ES2658310T3 - Una cepa de bacteroides thetaiotaomicron y su uso en la reducción de la inflamación - Google Patents

Una cepa de bacteroides thetaiotaomicron y su uso en la reducción de la inflamación Download PDF

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Abstract

Un Bacteroides thetaiotaomicron depositado como número de acceso 42341 en NCIMB.

Description

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[0064] En una realización, el término "regular" se refiere a una regulación al alza en la expresión de uno o más genes proinflamatorios. En una realización alternativa, el término "regular" se refiere a una regulación a la baja en la expresión de uno o más genes pro-inflamatorios.
[0065] En una realización, la cepa BT2013 regula a la baja la expresión de uno o más genes pro-inflamatorios en una célula o células de un sujeto.
[0066] El término "gen pro-inflamatorio" tal como se utiliza aquí se refiere a un gen que, cuando se expresa, promueve la inflamación. Ejemplos de genes pro-inflamatorios incluyen genes que codifican pero no limitan a IL1-β, IL4, IL5, IL6, IL8, IL12, IL13, IL17, IL21, IL22, IL23, IL27, IFN, CCL2, CCL3, CCL5, CCL20, CXCL5, CXCL10, CXCL12, CXCL13, y TNF-α.
[0067] En una realización, el gen pro-inflamatorio se selecciona del grupo que consiste de IL1-β, IL6 y IL8.
[0068] En una realización, el nivel de expresión (por ejemplo, nivel de ARNm) de uno o más genes pro-inflamatorios se disminuye (es decirm se regula hacia abajo) tal que el nivel es de al menos 10%, 20%, 30%, 40% o 50% más bajo después de la administración de la cepa BT2013 cuando se compara con el nivel en el sujeto antes de la administración.
[0069] El término "genes de integridad de barrera" como se utiliza aquí se refiere a un gen que, cuando se expresa, tiene un papel en la función de la barrera del intestino, tales como la reparación de la barrera y la prevención de que los microorganismos crucen la barrera. Ejemplos de genes de integridad de barrera incluyen genes que codifican RetnIg|RetnIb, Si, Defa24, HSD11B2, Hsd17b2, y NR1D1|Thra.
[0070] En una realización, el término "regular" se refiere a una regulación al alza en la expresión de uno o más genes de integridad de barrera. En una realización alternativa, el término "regular" se refiere a una regulación a la baja en la expresión de uno o más genes de integridad de barrera.
[0071] En una realización, la cepa BT2013 regula hacia arriba la expresión de genes de integridad de barrera en una célula o células de un sujeto.
[0072] En una realización, el gen de la integridad de la barrera se selecciona del grupo que consiste en RetnIg|RetnIb, Si, Defa24, HSD11B2, Hsd17b2, y NR1D1|Thra.
[0073] En una realización, el nivel de expresión (por ejemplo, nivel de ARNm) de uno o más genes de integridad de barrera se incrementa (es decir, se regula hacia arriba) tal que el nivel es de al menos 10%, 20%, 30%, 40% o 50% mayor después de la administración de cepa BT2013 en comparación con el nivel en el sujeto antes de la administración.
Canal alimenticio
[0074] Las partes del canal alimentario incluyen el esófago, el estómago y el intestino (tal como el intestino delgado (por ejemplo, el duodeno, el yeyuno y el íleon) y/o el intestino grueso (por ejemplo, el intestino ciego, colon ascendente, colon transverso, el colon descendente y colon sigmoide)).
[0075] En este documento, el término "intestino grueso" se puede usar indistintamente con el término "dos puntos".
[0076] En una realización, la cepa BT2013 se utiliza para mejorar la salud de canal alimentario en un sujeto.
[0077] El término "mejorar la salud del canal alimentario" tal como se utiliza aquí se refiere a la reducción del nivel de inflamación en el canal alimentario o parte del mismo y/o mejorar la microbiota intestinal.
[0078] En una realización, el nivel de inflamación en el canal alimentario es de al menos 10%, 20%, 30%, 40% o 50% más bajo después de la administración de la cepa BT2013 cuando se compara con el nivel de inflamación en el tubo digestivo de un sujeto antes de la administración.
[0079] En una realización, la cepa BT2013 se utiliza para mejorar la microbiota intestinal en un sujeto.
[0080] El término "microbiota intestinal" tal como se utiliza aquí se refiere a microorganismos que viven en el tracto digestivo de los animales hospedadoreses. Estos microorganismos realizan una amplia variedad de funciones beneficiarias metabólicas, estructurales, de protección y otras.
[0081] Tal como se utiliza aquí, el término "mejorar microbiota intestinal" se refiere al aumento en el número y/o tipo de microorganismos deseables presentes en el intestino de un sujeto (por ejemplo, el huésped), y/o el aumento de la actividad de dichos microorganismos deseables en términos de sus metabólicos, funciones beneficiarias estructurales, de protección y de otro tipo. El término "mejorar microbiota intestinal" también puede referirse a
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opcionalmente un excipiente, vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
[0095] La composición farmacéutica puede ser cualquier composición farmacéutica. En un aspecto, la composición farmacéutica se va a administrar por vía oral, por vía enteral o por vía rectal. Por ejemplo, la composición puede ser una composición comestible. "Comestible" significa un material que está aprobado para el consumo humano o animal.
[0096] Las composiciones farmacéuticas pueden ser para uso humano o animal en medicina humana y veterinaria.
[0097] Los ejemplos de tales excipientes adecuados para las diversas formas diferentes de composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento se pueden encontrar en el "Handbook of Pharmaceutical Excipients, 2ª edición, (1994), editado por A Wade y PJ Weller.
[0098] Portadores o diluyentes aceptables para uso terapéutico son bien conocidos en la técnica farmacéutica, y se describen, por ejemplo, en Pharmaceutical Sciences de Remington, Mack Publishing Co. (A.R. Gennaro edit. 1985).
[0099] Los ejemplos de vehículos adecuados incluyen lactosa, almidón, glucosa, metilcelulosa, estearato de magnesio, manitol, sorbitol y similares.
[0100] Los ejemplos de diluyentes adecuados incluyen uno o más de: agua, etanol, glicerol, propilenglicol y glicerina, y combinaciones de los mismos
[0101] La elección del vehículo, excipiente o diluyente farmacéutico puede seleccionarse con respecto a la vía de administración prevista y práctica farmacéutica estándar. Las composiciones farmacéuticas pueden comprender como portador, excipiente o diluyente, o además de los mismos, cualquier aglutinante, lubricante, agente de suspensión, agente de recubrimiento, agente solubilizante.
[0102] Ejemplos de aglutinantes adecuados incluyen almidón, gelatina, azúcares naturales tales como glucosa, lactosa anhidra, lactosa de flujo libre, beta-lactosa, edulcorantes de maíz, gomas naturales y sintéticas, tales como acacia, tragacanto o alginato de sodio, carboximetilcelulosa y polietileno glicol.
[0103] Los ejemplos de lubricantes adecuados incluyen oleato de sodio, estearato de sodio, estearato de magnesio, benzoato sódico, acetato sódico, cloruro sódico y similares.
[0104] Los conservantes, estabilizantes, colorantes e incluso agentes aromatizantes pueden proporcionarse en la composición farmacéutica. Los ejemplos de conservantes incluyen benzoato sódico, ácido sórbico y ésteres de ácido p-hidroxibenzoico. Los antioxidantes y agentes de suspensión también pueden usarse.
[0105] En un aspecto, se encapsulan los microorganismos de la composición farmacéutica de cepa BT2013.
[0106] La farmacéutica puede estar en forma de una solución o como un sólido -en función de la utilización y/o el modo de aplicación y/o el modo de administración.
[0107] Tal como se utiliza aquí, el término "medicamento" abarca medicamentos para el uso tanto humano como animal en medicina humana y veterinaria. Además, el término "medicamento", como se usa en este documento significa cualquier sustancia, que proporciona un efecto terapéutico y/o beneficioso. El término "medicamento", como se usa en el presente documento no se limita necesariamente a las sustancias, que necesitan la aprobación de comercialización, sino que puede incluir sustancias que se pueden utilizar en cosméticos, nutracéuticos, alimentos (incluyendo alimentos y bebidas, por ejemplo), cultivos probióticos, suplementos nutricionales y remedios naturales. Además, el término "medicamento", como se usa en este documento abarca un producto diseñado para su incorporación en la alimentación animal, por ejemplo de alimentación de ganado y/o alimentos para mascotas.
Suplementos nutricionales
[0108] Portadores nutricionalmente aceptables, diluyentes y excipientes incluyen los adecuados para el consumo humano o animal y que se utilizan como estándar en la industria alimentaria. Vehículos, diluyentes y excipientes típicos aceptables nutricionalmente serán familiares para la persona experta en la técnica.
[0109] En una realización, un suplemento nutricional comprende microorganismos de la cepa BT2013 o una célula huésped que comprende un vector de expresión que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y un excipiente, vehículo o diluyente nutricional.
[0110] En un ejemplo, se encapsulan los microorganismos de la cepa BT2013.
Piensos/productos
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[0111] Un aspecto adicional de la invención se refiere a piensos, productos alimenticios, suplementos dietéticos y aditivos alimentarios que comprenden los microorganismos de la cepa BT2013.
[0112] Los términos "alimento", "producto alimenticio" "aditivo alimentario" y "suplemento dietético" como se usa en el presente documento están destinados a cubrir todos los productos consumibles que pueden ser sólidos, en gelatina o líquido.
[0113] El término "producto alimenticio" se usa en un sentido amplio -y cubre alimentos para seres humanos así como alimentos para animales (es decir, un pienso). En un aspecto, el producto alimenticio es para el consumo humano. Ejemplos de productos alimenticios incluyen productos lácteos (tales como leche, queso, bebidas que comprenden proteína de suero, bebidas de leche, bebidas de bacterias del ácido láctico, yogur, yogur para beber), productos de panadería, bebidas y polvos para bebidas.
[0114] El "alimento", "producto alimenticio" "aditivo alimentario" y "suplemento dietético" puede ser en forma de una solución o como un sólido -en función de la utilización y/o el modo de aplicación y/o el modo de la administración.
[0115] Tal como se utiliza aquí, el término "suplemento dietético" incluye una formulación que es o puede añadirse a un producto alimenticio o pienso como un suplemento nutricional. El término "suplemento dietético" tal como se utiliza aquí también se refiere a formulaciones que pueden utilizarse a niveles bajos en una amplia variedad de productos que requieren gelificante, texturización, estabilizantes, de suspensión, formación de película y estructuración, la retención de jugosidad y mejor sensación en la boca, sin la adición de la viscosidad.
[0116] Productos alimenticios adecuados pueden incluir, por ejemplo, productos funcionales de alimentos, composiciones de alimentos, alimentos para mascotas, alimento para ganado, alimentos saludables, alimentos para animales y similares. En un aspecto, el producto alimenticio es un alimento saludable.
[0117] Tal como se utiliza aquí, el término "producto alimenticio funcional" significa comida que es capaz de proporcionar no sólo un efecto nutricional, pero también es capaz de suministrar un efecto beneficioso adicional al consumidor. Por consiguiente, los alimentos funcionales son alimentos ordinarios que tienen incorporados componentes o ingredientes (tales como los descritos en el presente documento) que imparten a la comida un beneficio funcional específico -por ejemplo, médico o fisiológico -con excepción de un efecto puramente nutritivo.
[0118] Ejemplos de productos específicos de alimentos que son aplicables a la presente invención incluyen productos a base de leche, postres listos para comer, polvos para reconstitución con, por ejemplo, leche o agua, bebidas de leche de chocolate, bebidas de malta, platos listos para comer, platos instantáneos o bebidas para seres humanos o composiciones alimenticias que representan una dieta completa o parcial destinada a animales domésticos o ganado.
[0119] En un aspecto, el alimento, producto alimenticio, suplemento dietético o aditivo alimentario de acuerdo con la presente invención están destinados para los seres humanos, animales domésticos o de granja, tales como animales monogástricos. El alimento, producto alimenticio, suplemento dietético o aditivo alimentario pueden estar destinados a animales seleccionados del grupo que consiste en perros, gatos, cerdos, caballos, o aves de corral. En otra forma de realización, el producto alimenticio, suplemento dietético o aditivo alimentario está dirigido a las especies adultas, en particular los humanos adultos.
[0120] El término "producto a base de leche" como se usa en este documento significa cualquier leche líquida o semisólida o producto a base de suero que tiene un contenido de grasa variable. El producto a base de leche puede ser, por ejemplo, leche de vaca, leche de cabra, leche de oveja, leche desnatada, leche entera, leche recombinada a partir de leche en polvo y suero de leche sin ningún procesamiento, o un producto procesado, tales como yogur, leche cuajada, requesón, leche agria, leche entera agria, suero de mantequilla y otros productos de leche agria. Otro grupo importante incluye bebidas de leche, tales como bebidas de suero de leche, leches fermentadas, leches condensadas, infantiles o leches para bebés; leches aromatizadas, helado; alimentos como los dulces que contienen leche.
[0121] Los piensos, productos alimenticios, suplementos dietéticos o aditivos alimentarios de la presente invención pueden ser -o se pueden añadir a -suplementos alimenticios, también denominados aquí como suplementos dietéticos o nutricionales o aditivos alimentarios.
[0122] Los piensos, productos alimenticios, suplementos dietéticos o aditivos alimentarios de acuerdo con la invención también se pueden usar en la alimentación animal (por ejemplo en la nutrición de cerdo), en particular en el período de destete temprano y creciente período de engorde. Se espera que los piensos productos alimenticios, suplementos dietéticos o aditivos alimentarios mejoren la función inmune, reduzan y prevengan enfermedades infecciosas, beneficiosamente alteran la composición de la microbiota, y mejoran el crecimiento y el rendimiento de los animales, por ejemplo, mediante una mayor eficiencia de conversión del pienso.
[0123] En una realización, el alimento, producto alimenticio, suplemento dietético, o aditivo alimentario se encapsula.
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Producto bioterapéutico vivo
[0124] Los microorganismos de la cepa BT2013 se pueden usar en o como un producto bioterapéutico vivo (LBP).
[0125] En un aspecto, la LBP es una composición administrable por vía oral de bacterias metabólicamente activas, es decir, vivas y/o liofilizadas, o muertas por calor no viables, irradiadas o lisadas. La LBP puede contener otros ingredientes. La LBP puede ser administrada por vía oral, es decir, en forma de un comprimido, cápsula o polvo. La LBP puede comprender adicionalmente otras especies bacterianas, por ejemplo, las especies bacterianas R. hominis. Productos encapsulados son favorecidos para R. hominis, ya que es un anaerobio. Otros ingredientes (como la vitamina C, por ejemplo), pueden ser incluidos como eliminadores de oxígeno y sustratos (tales como los que mejoran la colonización y la supervivencia in vivo). Alternativamente, la LBP de la invención se puede administrar por vía oral como un producto alimenticio o nutricional, tal como leche o producto lácteo fermentado basado en suero de leche, o como un producto farmacéutico.
[0126] Una dosis diaria adecuada de las bacterias en la LBP es de aproximadamente 1 x 103 a aproximadamente 1 x 1012 unidades formadoras de colonias (CFU); por ejemplo, de aproximadamente 1 x 107 a aproximadamente 1 x 1010 CFU; en otro ejemplo de aproximadamente 1 x 106 a aproximadamente 1 x 1010 CFU.
[0127] En un aspecto, la LBP contiene las especies bacterianas y/o componentes celulares de las mismas, como ingredientes activos, en una cantidad de aproximadamente 1 x 106 a aproximadamente 1 x 1012 CFU/g, respecto al peso de la composición; por ejemplo, desde aproximadamente 1 x 108 a aproximadamente 1 x 1010 CFU/g. Típicamente, una LBP se combina opcionalmente con al menos un compuesto prebiótico adecuado. Un prebiótico es normalmente un carbohidrato no digerible tal como un oligo-o polisacárido, o un alcohol de azúcar, que no se degrada ni se absorbe en el tracto digestivo superior. Prebióticos conocidos incluyen productos comerciales tales como inulina y transgalacto-oligosacáridos.
[0128] En un aspecto, la LBP de la presente descripción incluye un prebiótico en una cantidad de desde aproximadamente 1 a aproximadamente 30% en peso, respecto a la composición peso total, (por ejemplo de 5 a 20% en peso). Los hidratos de carbono se pueden seleccionar de entre el grupo que consiste en: fructooligosacáridos (o FOS), fructo-oligosacáridos de cadena corta, inulina, isomaltoligosacáridos, pectinas, xilooligosacáridos (o XOS), quitosano-oligosacáridos (o COS), beta-glucanos, goma de cultivo modificada y almidones resistentes, polidextrosa, D-tagatosa, fibras de acacia, de algarroba, de avena y fibras de cítricos. En un aspecto, los prebióticos son fructo-oligosacáridos de cadena corta (para simplicidad se muestran en lo que sigue como FOS-cc); FOS-cc dichos no son hidratos de carbono digeribles, obtenidos generalmente mediante la conversión del azúcar de remolacha y que incluyen una molécula de sacarosa a la que se unen tres moléculas de glucosa.
Administración
[0129] Las composiciones farmacéuticas, los suplementos nutricionales, alimentos para animales, productos alimenticios, suplementos dietéticos o aditivos alimentarios de la presente invención se pueden adaptar para administración oral, rectal, vaginal, parenteral, intramuscular, intraperitoneal, intraarterial, intratecal, intrabronquial, subcutánea, intradérmica, intravenosa, nasal, bucal o sublingual de administración.
[0130] En un aspecto, las composiciones farmacéuticas, los suplementos nutricionales, alimentos para animales, productos alimenticios, suplementos dietéticos o aditivos alimentarios de la presente invención están adaptados para administración oral, rectal, vaginal, parenteral, nasal, bucal o sublingual de administración.
[0131] En un aspecto adicional, las composiciones farmacéuticas, los suplementos nutricionales, alimentos para animales, productos alimenticios, suplementos dietéticos o aditivos alimentarios de la presente invención están adaptados para administración oral.
[0132] Para la administración oral, se hace uso particular de tabletas comprimidas, píldoras, tabletas, píldoras, gotas y cápsulas.
[0133] Otras formas de administración comprenden soluciones o emulsiones que se pueden inyectar por vía intravenosa, intraarterial, intratecal, subcutánea, intradérmica, intraperitoneal o intramuscular, y que se preparan a partir de soluciones estériles o esterilizables. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención también pueden estar en forma de supositorios, pesarios y suspensiones. composiciones farmacéuticas, suplementos nutricionales, piensos, alimentos productos, suplementos dietéticos o aditivos alimentarios se pueden formular en forma de dosificación unitaria, es decir, en forma de porciones discretas que contienen una dosis unitaria, o una unidad múltiple o subunidad de una unidad dosis.
Dosificación
[0134] Una persona de experiencia ordinaria en la técnica puede determinar fácilmente una cantidad de dosificación
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adecuada de la cepa BT2013 para administración a un sujeto sin experimentación excesiva. Típicamente, un médico determinará la dosis real que será la más adecuada para un paciente individual y dependerá de una variedad de factores incluyendo la actividad de la cepa empleada, la estabilidad metabólica y la duración de acción de esa cepa, la edad, el peso de cuerpo, salud general, sexo, dieta, modo y tiempo de administración, velocidad de excreción, combinación de fármacos, la gravedad de la afección particular y el individuo que se somete a terapia. Las dosis descritas en este documento son ejemplares del caso medio. Puede haber, por supuesto, casos individuales en los que se requieran intervalos de dosificación mayores o menores, y están dentro del alcance de esta invención.
Combinaciones
[0135] En un aspecto, los microorganismos de cepa BT2013 se administran en combinación con uno o más de otros agentes activos. En tales casos, los microorganismos de la cepa BT2013 pueden administrarse consecutivamente, simultáneamente o secuencialmente con uno o más otros agentes activos.
Ensayos funcionales:
Modelo In Vivo
[0136] Ratones C57BL/6 (6 semanas de edad) se utilizaron para evaluar el efecto terapéutico de cepas B. thetaiotaomicron de E1, E2 y BT2013 durante la colitis inducida por DSS. Los ratones fueron colonizados con una de las cepas B. thetaiotaomicron antes del tratamiento con DSS. Los animales se sometieron a eutanasia y se realizó el muestreo de tejido intestinal. El intestino delgado se recogió para análisis inmunológico por citometría de flujo y las mediciones de actividad enzimática de la mieloperoxidasa enzimática (MPO). Colon ascendente se divide en partes iguales y se transfiere a la formalina tamponada neutra (NBF; Sigma-Aldrich) para el análisis histológico o RNAlater (Ambion) para el análisis molecular.
[0137] Se realizó el análisis de citometría de flujo de poblaciones de células T en lámina propria del intestino delgado (Figura 1 y Figura 2). DSS solo y tratamiento de B. thetaiotaomicron no afectó el porcentaje total de la población CD3+CD4+CD8-. Las poblaciones influenciadas por DSS solo y B. thetaiotaomicron fueron los Tregs (CD25+FoxP3+* y FR4hiCD25+*) y las células Teff (FR4loCD25+*) (Figura 1 y 2). El porcentaje de células T reguladoras se aumentó en ratones tratados con cepa B. thetaiotaomicron BT2013 en comparación con DSS solo. La cepa E1W no parece tener ningún efecto sobre las células T reguladoras. (Figura 1). Los efectos de BT2013 en Tregs eran sólo aparentes en co-tratamiento de ratones con DSS. La cepa no tuvo efecto sobre Tregs en ratones no tratados pero tuvo influencia sobre la población de células Teff (Figura 2).
[0138] Se determinó la actividad enzimática de MPO en el íleon y ciego (Figura 3 a y 3b). MPO es una enzima proinflamatoria almacenada en los gránulos azurófilos de los granulocitos neutrófilos. MPO se utiliza como un indicador de inflamación, específicamente el reclutamiento de neutrófilos y la acumulación. Los niveles más bajos de actividad MPO detectados en muestras de tejido ileal o cecal de ratones tratados con B. thetaiotaomicron/DSS en comparación con DSS solo indica una reducción en el reclutamiento de neutrófilos y por lo tanto una reducción en la inflamación.
[0139] Se realizó el análisis histológico de colon ascendente (Figuras 4 y 5 y en la Tabla 1). El esquema de la histopatología de clasificación se basó en los criterios de Berg et al. 1996, tal como se resume:
0 = Criptas superficiales, ninguna o pocas células inflamatorias infiltrantes, epitelio intacto, células caliciformes aparecen llenas de mucina. es decir, sin patología 1 = Criptas pueden exhibir leve hiperplasia de células epiteliales, algunas células inflamatorias de infiltración difusa se pueden ver entre criptas, epitelio luminal aparece intacto, células caliciformes pueden aparecer con ligero agotamiento de mucina. 2 = Criptas aparecen más profundas con evidencia clara de la hiperplasia epitelial, agotamiento de mucina de células caliciformes, infiltración de células inflamatorias evidentes y pueden ser multifocales en la naturaleza, aunque los infiltrados no se ven en la submucosa. 3 = Lesiones implicaron un área más grande de la mucosa y/o eran más frecuentes que la observada en el grado
2. Las lesiones no implican la submucosa. Las células epiteliales luminales exhibieron pequeñas erosiones. Las lesiones no son transmurales. 4 = El epitelio de cripta aparece erosionado. Los abscesos pueden estar presentes.
[0140] Las células epiteliales luminales son irregulares, a veces con pérdida completa.
[0141] Se observa infiltrado transmural -esto se asocia a menudo con pérdida completa de las células epiteliales en el lumen.
[0142] La interrupción en el colon como resultado de la colitis inducida por DSS se redujo significativamente por el tratamiento de ratones con cepas B. thetaiotaomicron E1, E2 y BT2013. La expresión de genes asociados con la inflamación en el colon ascendente se redujo en ratones colonizados con B. thetaiotaomicron en comparación con
los ratones tratados con DSS solo. Las cepas de E1 y BT2013 redujeron en gran medida la expresión IL1B e IL6 de genes inflamatorios en comparación con la cepa E2. (Figura 6)
Tabla 1
PRUEBA T
CONTROL BT E1 BT 2013 BT E2
DSS
0,000 0,032 0,041 0,089
10
Modelo In Vitro
[0143] La expresión del gen inflamatorio interleuquina-8 inducido en las células epiteliales intestinales después de la 15 exposición PMA fue modulada en presencia de cepas de B. thetaiotaomicron E1, E2 y BT2013 (Figura 7).
Secuenciación del genoma de cepa BT2013
[0144] Una muestra de ADN de la cepa BT2013 se sometió a secuenciación en MiSeq (v2 nano 2x250bp) usando
20 una biblioteca de Nextera XT para la fragmentación rápida y etiquetado con adaptadores de secuenciación, para dar un total de 4605120 lecturas (1115615927 bases).
[0145] El análisis de datos se resume a continuación:
25 a. Asignación a la secuencia de referencia (NC_004663 y NC_004703) usando bowtie2 (2.2.2)
b.
Llamada de SNV e InDel pequeña usando VarScan (2.3.7) y SNVer (0.5.3) realizando una llamada de consenso para evitar falsos positivos
c.
Anotación de variaciones utilizando referencia gff
d. Gran llamada de InDel usando pindel (0.2.5a3) 30 e. Asamblea de-novo de lecturas no asignadas usando SOAPdenovo (2.04)
f.
Onda de contigs ensamblados contra la base de datos NCBI nt
g.
Submuestreo de todas las lecturas de la muestra a 50%
h.
Asamblea de-novo en las lecturas submuestreadas usando SOAPdenovo (2.04)
35 Las secuencias fueron asignadas a la secuencia de referencia (NC_004663 y NC_004703) usando bowtie2 (2.2.2). Variaciones de nucleótidos y pequeñas inserciones y/o deleciones se identificaron utilizando VarScan (2.3.7) y SNVer (0.5.3) para evitar falsos positivos durante la secuenciación y las variaciones fueron anotadas utilizando una secuencia de referencia. Grandes inserciones y deleciones se identificaron utilizando Pindel (0.2.5a3). Lecturas no asignadas se reunieron de novo usando SOAPdenovo (2,04). Los fragmentos de secuenciación se vuelven a montar
40 en contigs que fueron destruidos contra la base de datos de nucleótidos NCBI. Todas las lecturas de la muestra se submuestrearon a 50% y luego se ensamblaron de novo usando SOAPdenovo (2,04) para proporcionar una versión concatenada del montaje de secuencia de novo de BT2013.
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