ES2648803T3 - Proceso para la producción de sofosbuvir - Google Patents

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Abstract

Un proceso para preparar un compuesto de fórmula SP-4:**Fórmula** que comprende: i) hacer reaccionar el compuesto C:**Fórmula** en la que LG' es tosilato, canforsulfonato, p-nitrofenóxido, p-clorofenóxido, o-clorofenóxido, 2,4-dinitrofenóxido o pentafluorofenóxido, con un reactivo básico y el compuesto 3:**Fórmula** en la que Z es un grupo protector o hidrógeno, para obtener SP-4 protegido o sin proteger; y ii) cuando SP-4 está protegido, desproteger SP-4 protegido para obtener SP-4,

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DESCRIPCION
Proceso para la produccion de sofosbuvir
Esta solicitud es una solicitud divisional del documento EP 10721225.0.
Campo de la invencion
En el presente documento se desvelan fosforamidatos de nucleosido y su uso como agentes para el tratamiento de enfermedades virales. Estos compuestos son inhibidores de la replicacion viral de ARN dependiente de ARN y son utiles como inhibidores de la polimerasa NS5B del VHC, como inhibidores de la replicacion del VHC y para el tratamiento de la infeccion por hepatitis C en mamlferos.
Antecedentes
La infeccion por virus de la hepatitis C (VHC) es un problema de salud importante que desarrolla enfermedad hepatica cronica, tal como cirrosis y carcinoma hepatocelular, en un numero considerable de individuos infectados, se estima que afecta al 2-15 % de la poblacion mundial. Se calcula que hay 4,5 millones de personas infectadas solo en Estados Unidos, segun el Centro de Control de Enfermedades de EE. UU. De acuerdo con la Organizacion Mundial de la Salud, en todo el mundo hay mas de 200 millones de personas infectadas, infectandose cada ano al menos 3 a 4 millones de personas. Una vez infectadas, aproximadamente el 20 % de las personas eliminan el virus, pero el resto puede alojar el VHC durante toda su vida. El diez a veinte por ciento de los individuos infectados cronicamente desarrollara con el tiempo cirrosis que destruye el hlgado o cancer. La enfermedad viral se transmite por via parenteral a traves de la sangre y productos sangulneos contaminados, agujas contaminadas, o por via sexual, y puede pasar de una madre infectada o madre portadora a su hijo. Los tratamientos actuales para la infeccion por VHC, que se restringen a inmunoterapia con interferon-a recombinante solo o en combinacion con el analogo nucleosido, ribavirina, presentan un beneficio cllnico limitado. Ademas, no existe vacuna alguna establecida para el VHC. En consecuencia, existe una necesidad urgente de agentes terapeuticos mejorados que combatan eficazmente la infeccion cronica por VHC.
El virion del VHC es un virus de ARN de cadena positiva con envoltura con una unica secuencia genomica oligorribonucleotldica de aproximadamente 9.600 bases que codifica una poliprotelna de aproximadamente 3.010 aminoacidos. Los productos proteicos del gen del HCV consisten en las protelnas estructurales C, E1, y E2, y las protelnas no estructurales NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A y NS5B. Se cree que las protelnas no estructurales (NE), proporcionan la maquinaria catalltica para la replicacion viral. La proteasa NS3 libera NS5B, la ARN polimerasa dependiente de ARN para la cadena de poliprotelna. Se requiere la polimerasa NS5B del VHC para la slntesis de un ARN bicatenario a partir de un ARN viral monocatenario que sirve como plantilla en el ciclo de replicacion del VHC. Por lo tanto, se considera que la polimerasa NS5B es un componente esencial en el complejo de replicacion del VHC (K. Ishi, et al, Heptology, 1999, 29: 1227-1235; V. Lohmann, et al, Virology, 1998.249: 108-118). La inhibicion de la polimerasa NS5B del VHC previene la formation del ARN bicatenario del VHC y por lo tanto constituye un enfoque atractivo para el desarrollo de terapias antivirales especlficas para el VHC.
El VHC pertenece a una familia de virus mucho mayor que comparte numerosas caracterlsticas comunes.
Virus Flaviviridae
La familia de virus Flaviviridae comprende al menos tres generos distintos: pestivirus, que causan enfermedad en el ganado y cerdos; flavivirus, que son la causa principal de enfermedades, tales como fiebre del dengue y fiebre amarilla; y hepacivirus, cuyo unico miembro es el VHC. El genero flavivirus incluye mas de 68 miembros separados en grupos basandose en la similitud serologica (Calisher et al., J. Gen. Virol, 1993, 70, 37-43). Los slntomas cllnicos varlan e incluyen fiebre, encefalitis y fiebre hemorragica (Fields Virology, Editores: Fields, B. N., Knipe, D. M., y Howley, P. M., Lippincott-Raven Publishers, Filadelfia, PA, 1996, capltulo 31, 931-959). Los flavivirus de preocupacion mundial que se asocian con enfermedades humanas incluyen los virus de la fiebre hemorragica del dengue (FHD), virus de la fiebre amarilla, slndrome de choque y virus de la encefalitis japonesa (Halstead, S. B., Rev. Infect Dis, 1984, 6, 251-264; Halstead, S. B., Science, 239: 476-481, 1988; Monath, T. P., New Eng. J. Med, 1988, 319, 64 1-643).
El genero pestivirus incluye el virus de la diarrea viral bovina (VDVB), el virus de la peste porcina clasica (VPPC, tambien denominado virus del colera porcino) y el virus de la enfermedad de la frontera (VEF) ovina (Moennig, V. et al. Adv. Vir. Res. 1992, 41, 53-98). Las infecciones por pestivirus del ganado domestico (vacas, cerdos y ovejas) causan considerables perdidas economicas en todo el mundo. VDVB causa la enfermedad de las mucosas en el ganado y tiene gran importancia economica en la industria ganadera (Meyers, G. y Thiel, H. J., Advances in Virus Research, 1996, 47, 53-118; Moennig V., et al, Adv. Vir. Res. 1992, 41, 53-98). Los pestivirus humanos no se han caracterizado tan exhaustivamente como los pestivirus animales. No obstante, los estudios serologicos indican una exposition considerable a pestivirus en seres humanos.
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Los pestivirus y hepacivirus son grupos de virus relacionados estrechamente con la familia Flaviviridae. Otros virus estrechamente relacionados con esta familia incluyen el virus GB A, agentes similares al virus GB A, virus GB B y virus GB C (tambien denominado virus de la hepatitis G, VHG). El grupo de los hepacivirus (virus de la hepatitis C; VHC) consiste en diversos virus estrechamente relacionados pero genotlpicamente distinguibles que infectan seres humanos. Existen al menos 6 genotipos del VHC y mas de 50 subtipos. Debido a las similitudes entre pestivirus y hepacivirus, combinado con la escasa capacidad de los hepacivirus para crecer de manera eficiente en un cultivo celular, se utiliza a menudo el virus de la diarrea viral bovina (VDVB) como sustituto para estudiar el virus VHC.
La organizacion genetica de pestivirus y hepacivirus es muy similar. Estos virus de ARN de cadena positiva poseen un unico marco de lectura abierto (MLA) grande codificante de todas las protelnas virales necesarias para la replicacion del virus. Estas protelnas se expresan como una poliprotelna procesada co- y post-traduccionalmente mediante las proteinasas tanto celulares como codificadas por el virus para producir las protelnas virales maduras. Las protelnas virales responsables de la replicacion del ARN del genoma viral se encuentran aproximadamente en el carboxi-terminal. Dos tercios del MLA se denominan protelnas no estructurales (NE). La organizacion genetica y el procesamiento de la poliprotelna de la porcion de protelnas no estructurales del mLa para pestivirus y hepacivirus son muy similares. Tanto para los pestivirus como los hepacivirus, las protelnas no estructurales (NE) maduras, en orden secuencial del extremo amino-terminal de la region codificante de la protelna no estructural al carboxi-terminal del MLA, consisten en p7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A y NS5B.
Las protelnas NE de pestivirus y hepacivirus comparten dominios de secuencia que son caracterlsticos de funciones especlficas de las protelnas. Por ejemplo, las protelnas NS3 de los virus de ambos grupos poseen motivos de secuencias aminoacidas caracterlsticos de serina proteinasas y de helicasas (Gorbalenya et al., Nature, 1988, 333, 22; Bazan y Fletterick Virology, 1989, 171, 637-639; Gorbalenya et al., Nucleic Acid Res., 1989, 17, 3889-3897). Del mismo modo, las protelnas NS5B de pestivirus y hepacivirus poseen los motivos caracterlsticos de ARN polimerasas dirigidas por ARN (Koonin, E.V. y Dolja, V. V., Cric. Rev. Biochem. Molec. Biol. 1993, 28, 375-430).
Los papeles y funciones reales de las protelnas NE de pestivirus y hepacivirus en el ciclo de vida de los virus son directamente analogos. En ambos casos, la serina proteinasa NS3 es responsable de todo el procesamiento proteolltico de los precursores de la poliprotelna corriente abajo de su posicion en el MLA (Wiskerchen y Collett, Virology, 1991, 184, 341-350; Bartenschlager et al., J. Virol. 1993, 67, 3835-3844; Eckart et al. Biochem. Biophys. Res. Comm. 1993, 192, 399-406; Grakoui et al., J. Virol. 1993, 67, 2832-2843; Grakoui et al. Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 1993, 90, 10583-10587; Hijikata et al., J. Virol. 1993, 67, 4665-4675; Tome et al., J. Virol., 1993, 67, 40174026). La protelna NS4A, en ambos casos, actua como un cofactor con la serina proteasa NS3 (Bartenschlager et al., J. Virol. 1994, 68, 5045-5055; Failla et al., J. Virol. 1994, 68, 3753-3760; Xu et al., J. Virol., 1997, 71:53 12-5322). La protelna NS3 de ambos virus tambien funciona como una helicasa (Kim et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 1995, 215, 160-166; Jin y Peterson, Arch. Biochem. Biophys., 1995, 323, 47-53; Warrener y Collett, J. Virol. 1995, 69,1720-1726). Por ultimo, las protelnas NS5B de pestivirus y hepacivirus presentan la actividad prevista de ARN polimerasas dirigidas por ARN (Behrens et al., EmBo, 1996, 15, 12-22; Lechmann et al., J. Virol., 1997, 71, 84168428; Yuan et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 1997, 232, 231-235; Hagedorn, PCT WO 97/12033; Zhong et al, J. Virol., 1998, 72, 9365-9369).
En la actualidad, existen opciones de tratamiento limitadas para los individuos infectados por el virus de la hepatitis C. La opcion terapeutica aprobada actual es el uso de la inmunoterapia con interferon-a recombinante solo o en combinacion con el analogo de nucleosido, ribavirina. Esta terapia se limita en su eficacia cllnica y solo el 50 % de los pacientes tratados responden a la terapia. Por lo tanto, son sumamente necesarias terapias mas eficaces e innovadoras para hacer frente a la necesidad medica insatisfecha planteada por la infeccion por VHC.
Se ha identificado actualmente diversas dianas moleculares potenciales para el desarrollo de farmacos antivirales de accion directa como agentes terapeuticos anti-VHC, incluyendo, entre otros, autoproteasa NS2-NS3, proteasa N3, helicasa N3, y polimerasa NS5B. La ARN polimerasa dependiente de ARN es absolutamente esencial para la replicacion del genoma de ARN monocatenario en sentido positivo, y esta enzima ha suscitado gran interes entre los qulmicos medicinales.
Se han revisado inhibidores de NS5B del VHC como terapias potenciales para la infeccion por VHC: Tan, S.-L., et al., Nature Rev. Drug Discov., 2002, 1, 867-881; Walker, M. P. et al., Exp. Opin. Investigational Drugs, 2003, 12, 1269-1280; Ni, Z-J, et al., Current Opinion in Drug Discovery and Development, 2004, 7, 446-459; Beaulieu, P. L., et al., Current Opinion in Investigational Drugs, 2004, 5, 838-850; Wu, J., et al., Current Drug Targets-Infectious Disorders, 2003, 3, 207-219.; Griffith, R. C., et al, Annual Reports in Medicinal Chemistry, 2004, 39, 223-237; Carrol, S., et al., Infectious Disorders-Drug Targets, 2006, 6, 17-29. El potencial de emergencia de cepas resistentes del VHC y la necesidad de identificar los agentes con una amplia cobertura de genotipo apoyan la necesidad de continuar los esfuerzos para identificar nucleosidos mas eficaces e innovadores como inhibidores de NS5B del VHC.
Los inhibidores de nucleosido de la polimerasa NS5B pueden actuar como un sustrato no natural que da como resultado la termination de cadena o como un inhibidor competitivo que compite con la union del nucleotido a la polimerasa. Para funcionar como una terminacion de cadena, la celulas debe captar el analogo de nucleosido y convertirlo in vivo a un trifosfato para competir por el sitio de union del nucleotido en la polimerasa. Esta conversion
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al trifosfato se media habitualmente por quinasas celulares que imparten requisitos estructurales adicionales a un inhibidor potencial de la polimerasa de nucleosido. Desafortunadamente, esto limita la evaluation directa de los nucleosidos como inhibidores de la replication del VHC en ensayos basados en celulas capaces de la fosforilacion in situ.
En algunos casos, la actividad biologica de un nucleosido se ve obstaculizada por sus caracterfsticas de pobre sustrato para una o mas de las quinasas necesarias para convertirlo a la forma trifosfato activo. La formation del monofosfato por el nucleosido quinasa se aprecia generalmente como la etapa limitante de la velocidad de los tres acontecimientos de fosforilacion. Para evitar la necesidad de la etapa de fosforilacion inicial en el metabolismo de un nucleosido en el analogo de trifosfato activo, se ha descrito la preparation de profarmacos de fosfato estables. Se han mostrado que los profarmacos de fosforamidato de nucleosido son precursores del trifosfato de nucleosido activo e inhiben la replicacion viral cuando se administran a celulas enteras infectadas virales (McGuigan, C., et al., J. Med. Chem, 1996, 39, 1748-1753; Valette, G., et al., J. Med. Chem., 1996, 39, 1981-1990; Balzarini, J., et al., Proc. National Acad Sci EE. UU., 1996, 93, 7295-7299; Siddiqui, A. Q., et al., J. Med. Chem., 1999, 42, 4122-4128; Eisenberg, E. J., et al., Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids, 2001, 20, 1091-1098; Lee, W. A., et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2005, 49, 1898); documentos US 2006/0241064; y WO 2007/095269.
Asimismo la limitacion de la utilidad de los nucleosidos como agentes terapeuticos viables se debe a veces por sus pobres propiedades fisicoqufmicas y farmacocineticas. Estas propiedades pobres pueden limitar la absorcion intestinal de un agente y limitar la captation en el tejido o celula diana. Para mejorar sus propiedades se han empleado profarmacos de nucleosidos. Se ha demostrado que la preparacion de fosforamidatos de nucleosido mejora la absorcion sistemica de un nucleosido y, ademas, el resto de fosforamidato de estos "pronucleotidos" se enmascara con grupos lipofilos neutros para obtener un coeficiente de division adecuado para optimizar la captacion y el transporte en la celula mejorando drasticamente la concentration intracelular del analogo de monofosfato de nucleosido en relation con la administration de solo el nucleosido original. La hidrolisis mediada por la enzima del resto de ester de fosfato produce un monofosfato de nucleosido en el que la limitation de velocidad de fosforilacion inicial es innecesaria. Con este fin, la solicitud de la patente de Estados Unidos 12/053.015, que corresponde a los documentos WO 2008/121634 y US 2010/0016251, desvela una serie de profarmacos de fosforamidato de nucleosido, muchos de los cuales muestran actividad en un ensayo de VHC. Varios compuestos desvelados en el documento US 2010/0016251 se ensayaron como potencial candidato clfnico para su aprobacion por la AAM.
Sumario de la invencion
Se desvela en el presente documento un compuesto representado por la formula 4 y sus diastereomeros a base de fosforo respectivos representados por las formulas SP-4 y RP-4.
O
O,
NH
J?
() HN~-?p-
°ph HO*"
o
o,
,0
/ \ PhO HA 'c
NH
o,
o
NH
//° /V/°n^N^O
o hn-p"—
/\ Phd' HO F
HO F
Sp-4 Rp-4
La presente invencion proporciona un proceso para preparar un compuesto de formula SP-4:
que comprende:
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i) hacer reaccionar el compuesto C:
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en la que LG' es tosilato, canforsulfonato, p-nitrofenoxido, p-clorofenoxido, o-clorofenoxido, 2,4-dinitrofenoxido, o pentafluorofenoxido, con un reactivo basico y el compuesto 3:
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10 en la que Z es un grupo protector o hidrogeno, para obtener SP-4 protegido o sin proteger; y ii) cuando SP-4 esta protegido, desproteger SP-4 protegido para obtener SP-4.
La presente invention tambien proporciona un proceso para preparar un compuesto de formula Rp-4:
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que comprende:
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i) hacer reaccionar el compuesto C':
imagen5
en la que LG' es tosilato, canforsulfonato, p-nitrofenoxido, p-clorofenoxido, o-clorofenoxido, 2,4-dinitrofenoxido, o pentafluorofenoxido, con un reactivo basico y el compuesto 3:
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en la que Z es un grupo protector o hidrogeno, para obtener RP-4 protegido o sin proteger; y ii) cuando RP-4 esta protegido, desproteger el RP-4 protegido para obtener RP-4,
La presente invention tambien proporciona un compuesto representado por la estructura:
imagen7
en la que el compuesto comprende una mezcla de diastereomeros representada por las siguientes estructuras:
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y;
en las que LG' es tosilato, canforsulfonato, p-nitrofenoxido, p-clorofenoxido, o-clorofenoxido, 2,4-dinitrofenoxido, o pentafluorofenoxido.
La presente invencion tambien proporciona un compuesto representado por la estructura
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en la que LG' es tosilato, canforsulfonato, p-nitrofenoxido, p-clorofenoxido, o-clorofenoxido, 2,4-dinitrofenoxido, o pentafluorofenoxido.
Las caracterfsticas preferidas de la invencion se exponen en las reivindicaciones dependientes.
Breve descripcion de los dibujos
Figura 1. Difractograma de XRD de alta resolution de 4.
Figura 2. Difractograma de XRD de alta resolucion de Rp-4.
Figura 3. Difractograma de XRD de alta resolucion de SP-4 (Forma 1).
Figura 4. Difractograma de XRD de alta resolucion de SP-4 (Forma 1).
Figura 5. Difractograma de XRD de alta resolucion de Sp-4CH2CI2 (Forma 2).
Figura 6. Difractograma de XRD de alta resolucion de Sp-4CHCI3 (Forma 3).
Figura 7. Difractograma de XRD de alta resolucion de Sp-4 (Forma 4).
Figura 8. Difractograma de XRD de alta resolucion de Sp-4 (Forma 5).
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Figura 9. Difractograma de XRD de alta resolucion de Sp-4 (amorfo).
Figura 10. Estructura de cristal de rayos X para Sp-4 (Forma 1)
Figura 11. Estructura de cristal de rayos X (Isotropica) para SP-4CH2CI2 (Forma 2)
Figura 12. Estructura de cristal de rayos X (Anisotropica) para Sp-4-CH2Cl2 (Forma 2)
Figura 13. Estructura de cristal de rayos X para Sp-4CHCl3 (Forma 3)
Figura 14. Espectro FT-IR de 4.
Figura 15. Espectro FT-IR de Rp-4.
Figura 16. Espectro FT-IR de Sp-4 Figura 17. Analisis TGA y DSC de 4.
Figura 18. Analisis TGA y DSC de Rp-4.
Figura 19. Analisis TGA y DSC de Sp-4.
Figura 20A. Estructura de cristal de rayos X para 8 (isomero Sp) (molecula n.° 1 de la unidad asimetrica).
Figura 20B. Estructura de cristal de rayos X para 8 (isomero Sp) (molecula n.° 2 de la unidad asimetrica).
Descripcion detallada
Definiciones
La expresion "una" entidad, como se usa en este documento, se refiere a una o mas de esa entidad; por ejemplo, un compuesto se refiere a uno o mas compuestos o al menos un compuesto. Como tal, el termino "una" (o "un"), "uno o mas", y "al menos uno" pueden usarse de forma intercambiable en el presente documento.
Las expresiones "opcional" u "opcionalmente", como se usan en el presente documento, significan que un evento o circunstancia que se describe posteriormente puede no ocurrir necesariamente, y que la descripcion incluye casos en los que el evento o circunstancia se produce y casos en los que no. por ejemplo, "enlace opcional" significa que el enlace puede o no estar presente, y que la descripcion incluye enlaces sencillos, dobles o triples.
El termino "p*" significa que el atomo de fosforo es quiral y que tiene una designacion Cahn-Ingold-prelog correspondiente de "R" o "S" que tienen sus significados habituales aceptados.
El termino "purificado", como se describe en el presente documento, se refiere a la pureza de un compuesto dado. por ejemplo, un compuesto esta "purificado" cuando el compuesto dado es un componente principal de la composicion, es decir, al menos un 50 % p/p puro. por lo tanto, "purificado" incluye al menos un 50 % p/p de pureza, al menos un 60 % p/p de pureza, al menos un 70 % de pureza, al menos un 80 % de pureza, al menos un 85 % de pureza, al menos un 90 % de pureza, al menos un 92 % de pureza, al menos un 94 % de pureza, al menos un 96 % de pureza, al menos un 97 % de pureza, al menos un 98 % de pureza, al menos un 99 % de pureza, al menos un 99,5 % de pureza y al menos un 99,9 % de pureza, donde "sustancialmente puro" incluye al menos un 97 % de pureza, al menos un 98 % de pureza, al menos un 99 % de pureza, al menos un 99,5 % de pureza, y al menos un 99,9 % de pureza.
El termino "metabolito", como se describe en el presente documento, se refiere a un compuesto producido in vivo despues de la administracion un sujeto que necesita el mismo.
El termino "aproximadamente" (tambien representado por ~) significa que el valor numerico mencionado es parte de un intervalo que varla dentro del error experimental estandar.
La expresion "sustancialmente como se muestra en..." un patron XRpD especificado significa que las posiciones pico mostradas en el patron XRpD son sustancialmente las mismas, dentro la inspeccion visual o recurrir a listas pico seleccionadas (± 0,2 °20). Un experto entiende que las intensidades pueden variar dependiendo de la muestra.
La expresion "sustancialmente anhidro" significa que una sustancia contiene como mucho el 10 % en peso de agua, preferiblemente como mucho el 1 % en peso de agua, mas preferiblemente como mucho el 0,5 % en peso de agua, y mucho mas preferiblemente como mucho el 0,1 % en peso de agua.
Un disolvente o anti-disolvente (como se usa en las reacciones, la cristalizacion, etc. o disolventes reticulares y/o adsorbidos) incluye al menos uno de un alcohol C1 a Ca, un eter C2 a Ca, una cetona C3 a C7, un ester C3 a C7, un clorocarbono C1 a C2, un nitrilo C2 a C7, un disolvente diverso, un hidrocarburo saturado C5 a C12, y un hidrocarburo aromatico C6 a C12.
El alcohol C1 a C8 se refiere a un alcohol lineal/ramificado y/o clclico/aclclico que tiene tal numero de carbonos. El alcohol C1 a C8 incluye, pero sin limitacion, metanol, etanol, n-propanol, isopropanol, isobutanol, hexanol y ciclohexanol.
El eter C2 a C8 se refiere a un eter lineal/ramificado y/o clclico/aclclico que tiene dicho numero de carbonos. El eter C2 a C8 incluye, pero sin limitacion, eter dimetllico, eter dietllico, eter diisopropllico, di-n-butil eter, metil-t-butil eter (MTBE), tetrahidrofurano, y dioxano
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La cetona C3 a C7 se refiere a una cetona lineal/ramificada y/o ciclica/aciclica que tiene dicho numero de carbonos. La cetona C3 a C7 incluye, pero sin limitacion, acetona, metil etil cetona, propanona, butanona, metil isobutil cetona, metil butil cetona y ciclohexanona.
El ester C3 a C7 se refiere a un ester lineal/ramificado y/o clclico/aclclico que tiene dicho numero de carbonos. El ester C3 a C7 incluye, pero sin limitacion, acetato de etilo, acetato de propilo, acetato de n-butilo, etc.
El clorocarbono Ci a C2 se refiere a un clorocarbono que tiene dicho numero de carbonos. El clorocarbono Ci a C2 incluye, pero sin limitacion, cloroformo, cloruro de metileno (DCM), tetracloruro de carbono, 1,2-dicloroetano, y tetracloroetano.
Un nitrilo C2 a C7 se refiere a un nitrilo que tiene dicho numero de carbonos. El nitrilo C2 a C7 incluye, pero sin limitacion, acetonitrilo, propionitrilo, etc.
Un disolvente diverso se refiere a un disolvente empleado comunmente en la qulmica organica, que incluye, pero sin limitacion, dietilenglicol, diglima (dietilenglicol dimetil eter), 1,2-dimetoxi-etano, dimetilformamida, dimetilsulfoxido, etilenglicol, glicerina, hexametilfosforamida, hexametilfosforo triama, N-metil-2-pirrolidinona, nitrometano, piridina, trietil amina y acido acetico.
El termino hidrocarburo saturado C5 a C12 se refiere a un hidrocarburo lineal/ramificado y/o clclico/aclclico. El hidrocarburo saturado C5 a C12 incluye, pero sin limitacion, n-pentano, eter de petroleo (ligrolna), n-hexano, n- heptano, ciclohexano y cicloheptano.
El termino aromatico C6 a C12 se refiere a hidrocarburos sustituidos y sin sustituir que tienen un grupo fenilo como su estructura principal. Los hidrocarburos preferidos incluyen benceno, xileno, tolueno, clorobenceno, o-xileno, m- xileno, p-xileno, xilenos, siendo tolueno mas preferido.
El termino "halo" o "halogeno" como se usa en el presente documento, incluye cloro, bromo, yodo y fluor.
El termino "grupo de bloqueo" se refiere a un grupo qulmico que muestra las siguientes caracterlsticas. El "grupo" se obtiene a partir de un "compuesto protector". Los grupos que son selectivos para hidroxilos primarios sobre hidroxilos secundarios que pueden ponerse en condiciones compatibles con la estabilidad del fosforamidato (pH 2-8) e imparten sobre el producto resultante propiedades flsicas sustancialmente diferentes que permiten una separation mas facil del producto del grupo nuevo de 3'-fosforamidato-5' del compuesto deseado sin reaccionar. El grupo debe reaccionar selectivamente con un buen rendimiento para dar un sustrato protegido que sea estable para las reacciones proyectadas (vease Protective Groups in Organic Synthesis, 3a ed. T. W. Greene y P. G. M. Wuts, John Wiley & Sons, Nueva York, N.Y., 1999). Los ejemplos de grupos incluyen, pero sin limitacion: benzollo, acetilo, benzollo fenil-sustituido, tetrahidropiranilo, tritilo, DMT (4,4'-dimetoxitritilo), MMT (4-monometoxitritilo), trimetoxitritilo, grupo pixilo (9-fenilxanten-9-ilo), tiopixilo (9-feniltioxanten-9-ilo) o 9-(p-metoxifenil)xantina-9-ilo (MOX), etc.; C(O)- alquilo, C(O)Ph, C(O)arilo, CH2O-alquilo, CH2O-arilo, SO2-alquilo, SO2-arilo, ferc-butildimetilsililo, ferc-butildifenilsililo. Los acetales, tales como MOM o THP y similares se consideran grupos posibles. Los compuestos fluorados tambien se contemplan en la medida en que pueden unirse al compuesto y pueden eliminarse selectivamente pasando a traves de un medio de extraction en fase solida de fluor (FluoroFlash®). Un ejemplo especlfico incluye un analogo de tritilo fluorado, un analogo tritilo 1-[4-(1H,1H,2H,2H-perfluorodecil)fenil)-1,1-difenilmetanol. Tambien se contemplan otros analogos fluorados de tritilo, BOC, FMOC, CBz, etc. Los cloruros de sulfonilo como cloruro de p- toluenosulfonilo pueden reaccionar selectivamente en la position 5'. Los esteres pueden formarse selectivamente, tales como acetatos y benzoatos. Pueden usarse anhldridos dicarboxllicos, tal como anhldrido succlnico y sus derivados para generar un enlace ester con un acido carboxllico libre, dichos ejemplos incluyen, pero sin limitacion oxalilo, malonilo, succinilo, glutarilo, adipilo, pimelilo, superilo, azelailo, sebacilo, ftalilo, isoftalilo, tereftalilo, etc. El acido carboxllico libre aumenta la polaridad dramaticamente y tambien puede usarse como una palanca para extraer el producto de reaction en fases acuosas moderadamente basicas tales como soluciones de bicarbonato sodico. El grupo fosforamidato es relativamente estable en medios acidos, por lo que tambien pueden usarse grupos que requieren condiciones de reaccion acidas, tales como, tetrahidropiranilo.
El termino "grupo protector" que se obtiene a partir de un "compuesto protector", tiene su significado simple y habitual, es decir, al menos un grupo protector o de bloqueo esta unido a al menos un grupo funcional (por ejemplo, -OH, -NH2, etc.) que permite la modification qulmica de al menos un grupo funcional diferente. Los ejemplos de grupos protectores, incluyen, pero sin limitacion, benzollo, acetilo, benzollo fenil-sustituido, tetrahidropiranilo, tritilo, DMT (4,4'-dimetoxitritilo), MMT (4-monometoxitritilo), trimetoxitritilo, grupo pixilo (9-fenilxanten-9-ilo), tiopixilo (9- feniltioxanten-9-ilo) o 9-(p-metoxifenil)xantina-9-ilo (MOX), etc.; C(O)-alquilo, C(O)Ph, C(O)arilo, C(O)O(alquilo inferior), C(O)O(alquileno inferior)arilo (por ejemplo, -C(O)OCH2Ph), C(O)Oarilo, CH2O-alquilo, CH2O-arilo, SO2- alquilo, SO2-arilo, un grupo protector que comprende al menos un atomo de silicio, tales como ferc-butildimetilsililo, ferc-butildifenilsililo, Si(alquil inferior)2OSi(alquil inferior)2OH (tal como -Si('Pr)2OSi('Pr)2OH.
La expresion "compuesto protector", como se usa en el presente documento, y a menos que se indique otra cosa, se refiere a un compuesto que contiene un "grupo protector" y que es capaz de reaccionar con un compuesto que
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contiene grupos funcionales que son capaces de protegerse.
La expresion "grupo saliente", como se usa en este documento, tiene el mismo significado para el experto (Advanced Organic Chemistry: reactions, mechanisms and structure-Cuarta Edicion de Jerry March, John Wiley and Sons Ed.; 1992 paginas 351-357) y representa un grupo que forma parte de y esta unido a una molecula de sustrato; en una reaccion donde la molecula de sustrato experimenta una reaccion de desplazamiento (por ejemplo, con un nucleofilo), el grupo saliente se desplaza entonces. Los ejemplos de grupos salientes incluyen, pero sin limitacion: halogeno (F, Cl, Br e I), preferiblemente Cl, Br o I; tosilato, mesilato, triflato, acetato, canforsulfonato, ariloxido, y ariloxido sustituido con al menos un grupo aceptor de electrones (por ejemplo, p-nitrofenoxido, 2-clorofenoxido, 4- clorofenoxido, 2,4-dinitrofenoxido, pentafluorofenoxido, etc.), etc. La expresion "grupo aceptor de electrones" tiene su significado habitual aqul. Los ejemplos de grupos aceptores de electrones incluyen, pero sin limitacion, un halogeno, -NO2, -C(O)(alquilo inferior), -C(O)(arilo), -C(O)O(alquilo inferior), -C(O)O(arilo), etc.
La expresion "reactivo basico", como se usa en este documento, significa un compuesto que es capaz de desprotonar un grupo hidroxilo. Los ejemplos de reactivos basicos incluyen, pero sin limitacion, un (alk inferior)oxido ((alquil inferior)OM) junto con un disolvente alcoholico, donde los (alk inferior)oxidos incluyen, pero sin limitacion, MeO-, EtO-, "PrO', 'PrO-, (BuO', 'AmO' (iso-amiloxido), etc., y donde M es un cation de metal alcalino, tal como Li+, Na+, K+, etc. Los disolventes alcoholicos incluyen (alquil inferior)OH, tales como, por ejemplo, MeOH, EtOH, "PrOH, 'PrOH, 'BuOH, 'AmOH, etc. Tambien pueden usarse bases no alcoxi tales como hidruro sodico, hexametildisilazano sodico, hexametildisilazano de litio, diisopropilamida de litio, hidruro calcico, carbonato sodico, carbonato potasico, carbonato de cesio, DBU, DBN, reactivos de Grignard, tales como (alquil inferior)Mg(halogeno), que incluyen, pero sin limitacion, MeMgCl, MeMgBr, (BuMgCl, (BuMgBr, etc.
El termino "base" incluye el termino "reactivo basico" y pretende ser un compuesto que es capaz de desprotonar un compuesto que contiene proton, es decir, una base Bronsted. Ademas de los ejemplos que se han mencionado anteriormente, los ejemplos adicionales de una base incluyen, pero sin limitacion piridina, colidina, 2,6-(alquil inferior)-piridina, dimetilanilina, imidazol, N-metil-imidazol, pirazol, N-metil-pirazol, trietilamina, di-isopropiletilamina, etc.
La expresion "grupo aceptor de electrones" es acorde con su significado habitual. Los ejemplos de grupos aceptores de electrones incluyen, pero sin limitacion, un halogeno (F, Cl, Br o I), -NO2, -C(O)(alquilo inferior), -C(O)(arilo), - C(O)O(alquil inferior),-C(O)O(arilo), etc.
El termino "co-cristalatos" incluyen co-cristalatos de 4, RP-4, o SP-4 junto con sales, que incluye sales farmaceuticamente aceptables.
El termino "sales", como se describe en el presente documento, se refiere a un compuesto que comprende un cation y un anion, que puede producirse por la protonacion de un resto aceptor de protones y/o la desprotonacion de un resto donador de protones. Ha de apreciarse que la protonacion del resto aceptor de protones da como resultado la formacion de una especie cationica en la que la carga se equilibra por la presencia de un anion fisiologico, mientras que la desprotonacion del resto donador de protones da como resultado la formacion de una especie anionica en la que la carga se equilibra por la presencia de un cation fisiologico.
La expresion "sal farmaceuticamente aceptable" significa una sal que es farmaceuticamente aceptable. Los ejemplos de sales farmaceuticamente aceptables incluyen, pero sin limitacion: (1) sales de adicion de acidos, formadas con acidos inorganicos, tales como acido clorhldrico, acido bromhldrico, acido sulfurico, acido nltrico, acido fosforico, y similares; o formadas con acidos organicos, tales como acido glicolico, acido piruvico, acido lactico, acido malonico, acido malico, acido maleico, acido fumarico, acido tartarico, acido cltrico, acido 3-(4-hidroxibenzoil)benzoico, acido cinnamico, acido mandelico, acido metanosulfonico, acido etanosulfonico, acido 1,2-etano-disulfonico, acido 2- hidroxietanosulfonico, acido bencenosulfonico, acido 4-clorobencenosulfonico, acido 2-naftalenosulfonico, acido 4- toluenosulfonico, acido canforsulfonico, acido lauril sulfurico, acido gluconico, acido glutamico, acido salicllico, acido muconico, y similares, o (2) sales de adicion de bases formadas con las bases conjugadas de cualquiera de los acidos inorganicos que se han enumerado anteriormente, donde las bases conjugadas comprenden un componente cationico seleccionado de entre Na+, K+, Mg2+, Ca2+, NHgR 4-g+, en la que R es un alquilo C1-3 y g es un numero seleccionado de entre 0, 1, 2, 3 o 4. Ha de entenderse que todas las referencias a sales farmaceuticamente aceptables incluyen formas de adicion de disolventes (solvatos) o formas cristalinas (polimorfos) como se define en el presente documento, de la misma sal de adicion de acidos.
El termino "alquilo" se refiere a un residuo hidrocarburo de cadena no ramificada o ramificada, saturado y monovalente que contiene de 1 a 30 atomos de carbono. El termino "alquilo C1-m" se refiere a un alquilo que comprende de 1 a M atomos de carbono, donde M es un numero entro que tiene los siguientes valores: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30. El termino "alquilo CW se refiere a un alquilo que contiene de 1 a 4 atomos de carbono. El termino "alquilo inferior" representa un residuo hidrocarburo de cadena lineal o ramificada que comprende de 1 a 6 atomos de carbono. "Alquilo ^-20", como se usa en este documento, se refiere a un alquilo que comprende de 1 a 20 atomos de carbono. "Alquilo ^10", como se usa en este documento, se refiere a un alquilo que comprende de 1 a 10 carbonos. Los ejemplos de grupos alquilo
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incluyen, pero sin limitation, grupos alquilo inferior que incluyen metilo, etilo, propilo, /-propilo, n-butilo, /-butilo, t- butilo o pentilo, isopentilo, neopentilo, hexilo, heptilo y octilo. El termino (ar)alquilo o (heteroaril)alquilo indican que el grupo alquilo esta opcionalmente sustituido con un grupo arilo o un grupo heteroarilo respectivamente.
El termino "alquenilo" se refiere a un radical de cadena hidrocarburo sin sustituir que tiene de 2 a 10 atomos de carbono que tienen uno o dos dobles enlaces oleffnicos, preferiblemente un doble enlace oleffnico. El termino "alquenilo C2-N" se refiere a un alquenilo que comprende de 2 a N atomos de carbono, donde N es un numero entero que tiene los siguientes valores: 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10. El termino " alquenilo C2-i0" se refiere a un alquenilo que comprende de 2 a 10 atomos de carbono. El termino "alquenilo C2-4" se refiere a un alquenilo que comprende de 2 a 4 atomos de carbono. Los ejemplos incluyen, pero sin limitacion, vinilo, 1-propenilo, 2-propenilo (alilo) o 2-butenilo (crotilo).
El termino "arilo", como se usa en el presente documento, y a menos que se indique otra cosa, se refiere a fenilo sustituido o sin sustituir (Ph), bifenilo, o naftilo, preferiblemente el termino arilo se refiere a fenilo sustituido o sin sustituir. El grupo arilo puede estar sustituido con uno o mas restos seleccionados entre hidroxilo, F, Cl, Br, I, amino, alquilamino, arilamino, alcoxi, ariloxi, nitro, ciano, acido sulfonico, sulfato, acido fosfonico, fosfato y fosfonato, sin proteger o protegidos segun sea necesario, como se conoce por los expertos en la tecnica, por ejemplo, como se indica en T.W. Greene y P.G. M. Wuts, "Protective Groups in Organic Synthesis", 3a ed., John Wiley & Sons, 1999.
El termino "ariloxido", como se usa en el presente documento, y a menos que se indique otra cosa, se refiere a fenoxido sustituido o sin sustituir (PhO-), p-fenil-fenoxido (p-Ph-PhO-), o naftoxido, preferiblemente el termino ariloxido se refiere a fenoxido sustituido o sin sustituir. El grupo ariloxido puede estar sustituido con uno o mas restos seleccionados de entre hidroxilo, F, Cl, Br, I, -C(O)(alquilo inferior), -C(O)O(alquilo inferior), amino, alquilamino, arilamino, alcoxi, ariloxi, nitro, ciano, acido sulfonico, sulfato, acido fosfonico, fosfato y fosfonato, sin proteger o protegidos segun sea necesario, como se conoce por los expertos en la tecnica, por ejemplo, como se indica en T.W. Greene y P.G. M. Wuts, "Protective Groups in Organic Synthesis", 3a ed., John Wiley & Sons, 1999.
El termino "preparation" o "forma de dosificacion" pretende incluir tanto formulaciones solidas como lfquidas del compuesto activo y un experto en la tecnica apreciara que un ingrediente activo puede existir en diferentes preparaciones dependiendo de la dosis deseada y los parametros farmacocineticos.
El termino "excipiente", como se usa en este documento, se refiere a un compuesto que se usa para preparar una composition farmaceutica, y es generalmente seguro, no toxico y ni biologica ni de otra manera indeseable, e incluye excipientes que son aceptables para su uso veterinario, asf como para uso farmaceutico humano.
El termino "cristalino" se refiere a una situation en la que una muestra solida de Sp-4 o Rp-4 tiene caracterfsticas cristalinas cuando se determina por difraccion de polvo de rayos X o una tecnica de rayos X monocristalina.
El termino "tipo cristal" se refiere a una situacion en la que una muestra solida de Sp-4 o Rp-4 tiene caracterfsticas cristalinas cuando se determina por un medio, visualmente o por microscopfa optica o polarizante, pero no tiene caracterfsticas cristalinas cuando se determina por otros medios, por ejemplo, difraccion de polvo de rayos X. Los metodos de determination visual de la cristalinidad de una muestra solida por vision o por microscopfa optica o de polarization se desvelan en USP <695> y <776>. Una muestra solida de Sp-4 o Rp-4 que es de "tipo cristal" puede ser cristalina en ciertas condiciones, pero puede volverse no cristalina cuando se somete a otras condiciones.
El termino "amorfo" se refiere a una situacion en la que una muestra solida de Sp-4 o Rp-4 no es cristalina ni de tipo cristal.
Se desvela en el presente documento un compuesto representado por la formula 4:
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en la que P* representa un atomo de fosforo quiral. Debido al atomo de fosforo quiral, el compuesto representado por la formula 4 comprende dos diastereomeros designados como Rp-4 y Sp-4. El compuesto representado por la formula 4 tambien puede ser parte de un solvato, un hidrato, o un solvato/hidrato mixto. El solvato se designa como 4nS, mientras que el hidrato se designa como 4-mH2O, donde S es un disolvente reticular, n varfa en una cantidad de numero entero o no entero de aproximadamente 0 a aproximadamente 3 y m varfa en una cantidad de numero entero o no entero de aproximadamente 0 a aproximadamente 5. Finalmente, el compuesto representado por la
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formula 4 puede no existir como un solvato o hidrato, pero tiene una cierta cantidad ventajosa de disolvente adsorbido (S) o agua. En cuyo caso, la cantidad de S o agua puede variar de aproximadamente el 0 % en peso a aproximadamente el 10 % en peso, basado en el peso del compuesto representado por la formula 4. El compuesto representado por la formula 4 y sus solvatos e hidratos del mismo es cristalino, de tipo cristal o amorfo.
Tambien se desvela en el presente documento un compuesto representado por la formula RP-4:
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El compuesto representado por la formula Rp-4 tambien puede ser parte de un solvato, un hidrato o un solvato/hidrato mixto. El solvato se designa como RP-4-nS, mientras que el hidrato se designa como SP-4mH2O, donde S es un disolvente reticular, n varfa en una cantidad de numero entero o no entero de aproximadamente 0 a aproximadamente 3 y m varfa en una cantidad de numero entero o no entero de aproximadamente 0 a aproximadamente 5. Finalmente, el compuesto representado por la formula RP-4 puede no existir como un solvato, hidrato, o solvato/hidrato mixto, pero tener una cierta cantidad ventajosa de disolvente adsorbido (S), agua, o tanto S como agua. En cuyo caso, la cantidad de S o agua puede variar de aproximadamente el 0 % en peso a aproximadamente l0 % en peso basado en el peso del compuesto representado por la formula RP-4. El compuesto representado por la formula RP-4 y sus solvatos e hidratos del mismo es cristalino, de tipo cristal o amorfo.
Tambien se desvela un compuesto representado por la formula Sp-4:
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El compuesto representado por la formula Sp-4 tambien puede ser parte de un solvato, un hidrato, o un solvato/hidrato mixto. El solvato se designa como Sp-4-nS, mientras que el hidrato se designa como Sp-4mH2O, donde S es un disolvente reticular, n varfa en una cantidad de numero entero o no entero de aproximadamente 0 a aproximadamente 3 y m varfa en una cantidad de numero entero o no entero de aproximadamente 0 a aproximadamente 5. Finalmente, el compuesto representado por la formula SP-4 puede no existir como un solvato o hidrato, pero tener una cierta cantidad ventajosa de disolvente adsorbido (S) o agua. En cuyo caso, la cantidad de S o agua puede variar de aproximadamente 0 % en peso a aproximadamente 10 % en peso basado en el peso del compuesto representado por la formula SP-4. El compuesto representado por la formula SP-4 y sus solvatos e hidratos del mismo es cristalino, de tipo cristal o amorfo.
Dosificacion, administration, y uso
Tambien se desvela en el presente documento una composition para el tratamiento y/o profilaxis de cualquiera de los agentes virales puede prepararse utilizando cualquiera de los compuestos 4, Rp-4, o Sp-4. Agentes virales posibles incluyen, entre otros: virus de la hepatitis C, virus de la hepatitis B, virus de la hepatitis A, virus del Nilo Occidental, virus de la fiebre amarilla, virus del dengue, rinovirus, virus de la polio, diarrea viral bovina, virus de la encefalitis japonesa, o aquellos virus que pertenecen a los grupos pestivirus, hepacivirus o flavivirus.
Una composicion para el tratamiento de cualquiera de los agentes virales desvelados puede comprender un medio farmaceuticamente aceptable se selecciona entre un excipiente, transportador, diluyente, medio equivalente y cualquiera de los compuestos 4, Rp-4, o Sp-4, teniendo por objeto incluir sus hidratos, solvatos, y cualquier forma cristalina de cualquiera de los compuestos 4, Rp-4, o Sp-4 o sus hidratos y solvatos de los mismos.
Los compuestos 4, Rp-4, o Sp-4 pueden formularse de forma independiente en diversas formas de dosificacion y transportadores de administration oral. La administration oral puede encontrarse en forma de comprimidos,
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comprimidos recubiertos, capsulas duras y blandas de gelatina, soluciones, emulsiones, jarabes, o suspensiones. Los compuestos 4, Rp-4, o Sp-4 son eficaces cuando se administran por medio de la administracion con supositorios, entre otras vlas de administracion. El modo mas conveniente de administracion es generalmente oral utilizando un regimen de dosificacion diario conveniente que puede ajustarse de acuerdo con la gravedad de la enfermedad y la respuesta del paciente a la medicacion antiviral.
Los compuestos 4, Rp-4, o Sp-4 junto con uno o mas excipientes, transportadores o diluyentes convencionales, pueden ubicarse en forma de composiciones farmaceuticas y dosis unitarias. Las composiciones farmaceuticas y formas de dosificacion unitaria pueden comprender ingredientes convencionales en proporciones convencionales, con o sin compuestos activos adicionales y las formas de dosificacion unitaria pueden contener cualquier cantidad eficaz adecuada del principio activo acorde con el intervalo diario de dosificacion que se pretende emplear. Las composiciones farmaceuticas pueden emplearse como solidos, tales como comprimidos o capsulas rellenas, semisolidos, polvos, formulaciones de liberation sostenida, o llquidos, tales como suspensiones, emulsiones, o capsulas rellenas para uso oral; o en forma de supositorios para administracion rectal o vaginal. Una preparation tlpica contendra aproximadamente 5 % a aproximadamente 95 % de compuesto o compuestos activos (p/p).
Los compuestos 4, Rp-4, o Sp-4 pueden administrarse solos pero generalmente se administraran mezclados con uno o mas excipientes, diluyentes o transportadores farmaceuticos adecuados seleccionados con respecto a la via de administracion deseada y la practica farmaceutica convencional.
Las preparaciones en forma solida incluyen, por ejemplo, polvos, comprimidos, plldoras, capsulas, supositorios, y granulos dispersables. Un transportador solido puede ser una o mas sustancias que tambien pueden actuar como diluyentes, agentes aromatizantes, solubilizantes, lubricantes, agentes de suspension, aglutinantes, conservantes, agentes disgregantes de comprimidos, o un material de encapsulation. En polvos, el transportador es generalmente un solido finamente dividido que es una mezcla con el componente activo finamente dividido. En comprimidos, el componente activo generalmente se mezcla con el transportador que tiene la capacidad de union necesaria en proporciones adecuadas y se compacta en la forma y tamano deseados. Transportadores adecuados incluyen, entre otros, carbonato de magnesio, estearato de magnesio, talco, azucar, lactosa, pectina, dextrina, almidon, gelatina, tragacanto, metilcelulosa, carboximetilcelulosa sodica, una cera de bajo punto de fusion, manteca de cacao, y similares. Las preparaciones en forma solida pueden contener, ademas del componente activo, colorantes, aromatizantes, estabilizadores, tampones, edulcorantes artificiales y naturales, dispersantes, espesantes, agentes solubilizantes, y similares. Los ejemplos de formulaciones solidas se ejemplifican en los documentos EP 0524579; US 2002/0142050; US 2004/0224917; US 2005/0048116; US 2005/0058710; US 2006/0034937; US 2006/0057196; US 2006/0188570; US 2007/0026073; US 2007/0059360; US 2007/0077295; US 2007/0099902; US 2008/0014228; US 6.267.985; US 6.294.192; US 6.383.471; US 6.395.300; US 6.569.463; US 6.635.278; US 6.645.528; US 6.923.988; US 6.932.983; US 7.060.294; y US 7.462.608.
Las formulaciones llquidas que tambien son adecuadas para la administracion oral incluyen formulaciones llquidas que incluyen asimismo emulsiones, jarabes, elixires y suspensiones acuosas. Estas incluyen preparaciones en forma solida destinadas a convertirse en preparaciones en forma llquida poco antes de su uso. Ejemplos de formulaciones llquidas se ejemplifican en las patentes de Estados Unidos n.° 3.994.974; 5.695.784; y 6.977.257. Las emulsiones pueden prepararse en soluciones, por ejemplo, en soluciones acuosas de propilenglicol o pueden contener agentes emulsionantes, tales como lecitina, monooleato de sorbitan, o acacia. Las suspensiones acuosas pueden prepararse dispersando el componente activo finamente dividido en agua con material viscoso, tal como gomas naturales o sinteticas, resinas, metilcelulosa, carboximetilcelulosa sodica, y otros agentes de suspension adecuadamente conocidos.
Los compuestos 4, Rp-4, o Sp-4 pueden formularse de forma independiente para la administracion como supositorios. En primer lugar, se funde una cera de bajo punto de fusion, tal como una mezcla de gliceridos de acidos grasos o manteca de cacao y el componente activo se dispersa homogeneamente, por ejemplo, por agitation. La mezcla homogenea fundida se vierte entonces en moldes de tamano conveniente, se deja enfriar y solidificar.
Los compuestos 4, Rp-4, o Sp-4 pueden formularse de forma independiente para la administracion vaginal. Pesarios, tampones, cremas, geles, pastas, espumas o pulverizadores que contienen ademas el ingrediente activo, tal como transportadores se conocen en la materia por ser apropiados. Algunas de estas formulaciones pueden utilizarse igualmente junto con un condon con o sin un agente espermicida.
Formulaciones adecuadas junto con transportadores, diluyentes y excipientes farmaceuticos se describen en Remington: The Science and Practice of Pharmacy 1995, editado por E. W. Martin, Mack Publishing Company, 19a edition, Easton, Pensilvania. Un cientlfico experto en formulation puede modificar las formulaciones en las ensenanzas de la memoria descriptiva para proporcionar numerosas formulaciones para una via particular de administracion sin hacer que las composiciones que contienen los compuestos contemplados en el presente documento sean inestables o comprometan su actividad terapeutica.
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Adicionalmente, los compuestos purificados 4, Rp-4, o Sp-4 pueden formularse de forma independiente junto con liposomas o micelas. En cuanto a los liposomas, se contempla que los compuestos purificados pueden formularse de manera como se desvela en las patentes de Estados Unidos n.° 4.797.285; 5.013.556; 5.077.056; 5.077.057; 5.154.930; 5.192.549; 5.213.804; 5.225.212; 5.277.914; 5.316.771; 5.376.380; 5.549.910; 5.567.434; 5.736.155; 5.827.533; 5.882.679; 5.891.468; 6.060.080; 6.132.763; 6.143.321; 6.180.134; 6.200.598; 6.214.375; 6.224.903; 6.296.870; 6.653.455; 6.680.068; 6.726.925; 7.060.689; y 7.070.801. Con respecto a las micelas, se contempla que los compuestos purificados pueden formularse de manera como se desvela en las patentes de Estados Unidos 5.145.684 y 5.091.188.
Tambien se desvela en el presente documento el uso de cualquiera de los compuestos 4, Rp-4, o Sp-4 en la fabrication de un medicamento para el tratamiento de cualquier afeccion del resultado de una infection por uno cualquiera de los siguientes agentes virales: virus de la hepatitis C, virus del Nilo Occidental, virus de la fiebre amarilla, virus del dengue, rinovirus, virus de la polio, virus de la hepatitis A, virus de la diarrea viral bovina y virus de la encefalitis japonesa.
El termino "medicamento" significa una sustancia utilizada en un metodo de tratamiento y/o profilaxis de un sujeto en necesidad del mismo, en el que la sustancia incluye, entre otros, una composition, una formulation, una forma de dosificacion, y similares, que comprende cualquiera de los compuestos 4, Rp-4, o Sp-4. Se desvela el uso de cualquiera de los compuestos 4, Rp-4, o Sp-4 en la fabricacion de un medicamento, para el tratamiento de cualquiera de las afecciones antivirales desveladas en el presente documento, solo o en combination con otro compuesto desvelado en el presente documento.
Tambien se desvela en el presente documento un metodo de tratamiento y/o profilaxis en un sujeto en necesidad del mismo, en el que dicho metodo comprende administrar una cantidad terapeuticamente eficaz de cualquiera de los compuestos 4, Rp-4, o Sp-4 al sujeto.
Se tiene por objeto que un sujeto en necesidad del mismo es uno que posee cualquier afeccion del resultado de una infeccion por cualquiera de los agentes virales desvelados en el presente documento, que incluye, entre otros, virus de la hepatitis C, virus del Nilo Occidental, virus de la fiebre amarilla, virus del dengue, rinovirus, virus de la polio, virus de la hepatitis A, virus de la diarrea viral bovina o virus de la encefalitis japonesa, virus Flaviviridae o pestivirus o hepacivirus o un agente viral que provoca slntomas equivalentes o comparables a cualquiera de los virus mencionados previamente.
El termino "sujeto" se refiere a un mamlfero, que incluye, entre otros, ganado, cerdos, ovejas, pollos, pavos, bufalos, llamas, avestruces, perros, gatos y seres humanos, preferentemente el sujeto es un ser humano.
El termino "cantidad terapeuticamente eficaz" como se utiliza en el presente documento, significa una cantidad requerida para reducir los slntomas de una enfermedad en un individuo. La dosis se ajustara a los requisitos individuales en cada caso particular. Esa dosificacion puede variar en los amplios llmites en funcion de numerosos factores, tales como la gravedad de la enfermedad a tratar, la edad y el estado de salud general del paciente, otros medicamentos con los que se esta tratando al paciente, la via y forma de administration y las preferencias y experiencia del practicante medico involucrado. Para la administracion oral, una dosificacion diaria comprendida entre aproximadamente 0,001 y aproximadamente 10 g, incluyendo todos los valores intermedios, tales como 0,001, 0,0025, 0,005, 0,0075, 0,01, 0,025, 0,050, 0,075, 0,1, 0,125, 0,150, 0,175, 0,2, 0,25, 0,5, 0,75, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9 y 9,5, por dla ha de ser apropiada en monoterapia y/o en terapia de combinacion. Una dosificacion diaria en particular oscila entre aproximadamente 0,01 y aproximadamente 1 g por dla, incluyendo todos los valores incrementales de 0,01 g (es decir, 10 mg) intermedios, una dosificacion diaria preferente entre aproximadamente 0,01 y aproximadamente 0,8 g por dla, mas preferentemente 0,01 y aproximadamente 0,6 g por dla, y mas preferentemente aproximadamente 0,01 y aproximadamente 0,25 g por dla, incluyendo cada uno de los cuales todos los valores incrementales de 0,01 g intermedios. Generalmente, el tratamiento se inicia con una "dosis de carga" inicial elevada para reducir o eliminar rapidamente el virus seguido de una disminucion de la dosis a un nivel suficiente para evitar la reaparicion de la infeccion. Un experto en el tratamiento de las enfermedades descritas en el presente documento sera capaz de establecer, sin experimentation excesiva y en funcion de su conocimiento, experiencia y las divulgaciones de la presente solicitud, una cantidad terapeuticamente eficaz del compuesto desvelado en el presente documento para una enfermedad y un paciente dados.
La eficacia terapeutica puede determinarse a partir de ensayos de la funcion hepatica, incluyendo, entre otros, niveles proteicos, tales como protelnas sericas (p. ej., albumina, factores de coagulation, fosfatasa alcalina, aminotransferasas (p. ej., alanina transaminasa, aspartato transaminasa), 5'-nucleosidasa, y- glutaminiltranspeptidasa, etc.), slntesis de bilirrubina, slntesis de colesterol y slntesis de acidos biliares; una funcion metabolica hepatica, incluyendo, entre otros, metabolismo de carbohidratos, metabolismo de aminoacidos y de amonlaco. Alternativamente, la eficacia terapeutica puede controlarse por medicion de ARN de VHC. Los resultados de estos ensayos permitiran que se optimice la dosis.
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Tambien se desvela en el presente documento un metodo de tratamiento y/o profilaxis en un sujeto en necesidad del mismo, comprendiendo dicho metodo administrar al sujeto una cantidad terapeuticamente eficaz de un compuesto representado por cualquiera de los compuestos 4, Rp-4, o Sp-4 y una cantidad terapeuticamente eficaz de otro agente antiviral; en el que la administration es simultanea o alternativa. Queda entendido que el tiempo entre la administration alternativa puede oscilar entre 1-24 horas, que incluye cualquier subintervalo intermedio que incluye 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, y 23 horas.
Ejemplos de "otro agente antiviral" incluyen, entre otros: inhibidores de la proteasa NS3 del VHC (vease los documentos EP 1881001, US 2003187018, US 2005267018, WO 2003006490, WO 200364456, WO 2004094452, WO 2005028502, WO 2005037214, WO 2005095403, WO 2007014920, WO 2007014921, WO 2007014922, WO 2007014925, WO 2007014926, WO 2007015824, WO 2008010921 y WO 2008010921); inhibidores NS5B del VHC (vease los documentos US 2004229840, US 2005154056, US 2005-98125, US 20060194749, US 20060241064, US 20060293306, US 2006040890, US 2006040927, US 2006166964, US 2007275947, US 6784166, US20072759300, WO 2002057287, WO 2002057425, WO 2003010141, WO 2003037895, WO 2003105770, WO 2004000858, WO 2004002940, WO 2004002944, WO 2004002977, WO 2004003138, WO 2004041201, WO 2004065367, WO
2004096210, WO 2005021568, WO 2005103045, WO 2005123087, WO 2006012078, WO 2006020082, WO
2006065335, WO 2006065590, WO 2006093801, WO 200702602, WO 2007039142, WO 2007039145, WO
2007076034, WO 2007088148, WO 2007092000, y WO2007095269); inhibidores NS4 del VHC (vease los
documentos WO 2005067900 y WO 2007070556); inhibidores NS5a del VHC (vease los documentos US 2006276511, WO 2006035061, WO 2006100310, WO 2006120251 y WO 2006120252); agonistas del receptor tipo Toll (vease el documento WO 2007093901); y otros inhibidores (vease los documentos WO 2000006529, WO 2003101993, WO 2004009020, WO 2004014313, WO 2004014852 y WO 2004035571); y compuestos desvelados en la solicitud de patente de Estados Unidos n.° 12/053.015, presentada el 21 de marzo de 2008 (documento US 2010/0016251), interferon-a, interferon-p, interferon-a pegilado, ribavirina, levovirina, viramidina, otro inhibidor nucleosido de la polimerasa de VHC, inhibidor no nucleosido de la polimerasa de VHC, inhibidor de la proteasa de VHC, inhibidor de la helicasa de VHC o inhibidor de fusion de VHC.
Cuando cualquiera de los compuestos 4, Rp-4, o Sp-4 se administra en combination con otro agente antiviral, la actividad puede aumentar con respecto al compuesto original. Cuando el tratamiento es una terapia de combinacion, dicha administracion puede ser simultanea o secuencial con respecto a la de los derivados de nucleosido. "Administracion simultanea" como se utiliza en el presente documento incluye por consecuencia la administracion de los agentes al mismo tiempo o en momentos diferentes. La administracion de dos o mas agentes al mismo tiempo puede conseguirse mediante una formulation unica que contiene dos o mas principios activos o mediante la administracion basicamente simultanea de dos o mas formas de dosificacion con un unico agente activo.
Se entendera que las referencias en el presente documento con respecto al tratamiento se extienden a la profilaxis asf como al tratamiento de las afecciones existentes. Es mas, el termino "tratamiento" de una infection por VHC, como se utiliza en el presente documento, tambien incluye el tratamiento o profilaxis de una enfermedad o una afeccion asociada o mediada por la infeccion por VHC, o los sfntomas clfnicos de la misma.
Preparation
Se desvela en el presente documento un proceso para preparar uno cualquiera de los compuestos 4, RP-4 o SP-4, que comprende: a) hacer reaccionar un alanato de isopropilo, A, un di-LG-fenilfosfato, B, 2'-desoxi-2'-fluoro-2'-C- metiluridina, 3, y una base para obtener una primera mezcla que comprende al menos uno de SP-4 y RP-4
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en la que X es una base conjugada de un acido, n es 0 o 1, y LG es un grupo saliente; b) hacer reaccionar la primera mezcla con un compuesto protector para obtener una segunda mezcla que comprende al menos uno de SP-4 protegido y RP-4 protegido; y c) someter opcionalmente la segunda mezcla a cristalizacion, cromatograffa o extraction con el fin de obtener 4, o el diastereomero a base de fosforo del mismo.
Tambien se desvela en el presente documento un proceso para preparar SP-4 o RP-4, que comprende:
a) hacer reaccionar un alanato de isopropilo, A, un di-LG-fenilfosfato, B, 2'-desoxi-2'-fluoro-2'-C-metiluridina, 3, y una base para obtener una primera mezcla que comprende al menos uno de Sp-4 y Rp-4
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en la que X es una base conjugada de un acido, n es 0 o 1, y LG es un grupo saliente; y
b) someter opcionalmente la segunda mezcla a cristalizacion, cromatograffa o extraccion con el fin de obtener
Sp-4 o RP-4 purificados.
El proceso desvelado en el presente documento para preparar Rp-4 puede incluir adicionalmente purificar ademas puede la segunda mezcla o el Rp-4 purificado disolviendo o suspendiendo la segunda mezcla o la mezcla de Rp-4 purificado en un disolvente; opcionalmente seguido de siembra con Rp-4 cristalino; y anadir suficiente anti-disolvente para obtener Rp-4 cristalino.
El proceso desvelado en el presente documento para preparar Sp-4 puede incluir adicionalmente purificar ademas la segunda mezcla o el Sp-4 purificado d) disolviendo o suspendiendo la segunda mezcla o el Sp-4 purificado en un disolvente seguido de siembra con Sp-4 cristalino a aproximadamente la temperatura ambiente; recoger un primer solido cuya mayor parte comprende Sp-4; disolver el primer solido en un disolvente a su temperatura de reflujo; y enfriar o anadir un anti-disolvente para obtener un segundo solido.
El proceso desvelado en el presente documento para la preparation de Sp-4 puede incluir adicionalmente purificar ademas Sp-4 d) disolviendo o suspendiendo la segunda mezcla o la mezcla de Sp-4 purificado en un primer disolvente seguido de anadir un anti-disolvente para obtener una primera composition en la que el disolvente/anti- disolvente residual se elimina por decantation para obtener un residuo; tratar el residuo con una solution que contiene el primer disolvente y anti-disolvente para producir una segunda composicion por lo que tras reducir la presion produce un primer solido; disolver o suspender el primer solido usando un segundo disolvente para obtener una tercera composicion; anadir cristales de siembra de Sp-4 a la tercera composicion; recoger un segundo solido; disolver o suspender el segundo solido en un tercer disolvente, opcionalmente calentado a la temperatura de reflujo del tercer disolvente para obtener una cuarta composicion, y, si es necesario, enfriar la cuarta composicion para obtener un tercer solido que comprende Sp-4 que se recoge por filtration.
Sp-4 puede purificarse adicionalmente por la segunda mezcla o el Sp-4 purificado d) anadiendo gel de sflice a la segunda mezcla o el Sp-4 purificado seguido de evaporation del disolvente para proporcionar una suspension seca; agitar la suspension seca en una primera combination de disolvente/anti-disolvente para obtener una primera suspension humeda; decantar la primera combinacion de disolvente/anti-disolvente de la primera suspension humeda para obtener una segunda suspension humeda y una primera composicion; anadir a la segunda suspension humeda una segunda combinacion de disolvente/anti-disolvente seguido de agitation; decantar la segunda combinacion de disolvente/anti-disolvente de la segunda suspension humeda para obtener una tercera suspension humeda y una segunda composicion; repetir opcionalmente las etapas g)-h) en la tercera suspension humeda o suspensiones humedas adicionales; evaporar el disolvente de la segunda composicion, y opcionalmente cualquier composicion adicional obtenida de la etapa opcional i) para obtener un primer solido; disolver o suspender el primer solido en una solucion que contiene un tercer disolvente y opcionalmente un cuarto disolvente para obtener una tercera composicion; anadir opcionalmente cristales de siembra de Sp-4 a la tercera composicion; obtener de la tercera composicion un segundo solido que comprende Sp-4; y recristalizar opcionalmente el segundo solido usando un tercer disolvente para obtener un tercer solido que comprende Sp-4.
Un experto apreciara que los compuestos pueden separarse por extraccion tradicional, cristalizacion tradicional, o tecnicas cromatograficas tradicionales. Las tecnicas cromatograficas tradicionales incluyen, pero sin limitation, cromatograffa sobre gel de sflice (usando, por ejemplo, metanol al 3-5 % en DCM o isopropanol al 4-6 % en DCM) para producir niveles mejorados de un isomero (50-100 %) y despues cristalizarlo. Como alternativa, se puede usar cromatograffa de fase inversa (usando, por ejemplo, fase movil acuosa de acetonitrilo al 1-30 %). Ademas, los compuestos pueden aislarse por cromatograffa de fluidos supercrfticos SFC sobre dioxido de carbono como el disolvente principal y alcoholes tal como metanol como un modificador, usando preferiblemente el medio quiral apropiado, tal como Daicel Chiralpack IA. Como alternativa, puede emplearse cromatograffa SMB usando el medio quiral apropiado, tal como, Daicel Chiralpack IA, usando una mezcla de disolventes tal como hexanos/isopropanol o disolventes individuales, tal como acetato de etilo.
Tambien se desvela en el presente documento un proceso para preparar Sp-4, que comprende: a) hacer reaccionar un alanil-fosforamidato de isopropilo con un 3 3'-O-protegido o no protegido, y un reactivo basico para obtener una composicion que comprende Sp-4 protegido o no protegido
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,SP-4 + Rv-4
(protegido o no protegido)
en la que el alanil-fosforamidato de isopropilo esta compuesto por una mezcla de diastereomeros representada por las siguientes estructuras:

O O

p.,, + p.,,
LQ1/ ^'"NHAla-iPr L(y/ \ "OPh
OPh NHAla-iPr

C C'
en las que la relation de C:C' es de aproximadamente 1:1.
El reactivo basico puede ser cloruro de t-butilmagnesio y la relacion de C:C' puede ser mayor de o igual a aproximadamente 1:1.
El reactivo basico puede ser cloruro de t-butilmagnesio y la relacion de C:C' puede ser mayor de aproximadamente 1:1.
El reactivo basico puede ser cloruro de t-butilmagnesio y la relacion de C:C' puede ser al menos aproximadamente 1,5:1, aproximadamente 2,3:1, aproximadamente 4:1, aproximadamente 5,7:1, aproximadamente 9:1, aproximadamente 19:1, aproximadamente 32,3:1, aproximadamente 49:1, o aproximadamente 99:1.
El LG' puede ser p-nitrofenoxido, el reactivo basico puede ser cloruro de t-butilmagnesio, y la relacion de C:C' puede ser al menos aproximadamente 1,5:1, aproximadamente 2,3:1, aproximadamente 4:1, aproximadamente 5,7:1, aproximadamente 9:1, aproximadamente 19:1, aproximadamente 32,3:1, aproximadamente 49:1, o aproximadamente 99:1.
De acuerdo con un aspecto, la presente invention proporciona un proceso adicional para preparar Sp-4, que comprende: a) hacer reaccionar un alanil-fosforamidato de isopropilo (C) con un 3 3'-O-protegido o no protegido, y un reactivo basico para obtener una composition que comprende Sp-4 protegido o no protegido
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3 c
en la que Z es un grupo protector o hidrogeno; LG' es un grupo saliente; y b) someter opcionalmente el Sp-4 protegido o no protegido obtenido a cromatograffa, extraction o cristalizacion para obtener Sp-4 purificado protegido o no protegido. LG' es tosilato, canforsulfonato, p-nitrofenoxido, p-clorofenoxido, o-clorofenoxido, 2,4-dinitrofenoxido, o pentafluorofenoxido; mas preferiblemente, Lg' se selecciona de entre p-nitrofenoxido, 2,4-dinitrofenoxido y pentafluorofenoxido. Cuando Sp-4 esta protegido, es decir, Z no es hidrogeno, el proceso esta dirigido adicionalmente a desproteger el Sp-4 protegido. En una sub-realization, la reaction se realiza en un disolvente aprotico polar, tal como, tetrahidrofurano u otro disolvente etereo ya sea en solitario o en combination entre si o con un nitrilo C2 a C7, tal como acetonitrilo.
Tambien se desvela en el presente documento un proceso que comprende 1) hacer reaccionar (LG')P(O)(LG)2, en la que LG, independiente de LG', es un grupo saliente, con (i) alanato de isopropilo y una primera base para obtener (LG')P(O)(LG)(Ala-'Pr) seguido de hacer reaccionar (LG')P(O)(LG)(Ala-'Pr) con fenol y una segunda base para obtener una mezcla que comprende C y C', (ii) fenol y una primera base para obtener (LG')P(O)(LG)(OPh) seguido de hacer reaccionar (LG')P(O)(LG)(OPh) con alanato de isopropilo y una segunda base para obtener una mezcla que comprende C y C', o (iii) combinar alanato de isopropilo, fenol, y al menos una base para obtener una mezcla que comprende C y C'; o 2) hacer reaccionar (PhO)P(O)(LG)2, en la que LG', independiente de LG, es un grupo
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saliente, con (i) alanato de isopropilo y una primera base para obtener (PhO)P(O)(LG)(Ala-'Pr) seguido de hacer reaccionar (PhO)P(O)(LG)(Ala-'Pr) con un grupo saliente precursor y una segunda base para obtener una mezcla que comprende C y C',

O O

p... + p.,,
LQI/ ^’"NHAla-iPr LQ,/' \ "OPh
OPh NHAla-iPr

C C'
y someter la mezcla a cromatograffa o cristalizacion de la mezcla para obtener C. El alanato de isopropilo puede estar presente como su sal de acido clorhfdrico, que es preferiblemente sustancialmente anhidra.
Tambien se desvela en el presente documento un proceso adicional para preparar RP-4, que comprende: a) hacer reaccionar un alanil-fosforamidato de isopropilo con un 3 3'-O-protegido o no protegido, y un reactivo basico para obtener una composicion que comprende Rp-4 protegido o no protegido
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en la que el alanil-fosforamidato de isopropilo esta compuesto por una mezcla de diastereomeros representada por las siguientes estructuras:
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en las que la relacion de C':C es de aproximadamente 1:1.
El reactivo basico puede ser cloruro de t-butilmagnesio y la relacion de C':C puede ser mayor de o igual a aproximadamente 1:1.
El reactivo basico puede ser cloruro de t-butilmagnesio y la relacion de C':C puede ser mayor de aproximadamente 1:1.
El reactivo basico puede ser cloruro de t-butilmagnesio y la relacion de C':C puede ser al menos aproximadamente 1,5:1, aproximadamente 2,3:1, aproximadamente 4:1, aproximadamente 5,7:1, aproximadamente 9:1, aproximadamente 19:1, aproximadamente 32,3:1, aproximadamente 49:1, o aproximadamente 99:1.
El LG' puede ser p-nitrofenoxido, el reactivo basico es cloruro de t-butilmagnesio, y la relacion de C':C es al menos aproximadamente 1,5:1, aproximadamente 2,3:1, aproximadamente 4:1, aproximadamente 5,7:1, aproximadamente 9:1, aproximadamente 19:1, aproximadamente 32,3:1, aproximadamente 49:1, o aproximadamente 99:1.
De acuerdo con un aspecto adicional, la presente invencion proporciona un proceso para preparar Rp-4 que comprende: a) hacer reaccionar un alanil-fosforamidato de isopropilo (C') con un 3 3'-O-protegido o no protegido, y un reactivo basico para obtener una composicion que comprende RP-4 protegido o no protegido
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3 C'
en la que Z es un grupo protector o hidrogeno; LG' es un grupo saliente; y b) someter opcionalmente el RP-4 protegido o no protegido obtenido a cromatografia, extraction o cristalizacion para obtener RP-4 purificado protegido o no protegido, LG' es tosilato, canforsulfonato, p-nitrofenoxido, p-clorofenoxido, o-clorofenoxido, 2,4-dinitrofenoxido, o pentafluorofenoxido; mas preferiblemente, LG' se selecciona de entre p-nitrofenoxido, 2,4-dinitrofenoxido y pentafluorofenoxido. Cuando RP-4 esta protegido, es decir, Z no es hidrogeno, el proceso esta dirigido adicionalmente a desproteger el Rp-4 protegido. En una sub-realization, la reaction se realiza en un disolvente aprotico polar, tal como, tetrahidrofurano u otro disolvente etereo ya sea en solitario o en combination entre si o con un nitrilo C2 a C7, tal como acetonitrilo.
Tambien se desvela en el presente documento un proceso que comprende 1) hacer reaccionar (LG')P(O)(LG)2, en la que LG, independiente de LG', es un grupo saliente, con (i) alanato de isopropilo y una primera base para obtener (LG')P(O)(LG)(Ala-'Pr) seguido de hacer reaccionar (LG')P(O)(LG)(Ala-'Pr) con fenol y una segunda base para obtener una mezcla que comprende C y C', (ii) fenol y una primera base para obtener (LG')P(O)(LG)(OPh) seguido de hacer reaccionar (LG')P(O)(LG)(OPh) con alanato de isopropilo y una segunda base para obtener una mezcla que comprende C y C', o (iii) combinar alanato de isopropilo, fenol, y al menos una base para obtener una mezcla que comprende C y C'; o 2) hacer reaccionar (PhO)P(O)(LG)2, en la que LG', independiente de LG, es un grupo saliente, con (i) alanato de isopropilo y una primera base para obtener (PhO)P(O)(LG)(Ala-'Pr) seguido de hacer reaccionar (PhO)P(O)(LG)(Ala-'Pr) con un grupo saliente precursor y una segunda base para obtener una mezcla que comprende C y C',
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y someter la mezcla a cromatografia o cristalizar la mezcla para obtener C'. El alanato de isopropilo puede estar presente como su sal de acido clorhidrico, que es preferiblemente sustancialmente anhidra.
Tambien se desvela en el presente documento un compuesto 3
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en la que Z es un grupo protector o hidrogeno; que es util para la preparation de RP-4 o SP-4.
El compuesto 3 puede seleccionarse de entre un compuesto que tiene la siguiente estructura
rr°
NH
ZO* p
3a: Z = -C(0)CH2CH2C(0)CH3 3b: Z = -C(0)0CH2Ph 3c: Z = -Si(Me)2fBu 3d: Z = -Si('Pr)2OSi('Pr)2OH
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De acuerdo con un aspecto adicional, la presente invencion proporciona un compuesto representado por las siguientes estructuras
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que es util para la preparation de Rp-4 o Sp-4, LG' is tosilato, canforsulfonato, p-nitrofenoxido, p-clorofenoxido, o- clorofenoxido, 2,4-dinitrofenoxido, o pentafluorofenoxido.
Preferiblemente, LG' se selecciona de entre p-nitrofenoxido, 2,4-dinitrofenoxido y pentafluorofenoxido.
Tambien se desvela en el presente documento un analogo marcado con isotopos de Rp-4 o Sp-4. La expresion analogo "marcado con isotopos" se refiere a un analogo de Rp-4 o Sp-4 que es un "analogo deuterado", un "analogo marcado con 13C", o un "analogo deuterado/marcado con 13C". La expresion "analogo deuterado" significa un compuesto descrito en el presente documento, por lo que un isotopo 1H, es decir, hidrogeno (H), esta sustituido con un isotopo 2H, es decir, deuterio (D). La sustitucion de deuterio puede ser parcial o completa. La sustitucion de deuterio parcial significa que al menos un hidrogeno esta sustituido con al menos un deuterio. Por ejemplo, para Rp- 4 o Sp-4, un experto puede contemplar al menos los siguientes analogos deuterados parciales (donde "dn" representa n numero de atomos de deuterio, tal como, para un grupo n = 1-7, mientras que para un grupo fenilo, n = 1-5), asf como los representados a continuation.
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Aunque los grupos metilo que se han representado anteriormente se muestran como completamente deuterados, se reconocera que tambien son posibles variaciones deuteradas parciales, tales como -cDh2 y -CD2H. Tambien se contemplan etiquetas isotopicas en la furanosa y la base. De forma analoga, las expresiones "analogo marcado con 13C" y "analogo deuterado/marcado con 13C" se refiere a un compuesto descrito en el presente documento, por lo que el atomo de carbono se enriquece con un isotopo 13C lo que significa que la extension de enriquecimiento excede la abundancia natural habitual de aproximadamente el 1,1 %.
Ejemplos
Sin limitarse a modo de ejemplo, los siguientes ejemplos sirven para facilitar un mejor entendimiento de la divulgacion.
Aspectos sinteticos
Para preparar el nucleosido de uridina, se puede aprovechar un intermedio de citidina tribenzoilada avanzado en la sfntesis de ciertos analogos 3',5'-diacilados de 3 (vease a continuacion) ya producidos eficientemente a una escala de planta piloto (vease el documento WO 2006/031725 o el documento US 2006/0122146). Se descubrio que el
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siguiente metodo era escalable y rentable.
NHBz O O
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OBz F OBz F HO' F
1 2 3
Se obtiene 3',5'-O-dibenzoil-2'-desoxi-2'-fluoro-2'-C-metil-N4-benzoilcitidina (1) mediante un metodo desvelado en los documentos WO 2006/031725 y WO 2008/045419. 1 se trata con acido acetico acuoso al 70 % para formar 3',5'-O- dibenzoil-2'-desoxi-2'-fluoro-2'-C-metil-uridina (2). irios metodos
tambien, por ejemplo, alcoxidos en disolvente alcoholico, tal como metoxido sodico en metanol, carbonato potasico en metanol, o analogos de etanol, alquilaminas tal como metilamina en metanol, butilamina, etc. Se escoge amoniaco metanolico para el trabajo a mayor escala. El producto uridina (3) puede purificarse por cristalizacion para proporcionar un rendimiento del 70 % en la citidina tribenzoilada (1).
Numerosos procedimientos bibliograficos detallan diferentes rutas y condiciones para preparar fosforamidatos usando equivalentes en varias veces de reactivos. Veanse, por ejemplo, McGuigan y col. J. Med. Chem. 2005, 48, 3504-3515 y McGuigan y col. J. Med. Chem. 2006, 49, 7215. Para un trabajo a escala de proceso, existe unicamente un ejemplo conocido en la actualidad, que se desvela en Lehsten y col., Org. Process Res. Dev. 2002, 6, 819-822 ("Lehsten"). En esta referencia, los autores introducen el concepto de un "procedimiento de una etapa" en el que una sal clorhidrato de aminoacido y diclorofosfato de fenilo se hacen reaccionar junto con N-metilimidazol en diclorometano. Mas tarde, el nucleosido se anade para formar el producto de 5'-O-fosforamidato deseado, que en el presente caso proporcionara un compuesto representado por la formula 4. Desafortunadamente, el procedimiento de Lehsten tenia algunos inconvenientes. Por ejemplo, el procedimiento de Lehsten utilizo un exceso mucho mayor de reactivos del que fue necesario, lo que se anadio al coste y la dificultad de la purificacion cromatografica. Ademas, Lehsten sugirio que se puede controlar la selectividad de la reaction en el 5'-hidroxilo sobre el 3'-hidroxilo en comparacion con una referencia bibliografica a traves del uso de temperaturas inferiores y una adicion lenta del nucleosido.
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5'-0-fosforamidato (2 diastereomeros)
3'-0-fosforamidato (2 diastereomeros)
3',5'-bis-0-fosforamidato (4 diastereomeros)
Usando el procedimiento de Lehsten para los compuestos desvelados en el presente documento proporciono aproximadamente el 1-5 % de diastereomeros de 3'-O-fosforamidato mono-sustituido (5) y aproximadamente el 1030 % del producto bis-sustituido (6). Dado que la polaridad de los 3'-diastereomeros fue muy similar a los 5'- diastereomeros deseados (4), la separation cromatografica fue un gran desaffo. La expansion del proceso fue casi imposible sin descartar una portion sustancial de los 5'-diastereomeros menos polares (4) o aceptar un mayor nivel de contamination de los 3'-diastereomeros (5). En un aumento de 50 g inicial, el producto resultante contenfa una contamination del 3'-diastereomero (5) de aproximadamente un 3 %, que co-eluyo con el menos polar del 5'- diastereomero (4).
Se desvelan en el presente documento condiciones de reaccion que usan menos cantidades de reactivos y un metodo para eliminar selectivamente la impureza de los diastereomeros 3'-O-fosforamidato (5) con una separacion cromatografica mas facil, proporcionando de este modo los diastereomeros 5'-O-fosforamidato deseados con una pureza mucho mayor (4).
Para la estequiometrica del reactivo, se hizo un estudio en el que la estequiometrfa de los reactivos se cambio sistematicamente y los resultados se controlaron por RMN de fosforo de la reaccion en bruto segun Lehsten habfa
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indicado. En las realizaciones mas exitosas, el rendimiento aislado y la pureza del producto deseado se compararon. Se observo que el 5'-hidroxilo primario reacciona a una velocidad mas rapida que el 3'-hidroxilo secundario. Esto crea una situacion competente entre el progreso de reaccion del consumo de todo el nucleosido de partida y la conversion de los productos 5'- y 3'-monosustituidos (4 y 5) en los productos 5',3'-bis sustituidos (6). El producto 3'- monosustituido se convierte en el producto bis a una velocidad mas rapida que el producto 5'-monosustituido, por lo que es posible reducir el nivel de contamination del 3'-diastereomero empujando la reaccion mas a los productos bis-sustituidos. Sin embargo, con un modo eficaz para retirar los 3'-diastereomeros, la reaccion puede optimizarse para producir mas del 5'-diastereomero deseado sin tener que sacrificar gran parte del 5'-diastereomero que se convierte en el (6) bis-sustituido. Tambien se observo que el clorhidrato de aminoacido es muy higroscopico. Dado que cualquier agua presente consumira una cantidad equivalente del reactivo de diclorofosfato de fenilo, ha de tenerse cuidado para mantener el aminoacido sustancialmente anhidro o deberla hacerse sustancialmente anhidro antes de su uso. En resumen, Lehsten ha indicado que la relation optima de aminoacido con respecto a diclorofosfato de fenilo con respecto a nucleosido fue de 3,5:2,5:1, respectivamente. Se descubrio que la relacion optima de aminoacido con respecto a diclorofosfato de fenilo con respecto a nucleosido de aproximadamente 1,6 a aproximadamente 1,3 a aproximadamente 1 es optima en condiciones en las que el 3'-diastereomero puede eliminarse eficientemente y cuando el clorhidrato de aminoacido es sustancialmente anhidro. Usando una cantidad menor de los reactivos, se consiguen ahorros en el coste junto con una simplificacion de la separacion cromatografica del producto deseado de los subproductos de reactivo y del nivel reducido de bis diastereomeros.
En un procedimiento alternativo, un derivado 3'-hidroxi-bloqueado de 3 se preparo usando un grupo de bloqueo de t- butildimetilsililo en dos etapas. Despues, este se convirtio en su derivado 5'-fosforamidato. El deseo es que el grupo sililo puede entonces eliminarse y no habrla ningun 3' isomero (5) o 3',5'-bis fosforamidato (6). Se demostro un procedimiento similar por Borch y Fries (patente de Estados Unidos 5.233.031) con un rendimiento general bajo en un fosforamidato de alquilo.
Otro procedimiento alternativo fue usar la slntesis directa y despues usar la qulmica para facilitar la diferenciacion de las impurezas de 3'-diastereomero 5 de los 5'-diastereomeros deseados 4 para facilitar la separation. Se deseo que un grupo reaccionara selectivamente con el hidroxilo primario libre de la impureza de 3'-O-fosforamidato 5 sobre el hidroxilo secundario libre del 5'-O-fosforamidato deseado 4. Tambien se deseo que el grupo de bloqueo cambiase significativamente la polaridad del producto 3'-O-fosforamidato 5'-O-bloqueado resultante del 5'-O-fosforamidato deseado 4. No serla necesaria ninguna etapa adicional para eliminar el grupo de bloqueo ya que los 5'- diastereomeros deseados 4 no se cambiarlan. Los 3'-diastereomeros qulmicamente alterados permitiran entonces una separacion cromatografica mas facil o una separacion por soportes de barrido especiales o mediante extracciones.
Especlficamente, el grupo de bloqueo terc-butildimetilsililo (tBDMS) cumplio estos criterios y fue el primero en demostrarse y usarse posteriormente a una escala de multiples kilogramos. En ciertas condiciones, tales como en piridina como disolvente y base, el grupo tBDMS reacciona con alta selectividad en la position del hidroxilo primario sobre la posicion del hidroxilo secundario 3'. La reaccion de fosforamidato usa N-metilimidazol (NMI) como base. En presencia de NMI, la sililacion es menos selectiva. Preferiblemente, la cantidad de NMI deberla reducirse. Esto puede realizarse facilmente despues de la reaccion de fosforamidato lavando la solution de reaccion con acido clorhldrico 1 N. El NMI y el nucleosido de partida restante se eliminan, dejando una mezcla en bruto de productos mono y bis sustituidos y subproductos de reactivo. Despues, esto se disuelve en piridina y se trata con cloruro de terc-butildimetilsililo. El producto 3'-monosustituido 5 se convierte en algunas horas o en el 5'-O-tBDMS-3'-O- fosforamidato 7. El avance de la reaccion puede controlarse por HPLC. La polaridad de este producto sililado 7 es menor que el bis-fosforamidato 6 y se elimina facilmente por cromatografla. Usando este metodo, fue posible reducir el nivel de 3'-monofosforamidato 5 a menos del 0,1 % del producto 5' 4 en comparacion con el 1-3 % sin el tratamiento sililo. De forma analoga, el tratamiento con cloruro de dimetoxitrifenilmetilo (DMT-Cl) en las mismas condiciones funciono igual de bien. Tambien fue mas facil identificar el producto de reaccion DMT por TLC como DMT que contiene tincion de moleculas de color naranja brillante en calentamiento o exposition a acido. Tambien se pueden prever muchos grupos de bloqueo diferentes, como se ha apreciado anteriormente.
Tanto las condiciones de reaccion como el arrastre de la impureza 3' son metodos generales y pueden aplicarse a la mayor parte de fosforamidatos de nucleosido con un hidroxilo 3' libre. El resto fosforamidato puede ser cualquier combination de ester de aminoacido y alcohol aromatico. El resto nucleosido puede ser cualquier nucleosido en el que un 5' fosforamidato conducira a un 5'-monofosfato y puede metabolizarse adicionalmente en la forma 5'- trifosfato.
El siguiente esquema es el esquema de reaccion principal ilustrado haciendo isopropil L-alanato fenil fosforamidato de 2'-desoxi-2'-fluoro-2'-C-metiluridina con el producto principal como el 5'-O-fosforamidato deseado (4, dos diastereomeros) y el producto secundario como el 3'-O-fosforamidato (5, dos diastereomeros) y el 3',5'-bis-O- fosforamidato (6, cuatro diastereomeros). Los reactivos se anaden en las relaciones estequiometricas como se describe en el metodo de la section de preparation. La reaccion se deja avanzar hasta que queda aproximadamente un 5 % del material de partida segun se determina por visualization UV sobre cromatografla de capa fina (TLC). Ademas, UPLC/MS mostro que se ha formado aproximadamente el 10 % del 3',5' bis-fosforamidato 6 en comparacion en el producto 5' deseado. Despues de la inactivation y el tratamiento acuoso acido, el residuo en
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tBDMSiO
bruto de la capa organica se preparo para la sililacion. En las condiciones de reaction descritas, el grupo sililo reacciono preferiblemente con el 5'-hidroxilo libre del 3'-O-fosforamidato para formar 7. La reaction se continuo hasta que el 3'-0-fosforamidato ya no fue detectable por UPLC/MS.
OPh
HO
Cl
N X
5 -O-fosforamidato
3 -O-fosforamidato
3 .5 -bis-O-fosforamidato
(2 diastereomeros)
(2 diastereomeros)
(4 diastereomeros)
tBDMS-CI/piridina
M
O HN—p
O-i
OPh
/ ’'OPh
X
3 -O-fosforamidato-5 -O-tBDMS
(2 diastereomeros)
Despues del tratamiento de la reaccion de sililacion, el producto deseado se somete a cromatograffa sobre gel de sflice y se eluye con un gradiente de metanol en diclorometano (1-4 %). El 5'-monofosforamidato deseado 4 se eluye en ultimo lugar.
Metodo de preparation
Ejemplo de referenda 1. Preparacion de 2,-desoxi-2,-fluoro-2'-C-metiluridina (3)
En un matraz de 10 l se anadieron 3', 5'-O-dibenzoil-2'-desoxi-2'-fluoro-2'-C-metil-N4-benzoilcitidina (500 g, 0,874 mol) y acido acetico acuoso al 70 % (7,5 l). La solution se calento a reflujo (110 °C) durante 20 h. El analisis por TLC indico una reaccion completa (Fr 0,6 en metanol al 5 % en diclorometano (DCM)). La mezcla se enfrio a temperatura ambiente y se diluyo con agua (2 l). Despues de agitar durante 2 h, el precipitado resultante se recogio por filtration y el solido se aclaro con agua (5 l) y se seco en la atmosfera a temperatura ambiente durante 12 h para proporcionar 360 g (88 %). Este intermedio de dibenzoiluridina se uso directamente en la siguiente etapa anadiendolo tolo a amoniaco metanolico recien preparado (5,4 l, aprox. 25 %) a 0 °C. Esta temperatura se mantuvo durante 3 h y despues se dejo calentar a 15 °C durante 24 h. El analisis por TLC indico una reaccion completa (Fr 0,4 en metanol al 10 % en DCM). La mezcla de reaccion se filtro a traves de un lecho de Celite y se concentro a presion reducida para dar el producto en bruto (216 g). El producto en bruto se agito con acetato de etilo (325 ml) durante 3 h a temperatura ambiente. El solido resultante se recogio por filtration y se lavo con acetato de etilo
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(216 ml). El solido se seco al vaclo a temperatura ambiente durante 4 h para proporcionar 160 g (78 %) del producto deseado con el 98,7 % de pureza HPLC. 1H RMN (DMSO-cfe) 5 11,44 (s a, 1H, NH), 7,95 (d, 1H, C-6H), 5,97 (d, 1H, C-1'H), 5,64 (d, 1H, C-5H), 3,84-3,77 (m, 3H, C-5'-Ha, C-3'H. C-4'H), 3,63-3,60 (m, 1H, C5'-Hb), 1,23 (d, 3H, C-2'- CH3). ES-MS M-1 259.
Ejemplo de referenda 2. Preparacion de ester isopropflico del acido (S)-2-{[(1R,4R,5R)-5-(2,4-Dioxo-3,4- dihidro-2H-pirimidin-1-il)-4-(R)-fluoro-3-hidroxi-4-metil-tetrahidro-furan-2-ilmetoxi]-fenoxi-fosforilamino}- propionico (4)
Sinonimo: Mezcla diastereomerica de 5'-O-(Isopropil-L-alanato, fenil fosforamidil)-2'-desoxi-2'-fluoro-2'-C-metil- uridina.
Un matraz de 3 bocas de 5 l se equipo con un agitador mecanico y bano de hielo de salmuera, un termometro interno y una atmosfera de nitrogeno. El matraz se cargo con clorhidrato de L-alanina isopropil ester (82,0 g, 0,490 mol) y diclorometano anhidro (0,80 l). Mientras que esto se agitaba, se anadio en un lote diclorofosfato de fenilo (85,0 g, 0,40 mol) y se agito. Mientras que se mantenla la temperatura interna entre -5 a 5 °C, se anadio una solucion de N-metilimidazol (NMI, 250 g, 3,07 mol) en diclorometano (250 ml) durante un periodo de media hora. La solucion se dejo en agitacion durante 1 h en este intervalo de temperatura. Se anadio en una porcion 2'-desoxi-2'- fluoro-2'-C-metil-uridina (3, 80,0 g, 0,307 mol) a 0 °C y despues el matraz de reaccion se dejo calentar lentamente en el bano de salmuera. En 1 h, la temperatura interna fue de hasta -2 °C. El analisis por TLC (Metanol al 5 % en DCM) en 1 h mostro que se habla consumido mas del 50 % del nucleosido. El bano se retiro y el matraz de reaccion alcanzo la temperatura ambiente durante 1 h mas. El analisis por TLC despues de 3 h y en 5 h en total mostro que el 95 % del nucleosido de partida se habla consumido. La mezcla de reaccion se inactivo anadiendo metanol (100 ml) y agitando la reaccion durante 5 minutos.
La mezcla de reaccion se lavo con HCl 1 N (2 x 500 ml) seguido de una solucion saturada de bicarbonato sodico (2 x 500 ml). La capa organica separada se seco sobre sulfato sodico anhidro (50 g) y se filtro. La solucion se evaporo a presion reducida y despues a alto vaclo a sequedad para dar el producto en bruto en forma de un aceite viscoso (170 g). Las RMN del producto en bruto (31P y 1H) se tomaron. La 31P-RMN indico que aproximadamente el 1 % de la integracion de fosforo total fue debido a la presencia del isomero 3' 5.
Al producto en bruto se le anadio piridina anhidra (1700 ml). El disolvente se evaporo a presion reducida y despues a alto vaclo para reducir el contenido de agua de la mezcla en bruto a traves de co-evaporacion. El aceite resultante se disolvio de nuevo en piridina anhidra (500 ml) y despues se anadio exceso de cloruro de t-butildimetilsililo (9,0 g, 60 mM). La reaccion se agito a temperatura ambiente. El avance de la reaccion se controlo por UPLC/MS. Despues de 3 horas, la impureza 3' 5 ya no se detecto y la reaccion se interrumpio mediante la adicion de metanol (50 ml).
La reaccion se evaporo a presion reducida hasta un aceite. El residuo se disolvio en acetato de etilo (1,5 l) y se lavo con HCl 1 N (2 x 500 ml), seguido de una solucion saturada de bicarbonato sodico (2 x 500 ml). La capa organica se seco sobre sulfato sodico anhidro (50 g), se filtro y se evaporo a presion reducida para dar el producto en bruto en forma de un aceite de color amarillo palido.
El aceite en bruto se diluyo con el mismo volumen de diclorometano y se cargo sobre un cartucho de 2,5 kg de gel de sllice en un modulo de compresion radial a 100 psi (0,69 MPa) de presion de aire. Usando una bomba de gradiente a 60 psi (0,41 MPa) y un caudal de 400 ml/min, el cartucho se lavo con cloruro de metileno (4 l) seguido de un gradiente de metanol al 1-4 % en cloruro de metileno (48 l). La mayor parte de las impurezas principales (fosfato de di-(isopropilalanil)fenilo, 3',5'-bis fosforamidato (6), aducto de 3'-fosforamidato-5'-TBDMS (7)) eluyeron con ~3 % de gradiente. El producto deseado eluyo entre 3 y el 4 % de metanol. Las fracciones que contenlan el producto se clasificaron en dos lotes. El primero contenla pequenas cantidades de impurezas superiores y el ultimo era producto puro. El primer conjunto de fracciones contenla pequenas cantidades de impurezas menos polares (impurezas superiores) tal como el 3',5'-bis fosforamidato y el fosfato de di-alanilfenilo y una sobre todo el diastereomero Rp y requirio una segunda purificacion en columna. (La terminologla relativa, superior frente a inferior se refiere a la elucion sobre cromatografla en gel de sllice de fase normal, donde el "isomero superior" se refiere al primer isomero de elucion). El segundo conjunto de fracciones no tenia una cantidad significativa de impurezas -solo el Rp restante y sobre todo los diastereomeros SP. Se combino mas tarde con las fracciones en columnas de dos veces. El disolvente se evaporo a presion reducida y la espuma de color blanco resultante se seco adicionalmente (0,20 mmHg) durante 1 h para dar 42 g del lote impuro (isomero 4:1 superior frente a inferior en base a 31P-RMN) y 38 g del lote puro (isomero 1:3 superior frente a inferior). El lote impuro se volvio a someter a columna de una manera similar para dar 3,8 g de isomero superior puro al 97 % (fraccion reservada) y 36 g de producto puro en una relacion 4:1. Los dos lotes principales se disolvieron en DCM, se combinaron, se evaporaron a presion reducida y se secaron (50 °C, 0,2 mmHg, 24 h) para obtener 74 g (45,7 %) de producto puro 4 con una relacion diastereomerica de 48: 51, en forma de una espuma de color blanco, p.f. aproximadamente 75-85 °C.
Para producir un solido amorfo de la mezcla diastereomerica, 74 g de la espuma de color blanco se agitaron con t- butil metil eter (750 ml) dando como resultado una solucion parcial y un residuo solido gomoso. Mientras se agitaba, se anadieron lentamente heptanos (750 ml) y la suspension se agito mecanicamente durante 1 hora hasta que la
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mayor parte de la goma se convirtio en un solido de color blanco. El solido se raspo con una espatula y la suspension resultante se filtro. El solido se lavo con heptanos (4 x 50 ml) y se seco al vado (50 °C, 0,2 mmHg, 24 h) para dar un polvo amorfo de color blanco (64 g) con un amplio intervalo de fusion de aprox. 70-80 °C. 1H y 31P RMN se conformaron para estructurar y el analisis por HPLC mostro una pureza del 99,8 % con una relacion diastereomerica de 46:54 (tambien confirmada por 31P RMN).
Metodo alternativo para preparar la mezcla solida de 4. Despues de la cromatografia, el residuo se co-evaporo con diclorometano dos veces (5 ml/g) y se seco durante 24 h a 35-40 °C a 35-45 mTorr. El residuo de espuma se tamizo a traves de una pantalla de 250 micrometros y se seco adicionalmente en las mismas condiciones hasta que el diclorometano residual cayo por debajo de 400 ppm segun se midio por GC de espacio libre. El polvo amorfo fino de color blanquecino a blanco resultante tiene un intervalo de temperatura de transicion vrtrea de 53,7 a 63,5 °C.
Caracterizacion de la mezcla de isomeros (4): 1H RMN (CDCh) 5 10,05 (s a, 1H, NH, Sp), 10,00 (s a, 1H, NH, Rp), 7,49 (d, 1H, C6-H, Sp), 7,36 (m, 5H, C6-H, Rp, aromatico), 7,23-7,14 (m, 6H, Rp/Sp, aromatico), 6,18 (d a, 2H, C1'-H, Rp/Sp), 5,63 (d, 1H, C5-H, Sp), 5,58 (d, 1H, C5-H, Rp), 5,01 (m, 2H, CH-(CH3)2, Rp/Sp), 4,46-4,33 (m, 8H, C-5'-H2, ala-NH, C3'-OH, Rp/Sp), 4,12 (m, 2 H, ala-CH-C^, Rp/Sp), 4,01-3,85 (m, 4H, C3'-H, C4'-H, Rp/Sp), 1,39-1,22 (m, 12H, todos CH3, Rp/Sp).
31P-RMN (CDCl3) 5 3,60 (Rp), 3,20 Sp con respecto a trifenilfosfato a -17,80 ppm. ES-MS M+1 530,2. Analisis elemental: % calculado (incluyendo agua al 0,29 % como se descubrio por el analisis de Karl Fisher) C, 49,75; H, 5,54; N, 7,90, F, 3,58, P, 5,84. % observado: C, 49,50; H, 5,44; N, 7,85; F, 3,62; P, 6,05.
Analisis sobre la separacion de isomeros
El compuesto 4, debido a la quiralidad en fosforo, esta compuesto por dos diastereomeros, que se designan como Sp-4 y Rp-4. La asignacion estereoqmmica se hizo en base a un analisis de rayos X monocristalino de Sp-4. Tanto Rp-4 como Sp-4 dieron un producto cristalino.
Los procedimientos para la cristalizacion se describen a continuacion.
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Ejemplo de referencia 3. Cristalizacion del isomero Rp-4. La fraccion cromatografiada que contema el primer isomero de elucion menos polar Rp-4 (3,8 g, puro al 97 %) se disolvio en isopropanol (36 g) y se diluyo con heptanos hasta turbidez (72 g). La solucion se pipeteo y se agito a temperatura ambiente durante 5 h. El solido resultante se recogio por filtracion al vado, se lavo con heptanos (2 x 20 ml) y se seco (50 °C, 0,2 mm, 24 h) para dar 2,3 g de agujas de color blanco muy pequenas p.f. 136,2-137,8 °C. Se descubrio que la pureza HPLC del material resultante era del 99,02 %.
Rp-4: 1H RMN (CDCh) 5 9,10 (s a, 1H, NH), 7,36 (m, 2H, o-aromatico), 7,26-7,16 (m, 4 H, C6-H, m,p-aromatico), 6,16 (d a, 1H, C1'-H), 5,58 (d, 1H, C5-H), 5,01 (sept., 1H, CH-(CHs)2), 4,52-4,47 (m, 2H, C-5-H2), 4,10 (d, 1H, C3'-H), 4,02-3,76 (m, 4H, ala-NH, C3'-OH, C4'-H, ala-CH-CHs), 1,37-1,20 (m, 12H, todos CH3).
Ejemplo de referencia 4. Preparacion y cristalizacion de Sp-4.
Metodo 1: Precipitacion directa de 4 en bruto: A una solucion agitada de clorhidrato de ester isopropflico de L-alanina (10,5 g, 61,5 mmol, secado por destilacion azeotropica, dos veces, con 50 ml de tolueno cada vez) en diclorometano (100 ml) se le anadio fenildiclorofosfato (7,5 ml, 50 mmol) a temperatura ambiente. La mezcla se enfrio a -10 °C y despues se anadio una solucion de NMI (30,5 ml, 384,3 mmol) en 30 ml de diclorometano durante un periodo de 30 min. Despues de la finalizacion de la adicion, la mezcla se agito entre -10 y -15 °C durante 1 h. A la mezcla anterior se le anadio en un lote 2'-desoxi-2'-fluoro-2'-C-metiluridina (3) (10 g, 38,4 mmol) y la mezcla se agito por debajo de -10 °C durante 3 h y despues se dejo calentar lentamente a 20 °C (6 h). La mezcla se agito a esta temperatura durante una noche (15 h) y despues se inactivo con 10 ml de metanol. El disolvente se evaporo y el residuo se disolvio de nuevo en EtOAc (200 ml). La capa de EtOAc se lavo con agua (100 ml), HCl 1 N (3 x 75 ml), una solucion acuosa al 2 % de NaHCO3 (50 ml) y salmuera (50 ml). La capa organica se seco sobre Na2SO4, se filtro y se concentro. El residuo se seco a alto vado durante 2 h para dar una espuma de color blanco (22 g).
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La espuma anterior se disolvio en 33 ml de DCM y despues se anadio 65 ml de IPE (eter isopropllico) para dar una solucion saturada. La solucion se filtro a traves de un lecho pequeno de Celite y el filtrado se agito con semillas de Sp-4 durante 72 h a temperatura ambiente (aproximadamente 22 °C -ha de apreciarse que enfriar la suspension a 0 °C condujo a la lubricacion del producto en bruto). El solido de color blanco se filtro, se lavo con IPE (20 ml) y se seco para dar 4,58 g (-85:15 de mezcla de Sp-4:Rp-4 respectivamente segun se determino por 31P RMN) de un polvo de color blanco. El solido anterior se suspendio en 23 ml de DCM y despues se calento a reflujo durante 3 h. La mezcla se enfrio a temperatura ambiente y se agito durante 15 h. El solido de color blanco se filtro, se lavo con 4,5 ml de DCM frlo y se seco a alto vaclo a 45 °C para dar Sp-4 puro, p.f. 93,9-104,7 °C, pureza HPLC al 99,74 % (3,11 g, 15,2 % del nucleosido de uridina).
Sp-4 1H RMN (CDCla) 5 8,63 (s a, 1H, NH), 7,47 (d, 1H, C6-H), 7,30 (m, 2H, o-aromatico), 7,26-7,18 (m, 3H, m,p- aromatico), 6,18 (d a, 1H, C1'-H), 5,70 (d, 1H, C5-H), 5,02 (sept., CH-(CHs)2), 4,53 (m, 2H, C-5'-H2), 4,11 (d, 1H, C3'- H), 3,97 (m, 3H, C3'-OH, C4'-H, ala-CH-CHa), 3,77 (s a, 1H, ala-NH), 1,39 (d, 3H,C2'-CHa), 1,37 (d, 3H, ala-CHa), 1,24 (d, 6H, CH-(CH3)2).
Metodo 2: Lubricacion del 4 en bruto: A una solucion agitada de clorhidrato de ester isopropllico de L-alanina (20,6 g, 123 mmol, secado por destilacion azeotropica, dos veces, con 75 ml de tolueno cada vez) en diclorometano (200 ml) se le anadio fenildiclorofosfato (14,9 ml, 100 mmol) a temperatura ambiente. La mezcla se enfrio a -10 °C y despues se anadio una solucion de NMI (61,3 ml, 769 mmol) en 60 ml de diclorometano durante un periodo de 30 min. Despues de la finalizacion de la adicion, la mezcla se agito entre -10 °C y -15 °C durante 1 h. A la mezcla anterior se le anadio en un lote 2'-desoxi-2'-fluoro-2'-C-metiluridina (3) (20 g, 76,9 mmol) y la mezcla se agito por debajo de - 10 °C durante 3 h y despues se dejo calentar lentamente a 20 °C (6 h). La mezcla se agito a esta temperatura durante una noche (15 h) y despues se inactivo con 10 ml de metanol. El disolvente se evaporo y el residuo se disolvio de nuevo en EtOAc (400 ml). La capa de EtOAc se lavo con agua (200 ml), HCl 1 N (3 x 100 ml), una solucion acuosa al 2 % de NaHCO3 (100 ml) y salmuera (50 ml). La capa organica se seco sobre Na2SO4, se filtro y se concentro. El residuo se seco a alto vaclo durante 2 h para dar una espuma de color blanco (43 g). La espuma anterior se disolvio en 86 ml de EtOAc en un matraz de fondo redondo de dos bocas equipado con un agitador mecanico. Mientras se agitaba, se anadieron lentamente 100 ml de heptano y la suspension se agito durante 1 h. La capa superior se decanto y el residuo se agito de nuevo con 50 ml de soluciones 2:3 de EtOAc/heptano durante 10 min y despues se decanto. El residuo se seco a alto vaclo para dar una espuma de color blanco (31 g).
La espuma anterior se disolvio en 46 ml de DCM y despues se anadieron 95 ml de IPE para dar una solucion saturada. La solucion se filtro a traves de un lecho pequeno de Celite y el filtrado se agito con semillas de Sp-4 durante 72 h a temperatura ambiente. El solido de color blanco se filtro, se lavo con IPE (30 ml) y se seco para dar 7,33 g (-85:15 de mezcla de Sp-4:Rp-4 respectivamente segun se determino por 31P RMN) de polvo de color blanco. El solido anterior se suspendio en 36 ml de DCM y despues se calento a reflujo durante 3 h. La mezcla se enfrio a temperatura ambiente y se agito durante 15 h. El solido de color blanco se filtro, se lavo con 7,5 ml de DCM frlo y se seco a alto vaclo a 45 °C para dar >99 % de Sp-4 puro (4,78 g, 11,6 % del nucleosido de uridina).
Metodo 3: Carga de gel de sllice de 4 en bruto: Se produjeron 5,0 g de 4 en bruto de la misma manera que la mezcla de diastereomeros justo antes de la etapa de cromatografla en columna partiendo con aproximadamente 2,5 g de 2'- desoxi-2'-fluoro-2'-C-metiluridina (3). El producto en bruto se disolvio en 10 ml de DCM y a la solucion se le anadieron 10 g de gel de sllice. El disolvente se evaporo para dar una suspension seca. La suspension se agito con 40 ml de EtOAc al 50 %/hexanos durante 15 min y despues se filtro. El gel de sllice se lavo con 10 ml mas de EtOAc al 50 %/hexanos. Despues, el gel de sllice se lavo con MeOH al 15 %/DCM (100 ml) y se recogio por separado. El disolvente se evaporo y se seco a alto vaclo para dar 4,0 g del residuo (espuma). El residuo se disolvio en DCM (6 ml) y despues se anadieron ~9 ml de IPE para hacer una solucion saturada. Despues, la mezcla se agito suavemente durante una noche con semillas de Sp-4 a temperatura ambiente. El solido de color blanco se filtro y se lavo con IPE (5 ml) para dar 1,28 g de producto. 31P RMN revelo que el producto anterior contenla 77:23 de mezcla de Sp-4:Rp-4 respectivamente. Esto se recristalizo en 20 ml de DCM para obtener 0,75 g de >99 % de Sp-4 puro (aproximadamente 12 % del nucleosido de uridina). Esta preparation de Sp-4 no requiere la etapa de sililacion como se hizo para la mezcla, por lo que todo el procedimiento de reaction se ha mostrado anteriormente. Los aspectos de las formas monocristalinas y polimorficas de Sp-4 se presentan a continuation.
Metodo 4: Se disolvieron 40,0 g de mezcla 1:1 de 4 en 90 ml de diclorometano. Se anadio eter diisopropllico (70 ml) a la solucion anterior para dar una solucion saturada. (La cantidad de eter diisopropllico puede variar basandose en la pureza del producto). La solucion se pipeteo con Sp-4 puro (>99 %) y la mezcla se agito suavemente con una barra de agitation a temperatura ambiente durante 20 h (se observo la formation de solido despues de 2 h). El solido se filtro, se lavo con 40 ml de la mezcla de eter diisopropllico/diclorometano (1:1) y se seco para dar un solido de color blanco (16,6 g, 89,35 % de Sp-4 puro por RMN). Este solido se suspendio en 83 ml de diclorometano y se calento a reflujo durante 3 h. La suspension se enfrio a temperatura ambiente y se agito durante una noche. El solido se filtro y se lavo con 10 ml de DCM frlo. El solido se seco al vaclo para dar Sp-4 (13,1 g, 99,48 % puro por HPLC). Se disolvieron de nuevo 11 g de este solido en 330 ml de DCM en condiciones calientes. La solucion se enfrio a temperatura ambiente y se dejo a esta temperatura durante una noche. El producto cristalino se filtro y se seco para dar 10,5 g de Sp-4 (99,74 % por HPLC).
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Como alternativa, los compuestos SP-4 y RP-4 pueden prepararse haciendo reaccionar el nucleosido (protegido o no protegido) 3 con y alanil-fosforamidato de isopropilo (mezcla de C y C', C o C'), como se muestra en la siguiente ecuacion.
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P.D. Howes y col. Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids 2003, Vol. 22, n.° 5-8, pags. 687-689 ("Howes") desvelan 2'- y 5'-fosforamidatos obtenidos por una reaction con cloruro de t-butilmagnesio. Aquf, Howes desvela que cuando un nucleosido de 3'-desoxi-citidina se hace reaccionar con ester metflico del acido (S)-2-[cloro-fenoxi- fosforilamino] propionico en presencia de 1,2 equivalentes de cloruro de t-butilmagnesio, se produce una fosforilacion selectiva en la position 2', pero que con un equivalente adicional de cloruro de t-butilmagnesio se produce una fosforilacion selectiva en la posicion 5'. Esta divulgation debe contrastarse con la que se desvela en el Esquema 1.
Ejemplo 5-1. Preparacion de ester isopropilico del acido (S)-2-[(4-nitro-fenoxi)-fenoxi- fosforilaminojpropionico
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A una solution agitada de fosforodicloridato de 4-nitrofenilo (12,8 g, 50 mmol) en diclorometano (100 ml) se le anadio una solucion de fenol y trietilamina (7,7 ml, 55 mmol) en diclorometano (100 ml) a -78 °C durante un periodo de 20 min. La mezcla se agito a esta temperatura durante 30 min y despues se transfirio a otro matraz de fondo redondo que contenfa clorhidrato de ester isopropilico de L-alanina (8,38 g, 50 mmol) en diclorometano (100 ml) a 0 °C. A la mezcla se le anadio una segunda portion de trietilamina (14,6 ml, 105 mmol) durante un periodo de 15 min. La mezcla se agito a 0 °C durante 1 h y despues el disolvente se evaporo. El residuo se trituro con acetato de etilo (150 ml) y el solido de color blanco se retiro por filtracion. El filtrado se concentro a presion reducida para dar aceite de color amarillo palido. El compuesto en bruto se sometio a cromatograffa usando gradiente de acetato de etilo al 0-20 %/hexanos para dar un producto (17 g, rendimiento del 83 %) en forma de una mezcla de diastereomeros en una relation de aproximadamente 1:1. 31P RMN (162 MHz, DMSO-d6): 5 -0,31, -0,47; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): 5 8,31-8,27 (m, 2H), 7,51-7,37(m, 4H), 7,27-7,19(m, 3H), 6,70-6,63(m, 1H), 4,85-4,78(m, 1H), 3,97-3,86(m, 1H), 1,21-1,19(m, 3H), 1,11-1,09 (m, 6H); MS (ESI) m/z 407 (M-1)+. 31P RMN (162 MHz, CDCh): 5 - 2,05, -2,10; 1H RMN (400 MHz, CDCU): 5 8,22 (d, J = 9,2 Hz, 2H), 7,41-7,33(m, 4H), 7,26-7,18(m, 3H), 5,05-4,96(m, 1H), 4,14-4,05(m, 1H), 3,93-3,88(m, 1H), 1,38(d, J = 6,8 Hz, 3H), 1,22 (dd, J = 6,2 & 3,0 Hz, 6H); MS (ESI) m/z 407 (M-1)+.
Ejemplo de referencia 5-2. Preparacion de SP-4/RP-4.
3 + mezcla de C y C' (~1:1)
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Sp-4 + ^p-4
~3 ~1
A una solucion agitada de 1-((2R,3R,4R,5R)-3-Fluoro-4-hidroxi-5-hidroximetil-3-metil-tetrahidro-furan-2-il)-1H- pirimidina-2,4-diona (130 mg, 0,5 mmol) en THF seco (1,5 ml) se le anadio una solucion 1,0 M de cloruro de terc- butilmagnesio (1,05 ml, 1,05 mmol, 2,1 equiv.)) a temperatura ambiente durante un periodo de 5 min. Despues de 30 min, se anadio gota a gota una solucion de ester isopropilico del acido (S)-2-[(4-nitro-fenoxi)-fenoxi- fosforilamino]propionico (mezcla 1:1 de isomeros, 408 mg, 1 mmol) en THF (1,5 ml) durante un periodo de 5 min. La mezcla se dejo en agitation a temperatura ambiente durante 48 h y despues se inactivo con NH4Cl acuoso saturado (20 ml). La mezcla se repartio entre acetato de etilo (50 ml) y agua (20 ml). El extracto organico combinado se seco sobre sulfato sodico anhidro, se filtro y se concentro a presion reducida para dar un residuo amarillo palido. La cromatograffa en columna del residuo usando gradiente de MeOH al 0-2 %/diclorometano dio un soliido espumoso de color blanco (125 mg, rendimiento del 47 %, mezcla de SP-4/RP-4 en una relacion de aproximadamente 3,05:1,0).
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Ejemplo 6. Preparacion y aislamiento no cromatografico de ester isopropilico del acido (S)-2-[(S)-(4-nitro- fenoxi)-fenoxi-fosforilamino]propi6nico
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Se seco previamente clorhidrato de ester isoprop[lico de L-alanina (330 g, 1,97 mol) por co-evaporacion con tolueno (2 x 400 ml) a presion reducida y despues se seco en un horno de vacfo (50 °C, 0,2 mmHg, 17 h). A una solution agitada de fosforodicloridato de 4-nitrofenilo (500,0 g, 1,953 mol) en diclorometano anhidro (3,0 l) se le anadio una solucion de fenol (183,8 g, 1,953 mol) y trietilamina (300 ml, 2,15 mol) en diclorometano (900 ml) a -60 °C de temperatura interna durante un periodo de 3 horas. La mezcla se agito a esta temperatura durante 30 min mas y despues se dejo calentar hasta -5 °C durante 2,5 horas. El ester de aminoacido secado previamente se anadio a - 5~0 °C en una atmosfera de nitrogeno durante 10 min. El residuo de sal aminoester en el matraz de adicion se transfirio a la mezcla de reaction a traves de aclarado con diclorometano (2 x 100 ml). La mezcla se agito a 0 °C durante 40 min y se anadio una segunda portion de trietilamina (571 ml, 4,10 mol) durante un periodo de 40 min a 0 °C. La mezcla se agito a 0~10 °C durante 3 h y despues el solido de color blanco (clorhidrato de trietilamina) se retiro por filtration y se aclaro con diclorometano (3 x 300 ml). El filtrado se concentro a presion reducida y el residuo se trituro con metil t-butil eter (MTBE, 4 l). La sal solida adicional formada de esta manera se retiro por filtracion y se aclaro con MTBE (3 x 150 ml). El filtrado se concentro a presion reducida para dar un aceite de color pardo claro transparente. El residuo se co-evaporo con hexanos (2 x 140 ml) para retirar cualquier MTBE residual y se seco adicionalmente al vacfo a 40 °C durante 2 horas. El residuo seco se mezclo con eter diisopropflico (IPE, 1,1 l) y se agito a 5 °C en un bano de hielo-agua. A la solucion se le anadio una pequena cantidad de cristales de siembra del isomero Sp deseado del producto y la mezcla se agito a 5 °C durante 22 h para formar una suspension medio espesa. Esta se dejo en reposo en un refrigerador (-10 °C) durante 44 h. El producto precipitado se recogio por filtracion y se aclaro con disolventes mixtos enfirados previamente de IPE y hexanos (1:1, 3 x 190 ml). El solido se seco al vacfo (0,5 mm de Hg) a temperatura ambiente hasta que se obtuvo un peso constante para dar 227,23 g (rendimiento: 28,5 %) en forma de un solido en polvo de color blanco. La relation de dos diastereomeros Sp:Rp fue de 9,65/1 en base a 31P RMN (162 MHz, DMSO-d6, 5 -0,31 (Sp), -0,47). El producto se recristalizo disolviendo en IPE (840 ml) mientras se calentaba en un bano a 60 °C. La solucion anterior se agito a temperatura ambiente durante 1 h y depsues se anadio una pequena cantidad de semillas de isomero Sp cristalino. Se formo un polvo de color blanco en 2 horas y el matraz se almaceno en un refrigerador (-10 °C) durante 16 horas. Un solido cristalino de color blanco y fino obtenido se filtro, se lavo con IPE enfriado previamente (3x 50 ml) y se seco al vacfo (ambiente, 0,5 mm de Hg) a un peso constante para dar un solido mullido de color blanco (177,7 g, rendimiento total del 22 % o rendimiento total del 44 % basandose en el rendimiento teorico del isomero Sp) con una relacion diastereomerica de 48/1 en base a 31P-RMN. P.f. 62-66 °C.
31P RMN (162 MHz, DMSO-d6): 5 -0,31; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): 5 8,30-8,27 (m, 2H), 7,49(d, J = 8,8 Hz, 2H), 7,41-7,37(m, 2H), 7,23-7,19 (m, 3H), 6,66 (dd, J = 13,6, 10,0 Hz, 1H), 4,86-4,78 (m, 1H), 3,97-3,86 (m, 1H), 1,19 (d, J = 7,2 Hz, 3H), 1, 10(d, J = 6,4 Hz, 6H);
31P RMN (162 MHz, CDCU): 5 -2,05; (162 MHz, DMSO-d6): 5 -0,31; 1H RMN (400 MHz, CDCU): 5 8,22 (d, J =
9,2 Hz, 2H), 7,41-7,33(m, 4H), 7,26-7,18(m, 3H), 5,05-4,96(m, 1H), 4,14-4,05(m, 1H), 3,93-3,88(m, 1H), 1,38(d, J =
6.8 Hz, 3H), 1,22 (dd, J = 6,2 & 3,0 Hz, 6H); 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): 5 8,30-8,27 (m, 2H), 7,49(d, J = 8,8 Hz, 2H), 7,41-7,37(m, 2H), 7,23-7,19 (m, 3H), 6,66 (dd, J = 13,6, 10,0 Hz, 1H), 4,86-4,78 (m, 1H), 3,97-3,86 (m, 1H), 1,19 (d, J = 7,2 Hz, 3H), 1, 10(d, J = 6,4 Hz, 6H)
MS (ESI) m/z 407 (M-1)+.
La estereoqufmica de 8 (isomero Sp) se ha confirmado por cristalograffa de rayos X monocristalina, veanse los detalles proporcionados a continuation.
Ejemplo 7. Separacion de la mezcla diastereomerica de ester isopropilico del acido (S)-2-[(4-nitro-fenoxi)- fenoxi-fosforilamino]propionico por SFC
Una muestra de la mezcla de diastereomeros (4,8 g) enriquecida con el isomero RP se sometio a SFC usando una columna ChiralPak AD-H (2 x 15 cm) y se eluyo con isopropanol al 35 % en dioxido de carbono a 100 bar. Se uso una carga de inyeccion de 4 ml de muestra a una concentration de 17 mg/ml de metanol. El isomero RP [ester isopropilico del acido (S)-2-[(R)-(4-nitro-fenoxi)-fenoxi-fosforilamino]propionico] se eluyo en primer lugar. Las fracciones apropiadas de las multiples realizaciones se combinaron y se concentraron a presion reducida para dar
2.9 g del isomero Rp [ester isopropilico del acido (S)-2-[(R)-(4-nitro-fenoxi)-fenoxi-fosforilamino]propionico] en forma de un aceite viscoso de color amarillo claro y 1,9 g del isomero Sp [ester isopropilico del acido (S)-2-[(S)-(4-nitro- fenoxi)-fenoxi-fosforilamino]propionico] en forma de un solido de color blanco. Los datos analfticos del isomero RP son similares al producto aislado por el metodo de cristalizacion anterior.
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Datos anallticos para ester isopropilico del acido (S)-2-[(R)-(4-nitro-fenoxi)-fenoxi-fosforilamino]propi6nico
(8, isomero Rp) : 31P RMN (162 MHz, DMSO-d6): 5-0,47; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): 5 8,30-8,27 (m, 2H), 7,467,38 (m, 4H), 7,27-7,20 (m, 3H), 6,68 (dd, J = 13,8, 10,2 Hz, 1H), 4,86-4,77 (m, 1H), 3,97-3,86 (m, 1H), 1,20 (d, J =
7,2 Hz, 3H), 1,10(dd, J = 6,2, 2,2 Hz, 6H); MS (ESI) m/z 407 (M-1)+.
Ejemplo 8-1. Preparaci6n de ester isopropilico del acido 2-[(4-cloro-fenoxi)-fenoxi-fosforilamino]propi6nico racemico (±):
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A una solution agitada de fosforodicloridato de 4-cloro-fenilo (2,45 g, 10,0 mmol) en diclorometano (20 ml) se le anadio una solucion de fenol (0,94 g, 10 mmol) y trietilamina (1,56 ml, 11 mmol) en diclorometano (20 ml) a -78 °C durante un periodo de 20 min. La mezcla se agito a esta temperatura durante 30 min y despues se transfirio a otro matraz de fondo redondo que contenfa clorhidrato de ester isopropilico de L-alanina (1,67 g, 10 mmol) en diclorometano (50 ml) a 0 °C. A la mezcla se le anadio un segundo lote de trietilamina (2,92 ml, 21 mmol) durante un periodo de 15 min. La mezcla se agito a 0 °C durante 1 h y despues el disolvente se evaporo. El residuo se trituro con acetato de etilo (30 ml) y el solido de color blanco se retiro por filtration. El filtrado se concentro a presion reducida para dar aceite de color amarillo palido. El compuesto en bruto se sometio a cromatograffa usando gradiente de acetato de etilo al 10-20 %/hexanos para dar un producto (2,0 g, rendimiento del 50 %) en forma de una mezcla de diastereomeros en una relation de aproximadamente 1:1. 31P rMn (162 MHz, CDCl3): 5 -1,58, -1,62; 1H RMN (400 MHz, CDCU): 5 7,06-7,51 (m, 8H), 7,15-7,28 (m, 2H), 7,29-7,47(m, 2H), 4,0-4,10(m, 1H), 3,82-3,88 (m, 3H), 1,35-1,36 (dd, 6H); 1,19-1,22 (m, 3H). MS (ESI) m/z 398 (M-1)+. El producto resultante se purifico por extraction, cristalizacion o cromatograffa, como se ha indicado anteriormente.
Ejemplo de referencia 8-2. Preparaci6n de 2-((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-dioxo-3,4-dihidropirimidin-1(2H)-il)-4- fluoro-3-hidroxi-4-metiltetrahidrofurano-2 il)metoxi)(fenoxi)-fosforilamino)propanoato de (S)-isopropilo (4).
A una solucion agitada de 1-((2R,3R,4R,5R)-3-Fluoro-4-hidroxi-5-hidroximetil-3-metil-tetrahidro-furan-2-il)-1H- pirimidina-2,4-diona (3, 2,6 g, 10 mmol) en THF seco (50 ml) se le anadio una solucion 1,7 M de cloruro de terc- butilmagnesio (12,4 ml, 21 mmol, 2,1 equiv.)) a temperatura ambiente durante un periodo de 15 min. Despues de 30 min, se anadio gota a gota una solucion de ester isopropilico del acido (2-[(4-cloro-fenoxi)-fenoxi- fosforilaminojpropionico racemico (4,08 g, 10 mmol) en THF (15 ml) durante un periodo de 10 min. La mezcla se dejo en agitation a temperatura ambiente durante 72. El analisis por TLC co-punteado con producto autentico mostro que se habfa formado aproximadamente el 5 % del producto deseado en comparacion con el nucleosido de partida.
Ejemplo 9-1. Preparaci6n de ester isopropilico del acido 2-[(2-cloro-fenoxi)-fenoxi-fosforilamino]propi6nico racemico (±).
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A una solucion agitada de fosforodicloridato de 2-cloro-fenilo (9,8 g, 40 mmol) en diclorometano (80 ml) se le anadio una solucion de fenol (3,76 g, 40 mmol) y trietilamina (6,16 ml, 44 mmol) en diclorometano (80 ml) a -78 °C durante un periodo de 20 min. La mezcla se agito a esta temperatura durante 30 min y despues se transfi rio a otro matraz de fondo redondo que contenfa clorhidrato de ester isopropilico de L-alanina (6,7 g, 40 mmol) en diclorometano (150 ml) a 0 °C. A la mezcla se le anadio una segunda portion de trietilamina (11,6 ml, 84 mmol) durante un periodo de 15 min. La mezcla se agito a 0 °C durante 1 h y despues el disolvente se evaporo. El residuo se trituro con acetato de etilo (100 ml) y el solido de color blanco se retiro por filtracion. El filtrado se concentro a presion reducida para dar aceite de color amarillo palido. El compuesto en bruto se sometio a cromatograffa usando un gradiente de acetato de etilo al 10-20 %/hexanos para dar un producto (11,3 g, rendimiento del 72 %) en forma de una mezcla de diastereomeros en una relacion de aproximadamente 1:1. 31P RMN (162 MHz, CDCl3): 5 -1,58, -1,61; 1H RMN (400 MHz, CDCU): 5 7,06-7,51 (m, 8H), 5,02-5,94 (m, 1H), 4,10-4,16(m, 1H), 3,31-3,94(m, 1H), 1,18-1,35(m, 3H), 1,38-1,40 (dd, 6H); MS (ESI) m/z 398 (M-1)+. El producto resultante se purifica por extraccion, cristalizacion o cromatograffa, como se ha indicado anteriormente.
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Ejemplo de referencia 9-2. Preparacion de 2-((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-dioxo-3,4-dihidropirimidin-1(2H)-il)-4- fluoro-3-hidroxi-4-metiltetrahidrofurano-2 il)metoxi)(fenoxi)- fosforilamino)propanoato de (S)-isopropilo.
A una solucion agitada de 1-((2R,3R,4R,5R)-3-Fluoro-4-hidroxi-5-hidroximetil-3-metil-tetrahidro-furan-2-il)-1H- pirimidina-2,4-diona (3, 2,6 g, 10 mmol) en THF seco (50 ml) se le anadio una solucion 1,7 M de cloruro de terc- butilmagnesio (12,4 ml, 21 mmol, 2,1 equiv.)) a temperatura ambiente durante un periodo de 15 min. Despues de 30 min, se anadio gota a gota una solucion de ester isopropilico del acido (2-[(2-cloro-fenoxi)-fenoxi- fosforilamino]propionico (racemico, 4,08 g, 10 mmol) en THF (15 ml) durante un periodo de 10 min. La mezcla se dejo en agitation a temperatura ambiente durante 72 h. El analisis por TLC co-punteado con producto autentico mostro que se habfa formado aproximadamente el 5-10 % del producto deseado en comparacion con el nucleosido de partida.
Ejemplo 10-1. Preparacion de ester isopropilico del acido 2-[(2,3,4,5,6-pentafluorofenoxi)-fenoxi- fosforilamino]propionico racemico (±).
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A una solucion agitada de fosforodicloridato de pentafluorofenilo (6,0 g, 20 mmol) en diclorometano (40 ml) se le anadio una solucion de fenol y trietilamina (3,08 ml, 22 mmol) en diclorometano (40 ml) a -78 °C durante un periodo de 20 min. La mezcla se agito a esta temperatura durante 30 min y despues se transfirio a otro matraz de fondo redondo que contenfa clorhidrato de ester isopropilico de L-alanina (3,35 g, 20 mmol) en diclorometano (100 ml) a 0 °C. A la mezcla se le anadio un segundo lote de trietilamina (5,84 ml, 42 mmol) durante un periodo de 15 min. La mezcla se agito a 0 °C durante 1 h y despues el disolvente se evaporo. El residuo se trituro con acetato de etilo (60 ml) y el solido de color blanco se retiro por filtration. El filtrado se concentro a presion reducida para dar aceite de color amarillo palido en forma de una mezcla de diastereomeros en una relation de aproximadamente 1:1. 31P RMN (162 MHz, CDCU): 5 -0,49, -0,58, El producto resultante se purifica por extraction, cristalizacion o cromatograffa, como se ha indicado anteriormente.
Ejemplo de referencia 10-2. Preparacion de 2-((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-dioxo-3,4-dihidropirimidin-1(2H)-il)-4- fluoro-3-hidroxi-4-metiltetrahidrofurano-2 il)metoxi)(fenoxi)-fosforilamino)propanoato de (S)-isopropilo.
A una solucion agitada de 1-((2R,3R,4R,5R)-3-Fluoro-4-hidroxi-5-hidroximetil-3-metil-tetrahidro-furan-2-il)-1H- pirimidina-2,4-diona (3, 2,6 g, 10 mmol) en THF seco (50 ml) se le anadio una solucion 1,7 M de cloruro de terc- butilmagnesio (12,4 ml, 21 mmol, 2,1 equiv.)) a temperatura ambiente durante un periodo de 15 min. Despues de 30 min, se anadio gota a gota una solucion de ester isopropilico del acido (2-[(2,3,4,5,6-pentafluoro fenoxi)- fenoxi-fosforilamino]propionico racemico en bruto (4,08 g, 10 mmol) en THF (15 ml) durante un periodo de 10 min. La mezcla se dejo en agitacion a temperatura ambiente durante 72 h. El analisis por TLC co-punteado con producto autentico mostro que se habfa formado aproximadamente el 40-50 % del producto deseado en comparacion con el nucleosido de partida.
La preparacion y purification de C o C' proporciona acceso directo a SP-4 o RP-4, como se ilustra en los siguientes ejemplos.
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Ejemplo 11. Preparacion de SP-4 (escala de 32 mg): A una solucion agitada de 1-((2R,3R,4R,5R)-3-Fluoro-4- hidroxi-5-hidroximetil-3-metil-tetrahidro-furan-2-il)-1H-pirimidina-2,4-diona 3 (32 mg, 0,12 mmol) en THF seco (1 ml) se le anadio una solucion 1 M de cloruro de tButilmagnesio (0,26 ml, 0,26 mmol, 2,1 equiv.)) a temperatura ambiente durante un periodo de 3 min. Despues de 30 min, se anadio gota a gota una solucion de ester isopropilico del acido (S)-2-[(S)-(4-nitro-fenoxi)-fenoxi-fosforilamino]propionico (8, isomero SP) en THF (0,5 ml) durante un periodo de 3 min. La mezcla se dejo en agitacion a temperatura ambiente durante 42 h y despues se inactivo con NH4Cl acuoso saturado (10 ml). La mezcla se repartio entre acetato de etilo y agua. El extracto organico combinado se seco sobre sulfato sodico anhidro y se concentro. El residuo se sometio a cromatograffa usando un gradiente de metanol al 04 %/diclorometano para dar SP-4 en forma de un solido espumoso (29 mg, rendimiento del 44,5 %). 1H y 31P RMN
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coinciden con lo que se desvela en el presente documento.
Ejemplo 12. Preparacion de Sp-4 (escala de 2,6 g, sin cromatografia): A una solucion agitada de 1-((2R,3R,4R,5R)- 3-Fluoro-4-hidroxi-5-hidroximetil-3-metil-tetrahidro-furan-2-il)-1H-pirimidina-2,4-diona (2,6 g, 10 mmol) en THF seco (50 ml) se le anadio una solucion 1,7 M de cloruro de terc-butilmagnesio (12,4 ml, 21 mmol, 2,1 equiv.)) a temperatura ambiente durante un periodo de 15 min. Despues de 30 min, se anadio gota a gota una solucion de ester isopropilico del acido (S)-2-[(S)-(4-nitro-fenoxi)-fenoxi-fosforilamino]propionico (8, isomero Sp, 4,08 g, 10 mmol) en THF (15 ml) durante un periodo de 10 min. La mezcla se dejo en agitacion a temperatura ambiente durante 60 h y despues e inactivo con NH4O acuoso saturado (20 ml). La mezcla se repartio entre acetato de etilo (150 ml) y secuencialmente, Na2CO3 acuoso al 10 % (3 x 20 ml) y agua (20 ml). El extracto organico combinado se seco sobre sulfato sodico anhidro, se filtro y se concentro a presion reducida para dar un residuo amarillo palido (3,8 g). El residuo se disolvio en diclorometano (7,6 ml) y despues se agito durante 20 h a temperatura ambiente. El solido de color blanco se filtro, se lavo con 1:1 de IPE/diclorometano (5 ml) y se seco al vacio para dar un producto puro en forma de un solido de color blanco (1,85 g, rendimiento del 35 %).
Ejemplo 13. Preparacion de Sp-4 usando NaHMDS: A una solucion agitada de 1-((2R,3R,4R,5R)-3-Fluoro-4- hidroxi-5-hidroximetil-3-metil-tetrahidrofurano-2-il)-1H-pirimidina-2,4-diona (71 mg, 0,27 mmol) en THF seco (2,0 ml) se le anadio una solucion 2,0 M de bis(trimetilsilil)amida sodica (NaHMDS) en THF (270 ml, 0,54 mmol) a -78 °C durante un periodo de 2 min. Despues de 30 min, a la mezcla se le anadio una solucion de ester isopropilico del acido (S)-2-[(S)-(4-Nitro-fenoxi)-fenoxi-fosforilamino]-propionico (8, isomero Sp, 111 mg, 0,27 mmol) en THF (1 ml). La mezcla de reaccion se dejo agitar a esta temperatura durante 2 h y despues se calento a -20 °C a cuya temperatura se agito durante 20 h mas. El analisis por TLC indico ~30 % de material de partida de nucleosido sin reaccionar. Por lo tanto, a la mezcla se le anadieron 0,5 equivalentes mas del reactivo (55 mg, 0,14 mmol) en THF (0,5 ml) y se agito durante 6 h mas. La mezcla de reaccion se inactivo con una solucion acuosa saturada de cloruro de amonio y despues se repartio entre acetato de etilo y agua. El extracto organico combinado se seco sobre sulfato sodico anhidro y se concentro para dar un residuo de color pardo claro. La cromatografia en columna del producto en bruto usando un gradiente de metanol al 0-5 %/diclorometano dio Sp-4 (22 mg, rendimiento del 15 %), 3'- fosforamidato (5, isomero Sp, 11,5 mg, rendimiento del 16 %) y bis fosforamidato (6, Sp, isomero Sp, 12,6 mg).
Ejemplo 14. Preparacion de Rp-4 (escala de 260 mg): A una solucion agitada de 1-((2R,3R,4R,5R)-3-Fluoro-4- hidroxi-5-hidroximetil-3-metil-tetrahidro-furan-2-il)-1H-pirimidina-2,4-diona (260 mg, 1 mmol) en THF seco (6 ml) se le anadio una solucion 1,7 M de cloruro de terc-butilmagnesio (1,23 ml, 2,1 mmol, 2,1 equiv.)) a temperatura ambiente durante un periodo de 5 min. Despues de 30 min, se anadio gota a gota una solucion de ester isopropilico del acido (S)-2-[(R)-(4-nitro-fenoxi)-fenoxi-fosforilamino]propionico (8, isomero Rp) en THF (3 ml) durante un periodo de 3 min. La mezcla se dejo en agitacion a temperatura ambiente durante 96 h y despues se inactivo con NH4O acuoso saturado (10 ml). La mezcla se repartio entre acetato de etilo (50 ml) y agua (2 x 20 ml). El extracto organico combinado se seco sobre sulfato sodico anhidro, se filtro y se concentro a presion reducida para dar un residuo amarillo palido (490 mg). El residuo se sometio a cromatografia usando un gradiente de metanol al 05 %/diclorometano para dar un producto en forma de un solido de color blanco (160 mg, rendimiento del 30 %).
La preparacion de Sp-4 o Rp-4 tambien puede conseguirse haciendo reaccionar 3 3'-protegido con el reactivo apropiado C o C' o una mezcla que contiene C y C', como se ilustra en los siguientes ejemplos.
Ejemplo 15. Preparacion de Sp-4 con 3a como un intermedio sintetico
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JU-
N I
Anhidrido evuhnico
DMAP/CHiCl
Piridina
TEA,3111-
NO
NH
w’-°T'Ny' ,
NH
8 (isomero Sp)
tBuMgCl/THF
Na,S03: Na,S20
THF/H,0
NH
NH
O'-P-O
Ejemplo 15-1. Sfntesis de 5,-0-ferc-Butildimetilsilil-2,-desoxi-2,-fluoro-2,-C-metiluridina (9):
A una solucion agitada de 2'-desoxi-2'-fluoro-2'-C-metiluridina (3, 81,1 g, 312 mmol) en piridina seca (750 ml) se le anadio gota a gota una solucion de TBDMSCl (103,19 g, 685,6 mmol) en piridina seca (500 ml) durante un periodo de 45 min a temperatura ambiente. La reaccion se dejo en agitacion a temperatura ambiente durante 24 h. A la mezcla de reaccion se le anadio metanol (85 ml) y se dejo en agitacion durante 10 min, y despues los disolventes se retiraron por destilacion a presion reducida. A la masa de reaccion se le anadio agua caliente (45 °C) (1 l) y la mezcla se extrajo con acetato de etilo (2 x 500 ml) y se lavo con agua (1 x 500 ml). La capa organica se seco sobre sulfato sodico anhidro. Se retiro por destilacion acetato de etilo y el residuo obtenido se co-evaporo con tolueno (2 x 500 ml) para dar 9 en bruto en forma de una espuma de color blanco. Rendimiento = 116,9 g (cuantitativo). 1H RMN (CDCl3, 300 MHz): 5 0,1 (s,6H), 0,91 (s, 9H), 1,22 (d, 3H, J = 21 Hz), 2,50 (s, 2H), 3,75-4,05 (m,4H), 5,54 (d, 1H, J = 9 Hz), 5,73 (s, 1H), 6,0 (d, 1H, J = 18 Hz), 7,81 (d, 1H, J = 9 Hz), 8,57 (s a, 1H), 11,1 (s, 1H).
Ejemplo 15-2. Sfntesis de 5'-0 -(ferc-Butildimetilsilil)-3'-0-levulinil-2'-desoxi-2'-fluoro 2'-C-metil-uridina (10):
A una solucion agitada del nucleosido 9 (116,9 g, 312,1 mmol) en DCM (1 l) se le anadio DMAP (30,5 g, 249,7 mmol) y esto se dejo en agitacion a TA durante 20 min. A la mezcla se le anadio una solucion de anhidrido levulfnico (133,6 g, 642,3 mmol) en DCM (200 ml) y es dejo en agitacion durante 24 h. El analisis por TLC de la mezcla indico la finalizacion de la reaccion. Se anadio agua frfa (500 ml) y la mezcla se agito durante 20 min. Las capas se separaron y la capa organica se lavo con una solucion sat. de bicarbonato sodico (2 x 250 ml), se seco sobre sulfato sodico anhidro y despues el disolvente se destilo a presion reducida para dar un aceite de color amarillo. Rendimiento en bruto: 197,6 g (135 %). El material se uso tal cual para la siguiente etapa. 1H RMN (CDCl3, 300 MHz) 5 0,11 (s, 6H), 0,94 (s, 9H), 1,34 (d, 3H, J = 21 Hz), 2,22 (s, 3H), 2,6-2,89 (m, 4H), 3,72 (m, 1H), 4,01 (d,
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1H, J = 12 Hz), 4,23 (d, 1H, J = 9 Hz), 5,33 (dd, 1H, J = 15 Hz), 5,73 (d, 1H, J = 6 Hz), 6,26 (d, 1H, J = 15 Hz), 8,12 (d, 1H, J = 12 Hz), 8,72 (s a, 1H).
Ejemplo 15-3. Sfntesis de 3'-0-levulinil-2'-desoxi-2'-fluoro 2'-C-metil-uridina (3a):
Se disolvio 10 en bruto (197,6 g, ~312,1 mmol) en DCM (1 l) al que se le anadio TEA.3HF (50,3 g, 312,1 mmol) y se dejo agitar durante una noche a temperatura ambiente. El analisis por TLC de la mezcla indico un 50 % de finalizacion de la reaccion. Se anadio otro equivalente de TEA.3HF (50,3 g, 312,1 mmol) y la mezcla de reaccion se dejo en agitacion durante 6 h. El analisis por TLC en este punto indico aproximadamente un 10 % de material de partida sin reaccionar. Se anadieron 0,25 equiv. mas de TEA.3HF (12,5 g, 78,0 mmol) y la mezcla de reaccion se dejo en agitacion durante una noche. La mezcla de reaccion se concentro a sequedad para dar un aceite de color amarillo. El producto en bruto de todos los lotes se purifico por cromatografla en columna sobre gel de sllice (MeOH al 0-2 % en DCM) para dar 124,1 g de 3'-levulinato en forma de un solido espumoso de color blanco (rendimiento del 90 % purificado en tres etapas de 2'-desoxi-2'-fluoro-2'-C-metiluridina). 1H RMN: (CDCla, 400 MHz) 5 1,55 (d, 3H, CH3, J = 20 Hz), 2,36 (s, 3H, CH3), 2,8-3,03 (m, 5H, CH2CH3), 3,91-3,96 (dd, 1H, CH"), 4,2-4,25 (m, 1H, CH'), 4,34 (dd, 1H, CH, J = 8 Hz), 5,25 (dd, 1H, J = 16 Hz), 5,93 (d, 1H, J = 8 Hz), 8,20 (d, 1H, J = 8 Hz), 9,18 (s, 1H).
Ejemplo 15-4. Sfntesis estereoselectiva de (S)-isopropil ester del acido (S)-2-{[(1R,4R,5R)-5-(2,4-Dioxo-3,4- dihidro-2H-pirimidin-1-il)-4-(R)-fluoro-3-(4-oxopentanoil)-4-metil-tetrahidro-furan-2-ilmetoxi]-fenoxi- fosforilamino}-propionico (11):
A una solucion del nucleosido (3a, 1,00 mmol, 358 mg) en 5 ml de THF anhidro que se enfrio a 0 °C se le anadio tBuMgCl (1,7 M en THF, 2 equiv.), se dejo calentar a temperatura ambiente y se agito durante media hora. A esta mezcla se le anadio en un lote el reactivo (pureza quiral de aprox. el 97 %) ester isopropllico del acido (S)-2-[(S)-(4- nitro-fenoxi)-fenoxi-fosforilamino]propionico (8, isomero Sp) (408 mg, 1,00 mmol, 1,00 equiv.) y se dejo en agitacion a ta. Despues de 16 h, quedo ~30 % de material de partida. La mezcla de reaccion se inactivo con una solucion saturada de NH4Cl 10 ml, y la fase acuosa se extrajo con acetato de etilo (3 x 25 ml). La fase organica combinada se lavo con salmuera, se seco sobre sulfato sodico anhidro y se evaporo a sequedad para dar una espuma de color amarillo palido (500 mg). Esto se purifico por cromatografla sobre gel de sllice usando metanol al 2-5 % en cloruro de metileno para dar el producto en forma de una espuma de color blanco (275 mg) de pureza quiral P de
aproximadamente el 97 % y material de partida sin reaccionar (162 mg). Basado en el material de partida
consumido, el rendimiento fue del 76 %.
31P RMN (CDCla, 162 MHz): 3,7 ppm; 1H RMN (CDCl3, 400 MHz): 5 1,22 (dd, 6H, J = 6,4 Hz), 1,37 (s, 3H), 1,58 (s, 3H), 2,18 (s, 3H), 2,63-2,9 (m, 4H), 4,0 (d, 1H, J = 8 Hz), 4,2-4,33 (m, 1H), 4,57 (d, 1H, J = 8 Hz), 4,96-5,00 (sept.,
1H), 5,2 (dd, 1H, J = 9 Hz), 5,42 (d, 1H, J = 8 Hz), 6,19 (d, 1H, J = 18 Hz), 7,15-7,35 (m, 5H), 7,5 (d, 1H, J = 5,6 Hz),
8,2 (s a, 1H).
Ejemplo 15-5. Sfntesis de (S)-isopropil ester del acido (S)-2-{[(1R,4R,5R)-5-(2,4-Dioxo-3,4-dihidro-2H- pirimidin-1-il)-4-(R)-fluoro-3-hidroxi-4-metil-tetrahidro-furan-2-ilmetoxi]-fenoxi-fosforilamino}-propionico (Sp- 4)
Una solucion de sulfito sodico se preparo anadiendo Na2S2O3 (1,51 g) y Na2S2O5 (0,57 g) en agua (25 ml). A una solucion del levulinato (11, 250 mg, 0,40 mmol) en THF anhidro (2,5 ml) se le anadio 1,0 ml de la solucion de sulfito sodico. Esto se dejo en agitacion a temperatura ambiente durante 4 h. La mezcla de reaccion se vertio en agua (15 ml), se extrajo con acetato de etilo (3 x 25 ml), se seco y se evaporo para dar cuantitativamente un producto solido de color blanco con una pureza quiral P de aproximadamente el 97 % que correspondio con las propiedades flsicas y espectrales del Sp-4 producido directamente a partir del nucleosido no protegido.
Ejemplo 16. Procedimiento alternativo para preparar Sp-4 a partir de 3a.
A una solucion agitada de (2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-dioxo-3,4-dihidro-2H-pirimidin-1-il)-4-fluoro-2-hidroximetil-4-metil- tetrahidro-furan-3-il ester del acido 4-oxo-pentanoico (3a, 210 mg, 0,59 mmol) en THF seco (1,5 ml) se le anadio una solucion 1,7 M de cloruro de terc-butilmagnesio (1,07 ml, 1,82 mmol) a temperatura ambiente durante un periodo de 2 min. Inicialmente, se observo un precipitado de color blanco y despues 10 min, la mezcla de reaccion se convirtio en una solucion de color amarillo oscuro. Despues de 30 min, se anadio gota a gota una solucion de ester isopropllico del acido (S)-2-[(S)-(4-nitrofenoxi)-fenoxi-fosforilamino]-propionico (8 (isomero Sp), 382 mg, 0,94 mmol) en THF (1,5 ml) durante un periodo de 3 min. La mezcla se calento a 40 °C durante 5 h, momento en el que el analisis por TLC y 1H RMN indicaron menos del 2 % de material de partida sin reaccionar. La reaccion se interrumpio con cloruro de amonio acuoso saturado y despues se repartio entre acetato de etilo y agua. La fase organica combinada se lavo con una solucion acuosa al 10 % de Na2CO3 (3 x 10 ml) seguido de agua. La capa organica se seco sobre sulfato sodico anhidro y se concentro para dar un residuo de color pardo (410 mg). El producto en bruto se disolvio en tetrahidrofurano (1,0 ml) y despues se anadio una solucion acuosa de la mezcla de sulfito sodico (37 mg, 0,295 mmol) y metabisulfito sodico (224 mg, 1,18 mmol) en 1 ml de agua. La mezcla se calento a 45 °C durante 20 h, fase en la que unicamente se observo una conversion de aproximadamente el 10 % por TLC, por lo tanto, se anadio mas cantidad del sulfito sodico (74 mg) y el metabisulfito sodico (448 mg), y el calentamiento se continuo durante 52 h mas. En este momento, se observo una conversion de aproximadamente el 40 % por TLC. La
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mezcla de reaccion se repartio entre agua y acetato de etilo. La fase organica combinada se seco sobre sulfato sodico anhidro y se concentro para dar un residuo de color pardo (210 mg). La cromatografia en columna del residuo usando un gradiente de MeOH al 0-5 %/DCM dio material de partida sin reaccionar (89 mg) y SP-4 (57 mg, rendimiento del 18 %, 24 % basado en el material de partida recuperado).
Ejemplo 17. Preparacion de SP-4 con 3c como un intermedio sintetico
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Ejemplo 17-1. Preparacion de 1-[(2R,3R,4R,5R)-4-(terc-butildimetilsilaniloxi)-3-fluoro-5-hidroximetil-3-metil- tetrahidro-furan-2-il]-1H-pirimidina-2,4-diona, 12.
A una solution de 3 (10,0 g, 38,43 mmol) en piridina (50 ml) se le anadio diclorometano (50 ml). La solution se enfrio a 0 °C. A la solucion se le anadio cloruro de 4,4'-dimetoxitritilo (14,32 g, 42,27 mmol) y la solucion se agito a 0 °C durante 5 h. Se anadio metanol (5 ml) para interrumpir la reaccion. La solucion se concentro a sequedad a presion reducida y el residuo se repartio entre acetato de etilo (500 ml) y agua (50 ml). La solucion organica se lavo con salmuera (50 ml) y se seco (sulfato sodico, 4 g). El disolvente se retiro a presion reducida y el residuo se disolvio en diclorometano (100 ml). A la solucion se le anadieron imidazol (7,83 g, 115 mmol) y cloruro de t-butildimetilsililo (8,68 g, 57,6 mmol). La solucion se agito a temperatura ambiente durante 16 h. Se anadio metanol para interrumpir la reaccion (5 ml) y el disolvente se retiro a presion reducida y el residuo se repartio entre acetato de etilo (500 ml) y agua (50 ml). La solucion organica se seco (sulfato sodico, 4 g) y se evaporo a presion reducida. El residuo se purifico por cromatografia en columna (EtOAc al 10-40 % en Hexano) para dar el producto intermedio de 5'-O-DMT- 3'-O-tBDMS. A su vez, este se trato con acido trifluoroacetico al 1 % en diclorometano (200 ml). La solucion se agito a temperatura ambiente durante 1 h. Se anadio agua (20 ml) y la solucion se agito a ambiente durante 1 h mas. Se anadio lentamente metanol (5 ml) y la solucion se agito a temperatura ambiente durante 1 h mas. Se anadio hidroxido de amonio para ajustar el pH de la solucion a 7. La solucion organica se separo, se seco (sulfato sodico, 4 g) y se evaporo a sequedad a presion reducida. El residuo se purifico por cromatografia en columna sobre gel de sflice (metanol al 1-5 % en diclorometano) para dar 12 en forma de un solido de color blanco 7,5 g con un rendimiento del 50 % en tres etapas. 1H RMN (DMSO-d6) 5 (ppm) 11,48 (s a, 1H, NH), 7,94 (d, 1H, H-6), 6,00 (d, 1H, H-1'), 5,69 (d, 1H, H-5), 4,06 (dd, 1H, 3'-H), 3,85 (m, 2H, H-5'a, H-4'), 3,58 (d a, 1H, H-5'b), 1,27 (d, 3 H, 2-CHs), 0,89 (s, 9H, C(CHs)s), 0,12 (s, 6H, Si(CHs)2).
Ejemplo 17-2. Preparacion de SP-4 usando 1-[(2R,3R,4R,5R)-4-(terc-butildimetilsilaniloxi)-3-fluoro-5- hidroximetil-3-metil-tetrahidro-furan-2-il]-1H-pirimidina-2,4-diona (3c).
A una solucion agitada de 1-[(2R,3R,4R,5R)-4-(terc-butildimetilsilaniloxi)-3-fluoro-5-hidroximetil-3-metil-tetrahidro- furan-2-il]-1H-pirimidina-2,4-diona (12, 374 mg, 1 mmol) en THF seco (3 ml) se le anadio una solucion 1,7 M de cloruro de terc-butilmagnesio (1,8 ml, 3,1 mmol)) a temperatura ambiente durante un periodo de 2 min. Inicialmente, se observo un precipitado de color blanco y despues de 10 min la mezcla de reaccion se convirtio en una solucion de color amarillo oscuro transparente. Despues de 30 min, se anadio gota a gota una solucion de ester isopropflico del acido (S)-2-[(S)-(4-nitrofenoxi)-fenoxi-fosforilamino]-propionico (8, isomero Sp, 653 mg, 1,6 mmol) en THF (2,5 ml) durante un periodo de 3 min. La mezcla se calento a 40 °C durante 20 h, momento en el que el analisis por TLC y 1H RMN indico menos del 5 % de material de partida sin reaccionar. La mezcla de reaccion se inactivo con cloruro de amonio acuoso saturado y despues se repartio entre acetato de etilo y agua. La capa organica se lavo con una solucion acuosa al 10 % de Na2CO3 (3 x 10 ml), seguido de agua (20 ml). La capa organica se seco sobre sulfato sodico anhidro y se concentro para dar un residuo de color pardo que contema 3c (850 mg). El producto en bruto se disolvio en tetrahidrofurano (2 ml) y se anadieron 0,8 ml de acido formico acuoso al 80 % a temperatura ambiente. La mezcla de reaccion se calento a 50 °C durante 96 h. Se observo una conversion de aproximadamente el 70 % por TLC. La mezcla de reaccion se vertio en bicarbonato sodico acuoso saturado frfo y despues se repartio entre acetato de etilo y agua. La fase organica combinada se seco sobre sulfato sodico anhidro y se concentro para dar un residuo de color pardo (220 mg). La cromatografia en columna del residuo usando un gradiente de MeOH al
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0-5 %/DCM dio material de partida sin reaccionar (21 mg) y SP-4 (77 mg, rendimiento del 35 %, rendimiento del 39 % basado en el material de partida recuperado).
Ejemplo 18. Preparacion de SP-4 con 3d como intermedio sintetico
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Ejemplo 18-1. Preparacion de 3d
A una solucion agitada de 3 en piridina (20 ml) a 0 °C se le anadio gota a gota TIPDS-Cl durante un periodo de 15 min. La mezcla se dejo calentar lentamente a temperatura ambiente, temperatura a la que se agito durante 16 h. La piridina se evaporo y el residuo se co-evaporo con tolueno (50 ml). Despues, el residuo se trituro con hexanos y el precipitado blanco se retiro por filtracion usando una capa de Celite. El filtrado se concentro a presion reducida para dar un solido espumoso (12,97 g). El producto en bruto (13) se disolvio de nuevo en tetrahidrofurano (75 ml) y se anadio una solucion acuosa de TFA (75 ml, 1:1 TFA/agua) a 0 °C durante un periodo de 20 min. La mezcla se agito a esta temperatura durante 6 h. El analisis por TLC indico ~5 % de material de partida. La mezcla de reaccion se inactivo con NaHCO3 acuoso saturado hasta un pH 8 y despues se extrajo con acetato de etilo. El extracto organico combinado se lavo con agua, se seco y se concentro para dar un solido cristalino de color blanco. La trituracion adicional del solido con hexanos (30 ml) dio un solido de color blanco que se filtro y se seco a alto vacio para dar 3d (10,1 g, rendimiento del 84 % en 2 etapas). 1H RMN (400 MHz, CDCI3): 5 8,83 (s a, 1H), 7,94 (d a, J = 6,0 Hz, 1H), 6,10(d a, J = 18,4 Hz, 1H), 5,71 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 4,43 (s a, 1H), 4,36 (dd, J = 22,6, 9,0 Hz, 1H), 4,27 (s a, 1H), 4,10(d, J = 13,2 Hz, 1H), 4,03 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 3,92 (d, J = 13,2 Hz, 1H), 1,39 (d, J = 22,0 Hz, 3H), 1,110,92 (m, 28H).
Ejemplo 18-2. Preparacion de Sp-4
A una solucion agitada de 3d (520 mg, 1 mmol) en THF seco (5 ml) se le anadio una solucion 1,7 M de cloruro de terc-butilmagnesio (1,8 ml, 3,1 mmol, 3,1 equiv.)) a temperatura ambiente durante un periodo de 15 min. Despues de 30 min, se anadio gota a gota una solucion de ester isopropilico del acido (S)-2-[(S)-(4-nitro-fenoxi)- fenoxifosforilaminojpropionico (8, isomero SP, 653 mg, 1,6 mmol) en THF (1 ml) durante un periodo de 3 min. La mezcla se dejo en agitacion a temperatura ambiente durante 60 h. El analisis 1H y 31P RMN de la muestra en bruto indico una mezcla de diastereomeros en aproximadamente 1:0,76. La mezcla de reaccion se inactivo con NH4Cl acuoso saturado (20 ml). La mezcla se repartio entre acetato de etilo (150 ml) y secuencialmente, Na2CO3 acuoso al 10 % (3 x 20 ml) y agua (20 ml). El extracto organico combinado se seco sobre sulfato sodico anhidro, se filtro y se concentro a presion reducida para dar un residuo amarillo palido (14, 878 mg).
El compuesto anterior, 14, se disolvio de nuevo en tetrahidrofurano (3 ml) y despues se anadio acido formico acuoso al 80 %. La mezcla se calento a 55 °C durante 20 h. La mezcla de reaccion se enfrio a 0 °C, y despues se inactivo
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con bicarbonato sodico acuoso saturado (pH 7,0). Despues, la mezcla de reaccion se repartio entre acetato de etilo y agua. La fase organica combinada se seco sobre sulfato sodico y se concentro para dar 560 mg del residuo. El residuo se sometio a cromatograffa usando un gradiente de metanol al 0-5 %/diclorometano para dar material de partida sin reaccionar (14, 242 mg) y SP-4 (80 mg, rendimiento del 15 %) en forma de un solido de color blanco.
Ejemplo 19. Preparacion de SP-4 marcado con isotopos
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Ejemplo 19-1. Preparacion de 1-((6aR,8R,9R,9aS)-9-hidroxi-2,2,4,4-tetraisopropiltetrahidro-6H-furo[3,2- f][1,3,5,2,4]trioxadisilocin-8-il)pirimidina-2,4(1 H,3H)-diona, 16
Se co-evaporo uridina (15, 100,0 g, 409,5 mmol) a sequedad con piridina anhidra (600 ml) y se suspendio de nuevo en piridina anhidra (700 ml). A esta suspension fina agitada se le anadio 1,3-dicloro-1,1,3,3-tetraisopropildisiloxano (135,7 g, 482,5 mmol) durante 60 min a temperatura ambiente. Despues de agitar la suspension fina durante 17 h a temperatura ambiente, la reaccion se interrumpio anadiendo metanol (20 ml) y despues se concentro a presion reducida. El residuo se repartio entre acetato de etilo (1,5 l) y agua (2 l). La capa organica se lavo adicionalmente con acido clorhfdrico al 5 % (2 x 1 l) y salmuera (500 ml), se seco sobre sulfato sodico solido (50 g), se filtro y se concentro a presion reducida para dar el producto en bruto, aprox. 250 g. El residuo se sometio a una columna de filtracion usando gel de sflice (1,75 kg) y un gradiente de acetato de etilo en hexanos al 20-65 %. Las fracciones del producto puro, segun se determino por un analisis TLC homogeneo (Fr 0,55 en 1:1 de hexanos-acetato de etilo) se combinaron, se concentraron a presion reducida y se secaron (40 °C, 0,2 mm de Hg, 24 h) para proporcionar 145,5 g (76 %) de 16 en forma de un solido espumoso de color blanco. Tambien se recogio una fraction adicional (35 g) de 16 ligeramente impuro. 1H RMN (DMSO-tis) 5 (ppm) 11,35 (s, 1H, NH), 7,66 (d, 1H, J = 7,6 Hz, H-6), 5,57 (d, 1H, J = 4,8 Hz, 2'-OH), 5,50-5,49 (m, 2H, 1'-H y H-5), 4,14-4,18 (m, 3H, 2', 3', 4'-H), 3,97-3,87 (m, 2H, 5'-Ha y Hb), 1,02-0,95 (m, 28H, CH(CHs)2).
Ejemplo 19-2. Preparacion de 1-((6aR,8R,9aR)-2,2,4,4-tetraisopropil-9-oxotetrahidro-6H-furo[3,2- f][1,3,5,2,4]trioxadisilocin-8-il)pirimidina-2,4(1 H,3H)-diona, 17
En un matraz de fondo redondo de tres bocas seco se anadieron DCM anhidro (600 ml) y DMSO (30,82 g, 394,5 mmol). La solution se enfrio a -78 °C en un bano de hielo seco/acetona en una atmosfera de nitrogeno. Se anadio anhfdrido trifluoroacetico (puro, 77,7 g, 369,8 mmol) mediante una jeringa durante 40 min y proporciono una mezcla turbia. A la mezcla una solucion del derivado de uridina 16 en DCM (600 ml) se le anadio gota a gota durante 75 min a -78 °C mediante un embudo de adicion. La mezcla heterogenea se agito durante 2 h a -78~65 °C y despues se anadio trietilamina anhidra (92 ml) mediante una jeringa rapidamente para formar una solucion de color amarillo claro transparente. Despues de 1 h a baja temperatura, la reaccion se completo como se muestra por TLC (EtOAc al 30 % en hexanos). El bano de refrigeracion se retiro y la mezcla de reaccion se calento lentamente a temperatura ambiente durante 1 h. La reaccion se interrumpio mediante la adicion de NH4Cl sat. (180 ml). Se anadio agua (200 ml) y la fase organica se separo. La capa acuosa se extrajo de nuevo con DCM (300 ml). La fase organica combinada se lavo con agua (3 x 400 ml) y salmuera (150 ml), y se seco sobre Na2SO4. La retirada del disolvente proporciono un residuo de color pardo pegajoso.
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El residuo oleoso en bruto (contenla traza de DCM) se almaceno durante una noche en el refrigerador. Despues de durante una noche, se observo algo de solido de cristal en el aceite. El aceite se disolvio en 500 ml de hexanos a temperatura ambiente. La solucion se almaceno en el refrigerador durante 24 horas y se formo mas solido. El solido se recogio por filtracion y se aclaro con DCM frlo al 10 % en hexanos (1 l) para retirar la mayor parte del color naranja. El solido (17) se seco al vaclo durante 2 h y despues se seco al aire durante 24 h. El solido peso 21 g despues de secarse a 50 °C al vaclo. El filtrado se concentro y el residuo se purifico a traves de cromatografla en columna (acetato de etilo al 10-70 % en hexanos) para proporcionar 37 g mas (rendimiento combinado de 97 %) de 17 en forma de un solido de color naranja claro.
Ejemplo 19-3. Preparacion de 1-((2R,3S,4R,5R)-3,4-dihidroxi-5-(hidroximetil)-3-13-C-
perdeuteriometiltetrahidrofurano-2-il)pirimidina-2,4(1H,3H)-diona, 18
Se lavo magnesio (3,53 g, 147 mmol) con acido clorhldrico acuoso al 5 %, se seco (50 °C, 0,2 mm de Hg, 24 h), se puso en un matraz de fondo redondo de dos bocas equipado con un agitador magnetico y un condensador. El matraz se lleno con gas argon y despues se anadio eter anhidro (80 ml). Al magnesio en eter se e anadio lentamente metil yoduro de perdeuterio-13C (15,06 g, 110,3 mmol), que genero una reaccion exotermica. Despues de que la mezcla de reaccion se enfriase, el sobrenadante se transfirio a una solucion del compuesto seco 17 (50 °C, 0,2 mm de Hg, 15 h) (10,0 g, 20,63 mmol) en THF anhidro (1 l) a -50 °C durante 20 min. La temperatura se dejo elevar hasta -40 °C y la mezcla se agito entre -40 a -25 °C durante 4 h. Tras la finalizacion de la reaccion, la mezcla se diluyo con EtOAc (1 l) a -50 °C y despues se anadio lentamente salmuera (300 ml). La capa organica se separo, despues se lavo con una solucion sat. de cloruro de amonio (300 ml x 2) y se seco con sulfato sodico. Despues de la filtracion y la concentracion a presion reducida, el residuo se disolvio en MeOH (250 ml). Se anadieron fluoruro de amonio (12 g) y TBAF (400 mg). La mezcla resultante se agito a 90 °C durante 7 h y despues se concentro con gel de sllice (20 g) a presion reducida. Despues de un extenso secado al vaclo, el residuo obtenido se purifico por cromatografla ultrarrapida en columna sobre gel de sllice (MeOH:CH2Ch = 1:20 a 1:10) para dar el compuesto 18 (5 g, 46 %) en forma de un solido de color blanco. 1H RMN (DMSO-d6) 5 (ppm) 11,26 (s, 1H, NH), 7,65 (d, 1H, J =
8.4 Hz, H-6), 5,77 (d, 1H, J = 2,4 Hz, H-1'), 5,57 (d, 1H, J = 8,0 Hz, H-5), 5,46 (d, 1H, J = 5,2 Hz, HO-3'), 5,24 (d, 1H, J = 2,4 Hz, HO-2'), 5,14 (t, 1H, J = 5,6 Hz, HO-5'), 3,74-3,56 (m, 4H, H-3', 4', 5', 5").
Ejemplo 19-4. Preparacion de acetato de ((2R,3R,4S,5R)-3-acetoxi-5-(2,4-dioxo-3,4-dihidropirimidin-1(2H)-il)-4- hidroxi-4-13C-perdeuteriometiltetrahidrofurano-2-il)metilo, 19
A una solucion del compuesto 18 (5,00 g, 19,1 mmol) en piridina anhidra (100 ml) se le anadio anhldrido acetico (3 ml) a temperatura ambiente. La mezcla resultante se agito a tempera ambiente durante 15 h, se diluyo con EtOAc (250 ml), se lavo con agua (50 ml x 3), y se seco con sulfato sodico. Despues de la filtracion y la concentracion, el residuo se purifico por cromatografla en columna ultrarrapida (MeOH del 0 al 5 % en CH2O2) para dar el compuesto 19 (4,0 g, 68 %) en forma de un solido de color gris.
Ejemplo 19-5. Preparacion de acetato de ((2R,3R,4R,5R)-3-acetoxi-5-(2,4-dioxo-3,4-dihidropirimidin-1(2H)-il)-4- fluoro-4-13C-perdeuteriometiltetrahidrofurano-2-il)metilo, 20
A una solucion del compuesto 19 (2,33 g, 6,73 mmol) en CH2Cl2 anhidro (60 ml) se le anadio lentamente DAST (1,33 ml, 10,1 mmol) a -78 °C. La mezcla resultante se agito durante 30 min despues de exponerse a temperatura ambiente. Se realizaron dos reacciones a escala de 2,33 g adicionales y una reaccion a escala de 1,00 g exactamente de la misma manera. Las cuatro mezclas de reaccion se combinaron, se diluyeron con CH2O2 (300 ml), y se lavaron con hielo-agua (100 ml x 2) y despues una solucion acuosa frla de NaHCO3 (100 ml x 2). Despues del secado, la filtracion y la concentracion, el residuo se purifico por cromatografla ultrarrapida en columna sobre gel de sllice (EtOAc del 0 % al 50 % en hexanos, compuesto obtenido a aproximadamente el 48 %) para dar el compuesto 20 (2,0 g, 24 % de 7,99 g totales del compuesto 19) en forma de un solido de color blanco. 1H RMN (CDCla) 5 (ppm) 8,27 (s, 1H, NH), 7,55 (d, 1H, J = 8,4 Hz, H-6), 6,17 (d, 1H, J = 18,8 Hz, H-1'), 5,78 (dd, 1H, J = 1,2,
8.4 Hz, H-5), 5,12 (dd, 1H, J = 9,6, 21,6 Hz, H-3'), 4,40-4,31 (m, 3H, H-4', 5', 5"), 2,19 (s, 3H, CH3), 2,15 (s, 3H, CH3).
Ejemplo 19-6. Preparacion de 1-((2R,3R,4R,5R)-3-fluoro-4-hidroxi-5-(hidroximetil)-3-13C-
perdeuteriometiltetrahidrofurano-2-il)pirimidina-2,4(1H,3H)-diona, 21
A una solucion del compuesto 20 (2 g, 5,74 mmol) en metanol (20 ml) se le anadio n-butilamina (6 ml). La mezcla resultante se agito a ta durante 15 h y se concentro con gel de sllice al vaclo. El residuo obtenido se purifico por cromatografla ultrarrapida en columna sobre gel de sllice (MeOH del 0 al 10 % en CH2O2) para dar el compuesto 21 (1,3 g, 85 %) en forma de un solido de color blanco. 1H RMN (CD3OD) 5 (ppm) 8,08 (d, 1H, J = 8,0 Hz, H-6), 6,13 (d, 1H, J = 18,4 Hz, H-1'), 5,70 (d, 1H, J = 8,0 Hz, H-5), 3,99 (d, 1H, J = 13,6 Hz, H-5'), 3,97-3,91 (m, 2H, H-3', 4'), 3,80 (dd, 1H, J = 2,0, 12,8 Hz, H-5"), ESMS (M+1) estimado 265, observado 265.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
imagen41
Ejemplo 19-7. Preparacion de 2-((((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-dioxo-3,4-dihidropirimidin-1(2H)-il)-4-fluoro-3-hidroxi- 4-13C-perdeuteriometiltetrahidrofurano-2-il)metoxi)(fenoxi)fosforilamino)propanoato de (S)-isopropilo, 22
A una solution del nucleosido no protegido 21 (207 mg, 0,783 mmol) y N-metilimidazol (0,4 ml, 5 mmol) en THF (4 ml) se le anadio gota a gota el fosforocloridato preparado previamente en THF (1,0 M, 2,35 ml, 2,35 mmol) a 0 °C. La reaction se calento lentamente a temperatura ambiente durante 1 h y despues se anadieron agua (1 ml) y EtOAc (5 ml). La solucion organica se lavo con citrato sodico mono basico ac. sat. (2 x 2 ml), NaHCO3 ac. sat. (1 x 2 ml), se seco (MgSO4) y se concentro a presion reducida. El producto en bruto se purifico por cromatograffa en columna sobre sflice usando 'PrOH del 0 al 5 % en CH2Cl2 como eluyentes para dar el fosforamidato, 22 (216 mg, 52 %, mezcla 1:1 de P-diastereomeros) en forma de un solido de color blanco: 1H RMN (400 MHz, DMSO-cf6) 5 11,54 (s, 1H), 7,56 (d, J = 6,8 Hz, 1H), 7,40-7,35 (m, 2H), 7,23-7,18 (m, 3 H), 6,14-5,96 (m, 2H), 5,89 (dd, J = 5,6, 25,6 Hz, 1H), 5,55 (t, J = 8,4 Hz, 1H), 4,85 (dc, J = 1,6, 6,0 Hz, 1H), 4,44-4,32 (m, 1H), 4,25 (m, 1H), 4,06-3,98 (m, 1H), 3,863,70 (m, 2H), 1,30-1,08 (m, 9H); 31P RMN (162 MHz, DMSO-d6) 5 4,90, 4,77; LRMS (ESI) [M + H]+ calculado para C2113CH27DsFNsO9P 534,5, observado 534,4.
Ejemplo 19-8. Preparacion de acido (2S)-2-(((((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-dioxo-3,4-dihidropirimidin-1(2H)-il)-4- fluoro-3-hidroxi-4-13C-perdeuteriometiltetrahidrofurano-2-il)metoxi)(hidroxi)fosforil)amino)propanoico, 23
Se suspendio fosforamidato 22 (147 mg, 0,276 mmol) en trietilamina (2 ml) y agua (0,5 ml), y se calento a 60 °C durante 30 h. Despues, los componentes volatiles se evaporaron a presion reducida. El producto en bruto se purifico por cromatograffa en columna sobre sflice eluyendo con 'PrOH al 50-70 % en CH2Cl2 y despues, NH4OH del 0 al 20 % en 'PrOH para dar 23 en forma de un solido de color blanco (95 mg, 83 %): 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 5 8,00 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 5,98 (d, J = 19,2 Hz, 1H), 5,52 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 4,02-3,81 (m, 4H), 1,10 (d, J = 6,8 Hz, 3H); 31P RMN (162 MHz, DMSO-d6) 5 8,12; LRMS (ESI) [M + H]+ calculado para C1213CH17D3FN3O9P 416,3, observado 416,4.
Propiedades de las muestras de Rp-4, 4, y Sp-4
Las muestras de RP-4, 4, y SP-4 se analizaron por difraccion de polvo de rayos X (XRPD), espectrometrfa de resonancia magnetica nuclear (RMN), espectroscopia infrarroja transformada de Fourier (FT-IR), calorimetrfa diferencial de barrido (DSC), analisis gravimetrico termico (TGA), absorcion de vapor gravimetrico (GVS), solubilidad acuosa termodinamica, y cromatograffa lfquida de alto rendimiento).
Ejemplo de referencia 20. Difraccion de polvo de rayos X
Las muestras de Rp-4, 4 y Sp-4 se analizaron por difraccion de polvo de rayos X (XRPD) en el siguiente regimen. a. Bruker AXS/Siemens D5000
Los patrones de difraccion de polvo de rayos X se recogieron en un difractometro Siemens D5000 usando radiation Cu Ka (40 kV, 40 mA), goniometros 0-0, divergencia de V20 y hendiduras de reception, un monocromator secundario de grafito y un contador de centelleo. El instrumento es la realization verificada usando un estandar Corundum certificado (NIST 1976). El software usado para la recogida de datos fue Diffrac Plus XRPD Commander v2.3.1 y los datos se analizaron y presentaron usando Diffrac Plus EVA v 11.0.0.2 o v 13.0.0.2.
Condiciones ambientales
Las muestras realizadas en condiciones ambientales se prepararon como especimenes de placa plana usando polvo como se recibe. Aproximadamente se empaquetaron suavemente 35 mg de la muestra en una cavidad cortada en obleas de silicio (510) de respaldo nulo y pulidas. La muestra se giro en su propio plano durante el analisis. Los detalles de la recogida de datos son: intervalo angular: 2 a 42°20; tamano de la etapa: 0,05°20; y tiempo de recogida: 4 s.etapa-1.
b. Bruker AXS C2 GADDS
Los patrones de difraccion de polvo de rayos X se recogieron en un difractometro Bruker AXS C2 GADDS usando radiacion Cu Ka (40 kV, 40 mA), etapa XYZ automatica, microscopio de video laser para el posicionamiento de la
auto-muestra y un detector de area dimensional HiStar 2. Las opticas de rayos X consisten en un espejo de capa multiple Gobel individual acoplado con un colimador pinhole de 0,3 mm.
La divergencia del haz, es decir, el tamano efectivo del haz de rayos X en la muestra, fue aproximadamente 4 mm. 5 Se empleo un modo de barrido continuo 0-0 con una distancia del detector de muestra de 20 cm que da un intervalo
de 20 efectivo de 3,2o- 29,7°. Normalmente, la muestra debera exponerse al haz de rayos X durante 120 segundos.
El software usado para la recogida de datos fue GADDS para WNT 4.1.16 y los datos se analizaron y se presentaron usando Diffrac Plus EVA v 9.0.0.2 o v 13.0.0.2.
10 Condiciones ambientales
Las muestras realizadas bajo condiciones ambientales se prepararon como especimenes de placa plana usando polvo como se recibe sin moler. Aproximadamente 1-2 mg de la muestra se presionaron ligeramente en un portaobjetos de vidrio para obtener una superficie plana.
15
Difraccion de polvo de rayos X (XRPD)
Se descubrio por XRPD que 4 era amorfo (vease la figura 1). El analisis XRPD de alta resolucion de Rp-4 preparado de acuerdo con el Ejemplo 3 confirmo un solido cristalino que mostraba un patron en polvo diferente al de de Sp-4 20 (preparado de acuerdo con el Ejemplo 4, Metodo 4), que tambien se confirmo que era un solido cristalino. La tabla
de resultados XRPD para Rp-4 y Sp-4 se muestra en la Tabla 1 con todos los picos mostrando muestran una intensidad de <5 % (Rp-4) y <3 % (Sp-4) excluido.
Tabla 1. Datos XRPD para RP-4 y Sp-4.
Datos XRPD para Rp-4
Datos XRPD para Sp 4 (Forma 1)
Angulo 2-Theta °
% de intensidad Angulo 2-Theta ° % de intensidad
6,616
51,1 4,900 6,8
7,106
40,5 5,190 19,8
8,980
30,0 7,501 100,0
11,020
21,7 8,355 4,1
11,559
77,1 8,965 7,7
11,950
12,8 9,619 21,2
13,023
5,2 10,145 3,6
14,099
6,2 14,393 4,9
15,121
5,7 16,300 7,0
15,624
5,4 16,688 10,6
16,003
17,8 17,408 5,5
17,882
100,0 17,820 8,2
18,567
8,8 18,262 31,5
19,564
22,7 18,600 6,3
20,280
5,6 18,900 7,3
20,728
42,5 19,150 6,1
21,047
19,9 19,696 4,8
21,671
22,0 20,398 4,4
21,943
23,3 20,710 6,9
22,214
18,9 21,950 6,1
23,074
28,5 22,175 12,2
24,145
30,3 22,511 5,6
24,355
39,1 22,924 3,1
25,366
7,6 23,360 6,5
26,146
36,2 23,538 7,1
27,000
9,0 23,910 7,4
27,313
15,6 24,873 3,7
27,677
22,7 25,123 4,9
28,219
12,8 25,649 4,2
28,661
6,2 26,748 5,2
29,450
6,8 27,339 3,7
29,735
9,4 27,646 3,5
31,372
8,2 28,066 3,1
31,967
10,9 29,050 3,0
32,295
6,4 29,541 3,6
33,001
11,4 30,178 3,8
33,774
11,8 31,648 3,1
34,385
6,6 32,721 3,5
34,734
6,5 33,154 3,0
35,600
7,3 33,923 3,5
5
10
15
20
25
30
35,965
13,1 34,341 3,1
36,409
14,7 35,465 3,5
36,880
7,0 36,923 3,1
37,509
5,9 37,760 3,4
37,870
6,0 38,404 3,3
38,313
5,8 40,416 3,1
38,943
8,4
40,093
6,6
40,511
7,8
41,429
6,5
Una muestra de Sp-4 se molio con un mortero, y despues se paso sucesivamente a traves de tamices de 500 y 250 pm para producir la muestra en forma de un polvo fino. Esta muestra se analizo de nuevo por XRPD de alta resolution, confirmando que no se produce ningun cambio de forma.
Ejemplo de referenda 21. Estudios de cristalizacion para Sp-4.
Sp-4 cristalino muestra polimorfismo. Por lo tanto, un aspecto se dirige a Sp-4 cristalino y sus formas polimorficas individuales. Sp-4 puede existir en al menos cinco forma polimorficas, designadas como Formas 1-5. Ademas, Sp-4 amorfo tambien puede prepararse. Una cristalizacion tlpica se preve disolver aproximadamente 100 mg de Sp-4 en un volumen apropiado del disolvente de cristalizacion (acetonitrilo (5 vol.), cloroformo (5 vol.), acetato de n-butilo (7 vol.), diclorometano (50 vol.), anisol (7 vol.), y 1:1 de MTBE/heptano (50 vol.)) y despues permite la evaporation de la solution a 5 °C. Se obtuvieron diversas formas cristalinas, pero cada forma, durante la filtration y/o el secado, proporciono la Forma 1.
Las formas 1, 2 y 3 estan en forma no solvatada, 1:1 de solvato de DCM y 1:1 de solvato de cloroformo, respectivamente, como se confirmo por analisis XRPD y de rayos X de cristal sencillo. Las formas 4 y 5 se obtuvieron a partir de la cristalizacion de Sp-4 de soluciones de acetonitrilo y anisol, respectivamente. No pueden recogerse datos suficientes para determinar si las Formas 4 y 5 estan sin solvatar, hidratadas o solvatadas ya que no se obtuvieron cristales individuales de calidad suficiente. Las formas 4 y 5 se transforman en la Forma 1 en la filtracion. Se obtienen dos formas cristalinas adicionales se obtienen tras la cristalizacion de Sp-4 en acetato de n- butilo (nBuAc) y una solucion que contiene metil-fbutil eter (MTBE) y heptano; tras la filtracion ambas de estas formas cristalinas se convierten en la Forma 1. Las Formas 2 y 3 tambien se transforman en la Forma 1 en aislamiento. La Forma 1 es una forma no solvatada que muestra una amplia endotermia de fusion con una temperatura de aparicion de de 94,3 °C y AHfus de 24,0 kJ mol'1. Se representa un patron XRPD adicional de la Forma 1 de Sp-4 en la Figura 4.
Ejemplo de referencia 21-1. Forma 1 de Sp-4
Se presenta una lista de picos de la Forma 1 de Sp-4 en la Tabla 2.
Angulo
% de intensidad
2-Theta °
%
5,0
74,8
7,3
100,0
7,8
2,2
8,2
6,8
8,8
9,3
9,4
23,5
10,0
8,4
11,4
4,2
13,3
3,0
14,2
6,1
14,9
3,5
16,1
7,9
16,6
13,2
17,3
15,4
17,7
10,1
18,1
42,6
18,4
7,6
18,7
11,4
18,9
5,7
19,3
5,0
19,6
2,9
20,2
8,5
20,5
11,5
20,8
3,6
21,8
7,2
22,0
14,5
22,4
9,6
23,2
5,3
23,4
5,8
23,5
4,6
23,8
7,4
24,0
3,1
24,7
2,5
25,0
13,0
25,5
3,1
26,6
4,5
27,2
3,2
27,5
2,2
28,1
2,9
30,0
3,2
Ejemplo de referenda 21-2. Forma 2 de Sp-4
Se representa un patron de XRPD de la Forma 2 de Sp-4 en la Figura 5. 5
Se presenta una lista de picos de la Forma 2 de Sp-4 en la Tabla 3.
Angulo
% de intensidad
2-Theta °
%
4,9
44,1
5,1
19,1
6,9
62,1
8,7
6,8
9,8
28,6
10,1
10,4
13,7
7,0
16,7
3,1
19,5
8,9
19,8
45,5
20,1
18,6
20,4
3,6
20,6
25,6
20,9
15,9
21,1
10,9
22,1
3,4
24,6
38,7
24,7
100,0
25,1
61,2
26,1
53,3
39,0
6,3
Ejemplo de referencia 21-3. Forma 3 de Sp-4
Se representa un patron de XRPD de la Forma 3 de Sp-4 en la Figura 6. Se presenta una lista de picos de la Forma 3 de Sp-4 en la Tabla 4.
Angulo
% de intensidad
2-Theta °
%
5,0
10,0
6,9
23,3
9,8
22,6
19,7
34,8
20,6
100,0
5
10
15
20
25
21,8
10,5
24,6
65,3
34,7
4,1
Ejemplo de referenda 21-4. Forma 4 de Sp-5
Se representa un patron de XRPD de la Forma 4 de Sp-4 en la Figura 7. Se presenta una lista de picos de la Forma 4 de Sp-4 en la Tabla 5.
Angulo
% de intensidad
2-Theta °
%
5,0
29,8
6,8
100,0
8,2
4,8
8,7
5,2
9,9
3,8
13,7
1,7
14,9
4,8
19,9
22,5
20,4
2,1
20,6
20,0
20,9
20,0
24,7
3,4
24,9
29,9
25,1
1,5
36,8
3,1
Ejemplo de referencia 21-5. Forma 5 de Sp-4
Se representa un patron de XRPD de la Forma 5 de Sp-4 en la Figura 8. Se presenta una lista de picos de la Forma 5 de Sp-4 en la Tabla 6.
Angulo
% de intensidad
2-Theta °
%
5,2
52,9
6,6
100,0
7,1
25,9
9,7
12,1
10,4
16,4
13,4
11,4
15,7
25,8
19,1
31,1
19,9
12,9
20,0
9,0
21,3
3,5
25,0
22,3
25,6
2,3
26,3
5,9
26,9
2,0
31,7
2,1
Ejemplo de referencia 21-6, Sp-4 (Amorfo)
Se representa un patron XRPD para Sp-4 amorfo en la Figura 9.
Ejemplo de referencia 22. Cristalograffa de rayos X monocristalina de Sp-4 y sus solvatos Ejemplo de referencia 22-1. Cristalograffa de rayos X monocristalina de Sp-4 (Forma 1)
La figura 10 muestra una estructura de cristal de rayos X para la Forma 1 de Sp-4. Aqul, la figura muestra una vista de las moleculas de la Forma 1 de la estructura de cristal que muestra el esquema de numeration empleado. Los elipsoides de desplazamiento atomico anisotropicos para los atomos distintos de de hidrogeno se muestran en el
5
10
15
20
25
nivel de probabilidad del 50 %. Los atomos de hidrogeno se muestran con un radio arbitrariamente pequeno.
La solucion de la estructura se obtuvo mediante metodos directos, refinamiento de mlnimos cuadrados de matriz completa en F 2 con peso w'1 = o2(Fo2) + (0,0592P)2 + (0,6950P), donde P = (Fo2+2Fc2)/3, parametros de desplazamiento anisotropico, correccion de absorcion emplrica usando armonicos esfericos, implementados en un algoritmo de escala SCALE3 ABSPACK. wR2 final = {I[w(Fo -Fc )2]/I[w(Fo )2] } = 0,0871 para todos los datos, R convencional = 0,0329 en valores F de 7090 reflexiones con Fo > 4a( Fo), S = 1,016 para todos los datos y 870 parametros. A/a(max) final 0,001, A/a(promedio), 0,000. Mapa de diferencia final entre +0,534 y -0,36 e A-3.
Tabla 7. Parametros de cristal individual de la Forma 1
Formula molecular
C22H29F1N3O9P1
Peso molecular
529,45
Sistema de cristal
Monocllnico
Grupo espacial
P2i a 20,0898(5)A, a 90°,
b
6,10290(10)A, p 112,290(3)°,
c
23,0138(6)A, 90°
V
2610,79(10)A3
Z
4
Dc
1,347 g.cm-1
M
1,475 mm-1
Fuente, A
Cu Ka, 1,54178A
F(000)
1112
T
100(1)K
Cristal
Placa incolora, 0,12 x 0,09 x 0,03 mm
Datos truncados para
0,80 A
@max
74,48°
Plenitud
99,4 %
Reflexiones
14854
Reflexiones unicas
7513
Rint
0,0217
Ejemplo de referenda 22-2. Cristalograffa de rayos X monocristalina de Sp-4 (Forma 2)
La figura 11 muestra una estructura de cristal de rayos X para la Forma 2 de Sp-4. Aqul, esta figura muestra una vista de las moleculas de la Forma 2 de la estructura de cristal que muestra el esquema de numeration empleado. Los heteroatomos se resolvieron isotropicamente debido a datos muy debiles. Los atomos de hidrogeno no se muestran.
La solucion de la estructura se obtuvo mediante metodos directos, refinamiento de mlnimos cuadrados de matriz completa en F 2 con peso w'1 = a2(Fo2) + (0,0975P)2 + (10,6969P), donde P = (Fo2+2Fc2)/3, parametros de desplazamiento anisotropico, correccion de absorcion emplrica usando armonicos esfericos, implementados en un algoritmo de escala SCALE3 ABSPACK. wR2 final = {I[w(Fo2-Fc2)]/I[w(Fo2)2]1/2} = 0,1883 para todos los datos, R convencional = 0,0741 en valores F de 2525 reflexiones con Fo > 4a(Fo), S = 1,05 para todos los datos y 158 parametros. A/a(max) final 0,000, A/a(promedio), 0,000. Mapa de diferencia final entre +1,388 y -0,967 e A-3.
Tabla 8. Parametros de cristal individual de la Forma 2
Formula molecular
C23H31 Cl2FN3O9P
Peso molecular
614,38
Sistema de cristal
Monocllnico
Grupo espacial
P2i a 12,8315(3)A, a 90°,
b
6,14530(10)A, p 91,752(2)°,
c
17,6250(4)A, 90°
V
1389,14(5)A3
Z
2
Dc
1,469 g.cm-1
M
3,196 mm"1
Fuente, A
Cu-K, 1,54178A
F(000)
640
T
293(2)K
Datos truncados para
0,80 A
@max
62,23°
Plenitud
91,1 %
Reflexiones
3528
Reflexiones unicas
2562
5
10
15
20
25
30
35
40
Rnt_______________________0,0227
Ejemplo de referencia 22-3. Cristalografia de rayos X monocristalina de SP-4 (Forma 2)
La figura 12 representa una estructura de cristal de rayos X (ORTEP - anisotropica) SP-4 (Forma 2). Una estructura de cristal del solvato de cloruro de metileno de Sp-4 (Forma 2), C23H31N3POgFCl2, produce un grupo espacial monoclfnico P21 (ausencias sistematicas 0k0: k = impar) con a = 12,8822(14) A, b = 6,1690(7) A, c = 17,733(2) A, p = 92,045(3)°, V = 1408,4(3)A3, Z = 2 y dcalc. = 1,449 g/cm3. Los datos de intensidad de rayos X se recogieron en un detector de area Rigaku Mercury CCD empleando radiation Mo-Ka monocromada por grafito (A = 0,71073 A) a una temperatura de 143 °K. La indexation preliminar se realizo a partir de una serie de doce imagenes de rotation de 0,5° con exposiciones de 30 segundos. Se recogieron un total de 648 imagenes de rotacion con un cristal a una distancia del detector de 35 mm, un angulo de balanceo 20 de -12°, anchuras de rotacion de 0,5° y exposiciones de 30 segundos: El barrido n.° 1 fue un barrido ^ de 315° a 525° a w = 10° y x = 20°; el barrido n.° 2 fue un barrido w de -20° a 5° a x = -90° y ^ = 315°; el barrido n.° 3 fue un barrido w de -20° a 4° a x = -90° y ^ = 135°; el barrido n.° 4 fue un barrido w de -20° a 5° a x = -90° y ^ = 225°; el barrido n.° 5 fue un barrido w de -20° a 20° a x = -90° y ^ = 45°. Las imagenes de rotacion se procesaron usando CrystalClear (CrystalClear: Rigaku Corporation, 1999), produciendo una lista de valores no promediados F2 y a(F2) que despues se pasaron al paquete de programas CrystalStructure (CrystalStructure: Paquete de analisis de estructura de cristal, Rigaku Corp. Rigaku/MSC (2002)) para un procesamiento adicional y una solution de la estructura en un ordenador Dell Pentium III. Se midieron un total de 7707 reflexiones sobre los intervalos 5,48 < 20 < 50,04°, -14 < h < 15, -7 < k < 6, -19 < 1 < 21 produciendo 4253 reflexiones unicas (Rint = 0,0180). Los datos de intensidad se corrigieron para los efectos Lorentz y de polarization y para la absorcion usando REQAB (transmision minima y maxima 0,824, 1,000).
La estructura se resolvio por metodos directos (SIR97, SIR97: Altomare, A., M. Burla, M. Camalli, G. Cascarano, C. Giacovazzo, A. Guagliardi, A. Moliterni, G. Polidori & R. Spagna (1999). J. Appl. Cryst., 32, 115-119). El refinamiento fue por mfnimos cuadrados de matriz completa en base a F2 usando SHELXL-97 (SHELXL-97: Sheldrick, G.M. (2008) Acta Cryst., A64, 112-122). Se usaron todas las reflexiones durante el refinamiento. El esquema de peso
usado fue w-l/[a (F0)+0.0472P + 0.4960P] donde p = P = (F0 + 2Fc)/3. |_os atomos distintos de de hidrogeno se refinaron anisotropicamente y los atomos de hidrogeno se refinaron usando un modelo de "soporte". El refinamiento convergio en Ri = 0,0328 y wR2 = 0,0817 para 4046 reflexiones para las que F > 4a(F) y Ri = 0,0348,
(Rl = Z IIFJ - |FJ| /
wR2 = 0,0838 y GOF = 1,056 para todas las 4253 reflexiones unicas no nulas y 358 variables
y if
Z-r I O
wR2-{Zw(fS -Fc )2/i;w(fJ )2}1/2;
Fc )2 / (n - p)}1/2;
GOF (Xw(Fo -ic; / V11' \>)l ’ donde n = el numero de reflexiones y p = el numero de parametros refinados). El A/a maximo en el ciclo final de mfnimos cuadrados fue 0,000 y los dos picos mas prominentes en la diferencia final de Fourier fueron +0,312 y -0,389 e/A3. El parametro de estructura absoluto de Flack refinado en -0,06(6) corrobora de esta manera la estereoqufmica del compuesto del tftulo.
La Tabla 1 enumera la information celular, los parametros de recogida de datos y los datos de refinamiento. Los parametros termicos isotropicos equivalentes y posicionales finales se dan en la Tabla 2. Los parametros termicos anisotropicos se encuentran en la Tabla 3. ("ORTEP-II: A Fortran Thermal Ellipsoid Plot Program for Crystal Structure Illustrations". C.K. Johnson (1976) ORNL-5138). Se muestra la representation de la molecula con un 30 % de probabilidad de elipsoides termicos.
Tabla 9. Resumen de determination de la estructura del Compuesto Sp-4-CH2CI2
Formula:
Peso de la formula: Clase del cristal: Grupo espacial:
Z
C23H31N3PO9FCI2 614,38 monoclfnico P21 (#4)
2
Constantes celulares: a b c
P
V
H
tamano del cristal, mm
Dcalc
F(000)
Radiacion: angulo 20 hkl recogido:
N.° de reflexiones medidas:
12,8822(14)A 6,1690(7) A 17,733(2)A 92,045 (3)° 1408,4(3) A3 3
3,48 cm-1
0,42 x 0,12 x 0,10 1,449 g/cm3 640
Mo-Ka (A = 0,71073A) 5,48 - 50,04°
-14h<h<15; -7<k<6; -19<1<21 7707
N.° de reflexiones unicas:
4253 (Rint=0,0180)
5
10
15
20
25
30
N.° de reflexiones observadas
N.° de reflexiones usadas en el refinamiento
N.° de parametros
Indices R (F>4o)^
Indices R (todos los datos □
GOF:
Picos de diferencia finales, e/A3
4046(F>4a)
4253
358
Ri = 0,0328 WR2 = 0,0817 Ri = 0,0348 WR2 = 0,0838 1,056
+0,312, -0,389
Ejemplo de referenda 22-4. Cristalograffa de rayos X monocristalina de Sp-4 (Forma 3)
La figura 13 muestra una estructura de cristal de rayos X para la Forma 3 de Sp-4. Aqul, esta figura muestra una vista de las moleculas de la Forma 3 de la estructura de cristal que muestra el esquema de numeration empleado. Los elipsoides de desplazamiento atomico anisotropicos para los atomos distintos de de hidrogeno se muestran en el nivel de probabilidad del 50 %. Los atomos de hidrogeno se muestran con un radio arbitrariamente pequeno.
La solution de la estructura se obtuvo mediante metodos directos, refinamiento de mlnimos cuadrados de matriz completa en F2 con peso w'1 = a2(Fo2) + (0,0512F)2 + (0,6810F), donde P = (Fo2+2Fc2)/3, parametros de
desplazamiento anisotropico, correction de absorcion emplrica usando armonicos esfericos, implementados en un algoritmo de escala SCALE3 ABSPACK. wR2 final = {I_[w(Fo-Fc)2]/I_[w(Fo)2]1/2}= 0,0796 para todos los datos, R convencional = 0,0294 en los valores F de 2486 reflexiones con Fo > 4a(Fo), S = 1,068 para todos los datos y 377 parametros. A/a(max) final 0,001, A/a(promedio), 0,000. Mapa de diferencia final entre +0,211 y -0,334 e A-3.
Tabla 10. Parametros de cristal individual de la Forma 3
Formula molecular
C23H3C)Cl3F1 N3O9P1
Peso molecular
648,82
Sistema de cristal
Monocllnico
Grupo espacial
P2i a 12,9257(4)A, a 90°,
b
6,18080(10)A, p 96,399(2)°,
c
18,0134(4)A, 90°
V
1430,15(6)A3
Z
2
Dc
1,507 g.cm-1
P
3,977 mm-1
Fuente, A
Cu Ka, 1,54178A
F(000)
672
T
100(1)K
Cristal
Aguja incolora, 0,22 x 0,03 x 0,02 mm
Datos truncados para
0,80 A
9 max
74,41°
Plenitud
69,1 %
Reflexiones
3062
Reflexiones unicas
2607
Rint
0,0198
Ejemplo de referencia 23. Estabilidad a temperaturas elevadas y humedad relativa
Una muestra de Rp-4 se almaceno en una camara de humedad a 40 °C y humedad relativa al 75 % durante una semana, y la muestra se analizo de nuevo por XRPD. El patron de polvo obtenido para Rp-4 no mostro ningun cambio sustancial durante el transcurso del experimento, lo que significa que no se observo ningun en la forma solida. Esto debe contrastarse con una muestra de 4, que se convirtio en llquido en aproximadamente 16 horas tras el almacenamiento a 40 °C y una humedad relativa al 75 %. De hecho, se ilustra una ilustracion de la naturaleza delicuescente de 4 mediante lo siguiente. Una muestra de 4 se paso a traves de un tamiz de 250 pm y despues las muestras se almacenaron a 40 °C/HR al 75 % y 25 °C/humedad relativa al 53 % y se hicieron observaciones visuales a intervalos reguladores. Los resultados se dan en la Tabla 4.
Tabla 11. Estabilidad de 4 a humedad relativa elevada.
Condiciones
t = 1,5 h t = 4,5 h t = 6,5 h t = 8,5 h t = 73 h
40 °C/HR al 75 %
Delicuescencia - - - -
25 °C/HR al
Sin Solido Delicuescencia Delicuescencia casi Delicuescencia
53 %
delicuescencia pegajoso parcial completa
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
Tras el almacenamiento a 40 °C y humedad relativa al 75 %, una muestra de SP-4 se hizo delicuescente en 16 horas. Por ejemplo, una muestra de SP-4 se molio con un mortero, y despues se paso sucesivamente a traves de tamices de 500 y 250 |jm para producir la muestra en forma de un polvo fino. Las muestras de este material se almacenaron a 40 °C y una humedad relativa al 75 % y 25 °C y HR al 53 % y se hicieron observaciones visuales a intervalos regulares. Los resultados se dan en la Tabla 5.
Tabla 12. Estabilidad de Sp-4 a humedad relativa elevada.
Condiciones
t = 1,5 h t = 4,5 h t = 104 h
40 °C/HR al 75 % 25 °C/HR al 53 %
Sin delicuescencia Sin delicuescencia Delicuescencia Sin delicuescencia Sin delicuescencia
El analisis XRPD de la muestra despues de un almacenamiento a 25 °C y una HR al 53 % durante 104 horas no mostro ningun cambio significativo en los difractogramas producidos, lo que indica que no se produjo ningun cambio de forma.
Ejemplo de referenda 24. Transformada de Fourier - Espectrometrfa de infrarrojos (FT-IR)
Los datos se recogieron en un Perkin-Elmer Spectrum One equipado con un accesorio de muestreo de reflectancia total atenuada (ATR) universal. Los datos se recogieron y se analizaron usando el software Spectrum v 5.0.1.
El espectro IR obtenido para 4, Rp-4 y Sp-4 se muestra en las figuras 5-7, respectivamente. Los picos seleccionados, en numeros de onda (cm-1) se mencionan a continuacion:
4: ~1680, ~1454, ~1376, ~1205, ~1092, ~1023 (figura 14);
Rp-4: ~1742, ~1713, ~1679, ~1460, ~1377, ~1259, ~1157, ~1079 (figura 15); y Sp-4 (Forma 1): ~1743, ~1713, ~1688, ~1454, ~1378, ~1208, ~1082 (figura 16).
Ejemplo de referencia 25. Analisis termogravimetrico (TGA) por Calorimetrfa diferencial de barrido (DSC)
Los datos DSC se recogieron en un TA Instruments Q2000 equipado con un auto-muestreador de 50 posiciones. La calibracion para la capacidad termica se realizo usando zafiro y la calibracion para la energla y temperatura se realizo usando indio certificado.
La temperatura modulada DSC se realizo en normalmente 0,8-1,2 mg de cada muestra, en un plato de aluminio agujereado, usando una velocidad de calentamiento subyacente de 2 °C.min-1 y parametros de modulacion de temperatura de ± 0,2 °C.min-1 y 40 segundos. Se mantuvo sobre la muestra una purga de nitrogeno seco a 50 ml.min-1.
El software de control del instrumental fue Advantage para Q Series v 2.8.0.392 y Thermal Advantage v 4.8.3 y los datos se analizaron usando Universal Analysis v 4.3A.
Los datos DSC se recogieron en un Mettler DSC 823e equipado con un automuestreador de 34 posiciones. El instrumento se calibro para la energla y la temperatura usando indio certificado. Normalmente, se calentaron 0,8
1,2 mg de cada muestra, en un plato de aluminio agujereado, a 10 °C.min-1 de 25 °C a 250 °C. Se mantuvo sobre la muestra una purga de nitrogeno a 50 ml.min-1. El software de control de los instrumentos y el analisis de datos fue STARe v 9.20.
Los datos TGA se recogieron en un Mettler TGA/SDTA 851e equipado con un automuestreador de 34 posiciones. El instrumento se calibro para la temperatura usando indio certificado. Normalmente se cargaron 8-12 mg de cada muestra sobre un crisol de aluminio pesado previamente y se calento a 10 °C.min-1 de la temperatura ambiente a 350 °C. Se mantuvo sobre la muestra una purga de nitrogeno a 50 ml.min-1. El software de control de los instrumentos y el analisis de datos fue STARe v 9.20.
El analisis por DSC de 4 mostro una endotermia amplia individual con una aparicion de 58,7 °C (AH 14 J.g-1) confirmada que se debe a la relajacion molecular durante la transicion vltrea por un analisis por DSC modulado adicionalmente (figura 17). El analisis por TGA de 4 no mostro ninguna perdida de peso antes de la descomposicion por encima de 240 °C, lo que conforma que el material estaba sin solvatar. Dado que el analisis por XRpD de 4 confirmo que el material era amorfo, el analisis por DSC modulada se llevo a acabo en un intento de calcular la temperatura de la transicion vltrea, que se descubrio que era 57 °C.
El analisis por DSC mostro una unica endotermia marcada con una aparicion de 136,2 °C (AH 76 J.g-1) que se confirmo que era una fusion por microscopla en fase caliente. Vease la figura 18. El analisis por TGA de Rp-4 no mostro ninguna perdida de peso antes de la descomposicion por encima de 240 °C, lo que confirmo que el material estaba sin solvatar.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
El analisis por DSC de Sp-4 mostro una unica endotermia amplia con una aparicion de 93,9 °C (AH 43 J.g'1) que se confirmo a una fusion por microscopia en fase caliente. Vease la figura 19. El analisis por TGA de Sp-4 no mostro ninguna perdida de peso antes de la descomposicion por encima de 240 °C, lo que confirmo que el material estaba sin solvatar.
Ejemplo de referenda 26. Absorcion de vapor gravimetrica (GVS)
SMS DVS intrfnseco
Las isotermias de absorcion se obtuvieron usando un analizador de absorcion de humedad SMS DVS intrinseco, controlado por el software SMS Analysis Suite. La temperatura de muestra se mantuvo a 25 °C por los controles del instrumento. La humedad se controlo mezclando corrientes de nitrogeno seco y humedo, con un caudal total de 200 ml.min-1. La humedad relativa se midio por una sonda Rotronic calibrada (intervalo dinamico de HR al 1,0100 %), situada cerca de la muestra. El cambio de peso, (relajacion de la masa) de la muestra en funcion del % de HR se control constantemente por la microbalanza (precision ±0,005 mg).
Normalmente se pusieron 5-20 mg de muestra en una cesta de acero inoxidable de malla tarada en condiciones ambientales. La muestra se cargo y se descargo a una HR del 40 % y 25 °C (condiciones ambientales tipicas). Se realizo una isotermia de absorcion de la humedad como se describe a continuacion (2 barridos dando 1 ciclo completo). La isotermia estandar se realizo a 25 °C a intervalos de HR al 10 % sobre un intervalo de HR al 0,5-90 %.
Tabla 13. Parametros del metodo para experimentos SMS DVS intrfnsecos
Parametros
Valores
Absorcion - Barrido 1
40 - 90
Desorcion/Absorcion - Barrido 2
90 - 0, 0 - 40
Intervalos (% de HR)
10
Numero de barridos
2
Caudal (ml.min'1)
200
Temperatura (°C)
25
Estabilidad (°C.mn'')
0,2
Tiempo de absorcion (horas)
6 horas de tiempo de espera
La muestra se recupero despues de la finalizacion de la isotermia y se analizo de nuevo por XRPD.
El analisis por GVS mostro que Rp-4 no era higroscopico que muestra una captacion reversible de aproximadamente 0,2 % en peso de agua del 0 al 90 % de humedad relativa. El reanalisis de la muestra por XRPD despues del experimento por GVS no mostro ningun cambio en la forma.
Una muestra de Sp-4 se molio con un mortero, y despues se paso sucesivamente a traves de tamices de 500 y 250 pm para producir la muestra en forma de un polvo fino que despues se analizo usando un metodo de un unico ciclo modificado. La muestra se tomo de HR al 40 % (aproximadamente ambiente) al HR al 60 %, en lugar del 90 % para el metodo estandar, y despues se ciclo al 0 % y de nuevo al 40 % de HR. Este analisis mostro que Sp-4 no era higroscopico hasta una HR al 60 %, con captacion reversible de ~0,2 % en peso de agua del 0 al 60 % de HR.
Ejemplo de referencia 27. Solubilidad acuosa termodinamica
La solubilidad acuosa se determino suspendiendo una cantidad suficiente de compuesto en agua para dar una concentracion final maxima de >10 mg.ml'1 de la forma libre de partida del compuesto. La suspension se equilibro a 25 °C durante 24 horas y despues se midio el pH. Despues, la suspension se filtro a traves de un filtro C de fibra de vidrio en una placa de 96 pocillos. Despues, el filtrado se diluyo en un factor de 101. La cuantificacion fue por HPLC con referencia a una solucion estandar de aproximadamente 0,1 mg.ml'1 en DMSO. Se inyectaron diferentes volumenes de las soluciones de muestra diluidas y no diluidas estandar. La solubilidad se calculo usando las areas pico determinadas por la integracion del pico observado al mismo tiempo de retencion que el pico principal en la inyeccion estandar.
Tabla 14. Parametros del metodo por HPLC para mediciones de solubilidad
Tipo de metodo:
Fase inversa con gradiente de elucion
Columna:
Phenomenex Luna, C18 (2) 5 pm 50 x 4,6 mm
Temperatura de columna (°C):
25
Inyecciones estandar (pl):
1, 2, 3, 5, 7, 10
Inyecciones de ensayo (pl):
1, 2, 3, 10, 20, 50
Deteccion:
260,80
Longitud de onda, ancho de banda (nm) :
Caudal (ml.min'1):
2
Fase A:
TFA al 0,1 % en agua
Fase B:
TFA al 0,085 % en acetonitrilo
Planificacion:
Tiempo (min) % de Fase A % de Fase B
0,0 95 5
1,0 80 20
2,3 5 95
3,3 5 95
3,5 95 5
4,4 95 5
El analisis se realizo en las condiciones que se han indicado anteriormente en un sistema de la serie Agilent HP 1100 equipado con un detector de matriz de diodos y usando el software ChemStation vB.02.01-SR1.
5 _______Tabla 15. Resultado de solubilidad acuosa para Rp-4, 4, y SP-4._______
Muestra ID
pH de mezcla no filtrada Solubilidad/mg. ml-1 Comentarios
Rp-4
7,12 1,58 Suspension
4
7,03 6,11 Solido residual
Sp-4
6,88 5,65 Solido residual
Ejemplo de referencia 28. Determinacion de la pureza qufmica por HPLC
Pueden usarse diversas condiciones de HPLC para determinar la pureza qulmica de los compuestos desvelados en 10 el presente documento. Un de dichos ejemplos se ha desvelado anteriormente en relacion con los estudios de solubilidad acuosa termodinamica. Otro ejemplo se desvela a continuacion.
Condiciones de HPLC:
15
LC:
Columna: Caudal: Volumen inyeccion: Fase movil:
Gradiente:
Modulo de separaciones Waters Alliance 2695, detector Waters 2996 PDA y software Waters Empower 2 (Version 6.00)
Phenomenex Luna C18(2); 4,6 x 50 mm; 3 pm
1,2 ml/min de 10 ml
Disolvente A: 95 % Agua con Metanol al 5 % y acetato de amonio 10 mM; pH Disolvente B: MeOH con acetato de amonio 10 mM mantenimiento en 0 % de B 3 min
0-47 % de B 3-4 min
mantenimiento en 47 % de B 4-10 min
47 %-74 % de B 10-11 min
mantenimiento en 74 % de B 11-13,5 min
regreso al 0 % de B 13,5-13,6 min
mantenimiento en 0 % de B 13,6-15,5 min
5,3
En estas condiciones, la pureza de 4, Rp-4, y Sp-4 se determino que era del -99,6, ~99 %, y ~99,5 %, respectivamente. Se aprecia que pueden conseguirse mayores purezas optimizando los metodos desvelados anteriormente.
20 La inspeccion de los difractogramas de XRPD muestra que los dos diaestereoisomeros individuales cristalinos dieron patrones XRPD claramente diferentes. Ademas, hubo una clara diferencia en el punto de fusion de los dos diaestereoisomeros cristalinos, teniendo Rp-4 una aparicion considerablemente superior que Sp-4 (136 °C frente a 94 °C).
25 Ejemplo de referencia 29. Metodos de separacion adicionales
La siguiente separacion por SFC (condiciones enumeradas a continuacion) produjo la separacion adecuada de una mezcla de los diastereomeros, Rp-4 y Sp-4.
Metodo preparativo:
Metodo analltico:
Chiralpak AS-H (2 x 25 cm) SN# 07-8656
Chiralpak AS-H (25 x 0,46 cm)
metanol al 20 %/CO2 (100 bar)
metanol al 20 %/CO2 (100 bar)
50 ml/min, 220 nm.
3 ml/min, 220 nm.
Conc.: 260 mg/30 ml de metanol, vol. de iny.: 1,5 ml
La siguiente separacion por SFC (condiciones enumeradas a continuacion) produjo una separacion adecuada de una mezcla de los diastereomeros, Rp-4 y Sp-4.
5
10
15
20
25
30
Metodo preparativo:
Metodo analltico:
Chiralpak IA (2 x 15 cm) 802091
Chiralpak IA (15 x 0,46 cm)
isopropanol al 30 % (DEA al 0,1 %)/CO2, 100 bar
metanol al 40 % (DEA)/CO2,100 bar
60 ml/min, 220 nm.
3 ml/min, 220 nm.
vol. de iny.: 2 ml, 20 mg/ml de metanol
Tabla 16. Resumen de resultados de la caracterizacion por lotes de Rp-4, 4 y SP-4.
Analisis
Rp-4 4 Sp-4
RMN de
Diastereoisomero individual Mezcla 1:1 de Diastereoisomero
proton
diaestereoisomeros individual
XRPD
Cristalino - diferente de Sp-4 Amorfo Cristalino - diferente de Rp-4
DSC
Endotermia; fusion - 136 °C Endotermia; 59 °C Endotermia; fusion - 94 °C
TGA
Sin perdida de peso, Sin perdida de peso, Sin perdida de peso,
descomposicion >240 °C
descomposicion >240 °C
descomposicion >240 °C
IR
Vease anteriormente Vease anteriormente Vease anteriormente
Solubilidad ac. (mg. ml-1)
1,58 6,11 5,65
Pureza HPLC
96,9 % 99,6 % 99,5 %
40 °C/HR al 75 %
Sin cambio de forma Delicuescencia en 1,5 h Delicuescencia en 4,5 h
25 °C/HR al 53 %
Delicuescencia Sin cambio de forma
GVS
No higroscopico hasta HR al No higroscopico hasta HR
90 %
al 60 %
Ejemplo de referencia 30. Cristalografia de rayos X de 8 (isomero SP)
El compuesto 8 (isomero Sp), C18H21N2PO7, cristaliza en el grupo espacial monocilnico P2i (ausencias sistematicas 0k0: k = impar) con a = 5,3312(4)A, b = 15,3388(8)A, c = 23,7807(13)A, p = 92,891(3)°, V = 1942,2(2)A3 Z = 4, y dcalc=1,397 g/cm3. Los datos de intensidad de rayos X se recogieron en un detector de area Bruker APEXII CCD empleando radiacion Mo-Ka monocromada por grafito (= 0,71073 A) a una temperatura de 100(1)K. Las figuras 20A y 20B muestran moleculas numeradas 1 y 2, respectivamente, de la unidad asimetrica.
La indexacion preliminar se realizo a partir de una serie de treinta y seis cuadros de rotacion a 0,5° con exposiciones de 30 segundos. Se recogieron un total de 3608 cuadros con un cristal a una distancia del detector de 70,00 mm, anchuras de rotacion de 0,5° y exposiciones de 20 segundos:
tipo de barrido
20 w $ X cuadros
$
-35,50 279,40 27,32 48,96 725
$
24,50 22,31 35,56 69,08 692
w
-13,00 321,68 247,79 69,08 95
$
34,50 204,08 28,21 -92,80 293
$
-30,50 310,60 214,10 54,21 361
$
32,00 304,67 24,47 50,72 722
______$______
-35,50 122,14 316,59 -78,84 720
Los cuadros de rotacion se integraron usando SAINT (Bruker (2009) SAINT. Bruker AXS Inc., Madison, Wisconsin, Estados Unidos) produciendo una lista de valores no promediados F2 y o(F2) que despues se pasaron al paquete de programas SHELXTL (Bruker (2009) SHELXTL. Bruker AXS Inc., Madison, Wisconsin, Estados Unidos) para un procesamiento adicional y una solucion de la estructura en un ordenador Dell Pentium 4. Se midieron un total de 6909 reflexiones sobre los intervalos 1,58 < 0 < 25,09°, -6 < h < 6, -18 < k < 18, -28 < 1 < 28 produciendo 6909 reflexiones unicas (Rint = 0,0581). Los datos de intensidad se corrigieron para los efectos Lorentz y de polarizacion y para la absorcion usando SADABS (Sheldrick, G.M. (2007) SAdAbS. University of Gottingen, Alemania) (transmision minima y maxima 0,6093, 0,7452).
La estructura se resolvio por metodos directos (SHELXS-97 (Sheldrick, G.M. (2008) Acta Cryst. A64,112-122,)). El refinamiento fue por mlnimos cuadrados de matriz completa en base a F2 usando SHELXL-97 (Sheldrick, G.M. (2008) Acta Cryst. A64, 112-122,). Se usaron todas las reflexiones durante el refinamiento. El esquema de peso usado fue w=1/[a2(Fo2)+ (0,0000P)2 + 14,0738P] donde P = (Fo2 + 2Fc2)/3. Los atomos diferentes de hidrogeno se refinaron anisotropicamente y los atomos de hidrogeno se refinaron usando un modelo de soporte. El refinamiento convergio en R1 = 0,0847 y wR2 = 0,1899 para 6173 reflexiones observadas para las que F > 4a(F) y R1=0,0963 y wR2 = 0,1963 y GOF = 1,119 para todas las 6909 reflexiones no nulas unicas y 512 variables (R1 =I//F0|-|Fc///£ |Fo|; wR2 =[£w(Fo2- Fc2)2/Iw(Fo2)2]72; GOF = [£w(Fo2- Fc2)2/(n - p)]7; donde n = el numero de reflexiones y p = el numero de parametros refinados). El Ala maximo en el ciclo final de mlnimos cuadrados fue 0,000 y los dos picos
mas prominentes en la diferencia final de Fourier fueron +0,402 y -0,559 e/A3.
Tabla 17. Resumen de la determinacion de estructura del compuesto 8 (isomero SP)
Formula emplrica
C18H21N2PO7
Peso de la formula
408,34
Temperatura
100(1) K
Longitud de onda
0,71073 A
Sistema de cristal
monocllnico
Grupo espacial
P21
Constantes celulares
a
5,3312(4) A
b
15,3388(8) A
c
23,7807(13) A
p
92,891(3)°
Volumen
1942,2(2) A3
Z
4
Densidad (calculada)
1,397 Mg/m3
Coeficiente de absorcion
0,185 mm-1
F(000)
856
Tamano del cristal
0,40 x 0,10 x 0,08 mm3
Rango Theta para recogida de datos
1,58 a 25,09°
Rangos de Indice
-6 <h <6, -18 <k < 18, -28 < 1 < 28
Reflexiones recogidas
6909
Reflexiones independientes
6909 [R(int) = 0,05811
Plenitud hasta theta = 25,09°
99,6 %
Correction de absorcion
Semi-emplrica de equivalentes
Transmision max. y min.
0,7452 y 0,6093
Metodo de refinamiento
Mlnimos cuadrados de matriz completa en F2
Datos/restri cciones/parametros
6909/1/512
Bondad de aiuste en F2
1,119
indices R finales [I>2sigma(I)1
R1 = 0,0847, wR2 = 0,1899
Indices R (todos los datos)
R1 = 0,0963, wR2 = 0,1963
Parametro de estructura absoluta
0,1(2)
Pico y orificio de dif. mayor
0,402 y -0,559 e.A-3
5
Ejemplo de referencia 31. Actividad biologica
Se sembraron celulas que contenlan replicon a 3.000 celulas/pocillo (50 pl) en placas blancas/opacas de 96 pocillos, o a 1.500 celulas/pocillo (25 pl) en placas blancas/opacas de 384 pocillos. Se anadieron 50 pl de compuesto 2X en 10 la placa de 96 pocillos o se anadieron 25 pl de compuesto 2X en la placa de 384 pocillos. Las placas se incubaron a 37 °C en una atmosfera de CO2 humidificada al 5 % durante 4 dlas. Tras la incubacion, se anadio el reactivo Bright- Glo (50 pl para la placa de 96 pocillos, o 25 pl para la placa de 384 pocillos) para medir el indicador de luciferasa de luciernaga para la replicacion del VHC. El porcentaje de inhibicion se calculo frente al control sin farmaco.
Compuesto
Actividad del replicon de VHC (pM)
4
0,58
Rp-4
2,87
Sp-4
0,13
15
Se ha demostrado que Rp-4, o Sp-4 tienen una amplia cobertura de genotipo. Por ejemplo, se ha demostrado que ambos son activos frente a los genotipos 1-4 del virus de la hepatitis C.

Claims (10)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    REIVINDICACIONES
    1. Un proceso para preparar un compuesto de formula Sp-4:
    imagen1
    que comprende:
    i) hacer reaccionar el compuesto C:
    imagen2
    en la que LG' es tosilato, canforsulfonato, p-nitrofenoxido, p-clorofenoxido, o-clorofenoxido, 2,4-dinitrofenoxido o pentafluorofenoxido, con un reactivo basico y el compuesto 3:
    imagen3
    en la que Z es un grupo protector o hidrogeno, para obtener Sp-4 protegido o sin proteger; y ii) cuando Sp-4 esta protegido, desproteger Sp-4 protegido para obtener Sp-4,
  2. 2. Un proceso para preparar un compuesto de formula Rp-4:
    imagen4
    que comprende:
    i) hacer reaccionar el compuesto C':
    5
    10
    15
    20
    25
    30
    imagen5
    en la que LG' es tosilato, canforsulfonato, p-nitrofenoxido, p-clorofenoxido, o-clorofenoxido, 2,4-dinitrofen6xido o pentafluorofenoxido, con un reactivo basico y el compuesto 3:
    imagen6
    en la que Z es un grupo protector o hidrogeno, para obtener RP-4 protegido o sin proteger; y ii) cuando RP-4 esta protegido, desproteger RP-4 protegido para obtener RP-4,
  3. 3. Un proceso de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, en el que LG' es p-nitrofenoxido.
  4. 4. Un proceso de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, en el que LG' es pentafluorofenoxido.
  5. 5. Un compuesto representado por la estructura:
    imagen7
    en donde el compuesto comprende una mezcla de diastereomeros representada por las siguientes estructuras:
    imagen8
    y;
    en las que LG' es tosilato, canforsulfonato, p-nitrofenoxido, p-clorofenoxido, o-clorofenoxido, 2,4-dinitrofenoxido o pentafluorofenoxido.
  6. 6. Un compuesto representado por la estructura
    imagen9
    10
    en la que LG' es tosilato, canforsulfonato, p-nitrofenoxido, p-clorofenoxido, o-clorofenoxido, 2,4-dinitrofen6xido o pentafluorofenoxido.
  7. 7. Un compuesto de acuerdo con la reivindicacion 6, en donde el compuesto esta representado por la estructura
    imagen10
  8. 8. Un compuesto de acuerdo con la reivindicacion 6, en donde el compuesto esta representado por la estructura
    imagen11
  9. 9. Un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, en el que LG' es p-nitrofenoxido.
  10. 10. Un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, en el que LG' es pentafluorofenoxido.
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