ES2547142T3

ES2547142T3 - Cadena ligera común de ratón

Info

Publication number: ES2547142T3
Application number: ES11703799.4T
Authority: ES
Inventors: John Mcwhirter; Lynn Macdonald; Sean Stevens; Samuel Davis; Andrew J. Murphy; David R. Buckler
Original assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2010-02-08
Filing date: 2011-02-08
Publication date: 2015-10-02
Anticipated expiration: 2031-02-08
Also published as: JP6960005B2; IL221265A0; EP2505654B1; HUE045591T2; IL290085B2; MX378870B; US20120192300A1; EP2505654A1; HUE029785T2; US20130302836A1; LT3540066T; PL2505654T5; JP2020096633A; RS54367B2; KR102283195B1; CN105010238A; NZ631363A; RS67847B1; EP2501817A1; KR20190077630A

Abstract

Un ratón que comprende: (a) una sustitución en el locus endógeno del ratón de la región variable de cadena ligera κ de inmunoglobulina de los segmentos genéticos endógenos del ratón de la región variable de cadena ligera κ de inmunoglobulina con un único segmento genético Vκ 1-39/Jκ humano reordenado o un único segmento genético Vκ 3-20/Jκ humano reordenado, donde el segmento genético humano está unido operativamente a un gen constante κ endógeno del ratón y donde el ratón carece de un locus de la región variable de cadena ligera κ de inmunoglobulina de ratón que sea capaz de reordenar y formar un gen que codifique una región variable κ ; y, (b) una sustitución de 90-100% del locus del gen endógeno del ratón de la región variable de cadena pesada con una pluralidad de segmentos genéticos humanos de la región variable de la cadena pesada, donde los segmentos genéticos humanos de la región variable de cadena pesada están unidos operativamente a un gen endógeno del ratón constante de cadena pesada, y los segmentos genéticos humanos de la región variable de cadena pesada son capaces de reordenar y formar un gen quimérico humano/ratón de cadena pesada reordenado.

Description

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También se proporciona un método para producir un anticuerpo que se une a un antígeno de interés que comprende inmunizar el ratón que se proporciona con un antígeno de interés, obtener una secuencia genética de la región variable de inmunoglobulina del ratón y emplear la secuencia genética de la región variable de inmunoglobulina para producir un anticuerpo que se une al antígeno.

5 También se hace referencia un método para producir un anticuerpo que se proporciona, que comprende la expresión en una única célula de (a) una primera secuencia genética VH de un ratón inmunizado como se describe en el presente documento fusionada con una secuencia genética CH humana; (b) una secuencia genética VL de un ratón inmunizado como se describe en el presente documento fusionada con una secuencia genética CL humana; y, (c)

10 mantener la células bajo condiciones suficientes para expresar un anticuerpo humano completo, y aislar el anticuerpo. En un caso, la célula comprende una segunda secuencia genética VH de un segundo ratón inmunizado como se describe en el presente documento fusionada con una secuencia genética CH humana, la primera secuencia genética codifica un dominio VH que reconoce un primer epítopo, y la segunda secuencia genética VH codifica un dominio VH que reconoce un segundo epítopo, donde el primer epítopo y el segundo epítopo no son

15 idénticos.

También se hace referencia a un método para producir una proteína de unión a un epítopo, que comprende la exposición de un ratón como se describe en el presente documento con un inmunógeno que comprende un epítopo de interés, mantener el ratón bajo condiciones suficientes para que el ratón genere una molécula de inmunoglobulina

20 que se une específicamente al epítopo de interés, y aislar la molécula de inmunoglobulina que se une específicamente al epítopo de interés; donde la proteína de unión al epítopo comprende una cadena pesada que comprende una VH humana mutada somáticamente y una CH de ratón, asociada con una cadena ligera que comprende una CL de ratón y una VL humana derivada de un segmento genético V1-39J5 humano o V3-20J1 humano.

25 También se hace referencia a una célula que expresa una proteína de unión al epítopo, donde la célula comprende:

(a) una secuencia de nucleótido VL humana que codifica un dominio VL humano derivado de un segmento genético V1-39J5 humano o V3-20J1 humano, donde la secuencia de nucleótido está fusionada (directamente o mediante un enlazador) con una secuencia ADNc de un dominio constante de cadena ligera de inmunoglobulina 30 humana (por ejemplo, una secuencia ADN de un dominio constante  humano); y, (b) una primera secuencia de nucleótido VH que codifica un dominio VH humano derivado de una primera secuencia de nucleótido VH humana, donde la primera secuencia de nucleótido VH humana está fusionada (directamente o mediante un enlazador) a una secuencia ADNc de dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina humana; donde la proteína de unión al epítopo reconoce un primer epítopo. En un caso, la proteína de unión al epítopo se une al primer epítopo con una

35 constante de disociación menor de 10-6 M, menor de 10-8 M, menor de 10-9 M, menor de 10-10 M, menor de 10-11 M, o menor de 10-12 M.

En un caso, la célula comprende una segunda secuencia de nucleótido VH humana que codifica un segundo dominio VH humano, donde la segunda secuencia VH humana está fusionada (directamente o mediante un

40 enlazador) a una secuencia ADNc de un dominio constante de la cadena pesada de inmunoglobulina humana, y donde el segundo dominio VH humano no reconoce específicamente el primer epítopo (por ejemplo, presenta una constante de disociación de, por ejemplo, 10-6 M, 10-5 M, 10-4 M, o más), y donde la proteína de unión al epítopo reconoce el primer epítopo y el segundo epítopo, y donde las primera y segunda cadenas pesadas de inmunoglobulina se asocian cada una con una cadena ligera idéntica de (a).

45 En un caso, el segundo dominio VH se une al segundo epítopo con una constante de disociación que es menor de 10-6 M, menor de 10-8 M, menor de 10-9 M, menor de 10-10 M, menor de 10-11 M, o menor de 10-12 M.

En un caso, la proteína de unión al epítopo comprende una primera cadena pesada de inmunoglobulina y una

50 segunda cadena pesada de inmunoglobulina, que se asocian cada una de ellas con una cadena ligera idéntica derivada de un segmento genético VL humano que se selecciona de entre un segmento genético V1-39J5 humano o V3-20J1 humano, donde la primera cadena pesada de inmunoglobulina se une al primer epítopo con una constante de disociación en un intervalo nanomolar a picomolar, la segunda cadena pesada de inmunoglobulina se une al segundo epítopo con una constante de disociación en el intervalo nanomolar a picomolar, el primer epítopo

55 y el segundo epítopo no son idénticos, la primera cadena pesada de inmunoglobulina no se une al segundo epítopo

o se une al segundo epítopo con una constante de disociación más débil que el intervalo micromolar (por ejemplo, en el intervalo milimolar), la segunda cadena pesada de inmunoglobulina no se une al primer epítopo o se une al primer epítopo con una constante de disociación más débil que el intervalo micromolar (por ejemplo, en el intervalo milimolar), y uno o más de las VL, la VH de la primera cadena pesada de inmunoglobulina, y la VH de la segunda

60 cadena pesada de inmunoglobulina, están mutadas somáticamente.

En un caso, la primera cadena pesada de inmunoglobulina comprende un resto de unión a la proteína A, y la segunda cadena pesada de inmunoglobulina carece de resto de unión a la proteína A.

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En un caso, la célula se selecciona de entre CHO, COS, 293, HeLa, y una célula retiniana que expresa una secuencia de ácido nucleico vírico (por ejemplo, una célula PERC.6™).

También se hace referencia a un anticuerpo quimérico inverso, que comprende una VH humana y un dominio

5 constante de cadena pesada de ratón, una VL humana y un dominio constante de cadena ligera de ratón, donde el anticuerpo se produce por un proceso que comprende la inmunización de un ratón como se describe en el presente documento con un inmunógeno que comprende un epítopo, y el anticuerpo se une específicamente al epítopo del inmunógeno con el que se inmunizó al ratón. En un caso, el dominio VL está mutado somáticamente. En un caso el dominio VH está mutado somáticamente. En un caso, ambos, el dominio VL y el dominio VH están mutados somáticamente. En un caso, el VL está unido a un dominio constante  de ratón.

En un aspecto, en el ratón que se proporciona, el ratón comprende segmentos genéticos humanos variables de cadena pesada que sustituyen todos o sustancialmente todos los segmentos genéticos variables de cadena pesada del ratón en el locus endógeno de ratón; no más de un segmento genético humano variable de cadena ligera se

15 selecciona de entre un segmento V1-39J5 reordenado y un V3-20J1 reordenado, sustituye todos los segmentos genéticos de ratón variables de cadena ligera; donde los segmentos genéticos humanos variables de cadena pesada están unidos a un gen endógeno de ratón constante de cadena pesada, y el segmento genético humano variable de cadena ligera se une a un gen endógeno de ratón constante C.

También se hace referencia a una célula ES de ratón que comprende una sustitución de todos o sustancialmente todos los segmentos genéticos de ratón variables de cadena pesada con segmentos genéticos humanos variables de cadena pesada, y no más de uno o dos segmentos humanos V/J de cadena ligera reordenados, donde los segmentos genéticos humanos variables de cadena pesada están unidos a un gen de ratón constante de cadena pesada de inmunoglobulina, y los segmentos humanos V/J de cadena ligera están unidos a un gen constante de

25 cadena ligera de inmunoglobulina de ratón o humano. En un caso específico, el gen constante de cadena ligera es un gen constante de ratón.

También se hace referencia a una proteína de unión al antígeno producida por un ratón como se describe en el presente documento. En un caso específico, la proteína de unión al antígeno comprende una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana que se fusiona con una región constante de ratón, y una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana se deriva de un segmento genético V1-39 o un segmento genético V3-20, donde la región constante de la cadena ligera es una región constante de ratón.

También se hace referencia a una proteína de unión al antígeno completamente humana que se produce a partir de

35 un secuencia genética de región variable de inmunoglobulina de un ratón como se describe en el presente documento, donde la proteína de unión al antígeno comprende un cadena pesada completamente humana que comprende una región variable humana que se deriva de una secuencia de un ratón como se describe en el presente documento, y una cadena ligera completamente humana que comprende una región variable V1-39 o V3-20. En un caso, la región variable de la cadena ligera comprende una a cinco mutaciones somáticas. En un c aso, la región variable de cadena ligera es una región variable de cadena ligera equivalente que se empareja en una célula B de ratón con la región variable de cadena pesada.

En un caso, la proteína de unión al antígeno completamente humana comprende una primera cadena pesada y una segunda cadena pesada, donde la primera cadena pesada y la segunda cadena pesada comprenden regiones

45 variables no idénticas que se derivan independientemente de un ratón como se ha descrito en el presente documento, y donde cada una de las primera y segunda cadenas pesadas que se expresan a partir de una célula huésped se asocian con una cadena ligera humana derivada de un segmento genético V1-39 o un segmento genético V3-20. En un caso la primera cadena pesada comprende una primera región variable de cadena pesada que se une específicamente a un primer epítopo de un primer antígeno, y la segunda cadena pesada comprende una segunda región variable de cadena pesada que se une específicamente a un segundo epítopo de un segundo antígeno. En un caso específico, el primer antígeno y el segundo antígeno son el mismo, y el primer epítopo y el segundo epítopo no son idénticos; en un caso específico, la unión del primer epítopo por la primera molécula de la proteína de unión no bloquea la unión del segundo epítopo por una segunda molécula de la proteína de unión.

55 En un caso, una proteína de unión completamente humana que se deriva de una secuencia de inmunoglobulina humana de un ratón como se describe en el presente documento comprende una primera cadena pesada de inmunoglobulina y una segunda cadena pesada de inmunoglobulina, donde la primera cadena pesada de inmunoglobulina comprende una primera región variable que no es idéntica a una región variable de la segunda cadena pesada de inmunoglobulina, y donde la primera cadena pesada de inmunoglobulina comprende un determinante de unión a la proteína A tipo silvestre, y la segunda cadena pesada carece de un determinante de unión de proteína A tipo silvestre. En un caso, la primera cadena pesada de inmunoglobulina se une a la proteína A bajo condiciones de aislamiento, y la segunda cadena pesada de inmunoglobulina no se une a la proteína A o se une a la proteína A al menos 10 veces, cien veces, o mil veces más débilmente que como se une la primera cadena pesada de inmunoglobulina a la proteína A bajo condiciones de aislamiento. En una realización específica, las

65 primera y segunda cadenas pesadas son isotipos IgG1, donde la segunda cadena pesada comprende una

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modificación que se selecciona de entre 95R (EU 435R), 96F (EU 436F), y una combinación de los mismos, y donde la primera cadena pesada carece de tal modificación.

Se proporciona un método que es un método para producir un anticuerpo biespecífico humano, donde el método 5 comprende la inmunización de un ratón de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y produciendo el anticuerpo biespecífico utilizando secuencias genéticas humanas de la región variable de células B de ratón.

En un aspecto, el método para producir una proteína de unión al antígeno biespecífica comprende la exposición de un primer ratón como se proporciona a un primer antígeno de interés que comprende un primer epítopo, exponer un 10 segundo ratón como se proporciona en el presente documento a un segundo antígeno de interés que comprende un segundo epítopo, permitir que el primer y segundo ratón tenga cada uno una respuesta inmunitaria a los antígenos de interés, identificar en el primer ratón una primera región variable de cadena pesada humana que se une con el primer epítopo del primer antígeno de interés, identificar en el segundo ratón una segunda región variable de cadena pesada humana que se une al segundo epítopo del segundo antígeno de interés, producir un primer gen de cadena 15 pesada completamente humano que codifica una primera cadena pesada que se une al primer epítopo en el primer antígeno de interés, producir un segundo gen de cadena pesada completamente humano que codifica una segunda cadena pesada que se une al segundo epítopo del segundo antígeno de interés, expresar la primera cadena pesada y la segunda cadena pesada en una célula que expresa una única cadena ligera completamente humana que se deriva de un segmento genético V1-39 humano o V3-20 humano para formar una proteína de unión al antígeno

20 biespecífica, y aislar la proteína de unión al antígeno biespecífica.

En una realización, el primer antígeno y el segundo antígeno no son idénticos.

En una realización, el primer antígeno y el segundo antígeno son idénticos, y el primer epítopo y el segundo epítopo

25 no son idénticos. En una realización, la unión de la primera región variable de cadena pesada al primer epítopo no bloquea la unión de la segunda región variable de cadena pesada al segundo epítopo.

En una realización, el primer antígeno se selecciona de un antígeno soluble y un antígeno de superficie celular (por ejemplo, un antígeno tumoral), y el segundo antígeno comprende un receptor de superficie celular. En una

30 realización específica, el receptor de superficie celular es un receptor de inmunoglobulina. En una realización específica, el receptor de inmunoglobulina es un receptor Fc. En una realización, el primer antígeno y el segundo antígeno son el mismo receptor de superficie celular, y la unión de la primera cadena pesada al primer epítopo no bloquea la unión de la segunda cadena pesada al segundo epítopo.

35 En una realización, el dominio variable de la cadena ligera comprende 2 a 5 mutaciones somáticas. En una realización, el dominio variable de la cadena ligera es una cadena ligera mutada somáticamente equivalente que se expresa en una célula B del primer o segundo ratón inmunizado con o bien el primero o el segundo dominio variable de cadena pesada.

40 En una realización, la primera cadena pesada completamente humana contiene una modificación de aminoácidos que reduce su afinidad por la proteína A, y la segunda cadena pesada completamente humana no comprende una modificación que reduzca su afinidad por la proteína A.

También se hace referencia a un anticuerpo o un anticuerpo biespecífico que comprende un dominio humano

45 variable de cadena pesada producido de acuerdo con la invención. En otro aspecto, se proporciona el uso de un ratón que se proporciona para producir un anticuerpo completamente humano o un anticuerpo biespecífico completamente humano.

Cualquiera de las realizaciones y aspectos descritos en el presente documento se pueden utilizar en conjunción con

50 otra cualquiera, a menos de que se indique otra cosa o sea aparente por el contexto. Otras realizaciones llegarán a ser aparentes para los expertos en la técnica a partir de la revisión de la siguiente descripción.

Descripción detallada

55 La presente invención no se limita a los métodos particulares, y las condiciones experimentales descritas, por lo que tales métodos y condiciones pueden variar. También se tiene que entender que la terminología que se utiliza en el presente documento es solamente con el fin de describir realizaciones particulares, y no pretende que sea limitante, aunque el ámbito de la presente invención se define por las reivindicaciones.

60 A menos de que se defina otra cosa, todos los términos y frases utilizados en el presente documento incluyen los significados que lo términos y frases han alcanzado en la técnica, a menos que se indique claramente lo contrario o sea claramente aparente a partir del contexto en el que se utiliza el término o frase. Aunque se puede utilizar en la práctica o ensayo de la presente invención cualquiera de los métodos y materiales similares o equivalentes a los que se describen en el presente documento, se describen ahora métodos y materiales particulares.

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El término “anticuerpo”, como se utiliza en el presente documento, incluye moléculas que comprenden cuatro cadenas polipeptídicas, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro. Cada cadena pesada comprende una región variable (VH) de cadena pesada y una región constante (CH) de cadena pesada. La región constante de cadena pesada comprende tres dominios, CH1, CH2 y CH3. Cada cadena

5 ligera comprende una región variable (VL) de cadena ligera y una región constante (CL) de cadena ligera. Las regiones VH y VL se pueden subdividir en regiones de hipervariabilidad, llamadas regiones determinantes de complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, llamadas regiones estructurales (FR). Cada VH y VL comprende tres CDR y cuatro FR, dispuestas desde el extremo amino al extremo carboxilo en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 (las CDR de la cadena pesada se pueden abreviar como HCDR1, HCDR2 y HCDR3; las CDR de la cadena ligera se pueden abreviar como LCDR1, LCDR2 y LCDR3). La expresión anticuerpo de “alta afinidad” se refiere a un anticuerpo que tiene una KD con respecto a su epítopo diana de aproximadamente 10-9 M o menor (por ejemplo, aproximadamente 1 x 10-9 M, 1 x 10-10 M, 1 x 10-11 M, o aproximadamente 1 x 10-12 M). En una realización la KD se mide por resonancia de plasmones superficiales, por ejemplo, BIACORE™; en otra realización, la KD se mide por ELISA.

15 La frase “anticuerpo biespecífico” incluye un anticuerpo capaz de unirse selectivamente a dos o más epítopos. Los anticuerpos biespecíficos generalmente comprenden dos cadenas pesadas no idénticas, que se unen específicamente cada cadena pesada a un epítopo diferente -o bien en dos moléculas diferentes (por ejemplo, epítopos diferentes en dos inmunógenos diferentes) o en la misma molécula (por ejemplo, diferentes epítopos en el mismo inmunógeno). Si el anticuerpo biespecífico es capaz de unirse selectivamente a dos epítopos diferentes (un primer epítopo y un segundo epítopo), la afinidad de la primera cadena pesada por el primer epítopo generalmente será al menos una a dos o tres a cuatro órdenes de magnitud más baja que la afinidad de la primera cadena pesada por el segundo epítopo y viceversa. Los epítopos que se unen específicamente al anticuerpo biespecífico pueden estar en la misma o diferente diana (por ejemplo en la misma o diferente proteína). Los anticuerpos biespecíficos se

25 pueden producir, por ejemplo, combinando cadenas pesadas que reconocen diferentes epítopos del mismo inmunógeno. Por ejemplo, las secuencias de ácido nucleico que codifican secuencias variables de cadena pesada que reconocen diferentes epítopos del mismo inmunógeno se pueden fusionar con las secuencias de ácido nucleico que codifican las mismas o diferentes regiones constantes de cadena pesada, y tales secuencias se pueden expresar en una células que exprese una cadena ligera de inmunoglobulina. Un anticuerpo biespecífico típico tiene dos cadenas pesadas que tienen cada una tres CDR de cadena pesada, seguido por (hacia el extremo N o el extremo C) un dominio CH1, una bisagra, un dominio CH2, y un dominio CH3, y una cadena ligera de inmunoglobulina que o bien no confiere especificidad de unión al epítopo pero que se puede asociar con cada cadena pesada, o se puede asociar con cada cadena pesada y se puede unir a uno o más de los epítopos que se unen a las regiones de unión al epítopo de la cadena pesada, o que se puede asociar con cada cadena pesada y es

35 capaz de unirse a una o ambas cadenas pesadas por uno o ambos epítopos.

El término “célula” incluye cualquier célula que sea adecuada para expresar una secuencia de ácido nucleico recombinante. Las células incluyen las procariotas y eucariotas (célula única o múltiples células), células bacterianas (por ejemplo, cepas de E. coli, Bacillus spp., Streptomyces spp., etc.), células micobacterianas, células fúngicas, células de levaduras (por ejemplo, S. cerevisiae, S. pombe, P. pastoris, P. methanolica, etc.), células vegetales, células de insecto (por ejemplo, SF-9, SF-21, células de insecto infectadas con baculovirus, Trichoplusia ni, etc.), células animales no humanas, células humanas, o fusiones celulares tales como, por ejemplo, hibridomas o cuadromas. En algunas realizaciones, la células es una células humana, de mono, se simio, de hámster, de rata o de ratón. En algunas realizaciones, la célula es eucariota y se selecciona de entre las siguientes células: CHO (por

45 ejemplo, CHO K1, DXB-11 CHO, Veggie-CHO), COS (por ejemplo, COS-7), célula retiniana, Vero, CV1, riñón (por ejemplo, HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK), HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo205, HB 8065, HL60, (por ejemplo, BHK21), Jurkat, Daudi, A431 (epidérmica), CV-1, U937, 3T3, célula L, célula C127, SP2/0, NS-0, MMT 060562, célula de Sertoli, célula BRL 3A, célula HT1080, célula de mieloma, célula tumoral, y las líneas celulares derivadas de una célula mencionada anteriormente. En algunas realizaciones, la célula comprende uno o más genes víricos, por ejemplo, una célula retiniana que expresa un gen vírico (por ejemplo, una célula PER.C6™).

La frase “región determinante de complementariedad” o el término “CDR”, incluye una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de ácido nucleico de genes de inmunoglobulina de un organismo que normalmente (es decir en un animal de tipo silvestre) aparecen entre dos regiones estructurales en una región variable de una cadena

55 ligera o una cadena pesada de una molécula de inmunoglobulina (por ejemplo, un anticuerpo o un receptor de célula T). Una CDR se puede codificar, por ejemplo, por una secuencia de la línea germinal o una secuencia reordenada o no reordenada, y, por ejemplo, por una célula B o una célula T intacta o madura. Una CDR puede estar mutada somáticamente (por ejemplo, varía de la secuencia codificada en la línea germinal de un animal), humanizada, y/o modificada con sustituciones, adiciones o eliminaciones de aminoácidos. En algunas circunstancias (por ejemplo, para una CDR3), las CDR pueden codificarse por dos o más secuencias (por ejemplo, secuencias de la línea germinal) que no son contiguas (por ejemplo, en una secuencia de ácido nucleico no reordenada) pero son contiguas en una secuencia de ácido nucleico de célula B, por ejemplo, como resultado de corte y empalme o conexión de las secuencias (por ejemplo, en la recombinación V-D-J para formar una CDR3 de cadena pesada).

65 El término “conservadora”, cuando se utiliza para describir una sustitución conservadora de aminoácidos, incluye la sustitución de un resto de aminoácido por otro resto de aminoácido que tiene un grupo R en la cadena lateral con

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La frase “molécula de inmunoglobulina” incluye dos cadenas pesadas de inmunoglobulina y dos cadenas ligeras de inmunoglobulina. Las cadenas pesadas pueden ser idénticas o diferentes, y las cadenas ligeras pueden ser idénticas o diferentes.

5 La frase “cadena ligera” incluye una secuencia de cadena ligera de inmunoglobulina de cualquier organismo, y a menos de que se especifique otra cosa incluye cadenas ligeras  y  humanas y una VpreB, así como cadenas ligeras equivalentes. Los dominios variables (VL) de cadena ligera incluyen típicamente tres CDR de cadena ligera y cuatro regiones estructurales (FR), a menos de que se especifique otra cosa. En general, una cadena ligera de longitud completa incluye, desde el extremo amino al término carboxilo, un dominio VL que incluye FR1-CDR1-FR2

10 CDR2-FR3-CDR3-FR4, y un dominio constante de cadena ligera. Las cadenas ligeras incluyen, por ejemplo, las que no se unen selectivamente ni a un primer ni a un segundo epítopo unido selectivamente a una proteína de unión al epítopo en la que aparecen. Las cadenas ligeras también incluyen las que se unen y reconocen, o ayudan a la cadena pesada en la unión y reconocimiento, de uno o más epítopos unidos a una proteína de unión al epítopo en la que aparecen. Las cadenas ligeras comunes se las derivadas de un segmento genético V1-39J5 humano o un

15 segmento genético V3-20J1 humano, e incluyen versiones mutadas somáticamente (por ejemplo, de afinidad madurada) de las mismas.

La frase “intervalo micromolar” pretende significar 1-999 micromolar; la frase “intervalo nanomolar” pretende significar 1-999 nanomolar; la frase “intervalo picomolar” pretende significar 1-999 picomolar.

20 La frase “mutado somáticamente” incluye la referencia a una secuencia de ácido nucleico de una célula B que ha sufrido un cambio de clase, donde la secuencia del ácido nucleico de una región variable de inmunoglobulina (por ejemplo, un dominio variable de cadena pesada que incluye una secuencia CDR o FR de cadena pesada) de la célula B que está cambiada de clase no es idéntica a la secuencia de ácido nucleico de la célula B antes del cambio

25 de clase, tal como por ejemplo, una diferencia en una secuencia de ácido nucleico de CDR o estructural entre una célula B que no ha sufrido un cambio de clase y una célula B que ha sufrido un cambio de clase. “Mutado somáticamente” incluye la referencia a secuencias de ácido nucleico de células B de afinidad madurada que no son idénticas a las correspondientes secuencias de la región variable de inmunoglobulina correspondiente en las células B que no son de afinidad madurada (es decir, secuencias en el genoma de las células germinales). La frase “mutado

30 somáticamente” incluye también la referencia a una secuencia de ácido nucleico de una región variable de inmunoglobulina de una célula B tras la exposición de la célula B a un epítopo de interés, donde la secuencia de ácido nucleico se diferencia de la secuencia de ácido nucleico correspondiente antes de la exposición de la célula B al epítopo de interés. La frase “mutado somáticamente” se refiere a secuencias de los anticuerpos que se han generado en un animal, por ejemplo, un ratón que tiene secuencias de ácido nucleico de la región variable de

35 inmunoglobulina humana, en respuesta a un desafío inmunógeno, y que resultan de los procesos de selección operativos inherentemente en tal animal.

La expresión “no reordenado”, en referencia a una secuencia de ácido nucleico, incluye secuencias de ácidos nucleicos que existen en la línea germinal de una célula animal.

40 La frase “dominio variable” incluye una secuencia de aminoácidos de una cadena ligera o cadena pesada (modificadas como se desee) que comprende las siguientes regiones de aminoácidos, en una secuencia desde el extremo N al extremo C (a menos de que se indique otra cosa): FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.

45 Cadena ligera común

Los esfuerzos anteriores para producir proteínas de unión al epítopo multiespecíficas útiles, por ejemplo, anticuerpos biespecíficos, fueron obstaculizados por una variedad de problemas que frecuentemente compartían un paradigma común: la selección o manipulación in vitro de secuencias para modificar racionalmente, o para modificar por medio

50 de ensayo y error, un formato adecuado para emparejar una inmunoglobulina humana biespecífica heterodimérica. Desafortunadamente, la mayoría si no todas las estrategias de modificación in vitro proporciona extensamente fijos ad hoc que son adecuados, como mucho, para moléculas individuales. Por otra parte, los métodos in vivo que emplean organismos complejos para seleccionar los emparejamientos apropiados que sean capaces de dar lugar a una terapéutica en seres humanos no se han conseguido.

55 En general, las secuencias nativas de ratón no son frecuentemente una buena fuente para las secuencias terapéuticas humanas. Por al menos esta razón, generar regiones variables de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón que se empareje con una cadena ligera común tiene una utilidad práctica limitada. Más esfuerzos de modificación in vitro se emplearían en un proceso de ensayo y error para intentar humanizar las secuencias

60 variables de cadena pesada de ratón mientras que se espera que mantengan la especificidad y afinidad por el epítopo mientras que se mantiene la capacidad para acoplarse con la cadena ligera humana común, con un resultado incierto. Al final de tal proceso, el producto final puede mantener alguna de la especificidad y afinidad, y se asocia con la cadena ligera común, pero en último término la inmunogenicidad en un ser humano probablemente tenía un grave riesgo.

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Por lo tanto se proporciona un ratón que es un ratón que comprende:

(a) una sustitución en el locus endógeno del ratón de la región variable de cadena ligera  de inmunoglobulina de

5 los segmentos genéticos endógenos del ratón de la región variable de cadena ligera  de inmunoglobulina con un único segmento genético V1-39/J5 humano reordenado o un único segmento genético V3-20/J humano reordenado, donde el segmento genético humano está unido operativamente a un gen constante  endógeno del ratón y donde el ratón carece de un locus de la región variable de cadena ligera  de inmunoglobulina de ratón que sea capaz de reordenar y formar un gen que codifique una región variable ; y,

10 (b) una sustitución de 90-100% del locus del gen endógeno del ratón de la región variable de cadena pesada con una pluralidad de segmentos genéticos humanos de la región variable de la cadena pesada, donde los segmentos genéticos humanos de la región variable de cadena pesada están unidos operativamente a un gen endógeno del ratón constante de cadena pesada, y los segmentos genéticos humanos de la región variable de cadena pesada son capaces de reordenar y formar un gen quimérico humano/ratón de cadena pesada

15 reordenado.

El ratón modificado genéticamente que se proporciona, en varias realizaciones, comprende un locus de la región variable de cadena ligera que carece de un segmento genético endógeno del ratón variable de cadena ligera y que comprende un segmento genético humano variable, en una realización una secuencia V/J humana reordenada,

20 unida operativamente a una región constante de ratón, donde el locus es capaz de sufrir una hipermutación somática, y donde el locus expresa una cadena ligera que comprende la secuencia V/J humana unida a una región constante de ratón. Por lo tanto, en varias realizaciones, el locus comprende un amplificador 3’  de ratón, que se correlación con un nivel normal, o de tipo silvestre, de hipermutación somática.

25 El ratón modificado genéticamente en varias realizaciones cuando se inmuniza con un antígeno de interés genera células B que muestran una diversidad de reordenamientos de regiones variables de cadena pesada de inmunoglobulina humana que expresa y funciona con una cadena ligera reordenada, incluyendo realizaciones donde la cadena ligera comprende regiones variables de cadena ligera humana que comprenden, por ejemplo, 1 a 5 mutaciones somáticas. En varias realizaciones, las cadenas ligeras expresadas de esta manera son capaces de

30 asociarse y expresarse con cualquier región variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana que se expresa en el ratón.

Proteínas de unión al epítopo que se unen a más de un epítopo

35 Las composiciones y métodos descritos en el presente documento se pueden utilizar para producir proteínas de unión que se unan a más de un epítopo con alta afinidad, por ejemplo, anticuerpos biespecíficos. Las ventajas de la invención incluyen la capacidad para seleccionar adecuadamente cadenas de cadena pesada de inmunoglobulina de alta unión (por ejemplo, afinidad madurada) cada una de las cuales se asociará con una única cadena ligera.

40 La síntesis y expresión de proteínas de unión biespecífica han sido problemáticas, en parte debido a problemas asociados con la identificación de una cadena ligera adecuada que se pueda asociar y expresar con dos cadenas pesadas diferentes, y en parte debido a problemas de aislamiento. Los métodos y composiciones descritos en el presente documento permiten un ratón modificado genéticamente para seleccionar, por medio de procesos por otra parte naturales, una cadena ligera adecuada que se puede asociar y expresar con más de una cadena pesada, que

45 incluye cadenas pesadas que están mutadas somáticamente (por ejemplo, de afinidad madurada). Las secuencias VL y VH de células B adecuadas de ratones inmunizados como se describen en el presente documento que expresan anticuerpos de afinidad madurada que tienen cadenas pesadas quiméricas inversas (es decir, variables humanas y constantes de ratón) se pueden identificar y clonar en fase en un vector de expresión con una secuencia genética humana de la región constante adecuada (por ejemplo, una IgG1 humana). Se pueden preparar dos de

50 tales construcciones, donde cada construcción codifica un dominio variable de cadena pesada humano que se une a un epítopo diferente. Uno de las VL humanas (por ejemplo, V1-39J5 humano o V3-20J1 humano), de la secuencia de la línea germinal o de una células B donde la secuencia se ha mutado somáticamente, se pueden fusionar en fase con un gen humano de la región constante adecuado (por ejemplo, un gen constante  humano). Estas tres construcciones ligeras y pesadas completamente humanas se pueden situar en una célula adecuada para

55 su expresión. La célula expresará dos especies principales: una cadena pesada homodimérica con la cadena ligera idéntica, y una cadena pesada heterodimérica con la cadena ligera idéntica. Para permitir la separación fácil de estas tres especies principales, se modifica una de las cadenas pesadas para omitir el determinante de unión a la proteína A, dando como resultado una afinidad diferencial de una proteína de unión homodimérica de una proteína de unión heterodimérica. Las composiciones y métodos que se dirigen a este problema se describen en el

60 documento 12/832.838, presentada el 25 de junio de 2010, titulada "Readily Isolated Bispecific Antibodies with Native Immunoglobulin Format," publicada como el documento US 2010/0331527A1.

En un caso, se hace referencia a una proteína de unión al epítopo como se describe en el presente documento, donde las secuencias VL y VH humanas se derivan del ratón descrito en el presente documento que se ha

65 inmunizado con un antígeno que comprende un epítopo de interés.

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También se hace referencia una proteína de unión al epítopo que comprende un primer y segundo polipéptido, el primer polipéptido comprende, desde el extremo N al extremo C, una primera región de unión al epítopo que se une selectivamente a un primer epítopo, seguido por una región constante que comprende una primera región CH3 de una IgG humana que se selecciona de entre IgG1, IgG2, IgG4, y una combinación de las mismas; y, un segundo

5 polipéptido que comprende, del extremo N al extremo C, una segunda región de unión al epítopo que se une selectivamente a un segundo epítopo, seguido por una región constante que comprende una segunda región CH3 de una IgG seleccionada de entre IgG1, IgG2, IgG4, y una combinación de las mismas, donde la segunda región CH3 comprende una modificación que reduce o elimina la unión del segundo dominio CH3 a la proteína A.

En un caso, la segunda región CH3 comprende una modificación H95R (por la numeración de exones IMGT; H435R por numeración EU). En otra realización, la segunda región CH3 comprende además una modificación Y96F (IMGT; Y436F por EU).

En un caso, la segunda región CH3 es de una IgG1 humana modificada, y comprende además una modificación que

15 se selecciona de entre el grupo que consiste en D16E, L18M, N44S, K52N, V57M, y V82I (IMGT; D356E, L358M, N384S, K392N, V397M, y V422I por EU).

En un caso, la segunda región CH3 es de una IgG2 humana modificada, y comprende además una modificación que se selecciona de entre el grupo que consiste en N44S, K52N, y V82I (IMGT; N384S, K392N, y V422I por EU).

En un caso, la segunda región CH3 es de una IgG4 humana modificada, y comprende además una modificación que se selecciona de entre el grupo que consiste en Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q, y V82I (IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q, y V422I por EU).

25 Un método para producir una proteína de unión al epítopo que se une a más de un epítopo es inmunizar un primer ratón de acuerdo con la invención con un antígeno que comprende un primer epítopo de interés, donde el ratón comprende un locus de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que no contiene una VL endógena del ratón que sea capaz de reordenarse y formar una cadena ligera, donde en locus endógeno del ratón variable de cadena ligera de inmunoglobulina hay un único segmento genético VL humano unido operativamente al gen endógeno del ratón de la región constante de cadena ligera, y el segmento genético VL humano se selecciona de entre un V1-39J5 humano y un V3-20J1 humano, y los segmentos genéticos endógenos del ratón VH se han sustituido en parte o totalmente con segmentos genéticos VH humanos, tal que las cadenas pesadas de inmunoglobulinas producidas por el ratón son solamente o sustancialmente cadenas pesadas que comprenden dominios variables humanos y dominios constantes de ratón. Cuando se inmuniza, tal ratón producirá un anticuerpo

35 quimérico inverso que comprende solo uno o dos dominios humanos variables de cadena ligera (por ejemplo, uno de V1-39J5 humano o V3-20J1 humano). Una vez que se identifica la célula B que codifica una VH que se une al epítopo de interés, se puede recuperar (por ejemplo, por PCR) la secuencia de nucleótidos de la VH (y opcionalmente, la VL) y clonarse en una construcción de expresión en fase con un dominio humano constante de inmunoglobulina adecuado. Este proceso se puede repetir para identificar un segundo dominio VH que se une a un segundo epítopo, y se puede recuperar una segunda secuencia genética VH y clonarse en un vector de expresión en fase con un segundo dominio constante de inmunoglobulina adecuado. El primer y segundo dominios constantes de inmunoglobulina pueden ser el mismo isotipo o diferente, y se puede modificar uno de los dominios constantes de inmunoglobulina (pero no el otro) como se describe en el presente documento o en el documento US 2010/0331527A1, y se puede expresar la proteína de unión al epítopo, por ejemplo, como se describe en el

45 documento US 2010/0331527A1.

También se hace referencia a un método para producir una proteína de unión al epítopo biespecífico, que comprende la identificación de una primera secuencia de nucleótidos VH humana (VH1) de afinidad madurada (or ejemplo, que comprende una o más hipermutaciones somáticas) a partir de un ratón como se describe en el presente documento, identificar una segunda secuencia de nucleótidos humana (VH2) de afinidad madurada (por ejemplo que comprende una o más hipermutaciones somáticas) a partir de un ratón como se describe en el presente documento, clonar la VH1 en fase con una cadena pesada humana que carece de una modificación del determinante de proteína A como se describe en el documento US 2010/0331527A1 para formar una cadena pesada 1 (HC1), clonar la VH2 en fase con una cadena pesa humana que comprende un determinante de Proteína

55 A como se describe en el documento US 2010/0331527A1 para formar una cadena pesada 2 (HC2), introducir un vector de expresión que comprende HC1 y el mismo vector de expresión o uno diferente que comprende HC2 dentro de la célula, donde la célula también expresa una cadena ligera de inmunoglobulina humana que comprende un V1-39J5 humano o un V3-20J1 humano que se fusiona a un dominio humano constante de cadena ligera, permitiendo a la célula que exprese una proteína de unión al epítopo biespecífica que comprende un dominio VH codificado por VH1 y un dominio VH codificado por VH2, y aislar la proteína de unión al epítopo biespecífica en base a su capacidad diferencial de unirse a la Proteína A en comparación con la proteína de unión al epítopo homodimérica. En un caso específico, la HC1 es una IgG1, y la HC2 es una IgG1 que comprende la modificación H95R (IMGT; H435R por EU) y comprende además la modificación Y96F (IMGT; Y436F por EU). En un caso, el domino VH codificado por VH1, el dominio VH codificado por VH2, o ambos, están mutados somáticamente.

65

Genes VH humanos que se expresan con una VL humana común

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Se expresó una variedad de regiones variables humanas a partir de anticuerpos de afinidad madurada producidos contra cuatro antígenos diferentes con o su cadena ligera equivalente, o al menos una de las cadenas ligeras humanas seleccionadas de entre V1-39J5 humana, V3-20J1 humana o VpreBJ5 humana (véase el Ejemplo 1). Para los anticuerpos contra cada uno de los antígenos, se emparejaron satisfactoriamente las cadenas pesadas 5 de alta afinidad mutadas somáticamente de diferentes familias genéticas con las regiones de la línea germina humana V1-39J5 y V3-20J1 reordenadas y se segregaron a partir de las células que expresaban las cadenas pesada y ligera. Para V1-39J5 y V3-20J1, se expresaron favorablemente los dominios VH derivados de las siguientes familias VH humanas: 1-2, 1-8, 1-24, 2-5, 3-7, 3-9, 3-11, 3-13, 3-15, 3-20, 3-23, 3-30, 3-33, 3-48, 4-31, 439, 4-59, 5-51, y 6-1. Por lo tanto un ratón que se modifica para expresar un repertorio limitado de dominios VL

10 humanos a partir de uno o ambos V1-39J5y V3-20J1 generará una población diversa de dominios VH humanos mutados somáticamente a partir de locus VH modificado genéticamente para sustituir los segmentos genéticos VH de ratón por segmentos genéticos VH humanos.

Los ratones modificados genéticamente para expresar cadenas pesadas de inmunoglobulina quiméricas inversas

15 (variables humanas, constantes de ratón) que se asocian con una única cadena pesada reordenada (por ejemplo, una V1-39/J o una V3-20/J), cuando se inmunizan con un antígeno de interés, generan células B que comprenden una diversidad de reordenamientos del segmento V humano y expresan una diversidad de anticuerpos específicos de antígeno con alta afinidad con diversas propiedades con respecto a su capacidad para bloquear la unión del antígeno a su ligando, y con respecto a su capacidad para unirse a variantes del antígeno (véase los Ejemplos 5 a

20 10).

Por lo tanto, los ratones y métodos descritos en el presente documento son útiles para producir y seleccionar dominios humanos variables de cadena pesada, que incluyen dominios humanos variables de cadena pesada mutados somáticamente, que resultan de una diversidad de reordenamientos, que muestran una amplia variedad de

25 afinidades (que incluyen las que muestran una KD de aproximadamente nanomolar o menos), una amplia variedad de especificidades (que incluyen la unión a diferentes epítopos del mismo antígeno), y que se asocian y se expresan con la misma o sustancialmente la misma región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana.

Se proporcionan los siguientes ejemplos para describir a los expertos habituados en la técnica cómo hacer y utilizar

30 los métodos y composiciones de la invención, y no se pretende limitar el ámbito de lo que los inventores consideran como su invención. Se han hecho esfuerzos para asegurar la precisión con respecto a los números utilizados (por ejemplo, cantidades, temperaturas, etc.) pero se debería contar con algunos errores experimentales o desviaciones. A menos de que se indique otra cosa, las partes son partes por peso, el peso molecular es el peso molecular medio, las temperaturas se indican en grados Celsius, y la presión es o está cerca de la atmosférica.

35

Ejemplos

Ejemplo 1. Identificación de las regiones humanas variables de cadena pesada que se asocian con regiones humanas variables de cadena ligera seleccionadas

40 Se construyó un sistema de expresión in vitro para determinar si una única cadena ligera de la línea germinal humana reordenada podría co-expresarse con cadenas pesadas humanas de anticuerpos humanos específicos de antígeno.

45 Los métodos para generar anticuerpos humanos en ratones modificados genéticamente se conocen (véase por ejemplo, el documento US 6.596.541, Regeneron Pharmaceuticals, VELOCIMMUNE®). La tecnología VELOCIMMUNE® implica la generación de un ratón modificado genéticamente que tiene un genoma que comprende regiones variables de cadena pesada y ligera humanas unidas operativamente a loci endógenos del ratón de región constante tal que el ratón produce un anticuerpo que comprende una región variable humana y una

50 región constante de ratón en respuesta a la estimulación antigénica. El ADN que codifica las regiones variables de las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos producidos a partir de un ratón VELOCIMMUNE® son completamente humanos. Inicialmente los anticuerpos quiméricos de alta afinidad que se aíslan tienen una región variable y una región constante de ratón. Como se describe posteriormente, los anticuerpos se caracterizan y seleccionan por sus características deseables, que incluyen la afinidad, selectividad, epítopo, etc. Las regiones

55 constantes de ratón se sustituyen con una región constante humana deseable para generar un anticuerpo completamente humano que contiene un isotipo no IgM, por ejemplo, un IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 de tipo silvestre o modificado genéticamente. Aunque la región constante que se selecciona puede variar de acuerdo con el uso específico, las características de unión al antígeno con alta afinidad y la especificidad de diana residen en la región variable.

60 Se inmunizó un ratón VELOCIMMUNE® con un factor de crecimiento que promueve la angiogénesis (Antígeno C) y se asilaron los anticuerpos humanos específicos del antígeno y se secuenciaron con respecto a la utilización del gen V utilizando las técnicas de referencia que se reconocen en la técnica. Los anticuerpos seleccionados se clonaron en regiones constantes de cadena pesada y ligera humanas y se seleccionaron 69 cadenas pesadas para

65 emparejarlas con una de las tres cadenas ligeras humanas: (1) la cadena ligera  equivalente unida a una región

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constante  humana, (2) una línea germinal V1-39J5 humana reordenada unida a una región constante  humana,

o (3) una línea germinal V3-20J1 humana reordenada unida a una región constante  humana. Cada pareja de cadena pesada y cadena ligera se co-transfectaron en células CHO-K1 utilizando técnicas de referencia. La presencia de anticuerpo en el sobrenadante se detectó por anti-IgG humana en un ensayo ELISA. El título de

5 anticuerpos (ng/ml) se determinó para cada pareja de cadena pesada/ligera y se compararon los títulos de las diferentes cadenas ligeras de la línea germinal reordenadas con los títulos obtenidos con la molécula de anticuerpo parental (es decir, la cadena pesada emparejada con la cadena ligera equivalente) y se calculó el porcentaje del título nativo (Tabla 1). VH: gen variable de cadena pesada. ND: expresión no detectada bajo las condiciones experimentales en curso.

10

Tabla 1

VH: Título de anticuerpos (ng/ml) Porcentaje del título nativo

LC Equivalente: V1-39J5 V3-20J1 V1-39J5 V3-20J1

3-15: 63 23 11 36,2 17,5

1-2: 103 53 ND 51,1 -

3-23: 83 60 23 72,0 27,5

3-33: 15 77 ND 499,4 -

4-31: 22 69 17 309,4 76,7

3-7: 53 35 28 65,2 53,1

-: 22 32 19 148,8 89,3

1-24: 3 13 ND 455,2 -

3-33: 1 47 ND 5266,7 -

3-33: 58 37 ND 63,1 -

-: 110 67 18 60,6 16,5

3-23: 127 123 21 96,5 16,3

3-33: 28 16 2 57,7 7,1

3-23: 32 50 38 157,1 119,4

-: 18 45 18 254,3 101,7

3-9: 1 30 23 2508,3 1900,0

3-11: 12 26 6 225,9 48,3

1-8: 16 ND 13 - 81,8

3-33: 54 81 10 150,7 19,1

-: 34 9 ND 25,9
-

3-20: 7 14 54 203,0 809,0

3-33: 19 38 ND 200,5 -

3-11: 48 ND 203 - 423,6

-: 11 23 8 212,7 74,5

3-33: 168 138 182 82,0 108,2

3-20: 117 67 100 57,5 86,1

3-23: 86 61 132 70,7 154,1

3-33: 20 12 33 60,9 165,3

4-31: 69 92 52 133,8 75,0

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3-23: 87 78 62 89,5 71,2

1-2: 31 82 51 263,0 164,6

3-23: 53 93 151 175,4 285,4

-: 11 8 17 75,7 151,4

3-33: 114 36 27 31,6 23,4

3-15: 73 39 44 53,7 59,6

3-33: 1 34 16 5600,0 2683,3

3-9: 58 112 57 192,9 97,6

3-33: 67 20 105 30,1 157,0

3-33: 34 21 24 62,7 70,4

3-20: 10 49 91 478,4 888,2

3-33: 66 32 25 48,6 38,2

3-23: 17 59 56 342,7 329,8

-: 58 108 19 184,4 32,9

-: 68 54 20 79,4 29,9

3-33: 42 35 32 83,3 75,4

-: 29 19 13 67,1 43,9

3-9: 24 34 29 137,3 118,4

3-30/33: 17 33 7 195,2 43,1

3-7: 25 70 74 284,6 301,6

3-33: 87 127 ND 145,1 -

6-1: 28 56 ND 201,8 -

3-33: 56 39 20 69,9 36,1

3-33: 10 53 1 520,6 6,9

3-33: 20 67 10 337,2 52,3

3-33: 11 36 18 316,8 158,4

3-23: 12 42 32 356,8 272,9

3-33: 66 95 15 143,6 22,5

3-15: 55 68 ND 123,1 -

-: 32 68 3 210,9 10,6

1-8: 28 48 ND 170,9 -

3-33: 124 192 21 154,3 17,0

3-33: 0 113 ND 56550,0 -

3-33: 10 157 1 1505,8 12,5

3-33: 6 86 15 1385,5 243,5

3-23: 70 115 22 163,5 31,0

3-7: 71 117 21 164,6 29,6

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3-33: 82 100 47 122,7 57,1

3-7: 124 161 41 130,0 33,5

En un experimento similar, los ratones VELOCIMMUNE® se inmunizaron con varios antígenos diferentes y las cadenas pesadas de anticuerpos humanos específicos del antígeno que se seleccionaron se ensayaron en cuanto a su capacidad para emparejarse con diferentes cadenas ligeras de la línea germinal humana reordenadas (como se 5 ha descrito anteriormente). Los antígenos que se utilizan en este experimento incluyen una enzima implicada en la homeostasis del colesterol (Antígeno A), una hormona sérica implicada en la regulación de la homeostasis de la glucosa (Antígeno B), un factor de crecimiento que promociona la angiogénesis (Antígeno C) y un receptor de superficie celular (Antígeno D). Los anticuerpos específicos del antígeno se aislaron del ratón en cada grupo de inmunización y se clonaron y secuenciaron las regiones variables de la cadena ligera y la cadena pesada. A partir de 10 la secuencia de las cadenas pesada y ligera, se determinó el uso del gen V y las cadenas pesadas que se seleccionaron se emparejaron con o bien su cadena ligera equivalente o con la región de la línea germinal V1-39J5 humana reordenada. Cada par de cadenas pesada/ligera se co-transfectó en células CHO-K1 y se detectó la presencia del anticuerpo en el sobrenadante por anti-IgG humana en un ensayo ELISA. El título de anticuerpos (g/ml) se determinó para cada emparejamiento de cadena pesada/ligera y se compararon los títulos de diferentes

15 cadenas ligeras de la línea germinal humana reordenadas con los títulos obtenidos con la molécula de anticuerpo parental (es decir, la cadena pesada emparejada con la cadena ligera equivalente) y se calculó el porcentaje del título nativo (Tabla 2). VH: gen variable de cadena pesada. V: gen variable de cadena ligera . ND: expresión no detectada bajo las condiciones experimentales en curso.

Tabla 2

Antígeno: Anticuerpo VH V Título (mg/ml) Porcentaje de título nativo

VH Sola: Vn + V VH + V1-39J5

A: 320 1-18 2-30 0,3 3,1 2,0 66

321: 2-5 2-28 0,4 0,4 1,9 448

334: 2-5 2-28 0,4 2,7 2,0 73

313: 3-13 3-15 0,5 0,7 4,5 670

316: 3-23 4-1 0,3 0,2 4,1 2174

315: 3-30 4-1 0,3 0,2 3,2 1327

318: 4-59 1-17 0,3 4,6 4,0 86

B: 257 3-13 1-5 0,4 3,1 3,2 104

283: 3-13 1-5 0,4 5,4 3,7 69

637: 3-13 1-5 0,4 4,3 3,0 70

638: 3-13 1-5 0,4 4,1 3,3 82

624: 3-23 1-17 0,3 5,0 3,9 79

284: 3-30 1-17 0,3 4,6 3,4 75

653: 3-33 1-17 0,3 4,3 0,3 7

268: 4-34 1-27 0,3 5,5 3,8 69

633: 4-34 1-27 0,6 6,9 3,0 44

C: 730 3-7 1-5 0,3 1,1 2,8 249

728: 3-7 1-5 0,3 2,0 3,2 157

691: 3-9 3-20 0,3 2,8 3,1 109

749: 3-33 3-15 0,3 3,8 2,3 62

750: 3-33 1-16 0,3 3,0 2,8 92

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724: 3-33 1-17 0,3 2,3 3,4 151

706: 3-33 1-16 0,3 3,6 3,0 84

744: 1-18 1-12 0,4 5,1 3,0 59

696: 3-11 1-16 0,4 3,0 2,9 97

685: 3-13 3-20 0,3 0,5 3,4 734

732: 3-15 1-17 0,3 4,5 3,2 72

694: 3-15 1-5 0,4 5,2 2,9 55

743: 3-23 1-12 0,3 3,2 0,3 10

742: 3-23 2-28 0,4 4,2 3,1 74

693: 3-23 1-12 0,5 4,2 4,0 94

136: 3-23 2-28 0,4 5,0 2,7 55

D: 155 3-30 1-16 0,4 1,0 2,2 221

163: 3-30 1-16 0,3 0,6 3,0 506

171: 3-30 1-16 0,3 1,0 2,8 295

145: 3-43 1-5 0,4 4,4 2,9 65

49: 3-48 3-11 0,3 1,7 2,6 155

51: 3-48 1-39 0,1 1,9 0,1 4

159: 3-7 6-21 0,4 3,9 3,6 92

169: 3-7 6-21 0,3 1,3 3,1 235

134: 3-9 1-5 0,4 5,0 2,9 58

141: 4-31 1-33 2,4 4,2 2,6 63

142: 4-31 1-33 0,4 4,2 2,8 67

Los resultados obtenidos de estos experimentos demuestran que las cadenas pesadas de alta afinidad, mutadas somáticamente de diferentes familias genéticas eran capaces de emparejarse con regiones V1-39J5 y V3-20J1 5 de la línea germinal humana reordenadas y se segregaban a partir de la célula como una molécula de anticuerpo normal. Como se muestra en la Tabla 1, el título de anticuerpo aumentaba aproximadamente un 61% (42 de 69) de cadenas pesadas cuando se emparejaban con la cadena ligera V1-39J5 humana reordenada y aproximadamente un 29% (20 de 69) de cadenas pesadas cuando se emparejaban con la cadena ligera V3-20J1 humana reordenada en comparación con la cadena ligera equivalente el anticuerpo parental. Para aproximadamente el 20% 10 (14 de 69) de las cadenas pesadas, ambas cadenas ligeras de la línea germinal reordenadas conferían un aumento de la expresión cuando se compara a la cadena ligera equivalente del anticuerpo parental. Como se muestra en la Tabla 2, la región V1-39J5 de la línea germinal humana reordenada confería un aumento de la expresión de varias cadenas pesadas específicas para un intervalo de diferentes clases de antígeno en comparación con la cadena ligera equivalente de los anticuerpos parentales. En todas las cadenas pesadas que mostraban un aumento de la 15 expresión con respecto a la cadena ligera equivalente del anticuerpo parental, la familia tres de cadenas pesadas (VH3) estaba sobre-representadas en comparación con otras familias genéticas de la región variable de cadena pesada. Esto demuestra una relación favorable de las cadenas VH3 humanas para emparejarse con cadenas ligeras V3-20J1 y VpreB/J5 de la línea germinal humana reordenadas.

20 Ejemplo 2. Generación de un locus de cadena ligera de la línea germinal humana reordenado

Se produjeron varios vectores dirigidos a la cadena ligera de la línea germinal humana reordenada utilizando la tecnología VELOCIGENE® (véase, por ejemplo, la Pat. de EE. UU. Nº 6.586.251 y Valenzuela et al. (2003) Highthroughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech. 25 21(6):652-659) para modificar clones de Cromosoma Artificial Bacteriano (BAC) genómicos de ratón 302g12 y 254m04 (Invitrogen). Utilizando estos dos clones BAC, se modificaron construcciones genómicas para que

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contuvieran una única región de cadena ligera de la línea germinal humana reordenada y se insertó en un locus de cadena ligera  endógena que se había modificado genéticamente previamente para eliminar los segmentos genéticos de unión y variable  endógena.

5 A. Construcción de vectores que se dirigen a la cadena ligera de la línea germinal humana reordenada

Se produjeron tres diferentes regiones de cadena ligera de la línea germinal humana reordenadas utilizando técnicas de biología molecular de referencia. Los segmentos genéticos variables humanos utilizados para construir estas tres regiones incluían la secuencia V1-39J5 humana reordenada, una secuencia V3-20J1 humana reordenada y una

10 secuencia VpreBJ5 humana reordenada.

Un segmento de ADN que contiene el exón 1 (que codifica el péptido líder) y el intrón 1 del gen V3-7 del ratón se produjo por síntesis de ADN de novo (Integrated DNA Technologies). Se incluyó parte de la región sin traducir 5’ hasta un sitio de restricción enzimática BIpI de origen natural. Los exones de los genes V1-39 y V3-20 humanos 15 se amplificaron por PCR a partir de las bibliotecas de BAC genómicos humanos. Los cebadores directos tenían una extensión 5’ que contenía el sitio receptor de corte y empalme del intrón 1 del gen V3-7 del ratón. El cebador inverso que se utiliza para la PCR de la secuencia V1-39 incluye una extensión que codifica el J5 humano, mientras que el cebador inverso utilizado para la PCR de la secuencia V3-20 incluía una extensión que codificaba el J1 humano. La secuencia VpreBJ5 se produjo por síntesis de ADN de novo (Integrated DNA Technologies).

20 Una parte del intrón J-C humano incluyendo el sitio donante de corte y empalme se amplificó por PCR a partir del plásmido pBS-296-HA18-PIScel. El cebador directo de la PCR incluía una extensión que codificada parte de una secuencia o J5, J1 o J5. El cebador inverso incluía un sitio PI-Scel, que se había modificado genéticamente anteriormente en el intrón.

25 El exón1/intrón1 V3-7, los exones de cadena ligera variable humanos, y los fragmentos de intrón J-C humanos se cosieron juntos por solapamiento de extensiones de PCR, se digirieron con BIpI y PI-Scel, y se ligaron en el plásmido pBS-296-HA18-PIScel, que contenía el promotor del segmento genético variable V3-15 humano. Un casete de higromicina flanqueado por sitios loxP (floxado) dentro del plásmido pBS-296-HA18-PIScel se sustituyó con un casete de higromicina con sitios FRT flanqueado por los sitios Notl y AscI. El fragmento NotI/PI-Scel de este

30 plásmido se ligó en el ratón modificado genéticamente BAC 254m04, que contenía parte del intrón J-C de ratón, el exón C de ratón, y aproximadamente 75 kb de secuencia genómica corriente abajo del locus  de ratón que proporcionaba un brazo de homología 3’ para la recombinación homóloga en las células ES de ratón. El fragmento Notl/AscI de este BAC se ligaba entonces en una ratón modificado genéticamente BAC 302g12, que contenía un casete de neomicina con sitios FRT y aproximadamente 23 kb de secuencia genómica corriente arriba del locus 

35 endógeno para la recombinación homóloga en células ES de ratón.

B. Vector de direccionamiento de V1-39J5 de la línea germinal (Figura 1)

Los sitios de restricción enzimática se introdujeron en los extremos 5’ y 3’ de una inserción de cadena ligera

40 modificada para la clonación en un vector de direccionamiento; un sitio AscI en el extremo 5’ y un sitio PI-Scel en el extremo 3’. Con el sitio AscI 5’ y el sitio PI-Scel 3’ la construcción dirigida de 5’ a 3’ se incluía un brazo de homología 5’ que contenía una secuencia 5’ del locus de cadena ligera  de ratón que se obtiene del clon BAC 302g12, un gen de resistencia a la neomicina con sitios FRT, una secuencia genómica que incluye un promotor V3-15, una secuencia líder del segmento genético variable V3-7 de ratón, una secuencia de intrón del segmento genético

45 variable V3-7 de ratón, una fase de lectura abierta de una región V1-39J5 de la línea germinal humana reordenada, una secuencia genómica que contiene una porción del intrón J-C, y un brazo de homología 3’ que contenía la secuencia 30 del segmento genético J5 endógeno de ratón del clon BAC 254m04 de ratón (Figura 1, en el centro). Los genes y/o secuencias corriente arriba el locus de cadena ligera  endógeno de ratón y corriente abajo de la mayoría del segmento genético J 3’ (por ejemplo, el amplificador 3’ endógeno) no se modificaban por la

50 construcción dirigida (véase la Figura 1). La secuencia del locus V1-39J5 humano modificado genéticamente se muestra en la SEC ID Nº 1.

La inserción dirigida de región V1-39J5 de la línea germinal humana reordenada en el ADN BAC se confirmó por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando cebadores localizados en las secuencias de la región de 55 cadena ligera de la línea germinal humana reordenada. En resumen, la secuencia de intrón 3’ de la secuencia líder V3-7 de ratón se confirmó con los cebadores ULC-m1F (AGGTGAGGGT ACAGATAAGT GTTATGAG; SEC ID Nº 2) y ULC-m1R (TGACAAATGC CCTAATTATA GTGATCA; SEC ID Nº 3). La fase de lectura abierta de la región V1-39 de la línea germinal humana reordenada se confirmó con los cebadores 1633-h2F (GGGCAAGTCA GAGCATTAGCA; SEC ID Nº 4) y 1633-h2R (TGCAAACTGG ATGCAGCATAG; SEC ID Nº 5). El casete de

60 neomicina se confirmó con los cebadores neoF (GGTGGAGAGG CTATTCGGC; SEC ID Nº 6) y neoR (GAACACGGCG GCATCAG; SEC ID Nº 7).El ADN BAC dirigido se utilizó entonces para electroporar células ES de ratón para crear células ES modificadas para generar ratones quiméricas que expresan una región V1-39J5 de la línea germinal humana reordenada.

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Tabla 5

Anticuerpos con cadena ligera V1-39J5 común

Anticuerpo: % de bloqueo de perlas marcadas con Antígeno E % de bloqueo de Antígeno E en solución

2948: 81,1 47,8

2948G: 38,6 ND

2949: 97,6 78,8

2949G: 97,1 73,7

2950: 96,2 81,9

2950G: 89,8 31,4

2952: 96,1 74,3

2952G: 93,5 39,9

2954: 93,7 70,1

2954G: 91,7 30,1

2955: 75,8 30,0

2955G: 71,8 ND

2964: 92,1 31,4

2964G: 94,6 43,0

2978: 98,0 95,1

2978G: 13,9 94,1

2982: 92,8 78,5

2982G: 41,9 52,4

2985: 39,5 31,2

2985G: 2,0 5,0

2987: 81,7 67,8

2987G: 26,6 29,3

2996: 87,3 55,3

2996G: 95,9 38,4

2997: 93,4 70,6

2997G: 9,7 7,5

3004: 79,0 48,4

3004G: 60,3 40,7

3005: 97,4 93,5

3005G: 77,5 75,6

3010: 98,0 82,6

3010G: 97,9 81,0

3011: 87,4 42,8

3011G: 83,5 41,7

14-09-2015 E11703799

3012: 91,0 60,8

3012G: 52,4 16,8

3013: 80,3 65,8

3013G: 17,5 15,4

3014: 63,4 20,7

3014G: 74,4 28,5

3015: 89,1 55,7

3015G: 58,8 17,3

3016: 97,1 81,6

3016G: 93,1 66,4

3017: 94,8 70,2

3017G: 87,9 40,8

3018: 85,4 54,0

3018G: 26,1 12,7

3019: 99,3 92,4

3019G: 99,3 88,1

3020: 96,7 90,3

3020G: 85,2 41,5

3021: 74,5 26,1

3021G: 81,1 27,4

3022: 65,2 17,6

3022G: 67,2 9,1

3023: 71,4 28,5

3023G: 73,8 29,7

3024: 73,9 32,6

3024G: 89,0 10,0

3025: 70,7 15,6

3025G: 76,7 24,3

3027: 96,2 61,6

3027G: 98,6 75,3

3028: 92,4 29,0

3028G: 87,3 28,8

3030: 6,0 10,6

3030G: 41,3 14,2

3032: 76,5 31,4

3032G: 17,7 11,0

3033: 98,2 86,1

14-09-2015

3033G: 93,6 64,0

3036: 74,7 32,7

3036G: 90,1 51,2

3041: 95,3 75,9

3041G: 92,4 51,6

3042: 88,1 73,3

3042G: 60,9 25,2

3043: 90,8 65,8

3043G: 92,8 60,3

tabla 6

Anticuerpos con cadena ligera V3-20J1 común

2968: 97,1 73,3

2968G: 67,1 14,6

2969: 51,7 20,3

2969G: 37,2 16,5

2970: 92,2 34,2

2970G: 92,7 27,2

2971: 23,4 11,6

2971G: 18,8 18,9

2972: 67,1 38,8

2972G: 64,5 39,2

2973: 77,7 27,0

2973G: 51,1 20,7

2974: 57,8 12,4

2974G: 69,9 17,6

2975: 49,4 18,2

2975G: 32,0 19,5

2976: 1,0 1,0

2976G: 50,4 20,4

Ejemplo 8. Determinación de la capacidad de bloqueo de los anticuerpos con cadena ligera común específica del antígeno por ELISA

5 Los anticuerpos con cadena ligera común humanos que aparecen contra al Antígeno E se ensayaron en cuento a su capacidad para bloquear la unión del Antígeno E a una superficie revestida con el Ligando Y en un ensayo ELISA.

Se revistió con Ligando Y placas de 96 pocillos a una concentración de 2 g/ml en PBS y se incubaron durante una

10 noche seguido por el lavado 4 veces con PBS con un 0,05% de Tween-20. La placa se bloqueó entonces con PBS (Irvine Scientific, Santa Ana, CA) que contenía un 0,5% (p/v) de BSA (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO) durante una hora a temperatura ambiente. En una placa distinta se diluyeron 1:10 los sobrenadantes que contenían anticuerpos con cadena ligera común anti-Antígeno E en tampón. Se utilizó un sobrenadante falso con los mismos

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componentes que los anticuerpos como control negativo. Se añadió Antígeno E-mmH (descrito anteriormente) a una concentración final de 0,150 nM y se incubó durante una hora a temperatura ambiente. La mezcla de anticuerpo/Antígeno E-mmH se añadió entonces a la placa que contenía el Ligando Y y se incubó durante una hora a temperatura ambiente. La detección del Antígeno E-mmH unido al Ligando Y se determinó con una peroxidasa de 5 rábano rusticano (HRP) conjugada con un anticuerpo anti-Penta-His (Qiagen, Valencia, CA) y se desarrolló por respuesta colorimétrica de referencia utilizando un sustrato de tetrametilbenzidina (TMB) (BD Biosciences, San Jose, CA) neutralizado por ácido sulfúrico. Se leyó la absorbancia a una DO450 durante 0,1 s. Se restó la absorbancia de fondo de una muestra sin Antígeno E de todas las muestras. Se calculó el porcentaje de bloqueo dividiendo la MFI con el fondo sustraído de cada muestra por el valor del control negativo ajustado, multiplicando por 100 y restando el

10 valor del resultado de 100.

Las Tablas 7 y 8 muestran el porcentaje de bloqueo de los 98 anticuerpos con cadena ligera común anti-Antígeno E ensayados en el ensayo ELISA. ND: no determinado bajo las condiciones experimentales en curso.

15 Como se describe en el presente Ejemplo, de los 80 anticuerpos con cadena ligera común que contenían una cadena ligera V1-39J5 modificada que se ensayaron en cuanto a su capacidad para bloquear la unión del Antígeno E a una superficie revestida con Ligando Y, 22 demostraron > 50% de bloqueo, mientras que 58 demostraron < 50% de bloqueo (20 con un 25-50% de bloqueo y 38 con < 25% de bloqueo). Para los 18 anticuerpos con cadena ligera común que contenían la cadena ligera V3-20J1 modificada, 1 demostraba > 50% de bloqueo,

20 mientras que 17 demostraban < 50% de bloqueo (5 con 25-50% de bloqueo y 12 < 25% de bloqueo) de la unión del Antígeno E a la superficie revestida con el Ligando Y.

Estos resultados también son consistentes con el grupo de anticuerpos con cadena ligera común específica de Antígeno E que comprende anticuerpos que especificidad de epítopo solapada o no solapada con respecto al

25 Antígeno E.

Tabla 7

Anticuerpos con cadena ligera V1-39J5 común

Anticuerpo: % de bloqueo del Antígeno E en solución

2948: 21,8

2948G: 22,9

2949: 79,5

2949G: 71,5

2950: 80,4

2950G: 30,9

2952: 66,9

2952G: 47,3

2954: 55,9

2954G: 44,7

2955: 12,1

2955G: 25,6

2964: 34,8

2964G: 47,7

2978: 90,0

2978G: 90,2

2982: 59,0

2982G: 20,4

2985: 10,5

2985G: ND

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2987: 31,4

2987G: ND

2996: 29,3

2996G: ND

2997: 48,7

2997G: ND

3004: 16,7

3004G: 3,5

3005: 87,2

3005G: 54,3

3010: 74,5

3010G: 84,6

3011: 19,4

3011G: ND

3012: 45,0

3012G: 12,6

3013: 39,0

3013G: 9,6

3014: 5,2

3014G: 17,1

3015: 23,7

3015G: 10,2

3016: 78,1

3016G: 37,4

3017: 61,6

3017G: 25,2

3018: 40,6

3018G: 14,5

3019: 94,6

3019G: 92,3

3020: 80,8

3020G: ND

3021: 7,6

3021G: 20,7

3022: 2,4

3022G: 15,0

3023: 9,1

3023G: 19,2

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14-09-2015

2955G: 12,0 4

2964: 14,8 6

2964G: 13,0 9

2978: 1,91 49

2978G: 1,80 58

2982: 6,41 19

2982G: 16,3 9

2985: 64,4 9

2985G: 2,44 8

2987: 21,0 11

2987G: 37,6 4

2996: 10,8 9

2996G: 24,0 2

2997: 7,75 19

2997G: 151 1

3004: 46,5 14

3004G: 1,93 91

3005: 2,35 108

3005G: 6,96 27

3010: 4,13 26

3010G: 2,10 49

3011: 59,1 5

3011 G: 41,7 5

3012: 9,71 20

3012G: 89,9 2

3013: 20,2 20

3013G: 13,2 4

3014: 213 4

3014G: 36,8 3

3015: 29,1 11

3015G: 65,9 0

3016: 4,99 17

3016G: 18,9 4

3017: 9,83 8

3017G: 55,4 2

3018: 11,3 36

3018G: 32,5 3

3019: 1,54 59

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14-09-2015 E11703799

2950: 3296 4292 7756 5171 4749

2950G: 2521 2408 7532 5079 3455

2952: 3384 1619 1269 168 911

2952G: 3358 1001 108 55 244

2954: 2808 3815 7114 5039 3396

2954G: 2643 2711 7620 5406 3499

2955: 1310 2472 4738 3765 1637

2955G: 1324 1802 4910 3755 1623

2964: 5108 1125 4185 346 44

2964G: 4999 729 4646 534 91

2978: 6986 2800 14542 10674 8049

2978G: 5464 3295 11652 8026 6452

2982: 4955 2388 13200 9490 6772

2982G: 3222 2013 8672 6509 4949

2985: 1358 832 4986 3892 1669

2985G: 43 43 128 244 116

2987: 3117 1674 7646 5944 2546

2987G: 3068 1537 9202 6004 4744

2996: 4666 1917 12875 9046 6459

2996G: 2752 1736 8742 6150 4873

2997: 5164 2159 12167 8361 5922

2997G: 658 356 3392 2325 1020

3004: 2794 1397 8542 6268 3083

3004G: 2753 1508 8267 5808 4345

3005: 5683 2221 12900 9864 5868

3005G: 4344 2732 10669 7125 5880

3010: 4829 1617 2642 3887 44

3010G: 3685 1097 2540 3022 51

3011: 2859 2015 7855 5513 3863

3011 G: 2005 1072 6194 4041 3181

3012: 3233 2221 8543 5637 3307

3012G: 968 378 3115 2261 1198

3013: 2343 1791 6715 4810 2528

3013G: 327 144 1333 1225 370

3014: 1225 1089 5436 3621 1718

3014G: 1585 851 5178 3705 2411

3015: 3202 2068 8262 5554 3796

3015G: 1243 531 4246 2643 1611

14-09-2015 E11703799

3016: 4220 2543 8920 5999 5666

3016G: 2519 1277 6344 4288 4091

3017: 3545 2553 8700 5547 5098

3017G: 1972 1081 5763 3825 3038

3018: 2339 1971 6140 4515 2293

3018G: 254 118 978 1020 345

3019: 5235 1882 7108 4249 54

3019G: 4090 1270 4769 3474 214

3020: 3883 3107 8591 6602 4420

3020G: 2165 1209 6489 4295 2912

3021: 1961 1472 6872 4641 2742

3021G: 2091 1005 6430 3988 2935

3022: 2418 793 7523 2679 36

3022G: 2189 831 6182 3051 132

3023: 1692 1411 5788 3898 2054

3023G: 1770 825 5702 3677 2648

3024: 1819 1467 6179 4557 2450

3024G: 100 87 268 433 131

3025: 1853 1233 6413 4337 2581

3025G: 1782 791 5773 3871 2717

3027: 4131 1018 582 2510 22

3027G: 3492 814 1933 2596 42

3028: 4361 2545 9884 5639 975

3028G: 2835 1398 7124 3885 597

3030: 463 277 1266 1130 391

3030G: 943 302 3420 2570 1186

3032: 2083 1496 6594 4402 2405

3032G: 295 106 814 902 292

3033: 4409 2774 8971 6331 5825

3033G: 2499 1234 6745 4174 4210

3036: 1755 1362 6137 4041 1987

3036G: 2313 1073 6387 4243 3173

3041: 3674 2655 8629 5837 4082

3041G: 2519 1265 6468 4274 3320

3042: 2653 2137 7277 5124 3325

3042G: 1117 463 4205 2762 1519

3043: 3036 2128 7607 5532 3366

14-09-2015

3043G: 2293 1319 6573 4403 3228

Tabla 12

Anticuerpos con cadena ligera V3-20J1 común

Anticuerpo: Intensidad media de fluorescencia (MFI)

Antígeno E-ECD: Antígeno E-CT Antígeno E-Ala1 Antígeno E-Ala2 Mf Antígeno E

2968: 6559 3454 14662 3388 29

2968G: 2149 375 9109 129 22

2969: 2014 1857 7509 5671 3021

2969G: 1347 610 6133 4942 2513

2970: 5518 1324 14214 607 32

2970G: 4683 599 12321 506 31

2971: 501 490 2506 2017 754

2971G: 578 265 2457 2062 724

2972: 2164 2158 8408 6409 3166

2972G: 1730 992 6364 4602 2146

2973: 3527 1148 3967 44 84

2973G: 1294 276 1603 28 44

2974: 1766 722 8821 241 19

2974G: 2036 228 8172 135 26

2975: 1990 1476 8669 6134 2468

2975G: 890 315 4194 3987 1376

2976: 147 140 996 1079 181

2976G: 1365 460 6024 3929 1625

Los sobrenadantes con anticuerpos con cadena ligera común anti-Antígeno E mostraban una unión altamente específica a las perlas unidas al Antígeno E-ECD. En estas perlas, el sobrenadante falso de control negativo daba

5 como resultado una señal insignificante (< 10 MFI) cuando se combina con la muestra de perlas con el Antígeno E-ECD, mientras que los sobrenadantes que contenían anticuerpos con cadena ligera común anti-Antígeno E mostraban una fuerte señal de unión (MFI media de 2627 para los 98 sobrenadantes con anticuerpo; MFI > 500 para 91/98 muestras de anticuerpo).

10 Como se mide en cuento a la capacidad de los anticuerpos seleccionados con cadena ligera común anti-Antígeno E, se determinó la unión relativa de los anticuerpos con las variantes. Las cuatro variantes de Antígeno E cuando se capturaron con perlas Luminex™ anti-myc como se describe anteriormente para los estudios de unión con el Antígeno E-ECD nativo, y se determinaron las relaciones de unión relativas (MFIvariante/MFIAntígeno E-ECD). Para los 98 sobrenadantes con anticuerpos con cadena ligera común que se muestran en las Tablas 11 y 12, las relaciones

15 medias (MFIvariante/MFIAntígeno E-ECD) son diferentes para cada variante, probablemente reflejando diferentes cantidades de captura de las proteínas en las perlas (relaciones medias de 0,61, 2,9, 2,0, y 1,0 para Antígeno ECT, Antígeno E-Ala1, Antígeno E-Ala2 y Mf Antígeno E, respectivamente). Para cada variante de proteína, la unión para un subgrupo de los 98 anticuerpos con cadena ligera común ensayados mostraba una unión muy reducida, indicando la sensibilidad de la mutación que caracterizaba una variante determinada. Por ejemplo, 19 de las

20 muestras de anticuerpo con cadena ligera común del Mf Antígeno E con MFIvariante/MFIAntígeno E-ECD < 8%. Mientras que muchos de este grupos incluyen anticuerpos con una afinidad alta o moderadamente alta (5 con KD < 5 nM, 15 con KD < 50 nM), es probable que la señal más baja para este grupo sea como resultado de la sensibilidad a las diferencias de secuencia (epítopo) entre el Antígeno E-ECD nativo u una variante determinada más que por afinidades más bajas.

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Claims

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