RS55315B2 - Miš sa zajedničkim lakim lancem - Google Patents

Description

Oblast pronalaska

[0001] Opisan je genetski modifikovan miš koji eksprimira antitela koja imaju zajednički humani varijablan /mišji konstantan lak lanac povezan sa različitim humanim varijablnim/mišjim konstantnim teškim lanacima. Takođe je data metoda za dobijanje humanih bispecifičnih antitela od sekvenci gena humanih varijablnih regiona B ćelija miša.

Stanje tehnike

[0002] Antitela obično sadrže homodimerne komponente teškog lanca, gde je svaki monomer teškog lanca povezan je sa identičnim lakim lancem. Antitela sa heterodimerinom komponentom teškog lanca (npr., bispecifična antitela) su poželjna kao terapeutska antitela. Međutim, dobijanje bispecifičnih antitela sa odgovarajućom komponentnom lakog lanca koja se na zadovoljavajući način može povezati sa svakim od teških lanaca bispecifičnog antitela se pokazalo kao sporno.

[0003] U jednom pristupu, lak lanac može se odabre pregledom statističkog korišćenja varijabilnih domena lakih lanaca, čime se identifikuje najčešće korišćen lak lanac u antitelima čoveka i sparivanje ovog lakog lanca in vitro sa dva teška lanca različite specifičnosti.

[0004] U narednom pristupu, lak lanac se može odabrati promatranjem sekvenci lakog lanca u biblioteci eksponiranoj na fazima (engl.phage display library (npr., biblioteka eksponiranja na fazima koja sadrži sekvence varijabilnog regiona humanog lakog lanca, npr., biblioteka humanog ScFv)) i izborom najčešće korišćenog varijabilnog regiona lakog lanca iz biblioteke. Laki lanac se zatim može testirati na dva različita teška lanca od interesa.

[0005] U narednom pristupu, laki lanac se može odabrati testiranjem biblioteke varijabilnih sekvenci lakog lanca eksponiranih na fazima korišćenjem kao proba, varijabilnih sekvenci oba teška lanca od interesa. Laki lanac koji se vezuje sa varijabilnim sekvencama oba teška lanca, može se izabrati kao lak lanac za teške lance.

[0006] U sledećem pristupu, naznačen laki lanac može da bude poređen poravnanjem sa lakim lancima koji pripadaju tim teškim lancima i vrše se modifikacije na lakim lancima tako da oni bolje odgovaraju karakteristikama sekvenci koje su zajedničke za lake lance oba teško lanca. Ukoliko se verovatnoća za imunogenost želi da svede na minimum, modifikacije pretežno daju sekvence koje su prisutne u poznatim sekvencama lakih lanaca čoveka, tako da je malo verovatno da će proteolitička obrada dovesti do stvaranja T ćelijskog epitopa zasnovanog na parameterima i metodama koje su poznate u tehnici za procenu verovatnoće imunogenosti (tj., in silico kao i (engl.wet assays) vlažne probe)).

[0007] Svi navedeni pristupi zasnivaju se na in vitro metodama koje uključuju brojna a priori ograničenja, npr., identičnost sekvenci, sposobnost da se vezuje sa specifičnim prethodno odabranim teškim lancima, itd.U tehnici postoji potreba za kompozicijama i metodama koje se ne oslanjaju na uslov manipulisanja in vitro, već umesto toga primenjuju biološki osetljivije pristupe za dobijanje proteina koji vezuju epitop čoveka i koji uključuju zajednički laki lanac.

Kratak opis slika

[0008]

Slika 1 ilustruje strategiju ciljanja zamene segmenata gena endogenog varijabilnog regiona lakog lanca imunoglobulina miša regionom Vκ1-39Jκ5 gena čoveka.

Slika 2 ilustruje strategiju ciljanja zamene segmenata gena endogenog varijabilnog regiona lakog lanca imunoglobulina miša regionom Vκ3-20Jκ1 gena čoveka.

Slika 3 ilustruje strategiju ciljanja zamene segmenata gena endogenog varijabilnog regiona lakog lanca imunoglobulina miša regionom VpreB/Jλ5 gena čoveka.

OPIS

[0009] Opisani su genetski modifikovani miševi koji eksprimiraju varijabilne domene teškog i lakog lanca imunoglobulina čoveka, pri čemu miševi imaju ograničen repertoar varijabilnog lakog lanca. Genetski modifikovani miš koji eksprimira varijabilne domene teškog i lakog lanca čoveka, pri čemu su varijabilni regioni lakog lanca čoveka eksprimirani iz jedne preuređene sekvence gena varigbilnog regiona (VL/JL) lakog lanca imunoglobulina čoveka koja je prisutan u germitivnoj liniji ćelija miša koja obuhvata sekvencu germitivne linje segmenta VLgena i sekvencu germitivne linije segmenta JLgena, gde je varijabilni region lakog lanca imunoglobulina čoveka preuređen Vκ1-39/Jκ5, pri čemu:

(a) miš bez lokusa endogenog varijabilnog regiona lakog lanca κ imunoglobulina miša koji ima posobnost rearanžiranja i formiranja gena koji kodira varijabilni region κ miša;

(b) miš eksprimira zajednički laki lanac imunoglobulina ćoveka za veći broj humanih teških lanaca, gde je zajednički laki lanac izveden iz genske sekvence varijabilnog regiona lakog lanca imunoglobulina čoveka;

(c) miš sadrži B ćeliju koja eksprimira antitelo koje se spefično vezuje za antigen od interesa, pri čemu antitelo sadrži dati zajednički laki lanac i teški lanac imunoglobulina izveden i rearanžiranog varijabilnog genskog segmenta teškog lanca (VH) humanog imunoglobulina odabranog iz grupe koju čine segment VH2-5, VH3-23, VH3-30, VH4-59 i VH5-51 gena; i

(d) 90-100% endogenih nerearanžiranih genskih segmenata VHmiša je zamenjeno većim brojem nerearanžiranih genskih segmenata VHčoveka.

[0010] Dalje je obezbeđen i postupak dobijanja antitela koje vezuje antigen od interesa, a koji obuhvata imunizaciju miša antigenom od interesa i primenu sekvence gena varijabilnog regiona humanog imunoglobulina iz miša dobijanje antitela. Takođe je obezbeđena upotreba miša za dobianje antitela. Dodatno je obzbeđen i postupak za dobijanje humanog bispecifičnog antitela, koji obuhvata dobijanje genske sekvence varijabilnog regiona humanog imunoglobulina iz B ćelija miša i dobijanje antitela sa datim sekvencama.

[0011] Takođe se odnosi i na biološki sistem za dobijanje varijabilnog domena humanog lakog lanca koji se povezuje i eksprimira sa različitim repertoarom afinitetno-zrelih varijabilnih domena humanog teškog lanca. Dalje obezbeđana je i upotreba miša za dobijanje ćelije koja eksprimira humano bispecifično antitelo, pri čemu su sekvence varijabilnog regiona teškog lanca humanog bispecifičnog antitela eksprimirane iz sekvenci varijabilnih regiona teškog lanca humanog imunoglobulina dobijenim iz B ćelija miša.

[0012] Takođe je obezbeđena i upotreba miša za identifikaciju varijabilnog domena teškog lanca humanog imunoglobulina prisutnog u teškom lancu imunoglobulina koji je povezan sa jednim lakim lancem.

[0013] Dalje, dati su i biološki sistemi za dobijanje varijabilnih domena lakog lanca čoveka koji se povezuje i eksprimira sa različitim repertoarom afinitetno-sazrelih varijabilnih domena teškog lanca čoveka. Takođe upućuje i na metode za dobijanje vezujućih proteina koji sadrže varijabilne domene imunoglobulina, a obuhvataju imunizaciju miševa koji imaju ograničen repertoar imunoglobulinskog lakog lanca sa antigenom od interesa i primenu genske sekvence varijabilnog regiona mišjeg imunoglobulina za vezivanje proteina koji specifično vezuje antigen od interesa. Metode obuhvataju metode za dobijanje varijabilnih domena humanog imunoglobulinskog teškog lanca koji su pogodni za primenu u dobijanju multispecifičnih antigen-vezujućih proteina.

[0014] Dobijeni genetski modifikovani miševi mogu da odaberu odgovarajuće afinitetno-sazrele varijabilne domene humanog imunoglobulinskog teškog lanca izvedene iz repertoara nepreuređenih /nerearanžiranih genskih segmenata varijabilnih regiona humanog teškog lanca, pri čemu afinitetno -sazreli vrijabilni domeni humanog teškog lanca vezuju i eksprimiraju jedan varijabilni domen humanog lakog lanca izveden iz jednog genskog segmenta varijabilnog regiona humanog lakog lanca.

[0015] Dobijeni genetski modifikovanim miševi eksprimiraju jedan varijabilni domen humanog lakog lanca, iz genskih segmenata varijabilnog regiona jednog humanog lakog lanca.

[0016] Takođe je dat genetski modifikovani miše koji sadrži genski segment variajbilnog regiona (VL) jednog humanog imunoglobulinskog lakog lanca koji je sposoban da preuredi i kodira VL domen lakog lanca imunoglobulina čoveka. U narednom slučaju, miš sadrži ne više od dva humana VL genska segmenta koji su sposobni da preurede i kodiraju VL domen lakog lanca imunoglobulina čoveka.

[0017] Dobijeni genetski modifikovan miš sadrži jedan preuređen (V/J) segment varijabilnog regiona (V/L) humanog imunoglobulinskog lakog lanca (tj., V/J segment) koji kodira VL domen lakog lanca imunoglobulina čoveka.

[0018] Genski segment VL je genski segment Vκ1-39Jκ5 čoveka.

[0019] U narednoj realizaciji, genski segment VL čoveka je operativno vezan za humanu ili mišju vodeću sekvencu. U jednoj realzaciji, vodeža sekvenca je mišja vodeća sekvenca. U specifičnoj realizaciji, mišja vodeža sekvenca je mišja Vκ3-7 vodeća sekvenca.

[0020] U jednoj realizaciji, VL genski segment je operativno vezan za imunoglobulinsku promoter sekvencu. U jednoj realizaciji, promotor sekvenca je humana promotor sekvenca. U specifičnoj realizaciji, imunoglobulinski promotor čoveka je promotor Vκ3-15.

[0021] Takođe je dat i genetski modifikovani miš koji sadrži VL lokus koji ne sadrži endogeni mišji VL genski segment koji može da rearanžira/preuredi, tako da se formira gen imunoglobulinskog lakog lanca, pri čemu VL lokus sadrži jedan humani VL genski segment koji ima sposobnost rearanžiranja, tako da kodira VL region gena lakog lanca. Genski segment VL čoveka je humani Vκ1-39Jκ5 genski segment.

[0022] U jednoj realizaciji, VL lokus sadrži vodeću sekvencu sa bočnim 5' (u odnosu na smer transkripcije VL genskog segmenta) sa imunoglobulinskim promotorom čoveka i bolnim 3' sa genskim segmentom VL čoveka koji rearanžira i kodira VL domen reversnog himernog lakog lanca koji /koja obuhvata konstantan region (CL) endogenog mišjeg lakog lanca. U posebnoj realizaciji, genski segment VL je na mišjem kapa (κ) VL lokusu, i mišji CL je mišji κ CL.

[0023] U jednoj realizaciji, miš sadrži nefunkcionalni lambda (λ) lokus imunoglobulinskog lakog lanca. U posebnoj realizaciji, λ lokus obuhvata deleciju jedne ili više sekvenci lokusa, pri čemu jedan ili više delecija čini da λ lokus nesposobnim za rearanžiranjetako da obrazuje gen lakog lanca. U sledećoj realizaciji, svi ili suštinski svi segmenti VL gena λ lokusa su uklonjeni.

[0024] U jednoj realizaciji, VL lokus modifikovanog mišta je lokus κ, i lokus κ sadrži pojačivač kapa introna miša mišji κ intronski pojačivač, mišji κ 3' pojačivač, ili i introniski 3' pojačivač.

[0025] U jednoj realizaciji, miš pravi lak lanac koji sadrži somatski mutiran VL domen izveden iz genskog segmenta VL čoveka. U jednoj realizaciji, laki lanac sadrži somatski mutiran VL domen izveden iz humanog VL genskog segmenta i mišji κ CL region. U jednoj realizaciji, miš ne eksprimira λ laki lanac.

[0026] U jednoj realizaciji, genetski modifikovan miše je sposoban da somatski hipermutira region VL sekvencu region.

[0027] U jednoj realizaciji, miš sadrži ćeliju koja eksprimira lak lanac koji sadrži somatski mutiran VL domen čoveka povezan sa mišjim κ CL, pri čemu je laki lanac povezan sa teškim lancem koji sadrži somtastki mutiran VHdomen izveden iz humanog VH genskog segmenta i pri čemu težak lanac sadrži konstantan region mišjeg teškog lanca (CH).

[0028] U datom mišu, 90%-100% endogeno nerearanžiranih mišjih VHgenskih segmenta miša zamenjeno je većim brojem nerearanžiranih VHgenskih segmenata čoveka. Miš može da sadrži zamenu endogenih genskih segmenata VHmiša sa većim brojem VHgenski segmenata čoveka, pri čemu su VHgenski segmenti čoveka operablno vezani za CHregion gena miša, tako da miš rearanžira VHgenske segmente čoveka i eksprimira reversno i težak lanac imunoglobulina čoveka koji sadrži domen VHčoveka i CHmiša. U specifičnoj realizaciji, svi ili suštinski svi endogeni genski segmenti VHmiša zmanjeni su većim broje nerearanžiranih genskih segmenata VHčoveka. U jednoj realizaciji, zamanjeno je najmanje 19, najmanje 39, ili najmanje 80 ili 81 neraranžiran VHgenski segment čoveka. U sledećoj realizaciji, zamanjeno je najmanje 12 funkcionalnih nerearanžiranih VH genskih segmenata čoveka, najmanje 25 funkcionalnih neraranžiranih VHgenskih segmenata čoveka ili najmanje 43 funkcionalna nerearanžirania humana VHgenska segmenta. U jednoj realizaciji, miš obuhvata zamenu svih mišjih D i J segmenata najmanje jednim nerearanžiranim D segmentom čoveka i najmanje jednim neraranžiranim J segmentom čoveka. U jednoj realizaciji, najmanje jedan neraranžiran D segment čoveka je odabran od D1-7, D1-26, D3-3, D3-10, D3-16, D3-22, D5-5, D5-12, D6-6, D6-13, D7-27, i njihove kombinacije. U jednoj realizaciji, najmanje jedan neraranžiran J segment čoveka je odabran od J1, J3, J4, J5, J6, i njihove kombinacije. U posebnoj realizaciji, jedan ili više segmenata VH gena čoveka odabrano je od 1-2, 1-8, 1-24, 2-5, 3-7, 3-9, 3-11, 3-13, 3-15, 3-20, 3-23, 3-30, 3-33, 3-48, 4-31, 4-39, 4-59, 5-51, 6-1 humanog VH genskog segmenta i njihove kombinacije.

[0029] Dat je takav miš koji sadrži B ćeliju koja eksprimira antitelo koje speifično vezuje antigen od interesa, pri čemu antitelo sadrži zajednički lak lanac i težak lanac imunoglobulina izveden preuređivanjem varijabilnog (VH) genskog segmenta teškog lanca imunoglobulina čoveka odabranog iz grupe koju čine VH2-5, VH3-23, VH3-30, VH4-59, i VH5-51 genski segment.

U jednoj realizaciji, miš sadrži B ćeliju koja eksprimira vezujući protein koji specifično veže antigen od interesa, pri čemu vezujući protein sadrži laki lanac izveden od preuređenog humanog Vκ1-39/Jκ5 i pri čemu ćelija sadrži preuređen gen imunoglobulinskog teškog lanca izveden iz preuređenih segmenata gena čoveka odabranih od segmenata VH2-5, VH3-23, VH3-30, VH 4-39, VH4-59, i VH5-51 gena. U jednoj realizaciji, jedan ili više segmenata VH gena čoveka je preuređeno sa humanim segmentom teškog lanca J odabranim od J1, J3, J4, J5, i J6. U jednoj realizaciji, tjedan ili više genskih segmenata VH i J čoveka preuređeno je D genskim segmentom čoveka odabranim od D1-7, D1-26, D3-3, D3-10, D3-16, D3-22, D5-5, D5-12, D6-6, D6-13, i D7-27. U posebnoj realizaciji, gen lakog lanca sadrži 1, 2, 3, 4, ili 5 ili više somatskih hipermutacija.

[0030] U jednoj realizaciji, miš sadrži B ćeliju koja eksprimira preuređenu gensku sekvencu varijabilnog regiona imunoglobulinskog lakog lanca koja sadrži VH, JH, i DH genskisegment odabran od VH 2-5 JH1 D6-6, VH3-23 JH4 D3, VH3-23 JH4 D3-10, VH3-30 JH1 D6-6, VH3-30 JH3 D6-6, VH3-30 JH4 D1-7, VH3-30 JH4 D5-12, VH3-30 JH4 D6-13, VH3-30 JH4 D6-6, VH3-30 JH4 D7-27, VH3-30 JH5 D3-22, VH3-30 JH5 D6-6, VH3-30 JH5 D7-27, VH4-39 JH3 D1-26, VH4-59 JH3 D3-16, VH4-59 JH3 D3-22, VH4-59 JH4 D3-16, VH5-51 JH3 D5-5, VH5-51 JH5 D6-13, and VH5-51 JH6 D3-16. U posebnoj realizaciji, B ćelija eksprimira vezujući protein koji sadrži varijabilni region teškog lanca imunoglobulina čoveka koji je spojen sa konstantnim regionom mišjeg teškog lanca i varijabilni region humanog imunoglobulinskog lakog lanca koji je spoje sa konstantnim regionom mišjeg lakog lanca.

[0031] U jednoj realizaciji, genski segment VL čoveka je genski segment Vκ1-39Jκ5 čoveka i miš eksprimira reversni himerni laki lanac koji sadrži (i) VL domen izveden od humanog VL genskog segmenta i (ii) mišji CL; pri čemu laki lanac je povezan sa reversnim himernim teškim lancem koji sadrži (i) mišji CH i (ii) somatski mutiran domen VH čoveka izveden iz genskog segmenta VH čoveka koji je odabran od 1-2, 1-8, 1-24, 2-5, 3-7, 3-9, 3-11, 3-13, 3-15, 3-20, 3-23, 3-30, 3-33, 3-48, 4-31, 4-39, 4-59, 5-51, i 6-1 genskog segmenta VH čoveka i njihove kombinacije. U jednoj realizaciji, miš eksprimira laki lanac koji je somatski mutiran. CL je mišji κCL.

[0032] Takođe je opisan miš koji sadrži i genski segment Vκ1-39Jκ5 čoveka i genski segment Vκ3-20Jκ1 čoveka i miš eksprimira reversni himerni laki lanac koji sadrži (i) VL domen izveden od humanog Vκ1-39Jκ5 genskog segmenta ili Vκ3-20Jκ1 genskog segmenta čoveka, i (ii) mišji CL; pri čemu je laki lanac povezan sa reversnim himernim teškim lancem koji sadrži (i) mišji CH, i (ii) somatski mutiran VH čoveka izveden od VH genskog segmenta čoveka koji je odabran od 1-2, 1-8, 1-24, 2-5, 3-7, 3-9, 3-11, 3-13, 3-15, 3-20, 3-23, 3-30, 3-33, 3-48, 4-31, 4-39, 4-59, 5-51, 6-1 genskog segmenta VH čoveka i njihove kombinacije. U jednom slučaju, miš eksprimira laki lanac koji je somatski mutiran. U jednom slučaju CL je mišji κ CL.

[0033] Kod datog miša 90-100% endogenih nerearanžiranih genskih segmenata VHmiša je zamenjeno većim brojem nerearanžiranih genskih segmenata VHčoveka U posebnoj realizaciji, svi ili suštinski svi endogeni nerearanžirani mišji VHgenski segmenti zamenjeni su većim brojem nerearanžiranih VHgenskih segmenata čoveka. U jednoj realizaciji, zamenjeno je sa najmanje 18, najmanje 39, najmanje 80, ili 81 nerearanžiranim genskim segmentom VHčoveka. U jednoj realizaciji, zamenjeno je sa najmanje 12 funkcionalnih nerearanžiranih VHgenskih segmenata čoveka, najmanje 25 funkcionalnih nerearanžiranih genskih segmenata VHčoveka ili najmanje 43 nerearanžirana genska segmenta VHčoveka.

[0034] U jednoj realizaciji, genetski modifikovan mis je soj C57BL, u posebnoj realizaciji odabran je od C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57åBL/10Cr, C57BL/Ola. U posebnoj realizaciji, the genetski modifiikovan miš je kombinacija prethodno navednenog soja 129 i prethodno navedenog soja C57BL/6. U sledećoj specifičnoj realizaciji, miše je kombinacija prethodno navedneih sojeva 129 ili kombinaicja prethodno navedenih sojeva BL/6. U posebnoj realizaciji, soj 129 kombinacije je soj129S6 (129/SvEvTac).

[0035] U jednoj realizaciji, miš eksprimira reversno himerno antitelo koje sadrži laki lanac koji sadrži mišji κ CL i somatski mutiran VL domen čoveka izveden iz segmenta Vκ1-39Jκ5 gena čoveka ili segmenta Vκ3-20Jκ1 gena čoveka i teški lanac koji sadrži mišji CH i somatski mutiran VH domen čoveka izveden iz segmenta VH gena čoveka odabran od 1-2, 1-8, 1-24, 2-5, 3-7, 3-9, 3-11, 3-13, 3-15, 3-20, 3-23, 3-30, 3-33, 3-48, 4-31, 4-39, 4-59, 5-51, i 6-1 segmenta VH gena čoveka, pri čemu miš ne eksprimira celo mišje antitelo i ne eksprimira celo antitelo čoveka. U jednoj realiaciji, miš sadrži κ laki lanac lokusa koji obuhvata zamenu endogenog mišjeg κ VL genskih segmenata segmentima Vκ1-39Jκ5 gena čoveka i obuhvata zamenu svih ili suštinski svih endogenih segemnata VH gena miša celokupnim ili suštinski celokupnim repertoarom segmenata VH gena čoveka.

[0036] Takođe je obezbeđena i ćelija miša koja je izolovana iz miša kao što je ovde opisano. U jednom primeru, ćelija je ES ćelija. U jednom slučaju, ćelija je limfocit. U jednom primeru, B ćelija eksprimira himeran težak lanac koji sadrži varijabilan domen izveden iz segmenta gena čoveka; i lak lanac izveden iz rearanžiranog segmenta Vκ1-39/J čoveka; pri čemu je varijabilni domen teškog lanca spojen za konstantan region miša i varijabilni domen lakog lanca je spojen za konstanta region miša ili čoveka.

[0037] Ovde je takođe opisan i hibridom, pri čemu je hibridom dobijen sa B ćelijom miša kao što je ovde opisano. U posebnom slučaju, B ćelija je iz miša kao što je ovde opisano, a koji je imunizovan imunogenom koji sadrži epitop od interesa, i B ćelija eksprimira vezujući protein koji vezuje epitop od interesa, vezujući protein ima somatski mutiran domen VH čoveka i CH miša, i ima VL domen čoveka izveden iz segmenta gena Vκ1-39Jκ5 čoveka i CL miša.

[0038] Takođe je naveden i embrion miša koji sadrži donorsku ES ćeliju koja je izvedena iz miša kao što je ovde opisan.

[0039] U jednom aspektu, dati vektor za ciljanje (engl. targeting vectors), sadrži počev od 5' ka 3' smeru transkripcije u odnosu na sekvence 5' i 3' vektorskih krakova homologije sa mišem (engl.mouse homology arms), 5' krak homologije sa mišem, promotor imunoglobulina čoveka ili miša, čeonu sekvencu čoveka ili miša, i segment LCVR gena čoveka koji je segment Vκ1-39Jκ5 gena čoveka i 3' krak homologije miša. U jednom slučaju, 5' i 3' krakovi homologije upućuju vektor na sekvencu 5' u odnosu na pojačivačku sekvencu koja se nalazi 5' blizu gena za κ konstantnan region mipa. U jednom slučaju, promotor je promotor segmenta gena humanog varijabilnog regiona imunoglobulina. U posebnom slučaju, promotor je promotor Vκ3-15 čoveka. U jednom slučaju, čeona sekvenca je čeona sekvenca miša. U posebnoj realizaciji, čeona sekvenca miša je čeona sekvenca Vκ3-7 miša.

[0040] U jednom slučaju, dat je vektor kao što je prethodno opisano, ali umesto 5' kraka homologije miša uz humani ili mišji promotor sa 5' strane nalazi mesto prepoznavanja za specifičnu rekombinazu (engl. site-specific recombinase recognition site, (SRRS)), a umesto 3' kraka homologije miša uz segment LCVR gena čoveka sa 3' strane je SRRS.

[0041] Takođe je dato i reversno himerno antitelo dobijeno od miša kao što je ovde opisan, pri čemu reversno himerno antitelo sadrži laki lanac koji sadrži CL miša i VL čoveka i težak lanac koji sadrži VH čoveka i CH miša.

[0042] Data je metoda za dobijanje antitela koje vezuje antigen od interesa, a koja obuhvata imunizaciju miša sa antigenom interesa i primenu genske sekvence varijabilnog regiona imunoglobulina čoveka iz miša za dobijanje antitela.

[0043] Takođe je data i metoda za dobijanje antitela, koja obuhvata eksprimiranje u jednoj ćeliji (a) prve sekvence VH gena immunizovanog miša kao što je ovde opisano koja je spojena sa sekvencom CH gena čoveka; (b) sekvenca VL gena imunizovanog miša kao što je ovde opisano koja je spojena sa sekvencom CL gena; i (c) održavanje ćelije pod uslovima povoljnim za ekprimiranje celog antitela čoveka, i izolovanje antitela. U jednom slučaju, ćelija sadrži drugu sekvencu VH gena drugog imunizovanog miša kao što je ovde opisano spojenu sa sekvecom CH gena čoveka, prva sekvenca VH gena kodira VH domen koji prepoznaje prvi epitop i druga sekvenca VH gena kodira VH domen koji prepoznaje drugi epitop, pri čemu prvi epitop i drugi epitop nisu identični.

[0044] Takođe je opisan postupak dobijanja epitop-vezujućeg proteina, koji obuhvata izlaganja miša, kao što je ovde opisan, imunogenu koji sadrži epitop od interesa, čuvajući miša pod uslovima pod uslovima dovoljnim da miš proizvede moleku imunoglobulina koji specifično veže epitop od interesa i izolovanje molekula imunoglobulina koji specifično vezuje epitop od interesa; pri čemu epitop-vezujući protein sadrži težak lanac koji obuhvata somatski mutiran VH čoveka i CH miša, povezan sa lakim lancem koji sadrži CL miša VL čoveka izvedenim iz segmenta gena Vκ1-39 Jκ5 čoveka.

[0045] Takođe je opisana i ćelija koja eksprimira epitop-vezujući protein, pri čemu ćelija sadrži: (a) nukleotidnu sekvencu VL čoveka koja kodira domen VL čoveka izveden iz segmenta gena Vκ1-39Jκ5 čoveka, pri čemu je nukleotidna sekvenca VL čoveka kondenzovana (direktno ili preko linkera) za konstantan domen cDNK sekvence lakog lanca imunoglobulina čoveka (npr., sekvenca konstantnog domena κ DNK čoveka); i (b) prvu nukleotidnu sekvencu VH čoveka koja kodira domen VH čoveka izveden iz prve nukleotidne sekvence VH čoveka, pri čemu je prva nukleotidna sekvenca VH čoveka spojen (direktno ili preko linkera) za konstantan

1

domen cDNK sekvence teškog lanca imunoglobulina čoveka; pri čemu epitopvezujući protein propoznaje prvi epitop. U jednom slučaju, epitop-vezujući protein vezuje prvi epitop sa konstantnom disocijacije manjom od 10<-6>M, manjom od 10<-8>M, manjom od 10<-9>M, manjom od 10<-10>M, manjom od 10<-11>M, ili manjom od 10<-12>M.

[0046] U jednom slučaju, ćelija sadrži drugu nukleotidnu sekvencu VH čoveka koja kodira drugi domen VH čoveka, pri čemu je druga sekvenca VH čoveka spojena (direktno ili preko linkera) za konstantan domen cDNK sekvence teškog lanca imunoglobulina čoveka, i pri čemu drui domen VH čoveka specifično ne prepoznaje prvi epitop (npr., ima konstantnu disocijacije od npr., 10<-6>M, 10<-5>M, 10<-4>M, ili veću), i pri čemu epitop-vezujući protein prepoznaje prvi epitop i drugi epitop, i pri čemu se svaki od teških lanaca odnosno i prvi i drugi težaki lanac imunoglobulina povezuje sa identičnim lakim lancem (a).

[0047] U jednom slučaju, drugi domen VH vezuje drugi epitop sa konstantnom disocijacije koja ja manja od 10<-6>M, manja od 10<-7>M, manja od 10<-8>M, manja od 10<-9>M, manja od 10<-10>M, manja od 10<-11>M, ili manja od 10<-12>M.

[0048] U jednom slučaju, epitop-vezujući protein sadrži prvi težak lanac imunoglobulina i drugi težak lanac imunoglobulina, svaki povezan sa identičnim lakim lancem izvedenim iz segmenta gena VL čoveka odabran od Vκ1-39Jκ5 čoveka, pri čemu prvi težak lanac imunoglobulina vezuje prvi epitop sa konstantom disocijacije u nanomolarnom do pikomolarnog opsega, drugi težak lanac imunoglobulina vezuje drugi epitop sa konstantnom disocijacije u nanomolarnom do pikomolarnog opsega, prvi epitop i drugi epitop nisu identični, prvi težak lanac imunoglobulina ne vezuje drugi epitop ili vezuje drugi epitop sa konstatnom disocijacije koja je slabija od mikromolarnog opsega (npr., milimolarni opseg), drugi težak lanac imunoglobulina ne vezuje prvi epitop ili vezuje prvi epitop sa konstantom disocijacije koja je slabija od mikromolarnog opsega (npr., milimolarni opseg), i jedan ili više VL, VH prvog teškog lanca imunoglobulina i VH drugog teškog lanca imunoglobulina, su somatski mutirani.

[0049] U jednom slučaju, prvi težak lanac imunoglobulina sadrži protein A-vezujući ostatak i drugi težak lanac imunoglobulina nema protein A-vezujući ostatak.

[0050] I jednom slučaju,ćelija je odabrana od CHO, COS, 293, HeLa, i retinalne ćelije koja eksprimira sekvencu nukleinske kiseline virusa (npr., ćelija PERC.6™).

[0051] Reversno himerno antitelo je takođe obezbeđeno, koje sadrži konstantan domen VH čoveka i konstantan dome teškog lanca miša, VL čoveka i konstantan dome lakog lanca miša, pri čemu je antitelo dobijeno procesom koji obuhvata imunizaciju miša kao što je ovde opisnao imunogenom koji sadrži epitop, i antitelo specifično vezuje epitop imunogena koji je miš imunizovan. U jendom slučaju, domen VL je somatski mutiran. U narednom slučaju, domen VH je somatski mutiran. U jednom slučaju, i VL domen i VH domen su somatski mutirani. U narednom slučaju, VL je vezan za konstanta domen κ miša.

[0052] U sledećem aspektu, obezbeđen je miš, koji sadrži segmente gena varijabilnog regiona teškog lanca čoveka zamenom svih ili suštinski svih segmenata gena varijabilnog regiona teškog lanca miša na endogenom lokusu miša; ne više od segmenta gena varijabilnog regiona lakog lanca čoveka koji je preuređen/rearanžiran Vκ1-39/Jk5 i segment, zamenom svih segmenta gena varijabilnog lakog lanca miša; pri čemu su segmenti gena varijabilnog regiona teškog lanca čoveka vezani za gen endogenog konstantnog regiona teškog lanca miša i segment gena varijabilnog regiona lakog lanca čoveka je vezan za gen endogenog konstantnok regiona Cκ miša.

[0053] Takođe je obezbeđena i ćelija ES miša koja sadrži zamenu svih ili skoro svih segmenata gena varijabilnog regiona teškog lanca miša segmentima gena varijabilnog regiona teškog lanca čoveka i ne više od jednog ili dva rearanžirana segmenta VJ lakog lanca čoveka, pri čemu su segmenti gena varijabilnog regiona teškog lanca čoveka vezani za gen kosntatnog regiona teškog lanca imunoglobulina miša, a segmetni V/J lakog lanca čoveka su vezani za segment gena konstantnog regiona lakog lanca imunoglobulina miša ili čoveka. U specifičnom slučaju, segment gena ya konstantnog regiona lakog lanca je gen miša za konstantan deo.

[0054] Takođe je obezbeđen i antigen-vezujući protein koji je proizveo miš, ka o što je ovde opisan. U posebnom slučaju, antigen-vezujući protein sadrži varijabilan region teškog lanca imunoglobulina čoveka koji vezan sa konstantnim regionom miša i varijabilni region lakog lanca imunoglobulina čoveka je izvedeniz segmenta Vκ1-39/Jk5 gena, pri čemu konsatntan region lakog lanca je konstantan regeion miša.

[0055] Takođe je obezbeđen i celo antigen-vezujući protein čoveka dobijen od sekvence gena varijabilnog regiona imunoglobulina miša kao što je ovde opisano, pri čemu antigen-vezujući protein sadrži težak lanac čoveka pune dužine koji sadrži varijablni region izveden iz sekvenc miša kao što je ovde opisano i laki lanac čoveka pune dužine koji sadrži Vκ1-39 varijablni region. U jednom slučaju, varijabilni region lakog lanca sadrži jedan do pet somatskih mutacija. U narednom slučaju,varijabilni region lakog lanca je srodan varijabilnom regionu lakog lanca koji se sparuje u B ćeliji miša sa varijabilnim regionom teškog lanca.

[0056] U narednom slučaju, humani antigen-vezujući protein pune dužine sadrži prvi težak lanac i drugi težak lanac, pri čemu, prvi tažak lanac i drugi težak lanac sadrže ne-identične varijabilne regione koji su nezavisno izvedeni od miša kao što je ovde opisano i pri čemu se svaki od prvih i drugih teških lanaca eksprimovanih u ćeliji vezuje sa lakim lancem čoveka, izvedenim iz segmenta Vκ1-39/Jk5 gena. U jednom slučaju, prvi težak lanac sadrži prvi varijabilni region teškog lanca koji specifično vezuje prvi epitop prvog antigena, i drugi težak lanac sadrži drugi varijabilni region teškog lanca koji specifično vezuje drugi peitop drugog antigena. U posebnom slučaju, prvi antigen i drugi antigen su različit. U posebnom slučaju, prvi antigen i drugi second antigen su isti, i prvi epitop i drugi epitop nisu identični; u posebnom slučaju, vezivanje prvog epitopa prvim molekulom vezujućeg protein ne blokira vezivanje drugog epitopa drugim molekulom vezujućeg proteina.

[0057] U narednom slučaju, vezujući protein čoveka pune dužine izveden iz humane imunoglobulinske sekvence miša kao što je ovde opisano sadrži prvi težak lanac imunoglobulina i drugi težak lanac imunoglobulina, pri čemu prvi težak lanac imunoglobulina sadrži prvi varijabilni region koji nije identičan varijabilnom regionu drugog teškog lanca imunoglobulina i pri čemu prvi težak lanac imunoglobulina sadrži determinantu vezivanja prirodnog proteina A prirodnog tipa (engl. wild type), i drugi težak lanac nema determinantu vezivanja prirodnog proteina A. U jednom slučaju, prvi težak lanac imunoglobulina vezuje protein A pod uslovima izolovanja, i drugi težak lanac imunoglobulina ne vezuje protein A ili vezuje protein A barem 10-puta, sto puta ili hiljadu puta slabije nego što prvi težak lanac imunoglobulina vezuje protein A pod uslovima izolovanja. U posebnoj realizaciji, prvi i drugi težak lanac su IgG1 izotipovi, pri čemu drugi težak lanac sadrži modifikaciju odabranu od 95R (EU 435R), 96F (EU 436F), i njihove kombinacije i pri čemu prvi težak lanac ne sadrži ovu modifikaciju.

[0058] Obezbeđena je metoda za dobijanje humanog bispecifičnog antitela, pri čemu postupak obuhvata imunizaciju miša, obezbeđivanje i dobijanje bispecifičnog antitela koristeći sekvence varijabilnog regiona gena čoveka iz B ćelije miša.

[0059] U jednom aspektu, metoda dobijanja bispecifilnog antigen-vezujućeg proteina obuhvata izlaganje prvog miša prvom antigenu od interesa koji sadrži prvi epitop, izlaganje drugog miša kao što je ovde dato drugom antigenu od interesa koji sadrži drugi epitop, omogućavajući prvom i drugom mišu da svaki podignu imunski odgovor na antigene od interesa, identifikujući u prvom mišu prvi varijabilan region teškog lanca čoveka koji vezuje prvi epitop prvog antigena od interesa, identifikovanje u drugom mišu drugi varijabilni region teškog lanca čovela koji vezuje drugi epitop drugog antigena od interesa, stvarajući tako prvi težak lanac gena čoveka pune dužine koji kodira prvi težak lanac koji vezuje prvi epitop prvog antigena od interesa, stvarajući tako drugi težak lanac gena čoveka pune dužine koji kodira drugi težak lanac koji vezuje drugi epitop drugog antigena od interesa, eksprimirajući prvi težak lanac i drugi težak lanac u ćeliji koja eksprimira jedan laki lanac čoveka pune dužine

1

koji je izveden iz Vκ1-39/Jk5 segmenta gena čoveka, tako da formira bispecifičan antigen-vezujući protein i izolovanje bispecifičnog antigen-vezujućeg proteina.

[0060] U jednoj realizaciji, prvi antigen i drugi antigen nisu identične.

[0061] U jednoj realizaciji, prvi antigen i drugi antigen su identičan, i prvi epitop i drugi epitop nisu identični. U jednoj realizaciji, vezivanje varijabilnog regiona prvog teškog lanca za prvi epitop ne blokira vezivanje varijabilnog regiona drugog teškog lanca za drugi epitop.

[0062] U jednoj realizaciji, prvi antigen je odabran od rastvornog antigena i antigena na površini ćelije (npr., tumroski antigen), i drugi antigen sadrži transmembranske receptore. U posebnoj realizaciji, transmembranski receptor je imunoglobulinski receptor. U posebnoj realizaciji, imunoglobulinski receptor je Fc receptor. U jednoj realizaciji, prvi antigen i drugi antigen su isti transmembranski receptor, i vezivanje prvog teškog lanca za prvi epitop ne blokira vezivanje drugog teškog lanca za drugi epitop.

[0063] U jednoj realizaciji, varijabilni domen lakog lanca sadrži 2 do 5 somatskih mutacija. U narednoj realizaciji, varijabilni domen lakog lanca je somatski mutiran srodan laki lanac koji se eksprimira u B ćeliji prvog ili drugo imunizovanog miša bilo sa prvim ili drugim varijabilnim domenom teškog lanca.

[0064] U jednoj realizaciji, prvi težak lanac čoveka cele dužine nosi amino kiselinsku modifikaciju koja umanjuje afinitet za protein A, i drugi težak lanac čoveka cele dužine ne sadrži modifikaciju koja umanjuje njegov afinitet za protein A.

[0065] Takođe je obezbeđeno antitelo ili bispecifično antitelo koje sadrži varijabilni domen teškog lanca čoveka dobijen u skladu sa pronalaskom. U narednom aspektu, opisana je upotreba ovde obezbeđenog miša za dobijanje humanog antitela pune dužine ili humanog bispecifičnog antitela pune dužine.

[0066] Bilo koja od ovde opisanih realizacija ili aspekata može se upotrebiti u kombinaciji jedna sa drugom, osim ako je drugačije naznačeno ili je očigledno iz konteksta. Ostale realizacije će biti jasne prosečnom stručnjaku iz oblasti tehnike pregledom dostupnog opisa.

Detaljan opis

[0067] Predmetni pronalazak nije ogranočen na ovde opisane postupke i eksperimentalne uslove, tako da metode i uslovi mogu da variraju. Takođe treba napomenuti da je ovde korišćena terminologija data za potrebe opisivanja određenih realizacija i ne treba je smatrati kao ograničavajuću, budući da je predmet pronalaska definisan zahtevima.

[0068] Osim ako je drugačije naznačeno, svi izrazi i fraze koje su ovde upotrebljene uključujući značenja koji ovi izrazi i fraze imaju u tehnici, osim ako je drugačije jasno naznačeno ili je očigledno iz konteksta u kojem je izraz ili fraza upoterbeljena. Iako se druge metode i materijali slični ili ekvivalnetni onima koji su ovde opisani, mogu upotrebiti u izvođenju ili testiranju predmetnog pronalaska, sad su opisane date metode i matrijali.

[0069] Izraz "antitelo", kao što je ovde upotrebljen, obuhvata molekule imunoglobulina koji sadrže četiri polipeptidna lanca, dva teška lanca (H) lanca i dva laka (L) lanaca koja su međusobno povezana disulfidnim vezama. Svaki težak lanac sadrži varijabilni region (VH) teškog lanca i konstantan region (CH) teškog lanca. Konstantan region teškog lanca sadrži tri domena, CH1, CH2 i CH3. Svaki laki lanac sadrži varijablni (VL) region lakog lanca i konstantna region (CL) lakog lanca. Regioni VH i VL mogu se dalje podeliti u hipervarijabilne regione nazvane regioni određivanja komplementarnosti ( hipervarijabilne sekvence (CDR), sa razbacanim regionima koji su više konzervativni, nazavani okvirni regioni (FR). Svaki VH i VL sadrži tri CDR i četiri FR, poređanih od amino-kraja ka karboksilnom -kraju sledećim redosledom: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 (težak lanac CDR može se skraćeno označiti kao HCDR1, HCDR2 i HCDR3; laki lanac CDR može se skraćeno označiti kao LCDR1, LCDR2 i LCDR3. Izraz antitelo "visokog afiniteta" odnosi se na antitelo koje ima KDu odnosu na svoj ciljani epitop od oko 10<-9>M ili nižu (npr., odnosno oko 1 x 10<-9>M, 1 x 10<-10>M, 1 x 10<-11>M, ili oko 1 x 10<-12>M). U jednoj realizaciji, KDje meren površinskom plazmonskom rezonancom, npr., BIACORE™; u narednoj realizaciji, KDje meren sa ELISA.

[0070] Fraza "bispecifično antitelo" obuhvata antitelo koje može selektivno da veže dva ili više epitopa. Bispecifična antitela obično sadrže dva neidentična teška lanca, gde svaki težak lanac specifično vezuje različit epitop bilo na dva različita molekula (npr., različiti epitopi na dva različita imunogena) ili na istom molekulu (npr., različiti epitopi na istom imunogenu). Ako je bispecifično antitelo sposobno da selektivno veže dva različita epitopa (prvi epitop i drugi epitop), afinitet prvog teškog lanca za prvi epitop će obično biti barem jednom do dva ili tri ili četiti ili više puta niži od afiniteta prvog teškog lanca za drugi epitop, i vice versa. Epitopi spečno vezuju bispecifično antitelo mogu da budu na istom ili različitom cilju (npr., na istom ili različitom proteinu). Bispecifična antitela mogu se dobiti, na primer, kombinovanjem teških lanaca koji prepoznaju različite epitope istog imunogena. Na primer, sekvence nukleinskih kiselina koje kodiraju varijabilne sekvence teškog lanca koje prepoznaju različite epitope istog imunogena, mogu se spojiti sa nukelotidnim sekvencama koje kodiraju iste ili različite konstantne regione teškog lanca, i ove sekvence se mogu

1

eksprimirati u ćeliji koja eksprimira u lakom lancu imunoglobulina. Tipično bispecifično antitelo ima dva teška lanca gde svaki ima tri teška lanca CDR, zatim (N-kraj do C-kraja) CH1 domen, pregib, CH2 domen, i CH3 domen, i laki lanac imunoglobulina koji ili ne prenosi epitope-vezujuću specifičnost ali može da se veže sa svakim težakm lancem, ili može da se veže sza scaki težak lanac i može da veže jedan ili više epitopa koji su vezani eptiop-vezujućim regionima teškog lanca, ili mogu da se vežu za svaki težak lanac i omoguće vezivanje ili jednog ili oba teškalanca za jedan ili oba epitopa.

[0071] Termin "ćelija" obuhvata svaku ćelija koja je pogodna za ekspresiju rekombinantne sekvence nukleinskih kiselina. Ćelije obuhvataju ćelije prokariota i eukariota (jednoćelelijske ili višećelijske), bakterijske ćelije (npr., sojevi E. coli, Bacillus spp., Streptomyces spp., etc.), mikobakterijske ćelije, ćelije gljivica, ćelije kvasca (npr., S. cerevisiae, S. pombe, P. pastoris, P. methanolica, itd.), ćelije biljaka, ćelije insekata (npr., SF-9, SF-21, ćelije insekata inficirane baculovirusom, Trichoplusia ni, itd.), žibotinjske ćelije, humane ćelije, ili fuzionisane ćelije kao što su, na primer, hibridoma ili kvadroma ćelije. U nekim realizacijama, ćelija je ćelija čoveka, majmuna, čovekolikog majmuna, hrčka, pacova ili miša. u nekim realizacijama, ćelija je eukariotska i odabran je od sledećih ćelija: CHO (npr., CHO K1, DXB-11 CHO, Veggie-CHO), COS (npr., COS-7), retinalne ćelije, Vero, CV1, kidney (npr., HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK), HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo205, HB 8065, HL-60, (npr., BHK21), Jurkat, Daudi, A431 (epidermalne), CV-1, U937, 3T3, L ćelija, C127 ćelija, SP2/0, NS-0, MMT 060562, Sertoli ćelija, BRL 3A ćelija, HT1080 ćelija, ćelija mijeloma, tumorska ćelija, i ćelijska linija izvedena iz prethodno navedenih ćelija. U nekim realizacijama, ćelija sadrži jedan ili više viralnih gena, npr., retinalna ćelija koja eksprimira viralni gen (npr., a PER.C6™ cell).

[0072] Fraza "hipervarijabilne sekvence," ili izraz "CDR," obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja je kodirana sekvencom nukleinskih kiselina gena imunoglobulina organizma koji se normalno (tj., kod životinje divljeg tipa) pojavljuje između dva okvirna regiona u varijabilnom regionu lakog ili teškog lanca molekula imunoglobulina (npr., anttelo ili receptor T ćelija). CDR može da kodira, na primer, germitivna sekvenca ili rearanžirana ili nerearanžirana sekvenca i na primer, intaktna ili zrela B ćelija ili T ćelija. CDR može da bude somatski mutirana (npr., razlikuje se od sekvence koja je kodirana u životinjskoj gemitivnoj liniji), humanizovana, i/ili modifikovana supstitucijama, adicijama ili delecijom aminokiselina. U nekim slučajevima (npr., za CDR3), CDRs mogu da se kodiraju dve ili više sekvenci (npr., sekvence germitivnih linija ćelija) koje nisu susedne (npr., u nerearanžiranoj sekvenci

1

nukleinskih kiselina) ali su susedne u sekvenci nukelinskih kiselina B ćelije, npr., kao rezultat isecanja ili povezivanja sekvenci (npr., V-D-J rekombinacija za formiranje teškog lanca CDR3).

[0073] Izraz "konzervativna," kada se koristi da opiše konzervativnu supstituciju amino kiselina, obuhvata supstituciju aminokiselinskog ostatka drugim amino kiselinskim ostatkom koji ima R grupu bočnog lanca sličnih hemijskih osobina (npr., naeletrisanje ili hidrofobnost). Generalno, konzervativna supstitucija aminokiselina neće suštinski promeniti funkcionalne osobine od interesa proteina, na primer, sposobnost varijabilnog regiona da specifično veže ciljani epitop sa željenim afinitetom. Primeri grupa aminokiselina koji imaju bočne lance sličnih hemijskih osobina su alifatični bočni lanci kao što je glicin, alanin, valin, leucin, i izoleucin; alifatični-hidroksil bočni lanac kao što je serin i treonin; bočni lnaci sa amidom kao što je asparagin i glutamin; aromatični sporeni lanci popu fenilalanina, tirozina i triptofana; bazni bolčni lanci kao poput lizina, arginina i histidina; kiseli bočni lanci poput asparaginske kiseline i glutaminske kiseline; i bočni lanci koji sadrže sumpor kao što je cistein i metionin. Konzervativna supstitucija amino kiselinskih grupa obuhvata, na primer, valin/leucin/izoleucin, fenilalanin/tirozin, lizin/arginin, alanin/valin, glutamat/aspartat, i asparagin/glutamin. U nekim realizacijama, konzervatvna supstitucija aminokiselina može da bude supstitucija bilo kog intaktnog ostatka u proteinu, alaninom, kao što je radi u, na primer, alaninskoj mutagenezi (engl.alanine scanning mutagenesis). U nekim realizacijama, konzervativma supstitucija je izvedena tako da ima pozitivnu vrednost u matroksu PAM250 loglikelihood opisanom u Gonnet et al. (1992) Exhaustive Matching of the Entire Protein Sequence Database, Science 256:1443-45, ovde dat referencom. U nekim realizacijama, supstitucija je umereno konzervativna supstitucija, pri čemu supstitucija ima ne negativnu vrednost u matriksu PAM250 log-likelihood.

[0074] U nekim realizacijama, položaji ostatka u lakom ili teškom lancu imunoglobulina razlikuju se po jednoj ili više konzervativnih supstitucija aminokiselina. U nekim realizacijama, položaji ostataka u lako lancu ili njegovom fragmentu imunoglobulina (npr., fragment koji dozvoljava ekspresiju i sekreciju iz, npr., B ćelija) nisu identični onim u lakom lancu čija je aminokiselinska sekvenca ovde navedena, ali se razlikuje po jednoj ili više konzervativnih supstitucija amino kiselina.

[0075] Izraz "epitop-vezujući protein" obuhvata protein koji ima najmanje jedna CDR i koji je sposoban da selektivno prepozna epitop, npr., sposoban je da veže epitop sa KDkoja iznosi oko jednog mikromola ili manje (npr., KDkoja je oko 1 x 10<-6>M, 1 x 10<-7>M, 1 x 10<-9>M, 1 x 10<-9>M, 1 x 10<-10>M, 1 x 10<-11>M, ili oko 1 x 10<-12>M). Terapeutski

1

epitope-vezujući proteini (npr., terapeutska antitela) često zahtevaju KDkoja je u opsegu nanomol ili pikomol.

[0076] Izraz "funkcionalni fragment" obuhvata fragmente epitop-veujućih proteina koji se mogu eksprimirati, seretovati i specifično vezati za epitope sa KDu mikromolarnom, nanomolarnom ili pikomolarnom opsegu. Specifično prepoznavanje obuhvata KDkoja je najmanje u mikromolarnom opsegu, nanomolarnom opsegu ili pikomolarnom opsegu.

[0077] Izaz "germitivne (klicine) linije ćelija" obuhvata reference na nukleinsku sekvencu imunoglobulinau ćeliji koja nije somtaski mutirana, npr., ne-somatski mutirana B ćelija ili pre-B ćelija ili hematopoezna ćelija.

[0078] Izraz "težak lanac," ili "težak lanac imunoglobulina " obuhvata sekvencu konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina iz bilo kog organzima. Varijabilni domeni teškog lanca uključuju tri teška lanca CDRs i četiri regiona FR, osim ako je drugačije naznačeno. Fragmenti teških lanaca sadrže CDR, CDR and FR i njihove kombinacije. Tipičan teški lanac sadrži, poslevarijabilnog domena (od N-kraja ka C-kraju), CH1 domen, pregib, CH2 domen i CH3 domen. Funkcionalni fragment teškog lanca uključuje fragment kojije sposoban da specifično prepozna epitop (npr., prepoznaje epitope sa KDu mikromolarnom, nanomolarom ili pikomolarnom opsegu), koji je sposoban za exprimiranje i sekreciju iz ćelije, i koji sadrži najamnje jedan CDR.

[0079] Izraz "identitet" kada je upotrebljen u vezi sekvence, obuhvata identit kao što je određeno brojnim različitim algoritmima koji su poznati u tehnici, a koji se mogu upotrebiti za merenje identiteta nukelotida i/ili aminokiselinske sekvence. U nekim realizacijama koje su ovde opisane, identiteti su određeni pomoću tehnike ClustalW v. 1.83 (spor) alignment primenom metode gap penalty of 10.0, an extend gap penalty of 0.1, i korišćenjem matriksa Gonnet similarity (MaeVector™ 10.0.2, MacVector Inc., 2008). Dužina sekvenci u odnosu na identičnost sekvenci zavisiće od datih sekvenci, ali u slučaju konstantnog domena lakog lanca, dužina sekvence treda da obuhvati sekvencu dovoljne dužine da se preklopi u konstantan domen lakog lanca koji je sposoban da auto-asocijacije, tako da se formira kanonski konstantan domen lakog lanca, npr., sposoban da formira beta slojeve koji sadrže beta lance i koji su u stanju da interaguju sa barem jednim CH1 domenom čoveka ili miša. U slučaju domena CH1, sekvenca treba da sadrži sekvencu dovoljne dužine da se preklopi u CH1 domen koji je sposoban da formira dve beta ravni koje sadrže beta lance moguda interaguju sa najmanje jednim konstantnim domenom lakog lanca čoveka ili miša.

1

[0080] Izraz "molekul imunoglobulina" obuhvata dva teška lanca imunoglobulina i dva laka lanca imunoglobulina. teški lanci mogu da budu identični ili različiti i laki lanci mogu da budu identični ili različiti.

[0081] Izraz "laki lanac" obuhvata sekvencu lakog lanca imunoglobulina iz bilo kog organizma, osim ako je drugačije naznačeno, uključujući κ i λ lake lance čoveka i VpreB, kao i surogate lakih lanaca. Varijabilni (VL) domeni lakih lanaca obično sadrže tri laka lanca CDR i četiri regiona okvira čitanja (FR), osim ako je drugačije naznačeno. Generalno, laki lanac pune dužine sadrži, od amino kraja ka karboksilno kraju, VL domen koji obuhvata FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4, i konstantan domen lakog lanca. Laki lanci obuhvataju one, npr., koji neselektivno vezuju bilo prvi ili drugi epitop koji je selektivno vezan epitope-vezujućim proteinom u kojem se pojavljuju. Laki lanci takođe obuhvataju one koji vezuju i prepoznaju, ili pomažu teškim lancima u veivanju i prepoznavanju, jednog ili više epitopa koji su selektivno vezani epitope-vezujućim proteinom u kojem se pojavljuju. Zajednički laki lanci su oni koji su izvedeni iz segmenta Vκ1-39Jκ5 gena čoveka ili segmenta Vκ3-20Jκ1 gena čoveka i obihvataju somatski mutatirane (npr., afinitetno zrele) verzije istih.

[0082] Izraz "mikromolarni opseg " odnosi se na 1-999 mikromola; fraza "nanomolarni opseg" označava 1-999 nanomola; fraza "pikomolarni opseg " odnosi se na 1-999 pikomol.

[0083] Izraz "somatski mutiran" obuhvata reference na sekvencu nukelinskih kiselina B ćelija koje su podvrgnute izotipskom prekopčavanju (engl.class-switching), pri čemu sekvenca nukleinskih kiselina varijabilnog regiona imunoglobulina (npr., varijabilni region teškog lanca ili sadrže sekvence teškog lanca CDR ili FR) u B-ćelijama koje su izotpiski prekopčane, a koje nisu identične sekvenci nukleinskih kiselina u B ćeliji pre podvrgivanja izotipskom prekopčavanju, kao što su, na primer, razlike u CDR ili sekvenci okvria čitanja nukleinskih kiselina između B ćelije koja nije podvrgnuta izotipskom prekopčavanju i B ćelije koja je podvrgnuta izotipskom prekopčavanju. "Somatski mutirane" obuhvata referencu na sekvence nukelinskih kiselina iz afinitetno-zrelih B ćelija koje nisu identične odgovarajućim sekvencama varijabilnih regiona imunoglobulinau B ćelijama koji nisu afinitetno-zrele (tj., sekvence u genomu germlitivnih ćelija). Izraz "somatski mutirane" takođe obuhvata reference na sekvencu nukleinskih kiselina varijabilnog regiona imunoglobulina iz B ćelija nakon izlaganja B ćelija epitopu od interesa, pri čemu se sekvenca nukleinskih kiselina razlikuje od odgovarajuće sekvence nukleinskih kiselina pre izlaganja B ćelija epitopu od interesa. Izraz "somatski mutirane" odnosi se na sekvence iz antitela koje su stvorene u životinji, npr., miš koji sadrži sekvence nukleinskih kiselina

1

varijabilnog regiona imunoglobulina čoveka, u odgovoru na izazov imunogena, i koji rezultuje iz procesa selekcije koji je po sebi operativan u datoj životinji.

[0084] Izraz "nerearanžiran/nepreuređen," koji se odnosi na sekvencu nukleinskih kiselina, obuhvata sekvence nukleinskih kiselina koje postoje u germitivnoj ćelijskoj lini životinjskih ćelija.

[0085] Izraz "varijablni domen" obuhvata aminokiselinsku sekvencu lakog ili teškog lanca imunoglobulina (modifikovana po želji) koja sadrži sledeće aminokiselinske region, u sekvenci od N-kraja ka C-kraju (osim ako je drugačije naznačeno): FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.

Zajednički laki lanac

[0086] Raniji napori da se multispecifični epitope-vezujući proteini, npr., bispecifična antitela, učine korisnim su ometana različitim problemima koji često dele zajedničku karakteristiku: in vitro selekciju ili manipulaciju sekvenci za racionalni inženjering, ili za inženjering putem metode probe-i-greške, odgovarajući format za sparivanje heterodimerinog bispecifičnog imunoglobulina čoveka. Nažalost, većina, ako ne i svi most pristupi in vitro inženjeringa obezbeđuju većinom ad hoc popravke koje su odgovarajuće, ako uopšte, za pojedinačne molekule. Sa druge strane,nisu realizovane in vivo metode za primenu složenih organizama za izbor odgovoarajućeg sparivanja, a koji mogu da dovedu do lekova za ljude.

[0087] Generalno, nativne mišje sekvence su često dobar izvor humanih terapeutskih sekvenci. Osim toga, stvaranje varijabilnih regiona teškog lanca imunoglobulina miša koji se sparuje sa zajendičkom lakim lancem čoveka ima ograničenu praktičnu primenu. Više napora in vitro inženjeringa bi se proširilo u proces probe-i-greške za pokušaj humanizaxije varijabilnih sekvenci teškog lanca mišta nadajući se da će biti zadržana specifičnost i afinitet epitopa uz održavanje sposobnosti vezivanja sa zajedničkim lakim lancem čoveka, sa neizvesnim ishodom. Na kraju ovakvih procesa, konačni krajnji proizvod može da održi nešto od specifičnosti i afiniteta i da se poveže sa zajednički lakim lancem, ali konačna imunogenost kod ljudi po svojoj prilici ostaje i dalje ozbiljan rizik.

[0088] Shodno ovom, odgovarajući miš za dobijanje terapeutika za ljude obuhvatao bi veliki repertoar segemanta gena varijabilnih regiona teških lanaca čoveka umesto segmenata gena engodenih varijabilnih regiona teških lanaca miša. Segmenti gena varijabilnog regiona teškog lanca čoveka bi trebalo da mogu da se rearanžiraju

i rekombinuju sa konstantnim endogenim domenom teškog lanca miša tako da obrazuje reversni himerni teški lanac (tj., teški lanac koji sadrži varijablni domen čoveka i mišji konstantan region). Teški lanac bi trebalo da može da izvede izotipsko

2

prekopčavanje i somatsku hipermutaciju tako da je za miša dostupan relativno veliki repertoar varijabilnih domena teških lanaca kako bi se odrabrao jedan koji može da se poveže sa varijabilnim regionima lakog lanca čoveka ograničenog repertoara.

[0089] Miš koji selektuje zajednički lanac za veći broj teških lanaca nalazi praktičnu primenu. U različitim realizacijama, antitela koja se eksprimiraju u mišu koji može da eksprimira samo zajednički laki lanac imaće teške lance koji mogu da se povežu i eksprimiraju sa identičnim ili suptinski identičnim lakim lancem. Ovo je posebno korisno za dobijanje bispecifičnih antitela. Na primer, ovakav miš može da se imunizuje privim imunogenom da bi se dobila B ćelija koja eksprimira antitelo koje specifično vezuje prvi epitop. Miš (ili genetski isti miš) može da se imunizuje drugim imunogenom pri čemu se dobija B ćelija koja eksprimira antitelo koje specifično vezuje drugi epitop. Varijabilni regioni reškog laca mogu se klonirati od B ćelija i eksprimiraju se sa istim konstantnim regionom teškog lanca i istim lakim lancem i eksprimiraju se u ćeliji tako da se dobija bispecifično antitelo, pri čemu je komponentu lakog lanca bispecifičnog antitela odabrao miš da bi se povezala i eksprimirala sa komponentom lakog lanca.

[0090] Pronazači su genetskom modifikacijom proizveli miša za dobijanje lakih lanaca imunoglobulina koji će s epogodno upariti sa teškim lnacima iz sasvim različite familije, uključujući teške lance čiji varijablni regioni odstupaju od sekvenci germitivnih ćelijskih linija, npr., afinitetno sazreli ili somatski mutirani varijabilni regioni. U različitim realizacijama, miš je osmišljen kao par varijabilnih domena lakog lanca čoveka sa varijabilnim domenima teškog lanca čoveka koji sadrže somatske mutacije, omogućavajući tako put do proteina sa visokim afinitetom vezivanja koji su pogodni za upotrebu kao lekovi za ljude.

[0091] Miš dobijen genetskom modifikacijom/ genetski modifikovan miš, kroz dugačak i složen proces selekcije antitela u organizmima, predstavlja biološki odgovarajući izbor za sparivanje različitijh kolekcija varijabilnih domena teških lanca čoveka sa ograničenim brojem opcija lakog lanca čoveka. Da bi se ovo postiglo, miš je genetskom modifikacijom dobijen tkao da predstavlja ograničen broj opcija varijabilnih domena lakog lanca čoveka u kombinaciji sa opcijama varijabilnih domena teškog lanca čoveka, velike raznolikosti. Nakon izazivanja imunogenom, miš maksimizuje broj rešenja u svom repertoaru za ravoj antitela za imunogen, ograničen u mnogom ili isključivo brojem opcija lakog lanca u svom repertoaru. U različitim realizacijama, ovo obuhvata miša kako bi se postigle pogodne i kompatibilne somatske mutacije varijabilnog domena lakog lanca koje bi pored toga u mnogome bili kompatibilni sa relativno velikim brojem različitih varijabilnih domena teškog lanca čoveka, uključujući posebno somatski mutirane varijabilne domene teškog lanca čoveka.

[0092] Da bi se postigao ograničen repertoara opcija lakog lanca, miš dobijen genetskom modifikacijom takav da čini nefunkcionalnom ili suštinski nefunkcionalnom svoju sposobnost da pravi, ili preuredi, nativni varijabilni domen lakog lanca mišta. Ovo se može postići, npr., delecijom segmenata gena varijabilnog regiona lakog lanca miša. Endogeni lokus miša može se modifikovati pogodnim segmentom, po izboru, gena egzogenog varijabilnog regiona lakog lanca čoveka, operativno vezanim za konstantan domen endogenoog lakog lanca mišta, na takav način, da segmenti gena egzogenog varijabilnog regiona lakog lanca čoveka mogu da se rearanžiraju i rekombinuju sa konstantnim regionom gena lakog lanca miša i formira rearanžiran gen reversnog himernog lakog lanca (varijablan čoveka, mišji konstantan). U različitim reaalizacijama, varijabilni region lakog lanca je sposoban za somatsku mutaciju. U različitm realizacijama, za povećanje sposobnosti varijabilnog regiona lakog lanca, do maksimuma, da somatski mutira, u mišu su zadržani odgovarajući pojačivači. Na primer, za modifikaciju mišjeg κ lokusa da zameni segmente gena endogenous varijabilnog regiona κ miša segmentima gena varijabilnog regiona κ čoveka, mišji κ intronski pojačivači i mišji κ 3' pojačivači su funkcionalno održavani ili neporemećeni.

[0093] Miš dobijen genetskom modifikacijom eksprimira reversne himerne (varijablan čoveka, mišji konstantan) lake lanace ograničenog repertoara koji su povezanih sa različitim reversnim himernim (variablan čoveka, konstantan miša) teškim lancima. U različitim realizacijama, segmenti gena endogenih variajbilnih regiona mišjeg κ lakog lanca su izostavljeni i zamenjeni segmentima gena varijabilnog regiona lakog lanca čoveka, koji je operativno vezan za segment gena endogenog konstantnog regiona κ miša. U realizacijama za postizanje somatske hipermutacije segemnata gena varijabilnog regiona lakog lanca čoveka, do maksimuma, sačuvani su mišji κ intronski pojačivač i mišji κ 3' pojačivač su. U različitim realizacijama, miš takođe sadrži nefunkcionalan λ lokus lakog lanca ili njegovu deleciju li deleciju koja čini lokus nemoćnim da pravi λ laki lanac.

[0094] Tako, genetski modifikovani miš koji eksprimira varijabilne domene teškog i lakog lanca imunoglobulina čoveka, pri čemu su varijabilni domeni lakog lanca čoveka eksprimirani iz genske sekvence jednog prearanžiranog (VL/JL) varijabilnog regiona lakog lanca imunoglobulina čoveka koja je prisutna u genskoj sekvenci varijabilnog regiona lakog lanca koja je prisutna u germinativnoj ćeliji miša koja obuhvata geminativnu sekvencu segmenta VLgena i germinativnu sekvenu segmenta JLgena, pri čemu dati varijabilni region lakog lanca imunoglobulina čoveka je rearanžiran V κ1-39/J κ5, gde:

(a) miš bez lokusa endogenog varijabilnog regiona κ imunoglobulina miša koji ima posobnost rearanžiranja i formiranja gena koji kodira varijabilni region κ miša;

(b) miš eksprimira zajednički laki lanac imunoglobulina ćoveka za veći broj teških lanaca čoveka, gde je zajednički laki lanac izveden iz genske sekvence varijabilnog regiona lakog lanca imunoglobulina čoveka;

(c) miš sadrži B ćeliju koja eksprimira antitelo koje se spefično vezuje za antigen od interesa, pri čemu antitelo sadrži dati zajednički laki lanac i teški lanac imunoglobulina izveden iz rearanžiranog varijabilnog genskog segmenta teškog lanca (VH) humanog imunoglobulina odabranog iz grupe koju čine segment VH2-5, VH3-23, VH3-30, VH4-59 i VH5-51 gena; i

(d) 90-100% endogenih nerearanžiranih genskih segmenata VHmiša je zamenjeno veći brojem nerearanžiranih genskih segmenta VHčoveka.

[0095] Miš dobijen genetskim inženjeringom, u različitim realizacijama, sadrži lokus varijabilnog regiona lakog lanca koji je bez segmenta gena endogenog varijabilnog regiona lakog lanca miša i sadrži varijabilni segment gena čoveka, u jednoj realizaciji preuređena sekvenca V/J čoveka, operativno vezana za konstantan region miša, pri čemu lokus može da podlegne somatskoj hipermutaciji, i pri čemu lokus eksprimira laki lanac koji sadržu sekvencu V/J čoveka povezan za konstantan region miša. Tako, u različitim realizacijam, lokus sadrži mišji κ 3' pojačivač koji je povezan sa somatskom hipermutacijom normalnog ili divljeg tipa.

[0096] Miš dobijen genetskom modifikacijom u različitim realizacijama, kada je imunizovan antigenom od interesa stvara B ćelije koje ispoljavaju različite rearanžmane varijabilnog regiona teškog lanca imunoglobulina čoveka kojei eksprimira i funkcioniše sa jednim preuređenim lakim lancem, uključujući i realizacije u kojima jedan laki lanc sadrži varijabilne regione lakog lanca čoveka koji sadrže npr., 1 do 5 somatskih mutacija. U različitim realizacijama, ovako eksprimirani laki lanci čoveka mogu da se povezuju i eksprimiraju sa bilo kojim varijabilnim regionima teškog lanca imunoglobulina čoveka koji su eksprimirani u mišu.

Epitop-vezujući proteini koji vezuju više od jednog epitopa

[0097] Ovde opisane kompozicije i metode mogu se upotrebiti za dobijanje vezujućih proteina koji vezuju više od jednog epitopa sa visokim afinitetom, npr., bispecifična antitela. Prednosti pronalaska uključuju sposobnost za selekciju pogodno visoko

2

vezujućih (npr., afinitetno sazrelih ) teških lanaca imunoglobulina od kojih će se svaki povezati sa jednim lakim lancem.

[0098] Sinteza i ekspresija bispecifičnih vezujućih proteina je bila problematična, delom zbog problema povezanih sa identifikovanjem odgovarajućeg lakog lanca koji može da se poveže i eksprimira sa dva različita teška lanca, i delom usled problema za postupkom izolovanja. Metode i kompozicije koje su ovde opisane omogućavaju genetički modifikovanom mišu da selektuje, kroz inače prirodne procese, odgovarajući laki lanac koji može da se poveže i eksprimira sa više nego jednim lancem, uključujući teške lance koji su somatski mutirani (npr., afinitetno sazreli). Humane VL i VH sekvence od odgovarajućih B ćelija imunizovanog miša kao što je ovde opisano koje eksprimiraju afinitetno sazrela antitela sa reversnim himernim teškim lancima (tj., varijablan čoveka i mišji konstantan) se mogu identifikovati i klonirati u okviru u ekpresionom vektoru sa pogodnom sekvencom sekvencom gena konstantnog regiona čoveka (npr., IgG1 čoveka). Dva ovakva konstrukta mogu se pripremiti, gde svaki konstrukt kodira varijabilan domen teškog lanca čoveka koji vezuje različite epitope. Jedan od VL čoveka (npr., Vκ1-39Jκ5 čoveka ili Vκ3-20Jκ1 čoveka), embrionalna sekvenca ili od B ćelije gde je sekvenca somatski mutirana, može se fuzionisati okviru za odgovarajući konstantan region gena čoveka (npr., κ konstantan gen čoveka). Ove tri potpuno human teška i laka konstrukta mogu se postaviti u odgovarajuću ćeliju za ekspresiju. Ćelija će eksprimirati dve glavne vrste: homodimerni težak lanac sa identičnim lakim lancem i heterodimerni težak lanac sa identičnim lakim lancem. Da bi se izvelo lako razdvajanje ovih glavnih vrsta, jedan težak lanac je modifikovan tako da izostavi protein A-vezujuću determinantnu, što dovodi do različitog afiniteta homodimernih vezujućih proteina od heterodimernog vezujućeg proteina. Kompozicije i metode koje upućuju na ovaj problem opisane su u USSN 12/832,838, podnetoj 25 June 20010, pod nazivom "Readily Isolated Bispecific Antibodies with Native Immunoglobulin Format," objavljeno kao US 2010/0331527A1.

[0099] U jednom slučaju, epitope-veujući protein kao što je ovde opisanu kojem su humane VL i VH sekvence izvedene od ovde opisanih miševa koji su imunizovani antigenom koji sadrži epitop od interesa.

[0100] Takođe je naveden i an epitope-vezujući protein koji sadrži prvi i drugi poipeptid, gde prvi polipeptid sadrži, od N-kraja do C-kraja, prvi epitop-vezujući region koji selektivno vezuje prvi epitop, nakon čega sledi konstantan region koji sadrži prvi CH3 region humanog IgG odabranog od IgG1, IgG2, IgG4, i njihovu kombinaciju; i drugi polipeptid koji sadrži od N-kraja do C-kraja i drugi epitop-vezujući region koji selektivno vezuje drugi epitop, nakon čega sled konstantan region koji sadrži drugi CH3 region IgG čoveka odabran od IgG1, IgG2, IgG4, i njihovu kombinaciju, pri ćemu drugi CH3 region sadrži modifikaciju koja umanjuje ili eliminiše vezivanje drugog CH3 domena za protein A.

[0101] U jednom slučaju, drugi CH3 region sadrži H95R modifikaciju (prema numeraciji IMGT egzona; H435R prema EU numeraciji). U sledećoj realizaciji, drugi CH3 region dalje sadrži modifikaciju Y96F (IMGT; Y436F prema EU).

[0102] U narednomslučaju, drugi CH3 region je od modifikovanog humanog IgG1, i dlaje sadrži modifikaciju odabranu iz grupe koju čine D16E, L18M, N44S, K52N, V57M, i V82I (IMGT; D356E, L358M, N384S, K392N, V397M, i V422I prema EU).

[0103] U jednom slučaju, drugi CH3 region je od modifikovanog humanog IgG2, i dalje sadrži modifikaciju odabranu iz grupe koju čine N44S, K52N i V82I (IMGT; N384S, K392N, i V422I prema EU).

[0104] U narednom slučaju, drugi CH3 region je od modifikovanog humaog IgG4, i dalje sadrži modifikaciju odabranu iz grupe koju čine Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q, i V82I (IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q, i V422I by EU).

[0105] Jedan postupak dobijanja epitop-vezujućeg proteina koji vezuje više od jednog epitopa je imunizovati prvog miša, u skladu sa pronalaskom, antigenom koji sadrži prvi epitop od interesa, pri čemu miš sadrži lokus varijabilnog regiona endogenog lakog lanca imunoglobulina koji ne sadrži endogeni mišji VL koji ima sposobnost rearanžiranja i formiranja lakog lanca, pri čemu lokus varijabilnog regiona endogenog lakog lanca imunglobulina miša je jedan segment VL gena čoveka koji je operativno vezan za konstantan regiona gena endogenog lakog laca miša i segment VL gena čoveka je humani Vκ1-39Jκ5 i segmenti gena endogenog VH miša su zamenjeni u celosti ili deom segmentima gena VH čoveka, tako da teški lanci imunoglobulina dobijeni od miša su u celosti ili suštinski teški lanci koji sadrže varijabilne domene čoveka i konstantne domene miša. Kada je imunizovan, ovakav miš će napraviti reversno himerno antitelo, koje sadrži samo jedan od dva varijabilna domena lakog lanca čoveka (npr., Vκ1-39Jκ5 čoveka). Kada se identifikuje B ćelija koja kodira VH koji vezuje epitop od interesa, nukleotidna sekvenca VH (i po izobru, VL) se može ponovo pronaći (npr., pomoću PCR) i klonirana u ekspresioni konstrukt u okviru sa odgovarajućim konstantnim domenom imunoglobulina čoveka. Ovaj proces može se ponoviti tako da se identifikuje drugi VH domen koji vezuje drugi epitop i druga sekvenca VH gena se može povratiti i klonirati u ekspresioni vektor u okvir za drugi odgovarajući konstantan domen imunoglobulina. Prvi i drugo konstantni domeni imunoglobulina mogu biti istog ili razvličitog izotipa, i jedan od konstantnih domena imunoglobulina ali ne drugi) može se modifikovati kao što je

2

opisano ovde ili u US 2010/0331527A1, i epitop-vezujući protein se može eksprimriati u odgovarajućoj ćeliji i izolovati na osnovu diferencijanog afiniteta za Protein A u odnosu na homodimerni epitop-vezujući protein, npr., kao što je opisano u US 2010/0331527A1.

[0106] Takođe je opisan i postupak za dobijanje bispecifičnog epitop-vezujućeg proteina, koji obuhvata prvu afinitno-zrelu (npr., sadrži jednu ili više somatskih hipermutacija) humanu VH nukleotidnu sekvencu (VH1) miša kao što je ovde opisan, identifikujući drugu afinitetno-zrelu (npr., sadrži jedanu ili više somatskih hipermutacija) humanu VH nukleotidnu sekvencu (VH2) miša kao što je ovde opisan, klonirajući VH1 u okviru sa teškim lancem čoveka koji nema modifikaciju Protein A-determinante kao što je opisano u US 2010/0331527A1 za formiranje teškog lanca 1 (HC1), kloniranje VH2 u okviru sa teškim lancem čoveka koji sadrži Protein A-determinantu kao što je opisano u US 2010/0331527A1 za formiranje teškog lanca 2 (HC2), uvođenje ekspresionog vektora koji sadrži HC1 i isti ili različiti ekspresioni vektor koji sadrži HC2 , u ćeliju, pri čemu ćelija takođe eksprimira laki lanac imunoglobulina čoveka koji sadrži humani Vκ1-39/humani Jκ5 ili humani Vκ3-20/humani Jκ1 vezan za konstantan domen lakog lanca čoveka, omogućavajući tako ćeliji da eskprimira bispecifični epitop-vezujući protein koji sadrži VH domen koji je kodiran sa VH1 i VH domen kordiran sa VH2 i izolovanje bispecifičnog epitopvezujućeg proteina na osnovu njegove diferencijalne sposobnosti da veže Protein A u odnosu na monospecifičan homodimerni epitop-vezujući protein. U specifičnom slučaju, HC1 je IgG1, i HC2 je IgG1 koji sadrži modifikaciju H95R (IMGT; H435R prema EU) i sadrži još i modifikaciju Y96F (IMGT; Y436F prema EU). U jednom slučaju, VH domen kodiran sa VH1, VH domen kodiran sa VH2, ili oba su somatski mutirani.

VH geni čoveka koji se eksprimuju sa zajedničkim VL čoveka

[0107] Različiti humani varijablni regioni od afinitivno-zrelih antitela na četiri različita antigena eksprimuju se bilo sa svojim srodnim lakim lancem ili barem jednim lakim lancem čoveka, odabranim od Vκ1-39Jκ5 čoveka, Vκ3-20Jκ1 čoveka ili VpreBJλ5 čoveka (videti Primer 1). Za antitela na svaki od ovih antigena, somatski mutirani teški lanci visokog afiniteta iz različitih familija gena uspešno su se sparivali sa rearanžiranim regionima geritivnih linija Vκ1-39Jκ5 i Vκ3-20Jκ1 čoveka i izlučivali iz ćelija koje su eksprimirale teške i lake lance. Za Vκ1-39Jκ5 i Vκ3-20Jκ1, VH domeni izvedeni od sledećih humanih VH familija su se eksprimovale: 1-2, 1-8, 1-24, 2-5, 3-7, 3-9, 3-11, 3-13, 3-15, 3-20, 3-23, 3-30, 3-33, 3-48, 4-31, 4-39, 4-59, 5-51, i 6-1. Tako, miš dobijen tako da eksprimuje ograničen reportoar VL domena čoveka sa

2

jednog ili oba Vκ1-39Jκ5 i Vκ3-20Jκ1 generisaće različitu populaciju somatski mutiranih VH domena čoveka sa VH lokusa modifikovanog tako da su mišji segmenti VH gena zamenjeni segmentima VH gena čoveka.

[0108] Miševi dobijeni tako da eksprimiraju reversne himerne teške lance (varijablan čoveka, konstantan miša) imunoglobulina povezane sa jednim rearanžiranim lakim lancem (npr., Vκ1-39/Jk5), kad su imunizirani antigenom od interesa, dobijene B su ćelije koje sadrže različite preuređene segmente V čoveka i eksprimirane visokoafinitetna antigen-specifična antitela sa različitim osobinama po pitanju njihove sposobnosti da blokiraju vezivanje antigena za svoj ligand i po pitanju njihove sposobnosti da vežu varijante antigena (videti Primere 5 do 10).

[0109] Tako, ovde opisani miševi i postupci su korisni za dobijanje i odabir varijabilnih domena teškog lanca imunoglobulina čoveka, uključujući somatski mutirane varijabilne domene teškog lanca čoveka, koji nastaju kao razultat različitih rearanžiranja, koji ispoljavaju širok spektar afiniteta (uključujući i KDreda veličine od oko nanomola ili manje), širok spektar specifičnosti (uključujući vezivanje različitih epitopa istih antigena), i koji se povezuj i eksprimiraju sa stim ili suštini istim varijabilnim lakim lancima imunoglobulina čoveka.

[0110] Sledeći primeri su dati tako da opišu prosečnom stručnjaku kako da napravi i primeni metode i kompozicije pronalaska, i ni na koji način ne ograničavaju ono što pronalazačismatraju obimom pronalaska. Uloženi su napori da se osigura preciznost datih brojeva (npr., količine, temperatura, itd.) međutim treba računati na izvesne eksperimentalne greške i devijacije. Osim ako je drugačije naznačeno, delovi su težinski delovi, molekulska težina je prosečna molekulska težina, temperatura je data u stepenima Celzijusa, i pritisak je attmosferski pritisak ili prilbližno atmosferski.

PRIMERI

Primer 1. Identifikacija varijabilnih regiona lakog lanca čoveka koji su povezani sa odabranim varijabilnim regionima lakog lanca čoveka

[0111] Konstruisan je in vitro sistem ekspresije da bi se odredilo da li jedan prearanžiran laki lanac germitivne linije čoveka može biti eksprimovan zajedno sa humanim teškim lancima iz antigen specifičnih humanih antitela.

[0112] Metode za stvaranje humanih antitela kod genetski modifikovanih miševa su poznate (videti npr., US 6,596,541, Regeneron Pharmaceuticals, VELOCIMMUNE®). VELOCIMMUNE® tehnologija uključuje stvranje genetski modifikovanog miša koji ima genom koji sadrži humane varijabilne regione lakog i teškog lanca koji su operativno vezani za lokuse endogeg mišjeg konstantnog regiona tako da miš

2

proizvodi antitelo koji sadrži varijabilni region čoveka i konstantan region miša kao odgovor na antigensku stimulaciju. DNK koje kodiraju varijabilne regione teških i lakih lanaca antitela koje je proizveo VELOCIMMUNE® miš su potpuno humane. U početku, izolovana su himerna antitela visokog afiniteta koja imaju varijabilni region čoveka i konstantan region miša. Kao što je opisano u tekstu koji sledi, antitela su okarakterisana i izabrana sa željenim karakteristikama, uključujući afinitet, selektivnost, epitop, itd. Mišji konstantni regioni su zamenjeni željenim konstantnim regionom čoveka da bi se stvorilo potpuno humano antitelo koje sadrži izotip koji nije IgM (non-IgM), na primer prirodnog tipa ili modifikovani IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4. Dok izabrani konstantni region može da varira u zavisnosti od upotrebe, vezivanje antigena sa visokim afinitetom i karakteristike specifičnosti cilja sa nalaze u varijabilnom regionu.

[0113] VELOCIMMUNE® miš je imunizovan faktorom rasta koji promoviše angiogenezu (Antigen C) i antigen-specifična humana antitela su izolovana i sekvencirana za upotrebu V gena primenom poznatih standardnih tehnika. Izabrana antitela su klonirana na humane konstante regione teškog i lakog lanca i 69 teških lanaca je izabrano za sparivanje sa jednim ili tri humana laka lanca: (1) srodni κ laki lanac vezan za κonstantni region k čoveka, (2) preuređena humana germitivna linija Vκ1-39Jκ5 vezana za konstantan region κ čoveka, ili (3) preuređena humana germitivna linija Vκ3-20Jκ1 vezana za konstantan region κ čoveka. Svaki par teškog i lakog lanca je zajednički transfektovan u CHO-K1 ćelije korišćenjem standardnih tehnika. Prisustvo antitela u supernatantu je detektovano sa anti-humanim IgG metodom ELISA. Titar antitela (ng/ml) je određen za svaki par teškog i lakog lanca i titri sa različitim rearanžiranim lakim lancima germitivnih inija su poređeni sa titrima dobijenim od roditeljskog molekula antitela (tj., teškog lanca sparenog sa srodnim lakim lancem) i izračunat je procenat nativnog titra (Tabela 1). VH: varijabilni teški lanac gena. ND: pod datim eksperimentalnim uslovima ekspresija nije primećena.

2

2

[0115] U sličnom eksperimentu, VELOCIMMUNE® miševi su imunizovani sa nekoliko različitih antigena i izabrani teški lanci antigen specifičnih humanih antitela su testirani na njihovu sposobnost da se sparuju sa različitim preuređenim humanim germitivnim lakim lancima (kako je prethodno opisano). Antigeni upotrebljeni u ovom eksperimentu obuhvatali su enzim koji je uključen u homeostazu holesterola (antigen A), serum hormona uključenog u regulaciji homeostaze glukoze (anigen B), faktor rasta koji promoviše angiogenezu (Aantigen C) i receptor površine ćelije (antigen D). Antigen specifična antitela su izolovana od miševa iz svake imunizacione grupe i varijabilni regioni teškog lanca i lakog lanca su klonirani i sekvencirani. Iz sekvence teških i lakih lanaca, određena je upotreba V gena iizabrani teški lanci su spareni ili sa njihovim srodnim lakim lancem ili rearanžiranim regionom germitivne humane Vκ1-39Jκ5. Svaki par teški/laki lanac je ko-transfektovan u ćelije CHO-K1 i prisustvo antitela u supernatantu je detektovano sa anti-humanim IgG metodom ELISA. Titar antitela (µg/ml) je određen za svako sparivanje teškog lanca I lakog lanca I titri sa različtitim preuređenim humanim germitivnim lakim lancima su poređeni sa titrima dobijenim sa roditeljskim molekulom antitela (tj., teški lanac sparen sa srodnim lakim lancem) i izračunat je procenat nativnog titra (Tabela 2). VH: varijabilni teški lanac gena. Vκ: varijabilni κ laki lanac gena. ND: pod tekućim eksperimentalnim uslovima ekspresija nije detektovana.

[0116]

1

2

[0117] Rezultati dobijeni u ovim eksperimentima prikazuju da su somatski mutirani, teški lanci visokog afiniteta iz različitih familija gena sposobni da se sparuju sa preuređenim germitivnim humanim Vκ1-39Jκ5 i Vκ3-20Jκ1 regionima i budu izlučeni iz ćelija kao normalni molekul antitela. Kao što je prikazano u Tabeli 1, titar antitela je porastao za oko 61% (42 od 69) teških lanaca kad su spareni sa preuređenim humanim Vκ1-39Jκ5 lakim lancem i oko 29% (20 od 69) teških lanaca kad su spareni sa preuređenim Vκ3-20Jκ1 lakim lancem čoveka u poređenju sa srodnim lakim lancem roditeljskog antitela. Za oko 20% (14 od 69) teških lanaca, oba preuređena laka lanca humane germitivne linije su prikazala povećanje u ekspresiji u poređenju sa srodnim lakim lancem roditeljskog antitela. Kao što je prikazano u Tabeli 2, preuređen humani germitivni Vκ1-39Jκ5 region pokazao je povećanje ekspresije nekoliko teških lanaca specifičnih za raspon različitih klasa antigena u poređenju sa srodnim lakim lancem roditeljskih antitela. Titar antitela je povećan više od dva puta za oko 35% (15/43) teških lanaca u poređenju sa srodnim lakim lancem roditeljskih antitela. Za dva teška lanca (315 i 316), povećanje je bilo veće od deset puta u poređenju sa roditeljskim antitelom. Među svim teškim lancima koji su pokazali povećanje ekspresije u poređenju sa srodnim lakim lancem roditeljskih antitela, familija tri (VH3) teška lanca je najviše zastupljena u poređenju sa drugim varijabilnim regionima teških lanaca familija gena. Ovo pokazuje povoljan odnos humanih VH3 teških lanaca prema sparivanju sa preuređenim humanim germitivnim lakim lancima Vκ1-39Jκ5 i Vκ3-20Jκ1.

Primer 2. Generisanje lokusa lakog lanca rearanžiranog embriona čoveka [0118] Dobijeni su različiti ciljni vektori rearanžiranog humanog germitivnog lakog lanca upotrebom VELOCIGENE® tehnologije (videt, npr., US Pat. No. 6,586,251 i Valenzuela et al. (2003). Automatizovani sistem genomskog inženjeringa miša, konstruisan da obrade veliki broj ogleda, (engl.High-throughput) kuplovan sa analizom ekspresije velike rezolucije (engl.high-resolution expression analysis), Nature Biotech. 21(6):652-659) da bi se modifikovali klonovi mišjeg genomskog veštačkog blakterijskog hromozoma (BAC) 302g12 i 254m04 (Invitrogen). Upotrebom ova dva BAC klona, genomski konstrukti su dizajnirani tako da sadrže jedan preuređeni region germitivnog lakog lanca čoveka i ubačeni u lokus andogenog κ lakog lanca koji je prethodno modifikovan tako da deletira endogeni κ variabini deo i poveže segmenate gena.

A. Konstrukcija ciljnog vektora za rearanžirani laki lanac humane germitivne linije

[0119] Napravljena su tri različita preuređena regiona lakog lanca germitivne linije čoveka korišćenjem standardnih tehnika molekularne biologije koje su poznate u tehnici. Humani varijabilni segmenti gena upotrebljeni za komstrukciju ova tri regiona obuhvatali su rearanžiranu humanu Vκ1-39Jκ5 sekvencu, preuređenu humanu Vκ3-20Jκ1 sekvencu i rearanžiranu humanu VpreBJλ5 sekvencu.

[0120] Fragment DNK koji sadrži ekson 1 (koji enkodira vodeći peptid) i intron 1 mišjeg Vκ3-7 gena su napravljeni pomoću de novo DNK sinteze (Integrated DNA Technologies). Uključen je deo od 5' neprevedenog regiona do mesta prirodno nastalog Blpl restrikcionog enzima. Eksoni humanih Vκ1-39 i Vκ3-20 gena su pomoću PCR pojačani iz biblioteke humanih genomskih BAC. Čeone sekvence forward imale su 5' ekstenziju koja sadrži mesto splajsovanja akceptora introna 1 mišjeg Vκ3-7 gena. Desni (reverzni) prajmer (graničnik) upotrebljen za PCR humane Vκ1-39 sekvence uključivao je humani Jκ5 koji enkodira ekstenziju, dok je desni prajmer upotrebljen za PCR humane Vκ3-20 sekvence uključivao humani Jκ1 koji enkodira ekstenziju. Humana VpreBJλ5 sekvenca je načinjena de novo DNK sintezom (Integrated DNA Technologies). Deo humanog Jκ-Cκ introna koji uključuje mesto splajsovanja donora je PCR pojačan od plazmida pBS-296-HA18-PIScel. Levi (forward) PCR prajmer je uključio deo koji enkodira ekstenziju ili humane Jκ5, Jκ1, ili Jλ5 sekvence. Desni prajmer je uključio PI-Scel mesto, koje je prethodno ugrađeno u intron.

[0121] Mišji Vκ3-7 ekson1/intron 1, humani varijavilni laki lanac eksona,i fragmenti humanog Jκ-Cκ introna su su spojeni zajedno primenom lančane reakcije polimeraze (engl. overlap extension PCR), digestirani sa Blpl i PI-Scel, i ligatirani u plazmid pBS-296-HA18-PIScel, koji je sadržao promoter iz segmenta varijabilnog Vκ3-15 gena. Kaseta higromicina unutar plazmida pBS-296-HA18-PIScel u tečnom kiseoniku, zamenjena je sa kasetom FRTed higromicina okruženom sa NotI i AscI mestima. NotI/PI-SceI fragment ovog plazmida je ligatiran u modifikovani mišji BAC 254m04, koji je sadržap deo mišjeg Jκ-Cκ introna, mišji Cκ ekson, i oko 75 kb genomske sekvence nizvodono od mišjeg κ lokusa što je obezbedilo krak homolgoije 3' za homogu rekombinaciju u mišjim ES ćelijama. The Notl/Ascl fragment ovog BAC je podvrgnut ligaciji u modifikovani miši BAC 302g12, koji je sadržao FRTed neomicin kasetu i oko 23 kb genomske sekvence uzvodno od endogenog κ lokusa za homologu rekombinaciju u mišje ES ćelije.

B. Ciljni vektor za rearanžiran humani germitivn Vκ1-39Jκ5 (Slika 1)

[0122] Mesta restrikcionog enzima su uvedena na 5' i 3' krajevima genetski modifikovanog inserta lakog lanca za kloniranje u vektor za ciljanje : Ascl mesto na 5' kraju i PI-Scel mesto na 3' kraju. Unutar 5' Ascl mesta i 3' PI-Scel mesta ciljanog konstrukta od 5' do 3' uključivao je krak homologije 5' koji sadrži sekvencu 5' do

4

lokusa endogenog mišjeg κ lakog lanca dobijenog od mišjeg BAC klona 302g12, FRTed neomicin rezistantnog gena, genomske sekvence koja uključuje humani Vκ3-15 promoter, čeone sekvence segmenta gena mišjeg varijabilnog Vκ3-7, intronske sekvence segmenta gena mišjeg varijabilnog Vκ3-7, otvoren okvir čitanja preuređenog regiona humane germitivne linije Vκ1-39Jκ5, genomske sekvence koje sadrže deo humanog Jκ-Cκ introna, i krak homologije 3' koja sadrži sekvencu 3' segmenta gena endogenog mišjeg Jκ5 dobijenog od mišjeg BAC klona 254m04 (Slika 1, sredina). Geni i/ili sekvence uzvodno od lokusa endogenog mišjeg κ lakog lanca i nizvodno od većine segmenata 3' Jκ gena (npr., endogeni 3' pojačivač) sa nemodifikovani ciljanim konstruktom (videti Sliku 1). Sekvenca dizajniranog lokusa humanog Vκ1-39Jκ5 je prikazana u SEQ ID NO:1.

[0123] Ciljana insercija preuređenog regiona humane germitivne linije Vκ1-39Jκ5 u BAC DNA je potvrđena polimeraznom lančanom reakcijom (PCR) upotrebom prajmera koji su locirani na sekvencama unutar preuređenog regiona lakog lanca humane germitivne linije. Ukratko, intron sekvenca 3' do čeone mišje sekvence Vκ3-7 potvrđena je prajmerima ULC-m1F (AGGTGAGGGT ACAGATAAGT GTTATGAG; SEQ ID NO:2) i ULC-m1R (TGACAAATGC CCTAATTATA GTGATCA; SEQ ID NO:3). Otvoren okvir čitanja preuređenog regiona humane germitivne Vκ1-39Jκ5 potvrđena je prajmerima 1633-h2F (GGGCAAGTCA GAGCATTAGC A; SEQ ID NO:4) i 1633-h2R (TGCAAACTGG ATGCAGCATA G; SEQ ID NO:5). Neomicin kaseta je potvrđena prajmerima neoF (GGTGGAGAGG CTATTCGGC; SEQ ID NO:6) i neoR (GAACACGGCG GCATCAG; SEQ ID NO:7). Ciljana BAC DNK je tada upotrebljena da bi se elektroprirale mišje ES ćelije do kreiranih modifikovanih ES ćelija za stvaranje himernih miševa koji eksprimiraju preuređeni Vκ1-39Jκ5 region humanr germitivne linije.

[0124] Pozitivni klonovi ES ćelija su potvrđeni TAQMAN™ skriningom i kariotipizacijom upotrebom analiza koje su specifične za genteski modifikovan region lakog lanca Vκ1-39Jκ5 koji je insertovan u endogeni lokus. Ukratko, ispitivanje neoP (TGGGCACAAC AGACAATCGG CTG; SEQ ID NO:8) koji se vezuje unutar markera neomicin gena, ispitivanje ULC-m1 P (CCATTATGAT GCTCCATGCC TCTCTGTTC; SEQ ID NO:9) koji se vezuje za intron sekvencu 3' do mišje čeone sekvence Vκ3-7, i ispitivanje 1633h2P (ATCAGCAGAA ACCAGGGAAA GCCCCT; SEQ ID NO:10) koji se vezuje unutar preuređenog okvira čitanja Vκ1-39Jκ5 germitivne linije čoveka. Pozitivni klonovi ES ćelija su tada upotrebljeni za implantiranje u ženke miševa da bi se dobilo leglo mladunaca koji eksprimiraju region lakog lanca Vκ1-39Jκ5 germitivne linije čoveka.

[0125] Alternativno, ES ćelije koje nose region lakog lanca humane germitivne linije Vκ1-39Jκ5 transfektovani su u konstrukt koji eksprimira FLP da bi se uklonila kaseta FRTed neomicina uvedena ciljanim konstruktom. Opciono, neomicin kaseta je uklonjena uzgojem do miševa koji eksprimiraju FLP rekombinazu (npr., US 6,774,279). Po izboru, neomicin kaseta je zadržana u miševima

C. Ciljni vektor za preuređen germitivni Vk3-20Jk1 čoveka (Slika 2)

[0126] Na sličan način, gentski modifikovan lokus lakog lanca koji eksprimira preuređeni region humane germitivne linije Vκ3-20Jκ1 načinjen je upotrebom ciljanog konstrukta koji uključuje od 5' do 3', 5' krak homologije koji sadrži sekvencu 5' do lokusa endogenog mišjeg κ lakog lanca dobijenog od mišjeg BAC klona 302g12, FRTed neomicin rezistantni gen, genomsku sekvencu koja uključuje promotor Vκ3-15 čoveka, čeonu sekvencu segmenta mišjeg varijabilnog genskog segmenta Vκ3-7. intronsku sekvencu mišjeg varijabilnog genskog segmenta Vκ3-7, otvoren okvir čitanja preuređenog regiona germitivne Vκ3-20Jκ10 čoveka, genomsku sekvencu koja sadrži deo humanog Jκ-Cκ intron, i krak homologije 3' koji sadrži sekvence 3' endogenog mišjeg genskog segmenta Jκ5 dobijenog od mišjeg BAC klona 254m04 (Slika 2, sredina). Sekvenca genetski modifikovanog humanog Vκ3-20Jκ1 lokusa je prikazana u SEQ ID NO:11.

[0127] Ciljana insercija preuređenom regiona humane germitivne linije Vκ3-20Jκ1 u BAC DNA je potvrđena polimeraznom lančanom reakcijom (PCR) upotrebom prajmera koji su locirani na sekvenca unutar preuređenog regiona Vκ3-20Jκ1 lakog lanca humane germitivne linije. Ukratko, intron sekvenca 3' do mišje Vκ3-7 vodeće sekvence je potvrđena prajmerima ULC-m1 F (SEQ ID NO:2) i ULC-m1 R (SEQ ID NO:3). Otvoren okvir čitanja preuređenog regiona Vκ3-20Jκ1 humane germitivne linije, potvrđen je prajmerima 1635-h2F (TCCAGGCACC CTGTCTTTG; SEQ ID NO:12) i 1635-h2R (AAGTAGCTGC TGCTAACACT CTGACT; SEQ ID NO:13). Neomicin kaseta je potvrđena prajmerima neoF (SEQ ID NO:6) i neoR (SEQ ID NO:7). Ciljana BAC DNK je tada upotrebljena za eletroporaciju mišjih ES ćelija da bi se kreirale modifikovane ES ćelije za stvaranje humernih miševa koji eksprimiraju preuređeni regionv lakog lanca Vκ3-20Jκ1 humane germitivne linije.

[0128] Pozitivni klonovi ES ćelija su potvrđeni TAQMAN™ skriningom i kariotipizacijom upotrebom analiza koje su specifične za genetski modifikovan laki lanac Vκ3-20Jκ1 regiona koji je insertovan u endogeni lokus κ lakog lanca Ukratko, ispitivanje neoP (TGGGCACAAC AGACAATCGG CTG; SEQ ID NO:8) koji se vezuje unutar markera neomicin gena, ispitivanje ULC-m1 P (SEQ ID NO:9) koji se vezuje za intron sekvencu 3' do mišje Vκ3-7 vodeće sekvence, i ispitivanje 16353h2P (AAAGAGCCAC CCTCTCCTGC AGGG; SEQ ID NO:14) koji se vezuje unutar otvorenog okvira čitanja preuređenog regiona Vκ3-20Jκ1 humane germitivne linije. Pozitivni klonovi ES ćelija su tada upotrebljeni za implantiranje u ženke miševa. Leglo mladunaca eksprimira region Vκ3-20Jκ1 lakog lanca humane germitivne linije.

[0129] Alternativno, ES ćelije koje nose laki lanac Vκ3-20Jκ1 regiona germitivne linije čoveka, mogu biti transfektovane u konstrukt koji eksprimira FLP da bi se uklonila kaseta FRTed neomicina uvedena konstruktom (engl. targeting construct). Opciono, neomicin kaseta je uklonjena uzgojem do miševa koji eksprimiraju FLP rekombinazu (npr., US 6,774,279). Opciono, neomicin kaseta je zadržana u miševima

D. Ciljni vektor za rearanžiran germitivni VpreBJλ (Slika 3)

[0130] Na sličan način, gentski modifikovan lokus lakog lanca koji eksprimira preuređeni VpreBJλ5 region humane germitivne linije, dobijen je upotrebom konstrukta (engl. targeting construct) koji obuhvata krak homologije od 5' do 3', gde krak homologije 5' sadrži sekvencu 5' do lokusa endogenog mišjeg κ lakog lanca dobijenog od mišjeg BAC klona 302g12, FRTed neomicin rezistantni gen, genomsku sekvencu koja uključuje promotor Vκ3-15 čoveka, vodeću sekvencu segmenta mišjeg varijabilnog genskog segmenta Vκ3-7, intronsku sekvencu mišjeg varijabilnog genskog segmenta Vκ3-7, otvoren okvir čitanja preuređenog humanog germitivnog VpreBJλ5 regiona, genomsku sekvencu koja sadrži deo humanog Jκ-Cκ introna, i krak homologije 3' koji sadrži sekvence 3' endogenog mišjeg genskog segmenta Jκ5 dobijenog od mišjeg BAC klona 254m04. (Slika 3, sredina). Sekvenca genetski modifikovanog humanog VpreBJλ5 lokusa je prikazana u SEQ ID NO:15.

[0131] ] Ciljana insercija preuređenog VpreBJλ5 regiona humane germitivne linije u BAC, a DNK je potvrđena polimeraznom lančanom reakcijom (PCR) upotrebom prajmera koji su locirani na sekvencana unutar lakog lanca preuređeng VpreBJλ5 regiona humane germitivne linije. Ukratko, intronska sekvenca 3' do mišje Vκ3-7 vodeće sekvence potvrđena je prajmerima ULC-m1 F (SEQ ID NO:2) i ULC-m1 R (SEQ ID NO:3). Otvoren okvir čitanja preuređenog regiona VpreBJλ5 humane germitivne ćelije, potvrđen je prajmerima 1616-h1F (TGTCCTCGGC CCTTGGA; SEQ ID NO:16) i1616-h1R (CCGATGTCAT GGTCGTTCCT; SEQ ID NO:17). Neomicin kaseta je potvrđena prajmerima neoF (SEQ ID NO:6) i neoR (SEQ ID NO:7). Ciljana BAC DNK je tada upotrebljena za eletroporaciju mišjih ES ćelija da bi se kreirale modifikovane ES ćelije za kreiranje humernih miševa koji eksprimiraju preuređeni VpreBJλ5 region lakog lanca humane germitivne linije.

[0132] Pozitivni klonovi ES ćelija su potvrđeni TAQMAN™ skriningom i kariotipizacijom primenom analiza koje su specifične za genetski modifikovan laki lanac VpreBJλ5 regiona koji je insertovan u endogeni lokus κ lakog lanca, Ukratko, ispitivanje neoP (SEQ ID NO:8) koji se vezuje unutar markera neomicin gena, ispitivanje ULC-m1 P (SEQ ID NO:9) koji se vezuje za intron sekvencu 3' do mišje Vκ3-7 vodeće sekvence, i ispitivanje 1616h1P (ACAATCCGCC TCACCTGCAC CCT; SEQ ID NO:18) koji se vezuje unutar okvira čitanja VpreBJλ5 regiona humane germitivne linije. Pozitivni klonovi ES ćelija su tada upotrebljeni za implantiranje u ženke miševa da bi se dobilo leglo mladunaca koji eksprimiraju region lakog lanca germitivne linije.

[0133] Alternativno, ES ćelije koje nose region VpreBJλ5lakog lanca humane germitivne linije, mogu biti transfektovane u konstrukt koji eksprimira FLP da bi se uklonila FRTed kaseta sa neomicinom uvedena ciljanim konstruktom. Opciono, neomicin kaseta je uklonjena uzgojem do miševa koji eksprimiraju FLP rekombinazu (npr., US 6,774,279). Opciono, kaseta sa neomicinom je zadržana u miševima.

Primer 3. Stvaranje miševa koji eksprimiraju jedan rearanžirani germitivni laki lanac čoveka

[0134] Prethodno opisane ciljane ES ćelije su upotrebljene kao donorske ES ćelije i uvedene u mišji embrion faze 8 ćelija metodom VELOCIMOUSE® (videti, npr., US Pat. No.7,294,754 i Poueuremirouet al. (2007) F0 generacija miševa koji su u skoro potpuno izvedeni od donorskih ES ćelija sa ciljanim genima (engl.gene-targeted) koje omogućavaju neposrednu fenotipsku analizu Nature Biotech. 25(1):91-99. VELOCIMICE® koji nezavisno nosi genetski modifikovan region Vκ1-39Jκ5 lakog lanca humane germitivne linije, region Vκ3-20Jκ1 lakog lanca ili region VpreBJλ5 lakog lanca, identifikovani su genotipizacijom korišćenjem modifikacije analize alela (Valenzuela et al., supra) koja detektuje prisustvo jedinstvenog preuređenog regiona lakog lanca humane germitivne linije.

[0131] Mladunci su genotipizovani i mladunče koje je heterozigot za jedinstveni preuređeni region lakog lanca humane germitivne linije je izabrano za karakterizaciju ekspresije preuređenog regiona lakog lanca humane germitivne linije.

Primer 4. Uzgoj miševa koji eksprimiraju jedan rearanžirani germitivni laki lanac čoveka

A. Knokaut (KO) endogenog Igλ

[0135] Da bi se optimizovala upotreba genetski modifikovanog lokusa lakog lanca, miševi koji nose jedan od preuređenih regiona lakih lanaca humane germitivne linije, su pareni sa drugim mišem koji sadrži deleciju u lokusu endogenog λ lakog lanca. Na taj način, dobijeni potomci će eksprimirati, kao njihov jedini laki lanac, preuređeni region lakog lanca humane germitivne linije, kao što je opisano u Primeru 2. Uzgoj je izveden standardnim tehnikama koje su poznate u tehnici i, alternativno komercijalnim odgavijačem (npr., The Jackson Laboratory). Mišji soj koji nosi genetski modifikovan lokus lakog lanca i deleciju lokusa endogenog λ lakog lanca je kontrolisan na prisutvo jedinstvenog regiona lakog lanca i odsustvo endogenog lakog lanca λ miša.

B. Humanizovani lokus endogenog teškog lanca

[0136] Miševi koji nose genetski modifikovan lokus lakog lanca humane germitivne loinije, su pareni sa miševima koji sadrže zamenu lokusa varijabilnog teškog lanca endogenog mišjeg gena sa lokusom varijabilnog teškog lanca humanog gena (videti US 6,596,541; VELOCIMMUNE® mouse, Regeneron Pharmaceuticals, Inc.). VELOCIMMUNE® miš sadrži genome koji sadrži varijabilne regione humanog teškog lanca operativno povezane za endogene mišje lokuse konstantnog regiona tako da miš proizvodi antitela koja sadrže varijabilni region teškog lanca čoveka i mišji konstantni region teškog lanca kao odgovor na antigensku stimulaciju. DNK koja kodira varijabilne regione teških lanaca antitela je izolovana i operativno povezana za DNK koja nkodira konstantne regione teških lanaca čoveka. DNK je tada eksprimirana u ćelije koje su sposobne za ekspresiju potpuno humanog teškog lanca antitela.

[0137] Dobijeni su miševi koji nose zamenu endogenog mišjeg VH lokusa sa lokusom VH čoveka i jedan preuređeni region germitivnog VL čoveka na lokusu endogenog κ lakog lanca. Reverzna himerna antitela koja sadrže somatski mutirane teške lance (humane VH i mišje CH) sa jedinstvenim lakim lancem čoveka ( VL čoveka i CLmiša) dobijena su posle imunizacije sa antigenom od interesa. Identifikvoane su VH i VL sekvence nukleotida B ćelija koje eksprimiraju antitela i potpuno humana antitela su dobijena fuzijom VH i VL nukleotidnih sekvenci sa nukleotidnim sekvencama CH i CL čoveka u pogodnom sistemu eksprimiranja.

Primer 5. Stvaranje antitela od miševa koji eksprimiraju teške lance čoveka i rearanžirane regione germitivnog lakog lanaca čoveka

[0138] Posle uzgoja miševa koji sadrže getski modifikovan region humanog lakog lanca i različitih željenih sojeva koji sadrže modifikacije i delecije drugih endogenih Ig lokusa (kao što je opisano u Primer 4), izabrani miševi se mogu imunizovati antigenom od interesa.

[0139] Generalno, VELOCIMMUNE® miš koji sadrži jedan od jedinstvenih preuređenih regiona lakih lanaca humane germitivne linije, izazvan je antigenom i iz seruma životinja su izdvojene limfatične ćelije (kao što su B-ćelije). Limfatične ćelije su fuzionisane sa linijom mijelomskih ćelija da bi se pripremile linije besmrtnih hibridoma ćelija, i takve linije hibridoma ćelija su podvrgnute skriningu i izabrane za identifikaciju linija hibridoma ćelija koje proizvode antitela koja sadrže varijable humanog teškog lanca i preuređene lake lance humane germitivne linije koji su specifični za antigen upotrebljen za imunizaciju. Izolovane su DNK koje kodiraju variabilne regione teških lanaca i lakih lanaca i povezane sa željenim izotipnim konstantim regionima teških lanaca i lakih lanaca. Usled prisustva endogenih mišjih sekvenci i bilo kog dodatnih cis-delujućih elemenata prisutnih u endogenom lokusu, jedinstveni laki lanac svakog antitela može biti somatski mutiran. Ovo doprinosi dodatnoj raznolikosti antigen-specifičnog repertoara koji sadrži jedinstveni laki lanac i razne sekvence teškog lanca. Dobijene sekvence kloniranog antitela su zatim eksprimovane u ćeliji, kao što je CHO ćelija. Alternativno, DNK koje kodiraju antigenspecifična himerna antitela ili varijabilne domene lakih i teških lanaca su identifikovane direktno iz antigen-specifičnih limfocita.

[0140] U početku, izolovana su himerna antitela visokog afiniteta koja imaju variabilni region čoveka i mišji konstantni region. Kako je prethodno opisano, antitela su okarakterisana i izabrana prema željenim karakteristikama, uključujući afinitet, selektivnost, epitop, itd. Mišji konstantni regioni su zamenjeni željenim konstantnim regionom čoveka da bi se stvorilo potpuno humano antitelo koje sadrži somatski mutirani težak lanac čoveka i jedinstveni laki lanac izveden od preuređenog regiona lakog lanca germitivne linije čoveka, predmetnog pronalaska. Pogodni konstantni regioni čoveka uključuju, na primer divljeg tipa ili modofikovane IgG1 ili IgG4.

[0141] Izdvojene kohorte VELOCIMMUNE® miševa koji sadrže zamenu lokusa endogenog mišjeg teškog lanca sa segmentima gena V, D, i J čoveka i zamenu lokusa endogenog mišjeg lakog lanca sa ili genetski modifikovanim regionom Vκ1-39Jκ5 lakog lanca germitivne linije čoveka ili genetski modifikovanim regionom Vκ3-20Jκ1 lakog lanca germitivne linije čoveka (opisano ranije) su imunizovane sa proteinom receptora na površii ćelije čoveka (antigen E). Antigen E je dat direktno u stražnje stopalo miša sa šest uzastopnih injekcija svaka 3-4 dana. Dva do tri mikrograma antigena E je pomešano sa 10 µg CpG oligonukleotida (Cat # tlrl-modn -ODN1826 oligonukleotid ; InVivogen, San Diego, CA) i 25 µg Adju-Phos (Aluminijum fosfat gel adjuvant, Cat# H-71639-250; Brenntag Biosector, Frederikssund, Denmark) pre injekcije. Ukupno šest injekcija je dato pre krajnjeg povlačenja antigena, koji je dat 3-5 dana pre žrtvovanja. Uzorsci krvi posle četvrte i šeste

4

injekcije su sakupljeni i imunski odgovor antitela je posmatran pomoću standardne antigen-specifične imunoanalize.

[0142] Kada je postignut željeni imunski odgovor, sakupljeni su splenociti i spojeni sa mišjim mijelomskim ćelijama da bi se sačuvala njihova održivost i stvore linije hibridoma ćelija. Linije hibridoma ćelija su podvrgnute skriningu i izabrane da identifikuju ćelijske linije koje proizvode antigen E-specifična antitela zajedničkog lakog lanca antitela. Korišćenjem ove tehnike dobijeno je nekoliko anti-antigen E-specifičnih antitela zajednčkog lakog lanca (tj., antitela koja poseduju varijabilne domene teških lanaca čoveka, isti varijabilni domen humanog lakog lanca, i mišje konstantne domene).

[0143] Alternativno, anti-Antigen E antitela zajedničkog lakog lanca su izolovana direktno iz antigen-pozitivnih B ćelija bez spajanja sa ćelijama mjeloma, kao što je opisano u U.S. 2007/0280945A1. Upotrebom ove metode, dobijeno je nekoliko potpuno humanih anti-Antigen E antitela zajdničkog lakog lanca ( tj., antitela koja poseduju varijabilne domene humanog teškog lanca, ili dizajnirani laki lanac Vκ1-39Jκ5 čoveka ili dizajnirani region lakog lanca Vκ3-20Jκ1 čoveka i humane konstantne domene).

[0144] Biološke osobine ekzemplarnih anti-antigen E antitela zajednčkog lakog lanca generisanih prema metodama ovog Primera detaljno su opisane u delovima koje slede.

Primer 6. Upotreba genskog segmenta teškog lanca u antigen specifičnim antitelima zajedničkog lakog lanca

[0145] Da bi se analizirala struktura proizvedenih anti-antigen E antitela humanog zajedničkog lakog lanca, nukleniske kiseline koje enkodiraju varijabilne regione teškog lanca antitela su klonirane i sekvencirane. Iz sekvenci nukleinske kiseline i predviđenih sekvenci antitela, upotreba gena je identifikovana za varijabilni region teškog lanca (HCVR) izabranog zajedničkog lakog lanca antitela dobijenog od imunizovanih VELOCIMMUNE® miševa koji sadrže ili dizajnirani laki lanac Vκ1-39Jκ5 čoveka ili dizajnirani region lakog lanca Vκ3-20Jκ1 čoveka. Rezultati su prikazani u Tabelama 3 i 4, i pokazuju da miševi prema pronalasku stvaraju antigenspecifična antitela zajedničkog lakog lanca od raznih genskih segmenata humanog teškog lanca, usled raznih preuređivanja, kad se koriste ili miševi koji eksprimira laki lanac i samo jednog Vκ1-39- ili Vκ3-20-izvedeni laki lanac čoveka. VHgenski segment čoveka 2, 3, 4, i 5 familija preuređeni sa raznim DHsegmentima čoveka i JHsegmentima čoveka da bi se dobila antigen-specifična antitela.

[01463]

[0147]

Primer 7. Određivanje sposobnosti blokiranja antigen-specifičnih antitela zajedničkog lakog lanca Luminex™ metodom (engl.Luminex™ Assay)

[0148] Testirana je sposobnost devedeset osam antitela čoveka sa zajedničkim lakim lancem koja su odgajena na antigen E, za blokiranje vezivanja prirodnog liganda antigena E (Ligand Y) za antigen E u testu baziranom na kuglicama (engl. bead-based assay).

[0149] Ekstracekularni domen (ECD) antigena E je konjugovan za dva taga myc epitopa i tagom 6X histidina (antigen E-mmH) i amino-fuzionisan za karboksilovane mikrosfere sa koncentracijom od 20 µg/mL u MES puferu. Smeša je inkubirana tokom dva sata na sobnoj temperaturi pa je zatim izvršena deaktivacija kuglica sa 1M Tris pH 8.0 što je praćeno ispiranjem u PBS sa 0.05% (z/z) Tween-20. Kuglice su zatim blokirane sa PBS (Irvine Scientific, Santa Ana, CA)koji sadrži 2% (t/z) BSA (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO). U filter ploči sa 96 ležišta, supernatanti koji sadrže zajedničke lake lance antigen E-specifičifičnih antitela razblaženi su u puferu 1:15. Pripremljena je negativna kontrola koja sadrži lažni supernatant sa istim kompenentama medijuma kao za supernatant antitela. Antigenom E-označene kuglice su dodate supernatantu i inkubirane preko noći na 4°C. Biotinilizirani ligand Y protein je dodat krajnjoj koncentraciji od 0.06 nM i inkubiran tokom dva sata na sobnoj temperaturi. Detekcija biotiniliziranog-liganda Y vezanog za antigen E-myc-

4

myc-6His označene kuglice izvršena je sa R-fikoeritrinom konjugovanim sa streptavidinom (Moss Inc, Pasadena, MD) pa zatim merenjem u analizatoru baziranom na Luminex™ tečnoj citometriji. Srednja vrednost intenziteta fluorescencije fona (MFI) uzorka bez liganda Y je oduzeta od svih uzoraka. Procenat blokiranja je izračunat deljenjem MFI od koga je oduzet fon svakog uzorka sa podešenom vrednosti negativne kontrole, množenjem sa 100 i oduzimanjem dobijene vrednosti od 100.

[0150] U sličnom eksperimentu, testirana je sposobnost ista 98 humana antitela zajedničkog lakog lanca humanog antitela gajena na antigen E da blokiraju vezivanje antigena E za ligandom Y-obeležene kuglice.

[0151] Ukratko, ligand Y je amino-fuzionisan za karboksilovane mikrosfere sa koncentracijom od 20 µg/mL u MES puferu. Smeša je inkubirana tokom dva sata na sobnoj temperaturi pa je zatim izvršena deaktivacija kuglica sa 1 M Tris pH 8.0 što je praćeno ispiranjem u PBS sa 0.05% (z/z) Tween-20. Kuglice su zatim blokirane dodatkom PBS (Irvine Scientific, Santa Ana, CA) koji sadrži 2% (t/z) BSA (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO). U filter ploči sa 96 ležišta, supernatanti koji sadrže zajedničke lake lance antigen E-specifičifičnih antitela su razblaženi 1:15 u puferu. Pripremljena je negativna kontrola koja sadrži lažni supernatant sa istim kompenantama medijuma kao za supernatant antitela. Antigenom E-označene kuglice su dodate supernatantu i inkubirane preko noći na 4°C. Biotinilizirani antigen E-mmH je dodat krajnjoj koncentraciji od 0.42 nM i inkubiran preko noći na 4°C. Ligandom Y obeležene kuglice su tada dodate smeši antitelo/antigenE i inkubirane tokom dva sata na sobnoj temperaturi. Detekcija biotiniliziranog Antigen E-mmH vezanog za ligand Y-beads izvršena je sa R-fikoeritrinom konjugovanim sa streptavidinom (Moss Inc, Pasadena, MD) pa zatim merenjem u analizatoru zasnovanom na Luminex™ tečnoj citometriji. Srednja vrednost intenziteta fluorescencije fona (MFI) uzorka bez liganda Y je oduzeta od svih uzoraka. Procenat blokiranja je izračunat deljenjem MFI od koga je oduzet fon svakog uzorka sa podešenom vrednosti negativne kontrole, množenjem sa 100 i oduzimanjem dobijene vrednosti od 100.

[0152] Tabele 5 i 6 prikazuju procenat blokiranja za sva 98 antigen E antitela sa zajedničkim lakim lancem koja su testirana Luminex™ metodom. ND: nije određeno pod tekućim eksperimentalnim uslovima.

[0153] U prvom opisanom Luminex™ eksperimentu, testirana je sposobnost 80 antitela sa zajednilkim lakim lancem koji sadrže Vκ1-39Jκ5 dizajnirani laki lanac da blokiraju vezivanje liganda Y za antigenom E-označene kuglice. Od ovih 80 antitela sa zajedničkim lancem, 68 je pokazalo >50% blokiranja, dok je 12 pokazalo <50% blokiranja (6 sa 25-50% blokiranja i 6 sa <25% blokiranja). Za 18 antitela sa zajedničkim lancem koja sadrže Vκ3-20Jκ1 dizajnirani laki lanac, 12 je pokazalo više od >50% blokiranja, dok je 6 pokazalo <50% blokiranje (3 sa 25-50% blokiranja i 3 sa <25% blokiranja) vezivanja liganda Y za antigenom E-označene kuglice.

[0154] U drugom opisanom Luminex™ eksperimentu, testirana je sposobnost istih 80 antitela antitela sa zajedničkim lakim lancem, koja sadrže Vκ1-39Jκ5 dizajnirani laki lanac da blokiraju vezivanje antigena E za ligandom Y-označene kuglice. Od ovih 80 antitela sa zajedničkim lancem, 36 je pokazalo >50% blokiranja, dok je 44 pokazalo <50% blokiranja (27 sa 25-50% blokiranja i 17 sa <25% blokiranja). Za 18 antitela sa zajedničkim lancem koja sadrže Vκ3-20Jκ1 dizajnirani laki lanac, 1 je pokazao >50% blokiranja, dok je 17 pokazalo <50% blokiranja (5 sa 25-50% blokiranja i 12 sa <25% blokiranja) vezivanja antigena E za ligandom Y-obeležene kuglice.

[0155] Podaci u Tabelama 5 i 6 dokazuju da su rearanžiranja opisana u Tabelama 3 i 4 generisala anti-antigen E-specifična antitela lakog lanca koja blokiraju vezivanje liganda Y za njegov srodni receptor antigen E sa različitim stepenom efikasnosti, što je konzistentno sa anti-antigen E antitelima zajedničkog lanca iz Tabela 3 i 4 koje sadrže antitela sa epitopima preklapajuće i nepreklapajuće specifičnsti, u odnosu na antigen E.

[0156]

4

4

[0157]

4

Primer 8. Određivanje sposobnosti blokiranja antigen specifičnog antitela zajedničkog lanca ELISA metodom

[0158] Testirana je sposobnost h antitela čoveka sa zajedničkim lakim lancem gajena na antigen E da blokiraju vezivanje antigena E za ligandom Y obloženu površinu ELISA testom.

[0159] Ligand Y je obložen po ploči sa 96 ležista sa koncentracijom od 2 µg/mL razblažen u PBS i inkubiran preko noći, pa potom ispran četiri puta u PBS sa 0.05% Tween-20. Ploča je tada blokirana sa PBS (Irvine Scientific, Santa Ana, CA) koji sadrži 0.5% (t/z) BSA (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO) tokom jednog sata na sobnoj temperaturi. U posebnoj ploči, supernatanti koji sadrže anti-antigen E antitela sa zajedničkim lancem lakog lanca su razblaženi1:10 u puferu. Lažni supernatant sa istim komponentama antitela upotrebljen je kao negativna kontrola. Antigen E-mmH (prethodno opisan) dodat je u krajnjoj koncentraciji od 0.150 nM i inkubiran tokom jednog sata na sobnoj temperaturi. Smeša antitelo/antigen E-mmH je tada dodata u ploču koja sadrži ligand Y i inkubirana tokom jednog sata na sobnoj temperaturi. Detekcija antigen E-mmH vezanog za ligand Y određena je sa Horse-Radish peroksidazom (HRP) konjugovanom sa anti-penta-His antitelom (Qiagen, Valencia, CA) i razvijena standardnim kolorimetrijskim odgovorom upotrebom tetrametilbenzidin (TMB) supstrata (BD Biosciences, San Jose, CA) neutralizovanog sumpornom kiselinom. Apsorbancija je čitana na OD450 tokom 0.1 sec.

4

Apsorbancija fona uzorka bez antigena E je oduzeta od svih uzoraka. Procenat blokiranja je izračunat deljenjem MFI od koga je oduzet fon svakog uzorka sa podešenom vrednosti negativne kontrole, množenjem sa 100 i oduzimanjem dobijene vrednosti od 100.

[0160] Tabele 7 i 8 prikazuju procenat blokiranja za sva 98 anti-Antigen E antitela sa zajedničkim lakim lancem koja su testirani sa ELISA. ND: ND: nije određeno pod tekućim eksperimentalnim uslovima.

[0161] Kao što je opisano u ovom Primeru, od ovih 80 antitela sa zajedničkim lancem, koji sadrže Vκ1-39Jκ5 dizajnirani laki lanac i testirani su na njihovu sposobnost da blokiraju vezivanje antigena E za ligandom Y-obloženu površinu, 22 je pokazalo >50% blokiranja, dok je 58 pokazalo <50% blokiranja (20 sa 25-50% blokiranja i 38 sa <25% blokiranja). Za 18 antitela sa zajedničkim lancem koji sadrže Vκ3-20Jκ1 dizajnirani laki lanac, 1 je pokazalo >50% blokiranja, dok je 17 pokazalo <50% blokiranja (5 sa 25-50% blokitanja i 12 sa <25% blokiranja) vezivanja antigena E za ligandom Y-obeleženu površinu.

[0162] Ovi rezultati su takođe konzistentni sa skupom antigen E-specifičnih antitela sa zajednčkim lakim lancrm koji sadrži antitela sa preklapajućom i nepreklapajućom epitopskom specifičnosti u odnosu na antigen E.

4

1

Primer 9. Određivanje afiniteta za antigen E-specifična antitela sa zajedničkim lakim lancem pomoću BIAcore™

[0165] Konstante ravnoteže disocijacije (KD) za izabrane supernatante antitela određene su sa SPR (površinska plazmonska rezonanca) upotrebom BIAcore™ T100 instrumenta (GE Healthcare). Svu podaci su dobijeni korišćenjem HBS-EP (10mM Hepes, 150mM NaCl, 0.3mM EDTA, 0.05% surfaktant P20, pH 7.4) kako kao nosećeg pufera, tako i kao pufera uzorka na 25°C. Antitela su sakupljena iz sirovih uzoraka supernatanta na površinu CM5 senzorskog čipa koji je prethodno derivatizovan sa anti-humanim Fc antitelim velike gustine korišćenjem standardne tehnike fuzionisanja amina. Tokom faze sakupljanja, supernatanti su injektirani kroz anti-humanu Fc površinu sa brzinom toka od 3 µL/min, za ukupno 3 minuta. Sakupljanje je praćeno injekcijom ili nosećeg pufera ili analita sa koncentracijom od 100 nM tokom 2 minuta sa brzinom toka od 35 µL/min. Disocijacija antigena iz antitela je kontrolisana tokom 6 minuta. Sakupljena antitela su uklonjena kratkom injekcijom 10 mM glicina, pH 1.5. Svi senzogrami su dvostgruko referentni, oduzimanjem senzograma injekcija pufera od senzograma injekcija analita, uklanjajući na taj način artifakte uzrokovane disocijacijom antitela sa površine sakupljanja. Podaci o vezivanju za svako antitelo su fitovani sa 1:1 modelom

2

vezivanja sa transportom mase korišćenjem BIAcore T100 programa v2.1. Rezultati su prikazani u Tabelama 9 i 10.

[0166] Afiniteti vezivanja antitela sa zajedničkim lakim lancem koji sadrže preuređivanja prikazana u Tabelama 3 i 4 variraju, pri čemu svi pokazuju KDnanomolarskom opsegu. Podaci o afinitetu su konzistenzni sa antitelima zajedničkog lakog lanca nastalih iz kombinovanog spajanja preuređenih varijabilnih domena opisanih u Tabelama 3 i 4 budući da su visokog afiniteta, izabranih klonova, i somatski mutirani. Zajedno sa ranije prikazanim podacima, antitela zajednčkog lakog lanca opisana u Tabelama 3 i 4 čine skup različitih antitela, visokog afiniteta koja pokazuju specifičnost za jedan ili više epitopa na antigenu E.

[0167]

4

[0168]

Primer 10. Određivanje specifićnosti vezivanja antigen specifičnih antitela zajedničkog lakog lanca Luminex™ metodom

[0169] Testirana je sposobnost izabranih anti-antigen E antitela sa zajedničkim lakim lancem da se vezuju za ECD antigen E i ECD varijanti antigena E, uključujući ortolog cynomolgous majmuna (Mf antigen E), koji se razlikuje od humanog proteina u približno 10% ostataka njegovih amino kiselina; delecijski mutant antigena E kome nedostaje poslednjih 10 amino kiselina od C-terminalnog kraja ECD (antigen E-ΔCT); i dva mutantakoja sadrže supstituciju alanina na pretpostavljenoj lokaciji interakcije sa ligandomY (antigen E-Ala1 i antigenE-Ala2). Antigen E proteini su proizvedeni u CHO ćelijama i svaki je sadržao myc-myc-His C-terminalni tag.

[0170] Za ispitivanje vezivanja, antigen E ECD protein ili varijant proteina (prethodno opisan) sakupljeni su iz 1 mL medijuma kulture inkubacijom tokom 2 sata na sobnoj temperaturi sa 1 x 10<6>mikrosfernim (Luminex™) kuglicama koje su kovalentno obložene sa anti-myc monoklonalnim antitelom (MAb 9E10, hibridoma ćelijska linija CRL-1729™; ATCC, Manassas, VA). Kuglice su tada pre upotrebe isprane sa PBS. Supernatanti, koji sadrže anti-antigen E antitela sa zajedničkim lakim lancem, razblaženi su u puferu u odnosu 1:4 i dodati u filter ploče sa 96 ležišta. Lažni supernatant bez antitela je upotrebljen kao negativna kontrola. Kuglice koje sadrže sakupljene antigen E proteine su dodate u uzorke antitela (3000 kuglica po ležištu) i inkubirane preko noći na 4°C. Sledećeg dana, kuglice se uzorkom su isprane i vezano antitelo zajednčkog lakog lanca je detektovano sa R-fikoeritrin-konjugovanim anti-humanim IgG antitelom. Intenzitet fluorescencije kuglica (približno 100 kuglica je brojano za svaki uzorak antitela vezanog za svaki antigen E protein) meren je sa Luminex™ analizatorom baziranim na protočnoj citometriji, i srednja vrednost intenziteta fluorescencije (MFI) za najmanje 100 brojanih kuglica po interakciji kuglica/antitelo je zabeležena. Rezultati su prikazani u Tabelama 11 i 12.

[0173] Supernatanti anti-antigen E antitela zajedničkog lakog lanca ispoljili su visoko specifično vezivanje za čestice vezane za antigen E-ECD. za ove čestice, lažni supernatant negativne kontrole doveo je do zanemarljivog signala (<10 MFI) kad je kombinovan sa kuglicama uzorka antigen E-ECD, dok su supernatanti koji sadrže anti-antigen E antitela zajedničkog lakog lanca ispoljili jaki signal vezivanja (srednja MFI od 2627 za 98 supernatanata antitela; MFI > 500 za 91/98.uzoraka antitela)

[0174] Kao mera sposobnosti izabranih anti-antigen E antitela zajedničkog lakog lanca da identifikuju različite epitope na ECD antigena E, određeno je relativno vezivanje antitela za varijante. Sve četiri varijante antigena E su sakupljene na antimyc Luminex™ kuglicama kao što je ranije opisano za ispitivanje vezivanja nativnog antigen E-ECD, i određeni su odnosi relativnog vezivanja (MFIvarijanta/MFIAntigen E-ECD). Za 98 testiranih antitela zajedničkog lakog lanca supernatanti prikazani u Tabelama 11 i 12, prosečni odnosi (MFIvariant/MFIAntigen E-ECD) razlikuju se za svaku varijantu, verovatno odražavajući različite količine sakupljenog proteina na kuglicama (prosečni odnosi od 0.61, 2.9, 2.0, i 1.0 za antigen E-ΔCT, antigen E-Ala1, antigen E-Ala2, odnosno Mf Antigen E). Za svaku varijantu proteina, vezivanje za podgrupu od 98 testiranih antitela zajedničkog lakog lanca pokazalo je znatno smanjenje vezivanja, ukazujući na osetljivost na mutaciju koja karakteriše datu varijanru. Na primer, 19 od uzoraka antitela zajedničkog lakog lanca vezanih za Mf antigen E sa MFIvariant/MFIAntigen E-ECDod <8%. Pošto mnoge u ovoj grupi uključuju antitela visokog ili srednje visokog afiniteta (5 sa KD< 5nM, 15 sa KD< 50 nM), verovatno je da je niži signal za ovu grupu rezultat osetlivosti na razlike (epitop) sekvenci između nativnog antigena E-ECD, pre nego zbog manjeg afiniteta.

[0175] Ovi podaci potvrđuju da antitela zajedničkog lakog lanca opisana u Tabelama 3 i 4 zaista predstavljaju različitu grupu anti-antigen E antitela zajedničkog lakog lanca koja specifičo raspoznaju više od jednog epitopa na antigenu E.

1

Aspekti pronalaska

(1) Miš koji sadrži:

(a) zamenu na endogenom lokusu varijabilnog regiona lakog lanca κ imunoglobulina miša svih ili suštinski svih endogenih segmenata gena varijabilnog regiona lakog lanca κ imunoglobulina miša segmentom V κ1-39/J gena čiveka, segentom V κ3-20/J gena čovekaili njihovom kombinacijom, pri čemu je genski segment čoveka operablno vezan za endogeni konstantan gen κ miša;

(b) zamenu svih ili suštinski svih lokusa endogenih varijabilnih regiona teškog lanca miša većim brojem genskih segmenata varijabilnih regiona teškog lanca čoveka, pri čemu su segmenti gena varijabilnog regona teškog lanca čoveka operablno vezani za endogeni mišji konstantan gen lakog lanca i segementi gena varijabilnog regiona teškog lanca čoveka, su u stanju da se preurede i formiraju preuređeni humani/mišji himerni gen za teški lanac.

(2) Miš iz (1), pri čemu miš nema endogeni lokus varijabilnog regiona lakog lanca κ imunoglobulina miša koji može da se preuredi i formira gen koji kodira varijabilni region κ miša.

(3) Miš iz (1), koji dalje sadržo mišji κ intronski pojačivač 5' u odnosu na konstantan region lakog lanca miša.

(4) Miš iz (1), koji dalje sadrži mišji κ 3' pojačivač.

(5) Miš iz (1), gde je veći broj segemanata gena varijabilnog regiona teškog lanca čoveka sadrže segmente odabrane iz grupe koju čine 1-2, 1-8, 1-24, 2-5, 3-7, 3-9, 3-1 1, 3-13, 3-15, 3-20, 3-23, 3-30, 3-33, 3-48, 4-31, 4-39, 4-59, 5-51, 6-1 segment gena varijabilnog regiona imunoglobulina čoveka.

(6) Miš iz (1), gde veći broj segmenata gena varijabilnog regiona teškog lanca čoveka sadrže segment odabran iz grupe koju čine D1-7, D1-26, D3-3, D3-10, D3-16, D3-22, D5-5, D5-12, D6-6, D6-13, D7-27 segmenta gena i njihove kombinacije (7) Miš iz1), pri čemu miš sadži B ćeliju koja sadrži preuređenu sekvencu gena varijabilnog regiona teškog lanca imunoglobulina čoveka izvedenu od segmenta gena VH odabranog od VH2-5, VH3-23, VH3-30, VH4-39, VH4-59, VH5-51 , i izvedenu iz segmenta D gena odabranog od D1-7, D1-26, D3-3, D3-16, D3-10, D3-22, D5-5, D5-12, D6-6, D6-13 i D7-27.

(8) Miš iz (1), gde segment gena V κ1-39 čoveka je prisutan u preuređenom segmetu J κ5 gena čoveka.

2

(9) Miš iz zahteva 1(), gde je segment V κ3-20 gena čoveka prisutan u preuređenom segmentu J κ1 gena čoveka.

(10) Postupak za odabir humanog varijabilnog regiona za dobijanje bispecifičnog antitela, koji obuhvata:

(a) imunizaciju genetski modifikovanog miša sa antigenom od interesa, pri čemu miš sadrži (i) zamenu u endogenom lokusu varijabilnog regiona lakog lanca κ imunoglobulina miša svih ili suštinski svih endogenih segemanta gena varijabilnog regiona lakog lanca κ imunoglobulina miša, segmentom Vκ1-39/Jκ gena čoveka ili segmentom Vκ3-20/Jκ gena čoveka ili njihovom kombinacijom, pri čemu je segment gena čoveka operativno vezan za endogeni konstantan deo κ gena miša i (ii) zamenu svih ili suštinski svih u u endogenom lokusu varijabilnog regiona teškog lanca većim brojem segmenata gena varijabilnog regiona teškog lanca čoveka, pri čemu su segmenti gena varijabilnog regiona teškog lanca čoveka operabilno vezani za endogeni konstantan gen teškog lanca miša i segmenti gena varijabilnog regiona teškog lanca čoveka su u stanju da se preurede i formiraju preuređeni humani/mišji himerni gen za teški lanac.

(b) omogućavanje razvoj imunskog odgovora, kod miša, na antigen; i (c) identifikaciju klonalno odabranog limfocita miša koji eksprimira antitelo koje specifično veže antigen od interesa, i dobijanje nukleotidne sekvence koja kodira varijabilni region humanog teškog lanca iz limfocita ili antitela, koji specifično vezuje antigen od interesa; i

(d) Primenu nukleotidne sekvence iz (c) u dobijanju bispecifičnog antitela. (11) Postupak iz (10), gde je miš kojem nedostaje endogeni lokus varijabilnog lanca lakog lanca κ imunoglobulina miša u stanju da preuredi i formira gen koji kodira mišji varijabilni κ region.

(12) Postupak iz (10), koji dalje obuhvata mišji κ intronski pojačivač 5' u odnosu na konstantan region mišjeg lakog lanca.

(13) Postupak iz (10), koji dalje obuhvata mišji κ 3' pojačivač.

(14) Postupak iz (10), gde veći broj segmenata gena varijabilnih regiona lakog lanca čoveka sadrži segment odabran od 1-2, 1-8, 1-24, 2-5, 3-7, 3-9, 3-11, 3-13, 3-15, 3-20, 3-23, 3-30, 3-33, 3-48, 4-31, 4-39, 4-59, 5-51, 6-1 genskog segmenta varijabilnog regiona humanog imunoglobulina.

(15) Postupak iz (10), gde veći broj genskih segemnata varijabilnog regiona teškog lanca čoveka sadrže segment odabran od D1-7, D1-26, D3-3, D3-10, D3-6, D3- 22, D5-5, D5-12, D6-6, D6-13, D7-27 genskog segmenta i njihovu kombinaciju. (16) Postupak iz (10), gde miš sadrži B ćeliju koja sadrži preuređenu sekvencu gena za varijabilni region lakog lanca imunoglobulina koja obuhvata gen za varijabilni region teškog lanca čoveka dobijen od segmenta VH gena odabranog od VH2-5, VH3-23, VH3-30, VH4-39, VH4-59, VH5-51 , i izveden iz segmenta D gena odabranog od D1 -7, D1 -26, D3-3, D3-16, D3-10, D3-22, D5-5, D5-12, D6-6, D6-13, i D7-27.

(17) Postupak iz (10), gde je segment V κ1-39 gena čoveka prisutan u preuređenom genusegmenta J κ5 gena čoveka.

(18) Postupak iz (10), gde je segment V κ3-20 gena čoveka prisutan u preuređenom genu sa segementom J κ1 gena čoveka.

(19) Postupak iz (10), gde su koraci (a) do (d) izvedeni prvi put za prvi antigen od interesa za dobijanje prve sekvence varijabilnog regiona teškog lana čoveka koraci (a) do (d) su izvedeni drugi put za drugi antigen od interesa za dobijanje druge sekvence varijabilnog regiona teškog lanca čoveka, i pri čemu je prva sekvenca varijabilnog regiona teškof lanca čoveka eksprimirana fuzionisana sa prvim konstantnim regionom teškog lanca čoveka pri čemu se formira prvi težak lanac čoveka, druga sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca čoveka je eksprimirana fucionisana sa drugim konstantnim regionom teškog lanca čoveka pri čemu se formira drugi težak lanac čoveka, pri čemu su prvi i drugi teški lanci čoveka eksprimirani u prisustvu jednog lakog lanca čoveka koji je izveden iz segmenta V κ1 -39 ili V κ3-20 gena.

(20) Postupak iz (19), gde prvi težak lanac čoveka sadrži modifikaciju koja eliminiše ili suštinski umanjuje afinitet prvog teškog lanca čoveka za protein A, i drugi težak lanac čoveka zadržava sposovnost za vezivanje proteina A.

(21) Postupak iz (20), gde je modifikacija koja elminiše ili suštinski umanjuje afinitet prvog teškog lanca čoveka za protein A odabrana od 95R (EU 435R), 96F (EU 436F), i njihove kombinacije.

4

Claims (14)

Patentni zahtevi

1. Genetski modifikovani miš koji eksprimira varijabilne domene teškog i lakog lanca čoveka, pri čemu su varijabilni regioni lakog lanca čoveka eksprimirani iz jedne rearanžirane sekvence gena varigbilnog regiona (VL/JL) lakog lanca imunoglobulina čoveka koja je prisutan u germitivnoj liniji ćelija miša koja obuhvata sekvencu germitivne linje segmenta VLgena i sekvencu germitivne linije segmenta JLgena, gde varijabilni region lakog lanca imunoglobulina čoveka je rearanžiran Vκ1-39/Jκ5, pri čemu:

(a) miš bez lokusa endogenog varijabilnog regiona lakog lanca κ imunoglobulina miša koji može da rearanžira i formira gen koji kodira varijabilni region κ miša;

(b) miš eksprimira zajednički laki lanac imunoglobulina ćoveka za veći broj teških lanaca čoveka, gde je zajednički laki lanac izveden iz genske sekvence varijabilnog regiona lakog lanca imunoglobulina čoveka;

(c) miš sadrži B ćeliju koja eksprimira antitelo koje se spefično vezuje za antigen od interesa, pri čemu antitelo sadrži dati zajednički laki lanac i teški lanac imunoglobulina izveden i rearanžiranog varijabilnog genskog segmenta teškog lanca (VH) imunoglobulina čoveka odabranog iz grupe koju čine segment VH2-5, VH3-23, VH3-30, VH4-59 i VH5-51 gena; i

(d) 90-100% endogenih nerearanžiranih genskih segmenata VHmiša je zamenjeno većim brojem nerearanžiranih genskih segmenta VHčoveka.

2. Genetski modifikovan miš iz zahteva 1, naznačen time, što sadrži zamenu od 90 do 100% nerearanžiranih endogenih VHgenskih segmenata miša sa:

(i) najmanje 12 funkcionalnih nerearanžiranih VHgenskih segmenata čoveka;

(ii) najmanje 18 nerearanžiranih VHgenskih segmenata čoveka;

(iii) najmanje 39 nerearanžiranih VHgenskih segmenata čoveka;

(iv) najmanje 80 nerearanžiranih VHsegmenata čoveka; ili

(v) najmanje 81 nerearanžiran VHsegment čoveka.

3. Genetski modifikovan miš prema jednom od prethodnih zahteva, naznčen time, što miš eksprimira:

(a) težak lanac koji sadrži varijabilni domen imunoglobulina čoveka i konstantan region imunoglobolina miša; i/ili

(b) antitelo koje sadrži laki lanac koji sadrži varijabilni domen lakog lanaca imunoglobulina čoveka i konstantan dome lakog lanca imunoglobulina miša i težak lanac koji sadrži varijabilni domen teškog lanca imunoglobulina čoveka i konstantan domen teškog lanca imunoglobulina čoveka.

4. Genetski modifikovan miš prema jednom od prethodnih zahteva, naznačen time, što je genski segment VLčoveka operablno vezan za promotor sekvencu imunoglobulina.

5. Genetski modifikovani miš iz zahteva 4, naznačen time, što promotor sekvenca imunoglobulina je promotor sekvenca imunoglobulina čoveka.

6. Postupak dobijanja antitela koje vezuje antigen od interesa, a koji obuhvata imunizaciju miša prema jednom od zahteva 1 do 5, antigenom od interesa i primenu sekvence gena varijabilnog regiona humanog imunoglobulina iz miša za dobijanje antitela.

7. Postupak prema zahtevu 6 koji obuhvata: ekspresiju u jednoj ćeliji: (a) prve sekvence gena varijabilnog regiona teškog lanca miša prema jednom od zahteva 1 do 5 koji je imunizovan, pri čemu je sekvenca gena varijabilnog regiona imunoglobulina čoveka fuzionisana sa sekvencom gena konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina čoveka; i (b) sekvence gena varijabilnog regiona lakog lanca humanog imunoglobulina miša prema jednom od zahteva 1 do 5 koji je imunizovan, pri čemu je sekvenca gena varijabilnog regiona lako lanca imunoglobulina čoveka fuzionisana sa sekvencom gena konstantnog regiona lakog lanca imunoglobulina čoveka; održavanje ćelije pod uslovima dovoljnim za ekspresiju potpuno humanog antitela; i izolovanje antitela.

8. Postupak prema zahtevu 7, naznačen time, što ćelija sadrži drugu gensku sekvencu varijabilnog regiona teškog humanog imunoglobulina miša prema jednom od zahteva 1 do 5 koji je imunizovan, pri čemu je druga genska sekvenca teškog varijabilnog regiona imunoglobulina čoveka fuzionisana sa genskom sekvencom konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina čoveka, pri čemu prva genska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca kodira varijabilni region teškog lanca humanog imunoglobulina koji prepoznaje prvi epitop i druga genska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca imunoglobulin čoveka kodira varijabilni domen teškog lanca imunoglobulina čoveka koji prepoznaje drugi epitop i pri čemu prvi epitop i drugi epitop nisu identični.

9. Upotreba miša prema jednom od zahteva 1 do 5 za dobijanje antitela.

10. Upotreba prema zahtevu 9, gde antitelo je humano bispecifično antitelo.

11. Postupak za dobijanje humanog bispecifičnog antitela, koji obuhvata dobijanje genske sekvence varijabilnog regiona imunoglobulina čoveka iz B ćelija miša prema jednom od zahteva 1 do 5 i dobijanje antitela sa datim sekvencama.

12. Upotreba miša prema jednom od zahteva 1 do 5 za dobijanje ćelije koja eksprimira humano bispecifično antitelo, pri čemu su sekvence varijabilnog regiona teškog lanca humanog bispecifičnog antitela eksprimirane iz sekvenci varijabilnih regiona teškog lanca imunoglobulina čoveka dobijenim iz B ćelija miša.

13. Upotreba prema zahtevu 12, gde ćelija sadrži:

(a) gensku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca imunoglobulina čoveka koja kodira varijabilni dome lakog lanca imunoglobulina čoveka izvedan iz segmenta Vκ1-39Jκ5 gena čoveka, gde je sekvenca gena za varijabilni region lakog lanca imunoglobulina čoveka je fuzionisan, direktno ili preko linkera, za gensku sekvencu konstantnog regiona lakog lanca imunoglobulina čoveka, što za rezultat daje gen koji kodira laki lanac humanog imunoglobulina;

(b) prvu gensku sekvencu za varijabilni region lakog lanca imunoglobulina čoveka koja kodira prvi varijabilni domen teškog lanca imunoglobulina čoveka, pri čemu je prva genska sekvenca za varijabilni region teškog lanca imunoglobulina čoveka fuzionisana, direktno ili preko linkera, za gensku sekvencu konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina čoveka, pri čemu nastaje gen koji kodira prvi težak lanac imunoglobulina čoveka; pri čemu prvi varijabilni domen teškog lanca prepoznaje prvi epitop; i

(c) drugu gensku sekvencu za varijabilni region teškog lanca imunoglobulina čoveka koja kodira drugi varijabilni dimen teškog lanca imunoglobulina čoveka, pri čemu je druga genska sekvenca za varijabilni region teškog lanca imunoglobulina čoveka fuzionisana, direktno ili preko linkera, za gensku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca imunoglobulina čoveka, dajući tako gen koji kodira drugi težak lanac imunoglobulina čoveka; pri čemu drugi varjabilni domen teškog lanca humanog imunoglobulina prepoznaje drugi epitop i specifično ne prepoznaje prvi epitop,

pri čemu i prvi i drugi težak lanac imunoglobulina su povezani sa lakim lancem iz (a) imunoglobulina čoveka.

14. Upotreba miša prema jednom od zahteva 1 to 5 za identifikaciju varijabilnog domena teškog lanca imunoglobulina čoveka prisutnog u teškom lancu imunoglobulina koji je povezan sa jednim lakim lancem.