ES2603559T3

ES2603559T3 - Cadena ligera común de ratón

Info

Publication number: ES2603559T3
Application number: ES12173456.0T
Authority: ES
Inventors: John Mcwhirter; Lynn Macdonald; Sean Stevens; Samuel Davis; Andrew J. Murphy; David R. Buckler
Original assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2010-02-08
Filing date: 2011-02-08
Publication date: 2017-02-28
Anticipated expiration: 2031-02-08
Also published as: JP2022001066A; JP2024156973A; CN105010238A; ME02646B; ES2728942T3; IL267362B; BR122014002928A2; AU2011213585B2; SG183149A1; PT2505654T; EP3540066B1; IL221265B; CN102791866B; JP6666483B2; SMT201600432B; RS67847B1; MX378870B; EP2501817A1; JP5955781B2; PL2501817T5

Abstract

Un ratón modificado genéticamente que expresa dominios variables humanos de cadena ligera y pesada de inmunoglobulina, donde los dominios variables de cadena ligera humana se expresan a partir de una única secuencia genética de región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana (VL/JL) reordenada presente en la línea germinal del ratón que comprende una secuencia de línea germinal de un segmento genético VL y una secuencia de la línea germinal de un segmento genético JL, estando dicha región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana una Vκ 1-39/Jκ reordenada, donde: (a) el ratón carece de un locus de región variable de cadena ligera κ de inmunoglobulina de ratón que es capaz de reordenar y formar un gen que codifica una región variable κ de ratón; (b) el ratón expresa una cadena ligera de inmunoglobulina humana común para una pluralidad de cadenas pesadas humanas, derivada la cadena ligera común de dicha secuencia genética de región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana; (c) el ratón comprende una célula B que expresa un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno de interés, donde el anticuerpo comprende dicha cadena ligera común y una cadena pesada de inmunoglobulina de un reordenamiento de segmentos genéticos (VH) variables de cadena pesada de inmunoglobulina humana que se seleccionan de entre el grupo que consiste en un segmento genético VH2-5, VH3-23, VH3-30, VH4-59, and VH5-51; y (d) el 90-100 % de los segmentos genéticos VH endógenos de ratón reordenados del ratón se sustituyen con una pluralidad de segmentos genéticos VH humanos reordenados.

Description

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variable de cadena pesada.

En una realización, la primera cadena pesada completamente humana contiene una modificación de aminoácidos que reduce su afinidad por la proteína A, y la segunda cadena pesada completamente humana no comprende una 5 modificación que reduzca su afinidad por la proteína A.

También se hace referencia a un anticuerpo o un anticuerpo biespecífico que comprende un dominio humano variable de cadena pesada producido de acuerdo con la invención. En otro aspecto, se proporciona el uso de un ratón que se proporciona para producir un anticuerpo completamente humano o un anticuerpo biespecífico completamente humano.

Cualquiera de las realizaciones y aspectos descritos en el presente documento se pueden utilizar en conjunción con otra cualquiera, a menos de que se indique otra cosa o sea aparente por el contexto. Otras realizaciones llegarán a ser aparentes para los expertos en la técnica a partir de la revisión de la siguiente descripción.

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Descripción detallada

La presente invención no se limita a los métodos particulares, y las condiciones experimentales descritas, por lo que tales métodos y condiciones pueden variar. También se tiene que entender que la terminología que se utiliza en el presente documento es solamente con el fin de describir realizaciones particulares, y no pretende que sea limitante, aunque el ámbito de la presente invención se define por las reivindicaciones.

A menos de que se defina otra cosa, todos los términos y frases utilizados en el presente documento incluyen los significados que lo términos y frases han alcanzado en la técnica, a menos que se indique claramente lo contrario o

25 sea claramente aparente a partir del contexto en el que se utiliza el término o frase. Aunque se puede utilizar en la práctica o ensayo de la presente invención cualquiera de los métodos y materiales similares o equivalentes a los que se describen en el presente documento, se describen ahora métodos y materiales particulares.

El término “anticuerpo”, como se utiliza en el presente documento, incluye moléculas que comprenden cuatro cadenas polipeptídicas, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro. Cada cadena pesada comprende una región variable (VH) de cadena pesada y una región constante (CH) de cadena pesada. La región constante de cadena pesada comprende tres dominios, CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera comprende una región variable (VL) de cadena ligera y una región constante (CL) de cadena ligera. Las regiones VH y VL se pueden subdividir en regiones de hipervariabilidad, llamadas regiones determinantes de

35 complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, llamadas regiones estructurales (FR). Cada VH y VL comprende tres CDR y cuatro FR, dispuestas desde el extremo amino al extremo carboxilo en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 (las CDR de la cadena pesada se pueden abreviar como HCDR1, HCDR2 y HCDR3; las CDR de la cadena ligera se pueden abreviar como LCDR1, LCDR2 y LCDR3). La expresión anticuerpo de “alta afinidad” se refiere a un anticuerpo que tiene una KD con respecto a su epítopo diana de aproximadamente 10-9 M o menor (por ejemplo, aproximadamente 1 x 10-9 M, 1 x 10-10 M, 1 x 10-11 M, o aproximadamente 1 x 10-12 M). En una realización la KD se mide por resonancia de plasmones superficiales, por ejemplo, BIACORE™; en otra realización, la KD se mide por ELISA.

La frase “anticuerpo biespecífico” incluye un anticuerpo capaz de unirse selectivamente a dos o más epítopos. Los

45 anticuerpos biespecíficos generalmente comprenden dos cadenas pesadas no idénticas, que se unen específicamente cada cadena pesada a un epítopo diferente -o bien en dos moléculas diferentes (por ejemplo, epítopos diferentes en dos inmunógenos diferentes) o en la misma molécula (por ejemplo, diferentes epítopos en el mismo inmunógeno). Si el anticuerpo biespecífico es capaz de unirse selectivamente a dos epítopos diferentes (un primer epítopo y un segundo epítopo), la afinidad de la primera cadena pesada por el primer epítopo generalmente será al menos una a dos o tres o cuatro regiones de unión al epítopo, o que se puede asociar con cada cadena pesada y es capaz de unirse a una o ambas cadenas pesadas por uno o ambos epítopos.

El término “célula” incluye cualquier célula que sea adecuada para expresar una secuencia de ácido nucleico recombinante. Las células incluyen las procariotas y eucariotas (célula única o múltiples células), células bacterianas 55 (por ejemplo, cepas de E. coli, Bacillus spp., Streptomyces spp., etc.), células micobacterianas, células fúngicas, células de levaduras (por ejemplo, S. cerevisiae, S. pombe, P. pastoris, P. methanolica, etc.), células vegetales, células de insecto (por ejemplo, SF-9, SF-21, células de insecto infectadas con baculovirus, Trichoplusia ni, etc.), células animales no humanas, células humanas, o fusiones celulares tales como, por ejemplo, hibridomas o cuadromas. En algunas realizaciones, la células es una células humana, de mono, se simio, de hámster, de rata o de ratón. En algunas realizaciones, la célula es eucariota y se selecciona de entre las siguientes células: CHO (por ejemplo, CHO K1, DXB-11 CHO, Veggie-CHO), COS (por ejemplo, COS-7), célula retiniana, Vero, CV1, riñón (por ejemplo, HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK), HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo205, HB 8065, HL60, (por ejemplo, BHK21), Jurkat, Daudi, A431 (epidérmica), CV-1, U937, 3T3, célula L, célula C127, SP2/0, NS-0, MMT 060562, célula de Sertoli, célula BRL 3A, célula HT1080, célula de mieloma, célula tumoral, y las líneas

65 celulares derivadas de una célula mencionada anteriormente. En algunas realizaciones, la célula comprende uno o más genes víricos, por ejemplo, una célula retiniana que expresa un gen vírico (por ejemplo, una célula PER.C6™).

La frase “región determinante de complementariedad” o el término “CDR”, incluye una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de ácido nucleico de genes de inmunoglobulina de un organismo que normalmente (es decir en un animal de tipo silvestre) aparecen entre dos regiones estructurales en una región variable de una cadena ligera o pesada de una molécula de inmunoglobulina (por ejemplo, un anticuerpo o un receptor de célula T). Una

5 CDR se puede codificar, por ejemplo, por una secuencia de la línea germinal o una secuencia reordenada o no reordenada, y, por ejemplo, por una célula B o una célula T intacta o madura. Una CDR puede estar mutada somáticamente (por ejemplo, varía de la secuencia codificada en la línea germinal de un animal), humanizada, y/o modificada con sustituciones, adiciones o eliminaciones de aminoácidos. En algunas circunstancias (por ejemplo, para una CDR3), las CDR pueden codificarse por dos o más secuencias (por ejemplo, secuencias de la línea germinal) que no son contiguas (por ejemplo, en una secuencia de ácido nucleico no reordenada) pero son contiguas en una secuencia de ácido nucleico de célula B, por ejemplo, como resultado de corte y empalme o conexión de las secuencias (por ejemplo, en la recombinación V-D-J para formar una CDR3 de cadena pesada).

El término “conservadora”, cuando se utiliza para describir una sustitución conservadora de aminoácidos, incluye la

15 sustitución de un resto de aminoácido por otro resto de aminoácido que tiene un grupo R en la cadena lateral con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobia). En general, una sustitución conservadora de aminoácidos no cambia sustancialmente las propiedades de interés de una proteína, por ejemplo, la capacidad de una región variable para unirse específicamente a un epítopo diana con una afinidad deseada. Ejemplos de grupos de aminoácidos que tienen cadenas laterales con propiedades químicas similares incluyen cadenas laterales alifáticas tales como glicina, alanina, valina , leucina e isoleucina; cadenas laterales alifáticas-hidroxilo tales como serina y treonina; cadenas laterales que contienen amida tales como asparagina y glutamina; cadenas laterales aromáticas tales como fenilalanina, tirosina, y triptófano; cadenas laterales básicas tales como lisina, arginina e histidina; cadenas laterales ácidas tales como ácido aspártico y ácido glutámico; y cadenas laterales que contienen azufre tales como cisteína y metionina. Los grupos de sustitución conservadora incluyen, por ejemplo

25 valina/leucina/isoleucina, fenilalanina/tirosina, lisina/arginina, alanina/valina, glutamato/aspartato, y asparagina/glutamina. En algunas realizaciones, una sustitución de aminoácidos conservadora puede ser la sustitución de cualquier resto nativo en una proteína con alanina, como se utiliza, por ejemplo, en mutagénesis por selección de alanina. En algunas realizaciones, se produce una sustitución conservadora que tiene un valor positivo en la matriz de probabilidad-log PAM250 desvelada en Gonnet et al. (1992) Exhaustive Matching of the Entire Protein Sequence Database, Science 256:1443-45. En algunas realizaciones, la sustitución es una sustitución moderadamente conservadora donde la sustitución tiene un valor no negativo en la matriz de probabilidad log PAM250.

En algunas realizaciones, las posiciones de los restos en una cadena ligera o una cadena pesada de

35 inmunoglobulina se diferencian por una o más sustituciones conservadoras de aminoácidos. En algunas realizaciones, las posiciones de los restos en una cadena ligera de inmunoglobulina o un fragmento funcional de la misma (por ejemplo, un fragmento que permite la expresión y secreción a partir de, por ejemplo, una célula B) no son idénticas a una cadena ligera cuya secuencia de aminoácidos se enumera en el presente documento, sino que se diferencia por una o más sustituciones conservadoras de aminoácidos.

La frase “proteína de unión al epítopo” incluye una proteína que tiene al menos una CDR y que es capaz de reconocer selectivamente un epítopo, por ejemplo, es capaz de unirse a un epítopo con una KD que es aproximadamente micromolar o más baja (por ejemplo una KD que es aproximadamente 1 x 10-6 M, 1 x 10-7 M, 1 x 10-8 M, 1 x 10-9 M, 1 x 10-10 M, 1 x 10-11 M, o aproximadamente 1 x 10-12 M). Las proteínas se unión al epítopo

45 terapéuticas (por ejemplo, anticuerpos terapéuticos) frecuentemente necesitan una KD que está en el intervalo nanomolar o picomolar.

La frase “fragmento funcional” incluye fragmentos de proteínas de unión al epítopo que se pueden expresar, segregar, y unir específicamente a un epítopo con una KD que está al menos en el intervalo micromolar, intervalo nanomolar, o en el intervalo picomolar.

La expresión “línea germinal” incluye la referencia a una secuencia de ácido nucleico de inmunoglobulina en una célula no mutada somáticamente, por ejemplo, una célula B o una pre-célula B o una célula hematopoyética no mutada somáticamente.

55 La frase “cadena pesada”, o “cadena pesada de inmunoglobulina” incluye una secuencia de una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina de cualquier organismo. Los dominios variables de cadena pesada incluyen tres CDR de cadena pesada y cuatro regiones FR, a menos de que se especifique otra cosa. Los fragmentos de cadenas pesadas incluyen, CDR, CDR y FR, y combinaciones de los mismos. Una cadena pesada típica tiene, siguiendo el dominio variable (desde el extremo N al extremo C), un dominio CH1, una bisagra, un dominio CH2 y un dominio CH3. Un fragmento funcional de una cadena pesada incluye un fragmento que se capaz de reconocer específicamente un epítopo (por ejemplo, que reconoce un epítopo con una KD en el intervalo micromolar, nanomolar, o picomolar), que es capaz de expresarse y segregarse a partir de una célula, y que comprende al menos una CDR.

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El término “identidad” cuando se utiliza en conexión con secuencia, incluye la identidad como se determina por un número de diferentes algoritmos que se conocen en la técnica y que se pueden utilizar para medir la identidad de secuencia de nucleótidos y aminoácidos. En algunas realizaciones escritas en el presente documento, las identidades se determinan utilizando un alineamiento ClustaIW v.1.83 (lento) empleando una falta de huecos abierta

5 de 10,0, una falta de hueco extendida de 0,1, y utilizando una matriz de similitud de Gonnet (MacVector™ 10.0.2, MacVector Inc., 2008). La longitud de las secuencias comparadas con respecto a la identidad de secuencias dependerá de las secuencias en particular, pero en el caso de un dominio constante de cadena ligera, la longitud debería contener una secuencia de longitud suficiente para plegarse en un dominio constante de cadena ligera que es capaz de auto-asociarse para formar un dominio constante de cadena ligera canónico, por ejemplo, que sea capaz de formar dos láminas beta que comprendan láminas beta y capaces de interactuar con al menos un dominio CH de un ser humano o un ratón. En el caso de un dominio CH1, la longitud de secuencia debería contener una secuencia de suficiente longitud para plegarse en un dominio CH1 que sea capaz de formar dos láminas beta que comprenden cadenas beta y capaz de interactuar con al menos un dominio constante de cadena ligera de un ratón o un ser humano.

15 La frase “molécula de inmunoglobulina” incluye dos cadenas pesadas de inmunoglobulina y dos cadenas ligeras de inmunoglobulina. Las cadenas pesadas pueden ser idénticas o diferentes, y las cadenas ligeras pueden ser idénticas o diferentes.

La frase “cadena ligera” incluye una secuencia de cadena ligera de inmunoglobulina de cualquier organismo, y a menos de que se especifique otra cosa incluye cadenas ligeras κ y λ humanas y una VpreB, así como cadenas ligeras equivalentes. Los dominios variables (VL) de cadena ligera incluyen típicamente tres CDR de cadena ligera y cuatro regiones estructurales (FR), a menos de que se especifique otra cosa. En general, una cadena ligera de longitud completa incluye, desde el extremo amino al término carboxilo, un dominio VL que incluye FR1-CDR1-FR2

25 CDR2-FR3-CDR3-FR4, y un dominio constante de cadena ligera. Las cadenas ligeras incluyen, por ejemplo, las que no se unen selectivamente ni a un primer ni a un segundo epítopo unido selectivamente a una proteína de unión al epítopo en la que aparecen. Las cadenas ligeras también incluyen las que se unen y reconocen, o ayudan a la cadena pesada en la unión y reconocimiento, de uno o más epítopos unidos a una proteína de unión al epítopo en la que aparecen. Las cadenas ligeras comunes se las derivadas de un segmento genético Vκ1-39Jκ5 humano o un segmento genético Vκ3-20Jκ1 humano, e incluyen versiones mutadas somáticamente (por ejemplo, de afinidad madurada) de las mismas.

La frase “intervalo micromolar” pretende significar 1-999 micromolar; la frase “intervalo nanomolar” pretende significar 1-999 nanomolar; la frase “intervalo picomolar” pretende significar 1-999 picomolar.

35 La frase “mutado somáticamente” incluye la referencia a una secuencia de ácido nucleico de una célula B que ha sufrido un cambio de clase, donde la secuencia del ácido nucleico de una región variable de inmunoglobulina (por ejemplo, un dominio variable de cadena pesada que incluye una secuencia CDR o FR de cadena pesada) de la célula B que está cambiada de clase no es idéntica a la secuencia de ácido nucleico de la célula B antes del cambio de clase, tal como por ejemplo, una diferencia en una secuencia de ácido nucleico de CDR o estructural entre una célula B que no ha sufrido un cambio de clase y una célula B que ha sufrido un cambio de clase. “Mutado somáticamente” incluye la referencia a secuencias de ácido nucleico de células B de afinidad madurada que no son idénticas a las correspondientes secuencias de la región variable de inmunoglobulina correspondiente en las células B que no son de afinidad madurada (es decir, secuencias en el genoma de las células germinales). La frase “mutado

45 somáticamente” incluye también la referencia a una secuencia de ácido nucleico de una región variable de inmunoglobulina de una célula B tras la exposición de la célula B a un epítopo de interés, donde la secuencia de ácido nucleico se diferencia de la secuencia de ácido nucleico correspondiente antes de la exposición de la célula B al epítopo de interés. La frase “mutado somáticamente” se refiere a secuencias de los anticuerpos que se han generado en un animal, por ejemplo, un ratón que tiene secuencias de ácido nucleico de la región variable de inmunoglobulina humana, en respuesta a un desafío inmunógeno, y que resultan de los procesos de selección operativos inherentemente en tal animal.

La expresión “no reordenado”, en referencia a una secuencia de ácido nucleico, incluye secuencias de ácidos nucleicos que existen en la línea germinal de una célula animal.

55 La frase “dominio variable” incluye una secuencia de aminoácidos de una cadena ligera o pesada (modificadas como se desee) que comprende las siguientes regiones de aminoácidos, en una secuencia desde el extremo N al extremo C (a menos de que se indique otra cosa): FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.

Cadena ligera común

Los esfuerzos anteriores para producir proteínas de unión al epítopo multiespecíficas útiles, por ejemplo, anticuerpos biespecíficos, fueron obstaculizados por una variedad de problemas que frecuentemente compartían un paradigma común: la selección o manipulación in vitro de secuencias para modificar racionalmente, o para modificar por medio

65 de ensayo y error, un formato adecuado para emparejar una inmunoglobulina humana biespecífica heterodimérica. Desafortunadamente, la mayoría si no todas las estrategias de modificación in vitro proporcionan extensamente fijos

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para adquirir mutaciones somáticas, se retiene el amplificador(es) adecuado en el ratón. Por ejemplo, al modificar un locus κ de ratón para sustituir los segmentos genéticos de la región variable κ endógena de ratón con segmentos genéticos humanos de la región variable κ, se mantienen funcionalmente el amplificador intrónico κ el ratón y el amplificador κ 3’ del ratón, o no se destruyen.

5 El ratón modificado genéticamente proporcionado expresa un repertorio limitado de cadenas ligeras (variables humanas, constantes de ratón) quiméricas inversas asociadas con una diversidad de cadenas pesadas (variables humanas, constantes de ratón) quiméricas inversas. En varias realizaciones, los segmentos genéticos endógenos del ratón de la región variable de cadena ligera κ se eliminan y se sustituyen con segmentos genéticos humanos de la región variable de cadena ligera, unidos operativamente al gen de la región constante κ endógena del ratón. En realizaciones para maximizar la hipermutación somática de los segmentos genéticos humanos de la región variable de cadena ligera, el amplificador intrónico κ de ratón y el amplificador κ 3’ de ratón se mantienen. En varias realizaciones, el ratón también comprende un locus de cadena ligera λ no funcional, o una eliminación del mismo o una eliminación que convierte el locus en incapaz para producir una cadena ligera λ.

15 Por lo tanto un ratón modificado genéticamente que expresa dominios variables de cadena ligera y pesada de inmunoglobulina humana, donde los dominios variable de cadena ligera humana se expresan a partir de una única secuencia genética de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana (VL/JL) reordenada presente en la línea germinal del ratón que comprende una secuencia de la línea germinal de un segmento genético VL y una secuencia germinal de un segmento genético JL, siendo dicha región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana reordenada Vκ1-39/Jκ, donde:

(a) el ratón carece de un locus de la región variable de cadena ligera κ de inmunoglobulina endógena de ratón que sea capaz de reordenar y formar un gen que codifique una región variable κ de ratón;

25 (b) el ratón expresa una cadena ligera de inmunoglobulina humana común para una pluralidad de cadenas pesadas humanas, derivada la cadena ligera común de dicha secuencia genética de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana.

(c): el ratón comprende una célula B que expresa un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno de interés, donde el anticuerpo comprende dicha cadena ligera común y una cadena pesada de inmunoglobulina derivada de un reordenamiento de segmento genéticos variables (VH) de cadena pesada de inmunoglobulina humana que se seleccionan de entre el grupo que consiste en un segmento genético VH2-5, VH3-23, VH3-30, VH4-59, y VH5-51; y

(d): el 90-100 % de los segmentos genéticos VH de ratón endógenos no reordenados del ratón se sustituyen con una pluralidad de segmentos genéticos VH humanos no reordenados.

35 El ratón modificado genéticamente que se proporciona, en varias realizaciones, comprende un locus de la región variable de cadena ligera que carece de un segmento genético endógeno del ratón variable de cadena ligera y que comprende un segmento genético humano variable, en una realización una secuencia V/J humana reordenada, unida operativamente a una región constante de ratón, donde el locus es capaz de sufrir una hipermutación somática, y donde el locus expresa una cadena ligera que comprende la secuencia V/J humana unida a una región constante de ratón. Por lo tanto, en varias realizaciones, el locus comprende un amplificador 3’ κ de ratón, que se correlación con un nivel normal, o de tipo silvestre, de hipermutación somática.

El ratón modificado genéticamente en varias realizaciones cuando se inmuniza con un antígeno de interés genera

45 células B que muestran una diversidad de reordenamientos de regiones variables de cadena pesada de inmunoglobulina humana que expresa y funciona con una cadena ligera reordenada, incluyendo realizaciones donde la cadena ligera comprende regiones variables de cadena ligera humana que comprenden, por ejemplo, 1 a 5 mutaciones somáticas. En varias realizaciones, las cadenas ligeras humanas que se expresan de esta manera son capaces de asociarse y expresarse con cualquier región variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana que se expresa en el ratón.

Proteínas de unión al epítopo que se unen a más de un epítopo

Las composiciones y métodos descritos en el presente documento se pueden utilizar para producir proteínas de

55 unión que se unan a más de un epítopo con alta afinidad, por ejemplo, anticuerpos biespecíficos. Las ventajas de la invención incluyen la capacidad para seleccionar adecuadamente cadenas de cadena pesada de inmunoglobulina de alta unión (por ejemplo, afinidad madurada) cada una de las cuales se asociará con una única cadena ligera.

La síntesis y expresión de proteínas de unión biespecífica han sido problemáticas, en parte debido a problemas asociados con la identificación de una cadena ligera adecuada que se pueda asociar y expresar con dos cadenas pesadas diferentes, y en parte debido a problemas de aislamiento. Los métodos y composiciones descritos en el presente documento permiten un ratón modificado genéticamente para seleccionar, por medio de procesos por otra parte naturales, una cadena ligera adecuada que se puede asociar y expresar con más de una cadena pesada, que incluye cadenas pesadas que están mutadas somáticamente (por ejemplo, de afinidad madurada). Las secuencias

65 VL y VH humanas de células B adecuadas de ratones inmunizados como se describen en el presente documento que expresan anticuerpos de afinidad madurada que tienen cadenas pesadas quiméricas inversas (es decir,

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ejemplo, que comprende una o más hipermutaciones somáticas) a partir de un ratón como se describe en el presente documento, identificar una segunda secuencia de nucleótidos VH humana (VH2) de afinidad madurada (por ejemplo que comprende una o más hipermutaciones somáticas) a partir de un ratón como se describe en el presente documento, clonar la VH1 en fase con una cadena pesada humana que carece de una modificación del 5 determinante de proteína A como se describe en el documento US 2010/0331527A1 para formar una cadena pesada 1 (HC1), clonar la VH2 en fase con una cadena pesada humana que comprende un determinante de Proteína A como se describe en el documento US 2010/0331527A1 para formar una cadena pesada 2 (HC2), introducir un vector de expresión que comprende HC1 y el mismo vector de expresión o uno diferente que comprende HC2 dentro de la célula, donde la célula también expresa una cadena ligera de inmunoglobulina humana que comprende un Vκ1-39 humano/Jκ5 humano o un Vκ3 humano/20Jκ1 humano que se fusiona a un dominio humano constante de cadena ligera, permitiendo a la célula que exprese una proteína de unión al epítopo biespecífica que comprende un dominio VH codificado por VH1 y un dominio VH codificado por VH2, y aislar la proteína de unión al epítopo biespecífica en base a su capacidad diferencial de unirse a la Proteína A en comparación con la proteína de unión al epítopo homodimérica. En un caso específico, la HC1 es una IgG1, y la

15 HC2 es una IgG1 que comprende la modificación H95R (IMGT; H435R por EU) y comprende además la modificación Y96F (IMGT; Y436F por EU). En un caso, el domino VH codificado por VH1, el dominio VH codificado por VH2, o ambos, están mutados somáticamente.

Genes VH humanos que se expresan con una VL humana común

Se expresó una variedad de regiones variables humanas a partir de anticuerpos de afinidad madurada producidos contra cuatro antígenos diferentes con o su cadena ligera equivalente, o al menos una de las cadenas ligeras humanas seleccionadas de entre Vκ1-39Jκ5 humana, Vκ3-20Jκ1 humana o VpreBJλ5 humana (véase el Ejemplo 1). Para los anticuerpos contra cada uno de los antígenos, se emparejaron satisfactoriamente las cadenas pesadas de

25 alta afinidad mutadas somáticamente de diferentes familias genéticas con las regiones de la línea germina humana Vκ1-39Jκ5 y Vκ3-20Jκ1 reordenadas y se segregaron a partir de las células que expresaban las cadenas pesada y ligera. Para Vκ1-39Jκ5 y Vκ3-20Jκ1, se expresaron favorablemente los dominios VH derivados de las siguientes familias VH humanas: 1-2, 1-8, 1-24, 2-5, 3-7, 3-9, 3-11, 3-13, 3-15, 3-20, 3-23, 3-30, 3-33, 3-48, 4-31, 4-39, 4-59, 551, y 6-1. Por lo tanto un ratón que se modifica para expresar un repertorio limitado de dominios VL humanos a partir de uno o ambos Vκ1-39Jκ5 y Vκ3-20Jκ1 generará una población diversa de dominios VH humanos mutados somáticamente a partir de locus VH modificado genéticamente para sustituir los segmentos genéticos VH de ratón por segmentos genéticos VH humanos.

Los ratones modificados genéticamente para expresar cadenas pesadas de inmunoglobulina quiméricas inversas

35 (variables humanas, constantes de ratón) que se asocian con una única cadena ligera reordenada (por ejemplo, una Vκ1-39/J o una Vκ3-20/J), cuando se inmunizan con un antígeno de interés, generan células B que comprenden una diversidad de reordenamientos del segmento V humano y expresan una diversidad de anticuerpos específicos de antígeno con alta afinidad con diversas propiedades con respecto a su capacidad para bloquear la unión del antígeno a su ligando, y con respecto a su capacidad para unirse a variantes del antígeno (véase los Ejemplos 5 a 10).

Por lo tanto, los ratones y métodos descritos en el presente documento son útiles para producir y seleccionar dominios humanos variables de cadena pesada, que incluyen dominios humanos variables de cadena pesada mutados somáticamente, que resultan de una diversidad de reordenamientos, que muestran una amplia variedad de

45 afinidades (que incluyen las que muestran una KD de aproximadamente nanomolar o menos), una amplia variedad de especificidades (que incluyen la unión a diferentes epítopos del mismo antígeno), y que se asocian y se expresan con la misma o sustancialmente la misma región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana.

Se proporcionan los siguientes ejemplos para describir a los expertos habituados en la técnica cómo hacer y utilizar los métodos y composiciones de la invención, y no se pretende limitar el ámbito de lo que los inventores consideran como su invención. Se han hecho esfuerzos para asegurar la precisión con respecto a los números utilizados (por ejemplo, cantidades, temperaturas, etc.) pero se debería contar con algunos errores experimentales o desviaciones. A menos de que se indique otra cosa, las partes son partes por peso, el peso molecular es el peso molecular medio, las temperaturas se indican en grados Celsius, y la presión es o está cerca de la atmosférica.

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Ejemplos

Ejemplo 1. Identificación de las regiones humanas variables de cadena pesada que se asocian con regiones humanas variables de cadena ligera seleccionadas

Se construyó un sistema de expresión in vitro para determinar si una única cadena ligera de la línea germinal humana reordenada podría co-expresarse con cadenas pesadas humanas de anticuerpos humanos específicos de antígeno.

65 Los métodos para generar anticuerpos humanos en ratones modificados genéticamente se conocen (véase por ejemplo, el documento US 6.596.541, Regeneron Pharmaceuticals, VELOCIMMUNE®). La tecnología

VELOCIMMUNE® implica la generación de un ratón modificado genéticamente que tiene un genoma que comprende regiones variables de cadena pesada y ligera humanas unidas operativamente a loci endógenos del ratón de región constante de manera que el ratón produce un anticuerpo que comprende una región variable humana y una región constante de ratón en respuesta a la estimulación antigénica. El ADN que codifica las regiones 5 variables de las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos producidos a partir de un ratón VELOCIMMUNE® son completamente humanos. Inicialmente los anticuerpos quiméricos de alta afinidad que se aíslan tienen una región variable humana y una región constante de ratón. Como se describe posteriormente, los anticuerpos se caracterizan y seleccionan por sus características deseables, que incluyen la afinidad, selectividad, epítopo, etc. Las regiones constantes de ratón se sustituyen con una región constante humana deseable para generar un anticuerpo

10 completamente humano que contiene un isotipo no IgM, por ejemplo, un IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 de tipo silvestre o modificado. Aunque la región constante que se selecciona puede variar de acuerdo con el uso específico, las características de unión al antígeno con alta afinidad y la especificidad de diana residen en la región variable.

Se inmunizó un ratón VELOCIMMUNE® con un factor de crecimiento que promueve la angiogénesis (Antígeno C) y

15 se asilaron los anticuerpos humanos específicos del antígeno y se secuenciaron con respecto a la utilización del gen V utilizando las técnicas de referencia que se reconocen en la técnica. Los anticuerpos seleccionados se clonaron en regiones constantes de cadena pesada y ligera humanas y se seleccionaron 69 cadenas pesadas para emparejarlas con una de las tres cadenas ligeras humanas: (1) la cadena ligera κ equivalente unida a una región constante κ humana, (2) una línea germinal Vκ1-39Jκ5 humana reordenada unida a una región constante κ humana,

20 o (3) una línea germinal Vκ3-20Jκ1 humana reordenada unida a una región constante κ humana. Cada pareja de cadena pesada y cadena ligera se co-transfectaron en células CHO-K1 utilizando técnicas de referencia. La presencia de anticuerpo en el sobrenadante se detectó por anti-IgG humana en un ensayo ELISA. El título de anticuerpos (ng/ml) se determinó para cada pareja de cadena pesada/cadena ligera y se compararon los títulos de las diferentes cadenas ligeras de la línea germinal reordenadas con los títulos obtenidos con la molécula de

25 anticuerpo parental (es decir, la cadena pesada emparejada con la cadena ligera equivalente) y se calculó el porcentaje del título nativo (Tabla 1). VH: gen variable de cadena pesada. ND: expresión no detectada bajo las condiciones experimentales en curso.

Tabla 1

VH: Título de anticuerpos (ng/ml) Porcentaje del título nativo

LC Equivalente: Vκ1-39Jκ5 Vκ3-20Jκ1 Vκ1-39Jκ5 Vκ3-20Jκ1

3-15: 63 23 11 36,2 17,5

1-2: 103 53 ND 51,1 -

3-23: 83 60 23 72,0 27,5

3-33: 15 77 ND 499,4 -

4-31: 22 69 17 309,4 76,7

3-7: 53 35 28 65,2 53,1

-: 22 32 19 148,8 89,3

1-24: 3 13 ND 455,2 -

3-33: 1 47 ND 5266,7 -

3-33: 58 37 ND 63,1 -

-: 110 67 18 60,6 16,5

3-23: 127 123 21 96,5 16,3

3-33: 28 16 2 57,7 7,1

3-23: 32 50 38 157,1 119,4

-: 18 45 18 254,3 101,7

3-9: 1 30 23 2508,3 1900,0

3-11: 12 26 6 225,9 48,3

1-8: 16 ND 13 - 81,8

Tabla 1

VH: Título de anticuerpos (ng/ml) Porcentaje del título nativo

LC Equivalente: Vκ1-39Jκ5 Vκ3-20Jκ1 Vκ1-39Jκ5 Vκ3-20Jκ1

3-33: 54 81 10 150,7 19,1

-: 34 9 ND 25,9
-

3-20: 7 14 54 203,0 809,0

3-33: 19 38 ND 200,5 -

3-11: 48 ND 203 - 423,6

-: 11 23 8 212,7 74,5

3-33: 168 138 182 82,0 108,2

3-20: 117 67 100 57,5 86,1

3-23: 86 61 132 70,7 154,1

3-33: 20 12 33 60,9 165,3

4-31: 69 92 52 133,8 75,0

3-23: 87 78 62 89,5 71,2

1-2: 31 82 51 263,0 164,6

3-23: 53 93 151 175,4 285,4

-: 11 8 17 75,7 151,4

3-33: 114 36 27 31,6 23,4

3-15: 73 39 44 53,7 59,6

3-33: 1 34 16 5600,0 2683,3

3-9: 58 112 57 192,9 97,6

3-33: 67 20 105 30,1 157,0

3-33: 34 21 24 62,7 70,4

3-20: 10 49 91 478,4 888,2

3-33: 66 32 25 48,6 38,2

3-23: 17 59 56 342,7 329,8

-: 58 108 19 184,4 32,9

-: 68 54 20 79,4 29,9

3-33: 42 35 32 83,3 75,4

-: 29 19 13 67,1 43,9

3-9: 24 34 29 137,3 118,4

3-30/33: 17 33 7 195,2 43,1

3-7: 25 70 74 284,6 301,6

3-33: 87 127 ND 145,1 -

6-1: 28 56 ND 201,8 -

3-33: 56 39 20 69,9 36,1

Tabla 1

VH: Título de anticuerpos (ng/ml) Porcentaje del título nativo

LC Equivalente: Vκ1-39Jκ5 Vκ3-20Jκ1 Vκ1-39Jκ5 Vκ3-20Jκ1

3-33: 10 53 1 520,6 6,9

3-33: 20 67 10 337,2 52,3

3-33: 11 36 18 316,8 158,4

3-23: 12 42 32 356,8 272,9

3-33: 66 95 15 143,6 22,5

3-15: 55 68 ND 123,1 -

-: 32 68 3 210,9 10,6

1-8: 28 48 ND 170,9 -

3-33: 124 192 21 154,3 17,0

3-33: 0 113 ND 56550,0 -

3-33: 10 157 1 1505,8 12,5

3-33: 6 86 15 1385,5 243,5

3-23: 70 115 22 163,5 31,0

3-7: 71 117 21 164,6 29,6

3-33: 82 100 47 122,7 57,1

3-7: 124 161 41 130,0 33,5

En un experimento similar, los ratones VELOCIMMUNE® se inmunizaron con varios antígenos diferentes y las cadenas pesadas de anticuerpos humanos específicos del antígeno que se seleccionaron, se ensayaron en cuanto a su capacidad para emparejarse con diferentes cadenas ligeras de la línea germinal humana reordenadas (como se 5 ha descrito anteriormente). Los antígenos que se utilizan en este experimento incluyen una enzima implicada en la homeostasis del colesterol (Antígeno A), una hormona sérica implicada en la regulación de la homeostasis de la glucosa (Antígeno B), un factor de crecimiento que promociona la angiogénesis (Antígeno C) y un receptor de superficie celular (Antígeno D). Los anticuerpos específicos del antígeno se aislaron de los ratones en cada grupo de inmunización y se clonaron y secuenciaron las regiones variables de la cadena ligera y la cadena pesada. A partir de 10 la secuencia de las cadenas pesada y ligera, se determinó el uso del gen V y las cadenas pesadas que se seleccionaron se emparejaron con su cadena ligera equivalente o con la región de la línea germinal Vκ1-39Jκ5 humana reordenada. Cada par de cadenas pesada/ligera se co-transfectó en células CHO-K1 y se detectó la presencia del anticuerpo en el sobrenadante por anti-IgG humana en un ensayo ELISA. El título de anticuerpos (g/ml) se determinó para cada emparejamiento de cadena pesada/cadena ligera y se compararon los títulos de

15 diferentes cadenas ligeras de la línea germinal humana reordenadas con los títulos obtenidos con la molécula de anticuerpo parental (es decir, la cadena pesada emparejada con la cadena ligera equivalente) y se calculó el porcentaje del título nativo (Tabla 2). VH: gen variable de cadena pesada. Vκ: gen variable de cadena ligera κ. ND: expresión no detectada bajo las condiciones experimentales en curso.

Tabla 2

Antígeno: Anticuerpo VH Vκ Título (mg/ml) Porcentaje de títulonativo

VH Sola: VH + Vκ VH + Vκ1-39Jκ5

A: 320 1-18 2-30 0,3 3,1 2,0 66

321: 2-5 2-28 0,4 0,4 1,9 448

334: 2-5 2-28 0,4 2,7 2,0 73

Tabla 2

Antígeno: Anticuerpo VH Vκ Título (mg/ml) Porcentaje de títulonativo

VH Sola: VH + Vκ VH + Vκ1-39Jκ5

313: 3-13 3-15 0,5 0,7 4,5 670

316: 3-23 4-1 0,3 0,2 4,1 2174

315: 3-30 4-1 0,3 0,2 3,2 1327

318: 4-59 1-17 0,3 4,6 4,0 86

B: 257 3-13 1-5 0,4 3,1 3,2 104

283: 3-13 1-5 0,4 5,4 3,7 69

637: 3-13 1-5 0,4 4,3 3,0 70

638: 3-13 1-5 0,4 4,1 3,3 82

624: 3-23 1-17 0,3 5,0 3,9 79

284: 3-30 1-17 0,3 4,6 3,4 75

653: 3-33 1-17 0,3 4,3 0,3 7

268: 4-34 1-27 0,3 5,5 3,8 69

633: 4-34 1-27 0,6 6,9 3,0 44

C: 730 3-7 1-5 0,3 1,1 2,8 249

728: 3-7 1-5 0,3 2,0 3,2 157

691: 3-9 3-20 0,3 2,8 3,1 109

749: 3-33 3-15 0,3 3,8 2,3 62

750: 3-33 1-16 0,3 3,0 2,8 92

724: 3-33 1-17 0,3 2,3 3,4 151

706: 3-33 1-16 0,3 3,6 3,0 84

744: 1-18 1-12 0,4 5,1 3,0 59

696: 3-11 1-16 0,4 3,0 2,9 97

685: 3-13 3-20 0,3 0,5 3,4 734

732: 3-15 1-17 0,3 4,5 3,2 72

694: 3-15 1-5 0,4 5,2 2,9 55

743: 3-23 1-12 0,3 3,2 0,3 10

742: 3-23 2-28 0,4 4,2 3,1 74

693: 3-23 1-12 0,5 4,2 4,0 94

Tabla 2

Antígeno: Anticuerpo VH Vκ Título (mg/ml) Porcentaje de títulonativo

VH Sola: VH + Vκ VH + Vκ1-39Jκ5

D: 136 3-23 2-28 0,4 5,0 2,7 55

155: 3-30 1-16 0,4 1,0 2,2 221

163: 3-30 1-16 0,3 0,6 3,0 506

171: 3-30 1-16 0,3 1,0 2,8 295

145: 3-43 1-5 0,4 4,4 2,9 65

49: 3-48 3-11 0,3 1,7 2,6 155

51: 3-48 1-39 0,1 1,9 0,1 4

159: 3-7 6-21 0,4 3,9 3,6 92

169: 3-7 6-21 0,3 1,3 3,1 235

134: 3-9 1-5 0,4 5,0 2,9 58

141: 4-31 1-33 2,4 4,2 2,6 63

142: 4-31 1-33 0,4 4,2 2,8 67

Los resultados obtenidos de estos experimentos demuestran que las cadenas pesadas de alta afinidad, mutadas somáticamente de diferentes familias genéticas eran capaces de emparejarse con regiones Vκ1-39Jκ5 y Vκ3-20Jκ1 5 de la línea germinal humana reordenadas y se segregaban a partir de la célula como una molécula de anticuerpo normal. Como se muestra en la Tabla 1, el título de anticuerpo aumentaba aproximadamente un 61 % (42 de 69) de cadenas pesadas cuando se emparejaban con la cadena ligera Vκ1-39Jκ5 humana reordenada y aproximadamente un 29 % (20 de 69) de cadenas pesadas cuando se emparejaban con la cadena ligera Vκ3-20Jκ1 humana reordenada en comparación con la cadena ligera equivalente el anticuerpo parental. Para aproximadamente el 20 % 10 (14 de 69) de las cadenas pesadas, ambas cadenas ligeras de la línea germinal humana reordenadas conferían un aumento de la expresión cuando se compara a la cadena ligera equivalente del anticuerpo parental. Como se muestra en la Tabla 2, la región Vκ1-39Jκ5 de la línea germinal humana reordenada confería un aumento de la expresión de varias cadenas pesadas específicas para un intervalo de diferentes clases de antígeno en comparación con la cadena ligera equivalente de los anticuerpos parentales. El título de anticuerpo aumentaba más de dos veces 15 en aproximadamente un 35 % (15/43) de las cadenas pesadas en comparación con la cadena ligera equivalente de los anticuerpos parentales. Para dos cadenas pesadas (315 y 316), el aumento era mayor de diez veces en comparación con el anticuerpo parental. En todas las cadenas pesadas que mostraban un aumento de la expresión con respecto a la cadena ligera equivalente del anticuerpo parental, la familia tres de cadenas pesadas (VH3) estaba sobre-representada en comparación con otras familias genéticas de la región variable de cadena pesada. Esto

20 demuestra una relación favorable de las cadenas pesadas VH3 humanas para emparejarse con cadenas ligeras Vκ3-20Jκ1 y VpreB/Jλ5 de la línea germinal humana reordenadas.

Ejemplo 2. Generación de un locus de cadena ligera de la línea germinal humana reordenado

25 Se produjeron varios vectores dirigidos a la cadena ligera de la línea germinal humana reordenada utilizando la tecnología VELOCIGENE® (véase, por ejemplo, la Pat. de EE. UU. Nº 6.586.251 y Valenzuela et al. (2003) Highthroughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech. 21(6):652-659) para modificar clones de Cromosoma Artificial Bacteriano (BAC) genómicos de ratón 302g12 y 254m04 (Invitrogen). Utilizando estos dos clones BAC, se modificaron construcciones genómicas para que

30 contuvieran una única región de cadena ligera de la línea germinal humana reordenada y se insertó en un locus de cadena ligera κ endógena que se había modificado genéticamente previamente para eliminar los segmentos genéticos de unión y variable κ endógena.

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Tabla 5

Anticuerpos con cadena ligera Vκ1-39Jκ5 común

Anticuerpo: % de bloqueo de perlas marcadas con Antígeno E % de bloqueo de Antígeno E en solución

2949G: 97,1 73,7

2950: 96,2 81,9

2950G: 89,8 31,4

2952: 96,1 74,3

2952G: 93,5 39,9

2954: 93,7 70,1

2954G: 91,7 30,1

2955: 75,8 30,0

2955G: 71,8 ND

2964: 92,1 31,4

2964G: 94,6 43,0

2978: 98,0 95,1

2978G: 13,9 94,1

2982: 92,8 78,5

2982G: 41,9 52,4

2985: 39,5 31,2

2985G: 2,0 5,0

2987: 81,7 67,8

2987G: 26,6 29,3

2996: 87,3 55,3

2996G: 95,9 38,4

2997: 93,4 70,6

2997G: 9,7 7,5

3004: 79,0 48,4

3004G: 60,3 40,7

3005: 97,4 93,5

3005G: 77,5 75,6

3010: 98,0 82,6

3010G: 97,9 81,0

3011: 87,4 42,8

3011G: 83,5 41,7

3012: 91,0 60,8

3012G: 52,4 16,8

3013: 80,3 65,8

3013G: 17,5 15,4

Tabla 5

Anticuerpos con cadena ligera Vκ1-39Jκ5 común

3014: 63,4 20,7

3014G: 74,4 28,5

3015: 89,1 55,7

3015G: 58,8 17,3

3016: 97,1 81,6

3016G: 93,1 66,4

3017: 94,8 70,2

3017G: 87,9 40,8

3018: 85,4 54,0

3018G: 26,1 12,7

3019: 99,3 92,4

3019G: 99,3 88,1

3020: 96,7 90,3

3020G: 85,2 41,5

3021: 74,5 26,1

3021G: 81,1 27,4

3022: 65,2 17,6

3022G: 67,2 9,1

3023: 71,4 28,5

3023G: 73,8 29,7

3024: 73,9 32,6

3024G: 89,0 10,0

3025: 70,7 15,6

3025G: 76,7 24,3

3027: 96,2 61,6

3027G: 98,6 75,3

3028: 92,4 29,0

3028G: 87,3 28,8

3030: 6,0 10,6

3030G: 41,3 14,2

3032: 76,5 31,4

3032G: 17,7 11,0

3033: 98,2 86,1

3033G: 93,6 64,0

Tabla 5

Anticuerpos con cadena ligera Vκ1-39Jκ5 común

3036: 74,7 32,7

3036G: 90,1 51,2

3041: 95,3 75,9

3041G: 92,4 51,6

3042: 88,1 73,3

3042G: 60,9 25,2

3043: 90,8 65,8

3043G: 92,8 60,3

Tabla 6

Anticuerpos con cadena ligera Vκ3-20Jκ1 común

2968: 97,1 73,3

2968G: 67,1 14,6

2969: 51,7 20,3

2969G: 37,2 16,5

2970: 92,2 34,2

2970G: 92,7 27,2

2971: 23,4 11,6

2971G: 18,8 18,9

2972: 67,1 38,8

2972G: 64,5 39,2

2973: 77,7 27,0

2973G: 51,1 20,7

2974: 57,8 12,4

2974G: 69,9 17,6

2975: 49,4 18,2

2975G: 32,0 19,5

2976: 1,0 1,0

2976G: 50,4 20,4

Ejemplo 8. Determinación de la capacidad de bloqueo de los anticuerpos con cadena ligera común específica del antígeno por ELISA

5 Los anticuerpos con cadena ligera común humanos que aparecen contra al Antígeno E se ensayaron en cuento a su capacidad para bloquear la unión del Antígeno E a una superficie revestida con el Ligando Y en un ensayo ELISA.

Se revistió con Ligando Y placas de 96 pocillos a una concentración de 2 g/ml en PBS y se incubaron durante una 10 noche seguido por el lavado 4 veces con PBS con un 0,05 % de Tween-20. La placa se bloqueó entonces con PBS

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Tabla 7

Anticuerpos con cadena ligera Vκ1-39Jκ5 común

Anticuerpo: % de bloqueo del Antígeno E en solución

2985: 10,5

2985G: ND

2987: 31,4

2987G: ND

2996: 29,3

2996G: ND

2997: 48,7

2997G: ND

3004: 16,7

3004G: 3,5

3005: 87,2

3005G: 54,3

3010: 74,5

3010G: 84,6

3011: 19,4

3011G: ND

3012: 45,0

3012G: 12,6

3013: 39,0

3013G: 9,6

3014: 5,2

3014G: 17,1

3015: 23,7

3015G: 10,2

3016: 78,1

3016G: 37,4

3017: 61,6

3017G: 25,2

3018: 40,6

3018G: 14,5

3019: 94,6

3019G: 92,3

3020: 80,8

3020G: ND

3021: 7,6

Tabla 7

Anticuerpos con cadena ligera Vκ1-39Jκ5 común

Anticuerpo: % de bloqueo del Antígeno E en solución

3021G: 20,7

3022: 2,4

3022G: 15,0

3023: 9,1

3023G: 19,2

3024: 7,5

3024G: 15,2

3025: ND

3025G: 13,9

3027: 61,4

3027G: 82,7

3028: 40,3

3028G: 12,3

3030: ND

3030G: 9,5

3032: ND

3032G: 13,1

3033: 77,1

3033G: 32,9

3036: 17,6

3036G: 24,6

3041: 59,3

3041G: 30,7

3042: 39,9

3042G: 16,1

3043: 57,4

3043G: 46,1

Tabla 8

Anticuerpos con cadena ligera Vκ3-20Jκ1 común

Anticuerpo: % de bloqueo del Antígeno E en solución

2968: 68,9

2968G: 15,2

2969: 10,1

2969G: 23,6

imagen18

Tabla 9

Anticuerpos con cadena ligera Vκ1-39Jκ5 común

Anticuerpo: 100 nM de Antígeno E

KD (nM): T1/2 (min)

2948: 8,83 28

2948G: 95,0 1

2949: 3,57 18

2949G: 6,37 9

2950: 4,91 17

2950G: 13,6 5

2952: 6,25 7

2952G: 7,16 4

2954: 2,37 24

2954G: 5,30 9

2955: 14,4 6

2955G: 12,0 4

2964: 14,8 6

2964G: 13,0 9

2978: 1,91 49

2978G: 1,80 58

2982: 6,41 19

2982G: 16,3 9

2985: 64,4 9

2985G: 2,44 8

2987: 21,0 11

2987G: 37,6 4

2996: 10,8 9

2996G: 24,0 2

2997: 7,75 19

2997G: 151 1

3004: 46,5 14

3004G: 1,93 91

3005: 2,35 108

3005G: 6,96 27

3010: 4,13 26

3010G: 2,10 49

Tabla 9

Anticuerpos con cadena ligera Vκ1-39Jκ5 común

Anticuerpo: 100 nM de Antígeno E

KD (nM): T1/2 (min)

3011: 59,1 5

3011 G: 41,7 5

3012: 9,71 20

3012G: 89,9 2

3013: 20,2 20

3013G: 13,2 4

3014: 213 4

3014G: 36,8 3

3015: 29,1 11

3015G: 65,9 0

3016: 4,99 17

3016G: 18,9 4

3017: 9,83 8

3017G: 55,4 2

3018: 11,3 36

3018G: 32,5 3

3019: 1,54 59

3019G: 2,29 42

3020: 5,41 39

3020G: 41,9 6

3021: 50,1 6

3021 G: 26,8 4

3022: 25,7 17

3022G: 20,8 12

3023: 263 9

3023G: 103 5

3024: 58,8 7

3024G: 7,09 10

3025: 35,2 6

3025G: 42,5 8

3027: 7,15 6

3027G: 4,24 18

3028: 6,89 37

imagen19

Tabla 10

Anticuerpos con cadena ligera Vκ3-20Jκ1 común

Anticuerpo: 100 nM de Antígeno E

KD (nM): T1/2 (min)

2975G: 134 1

2976: 6,73 10

2976G: 656 8

Ejemplo 10. Determinación de especificidades de unión de anticuerpos con cadena ligera común específica de antígeno por ensayo Luminex™

5 Se ensayaron los anticuerpos con cadena ligera común anti-Antígeno E en cuanto a su capacidad para unirse al ECD del Antígeno E y variantes de ECD Antígeno E, que incluyen el ortólogo de mono Cynomolgus (Mf Antígeno E), que se diferencia de la proteína humana en aproximadamente el 10 % de sus restos de aminoácidos; una eliminación mutante de Antígeno E que carece de los últimos 10 aminoácidos del extremo C del ECD (Antígeno ECT); y dos mutantes que contenían una sustitución de alanina en localizaciones sospechosas de interacción con el

10 Ligando Y (Antígeno E-Ala1 y Antígeno E-Ala2). Las proteínas de Antígeno E se produjeron en células CHO que contenían cada una un marcador myc-myc-His en el extremo C.

Para los estudios de unión, se capturó la proteína Antígeno E ECD o una variante de la proteína (descrito anteriormente) de 1 ml de medio de cultivo por incubación durante 2 h a temperatura ambiente con 1 x 106 perlas

15 microesféricas (Luminex™) revestidas covalentemente con un anticuerpo monoclonal anti-myc (MAb 9E10, línea celular de hibridoma CRL-1729™; ATCC, Manassas, VA).

Las perlas se lavaron entonces con PBS antes de su uso. Los sobrenadantes que contenían los anticuerpos con cadena ligera común anti-Antígeno E se diluyeron 1:4 en tampón y se añadieron a placas filtro de 96 pocillos. Un 20 sobrenadante falso sin anticuerpo se utilizó como control negativo. Las perlas que contenían las proteínas de Antígeno E capturado se añadieron entonces a las muestras de anticuerpo (3000 perlas por pocillo) y se incubaron durante una noche a 4 ºC. Al día siguiente, las perlas de muestra se lavaron y se detectó la unión de anticuerpos con cadena ligera común con un anticuerpo anti-IgG humana conjugado con R-ficoeritrina. La intensidad de fluorescencia de las perlas (aproximadamente se contaron 100 perlas para cada muestra de anticuerpo unido a cada

25 proteína de Antígeno E) se midió con un analizador basado en citometría Luminex™, y se registró la intensidad media de fluorescencia (MFI) para al menos 100 perlas que se contaron por interacción perla/anticuerpo. Los resultados se muestran en las Tablas 11 y 12.

Tabla 11

Anticuerpos con cadena ligera Vκ1-39Jκ5 común

Anticuerpo: Intensidad media de fluorescencia (MFI)

Antígeno E-ECD: Antígeno E-CT Antígeno E-Ala1 Antígeno E-Ala2 Mf Antígeno E

2948: 1503 2746 4953 3579 1648

2948G: 537 662 2581 2150 863

2949: 3706 4345 8169 5678 5142

2949G: 3403 3318 7918 5826 5514

2950: 3296 4292 7756 5171 4749

2950G: 2521 2408 7532 5079 3455

2952: 3384 1619 1269 168 911

2952G: 3358 1001 108 55 244

2954: 2808 3815 7114 5039 3396

2954G: 2643 2711 7620 5406 3499

Tabla 11

Anticuerpos con cadena ligera Vκ1-39Jκ5 común

Anticuerpo: Intensidad media de fluorescencia (MFI)

2955: 1310 2472 4738 3765 1637

2955G: 1324 1802 4910 3755 1623

2964: 5108 1125 4185 346 44

2964G: 4999 729 4646 534 91

2978: 6986 2800 14542 10674 8049

2978G: 5464 3295 11652 8026 6452

2982: 4955 2388 13200 9490 6772

2982G: 3222 2013 8672 6509 4949

2985: 1358 832 4986 3892 1669

2985G: 43 43 128 244 116

2987: 3117 1674 7646 5944 2546

2987G: 3068 1537 9202 6004 4744

2996: 4666 1917 12875 9046 6459

2996G: 2752 1736 8742 6150 4873

2997: 5164 2159 12167 8361 5922

2997G: 658 356 3392 2325 1020

3004: 2794 1397 8542 6268 3083

3004G: 2753 1508 8267 5808 4345

3005: 5683 2221 12900 9864 5868

3005G: 4344 2732 10669 7125 5880

3010: 4829 1617 2642 3887 44

3010G: 3685 1097 2540 3022 51

3011: 2859 2015 7855 5513 3863

3011 G: 2005 1072 6194 4041 3181

3012: 3233 2221 8543 5637 3307

3012G: 968 378 3115 2261 1198

3013: 2343 1791 6715 4810 2528

3013G: 327 144 1333 1225 370

3014: 1225 1089 5436 3621 1718

3014G: 1585 851 5178 3705 2411

3015: 3202 2068 8262 5554 3796

3015G: 1243 531 4246 2643 1611

3016: 4220 2543 8920 5999 5666

3016G: 2519 1277 6344 4288 4091

Tabla 11

Anticuerpos con cadena ligera Vκ1-39Jκ5 común

Anticuerpo: Intensidad media de fluorescencia (MFI)

3017: 3545 2553 8700 5547 5098

3017G: 1972 1081 5763 3825 3038

3018: 2339 1971 6140 4515 2293

3018G: 254 118 978 1020 345

3019: 5235 1882 7108 4249 54

3019G: 4090 1270 4769 3474 214

3020: 3883 3107 8591 6602 4420

3020G: 2165 1209 6489 4295 2912

3021: 1961 1472 6872 4641 2742

3021G: 2091 1005 6430 3988 2935

3022: 2418 793 7523 2679 36

3022G: 2189 831 6182 3051 132

3023: 1692 1411 5788 3898 2054

3023G: 1770 825 5702 3677 2648

3024: 1819 1467 6179 4557 2450

3024G: 100 87 268 433 131

3025: 1853 1233 6413 4337 2581

3025G: 1782 791 5773 3871 2717

3027: 4131 1018 582 2510 22

3027G: 3492 814 1933 2596 42

3028: 4361 2545 9884 5639 975

3028G: 2835 1398 7124 3885 597

3030: 463 277 1266 1130 391

3030G: 943 302 3420 2570 1186

3032: 2083 1496 6594 4402 2405

3032G: 295 106 814 902 292

3033: 4409 2774 8971 6331 5825

3033G: 2499 1234 6745 4174 4210

3036: 1755 1362 6137 4041 1987

3036G: 2313 1073 6387 4243 3173

3041: 3674 2655 8629 5837 4082

3041G: 2519 1265 6468 4274 3320

3042: 2653 2137 7277 5124 3325

3042G: 1117 463 4205 2762 1519

Tabla 11

Anticuerpos con cadena ligera Vκ1-39Jκ5 común

Anticuerpo: Intensidad media de fluorescencia (MFI)

3043: 3036 2128 7607 5532 3366

3043G: 2293 1319 6573 4403 3228

Tabla 12

Anticuerpos con cadena ligera Vκ3-20Jκ1 común

Anticuerpo: Intensidad media de fluorescencia (MFI)

2968: 6559 3454 14662 3388 29

2968G: 2149 375 9109 129 22

2969: 2014 1857 7509 5671 3021

2969G: 1347 610 6133 4942 2513

2970: 5518 1324 14214 607 32

2970G: 4683 599 12321 506 31

2971: 501 490 2506 2017 754

2971G: 578 265 2457 2062 724

2972: 2164 2158 8408 6409 3166

2972G: 1730 992 6364 4602 2146

2973: 3527 1148 3967 44 84

2973G: 1294 276 1603 28 44

2974: 1766 722 8821 241 19

2974G: 2036 228 8172 135 26

2975: 1990 1476 8669 6134 2468

2975G: 890 315 4194 3987 1376

2976: 147 140 996 1079 181

2976G: 1365 460 6024 3929 1625

Los sobrenadantes con anticuerpos con cadena ligera común anti-Antígeno E mostraban una unión altamente específica a las perlas unidas al Antígeno E-ECD. En estas perlas, el sobrenadante falso de control negativo daba

5 como resultado una señal insignificante (< 10 MFI) cuando se combina con la muestra de perlas con el Antígeno E-ECD, mientras que los sobrenadantes que contenían anticuerpos con cadena ligera común anti-Antígeno E mostraban una fuerte señal de unión (MFI media de 2627 para los 98 sobrenadantes con anticuerpo; MFI > 500 para 91/98 muestras de anticuerpo).

10 Como se mide en cuento a la capacidad de los anticuerpos seleccionados con cadena ligera común anti-Antígeno E, se determinó la unión relativa de los anticuerpos con las variantes. Las cuatro variantes de Antígeno E cuando se capturaron con perlas Luminex™ anti-myc como se describe anteriormente para los estudios de unión con el Antígeno E-ECD nativo, y se determinaron las relaciones de unión relativas (MFIvariante/MFIAntígeno E-ECD). Para los 98 sobrenadantes con anticuerpos con cadena ligera común que se muestran en las Tablas 11 y 12, las relaciones

15 medias (MFIvariante/MFIAntígeno E-ECD) son diferentes para cada variante, probablemente reflejando diferentes cantidades de captura de las proteínas en las perlas (relaciones medias de 0,61, 2,9, 2,0, y 1,0 para Antígeno ECT, Antígeno E-Ala1, Antígeno E-Ala2 y Mf Antígeno E, respectivamente). Para cada variante de proteína, la unión

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Claims

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