipo también incluye las versiones modificadas de una de estas clases, en donde se han hecho las modificaciones para alterar la función de Fc, por ejemplo, para mejorar o reducir las funciones efectoras o el enlazamiento con los receptores de Fc.

El término "Kasoc" o "Ka", como se utiliza en la presente invención, pretende hacer referencia al índice de asociación de una interacción particular anticuerpo-antígeno, mientras que el término "Kdis" o Kd" como se utiliza en la presente invención, pretende referirse al índice de disociación de una interacción particular anticuerpo-antígeno. El término "KD", como se utiliza en la presente invención, pretende hacer referencia a la constante de disociación, que se obtiene a partir de la relación de Kd con respecto a Ka (es decir, Kd/Ka), y se expresa como una concentración molar (M). Los valores de KD para los anticuerpos se pueden determinar empleando métodos bien establecidos en el arte. Un método para determinar la KD de un anticuerpo, es mediante la utilización de resonancia del plasmón superficial, o mediante la utilización de un sistema biosensor, tal como un sistema Biacore®.

Los términos "anticuerpo monoclonal" o "composición de anticuerpo monoclonal", como se utilizan en la presente invención, se refieren a una preparación de moléculas de anticuerpo de una sola composición molecular. Una composición de anticuerpo monoclonal exhibe una sola especificidad y afinidad de enlazamiento por un epítopo particular.

EI término "ácido nucleico" se utiliza en la presente invención de una manera intercambiable con el término "polinucleótido", y se refiere a desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos y polímeros de los mismos, ya sea en forma monocatenaria o bicatenaria. El término abarca los ácidos nucleicos que contienen análogos de nucleótidos conocidos, o residuos o enlaces de cadena principal modificados, que son sintéticos, de origen natural, y que no se presentan naturalmente, que tienen propiedades de enlazamiento similares a las del ácido nucleico de referencia, y que se metabolizan de una manera similar a los nucleótidos de referencia. Los ejemplos de tales análogos incluyen, sin limitación, fosforotioatos, fosforamidatos, fosfonatos de metilo, fosfonatos de metilo quirales, 2-O-metilribonucleótidos, ácidos nucleicos peptídicos (PNA).

A menos que se indique otra cosa, una secuencia de ácido nucleico particular también abarca implícitamente variantes conservadoramente modificadas de la misma (por ejemplo, sustituciones de codones degenerados), y secuencias complementarias, así como la secuencia explícitamente indicada. Específicamente, como se detalla más adelante, se pueden lograr sustituciones de codones degenerados mediante la generación de secuencias en las que la tercera posición de uno o más codones seleccionados (o todos), está sustituida con residuos de base mixta y/o de desoxiinosina (Batzer y colaboradores, Nucleic Acid Res. 19: 5081, 1991; Ohtsuka y colaboradores, J. Biol. Chem.

260: 2605 - 2608, 1985; y Rossolini y colaboradores, Mol. Cell. Probes 8: 91 - 98, 1994).

El término "operablemente enlazado" se refiere a una relación funcional entre dos o más segmentos de polinucleótido (por ejemplo, ADN). Típicamente, se refiere a la relación funcional de una secuencia reguladora de transcripción con una secuencia transcrita. Por ejemplo, una secuencia promotora o potenciadora se enlaza operablemente a una secuencia de codificación si estimula o modula la transcripción de la secuencia de codificación en una célula huésped apropiada o en otro sistema de expresión. Generalmente, las secuencias reguladoras de transcripción del promotor que se enlazan operablemente a una secuencia transcrita, están físicamente contiguas a la secuencia transcrita, es decir, actúan en forma cis. Sin embargo, algunas secuencias reguladoras de transcripción, tales como las potenciadoras, no necesitan estar físicamente contiguas o localizadas en estrecha proximidad a las secuencias de codificación cuya transcripción potencian.

Como se utiliza en la presente invención, el término "optimizada" significa que una secuencia de nucleótidos ha sido alterada para codificar una secuencia de aminoácidos, utilizando los codones que son preferidos en la célula u organismo productor, en general una célula eucariota, por ejemplo, una célula de Pichia, una célula de ovario de hámster chino (CHO), o una célula humana. La secuencia de nucleótidos optimizada se diseña genéticamente para retener completamente o tanto como sea posible la secuencia de aminoácidos originalmente codificada por la secuencia de nucleótidos de partida, que también se conoce como la secuencia "progenitora". Las secuencias optimizadas de la presente invención se han diseñado genéticamente para tener codones que sean preferidos en las células de mamífero. Sin embargo, también se prevé en la presente invención la expresión optimizada de estas secuencias en otras células eucariotas o células procariotas. Las secuencias de aminoácidos codificadas por las secuencias optimizadas de nucleótidos también se denominan como optimizadas.

Los términos "polipéptido" y "proteína" se utilizan de una manera intercambiable en la presente invención para referirse a un polímero de residuos de aminoácidos. Los términos se aplican a los polímeros de aminoácidos en los que uno o más residuos de aminoácidos son un mimético químico artificial de un aminoácido correspondiente de origen natural, así como a los polímeros de aminoácidos de origen natural y a los polímeros de aminoácidos de origen no natural. A menos que se indique otra cosa, una secuencia particular de polipéptidos también abarca implícitamente variantes conservadoramente modificadas de la misma.

EI término "anticuerpo humano recombinante", como se utiliza en la presente invención, incluye todos los anticuerpos humanos que se preparan, se expresan, se crean, o se aíslan por medios recombinantes, tales como los anticuerpos aislados a partir de un animal (por ejemplo, un ratón) que sea transgénico o transcromosómico para los genes de inmunoglobulina humana, o un hibridoma preparado a partir de los mismos, los anticuerpos aislados a partir de una célula huésped transformada para expresar el anticuerpo humano, por ejemplo, a partir de un transfectoma, los anticuerpos aislados a partir de una biblioteca de anticuerpos humanos recombinantes, de combinación y los anticuerpos preparados, expresados, creados, o aislados por cualquier otro medio que involucre el empalme de todo o una porción de un gen de inmunoglobulina humana, las secuencias para otras secuencias de ADN. Estos anticuerpos humanos recombinantes tienen regiones variables en donde las regiones de estructura y las regiones CDR se derivan a partir de las secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. Sin embargo, en ciertas realizaciones, estos anticuerpos humanos recombinantes se pueden someter a mutagénesis in vitro (o, cuando se utiliza un animal transgénico para las secuencias de Ig humana, mutagénesis somática in vivo), y por lo tanto, las secuencias de aminoácidos de las regiones VH y VL de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, aunque se derivan a partir de, y se relacionan con las secuencias de VH y VL de línea germinal humana, pueden no existir naturalmente dentro del repertorio de la línea germinal de anticuerpos humanos in vivo.

EI término "célula huésped recombinante" (o simplemente "célula huésped") se refiere a una célula en la que se ha introducido un vector de expresión recombinante. Se debe entender que estos términos pretenden referirse no solamente a la célula objetivo particular, sino también a la progenie de dicha célula. Debido a que se pueden presentar ciertas modificaciones en las siguientes generaciones debido ya sea a mutación o a influencias del medio ambiente, esta progenie, de hecho, puede no ser idéntica a la célula progenitora, pero todavía se puede incluir dentro del alcance del término "célula huésped" como se utiliza en la presente invención.

El término "sujeto" incluye animales humanos y no humanos. Los animales no humanos incluyen a todos los vertebrados, por ejemplo, mamíferos y no mamíferos, tales como primates no humanos, ovejas, perros, vacas, pollos, anfibios, y reptiles. Excepto cuando se haga la observación, los términos "paciente" o sujeto" se utilizan en la presente invención de una manera intercambiable.

El término "tratamiento" incluye la administración de composiciones o anticuerpos para prevenir o retrasar el inicio de los síntomas, complicaciones, o indicios bioquímicos de una enfermedad (por ejemplo, degeneración macular relacionada con la edad), para aliviar los síntomas o detener o inhibir el desarrollo adicional de la enfermedad, condición, o trastorno. El tratamiento puede ser profiláctico (para prevenir o retrasar el inicio de la enfermedad, o para prevenir la manifestación de los síntomas clínicos o subclínicos de la misma), o la supresión terapéutica o el alivio de los síntomas después de la manifestación de la enfermedad.

El término "vector" pretende referirse a una molécula de polinucleótido capaz de transportar a otro polinucleótido con el que se ha enlazado. Un tipo de vector es un "plásmido", el cual se refiere a un bucle de ADN bicatenario circular dentro del cual se pueden ligar segmentos adicionales de ADN. Otro tipo de vector es un vector viral, en donde se pueden ligar segmentos de ADN adicionales en el genoma viral. Ciertos vectores son capaces de replicación autónoma en una célula huésped en la cual se introducen (por ejemplo, los vectores bacterianos que tienen un origen bacteriano de replicación, y los vectores de mamífero episomales). Otros vectores (por ejemplo, vectores de mamífero no episomales) se pueden integrar en el genoma de una célula huésped después de su introducción en la célula huésped, y de esta manera, se replican junto con el genoma del huésped. Más aún, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de los genes con los que se enlazan operativamente. Estos vectores se denominan en la presente invención como "vectores de expresión recombinante" (o simplemente, "vectores de expresión"). En general, los vectores de expresión útiles en las técnicas de ADN recombinante están con frecuencia en la forma de plásmidos. En la presente memoria descriptiva, "plásmido" y "vector" se pueden utilizar de una manera intercambiable, debido a que el plásmido es la forma más comúnmente utilizada de vector. Sin embargo, la invención pretende incluir las otras formas de vectores de expresión, tales como vectores virales (por ejemplo, retrovirus de replicación defectuosa, adenovirus, y virus adeno-asociados), los cuales sirven funciones equivalentes.

4. Breve descripción de las figuras

La Figura 1 muestra las alineaciones de las regiones variables de los anticuerpos seleccionados con sus secuencias de la línea germinal humana más estrechamente relacionadas.

La Figura 2 muestra un ensayo hemolítico en el que se titula la C5 humana en el suero agotado en C5 humana, para determinar la actividad de C5.

La Figura 3 muestra la titulación del suero de cinomólogo en el suero agotado en C5 humana, para determinar la concentración óptima de C5 de cinomólogo, para el ensayo hemolítico de la ruta alternativa.

La Figura 4 muestra ejemplos de los ensayos hemolíticos de la ruta clásica con suero humano al 20%.

La Figura 5 muestra un ejemplo de ensayos hemolíticos de la ruta alternativa con 100 pM de la C5 humana purificada agregada al suero agotado en C5 humana.

La Figura 6 muestra los ejemplos de ensayos hemolíticos de la ruta alternativa con suero de cinomólogo al 0,025% agregado al suero agotado en C5 humana.

La Figura 7 muestra los ejemplos de ensayos hemolíticos de la ruta clásica (suero humano al 20%), con Fab maduros, en comparación con sus progenitores respectivos.

La Figura 8 muestra los ejemplos de ensayos hemolíticos de la ruta clásica (suero de cinomólogo al 5%) con Fab maduros.

La Figura 9 muestra la caracterización del Fab madurado por afinidad en el ensayo hemolítico de la ruta alternativa,

utilizando 100 pM de C5 humana agregada al suero agotado en C5 humana al 20%. La Figura 10 muestra la caracterización del Fab madurado por afinidad en el ensayo hemolítico de la ruta alternativa, utilizando suero humano al 20%.

La Figura 11 muestra la caracterización del Fab madurado por afinidad en el ensayo hemolítico de la ruta alternativa,

utilizando 100 pM de C5 de cinomólogo agregada al suero agotado en C5 humana al 20%. La Figura 12 muestra la caracterización de las lgG de la línea germinal en el ensayo hemolítico de la ruta clásica, utilizando suero humano al 20%.

La Figura 13 muestra la caracterización de las IgG de la línea germinal en el ensayo hemolítico de la ruta clásica,

utilizando suero de cinomólogo al 5%. La Figura 14 muestra la caracterización de las IgG de la línea germinal en el ensayo hemolítico de la ruta alternativa, 100 pM de C5 humana.

La Figura 15 muestra la caracterización de las IgG de la línea germinal final en el ensayo hemolítico de la ruta

alternativa, y el ELISA de generación de C5a, utilizando suero humano al 20%. La Figura 16 muestra la caracterización del Fab madurado por afinidad en el ELISA de C5a, utilizando el sobrenadante de los ensayos hemolíticos de suero humano al 20%.

La Figura 17 muestra el ELISA en solución de especificidad sobre el anticuerpo 7091 para el análisis de C3, C4, C5

humanas, y C5 de cinomólogo, y sus derivados. La Figura 18 muestra los ensayos de estabilidad en suero (enlazamiento con C5 humana en presencia de suero al 50%) con los Fab.

La Figura 19 muestra el enlazamiento del epítopo de algunos Fab mejorados por afinidad. La Figura 20 muestra un ELISA para el enlace del anticuerpo con C5 quimérica de ratón-humana o con C5 humana,

para determinar los enlazadores de la cadena alfa versus los enlazadores de la cadena beta. C5 fue presentada por 5G1.1, para determinar la competencia con 5G1.1. La Figura 21 muestra el ELISA para probar los enlazadores de la cadena alfa versus los enlazadores de la cadena

beta con la captura de 5G1.1.

La Figura 22 muestra los resultados del ensayo hemolítico para la prueba de los enlazadores de la cadena alfa versus la cadena beta. La Figura 23 muestra la proteólisis de la termolisina de los Fab progenitores a 37°C (a los 0, 30, 60, y 90 minutos). La Figura 24 muestra la proteólisis de la termolisina de los Fab progenitores a 55°C (a los 0, 30, 60, y 90 minutos). La Figura 25 muestra la sensibilidad a la termolisina de los Fab maduros a 37°C. La Figura 26 muestra la sensibilidad a la termolisina de los Fab maduros a 55°C. La Figura 27 muestra ejemplos de la inhibición de Fab de una ruta alternativa en el ensayo de deposición de CAM.

5. Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona anticuerpos que se enlazan específicamente a la proteína C5 del complemento (por ejemplo, C5 humana, C5 de cinomólogo), composiciones farmacéuticas, métodos de producción, y métodos de uso de estos anticuerpos y composiciones.

5.1 Anticuerpos de C5.

La presente invención proporciona anticuerpos que se enlazan específicamente a C5 (por ejemplo, C5 humana, C5 de cinomólogo). En un aspecto de la divulgación, se proporcionan anticuerpos que se enlazan específicamente tanto a C5 humana como de cinomólogo. Los anticuerpos de la invención incluyen, pero no se limitan a, los anticuerpos monoclonales humanos, aislados como se describe en los ejemplos (véase la sección 6 más adelante).

La presente invención proporciona anticuerpos que se enlazan específicamente a una proteína C5 (por ejemplo, C5 humana y/o de cinomólogo), comprendiendo estos anticuerpos un dominio VH que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7.

En un aspecto de la divulgación se proporcionan anticuerpos que se enlazan específicamente a una proteína C5 (por ejemplo, C5 humana y/o de cinomólogo), comprendiendo estos anticuerpos un dominio VH que tiene una secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 23, 39, 51, 67, 79, 96, 108, 114, 121, 137, 151, 165, 179, 187, 201, 210, 218, 227, 241, 253, 257, 273, 277, o 281. En un aspecto de la divulgación se proporcionan anticuerpos que se enlazan específicamente a una proteína C5 (por ejemplo, C5 humana y/o de cinomólogo), comprendiendo estos anticuerpos una CDR VH que tiene una secuencia de aminoácidos de cualquiera de las CDR VH enlistadas en la Tabla 1, más adelante. En particular, se divulgan anticuerpos que se enlazan específicamente a una proteína C5 (por ejemplo, C5 humana y/o de cinomólogo), comprendiendo estos anticuerpos (o alternativamente, consistiendo de) una, dos, tres, cuatro, cinco, o más CDR VH, que tienen una secuencia de aminoácidos de cualquiera de las CDR VH enlistadas en la Tabla 1 más adelante.

La presente invención proporciona anticuerpos que se enlazan específicamente a una proteína C5 (por ejemplo, C5 humana y/o de cinomólogo), comprendiendo estos anticuerpos un dominio VL que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8.

En un aspecto de la divulgación se proporcionan anticuerpos que se enlazan específicamente a una proteína C5 (por ejemplo, C5 humana y/o de cinomólogo), comprendiendo estos anticuerpos un dominio VL que tiene una secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 24, 40, 52, 68, 80, 90, 102, 122, 138, 152, 166, 180, 188, 202, 211, 219, 228, 242, 261, 265, 269, 285, o 289. En un aspecto de la divulgación se proporcionan anticuerpos que se enlazan específicamente a una proteína C5 (por ejemplo, C5 humana y/o de cinomólogo), comprendiendo estos anticuerpos una CDR VL que tiene una secuencia de aminoácidos de cualquiera de las CDR VL enlistadas en la Tabla 1 más adelante. En particular, se divulgan anticuerpos que se enlazan específicamente a una proteína C5 (por ejemplo, C5 humana y/o de cinomólogo), comprendiendo estos anticuerpos (o alternativamente, consistiendo de) una, dos, tres, o más CDR VL que tienen una secuencia de aminoácidos de cualquiera de las CDR VL enlistadas en la Tabla 1 más adelante.

Se divulgan anticuerpos que incluyen aminoácidos que han sido mutados, y todavía tienen una identidad de al menos el 60, 70, 80, 90, o el 95% en las regiones CDR, con las regiones CDR ilustradas en las secuencias descritas en la Tabla 1. Un aspecto de la divulgación incluye secuencias de aminoácidos mutantes, en donde se han mutado no más de 1, 2, 3, 4, o 5 aminoácidos en las regiones CDR, cuando se comparan con las regiones CDR ilustradas en la secuencia descrita en la Tabla 1.

La presente invención también proporciona secuencias de ácidos nucleicos que codifican VH, VL, la cadena pesada de longitud completa, y la cadena ligera de longitud completa, de los anticuerpos que se enlazan específicamente a una proteína C5 (por ejemplo, C5 humana y/o de cinomólogo). Estas secuencias de ácidos nucleicos se pueden optimizar para su expresión en células de mamífero (por ejemplo, la Tabla 1 muestra las secuencias optimizadas de ácidos nucleicos para la cadena pesada y la cadena ligera de los anticuerpos 8109, 8110, 8111, 8113, 8114, 8112, 8125, 8126, 8127, 8128, 8129, 8130, 8131, 8132, y 8091).

Tabla No 1. Ejemplos de anticuerpos contra C5 de la presente invención y proteína C5

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Otros anticuerpos de la invención incluyen aquéllos en donde los aminoácidos o los ácidos nucleicos que codifican los aminoácidos han sido mutados, y no obstante, tienen una identidad de al menos el 60, 70, 80, 90, o el 95% con las secuencias descritas en la Tabla 1. Otros anticuerpos de la divulgación incluyen secuencias de aminoácidos mutantes, en donde se han mutado no más de 1, 2, 3, 4, o 5 aminoácidos en las regiones variables, cuando se comparan con las regiones variables ilustradas en la secuencia descrita en la Tabla 1, aunque retienen sustancialmente la misma actividad terapéutica.

Debido a que cada uno de estos anticuerpos se pueden enlazar a C5, las secuencias de VH, VL, cadena ligera de longitud completa, y cadena pesada de longitud completa (las secuencias de aminoácidos y las secuencias de nucleótidos que codifican las secuencias de aminoácidos), se pueden "mezclar y emparejar", para crear otros anticuerpos de la invención que se enlazan a C5. Estos anticuerpos que se enlazan a C5 "mezclados y emparejados" se pueden probar utilizando los ensayos de enlazamiento conocidos en la técnica (por ejemplo, los ELISA, y otros ensayos descritos en la sección de ejemplos). Cuando estas cadenas se mezclan y se emparejan, una secuencia VH de un apareamiento particular de VHNL debe ser reemplazada con una secuencia VH estructuralmente similar. Igualmente, una secuencia de cadena pesada de longitud completa de un apareamiento particular de cadena pesada de longitud completa / cadena ligera de longitud completa, debe ser reemplazada con una secuencia de cadena pesada de longitud completa estructuralmente similar. Igualmente, una secuencia VL de un apareamiento particular de VHNL debe ser reemplazada con una secuencia VL estructuralmente similar. Igualmente, una secuencia de cadena ligera de longitud completa de un apareamiento particular de cadena pesada de longitud completa / cadena ligera de longitud completa, debe ser reemplazada con una secuencia de cadena ligera de longitud completa estructuralmente similar. De conformidad con lo anterior, en una realización se proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o una región del mismo de enlazamiento del antígeno, que tiene: una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que consiste de la SEQ ID NO: 7; y una región variable de cadena liviana que comprende una secuencia de aminoácidos que consiste de la SEQ ID NO: 8; en donde el anticuerpo se enlaza específicamente a C5 (por ejemplo, C5 humana y/o de cinomólogo). Por lo tanto, en un aspecto de la divulgación se proporciona un anticuerpo monoclonal aislado o región del mismo de enlazamiento del antígeno que tiene: una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 23, 39, 51, 67, 79, 96, 108, 114, 121, 137, 151, 165, 179, 187, 201, 210, 218, 227, 241, 253, 257, 273, 277, y 281; y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 24, 40, 52, 68, 80, 90, 102, 122, i38, 152, 166,180, 188, 202, 211, 219, 228, 242, 261, 265, 269, 285 y 289; en donde el anticuerpo se enlaza específicamente a C5 (por ejemplo, C5 humana y/o de cinomólogo).

En un aspecto de la divulgación se proporciona: (i) un anticuerpo monoclonal aislado, el cual tiene: una cadena pesada de longitud completa que comprende una secuencia de aminoácidos que se ha optimizado para su expresión en la célula de un mamífero, seleccionada a partir del grupo que consiste de las SEQ lD NOs: 9, 25, 41, 53, 69, 81, 97, 109, 115, 123, 139, 153, 167, 181, 189, 203, 212, 220, 229, 243, 249, 254, 258, 274, 278, y 282; y una cadena ligera de longitud completa que comprende una secuencia de aminoácidos que se ha optimizado para su expresión en la célula de un mamífero, seleccionada a partir del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 10, 26, 42, 54, 70, 82, 91, 103, 124, 140, 154, 168, 182, 190, 204, 213, 221, 230, 244, 251, 262, 266, 270, 286, y 290; o (ii) una proteína funcional que comprende una porción de la misma de enlazamiento al antígeno.

En otro aspecto, la divulgación proporciona anticuerpos de enlazamiento de C5 que comprenden las CDR1, CDR2, y CDR3 de cadena pesada y de cadena ligera, como se describe en la Tabla 1, o combinaciones de las mismas. Las secuencias de aminoácidos de las CDR1 VH de los anticuerpos se muestran en las SEQ ID NOs: 1, 17, 33, 61, 131, 145, 159, 173, 195, y 235. Las secuencias de aminoácidos de la CDR2 VH de los anticuerpos se muestran en las SEQ ID NOs: 2,18, 34, 49, 62, 77, 95, 107, 113, 119, 132,146, 160, 174, 196, 226, y 236. Las secuencias de aminoácidos de las CDR3 VH de los anticuerpos se muestran en las SEQ ID NOs: 3, 19, 35, 63, 133, 147, 161, 175, 197, y 237. Las secuencias de aminoácidos de las CDR1 VL de los anticuerpos se muestran en las SEQ ID NOs: 4, 20, 36, 64, 134, 148, 162, 176, 198, y 238. Las secuencias de aminoácidos de las CDR2s VL de los anticuerpos se muestran en las SEQ ID NOs: 5, 21, 37, 65,135, 149, 163, 177, 199, y 239. Las secuencias de aminoácidos de las CDR3s VL de los anticuerpos se muestran en las SEQ ID NOs: 6, 22, 38, 50, 66, 78, 89, 101, 120, 136, 150, 164, 178, 200,209, y 240. Las regiones CDR se delinean utilizando el sistema de Kabat (Kabat, E. A. y colaboradores, 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos, Publicación de NIH No. 91-3242).

Dado que cada uno de estos anticuerpos puede enlazarse a C5, y que la especificidad de enlazamiento del antígeno es proporcionada primordialmente por las regiones CDR1, 2, y 3, las secuencias de CDR1, 2, y 3 VH, y las secuencias de CDR1, 2, y 3 VL, se pueden "mezclar y emparejar" (es decir, las CDR de diferentes anticuerpos se pueden mezclar y emparejar, aunque cada anticuerpo debe contener una CDR1, 2, y 3 VH y una CDR1, 2, y 3 VL, para crear otras moléculas de enlazamiento de C5 de la invención. Estos anticuerpos de enlazamiento de C5 "mezclados y emparejados" se pueden probar utilizando los ensayos de enlazamiento conocidos en la técnica, y aquéllos descritos en los Ejemplos (por ejemplo, los ELISA). Cuando las secuencias de CDR VH se mezclan y se emparejan, la secuencia de CDR1, CDR2, y/o CDR3 de una secuencia VH particular debe ser reemplazada con

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una(s) secuencia(s) de CDR estructuralmente similar(es). Igualmente, cuando las secuencias de CDR VL se mezclan y se emparejan, la secuencia de CDR1, CDR2, y/o CDR3 de una secuencia particular VL, debe ser reemplazada con una(s) secuencia(s) de CDR estructuralmente similar(es). Será fácilmente evidente para el experto ordinariamente capacitado que se pueden crear secuencias VH y VL novedosas, sustituyendo una o más secuencias de la región CDR VH y/o VL con secuencias estructuralmente similares a partir de las secuencias de CDR mostradas en la presente invención para los anticuerpos monoclonales de la presente invención.

De conformidad con Io anterior, en un aspecto de la invención se proporciona un anticuerpo monoclonal aislado o una región del mismo de enlazamiento del antígeno, que comprende una CDR1 de la región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 1, 17, 33, 61, 131, 145, 159, 173, 195, y 235; una CDR2 de la región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste de las SEQ lD NOs: 2, 18, 34, 49, 62, 77, 95, 107, 113, 119, 132, 146, 160, 174, 196, 226, y 236; una CDR3 de la región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 3, 19, 35, 63, 133, 147, 161, 175, 197, y 237; una CDR1 de la región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 4, 20, 36, 64, 134, 148, 162, 176, 198, y 238; una CDR2 de la región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 5, 21, 37, 65, 135, 149, 163, 177, 199, y 239; y una CDR3 de la región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 6, 22, 38, 50, 66, 78, 89, 101, 120, 136, 150, 164, 178, 200, 209, y 240; en donde el anticuerpo se enlaza específicamente a C5.

En una realización específica, se proporciona un anticuerpo que se enlaza específicamente a C5, que comprende una CDR1 de la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 1; una CDR2 de la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 2; una CDR3 de la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 3; una CDR1 de la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 4; una CDR2 de la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 5; y una CDR3 de la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 6. En un aspecto de la divulgación, se proporciona un anticuerpo que se enlaza específicamente a C5, que comprende una CDR1 de la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 17; una CDR2 de la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 18; una CDR3 de la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 19; una CDR1 de la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 20; una CDR2 de la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 21; y una CDR3 de la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 22.

En un aspecto de la divulgación, se proporciona un anticuerpo que se enlaza específicamente a C5, que comprende una CDR1 de la región variable de cadena pesada de la SEQ lD NO: 33; una CDR2 de la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 34; una CDR3 de la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 35; una CDR1 de la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 36; una CDR2 de la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 37; y una CDR3 de la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 38. En un aspecto de la divulgación, se proporciona un anticuerpo que se enlaza específicamente a C5, que comprende una CDR1 de la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 17; una CDR2 de la región variable de cadena pesada de la SEQ lD NO: 49; una CDR3 de la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 19; una CDR1 de la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 20; una CDR2 de la región variable de cadena ligera de la SEQ lD NO: 21; y una CDR3 de la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 50.

En un aspecto de la divulgación, se proporciona un anticuerpo que se enlaza específicamente a C5, que comprende una CDR1 de la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 61; una CDR2 de la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 62; y una CDR3 de la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 63; una CDR1 de la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 64; una CDR2 de la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 65; y una CDR3 de la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 66. En un aspecto de la divulgación, se proporciona un anticuerpo que se enlaza específicamente a C5, que comprende una CDR1 de la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 61; una CDR2 de la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 77; una CDR3 de la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 63; una CDR1 de la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 64; una CDR2 de la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 65; y una CDR3 de la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 78.

En un aspecto de la divulgación, se proporciona un anticuerpo que se enlaza específicamente a C5, que comprende una CDR1 de la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 61; una CDR2 de la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 77; y una CDR3 de la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 63; una CDR1 de la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 64; una CDR2 de la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 6.5; y una CDR3 de la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 89. En un aspecto de la divulgación, se proporciona un anticuerpo que se enlaza específicamente a C5, que comprende una CDR1 de la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 61; una CDR2 de la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 62; una CDR3 de la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 63; una CDR1 de la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 64; una CDR2 de la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 65; y una CDR3 de la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 89.

En un aspecto de la divulgación, se proporciona un anticuerpo que se enlaza específicamente a C5, que comprende una CDR1 de la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 61; una CDR2 de la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 95; y una CDR3 de la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 63; una CDR1 de la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 64; una CDR2 de la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 65; y una CDR3 de la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 89. En un aspecto de la divulgación, se proporciona un anticuerpo que se enlaza específicamente a C5, que comprende una CDR1 de la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 17; una CDR2 de la región variable de cadena pesada de la SEQ lD NO: 49; una CDR3 de la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 19; una CDR1 de la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 20; una CDR2 de la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 21; y una CDRS de la región variable de cadena ligera de la SEQ lD NO: 101.

En un aspecto de la divulgación, se proporciona un anticuerpo que se enlaza específicamente a C5, que comprende una CDR1 de la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 17; una CDR2 de la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 107; y una CDR3 de la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 19; una CDR1 de la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 20; una CDR2 de la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 21; y una CDR3 de la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 22. En un aspecto de la divulgación, se proporciona un anticuerpo que se enlaza específicamente a C5, que comprende una CDR1 de la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 17; una CDR2 de la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 107; una CDR3 de la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 19; una CDR1 de la región variable de cadena ligera de la SEQ lD NO: 20; una CDR2 de la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 21; y una CDR3 de la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 101.

En un aspecto de la divulgación, se proporciona un anticuerpo que se enlaza específicamente a C5, que comprende una CDR1 de la región variable de cadena pesada de la SEQ ID No: 17; una CDR2 de la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 113; y una CDR3 de la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 19; una CDR1 de la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 20; una CDR2 de la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 21; y una CDR3 de la región variable de cadena ligera de la SEQ lD NO: 22. En un aspecto de la divulgación, se proporciona un anticuerpo que se enlaza específicamente a C5, que comprende una CDR1 de la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 17; una CDR2 de la región variable de cadena pesada de la SEQ lD NO: 113; una CDR3 de la región variable de cadena pesada de la SEQ lD NO: 19; una CDR1 de la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 20; una CDR2 de la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 21; y una CDR3 de la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 101.

En un aspecto de la divulgación, se proporciona un anticuerpo que se enlaza específicamente a C5, que comprende una CDR1 de la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 1; una CDR2 de la región variable de cadena pesada de la SEQ lD NO: 119; y una CDR3 de la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 3; una CDR1 de la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 4; una CDR2 de la región variable de cadena ligera de la SEQ lD NO: 5; y una CDR3 de la región variable de cadena ligera de la SEQ lD NO: 120. En un aspecto de la divulgación, se proporciona un anticuerpo que se enlaza específicamente a C5, que comprende una CDR1 de la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 131; una CDR2 de la región variable de cadena pesada de la SEQ lD NO: 132; una CDR3 de la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 133; una CDR1 de la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 134; una CDR2 de la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 135; y una CDR3 de la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 136.

En un aspecto de la divulgación, se proporciona un anticuerpo que se enlaza específicamente a C5, que comprende una CDR1 de la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 145; una CDR2 de la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 146; y una CDR3 de la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 147; una CDR1 de la región variable de cadena ligera de la SEQ ID No: 148; una CDR2 de la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 149; y una CDR3 de la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 150. En un aspecto de la divulgación, se proporciona un anticuerpo que se enlaza específicamente a C5, que comprende una CDR1 de la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 159; una CDR2 de la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 160; una CDR3 de la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 161; una CDR1 de la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 162; una CDR2 de la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 163; y una CDR3 de la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 164.

En un aspecto de la divulgación, se proporciona un anticuerpo que se enlaza específicamente a C5, que comprende una CDR1 de la región variable de cadena pesada de la SEQ lD NO: 173; una CDR2 de la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 174; y una CDR3 de la región variable de cadena pesada de la SEQ ID No: 175; una CDR1 de la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 176; una CDR2 de la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 177; y una CDR3 de la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 178. En un aspecto de la divulgación, se proporciona un anticuerpo que se enlaza específicamente a C5, que comprende una CDR1 de la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 195; una CDR2 de la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 196; una CDR3 de la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 197; una CDR1 de la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 198; una CDR2 de la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 199; y una CDR3 de la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 200.

En un aspecto de la divulgación, se proporciona un anticuerpo que se enlaza específicamente a C5, que comprende una CDR1 de la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 61; una CDR2 de la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 77; y una CDR3 de la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 63; una CDR1 de la región variable de cadena ligera de la SEQ lD NO: 64; una CDR2 de la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 65; y una CDR3 de la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 209. En un aspecto de la divulgación, se proporciona un anticuerpo que se enlaza específicamente a C5, que comprende una CDR1 de la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 17; una CDR2 de la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 49; una CDR3 de la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 19; una CDR1 de la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 20; una CDR2 de la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 21; y una CDR3 de la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 22.

En un aspecto de la divulgación, se proporciona un anticuerpo que se enlaza específicamente a C5, que comprende una CDR1 de la región variable de cadena pesada de la SEQ lD NO: 33; una CDR2 de la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 226; y una CDR3 de la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 35; una CDR1 de la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 36; una CDR2 de la región variable de cadena ligera de la SEQ lD NO: 37; y una CDR3 de la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 38. En un aspecto de la divulgación, se proporciona un anticuerpo que se enlaza específicamente a C5, que comprende una CDR1 de la región variable de cadena pesada de la SEQ lD NO: 235; una CDR2 de la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 236; una CDR3 de la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 237; una CDR1 de la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 238; una CDR2 de la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 239; y una CDR3 de la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 240.

En un aspecto de la divulgación, se proporciona un anticuerpo que se enlaza específicamente a C5, que comprende una CDR1 de la región variable de cadena pesada de la SEQ lD NO: 1; una CDR2 de la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 119; y una CDR3 de la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 3; una CDR1 de la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 4; una CDR2 de la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 5; y una CDR3 de la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 6. En un aspecto de la divulgación, se proporciona un anticuerpo que se enlaza específicamente a C5, que comprende una CDR1 de la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 1; una CDR2 de la región variable de cadena pesada de la SEQ lD NO: 2; una CDR3 de la región variable de cadena pesada de la SEQ lD NO: 3; una CDR1 de la región variable. de cadena ligera de la SEQ ID NO: 4; una CDR2 de la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 5; y una CDR3 de la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 120.

En un aspecto de la divulgación, se proporciona un anticuerpo que se enlaza específicamente a C5, que comprende una CDR1 de la región variable de cadena pesada de la SEQ lD NO: 61; una CDR2 de la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 62; y una CDR3 de la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 63; una CDR1 de la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 64; una CDR2 de la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 65; y una CDR3 de la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 209. En un aspecto de la divulgación, se proporciona un anticuerpo que se enlaza específicamente a C5, que comprende una CDR1 de la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 61; una CDR2 de la región variable de cadena pesada de la SEQ lD NO: 95; una CDR3 de la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 63; una CDR1 de la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 64; una CDR2 de la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 65; una CDR3 de la región variable de cadena ligera de la SEQ lD NO: 209.

En un aspecto de la divulgación, se proporciona un anticuerpo que se enlaza específicamente a C5, que comprende una CDR1 de la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 61; una CDR2 de la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 77; y una CDR3 de la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 63; una CDR1 de la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 64; una CDR2 de la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 65; y una CDR3 de la región variable de cadena ligera de la SEQ lD NO: 66. En un aspecto de la divulgación, se proporciona un anticuerpo que se enlaza específicamente a C5, que comprende una CDR1 de la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 61; una CDR2 de la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 77; una CDR3 de la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 63; una CDR1 de la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 64; una CDR2 de la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 65; y una CDR3 de la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 78.

En un aspecto de la divulgación, se proporciona un anticuerpo que se enlaza específicamente a C5, que comprende una CDR1 de la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 61; una CDR2 de la región variable de cadena pesada de la SEQ lD NO: 77; y una CDR3 de la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 63; una CDR1 de la región variable de cadena ligera de la SEQ lD NO: 64; una CDR2 de la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 65; y una CDR3 de la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 89. En un aspecto de la divulgación, se proporciona un anticuerpo que se enlaza específicamente a C5, que comprende una CDR1 de la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 17; una CDR2 de la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 107; una CDR3 de la región variable de cadena pesada de la SEQ lD NO: 19; una CDR1 de la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 20; una CDR2 de la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 21; y una CDR3 de la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 22.

En ciertas realizaciones, un anticuerpo que se enlaza específicamente a C5 es un anticuerpo que se describe en la Tabla 1.

Como se utiliza en la presente invención, un anticuerpo humano comprende las regiones variables de cadena pesada o ligera o las cadenas pesada o ligera de longitud completa que son "el producto de" o "derivadas a partir de" una secuencia particular de la línea germinal, si las regiones variables o las cadenas de longitud completa del anticuerpo se obtienen a partir de un sistema que utiliza genes de inmunoglobulina de la línea germinal humana. Estos sistemas incluyen la inmunización de un ratón transgénico que porta los genes de inmunoglobulina humana con el antígeno de interés, o la selección de una biblioteca de genes de inmunoglobulina humana desplegada en un fago con el antígeno de interés. Un anticuerpo humano que sea "el producto de" o un "derivado de" una secuencia de inmunoglobulina de la línea germinal humana se puede identificar como tal mediante la comparación de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo humano con las secuencias de aminoácidos de las inmunoglobulinas de la línea germinal humana, y que selecciona la secuencia de inmunoglobulina de la línea germinal humana que tenga la secuencia más cercana (es decir, mayor % de identidad), con la secuencia del anticuerpo humano. Un anticuerpo humano que es "el producto de" o un "derivado de" una secuencia particular de inmunoglobulina de la línea germinal humana, puede contener diferencias de aminoácidos, en comparación con la secuencia de la línea germinal, debido, por ejemplo, a las mutaciones somáticas de origen natural, o a la introducción intencional de mutaciones dirigidas al sitio. Sin embargo, en las regiones de estructura VH o VL, un anticuerpo humano seleccionado típicamente es al menos 90% idéntico en la secuencia de aminoácidos a una secuencia de aminoácidos codificada por un gen de inmunoglobulina de la línea germinal humana, y contiene residuos de aminoácidos que identifican al anticuerpo humano como de humano cuando se compara con las secuencias de aminoácidos de inmunoglobulina de la línea germinal de otras especies (por ejemplo, las secuencias de la línea germinal de murino). En ciertos casos, un anticuerpo humano puede ser al menos 60%, 70%, 80%, 90%, o al menos 95%, o inclusive al menos 96%, 97%, 98%, o 99% idéntico en la secuencia de aminoácidos a la secuencia de aminoácidos codificada por el gen de inmunoglobulina de la línea germinal. Típicamente, un anticuerpo humano recombinante exhibirá no más de 10diferencias de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos codificada por el gen de inmunoglobulina de la línea germinal humana en las regiones de estructura VH o VL. En ciertos casos, el anticuerpo humano puede exhibir no más de 5, o inclusive no más de 4, 3, 2, o 1 diferencia de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos codificada por el gen de inmunoglobulina de la línea germinal.

Anticuerpos homólogos

En aún otro aspecto de la divulgación, la presente invención proporciona un anticuerpo o un fragmento del mismo que se enlaza al antígeno, que comprende secuencias de aminoácidos que son homólogas a las secuencias descritas en la Tabla 1, y este anticuerpo se enlaza a una proteína C5 (por ejemplo, C5 humana y/o de cinomólogo), y retiene las propiedades funcionales deseadas de estos anticuerpos descritos en la Tabla 1.

Por ejemplo, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal aislado (o un fragmento funcional del mismo que se enlaza al antígeno) que comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera, en donde la región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 80%, al menos 90%, o al menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos que consiste de la SEQ ID NO: 7; la región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 80%, al menos 90%, o al menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos que consiste de la SEQ ID NO: 8; el anticuerpo se enlaza específicamente a C5 (por ejemplo, C5 humano y/o de cinomólogo), y el anticuerpo puede inhibir la lisis de los glóbulos rojos en un ensayo hemolítico. En un ejemplo específico, tales anticuerpos tienen un valor de IC50 en el ensayo hemolítico de 20 - 200 pM, cuando se utiliza suero agotado en C5 humana que se reconstituya con C5 humana 100 pM.

En un aspecto de la divulgación, existe un anticuerpo monoclonal aislado (o un fragmento funcional del mismo que se enlaza al antígeno) que comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena liviana, en donde la región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 80%, al menos 90%, o al menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de la SEQ ID NO: 23, 39, 51, 67, 79, 96, 108, 114, 121, 137, 151, 165, 179, 187, 201, 210, 218, 227, 241, 253, 257, 273, 277, o 281; la región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 80%, al menos 90%, o al menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 24, 40, 52, 68, 80, 90, 102, 122, 138, 152, 166, 180, 188, 202, 211, 219, 228, 242, 261, 265, 269, 285, o 289; el anticuerpo se enlaza específicamente a C5 (por ejemplo, C5 humana y/o de cinomólogo), y el anticuerpo puede inhibir la lisis de los glóbulos rojos en un ensayo hemolítico. En un ejemplo especifico, estos anticuerpos tienen un valor de IC50 en un ensayo hemolítico de 20 - 200 pM, cuando se utiliza suero agotado en C5 humana que se reconstituye con C5 humana 100 pM.

En otras realizaciones, las secuencias de aminoácidos VH y/o VL pueden ser 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, o el 99% idénticas a las secuencias estipuladas en la Tabla 1. En otra aspecto de la divulgación, las secuencias de aminoácidos VH y/o VL pueden ser idénticas, excepto por una sustitución de aminoácido en no más de 1, 2, 3, 4, o 5 posiciones de aminoácidos. Un anticuerpo que tenga las regiones VH y VL con una alta identidad (es decir, del 80% o mayor) con las regiones VH y VL de aquellas descritas en la Tabla 1, se puede obtener mediante mutagénesis (por ejemplo, mutagénesis mediada por PCR o dirigida al sitio) de moléculas de ácidos nucleicos que codifiquen las SEQ ID NOs: 7, 23, 39, 51, 67, 79, 96, 108, 114, 121, 137, 151, 165, 179, 187, 201, 210, 218, 227, 241, 253, 257, 273, 277, o 281; y 8, 24, 40, 52, 68, 80, 90, 102, 122, 138, 152, 166, 180, 188, 202, 211, 219, 228, 242, 261, 265, 269, 285, o 289, respectivamente, seguido por el análisis del anticuerpo alterado codificado para determinar la función retenida, utilizando los ensayos funcionales descritos en la presente invención.

En otro aspecto de la divulgación, las secuencias de aminoácidos de la cadena pesada de longitud completa y/o de la cadena ligera de longitud completa pueden ser 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% idénticas a las secuencias estipuladas en la Tabla 1. Un anticuerpo que tenga una cadena pesada de longitud completa y una cadena ligera de longitud completa con una alta identidad (es decir, del 80% o superior) con las cadenas pesadas de longitud completa de cualquiera de las SEQ ID NOs: 9, 25, 41, 53, 69, 81, 97, 109, 115, 123, 139, 153, 167, 181, 189, 203, 212, 220, 229, 243, 249, 254, 258, 274, 278, y 282 y con las cadenas ligeras de longitud completa de cualquiera de las SEQ lD NOs: 10, 26, 42, 54,70, 82, 91, 103, 124, 140, 154, 168, 182, 190, 204, 213, 221, 230, 244, 251, 262, 266, 270, 286, y 290, respectivamente, se pueden obtener mediante mutagénesis (por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio o mediada por PCR) de las moléculas de ácido nucleico que codifiquen estos polipéptidos, respectivamente, seguido por el análisis del anticuerpo alterado codificado para la función retenida, utilizando los ensayos funcionales descritos en la presente invención.

En un aspecto de la divulgación, las secuencias de nucleótidos de cadena pesada de longitud completa y/o de cadena ligera de longitud completa pueden ser 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idénticas a las secuencias estipuladas anteriormente.

En un aspecto de la divulgación, las regiones variables de las secuencias de nucleótidos de cadena pesada y/o de cadena ligera pueden ser 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idénticas a las secuencias estipuladas anteriormente.

Como se utiliza en la presente invención, el porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, el porcentaje de identidad es igual al número de posiciones idénticas / número total de posiciones x 100), tomando en cuenta el número de espacios, y la longitud de cada espacio, que se necesite introducir para la alineación óptima de las dos secuencias. La comparación de las secuencias y la determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias, se pueden lograr utilizando un algoritmo matemático, como se describe en los ejemplos no limitantes que se encuentran más adelante.

De forma adicional o alternativamente, las secuencias de proteína de la presente invención se pueden utilizar adicionalmente como una "secuencia de consulta", para llevar a cabo una búsqueda contra las bases de datos públicas, por ejemplo, con el fin de identificar las secuencias relacionadas. Por ejemplo, estas búsquedas se pueden llevar a cabo utilizando el programa BLAST (versión 2.0) de Altschul y colaboradores, 1990 J. Mol. Biol. 215: 403

10.

Anticuerpos con modificaciones conservadoras

En un aspecto de la divulgación, se proporciona un anticuerpo de la invención que tiene una región variable de cadena pesada que comprende las secuencias de CDR1, CDR2, y CDR3, y una región variable de cadena ligera que comprende las secuencias de CDR1,CDR2,y CDR3, en donde una o más de estas secuencias de CDR tienen secuencias de aminoácidos especificadas basadas en los anticuerpos descritos en la presente invención, o modificaciones conservadoras de las mismas, y en donde los anticuerpos retienen las propiedades funcionales deseadas de los anticuerpos que enlazan a C5 de la invención. Por lo tanto, un aspecto de la divulgación proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o un fragmento funcional del mismo para enlazamiento del antígeno, que consiste en una región variable de cadena pesada que comprende las secuencias de CDR1, CDR2, y CDR3, y una región variable de cadena ligera que comprende las secuencias de CDR1, CDR2, y CDR3, en donde: las secuencias de aminoácidos de CDR1 de la región variable de cadena pesada se seleccionan a partir del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 1, 17, 33, 61, 131, 145, 159, 173, 195, y 235, y las modificaciones conservadoras de las mismas; las secuencias de aminoácido de CDR2 de la región variable de cadena pesada se seleccionan a partir del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 2, 18, 34, 49, 62, 77, 95, 107, 113, 119, 132, 146, 160, 174, 196, 226, y 236, y las modificaciones conservadoras de las mismas; las secuencias de aminoácidos de CDR3 de la región variable de cadena pesada se seleccionan a partir del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 3, 19, 35, 63, 133, 147, 161, 175, 197, y 237, y las modificaciones conservadoras de las mismas; las secuencias de aminoácidos de CDR1 de la región variable de cadena ligera se seleccionan a partir del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 4, 20, 36, 64, 134, 148, 162, 176, 198, y 238, y las modificaciones conservadoras de las mismas; las secuencias de aminoácidos de CDR2 de la región variable de cadena ligera se seleccionan a partir del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 5, 21, 37, 65, 135, 149, 163, 177, 199, y 239, y las modificaciones conservadoras de las mismas; las secuencias de aminoácidos de CDR3 de la región variable de cadena ligera se seleccionan a partir del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 6, 22, 38, 50, 66, 78, 89, 101, 120, 136, 150, 164, 178, 200, 209, y 240, y las modificaciones conservadoras de las mismas; el anticuerpo o el fragmento del mismo que se enlaza al antígeno se enlaza específicamente a C5, e inhibe la lisis de los glóbulos rojos en un ensayo hemolítico, como se describe en la presente invención.

En un aspecto de la divulgación, se proporciona un anticuerpo de la invención optimizado para la expresión en una célula de mamífero, que tiene una secuencia de cadena pesada de longitud completa y una secuencia de cadena ligera de longitud completa, en donde una o más de estas secuencias tienen secuencias de aminoácidos especificadas basadas en los anticuerpos descritos en la presente invención, o modificaciones conservadoras de las mismas, y en donde los anticuerpos retienen las propiedades funcionales deseadas de los anticuerpos de la invención que se enlazan a C5. Por lo tanto, un aspecto de la divulgación proporciona un anticuerpo monoclonal aislado optimizado para su expresión en una célula de mamífero, que consiste en una cadena pesada de longitud completa y una cadena ligera de longitud completa, en donde: la cadena pesada de longitud completa tiene las secuencias de aminoácidos seleccionadas a partir del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 9, 25, 41, 53, 69, 81, 97, 109, 115, 123, 139, 153, 167, 181, 189, 203, 212, 220, 229, 243, 249, 254, 258, 274, 278, y 282, y las modificaciones conservadoras de las mismas; y la cadena ligera de longitud completa tiene las secuencias de aminoácidos seleccionadas a partir del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 10, 26, 42, 54, 70, 82, 91, 103, 124, 140, 154, 168, 182, 190, 204, 213, 221, 230, 244, 251, 262, 266, 270, 286, y 290, y las secuencias conservadoras de las mismas; el anticuerpo se enlaza específicamente a C5 (por ejemplo, C5 humana y/o de cinomólogo); y el anticuerpo inhibe la lisis de los glóbulos rojos en un ensayo hemolítico, como se describe en la presente invención. En una realización específica, estos anticuerpos tienen un valor de IC50 en un ensayo hemolítico de 20 - 200 pM, cuando se utiliza el suero agotado en C5 humana que se reconstituye con 100 pM de C5 humana.

Anticuerpos que se enlazan al mismo epítopo

Un aspecto de la divulgación proporciona anticuerpos que se enlazan al mismo epítopo que los anticuerpos que se enlazan con C5 descritos en la Tabla 1. Por consiguiente, se pueden identificar anticuerpos adicionales con base en su capacidad para competir en forma cruzada (por ejemplo, para inhibir de una manera competitiva el enlace de, en una forma estadísticamente significativa) con otros anticuerpos de la invención en los ensayos de enlazamiento con C5. La capacidad de un anticuerpo de prueba para inhibir el enlazamiento de los anticuerpos de la presente invención a una proteína C5 (por ejemplo, C5 humana y/o de cinomólogo), demuestra que el anticuerpo de prueba puede competir con este anticuerpo por el enlazamiento con C5; este anticuerpo puede, de acuerdo con una teoría no limitante, enlazarse al mismo epítopo o a un epítopo relacionado (por ejemplo, estructuralmente similar o especialmente próximo) sobre la proteína C5 que el anticuerpo con el que compite. En cierta realización, el anticuerpo que se enlaza al mismo epítopo sobre C5 que los anticuerpos de la presente invención, es un anticuerpo monoclonal humano. Estos anticuerpos monoclonales humanos se pueden preparar y aislar como se describe en la presente invención.

Anticuerpos diseñados genéticamente y modificados

Un anticuerpo de la invención se puede preparar además utilizando un anticuerpo que tenga una o más de las secuencias VH y/o VL mostradas en la presente invención como material de partida para diseñar genéticamente un anticuerpo modificado, donde el anticuerpo modificado puede tener propiedades alteradas con respecto al anticuerpo de partida. Un anticuerpo se puede diseñar mediante la modificación de uno o más residuos dentro de una o ambas regiones variables (es decir, VH y/o VL), por ejemplo, dentro de una o más regiones CDR, y/o dentro de una o más regiones de estructura. De una manera adicional o alternativa, un anticuerpo se puede diseñar mediante la modificación de los residuos dentro de la(s) región(es) constante(s), por ejemplo, para alterar la(s) función(es) efectora(s) del anticuerpo.

Un tipo de diseño de la región variable que se puede llevar a cabo es el injerto de CDR. Los anticuerpos interactúan con los antígenos objetivo predominantemente a través de los residuos de aminoácidos que se localizan en las seis regiones determinantes de complementariedad (CDR) de cadena pesada y ligera. Por esta razón, las secuencias de aminoácidos dentro de las CDR son más diversas entre los anticuerpos individuales que las secuencias que están fuera de las CDR. Debido a que las secuencias de CDR son responsables de la mayoría de las interacciones de anticuerpo-antígeno, es posible expresar los anticuerpos que imiten las propiedades de anticuerpos específicos de origen natural, mediante la construcción de vectores de expresión que incluyan secuencias de CDR a partir del anticuerpo específico de origen natural, injertadas sobre las secuencias de estructura de un anticuerpo diferente con propiedades diferentes (véanse, por ejemplo, Riechmann, L. y colaboradores, 1998 Nature 332: 323 - 327; Jones, P. y colaboradores, 1986 Nature 321: 522 - 525; Queen, C. y colaboradores, 1989 Proc. Natl. Acad., EUA. 86: 10029 10033; la patente de los Estados Unidos de Norteamérica No. 5.225.539 de Winter, y las patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Nos. 5.530.101; 5.585.089; 5.693.762 y 6.180.370 de Queen y colaboradores).

Por lo tanto, un aspecto de la divulgación se relaciona con un anticuerpo monoclonal aislado, o un fragmento del mismo que se enlaza con el antígeno, que comprende una región variable de cadena pesada que comprende las secuencias de CDR1 que tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 1, 17, 33, 61, 131, 145, 159, 173, 195, y 235; las secuencias de CDR2 que tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 2, 18, 34, 49, 62, 77, 95, 107, 113, 119, 132, 146, 160, 174, 196, 226, y 236; secuencias de CDR3 que tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 3, 19, 35, 63, 133, 147, 161, 175, 197, y 237, respectivamente; y una región variable de cadena ligera que tiene las secuencias de CDR1 que tiene un secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 4, 20, 36, 64, 134, 148, 162, 176, 198, y 238; secuencias de CDR2 que tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 5, 21, 37, 65, 135, 149, 163, 177, 199, y 239; y las secuencias de CDR3 que consisten de una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 6, 22, 38, 50, 66, 78, 89, 101, 120, 136, 150, 164, 178, 200, 209, y 240, respectivamente. Por consiguiente, estos anticuerpos contienen las secuencias de CDR VH y VL de los anticuerpos monoclonales, e incluso pueden contener diferentes secuencias de estructura de estos anticuerpos.

Estas secuencias de estructura se pueden obtener a partir de las bases de datos públicas de ADN o de las referencias publicadas que incluyan secuencias de genes de anticuerpos de la línea germinal. Por ejemplo, las secuencias de ADN de la línea germinal para los genes humanos de la región variable de cadena pesada y ligera se pueden encontrar en la base de datos de secuencias de la línea germinal humana “VBase” (disponible en la Internet en www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase), así como en Kabat, E. A. y colaboradores, 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos, NlH Publicación Número 91-3242; Tomlinson, l. M. Y colaboradores, 1992 J. Mol. Biol. 227: 776 - 798; y Cox, J. P. L. y colaboradores, 1994 Eur. J. Immunol. 24: 827 - 836).

Un ejemplo de las secuencias de estructura para utilizarse en los anticuerpos de la invención son aquéllas que son estructuralmente similares a las secuencias de estructura utilizadas por los anticuerpos seleccionados de la invención, por ejemplo, las secuencias de consenso y/o las secuencias de estructura utilizadas por los anticuerpos monoclonales de la invención. Las secuencias de CDR1, CDR2, y CDR3 VH, y las secuencias de CDR1, CDR2, y CDR3 VL, se pueden injertar en las regiones de estructura que tengan una secuencia idéntica a la que se encuentra en el gen de inmunoglobulina de la línea germinal a partir de la cual se deriva la secuencia de estructura, o las secuencias de CDR se pueden injertar en las regiones de estructura que contengan una o más mutaciones, en comparación con las secuencias de la línea germinal. Por ejemplo, se ha encontrado que, en ciertos casos, es beneficioso mutar los residuos dentro de las regiones de estructura para mantener o mejorar la capacidad de enlazamiento con el antígeno del anticuerpo (véanse, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Nos. 5.530.101; 5.585.089; 5.693.762 y 6.180.370 de Queen y colaboradores).

Otro tipo de modificación de la región variable es mutar los residuos de aminoácidos dentro de las regiones CDR1, CDR2, y/o CDR3 VH y/o VL, para así mejorar una o más propiedades de enlazamiento (por ejemplo, la afinidad) del anticuerpo de interés, conocida como “maduración de afinidad”. Se puede llevar a cabo mutagénesis dirigida al sitio

: o la mutagénesis mediada por PCR para introducir la(s) mutación(es), y se puede evaluar el efecto sobre el enlazamiento del anticuerpo, u otra propiedad funcional de interés, en ensayos in vitro o in vivo, como se describe en la presente invención, y como se proporciona en los ejemplos. Se pueden introducir modificaciones conservadoras (como se discutió anteriormente). Las mutaciones pueden ser sustituciones, adiciones, o supresiones de aminoácidos. Además, típicamente no se alteran más de uno, dos, tres, cuatro, o cinco residuos dentro de una región CDR.

De conformidad con Io anterior, un aspecto de la divulgación proporciona anticuerpos monoclonales aislados que se enlazan a C5, o un fragmento de los mismos que se enlazan al antígeno, que consisten de una región variable de cadena pesada que tiene: una región CDR1 VH que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que tiene las SEQ ID NOs: 1, 17, 33, 61, 131, 145, 159, 173, 195, y 235, o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro, o cinco sustituciones, supresiones, o adiciones de aminoácidos, comparado con las SEQ ID NOs: 1, 17, 33, 61, 131, 145, 159, 173, 195, y 235; una región CDR2 VH que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 2, 18, 34, 49, 62, 77, 95, 107, 113, 119, 132, 146, 160, 174, 196, 226, y 236, o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro,

: o cinco sustituciones, supresiones, o adiciones de aminoácidos, comparado con las SEQ ID NOs: 2, 18, 34, 49, 62, 77, 95, 107, 113, 119, 132, 146, 160, 174, 196, 226, y 236; una región CDR3 VH que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 3, 19, 35, 63, 133, 147, 161, 175, 197, y 237, o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro, o cinco sustituciones, supresiones, o adiciones de aminoácidos, comparado con las SEQ ID NOs: 3, 19, 35, 63, 133, 147, 161, 175, 197, y 237; una región CDR1 VL que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 4, 20, 36, 64, 134, 148, 162, 176, 198, y 238, o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro, o cinco sustituciones, supresiones, o adiciones de aminoácidos, comparado con las SEQ ID NOs: 4, 20, 36, 64, 134, 148, 162, 176, 198, y 238; una región CDR2 VL que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 5, 21, 37, 65, 135, 149, 163, 177, 199, y 239, o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro, o cinco sustituciones, supresiones, o adiciones de aminoácidos, comparado con las SEQ ID NOs: 5, 21, 37, 65, 135, 149, 163, 177, 199, y 239; y una región CDR3 VL que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 6, 22, 38, 50, 66, 78, 89, 101, 120, 136, 150, 164, 178, 200, 209, y 240, o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro, o

cinco sustituciones, supresiones, o adiciones de aminoácidos, comparado con las SEQ ID NOs: 6, 22, 38, 50, 66, 78, 89, 101, 120, 136, 150, 164, 178, 200, 209, y 240.

Injerto de dominios de enlazamiento de antígeno en estructuras o andamiajes alternativos

Se pueden emplear una amplia variedad de estructuras o andamiajes de anticuerpos/inmunoglobulina, siempre y cuando el polipéptido resultante incluya al menos una región de enlazamiento que se enlace específicamente a C5. Estas estructuras o andamiajes incluyen los 5 idiotipos principales de inmunoglobulinas humanas, o fragmentos de los mismos, e incluyen las inmunoglobulinas de otras especies de animales, que tengan preferiblemente aspectos humanizados. Los anticuerpos individuales de cadena pesada, tales como aquéllos identificados en los camélidos son de particular interés en este sentido. Los expertos en la materia continúan descubriendo y desarrollando novedosas estructuras, andamiajes, y fragmentos.

En un aspecto, la divulgación se refiere a la generación de anticuerpos no basados en inmunoglobulina, utilizando andamiajes que no son de inmunoglobulina, sobre los cuales se pueden injertar las CDR de la invención. Se pueden emplear estructuras o andamiajes conocidos o por conocer que no sean de inmunoglobulina, siempre y cuando comprendan una región de enlazamiento específica para la proteína C5 objetivo (por ejemplo, C5 humana y/o de cinomólogo). Las estructuras o andamiajes conocidos que no son de inmunoglobulina incluyen, pero no se limitan a, fibronectina (Compound Therapeutics, Inc., Waltham, MA), anquirina (Molecular Partners AG, Zurich, Suiza), anticuerpos de dominio (Domantis, Ltd., Cambridge, MA, y Ablynx nv, Zwijnaarde, Bélgica), Iipocalina (Pieris Proteolab AG, Freising, Alemania), productos inmunofarmacéuticos modulares pequeños (Trubion Pharmaceuticals Inc., Seattle, WA), maxicuerpos (Avidia, Inc., Mountain View, CA), Proteína A (Affibody AG, Suecia), y afilina (gamma-cristalina o ubiquitina) (Scil Proteins GmbH, Halle, Alemania).

Los andamiajes de fibronectina se basan en el dominio de fibronectina tipo III (por ejemplo, el décimo módulo de la fibronectina tipo III (dominio 10 Fn3)). El dominio de fibronectina tipo III tiene 7 u 8 cadenas beta, que están distribuidas entre dos láminas beta, que por sí mismas se empacan una contra la otra para formar el núcleo de la proteína, y que además contienen bucles (análogos a las CDR), que conectan las cadenas beta entre sí, y se exponen al solvente. Existen al menos tres de estos bucles en cada borde del emparedado de láminas beta, en donde el borde es el límite de la proteína perpendicular a la dirección de las cadenas beta (véase la patente de los Estados Unidos de Norteamérica No. 6.818.418). Estos andamiajes basados en fibronectina no son una inmunoglobulina, aunque el plegado total está estrechamente relacionado con aquél del fragmento de anticuerpo funcional más pequeño, la región variable de la cadena pesada, que comprende la unidad de reconocimiento completa del antígeno en la IgG de camello y de llama. Debido a esta estructura, el anticuerpo que no es de inmunoglobulina, imita las propiedades de enlazamiento del antígeno que son de naturaleza y afinidad similares a aquéllas de los anticuerpos. Estos andamiajes se pueden utilizar en una estrategia de transposición y asignación al azar del bucle in vitro, que es similar al proceso de maduración por afinidad de los anticuerpos in vivo. Estas moléculas basadas en fibronectina se pueden utilizar como andamiajes, en donde las regiones del bucle de la molécula pueden ser reemplazadas con CDR de la invención, empleando técnicas de clonación convencionales.

La tecnología de anquirina se basa en la utilización de proteínas con módulos de repetición derivados de anquirina como andamiajes, para soportar las regiones variables, que se pueden utilizar para el enlazamiento con diferentes objetivos. El módulo de repetición de anquirina es un polipéptido de 33 aminoácidos que consiste en dos hélices α antiparalelas y una vuelta β. El enlace de las regiones variables se optimiza en su mayor parte mediante la utilización del despliegue en ribosomas.

Los avímeros se derivan de la proteína que contiene un dominio A natural, tal como LRP-1. Estos dominios son utilizados por la naturaleza para las interacciones proteína-proteína, y en el ser humano, más de 250 proteínas están estructuralmente basadas en los dominios A. Los avímeros consisten en una cantidad de monómeros diferentes del "dominio A" (de 2 a 10) enlazados por medio de enlazadores de aminoácidos. Se pueden crear avímeros que se puedan enlazar al antígeno objetivo utilizando la metodología descrita, por ejemplo, en las publicaciones de las solicitudes de patente de los Estados Unidos de Norteamérica Nos. 20040175756; 20050053973; 20050048512; y 20060008844.

Los ligandos de afinidad del mimético de afficuerpo son proteínas simples pequeñas compuestas de un haz de tres hélices basado en el andamiaje de uno de los dominios de enlazamiento de IgG de la Proteína A. La Proteína A es una proteína de superficie de la bacteria Staphylococcus aureus. Este dominio de andamiaje consiste de 58 aminoácidos, 13 de los cuales se seleccionan aleatoriamente para generar las bibliotecas de afficuerpos con un gran número de variantes de ligandos (véase, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos de Norteamérica No. 5.831.012). Las moléculas de afficuerpos imitan a los anticuerpos, tienen un peso molecular de 6 kDa, comparado con el peso molecular de los anticuerpos, que es de 150 kDa. A pesar de su pequeño tamaño, el sitio de enlazamiento de las moléculas de afficuerpo es similar a aquél de un anticuerpo.

Las anticalinas son productos desarrollados por la compañía Pieris ProteoLab AG. Se derivan de las lipocalinas, un grupo ampliamente extendido de proteínas pequeñas y robustas que normalmente están involucradas en el

transporte o almacenamiento fisiológico de compuestos químicamente susceptibles o insolubles. Existen varias lipocalinas naturales en los tejidos o líquidos corporales humanos. La arquitectura de la proteína recuerda a las inmunoglobulinas, con bucles hipervariables encima de una estructura rígida. Sin embargo, en contraste con los anticuerpos o con sus fragmentos recombinantes, las lipocalinas se componen de una sola cadena de polipéptido con 160 a 180 residuos de aminoácidos, que es solo marginalmente mayor que un solo dominio de inmunoglobulinas. EI conjunto de cuatro bucles, que forma el bolsillo de enlazamiento, muestra una marcada plasticidad estructural, y tolera una variedad de cadenas laterales. Por consiguiente, el sitio de enlazamiento se puede reconfigurar en un proceso registrado, con el objeto de reconocer las moléculas objetivo prescritas de diferente forma con una alta afinidad y especificidad. Se ha utilizado una proteína de la familia de la lipocalina, la proteína de enlazamiento de bilina (BBP) de Pieris Brassicae, para desarrollar anticalinas, mutando el conjunto de cuatro bucles. Un ejemplo de una solicitud de patente que describe anticalinas está en la publicación del TCP No. WO 1999/16873.

Las moléculas de afilina son pequeñas proteínas que no son de inmunoglobulina, que están diseñadas para afinidades específicas hacia las proteínas y moléculas pequeñas. Las nuevas moléculas de afilina se pueden seleccionar muy rápidamente a partir de dos bibliotecas, cada una de las cuales se basa en una proteína diferente de andamiaje derivada de humano. Las moléculas de afilina no muestran ninguna homología estructural con las proteínas de inmunoglobulina. En la actualidad, se emplean dos andamiajes de afilina, uno de los cuales es gamma cristalino, una proteína del lente ocular estructural humano, y el otro es de las proteínas de la superfamilia de la “ubiquitina”. Ambos andamiajes humanos son muy pequeños, muestran estabilidad a alta estabilidad y son casi resistentes a cambios de pH y a los agentes desnaturalizantes. Esta alta estabilidad se debe principalmente a la estructura de lámina beta expandida de las proteínas. Los ejemplos de proteínas derivadas de gamma cristalina se describen en la Publicación Internacional Número WO200104144, y los ejemplos de las proteínas de “tipo ubiquitina” se describen en la publicación internacional No. WO2004106368.

Los miméticos de epítopos de proteína (PEM) son moléculas tipo péptido cíclicas, de tamaño mediano (peso molecular de 1 a 2 kDa), que imitan las estructuras secundarias de horquilla beta de las proteínas, la principal estructura secundaria involucrada en las interacciones proteína-proteína.

En un aspecto de la divulgación, las Fab se convierten a un formato de IgG1 silencioso, cambiando la región Fc. Por ejemplo, los anticuerpos 6525-7910 de la Tabla 1 se pueden convertir a un formato de lgG1 silencioso, sustituyendo la “X” en las secuencias de aminoácidos para la cadena pesada, con:

y sustituyendo la “X” en la secuencia de aminoácidos para la cadena ligera, con: CS si la cadena ligera es lambda, o C si la cadena ligera es kappa. Como se utiliza en la presente invención, una "IgG1 silenciosa" es una secuencia de Fc de IgG1 en la que la secuencia de aminoácidos ha sido alterada para reducir las funciones efectoras mediadas por Fc (por ejemplo, ADCC y/o CDC). Este anticuerpo típicamente tendrá un enlazamiento reducido con los receptores de Fc y/o C1q.

En un aspecto de la divulgación, las Fab se convierten en el formato de lgG2. Por ejemplo, los anticuerpos 6525 - 7910 de la Tabla 1 se pueden convertir hasta al formato de IgG2 sustituyendo la secuencia constante:

con la secuencia constante para la cadena pesada de lgG2:

y sustituyendo la “X” en la secuencia de aminoácidos para la cadena ligera, con CS si la cadena ligera es lambda, o con C si la cadena ligera es kappa.

Anticuerpos humanos o humanizados

La presente invención proporciona anticuerpos completamente humanos que se enlazan específicamente a una proteína C5 (por ejemplo, C5 humana y/o de cinomólogo). Comparado con los anticuerpos quiméricos o humanizados, los anticuerpos humanos de la invención que se enlazan a C5 tienen además una antigenicidad reducida cuando se administran a sujetos humanos.

Los anticuerpos humanos que se enlazan a C5 pueden ser generados empleando métodos que son conocidos en el arte. Por ejemplo, la tecnología de humanización mediante modificación por ingeniería genética (humaneering) utilizada para convertir anticuerpos no humanos en anticuerpos humanos modificados por ingeniería genética. La publicación de la patente de los Estados Unidos de Norteamérica No. 2005/0008625 describe un método in vivo para reemplazar una región variable de un anticuerpo no humano con una región variable humana en un anticuerpo, mientras se mantienen las mismas o se proporcionan mejores características de enlazamiento, con relación a aquellas del anticuerpo no humano. EI método se apoya en el reemplazo guiado del epítopo de las regiones variables de un anticuerpo de referencia no humano con un anticuerpo completamente humano. El anticuerpo humano resultante generalmente no está relacionado estructuralmente con el anticuerpo no humano de referencia, pero se enlaza al mismo epítopo sobre el mismo antígeno que el anticuerpo de referencia. En resumen, se hace posible el enfoque de reemplazo en serie de complementariedad guiado por el epítopo mediante el establecimiento de una competencia en las células entre un “competidor” y una biblioteca de diversos híbridos del anticuerpo de referencia (“anticuerpos de prueba”) por el enlazamiento con cantidades limitantes de antígeno en la presencia de un sistema reportero que responde al enlazamiento del anticuerpo de prueba con el antígeno. El competidor puede ser el anticuerpo de referencia o un derivado del mismo, tal como un fragmento Fv de una sola cadena. El competidor también puede ser un ligando natural o artificial del antígeno que se enlaza al mismo epítopo que el anticuerpo de referencia. Los únicos requerimientos del competidor son que se enlace al mismo epítopo que el anticuerpo de referencia, y que compita con el anticuerpo de referencia por el enlazamiento del antígeno. Los anticuerpos de prueba tienen una región V de enlazamiento del antígeno en común a partir del anticuerpo de referencia no humano, y la otra región V seleccionada al azar a partir de una fuente diversa, tal como una biblioteca de repertorio de anticuerpos humanos. La región V común del anticuerpo de referencia sirve como una guía, colocando a los anticuerpos de prueba sobre el mismo epítopo sobre el antígeno, y en la misma orientación, de tal manera que se sesga la selección hacia la fidelidad más alta de enlazamiento del antígeno con el anticuerpo de referencia.

Se pueden utilizar muchos tipos de sistemas reporteros para detectar las interacciones deseadas entre los anticuerpos de prueba y el antígeno. Por ejemplo, se pueden enlazar fragmentos de reporteros del complemento al antígeno y al anticuerpo de prueba, respectivamente, de tal manera que la activación del reportero mediante la complementación del fragmento solamente ocurre cuando el anticuerpo de prueba se enlaza al antígeno. Cuando se coexpresan fusiones del anticuerpo de prueba y del fragmento del reportero del antígeno con un competidor, la activación del reportero se hace dependiente de la capacidad del anticuerpo de prueba para competir con el competidor, Io cual es proporcional a la afinidad del anticuerpo de prueba por el antígeno. Otros sistemas reporteros que se pueden utilizar incluyen al reactivador de un sistema de reactivación del reportero autoinhibido (RAIR), como se da a conocer en la solicitud de patente de los Estados Unidos de Norteamérica serie No. 10/208.730 (publicación No. 20030198971), o el sistema de activación competitiva dado a conocer en la solicitud de patente de los Estados Unidos de Norteamérica serie No. 10/076.845 (publicación No. 20030157579).

Con el sistema de reemplazo de complementariedad en serie guiado por el epítopo, se hace una selección para identificar las células que expresen un solo anticuerpo de prueba junto con el competidor, antígeno, y componentes del reportero. En estas células, cada anticuerpo de prueba compite uno a uno con el competidor por el enlace con una cantidad limitante de antígeno. La actividad del reportero es proporcional a la cantidad de antígeno enlazado al anticuerpo de prueba, la cual a su vez es proporcional a la afinidad del anticuerpo de prueba por el antígeno y a la estabilidad del anticuerpo de prueba. Los anticuerpos de prueba inicialmente se seleccionan con base en su actividad en relación con aquélla del anticuerpo de referencia cuando se expresan como el anticuerpo de prueba. El resultado de la primera ronda de selección es un conjunto de anticuerpos "híbridos", cada uno de los cuales consta de la misma región V no humana del anticuerpo de referencia, y una región V humana de la biblioteca, y cada uno de los cuales se enlaza al mismo epítopo sobre el antígeno que el anticuerpo de referencia. Uno o más de los anticuerpos híbridos seleccionados en la primera ronda tendrán una afinidad por el antígeno comparable con, o más alta que, aquélla del anticuerpo de referencia.

En la segunda etapa de reemplazo de la región V, se utilizan las regiones V humanas seleccionadas en la primera etapa como guía para la selección de los reemplazos humanos para la región V del anticuerpo de referencia restante no humano, con una biblioteca diversa de regiones V humanas afines. Los anticuerpos híbridos seleccionados en la primera ronda también se pueden utilizar como competidores para la segunda ronda de selección. El resultado de la segunda ronda de selección es un conjunto de anticuerpos completamente humanos que difieren estructuralmente del anticuerpo de referencia, pero que compiten con el anticuerpo de referencia por el enlazamiento con el mismo antígeno. Algunos de los anticuerpos humanos seleccionados se enlazan al mismo epítopo sobre el mismo antígeno que el anticuerpo de referencia. Entre estos anticuerpos humanos seleccionados, uno o más se enlazan al mismo epítopo con una afinidad que es comparable a, o más alta que, aquélla del anticuerpo de referencia.

Utilizando uno de los anticuerpos que se enlazan a C5 de ratón o quiméricos descritos anteriormente como el anticuerpo de referencia, este método se puede emplear fácilmente para generar anticuerpos humanos que se enlazan a C5 humana con la misma especificidad de enlazamiento y con la misma o mejor afinidad de enlazamiento. Además, estos anticuerpos humanos que se enlazan a C5 también se obtener comercialmente a través de compañías que producen habitualmente anticuerpos humanos, por ejemplo, KaloBios, Inc. (Mountain View, CA).

Anticuerpos de camélido.

Las proteínas anticuerpo obtenidas de los miembros de la familia del camello y del dromedario (Camelus bactrianus y Calelus dromaderius), incluyendo los miembros del nuevo mundo, tales como las especies de llama (Lama paccos, Lama glama, y Lama vicugna), han sido caracterizadas con respecto al tamaño, la complejidad estructural, y la antigenicidad para sujetos humanos. Ciertos anticuerpos de IgG de esta familia de mamíferos, como se encuentran en la naturaleza, carecen de cadenas ligeras, y por Io tanto, son estructuralmente distintos de la estructura cuaternaria típica de cuatro cadenas que tiene dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras, para los anticuerpos de otros animales. Véase la publicación internacional No. WO 94/04678, publicada el 3 de marzo de 1994).

Se puede obtener una región del anticuerpo de camélido que es el dominio variable individual pequeño identificado como VHH, mediante ingeniería genética, para proporcionar una proteína pequeña que tiene una alta afinidad por un objetivo, dando como resultado una proteína derivada de anticuerpo de bajo peso molecular conocida como un "nanocuerpo de camélido". Véase la patente de los Estados Unidos de Norteamérica No. 5.759.808 expedida el 2 de junio de 1998; véanse también Stijlemans, B. y colaboradores, 2004 J. Biol. Chem. 279: 1256 - 1261; Dumoulin, M. y colaboradores, 2003 Nature 424: 783 - 788; Pleschberger, M. y colaboradores, 2003 Bioconjugate Chem 14: 440 448; Cortez-Retamozo, V. y colaboradores, 2002 Int. J. Cancer 89: 456 - 62; Lauwereys, M. y colaboradores, 1998 EMBO J 17: 3512 - 3520. Las bibliotecas modificadas genéticamente de anticuerpos de camélido y fragmentos de anticuerpos están comercialmente disponibles, por ejemplo, a través de Ablynx, Ghent, Bélgica. Al igual que con otros anticuerpos de origen no humano, una secuencia de aminoácidos de un anticuerpo de camélido puede ser alterada de una manera recombinante para obtener una secuencia que se parezca más a una secuencia humana, es decir, el nanocuerpo se puede "humanizar". Por lo tanto, se puede reducir aún más la baja antigenicidad natural de los anticuerpos de camélido para los seres humanos.

EI nanocuerpo de camélido tiene un peso molecular de aproximadamente una décima parte de aquél de una molécula de lgG humana, y la proteína tiene un diámetro físico de solamente unos cuantos nanómetros. Una consecuencia del pequeño tamaño es la capacidad de los nanocuerpos de camélido para enlazarse a los sitios antigénicos que son funcionalmente invisibles para las proteínas de anticuerpo más grandes, es decir, los nanocuerpos de camélido son útiles como reactivos para detectar antígenos que de otra manera son crípticos utilizando las técnicas inmunológicas clásicas, y como posibles agentes terapéuticos. Por consiguiente, aún otra consecuencia del pequeño tamaño es que un nanocuerpo de camélido puede inhibir, como un resultado del enlazamiento a un sitio específico en una ranura o hendidura estrecha de una proteína objetivo, y por consiguiente, puede servir en una capacidad que se parezca más estrechamente a la función de un fármaco clásico de bajo peso molecular que la de un anticuerpo clásico.

El bajo peso molecular y el tamaño compacto dan como resultado además que los nanocuerpos de camélido sean extremadamente termoestables, estables a un pH extremo y a la digestión proteolítica, y pobremente antigénicos. Otra consecuencia es que los nanocuerpos de camélido se mueven fácilmente desde el sistema circulatorio hacia los tejidos, e inclusive cruzan la barrera hematoencefálica, y pueden tratar trastornos que afecten al tejido nervioso. Los nanocuerpos pueden facilitar además el transporte de fármacos a través de la barrera hematoencefálica. Véase la solicitud de patente de los Estados Unidos de Norteamérica No. 2004/0161738 publicada el 19 de agosto de 2004. Estas características, combinadas con la baja antigenicidad para los seres humanos, indican un gran potencial terapéutico. Además, estas moléculas se pueden expresar completamente en las células procariotas, tales como las de E. coli, y se expresan como proteínas de fusión con bacteriófagos, y son funcionales.

Por lo tanto, un aspecto de la divulgación es un anticuerpo o nanocuerpo de camélido que tiene una alta afinidad por C5. En ciertas realizaciones de la presente invención, el anticuerpo o nanocuerpo de camélido se produce naturalmente en el animal camélido, es decir, es producido por el camélido después de la inmunización con C5 o un fragmento peptídico del mismo, empleando las técnicas descritas en la presente invención para otros anticuerpos. De una manera alternativa, el nanocuerpo de camélido que se enlaza a C5 se modifica genéticamente, es decir, se produce mediante selección, por ejemplo, a partir de una biblioteca de fagos que exhiban las proteínas de nanocuerpo de camélido apropiadamente mutadas, utilizando procedimientos de encuadre con C5 como objetivo, como se describe en los ejemplos de la presente invención. Los nanocuerpos modificados por ingeniería genética se pueden elaborar además a la medida mediante ingeniería genética, para que tengan una vida media en un sujeto receptor de 45 minutos hasta dos semanas. En una realización específica, el anticuerpo o nanocuerpo de camélido se obtiene mediante el injerto de las secuencias de las CDR de la cadena pesada o ligera de los anticuerpos humanos de la invención en las secuencias de estructura del nanocuerpo o del anticuerpo de un solo dominio, como se describe, por ejemplo, en la publicación internacional WO 1994/004678 A1.

Moléculas biespecíficas y anticuerpos multivalentes

En otro aspecto, la divulgación ofrece moléculas biespecíficas o multiespecíficas que comprenden un anticuerpo que se enlaza a C5, o un fragmento del mismo, de la invención. Un anticuerpo de la invención, o las regiones de enlazamiento del antígeno del mismo, se pueden derivar o enlazar a otra molécula funcional, por ejemplo, a otro péptido o proteína (por ejemplo, otro anticuerpo o ligando para un receptor), con el fin de generar una molécula biespecífica que se enlace con al menos dos sitios de enlazamiento o moléculas objetivo diferentes. El anticuerpo de la invención puede de hecho, derivarse o enlazarse a más de una molécula funcional diferente para generar moléculas multiespecíficas que se enlacen a más de dos sitios de enlazamiento y/o moléculas objetivo diferentes; estas moléculas multiespecíficas también pretenden ser abarcadas por el término "molécula biespecífica", como se utiliza en la presente invención. Para crear una molécula biespecífica de la invención, se puede enlazar funcionalmente un anticuerpo de la invención (por ejemplo, mediante acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente, o de otra manera) a una o más moléculas de enlazamiento diferentes, tales como otro anticuerpo, fragmento de anticuerpo, péptido o mimético de enlazamiento, de tal manera que resulte una molécula biespecífica.

Por lo tanto, un aspecto de la divulgación incluye moléculas biespecíficas que comprenden al menos una primera especificidad de enlazamiento por C5, y una segunda especificidad de enlazamiento por un segundo epítopo objetivo. Por ejemplo, el segundo epítopo objetivo es otro epítopo de C5 diferente del primer epítopo objetivo.

Adicionalmente, para la invención en donde la molécula biespecífica es multiespecífica, la molécula puede incluir además una tercera especificidad de enlazamiento, además del primero y segundo epítopos objetivo.

En un aspecto de la divulgación, las moléculas biespecíficas de la invención comprenden, como una especificidad de enlazamiento, al menos un anticuerpo, o un fragmento de anticuerpo, incluyendo, por ejemplo, un Fab, Fab’, F(ab’)2, Fv, o un Fv de una sola cadena. El anticuerpo también puede ser un dímero de cadena ligera o de cadena pesada, o cualquier fragmento mínimo del mismo, tal como un Fv, o un constructo de una sola cadena, como se describe en Ladner y colaboradores, patente de los Estados Unidos de Norteamérica No. 4.946.778.

Los diacuerpos son moléculas biespecíficas bivalentes, en donde los dominios VH y VL se expresan sobre una sola cadena de polipéptido, conectados por un enlazador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios sobre la misma cadena. Los dominios VH y VL se emparejan con dominios de complementariedad de otra cadena, creando de esta manera dos sitios de enlazamiento del antígeno (véanse, por ejemplo, Holliger y colaboradores, 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 90: 6444 - 6448; Poljak y colaboradores, 1994 Structure 2: 1121 1123). Los diacuerpos pueden ser producidos mediante la expresión de dos cadenas de polipéptido ya sea con la estructura VHA-VLB y VHB-VLA (configuración VH-VL), o bien VLA-VHB y VLB-VHA (configuración VL-VH) dentro de la misma célula. La mayoría de ellos se pueden expresar en una forma soluble en bacterias. Los diacuerpos de una sola cadena (scDb) se producen mediante la conexión de las dos cadenas del polipéptido que forman el diacuerpo con un enlazador de aproximadamente 15 residuos de aminoácidos (véanse Holliger y Winter, 1997 Cancer lmmunol. Immunother., 45(3-4): 128 - 30; Wu y colaboradores, 1996 lmmunotechnology, 2(1): 21 - 36). Los scDb se pueden expresar en bacterias en una forma monomérica activa soluble (véanse Holliger y Winter, 1997 Cancer lmmunol. Immunother., 45(34): 128 - 30; Wu y colaboradores, 1996 lmmunotechnology, 2(1): 21 - 36; Pluckthun y Pack, 1997 lmmunotechnology, 13(2): 83 - 105; Ridgway y colaboradores, 1996 Protein Eng., 9(7): 617 - 21). Un diacuerpo se puede fusionar a Fc para generar un “di-diacuerpo” (véase Lu y colaboradores, 2004 J. Biol. Chem., 279(4): 2856 - 65).

Otros anticuerpos que se pueden emplear en las moléculas biespecíficas de la invención son los anticuerpos monoclonales de murino, quiméricos, y humanizados.

Las moléculas biespecíficas de la presente invención se pueden preparar mediante la conjugación de las especificidades de enlazamiento constituyentes, empleando los métodos conocidos en el arte. Por ejemplo, cada especificidad de enlazamiento de la molécula biespecífica se puede generar por separado, y luego se conjugan entre sí. Cuando las especificidades de enlazamiento son proteínas o péptidos, se pueden utilizar una variedad de agentes de acoplamiento o entrecruzamiento para la conjugación covalente. Los ejemplos de agentes de entrecruzamiento incluyen a la proteína A, carbodiimida, N-succinimidil-S-acetil-tioacetato (SATA), 5,5’-ditiobis-(ácido 2-nitrobenzoico) (DTNB), o-fenilendimaleimida (oPDM), N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP), y sulfosuccinimidil 4-(N-maleimidometil)-ciclohexan-1-carboxilato (sulfo-SMCC) (véanse, por ejemplo, Karpovsky y colaboradores, 1984 J. Exp. Med. 160:1686; Liu, MA y colaboradores, 1985 Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 82: 8648). Otros métodos incluyen aquéllos descritos en Paulus, 1985 Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132; Brennan y colaboradores, 1985 Science 229: 81 - 83; y Glennie y colaboradores, 1987 J. Immunol. 139: 2367 - 2375). Los agentes de conjugación son SATA y sulfo-SMCC, ambos disponibles a través de Pierce Chemical Co. (Rockford, IL).

Cuando las especificidades de enlazamiento son anticuerpos, se pueden conjugar mediante el enlace de sulfhidrilo de las regiones de bisagra del terminal C de las dos cadenas pesadas. En una realización particular, la región de bisagra se modifica para contener un número impar de residuos de sulfhidrilo, por ejemplo, uno, antes de la conjugación.

De una manera alternativa, ambas especificidades de enlazamiento se pueden codificar en el mismo vector, y se pueden expresar y ensamblar en la misma célula huésped. Este método es particularmente útil cuando la molécula biespecífica es una proteína de fusión de mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab’)2, o ligando x Fab. Una molécula biespecífica de la invención puede ser una molécula de una sola cadena que comprenda un anticuerpo de una sola cadena y un determinante de enlazamiento, o una molécula biespecífica de una sola cadena que comprenda dos determinantes de enlazamiento. Las moléculas biespecíficas pueden comprender al menos dos moléculas de una sola cadena. Los métodos para la preparación de las moléculas biespecíficas se describen, por ejemplo, en la patente de los Estados Unidos de Norteamérica No. 5.260.203; en la patente de los Estados Unidos de Norteamérica No. 5.455.030; en la patente de los Estados unidos de Norteamérica No. 4.881.175; en la patente de los Estados Unidos de Norteamérica No. 5.132.405; en la patente de los Estados Unidos de Norteamérica No. 5.091.513; en la patente de los Estados Unidos de Norteamérica No. 5.476.786; en la patente de los Estados Unidos de Norteamérica No. 5.013.653; en la patente de los Estados Unidos de Norteamérica No. 5.258.498; y en la patente de los Estados Unidos de Norteamérica No. 5.482.858.

EI enlazamiento de las moléculas biespecíficas a sus objetivos específicos se puede confirmar, por ejemplo, mediante el ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), un radioinmunoensayo (REA), análisis FACS, un bioensayo (por ejemplo, inhibición del crecimiento), o un ensayo de transferencia tipo Western. Cada uno de estos ensayos detecta en general la presencia de los complejos de proteína-anticuerpo de interés particular, mediante el empleo de un reactivo marcado (por ejemplo, un anticuerpo) específico para el complejo de interés.

En otro aspecto, la presente invención proporciona compuestos multivalentes que comprenden al menos dos porciones de enlazamiento al antígeno idénticas o diferentes de los anticuerpos de la invención, que se enlazan a C5. Las porciones de enlazamiento al antígeno se pueden enlazar entre sí por medio de fusión de proteína, o de un enlace covalente o no covalente. De una manera alternativa, se han descrito los métodos de enlazamiento para las moléculas biespecíficas. Se pueden obtener compuestos tetravalentes, por ejemplo, mediante entrecruzamiento de los anticuerpos de la invención con un anticuerpo que se enlaza a las regiones constantes de los anticuerpos de la invención, por ejemplo, la región Fc o de bisagra.

El dominio trimerización se describe, por ejemplo, en la patente de Borean EP 1 012 280B1. Los módulos pentamerización se describen, por ejemplo, en la publicación WO 98/18943 A1.

Anticuerpos con una vida media prolongada

En un aspecto de la divulgación se proporcionan anticuerpos que se enlazan específicamente a la proteína C5, que tienen una vida media prolongada in vivo.

Muchos factores pueden afectar la vida media de una proteína in vivo. Por ejemplo, la filtración del riñón, el metabolismo en el hígado, la degradación mediante las enzimas proteolíticas (proteasas), y las respuestas inmunogénicas (por ejemplo, neutralización de proteína mediante anticuerpos, y absorción por los macrófagos y las células dendríticas). Se pueden emplear una variedad de estrategias para prolongar la vida media de los anticuerpos de la presente invención. Por ejemplo, mediante enlace químico a polietilenglicol (PEG), reCODE PEG, andamiaje de anticuerpo, ácido polisiálico (PSA), hidroxietil almidón (HES), ligandos que enlazan albúmina, y protectores de carbohidratos; mediante fusión genética a proteínas que se enlazan a las proteínas de suero, tales como albúmina, IgG, FcRn, y transferencia; mediante acoplamiento (genéticamente o químicamente) a otras fracciones de enlazamiento que se enlacen a las proteínas del suero, tales como nanocuerpos, Fab, DARPin, avímeros, afficuerpos, y anticalinas; mediante fusión genética a rPEG, albúmina, dominio de albúmina, proteínas de enlazamiento de albúmina, y Fc; o mediante la incorporación en nanoportadores, formulaciones de liberación lenta, o dispositivos médicos.

Para prolongar la circulación en suero de los anticuerpos in vivo, se pueden unir moléculas poliméricas inertes, tales como PEG de alto peso molecular, a los anticuerpos o a un fragmento de los mismos, con o sin un enlazador multifuncional, ya sea a través de conjugación especifica del sitio del PEG al terminal N o C de los anticuerpos, o a través de los grupos épsilon-amino presentes sobre residuos de lisina. Para pegilar un anticuerpo, típicamente se hace reaccionar el anticuerpo o un fragmento del mismo con polietilenglicol (PEG), tal como un éster o un aldehído reactivo derivado de PEG, bajo condiciones en las cuales uno o más grupos PEG lleguen a unirse al anticuerpo o al fragmento de anticuerpo. La pegilación se puede llevar a cabo mediante una reacción de acilación o una reacción de alquilación con una molécula reactiva de PEG (o un polímero reactivo análogo soluble en agua). Como se utiliza en la presente invención, el término “polietilenglicol” pretende abarcar cualquiera de las formas de PEG que se han utilizado para derivar otras proteínas, tales como monoalcoxi (de 1 a 10 átomos de carbono)- o ariloxi-polietilenglicol,

o polietilenglicol-maleimida. En ciertas realizaciones, el anticuerpo que se va a pegilar es un anticuerpo no glicosilado. Se empleará la derivación del polímero lineal o ramificado que dé como resultado una pérdida mínima de actividad biológica. Se puede hacer seguimiento cercano al grado de conjugación mediante SDS-PAGE y espectrometría de masas, para asegurar una conjugación apropiada de las moléculas de PEG con los anticuerpos. El PEG sin reaccionar se puede separar de los conjugados de anticuerpo-PEG mediante cromatografía de exclusión por tamaño o mediante cromatografía de intercambio iónico. Los anticuerpos derivados de PEG se pueden probar por la actividad de enlazamiento, así como por su eficacia in vivo, empleando métodos bien conocidos por aquellos capacitados en al arte, por ejemplo, mediante los inmunoensayos descritos en la presente invención. Los métodos para pegilar proteínas son conocidos en la técnica, y se pueden aplicar a los anticuerpos de la invención. Véanse, por ejemplo, la patente europea EP O 154 316 de Nishimura y colaboradores, y la patente europea EP 0 401 384 de Ishikawa y colaboradores.

Otras tecnologías modificadas de pegilación incluyen la tecnología reconstituyente de ingeniería químicamente ortogonal dirigida (ReCODE PEG), la cual incorpora cadenas laterales químicamente especificadas en proteínas biosintéticas a través de un sistema reconstituido que incluye ARNt sintetasa y ARNt. Esta tecnología hace posible la incorporación de más de 30 nuevos aminoácidos en las proteínas biosintéticas en células de E. coli, levadura, y de mamífero. El ARNt incorpora un aminoácido no nativo en cualquier lugar en donde se coloque un codón ámbar, convirtiendo el ámbar de un codón de detención en uno que señala la incorporación del aminoácido químicamente especificado.

También se puede emplear tecnología de pegilación recombinante (rPEG) para prolongar la vida media en suero. Esta tecnología involucra fusionar genéticamente una cola de proteína no estructurada de 300 a 600 aminoácidos con una proteína farmacéutica existente. Debido a que el peso molecular aparente de esta cadena de proteína no estructurada es aproximadamente 15 veces más grande que su peso molecular real, se aumenta mucho la vida media en suero de la proteína. En contraste con la pegilación tradicional, que requiere de conjugación y nueva purificación química, el proceso de fabricación se simplifica mucho, y el producto es homogéneo.

La polisialilación es otra tecnología que utiliza el ácido polisiálico polimérico natural (PSA) para prolongar la vida activa y mejorar la estabilidad de los péptidos y proteínas terapéuticos. El PSA es un polímero de ácido siálico (un azúcar). Cuando se utiliza para el suministro de proteínas y de fármacos peptídicos terapéuticos, el ácido polisiálico proporciona un microambiente protector en la conjugación. Esto aumenta la vida activa de la proteína terapéutica en la circulación, e impide que sea reconocida por el sistema inmunológico. El polímero PSA se encuentra naturalmente en el cuerpo humano. Fue adoptado por ciertas bacterias que evolucionaron durante millones de años para recubrir sus paredes con él. Estas bacterias naturalmente polisialiladas fueron entonces capaces, en virtud de la imitación molecular, de recubrir el sistema de defensa del cuerpo. El PSA, la última tecnología de sigilo de la naturaleza, se puede producir fácilmente a partir de estas bacterias en grandes cantidades y con características físicas predeterminadas. El PSA bacteriano es completamente no inmunogénico, inclusive cuando se acopla a proteínas, debido a que es químicamente idéntico al PSA en el cuerpo humano.

Otra tecnología incluye el uso de derivados de hidroxietil almidón (“HES”) enlazados a anticuerpos. HES es un polímero natural modificado derivado del almidón de maíz ceroso, y puede ser metabolizado por las enzimas del cuerpo. Las soluciones de HES usualmente se administran para sustituir el volumen deficiente de sangre, y para mejorar las propiedades reológicas de la sangre. La hesilación de un anticuerpo hace posible la prolongación de la vida media en circulación, al aumentar la estabilidad de la molécula, así como por la reducción de la eliminación renal, dando como resultado una actividad biológica incrementada. Al variar diferentes parámetros, tales como el peso molecular de HES, se pueden hacer a la medida un gran número de conjugados de anticuerpos de HES.

También se pueden generar anticuerpos con una mayor vida media in vivo mediante la introducción de una o más modificaciones de aminoácidos (es decir, sustituciones, inserciones, o supresiones) en un dominio constante de IgG,

o en un fragmento del mismo de enlazamiento de FcRn (de preferencia un fragmento Fc o un fragmento del dominio Fc de bisagra). Véanse, por ejemplo, la publicación internacional WO 98/23289; la publicación internacional WO 97/34681; y la patente de los Estados Unidos de Norteamérica No. 6.277.375.

Además, los anticuerpos se pueden conjugar con albúmina con el objeto de hacer que el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo sea más estable in vivo, o tenga una vida media más larga in vivo. Las técnicas son bien conocidas en el arte, véanse, por ejemplo, las publicaciones internacionales WO 93/15199, WO 93/15200, y WO 01/77137; y la patente europea EP 413.622.

Las estrategias para aumentar la vida media son especialmente útiles en los nanocuerpos, enlazadores basados en fibronectina, y otros anticuerpos o proteínas para los cuales se desee aumentar la vida media in vivo.

Conjugados de anticuerpos

Un aspecto de la divulgación proporciona anticuerpos o fragmentos de los mismos que se enlazan específicamente a una proteína C5 fusionada en forma recombinante o conjugada químicamente (incluyendo tanto conjugaciones covalentes como no covalentes) a una proteína o polipéptido heterólogo (o fragmento de los mismos, de preferencia a un polipéptido de al menos 10, al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 60, al menos 70, al menos 80, al menos 90 o al menos 100 aminoácidos), para generar proteínas de fusión. En particular, la invención proporciona proteínas de fusión que comprenden un fragmento de enlazamiento al antígeno de un anticuerpo descrito en la presente invención (por ejemplo, un fragmento Fab, un fragmento Fd, un fragmento Fv, un fragmento F(ab)2, un dominio VH, una CDR VH, un dominio VL, o una CDR VL), y una proteína, polipéptido, o péptido heterólogos. Los métodos para fusionar o conjugar proteínas, polipéptidos, o péptidos a un anticuerpo o a un fragmento de anticuerpo, son conocidos en el arte. Véanse, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Nos. 5.336.603, 5.622.929, 5.359.046, 5.349.053, 5.447.851, y 5.112.946; las patentes europeas Nos. EP 307.434 y EP 367.166; las Publicaciones Internacionales Nos. WO 96/04388 y WO 91/06570; Ashkenazi y colaboradores, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 88: 10535 - 10539; Zheng y colaboradores, 1995, J. Immunol. 154: 5590 - 5600; y Vil y colaboradores, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 89: 11337 - 11341.

Se pueden generar proteínas de fusión adicionales a través de las técnicas de transposición de genes, transposición de motivos, transposición de exones, y/o transposición de codones (colectivamente denominadas como "transposición del ADN"). La transposición del ADN se puede emplear para alterar las actividades de los anticuerpos de la invención o de los fragmentos de los mismos (por ejemplo, los anticuerpos o fragmentos de los mismos con más altas afinidades y más bajos índices de disociación). Véanse, en general, las patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Nos. 5.605.793, 5.811.238, 5.830.721, 5.834.252, y 5.837.458; Patten y colaboradores, 1997, Curr. Opinion Biotechnol. 8: 724 - 33; Harayama, 1998, Trends Biotechnol. 16(2): 76 - 82; Hansson y colaboradores, 1999,

J. Mol. Biol. 287: 265 - 76; y Lorenzo y Blasco, 1998, Biotechniques 24(2): 308 - 313. Los anticuerpos o fragmentos de los mismos, o los anticuerpos codificados o fragmentos de los mismos, se pueden alterar al someterlos a mutagénesis aleatoria mediante PCR susceptible a error, inserción aleatoria de nucleótidos u otros métodos, antes de la recombinación. Un polinucleótido que codifique un anticuerpo o fragmento del mismo que se enlace específicamente a una proteína C5, se puede recombinar con uno o más componentes, motivos, secciones, partes, dominios, fragmentos, etc., de una o más moléculas heterólogas.

Además, los anticuerpos o fragmentos de los mismos se pueden fusionar a secuencias marcadoras, tales como un péptido, para facilitar la purificación. En las realizaciones preferidas, la secuencia de aminoácidos marcadora es un péptido de hexa-histidina, tal como la etiqueta proporcionada en un vector pQE (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, ChatSworth, CA, 91311), entre otros, muchos de los cuales están comercialmente disponibles. Como se describe en Gentz y colaboradores, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 86: 821 - 824, por ejemplo, proporciona hexa-histidina para una purificación conveniente de la proteína de fusión. Otras etiquetas peptídicas útiles para la purificación incluyen, pero no se limitan a, la etiqueta de hemaglutinina (“HA”), la cual corresponde a un epítopo derivado de la proteína hemaglutinina de la influenza (Wilson y colaboradores, 1984, Cell 37: 767), y la etiqueta “flag”.

En otros aspectos de la divulgación, los anticuerpos de la presente invención o los fragmentos de los mismos, se conjugan a un agente de diagnóstico o detectable. Estos anticuerpos pueden ser útiles para monitorear o pronosticar el inicio, desarrollo, progreso, y/o severidad de una enfermedad o trastorno, como parte de un procedimiento de análisis clínico, tal como la determinación de la eficacia de una terapia particular. Este diagnóstico y detección se pueden llevar a cabo mediante el acoplamiento del anticuerpo a sustancias detectables que incluyen, pero no se limitan a, diferentes enzimas, tales como, pero sin limitarse a, peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, betagalactosidasa, o acetilcolinesterasa; grupos protésicos, tales como, pero sin limitarse a, estreptavidina/biotina y avidina/biotina; materiales fluorescentes, tales como, pero sin limitarse a, umbeliferona, fluoresceína, isocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina, fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; materiales Iuminiscentes, tales como, pero sin limitarse a, luminol; materiales bioluminiscentes, tales como, pero sin limitarse a, Iuciferasa, Iuciferina, y aequorina; materiales radioactivos, tales como, pero sin limitarse a, yodo (131l, 125I, 123I, y 121I,), carbono (14C), azufre (35S), tritio (3H), indio (115In, 113In, 112In, y 111In), tecnecio (99Tc), talio (201Ti), galio (68Ga, 67Ga), paladio (103Pd), molibdeno (99Mo), xenón (133Xe), flúor (18F), 153Sm, 177Lu, 159Gd, 149Pm, 140La, 175Yb, 166Ho, 90Y, 47Sc, 186Re,188Re, 142Pr, 105Rh, 97Ru, 68Ge, 57Co, 65Zm 85Sr, 32P, 153Gdl, 169Yb, 51Cr, 54Mn, 75Se, 113Sn, y 117Tin; y los metales emisores de positrones que utilizan diferentes tomografías de emisión de positrones, y los iones de metales paramagnéticos no radioactivos.

Un aspecto de la divulgación abarca además los usos de los anticuerpos o fragmentos de los mismos conjugados a una fracción terapéutica. Un anticuerpo o fragmento del mismo se puede conjugar a una fracción terapéutica, tal como una citotoxina, por ejemplo, un agente citostático o citocida, un agente terapéutico, o un ión de metal radioactivo, por ejemplo emisores alfa. Una citotoxina o un agente citotóxico incluye cualquier agente que sea perjudicial para las células.

Adicionalmente, un anticuerpo o fragmento del mismo se puede conjugar a una fracción terapéutica o a una fracción de un fármaco que modifique una respuesta biológica dada. Las fracciones terapéuticas o las fracciones de un fármaco no deben interpretarse como limitadas a los agentes terapéuticos químicos clásicos. Por ejemplo, la fracción de un fármaco puede ser una proteína, péptido, o polipéptido que posea una actividad biológica deseada. Estas proteínas pueden incluir, por ejemplo, una toxina, tal como abrina, ricina A, exotoxina de Pseudomonas, toxina de cólera, o toxina de difteria; una proteína, tal como el factor de necrosis tumoral, interferón α, interferón β, factor de crecimiento de nervios, factor de crecimiento derivado de plaquetas, activador de plasminógeno de tejido, un agente apoptótico, un agente antiangiogénico; o un modificador de la respuesta biológica, tal como, por ejemplo, una Iinfoquina.

Además, un anticuerpo se puede conjugar con fracciones terapéuticas, tales como unión de metal radioactivo, tales como emisores alfa, tales como 213Bi, o quelantes macrocíclicos útiles para la conjugación de iones de metales radioactivos, incluyendo, pero sin limitarse a, 131In, 131Lu, 131Y, 131Ho, 131Sm, a los polipéptidos. En ciertas realizaciones, el quelante macrocíclico es el ácido 1,4,7,10-tetra-aza-ciclododecano-N,N’,N”,N’”-tetraacético (DOTA), que se puede unir al anticuerpo a través de una molécula enlazadora. Estas moléculas enlazadoras se conocen comúnmente en la técnica, y se describen en Denardo y colaboradores, 1998, Clin. Cancer Res. 4(10): 2483 - 90; Peterson y colaboradores, 1999, Bioconjug. Chem. 10(4): 553 - 7; y Zimmerman y colaboradores, 1999, Nucl. Med. Biol. 26(8): 943 - 50.

Las técnicas para conjugar las fracciones terapéuticas a los anticuerpos son bien conocidas; véanse, por ejemplo, Arnon y colaboradores, “Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs ln Cancer Therapy”, en Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld y colaboradores (Editores), páginas 243 - 56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom y colaboradores, “Antibodies For Drug Delivery”, en Controlled Drug Delivery (Segunda Edición), Robinson y colaboradores, (Editores), páginas 623 - 53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, “Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents ln Cancer Therapy: A Review”, en Monoclonal Antibodies 84: Biological And Clinical Applications, Pinchera y colaboradores (Editores), páginas 475 - 506 (1985); “Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy”, en Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin y colaboradores, (Editores), páginas 303 - 16 (Academic Press 1985), y Thorpe y colaboradores, 1982, Immunol. Rev. 62: 119 - 58.

Los anticuerpos también se pueden unir a soportes sólidos, los cuales son particularmente útiles para los inmunoensayos o para la purificación del antígeno objetivo. Estos soportes sólidos incluyen, pero no se limitan a, vidrio, celulosa, poliacrilamida, nailon, poliestireno, cloruro de polivinilo, o polipropileno.

5.2 Métodos para la producción de los anticuerpos de la invención 5.2.1 Ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos

La invención proporciona moléculas de ácido nucleico sustancialmente purificadas que codifican los polipéptidos que comprenden segmentos o dominios de las cadenas de anticuerpo que se enlazan a C5 descritas anteriormente. Algunos de los ácidos nucleicos de la invención comprenden la secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de cadena pesada mostrada en las SEQ ID NOs: 7, y/o la secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de cadena ligera mostrada en la SEQ ID NO: 8. Algunos de los ácidos nucleicos de la divulgación comprenden la secuencia de nucleótidos que codifican la región variable de cadena pesada mostrada en las SEQ ID NOs: 23, 39, 51, 67, 79, 96, 108, 114, 121, 137, 151, 165, 179, 187, 201, 210, 218, 227, 241, 253, 257, 273, 277, o 281, y/o la secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de cadena ligera mostrada en las SEQ ID NOs: 24, 40, 52, 68, 80, 90, 102, 122, 138, 152, 166, 180, 188, 202, 211, 219, 228, 242, 261, 265, 269, 285, o 289. En una realización especifica, las moléculas de ácidos nucleicos son aquéllas identificadas en la Tabla 1. Algunas otras moléculas de ácidos nucleicos de la invención comprenden secuencias de nucleótidos que son sustancialmente idénticas (por ejemplo, al menos 65%, 80%, 95%, o 99%) a las secuencias de nucleótidos de aquellas identificadas en la Tabla 1. Cuando se expresan a partir de vectores de expresión apropiados, los polipéptidos codificados por estos polinucleótidos son capaces de exhibir una capacidad de enlazamiento al antígeno de C5.

También se divulgan polinucleótidos que codifican al menos una región CDR, y usualmente las tres regiones CDR de la cadena pesada o ligera del anticuerpo que se enlaza a C5 expuestas anteriormente. Algunos otros polinucleótidos codifican todas o sustancialmente todas las secuencias de la región variable de la cadena pesada y/o de la cadena ligera del anticuerpo que se enlaza a C5 expuestas anteriormente. Debido a la degeneración del código, una variedad de secuencias de ácidos nucleicos codificarán cada una de las secuencias de aminoácidos de inmunoglobulina.

Las moléculas de ácido nucleico de la divulgación pueden codificar tanto una región variable como una región constante del anticuerpo. Algunas de las secuencias de ácido nucleico de la invención comprenden nucleótidos que codifican una secuencia de la región variable de cadena pesada madura que es sustancialmente idéntica (por ejemplo, al menos 80%, 90%, o 99%) a la secuencia de la región variable de cadena pesada madura expuesta en las SEQ ID NOs: 7, 23, 39, 51, 67, 79, 96, 108, 114, 121, 137, 151, 165, 179, 187, 201, 210, 218, 227, 241, 253, 257, 273, 277, o 281. Algunas otras secuencias de ácidos nucleicos comprenden nucleótidos que codifican una secuencia de la región variable de cadena ligera madura que es sustancialmente idéntica (por ejemplo, al menos 80%, 90%, o 99%) a la secuencia de la región variable de cadena ligera madura expuesta en las SEQ ID NOs: 8, 24, 40, 52, 68, 80, 90, 102, 122, 138, 152, 166, 180, 188, 202, 211, 219, 228, 242, 261, 265, 269, 285, o 289.

Las secuencias de polinucleótidos se pueden producir mediante nueva síntesis de ADN en fase sólida, o mediante mutagénesis por PCR de una secuencia existente (por ejemplo, secuencias como las descritas en los Ejemplos que se encuentran más adelante), que codifica un anticuerpo que se enlaza a C5 o su fragmento de enlazamiento. La síntesis química directa de los ácidos nucleicos se puede lograr mediante los métodos conocidos en el arte, tales como el método de fosfotriéster de Narang y colaboradores, 1979, Meth. Enzymol. 68: 90; el método de fosfodiéster de Brown y colaboradores, Meth. Enzymol. 68: 109, 1979; el método de dietilfosforamidita de Beaucage y colaboradores, Tetra. Lett., 22: 1859, 1981; y el método de soporte solido de la patente de los Estados Unidos de Norteamérica No. 4.458.066. La introducción de mutaciones a una secuencia de polinucleótido mediante PCR se puede llevar a cabo como se describe, por ejemplo, en PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, H. A. Erlich (Editor), Freeman Press, NY, NY, 1992; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, lnnis y colaboradores (Editores), Academic Press, San Diego, CA, 1990; Mattila y colaboradores, Nucleic Acids Res. 19: 967, 1991; y Eckert y colaboradores, PCR Methods and Applications 1: 17, 1991.

También se proporcionan en la invención vectores de expresión y células huésped para producir los anticuerpos que se enlazan a C5 descritos anteriormente. Se pueden emplear diferentes vectores de expresión para expresar los polinucleótidos que codifican las cadenas de anticuerpo que se enlazan a C5 o los fragmentos de enlazamiento. Se pueden utilizar tanto vectores de expresión basados en virus como no virales para producir los anticuerpos en una célula huésped de mamífero. Los vectores y sistemas no virales incluyen plásmidos, vectores episomales, típicamente con un casete de expresión para expresar una proteína o ARN, y cromosomas artificiales humanos (véase, por ejemplo, Harrington y colaboradores, Nat. Genet 15: 345, 1997). Por ejemplo, los vectores no virales útiles para la expresión de los polinucleótidos y polipéptidos que se enlazan a C5 en células de mamífero (por ejemplo, humanas) incluyen a los vectores pThioHis A, B & C, pcDNA3.t/His, pEBVHis A, B & C, (Invitrogen, San Diego, CA), MPSV, y otros numerosos vectores conocidos en la técnica para la expresión de otras proteínas. Los vectores virales útiles incluyen a los vectores basados en retrovirus, adenovirus, virus adeno-asociados, virus del herpes, vectores basados en SV40, virus de papiloma, virus HBP de Epstein Barr, vectores de virus de vacuna, y virus de Semliki Forest (SFV). Véanse, Brent y colaboradores, más arriba; Smith, Annu. Rev. Microbiol. 49: 807, 1995; y Rosenfeld y colaboradores, Cell 68: 143, 1992.

La elección del vector de expresión depende de las células huésped pretendidas en donde se vaya a expresar el vector. Típicamente, los vectores de expresión contienen un promotor y otras secuencias reguladoras (por ejemplo, potenciadoras), que se enlazan operativamente a los polinucleótidos que codifican una cadena o fragmento de anticuerpo que se enlaza a C5. En algunas realizaciones, se emplea un promotor inducible para impedir la expresión de las secuencias insertadas, excepto bajo condiciones de inducción. Los promotores inducibles incluyen, por ejemplo, arabinosa, LacZ, promotor de metalotioneína, o un promotor de choque térmico. Los cultivos de organismos transformados se pueden expandir bajo condiciones no inductoras sin desviación de la población por las secuencias de codificación cuyos productos de expresión sean mejor tolerados por las células huésped. Además de los promotores, también se pueden requerir o desear otros elementos reguladores para la expresión eficiente de una cadena o fragmento de anticuerpo que se enlaza a C5. Estos elementos típicamente incluyen un codón de inicio ATG, y un sitio de enlazamiento al ribosoma adyacente, u otras secuencias. Además, la eficiencia de la expresión se puede mejorar mediante la inclusión de potenciadores apropiados al sistema celular en uso (véanse, por ejemplo, Scharf y colaboradores, Results Probl. Cell Differ. 20: 125, 1994; y Bittner y colaboradores, Meth. Enzymol., 153: 516, 1987). Por ejemplo, se puede utilizar el potenciador de SV40 o el potenciador de CMV para aumentar la expresión en las células huésped de mamífero.

Los vectores de expresión también pueden proporcionar una posición de la secuencia señal de secreción para formar una proteína de fusión con los polipéptidos codificados por las secuencias de anticuerpo insertadas que se enlazan a C5. Más a menudo, las secuencias de anticuerpo insertadas que se enlazan a C5, se enlazan a secuencias de señal antes de la inclusión en el vector. Los vectores que se utilizan para recibir a las secuencias que codifican los dominios variables de cadena ligera y pesada del anticuerpo que se enlaza a C5, algunas veces también codifican regiones constantes o partes de las mismas. Estos vectores permiten la expresión de las regiones variables como proteínas de fusión con las regiones constantes, conduciendo de esta manera a la producción de anticuerpos intactos o fragmentos de los mismos. Típicamente, estas regiones constantes son humanas.

Las células huésped para albergar y expresar las cadenas de los anticuerpos que se enlazan a C5 pueden ser procariotas o eucariotas; E. coli es un huésped procariota útil para la clonación y expresión de los polinucleótidos de la presente invención. Otros huéspedes microbianos adecuados para utilizarse incluyen bacilos, tales como Bacillus subtilis, y otras enterobacterias, tales como las especies de Salmonella, Serratia, y diferentes Pseudomonas. En estos huéspedes procariotas, también se pueden hacer vectores de expresión, los cuales típicamente contienen secuencias de control de expresión compatibles con la célula huésped (por ejemplo, un origen de replicación). Además, estará presente cualquier cantidad de una variedad de promotores bien conocidos, tales como el sistema promotor de lactosa, un sistema promotor de triptófano (trp), un sistema promotor de beta-Iactamasa, o un sistema promotor a partir del fago lambda. Los promotores típicamente controlan la expresión, opcionalmente con una secuencia operadora, y tienen secuencias del sitio de enlazamiento al ribosoma y similares, para iniciar y completar la transcripción y la traducción. También se pueden emplear otros microbios, tales como levadura, para expresar los polipéptidos de la invención que se enlazan a C5. También se pueden utilizar células de insecto en combinación con vectores de baculovirus.

En un aspecto de la divulgación, se utilizan células huésped de mamífero para expresar y producir los polipéptidos de la presente invención que se enlazan a C5. Por ejemplo, pueden ser ya sea una línea celular de hibridoma que expresa los genes de inmunoglobulina endógenos (por ejemplo, el clon de hibridoma de mieloma 1D6.C9, como se describe en los Ejemplos), o bien una línea celular de mamífero que alberga un vector de expresión exógeno (por ejemplo, las células de mieloma SP2/0 ejemplificadas más adelante). Estas incluyen cualquier célula animal o humana mortal normal, o inmortal normal o anormal. Por ejemplo, se han desarrollado una cantidad de líneas celulares huésped adecuadas capaces de secretar las inmunoglobulinas intactas, incluyendo las líneas celulares de CHO, diferentes líneas celulares Cos, las células HeLa, las líneas celulares de mieloma, las células B transformadas, e hibridomas. El uso del cultivo celular de tejido de mamífero para expresar polipéptidos se discute en general, por ejemplo, en Winnacker, FROM GENES TO CLONES, VCH Publishers, N.Y., N.Y., 1987. Los vectores de expresión para las células huésped de mamífero pueden incluir secuencias de control de expresión, tales como un origen de replicación, un promotor, y un potenciador (véase, por ejemplo, Queen, y colaboradores, lmmunol. Rev. 89: 49 - 68, 1986), y los sitios necesarios de información de procesamiento, tales como los sitios de enlazamiento al ribosoma, los sitios de empalme de ARN, los sitios de poliadenilación, y las secuencias terminadoras de la transcripción. Estos vectores de expresión normalmente contienen promotores derivados a partir de los genes de mamífero o a partir de los virus de mamífero. Los promotores adecuados pueden ser constitutivos, específicos del tipo de célula, específicos de la etapa, y/o modulables o regulables. Los promotores útiles incluyen, pero no se limitan a, el promotor de metalotioneína, el promotor constitutivo tardío mayor de adenovirus, el promotor de MMTV inducible por dexametasona, el promotor de SV40, el promotor poIII de MRP, el promotor constitutivo de MPSV, el promotor de CMV inducible por tetraciclina (tal como el promotor de CMV inmediato temprano humano), el promotor constitutivo de CMV, y combinaciones de promotores-potenciadores conocidos en el arte.

Los métodos para la introducción de vectores de expresión que contengan las secuencias de polinucleótidos de interés varían dependiendo del tipo de huésped celular. Por ejemplo, comúnmente se utiliza la transfección con cloruro de calcio para las células procariotas, mientras que se puede utilizar el tratamiento con fosfato de calcio o electroporación para otros huéspedes celulares. (Véase en general Sambrook y colaboradores, más arriba). Otros métodos incluyen, por ejemplo, electroporación, tratamiento con fosfato de calcio, transformación mediada por Iiposomas, inyección y microinyección, métodos balísticos, virosomas, inmunoliposomas, conjugados de policatión : ácido nucleico, ADN desnudo, viriones artificiales, fusión con la proteína estructural del virus del herpes VP22 (Elliot y O’Hare, Cell 88: 223, 1997), absorción de ADN mejorada por un agente, y transducción ex vivo. Para la producción a largo plazo de alto rendimiento de proteínas recombinantes, con frecuencia se deseará una expresión estable. Por ejemplo, se pueden preparar líneas celulares que expresen establemente las cadenas de anticuerpos que se enlazan a C5 o los fragmentos de enlazamiento, utilizando los vectores de expresión de la invención que contengan orígenes virales de replicación o elementos de expresión endógenos y un gen marcador seleccionable. Después de la introducción del vector, se puede permitir que las células crezcan durante 1 a 2 días en un medio enriquecido, antes de cambiarlas a un medio selectivo. El propósito del marcador seleccionable es conferir resistencia a la selección, y su presencia permite el crecimiento de las células que expresen exitosamente las secuencias introducidas en el medio selectivo. Se pueden hacer proliferar las células establemente transfectadas, resistentes, utilizando técnicas de cultivo de tejido apropiadas para el tipo de célula.

5.2.2 Generación de los anticuerpos monoclonales de la invención

Los anticuerpos monoclonales (mAb) se pueden producir mediante una variedad de técnicas, incluyendo la metodología convencional de anticuerpos monoclonales, por ejemplo, la técnica estándar de hibridación de células somáticas de Kohler y Milstein, 1975 Nature 256: 495. Se pueden emplear muchas técnicas para producir anticuerpos monoclonales, por ejemplo, transformación viral u oncogénica de los linfocitos B.

Un sistema animal para preparar hibridomas es el sistema de murino. La producción de hibridoma en el ratón es un procedimiento bien establecido. Los protocolos y técnicas de inmunización para el aislamiento de los esplenocitos inmunizados para fusión son conocidos en el arte. También se conocen los compañeros de fusión (por ejemplo, células de mieloma de murino), y los procedimientos de fusión.

Los anticuerpos quiméricos o humanizados de la presente invención se pueden preparar con base en la secuencia de un anticuerpo monoclonal de murino preparado como se describió anteriormente. El ADN que codifica las inmunoglobulinas de cadena pesada y ligera se puede obtener a partir del hibridoma de murino de interés, y se puede modificar genéticamente para contener secuencias de inmunoglobulina que no sean de murino (por ejemplo, humanas), empleando técnicas convencionales de biología molecular. Por ejemplo, con el fin de crear un anticuerpo quimérico, las regiones variables de murino se pueden enlazar a las regiones constantes humanas, empleando los métodos conocidos en el arte (véase, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos de Norteamérica No. 4.816.567 de Cabilly y colaboradores). Con el objeto de crear un anticuerpo humanizado, se pueden insertar las regiones CDR de murino en una estructura humana, empleando los métodos conocidos en el arte. Véanse, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos de Norteamérica No. 5.225.539 de Winter, y las patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Nos. 5.530.101; 5.585.089; 5.693.762 y 6.180.370 de Queen y colaboradores.

En una cierta realización, los anticuerpos de la invención son anticuerpos monoclonales humanos. Estos anticuerpos monoclonales humanos dirigidos contra C5, se pueden generar utilizando ratones transgénicos o transcromosómicos que portan partes del sistema inmunitario humano, en lugar del sistema de ratón. Estos ratones transgénicos y transcromosómicos incluyen a los ratones denominados en la presente invención como ratones HuMAb y ratones KM, respectivamente, y son denominados colectivamente en la presente invención como “ratones con lg humana”.

El ratón HuMAb® (Medarex, Inc.) contiene miniloci del gen de inmunoglobulina humana, que codifican las secuencias de inmunoglobulina de cadena pesada (μ y γ) y cadena ligera κ humanas no reordenadas, junto con las mutaciones dirigidas que inactivan los loci de las cadenas μ y κ endógenos (véase, por ejemplo, Lonberg y colaboradores, 1994 Nature 368(6474): 856 - 859). Por lo tanto, los ratones exhiben una expresión reducida de la IgM o κ de ratón, y, en respuesta a la inmunización, los transgenes de cadena pesada y ligera humanos introducidos experimentan un cambio de clase y mutación somática para generar la lgGκ monoclonal humana de alta afinidad (Lonberg, N. y colaboradores, 1994, ver más arriba; revisado en Lonberg, N., 1994 Handbook of Experimental Pharmacology 113: 49 - 101; Lonberg, N. y Huszar, D., 1995 Intern. Rev. Immunol.13: 65 - 93, y Harding, F. y Lonberg, N., 1995 Ann. N. Y. Acad. Sci. 764: 536 - 546). La preparación y uso de ratones HuMAb, y las modificaciones genómicas portadas por estos ratones, se describen adicionalmente en Taylor, L. y colaboradores, 1992 Nucleic Acids Research 20: 6287 - 6295; Chen, J. y colaboradores, 1993 International lmmunology 5: 647 656; Tuaillon y colaboradores, 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 94: 3720 - 3724; Choi y colaboradores, 1993 Nature Genetics 4: 117 - 123; Chen, J. y colaboradores, 1993 EMBO J. 12: 821 - 830; Tuaillon y colaboradores, 1994 J. Immunol. 152: 2912 - 2920; Taylor, L. y colaboradores, 1994 International lmmunology 579 - 591; y Fishwild, D. y colaboradores, 1996 Nature Biotechnology 14: 845 - 851. Véanse además las patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Nos. 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.789.650; 5.877.397; 5.661.016; 5.814.318; 5.874.299; y 5.770.429; todas de Lonberg y Kay; la patente de los Estados Unidos de Norteamérica No. 5.545.807 de Surani y colaboradores; las publicaciones del TCP Nos. WO 92/103918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97113852, WO 98/24884 y WO 99/45962, todas de Lonberg y Kay; y la publicación del TCP No. WO 01/14424 de Korman y colaboradores.

Los anticuerpos humanos de la invención se pueden aumentar utilizando un ratón que porte las secuencias de inmunoglobulina humana sobre transgenes y transcromosomas, tal como un ratón que porte un transgén de cadena pesada humana y un transcromosoma de cadena ligera humana. Estos ratones, denominados en la presente invención como “ratones KM”, se describen con detalle en la publicación del TCP Número WO 02/43478 de lshida y colaboradores.

Incluso además, en la técnica están disponibles sistemas alternativos de animales transgénicos que expresan genes de inmunoglobulina humana, y se pueden utilizar para elevar los anticuerpos de la invención que se enlazan a C5. Por ejemplo, se puede utilizar un sistema transgénico alternativo denominado como el Xenoratón (Abgenix, Inc.). Estos ratones se describen, por ejemplo, en las patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Nos. 5.939.598; 6.075.181; 6.114.598; 6.150.584 y 6.162.963 de Kucherlapati y colaboradores.

Por otra parte, están disponibles en el arte sistemas de animales transcromosómicos alternativos que expresan genes de inmunoglobulina humana, y se pueden utilizar para elevar los anticuerpos de la invención que se enlazan a C5. Por ejemplo, se pueden utilizar ratones que portan tanto un transcromosoma de cadena pesada humana como un transcromosoma de cadena ligera humana, denominados como “ratones TC”; estos ratones se describen en Tomizuka y colaboradores, 2000 Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 97: 722 - 727. Adicionalmente, se han descrito en la técnica vacas que portan transcromosomas de cadena pesada y ligera humanos (Kuroiwa y colaboradores, 2002 Nature Biotechnology 20: 889 - 894), y se pueden utilizar para elevar los anticuerpos de la invención que se enlazan a C5.

Los anticuerpos monoclonales humanos de la invención también se pueden preparar utilizando los métodos de despliegue en fagos para seleccionar bibliotecas de genes de inmunoglobulina humana. Estos métodos de despliegue en fagos para aislar los anticuerpos humanos están establecidos en la técnica, o se describen en los ejemplos que se encuentran más adelante. Véanse, por ejemplo: las patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Nos. 5.223.409; 5.403,484; y 5,571,698 de Ladner y colaboradores; las patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Nos. 5.427.908 y 5.580,717 de Dower y colaboradores; las patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Nos. 5.969.108 y 6.172.197 de McCafferty y colaboradores; y las patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Nos. 5.885.793; 6.521.404; 6.544.731; 6.555.313; 6.582.915 y 6.593.081 a Griffiths y colaboradores.

Los anticuerpos monoclonales humanos de la invención también se pueden preparar utilizando ratones SCID, en los cuales se han reconstituido células inmunes humanas, de tal manera que se puede generar una respuesta de anticuerpo humano después de la inmunización. Estos ratones se describen, por ejemplo, en las patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Nos. 5.476.996 y 5.698.767 de Wilson y colaboradores.

5.2.3 Modificación por ingeniería genética de la estructura o de Fc.

Los anticuerpos modificados por ingeniería genética de la invención incluyen aquéllos en donde se han hecho modificaciones a los residuos de la estructura dentro de la VH y/o VL, por ejemplo, para mejorar las propiedades del anticuerpo. Típicamente, estas modificaciones de la estructura se hacen para disminuir la inmunogenicidad del anticuerpo. Por ejemplo, un enfoque es “mutar nuevamente” uno o más residuos de la estructura hasta la correspondiente secuencia de la línea germinal. Más específicamente, un anticuerpo que haya experimentado una mutación somática puede contener residuos de estructura que difieran de la secuencia de la línea germinal a partir de la cual se deriva el anticuerpo. Estos residuos se pueden identificar mediante la comparación de las secuencias de la estructura del anticuerpo con las secuencias de la línea germinal a partir de la cual se deriva el anticuerpo. Para regresar las secuencias de la región de estructura hasta su configuración de la línea germinal, las mutaciones somáticas se pueden “mutar nuevamente” hasta la secuencia de la línea germinal, por ejemplo, mediante mutagénesis dirigida al sitio. También se pretende que estos anticuerpos “nuevamente mutados” sean abarcados por la invención.

Otro tipo de modificación de estructura involucra la mutación de uno o más residuos dentro de la región de estructura, o inclusive dentro de una o más regiones CDR, para remover los epítopos de células T, con el fin de reducir de esta manera la inmunogenicidad potencial del anticuerpo. Este enfoque también se denomina como “desinmunización” y se describe con mayor detalle en la publicación de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica No. 2003/0153043 de Carr y colaboradores.

Además o de una manera alternativa a las modificaciones hechas dentro de la estructura o de las regiones CDR, los anticuerpos de la invención pueden ser modificados por ingeniería genética para incluir modificaciones dentro de la región Fc, típicamente para alterar una o más propiedades funcionales del anticuerpo, tales como la vida media en suero, la fijación del complemento, el enlazamiento al receptor Fc, y/o la citotoxicidad celular dependiente del antígeno. Adicionalmente, un anticuerpo de la invención puede ser químicamente modificado (por ejemplo, se pueden unir o más fracciones químicas al anticuerpo), o ser modificado para alterar su glicosilación, nuevamente con el fin de alterar una o más propiedades funcionales del anticuerpo. Cada una de estos aspectos se describe con mayor detalle más adelante. La numeración de los residuos en la región Fc es aquélla del índice EU de Kabat.

En un aspecto de la divulgación, la región de bisagra de CH1 se modifica de tal manera que se altera el número de residuos de cisteína en la región de bisagra, por ejemplo, se aumentan o se reducen. Este enfoque se describe adicionalmente en la patente de los Estados Unidos de Norteamérica No. 5.677.425 de Bodmer y colaboradores. El número de residuos de cisteína en la región de bisagra de CH1 se altera, por ejemplo, para facilitar el ensamblaje de las cadenas ligera y pesada, o con el fin de aumentar o disminuir la estabilidad del anticuerpo.

En otro aspecto de la divulgación, se muta la región de bisagra de Fc para disminuir la vida media biológica del anticuerpo. Más específicamente, se introducen una o más mutaciones de aminoácidos en la región de interfaz del dominio CH2-CH3 del fragmento de bisagra de Fc, de tal manera que el anticuerpo tenga el enlace de proteína A de Estafilocócica (SpA) debilitado en relación con el enlace de SpA del dominio de bisagra de Fc nativo. Este enfoque se describe con mayor detalle en la patente de los Estados Unidos de Norteamérica No. 6.165.745 de Ward y colaboradores.

En otro aspecto de la divulgación, el anticuerpo se modifica para aumentar su vida media biológica. Son posibles diferentes enfoques. Por ejemplo, se pueden introducir una o más de las siguientes mutaciones: T252L, T254S, T256F, como se describe en la patente de los Estados Unidos de Norteamérica No. 6.277.375 de Ward. De una manera alternativa, con el fin de aumentar la vida media biológica, se puede alterar el anticuerpo dentro de la región CH1 o CL para contener un epítopo que se enlaza al receptor de salvamento tomado a partir de dos bucles de un dominio CH2 de una región Fc de una IgG, como se describe en las patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Nos. 5.869.046 y 6.121.022 de Presta y colaboradores.

En aún otras aspectos de la divulgación, se altera la región Fc reemplazando al menos un residuo de aminoácido con un residuo de aminoácido diferente, con el fin de alterar las funciones efectoras del anticuerpo. Por ejemplo, uno

o más aminoácidos pueden ser reemplazados con un residuo de aminoácido diferente, de tal manera que el anticuerpo tenga una afinidad alterada por un ligando efector, pero retenga la capacidad de enlazamiento con el antígeno del anticuerpo progenitor. El ligando efector con el cual se altera la afinidad puede ser, por ejemplo, un receptor de Fc, o el componente C1 del complemento. Este enfoque se describe con mayor detalle en las patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Nos. 5.624.821 y 5.648.260, ambas de Winter y colaboradores.

En otro aspecto de la divulgación, uno o más aminoácidos seleccionados a partir de los residuos de aminoácidos, pueden ser reemplazados con un residuo de aminoácido diferente, de tal manera que el anticuerpo tenga un enlace de C1q alterado, y/o una citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) reducida o abolida. Este enfoque se describe con mayor detalle en la patente de los Estados Unidos de Norteamérica No. 6.194.551 de ldusogie y colaboradores.

En otro aspecto de la divulgación, se alteran uno o más residuos de aminoácidos para alterar de esta manera la capacidad del anticuerpo para fijar el complemento. Este enfoque se describe adicionalmente en la Publicación del TCP No. WO 94/29351 de Bodmer y colaboradores.

En aún otro aspecto de la divulgación, se modifica la región Fc para aumentar la capacidad del anticuerpo para mediar la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC), y/o para aumentar la afinidad del anticuerpo por un receptor de Fcγ, mediante la modificación de uno o más aminoácidos. Este enfoque se describe adicionalmente en la publicación del TCP WO 00/42072 de Presta. Más aún, los sitios de enlazamiento sobre IgG1 para FcγRI, FcγRII, FcγRIII y FcRn humana, han sido mapeados, y se han descrito las variantes con enlazamiento mejorado (véase Shields, R. L. y colaboradores, 2001 J. Biol. Chem. 276: 6591 - 6604).

En aún otro aspecto de la divulgación, se modifica la glicosilación de un anticuerpo. Por ejemplo, se puede elaborar un anticuerpo no glicosilado (es decir, el anticuerpo carece de glicosilación). La glicosilación se puede alterar, por ejemplo, para aumentar la afinidad del anticuerpo por el “antígeno”. Estas modificaciones del carbohidrato se pueden lograr mediante, por ejemplo, la alteración de uno o más sitios de glicosilación dentro de la secuencia del anticuerpo. Por ejemplo, se pueden hacer una o más sustituciones de aminoácidos que den como resultado la eliminación de uno o más sitios de glicosilación de la estructura de región variable, para eliminar de esta manera la glicosilación en ese sitio. Esta falta de glicosilación puede aumentar la afinidad del anticuerpo por el antígeno. Este enfoque se describe con mayor detalle en las patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Nos. 5.714.350 y 6.350.861 de Co y colaboradores.

Adicionalmente o de una manera alternativa, se puede elaborar un anticuerpo que tenga un tipo de glicosilación alterada, tal como un anticuerpo hipofucosilado que tenga cantidades reducidas de residuos de fucosilo, o un anticuerpo que tenga más estructuras de GlcNac de bisección. Se ha demostrado que estos patrones de glicosilación alterada aumentan la capacidad de ADCC de los anticuerpos. Estas modificaciones de carbohidratos se pueden lograr, por ejemplo, mediante la expresión del anticuerpo en una célula huésped con una maquinaria de glicosilación alterada. Las células con la maquinaria de glicosilación alterada han sido descritas en el arte, y se pueden utilizar como células huésped en las que se expresan los anticuerpos recombinantes de la invención, para producir de esta manera un anticuerpo con glicosilación alterada. Por ejemplo, la patente europea EP 1.176.195 de Hang y colaboradores, describe una línea celular con un gen FUT8 funcionalmente interrumpido, el cual codifica una fucosil transferasa, de tal manera que los anticuerpos expresados en esta línea celular exhiben hipofucosilación. La publicación del TCP WO 03/035835 de Presta describe una variante de línea celular CHO, las células Lecl3, con una capacidad reducida para unir la fucosa a los carbohidratos enlazados con Asn(297), que también da como resultado una hipofucosilación de los anticuerpos expresados en esa célula huésped (véase también Shields, R. L. y colaboradores, 2002 J. Biol. Chem. 277: 26733 - 26740). La Publicación del TCP WO 99/54342 de Umana y colaboradores, describe líneas celulares modificadas por ingeniería genética para expresar las glicosiltransferasas que modifican la glicoproteína (por ejemplo, beta(1,4)-N-acetiIglucosaminiItransferasa III (GnTIII)), de tal manera que los anticuerpos expresados en las líneas celulares modificadas por ingeniería genética que exhiben un aumento de estructuras de GlcNac de bisección, lo cual da como resultado un aumento en la actividad de ADCC de los anticuerpos (véase también Umana y colaboradores, 1999 Nat. Biotech. 17: 176 - 180).

5.2.4 Métodos para modificación por ingeniería genética de anticuerpos alterados.

Como se discutió anteriormente, los anticuerpos que se enlazan a C5 que tienen las secuencias VH y VL o las secuencias de cadena pesada y ligera de longitud completa mostradas en la presente invención, se pueden utilizar para crear nuevos anticuerpos que se enlazan a C5, mediante la modificación de las secuencias de cadena pesada y/o de cadena ligera de longitud completa, las secuencias VH y/o VL, o la(s) región(es) constante(s) unida(s) a las mismas. Por consiguiente, en otro aspecto de la divulgación, se utilizan las características estructurales de un anticuerpo de la invención que se enlazan a C5 para crear anticuerpos que se enlazan a C5 estructuralmente relacionados que retienen al menos una propiedad funcional de los anticuerpos de la invención, tal como el enlazamiento a la C5 humana, y también la inhibición de una o más propiedades funcionales de C5 (por ejemplo, inhiben la lisis de los glóbulos rojos en un ensayo hemolítico).

Por ejemplo, una o más regiones CDR de los anticuerpos de la presente invención, o mutaciones de las mismas, se pueden combinar de una manera recombinante con las regiones de estructura conocidas y/o con otras CDR, para crear anticuerpos adicionales de la invención que se enlazan a C5 modificados por ingeniería genética en forma recombinante, como se discutió anteriormente. Otros tipos de modificaciones incluyen aquéllas descritas en la sección anterior. El material de partida para el método de modificación por ingeniería genética es una o más de las secuencias VH y/o VL suministradas en la presente invención, o una o más regiones CDR de las mismas. Con el fin de crear el anticuerpo modificado por ingeniería genética, no es necesario preparar realmente (es decir, expresar como una proteína) un anticuerpo que tenga una o más de las secuencias VH y/o VL proporcionadas en la presente invención, o una o más regiones CDR de las mismas. En su lugar, se usa la información contenida en la(s) secuencia(s) como el material de partida para crear secuencia(s) de “segunda generación” derivadas a partir de las secuencia(s) original(es), y luego se prepara(n) la(s) secuencia(s) de “segunda generación” y se expresan como una proteína.

De conformidad con lo anterior, en otro aspecto de la divulgación, la invención proporciona un método para preparar un anticuerpo que se enlaza a C5, el cual consiste de: una secuencia de anticuerpo de región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de CDR1 seleccionada a partir del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 1, 17, 33, 61, 131, 145, 159, 173, 195, y 235, una secuencia de CDR2 seleccionada a partir del grupo que consiste de las SEQ lD NOs: 2, 18, 34, 49, 62, 77, 95, 107,113, 119, 132, 146, 160, 174, 196, 226, y 236, y/o una secuencia de CDR3 seleccionada a partir del grupo que consiste de las SEQ ID NOs:3,19, 35, 63, 133, 147, 161, 175, 197, y 237; y una secuencia de anticuerpo de la región variable de cadena ligera que tiene una secuencia de CDR1 seleccionada a partir del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 4, 20, 36, 64, 134, 148, 162, 176, 198, y 238, una secuencia de CDR2 seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 5, 21,37, 65, 135,149, 163, 177, 199, y 239, y/o una secuencia de CDR3 seleccionada a partir del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 6, 22, 38, 50, 66, 78, 89, 101, 120, 136, 150, 164, 178, 200, 209, y 240; alterando al menos un residuo de aminoácido dentro de la secuencia de anticuerpo de la región variable de cadena pesada y/o dentro de la secuencia de anticuerpo de la región variable de cadena ligera, para crear al menos una secuencia de anticuerpo alterada; y expresar la secuencia de anticuerpo alterada como una proteína.

De conformidad con lo anterior, en otro aspecto, la divulgación proporciona un método para la preparación de un anticuerpo que se enlaza a C5 optimizado para su expresión en una célula de mamífero, que consiste de: una secuencia de anticuerpo de cadena pesada de longitud completa que tiene una secuencia seleccionada a partir del grupo de las SEQ ID NOs: 9, 25, 41, 53, 69, 81, 97, 109, 115, 123, 139, 153, 167, 181, 189, 203, 212, 220, 229, 243, 249, 254, 258, 274, 278, y 282; y una secuencia de anticuerpo de cadena ligera de longitud completa que tiene una secuencia seleccionada a partir del grupo de las SEQ ID NOs: 10, 26, 42, 54, 70, 82, 91, 103, 124, 140, 154, 168, 182, 190, 204, 213, 221, 230, 244, 251, 262, 266, 270, 286, y 290; alterando al menos un residuo de aminoácido dentro de la secuencia de anticuerpo de cadena pesada de longitud completa y/o dentro de la secuencia de anticuerpo de cadena ligera de longitud completa, para crear al menos una secuencia de anticuerpo alterada; y expresar la secuencia de anticuerpo alterada como una proteína.

La secuencia de anticuerpo alterada también se puede preparar mediante la selección de bibliotecas de anticuerpos que tengan secuencias de CDR3 fijas o determinantes de enlazamiento esencial mínimo, como se describen en la solicitud de patente de los Estados Unidos de Norteamérica No. 2005/0255552, y la diversidad sobre las secuencias de CDR1 y CDR2. La selección se puede llevar a cabo de acuerdo con cualquier tecnología de selección apropiada para la selección de anticuerpos a partir de bibliotecas de anticuerpos, tal como la tecnología de despliegue en fagos.

Se pueden emplear técnicas de biología molecular convencionales para preparar y expresar la secuencia de anticuerpo alterada. EI anticuerpo codificado por la(s) secuencia(s) alterada(s) de anticuerpo, es uno que retiene una, algunas, o todas las propiedades funcionales de los anticuerpos que se enlazan a C5 descritos en la presente invención, cuyas propiedades funcionales incluyen, pero no se limitan a, enlazarse específicamente a la C5 humana y/o de cinomólogo; y el anticuerpo inhibe la lisis de los glóbulos rojos en un ensayo hemolítico.

Las propiedades funcionales de los anticuerpos alterados se pueden evaluar empleando ensayos convencionales disponibles en la técnica y/o descritos en la presente invención, tales como los que se exponen en los Ejemplos (por ejemplo, los ELISA).

En ciertos aspectos de los métodos divulgados de los anticuerpos modificados por ingeniería genética de la invención, se pueden introducir mutaciones de una manera aleatoria o selectiva a lo largo de toda o parte de una secuencia de codificación de un anticuerpo que se enlazan a C5, y los anticuerpos resultantes modificados que se enlazan a C5 se pueden seleccionar por actividad de enlazamiento y/ u otras propiedades funcionales, como se describe en la presente invención. Se han descrito métodos de mutación en el arte. Por ejemplo, la publicación del TCP WO 02/092780 de Short, describe métodos para crear y seleccionar mutaciones de anticuerpos utilizando mutagénesis de saturación, ensamble de ligación sintético, o una combinación de los mismos. De una manera alternativa, la publicación del TCP WO 03/074679 de Lazar y colaboradores, describe métodos para la utilización de métodos de selección por ordenador con el fin de optimizar las propiedades fisicoquímicas de los anticuerpos.

5.3 Caracterización de los anticuerpos de la invención.

Los anticuerpos de la invención se pueden caracterizar mediante diferentes ensayos funcionales. Por ejemplo, se pueden caracterizar por su capacidad para inhibir la lisis de los glóbulos rojos en los ensayos hemolíticos, su afinidad con una proteína C5 (por ejemplo, C5 humana y/o de cinomólogo), el enlace del epítopo, su resistencia a la proteólisis, y su capacidad para bloquear la cascada de complemento, por ejemplo, su capacidad para inhibir la formación de CAM.

Se pueden emplear diferentes métodos para medir la presencia de las moléculas de la ruta del complemento y la activación del sistema del complemento (véanse, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos de Norteamérica No. 6.087.120; y Newell y colaboradores, J. Lab. Clin. Med, 100: 437 - 44, 1982). Por ejemplo, la actividad del complemento se puede monitorear mediante: (i) la medición de la inhibición de la lisis de glóbulos rojos (hemólisis) mediada por el complemento; (ii) la medición de la capacidad para inhibir la disociación de C3 ó C5; y (iii) la inhibición de la hemólisis mediada por la ruta alternativa.

Las dos técnicas más comúnmente empleadas son ensayos hemolíticos (véase, por ejemplo, Baatrup y colaboradores, Ann Rheum. Dis., 51: 892 - 7, 1992), y ensayos inmunológicos (véase, por ejemplo, Auda y colaboradores, Rheumatol Int, 10: 185 - 9, 1990). Las técnicas hemolíticas miden la capacidad funcional de la secuencia entera ya sea la ruta clásica o bien la alternativa. Las técnicas inmunológicas miden la concentración de proteína de un componente del complemento específico o de un producto dividido. Otros ensayos que se pueden emplear para detectar la activación del complemento o para medir las actividades de los componentes del complemento en los métodos de la presente invención incluyen, por ejemplo, el ensayo de proliferación de células T (Chain y colaboradores, J. lmmunol Methods, 99: 221 - 8, 1987), y el ensayo de hipersensibilidad de tipo retardado (DTH) (Forstrom y colaboradores, 1983, Nature 303: 627 - 629; Halliday y colaboradores, 1982, en Assessment of Immune Status by the Leukocyte Adherence Inhibition Test, Academic, Nueva York, páginas 1 - 26; Koppi y colaboradores, 1982, Cell. Immunol. 66: 394 - 406; y la patente de los Estados Unidos de Norteamérica No. 5.843.449).

En las técnicas hemolíticas, todos los componentes del complemento deben estar presentes y ser funcionales. Por consiguiente, las técnicas hemolíticas pueden seleccionar tanto la integridad funcional como las deficiencias del sistema del complemento (véanse, por ejemplo, Dijk y colaboradores, J. lmmunol. Methods 36: 29 - 39, 1980; Minh y colaboradores, Clin. Lab. Haematol. 5: 23 – 34, 1983; y Tanaka y colaboradores, J. lmmunol. 86: 161 - 170, 1986). Con el objeto de medir la capacidad funcional de la ruta clásica, se utilizan glóbulos rojos de oveja recubiertos con hemolisina (IgG de conejo para glóbulos rojos de oveja), o glóbulos rojos de pollo que se sensibilizan con anticuerpos anti-pollo de conejo, como células objetivo (células sensibilizadas). Estos complejos de Ag-Ab activan la ruta clásica, y dan como resultado la lisis de las células objetivo cuando los componentes son funcionales y están presentes en una concentración adecuada. Para determinar la capacidad funcional de la ruta alternativa, se usan glóbulos rojos de conejo como células objetivo (véase, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos de Norteamérica No. 6.087.120).

Con el fin de probar la capacidad de un anticuerpo para inhibir la formación de CAM (complejo de ataque de la membrana), se puede llevar a cabo un ensayo de deposición del CAM. Dicho de una manera breve, se puede utilizar zymosan para activar la ruta alternativa, y se puede utilizar lgM para activar la ruta clásica. Los Fab se incuban previamente con suero humano, y se agregan a las placas recubiertas con zymosan o IgM. Se puede calcular el porcentaje de inhibición de deposición del CAM para cada muestra en relación con la línea base (suero humano tratado con EDTA) y con un control positivo (suero humano).

La capacidad de un anticuerpo para enlazarse a C5 se puede detectar marcando el anticuerpo de interés directamente, o el anticuerpo puede no estar marcado, y se detecta el enlace de una manera indirecta, utilizando diferentes formatos de ensayo tipo sándwich conocidos en este campo.

En un aspecto de la divulgación, los anticuerpos de la invención que se enlazan a C5 bloquean o compiten con elenlace de un anticuerpo de referencia que se enlaza a C5 con un polipéptido C5. Éstos pueden ser anticuerpos humanos que se enlazan a C5 descritos anteriormente. También pueden ser otros anticuerpos de ratón, quiméricos,

o humanizados, que se enlazan a C5 que se enlacen al mismo epítopo que el anticuerpo de referencia. La capacidad para bloquear o competir con el enlace del anticuerpo de referencia, indica que un anticuerpo que se enlaza a C5 bajo el ensayo se enlaza al mismo epítopo o un epítopo similar al definido por el anticuerpo de referencia, o a un epítopo que está suficientemente próximo al epítopo enlazado por el anticuerpo de referencia que se enlazan a C5. Estos anticuerpos tienen especialmente probabilidades de compartir las propiedades convenientes identificadas para el anticuerpo de referencia. La capacidad para bloquear o competir con el anticuerpo de referencia se puede determinar, por ejemplo, mediante un ensayo de enlazamiento de competición. Con un ensayo de enlazamiento por competición, el anticuerpo bajo ensayo se examina para determinar su capacidad para inhibir el enlace especifico del anticuerpo de referencia a un antígeno común, tal como un polipéptido C5. Un anticuerpo de prueba compite con el anticuerpo de referencia por el enlace específico al antígeno si un exceso del anticuerpo de prueba inhibe sustancialmente el enlace del anticuerpo de referencia. La inhibición sustancial significa que el anticuerpo de prueba reduce el enlace específico del anticuerpo de referencia usualmente en al menos el 10%, 25%, 50%, 75%, o 90%.

Existen una cantidad de ensayos de enlazamiento por competición conocidos que se pueden utilizar para evaluar la competición de un anticuerpo que se enlaza a C5 con el anticuerpo de referencia que se enlaza a C5, para el enlacecon una proteína C5. Éstos incluyen, por ejemplo, radioinmunoensayo directo o indirecto en fase sólida (RIA), inmunoensayo enzimático directo o indirecto en fase sólida (EIA), ensayo de competición tipo sándwich (véase Stahli y colaboradores, Methods in Enzymology 9: 242 - 253, 1983); EIA de biotina-avidina directo en fase sólida (véase Kirkland y colaboradores, J. Immunol. 137: 3614 - 3619, 1986); ensayo marcado directo en fase sólida, ensayo tipo sándwich marcado directo en fase sólida (véase Harlow & Lane, ver más arriba); RIA marcado directo en fase sólida utilizando una marca de l125 (véase Morel y colaboradores, Molec. Immunol. 25: 7 - 15, 1988); EIA de biotina-avidina directo en fase sólida (Cheung y colaboradores, Virology 176: 546 - 552, 1990); y RIA marcado directo (Moldenhauer y colaboradores, Scand. J. Immunol. 32: 77 - 82, 1990). Típicamente, este ensayo involucra el uso del antígeno purificado enlazado a una superficie sólida o a células que portan a cualquiera de estos, un anticuerpo que se enlaza a C5 de prueba no marcado, y un anticuerpo de referencia marcado. La inhibición competitiva se mide mediante la determinación de la cantidad de marcador enlazada a la superficie sólida o a las células en presencia del anticuerpo de prueba. Usualmente, el anticuerpo de prueba está presente en exceso. Los anticuerpos identificados mediante el ensayo de competición (anticuerpos de competición) incluyen los anticuerpos que se enlacen al mismo epítopo que el anticuerpo de referencia, y los anticuerpos que se enlacen a un epítopo adyacente suficientemente próximo al epítopo enlazado por el anticuerpo de referencia, para que ocurra el impedimento estérico.

Para determinar si los anticuerpos monoclonales seleccionados que se enlazan a C5 se enlazan a epítopos únicos, cada anticuerpo se puede biotinilar utilizando reactivos comercialmente disponibles (por ejemplo, los reactivos de Pierce, Rockford, lL). Se pueden llevar a cabo estudios de competición utilizando anticuerpos monoclonales no marcados y anticuerpos monoclonales biotinilados, utilizando placas ELISA recubiertas con el polipéptido C5. El enlazamiento MAb biotinilado se puede detectar con una sonda de fosfatasa alcalina-estreptavidina. Para determinar el isotipo de un anticuerpo purificado que se enlaza a C5, se pueden llevar a cabo ELISA de isotipo. Por ejemplo, se pueden recubrir pozos de placas de microtitulación con 1 µg/mL de IgG antihumano durante la noche a 4°C. Después del bloqueo con BSA al 1%, las placas se hacen reaccionar con 1 µg/mL o menos del anticuerpo monoclonal que se enlaza a C5, o controles de isotipos purificados, a temperatura ambiente, durante una a dos horas. Luego se pueden hacer reaccionar los pozos ya sea con sondas conjugadas de fosfatasa alcalina específicas de lgM humana o IgGI humana. Luego se desarrollan las placas y se analizan, de tal manera que se puede determinar el isotipo del anticuerpo purificado.

Para demostrar el enlazamiento de los anticuerpos monoclonales que se enlazan a C5 con células vivas que expresan un polipéptido C5, se puede utilizar citometría de flujo. Dicho de una manera breve, las líneas celulares que expresan C5 (cultivadas bajo condiciones de cultivo convencionales) se pueden mezclar con diferentes concentraciones de un anticuerpo que se enlaza a C5 en PBS que contiene BSA al 0.1% y suero de ternera fetal al 10%, y se incuban a 37°C durante 1 hora. Después del lavado, se hacen reaccionar las células con anticuerpo lgG antihumano marcado con fluoresceína bajo las mismas condiciones que el teñido del anticuerpo primario. Las muestras se pueden analizar mediante el instrumento FACScan utilizando las propiedades de dispersión de luz y laterales para confinarla sobre las células individuales. Se puede usar un ensayo alternativo utilizando microscopía de fluorescencia (además, o en vez de) el ensayo de citometría de flujo. Las células se pueden teñir exactamente como se describió anteriormente, y se examinan mediante microscopía de fluorescencia. Este método permite la visualización de las células individuales, pero puede tener una sensibilidad disminuida, dependiendo de la densidad del antígeno.

Los anticuerpos de la invención que se enlazan a C5 se pueden ensayar adicionalmente para determinar su reactividad con un polipéptido de C5 o fragmento antigénico, mediante transferencia Western. Brevemente, se pueden preparar polipéptidos de C5 purificados o proteínas de fusión, o extractos celulares a partir de las células que expresen C5, y se pueden someter a electroforesis en gel de poliacrilamida dodecil sulfato de sodio. Después de la electroforesis, los antígenos separados se transfieren a las membranas de nitrocelulosa, se bloquean con suero de ternera fetal al 10%, y se sondean con los anticuerpos monoclonales que se van a ensayar. EI enlace de lgG humana se puede detectar utilizando una fosfatasa alcalina de IgG antihumana, y se desarrolla con tabletas de sustrato de BCIP/NBT (Sigma Chem Co., St. Louis, MO).

Los ejemplos de los ensayos funcionales también se describen en la sección de Ejemplos que se encuentra más adelante.

5.4 Usos profilácticos y terapéuticos.

La presente invención proporciona anticuerpos de la invención para uso en el tratamiento de una enfermedad o trastorno asociado con mayor complemento. En una realización específica, la presente invención proporciona anticuerpos de la invención para uso en el tratamiento de degeneración macular relacionada con la edad (AMD).

Los anticuerpos de la invención se pueden utilizar, entre otras cosas, para prevenir el progreso de la AMD seca, para la AMD húmeda, para hacer más lento y/o prevenir el progreso de la atrofia geográfica, y para mejorar la pérdida de visión debida al progreso de la AMD seca. También se puede utilizar en combinación con terapias anti-VEGF, para el tratamiento de pacientes con AMD húmeda.

En algunas realizaciones, la presente invención proporciona anticuerpos de la invención para uso en el tratamiento de una enfermedad o trastorno relacionado con el complemento. Los ejemplos de enfermedades o trastornos relacionados con el complemento incluyen: trastornos neurológicos, esclerosis múltiple, embolia, Síndrome de Guillain-Barre, lesión cerebral traumática, enfermedad de Parkinson, trastornos de activación inapropiada o indeseable del complemento, complicaciones de la hemodiálisis, rechazo hiperagudo de un aloinjerto, rechazo de xenoinjerto, toxicidad inducida por interleucina-2 durante la terapia con lL-2, trastornos inflamatorios, inflamación por enfermedades autoinmunes, enfermedad de Crohn, síndrome de insuficiencia respiratoria en adultos, lesión térmica, incluyendo quemaduras o congelación, condiciones de reperfusión post-isquémicas, infarto de miocardio, angioplastia con balón, síndrome posterior a la bomba en la derivación cardiopulmonar o en la derivación renal, hemodiálisis, isquemia renal, reperfusión arterial mesentérica después de reconstrucción aórtica, enfermedad infecciosa o sepsis, trastornos del complejo inmune y enfermedades autoinmunes, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico (SLE), nefritis por SLE, nefritis proliferativa, anemia hemolítica, y miastenia grave. Además, otras enfermedades conocidas relacionadas con el complemento son las enfermedades y trastornos pulmonares tales como disnea, hemoptisis, ARDS, asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), enfisema, embolias e infartos pulmonares, neumonía, enfermedades fibrogénicas por polvos, polvos y minerales inertes (por ejemplo, silicio, polvo de carbón, berilio, y asbestos), fibrosis pulmonar, enfermedades por polvos orgánicos, lesión química (debido a gases y productos químicos irritantes, por ejemplo cloro, fosgeno, dióxido de azufre, sulfuro de hidrógeno, dióxido de nitrógeno, amoniaco, y ácido clorhídrico), lesión por humo, lesión térmica (por ejemplo, quemadura, congelación), asma, alergia, bronco constricción, neumonitis por hipersensibilidad, enfermedades parasitarias, Síndrome de Goodpasture, vasculitis pulmonar, e inflamación asociada con el complejo inmune.

En una realización específica, la presente invención proporciona anticuerpos de la invención para el uso en el tratamiento de una enfermedad o trastorno relacionado con el complemento, en donde dicha enfermedad o trastorno es asma, artritis (por ejemplo, artritis reumatoide), enfermedad cardíaca autoinmune, esclerosis múltiple, enfermedad inflamatoria del intestino, lesiones por isquemia-reperfusión, Síndrome de Barraquer-Simons, hemodiálisis, lupus sistémico, lupus eritematoso, soriasis, esclerosis múltiple, trasplante, enfermedades del sistema nervioso central, tales como enfermedad de Alzheimer y otras condiciones neurodegenerativas, aHUS, glomerulonefritis, penfigoide ampolloso, o MPGN ll.

En una realización específica, la presente invención proporciona un anticuerpo de la presente invención para uso en el tratamiento de la glomerulonefritis. Los síntomas de la glomerulonefritis incluyen, pero no se limitan a, proteinuria; índice reducido de filtración glomerular (GFR); cambios electrolitos del suero, incluyendo azotemia (uremia, nitrógeno ureico excesivo en sangre BUN), y retención de sal, que conducen a retención de agua, dando como resultado hipertensión y edema; hematuria y sedimentos urinarios anormales, incluyendo cilindros de glóbulos rojos; hipoalbuminemia; hiperlipidemia; y lipiduria. En una realización específica, la presente invención proporciona un anticuerpo de la presente invención para usar en el tratamiento de hemoglobinuria nocturna paroxismal (PNH).

En una realización específica, la presente invención proporciona un anticuerpo de la presente invención para uso en la reducción de la disfunción de los sistemas inmunitario y hemostático asociados con la circulación extracorpórea, mediante la administración a un sujeto que requiera del mismo, de una cantidad efectiva de una composición que comprenda un anticuerpo de la presente invención. Los anticuerpos de la presente invención se pueden utilizar en cualquier procedimiento que involucre la circulación de la sangre del paciente desde un vaso sanguíneo del paciente, a través de un conducto, y retornar al vaso sanguíneo del paciente, teniendo el conducto una superficie Iuminal que comprende un material capaz de provocar al menos una entre una activación del complemento, activación plaquetaria, activación de los leucocitos, o adhesión de leucocitos - plaquetas. Tales procedimientos incluyen, pero no se limitan a, todas las formas de ECC, así como los procedimientos que involucran la introducción de un órgano, tejido, o vaso artificial o extraño en el torrente sanguíneo de un paciente.

Los sujetos que se van a tratar con agentes terapéuticos de la presente invención también se les puede administrar otros agentes terapéuticos con métodos conocidos de condiciones de tratamiento asociadas con degeneración macular, tales como tratamientos con antibióticos, como se describe en la patente de los Estados Unidos de Norteamérica No. 6.218.368. En otros tratamientos, los agentes inmunosupresores, tales como la ciclosporina, son agentes capaces de suprimir las respuestas inmunes. Estos agentes incluyen fármacos citotóxicos, corticosteroides, fármacos antiinflamatorios no esteroideos (NSAID), inmunosupresores de linfocitos T específicos, y anticuerpos o fragmentos de los mismos (véase el Physicians Desk Reference, 53ª Edición, Medical Economics Company Inc., Montvale, N. J. (1999)). EI tratamiento inmunosupresor típicamente se continúa a intervalos durante un periodo de una semana, un mes, tres meses, seis meses, o un año. En algunos pacientes, el tratamiento se administra hasta por el resto de la vida del paciente.

Cuando los agentes terapéuticos de la presente invención se administran junto con otro agente, los dos pueden ser administrados secuencialmente en cualquier orden, o de una manera simultánea. En algunos aspectos, un anticuerpo de la presente invención se administra a un sujeto que también esté recibiendo terapia con un segundo agente (por ejemplo, verteporfina). En otros aspectos, la molécula de enlazamiento se administra en conjunto con tratamientos quirúrgicos.

Los agentes adecuados para el tratamiento de combinación con los anticuerpos que se enlazan a C5 incluyen agentes conocidos en la técnica que sean capaces de modular las actividades de los componentes de complemento (véase, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos de Norteamérica No. 5,808.109). Se ha reportado que otros agentes disminuyen la actividad mediada por el complemento. Estos agentes incluyen: aminoácidos (Takada, Y. y colaboradores, lmmunology 1978, 34, 509); ésteres de fosfonato (Becker, L. Biochem. Biophy. Acta 1967, 147, 289); sustancias polianiónicas (Conrow, R. B. y colaboradores, J. Med. Chem. 1980, 23, 242); fluoruros de sulfonilo (Hansch, C.; Yoshimoto, M. J. Med. Chem. 1974, 17, 1160, y las referencias citadas allí); polinucleótidos (DeCIercq,

P. F. y colaboradores, Biochem. Biophysl. Res. Commun. 1975, 67, 255); ácidos pimaricos (Glovsky, M. M. y colaboradores, J. Immunol. 1969, 102, 1); porfinas (Lapidus, M. Y Tomasco, JI. Immunopharmacol: 1981, 3, 137); varios antiinflamatorios (Burge, J. J. y colaboradores, J. Immunol. 1978, 120, 1625); fenoles (Muller-Eberhard, Ht J. 1978, en Molecular Basis of Biological Degradative Processes, Berlin, R. D. y colaboradores, Editores, Academic Press, Nueva York, página 65); y benzamidinas (Vogt, W. y colaboradores, Immunology 1979, 36, 138). Algunos de estos agentes funcionan mediante inhibición general de proteasas y esterasas. Otros no son específicos para ninguna etapa intermedio particular en la ruta del complemento, pero en vez de eso inhiben más de un paso de la activación del complemento. Los ejemplos de los últimos compuestos incluyen las benzamidinas, que bloquean la utilización de C1, C4, y C5 (véase, por ejemplo, Vogt y colaboradores, Immunol. 1979, 36, 138).

Los agentes adicionales conocidos en el arte que pueden inhibir la actividad de los componentes de complemento incluyen K-76, un metabolito fúngico de Stachybotrys (Corey y colaboradores, J. Amer. Chem. Soc. 104: 5551, 1982). Se ha demostrado que tanto K-76 como K-76 COOH, inhiben al complemento principalmente en la etapa C5 (Hong y colaboradores, J. lmmunol. 122: 2418, 1979; Miyazaki y colaboradores, Microbiol. Immunol. 24: 1091, 1980), y prevenir la generación de un factor quimiotáctico a partir del complemento humano normal (Bumpers y colaboradores, Lab. Clinc. Med. 102: 421, 1983). Con altas concentraciones de K-76 o de K-76 COOH, se exhibe alguna inhibición de las reacciones de C2, C3, C6, C7, y C9 con sus respectivos intermediarios precedentes. También se ha reportado que K-76 o K-7é COOH inhiben el sistema inactivador de C3b del complemento (Hong y colaboradores, J. lmmunol. 127: 104 - 108, 1981). Otros agentes adecuados para la realización de los métodos de la presente invención incluyen griseofulvina (Weinberg, en Principles of Medicinal Chemistry, Segunda Edición, Foye,

W. 0., Editores, Lea & Febiger, Filadelfia, Pa., página 813, 1981), isopanarina (Djura y colaboradores, Aust. J. Chem.

36: 1057, 1983), y metabolitos del fago de Siphonodictyon coralli (Sullivan y colaboradores, Tetrahedron 37: 979, 1981).

Un régimen de terapia de combinación puede ser aditivo, o puede producir resultados sinérgicos (por ejemplo, reducciones en la actividad de la ruta del complemento más de las esperadas para el uso combinado de los dos agentes). En algunas realizaciones, la presente invención proporciona una terapia de combinación para prevenir y/o tratar AMD, u otra enfermedad relacionada con el complemento, como se describió anteriormente, con un anticuerpo de la invención que se enlaza a C5, y un agente antiangiogénico, tal como un agente anti-VEGF.

5.5 Usos de diagnóstico.

En un aspecto, la divulgación abarca ensayos diagnósticos para determinar la expresión de la proteína C5 y/o del ácido nucleico, así como la función de la proteína C5, en el contexto de una muestra biológica (por ejemplo, sangre, suero, células, tejido), o a partir de un individuo que esté afectado con una enfermedad o trastorno, o que esté en riesgo de desarrollar un trastorno asociado con AMD.

Los ensayos de diagnóstico, tales como los ensayos competitivos, se apoyan en la capacidad de un análogo marcado (el “trazador”) para competir con el analito de la muestra de ensayo, para un número limitado de sitios de enlazamiento, sobre un compañero de enlazamiento común. El compañero de enlazamiento generalmente está insolubilizado antes o después de la competición, y luego el trazador y el analito se enlazados al compañero de enlazamiento, se separan del trazador y el analito no enlazados. Esta separación se logra por decantación (en donde el compañero de enlazamiento fue previamente insolubilizado), o mediante centrifugación (en donde se precipitó el compañero de enlazamiento después de la reacción competitiva). La cantidad del analito de la muestra de prueba es inversamente proporcional a la cantidad de trazador enlazado, como se mide mediante la cantidad de sustancia marcadora. Se preparan curvas de respuesta a la dosis con cantidades conocidas del analito, y se comparan con los resultados de la prueba, con el objeto de determinar cuantitativamente la cantidad de analito presente en la muestra de prueba. Estos ensayos se denominan sistemas ELISA, cuando se utilizan enzimas como los marcadores detectables. En un ensayo de esta forma, el enlace competitivo entre los anticuerpos y los anticuerpos que se enlazan a C5 da como resultado la proteína C5 enlazada, de preferencia los epítopos C5 de la invención, que es una medida de los anticuerpos en la muestra de suero, más particularmente los anticuerpos de neutralización en la muestra de suero.

Una ventaja significativa del ensayo, es que se hace la medición de los anticuerpos de neutralización directamente (es decir, aquéllos que interfieren con el enlace de la proteína C5, específicamente los epítopos). Este ensayo, en particular en la forma de una prueba ELISA, tiene aplicaciones considerables en el medio ambiente clínico, y en la selección rutinaria de sangre.

Las técnicas inmunológicas emplean anticuerpos policlonales o monoclonales contra los diferentes epítopos de los distintos componentes del complemento (por ejemplo, C3, C4, C5), para detectar, por ejemplo, los productos divididos de los componentes del complemento (véanse, por ejemplo, Hugli y colaboradores, lmmunoassays Clinical Laboratory Techniques 443 - 460, 1980; Gorski y colaboradores, J. Immunol. Meth. 47: 61 - 73, 1981; Linder y colaboradores, J. Immunol. Meth. 47: 49 - 59, 1981; y Burger y colaboradores, J. Immunol. 141: 553 - 558, 1988). El enlazamiento del anticuerpo con el producto dividido en competencia con una concentración conocida del producto dividido marcado podría ser luego medido. Se encuentran disponibles diferentes ensayos, tales como radioinmunoensayos, ELISA, y ensayos de difusión radial, para detectar los productos divididos del complemento.

Las técnicas inmunológicas proporcionan una alta sensibilidad para detectar la activación del complemento, debido a que permiten hacer la medición de la formación del producto dividido en la sangre a partir de un sujeto de prueba y de los sujetos de control con o sin trastornos relacionados con la degeneración macular. De conformidad con lo anterior, en algunos métodos de la presente invención, se obtiene el diagnóstico de un trastorno asociado con los trastornos oculares mediante la medición de la activación anormal del complemento a través de la cuantificación de los productos divididos solubles de los componentes del complemento en plasma sanguíneo de un sujeto de prueba. Las mediciones se pueden llevar a cabo como se describe, por ejemplo, en Chenoweth y colaboradores, N. Engl. J. Med. 304: 497 - 502, 1981; y Bhakdi colaboradores, Biochim Biophys Acta 737: 343 - 372, 1983. Preferiblemente, solamente se mide la activación del complemento formada in vivo. Esto se puede llevar a cabo mediante la recolección de una muestra biológica del sujeto (por ejemplo, suero) en un medio que contenga los inhibidores del sistema del complemento, y posteriormente se mide la activación del complemento (por ejemplo, cuantificación de los productos divididos) en la muestra.

En el diagnóstico clínico o el monitoreo de los pacientes con trastornos asociados con las enfermedades o trastornos oculares, la detección de las proteínas del complemento, en comparación con los niveles en una muestra biológica correspondiente de un sujeto normal, indica un paciente con trastornos asociados con degeneración macular.

El diagnóstico o formación de imágenes in vivo se describe en la solicitud de patente de los Estados Unidos de Norteamérica No. 2006/0067935. En resumen, estos métodos comprenden en general la administración o la introducción a un paciente, de una cantidad diagnósticamente efectiva de una molécula que se enlaza a C5 que está unida operativamente a un marcador o marca que sea detectable mediante métodos no invasivos. Se permite que el conjugado de anticuerpo-marcador tenga suficiente tiempo para localizar y enlazarse a las proteínas del complemento dentro del ojo. Luego se expone al paciente a un dispositivo de detección para identificar el marcador detectable, formando de esta manera una imagen de la localización de las moléculas que se enlazan a C5 en el ojo de un paciente. La presencia del anticuerpo que se enlaza a C5 o de un fragmento del mismo que se enlaza al antígeno, se detecta mediante la determinación de si un marcador del anticuerpo se enlaza a un componente del ojo. La detección de un mayor nivel de proteínas seleccionadas del complemento, o de una combinación de proteína en comparación con un individuo normal sin enfermedad AMD, es indicativa de una predisposición para, y/o del inicio de trastornos asociados con la degeneración macular. Estos aspectos de la invención también son preferidos para uso en los métodos de formación de imágenes del ojo, y en los métodos de diagnóstico y tratamiento angiogénicos combinados.

La divulgación también se relaciona con el campo de la medicina predictiva, en la cual se utilizan ensayos diagnósticos, ensayos de pronóstico, farmacogenómicos, y ensayos clínicos de monitoreo, para propósitos de pronóstico (predictivos), para tratar por lo tanto a un individuo de forma profiláctica.

En un aspecto de la divulgación, se proporciona un ensayo de pronóstico (o predictivo) para determinar si un individuo está en riesgo de desarrollar un trastorno asociado con mala regulación de la actividad de la ruta del complemento. Por ejemplo, las mutaciones en un gen para C5 se pueden evaluar en una muestra biológica. Tales ensayos se pueden utilizar para propósitos de pronóstico o predictivos, con el fin de tratar de esta manera profilácticamente a un individuo antes del inicio de un trastorno caracterizado por, o asociado con, la expresión o actividad del ácido nucleico para la proteína C5.

En otro aspecto de la divulgación proporciona métodos para determinar la expresión del ácido nucleico para C5 o de la actividad de la proteína C5 en un individuo, para seleccionar de esta manera los agentes terapéuticos o profilácticos apropiados para ese individuo (denominado aquí ‘como “farmacogenómica”). Los farmacogenómicos permite la selección de agentes (por ejemplo, fármacos) para el tratamiento terapéutico o profiláctico de un individuo, con base en el genotipo del individuo (por ejemplo, el genotipo del individuo examinado para determinar la capacidad del individuo para responder a un agente particular).

Aún otro aspecto de la divulgación se refiere al monitoreo de la influencia de los agentes (por ejemplo, fármacos) sobre la expresión o actividad de la proteína C5 en ensayos clínicos.

5.6 composiciones farmacéuticas.

La invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden los anticuerpos que se enlazan a C5 (intactos o fragmentos de enlazamiento) formulados junto con un portador farmacéuticamente aceptable. Las composiciones pueden contener adicionalmente uno o más de otros agentes terapéuticos que sean adecuados para el tratamiento o la prevención de una enfermedad asociada con el complemento (por ejemplo, AMD). Los portadores farmacéuticos mejoran o estabilizan la composición, o facilitan la preparación de la composición. Los portadores farmacéuticamente aceptables incluyen solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de absorción, y similares, que sean fisiológicamente compatibles.

Una composición farmacéutica de la presente invención se puede administrar mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica. La ruta y/o el modo de administración varían dependiendo de los resultados deseados. Se prefiere que la administración sea intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, o subcutánea, o administrada próxima al sitio objetivo. En una realización específica, los anticuerpos de la invención se formulan de tal manera que puedan administrarse en forma intravítrea en el ojo. El portador farmacéuticamente aceptable debe ser adecuado para administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, parenteral, espinal, o epidérmica (por ejemplo, mediante inyección o infusión). Dependiendo de la ruta de administración, se puede recubrir el compuesto activo, es decir, el anticuerpo, la molécula biespecífica y multiespecífica, en un material para proteger al compuesto de la acción de ácidos y de otras condiciones naturales que puedan inactivar al compuesto.

La composición debe ser estéril y fluida. El fluido apropiado, se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento, tal como Iecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de una dispersión, y mediante el uso de tensoactivos. En muchos casos, es preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes, tales como manitol o sorbitol, y cloruro de sodio, en la composición. La absorción a largo plazo de las composiciones inyectables se puede lograr mediante la inclusión en la composición de un agente que retarde la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio o gelatina.

Las composiciones farmacéuticas de la invención se pueden preparar de acuerdo con métodos bien conocidos y

rutinariamente practicados en el arte. Véanse, por ejemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing Co., 20a Edición, 2000; y Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, Editor, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1978. Las composiciones farmacéuticas se fabrican preferiblemente bajo las condiciones de BPM (buenas prácticas de manufactura). Típicamente, se emplea una dosis terapéuticamente efectiva o una dosis eficaz del anticuerpo que se enlaza a C5 en las composiciones farmacéuticas de la invención. Los anticuerpos que se enlazan a C5 se formulan en formas de dosificación farmacéuticamente aceptables mediante los métodos convencionales conocidos por los expertos en este campo. Los regímenes de dosificación se ajustan para proporcionar la respuesta óptima deseada (por ejemplo, una respuesta terapéutica). Por ejemplo, se puede administrar un solo bolo, se pueden administrar varias dosis divididas a través del tiempo, o se puede reducir o aumentar proporcionalmente la dosis, de acuerdo a las exigencias de la situación terapéutica. Es especialmente conveniente formular composiciones parenterales en forma unitaria de dosificación por facilidad de administración y uniformidad de la dosis. La forma unitaria de dosificación, como se utiliza en la presente invención, se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosis unitarias para los sujetos que se van a ser tratados; cada unidad contiene una cantidad previamente determinada del compuesto activo, calculada para producir el efecto terapéutico deseado, junto con el portador farmacéutico requerido.

Los niveles de dosificación reales de los ingredientes activos en las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden variar para obtener una cantidad del ingrediente activo que sea efectiva para lograr la respuesta terapéutica deseada para un paciente, composición, y modo de administración particular, sin que sea tóxica para el paciente. El nivel de dosificación seleccionado depende de una variedad de factores farmacocinéticos, incluyendo la actividad de las composiciones particulares de la presente invención empleadas, o del éster, la sal, o la amida de las mismas, de la vía de administración, del tiempo de administración, de la velocidad de excreción del compuesto particular empleado, de la duración del tratamiento, de otros fármacos, compuestos y/o materiales utilizados en combinación con las composiciones particulares empleadas, de la edad, el sexo, peso, condición, estado general de salud e historia médica previa del paciente que va a ser tratado, y factores similares.

Un médico o veterinario puede iniciar con dosis de los anticuerpos de la invención empleados en la composición farmacéutica en niveles inferiores a aquellos requeridos para lograr el efecto terapéutico deseado, e incrementar gradualmente la dosis hasta que se logre el efecto deseado. En general, las dosis efectivas de las composiciones de la presente invención, para el tratamiento de un trastorno inflamatorio alérgico descrito aquí, varían dependiendo de muchos factores diferentes, incluyendo el medio de administración, el sitio objetivo, el estado fisiológico del paciente, si el paciente es un ser humano o un animal, de otros medicamentos administrados, y si el tratamiento es profiláctico

o terapéutico. Las dosis de tratamiento requieren ser tituladas para optimizar la seguridad y la eficacia. Para la administración sistémica con un anticuerpo, los intervalos de dosificación van desde aproximadamente 0.0001 hasta 100 mg/Kg, y más usualmente de 0.01 a 15 mg/Kg del peso corporal del huésped. Un ejemplo de régimen de tratamiento implica la administración sistémica una vez cada dos semanas, o una vez al mes, o una vez cada tres a seis meses. Para la administración intravítrea con un anticuerpo, la dosificación está en el intervalo de aproximadamente 0,0001 hasta aproximadamente 10 mg. Un ejemplo de un régimen de tratamiento implica la administración sistémica una vez cada dos semanas, o una vez al mes, o una vez cada 3 a 6 meses.

EI anticuerpo normalmente se administra en múltiples ocasiones. Los intervalos entre las dosificaciones individuales pueden ser semanales, mensuales, o anuales. Los intervalos también pueden ser irregulares, como sea indicado por la medición de los niveles en sangre del anticuerpo que se enlaza a C5 en el paciente. En algunos métodos de administración sistémica, la dosificación se ajusta para alcanzar una concentración del anticuerpo en plasma de 1 hasta 1.000 µg/mL, y en algunos métodos de 25 - 500 µg/mL. De una manera alternativa, el anticuerpo se puede administrar como una formulación de liberación sostenida, en cuyo caso, se requiere una administración menos frecuente. La dosificación y la frecuencia varían dependiendo de la vida media del anticuerpo en el paciente. En general, los anticuerpos humanizados muestran una vida media más larga que aquélla de los anticuerpos quiméricos y de los anticuerpos no humanos. La dosificación y frecuencia de administración pueden variar dependiendo de si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. En las aplicaciones profilácticas, se administra una dosificación relativamente baja a intervalos relativamente infrecuentes durante un largo período de tiempo. Algunos pacientes continúan recibiendo el tratamiento por el resto de sus vidas. En las aplicaciones terapéuticas, algunas veces se requiere una dosificación relativamente alta a intervalos relativamente cortos hasta que se reduzca o termine el progreso de la enfermedad, y de preferencia hasta que el paciente muestre un alivio parcial o completo de los síntomas de la enfermedad. Posteriormente, se puede administrar al paciente un régimen profiláctico.

6. Ejemplos

Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar adicionalmente la invención, pero no para limitar su alcance.

Ejemplo 1: Generación de C5 de cinomólogo y de C5 humana.

1.: Generación de C5 de cinomólogo.

Se purificó C5 de cinomólogo exitosamente a partir de suero de cinomólogo por medio de cromatografía de afinidad, utilizando la IgG1 hu MOR07086. Se analizó la calidad de C5 de cinomólogo mediante SDS-PAGE, transferencia tipo Western, espectrometría de masas, y ensayos hemolíticos. Se demostró mediante SDS-PAGE y transferencia tipo Western la alta calidad de la C5 de cinomólogo purificada. La falta de contaminación con C3 se confirmó mediante SDS y transferencia tipo Western. Además, se determinó la identidad de la secuencia de C5 de cinomólogo mediante el análisis espectrométrico de masas, y se probó la actividad de C5 de cinomólogo purificada en ensayos hemolíticos. En los ensayos hemolíticos, la nueva preparación fue equipotente con la C5 humana (por ejemplo, la muestra 6, que se utilizó en paneos de maduración de afinidad, reconstituyó la actividad del complemento del suero agotado en C5 humana al 20% con actividad similar a la C5 humana purificada).

2.: Control de calidad de las proteínas C5 biotiniladas y no biotiniladas humanas y de cinomólogo.

Se caracterizó la bioactividad de C5 humana purificada, y se confirmó mediante la actividad hemolítica de la ruta alternativa. Se esparció C5 en suero humano agotado en C5 a diferentes concentraciones para obtener una EC50. Los valores EC50 en el intervalo entre 0,02 y 0,1 nM se consideraron aceptables.

Antes de utilizarse, se probó la bioactividad de cada lote de proteína C5 humana purificada en el ensayo hemolítico. Se hizo el mismo control de calidad para la C5 de cinomólogo después de la purificación a partir de suero de cinomólogo. Después de la biotinilación de C5 humana y de cinomólogo, también se probó la bioactividad del material en ensayos hemolíticos, con el objeto de analizar si había una pérdida de actividad causada por la biotinilación.

Ejemplo 2. Generación de anticuerpos específicos de C5 a partir de la biblioteca HuCAL GOLD®.

Se generaron anticuerpos de C5 mediante la selección de los clones que tuvieran altas afinidades de enlazamiento, utilizando como la fuente de las proteínas variantes de anticuerpo, una biblioteca de despliegue en fagos comercialmente disponible, la biblioteca MorphoSys HuCAL GOLD®.

La biblioteca HuCAL GOLD® es una biblioteca de Fab (Knappik y colaboradores, 2000), en la cual todas las seis CDR se diversifican mediante mutaciones apropiadas, y las cuales emplean la tecnología CysDispIayMR para el enlazamiento de Fab a la superficie del fago (Publicación Internacional WO 01/05950, Löhning y colaboradores, 2001).

1. Selección mediante paneo de anticuerpos específicos de C5 a partir de la biblioteca.

Para la selección de anticuerpos contra C5, se emplearon dos estrategias diferentes de paneo. Las seis diferentes combinaciones fueron sometidas individualmente a tres rondas de: (a) un paneo en fase sólida, donde los antígenos (C5 humana y de cinomólogo) fueron directamente recubiertos sobre placas de microtitulación de 96 pozos Maxisorp (Nunc, Wiesbaden, Alemania); o (b) un paneo en solución con la C5 humana y de cinomólogo biotinilada, donde el complejo de fago-antígeno fue capturado por perlas magnéticas de estreptavidina (Dynabeads M-280; Dynal) para cada combinación de paneo.

La biblioteca HuCAL GOLD® se amplificó en un medio 2xYT que contenía 34 µg/mL de cloranfenicol y glucosa al 1% (2xYT-CG). Después de la infección con el fago auxiliar VCSM13 a una DO600nm de 0.5 (30 minutos a 37°C sin agitación; 30 minutos a 37°C con agitación a 250 rpm), se centrifugaron las células (4.120 gramos; 5 minutos; 4°C), se resuspendieron en 2xYT/34 µg/mL de cloranfenicol/50 µg/mL de kanamicina/IPTG 0.25 mM, y se cultivaron durante la noche a 22°C. Los fagos se precipitaron en PEG a partir del sobrenadante, se resuspendieron en PBS /glicerol al 20%, y se almacenaron a -80°C. La amplificación del fago entre dos rondas de paneo se realizó de la siguiente manera: las células TG1 de E. coli en fase mid-log se infectaron con el fago eluido, y se sembraron en placa sobre agar LB complementado con 1% de glucosa y 34 µg/mL de cloranfenicol (placas LB-CG). Después de incubación durante la noche a 30°C, se rasparon las colonias de TG1 de las placas de agar, y se utilizaron para inocular 2xYT-CG hasta que se alcanzó una DO600nm de 0,5. Se agregaron fagos auxiliares VCSM13 para la infección, como se describió anteriormente.

Se secuenciaron los 354 clones derivados de todas las estrategias de paneo, dando como resultado 64 clones únicos con el perfil deseado: que se enlazan con la C5 humana y de cinomólogo y que no se enlazan con los contra-objetivos C3 y C4.

Se seleccionaron 45 clones derivados de los paneos en fase sólida; y 19 clones de los paneos en solución, para la expresión y purificación de la proteína. Cuatro Fab a partir de los paneos en fase sólida (MOR06525, MOR06756, MOR06757 y MOR06763) y 6 Fab de los paneos en solución (MOR07086, MOR07087, MOR07091, MOR07092, MOR07093 y MOR07094) entraron a la maduración de afinidad.

Paneo en fase sólida contra C5 sobre la proteína directamente recubierta

La primera variante de paneo fue el paneo en fase sólida alternando la C5 humana (primera y tercera ronda de selección) y la C5 de cinomólogo (segunda ronda de selección).

Tres pozos de una placa Maxisorp (F96 Nunc-lmmunoplate) se recubrieron con 200 µl de C5 50 nM cada uno durante la noche a 4°C. Los pozos recubiertos se lavaron dos veces con 400 µl de PBS, y se bloquearon con 350 µl de MPBS al 5% durante 2 horas a temperatura ambiente sobre un agitador de placas de microtitulación. Para cada paneo, se bloquearon aproximadamente 1013 anticuerpos de fago HuCAL GOLD® con un volumen igual de PBST/5% de leche en polvo durante 2 horas a temperatura ambiente. Los pozos recubiertos se lavaron dos veces con 400 µl de PBS después del procedimiento de bloqueo. Se agregaron 200 µl de anticuerpos de fago HuCAL GOLD® previamente bloqueados, a cada pozo recubierto, y se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente en un agitador. Se llevó a cabo el lavado mediante la adición de cinco veces 350 µl PBS /Tween al 0.05%, seguido por el lavado otras cinco veces con PBS. Para algunas condiciones de paneo, se aplicó un procedimiento de lavado más riguroso.

La elución del fago de la placa se llevó a cabo con 200 µl de DTT 20 mM en Tris/HCI 10 mM, pH 8, por pozo durante 10 minutos. El eluato de fago con DTT se añadió a 15 ml de TG1 de E. coli, que se cultivó hasta una DO600nm 0,6 -0,8 a 37°C en un medio 2YT, y se incubó en tubos plásticos de 50 ml durante 45 minutos a 37°C sin agitación para la infección del fago. Después de la centrifugación durante 5 minutos a 4,120 x g, se resuspendió cada uno de los precipitados bacterianas en 600 µl del medio 2xYT, se sembró en placas de agar 3xYT-CG, y se incubó durante la noche a 37°C. Las colonias se rasparon de las placas, y se rescataron los fagos y se amplificaron como se describió anteriormente.

Las segunda y terca rondas de paneo en fase sólida se llevaron a cabo de acuerdo con el protocolo de la primera ronda. En la segunda ronda de selección para algunas condiciones de paneo, se utilizó la producción de la primera ronda para selecciones sobre C5 de cinomólogo, con el fin de enriquecer los anticuerpos de reacción cruzada de cinomólogo.

Para algunas condiciones de paneo, se incrementó la rigurosidad de lavado, y se disminuyó la concentración de antígeno en la tercera ronda de selección, con el fin de generar anticuerpos de alta afinidad.

Se utilizó la biblioteca de fagémidos HuCAL GOLD® para seleccionar fragmentos de anticuerpos Fab específicos contra C5 humana. La primera estrategia fue un paneo en fase sólida sobre la proteína C5 humana recubierta directamente (procedimiento de paneo descrito anteriormente).

Después de la tercera ronda de paneo, las combinaciones enriquecidas de fagos se subclonaron a partir del vector de la biblioteca pMORPH®23 (permitiendo un despliegue eficiente del anticuerpo sobre la superficie del fago) en el vector de expresión pMORPH®x9_Fab_MH, que media la expresión periplasmática de los Fab solubles. Se recogieron los clones individuales, y se expresaron los Fab solubles a partir de estos clones individuales.

En total, se analizaron 6.624 clones en la selección primaria, que se realizó mediante el enlazamiento de los Fab directamente a partir de los lisados bacterianos hasta C5 humana inmovilizada sobre placas de microtitulación Maxisorp. Se obtuvieron 1.660 aciertos a partir de la selección primaria sobre C5 humana, con señales 5 veces mayores sobre el fondo. Además se analizaron 384 aciertos en una selección secundaria para confirmar el enlazamiento sobre C5 humana, y para seleccionar el enlazamiento a los contra objetivos C3 y C4 humanas.

Se pudieron confirmar muchos aciertos primarios sobre C5 humana, y no mostraron reactividad cruzada con C3 y C4 humanas, sino solamente seis Fab tuvieron una débil reactividad cruzada con C5 de cinomólogo.

Como una primera consecuencia, se llevaron a cabo nuevos paneos en fase sólida, alternando sobre C5 humana y de cinomólogo. En paralelo, los controles de calidad del lote C5 de cinomólogo purificado revelaron una alta cantidad de C3 de cinomólogo dentro del lote de C5 de cinomólogo. Considerando estos resultados, se aplicó un nuevo método para seleccionar los anticuerpos que reaccionan en forma cruzada de cinomólogo. Se capturó C5 de cinomólogo a partir de suero de cinomólogo, utilizando un anticuerpo policlonal que se enlaza a C5 (véase el Ejemplo 3, sección 3). Empleando este método, se seleccionaron nuevamente los aciertos primarios iniciales sobre C5 de cinomólogo, y se confirmaron 56 clones para el enlace con C5 de cinomólogo.

Para los paneos alternantes en fase sólida, se utilizó producción de la primera ronda de los doce paneos en fase sólida humanos de más éxito, para las selecciones sobre C5 de cinomólogo (lote de proteína contaminado con C3 de cinomólogo; no conocida durante los paneos). Se confirmaron 376 clones en una selección secundaria para el enlazamiento con C5 humana, y 365 clones para el enlazamiento con C5 de cinomólogo capturada a partir del suero de cinomólogo.

Paneo en solución sobre la proteína C5 biotinilada

La segunda variante de paneo fue un paneo en solución contra C5 humana biotinilada biológicamente activa (en ensayos hemolíticos) y C5 de cinomólogo biotinilada.

Para este paneo, se lavaron 200 µl de perlas magnéticas de estreptavidina (Dynabeads M-280; Dynal) una vez con PBS, y se bloquearon con Chemiblocker durante 2 horas a temperatura ambiente. Se bloquearon 300 µl de los fagos diluidos PBS, también con Chemiblocker, durante 1 a 2 horas a temperatura ambiente sobre un rotador. Los fagos bloqueados se adsorbieron previamente dos veces contra 50 µl de perlas magnéticas de estreptavidina durante 30 minutos. El sobrenadante de fago se transfirió a un nuevo tubo de reacción de 2 ml bloqueado, y se agregó C5 humana biotinilada, y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente sobre un rotador. Se agregaron 100 µl de perlas magnéticas de estreptavidina bloqueadas a cada combinación de paneo, y se incubaron durante 10 minutos sobre un rotador. Las perlas se recolectaron con un separador de partículas (Dynal MPC-E) durante aproximadamente 2,5 minutos, y se removió cuidadosamente la solución.

Luego se lavaron las perlas siete veces PBS/Tween al 0,05%, utilizando un rotador, seguido por lavado otras tres veces con PBS. La elución del fago a partir de las Dynabeads se llevó a cabo mediante la adición de 200 µl de DTT 20 mM en Tris/HCI 10 mM, pH 8, para cada tubo, e incubación durante 10 minutos. Las Dynabeads se removieron mediante el separador de partículas magnéticas, y se agregó el sobrenadante a 15 ml de un cultivo TG-1 de E. coli que se desarrolló hasta una DO600nm de 0,6 a 0,8. Se lavaron luego las perlas una vez con 200 µl PBS, y junto con fagos adicionalmente removidos, se agregó PBS a 15 ml de cultivo TG-1 de E. coli. Para la infección del fago, se incubó el cultivo en tubos de plástico de 50 ml durante 45 minutos a 37°C sin agitación. Después de centrifugación durante 5 minutos a 4.120 x g, los precipitados bacterianos se volvieron a suspender cada uno en 600 µl de medio 2xYT, se sembraron sobre placas de agar 3xYT-CG, y se incubaron durante la noche a 37°C. Las colonias se rasparon de las placas, y los fagos se rescataron y se amplificaron como se describió anteriormente. Las segunda y tercera rondas de selección se llevaron a cabo de una manera idéntica a la primera ronda de selección.

Una estrategia adicional de paneo fue el paneo en solución utilizando C5 humana, y alternando la C5 humana y de cinomólogo (lote de proteína contaminado con C3 de cinomólogo; no conocido durante los paneos). Por consiguiente, se biotinilaron las proteínas, y se confirmó la biofuncionalidad retenida después del procedimiento de biotinilación en los bioensayos hemolíticos.

El complejo de fago-antígeno se capturó sobre perlas magnéticas de estreptavidina por medio de la fracción de biotina del antígeno. Después del lavado, solamente se eluyeron los fagos específicos enlazados (procedimiento de paneo descrito anteriormente).

La primer selección se hizo sobre las proteínas directamente recubiertas (véase el Ejemplo 3, sección 1), y solamente se pudieron confirmar 80 clones sobre C5 humana. Debido al hecho de que durante los paneos, el antígeno se mantuvo en solución, se desarrolló un nuevo método de selección. En un ELISA en solución, se incubaron los Fab con el antígeno biotinilado sobre una placa NeutrAvidin. Utilizando este procedimiento de selección en solución, se pudo seleccionar una cantidad significativamente más alta de clones específicos de C5 humana y de cinomólogo. Estos resultados confirmaron que muchos Fab derivados a partir de los paneos en solución reconocen únicamente C5 en solución, o cuando se capturan (por ejemplo, por medio de un anticuerpo policlonal que se enlaza a C5).

2. Subclonación y expresión de fragmentos Fab seleccionados.

Para facilitar la expresión rápida de los Fab solubles, se subclonaron los insertos que codificaban Fab de los fagos HuCAL GOLD® seleccionados, a través de Xbal y EcoRl en el vector de expresión de E. coli pMORPH®x9_MH. Los fragmentos Fab portan una etiqueta Myc en el terminal C, y como segunda etiqueta en el terminal C, la etiqueta 6xHis (Chen y colaboradores, Gene 139: 73 - 75 (1994)). Después de la transformación de los plásmidos de expresión en células TG1F de E. coli, se recogieron los clones individuales resistentes al cloranfenicol en los pozos de una placa de microtitulación estéril de 384 pozos previamente llenados con 60 µl del medio 2xYT-CG, y se cultivaron durante la noche a 30°C. Se transfirieron 5 µl de cada cultivo de TG-1 de E. coli durante la noche a una placa de microtitulación nueva estéril de 96 pozos previamente llenada con 40 µl de medio 2xYT complementado con 34 µg/ml de cloranfenicol por pozo. Las placas de microtitulación se incubaron a 30°C, agitando a 400 rpm sobre un agitador de microplacas, hasta que los cultivos estuvieron ligeramente turbios (de aproximadamente 2 a 4 horas) con una DO600nm de aproximadamente 0,5. A estas placas de expresión, se les añadió 10 µl de medio 2xYT complementado con 34 µg/ml de cloranfenicol e IPTG 3 mM (isopropiI-β-D-tiogalactopiranosido) por pozo (concentración final de lPTG 0,5 mM). Las placas de microtitulación se sellaron con una cinta permeable a gas, y se incubaron durante la noche a 30°C, agitando a 400 rpm. A cada pozo de las placas de expresión, se le añadieron 15 µl de regulador BEL que contenía 2,5 mg/ml de lisozima, EDTA 4 mM, y 10 unidades/µl de benzonasa, y se incubaron durante 1 hora a 22°C sobre un agitador de placas de microtitulación (400 rpm), seguido por un paso de congelación opcional durante al menos 2 horas a -80°C. Los extractos de BEL se utilizaron para los análisis de enlazamiento mediante ELISA o selección SET de Fab después de la maduración de afinidad.

La expresión de los fragmentos Fab codificados por pMORPH®x9_FabMH en células TG-1, se llevó a cabo en cultivos en frascos de agitación, utilizando 750 ml de medio 2xYT complementado con 34 µg/ml de cloranfenicol. Los cultivos se agitaron a 30°C hasta que la DO600nm alcanzó 0,5. La expresión se indujo mediante la adición de lPTG 0,75 mM durante 20 horas a 30°C. Se rompieron las células utilizando lisozima y se aislaron los fragmentos Fab mediante cromatografía Ni-NTA (Qiagen, Hilden, Alemania). Se realizó el intercambio de regulador con PBS de Dulbecco 1x (pH 7,2) utilizando columnas PD10. se filtraron en forma estéril Las muestras (0,2 µm, Millipore). Se determinó las pureza de las muestras en estado reducido y desnaturalizado por SDS-PAGE (Criterion Gels al 15%, BioRad), y en estado nativo mediante cromatografía de exclusión por tamaño (HP-SEC). Se determinaron las concentraciones de proteína por espectrofotometría UV (Krebs y colaboradores, J. lmmunol. Methods 254: 67 - 84 (2,001)).

A nivel de Fab, las velocidades totales de expresión y los porcentajes de fracción monomérica en SEC (cromatografía de exclusión por tamaño), estaban en un intervalo desde aceptable hasta bueno para la mayoría de los fragmentos de anticuerpo identificados. Se expresaron 64 Fab progenitores, y se pudieron purificar 61 Fab. Se purificaron 60 Fab madurados por afinidad a escala de mg. La mayoría de los Fab fueron buenos expresadores y no tuvieron tendencia a la agregación.

Ejemplo 3: Identificación de anticuerpos específicos para C5 a partir de la biblioteca HuCAL GOLD®.

A continuación, cuatro métodos diferentes de ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) describen la selección de anticuerpos que se enlazan a C5 (como Iisados BEL bacterianos o Fab purificados) sobre antígenos específicos y contra-antígenos.

1. Selección sobre proteína directamente recubierta.

Se recubrieron placas Maxisorp de 384 pozos (Nunc, Rochester, NY, EUA), con 20 µl por pozo de 2,5 µg/ml de antígeno (C5 humana, y las contra-proteínas humanas C3 y C4) EN PBS, pH 7.4, durante la noche a 4°C. Al mismo tiempo, se recubrieron las placas con 20 µl por pozo de 5 µg/ml de lgG antihumana de oveja, específica del fragmento Fd (The Binding Site, Birmingham, Reino Unido), diluido en PBS, pH 7.4, para verificar el nivel de expresión de Fab.

Se bloquearon las placas PBS/Tween 20 al 0,05% (PBST) que contenían 5% de leche en polvo, durante 1 - 2 horas a temperatura ambiente. Después de lavar los pozos con PBST, se añadieron extractos de BEL, Fab HuCAL GOLD®, purificados o Fab de control diluidos en PBS, y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Para detectar el enlazamiento de Fab, se aplicó el anticuerpo anti-HlS6 acoplado con peroxidasa (Roche).

Para la detección de conjugados de POD, se utilizó el sustrato fluorogénico QuantaBIu (Pierce), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Entre todos las etapas de incubación, se lavaron tres veces las placas de microtitulación y cinco veces con PBST después de la incubación final con el anticuerpo secundario. Se midió la fluorescencia en un lector de placas Tecan GENios Pro.

2. Selección en solución con proteínas biotiniladas.

Se utilizó el método ELISA descrito más adelante para seleccionar los Fab HuCAL GOLD®, después de los paneos en solución, utilizando proteínas biotiniladas del complemento.

Se bloquearon placas NeutrAvidin con Chemiblocker 1x (Chemicon) diluido en PBS durante la noche a 4°C. Estas placas se utilizaron para seleccionar el enlazamiento con C5 humana y los contra-objetivos de C3 y C4. Al mismo tiempo, se recubrieron las placas Maxisorp de 384 pozos (Nuno, Rochester, NY, EUA) con 20 µl por pozo de 5 µg/ml de lgG antihumana de oveja, específica del fragmento Fd (The Binding Site, Birmingham, Reino Unido), diluida en PBS, pH 7,4: Se usaron estas placas para verificar los niveles de expresión de Fab y para el enlazamiento no especifico de biotina. AI día siguiente, se lavaron las placas Maxisorp recubiertas dos veces con PBST, y se bloquearon con BSA al 3% en TBS durante 1 a 2 horas a temperatura ambiente. Se añadieron extractos periplásmicos de BEL que contenían Fab, o Fab HuCAL GOLD® purificados, tanto para placas NeutrAvidin como Maxisorp bloqueadas.

Posteriormente, se añadieron 20 µl por pozo de C5 humana biotinilada (para detectar enlazamiento específico), y al mismo tiempo, C3 y la C4 humanas biotiniladas (para detectar enlazamiento indeseado) a los pozos de las placas NeutrAvidin. Se incubaron los antígenos biotinilados con los Fab HuCAL GOLD® durante 1 a 2 horas a temperatura ambiente. Se añadió luego el antígeno transferrina biotinilado no relacionado a las placas Maxisorp, para verificar los Fab que se enlazan con biotina (en este caso, se capturaron previamente los fragmentos Fab HuCAL® a través del anticuerpo anti-Fd).

A continuación, se aplicaron los anticuerpos secundarios para detección: se añadió el fragmento F(ab’)2 AffiniPure estreptavidina-AP conjugado con fosfatasa alcalina (AP), antihumano de cabra, a las placas de expresión Maxisorp; se añadió el anticuerpo de ratón conjugado con peroxidasa anti-HIS6, Roche, a las placas NeutrAvidin y se agregó estreptavidina-fosfatasa alcalina, ZYMED, a las placas Maxisorp con la transferrina biotinilada.

Para la detección de conjugados de AP, se utilizaron sustrato fluorogénico AttoPhos (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania), y para la detección de conjugados de POD, sustrato fluorogénico QuantaBIu (Pierce), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se midió la fluorescencia en un lector de placas Tecan GENios Pro.

Empleando este método, fue posible seleccionar los Fab de C5 anti-humanos que reconocen C5 humana en solución, y excluir anticuerpos que se enlazan a la fracción de biotina de los antígenos objetivo.

3. Determinación de la reactividad cruzada con C5 de cinomólogo.

Se utilizó un anticuerpo policlonal que se enlaza a C5 (US Biological Cat. #C7850-24) para capturar C5 de cinomólogo a partir de suero de cinomólogo.

Se recubrieron placas Maxisorp de 384 pozos con 20 µl/pozo de 5 µg/ml de anticuerpo policlonal que se enlaza a C5 en PBS, y se incubó durante la noche a 4°C. AI siguiente día, se lavaron las placas tres veces con PBST, y se bloquearon con 100 µl/pozo de diluyente (BSA al 4%/Tween 20 al 0,1%/Triton-X 100 al 0,1%/PBS) durante 2 horas a temperatura ambiente. Se diluyó el suero de cinomólogo 1:20 en diluyente (BSA al 4%/Tween 20 al 0,1%/Triton-X 100 al 0,1%/PBS) (concentración aproximada de C5 de cinomólogo de 4 µg/ml), y se agregaron 20 µl/pozo a las placas Maxisorp lavadas con PBST. Después de 1 hora de incubación a temperatura ambiente, se lavaron las placas se lavaron tres veces con PBST, y se añadieron los lisados BEL que contenían fragmentos Fab o Fab purificados, y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Se lavaron las placas nuevamente, y se añadió el anticuerpo de detección anti-HIS6-POD (Roche #1965085). Se añadió sustrato POD, BM Blue, soluble (Roche Applied Science), y se detuvo la reacción con H2SO4 1M. Se leyó la absorbencia a 450 nm, utilizando el dispositivo lector BMG.

Ejemplo 4: Maduración de afinidad.

1. Construcción de bibliotecas de maduración de afinidad de Fab seleccionados que se enlazan a C5

Para incrementar la afinidad y la actividad biológica de fragmentos de anticuerpo seleccionados, se optimizaron al mismo tiempo regiones L-CDR3 y H-CDR2 mediante mutagénesis del casete, utilizando mutagénesis dirigida al trinucleótido (véase, por ejemplo, Virnekas y colaboradores, Nucleic Acids Res. 22: 5600- 5607 (1994)), mientras que las regiones de la estructura se mantuvieron constantes. Antes de la clonación, por maduración de afinidad, se transfirieron todos los fragmentos Fab progenitores desde el vector de expresión correspondiente (pMORPH®x9_MH) hasta el vector pMORPH®25 CysDispIayMR a través de XbaI/EcoRl. Se creó pMORPH®25 a partir del vector pMORPH®23 que se despliega en HuCAL GOLD® mediante la remoción de un sitio BssHlI que interfiere con la clonación de la biblioteca, para la optimización de H-CDR2. Para la optimización de L-CDR3 de Fab progenitores, la L-CDR3, se removieron la estructura 4, y la región constante de las cadenas ligeras (405 pb) de los enlazadores mediante BpiI/Sphl, y se reemplazaron por un repertorio de L-CDR3 diversificadas, junto con la

5 estructura 4 y el dominio constante.

Se dividieron diez Fab progenitores que se enlazan a C5 en 7combinaciones de acuerdo con diferentes criterios de selección, y solamente se colocaron juntos los Fab con la misma estructura: (1) MOR07086; (2) MOR06525 + 6756 (misma estructura); (3) MOR06757; (4) MOR06763; (5) MOR07087; (6) MOR07091 + 7092 (misma estructura); (7) MOR07093 + 7094 (misma estructura).

10 Se ligaron aproximadamente 1,5 µg del fragmento del vector Fab individual y de la combinación de Fab con un exceso molar de 3 a 5 veces del fragmento insertado que porta las L-CDR3 diversificadas. En un segundo grupo de bibliotecas, se diversificó la H-CDR2 (Xhol/BssHll) mientras que las regiones de estructura de conexión se mantuvieron constantes. Con el fin de monitorear la eficiencia de la clonación, se reemplazó la H-CDR2 progenitora por una falsa, antes de clonar el casete de H-CDR2, diversificado.

15 Las mezclas de ligación de las diferentes bibliotecas se electroporaron en las células TOP10 F’ de E. coli (lnvitrogen), produciendo de 2x107 a 2x108 colonias independientes. Se amplificaron las bibliotecas. Para el control de calidad, se recolectaron al azar varios clones individuales por biblioteca, y se secuenciaron utilizando los cebadores CFR84 (VL) y OCAL_Seq_Hp (VH).

Como se describió anteriormente, se generaron siete subcombinaciones de maduración, y se mantuvieron 20 separadas durante el proceso de selección posterior.

Se generaron 14 bibliotecas de maduración de afinidad diferentes (una biblioteca de LCDR3 y una biblioteca de HCDR3 para cada guía o combinación) mediante procedimientos de clonación convencionales y transformación de los clones diversificados en células TOP10 F’ de E. coli electrocompetentes (Invitrogen). Los tamaños de las bibliotecas eran buenos, estando en el intervalo de 2x107 - 5x108. La secuenciación de los clones recogidos al azar

25 mostró una diversidad del 100%. No se encontraron enlazadores progenitores sino derivados de todos los enlazadores de entrada progenitores respectivos. Finalmente, se prepararon por separado fagos de todas las 14 bibliotecas.

Tabla 2 Resumen de las bibliotecas de maduración

MOR0: Maduración Tipo VHNL Tamaño de la biblioteca

6757: HCDR2 VH3 3,70x10E7

6763: HCDR2 VH3 4,95x10E7

7086: HCDR2 VH1A 1,58x10E8

7087: HCDR2 VH1A 7,85x10E7

6525 + 6756: HCDR2 VH5 5,22x10E7

7091+ 7092: HCDR2 VH5 3,51x10E7

7093 + 7094: HCDR2 VH2 2,01x10E7

6757: LCDR3 Vkappa1 1,89x10E7

6763: LCDR3 Vlambda2 7,35x10E7

7086: LCDR3 Vlambda3 7,54x10E7

7087: LCDR3 Vkappa1 5,46x10E7

6525 + 6756: LCDR3 Vlambda2 8,50x10E7

7091+ 7092: LCDR3 Vlambda3 4,93x10E8

7093 + 7094: LCDR3 Vlambda2 1,33x10E8

2. Preparación de fagos de anticuerpos para maduración de afinidad.

Las bibliotecas de maduración HuCAL® se amplificaron en medio 2xYT que contenía 34 µg/ml de cloranfenicol, y glucosa al 1% (2xYT-CG). Después de la infección con el fago auxiliar VCSM13 a una DO600nm de 0,5 (30 minutos a

5 37°C sin agitación; 30 minutos a 37°C con agitación a 250 rpm), se centrifugaron las células (4.120 x g; 5 minutos; 4°C), se resuspendieron en 2xYT/34 µg/ml de cloranfenicol/50 µg/ml de kanamicina/IPTG 0,25 mM, y se cultivaron durante la noche a 22°C. se precipitaron los fagos en PEG dos veces a partir del sobrenadante, se resuspendieron PBS, y se utilizaron para los paneos de maduración descritos anteriormente.

3. Paneo de maduración en solución estándar sobre proteína C5 biotinilada.

10 Aproximadamente 1012 fagos rescatados de las bibliotecas generadas de maduración de afinidad, como se describió anteriormente, fueron sometidos a paneos bajo condiciones muy rigurosas para seleccionar por afinidad Fab mejorados específicos de C5.

Los paneos en solución que utilizan las combinaciones respectivas de fagos se realizaron ya sea utilizando C5 humana biotinilada, o alternando proteínas C5 humanas y de cinomólogo biotiniladas. Con el fin de incrementar la

15 rigurosidad del paneo y para seleccionar mejores valores, se disminuyó la concentración de antígeno, y se aplicaron periodos de lavado prolongados (las condiciones de lavado se enlistan en la Tabla 3).

Tabla 3. Mejores condiciones de lavado dentro de las rondas de selección de paneos de maduración en solución

Rondas de selección: Condiciones de lavado (modificadas: rigurosas)

Primera ronda:  4x PBS/ 0,05% Tween 5 min sobre rotador  3x PBS/ 0,05% Tween 15 min sobre rotador-> transferir perlas magnéticas con el antígeno y los fagos capturados a un nuevo tubo bloqueado  4x PBS rápido  3x PBS 5 min sobre rotador-> transferir perlas magnéticas con el antígeno y los fagos capturados a un nuevo tubo bloqueado

Segunda ronda:  3x PBS/ 0,05% Tween rápido  7x PBS/ 0,05% Tween 15min sobre rotador-> transferir perlas magnéticas con el antígeno y los fagos capturados a un nuevo tubo bloqueado  3x PBS rápido  7x PBS 15min sobre rotador-> transferir perlas magnéticas con el antígeno y los fagos capturados a un nuevo tubo bloqueado

Tercera ronda:  5x PBS/ 0,05% Tween rápido �  8x PBS/ 0,05% Tween 15min sobre rotador �  1x PBS/ 0,05% Tween durante la noche sobre rotador �  3x PBS/ 0,05% Tween rápido �  6x PBS/ 0,05% Tween 15min sobre rotador -> transferir perlas magnéticas con el antígeno y los fagos capturados a un nuevo tubo bloqueado  5x PBS rápido  8x PBS 15min sobre rotador -> transferir perlas magnéticas con el antígeno y los fagos capturados a un nuevo tubo bloqueado

Se incubaron los fagos previamente bloqueados (mezcla de 1:2 con Chemiblocker 2x incubada durante 1 hora a temperatura ambiente) con baja concentración de proteína C5 biotinilada durante 1 - 2 horas a temperatura

5 ambiente. La estrategia de paneo es similar al paneo en solución estándar descrito anteriormente. Se capturó el complejo fago-antígeno a través de la fracción de biotina de C5 a las perlas magnéticas de estreptavidina previamente bloqueadas durante 30 minutos a temperatura ambiente. Luego se lavaron las perlas en forma más rigurosa, comparado con un paneo normal. La elución y la amplificación de los fagos se realizó como se describió anteriormente.

10 Las segunda y tercera rondas de selección se realizaron en forma idéntica a la primera ronda, pero en condiciones de lavado más rigurosas y menores concentraciones de antígeno. Para cada guía o combinación de anticuerpos, se realizaron varios paneos diferentes; Para cada estrategia de paneo, se aplicaron diferentes condiciones de rigurosidad. Las estrategias de paneo se resumen en la Tabla 4.

Tabla4. Resumen de los paneos de maduración en solución 1783 y 1784 sobre C5 humana biotinilada y C5 de cinomólogo biotinilada

Paneo #: Biblioteca Modo de paneo Antígeno Primera ronda Antígeno segunda ronda Antígeno tercera ronda Concentración de antígeno Lavado

1783.1: MOR06525 + 6756 HCDR2 Perlas de estreptavidina en solución C5 humana C5 humana C5 humana 50nM humano / 5nM humano / 0,25nM humano Modificado (más riguroso)

1783.2: MOR07086 HCDR2

1783.3: MOR06763 HCDR2

1783.4: MOR07087 HCDR2

1783.5: MOR06525 + 6756 LCDR3

1783.6: MOR07086 LCDR3

1783.7: MOR06763 LCDR3

1783.8: MOR07087 LCDR3

1783.9 1783.10: MOR06525 + 6756 HCDR2 MOR07086 HCDR2 Perlas de estreptavidina en solución C5 humana C5 de cinomólogo C5 humana 25nM humano / 5nM de cinomólogo / 0,25nM humano Modificado (más riguroso)

1783.11: MOR06763 HCDR2

1783.12: MOR06525 + 6756 LCDR3

1783.13: MOR07086 LCDR3

1783.14: MOR06763 LCDR3

1784.1: MOR06757 HCDR2 Perlas de estreptavidina en solución C5 humana C5 humana C5 humana 50nM humano / 5nM humano / 0,25nM humano Modificado (más riguroso)

1784.2: MOR07091 + 7092 HCDR2

1784.3: MOR07093 + 7094 HCDR2

1784.4: MOR06757 LCDR3

1784.5: MOR07091 + 7092 LCDR3

1784.6: MOR07093 + 7094 LCDR3

1784.7: MOR06757 HCDR2 Perlas de estreptavidina en solución C5 humana C5 de cinomólogo C5 humana 25nM humano / 5nM de cinomólogo / 0,25nM humano Modificado (más riguroso)

1784.8: MOR07091 + 7092 HCDR2

1784.9: MOR07093 + 7094 HCDR2

1784.10: MOR07087 HCDR2

1784.11: MOR06757 LCDR3

1784.12: MOR07091 + 7092 LCDR3

1784.13: MOR07093 + 7094 LCDR3

1784.14: MOR07087 LCDR3

Después de los paneos de maduración, se subclonaron los fagémidos combinados enriquecidos en el vector de expresión pMORPH®x9_MH.

4. Combinación cruzada de VL optimizado (L-CDR3) con VH optimizado (H-CDR2).

5 Para una mejora adicional de la afinidad y la potencia, se combinaron las cadenas pesada y ligera optimizadas en forma independiente a partir de anticuerpos madurados, derivados del mismo clon progenitor (véanse, por ejemplo, Rauchenberger y colaboradores, J. Biol. Chem. 278: 38194 - 38205 (2003); Chen y colaboradores, J. Mol. Biol. 293: 865 - 881 (1999); y Schier y colaboradores, J. Mol. Biol. 263: 551 - 567 (1996)). Este procedimiento, llamado clonación cruzada, se aplicó para los enlazadores que se derivan de los mismos clones progenitores.

10 5. Selección de afinidad y resultado del paneo de maduración.

Se seleccionaron un total de 2.640 clones derivados de todos los paneos como lisados bacterianos para afinidades mejoradas sobre C5 humana. Se estimaron las afinidades preliminares por titulación de equilibrio en solución (SET). Con base en sus afinidades estimadas se secuenciaron los clones derivados de cada Fab progenitor o combinaciones de Fab. La Tabla 5 muestra el número de clones secuenciados y el número de secuencias únicas

15 obtenidas para cada condición de paneo.

Tabla 5. Resumen de los clones mejorados por afinidad seleccionados por análisis de secuencia

secuenciados: secuencias únicas

MOR06525 + 6756 CDR2: hu/hu/hu 10 9 6525

MOR07088 HCDR2: hu/hulhu 10 4 7086

MOR06763 HCDR2: hu/hu/hu 22 10 6763(8x), 7086(2x)

MOR07087 HCDR2: hu/hu/hu 10 4 7087

MOR06757 HCDR2: hu/hu/hu 10 0

MOR07091 + 7092 HCDR2: hu/hu/hu 24 7 7092

MOR07093 + 7094 HCDR2: hu/hu/hu 10 10 7093

MOR06525 + 6756 LCDR3: hu/hu/hu 20 5 6756

MOR07086 LCDR3: hu/hulhu 10 5 7086

MOR06763 LCDR3: hu/hu/hu 10 8 7086

MOR07087 LCDR3: hu/hu/hu 6 1 7086

MOR06757 LCDR3: hu/hu/hu 16 0

MOR07091 + 7092 LCDR3: hu/hu/hu 6 6 7091(1x), 7092(5x)

MOR07093 + 7094 LCDR3: hu/hu/hu 10 9 7094

MOR06525 + 6756 CDR2: hu/cino/hu 10 8 6525

MOR07086 HCDR2: hu/cino/hu 10 6 7086

MOR06763 HCDR2: hu/cino/hu 22 5 6763

MOR06757 HCDR2: hu/cino/hu 15 2 6757

MOR07091 + 7092 HCDR2: hu/cino/hu 15 6 7091(3x), 7092(3x)

MOR07093 + 7094 HCDR2: hu/cino/hu 10 10 7093

MOR07087 HCDR2: hu/cino/hu 10 6 7087(5x), 7086(1x)

MOR08525 + 6756 LCDR3: hu/cino/hu 12 0

MOR07088 LCDR3: hu/cino/hu 10 1 7086

MOR08763 LCDR3: hu/cino/hu 10 0

MOR06757 LCDR3: hu/cino/hu 9 1 7094

MOR07091 +7092 LCDR3: hu/cino/hu 11 9 7091(6x), 7092(3x)

Progenitor/Maduración: Antígeno Clones secuenciados Secuencias únicas Progenitor de las secuencias únicas

MOR07093 + 7094 LCDR3: hu/cino/hu 10 7 7094

MOR07087 LCDR3: hu/cino/hu 10 0

Suma: 338 139

6. Análisis de secuencia y selección de los Fab optimizados por afinidad para la producción de proteína.

Se mantuvo una muy buena diversidad durante la recuperación de los derivados de los 10 Fab progenitores. Se determinaron las secuencias de nucleótidos de la cadena pesada (VH) para 188 clones mejorados de HCDR2, y de las regiones variables de cadena ligera (VL) para 150 clones mejorados de LCDR3. Se seleccionaron 87 secuencias únicas de HCDR2 y 52 secuencias únicas de LCDR3 para un análisis detallado de la diversidad de secuencia dentro de las CDR maduras. Se omitieron los Fab que contenían posibles sitios de glicosilación en las CDR de otras caracterizaciones adicionales.

El análisis de secuencia de VH y VL y los datos de afinidad mostraron que todos los 10 Fab progenitores produjeron sucesores mejorados por afinidad. Los Fab progenitores MOR06525, MOR06757, MOR06763, MOR07087 y MOR07094 produjeron únicamente clones mejorados de HCDR2, y los progenitores MOR06756 y MOR07093 proporcionaron únicamente clones mejorados de LCDR3. MOR07086, MOR07091 y MOR07092 tenían clones maduros tanto para VH como para VL. Esto último permitió una clonación cruzada de cadenas maduras de VH y VL. A partir de todos los datos, se seleccionaron 60 clones con la mejor afinidad y la más alta diversidad en las CDR maduras para expresión de Fab. Las secuencias seleccionadas de aminoácidos de VH y VL, así como las secuencias de nucleótidos, se enlistan en la Tabla 1.

Ejemplo 5: Conversión de lgG.

1. Conversión en el formato de lgG2 humana.

Con el fin de expresar inmunoglobulina de longitud completa (Ig), se subclonaron fragmentos de dominio variable de cadenas pesada (VH) y ligera (VL) desde los vectores de expresión de Fab pMORPH®x9_MH en la serie de vectores pMORPH®2_h_lg para lgG2 humana. Se utilizaron enzimas de restricción Mfel, y Blpl para subclonación del fragmento del dominio VH en pMORPH®2_h_lgG2. La subclonación del fragmento del dominio VL en pMORPH®2_h_IgK se realizó a través de los sitios EcoRV y BsiWI, mientras que la subclonación en pMORPH®2_h_IgA2 se hizo usando EcoRV y Hpal.

Todos los diez Fab progenitores (MOR06525, 6756, 6757, 6763, 7086, 7087, MOR07091, 7092, 7093 y 7094) fueron convertidos en IgG2 humana. Las IgG fueron también expresadas.

2. Conversión en formato IgG1AA humana

Con el fin de expresar inmunoglobulina de longitud completa, se subclonaron fragmentos de dominio variable de cadenas de Fab pesada (VH) y ligeras (VL) de los vectores de expresión de Fab en vectores de expresión de IgG1. Se utilizaron enzimas de restricción Mfel y Blpl para la subclonación del fragmento de dominio VH en pMORPH®2_h_IgG1AA, en donde las leucinas en las posiciones 234 y 235 fueron mutadas por alaninas para anular el enlazamiento de FcRy y atenuar las funciones efectoras. Las enzimas de restricción EcoRV y HpaI se utilizaron para la subclonación del fragmento del dominio VL en pMORPH®2_h_Igλ2.

Después, los Fab madurados con perfiles deseados fueron subclonados en formato IgG1AA humana: MOR07832, 7834, 7872, 7876, 7829, 7871, 7865, 7873, 7830, 7878, 7910. Se logró la clonación cruzada a nivel de IgG mediante transfección de células con combinaciones de constructos de cadena ligera y pesada. Por ejemplo, MOR08114 era el producto de la cadena pesada de línea germinal de MOR07829 y la cadena liviana de línea germinal de MOR07871. La Tabla 6 resume las IgG de línea germinal clonadas en forma cruzada.

Tabla 6. Resumen de las IgG más relevantes de línea germinal clonadas en forma cruzada

MOR0 No.: VH/VL de línea germinal VHNL CDR maduradas formato

VH: VL VH maduradas VL maduradas

8114: si 7829 7871 7091/HCDR2 7091/LCDR3 hulg1AA

8125: si 7091 7873 - 7091/LCDR3 hulg1AA

8126: si 7829 7873 7091/HCDR2 7091/LCDR3 hulg1AA

8127: si 7830 7873 7091/HCDR2 7091 /LCDR3 hulg1AA

8128: si 7092 7878 - 7092/LCDR3 hulg1AA

8129: si 7909 7092 7092/HCDR2 - hulg1AA

8130: si 7909 7878 7092/HCDR2 7092/LCDR3 hulg1AA

8131: si 7910 7092 7092/HCDR2 - hulg1AA

8132: si 7910 7878 7092/HCDR2 7092/LCDR3 Pulg1AA

3. Expresión transitoria y purificación de IgG humana

Se transfectaron células eucariotas HKB11 y HEK293 con una relación equimolar de ADN del vector de expresión

5 cadena pesada y liviana de IgG. Se recolectó el sobrenadante de cultivo celular a los 3 o 7 días después de la transfección y se lo sometió a cromatografía de afinidad convencional con proteína A (rProteinA FF o MabSelect SURE, GE Healthcare). Mientras no se indique lo contrario, se realizó el intercambio del regulador por PBS de Dulbecco 1x (pH 7,2, Invitrogen) y se filtraron las muestras en forma estéril (0,2 µm). Se analizó la pureza de IgG bajo condiciones desnaturalizantes, reductoras y no reductoras en SDS-PAGE o mediante el uso de BioAnalyzer

10 Agilent y en estado nativo por HP-SEC.

Ejemplo 6: Mutación de la línea germinal

Constructos de IgG se mutaron a la línea germinal a través de mutagénesis dirigida al sitio usando el kit para mutagénesis dirigida al sitio QuickChange® (Stratagene). Los DI del terminal N de MOR08111 Vλ2 fueron cambiados a ES para hacer coincidir la secuencia de línea germinal humana, así como evitar un terminal Q (la Q del

15 terminal N puede formar piroglutamina). Los DI del terminal N de MOR08110 Vλ3, MOR08113 Vλ3, y MOR08114 Vλ3 fueron mutados a la línea germinal SY, la secuencia más comúnmente encontrada en a genes λ3 humanos. QVQ del terminal N de MOR08111 VH2 fue mutado a la línea germinal EVT para que coincidiera con un gen λ2 y evitar el terminal Q. Q del terminal N en MOR08109 VH5, MOR08110 VH5, MOR08113 VH5 y MOR08114 VH5 también fue mutada a E.

20 Las secuencias de la estructura para MOR08109 VA3 fueron sintetizadas para que coincidieran con el gen λ3j humano y se clonaron en el vector de expresión usando sitios de restricción NheI y HpaI. Los alineaciones de secuencia de los dominios variables de anticuerpos con sus respectivas secuencias de línea germinal humana más cercanamente relacionadas se muestran en la Fig. 1.

Ejemplo 7: Determinación de afinidad

25 1. Determinación de Kactivación / Kdesactivación y KD de anticuerpos anti-C5 humanos usando resonancia de plasmón superficial (Biacore).

Se determinó que los anticuerpos anti-Fab usados para inmovilizar Fab al chip Biacore influyeron en forma diferente la afinidad de enlazamiento de cada Fab para C5 humana, haciendo por lo tanto difícil la comparación de los Fab entre sí.

30 El análisis Biacore se realizó en anticuerpos IgG.

Se recubrió un chip CM4 con 50 µg/ml de anticuerpo anti Fc humana de cabra (500-2000 RU) en regulador de acetato 10 mM, pH 4,5, usando química convencional de acoplamiento de aminas EDC-NHS. Cada IgG anti-C5 humana fue capturado en el chip en regulador HBSEP a una velocidad de flujo constante de 10 µl/min durante un tiempo de contacto que conduce a una densidad de ligando de alrededor de 20 RU. Después de capturar la IgG anti- 5 C5 humana, se inyectaron diferentes concentraciones de C5 humana o de cinomólogo, en el intervalo entre 0,156 nM a 2,5 nM. Cada ciclo se completó con dos etapas de regeneración con ácido fosfórico. Todas las condiciones de ejecución se llevaron a cabo a 25 °C en regulador HBS-EP 1x . Se ajustaron las señales resultantes mediante referenciación doble, restando los valores del índice de refracción de la celda de flujo de referencia y la etapa de enlazamiento sin analito. Se recolectaron los datos a 10 Hz y se analizaron utilizando el software de evaluación

10 Biacore T100 versión 1.1 (GE). Este programa utiliza un método de análisis de ajuste global para la determinación de las constantes de velocidad y de afinidad para cada interacción.

Se midió la especificidad de los anticuerpos. Preferiblemente, los valores de Kactivación y Kdesactivación para el enlazamiento con C5 humana y cinomólogo son los siguientes: Kactivación > 1x105, Kdesactivación < 1x10-4. Estas mediciones se realizaron en Biacore para la IgG de línea germinal mutada y los datos resultantes se enlistan en la

15 Tabla 7.

Tabla 7. Valores de KD, Kactivación y Kdesactivación de las IgG de línea germinal mutada determinados en Biacore

IgG final antiC5: Muestra C5 ka [1/Ms] kd[1/s] KD [pM]

MOR08109: huC5 2,13E+06 2,56E-05 12

cinoC5: 1,23E+06 4,49E-05 37

MOR08110: huC5 4,15E+06 4,69E-05 12

cinoC5: 1,81E+06 9,24E-05 60

MOR08111: huC5 1,00E+06 3,07E-05 31

cinoC5: 8,91E+05 1,28E-04 144

MOR08113: huC5 2,51E+06 6,77E-05 28

cinoC5: 1,53E+06 1,27E-04 83

MOR08114: huC5 2,09E+06 3,12E-05 15

cinoC5: 1,06E+06 3,13E-05 31

5G1.1: huC5 1,29E+06 7,22E-05 56

2. Determinación de las afinidades picomolares usando titulación de equilibrio en solución (SET) para Fab purificados o Fab de lisados Bacterianos (Meso Escale Discovery (MSD))

20 Para la determinación de KD por titulación de equilibrio de solución (SET), se utilizaron fracciones de monómero (al menos 90% de contenido de monómero, analizado por SEC analítico; Superdex75, Amersham Pharmacia) de proteína Fab. La determinación en afinidad en solución se realizó básicamente como se describe en la literatura (Friguet y colaboradores, J. Immunol Methods 77: 305 - 319 (1985)). Con el fin de mejorar la sensibilidad y la precisión del método SET, se transfirió desde ELISA clásico a tecnología con base en ECL (Haenel y colaboradores,

25 Anal Biochem 339: 182 - 184 (2005).

Se marcaron 1 mg/ml de anticuerpos específicos del fragmento anti (Fab)2 humano de cabra (Dianova) con NHS – éster ECL sulfo-TAGTM (Meso Escale Discovery, Gaithersburg, MD, EUA) según las instrucciones del fabricante. Los experimentos se llevaron a cabo en placas de microtitulación de polipropileno y PBS pH 7,4 con 0,5% de BSA y 0,02% de Tween 20 como reguladores del ensayo. El antígeno no marcado se diluyó en una serie 2n, partiendo de 30 una concentración al menos 10 veces superior que la KD. Los pozos sin antígeno se utilizaron para determinar los valores de Bmax; los pozos sin antígeno ni Fab se utilizaron para determinar la línea base. Después de la adición

por ejemplo de, Fab 10 pM (concentración final en un volumen final de 60 µl), se incubó la mezcla durante la noche a temperatura ambiente. La concentración aplicada de Fab fue similar o inferior a la KD esperada.

Las placas MSD de estreptavidina se recubrieron con 0,2 µg/ml de C5 humana biotinilada (30 µl/pozo) y se bloquearon con BSA al 5% en PBS. Posteriormente, las muestras equilibradas fueron transferidas a aquellas placas

5 (30 µl por pozo) y se incubaron durante 20 min. Después del lavado se añadieron 30 µl/pozo del anticuerpo de detección marcado con la etiqueta ECL sulfo (anti(Fab)2 humano de cabra) en una dilución final de 1:1500 a la placa MSD y se incubó durante 30 minutos en un agitador Eppendorf (700 rpm).

Después de lavar y añadir 30 µl/pozo se detectaron las señales de electroquimiluminiscencia del regulador T de lectura de MSD con tensoactivo usando un Sector Imager 6000 (Meso Escale Discovery, Gaithersburg, MD, EUA).

10 Los datos se evaluaron con el software XLfit (IDBS) aplicando modelos de ajuste personalizados. Para la evaluación de los datos, es decir la determinación de KD de las moléculas de Fab, se utilizó el siguiente modelo de ajuste (modelo de Abraham y colaboradores,16, modificado de acuerdo con Piehler y colaboradores, 15): y = Bmax (Bmax / (2 * cFab) * (x + cFab + KD - sqrt ((x + cFab + KD) * (x + cFab + KD) - 4 * x * cFab))); cFab: concentración aplicada de Fab; x: concentración total aplicada de antígeno soluble (sitios de enlazamiento); sqrt: raíz cuadrada.

15 Utilizando las condiciones del ensayo descritas anteriormente, se determinaron las afinidades anteriores (monoméricos) para los Fab que se enlazan a C5 optimizadas por afinidad en solución.

Fab progenitores

Con el fin de caracterizar adicionalmente los anticuerpos que se enlazan a C5, se determinó la afinidad de los Fab progenitores para C5 humana. Debido a que el enfoque de la caracterización estaba en la eficacia en los ensayos

20 hemolíticos, se hicieron las mediciones de afinidad únicamente para los Fab más relevantes. Para una determinación confiable de afinidades monovalentes, se utilizaron únicamente lotes Fab para las mediciones que mostraron una fracción monomérica ≥ 90% en una cromatografía de exclusión por tamaño cualitativa.

Las afinidades de los 10 Fab progenitores que ingresaron a maduración por afinidad se resumen en la Tabla 8. Las afinidades oscilaron entre 72 pM a 3,7 nM.

25 Tabla 8. Afinidades de los 10 Fab determinadas en SET

SET: (n = 1)

MOR0 Número: KD [pM]

6525: 72

6756: 1521

6757: 1186

6763: 820

7086: 108

7087: 3793

7091: 324

7092: 229

7093: 576

7094: 1364

3207 (control negativo): no enlazante

Fab madurados Se midieron las afinidades monovalentes de los Fab purificados para C5 humano en SET. Las afinidades estaban en el intervalo inferior de pM y se obtuvieron mejores afinidades para los derivados de MOR07086, 7091, 7092 y 7093. Posteriormente, las mediciones de afinidad de estos derivados para C5 de cinomólogo mostraron afinidades en el rango de medio a bajo de pM.

El proceso de maduración de afinidad fue muy exitoso dando como resultado un repertorio de enlazadores con una afinidad marcadamente mejorada. La Tabla 9 resume las afinidades para C5 humano y de cinomólogo de los mejores enlazadores mejorados. Ciertos Fab tienen una KD para C5 humana ≤ 30 pM y para C5 de cinomólogo ≤ 150pM.

Tabla 9. Resumen de afinidades para C5 humana y de cinomólogo para los Fab de mejor afinidad mejorada 3. Determinación de KD de moléculas de IgG usando titulación de equilibrio en solución (SET)

MOR: Madurado SET hu C5 (n=1-2) SET cino C5 (n=1) MOR Madurado SET hu C5 (n=1-2) SET cino C5 (n=1)

KD [pM]: KD[pM] KD [pM] KD[pM]

6525: 273 / 29 7871 LCDR3

7813: HCDR2 437 7872 LCDR3

7814: HCDR2 137 7873 LCDR3

7816: HCDR2 116 7874 LCDR3

6757: 3650 / 1245 7092 96 481

7818: HCDR2 491 7831 HCDR2

7907: HCDR2 179 7832 HCDR2

6763: 673 / 962 7909 HCDR2

7820: HCDR2 62 7910 HCDR2

7086: 12 / 65 7876 LCDR3 78

7821: HCDR2 7877 LCDR3

7822: HCDR2 7878 LCDR3

7823: HCDR2 7879 LCDR3

7824: HCDR2 55 / 130 7093 431 / 992 3146

7864: LCDR3 974 7833 HCDR2 47

7865: LCDR3 7834 HCDR2

7866: LCDR3 191 7835 HCDR2

7867: LCDR3 7836 HCDR2

7868: LCDR3 384 7890 HCDR2 46

7869: LCDR3 7094

7870: LCDR3 500 7880 LCDR3

7087: 120 7881 LCDR3 88

Se determinaron las afinidades de las IgG de línea germinal mutada (formato IgG1AA humana) para C5 humana y de cinomólogo en SET como se describe más abajo. Conjuntos similares de datos entre dos mediciones independientes mostraron mayores afinidades de las IgG guía con C5 humana que la IgG 5G1.1 de referencia (véase la patente de los Estados Unidos de Norte América No. 6.355.245). Las IgG finales tenían afinidades para C5 humana en el intervalo de 1 a 14 pM y afinidades para C5 de cinomólogo en el intervalo de 3 a 29 pM.

Tabla 10. Determinación de los valores de KD para las IgG guía finales (formato IgG1AA humana) en SET

Primera medición: Segunda medición

C5 humana: C5 de cinomólogo C5 humana C5 de cinomólogo

KD [pM]
KD [pM]: DD [pM]
KD [pM]

IgG1AA humana de línea germinal mutada: MOR08109 4 13 2 6

MOR08110: 7 18 3 8

MOR08111: 5 14 3 17

MOR08113: 14 29 8 16

MOR08114: 1 5 2 4

hulgG2/4 (IgG de referencia): 5G1.1 24 no enlazante 19 no enlazante

10 Para la determinación de KD mediante titulación de equilibrio en solución (SET), se utilizaron fracciones de monómero de proteína IgG (al menos con un contenido de 90% de monómero, analizado mediante SEC MALS analítico; Tosoh TSKgel G3000SWXL, Wyatt Treos miniDAWN). La determinación de afinidad en solución se realizó básicamente como se describe en la literatura (Friguet y colaboradores J. Immunol Methods 77: 305 - 319 (1985)). Con el fin de mejorar la sensibilidad y precisión del método SET, se transfirió desde ELISA clásico hasta tecnología

15 basada en ECL (Haenel y colaboradores, Anal Biochem 339: 182 - 184 (2005)).

Se marcaron 1 mg/ml de anticuerpos específicos del fragmento anti (Fab)2 humano de cabra (Dianova) con NHS – éster ECL sulfo-TAGTM (Meso Escale Discovery, Gaithersburg, MD, EUA) según las instrucciones del fabricante. Los experimentos se llevaron a cabo en placas de microtitulación de polipropileno y PBS pH 7,4 con 0,5% de BSA y 0,02% de Tween 20 como reguladores del ensayo. El antígeno no marcado se diluyó en una serie 2n o 1,75n,

20 respectivamente, partiendo de una concentración al menos 10 veces superior que la KD. Los pozos sin antígeno se utilizaron para determinar los valores de Bmax; los pozos que no contenían ni antígeno ni IgG se utilizaron para determinar la línea base. Después de la adición por ejemplo de, IgG 10 pM (concentración final en un volumen final de 60 µl), se incubó la mezcla durante la noche a temperatura ambiente. La concentración aplicada de IgG fue similar o inferior a la KD esperada.

Las placas MSD de estreptavidina se recubrieron con 0,2 µg/ml de C5 humana biotinilada (30 µl/pozo) y se bloquearon con BSA al 5% en PBS. Posteriormente, las muestras equilibradas fueron transferidas a aquellas placas (30 µl por pozo) y se incubaron durante 20 min. Después del lavado se añadieron 30 µl/pozo del anticuerpo de detección marcado con la etiqueta ECL sulfo (anti(Fab)2 humano de cabra) en una dilución final de 1:1500 a la placa MSD y se incubó durante 30 minutos en un agitador Eppendorf (700 rpm).

Los datos se evaluaron con el software XLfit (IDBS) aplicando modelos de ajuste personalizados. Para la evaluación de los datos, es decir la determinación de KD de las moléculas de IgG, se utilizó el siguiente modelo de ajuste para IgG(modificado de acuerdo a Piehler y colaboradores, 1997,17): y = Bmax / (clgG / 2) * (clgG / 2 - ((x + clgG + KD) / 2 - ((x + clgG + KD) ^ 2/4 - x * clgG ^ 0,5) ^ 2 / (2 * IgG)); clgG = concentración aplicada de IgG, molécula completa (sin sitios de enlazamiento); x = concentración total aplicada de antígeno soluble (sitios de enlazamiento); sqrt: raíz cuadrada.

Ejemplo 8: Caracterización mediante ensayos hemolíticos

El ensayo hemolítico es un ensayo funcional básico que analiza la activación del complemento y ha sido utilizado para evaluar la capacidad de mAb anti-C5 humana y moléculas Fab para bloquear la lisis de glóbulos rojos (RBC) por rutas del complemento (véase, por ejemplo, Evans y colaboradores, Mol Immunol 32: 1183 - 1195 (1995); Thomas y colaboradores, Mol Immunol. 33: 1389 - 1401 (1996); Rinder y colaboradores, J Clin Invest 96: 1564 1572 (1995)). En resumen, para los ensayos de ruta clásica, se utilizan glóbulos rojos sensibilizados como objetivos para lisis por las proteínas del complemento presentes en el suero. Este ensayo es de interés para la caracterización y selección de mAb anti-C5 humanas de alta afinidad.

1. Ruta clásica

El número deseado de glóbulos rojos de pollo se lavó cuatro veces con regulador veronal de gelatina fría (GVB ++) y se resuspendió hasta 5x107 células/ml. Para sensibilizar las células se añadió IgG anti-chRBC de conejo a la suspensión de RBC hasta una concentración final de 1 µg/ml de IgG. Después de 15 minutos de incubación sobre hielo, se centrifugaron las chRBC sensibilizadas, se lavó dos veces con GVB ++ y se diluyó hasta 8,33x107 células / ml.

Se utilizaron placas de 96 pozos de fondo redondo para los ensayos hemolíticos. Los anticuerpos se diluyeron en regulador GVB ++ y se añadieron a los pozos (cuando se cálculo a concentración requerida de Ab que se enlazan a C5, se consideró que la muestra sería diluida dos veces cuando se añade el suero). Se añadieron 50 µl de suero humano al 40% (diluido en GVB ++) se añadieron a 50 µl de diluciones del anticuerpo, lo que resulta en una concentración final del ensayo de suero del 20%.

Se prepararon pozos de control y de blanco como se describe aquí: pozos de control: i) 0% de Control de lisis → 100 µl de GVB ++, ii) 100% de control de lisis → 100 µl de NP-40 al 1%, iii) 20% de control de suero→ 100 µl de 20% control de suero (0% de control de Ab). Pozos de blanco: i) 20% de blanco de suero → 100 µl 20% de suero, ii) blanco de GVB ++ → 100 µl deGVB ++, iii) blanco de NP-40 → 100 µl 0,1% de NP-40.

Se añadieron 2,5x106 (30 µl) de chRBC sensibilizados /pozo a toda la muestra y a los pozos de control. Para los pozos de blanco se les añadió PBS en vez de células. S incubó la placa del ensayo durante 30 minutos a 37 °C, se centrifugó (2.000 rpm, 5 min) y se transfirieron 85 µl del sobrenadante a una nueva placa de 96 pozos de fondo plano. Se centrifugó la nueva placa (2.000 rpm, 3min) para deshacerse de cualquier burbuja. Se midió la liberación de hemoglobina mediante lectura de la absorbancia a 415 nm. Se calculó el porcentaje de hemólisis con respecto a los pozos de control y de blanco utilizando los siguientes algoritmos de cálculo:

% de hemólisis = 100 x DOmuestra – DOcontrol negativo

DOcontrol positivo – DOcontrol negativo

donde

DOmuestra = [DOmuestra promedio] -[DO20% blanco de suero promedio]

DOcontrol negativo = [DO0% de lisis promedio] -[DOblanco de GBB++ promedio]

DOcontrol positivo = [DO100% de lisis promedio] -[DOblanco de NP-40 promedio]

Usando este procedimiento, se pueden identificar los anticuerpos anti-C5 humana que eran capaces de inhibir la lisis de glóbulos rojos. Para seleccionar la reactividad cruzada para C5 de cinomólogo, se realizó la ruta clásica utilizando 5% de suero de cinomólogo.

2. Ruta alternativa

Los ensayos hemolíticos sometidos a la ruta alternativa se realizaron de una manera similar a la ruta clásica de ensayos hemolíticos. En la ruta alternativa se utilizaron glóbulos rojos de conejo y no hubo necesidad de sensibilizar a las células. Los glóbulos rojos de conejo son diferentes de los glóbulos rojos de pollo ya que son sensibles a la lisis causada por la ruta alternativa del complemento.

El regulador de trabajo fue GVB ++ suplementado con EGTA 10 mM y Mg++ 5 mM, ya que la C5 convertasa de la ruta alternativa depende de Mg ++ y la C5 convertasa de la ruta clásica depende de Ca++.

Los ensayos hemolíticas de la ruta alternativa se corrieron con: i) 20% de suero humano, ii) C5 humana 100 pM añadida a 20% de suero agotado en C5 humana, iii) 0,025% de suero de cinomólogo añadido a 20% de suero de agotado en C5 humana, iv) C5 de cinomólogo 100 pM añadida a 20% de suero agotado en C5 humana, v) 10% de suero de cinomólogo. Estos configuraciones se usaron para seleccionar los anticuerpos con alta afinidad para las proteínas C5 humanas y de cinomólogo que fueron capaces de inhibir muy eficientemente la lisis de glóbulos rojos inducida por la ruta alternativa del complemento.

3. Ensayos hemolíticos con Fab progenitores

Se utilizaron ensayos hemolíticos como ensayos biofuncionales básicos para evaluar la capacidad de mAb anti-C5 humana para bloquear la lisis mediada por el complemento de los glóbulos rojos. La C5 convertasa escinde C5 en un péptido C5a y un fragmento C5b, que se incorpora posteriormente en el complejo de ataque de la membrana (CAM), que conduce a la lisis celular. La C5 convertasa de la ruta clásica, formada por un complejo C3bC4bC2a tiene una estructura diferente que la C5 convertasa de la ruta alternativa que está formada por un complejo C3bC3bBb. Los anticuerpos generados por HuCAL Gold® deben ser inhibidores tanto en la ruta clásica como alternativa, pero enfocada en la ruta alternativa debido principalmente a que la ruta alternativa (Factor H, factor B y los genes relacionados con el factor H) está implicada en AMD.

Los ensayos de la rutas clásica y alternativa se realizaron con 20% de suero humano (C5 ~ 80 nM). Para aumentar la sensibilidad de los ensayos de la ruta alternativa, se desarrollaron nuevos formatos de ensayo. Se añadieron C5 humana purificada 10 – 100 pM o 0,025% de suero cinomólogo (C5 de cinomólogo aprox.100 pM) se añadieron a suero agotado en C5 humana (pero que contenía todos los otros componentes del suero y del complemento).

La Figura 2 muestra que se puede observar una hemólisis considerable entre C5 humana purificada 10 y 100 pM añadida al suero agotado en C5 humana. Se añadió suero de cinomólogo en C5 humana para analizar la reactividad cruzada.

La Figura 3 muestra que 0,025% de suero de cinomólogo (C5 ~ 100 pM) añadido al suero agotado en C5 humana restaura la actividad hemolítica.

Ruta clásica

Se hizo una primera selección de Fab en la ruta clásica (20% de suero humano). Aproximadamente la mitad de los 61 Fab progenitores purificados eran inhibidores entre débiles hasta fuertes de la ruta clásica. Los valores de IC50 de los mejores Fab inhibidores estaban entre 35 y 900 nM.

Se hicieron ensayos que mostraron resultados congruentes (como se muestra en la Fig. 4). Se calculó el % de hemólisis con respecto a los pozos de control y del blanco. Se comparó la inhibición de Fab de la lisis comparó con la lisis máxima causada por 20% de suero humano (= 100%). Se usó un Fab humano irrelevante (enlazador de lisozima de huevo blanco de gallina MOR03207) como control negativo y anticuerpo monoclonal IgG anti-C5 humana (Quidel) como control positivo. La FIG. 4 muestra un ejemplo con los mejores Fab inhibidor.

Ruta Alternativa

Los Fab que mostraron actividad inhibidora en la ruta clásica fueron evaluados adicionalmente en la ruta alternativa. Se corrieron ensayos hemolíticas con C5 humana purificada 100 pM o 0,025% de suero de cinomólogo añadido al suero agotado en C5 humana. Los valores de IC50 para los ensayos alternativos humanos estaban entre 0,1 y 90 nM (ejemplos de ensayos con los Fab más relevantes se muestran en la FIG. 5).

El control positivo de la ruta clásica (anticuerpo anti-C5 humana, Quidel) no fue inhibitorio en la ruta alternativa. Por lo tanto, se usó un anticuerpo antifactor P del complemento (Quidel) como control positivo. Como se muestra en la Figura 5, MOR07086 tenía la mejor actividad inhibidora y los datos NVS revelaron una mejor potencia que para el anticuerpo de referencia 5G1.1.

5 Para analizar la reactividad cruzada de cinomólogo, se realizaron ensayos hemolíticos de la ruta alternativa con 0,025% de suero de cinomólogo añadido al suero agotado en C5 humana. No fue posible una comparación con 5G1.1, ya que 5G1.1 no reconoce a C5 de cinomólogo. Se usó el anticuerpo anti-Factor P como control positivo. Resultados del ensayo revelaron valores de IC50 entre 0,1 y 400 nM para los mejores Fab inhibidores. Nuevamente, MOR07086 mostró la mejor potencia (mostrada en FIG. 6).

10 Se observó una actividad inhibidora consistente de los Fab tanto en la ruta clásica como en la ruta alternativa. La Tabla 11 a continuación resume los resultados de los ensayos hemolíticos para los 22 Fab más relevantes. Para tener una comparación más confiable entre los diferentes experimentos, se normalizó la lisis causada por el 20% de suero humano hasta 100%.

Tabla 11. Resumen de los ensayos hemolíticos con los Fab más relevantes

IC50 de MOR [nM]: NVS IC50 de NVS [nM]

MOR No.: Ruta clásica [humana] normalizada Ruta alternativa (C5 0,1 nM) [humana] normalizada Ruta alternativa (0,025% de suero de cinomólogo) [cinomólogo] normalizada Ruta clásica [humana] normalizada Ruta alternativa (C5 0,1 nM) [humana] normalizada Ruta alternativa (0,025% de suero de cinomólogo) [cinomólogo] normalizada

6525: 190 15 11 185 7 5

6756: 320 80 400 225 70 2500

6757: 500 90 30 305 130 25

6763: 250 45 110 195 20 360

6764: n.t. 50 n.t. n.t 25 30% inh

6776: >4000 40 n.t. 20* 50% inh

6952: 90 20 >1000 110 15 200

6961: 100 25 600 85 15 30

7081: 180 5 40% inh 170 3 10

7082: 70 2.5 1 90 1 1

7083: 100 30 300 140 10 5

7084: 120 10 1.2 160 5 1.5

7086: 35 0.2/0.2 0.2/0.4 85 0.1 0.1

7087: >4000 50 100 775 10 1

7088: 110 15 230 130 5 15

IC50 de MOR [nM]: NVS IC50 de NVS [nM]

MOR No.: Ruta clásica [humana] Ruta alternativa (C5 0,1 nM) [humana] Ruta alternativa (0,025% de suero de cinomólogo) Ruta clásica [humana] Ruta alternativa (C5 0,1 nM) [humana] Ruta alternativa (0,025% de suero de cinomólogo)

normalizada: normalizada [cinomólogo] normalizada normalizada normalizada [cinomólogo] normalizada

7089: 150 75 900 250 20 50

7090: 105 20 10 120 10 1

7091: 82 7 40 110 3 4

7092: 100 1 1.5 90 0.5 1.5

7093: >4000 7 190 230 5 15

7094: 770 40 190

7095*: 120* C5** 1.3** n.t.

*no tan pura como MH **como pMx9_FS

4. Ensayos hemolíticos con Fab maduros

Ruta clásica

(1) Ruta clásica utilizando suero humano al 20%

5 Los Fab maduros se probaron en la ruta clásica con suero humano al 20%. Los derivados de MOR07086, 7091, 7092 y 7093 mostraron la más alta potencia (valores de IC50 en el intervalo bajo de nM). Los descendientes de MOR07091, 7092 y 7093, mostraron una potencia fuertemente mejorada. La Figura 7 muestra ejemplos de ensayos hemolíticos con los derivados de MOR07086, 7091, 7092 y 7093.

(2) Ruta clásica utilizando suero de cinomólogo al 5%

10 También se corrieron ensayos de la ruta del complemento en presencia de suero de cinomólogo al 5% con el objeto de probar la reactividad cruzada. Los derivados de MOR07086, 7091, 7092 y 7093 pudieron inhibir muy efectivamente la lisis de los glóbulos rojos. El control negativo, MOR03207 (anti-Fab de lisozima), no tuvo impacto en la ruta del complemento. Los resultados de estos ensayos se muestran en la Figura 8.

Ruta alternativa

15 (1) Ruta alternativa utilizando C5 humana 100 pM

Los Fab maduros se probaron en el ensayo hemolítico de la ruta alternativa con C5 humana 100 pM. Algunos derivados de MOR06525, 6757, 6763, y 7087, mostraron una potencia mejorada comparada con sus progenitores. Los Fab derivados de MOR07086, 7091, 7092, 7093, y 7094, mostraron la más alta potencia (valores IC50 en el intervalo bajo de nM). Los descendientes de MOR07091, 7092, 7093, y 7094 mostraron una potencia altamente

20 mejorada, muchos de los cuales son más potentes que el anticuerpo de referencia 5G1.1. La Figura 9 muestra los ejemplos de los resultados del ensayo hemolítico para los Fab madurados en afinidad, y 5G1.1.

(2) Ruta alternativa utilizado suero humano al 20%

Los Fab maduros se probaron en el ensayo hemolítico de la ruta alternativa, con suero humano al 20%. Los Fab derivados de MOR07086, 7091, 7092 y 7093, mostraron la mejor actividad inhibidora. Muchos de estos Fab tuvieron

25 una mejor actividad inhibidora que 5G1.1. La Figura 10 muestra ejemplos de los resultados del ensayo hemolítico para los Fab madurados en afinidad, y el anticuerpo de referencia 5G1.1.

(3) Ruta alternativa utilizando C5 de cinomólogo 100 pM.

Los Fab maduros se probaron en el ensayo hemolítico de la ruta alternativa, utilizando C5 de cinomólogo 100 pM agregada al suero agotado en C5 humana al 20%. Los Fab derivados de MOR07091, 7092 y 7093 mostraron la mejor actividad inhibidora; 5G1.1 no reacciona en forma cruzada con la C5 de cinomólogo. La Figura 11 muestra los ejemplos de los resultados del ensayo hemolítico para los Fab madurados en afinidad.

5. Ensayos hemolíticos con las IgG de la línea germinal (formato de lgG1AA humana).

Ruta clásica

(1): Ruta clásica utilizando suero humano al 20%

Los ensayos de la ruta clásica que utiliza suero humano al 20% se corrieron en MOR. Los valores de IC50 de la IgGAA humana de la línea germinal final - MOR08109, 8110, 8113, 8114 fueron mejores o similares a la lgG 5G1.1 de referencia (véase la Figura 12).

(2): Ruta clásica utilizando suero de cinomólogo al 5%

Una comparación con 5G1.1 en la ruta clásica utilizando suero de cinomólogo al 5% no fue aplicable, debido a que este anticuerpo de referencia no reconoce la C5 de cinomólogo. Las lgG de la línea germinal final pudieron inhibir completamente la lisis de los glóbulos rojos inducida por el suero de cinomólogo, excepto MOR08111. Los datos se muestran en la Figura 13.

Ruta alternativa

(1): Ruta alternativa utilizando C5 humana 100 pM.

Las lgG de la línea germinal se probaron en el ensayo hemolítico de la ruta alternativa, utilizando la C5 humana 100 pM. Todos los anticuerpos mostraron una potente actividad inhibidora, con valores de IC50 entre 28 y 128 pM (con la excepción de MOR08111, véase la Figura 14), todos fueron iguales o mejores a 5G1.1. La Figura 14 muestra ejemplos de los resultados del ensayo hemolítico para las lgG.

(2): Ruta alternativa utilizando suero humano al 20% y ELISA de generación de C5a

Las lgG de la línea germinal también se probaron en el ensayo hemolítico de la ruta alternativa con suero humano al 20%. La mayoría de los anticuerpos probados lograron una inhibición completa con valores de IC50 inferiores a 80 nM. EI anticuerpo de referencia 5G1.1 no inhibe completamente la hemólisis en este ensayo. La Figura 15 muestra ejemplos de los resultados del ensayo hemolítico para las lgG. La inhibición de la generación de C5a por parte de las IgG finales fue similar a la 5G1.1 (valores de IC50 en el intervalo bajo de nM).

(3): Ruta alternativa utilizando C5 de cinomólogo 100 pM.

Los ensayos hemolíticos de la ruta alternativa en suero agotado en C5 humana al 20% se reconstituyeron con C5 de cinomólogo 100 pM. La potencia de los candidatos finales de la línea germinal mutada contra la C5 de cinomólogo estuvo dentro de cinco veces aquélla para la C5 humana (valores de IC50 en el intervalo bajo de pM).

(4): Ruta alternativa utilizando suero de cinomólogo al 10%.

En los ensayos hemolíticos de la ruta alternativa utilizando suero de cinomólogo al 10% ([C5] aprox. 40 nM), la potencia de los candidatos de línea germinal mutada fue similar a la potencia en suero humano (el criterio de éxito fue tener una potencia no mayor de cinco veces más débil que para el ensayo funcional utilizando C5 humana).

Ejemplo 9: ELISA de generación de C5a.

Se desarrolló el ELISA de C5a-des-Arg para medir la generación de C5a durante la hemólisis, con el fin de confirmar que los anticuerpos que eran inhibidores en el ensayo hemolítico, también inhibieran la escisión de C5 en C5a y C5b.

Se recubrió una placa Maxisorp con 100 µl/pozo de anti-C5a-des-Arg humana de ratón (US Biologics) a 1 µg/ml, en regulador de recubrimiento (bicarbonato, pH 9,5 - 9,8), y se incubó durante la noche a 4°C. Después de lavar tres veces con PBST, la placa se bloqueo con 300 µl /pozo de diluyente (Synblock, AbD Serotec) durante 2 horas a temperatura ambiente. Después de aspirar la solución de bloqueo, se incubaron 100 µl de muestras o de estándares diluidos con diluyente, durante 1 hora, a temperatura ambiente. Se prepararon los estándares como sigue: se inició con 20 ng/ml de estándar (rC5a-des-Arg), y se prepararon diluciones en serie de 1:4 para una curva de 7 puntos.

Las muestras de los ensayos hemolíticos se diluyeron 1:5 en diluyente (los sobrenadantes del ensayo hemolítico se deben almacenar a -80°C hasta que se utilicen en el ELISA de C5a). Entre tanto, se lavó la placa tres veces con PBST. Se agregaron 100 µl /pozo de 0,4 µg/ml de anticuerpo de detección (biotina-anti-C5a humana de cabra, R&D Systems) diluidos en el diluyente, y después de 1 hora de incubación a temperatura ambiente, se agregaron 100 µl /pozo de Strep-HRP (poli-HRP estreptavidina) diluidos 1:5000 en diluyente HRP (diluyente poli-HRP) durante 30 minutos. Después de lavar cuatro veces con PBST, se agregaron 100 µl /pozo de Sustrato TMB (solución de sustrato Ultra TMB) durante 5 a 10 minutos. La reacción se detuvo con 50 µl /pozo de solución de detención (H2SO4 2 N). Se leyó la absorbancia (A450 - A570) y se analizaron los datos utilizando SoftMax Pro.

Los Fab maduros se probaron para la generación de C5a durante la hemólisis, con el fin de confirmar que la actividad inhibidora se debía al bloqueo de la disociación de C5 en C5a y C5b. Los sobrenadantes de los ensayos hemolíticos en suero humano al 20% se utilizaron para cuantificar la formación de C5a.

Todos los Fab probados bajaron los niveles de C5a hasta la línea base. La Figura 16 muestra ejemplos de los resultados del ELISA de C5a.

Ejemplo 10: ELISA de especificidad sobre C3, C4, C5 humanas, y C5 de cinomólogo.

Todos los Fab purificados se analizaron en un ELISA en solución (el método se describió anteriormente), para enlazamiento a C3, C4, y C5 humanas. Los Fab se incubaron con el antígeno biotinilado sobre una placa NeutrAvidin, y se detectaron a través de la etiqueta de histidina.

Se observó un mejor enlazamiento para casi todos los Fab maduros, comparado con sus progenitores respectivos. No se detectó ningún enlazamiento con los contra objetivos de C4 y C3 humanas hasta Fab 100 nM. Estos resultados impactan los criterios de éxito para la especificidad: el enlazamiento con C5 humana y de cinomólogo, y ningún enlazamiento con las proteínas C3 y C4 humanas del complemento. Los ejemplos para los derivados del Fab progenitor MOR07091 se muestran en la Figura 17.

Ejemplo 11: Ensayos de estabilidad en suero.

Se determinó la actividad de enlazamiento retenida con C5 humana en un ensayo de enlazamiento, en suero humano al 50%, de los anticuerpos de enlazamiento de C5, como se describe a continuación.

Los anticuerpos (formato Fab) se incubaron hasta por 8 horas a 37°C con suero agotado en C5 humana al 100%, o con PBST/BSA al 0,5% (control positivo). Se utilizaron los pozos de una placa de polipropileno bloqueada para la incubación, con el fin de asegurar que no hubiera enlazamiento de los anticuerpos a la superficie durante el largo tiempo de incubación. Las muestras se recolectaron en diferentes momentos, y se almacenaron a -20°C.

Las muestras se probaron en un ELISA en solución sobre placas NeutrAvidin para verificar la capacidad de enlazamiento con C5 humana. A las placas NeutrAvidin, que se bloquearon durante la noche con el ChemiBIocker-PBST 1x, se les agregó 20 µl de diluciones en serie de las diferentes muestras recolectadas. La primera dilución de las muestras fue de 1:2 (concentración final en suero del 50%), seguido por etapas de dilución 1:3. Después de 1 hora de incubación, se lavó la placa tres veces con PBST, y se aplicaron 20 µl de C5 humana biotinilada hasta una concentración de 2,5 µg/ml. Después de 1 hora, se lavó la placa nuevamente cinco veces con PBST (Tween al 0,05%), y se agregó el anticuerpo de detección anti-HIS6-POD para los Fab.

La fluorescencia del sustrato (Quanta Blue o AttoPhos) se midió después de 5 a 10 minutos, y se calculó la actividad de enlazamiento retenida, comparado con la señal máxima respectiva (anticuerpo incubado con PBST/BSA al 0,5%).

Uno de los criterios “obligados” para los anticuerpos de enlazamiento de C5 es retener del 75 al 80% de actividad de enlazamiento en suero humano i) en un ensayo funcional en suero al 10%, y ii) en un ensayo de enlazamiento en suero al 50%. Debido a que los ensayos hemolíticos se corrieron en presencia de suero al 20%, solamente fue necesario mostrar el enlazamiento retenido en un ensayo de enlazamiento en suero al 50%.

Por lo tanto, los Fab finales maduros se incubaron con suero agotado en C5 humana al 100% a 37°C durante 8 horas. Las muestras se recolectaron en diferentes momentos, y se probaron para determinar el enlazamiento con C5 humana en un ELISA en solución. Las muestras de Fab + suero utilizadas para el ELISA se diluyeron hasta una concentración de suero al 50% + Fab 10 nM.

La Figura 18 ilustra los resultados de los anticuerpos finales de enlazamiento de C5 en el formato Fab. Se retuvo del 70 al 93% de la actividad de enlazamiento después de un tiempo de incubación de 8 horas a 37°C en suero al 50%, comparado con la incubación en PBS.

Ejemplo 12: Caracterización mediante colocación del epítopo

Este procedimiento se utilizó para agrupar los Fab anti-C5 humana en diferentes compartimientos del epítopo que se enlazan al mismo epítopo o a un epítopo de superposición de la proteína C5.

Se probó la competición de cada anticuerpo anti-C5 humana biotinilado con cada anticuerpo anti-C5 humana no marcado en un exceso de 100 veces en un ELISA (modo de captura). Se comparó con la señal más alta de cada anticuerpo (Fab biotinilado sin competición).

La C5 humana se capturó por medio de una lgG anti-C5 humana policlonal (US Biological), que se recubrió previamente durante la noche a 4°C sobre placas Maxisorp negras de 384 pozos. AI día siguiente, la placa se lavó dos veces con PBST, y se bloqueó durante 2 horas con BSA - PBST al 3%. Después de lavar tres veces con PBST, se agregaron 20 µl de C5 humana, y se incubó durante 2 horas a temperatura ambiente. La placa se lavó tres veces con PBST antes de agregar los Fab.

Se agregaron 20 µl de Fab no marcado (200 µg/ml ó 400 µg/ml) (exceso de 100 veces) a los pozos de una placa Maxisorp, y posteriormente se agregaron 20 ng/ml o 40 ng/ml del Fab biotinilado. Los Fab biotinilados y no marcados se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. La placa se lavó tres veces con PBST, y se agregó Strep-AP Zymax Estreptavidina-Fosfatasa Alcalina, ZYMED, Código: 43-8322, Lote: 50799648, para la detección del Fab biotinilado que se enlaza a través de C5 a las placas. Se agregó el sustrato AttoPhos (Roche) a las placas, y se leyó la fluorescencia después de 5 a 10 minutos.

Fab progenitores

Se capturó C5 (a través de un anticuerpo policlonal), y se aplicó FabY no marcado en exceso al FabX biotinilado. Se detectó el enlazamiento de FabX biotinilado con C5 humana. Se pudieron definir seis grupos de Fab: Grupo 1: MOR06952, 6961; Grupo 2: MOR06525, 6756, 6757, 6763; Grupo 3: MOR07087; Grupo 4: MOR06764, 6776, 7081; Grupo 5: MOR07089; Grupo 6: MOR07082, 7083, 7084, 7086, 7088, 7090, 7091, 7092, 7093, 7095.

Los Fab también se dividieron en diferentes grupos de enlazamiento del epítopo utilizando un método diferente: se inmovilizó FabX, luego se añadió FabY previamente incubado con C5 biotinilada. Se pudieron definir los siguientes grupos de Fab: Grupo 1: MOR06952, 6961; Grupo 2: MOR06525, 6757, 7083; Grupo 3: MOR07087; Grupo 4: MOR06763; Grupo 5: MOR07081; Grupo 6: MOR07082, 7083, 7084, 7086, 7088, 7091, 7092, 7093 (7089 compite con 7084). Se sacó la conclusión de que, utilizando dos métodos diferentes, se podían obtener resultados similares.

Fab madurados

Con el objeto de completar la caracterización de Fab, se midió la competición de Fab biotinilado con Fab no marcado (aplicado en un exceso de 100 veces) en un ELISA en solución. Los resultados se compararon con la señal más alta (Fab biotinilado sin competición).

Como se muestra en la Figura 19, los Fab biotinilados compiten con los Fab no marcados idénticos, y todos los Fab compiten por el enlazamiento con el mismo epítopo o con un epítopo de superposición. Estos resultados se correlacionan con los datos de colocación del epítopo para los Fab progenitores.

Ejemplo 13: Selección de C5 alfa versus enlazadores de cadena beta, y ensayos de competición

Se llevaron a cabo dos experimentos de ELISA y ensayos hemolíticos para probar si un Fab era un enlazador de cadena alfa o beta como se describe a continuación.

En el primer experimento, Se colocó Fab sobre una placa, y se añadió C5 purificada o sobrenadante de la preparación de C5 quimérica (cadena alfa humana, cadena beta de ratón). Como una siguiente etapa, se aplicó 5G1.1, y se hizo la detección a través de un anticuerpo anti-IgG humano.

En un segundo experimento, se colocó 5G1.1 sobre una placa, se agregó C5 purificada o el sobrenadante de la preparación de la C5 quimérica (cadena alfa humana, cadena beta de ratón), luego Fab, que se detectó con un anticuerpo anti-Myc.

IgG 5G1.1 de referencia reconoce la cadena alfa, y se utilizó para determinar si los Fab generados por MorhpSys compiten con 5G1.1 por el enlazamiento. En los ensayos hemolíticos, se añadió sobrenadante de la preparación de C5 quimérica al suero agotado en C5 humana, y se analizaron los Fab para determinar la inhibición de la hemólisis.

Fab progenitores La Figura 20 muestra los resultados de un experimento de ELISA, donde se colocaron los Fab sobre una placa, se añadió C5 o sobrenadante de una preparación de C5 quimérica (cadena alfa humana y, cadena beta de ratón), luego 5G1.1. La Figura 21 muestra los resultados de un experimento de ELISA, donde se capturaron C5 purificada y sobrenadante de C5 quimérica a través de 5G1.1.

MOR06525, 6756, 6763 eran enlazadores de cadena beta (se enlazan a C5 pero no a C5 quimérica). La mayor parte de los Fab MOR07OXX (derivados a partir de los paneos en solución) son enlazadores de cadena alfa (se enlazan a C5 y a C5 quimérica). MOR06952 y 6961 compiten con 5G1.1, de tal manera que son negativos tanto para C5 como para C5 quimérica, y por lo tanto, son más probablemente enlazadores de cadena alfa como 5G1.1. MOR06757 se comporta como MOR06952 y 6961, es decir, probablemente es un enlazador de cadena alfa. Sin embargo, MOR06757 no inhibe la hemólisis del sobrenadante de C5 quimérica esparcido en el suero agotado en C5, mientras que todos los otros enlazadores de cadena alfa si lo hacen (véase la Figura 22).

En un ensayo hemolítico, se añadió sobrenadante de la preparación de C5 quimérica al suero agotado en C5 humana, y se analizaron los Fab para determinar la inhibición de la hemólisis. MOR06525, 6756, 6757 y 6763 no inhibieron la hemólisis con C5 quimérica, y por Io tanto, podrían ser enlazadores de cadena beta. MOR06952, 6961, 7081, 7082, 7083, 7084, 7086, 7087, 7088, 7089, 7090, 7091, 7092, 7093, 7094, 7095 inhibieron la hemólisis, y por Io tanto, podrían ser enlazadores de cadena alfa.

Ejemplo 14: Resistencia a la proteólisis.

Para investigar la rigidez estructural de los Fab, se realizó la prueba de resistencia de los Fab a la proteólisis mediante termolisina (proteasa bacteriana de termolisina, Calbiochem). Se incubó Fab con termolisina (Fab: termolisina = 3:1 (p/p), volumen de reacción de 8 µL), ya sea a 37°C, o a 55°C (la actividad de la termolisina es óptima a 55°C). Se detuvo reacción mediante la adición de 4 µL de EDTA 0,5 M y 4 µL de regulador para la muestra de LDS 4x (Invitrogen), y las muestras detenidas se corrieron sobre SDS-PAGE al 4 - 12% en condiciones no reductoras. La proteólisis de los Fab se analizó mediante el monitoreo de la desaparición de las bandas de Fab que se visualizaron mediante teñido con Coomassie.

Fab progenitores

Los Fab progenitores se probaron para determinar su resistencia a la proteólisis de termolisina a 37°C y a 55°C. Se utilizó el Fab de un anticuerpo lL-1β humanizado como control. La mayoría de los Fab probados fueron resistentes a la degradación por termólisis a 37°C hasta durante 90 minutos. Para diferenciar adicionalmente la rigidez estructural de los Fab, se realizó la proteólisis a una temperatura más alta de 55°C. Muchos de los Fab analizados se degradaron rápidamente a 55°C (más del 90% de Fab se degradó en el lapso de 30 minutos), mientras que algunos Fab todavía fueron resistentes a la proteólisis después de 90 minutos (por ejemplo, el 7094). Se sugirió que los Fab resistentes tenían una estructura más rígida, de tal manera que podrían mostrar mejores propiedades farmacocinéticas in vivo. Los resultados de estos experimentos se muestran en la Figura 23 y en la Figura 24.

Fab maduros

Se probaron los Fab con la más alta potencia en los ensayos hemolíticos para determinar su sensibilidad a la termolisina a 37°C y a 55°C. En la Figura 25 y en la Figura 26, se muestran los experimentos con derivados de MOR07086, 7091, 7092 y 7093.

Los resultados de estas pruebas revelaron que los derivados de los MOR07091, 7092 y 7093 progenitores, eran menos sensibles a la proteólisis, mientras que los derivados de MOR07086 eran más sensibles a la proteólisis.

Ejemplo 15: Ensayo de deposición del CAM.

Debido a que la cascada del complemento terminal finaliza con la formación del CAM, la inhibición de la formación del CAM fue un indicio adicional para la capacidad del anticuerpo de bloquear la cascada del complemento. Lo lógico era tener una configuración adicional independiente de las células y del comportamiento de las células.

Zymosan (Sigma), que es un carbohidrato insoluble de la pared celular de la levadura, usado especialmente en el inmunoensayo de la ruta alternativa, se colocó para activar la ruta alternativa, y se colocó IgM (Sigma) para activar la ruta clásica para la determinación de la deposición del CAM (complejo de ataque de la membrana). Los Fab se incubaron previamente con suero humano (6% para la RA, 2% para la RC), y se agregaron a la placa. Se calculó el porcentaje (%) de inhibición de la deposición del CAM para cada muestra con relación a la línea base (suero humano tratado con EDTA) y con el control positivo (suero humano), y se utilizó para generar la curva de IC50 con XLFit.

Fab progenitores Se utilizaron los Fab progenitores en diferentes concentraciones, y se determinó la máxima inhibición (si es aplicable, también los valores de IC50) (ejemplo mostrado en la Figura 27). La mayoría de los Fab inhibieron completamente la deposición del CAM, indicando el bloqueo de la escisión de C5. La potencia y clasificación de los Fab fueron similares a los datos de los ensayos hemolíticos.

5 Listado de secuencias

<110> Novartis AG

<120> Composiciones y métodos para anticuerpos dirigidos a la proteína C5 del complemento

<130> 52633-US-P

<140> 61/086.355 10 <141> 2008-08-C5

<160> 297

<170> PatentIn versión 3.3

<210> 1

<211> 5 15 <212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 1

<210> 2

20 <211> 17

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 2

25 <210> 3

<211> 7

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 3

<210> 4

<211> 11

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 4

<210> 5

<211> 7

10 <212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 5

<210> 6

15 <211> 11

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 6

20 <210> 7

<211> 116

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 7

<210> 8

<211> 108

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 8

<210> 9

<211> 446

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 9

<210> 10

<211> 214

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 10

<210> 11

<211> 348

<212> ADN

<213> homo sapiens

<400> 11

<210> 12

<211> 324

<212> ADN

<213> homo sapiens

<400> 12

<210> 13

<211> 1338

<212> ADN

<213> homo sapiens

<400> 13

<210> 14

<211> 642

<212> ADN

<213> homo sapiens

<400> 14

<210> 15

<211> 1338

<212> ADN

<213> homo sapiens

<400> 15

<210> 16

<211> 642

<212> ADN

<213> homo sapiens

<400> 16

<210> 17

<211> 4

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 17

<210> 18

<211> 17

<212> PRT

<213> homo sapiens

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<211> 8

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 19

<210> 20

<211> 11

<212> PRT

<213> homo sapiens

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<210> 21

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<212> PRT

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<210> 22

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<210> 23

<211> 116

<212> PRT 15 <213> homo sapiens

<400> 23

<210> 24

<211> 106

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 24

<210> 25

<211> 446

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 25

<210> 26

<211> 212

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 26

<210> 27

<211> 348

<212> ADN

<213> homo sapiens

<400> 27

<210> 28

<211> 318

<212> ADN

<213> homo sapiens

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<210> 29

<211> 1338

<212> ADN 15 <213> homo sapiens

<400> 29

<210> 30

<211> 636

<212> ADN

<213> homo sapiens

<400> 30

<210> 31

<211> 1338

<212> ADN

<213> homo sapiens

<400> 31

<210> 32

<211> 636

<212> ADN

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<400> 32

<210> 33

<211> 7

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 33

<210> 34

<211> 16

10 <212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 34

<210> 35

15 <211> 7

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 35

<210> 36

<211> 14

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 36

<210> 37

<211> 7

10 <212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 37

<210> 38

15 <211> 9

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 38

20 <210> 39

<211> 117

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 39

<210> 40

<211> 109

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 40

<210> 41

<211> 447

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 41

<210> 42

<211> 215

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 42

<210> 43

<211> 351

<212> ADN

<213> homo sapiens

<400> 43

<210> 44

<211> 327

<212> ADN

<213> homo sapiens

<400> 44

<210> 45

<211> 1341

<212> ADN

<213> homo sapiens

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<210> 46

<211> 645

<212> ADN

<213> homo sapiens

<400> 46

<210> 47

<211> 1341

<212> ADN 10 <213> homo sapiens

<400> 47

<210> 48

<211> 645

<212> ADN

<213> homo sapiens

<400> 48

<210> 49

<211> 17

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 49

<210> 50

<211> 9

10 <212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 50

<210> 51

15 <211> 116

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 51

<210> 52

<211> 106

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 52

<210> 53

<211> 446

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 53

<210> 54

<211> 212

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 54

<210> 55

<211> 348

<212> ADN

<213> homo sapiens

<400> 55

<210> 56

<211> 318

<212> ADN

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10 <211> 1338

<212> ADN

<213> homo sapiens

<400> 57

<210> 58

<211> 636

<212> ADN

<213> homo sapiens

<400> 58

<210> 59

<211> 1338

<212> ADN

<213> homo sapiens

<400> 59

<210> 60

<211> 636

<212> ADN

<213> homo sapiens

<400> 60

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<211> 5

<212> PRT

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<210> 62

<211> 17

10 <212> PRT

<213> homo sapiens

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15 <211> 8

<212> PRT

<213> homo sapiens

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<211> 11

<212> PRT

<213> homo sapiens

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<211> 7

<212> PRT

<213> homo sapiens

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<211> 10

<212> PRT

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<211> 117

<212> PRT

<213> homo sapiens

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<211> 107

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 68

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<211> 447

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 69

<210> 70

<211> 213

<212> PRT

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<400> 70

<210> 71

<211> 351

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<210> 72

<211> 321

<212> ADN 10 <213> homo sapiens

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<211> 1341

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<213> homo sapiens

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<210> 74

<211> 639

<212> ADN

<213> homo sapiens

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<210> 75

<211> 1341

<212> ADN

<213> homo sapiens

<400> 75

<210> 76

<211> 639

<212> ADN

<213> homo sapiens

<400> 76

<210> 77

<211> 17

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 77

<210> 78

<211> 11

10 <212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 78

<210> 79

15 <211> 117

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 79

<210> 80

<211> 108

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 80

<210> 81

<211> 447

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 81

<210> 82

<211> 214

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 82

<210> 83

<211> 351

<212> ADN

<213> homo sapiens

<400> 83

<210> 84

<211> 324

10 <212> ADN

<213> homo sapiens

<400> 84

<210> 85

<211> 1341

<212> ADN

<213> homo sapiens

<400> 85

<210> 86

<211> 642

<212> ADN

<213> homo sapiens

<400> 86

<210> 87

<211> 1341

<212> ADN

<213> homo sapiens

<400> 87

<210> 88

<211> 642

<212> ADN

<213> homo sapiens

<400> 88

<210> 89

<211> 11

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 89

<210> 90

<211> 108

10 <212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 90

<210> 91

<211> 214

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 91

<210> 92

<211> 324

<212> ADN

<213> homo sapiens

<400> 92

<210> 93

<211> 642

<212> ADN 10 <213> homo sapiens

<400> 93

<210> 94

<211> 642

<212> ADN

<213> homo sapiens

<400> 94

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<211> 17

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 95

<210> 96

<211> 117

<212> PRT

<213> homo sapiens

15 <400> 96

<210> 97

<211> 447

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 97

<210> 98

<211> 353

<212> ADN

<213> homo sapiens

<400> 98

<210> 99

<211> 1343

<212> ADN

<213> homo sapiens

<400> 99

<210> 100

<211> 1341

<212> ADN

<213> homo sapiens

<400> 100

<210> 101

<211> 10

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 101

<210> 102

<211> 107

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 102

<210> 103

10 <211> 213

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 103

<210> 104

<211> 321

<212> ADN

<213> homo sapiens

<400> 104

<210> 105

<211> 639

<212> ADN

<213> homo sapiens

10 <400> 105

<210> 106

<211> 639

<212> ADN

<213> homo sapiens

<400> 106

<210> 107

<211> 17

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 107

10 <210> 108

<211> 116

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 108

<210> 109

<211> 446

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 109

<210> 110

<211> 348

<212> ADN

<213> homo sapiens

<400> 110

<210> 111

<211> 1338

10 <212> ADN

<213> homo sapiens

<400> 111

<210> 112

<211> 1338

<212> ADN

<213> homo sapiens

<400> 112

<210> 113

<211> 17

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 113

<210> 114

<211> 116

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 114

<210> 115

<211> 446

10 <212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 115

<210> 116

<211> 348

<212> ADN

<213> homo sapiens

<400> 116

<210> 117

<211> 1338

10 <212> ADN

<213> homo sapiens

<400> 117

<210> 118

<211> 1338

<212> ADN

<213> homo sapiens

<400> 118

<210> 119

<211> 17

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 119

<210> 120

<211> 11

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 120

<210> 121

<211> 116

10 <212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 121

<210> 122

<211> 108

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 122

<210> 123

<211> 442

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 123

<210> 124

<211> 214

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 124

<210> 125

<211> 348

<212> ADN

<213> homo sapiens

<400> 125

<210> 126

<211> 324

<212> ADN 10 <213> homo sapiens

<400> 126

<210> 127

<211> 1326

15 <212> ADN

<213> homo sapiens

<400> 127

<210> 128

<211> 642

<212> ADN

<213> homo sapiens

<400> 128

<210> 129

<211> 1326

<212> ADN

<213> homo sapiens

<400> 129

<210> 130

<211> 642

<212> ADN

<213> homo sapiens

<400> 130

<210> 131

<211> 5

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 131

<210> 132

<211> 17

10 <212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 132

<210> 133

15 <211> 8

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 133

<210> 134

<211> 15

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 134

<210> 135

<211> 7

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 135

<210> 136

<211> 11

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 136

<210> 137

<211> 117

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 137

<210> 138

<211> 112

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 138

<210> 139

<211> 220

<212> PRT 5 <213> homo sapiens

<220>

<221> CARACTERÍSTICA NUEVA

<222> (220)..(220)

<223> X puede ser C, EF, o CEF

10 <400> 139

<210> 140

<211> 217

<212> PRT

<213> homo sapiens

<220>

<221> CARACTERÍSTICA NUEVA

<222> (217)..(217)

<223> X puede ser C5 o A

<400> 140

<210> 141

<211> 351

<212> ADN

<213> homo sapiens

<400> 141

<210> 142

<211> 336

<212> ADN

<213> homo sapiens

10 <400> 142

<210> 143

<211> 658

<212> ADN 15 <213> homo sapiens

<220>

<221> característica nueva

<222> (658)..(658)

<223> n puede ser TGC, GAATTC, o TGCGAATTC

20 <400> 143 <210> 144

<211> 649

<212> ADN 5 <213> homo sapiens

<220>

<221> característica nueva

<222> (649)..(649)

<223> n puede ser TGCAGC o GCC

10 <400> 144

<210> 145

<211> 5

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 145

<210> 146

<211> 17

10 <212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 146

<210> 147

15 <211> 8

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 147

<210> 148

<211> 14

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 148

<210> 149

<211> 7

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 149

<210> 150

<211> 11

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 150

<210> 151

<211> 117

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 151

<210> 152

<211> 111

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 152

<210> 153

<211> 220

<212> PRT 5 <213> homo sapiens

<220>

<221> CARACTERÍSTICA NUEVA

<222> (220)..(220)

<223> X puede ser C, EF, o CEF

10 <400> 153

<210> 154

<211> 216

<212> PRT

<213> homo sapiens

<220>

<221> CARACTERÍSTICA NUEVA

<222> (216)..(216)

<223> X puede ser C5 o A

<400> 154

<210> 155

<211> 351

<212> ADN

<213> homo sapiens

<400> 155

<210> 156

<211> 333

10 <212> ADN

<213> homo sapiens

<400> 156

<210> 157

<211> 658

<212>: ADN 5 <213> homo sapiens

<220>

<221> característica nueva

<222> (658)..(658)

<223> n puede ser TGC, GAATTC, o TGCGAATTC

<210> 158

<211> 646

<212>: ADN 15 <213> homo sapiens

<220>

<221> característica nueva

<222> (646)..(646)

<223> n puede ser TGCAGC o GCC

<400> 158

<210> 159

<211> 5

<212>: PRT 10 <213> homo sapiens

10 <400> 157 <400> 159

<210> 160

<211> 17

15 <212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 160

<210> 161

<211> 7

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 161

<210> 162

<211> 11

10 <212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 162

<210> 163

15 <211> 7

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 163

20 <210> 164

<211> 9

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 164

<210> 165

<211> 116

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 165

<210> 166

<211> 107

10 <212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 166

<210> 167

<211> 219

<212> PRT 5 <213> homo sapiens

<220>

<221> CARACTERÍSTICA NUEVA

<222> (219)..(219)

<223> X puede ser C, EF, o CEF

10 <400> 167

<210> 168

<211> 214

<212> PRT

<213> homo sapiens

<220>

<221> CARACTERÍSTICA NUEVA

<222> (214)..(214)

<223> X puede ser C o A

<400> 168

<210> 169

<211> 348

<212> ADN

<213> homo sapiens

<400> 169

<210> 170

<211> 321

<212> ADN

<213> homo sapiens

<400> 170

<210> 171

<211> 655

10 <212> ADN

<213> homo sapiens

<220>

<221> característica nueva

<222> (655)..(655) 15 <223> n puede ser TGC, TAATTC, o TGCGAATTC

<400> 171 <210> 172

<211> 640

<212> ADN 5 <213> homo sapiens

<220>

<221> característica nueva

<222> (640)..(640)

<223> n puede ser TGC o GCC

10 <400> 172

<210> 173

<211> 5

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 173

<210> 174

<211> 16

10 <212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 174

<210> 175

15 <211> 12

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 175

<210> 176

<211> 14

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 176

<210> 177

<211> 7

10 <212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 177

<210> 178

15 <211> 9

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 178

20 <210> 179

<211> 120

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 179

<210> 180

<211> 109

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 180

<210> 181

<211> 223

<212> PRT 5 <213> homo sapiens

<220>

<221> CARACTERÍSTICA NUEVA

<222> (223)..(223)

<223> X puede ser C, EF, o CEF

10 <400> 181

<210> 182

<211> 214

<212> PRT

<213> homo sapiens

<220>

<221> CARACTERÍSTICA NUEVA

<222> (214)..(214)

<223> X puede ser C5 o A

<400> 182

<210> 183

<211> 360

<212> ADN

<213> homo sapiens

<400> 183

<210> 184

<211> 327

10 <212> ADN

<213> homo sapiens

<400> 184

<210> 185

15 <211> 667

<212> ADN

<213> homo sapiens

<220>

<221> característica nueva

<222> (667)..(667)

<223> n puede ser TGC, TAATTC, o TGCGAATTC

<400> 185

<210> 186

<211> 640

<212> ADN 10 <213> homo sapiens

<220>

<221> característica nueva

<222> (640)..(640)

<223> n puede ser TGCAGC o GCC

15 <400> 186

<210> 187

<211> 116

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 187

<210> 188

<211> 108

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 188

<210> 189

<211> 219

<212> PRT 5 <213> homo sapiens

<220>

<221> CARACTERÍSTICA NUEVA

<222> (219)..(219)

<223> X puede ser C, EF, o CEF

10 <400> 189

<210> 190

<211> 213

<212> PRT

<213> homo sapiens

<220>

<221> CARACTERÍSTICA NUEVA

<222> (213)..(213)

<223> X puede ser C5 o A

<400> 190

<210> 191

<211> 348

<212> ADN

<213> homo sapiens

<400> 191

<210> 192

<211> 324

10 <212> ADN

<213> homo sapiens

<400> 192

<210> 193

<211> 655

<212> ADN 5 <213> homo sapiens

<220>

<221> característica nueva

<222> (655)..(655)

<223> n puede ser TGC, GAATTC, o TGCGAATTC

10 <400> 193

<210> 194

<211> 637

<212> ADN

<213> homo sapiens

<220>

<221> característica nueva

<222> (637)..(637)

<223> n puede ser TGCAGC o GCC

<400> 194

<210> 195

<211> 5

10 <212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 195

<210> 196

15 <211> 17

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 196

<210> 197

<211> 19

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 197

<210> 198

<211> 11

10 <212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 198

<210> 199

15 <211> 7

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 199

20 <210> 200

<211> 9

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 200

<210> 201

<211> 128

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 201

<210> 202

10 <211> 107

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 202

<210> 203

<211> 231

<212>: PRT 5 <213> homo sapiens

<220>

<221> CARACTERÍSTICA NUEVA

<222> (231)..(231)

<223> X puede ser C, EF, o CEF

<210> 204

<211> 214

<212> PRT

<213> homo sapiens

<220>

<221> CARACTERÍSTICA NUEVA

<222> (214)..(214)

<223> X puede ser C o A

<400> 204

<210> 205

<211> 384

<212> ADN

<213> homo sapiens

<400> 205

<210> 206

<211> 321

<212>: ADN 10 <213> homo sapiens

10 <400> 203

<400> 206

<210> 207

<211> 691

15 <212> ADN

<213> homo sapiens

<220>

<221> característica nueva

<222> (691)..(691)

<223> n puede ser TGC, GAATTC, o TGCGAATTC

<400> 207

5 <210> 208

<211> 640

<212> ADN

<213> homo sapiens

<220> 10 <221> característica nueva

<222> (640)..(640)

<223> n puede ser TGC o GCC

<400> 208

<210> 209

<211> 11

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 209

<210> 210

<211> 117

10 <212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 210

<210> 211

<211> 108

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 211

<210> 212

<211> 220

<212> PRT 5 <213> homo sapiens

<220>

<221> CARACTERÍSTICA NUEVA

<222> (220)..(220)

<223> X puede ser C, EF, o CEF

10 <400> 212

<210> 213

<211> 213

<212> PRT

<213> homo sapiens

<220>

<221> CARACTERÍSTICA NUEVA

<222> (213)..(213)

<223> X puede ser C5 o A

<400> 213

<210> 214

<211> 351

<212> ADN

<213> homo sapiens

<400> 214

<210> 215

<211> 324

10 <212> ADN

<213> homo sapiens

<400> 215

<210> 216

<211> 658

<212> ADN 5 <213> homo sapiens

<220>

<221> característica nueva

<222> (658)..(658)

<223> n puede ser TGC, GAATTC, o TGCGAATTC

10 <400> 216

<210> 217

<211> 637

<212> ADN

<213> homo sapiens

<220>

<221> característica nueva

<222> (637)..(637)

<223> n puede ser TGCAGC o GCC

<400> 217

<210> 218

<211> 116

10 <212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 218

<210> 219

<211> 106

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 219

<210> 220

<211> 219

<212> PRT 5 <213> homo sapiens

<220>

<221> CARACTERÍSTICA NUEVA

<222> (219)..(219)

<223> X puede ser C, EF, o CEF

10 <400> 220

<210> 221

<211> 211

<212> PRT

<213> homo sapiens

<220>

<221> CARACTERÍSTICA NUEVA

<222> (211)..(211)

<223> X puede ser C5 o A

<400> 221

<210> 222

<211> 348

<212> ADN

<213> homo sapiens

<400> 222

<210> 223

<211> 318

<212> ADN

<213> homo sapiens

<400> 223

<210> 224

<211> 655

10 <212> ADN

<213> homo sapiens

<220>

<221> característica nueva

<222> (655)..(655) 15 <223> n puede ser TGC, GAATTC, o TGCGAATTC

<400> 224 <210> 225

<211> 631

<212> ADN 5 <213> homo sapiens

<220>

<221> característica nueva

<222> (631)..(631)

<223> n puede ser TGCAGC o GCC

10 <400> 225

<210> 226

<211> 16

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 226

<210> 227

<211> 117

10 <212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 227

<210> 228

<211> 109

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 228

<210> 229

<211> 220

<212>: PRT 5 <213> homo sapiens

<220>

<221> CARACTERÍSTICA NUEVA

<222> (220)..(220)

<223> X puede ser C, EF, o CEF

<210> 230

<211> 214

<212> PRT

<213> homo sapiens

<220>

<221> CARACTERÍSTICA NUEVA

<222> (214)..(214)

<223> X puede ser C5 o A

<400> 230

<210> 231

<211> 351

<212> ADN

<213> homo sapiens

<400> 231

<210> 232

<211> 327

<212>: ADN 10 <213> homo sapiens

10 <400> 229

<400> 232

<210> 233

<211> 658

15 <212> ADN

<213> homo sapiens

<220>

<221> característica nueva

<222> (658)..(658) 20 <223> n puede ser TGC, GAATTC, o TGCGAATTC

<400> 233

<210> 234

<211> 640

5 <212> ADN

<213> homo sapiens

<220>

<221> característica nueva

<222> (640)..(640) 10 <223> n puede ser TGCAGC o GCC

<400> 234

<210> 235

<211> 7

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 235

<210> 236

<211> 16

10 <212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 236

<210> 237

15 <211> 11

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 237

<210> 238

<211> 13

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 238

<210> 239

<211> 7

10 <212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 239

<210> 240

15 <211> 9

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 240

20 <210> 241

<211> 121

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 241

<210> 242

<211> 108

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 242

<210> 243

<211> 224

<212> PRT 5 <213> homo sapiens

<220>

<221> CARACTERÍSTICA NUEVA

<222> (224)..(224)

<223> X puede ser C, EF, o CEF

10 <400> 243

<210> 244

<211> 213

<212> PRT

<213> homo sapiens

<220>

<221> CARACTERÍSTICA NUEVA

<222> (213)..(213)

<223> X puede ser C5 o A

<400> 244

<210> 245

<211> 363

<212> ADN

<213> homo sapiens

<400> 245

<210> 246

<211> 324

10 <212> ADN

<213> homo sapiens

<400> 246

<210> 247

<211> 670

<212> ADN 5 <213> homo sapiens

<220>

<221> característica nueva

<222> (670)..(670)

<223> n puede ser TGC, GAATTC, o TGCGAATTC

10 <400> 247

<210> 248

<211> 637

<212> ADN

<213> homo sapiens

<220>

<221> característica nueva

<222> (637)..(637)

<223> n puede ser TGCAGC o GCC

<400> 248

<210> 249

10 <211> 219

<212> PRT

<213> homo sapiens

<220>

<221> CARACTERÍSTICA NUEVA

15 <222> (219)..(219)

<223> X puede ser C, EF, o CEF

<400> 249

<210> 250

<211> 655

<212> ADN

<213> homo sapiens

<220>

<221> característica nueva

<222> (655)..(655)

<223> n puede ser TGC, GAATTC, o TGCGAATTC

<400> 250

10 <210> 251

<211> 213

<212> PRT

<213> homo sapiens

<220>

15 <221> CARACTERÍSTICA NUEVA

<222> (213)..(213)

<223> X puede ser C5 o A

<400> 251

<210> 252

<211> 637

<212> ADN

<213> homo sapiens

<220>

<221> característica nueva

<222> (637)..(637)

<223> n puede ser TGCAGC o GCC

<400> 252

<210> 253

<211> 117

<212> PRT

<213> homo sapiens

15 <400> 253

<210> 254

5 <211> 220

<212> PRT

<213> homo sapiens

<220>

<221> CARACTERÍSTICA NUEVA

10 <222> (220)..(220)

<223> X puede ser C, EF, o CEF

<400> 254

<210> 255

<211> 351

<212> ADN

<213> homo sapiens

<400> 255

<210> 256

<211> 658

<212> ADN

<213> homo sapiens

10 <220>

<221> característica nueva

<222> (658)..(658)

<223> n puede ser TGC, GAATTC, o TGCGAATTC

<400> 256

<210> 257

<211> 117

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 257

<210> 258

<211> 220

<212>: PRT 5 <213> homo sapiens

<220>

<221> CARACTERÍSTICA NUEVA

<222> (220)..(220)

<223> X puede ser C, EF, o CEF

<210> 259

<211> 351

<212> ADN

<213> homo sapiens

<400> 259

<210> 260

<211> 658

<212>: ADN 10 <213> homo sapiens

10 <400> 258

<220>

<221> característica nueva

<222> (658)..(658)

<223> n puede ser TGC, GAATTC, o TGCGAATTC

15 <400> 260

<210> 261

<211> 107

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 261

<210> 262

<211> 212

<212>: PRT 5 <213> homo sapiens

<220>

<221> CARACTERÍSTICA NUEVA

<222> (212)..(212)

<223> X puede ser C5 o A

<210> 263

<211> 321

<212> ADN

<213> homo sapiens

<400> 263

<210> 264

<211> 634

<212>: ADN 10 <213> homo sapiens

10 <400> 262

<220>

<221> característica nueva

<222> (634)..(634)

<223> n puede ser TGCAGC o GCC

15 <400> 264

<210> 265

<211> 108

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 265

<210> 266

<211> 213

<212> PRT

<213> homo sapiens

<220>

<221> CARACTERÍSTICA NUEVA

<222> (213)..(213)

<223> X puede ser C5 o A

<400> 266

<210> 267

<211> 324

<212> ADN

<213> homo sapiens

<400> 267

<210> 268

<211> 637

<212> ADN

<213> homo sapiens

10 <220>

<221> característica nueva

<222> (637)..(637)

<223> n puede ser TGCAGC o GCC

<400> 268

<210> 269

<211> 108

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 269

<210> 270

<211> 213

<212> PRT 5 <213> homo sapiens

<220>

<221> CARACTERÍSTICA NUEVA

<222> (213)..(213)

<223> X puede ser C5 o A

10 <400> 270

<210> 271

<211> 324

<212> ADN

<213> homo sapiens

<400> 271

5 <210> 272

<211> 637

<212> ADN

<213> homo sapiens

<220> 10 <221> característica nueva

<222> (637)..(637)

<223> n puede ser TGCAGC o GCC

<400> 272

<210> 273

<211> 116

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 273

<210> 274

<211> 219

<212>: PRT 10 <213> homo sapiens

<220>

<221> CARACTERÍSTICA NUEVA

<222> (219)..(219)

<223> X puede ser C, EF, o CEF

<400> 274

<210> 275

<211> 348

<212> ADN

<213> homo sapiens

<400> 275

<210> 276

<211> 655

<212>: ADN 10 <213> homo sapiens

<220>

<221> característica nueva

<222> (655)..(655)

<223> n puede ser TGC, GAATTC, o TGCGAATTC

15 <400> 276

<210> 277

<211> 116

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 277

<210> 278

<211> 219

<212> PRT 5 <213> homo sapiens

<220>

<221> CARACTERÍSTICA NUEVA

<222> (219) .. (219)

<223> X puede ser C, EF, o CEF

10 <400> 278

<210> 279

<211> 348

<212> ADN

<213> homo sapiens

<400> 279

<210> 280

<211> 655

<212> ADN

<213> homo sapiens

10 <220>

<221> característica nueva

<222> (655)..(655)

<223> n puede ser TGC, GAATTC, TGCGAATTC

<400> 280

<210> 281

<211> 116

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 281

<210> 282

<211> 219

<212> PRT 5 <213> homo sapiens

<220>

<221> CARACTERÍSTICA NUEVA

<222> (219) .. (219)

<223> X puede ser C, EF, o CEF

10 <400> 282

<210> 283

<211> 348

<212> ADN

<213> homo sapiens

<400> 283

<210> 284

<211> 655

5 <212> ADN

<213> homo sapiens

<220>

<221> característica nueva

<222> (655)..(655) 10 <223> n puede ser TGC, GAATTC, o TGCGAATTC

<400> 284

<210> 285

<211> 106

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 285

<210> 286

<211> 211

<212> PRT

<213> homo sapiens

10 <220>

<221> CARACTERÍSTICA NUEVA

<222> (211)..(211)

<223> X puede ser C5 o A

<400> 286

<210> 287

<211> 318

<212> ADN

<213> homo sapiens

<400> 287

<210> 288

<211> 631

<212> ADN 10 <213> homo sapiens

<220>

<221> característica nueva

<222> (631)..(631)

<223> n puede ser TGCAGC o GCC

15 <400> 288

<210> 289

<211> 107

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 289

<210> 290

<211> 212

<212>: PRT 5 <213> homo sapiens

<220>

<221> CARACTERÍSTICA NUEVA

<222> (212)..(212)

<223> X puede ser C5 o A

<210> 291

<211> 321

<212> ADN

<213> homo sapiens

<400> 291

<210> 292

<211> 634

<212>: ADN 10 <213> homo sapiens

10 <400> 290

<220>

<221> característica nueva

<222> (634)..(634)

<223> n puede ser TGCAGC o GCC

15 <400> 292

<210> 293

<211> 228

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 293

<210> 294

<211> 103

<212> PRT

<213> homo sapiens

<220>

<221> característica nueva

<222> (103)..(103)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural

<400> 294

<210> 295

<211> 326

<212> PRT

<213> homo sapiens

15 <400> 295

<210> 296

<211> 1676

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 296

<210> 297

<211> 1676

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 297

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo monoclonal aislado dirigido contra la proteína C5 humana, o un fragmento del mismo que se enlaza al antígeno, que comprende

(i)

una CDR1 de cadena pesada que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 1; una CDR2 de cadena pesada que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 2; y una CDR3 de cadena pesada que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 3; y

(ii)

una CDR1 de cadena ligera que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 4; una CDR2 de cadena ligera que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 5; y una CDR3 de cadena ligera que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 6, en donde dicho anticuerpo o fragmento del mismo que se enlaza al antígeno se enlaza a la proteína C5 humana con una KD de 10-10 M o menos de acuerdo a lo medido por resonancia de plasmón superficial.
2.

Un anticuerpo monoclonal aislado, o fragmento que se enlaza al antígeno como se reivindica en la reivindicación 1 que comprende una región variable de cadena pesada que tiene al menos 80%, 90%, 95%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7; y una región variable de cadena ligera que tiene al menos 80%, 90%, 95%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8.
3.

Un anticuerpo monoclonal aislado, o fragmento que se enlaza al antígeno como se reivindica en la reivindicación 1 o la reivindicación 2 que comprende una región variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7; y una región variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:
8.
4.

Un anticuerpo monoclonal aislado, o fragmento que se enlaza al antígeno como se reivindica en cualquier reivindicación anterior que comprende una cadena pesada que tiene al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 9; y una cadena ligera que tiene al menos 95%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 10.
5.

Un anticuerpo monoclonal aislado, o fragmento que se enlaza al antígeno como se reivindica en la reivindicación 4 que comprende una cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9; y una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10.
6.

El anticuerpo como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 que inhibe la ruta alternativa del complemento con una IC50 de 20 - 200 pM como la medida por el ensayo hemolítico in vitro cuando se utiliza suero agotado en C5 humana que se reconstituye con C5 humana 100 pM.
7.

El anticuerpo o un fragmento que se enlaza al antígeno como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo quimérico o humano.
8.

El anticuerpo como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde dicho anticuerpo es un isotipo de IgG.
9.

Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o fragmento que se enlaza al antígeno tal como se reivindica en cualquier reivindicación anterior y un portador farmacéuticamente aceptable.
10.

Un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el anticuerpo o fragmento que se enlaza al antígeno como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
11.

El ácido nucleico como se reivindica en la reivindicación 10, que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una región variable de cadena pesada que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 7, o una región variable de cadena ligera que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 8.
12.

El ácido nucleico como se reivindica en la reivindicación 11 en donde la secuencia de nucleótidos que codifica al polipéptido que comprende una región variable de cadena pesada tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 11, y la secuencia de nucleótidos que codifica al polipéptido que comprende una región variable de cadena ligera tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 12.
13.

Un vector que comprende el ácido nucleico como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12.
14.

Una célula huésped aislada que comprende segmentos de ADN recombinantes que codifican una cadena pesada y una cadena ligera del anticuerpo como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8; en

donde dichos segmentos de ADN están operativamente enlazados a un promotor, y son capaces de ser expresados en dicha célula huésped.
15.

El anticuerpo o fragmento que se enlaza al antígeno como se reivindica en una cualquiera de las

reivindicaciones 1 a 8, o la composición farmacéutica como se reivindica en la reivindicación 9, para uso como un 5 medicamento.
16. El anticuerpo o fragmento que se enlaza al antígeno como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o la composición farmacéutica como se reivindica en la reivindicación 9, para uso en el tratamiento de la degeneración macular relacionada con la edad, asma, artritis, enfermedad coronaria autoinmune, esclerosis múltiple, enfermedad inflamatoria del intestino, lesiones por isquemia-reperfusión, síndrome de Barraquer

10 Simons, lupus sistémico, lupus eritematoso, psoriasis, esclerosis múltiple, enfermedad de Alzheimer, glomerulonefritis, hemoglobinuria nocturna paroxismal (PNH), o MPGN II.
17. El anticuerpo o fragmento que se enlaza al antígeno como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o la composición farmacéutica como se reivindica en la reivindicación 9 para uso en un método para reducir la disfunción de los sistemas inmunológico y hemostático asociada con circulación

15 extracorpórea mediante la administración del anticuerpo o fragmento del mismo que se enlaza al antígeno o la composición farmacéutica a un sujeto que requiera del mismo.