ES2545577T3 - Método mejorado para el tratamiento con bisulfito - Google Patents

Abstract

Método para la conversión de una base citosina en un ácido nucleico a una base uracilo, que comprende las etapas de: a) incubar el ácido nucleico en presencia de iones sulfito de manera que el ácido nucleico se desamina, b) unir el ácido nucleico desaminado a una fase sólida, c) lavar opcionalmente el ácido nucleico desaminado unido a la fase sólida, d) incubar el ácido nucleico unido a la fase sólida desaminado bajo condiciones alcalinas de manera que el ácido nucleico desaminado se desulfona, e) lavar opcionalmente el ácido nucleico unido a la fase sólida desaminado y desulfonado, y f) eluir opcionalmente el ácido nucleico desaminado y desulfonado a partir de la fase sólida.

Description

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1.2 Metodología General

El experimento siguiente demuestra que la PCR que se describe en el instrumento LightCycler® puede utilizarse como herramienta de evaluación del ADN que se trató con bisulfito. Muestra que la combinación iniciador/sonda diseñada da resultados positivos solamente con ADN después del tratamiento con bisulfito. El ADN tratado con bisulfito (en este caso el ADN se trató con bisulfito de acuerdo con el protocolo que se describe en el Ejemplo 2) y el ADN no tratado se amplificaron en paralelo con la utilización de las mismas concentraciones de molde (20ng y 1ng por PCR).

1.3 Análisis por PCR en el Instrumento LightCycler® 1.3.1 Composición de mezcla madre:

Sonda de hibridación LC FastStart DNA Master Hybridation Probe 1x, MgCl2 2 mM, iniciador directo 0.5μM,iniciador inverso 0.5μM, sonda donadora 250nM, sonda aceptora 250nM, molde 10μl, volumen total de la PCR 20μl.

1.3.2 Condiciones de la PCR:

Desnaturalización 10min/95°C 55 ciclos 95°C/10s 65°C/10s - captación de señal 72°C110s Incremento gradual de la temperatura 20°C/s

1.4 Resultado

MDNA/PCR

Tratamiento con bisulfito Valor de CT o Punto de cruce

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20 ng

Sí 30.55

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imagen15 29.72

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imagen17 29.95

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imagen19 30.06

1 ng

Sí 34.7

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imagen21 35.8

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imagen23 34.07

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imagen25 33.86

20 ng

No Sin curva de crecimiento

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imagen27 Sin curva de crecimiento

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imagen29 Sin curva de crecimiento

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imagen31 Sin curva de crecimiento

1 ng

No Sin curva de crecimiento

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imagen33 Sin curva de crecimiento

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imagen35 Sin curva de crecimiento

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imagen37 Sin curva de crecimiento

El resultado muestra puntos de cruce solamente para el ADN que se trató con bisulfito. Por lo tanto, esta PCR es adecuada para evaluar los métodos con bisulfito. Para aquellos con experiencia en la materia está claro que podría utilizarse cualquier PCR como herramienta de evaluación si se garantiza que la combinación iniciador/sonda no reacciona con el ADN antes del tratamiento con bisulfito.

2. Ejemplo 2: Reacción del bisulfito mediante la utilización de partículas de vidrio magnéticas (MGPs)

2.1.1 Desnaturalización del ADN:

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2.4.3 Resultados:

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ADN metilado por Método del Bisulfito que se utilizó

réplicas

Bisulfito PCR Intergen Método MGP

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imagen41 imagen42 Valores de CT o Puntos de cruce

1

30 ng 6 ng 29.90 30.46

2

imagen43 imagen44 30.07 29.86

3

imagen45 imagen46 30.07 30.44

4

imagen47 imagen48 30.14 30.35

5

imagen49 imagen50 30.22 30.24

6

imagen51 imagen52 30.26 30.46

7

imagen53 imagen54 30.31 30.50

8

imagen55 imagen56 30.19 30.54

9

imagen57 imagen58 30.03 30.17

10

imagen59 imagen60 29.85 30.69

1

6ng 1.2 ng 32.49 32.14

2

imagen61 imagen62 32.67 32.60

3

imagen63 imagen64 32.29 32.83

4

imagen65 imagen66 32.87 32.53

5

imagen67 imagen68 32.15 32.90

6

imagen69 imagen70 32.23 32.77

7

imagen71 imagen72 32.59 32.73

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imagen73 imagen74 32.91 33.09

9

imagen75 imagen76 32.46 32.88

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imagen77 imagen78 33.17 32.83

Los valores de CT o puntos de cruce que se calculan durante la PCR en tiempo real son casi idénticos para los dos métodos con bisulfito que se utilizaron, es decir que el desempeño de los métodos es el mismo.

3 Ejemplo 3: Reacción con bisulfito automatizada mediante la utilización de MGPs

3.1 Realización de la reacción con bisulfito: 3.1.1 Desnaturalización del ADN:

Se mezclan y se incuban durante 10 minutos a 37 °C 20 μl de la dilución de ADN metilado (Intergen, que se distribuye por Serologicals Corporation, Norcross, GA, Estados Unidos; Cat S7821) (50 ng/ensayo), 4 μl de una solución de Poli(dA)(concentración 250 ng/ μl) y2.6 μl de NaOH 2 M.

3.1.2 Desaminación de ADN

Se mezclan 26 μl de ADN desnaturalizado con 220 μl de reactivo de bisulfito (bisulfito de sodio 2.5M, hidroquinona125mM, pH 5.0) y se incuban durante 4 horas a 50 °C.

3.1.3 Procesamiento automatizado mediante la utilización del instrumento LC MagNAPure

Se mezclan 250 μl de ADN desaminado con 600 μl de amortiguador de unión (estuche de aislamiento de ADN MagNAPureDNA Isolation Kit I, Roche, Mannheim, Alemania) y 75 μl de la solución de partículas de vidrio magnéticas (estuche de aislamiento de ADN MagNAPure DNA Isolation Kit I, Roche, Mannheim, Alemania) y se incuban durante 15min/ temperatura ambiente con mezclado continuo. Después de eso, las partículas de vidrio magnéticas se lavan tres

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Lista de Referencias

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Claims (1)

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