ES2775431T3

ES2775431T3 - Anticuerpos biespecíficos que se unen a CD38 y CD3

Info

Publication number: ES2775431T3
Application number: ES15720820T
Authority: ES
Inventors: Matthew Bernett; Seung Chu; Gregory Moore; John Desjarlais
Original assignee: Xencor Inc
Current assignee: Xencor Inc
Priority date: 2014-03-28
Filing date: 2015-03-30
Publication date: 2020-07-27
Anticipated expiration: 2035-03-30
Also published as: DK3122781T3; ME03666B; PE20161431A1; PL3122781T3; RS59907B1; CA2943621A1; US20210309762A1; EA201691925A1; JP2023052766A; AU2015237184A1; PT3122781T; EP3122781A1; KR20210097222A; SG11201607983YA; UA119167C2; SI3122781T1; SMT202000141T1; AP2016009475A0; CN111410691A; CR20160506A

Abstract

Un anticuerpo heterodimérico que comprende: a) una primera cadena pesada que comprende: i) una primera variante de dominio Fc; ii) una región Fv de cadena sencilla (scFv) que se une a CD3; y b) una segunda cadena pesada que comprende: i) una segunda variante de dominio Fc; y ii) un primer dominio pesado variable; y c) una primera cadena ligera que comprende un primer dominio ligero variable y un primer dominio ligero constante; en donde dicho primer dominio pesado variable y dicho primer dominio ligero variable se unen a CD38, y en donde dicha segunda cadena pesada y dicha primera cadena ligera se seleccionan de los pares que consisten en **(Ver cadena)**

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos biespecíficos que se unen a CD38 y CD3

REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS

La presente solicitud reivindica prioridad bajo la Sección 119 del Título 35 del U.S.C. a las solicitudes de patente provisional de EE. UU. N° 61/972.172, presentada el 28 de marzo de 2014, 62/025.974, presentada el 7 de julio de 2014, y 62/025.931, presentada el 17 de julio de 2014.

CAMPO TÉCNICO

La presente invención describe novedosas composiciones de inmunoglobulina que se co-acoplan simultáneamente a antígenos, donde ambos de los antígenos se unen monovalentemente. Las novedosas inmunoglobulinas descritas utilizan preferentemente regiones Fc heterodiméricas. También se describen en el presente documento métodos de uso de las novedosas composiciones de inmunoglobulina, particularmente para fines terapéuticos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Se han usado satisfactoriamente terapéuticos basados en anticuerpos para tratar una variedad de enfermedades, que incluye cáncer y trastornos autoinmunitarios / inflamatorios. Aún se necesitan mejoras a esta clase de fármacos, particularmente con respecto a potenciar su eficacia clínica. Una posibilidad que se explora es la manipulación de sitios de unión al antígeno adicionales y novedosos en fármacos basados en anticuerpos tal que una única molécula de inmunoglobulina se co-acople a dos antígenos diferentes. Dichos formatos de anticuerpo no nativos o alternativos que se acoplan a dos antígenos diferentes frecuentemente se denominan biespecíficos. Debido a que la considerable diversidad de la región variable del anticuerpo (Fv) hace posible producir un Fv que reconoce prácticamente cualquier molécula, el enfoque típico para la generación de biespecíficos es la introducción de nuevas regiones variables en el anticuerpo.

Se han explorado varios formatos de anticuerpo alternativos para el direccionamiento biespecífico (Chames & Baty, 2009, mAbs 1[6]:1-9; Holliger & Hudson, 2005, Nature Biotechnology 23[9]:1126-1136; y Kontermann, 2012 MAbs 4(2):182). Inicialmente, se produjeron anticuerpos biespecíficos fusionando dos líneas celulares que producían cada una un anticuerpo monoclonal simple (Milstein et al., 1983, Nature 305:537-540). Aunque el hibridoma o cuadroma híbrido resultante producía anticuerpos biespecíficos, solo era una población menor, y se requirió una amplia purificación para aislar el anticuerpo deseado. Una solución de manipulación para esto fue el uso de fragmentos de anticuerpo para producir biespecíficos. Debido a que dichos fragmentos carecen de la estructura cuaternaria compleja de un anticuerpo de longitud completa, las cadenas pesada y ligera variables se pueden unir en construcciones genéticas simples. Se han generado fragmentos de anticuerpo de muchas formas diferentes, que incluyen diacuerpos, diacuerpos de cadena simple, scFv en tándem y biespecíficos de Fab²(Chames & Baty, 2009, mAbs 1[6]:1-9; Holliger & Hudson, 2005, Nature Biotechnology 23[9]:1126-1136). Aunque estos formatos se pueden expresar a altos niveles en bacterias y pueden tener beneficios de penetración favorables debido a su pequeño tamaño, se eliminan rápidamente in vivo y pueden presentar obstáculos de fabricación relacionados con su producción y estabilidad. Una causa principal de estos inconvenientes es que los fragmentos de anticuerpo normalmente carecen de la región constante del anticuerpo con sus propiedades funcionales asociadas, que incluyen mayor tamaño, alta estabilidad y unión a diversos receptores de Fc y ligandos que mantienen una larga semivida en suero (es decir, el receptor de Fc neonatal FcRn) o sirven de sitios de unión para la purificación (es decir, proteína A y proteína G).

El trabajo más reciente ha intentado tratar las limitaciones de los biespecíficos basados en fragmentos por manipulación de unión doble en formatos de tipo anticuerpo de longitud completa (Wu et al., 2007, Nature Biotechnology 25[11]:1290-1297; documento de patente US 2009/0311253; Michaelson et al., 2009, mAbs 1 [2]:128-141; documento de patente WO 2009/032782; Zuo et al., 2000, Protein Engineering 13[5]:361-367; documento de patente US 2002/0103345; Shen et al., 2006, J Biol Chem 281 [16]:10706-10714; Lu et al., 2005, J Biol Chem 280[20]:19665-19672; documento de patente WO 2006/020258; y Kontermann, 2012 MAbs 4(2):182). Estos formatos superan algunos de los obstáculos de los biespecíficos de fragmentos de anticuerpo, principalmente debido a que contienen una región Fc. Un inconveniente significativo de estos formatos es que, debido a que construyen nuevos sitios de unión al antígeno encima de las cadenas constantes homodiméricas, siempre es bivalente la unión al nuevo antígeno.

Para muchos antígenos que son atractivos como co-dianas en un formato biespecífico terapéutico, la unión deseada es monovalente en vez de bivalente. Para muchos receptores inmunitarios, la activación celular se lleva a cabo por reticulación de una interacción de unión monovalente. El mecanismo de reticulación normalmente está mediado por complejos inmunitarios de anticuerpo/antígeno, o por acoplamiento de célula efectora a célula diana. Por ejemplo, los receptores Fc gamma de baja afinidad (FcyRs), tales como FcYRIIa, FcYRIIb y FcYRIIIa, se unen de forma monovalente a la región Fc del anticuerpo. La unión monovalente no activa las células que expresan estos FcyRs; sin embargo, tras la complejación inmunitaria o contacto célula con célula, se reticulan los receptores y se agrupan sobre la superficie celular, conduciendo a la activación. Para los receptores responsables de mediar en la destrucción celular, por ejemplo FcYRIIIa en los linfocitos citolíticos espontáneos (NK), la reticulación de receptores y la activación celular ocurren cuando la célula efectora se acopla con la célula diana en un formato altamente ávido (Bowles & Weiner, 2005, J Immunol Methods 304:88-99). Similarmente, en linfocitos B, el receptor inhibidor FcyRIIb regula por disminución la activación de linfocitos B solo cuando se acopla en un complejo inmunitario con el receptor de la superficie celular de linfocitos B (BCR), un mecanismo que está mediado por la complejación inmunitaria de IgGs solubles con el mismo antígeno que es reconocido por el BCR (Heyman 2003, Immunol Lett 88[2]:157-161; Smith y Clatworthy, 2010, Nature Reviews Immunology 10:328-343). Como otro ejemplo, la activación por CD3 de linfocitos T ocurre solo cuando su receptor de linfocitos T (TCR) asociado se acopla con MHC cargado con antígenos en células presentadoras de antígenos en una sinapsis célula a célula altamente ávida (Kuhns et al., 2006, Immunity 24:133-139). De hecho, la reticulación bivalente no específica de CD3 usando un anticuerpo anti-CD3 provoca una tormenta de citocinas y toxicidad (Perruche et al., 2009, J Immunol 183[2]:953-61; Chatenoud & Bluestone, 2007, Nature Reviews Immunology 7:622-632). Así, para el uso clínico práctico, el modo preferido de co-acoplamiento de CD3 para la destrucción re dirigida de células diana es la unión monovalente que da como resultado la activación solo tras el acoplamiento con la diana co-acoplada.

CD38, también conocida como ADP ribosa hidrolasa cíclica, es una glucoproteína transmembranaria de tipo II con un dominio extracelular de extremo C largo y un dominio citoplásmico de extremo N corto. Entre las células hematopoyéticas, se le ha atribuido una selección de efectos funcionales a la señalización mediada por CD38, que incluye proliferación de linfocitos, liberación de citocinas, regulación de linfocitos B y desarrollo y supervivencia de células mieloides, e inducción de la maduración de células dendríticas. CD38 no está regulado en muchos tumores malignos hematopoyéticos y en líneas celulares derivadas de diversos tumores malignos hematopoyéticos que incluyen linfoma no Hodgkin (NHL), linfoma de Burkitt (BL), mieloma múltiple (MM), leucemia linfocítica crónica B (B-CLL), leucemia linfocítica aguda B y T (ALL), linfoma de linfocitos T (TCL), leucemia mieloide aguda (AML), leucemia de células pilosas (HCL), linfoma Hodgkin (HL) y leucemia mieloide crónica (CML). Por otra parte, la mayoría de las células madre pluripotentes primitivas del sistema hematopoyético son CD38-. A pesar del reciente progreso en el descubrimiento y el desarrollo de agentes antineoplásicos, muchas formas de cáncer que implican tumores que expresan CD38- todavía tienen un mal pronóstico. Así, existe una necesidad de métodos de tratamiento mejorados de dichas formas de cáncer.

Así, mientras que los biespecíficos generados a partir de fragmentos de anticuerpo presentan obstáculos biofísicos y farmacocinéticos, un inconveniente de los construidos con formatos de tipo anticuerpo de longitud completa es que se acoplan de forma multivalente con antígenos co-diana en ausencia del antígeno diana primario, que conduce a la activación no específica y posiblemente toxicidad. La presente invención resuelve este problema introduciendo un novedoso formato biespecífico que permite el co-acoplamiento de distintos antígenos diana.

El documento de patente US 2013/209355 A1 desvela anticuerpos que se unen a CD38 humano, composiciones farmacéuticas que comprenden dichos anticuerpos, y el uso de estos anticuerpos en métodos de tratamiento de enfermedades o trastornos que implican a células que expresan CD38.

El documento de patente WO 2012/131555 desvela inmunoglobulinas heterodiméricas manipuladas o fragmentos de las mismas y métodos de su fabricación.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

Por consiguiente, la presente invención proporciona anticuerpos heterodiméricos que se unen a CD3 y CD38. Los anticuerpos heterodiméricos comprenden una primera cadena pesada que comprende una primera variante de dominio Fc y una región Fv de cadena sencilla (scFv) que se une a CD3. Los anticuerpos heterodiméricos también comprenden una segunda cadena pesada que comprende una segunda variante de dominio Fc y un primer dominio pesado variable. Los anticuerpos heterodiméricos comprenden además una primera cadena ligera que comprende un primer dominio ligero variable y un primer dominio ligero constante, en donde dicho primer dominio pesado variable y dicho primer dominio ligero variable se unen a CD38. La segunda cadena pesada y la primera cadena ligera de los anticuerpos heterodiméricos de la invención se seleccionan de los pares de secuencias que se definen en la reivindicación 1.

La divulgación proporciona anticuerpos heterodiméricos seleccionados del grupo que consiste en XENP13243; XENP13545; XENP13546; XENP13547; XENP13548; XENP13549; XENP13550; XENP13551; XENP13544; XENP13752; XENP13753; XENP13754; XENP13756; XENP13757 y XENP13694.

Como se describe en el presente documento, scFv tiene una secuencia que comprende una vhCDR1 que tiene la secuencia T-Y-A-M-Xaa1, en donde Xaa1 es N, S o H (SEQ ID NO:435), una vhCDR2 que tiene la secuencia R-I-R-S-K-Xaa1 -N-Xaa2-Y-A-T-Xaa3-Y-Y-A-Xaa4-S-V-K-G, en donde Xaa1 es Y o A, Xaa2 es N o S, Xaa3 es Y o A y Xaa4 es D o A (SEQ ID NO:436), una vhCDR3 que tiene la secuencia H-G-N-F-G-Xaa1-S-Y-V-S-W-F-Xaa2-Y, en donde Xaa1 es N, D o Q y Xaa2 es A o D (SEQ ID NO:437), una vlCDR1 que tiene la secuencia Xaal-S-S-T-G-A-V-T-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Y-A-N, en donde Xaa1 es G, R o K, Xaa2 es T o S, Xaa3 es S o G y Xaa4 es N o H, (SEQ ID NO:438), una vlCDR2 que tiene la secuencia Xaal-T-N-Xaa2-R-A-Xaa3, en donde Xaa1 es G o D, Xaa2 es K o N, y Xaa3 es P o S (SEQ ID NO:439) y una vlCDR3 que tiene la secuencia Xaa1-L-W-Y-S-N-Xaa2-W-V, en donde Xaa1 es A o L y Xaa2 es L o H (SEQ ID NO:440).

Como también se describe en el presente documento, scFv se selecciona del grupo que consiste en H1.30_L1.47, H1.33_L1.47 y H1.31_L1.47.

Como se describe en el presente documento, la región variable anti-CD3 tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en:

a) una secuencia que comprende una vhCDR1 que tiene SEQ ID NO: 411, una vhCDR2 que tiene SEQ ID NO: 413, una vhCDR3 que tiene SEQ ID NO: 416, una vlCDR1 que tiene s Eq ID NO: 420, una vlCDR2 que tiene SEQ ID NO: 425 y una vlCDR3 que tiene SEQ ID NO: 430;

b) una secuencia que comprende una vhCDR1 que tiene SEQ ID NO: 412, una vhCDR2 que tiene SEQ ID NO: 413, una vhCDR3 que tiene SEQ ID NO: 416, una vlCDR1 que tiene s Eq ID NO: 420, una vlCDR2 que tiene SEQ ID NO: 425 y una vlCDR3 que tiene SEQ ID NO: 430;

c) una secuencia que comprende una vhCDR1 que tiene SEQ ID NO: 411, una vhCDR2 que tiene SEQ ID NO: 414, una vhCDR3 que tiene SEQ ID NO: 416, una vlCDR1 que tiene s Eq ID NO: 420, una vlCDR2 que tiene SEQ ID NO: 425 y una vlCDR3 que tiene SEQ ID NO: 430;

d) una secuencia que comprende una vhCDR1 que tiene SEQ ID NO: 411, una vhCDR2 que tiene SEQ ID NO: 413, una vhCDR3 que tiene SEQ ID NO: 417, una vlCDR1 que tiene s Eq ID NO: 420, una vlCDR2 que tiene SEQ ID NO: 425 y una vlCDR3 que tiene SEQ ID NO: 430;

e) una secuencia que comprende una vhCDR1 que tiene SEQ ID NO: 411, una vhCDR2 que tiene SEQ ID NO: 413, una vhCDR3 que tiene SEQ ID NO: 418, una vlCDR1 que tiene s Eq ID NO: 420, una vlCDR2 que tiene SEQ ID NO: 425 y una vlCDR3 que tiene SEQ ID NO: 430;

f) una secuencia que comprende una vhCDR1 que tiene SEQ ID NO: 411, una vhCDR2 que tiene SEQ ID NO: 413, una vhCDR3 que tiene SEQ ID NO: 416, una vlCDR1 que tiene SEQ ID NO: 421, una vlCDR2 que tiene SEQ ID NO: 425 y una vlCDR3 que tiene SEQ ID NO: 430;

g) una secuencia que comprende una vhCDR1 que tiene SEQ ID NO: 411, una vhCDR2 que tiene SEQ ID NO: 413, una vhCDR3 que tiene SEQ ID NO: 416, una vlCDR1 que tiene s Eq ID NO: 422, una vlCDR2 que tiene SEQ ID NO: 425 y una vlCDR3 que tiene SEQ ID NO: 430;

h) una secuencia que comprende una vhCDR1 que tiene SEQ ID NO: 411, una vhCDR2 que tiene SEQ ID NO: 413, una vhCDR3 que tiene SEQ ID NO: 416, una vlCDR1 que tiene s Eq ID NO: 420, una vlCDR2 que tiene SEQ ID NO: 427 y una vlCDR3 que tiene SEQ ID NO: 430;

i) una secuencia que comprende una vhCDR1 que tiene SEQ ID NO: 411, una vhCDR2 que tiene SEQ ID NO: 413, una vhCDR3 que tiene SEQ ID NO: 416, una vlCDR1 que tiene SEQ ID NO: 420, una vlCDR2 que tiene SEQ ID NO: 428 y una vlCDR3 que tiene SEQ ID NO: 430;

j) una secuencia que comprende una vhCDR1 que tiene SEQ ID NO: 411, una vhCDR2 que tiene SEQ ID NO: 413, una vhCDR3 que tiene SEQ ID NO: 416, una vlCDR1 que tiene SEQ ID NO: 420, una vlCDR2 que tiene SEQ iD NO: 425 y una vlCDR3 que tiene SEQ iD NO: 431;

k) una secuencia que comprende una vhCDR1 que tiene SEQ ID NO: 411, una vhCDR2 que tiene SEQ ID NO: 413, una vhCDR3 que tiene SEQ ID NO: 416, una vlCDR1 que tiene SEQ ID NO: 420, una vlCDR2 que tiene SEQ iD NO: 425 y una vlCDR3 que tiene SEQ iD NO: 430;

l) una secuencia que comprende una vhCDR1 que tiene SEQ ID NO: 411, una vhCDR2 que tiene SEQ ID NO: 413, una vhCDR3 que tiene SEQ ID NO: 416, una vlCDR1 que tiene SEQ ID NO: 423, una vlCDR2 que tiene SEQ iD NO: 425 y una vlCDR3 que tiene SEQ iD NO: 432;

m) una secuencia que comprende una vhCDR1 que tiene SEQ ID NO: 411, una vhCDR2 que tiene s Eq ID NO: 413, una vhCDR3 que tiene SEQ ID NO: 416, una vlCDR1 que tiene s Eq ID NO: 424, una vlCDR2 que tiene SEQ iD NO: 425 y una vlCDR3 que tiene SEQ iD NO: 432;

n) una secuencia que comprende una vhCDR1 que tiene SEQ ID NO: 412, una vhCDR2 que tiene SEQ ID NO: 413, una vhCDR3 que tiene SEQ ID NO: 417, una vlCDR1 que tiene s Eq ID NO: 420, una vlCDR2 que tiene SEQ iD NO: 425 y una vlCDR3 que tiene SEQ iD NO: 430;

o) una secuencia que comprende una vhCDR1 que tiene SEQ ID NO: 412, una vhCDR2 que tiene SEQ ID NO: 414, una vhCDR3 que tiene SEQ ID NO: 419, una vlCDR1 que tiene s Eq ID NO: 420, una vlCDR2 que tiene SEQ iD NO: 425 y una vlCDR3 que tiene SEQ iD NO: 430;

p) una secuencia que comprende una vhCDR1 que tiene SEQ ID NO: 411, una vhCDR2 que tiene SEQ ID NO: 415, una vhCDR3 que tiene SEQ ID NO: 416, una vlCDR1 que tiene s Eq ID NO: 420, una vlCDR2 que tiene SEQ iD NO: 425 y una vlCDR3 que tiene SEQ iD NO: 430;

q) una secuencia que comprende una vhCDRI que tiene SEQ ID NO: 411, una vhCDR2 que tiene SEQ ID NO: 415, una vhCDR3 que tiene SEQ ID NO: 416, una vlCDR1 que tiene s Eq ID NO: 420, una vlCDR2 que tiene SEQ ID NO: 425 y una vlCDR3 que tiene SEQ ID NO: 430;

r) una secuencia que comprende una vhCDR1 que tiene SEQ ID NO: 411, una vhCDR2 que tiene

SEQ ID NO: 413, una vhCDR3 que tiene SEQ ID NO: 417, una vlCDR1 que tiene SEQ ID NO: 420, una vlCDR2 que tiene SEQ iD NO: 425 y una vlCDR3 que tiene SEQ iD NO: 430;

s) una secuencia que comprende una vhCDR1 que tiene SEQ ID NO: 411, una vhCDR2 que tiene

SEQ ID NO: 413, una vhCDR3 que tiene SEQ ID NO: 419, una vlCDR1 que tiene s Eq ID NO: 420, una vlCDR2 que tiene SEQ iD NO: 425 y una vlCDR3 que tiene SEQ iD NO: 430;

t) una secuencia que comprende una vhCDR1 que tiene SEQ ID NO: 411, una vhCDR2 que tiene SeQ ID NO: 413, una vhCDR3 que tiene SEQ ID NO: 417, una vlCDR1 que tiene SEQ ID NO: 420, una vlCDR2 que tiene SEQ iD NO: 425 y una vlCDR3 que tiene SEQ iD NO: 433;

u) una secuencia que comprende una vhCDR1 que tiene SEQ ID NO: 411, una vhCDR2 que tiene SEQ ID NO: 413, una vhCDR3 que tiene SEQ ID NO: 416, una vlCDR1 que tiene s Eq ID NO: 420, una vlCDR2 que tiene SEQ ID NO: 425 y una vlCDR3 que tiene SEQ ID NO: 433 y

v) una secuencia que comprende una vhCDR1 que tiene SEQ ID NO: 411, una vhCDR2 que tiene

SEQ ID NO: 434, una vhCDR3 que tiene SEQ ID NO: 416, una vlCDR1 que tiene s Eq ID NO: 420, una vlCDR2 que tiene SEQ ID NO: 425 y una vlCDR3 que tiene SEQ ID NO: 430.

Como se describe en el presente documento, la región variable anti-CD3 comprende una región pesada variable y una región ligera variable seleccionada del grupo que consiste en:

SEQ ID NOs: 5

6; SEQ ID NOs: 9 y 10; SEQ ID NOs: 13 y 14; SE ID NOs: 21 y 22; SEQ ID NOs: 25

26; SEQ ID NOs: 29 y 30; 34; SEQ ID NOs: 37 SEQ ID NOs: 45

46;

50; 54; SEQ ID NOs: 57 SEQ ID NOs: 65 y 66; SEQ ID NOs: 69 y 70; 74; SEQ ID NOs: 77 SEQ ID NOs: 85 y 86; SEQ ID NOs: 89 y 90; SEQ ID NOs: 93 y 94; SEQ ID NOs: 9 01 y 102;

SEQ ID NOs: 105 y 106; SEQ ID NOs: 109 y 110; SEQ ID NOs: 113 y 114; SEQ ID N NOs: 121 y 122; SEQ ID NOs: 125 y 126; SEQ ID NOs: 129 y 130; SEQ ID NOs: 133 y 7 y 138;

SEQ ID NOs: 141 y 142; SEQ ID NOs: 145 y 146; SEQ ID NOs: 149 y 150; SEQ ID N NOs: 157 y 158; SEQ ID NOs: 161 y 162; SEQ ID NOs: 165 y 166; SEQ ID NOs: 169 y 3 y 174;

SEQ ID NOs: 177 y 178; SEQ ID NOs: 181 y 182; SEQ ID NOs: 185 y 186; SEQ ID N NOs: 193 y 194; SEQ ID NOs: 197 y 198; SEQ ID NOs: 201 y 202; SEQ ID NOs: 205 y 9 y 210;

SEQ ID NOs: 213 y 214; SEQ ID NOs: 217 y 218; SEQ ID NOs: 221 y 222; SEQ ID N NOs: 229 y 230; SEQ ID NOs: 233 y 234; SEQ ID NOs: 237 y 238; SEQ ID NOs: 241 y 5 y 246;

SEQ ID NOs: 249 y 250; SEQ ID NOs: 253 y 254; SEQ ID NOs: 257 y 258; SEQ ID N NOs: 265 y 266; SEQ ID NOs: 269 y 270; SEQ ID NOs: 273 y 274; SEQ ID NOs: 277 y 1 y 282;

SEQ ID NOs: 285 y 286; SEQ ID NOs: 289 y 290; SEQ ID NOs: 293 y 294; SEQ ID N NOs: 301 y 302; SEQ ID NOs: 305 y 306; SEQ ID NOs: 309 y 310; SEQ ID NOs: 313 y 7 y 318;

SEQ ID NOs: 321 y 322; SEQ ID NOs: 325 y 326; SEQ ID NOs: 329 y 330; SEQ ID N NOs: 337 y 338; SEQ ID NOs: 341 y 342; SEQ ID NOs: 345 y 346; SEQ ID NOs: 349 y 3 y 354;

SEQ ID NOs: 357 y 358; SEQ ID NOs: 361 y 362; SEQ ID NOs: 365 y 366; SEQ ID N NOs: 373 y 374; SEQ ID NOs: 377 y 378; SEQ ID NOs: 381 y 382; SEQ ID NOs: 385 y 9 y 390;

SEQ ID NOs: 393 y 394; SEQ ID NOs: 397 y 398; SEQ ID NOs: 401 y 402; SEQ ID N

NOs: 409 y 410.

Los anticuerpos heterodiméricos tienen el primer dominio pesado variable y el primer dominio ligero variable se seleccionan de los pares que consisten en H1 y L1; HI y L1.24; HI y L1.96; H1.77 y L1.96; H1.77 y L1.97; H1.72 y L1.97; H1.71 y L1.96 y H1.77 y L1.24.

En un aspecto adicional, la invención proporciona anticuerpos heterodiméricos como antes, en donde la scFv tiene un conector de scFv cargado. El conector de scFv cargado puede tener una carga positiva desde 3 hasta 8 y se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 443 a 451.

Como se describe en el presente documento, scFv tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en

SEQ ID NO 4; SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 24; SEQ ID NO: 28

SEQ ID NO SEQ ID NO: 36: SEQ ID NO: 40; SEQ ID NO: 44; SEQ ID NO: 48 SEQ ID NO: 52; SEQ ID NO: 56

SEQ ID NO SEQ ID NO: 64: SEQ ID NO: 68; SEQ ID NO: 72; SEQ ID NO: 76 SEQ ID NO: 80; SEQ ID NO: 84

SEQ ID NO 88; SEQ ID NO: 92; SEQ ID NO: 96; SEQ ID NO: 100; SEQ ID NO: 104; SEQ ID NO: 108

SEQ ID NO 112; SEQ ID NO: 116; SEQ ID NO 120; SEQ ID NO: 124; SEQ ID NO: 128; SEQ ID NO: 132

SEQ ID NO 136; SEQ ID NO: 140; SEQ ID NO 144; SEQ ID NO: 148; SEQ ID NO: 152; SEQ ID NO: 156

SEQ ID NO 160; SEQ ID NO: 164; SEQ ID NO 168; SEQ ID NO: 172; SEQ ID NO: 176; SEQ ID NO: 180

SEQ ID NO 184; SEQ ID NO: 188; SEQ ID NO 192; SEQ ID NO: 196; SEQ ID NO: 200; SEQ ID NO: 204

SEQ ID NO 208 SEQ ID NO 212 SEQ ID NO: 216 SEQ ID NO 220 SEQ ID NO 224 SEQ ID NO 228 SEQ ID NO 232 SEQ ID NO 236 SEQ ID NO: 240 SEQ ID NO 244 SEQ ID NO 248 SEQ ID NO 252 SEQ ID NO: 256 SEQ ID NO 260 SEQ ID NO: 264 SEQ ID NO 268 SEQ ID NO 272 SEQ ID NO 276 SEQ ID NO: 280 SEQ ID NO 284 SEQ ID NO: 288 SEQ ID NO 292 SEQ ID NO 296 SEQ ID NO 300 SEQ ID NO: 304 SEQ ID NO 308 SEQ ID NO: 312 SEQ ID NO 316 SEQ ID NO 320 SEQ ID NO 324 SEQ ID NO: 328 SEQ ID NO 332 SEQ ID NO: 336 SEQ ID NO 340 SEQ ID NO 344 SEQ ID NO 348 SEQ ID NO: 352 SEQ ID NO 356 SEQ ID NO: 360 SEQ ID NO 364 SEQ ID NO 368 SEQ ID NO 372 SEQ ID NO: 376 SEQ ID NO 380 SEQ ID NO: 384 SEQ ID NO 388 SEQ ID NO 392 SEQ ID NO 396 SEQ ID NO: 400 SEQ ID NO: 404; SEQ ID NO: 408

Como se describe en el presente documento, la región Fc de las cadenas pesadas comprende además una variante de FcRn, que incluye, pero no se limita a, 428L/434S.

En un aspecto adicional, la invención proporciona composiciones de ácido nucleico que comprenden un primer ácido nucleico que codifica una primera cadena pesada que comprende una región Fc y una scFv que se une a CD3, un segundo ácido nucleico que codifica una segunda cadena pesada que comprende una cadena constante pesada y una cadena variable pesada, y un tercer ácido nucleico que codifica una cadena ligera, en donde las regiones Fv de la segunda cadena pesada y la cadena ligera se unen a CD38. Estos ácidos nucleicos pueden estar en diferentes vectores de expresión o el mismo. La invención proporciona células hospedadoras que comprenden las composiciones de ácido nucleico.

En un aspecto adicional, la invención proporciona métodos de producción anticuerpos heterodiméricos de la invención que comprenden proporcionar un primer vector de expresión que comprende un primer ácido nucleico que codifica una primera cadena pesada que comprende un primer dominio Fc y una primera cadena pesada variable; proporcionar un segundo vector de expresión que comprende un segundo ácido nucleico que codifica una segunda cadena pesada que comprende un primer dominio Fc y una región Fv de cadena sencilla (scFv) que se une a CD3; y proporcionar un tercer vector de expresión que comprende ácido nucleico que comprende una cadena ligera; en donde dicha primera cadena pesada variable y el dominio ligero variable de dicha cadena ligera se unen a CD38. El primer, segundo y tercer vectores de expresión se transfectan en células hospedadoras a una relación seleccionada del grupo que consiste en 1:1,5:1,5, 1:2:1,5, 1:0,667:2, 1:1:2, 1:1,5:2, y 1:2:2. El primer, segundo y tercer ácidos nucleicos en las células hospedadoras producen una primera, segunda y tercera secuencia de aminoácidos, respectivamente, de forma que dichas primera, segunda y tercera secuencias de aminoácidos formen anticuerpo heterodimérico.

En un aspecto adicional, la invención proporciona anticuerpos heterodiméricos para su uso en terapia.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Las Figuras 1A y 1B representan la secuencia de CD38 humano. La Figura 1A representa la secuencia de longitud completa y la Figura 1B representa el dominio extracelular.

La Figura 2 representa la secuencia de CD3 humano.

Las Figuras 3A a 3YY representan las secuencias de aminoácidos de scFvs de variante de anti-CD3 humanizadas con estabilidad optimizada, las secuencias pesadas variables y ligeras variables. (Obsérvese que la primera secuencia es la versión marcada con histidina para facilitar la purificación). Las CDRs están subrayadas. Se debe entender que el aumento de estabilidad de las cadenas variables optimizadas y ligeras optimizadas (así como las cadenas de scFv) se puede atribuir a regiones estructurales, así como a las CDRs. Así, se debe entender que la divulgación de toda la región variable incluye la divulgación de las regiones estructurales, aunque no se enumeren por separado. Además, los conectores de scFv se muestran en gris. Cada conector de scFv se puede sustituir con un conector de scFv cargado como se representa en la Figura 5. Es decir, cualquier conector de scFv cargado, tanto positivo como negativo, que incluye los representados en la Figura 5, se puede sustituir por la región destacada en las Figuras 3A a 3YY.

Las Figuras 4A a 4I representan una recopilación de todas las secuencias de CD3 vhCDR1 -3 y vlCDR1 -3 útiles en la presente invención y CDRs consenso.

La Figura 5 representa conectores de scFv adecuados cargados positiva y negativamente. Un conector de scFv simple del estado de la técnica con una carga simple se denomina "Whitlow", de Whitlow et al., Protein Engineering 6(8):989-995 (1993). Se debe observar que este conector se usó para reducir la agregación y potenciar la estabilidad proteolítica en scFvs.

Las Figuras 6A, 6B, 6C y 6D representan novedosas variantes estéricas. Como se entenderá por los expertos en la técnica, la primera columna de cada tabla representa pares de monómeros "correspondientes"; es decir, el monómero 1 tiene 405A y la variante estérica correspondiente es 394F. Es importante observar que en el contexto del formato de triple F asimétrico, cualquier monómero puede tener cualquier variante. Es decir, el monómero de scFv puede ser el monómero 1 o monómero 2. Nuevamente, estos conjuntos pueden estar opcional e independientemente combinados con otras variantes estéricas, así como otras variantes de heterodimerización que incluyen pares de carga, variantes isotípicas, variantes isostéricas, variantes de pl, etc., siempre y cuando se mantenga cierta "naturaleza de las cadenas". Además, el "monómero" se refiere a los dominios Fc; es decir, en el formato de triple F, un monómero es la construcción scFv y el otro monómero es la construcción Fab, a pesar del hecho de que existen en realidad dos secuencias de aminoácidos que comprenden la construcción Fab (las cadenas pesadas y ligeras). muestran varias variantes estéricas o "de sesgo" adecuadas de uso en la presente invención. La Figura a6 representa varias variantes estéricas que se pueden usar solas o en combinación con variantes de pI (como es cierto de todas las variantes en la Figura 6); sin embargo, como será apreciado por los expertos en la técnica, si existen variantes de pI, se debe mantener la "naturaleza de las cadenas" de las variantes de pI y las variantes estéricas. Es decir, si se van a combinar, por ejemplo, las variantes de pI S364K/E357Q (monómero 1) y L368D/K370S (monómero 2) con las variantes de la Figura 29C, se debe considerar el pI de las variantes estéricas y asignar al monómero correcto. Es decir, se añaden variantes estéricas que alteran la carga (T411E), por ejemplo, al monómero "negativo".

La Figura 7 representa una lista de variantes de Fc manipuladas de sesgo hacia el heterodímero (por ejemplo "heterodimerización estérica") con rendimientos de heterodímero (determinados por HPLC-CIEX) y estabilidades térmicas (determinadas por DSC). La estabilidad térmica no determinada se indica por "n.d.".

Figura 8A a 8C. Ilustración del formato de "triple F" para inmunoglobulinas biespecíficas. La Figura 8A muestra un formato scFv-Fc. La Figura 8C representa un formato biespecífico más estándar, que también utiliza las variantes de pI de la invención (y opcional e independientemente las otras variantes de heterodimerización). La Figura 8B muestra el formato de "triple F" (algunas veces también denominada la configuración de "abridor de botellas"; (y opcional e independientemente las otras variantes de heterodimerización). Muchas de las realizaciones enumeradas en el presente documento tienen el componente anti-CD3 del anticuerpo biespecífico como el scFv, y el componente anti-CD38 como el fragmento Fab, aunque como será apreciado por los expertos en la técnica, estos se pueden intercambiar, siendo el componente anti-CD38 el scFv, opcionalmente con un conector cargado, y siendo las regiones Fv de scFv de las secuencias anti-CD3 en el presente documento re manipuladas para ser fragmentos Fab.

La Figura 9 representa varias variantes de "inactivación" ("KO") adecuadas para reducir la unión a algunos o todos de los receptores FcyR. Como es cierto para muchas, si no para todas las variantes en el presente documento, estas variantes de KO pueden ser independientemente y opcionalmente combinadas, tanto dentro del conjunto descrito en la Figura 9 como con cualquier variante de heterodimerización brevemente expuesta en el presente documento, que incluye variantes estéricas y de pI. Por ejemplo, se puede combinar E233P/L234V/L235A/G236del con cualquier otra variante simple o doble de la lista. Además, aunque se prefiere en algunas realizaciones que ambos monómeros contengan las mismas variantes de KO, es posible combinar diferentes variantes de KO en diferentes monómeros, así como tener solo un monómero que comprenda la(s) variante(s) KO. También se hace referencia a las figuras y leyendas del documento de patente USSN 61/913.870, ya que se refieren a variantes de "inactivación" o "escisión".

La Figura 10 muestra una lista de variantes de Fc manipuladas de sesgo hacia el heterodímero con rendimientos de heterodímeros (determinados mediante HPLC-CIEX) y estabilidades térmicas (determinadas por DSC). La estabilidad térmica no determinada se indica por "n.d.".

Figura 11. Esquema que muestra la estructura de la molécula biespecífica Anti-CD38 x Anti-CD3

Figura 12. Datos de resonancia de plasmones superficiales (SPR) de moléculas biespecíficas Anti-CD38 x Anti-CD3 de variante manipuladas para afinidad/estabilidad.

Figura 13. Ensayo de citotoxicidad de linfocitos T redirigida con LDH fluorescente (RTCC) que muestra la muerte de células de mieloma múltiple RPMI8226 por moléculas biespecíficas Anti-CD28 x Anti-CD3.

Figura 14. Ensayo RTCC (Anexina V+) que muestra la destrucción de células de mieloma múltiple RPMI8226 por moléculas biespecíficas Anti-CD38 x Anti-CD3. Variaron la relación entre linfocito T y células RPMI8226 y el tiempo de incubación.

Figura 15. Tabla que indica las propiedades de las moléculas biespecíficas Anti-CD38 x Anti-CD3 de variante manipuladas para afinidad/estabilidad. La numeración es según Kabat.

Figura 16. Unión de moléculas biespecíficas Anti-CD38 x Anti-CD3 a células CD20+ de mono cinomolgo (Macaca fascicularis).

Figura 17. Destrucción de células plasmáticas humanas por biespecíficos Anti-CD38 x Anti-CD3 en ratones SCID injertados con CMSPhu. Se observan reducciones significativas en los isotipos IgG2 e IgE humanos. Se muestran media ± EEM para Día 22. BLQ para IgG2 es < 1 pg/mL y para IgE es < 16 ng/mL. A los puntos de datos por debajo de BLQ se les asignó el valor BLQ.

Figura 18. Destrucción de células plasmáticas humanas por biespecíficos Anti-CD38 x Anti-CD3 en ratones SCID injertados con CMSPhu. Se observa una reducción significativa en IgM humana. Se muestran media ± EEM para Día 22. BLQ para IgM es < 0,03 pg/mL. A los puntos de datos por debajo de BLQ se les asignó el valor BLQ.

Figura 19. Empobrecimiento de células CD38+CD138+ en CMSP de MM por anticuerpos biespecíficos Anti-CD38 x Anti-CD3.

La Figura 20A-20Q muestra las secuencias de los abridores de botellas scFv CD38 X CD3 de la invención.

La Figura 21 muestra las variantes de algunos dominios Fc útiles de los abridores de botellas CD38 X CD3.

Las Figuras 22A y 22B representan las secuencias de aminoácidos para los biespecíficos anti-CD38 x anti-CD3 XENP13243 y XENP13551, con las CDRs subrayadas y el conector cargado (que puede no estar cargado o sustituirse por cualquier otro conector cargado, ya sea de forma positiva o negativa, de la Figura 7).

La Figura 23A, 23B, 23C y 23D muestra las secuencias de ADN que codifican los biespecíficos anti-CD38 x anti-CD3 XENP13243 y XENP13551.

La Figura 24 muestra el cuadro de relaciones de transfección de ADN para la generación de conjuntos estables para XENP13243 y XENP13551. Se enumeran cantidades relativas de ADN transfectado para HC-Fab, HC-scFv y LC.

La Figura 25A, 25B, 25C y 25D representan cromatogramas de intercambio catiónico de material purificado con proteína A a partir de sobrenadantes concentrados estables recogidos después de 7 días de cultivo discontinuo para XENP13243 y XENP13551. Las relaciones de transfección de ADN son como se enumeran en la Fig. 24. Se indican las áreas integradas de los picos.

Figura 26. Resumen de diferentes especies de proteínas generadas para conjuntos estables como se identificó por los cromatogramas de intercambio catiónico mostrados en la Fig. 25. Las relaciones de transfección de ADN son como se enumeran en la Fig. 24.

Figura 27. Farmacocinética de los biespecíficos anti-CD38 x anti-CD3 XENP13243 y XENP13551 en ratones C57BL/6 (n = 5 ratones por grupo). Se indican en la leyenda de la figura los valores de semivida calculados mediante análisis no compartimental.

Figura 28. Citotoxicidad de linfocitos T redirigida de células RPMI8226 CD38+. El ensayo consistió en una incubación de 24 h a 37 °C de 10.000 células RPMI8226 con 400.000 linfocitos T humanos purificados. La lectura de la citotoxicidad fue por lactato deshidrogenasa (LDH).

Figura 29. Cinética de la unión de CD38 y CD3 humano y de mono cino a XENP13243 y XENP13551, como se ha determinado por resonancia de plasmones superficiales. El formato del ensayo es como se especificó.

Figura 30. Empobrecimiento de células CD20-CD38+ en monos cinomolgos por XENP13243 (panel superior) y XENP13551 (panel inferior).

Figura 31. Regulación por incremento de CD69 en linfocitos T CD8+ en monos cinomolgos por XENP13243 (panel superior) y XENP13551 (panel inferior).

La Figura 32 representa una lista de regiones constantes de anticuerpos de variante isostéricos y sus sustituciones respectivas. pI_(-) indica variantes de pl más bajo, mientras que pI_(+) indica variantes de pl más alto. Estas se pueden combinar opcional e independientemente con otras variantes de heterodimerización de la invención.

La Figura 33 muestra algunos conectores cargados y datos para scFvs anti-CD3 particulares.

La Figura 34 representa un esquema asociado al uso de variantes de separación, también denominadas en el presente documento "variantes de pl", y combinado con las variantes de ensamblaje de heterodímeros, también denominadas en el presente documento "variantes de sesgo". Estas variantes se pueden usar en un formato de "conectar y utilizar", en el que los efectos de las variantes se transfieren fácilmente a diferentes anticuerpos con diferentes regiones Fv y son muy estables.

La Figura 35 representa la optimización de un scFv-Fc anti-CD3 común. La estabilidad se aumentó en una variedad de formas, que incluyen el reemplazo de aminoácidos raros, el reemplazo de aminoácidos con restos de contacto poco usuales, haciendo manipulación de conectores (para la estabilidad y purificación mejorada, por ejemplo conectores de scFv cargados) y conversión en la orientación VL-VH.

La Figura 36 representa el uso de una inactivación de Fc (o variante de escisión) que retiene la estabilidad no mutante, pero que suprime toda la unión a FcyR.

La Figura 37 representa los datos de destrucción y estabilidad in vitro para un formato de abridor de botellas anti-CD3 X anti-CD38.

La Figura 38 representa la destrucción de una línea celular de mieloma humano. XmAbl 3551 tiene alta afinidad por CD3, mientras que XmAb13243 tiene afinidad más baja. Daratumumab es un anticuerpo monoespecífico bivalente anti-CD38.

La Figura 39 muestra la actividad de semivida larga de los biespecíficos de abridor de botellas de la invención y la supresión correspondiente de Igs humanas en ratones.

La Figura 40 muestra las funciones anti-CD38 X anti-CD3 de XmAb13551 y XmAb13243, que incluyen el empobrecimiento de células CD38+ de mono en sangre y médula ósea.

La Figura 41 muestra que el empobrecimiento de células CD38+ se correlaciona con la redistribución y activación de linfocitos T.

La Figura 42 muestra el desarrollo de una línea celular estable para la producción de XmAb13551 (alta afinidad por CD3) y sus rendimientos correspondientes.

La Figura 43 muestra cierta optimización del cultivo celular para rendimiento mejorado, obteniéndose títulos de >3 g/L, no observándose diferencia significativa en las relaciones heterodímero / homodímero durante la ampliación.

La Figura 44 muestra los resultados analíticos del proceso de fabricación de tres etapas. El proceso produce altos rendimientos, superiores a 55 %, de moléculas biespecíficas heterodiméricas muy puras, y elimina eficazmente contaminantes homodiméricos, HMW y LMW, así como HCP.

La Figura 45A-45U muestra una variedad de formatos de heterodimerización adicionales, cualquiera de los cuales puede incluir las secuencias anti-CD3 y anti-CD38 de la invención. Las Figuras 45A a 45U representan una amplia variedad de los formatos multiespecíficos (por ejemplo, heterodimerización) y las combinaciones de diferentes tipos de variantes de heterodimerización que se pueden usar en la presente invención (estas se denominan algunas veces en el presente documento "armazones heterodiméricos"). Obsérvese además que todos estos formatos pueden incluir variantes de adición en la región Fc, como se trata más completamente a continuación, que incluyen variantes de "escisión" o "inactivación" (Figura 7), variantes de Fc para alterar la unión de FcyR (FcYRIIb, FcYRIIIa, etc.), variantes de Fc para alterar la unión al receptor FcRn, etc. La Figura 45A muestra un formato de scFv-Fc doble que, en cuanto a todos los formatos de heterodimerización en el presente documento, puede incluir variantes de heterodimerización tales como variantes de pI, botones en ojales (KIH, también denominado en el presente documento variantes estéricas o variantes "de sesgo"), pares de cargas (un subconjunto de variantes estéricas), variantes isostéricas, y cuerpo SEED ("dominio manipulado de intercambio de cadenas"; véase Klein et al., mAbs 4:6653-663 (2012) y Davis et al., Protein Eng Des Sel 201023:195-202) que se basan en el hecho de que los dominios CH3 de IgG e IgA humanas no se unen entre sí. La Figura 45B representa una IgG biespecífica, nuevamente con la opción de una variedad de variantes de heterodimerización. La Figura 45C representa la versión de "un brazo" de DVD-Ig que utiliza dos dominios pesados variables y ligeros variables diferentes. La Figura 45D es similar, excepto que en vez de un "brazo vacío", las cadenas pesadas y ligeras variables están en cadenas pesadas opuestas. La Figura 45E se denomina, en general, "mAb-Fv". La Figura 45F representa un formato multi-scFv; como será apreciado por los expertos en la técnica, similar a los formatos "A, B, C, D" tratados en el presente documento, puede ser cualquier número de scFvs asociados (o, para el caso, cualquier otro ligando o funcionalidad de unión). Así, la Figura 45F podría tener 1, 2, 3 o 4 scFvs (por ejemplo, para biespecíficos, los scFv podrían estar en "cis" o "trans", o ambos, en un "extremo" de la molécula). La Figura 45G representa un Fab-Fc heterodimérico estando el Fab formado por dos cadenas pesadas diferentes, una que contiene secuencias Fab de cadena pesada y la otra que contiene secuencias Fab de cadena ligera. La Figura 45H representa "Fab-Fc de un brazo", donde una cadena pesada comprende Fab. La Figura 45I representa un "scFv-Fc de un brazo", en donde un Fc de cadena pesada comprende un scFv y la otra cadena pesada está "vacía". La Figura 45J muestra scFv-CH3, en donde solo se usan regiones CH3 de cadena pesada, cada una con su propio scFv. La Figura 45K representa un mAb-scFv, en donde un extremo de la molécula acopla un antígeno de forma bivalente con un acoplamiento monovalente usando un scFv en una de las cadenas pesadas. La Figura 45L representa la misma estructura, excepto que ambas cadenas pesadas comprenden un scFv adicional, que se puede o bien unir al mismo antígeno o a diferentes antígenos. La Figura 45M muestra la estructura "CrossMab", donde el problema de la formación de múltiplex debido a dos cadenas ligeras diferentes se trata por secuencias de conmutación en la porción Fab. La Figura 45N representa scFv, la Figura 45O es "BiTE" o scFv-scFv unido por un conector como se expone brevemente en el presente documento, la Figura 45P representa DART, la Figura 45Q representa TandAb, y la Figura 45R muestra un diacuerpo. Las Figuras 45S, 45T y 45U representan formatos de armazón alternativo adicional que encuentran uso en la presente invención.

Las Figuras 46A, 46B y 46C representan scFv de variante anti-CD3 humanizados de estabilidad optimizada. Se proporcionan sustituciones con respecto a la secuencia de scFv H1.1_L1.4. La numeración de aminoácidos es la numeración de Kabat.

Figuras 47A y 47B. Las cadenas pesadas variables y ligeras variables para secuencias anti-CD3 de uso en la presente invención incluyen secuencias de unión tanto "fuertes" como "inferiores". Como será apreciado por los expertos en la técnica, éstas se pueden usar en construcciones de Fab o scFv en combinación con cualquier dominio de unión a antígeno tumoral diana.

La Figura 48 muestra afinidades de unión en un ensayo Biacore.

La Figura 49 muestra la pureza del heterodímero durante la generación de conjuntos estables usando relaciones variadas de cadena ligera, Fab-Fc, y scFv-Fc.

Figura 50. Empobrecimiento de IgM e IgG2 humanas por biespecíficos anti-CD38 x anti-CD3 en un modelo de CMSPhu de ratón.

La Figura 51A y 51B muestran la purificación de XENP13243 y XENP13551 que se diseñan con baja y alta afinidad, respectivamente, por CD38.

La Figura 52A, 52B y 52C muestran la unión a CD38 y CD3 humanos y de mono, y Kd.

La Figura 53 muestra la destrucción de células de mieloma.

La Figura 54 muestra que los linfocitos T son destructores en serie incluso cuando son superados en cantidad por las células diana.

La Figura 55 muestra que el dominio Fc prolonga la semivida.

La Figura 56 muestra la dosificación para el experimento de la Figura 14.

La Figura 57 muestra mayor empobrecimiento de hIg frente a daratumumab.

La Figura 58 muestra la dosificación para el experimento de la Figura 16.

Figura 59A y 59B. Los biespecíficos empobrecen células CD38+ en sangre y órganos linfoides en monos. Figuras 60A, 60B y 60C. La Figura 60A (redistribución de sangre), Figura 60B (inducción de CD69) y Figura 60C (liberación de citocinas) muestran que el empobrecimiento de células CD38+ se correlaciona con la redistribución y la activación de linfocitos T.

La Figura 61 representa varias realizaciones de uso particular en la presente invención.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

I. Visión general

La presente invención se refiere a novedosas construcciones para proporcionar anticuerpos biespecíficos que se unen a tanto antígenos CD3 como CD38. Un problema actual en las tecnologías de anticuerpos es el deseo de anticuerpos "biespecíficos" (y/o multiespecíficos) que se unen a dos (o más) antígenos diferentes simultáneamente, permitiendo así en general que los diferentes antígenos se acerquen y den como resultado nuevas funcionalidades y nuevas terapias. En general, estos anticuerpos se producen incluyendo genes para cada cadena pesada y ligera en las células hospedadoras. Esto da generalmente como resultado la formación del heterodímero deseado (A-B), así como los dos homodímeros (A-A y B-B). Sin embargo, un gran obstáculo en la formación de anticuerpos multiespecíficos es la dificultad de purificar los anticuerpos heterodiméricos de los anticuerpos homodiméricos y/o predisponer la formación de los heterodímeros en lugar de la formación de los homodímeros.

La presente invención se refiere, en general, a la creación de proteínas heterodiméricas tales como anticuerpos que se pueden co-acoplar a antígenos en varias formas, que se basan en variantes de aminoácidos en las regiones constantes que son diferentes en cada cadena para promover la formación heterodimérica y/o permitir la facilidad de purificación de heterodímeros con respecto a los homodímeros.

Así, la presente invención se refiere a novedosas composiciones de inmunoglobulina que se co-acoplan a al menos un primer y un segundo antígeno. Los primeros y segundos antígenos de la invención se denominan en el presente documento antígeno-1 y antígeno-2, respectivamente. Una cadena pesada del anticuerpo contiene un Fv de cadena simple ("scFv", como se define más adelante) y la otra cadena pesada es un formato FAb "regular", que comprende una cadena pesada variable y una cadena ligera. Esta estructura se denomina algunas veces en el presente documento formato de "triple F" (scFv-FAb-Fc) o el formato de "abridor de botellas", debido a una similitud visual aproximada a un abridor de botellas (Figura 8B). Las dos cadenas se juntan usando variantes de aminoácidos en las regiones constantes (por ejemplo, el dominio Fc y/o la región bisagra) que promueven la formación de anticuerpos heterodiméricos como se describe más completamente a continuación.

Existen varias ventajas distintas en el presente formato de "triple F". Como se conoce en la técnica, los análogos de anticuerpos que se basan en dos construcciones de scFv frecuentemente tienen problemas de estabilidad y agregación, que se pueden aliviar en la presente invención mediante la adición de un emparejamiento "regular" de cadenas pesadas y ligeras. Además, a diferencia de los formatos que se basan en dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras, no hay problemas con el par incorrecto de las cadenas pesadas y ligeras (por ejemplo, emparejamiento de pesada 1 con ligera 2, etc.)

Existen varios mecanismos que se pueden usar para generar los heterodímeros de la presente invención. Además, como se apreciará por los expertos en la técnica y se describirá más completamente a continuación, estos mecanismos se pueden combinar para garantizar la alta heterodimerización.

También se puede usar opcionalmente un mecanismo que se denomina en general en la técnica "botones en ojales" ("KlH"), o algunas veces en el presente documento variantes "de sesgo", con referencia a la ingeniería de aminoácidos que crea influencias estéricas para favorecer la formación heterodimérica y desfavorecer la formación homodimérica; esto se denomina algunas veces "botones en ojales", como se describe en USSN 61/596.846, Ridgway et al., Protein Engineering 9(7):617 (1996); Atwell et al., J. Mol. Biol. 1997270:26; patente de EE. UU. N28.216.805.

Las figuras identifican varios pares "monómero A - monómero B" que se basan en "botones en ojales". Además, como se describe en Merchant et al., Nature Biotech. 16:677 (1998), estas mutaciones de "botones en ojales" se pueden combinar con enlaces disulfuro para sesgar la formación hacia la heterodimerización.

Un mecanismo adicional que encuentra uso en la generación de heterodímeros se denomina algunas veces "orientación por interacción electrostática" como se describe en Gunasekaran et al., J. Biol. Chem. 285(25): 19637 (2010). Esto se denomina algunas veces en el presente documento "pares de carga". En esta realización, se usan interacciones electrostáticas para sesgar la formación hacia la heterodimerización. Como apreciarán los expertos en la técnica, estos también pueden tener un efecto sobre el pl, y así sobre la purificación, y así también se podrían considerar en algunos casos variantes de pl. Sin embargo, como estos se generaron para formar la heterodimerización y no se usaron como herramientas de purificación, se clasifican como "variantes estéricas". Estas incluyen, pero no se limitan a, D221E/P228E/L368E emparejado con D221R/P228R/K409R (por ejemplo, estos son "conjuntos de monómeros correspondientes") y C220E/P228E/368E emparejado con C220R/E224R/P228R/K409R. (Obsérvese que la mutación 220 es para retirar una cisteína que ya no se necesita para la formación de disulfuro de la cadena pesada y ligera, como se describirá más completamente más adelante).

En la presente invención, existen varios mecanismos básicos que pueden conducir a facilitar la purificación de proteínas heterodiméricas; uno se basa en el uso de variantes de pl, de forma que cada monómero tenga un pl diferente, permitiendo así la purificación isoeléctrica de las proteínas diméricas A-A, A-B y B-B. Alternativamente, el formato de "triple F" también permite la separación basándose en el tamaño. Como se expone adicionalmente a continuación, también es posible "sesgar" la formación de heterodímeros con respecto a los homodímeros, como, en general, se expone brevemente a continuación. Así, una combinación de variantes estéricas de heterodimerización y variantes de pl o de pares de carga encuentra uso particular en la invención. Además, como se expone brevemente más completamente a continuación, el monómero scFv del formato de triple F puede incluir conectores de scFv cargados (tanto positivos como negativos), que dan un refuerzo de pl adicional para fines de purificación. Como será apreciado por los expertos en la técnica, algunos formatos de triple F son útiles con solo conectores de scFv cargados y ningún ajuste de pl adicional, aunque la invención también proporciona el uso de variantes de sesgo con conectores de scFv cargados (y combinaciones de Fc, FcRn y variantes KO).

En la presente invención que utiliza pl como mecanismo de separación para crear el formato de triple F heterodimérico, se pueden introducir variantes de aminoácidos en uno o ambos de los polipéptidos monoméricos; es decir, el pl de uno de los monómeros (denominado en el presente documento por simplicidad el "monómero A") se puede extraer del monómero B, o se puede cambiar el cambio tanto del monómero A como B, aumentando el pl del monómero A y disminuyendo el pl del monómero B. Como se expone brevemente más completamente más adelante, se pueden hacer cambios de pl de cualquiera o ambos monómeros retirando o añadiendo un resto cargado (por ejemplo, se sustituye un aminoácido neutro por un resto de aminoácido positiva o negativamente cargado, por ejemplo glicina por ácido glutámico), cambiando un resto cargado de carga positiva o negativa a la carga opuesta (ácido aspártico por lisina), o cambiando un resto cargado por un resto neutro (por ejemplo, pérdida de una carga; lisina por serina). Varias de estas variantes se muestran en las figuras.

Por consiguiente, en esta realización de la presente invención se proporciona crear un cambio suficiente en el pl en al menos uno de los monómeros de forma que se puedan separar los heterodímeros de los homodímeros. Como será apreciado por los expertos en la técnica, y como se trata más adelante, esto se puede hacer usando una región constante de la cadena pesada "no mutante" y una región de variante que se ha manipulado para o aumentar o disminuir su pl (A- wt B o A- wt - B), o aumentando una región y disminuyendo la otra región (A+ -B- o A- B+). Se debe observar que en esta discusión no importa qué monómero comprende scFv y cuál Fab.

Así, en general, un componente de la presente divulgación son variantes de aminoácido en las regiones constantes de anticuerpos que se orientan para alterar el punto isoeléctrico (pl) de al menos uno, si no ambos, de los monómeros de una proteína dimérica para formar "heterodímeros de pl" (cuando la proteína es un anticuerpo, estos se denominan "anticuerpos de pl") incorporando sustituciones de aminoácidos ("variantes de pl" o "sustituciones de pl") en uno o ambos de los monómeros. Como se muestra en el presente documento, la separación de los heterodímeros de los dos homodímeros se puede llevar a cabo si los pls de los dos monómeros se diferencian en tan solo 0,1 unidades de pH, encontrando todos de 0,2, 0,3, 0,4 y 0,5 o mayor uso en la presente invención.

Como será apreciado por los expertos en la técnica, el número de variantes de pI a incluir en cada uno o ambos de los monómeros para conseguir una buena separación dependerá en parte del pI inicial del scFv y Fab de interés. Es decir, para determinar qué monómero manipular o en qué "dirección" (por ejemplo, más positivo o más negativo), se calculan las secuencias de Fv de los dos antígenos diana y se toma una decisión a partir de esto. Como se conoce en la técnica, diferentes Fvs tendrán diferentes pIs iniciales que son explotados en la presente invención. En general, como se expone brevemente en el presente documento, los pIs se manipulan para dar como resultado una diferencia de pI total de cada monómero de al menos aproximadamente 0,1 logs, siendo preferidos 0,2 a 0,5 como se expone brevemente en el presente documento.

Además, como será apreciado por los expertos en la técnica y se expondrá brevemente en el presente documento, se pueden separar heterodímeros de homodímeros basándose en el tamaño. Por ejemplo, como se muestra en la Figura 8, se pueden separar heterodímeros con dos scFvs (Figura 8A) por los del formato de "triple F" (Figura 8B) y un mAb biespecífico (Figura 8C). Esto se puede explotar además con mayor valencia utilizando sitios de unión al antígeno adicionales. Por ejemplo, como se muestra adicionalmente, un monómero tendrá dos fragmentos Fab y el otro tendrá un scFv, dando como resultado una diferencia en el tamaño y así el peso molecular.

Además, como será apreciado por los expertos en la técnica y se expondrá brevemente en el presente documento, el formato brevemente expuesto en el presente documento se puede expandir para también proporcionar anticuerpos triespecíficos y tetraespecíficos. En esta realización, de la cual algunas variaciones se representan en las figuras, se reconocerá que es posible que algunos antígenos se unan de forma divalente (por ejemplo, dos sitios de unión al antígeno para un solo antígeno; por ejemplo, A y B podrían ser parte de una asociación bivalente típica y C y D pueden estar opcionalmente presentes y ser opcionalmente iguales o diferentes). Como se apreciará, se puede utilizar cualquier combinación de Fab y scFvs para lograr el resultado y las combinaciones deseadas.

En el caso en el que se usen variantes de pI para lograr la heterodimerización, usando la o las regiones constantes de la o las cadenas pesadas, se proporciona un enfoque más modular para diseñar y purificar proteínas multiespecíficas, que incluyen anticuerpos. Así, en algunas realizaciones, no se incluyen variantes de heterodimerización (incluyendo variantes de heterodimerización de sesgo y de purificación) en las regiones variables, de forma que se debe manipular cada anticuerpo individual. Además, en algunas realizaciones, la posibilidad de inmunogenicidad resultante de las variantes de pI se reduce significativamente importando variantes de pI de diferentes isotipos de IgG de forma que cambie el pI sin introducir inmunogenicidad significativa. Así, un problema adicional a ser resuelto es la elucidación de dominios constantes de pl bajo con alto contenido de secuencia humana, por ejemplo minimizar o evitar restos no humanos en cualquier posición particular.

En una realización, el anticuerpo heterodimérico proporciona el acoplamiento monovalente de un antígeno usando un scFv y acoplamiento monovalente del otro antígeno usando un FAb. Como se expone brevemente más adelante, también se puede variar este formato; en algunas realizaciones, existe acoplamiento monovalente de tres antígenos, acoplamiento divalente de un antígeno y acoplamiento monovalente de un segundo antígeno (por ejemplo, A y C son para el mismo antígeno y B es para un antígeno diferente), etc.

Un beneficio adicional que puede ocurrir con esta manipulación del pI también es la prolongación de la semivida en suero y la elevada unión de FcRn. Es decir, como se describe en el documento de patente US 2012/0028304, reducir el pl de los dominios constantes del anticuerpo (incluyendo los encontrados en anticuerpos y fusiones de Fc) puede conducir a una retención más prolongada en el suero in vivo. Estas variantes de pI para una semivida en suero aumentada también facilitan los cambios de pI para la purificación.

Además, como se expone brevemente en el presente documento, se pueden introducir variantes de aminoácidos adicionales en los anticuerpos biespecíficos de la invención, para añadir funcionalidades adicionales. Por ejemplo, se pueden añadir cambios de aminoácido dentro de la región Fc (ya sea a un monómero o a ambos) para facilitar la elevada ADCC o CDC (por ejemplo, unión alterada a receptores de Fcy); para permitir o aumentar el rendimiento de la adición de toxinas y fármacos (por ejemplo, para ADC), así como para aumentar la unión a FcRn y/o aumentar la semivida en suero de las moléculas resultantes. Como se describe adicionalmente en el presente documento y como será apreciado por los expertos en la técnica, todas y cada una de las variantes brevemente expuestas en el presente documento se puede combinar opcional e independientemente con otras variantes.

Similarmente, otra categoría de variantes funcionales son "variantes de escisión de Fcy" o variantes de "inactivación de Fc (FcKO o KO). En estas realizaciones, para algunas aplicaciones terapéuticas, se desea reducir o retirar la unión normal del dominio Fc a uno o más o todos de los receptores de Fcy (por ejemplo, FcyR1 , FcYRIIa, FcYRIIb, FcYRIIIa, etc.) para evitar mecanismos de acción adicionales. Es decir, por ejemplo, en muchas realizaciones, en general, se desea escindir la unión de FcYRIIIa para eliminar o reducir significativamente la actividad de ADCC.

Además, la divulgación proporciona novedosas secuencias anti-CD3 humanizadas, que incluyen conjuntos de CDRs, cadenas ligeras y pesadas variables completas, así como los scFvs asociados, que opcionalmente pueden incluir conectores de scFv cargados. Estas secuencias optimizadas se pueden usar en otros formatos de anticuerpo.

La divulgación proporciona además novedosas secuencias anti-CD38, que incluyen conjuntos de CDRs, cadenas ligeras y pesadas variables completas, así como los scFvs asociados, que opcionalmente pueden incluir conectores de scFv cargados. Estas secuencias optimizadas se pueden usar en otros formatos de anticuerpo.

Por consiguiente, la presente invención proporciona novedosas construcciones para producir anticuerpos bivalentes específicos que se unen tanto a CD3 como a CD38.

Además, la presente invención proporciona dominios de unión al antígeno de diferentes afinidades. Es decir, en algunas indicaciones, se pueden preferir afinidades más fuertes, mientras que en otras, pueden encontrar uso afinidades más bajas, para tanto secuencias anti-CD3 como anti-CD38. Por consiguiente, en algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona construcciones de anticuerpo que comprenden dominios de unión al antígeno anti-CD3 que son ligantes "fuertes" o de "alta afinidad" por CD3 (por ejemplo, un ejemplo son dominios variables pesados y ligeros presentados como H1.30_L1.47 (que opcionalmente incluyen un conector cargado según convenga)). En otras realizaciones, la presente divulgación proporciona construcciones de anticuerpo que comprenden dominios de unión al antígeno anti-CD3 que son ligantes "débiles" o de "menor afinidad" por CD3, como se muestra en la Figura 47.

II. Definiciones

Con el fin de que la solicitud se pueda entender más completamente, se exponen a continuación varias definiciones. Dichas definiciones pretenden englobar equivalentes gramaticales.

Por "escisión" en el presente documento se indica una disminución o eliminación de actividad. Así, por ejemplo, "escisión de la unión de FcyR" significa que la variante de aminoácidos de la región Fc tiene menos de 50 % de unión inicial en comparación con una región Fc que no contiene la variante específica, prefiriéndose menos de 70-80-90-95 98 % de pérdida de actividad, y en general, estando la actividad por debajo del nivel de unión detectable en un ensayo Biacore. Las variantes de uso particular cuando se usan variantes de escisión (también denominadas algunas veces en el presente documento "variantes de escisión de FcyR", "variantes de escisión de Fc", "inactivaciones de Fc" ("FcKO") o "variantes de inactivación" ("KO")) son las representadas en la Figura 35.

Por "ADCC" o "citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo", como se usa en el presente documento, se indica la reacción mediada por células en donde células citotóxicas no específicas que expresan FcyRs reconocen anticuerpo unido a una célula diana y posteriormente provocan la lisis de la célula diana. La ADCC se correlaciona con la unión a FcYRIIIa; el aumento de la unión a FcyRII Ia conduce a un aumento en la actividad de ADCC.

Por "ADCP" o fagocitosis mediada por células dependiente de anticuerpo, como se usa en el presente documento, se indica la reacción mediada por células en la que células citotóxicas no específicas que expresan FcyRs reconocen anticuerpo unido a una célula diana y posteriormente provocan la fagocitosis de la célula diana.

Por "modificación" se indica en el presente documento una sustitución, inserción y/o deleción de aminoácidos en una secuencia de polipéptidos o una alteración en un resto químicamente unido a una proteína. Por ejemplo, una modificación puede ser un hidrato de carbono alterado o una estructura de PEG unida a una proteína. Por "modificación de aminoácidos" se indica en el presente documento una sustitución, inserción y/o deleción de aminoácidos en una secuencia de polipéptidos. Para mayor claridad, a menos que se indique lo contrario, la modificación de aminoácidos siempre es a un aminoácido codificado por ADN, por ejemplo los 20 aminoácidos que tienen codones en ADN y ARN.

Por "sustitución de aminoácidos" o "sustitución" se indica en el presente documento la sustitución de un aminoácido en una posición particular en una secuencia de polipéptidos principal con un aminoácido diferente. En particular, en algunas realizaciones, la sustitución es a un aminoácido que no existe de forma natural en la posición particular, o que no existe de forma natural dentro del organismo o en ningún organismo. Por ejemplo, la sustitución E272Y se refiere a un polipéptido de variante, en este caso una variante de Fc, en la que el ácido glutámico en la posición 272 se sustituye por tirosina. Para mayor claridad, una proteína que ha sido manipulada para cambiar la secuencia codificante de ácidos nucleicos, pero no cambiar el aminoácido inicial (por ejemplo, intercambiar CGG (que codifica arginina) por CGA (que también codifica arginina) para aumentar los niveles de expresión en el organismo hospedador) no es una "sustitución de aminoácidos"; es decir, a pesar de la creación de un nuevo gen que codifica la misma proteína, si la proteína tiene el mismo aminoácido en la posición particular con la que empezó, no es una sustitución de aminoácidos.

Por "inserción de aminoácido" o "inserción", como se usa en el presente documento, se indica la adición de una secuencia de aminoácidos en una posición particular en una secuencia de polipéptidos principal. Por ejemplo, - 233E o 233E designa una inserción de ácido glutámico después de la posición 233 y antes de la posición 234. Además, -233ADE o A233ADE designa una inserción de AlaAspGlu después de la posición 233 y antes de la posición 234.

Por "deleción de aminoácido" o "deleción", como se usa en el presente documento, se indica la retirada de una secuencia de aminoácidos en una posición particular en una secuencia de polipéptidos principal. Por ejemplo, G236-o G236# o G236del designa una deleción de glicina en la posición 236. Además, EDA233- o EDA233# designa una deleción de la secuencia GluAspAla que empieza en la posición 233. Similarmente, algunas de las variantes de heterodimerización incluyen "K447del", que significa que se ha delecionado la lisina en la posición 447.

Por "proteína de variante" o "variante de proteína", o "variante", como se usan en el presente documento, se indica una proteína que se diferencia de una proteína principal en virtud de al menos una modificación de aminoácidos. Variante de proteína se puede referir a la proteína en sí, una composición que comprende la proteína, o la secuencia de aminoácidos que la codifica. Preferentemente, la variante de proteína tiene al menos una modificación de aminoácidos en comparación con la proteína principal, por ejemplo desde aproximadamente una hasta aproximadamente setenta modificaciones de aminoácidos, y preferentemente desde aproximadamente una hasta aproximadamente cinco modificaciones de aminoácidos en comparación con la principal. Como se describe más adelante, en algunas realizaciones, el polipéptido principal, por ejemplo un polipéptido principal de Fc, es una secuencia no mutante humana, tal como la región Fc de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4, aunque secuencias humanas con variantes también pueden servir de "polipéptidos principales". La secuencia de variante de proteína en el presente documento poseerá preferentemente al menos aproximadamente 80 % de identidad con una secuencia de proteínas principal, y lo más preferentemente al menos aproximadamente 90 % de identidad, más preferentemente al menos aproximadamente 95-98-99 % de identidad. La proteína de variante se puede referir a la proteína de variante en sí, composiciones que comprenden la variante de proteína, o la secuencia de ADN que la codifica. Por consiguiente, por "variante de anticuerpo" o "anticuerpo de variante", como se usa en el presente documento, se indica un anticuerpo que se diferencia de un anticuerpo principal en virtud de al menos una modificación de aminoácidos, "variante de IgG" o "IgG de variante" como se usa en el presente documento indica un anticuerpo que se diferencia de una IgG principal (nuevamente, en muchos casos, de una secuencia de IgG humana) en virtud de al menos una modificación de aminoácidos, y "variante de inmunoglobulina" o "inmunoglobulina de variante", como se usa en el presente documento, indica una secuencia de inmunoglobulina que se diferencia de una secuencia de inmunoglobulina principal en virtud de al menos una modificación de aminoácidos. "Variante de Fc" o "Fc de variante", como se usa en el presente documento, indica una proteína que comprende una modificación de aminoácidos en un dominio Fc. Las variantes de Fc de la presente invención se definen según las modificaciones de aminoácidos que las componen. Así, por ejemplo, N434S o 434S es una variante de Fc con la sustitución serina en la posición 434 con respecto al polipéptido de Fc principal, en donde la numeración es según el índice EU. Asimismo, M428L/N434S define una variante de Fc con las sustituciones M428L y N434S con respecto al polipéptido de Fc principal. La identidad del aminoácido WT puede no estar especificada, en cuyo caso la variante anteriormente mencionada se denomina 428L/434S. Se observa que el orden en el que se proporcionan las sustituciones es arbitrario, es decir, que, por ejemplo, 428L/434S es la misma variante de Fc que M428L/N434S, etc. Para todas las posiciones tratadas en la presente invención que se refieren a anticuerpos, a menos que se indique lo contrario, la numeración de la posición del aminoácido es según el índice EU. El índice EU o índice EU como en Kabat o esquema de numeración EU se refiere a la numeración del anticuerpo EU (Edelman et al., 1969, Proc Natl Acad Sci USA 63:78-85). La modificación puede ser una adición, deleción o sustitución. Las sustituciones pueden incluir aminoácidos que existen de forma natural y, en algunos casos, aminoácidos sintéticos. Los ejemplos incluyen la patente de EE. UU. N° 6.586.207; documentos de patente WO 98/48032; WO 03/073238; US2004-0214988A1; WO 05/35727A2; WO 05/74524A2; J. W. Chin et al., (2002), Journal of the American Chemical Society 124:9026-9027; J. W. Chin, & P. G. Schultz, (2002), ChemBioChem 11:1135-1137; J. W. Chin, et al., (2002), PICAS United States of America 99:11020-11024; y, L. Wang, & P. G. Schultz, (2002), Chem.

1-10.

Como se usa en el presente documento, "proteína" en el presente documento indica al menos dos aminoácidos covalentemente unidos, que incluyen proteínas, polipéptidos, oligopéptidos y péptidos. El grupo peptidilo puede comprender aminoácidos que existen de forma natural y enlaces peptídicos, o estructuras peptidomiméticas sintéticas, es decir, "análogos", tales como peptoides (véase Simon et al., PNAS USA 89(20):9367 (1992)). Los aminoácidos pueden o existir de forma natural o ser sintéticos (por ejemplo, un aminoácido que no es codificado por ADN); como será apreciado por los expertos en la técnica. Por ejemplo, homo-fenilalanina, citrulina, ornitina y norleucina se consideran aminoácidos sintéticos a efectos de la invención, y se pueden utilizar aminoácidos configurados tanto D-como L-(R o S). Las variantes de la presente invención pueden comprender modificaciones que incluyen el uso de aminoácidos sintéticos incorporados usando, por ejemplo, las tecnologías desarrolladas por Schultz y colaboradores, que incluyen, pero no se limitan a, los métodos descritos por Cropp & Shultz, 2004, Trends Genet. 20(12):625-30, Anderson et al., 2004, Proc Natl Acad Sci USA 101 (2):7566-71, Zhang et al., 2003, 303(5656):371-3, y Chin et al., 2003, Science 301 (5635):964-7. Además, los polipéptidos pueden incluir derivatización sintética de una o más cadenas laterales o extremos, glucosilación, PEGilación, permutación circular, ciclación, conectores con otras moléculas, fusión con proteínas o dominios de proteína, y adición de marcadores o etiquetas de péptidos.

Por "residuo", como se usa en el presente documento, se indica una posición en una proteína y su identidad de aminoácido asociada. Por ejemplo, Asparagina 297 (también denominada Asn297 o N297) es un resto en la posición 297 en el anticuerpo humano IgG1.

Por "Fab" o "región Fab", como se usa en el presente documento, se indica el polipéptido que comprende los dominios de inmunoglobulina VH, CH1, VL y CL. Fab se puede referir a esta región en aislamiento, o esta región en el contexto de un anticuerpo de longitud completa, fragmento de anticuerpo o proteína de fusión de Fab. Por "Fv" o "fragmento Fv" o "región Fv", como se usa en el presente documento, se indica un polipéptido que comprende los dominios VL y VH de un único anticuerpo.

Por "modificación de subclase de IgG" o "modificación de isotipo", como se usa en el presente documento, se indica una modificación de aminoácidos que convierte un aminoácido de un isotipo IgG en el aminoácido correspondiente en un isotipo IgG alineado diferente. Por ejemplo, debido a que IgG1 comprende una tirosina e IgG2 una fenilalanina en la posición EU 296, una sustitución F296Y en IgG2 se considera una modificación de subclase de IgG.

Por "modificación que no existe de forma natural", como se usa en el presente documento, se indica una modificación de aminoácidos que no es isotípica. Por ejemplo, debido a que ninguna de las IgGs comprende una serina en la posición 434, la sustitución 434S en IgG 1, IgG2, IgG3, o IgG4 (o híbridos de las mismas) se considera una modificación que no existe de forma natural. Modificaciones "isotípicas" se refiere a la importación de un aminoácido de isotipo en una posición en el esqueleto de un isotipo diferente; por ejemplo, la importación de un aminoácido de IgG1 en un esqueleto de IgG2 en la misma posición.

Por "aminoácido" e "identidad de aminoácidos", como se usa en el presente documento, se indica uno de los 20 aminoácidos que existen de forma natural que son codificados por ADN y ARN.

Por "función efectora", como se usa en el presente documento, se indica un evento bioquímico que resulta de la interacción de una región Fc de anticuerpo con un receptor de Fc o ligando. Las funciones efectoras incluyen, pero no se limitan a, ADCC, ADCP y CDC.

Por "ligando de Fc de IgG", como se usa en el presente documento, se indica una molécula, preferentemente un polipéptido, de cualquier organismo que se une a la región Fc de un anticuerpo IgG para formar un complejo Fc/ligando de Fc. Los ligandos de Fc incluyen, pero no se limitan a, FcyRIs, FcyRIIs, FcyRIIIs, FcRn, C1q, C3, lectina de unión a manano, receptor de manosa, proteína A estafilocócica, proteína G estreptocócica y FcyR viral. Los ligandos de Fc también incluyen homólogos del receptor de Fc (FcRH), que son una familia de receptores de Fc que son homólogos a los FcyRs (Davis et al., 2002, Immunological Reviews 190:123-136). Los ligandos de Fc pueden incluir moléculas todavía no descubiertas que se unen a Fc. Los ligandos de Fc de IgG particulares son FcRn y receptores Fc gamma. Por "ligando de Fc", como se usa en el presente documento, se indica una molécula, preferentemente un polipéptido, de cualquier organismo que se une a la región Fc de un anticuerpo para formar un complejo Fc/ligando de Fc.

Por "receptor de Fc gamma", "FcyR" o "FcgammaR", como se usa en el presente documento, se indica cualquier miembro de la familia de proteínas que se unen a la región Fc del anticuerpo IgG y es codificado por un gen FcyR. En los seres humanos, esta familia incluye, pero no se limita a, FcyRI (CD64), que incluye las isoformas FcYRIa, FcYRIb y FcyRIc; FcyRII (CD32), que incluye las isoformas FcyRIIa (incluyendo los alotipos H131 y R131), FcyRIIb (incluyendo FcYRIIb-1 y FcYRIIb-2) y FcyRIIc; y FcyRIII (CD16), que incluyen las isoformas FcYRIIIa (incluyendo los alotipos V158 y F158) y FcYRIIIb (incluyendo los alotipos FcYRIIb-NA1 y FcYRIIb-NA2) (Jefferis et al., 2002, Immunol Lett 82:57-65), así como cualquier FcyRs humana no descubierta o isoformas o alotipos de FcyR. Un FcyR puede ser de cualquier organismo, que incluye, pero no se limita a, seres humanos, ratones, ratas, conejos y monos. Los FcyRs de ratón incluyen, pero no se limitan a, FcyRI (CD64), FcyRII (CD32), FcyRIII (CD16), y FcyRIII-2 (CD16-2), así como cualquier FcyRs de ratón no descubierto o isoformas o alotipos de FcyR.

Por "FcRn" o "receptor de Fc neonatal", como se usa en el presente documento, se indica una proteína que se une a la región Fc del anticuerpo IgG y es codificado al menos en parte por un gen FcRn. El FcRn puede ser de cualquier organismo, que incluye, pero no se limita a, seres humanos, ratones, ratas, conejos y monos. Como se conoce en la técnica, la proteína FcRn funcional comprende dos polipéptidos, frecuentemente denominados la cadena pesada y la cadena ligera. La cadena ligera es beta-2-microglobulina y la cadena pesada está codificada por el gen FcRn. A menos que se indique lo contrario en el presente documento, FcRn o una proteína FcRn se refiere al complejo de cadena pesada de FcRn con beta-2-microglobulina. Se usan una variedad de variantes de FcRn para aumentar la unión al receptor FcRn, y en algunos casos, para aumentar la semivida en suero. Las variantes de Fc que confieren elevada unión al receptor FcRn y aumentos correspondientes en la semivida en suero incluyen, pero no se limitan a, 434A, 434S, 428L, 308F, 259I, 428L/434S, 259I/308F, 436I/428L, 436I o V/434S, 436V/428L, 252Y, 252Y/254T/256E y 259I/308F/428L. Es decir, el formato de triple F de la Figura 8B puede tener cualquiera de estas variantes de FcRn en cualquier o ambas secuencias de monómeros. Por claridad, como cada cadena pesada es diferente, las variantes de FcRn (así como las variantes de Fc) pueden residir en uno o ambos monómeros.

Por "polipéptido principal", como se usa en el presente documento, se indica un polipéptido inicial que posteriormente se modifica para generar una variante. El polipéptido principal puede ser un polipéptido que existe de forma natural, o una variante o versión manipulada de un polipéptido que existe de forma natural. El polipéptido principal se puede referir al polipéptido en sí, composiciones que comprenden el polipéptido principal, o la secuencia de aminoácidos que lo codifica. Por consiguiente, por "inmunoglobulina principal", como se usa en el presente documento, se indica un polipéptido de inmunoglobulina no modificado que se modifica para generar una variante, y por "anticuerpo principal" como se usa en el presente documento se indica un anticuerpo no modificado que se modifica para generar un anticuerpo de variante. Se debe observar que "anticuerpo principal" incluye anticuerpos comerciales producidos recombinantemente conocidos como se expone brevemente más adelante.

Por "proteína de fusión de Fc" o "inmunoadhesina" en el presente documento se indica una proteína que comprende una región Fc, en general, unida (opcionalmente mediante un resto conector, como se describe en el presente documento) a una proteína diferente, tal como un resto de unión a una proteína diana, como se describe en el presente documento).

Por "posición", como se usa en el presente documento, se indica una localización en la secuencia de una proteína. Las posiciones pueden ser numeradas secuencialmente, o según un formato establecido, por ejemplo el índice EU para la numeración de anticuerpos.

Por "naturaleza de las cadenas" en el contexto de los monómeros de las proteínas heterodiméricas de la invención en el presente documento se indica que, similar a las dos cadenas de ADN que "coinciden", las variantes de heterodimerización se incorporan en cada monómero para conservar la capacidad de "coincidir" para formar heterodímeros. Por ejemplo, si algunas variantes de pI se manipulan en el monómero A (por ejemplo, aumentando el pI), entonces las variantes estéricas que son "pares de carga" que también se pueden utilizar no interfieren con las variantes de pI, por ejemplo, las variantes de carga que aumentan un pI se ponen en la misma "cadena" o "monómero" para conservar ambas funcionalidades.

Por "antígeno diana", como se usa en el presente documento, se indica la molécula que se une específicamente por la región variable de un anticuerpo dado. Un antígeno diana puede ser una proteína, hidrato de carbono, lípido, u otro compuesto químico. Los antígenos diana preferidos de la presente invención son CD3 y CD38.

Por "célula diana", como se usa en el presente documento, se indica una célula que expresa un antígeno diana.

Por "región variable", como se usa en el presente documento, se indica la región de una inmunoglobulina que comprende uno o más dominios de Ig sustancialmente codificados por cualquiera de los genes V.kappa., V.lamda., y/o VH que constituyen los loci genéticos de inmunoglobulina kappa, lambda y de cadena pesada, respectivamente.

Por "no mutante o WT" en el presente documento se indica una secuencia de aminoácidos o una secuencia de nucleótidos que se encuentra en la naturaleza, que incluye variaciones alélicas. Una proteína WT tiene una secuencia de aminoácidos o una secuencia de nucleótidos que no se ha modificado intencionadamente.

Por "fragmento variable de cadena simple", "scFv" o "Fv de cadena simple" como se entiende bien en la materia, en el presente documento se indica una proteína de fusión de las cadenas pesadas y ligeras variables de un anticuerpo, normalmente unido con un péptido de conector. Los conectores de scFv típicos se conocen bien en la técnica, en general, tienen 10 a 25 aminoácidos de longitud e incluyen glicinas y serinas.

Por "conector de scFv cargado" en el presente documento se indica un conector de scFv que utiliza aminoácidos cargados para su uso en la creación y purificación de anticuerpos heterodiméricos que incluyen al menos un scFv. Los conectores de scFv cargados adecuados se muestran en la Figura 5, aunque se pueden usar otros. En general, los conectores de scFv cargados para su uso en la presente invención tienen un cambio de carga desde 3 hasta 8 (siendo posibles todos de 3, 4, 5, 6, 7 u 8) en comparación con los conectores de scFv no cargados estándar tales como las secuencias (GGGGS)3-5 tradicionalmente usadas (ya sean negativas o positivas). Como será apreciado por los expertos en la técnica, los anticuerpos heterodiméricos que utilizan dos scFvs pueden tener un conector cargado y uno neutro (por ejemplo, ya sea un conector de scFv positivamente o negativamente cargado) o dos conectores de scFv de carga opuesta (uno positivo y uno negativo).

Proteínas heterodiméricas

La presente invención se refiere a la generación de proteínas de unión multiespecíficas, particularmente biespecíficas, y en particular, anticuerpos multiespecíficos que tienen un monómero que comprende un scFv y el otro un Fv. Como se trata en el presente documento, muchas de las realizaciones desveladas usan un scFv que se une a CD3 y el Fv (o Fab) que se une a CD38. Alternativamente, las secuencias vh y vl anti-CD38 en el presente documento se pueden usar en construcciones scFv, donde el monómero anti-CD3 es un Fab.

Anticuerpos

La presente invención se refiere a la generación de anticuerpos multiespecíficos, en general, anticuerpos terapéuticos. Como se trata más adelante, el término "anticuerpo" se usa generalmente. Los anticuerpos que encuentran uso en la presente invención pueden adoptar varios formatos, como se describe en el presente documento, que incluye anticuerpos tradicionales, así como derivados, fragmentos y miméticos de anticuerpos, descritos más adelante. En general, el término "anticuerpo" incluye cualquier polipéptido que incluye al menos un dominio constante, que incluye, pero no se limita a, CH1, CH2, CH3 y CL. Los anticuerpos particularmente preferidos en el presente documento son los anticuerpos de formato de "triple F".

Las unidades estructurales de anticuerpo tradicionales normalmente comprenden un tetrámero. Cada tetrámero normalmente está compuesto por dos pares idénticos de cadenas de polipéptidos, teniendo cada par una cadena "ligera" (que normalmente tiene un peso molecular de aproximadamente 25 kDa) y una cadena "pesada" (que normalmente tiene un peso molecular de aproximadamente 50-70 kDa). Las cadenas ligeras humanas se clasifican como cadenas ligeras kappa y lambda. La presente invención se refiere a la clase IgG, que tiene varias subclases, que incluyen, pero no se limitan a, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Así, "isotipo" como se usa en el presente documento indica cualquiera de las subclases de inmunoglobulinas definidas por las características químicas y antigénicas de sus regiones constantes. Se debe entender que los anticuerpos terapéuticos también pueden comprender híbridos de isotipos y/o subclases. Por ejemplo, como se muestra en la publicación de EE. UU. 2009/0163699, la presente invención cubre la manipulación de pI de híbridos IgG1/G2.

La porción del extremo amino de cada cadena incluye una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos principalmente responsables del reconocimiento del antígeno denominados, en general, en la técnica y en el presente documento, el "dominio Fv" o "región Fv". En la región variable, se juntan tres bucles para cada uno de los dominios V de la cadena pesada y la cadena ligera para formar un sitio de unión al antígeno. Cada uno de los bucles se denomina una región determinante de la complementariedad (denominada en lo sucesivo a "CDR"), en la que la variación en la secuencia de aminoácidos es la más significativa. "Variable" se refiere al hecho de que ciertos segmentos de la región variable se diferencien ampliamente en secuencia entre los anticuerpos. La variabilidad dentro de la región variable no se distribuye uniformemente. En su lugar, las regiones V consisten en tramos relativamente invariables denominados regiones estructurales (FRs) de 15-30 aminoácidos separadas por regiones más cortas de variabilidad extrema denominadas "regiones hipervariables" que tienen cada una 9-15 aminoácidos de longitud o más.

Cada VH y VL está compuesto por tres regiones hipervariables ("regiones determinantes de la complementariedad," "CDRs") y cuatro FRs, dispuestas desde el extremo amino hasta el extremo carboxi en el siguiente orden: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4.

La región hipervariable, en general, engloba restos de aminoácidos desde aproximadamente los restos de aminoácidos 24-34 (LCDR1; "L" indica cadena ligera), 50-56 (LCDR2) y 89-97 (LCDR3) en la región variable de la cadena ligera y alrededor de aproximadamente 31-35B (HCDR1; "H" indica cadena pesada), 50-65 (HCDR2) y 95-102 (HCDR3) en la región variable de la cadena pesada; Kabat et al., SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991) y/o los restos que forman un bucle hipervariable (por ejemplo, los restos 26-32 (LCDR1), 50-52 (LCDR2) y 91-96 (LCDR3) en la región variable de la cadena ligera y 26-32 (HCDR1), 53-55 (HCDR2) y 96-101 (HCDR3) en la región variable de la cadena pesada; Chothia y Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196:901 -917. Se describen a continuación CDRs específicas de la invención.

En toda la presente memoria descriptiva, el sistema de numeración de Kabat se usa, en general, cuando se refiere a un resto en el dominio variable (aproximadamente, los restos 1-107 de la región variable de la cadena ligera y los restos 1-113 de la región variable de la cadena pesada) (por ejemplo, Kabat et al., arriba (1991)).

Las CDRs contribuyen a la formación de la unión al antígeno, o más específicamente, el sitio de unión al epítope de anticuerpos. "Epítope" se refiere a un determinante que interacciona con un sitio de unión al antígeno específico en la región variable de una molécula de anticuerpo conocida como un parátope. Los epítopes son agrupaciones de moléculas, tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcar, y normalmente tienen características estructurales específicas, así como características de carga específicas. Un antígeno simple puede tener más de un epítope.

El epítope puede comprender restos de aminoácidos directamente implicados en la unión (también denominado componente inmunodominante del epítope) y otros restos de aminoácidos, que no están directamente implicados en la unión, tales como restos de aminoácidos que son eficazmente bloqueados por el péptido que se une específicamente al antígeno; en otras palabras, el resto de aminoácido está dentro de la huella del péptido que se une específicamente al antígeno.

Los epítopes pueden ser o conformacionales o lineales. Un epítope conformacional se produce por aminoácidos espacialmente yuxtapuestos de diferentes segmentos de la cadena lineal de polipéptidos. Un epítope lineal es uno producido por restos de aminoácidos adyacentes en una cadena de polipéptidos. Los epítopes conformacionales y no conformacionales se pueden distinguir en que se pierde la unión a los primeros, pero no a los últimos, en presencia de disolventes desnaturalizantes.

Un epítope normalmente incluye al menos 3, y más normalmente, al menos 5 u 8-10 aminoácidos en una conformación espacial única. Los anticuerpos que reconocen el mismo epítope se pueden verificar en un simple inmunoensayo que muestra la capacidad de un anticuerpo para bloquear la unión de otro anticuerpo a un antígeno diana, por ejemplo "agrupamiento".

La porción del extremo carboxi de cada cadena define una región constante principalmente responsable de la función efectora. Kabat et al. recogieron numerosas secuencias primarias de las regiones variables de cadenas pesadas y cadenas ligeras. Basándose en el grado de conservación de las secuencias, clasificaron secuencias primarias individuales en la CDR y la región estructural e hicieron una lista de los mismos (véase SEQUENCES OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, 5a edición, publicación de NIH, N° 91-3242, E.A. Kabat et al.).

En la subclase de inmunoglobulinas IgG, existen varios dominios de inmunoglobulina en la cadena pesada. Por "dominio de inmunoglobulina (Ig)" se indica en el presente documento una región de una inmunoglobulina que tiene una estructura terciaria distinta. Son de interés en la presente invención los dominios de cadena pesada, que incluyen los dominios pesados constantes (CH) y los dominios bisagra. En el contexto de anticuerpos IgG, los isotipos IgG tienen cada uno tres regiones CH. Por consiguiente, dominios "CH" en el contexto de IgG son del siguiente modo: "CH1" se refiere a las posiciones 118-220 según el índice EU como en Kabat. "CH2" se refiere a las posiciones 237 340 según el índice EU como en Kabat, y "CH3" se refiere a las posiciones 341-447 según el índice EU como en Kabat. Como se muestra en el presente documento y se describe a continuación, las variantes de pI pueden estar en una o más de las regiones CH, así como la región bisagra, tratado a continuación.

Se debe observar que las secuencias representadas en el presente documento empiezan en la región CH1, posición 118; las regiones variables no están incluidas, excepto que se indique. Por ejemplo, el primer aminoácido de SEQ ID NO: 2, mientras que se designa posición "1" en el lista de secuencia, corresponde a la posición 118 de la región CH1, según la numeración EU.

Otro tipo de dominio Ig de la cadena pesada es la región bisagra. Por "bisagra" o "región bisagra" o "región bisagra de anticuerpo" o "región bisagra de inmunoglobulina" en el presente documento se indica el polipéptido flexible que comprende los aminoácidos entre el primer y segundo dominios constantes de un anticuerpo. Estructuralmente, el dominio CH1 de IgG termina en la posición EU 220, y el dominio CH2 de IgG empieza en la posición EU de restos 237. Así, para IgG se define en el presente documento que la bisagra del anticuerpo incluye las posiciones 221 (D221 en IgG 1) a 236 (G236 en IgG1), en donde la numeración es según el índice EU como en Kabat. En algunas realizaciones, por ejemplo en el contexto de una región Fc, se incluye la bisagra inferior, con la "bisagra inferior", en general, con referencia a las posiciones 226 o 230. Como se indica en el presente documento, también se pueden preparar variantes de pI en la región bisagra.

La cadena ligera comprende, en general, dos dominios, el dominio ligero variable (que contiene las CDRs de la cadena ligera y junto con los dominios pesados variables que forman la región Fv), y una región constante de la cadena ligera (frecuentemente denominada CL o Ck).

Otra región de interés para sustituciones adicionales, expuesta brevemente a continuación, es la región Fc. Por "Fc" o "región Fc" o "dominio Fc", como se usa en el presente documento, se indica el polipéptido que comprende la región constante de un anticuerpo, excluyendo el primer dominio de inmunoglobulina de la región constante y en algunos casos, parte de la bisagra. Así, Fc se refiere a los dos últimos dominios de inmunoglobulina de la región constante de IgA, IgD e IgG, los tres últimos dominios de inmunoglobulina de la región constante de IgE e IgM, y el extremo N de bisagra flexible a estos dominios. Para IgA e IgM, Fc puede incluir la cadena J. Para IgG, el dominio Fc comprende los dominios de inmunoglobulina Cy2 y Cy3 (Cy2 y Cy3) y la región bisagra inferior entre Cy1 (Cy1) y Cy2 (Cy2). Aunque pueden variar los límites de la región Fc, se define normalmente que la región Fc de la cadena pesada de IgG humana incluye los restos C226 o P230 hasta su extremo carboxilo, en donde la numeración es según el índice EU como en Kabat. En algunas realizaciones, como se describe más completamente a continuación, las modificaciones de aminoácidos se hacen a la región Fc, por ejemplo para alterar la unión a uno o más receptores FcyR o al receptor FcRn.

En algunas realizaciones, los anticuerpos son de longitud completa. Por "anticuerpo de longitud completa" se indica en el presente documento la estructura que constituye la forma biológica natural de un anticuerpo, que incluye regiones variables y constantes, que incluyen una o más modificaciones como se expone brevemente en el presente documento.

Alternativamente, los anticuerpos pueden incluir una variedad de estructuras, que incluyen, pero no se limitan a, fragmentos de anticuerpos, anticuerpos monoclonales, anticuerpos biespecíficos, minicuerpos, anticuerpos de dominio, anticuerpos sintéticos (algunas veces denominados en el presente documento "miméticos de anticuerpos"), anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, fusiones de anticuerpos (algunas veces denominados "conjugados de anticuerpo"), y fragmentos de cada uno, respectivamente.

En una realización, el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo, en tanto que contenga al menos un dominio constante que se puede manipular para producir heterodímeros, tales como manipulación de pI. Otros fragmentos de anticuerpos que se pueden usar incluyen fragmentos que contienen uno o más de los dominios CH1, CH2, CH3, bisagra y CL de la invención que han sido manipulados en pI. Por ejemplo, las fusiones de Fc son fusiones de la región Fc (CH2 y CH3, opcionalmente con la región bisagra) fusionada con otra proteína. Se conocen en la técnica varias fusiones Fc y se pueden mejorar mediante la adición de las variantes de heterodimerización de la invención. En el presente caso, se pueden hacer fusiones de anticuerpos que comprenden CH1; CH1, CH2 y CH3; CH2; CH3; CH2 y CH3; CH1 y CH3, cualquiera o todas de las cuales se pueden hacer opcionalmente con la región bisagra, utilizando cualquier combinación de las variantes de heterodimerización descritas en el presente documento.

En algunas realizaciones de la presente invención, un monómero comprende una cadena pesada que comprende un scFV unido a un dominio Fc, y el otro monómero comprende una cadena pesada que comprende un Fab unido a un dominio Fc, por ejemplo una cadena pesada "típica", y una cadena ligera. Por "Fab" o "región Fab", como se usa en el presente documento, se indica el polipéptido que comprende el dominios de inmunoglobulina VH, CH1, VL y CL. Fab se puede referir a esta región en aislamiento, o esta región en el contexto de un anticuerpo de longitud completa, fragmento de anticuerpo o proteína de fusión de Fab. Por "Fv" o "fragmento Fv" o "región Fv" como se usa en el presente documento se indica un polipéptido que comprende los dominios VL y VH de un único anticuerpo.

Anticuerpos quiméricos y humanizados

En algunas realizaciones, el anticuerpo puede ser una mezcla de diferentes especies, por ejemplo un anticuerpo quimérico y/o un anticuerpo humanizado. En general, tanto "anticuerpos quiméricos" como "anticuerpos humanizados" se refiere a anticuerpos que combinan regiones de más de una especie. Por ejemplo, los "anticuerpos quiméricos" comprenden tradicionalmente una región variable (regiones variables) de un ratón (o rata, en algunos casos) y una región constante (regiones constantes) de un humano. "Anticuerpos humanizados" se refiere, en general, a anticuerpos no humanos que han tenido las regiones estructurales de dominio variable cambiadas por secuencias encontradas en anticuerpos humanos. En general, en un anticuerpo humanizado, todo el anticuerpo, excepto las CDRs, está codificado por un polinucleótido de origen humano o es idéntico a dicho anticuerpo, excepto dentro de sus CDRs. Las CDRs, algunas o todas de las cuales están codificadas por ácidos nucleicos que se originan en un organismo no humano, se injertan en la región estructura de hoja beta de una región variable de anticuerpo humano para crear un anticuerpo, cuya especificidad se determina por las CDRs injertadas. La creación de dichos anticuerpos se describe en, por ejemplo, los documentos de patente WO 92/11018, Jones, 1986, Nature 321:522-525, Verhoeyen et al., 1988, Science 239:1534-1536. Frecuentemente se requiere la "retromutación" de restos aceptores seleccionados de la región estructural a los restos donantes correspondientes para recuperar la afinidad que se pierde en la construcción injertada inicial (documentos de patente US 5530101; US 5585089; Us 5693761; US 5693762; US 6180370; US 5859205; US 5821337; US 6054297; US 6407213). El anticuerpo humanizado también comprenderá óptimamente al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina, normalmente la de una inmunoglobulina humana, y así normalmente comprenderá una región Fc humana. Los anticuerpos humanizados también se pueden generar usando ratones con un sistema inmunitario genéticamente manipulado. Roque et al., 2004, Biotechnol. Prog. 20:639-654. Se conocen bien en la técnica una variedad de técnicas y métodos para humanizar y remodelar anticuerpos no humanos (véase Tsurushita & Vasquez, 2004, Humanization of Monoclonal Antibodies, Molecular Biology of B Cells, 533-545, Elsevier Science (EE. UU.), y referencias citadas en su interior). Los métodos de humanización incluyen, pero no se limitan a, los métodos descritos en Jones et al., 1986, Nature 321:522-525; Riechmann et al., 1988; Nature 332:323-329; Verhoeyen et al., 1988, Science, 239:1534-1536; Queen et al., 1989, Proc Natl Acad Sci, USA 86:10029-33; He et al., 1998, J. Immunol. 160: 1029-1035; Carter et al., 1992, Proc Natl Acad Sci USA 89:4285-9, Presta et al., 1997, Cancer Res. 57(20):4593-9; Gorman et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4181-4185; O'Connor et al., 1998, Protein Eng 11:321-8. La humanización u otros métodos de reducción de la inmunogenicidad de regiones variables de anticuerpos no humanos pueden incluir métodos de remodelación superficial, como se describen, por ejemplo, en Roguska et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:969-973. En una realización, el anticuerpo principal se ha madurado por afinidad, como se conoce en la técnica. Se pueden emplear métodos basados en estructura para la humanización y maduración por afinidad, por ejemplo como se describen en el documento de patente US 2006/0008883. Se pueden emplear métodos basados en selección para humanizar y/o madurar por afinidad las regiones variables del anticuerpo, que incluyen, pero no se limitan a, los métodos descritos en Wu et al., 1999, J. Mol. Biol. 294:151-162; Baca et al., 1997, J. Biol. Chem. 272(16):10678-10684; Rosok et al., 1996, J. Biol. Chem. 271(37): 22611-22618; Rader et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 8910-8915; Krauss et al., 2003, Protein Engineering 16(10):753-759. Otros métodos de humanización pueden implicar el injerto de solo partes de las CDRs, que incluyen, pero no se limitan a, los métodos descritos en el documento de patente US 2001/0035606; Tan et al., 2002, J. Immunol. 169:1119-1125; De Pascalis et al., 2002, J. Immunol. 169:3076-3084.

Construcciones de anticuerpo multiespecífico

Como será apreciado por los expertos en la técnica y tratado más completamente a continuación, las proteínas de fusión heterodiméricas de la presente invención adoptan una gran variedad de configuraciones, con una realización preferida mostrada en la Figura 8B como una construcción de "triple F".

Regiones constantes de la cadena pesada heterodiméricas

Por consiguiente, la presente invención proporciona proteínas heterodiméricas basadas en el uso de monómeros que contienen regiones constantes de la cadena pesada de variante como primer dominio. Por "monómero" en el presente documento se indica la mitad de la proteína heterodimérica. Se debe observar que los anticuerpos tradicionales son en realidad tetrámeros (dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras). En el contexto de la presente invención, un par de cadenas pesadas-ligeras (si es aplicable, por ejemplo, si el monómero comprende un Fab) se considera un "monómero". Similarmente, una región de la cadena pesada que comprende el scFv se considera un monómero. Esencialmente, cada monómero comprende región constante de la cadena pesada suficiente para permitir la manipulación de heterodimerización, ya sea toda la región constante, por ejemplo Ch1-bisagra-CH2-CH3, la región Fc (CH2-CH3), o solo el dominio CH3.

Las regiones constantes de la cadena pesada de variante pueden comprender toda o parte de la región constante de la cadena pesada, que incluye la construcción de longitud completa, CH1-bisagra-CH2-CH3, o porciones de la misma, que incluyen, por ejemplo, CH2-CH3 o CH3 solo. Además, la región de la cadena pesada de cada monómero puede ser el mismo esqueleto (CH1-bisagra-CH2-CH3 o CH2-CH3) o diferente. Las truncaciones y adiciones del extremo N y extremo C también están incluidas dentro de la definición; por ejemplo, algunas variantes de pI incluyen la adición de aminoácidos cargados al extremo C del dominio de la cadena pesada.

Así, en general, un monómero de la presente construcción de "triple F" es una región scFv-bisagra-dominio Fc) y la otra es (VH-CH1-bisagra-CH2-CH3 más cadena ligera asociada), con variantes de heterodimerización, que incluyen variantes estéricas y de pI, Fc y variantes de FcRn, y dominios de unión al antígeno adicionales (con conectores opcionales) incluidos en estas regiones.

Además de las variantes de heterodimerización (por ejemplo, variantes estéricas y de pI) brevemente expuestas en el presente documento, las regiones de la cadena pesada también pueden contener sustituciones de aminoácidos adicionales, que incluyen cambios para alterar la unión de FcyR y FcRn como se trata más adelante.

Además, algunos monómeros pueden utilizar conectores para la porción de scFv del "abridor de botellas". En el formato de triple F, se usa un conector de scFv cargado. Como se indica en el presente documento, dependiendo del pI inherente de scFv para el antígeno diana y el pI inherente del Fab del otro antígeno diana, el conector de scFv cargado puede o ser positivo o negativo. En formatos de scFv dobles, o bien se usa un conector de scFv cargado simple en un monómero (nuevamente, ya sea positivo o negativo) o ambos (uno positivo y uno negativo). En esta realización, la carga de cada uno de los dos conectores no necesita ser la misma (por ejemplo, 3 para uno y -4 para el otro, etc.).

En una realización, es el sitio de unión al antígeno anti-CD3 que es el scFv, e incluye un conector de scFv positivamente cargado. Alternativamente, puede ser el sitio de unión al antígeno anti-CD38 que es el scFv de la construcción de "abridor de botellas".

Las variantes de heterodimerización incluyen varios tipos diferentes de variantes, que incluyen, pero no se limitan a, variantes estéricas (incluyendo variantes de carga) y variantes de pI, que pueden ser opcional e independientemente combinadas con cualquier otra variante. En estas realizaciones, es importante hacer corresponder el "monómero A" con el "monómero B"; es decir, si una proteína heterodimérica se basa en ambas variantes estéricas y variantes de pI, estas necesitan ser correctamente correspondidas con cada monómero: por ejemplo, el conjunto de variantes estéricas que funcionan (1 conjunto en el monómero A, 1 conjunto en el monómero B) se combina con conjuntos de variantes de pI (1 conjunto en el monómero A, 1 conjunto en el monómero B), de forma que las variantes en cada monómero se diseñan para lograr la función deseada. En el caso, por ejemplo, donde variantes estéricas también pueden cambiar la carga, los conjuntos correctos se tienen que corresponder con el monómero correcto.

Es importante observar que las variantes de heterodimerización brevemente expuestas en el presente documento (por ejemplo, que incluyen, pero no se limitan a, las variantes mostradas en las Figuras), pueden ser opcional e independientemente combinadas con cualquier otra variante, y en cualquier otro monómero. Así, por ejemplo, las variantes de pI para el monómero 1 de una figura se pueden añadir a otras variantes de heterodimerización para el monómero 1 en una figura diferente o del monómero 2. Es decir, lo que es importante para la heterodimerización es que existan "conjuntos" de variantes, un conjunto para un monómero y un conjunto para el otro. Es irrelevante si estos se combinan de las figuras 1 a 1 (por ejemplo, los listados del monómero 1 pueden ir juntos) o se intercambian (las variantes de pI de monómero 1 con las variantes estéricas de monómero 2). Sin embargo, como se observa en el presente documento, la "naturaleza de las cadenas" se debe conservar cuando se producen combinaciones como se explica resumidamente anteriormente de forma que se favorezca la heterodimerización; por ejemplo, se deben usar variantes de carga que aumentan el pI con elevadas variantes de pI y/o un conector de scFv con aumento de pI, etc. Además, para las variantes de Fc adicionales (tales como para la unión de FcyR, la unión de FcRn, variantes de escisión, etc.), cualquier monómero, o ambos monómeros, pueden incluir cualquiera de las variantes enumeradas, independientemente y opcionalmente. En algunos casos, ambos monómeros tienen las variantes adicionales y en algunos solo un monómero tiene las variantes adicionales, o se pueden combinar.

Variantes de heterodimerización

La presente invención proporciona formatos de anticuerpo multiespecífico, en un armazón de "triple F" o de "abridor de botellas" como se representa en la Figura 8B, por ejemplo.

Variantes estéricas

En algunas realizaciones, la formación de heterodímeros se puede facilitar mediante la adición de variantes estéricas. Es decir, cambiando aminoácidos en cada cadena pesada, es más probable que se asocien diferentes cadenas pesadas para formar la estructura heterodimérica que para formar homodímeros con las mismas secuencias de aminoácidos de Fc. Se muestran en las figuras variantes estéricas adecuadas

Un mecanismo se denomina, en general, en la técnica "botones en ojales", con referencia a la manipulación de aminoácidos que crea influencias estéricas para favorecer la formación heterodimérica y opcionalmente también se puede usar para desfavorecer la formación homodimérica; esto se denomina algunas veces "botones en ojales", Ridgway et al., Protein Engineering 9(7):617 (1996); Atwell et al., J. Mol. Biol. 1997 270:26; patente de EE. UU. N° 8.216.805. Las Figuras 4 y 5, descritas adicionalmente más adelante, identifican varios pares "monómero A -monómero B" que se basan en "botones en ojales". Además, como se describe en Merchant et al., Nature Biotech.

16:677 (1998), estas mutaciones de "botones en ojales" se pueden combinar con enlaces disulfuro para sesgar la formación hacia la heterodimerización.

Un mecanismo adicional que encuentra uso en la generación de heterodímeros se denomina algunas veces "orientación por interacción electrostática", como se describe en Gunasekaran et al., J. Biol. Chem. 285(25):19637 (2010). Esto se denomina algunas veces en el presente documento "pares de carga". En esta realización, se usan interacciones electrostáticas para sesgar la formación hacia la heterodimerización. Como apreciarán los expertos en la técnica, esto también puede haber tenido un efecto sobre pI, y así sobre la purificación, y así también se podrían considerar en algunos casos variantes de pI. Sin embargo, como estos se generaron para forzar la heterodimerización y no se usaron como herramientas de purificación, se clasifican como "variantes estéricas''. Estas incluyen, pero no se limitan a, variantes que dan como resultado más de 75 % de heterodimerización en las figuras tales como D221E/P228E/L368E emparejado con D221R/P228R/K409R (por ejemplo, estos son "conjuntos de monómeros correspondientes") y C220E/P228E/368E emparejado con C220R/E224R/P228R/K409R.

Las variantes adicionales de monómero A y monómero B se pueden combinar con otras variantes, opcional e independientemente en cualquier cantidad, tales como las variantes de pI brevemente expuestas en el presente documento u otras variantes estéricas que se muestran en la Figura 37 del documento de patente US 2012/0149876.

En algunas realizaciones, las variantes estéricas expuestas brevemente en el presente documento pueden ser opcional e independientemente incorporadas con cualquier variante de heterodimerización que incluye variantes de pI (u otras variantes tales como variantes de Fc, variantes de FcRn, variantes de escisión, etc.) en uno o ambos monómeros.

Variantes de pI (punto isoeléctrico) para heterodímeros

En general, como será apreciado por los expertos en la técnica, existen dos categorías generales de variantes de pI: las que aumentan el pI de la proteína (cambios básicos) y las que disminuyen el pI de la proteína (cambios ácidos). Como se describe en el presente documento, se pueden hacer todas las combinaciones de estas variantes: un monómero puede ser no mutante, o una variante que no muestra un pI significativamente diferente de no mutante, y la otra puede ser o más básica o más ácida. Alternativamente, se cambia cada monómero, uno a más básico y uno a más ácido.

Se muestran en las figuras combinaciones preferidas de variantes de pI.

Cambios de pI ácido de cadena pesada

Por consiguiente, cuando un monómero que comprende un dominio constante de la cadena pesada de variante se va a hacer más positivo (por ejemplo, más bajo el pI), se puede hacer una o más de las siguientes sustituciones: S119E, K133E, K133Q, T164E, K205E, K205Q, N208D, K210E, K210Q, K274E, K320E, K322E, K326E, K334E, R355E, K392E, una deleción de K447, adición de péptido DEDE en el extremo C, G137E, N203D, K274Q, R355Q, K392N y Q419E. Como se expone brevemente en el presente documento y se muestra en las figuras, estos cambios se muestran con respecto a IgG1, pero se pueden alterar de esta forma todos los isotipos, así como los híbridos de isotipo.

En el caso en el que el dominio constante de la cadena pesada sea de IgG2-4, también se pueden usar R133E y R133Q.

Cambios de pI básico

Por consiguiente, cuando un monómero que comprende un dominio constante de la cadena pesada de variante se va a hacer más negativo (por ejemplo, aumento del pI), se puede hacer una o más de las siguientes sustituciones: Q196K, P217R, P228R, N276K y H435R. Como se expone brevemente en el presente documento y se muestra en las figuras, estos cambios se muestran con respecto a IgG1, pero se pueden alterar de esta forma todos los isotipos, así como los híbridos de isotipo.

Variantes de cadena ligera de heterodímeros de anticuerpo

En el caso de heterodímeros basados en anticuerpos, por ejemplo donde al menos uno de los monómeros comprende una cadena ligera, además del dominio de la cadena pesada, también se pueden hacer variantes de pI en la cadena ligera. Las sustituciones de aminoácidos para reducir el pI de la cadena ligera incluyen, pero no se limitan a, K126E, K126Q, K145E, K145Q, N152D, S156E, K169E, S202E, K207E y la adición de péptido DEDE en el extremo C de la cadena ligera. Los cambios en esta categoría basados en la cadena ligera lambda constante incluyen una o más sustituciones en R108Q, Q124E, K126Q, N138D, K145T y Q199E. Además, también se puede hacer el aumento del pI de las cadenas ligeras.

Variantes isotípicas

Además, muchas realizaciones de la invención se basan en la "importación" de aminoácidos de pI en las posiciones particulares de un isotipo de IgG en otro, reduciendo o eliminando así la posibilidad de inmunogenicidad no deseada que se introduce en las variantes. Es decir, IgG1 es un isotipo común para anticuerpos terapéuticos para una variedad de motivos, que incluye alta función efectora. Sin embargo, la región constante pesada de IgG1 tiene un pI más alto que de la IgG2 (8,10 frente a 7,31). Introduciendo restos de IgG2 en las posiciones particulares en el esqueleto de IgG1, se reduce (o aumenta) el pI del monómero resultante y adicionalmente presenta mayor semivida en suero. Por ejemplo, IgG 1 tiene una glicina (pI 5,97) en la posición 137, e IgG2 tiene un ácido glutámico (pI 3,22); la importación del ácido glutámico afectará el pI de la proteína resultante. Como se describe a continuación, se requieren, en general, varias sustituciones de aminoácidos para afectar significativamente el pI del anticuerpo de variante. Sin embargo, se debe observar como se trata más adelante que incluso cambios en las moléculas de IgG2 permiten elevada semivida en suero.

En otras realizaciones, se hacen cambios de aminoácidos no isotípicos, o para reducir el estado de carga global de la proteína resultante (por ejemplo, cambiando un aminoácido de mayor pI a un aminoácido de menor pI), o para permitir las acomodaciones en la estructura para estabilidad, etc., como se describe adicionalmente más adelante.

Además, manipulando el pI de tanto los dominios constantes pesados como ligeros, se pueden observar cambios significativos en cada monómero del heterodímero. Como se trata en el presente documento, tener los pIs de los dos monómeros que se diferencian en al menos 0,5 puede permitir la separación por cromatografía de intercambio iónico o isoelectroenfoque, u otros métodos sensibles al punto isoeléctrico.

Variantes isoestéricas

Además, como se muestra en la Figura 47, se pueden preparar variantes de pI que son isostéricas, por ejemplo variantes de carga que son de aproximadamente el mismo tamaño que el aminoácido principal.

Cálculo del pI

El pI de cada monómero puede depender del pI del dominio constante de la cadena pesada de variante y el pI del monómero total, incluyendo el dominio constante de la cadena pesada de variante y el componente de fusión. Así, en algunas realizaciones, el cambio en el pI se calcula basándose en el dominio constante de la cadena pesada de variante, usando el diagrama en las figuras. Alternativamente, se puede comparar el pI de cada monómero. Similarmente, se calculan los pIs de las regiones variables "iniciales" (por ejemplo, ya sea scFv o Fab) para informar qué monómero se manipulará en esa dirección.

Variantes de pI que también confieren mejor unión in vivo de FcRn

En el caso en el que la variante de pI disminuya el pI del monómero, puede tener el beneficio añadido de mejorar la retención en suero in vivo.

Aunque todavía se está examinando, se cree que las regiones Fc tienen mayores semividas in vivo, debido a que la unión a FcRn a pH 6 en un endosoma secuestra Fc (Ghetie y Ward, 1997 Immunol Today. 18(12): 592-598). Entonces el compartimento endosómico recircula el Fc a la superficie celular. Una vez se abre el compartimento al espacio extracelular, el pH más alto, ~7,4, induce la liberación de Fc de nuevo a la sangre. En ratones, Dall' Acqua et al. mostraron que los mutantes de Fc con elevada unión de FcRn a pH 6 y pH 7,4 tuvieron en realidad concentraciones en suero reducidas y la misma semivida que Fc no mutante (Dall' Acqua et al. 2002, J. Immunol. 169:5171-5180). Se cree que el aumento de la afinidad de Fc por FcRn a pH 7,4 prohíbe la liberación de Fc de nuevo en la sangre. Por tanto, las mutaciones de Fc que aumentarán la semivida de Fc in vivo aumentarán idealmente la unión de FcRn al pH más bajo, mientras que todavía permitirá la liberación de Fc a pH más alto. El aminoácido histidina cambia su estado de carga en el intervalo de pH de 6,0 a 7,4. Por tanto, no es sorprendente encontrar restos de His en posiciones importantes en el complejo Fc/FcRn.

Recientemente se ha sugerido que los anticuerpos con regiones variables que tienen puntos isoeléctricos más bajos también pueden tener largas semividas en suero (Igawa et al., 2010 PEDS. 23(5): 385-392). Sin embargo, el mecanismo de esto es todavía poco entendido. Además, las regiones variables se diferencian de anticuerpo a anticuerpo. Las variantes de la región constante con pI reducido y semivida prolongada proporcionarían un enfoque más modular a la mejora de las propiedades farmacocinéticas de anticuerpos, como se describe en el presente documento.

Se desvelan en las figuras variantes de pI que encuentran uso en esta realización, así como su uso para la optimización de la purificación.

Combinación de variantes

Como será apreciado por los expertos en la técnica, todas las variantes de heterodimerización citadas pueden ser opcional e independientemente combinadas de algún modo, en tanto que retengan su "naturaleza de las cadenas" o "reparto de monómeros". Además, todas esas variantes se pueden combinar en cualquiera de los formatos de heterodimerización.

En el caso de variantes de pI, aunque realizaciones que encuentran uso particular se muestran en las figuras, se pueden generar otras combinaciones, siguiendo la regla básica de alterar la diferencia de pI entre dos monómeros para facilitar la purificación.

Los anticuerpos de la presente invención son, en general, aislados o recombinantes. "Aislado", cuando se usa para describir los diversos polipéptidos desvelados en el presente documento, significa un polipéptido que se ha identificado y separado y/o recuperado de una célula o cultivo celular del que se expresó. En general, un polipéptido aislado se preparará por al menos una etapa de purificación. Un "anticuerpo aislado" se refiere a un anticuerpo que está sustancialmente libre de otros anticuerpos que tienen diferentes especificidades antigénicas.

"Unión específica" o "se une específicamente a" o es "específico para" un antígeno particular o un epítope significa la unión que se mide de forma diferente de una interacción no específica. La unión específica se puede medir, por ejemplo, determinando la unión de una molécula en comparación con la unión de una molécula de control, que, en general, es una molécula de estructura similar que no tiene actividad de unión. Por ejemplo, la unión específica se puede determinar por competición con una molécula de control que es similar a la diana.

La unión específica para un antígeno particular o un epítope se puede presentar, por ejemplo, por un anticuerpo que tiene una KD para un antígeno o epítope de al menos aproximadamente 10-4 M, al menos aproximadamente 10-5 M, al menos aproximadamente 10-6 M, al menos aproximadamente 10-7 M, al menos aproximadamente 10-8 M, al menos aproximadamente 10-9 M, alternativamente al menos aproximadamente 10-10 M, al menos aproximadamente 10-11 M, al menos aproximadamente 10-12 M, o mayor, donde KD se refiere a una velocidad de disociación de una interacción anticuerpo-antígeno particular. Normalmente, un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno tendrá una KD que es 20, 50, 100, 500, 1000, 5.000, 10.000 o más veces mayor para una molécula de control con respecto al antígeno o epítope.

Por tanto, la unión específica para un antígeno particular o un epítope se puede presentar, por ejemplo, por un anticuerpo que tiene una KA o Ka para un antígeno o epítope de al menos 20, 50, 100, 500, 1000, 5.000, 10.000 o más veces mayor para el epítope con respecto a un control, donde KA o Ka se refiere a una velocidad de asociación de una interacción anticuerpo-antígeno particular.

Anticuerpos modificados

Además de las modificaciones brevemente expuestas anteriormente, se pueden hacer otras modificaciones. Por ejemplo, las moléculas se pueden estabilizar por la incorporación de puentes de disulfuro que unen los dominios VH y VL (Reiter et al., 1996, Nature Biotech. 14:1239-1245). Además, existe una variedad de modificaciones covalentes de anticuerpos que se pueden hacer como se expone brevemente más adelante.

Las modificaciones covalentes de anticuerpos están incluidas dentro del alcance de la presente invención, y, en general, se hacen, pero no siempre, post-traduccionalmente. Por ejemplo, se introducen varios tipos de modificaciones covalentes del anticuerpo en la molécula haciendo reaccionar restos de aminoácidos específicos del anticuerpo con un agente derivatizante orgánico que es capaz de reaccionar con cadenas laterales seleccionadas o los restos del extremo N o C.

Se hacen reaccionar restos de cisteinilo lo más comúnmente con a-haloacetatos (y aminas correspondientes), tales como ácido cloroacético o cloroacetamida, dando derivados de carboximetilo o carboxiamidometilo. Los restos de cisteinilo también se pueden derivatizar por reacción con bromotrifluoroacetona, ácido a-bromo-p-(5-imidozoil)propiónico, fosfato de cloroacetilo, N-alquilmaleimidas, disulfuro de 3-nitro-2-piridilo, 2-piridil disulfuro de metilo, p-cloromercuribenzoato, 2-cloromercuri-4-nitrofenol, o cloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol y similares.

Además, las modificaciones en las cisteínas son particularmente útiles en las aplicaciones de conjugados de anticuerpo-fármaco (ADC), descritas adicionalmente a continuación. En algunas realizaciones, la región constante de los anticuerpos se puede manipular para contener una o más cisteínas que son particularmente "reactivas con tiol", para permitir la ubicación más específica y controlada del resto de fármaco. Véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. N27.521.541.

Se derivatizan restos de histidilo por reacción con dietilpirocarbonato a pH 5,5-7,0 debido a que este agente es relativamente específico por la cadena lateral de histidilo. También es útil el bromuro de para-bromofenacilo; la reacción se realiza preferentemente en cacodilato de sodio 0,1 M a pH 6,0.

Se hacen reaccionar restos de lisinilo y del extremo amino con anhídridos de ácido succínico u otros anhídridos de ácido carboxílico. La derivatización con estos agentes tiene el efecto de revertir la carga de los restos de lisinilo. Otros reactivos adecuados para derivatizar restos que contienen alfa-amino incluyen imidoésteres tales como picolinimidato de metilo; fosfato de piridoxal; piridoxal; cloroborohidruro; ácido trinitrobencenosulfónico; O-metilisourea; 2,4-pentanodiona; y reacción catalizada por transaminasa con glioxilato.

Los restos de arginilo se modifican por reacción con uno o varios reactivos convencionales, entre ellos fenilglioxal, 2,3-butanodiona, 1,2-ciclohexanodiona y ninhidrina. La derivatización de restos de arginina requiere que la reacción se realice bajo condiciones alcalinas debido al alto pKa del grupo funcional guanidina. Además, estos reactivos pueden reaccionar con los grupos de lisina, así como los grupos épsilon-amino de arginina.

Se puede hacer la modificación específica de restos de tirosilo, con particular interés en la introducción de marcas espectrales dentro de restos de tirosilo por reacción con compuestos aromáticos de diazonio o tetranitrometano. Lo más comúnmente, se usan N-acetilimidizol y tetranitrometano para formar especies de O-acetiltirosilo y derivados de 3-nitro, respectivamente. Los restos de tirosilo se yodan usando 125I o 131I para preparar proteínas marcadas para su uso en radioinmunoensayo, siendo adecuado el método de cloramina T descrito anteriormente.

Se modifican selectivamente grupos laterales de carboxilo (aspartilo o glutamilo) por reacción con carbodiimidas (R'-N=C=N--R'), donde R y R' son grupos alquilo opcionalmente diferentes, tales como 1-ciclohexil-3-(2-morfolinil-4 etil)carbodiimida o 1-etil-3-(4-azonia-4,4-dimetilpentil)carbodiimida. Además, se convierten restos aspartilo y glutamilo en restos asparaginilo y glutaminilo por reacción con iones amonio.

La derivatización con agentes bifuncionales es útil para reticular anticuerpos con una matriz o superficie de soporte insoluble en agua para su uso en una variedad de métodos, además de los métodos descritos más adelante. Los agentes de reticulación comúnmente usados incluyen, por ejemplo, 1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletano, glutaraldehído, ésteres de N-hidroxisuccinimida, por ejemplo, ésteres con ácido 4-azidosalicílico, imidoésteres homobifuncionales, que incluyen ésteres disuccinimidílicos tales como 3,3'-ditiobis(succinimidilpropionato), y maleimidas bifuncionales tales como bis-N-maleimido-1,8-octano. Agentes derivatizantes tales como metil-3-[(p-azidofenil)ditio]propioimidato dan productos intermedios fotoactivables que son capaces de formar reticulaciones en presencia de luz. Alternativamente, se emplean matrices reactivas insolubles en agua tales como hidratos de carbono activados con bromuro de cianógeno y los sustratos reactivos descritos en las patentes de EE. UU. N° 3,969.287; 3.691.016; 4.195.128; 4.247.642; 4.229.537; y 4.330.440 para la inmovilización de proteínas.

Los restos de glutaminilo y asparaginilo son frecuentemente desamidados a los restos de glutamilo y aspartilo correspondientes, respectivamente. Alternativamente, estos restos son desamidados bajo condiciones suavemente ácidas. Cualquier forma de estos restos entra dentro del alcance de la presente invención.

Otras modificaciones incluyen hidroxilación de prolina y lisina, fosforilación de grupos hidroxilo de restos de serilo o treonilo, metilación de los grupos a-amino de cadenas laterales de lisina, arginina e histidina (T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, 1983, pp. 79-86), acetilación de la amina del extremo N y amidación de cualquier grupo carboxilo del extremo C.

Además, como será apreciado por los expertos en la técnica, se pueden añadir todas las marcas (incluyendo fluorescentes, enzimáticas, magnéticas, radiactivas, etc.) a los anticuerpos (así como las otras composiciones descritas y reivindicadas en el presente documento).

Glucosilación

Otro tipo de modificación covalente es las alteraciones en la glucosilación. En otra realización, los anticuerpos desvelados en el presente documento se pueden modificar para incluir una o más glucoformas manipuladas. Por "glucoforma manipulada", como se usa en el presente documento, se indica una composición de hidrato de carbono que está covalentemente unida al anticuerpo, en donde dicha composición de hidrato de carbono se diferencia químicamente de la de un anticuerpo principal. Las glucoformas manipuladas pueden ser útiles para una variedad de fines, que incluyen, pero no se limitan a, potenciar o reducir la función efectora. Una forma preferida de glucoforma manipulada es la afucosilación, que se ha mostrado que se correlaciona con un aumento en la función de ADCC, supuestamente mediante unión más ceñida al receptor FcyRIIIa. En este contexto, "afucosilación" significa que la mayor parte del anticuerpo producido en las células hospedadoras carece sustancialmente de fucosa, por ejemplo 90 95-98 % de los anticuerpos generados no tienen fucosa apreciable como componente del resto de hidrato de carbono del anticuerpo (generalmente unido en N297 en la región Fc). Definidos funcionalmente, los anticuerpos afucosilados presentan, en general, al menos a 50 % o mayor afinidad por el receptor FcYRIIIa.

Se pueden generar glucoformas manipuladas mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica (Umaña et al., 1999, Nat Biotechnol 17:176-180; Davies et al., 2001, Biotechnol Bioeng 74:288-294; Shields et al., 2002, J Biol Chem 277:26733-26740; Shinkawa et al., 2003, J Biol Chem 278:3466-3473; documentos de patente US 6.602.684; US 2007/0275460; US 2003/0003097; documento de patente PCT WO 00/61739A1; documento de patente PCT WO 01/29246A1; documento de patente PCT WO 02/31140A1; documento de patente PCT WO 02/30954A1; (tecnología Potelligent® [Biowa, Inc., Princeton, NJ]; tecnología de manipulación por glucosilación GlycoMAb® [Glycart Biotechnology AG, Zürich, Suiza]). Muchas de estas técnicas se basan en controlar el nivel de oligosacáridos fucosilados y/o bisecantes que se unen covalentemente a la región Fc, por ejemplo expresando una IgG en diversos organismos o líneas celulares, manipulados o de otro modo (por ejemplo, células CHO Lec-13 o células YB2/0 de hibridoma de rata, por regulación de enzimas implicadas en la vía de glucosilación (por ejemplo, FUT8 [a1,6-fucosiltranserasa] y/o p1-4-N-acetilglucosaminiltransferasa III [GnTIII]), o modificando hidrato(s) de carbono después de que se haya expresado la IgG. Por ejemplo, el "anticuerpo modificado con azúcar" o "tecnología SEA" de Seattle Genetics funciona añadiendo sacáridos modificados que inhiben la fucosilación durante la producción; véase, por ejemplo, el documento de patente US2009317869. La glucoforma manipulada normalmente se refiere a los diferentes hidratos de carbono u oligosacáridos; así un anticuerpo puede incluir una glucoforma manipulada.

Alternativamente, glucoforma manipulada se puede referir a la variante de IgG que comprende los diferentes hidratos de carbono u oligosacáridos. Como se conoce en la técnica, los patrones de glucosilación pueden depender de tanto la secuencia de la proteína (por ejemplo, la presencia o ausencia de restos de aminoácidos de glucosilación particular, tratados a continuación), como la célula hospedadora u organismo en el que se produce la proteína. Se tratan a continuación sistemas de expresión particulares.

La glucosilación de polipéptidos normalmente es o unida a N o unida a O. Unida a N se refiere a la unión del resto de hidrato de carbono a la cadena lateral de un resto de asparagina. Las secuencias de tri-péptidos asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, donde X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para la unión enzimática del resto de hidrato de carbono a la cadena lateral de asparagina. Así, la presencia de cualquiera de estas secuencias de tri-péptidos en un polipéptido crea un posible sitio de glucosilación. Glucosilación unida a O se refiere a la unión de uno de los azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa, o xilosa, a un hidroxiaminoácido, lo más comúnmente serina o treonina, aunque también se puede usar 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina.

La adición de sitios de glucosilación al anticuerpo se lleva a cabo convenientemente alterando la secuencia de aminoácidos de forma que contenga una o más de las secuencias de tri-péptidos anteriormente descritas (para sitios de glucosilación unidos a N). La alteración también se puede preparar mediante la adición de, o sustitución por, uno o más restos de serina o treonina a la secuencia inicial (para sitios de glucosilación unidos a O). Para mayor facilidad, la secuencia de aminoácidos del anticuerpo se altera preferentemente mediante cambios al nivel de ADN, particularmente mutando el ADN que codifica el polipéptido diana en bases preseleccionadas de forma que se generen codones que se traducirán en los aminoácidos deseados.

Otro medio de aumentar el número de restos de hidrato de carbono en la proteína de unión al antígeno es por acoplamiento químico o enzimático de glucósidos con la proteína. Estos procedimientos son ventajosos en que no requieren la producción de la proteína en una célula hospedadora que tiene capacidades de glucosilación para la glucosilación unida a N y O. Dependiendo del modo de acoplamiento usado, el (los) azúcar(es) se puede(n) unir a (a) arginina e histidina, (b) grupos carboxilo libres, (c) grupos sulfhidrilo libres tales como los de cisteína, (d) grupos hidroxilo libres tales como los de serina, treonina, o hidroxiprolina, (e) restos aromáticos tales como los de fenilalanina, tirosina, o triptófano, o (f) el grupo amida de glutamina. Estos métodos se describen en el documento de patente WO 87/05330 y en Aplin y Wriston, 1981, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306.

La eliminación de restos de hidrato de carbono presentes en el anticuerpo inicial (por ejemplo, post-traduccionalmente) se puede llevar a cabo química o enzimáticamente. La desglucosilación química requiere la exposición de la proteína al compuesto ácido trifluorometanosulfónico, o un compuesto equivalente. Este tratamiento da como resultado la escisión de la mayoría o todos los azúcares, excepto el azúcar de enlace (N-acetilglucosamina o N-acetilgalactosamina), mientras que deja el polipéptido intacto. La desglucosilación química se describe por Hakimuddin et al., 1987, Arch. Biochem. Biophys, 259:52 y por Edge et al., 1981, Anal. Biochem. 118:131. Se puede lograr la escisión enzimática de restos de hidrato de carbono en polipéptidos usando una variedad de endo- y exo-glucosidasas como se describe por Thotakura et al., 1987, Meth. Enzymol. 138:350. Se puede prevenir la glucosilación en posibles sitios de glucosilación por el uso del compuesto tunicamicina como se describe por Duskin et al., 1982, J. Biol. Chem.

257:3105. La tunicamicina bloquea la formación de enlaces proteína-N-glucósido.

Otro tipo de modificación covalente del anticuerpo comprende unir el anticuerpo a diversos polímeros no proteináceos, que incluyen, pero no se limitan a, diversos polioles tales como polietilenglicol, polipropilenglicol o polioxialquilenos, en el modo expuesto en, por ejemplo, 2005-2006 PEG Catalog de Nektar Therapeutics (disponible en el sitio web de Nektar), patentes de EE. UU. 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 o 4.179.337. Además, como se conoce en la técnica, se pueden hacer sustituciones de aminoácidos en diversas posiciones dentro del anticuerpo para facilitar la adición de polímeros tales como PEG. Véase, por ejemplo, la publicación de EE. UU. N° 2005/0114037A1.

Variantes de Fc adicionales para funcionalidad adicional

Además de las variantes de aminoácidos de pl, existen varias modificaciones de aminoácidos de Fc útiles que se pueden hacer por una variedad de motivos, que incluyen, pero no se limitan a, alterar la unión a uno más receptores FcyR, unión alterada a receptores FcRn, etc.

Por consiguiente, las proteínas de la invención pueden incluir modificaciones de aminoácidos, que incluyen las variantes de heterodimerización brevemente expuestas en el presente documento, que incluyen las variantes de pl.

Variantes de FcyR

Por consiguiente, existen varias sustituciones en Fc útiles que se pueden hacer para alterar la unión a uno o más de los receptores FcyR. Pueden ser útiles sustituciones que dan como resultado la elevada unión, así como reducida unión. Por ejemplo, se conoce que la elevada unión a FcRIIIa da como resultado, en general, elevada ADCC (citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo; la reacción mediada por células en donde células citotóxicas no específicas que expresan FcyRs reconocen anticuerpo unido en una célula diana y posteriormente provocan la lisis de la célula diana). Similarmente, la unión reducida a FcYRIIb (un receptor inhibidor) también puede ser beneficiosa en algunas circunstancias. Las sustituciones de aminoácidos que encuentran uso en la presente invención incluyen las enumeradas en los documentos de patente US 2006/0024298 (particularmente la Figura 41), US 2006/0121032, US 2006/0235208, US 2007/0148170. Las variantes particulares que encuentran uso incluyen, pero no se limitan a, 236A, 239D, 239E, 332E, 332D, 239D/332E, 267D, 267E, 328F, 267E/328F, 236A/332E, 239D/332E/330Y, 239D, 332E/330L y 299T.

Además, existen sustituciones de Fc adicionales que encuentran uso en la elevada unión al receptor FcRn y elevada semivida en suero, como se desvela específicamente en el documento de patente US 2009/0163699 que incluyen, pero no se limitan a, 434S, 428L, 308F, 259I, 428L/434S, 259I/308F, 436I/428L, 436I o V/434S, 436V/428L y 259I/308F/428L.

Variantes de escisión de Fc

Las variantes adicionales que encuentran uso en la presente invención son las que escinden (por ejemplo, reducen o eliminan) la unión a receptores de Fcy. Esto puede ser deseable para reducir los posibles mecanismos de acción (por ejemplo, reducir la actividad de ADCC) de los anticuerpos heterodiméricos de la invención. Se representan varias variantes de escisión de Fc adecuadas en la Figura 35, y pueden ser opcional e independientemente incluidas o excluidas en combinación con cualquier otra variante de heterodimerización, que incluye variantes de pI y estéricas.

Son de uso particular en algunas realizaciones un primer monómero (el "lado negativo") que contiene las variantes de pI N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D, variantes de sesgo 368D/370S y variantes de escisión E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, emparejadas con un lado positivo que no comprende las variantes de pI, variantes de sesgo S364K/E357Q y variantes de escisión E233P/L234V/L235A/G236del/S267K (conteniendo opcionalmente ambos monómeros las variantes de FcRn 428L/434S), donde el lado positivo es el monómero de scFv y contiene un conector de scFv cargado (particularmente cuando el scFv es anti-CD3). Una segunda realización utiliza un primer monómero de lado negativo que comprende I199T/N203D/K274Q/R355Q/Q419E/K447del, variantes de sesgo S364K/E357Q y variantes de escisión E233P/L234V/L235A/G236del/S267K (conteniendo opcionalmente ambos monómeros las variantes de FcRn 428L/434S), emparejadas con un lado positivo que comprende las variantes de pI Q196K/I199T/P271R/P228R/N276K, variantes de sesgo S364K/E357Q y variantes de escisión E233P/L234V/L235A/G236del/S267K (conteniendo opcionalmente ambos monómeros las variantes de FcRn 428L/434S), donde el lado positivo es el monómero de scFv y contiene un conector de scFv cargado (particularmente cuando el scFv es anti-CD3). Una tercera realización utiliza un primer monómero de lado negativo que comprende I199T/N203D/K274Q/R355Q/N384S/K392N/V397M/Q419E/K447del, variantes de sesgo S364K/E357Q y variantes de escisión E233P/L234V/L235A/G236del/S267K (conteniendo opcionalmente ambos monómeros las variantes de FcRn 428L/434S), emparejadas con un monómero de lado positivo sin variantes de pI, con variantes de sesgo S364K/E357Q y variantes de escisión E233P/L234V/L235A/G236del/S267K (conteniendo opcionalmente ambos monómeros las variantes de FcRn 428L/434S), donde el lado positivo es el monómero de scFv y contiene un conector de scFv cargado (particularmente cuando el scFv es anti-CD3). Una cuarta realización utiliza un primer monómero (el "lado negativo") que contiene las variantes de pI N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D, variantes de sesgo 368D/370S y variantes de escisión E233P/L234V/L235A/G236del/S239K, emparejadas con un lado positivo que no comprende variantes de pI, variantes de sesgo S364K/E357Q y variantes de escisión E233P/L234V/L235A/G236del/S239K (conteniendo opcionalmente ambos monómeros las variantes de FcRn 428L/434S). Una quinta realización utiliza un primer monómero de lado negativo que comprende I199T/N203D/K274Q/R355Q/Q419E/K447del, variantes de sesgo S364K/E357Q y variantes de escisión E233P/L234V/L235A/G236del/S239K (conteniendo opcionalmente ambos monómeros las variantes de FcRn 428L/434S), emparejadas con un lado positivo que comprende las variantes de pI Q196K/I199T/P271R/P228R/N276K, variantes de sesgo S364K/E357Q y variantes de escisión E233P/L234V/L235A/G236del/S239K (conteniendo opcionalmente ambos monómeros las variantes de FcRn 428L/434S). Una sexta realización utiliza un primer monómero de lado negativo que comprende I199T/N203D/K274Q/R355Q/N384S/K392N/V397M/Q419E/K447del, variantes de sesgo S364K/E357Q y variantes de escisión E233P/L234V/L235A/G236del/S267K (conteniendo opcionalmente ambos monómeros las variantes de FcRn 428L/434S), emparejadas con un monómero de lado positivo variantes de sesgo S364K/E357Q y variantes de escisión E233P/L234V/L235A/G236del/S239K (conteniendo opcionalmente ambos monómeros las variantes de FcRn 428L/434S), donde el lado positivo es el monómero de scFv y contiene un conector de scFv cargado (particularmente cuando el scFv es anti-CD3). Una séptima realización utiliza un primer monómero (el "lado negativo") que contiene las variantes de pI N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D, variantes de sesgo 368D/370S y variantes de escisión S239K/S267K, emparejadas con un lado positivo que no comprende variantes de pI, variantes de sesgo S364K/E357Q y variantes de escisión S239K/S267K (conteniendo opcionalmente ambos monómeros las variantes de FcRn 428L/434S), donde el lado positivo es el monómero de scFv y contiene un conector de scFv cargado (particularmente cuando el scFv es anti-CD3). Una octava realización utiliza un primer monómero de lado negativo que comprende I199T/N203D/K274Q/R355Q/Q419E/K447del, variantes de sesgo S364K/E357Q y variantes de escisión S239K/S267K (conteniendo opcionalmente ambos monómeros las variantes de FcRn 428L/434S), emparejadas con un lado positivo que comprende las variantes de pI Q196K/I199T/P271R/P228R/N276K, variantes de sesgo S364K/E357Q y variantes de escisión S239K/S267K, (conteniendo opcionalmente ambos monómeros las variantes de FcRn 428L/434S), donde el lado positivo es el monómero de scFv y contiene un conector de scFv cargado (particularmente cuando el scFv es anti-CD3). Una novena realización utiliza un primer monómero de lado negativo que comprende I199T/N203D/K274Q/R355Q/N384S/K392N/V397M/Q419E/K447del, variantes de sesgo S364K/E357Q y variantes de escisión S239K/S267K (conteniendo opcionalmente ambos monómeros las variantes de FcRn 428L/434S), emparejadas con un monómero de lado positivo sin variantes de pI, con variantes de sesgo S364K/E357Q y variantes de escisión S239K/S267K, (conteniendo opcionalmente ambos monómeros las variantes de FcRn 428L/434S), donde el lado positivo es el monómero de scFv y contiene un conector de scFv cargado (particularmente cuando el scFv es anti-CD3). Una décima realización utiliza un primer monómero (el "lado negativo") que contiene las variantes de pI N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D, variantes de sesgo 368D/370S y variantes de escisión S267K/P329K, emparejadas con a lado positivo que comprende no variantes de pI, variantes de sesgo S364K/E357Q y variantes de escisión S267K/P329K (conteniendo opcionalmente ambos monómeros las variantes de FcRn 428L/434S), donde el lado positivo es el monómero de scFv y contiene un conector de scFv cargado (particularmente cuando el scFv es anti-CD3). Un undécima realización utiliza un primer monómero de lado negativo que comprende I199T/N203D/K274Q/R355Q/Q419E/K447del, variantes de sesgo S364K/E357Q y variantes de escisión S267K/P329K (conteniendo opcionalmente ambos monómeros las variantes de FcRn 428L/434S), emparejadas con un lado positivo que comprende las variantes de pI Q196K/I199T/P271R/P228R/N276K, variantes de sesgo S364K/E357Q y variantes de escisión S267K/P329K (conteniendo opcionalmente ambos monómeros las variantes de FcRn 428L/434S), donde el lado positivo es el monómero de scFv y contiene un conector de scFv cargado (particularmente cuando el scFv es anti-CD3). Una 12a realización utiliza un primer monómero de lado negativo que comprende I199T/N203D/K274Q/R355Q/N384S/K392N/V397M/Q419E/K447del, variantes de sesgo S364K/E357Q y variantes de escisión S267K/P329K (conteniendo opcionalmente ambos monómeros las variantes de FcRn 428L/434S), emparejadas con un monómero de lado positivo sin variantes de pI, con variantes de sesgo S364K/E357Q y variantes de escisión S267K/P329K (conteniendo opcionalmente ambos monómeros las variantes de FcRn 428L/434S), donde el lado positivo es el monómero de scFv y contiene un conector de scFv cargado (particularmente cuando el scFv es anti-CD3).

Conectores

La presente divulgación proporciona opcionalmente conectores según se necesiten, por ejemplo en la adición de sitios de unión al antígeno adicionales, como se representa, por ejemplo, en las Figuras 11, 12 y 13, donde "el otro extremo" de la molécula contiene componentes de unión al antígeno adicionales. Además, como se expone brevemente más adelante, también se usan opcionalmente conectores en sistemas de conjugado de anticuerpo-fármaco (ADC). Cuando se usan para unir los componentes de las construcciones mAb-Fv centrales, el conector, en general, es un polipéptido que comprende dos o más restos de aminoácidos unidos por enlaces peptídicos y se usan para enlazar uno o más de los componentes de la presente invención. Dichos polipéptidos de conector se conocen bien en la técnica (véase por ejemplo, Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak, R. J., et al. (1994) Structure 2:1121-1123). Una variedad de conectores puede encontrar uso en algunas realizaciones descritas en el presente documento. Como será apreciado por los expertos en la técnica, existen al menos tres tipos de conectores diferentes usados en la presente invención.

"Conector" en el presente documento también se denomina "secuencia conectora", "espaciador", "secuencia de amarre" o sus equivalentes gramaticales. Se conocen bien los conectores homo- o hetero-bifuncionales (véase el catálogo de 1994 de Pierce Chemical Company, sección técnica sobre reticulantes, páginas 155-200). (Obsérvese la distinción entre "conectores" genéricos y "conectores de scFv y "conectores de scFv cargados"). Se pueden usar varias estrategias para enlazar covalentemente moléculas juntas. Estas incluyen, pero no se limitan a, enlaces polipeptídicos entre los extremos N y C de proteínas o dominios de proteína, enlace mediante enlaces disulfuro, y enlace mediante reactivos de reticulación química. En un aspecto de esta realización, el conector es un enlace peptídico, generado por técnicas recombinantes o síntesis de péptidos. El péptido conector puede incluir predominantemente los siguientes restos de aminoácidos: Gly, Ser, Ala o Thr. El péptido conector debe tener una longitud que es adecuada para enlazar dos moléculas de tal forma que asuman la conformación correcta la una con respecto a la otra de manera que retengan la actividad deseada. En una realización, el conector es desde aproximadamente 1 hasta 50 aminoácidos de longitud, preferentemente aproximadamente 1 a 30 aminoácidos de longitud. En una realización, se pueden usar conectores de 1 a 20 aminoácidos de longitud. Los conectores útiles incluyen polímeros de glicina-serina, que incluyen, por ejemplo, (GS)n, (GSGGS)n, (GGGGS)n y (GGGS)n, donde n es un número entero de al menos uno, polímeros de glicina-alanina, polímeros de alanina-serina, y otros conectores flexibles. Alternativamente, una variedad de polímeros no proteináceos, que incluyen, pero no se limitan a, polietilenglicol (PEG), polipropilenglicol, polioxialquilenos, o copolímeros de polietilenglicol y polipropilenglicol, pueden encontrar uso como conectores, es decir, pueden encontrar uso como conectores.

Otras secuencias conectoras pueden incluir cualquier secuencia de cualquier longitud de dominio CL/CH1, pero no todos los restos de dominio CL/CH1; por ejemplo, los primeros 5-12 restos de aminoácidos de los dominios CL/CH1. Los conectores se pueden derivar de la cadena ligera de la inmunoglobulina, por ejemplo Ck o CA. Los conectores se pueden derivar de la cadena pesada de las inmunoglobulinas de cualquier isotipo, que incluyen, por ejemplo, Cy1, Cy2, Cy3, Cy4, Ca1, Ca2, C5, Cs y Cg. También se pueden derivar secuencias conectoras de otras proteínas tales como proteínas de tipo Ig (por ejemplo TCR, FcR, KIR), secuencias derivadas de la región bisagra, y otras secuencias naturales de otras proteínas.

Conjugados de anticuerpo-fármaco

En algunas realizaciones, los anticuerpos multiespecíficos de la invención se conjugan con fármacos para formar conjugados de anticuerpo-fármaco (ADCs). En general, se usan ADCs en aplicaciones de oncología, donde el uso de conjugados de anticuerpo-fármaco para la administración local de agentes citotóxicos o citostáticos permite la administración elegida como diana del resto de fármaco a tumores, que puede permitir mayor eficacia, menor toxicidad, etc. Una visión general de esta tecnología se proporciona en Ducry et al., Bioconjugate Chem., 21:5-13 (2010), Carter et al., Cancer J. 14(3):154 (2008) y Senter, Current Opin. Chem. Biol. 13:235-244 (2009).

Así, la invención proporciona anticuerpos multiespecíficos conjugados con fármacos. En general, la conjugación se hace por unión covalente al anticuerpo, como se describe adicionalmente a continuación, y, en general, se basa en un conector, frecuentemente un enlace peptídico (que, como se describe más adelante, se puede diseñar para ser sensible a la escisión por proteasas en el sitio diana o no). Además, como se ha descrito anteriormente, el enlace de la unidad conector-fármaco (LU-D) se puede hacer por unión a cisteínas dentro del anticuerpo. Como será apreciado por los expertos en la técnica, el número de restos de fármaco por anticuerpo puede cambiar, dependiendo de las condiciones de la reacción, y puede variar desde 1:1 hasta 10:1 de fármaco:anticuerpo. Como será apreciado por los expertos en la técnica, el número real es un promedio.

Así, la invención proporciona anticuerpos multiespecíficos conjugados con fármacos. Como se describe más adelante, el fármaco del ADC puede ser cualquier número de agentes, que incluyen, pero no se limitan a, agentes citotóxicos tales como agentes quimioterapéuticos, agentes inhibidores del crecimiento, toxinas (por ejemplo, una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o fragmentos de los mismos), o un isótopo radiactivo (es decir, un radioconjugado). También se describen en el presente documento métodos de uso de los ADCs.

Los fármacos para su uso en la presente invención incluyen fármacos citotóxicos, particularmente los que se usan para terapia del cáncer. Dichos fármacos incluyen, en general, agentes que dañan el ADN, antimetabolitos, productos naturales y sus análogos. Las clases de agentes citotóxicos a modo de ejemplo incluyen inhibidores enzimáticos tales como inhibidores de dihidrofolato reductasa, e inhibidores de timidilato sintasa, intercaladores de ADN, escindidores de ADN, inhibidores de la topoisomerasa, la familia de fármacos de antraciclina, los fármacos de la vinca, las mitomicinas, las bleomicinas, los nucleósidos citotóxicos, la familia de fármacos de pteridina, diinenos, las podofilotoxinas, dolastatinas, maitansinoides, inductores de la diferenciación y taxoles.

Los miembros de estas clases incluyen, por ejemplo, metotrexato, metopterina, diclorometotrexato, 5-fluorouracilo, 6-mercaptopurina, arabinósido de citosina, melfalán, leurosina, leurosideína, actinomicina, daunorubicina, doxorubicina, mitomicina C, mitomicina A, caminomicina, aminopterina, talmentesomicina, podofilotoxina y derivados de podofilotoxina tales como etopósido o fosfato de etopósido, vinblastina, vincristina, vindesina, taxanos que incluyen taxol, taxotere, ácido retinoico, ácido butírico, N8-acetil espermidina, camptotecina, caliqueamicina, esperamicina, eno-diinos, duocarmicina A, duocarmicina SA, caliqueamicina, camptotecina, maitansinoides (incluyendo DM1), monometilauristatina E (MMAE), monometilauristatina F (MMAF) y maitansinoides (DM4) y sus análogos.

Las toxinas se pueden usar como conjugados de anticuerpo-toxina e incluyen toxinas bacterianas tales como toxina diftérica, toxinas vegetales tales como ricina, toxinas de molécula pequeña tales como geldanamicina (Mandler et al (2000) J. Nat. Cancer Inst. 92(19):1573-1581; Mandler et al (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028; Mandler et al (2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791), maitansinoides (documento de patente EP 1391213; Liu et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623) y caliqueamicina (Lode et al (1998) Cancer Res. 58:2928; Hinman et al (1993) Cancer Res. 53:3336-3342). Las toxinas pueden ejercer sus efectos citotóxico y citostáticos por mecanismos que incluyen unión a tubulina, unión a ADN, o inhibición de la topoisomerasa.

Se contemplan los conjugados de un anticuerpo multiespecífico y una o más toxinas de molécula pequeña, tales como maitansinoides, dolastatinas, auristatinas, un tricoteceno, caliqueamicina, y CC1065, y los derivados de estos toxinas que tienen actividad de toxina.

Maitansinoides

Se conocen bien en la técnica compuestos de maitansina adecuados para su uso como restos de fármaco maitansinoide, y se pueden aislar de fuentes naturales según métodos conocidos, producir usando técnicas de ingeniería genética (véase Yu et al (2002) PNAS 99:7968-7973), o análogos de maitansinol y maitansinol preparados sintéticamente según métodos conocidos. Como se describe más adelante, los fármacos se pueden modificar por la incorporación de un grupo funcionalmente activo tal como un grupo tiol o amina para conjugación con el anticuerpo.

Los restos de fármaco maitansinoide a modo de ejemplo incluyen los que tienen un anillo aromático modificado, tal como: C-19-descloro (patente de EE. UU. N° 4.256.746) (preparados por reducción con hidruro de litio y aluminio de ansamitocina P2); C-20-hidroxi (o C-20-demetilo) /-C-19-descloro (patentes de EE. UU. N° 4.361.650 y 4.307.016) (preparados por desmetilación usando Streptomyces o Actinomyces o descloración usando LAH); y C-20-desmetoxi, C-20-aciloxi (--OCOR), /-descloro (patente de EE. UU. N° 4.294.757) (preparados por acilación usando cloruro de acilo) y los que tienen modificaciones en otras posiciones

Los restos de fármaco maitansinoide a modo de ejemplo también incluyen los que tienen modificaciones tales como: C-9-SH (patente de EE. UU. N° 4.424.219) (preparados mediante la reacción de maitansinol con H2S o P2S5); C-14-alcoximetilo (desmetoxi/CH2OR) (patente de Ee . UU. N° 4.331.598); C-14-hidroximetilo o aciloximetilo (CH2OH o CH2OAc) (patente de EE. UU. N° 4.450.254) (preparados de Nocardia); C-15-hidroxi/aciloxi (patente de EE. UU. N° 4.364.866) (preparados por la conversión de maitansinol por Streptomyces); C-15-mestoxi (patentes de EE. UU. N° 4.313.946 y 4.315.929) (aislados de Trewia nudiflora); C-18-N-desmetilo (patentes de EE. UU. N° 4.362.663 y 4.322.348) (preparados por la desmetilación de maitansinol por Streptomyces); y 4,5-desoxi (patente de EE. UU. N° 4.371.533) (preparados por la reducción con tricloruro de titanio/LAH de maitansinol).

Son de uso particular DM1 (desvelado en la patente de EE. UU. N° 5.208.020, incorporado como referencia) y DM4 (desvelado en la patente de EE. UU. N° 7.276.497). Véanse también varios derivados de maitansinoide adicionales y métodos en los documentos de patente 5.416.064, WO/01/24763, 7.303.749, 7.601.354, US 7.303.749, WO02/098883, 6.441.163, 7.368.565, WO02/16368 y WO04/1033272.

Se desvelan ADCs que contienen maitansinoides, métodos de producción de los mismos, y su uso terapéutico, por ejemplo, en las patentes de EE. UU. N° 5.208.020; 5.416.064; 6.441.163 y la patente europea EP 0425 235 B1. Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623 (1996) describieron ADCs que comprendían un maitansinoide designado DM1 enlazado al anticuerpo monoclonal C242 dirigido contra cáncer colorrectal humano. Se encontró que el conjugado era altamente citotóxico hacia células de cáncer de colon cultivadas, y mostró actividad antitumoral en un ensayo de crecimiento tumoral in vivo.

Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992) describen ADCs en los que un maitansinoide se conjugó por un conector de disulfuro con el anticuerpo murino A7 que se une a un antígeno en líneas celulares de cáncer de colon humano, o a otro anticuerpo monoclonal murino TA.1 que se une al oncogén HER-2/neu. Se probó in vitro la citotoxicidad del conjugado de TA.1-maitansonoide en la línea celular de cáncer de mama humano SK-BR-3, que expresa 3x105 antígenos de superficie HER-2 por célula. El conjugado de fármaco logró un grado de citotoxicidad similar al fármaco maitansinoide libre, que se podría aumentar aumentando el número de moléculas de maitansinoide por molécula de anticuerpo. El conjugado de A7-maitansinoide mostró baja citotoxicidad sistémica en ratones.

Auristatinas y dolastatinas

En algunas realizaciones, el ADC comprende un anticuerpo multiespecífico conjugado con dolastatinas o análogos y derivados peptídicos de dolastatina, las auristatinas (patentes de EE. UU. N° 5.635.483; 5.780.588). Se ha mostrado que las dolastatinas y auristatinas interfieren con la dinámica de los microtúbulos, hidrólisis de GTP y división nuclear y división (Woyke et al (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12):3580-3584) y tienen actividad anticancerosa (patente de e E. UU. N° 5.663.149) y antifúngica (Pettit et al (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965). El resto de fármaco dolastatina o auristatina se puede unir al anticuerpo a través del extremo N (amino) o el extremo C (carboxilo) del resto de fármaco peptídico (documento de patente WO 02/088172).

Las realizaciones de auristatina a modo de ejemplo incluyen restos DE y DF de fármaco monometilauristatina enlazados al extremo N, desvelados en "Sentran en et al., Proceedings of the American Association for Cancer Research, Volumen 45, Resumen Número 623, presentado el 28 de marzo de 2004 y descrito en la publicación de patente de Estados Unidos N° 2005/0238648.

Una realización de auristatina a modo de ejemplo es MMAE (véase la patente de EE. UU. N° 6.884.869).

Otra realización de auristatina a modo de ejemplo es MMAF (véanse los documentos de patente US 2005/0238649, 5.767.237 y 6.124.431).

Las realizaciones adicionales a modo de ejemplo que comprenden MMAE o MMAF y diversos componentes conectores (descritos adicionalmente en el presente documento) tienen las siguientes estructuras y abreviaturas (en donde Ab significa anticuerpo y p es 1 a aproximadamente 8):

Normalmente, se pueden preparar restos de fármaco basados en péptidos formando un enlace peptídico entre dos o más aminoácidos y/o fragmentos de péptidos. Dichos enlaces peptídicos se pueden preparar, por ejemplo, según el método de síntesis en fase líquida (véase E. Schroder y K. Lubke, "The Peptides", volumen 1, pp 76-136, 1965, Academic Press) que se conoce bien en el campo de la química de péptidos. Los restos de fármaco de auristatina/dolastatina se pueden preparar según los métodos de: la patente de EE. UU. N° 5.635.483; la patente de EE. UU. N° 5.780.588; Pettit et al (1989) J. Am. Chem. Soc. 111:5463-5465; Pettit et al (1998) Anti-Cancer Drug Design 13:243-277; Pettit, G. R., et al. Synthesis, 1996, 719-725; Pettit et al. (1996) J. Chem. Soc. Perkin Trans. 15:859-863; y Doronina (2003) Nat Biotechnol 21(7):778-784.

Caliqueamicina

Como se describe en el presente documento, el ADC comprende un anticuerpo de la invención conjugado con una o más moléculas de caliqueamicina. Por ejemplo, Mylotarg es el primer fármaco de ADC comercial y utiliza caliqueamicina y1 como carga útil (véase la patente de EE. UU. N° 4.970.198). Se describen derivados de caliqueamicina adicionales en las patentes de EE. UU. N° 5.264.586, 5.384.412, 5.550.246, 5.739.116, 5.773.001, 5.767.285 y 5.877.296. La familia de antibióticos de caliqueamicina es capaz de producir roturas de ADN bicatenario en concentraciones subpicomolares. Para la preparación de los conjugados de la familia de caliqueamicina, véanse las patentes de EE. UU. N25.712.374, 5.714.586, 5.739.116, 5.767.285, 5.770.701,5.770.710, 5.773.001, 5.877.296 (todas de American Cyanamid Company). Los análogos estructurales de caliqueamicina que se pueden usar incluyen, pero no se limitan a, y1I, a2I, a2I, N-acetil-Y1I, PSAG y 0I1 (Hinman et al., Cancer Research 53:3336-3342 (1993), Lode et al., Cancer Research 58:2925-2928 (1998) y las patentes de EE. UU. anteriormente mencionadas de American Cyanamid). Otro fármaco antitumoral con el que se puede conjugar el anticuerpo es QFA, que es un antifolato. Tanto la caliqueamicina como QFA tienen sitios de acción intracelular y no atraviesan fácilmente la membrana plasmática. Por tanto, la captación celular de estos agentes a través de la internalización mediada por anticuerpo potencia enormemente sus efectos citotóxicos.

Duocarmicinas

CC-1065 (véase la patente de EE. UU. N° 4.169.888) y las duocarmicinas son miembros de una familia de antibióticos antitumorales utilizados en ADC. Estos antibióticos parecen trabajar a través de ADN selectivamente alquilante de secuencias en el N3 de adenina en el surco menor, que inicia una cascada de eventos que da como resultado la apoptosis.

Miembros importantes de las duocarmicinas incluyen duocarmicina A (patente de EE. UU. N° 4.923.990) y duocarmicina SA (patente de EE. UU. N° 5.101.038), y un gran número de análogos como se describen en las patentes de EE. UU. N27.517.903, 7.691.962, 5.101.038; 5.641.780; 5.187.186; 5.070.092; 5.070.092; 5.641.780; 5.101.038; 5.084.468. 5.475.092. 5.585.499, 5.846.545, WO2007/089149, WO2009/017394A1,5.703.080, 6.989.452, 7.087.600, 7.129.261,7.498.302 y 7.507.420.

Otros agentes citotóxicos

Otros agentes antitumorales que se pueden conjugar con los anticuerpos de la invención incluyen BCNU, estreptozoicina, vincristina y 5-fluorouracilo, la familia de agentes conocida conjuntamente como complejo de LL-E33288 descrita en las patentes de EE. UU. N° 5.053.394, 5.770.710, así como esperamicinas (patente de EE. UU. N25.877.296).

Las toxinas enzimáticamente activas y sus fragmentos que se pueden usar incluyen cadena de difteria A, fragmentos activos que no son de unión de toxina diftérica, cadena de exotoxina A (de Pseudomonas aeruginosa), cadena de ricina A, cadena de abrina A, cadena de modeccina A, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAP-S), inhibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de Saponaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricotecenos. Véase, por ejemplo, el documento de patente WO 93/21232 publicado el 28 de octubre de 1993.

En el presente documento se describe un ADC formado entre un anticuerpo y un compuesto con actividad nucleolítica (por ejemplo, una ribonucleasa o una endonucleasa de ADN tal como una desoxirribonucleasa; DNAsa).

Para la destrucción selectiva del tumor, el anticuerpo puede comprender un átomo altamente radiactivo. Están disponibles una variedad de isótopos radiactivos para la producción de anticuerpos radioconjugados. Los ejemplos incluyen At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radiactivos de Lu.

Las radiomarcas u otras marcas se pueden incorporar en el conjugado en formas conocidas. Por ejemplo, el péptido puede ser biosintetizado o se puede sintetizar por síntesis química de aminoácidos usando precursores de aminoácidos adecuados que implican, por ejemplo, flúor-19 en lugar de hidrógeno. Marcas tales como Tc99m o I123, Re186, Re188 e In111 se pueden unir mediante un resto de cisteína en el péptido. Se puede unir itrio-90 mediante un resto de lisina. Se puede usar el método IODOGEN (Fraker et al (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57 para incorporar Yodo-123. "Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" (Chatal, CRC Press 1989) describe otros métodos con detalle.

Para composiciones que comprenden una pluralidad de anticuerpos, la carga de fármaco se representa por p, el número promedio de moléculas de fármaco por anticuerpo. La carga de fármaco puede varias desde 1 hasta 20 fármacos (D) por anticuerpo. El número promedio de fármacos por anticuerpo en la preparación de reacciones de conjugación se puede caracterizar por medios convencionales tales como espectroscopía de masas, ensayo de ELISA, y HPLC. También se puede determinar la distribución cuantitativa de los conjugados de anticuerpo-fármaco en términos de p.

En algunos casos, la separación, purificación y caracterización de conjugados de anticuerpo-fármaco homogéneos donde p es un valor determinado de conjugados de anticuerpo-fármaco con otras cargas de fármaco se puede lograr por medios tales como HPLC de fase inversa o electroforesis. En realizaciones a modo de ejemplo, p es 2, 3, 4, 5, 6, 7, u 8 o una fracción de los mismos.

La generación de compuestos de conjugado de anticuerpo-fármaco se puede lograr mediante cualquier técnica conocida para el experto. Brevemente, los compuestos de conjugado de anticuerpo-fármaco pueden incluir un anticuerpo multiespecífico como la unidad de anticuerpo, un fármaco y opcionalmente un conector que une el fármaco y el agente de unión.

Están disponibles varias reacciones diferentes para la unión covalente de fármacos y/o conectores con agentes de unión. Esto se puede llevar a cabo haciendo reaccionar los restos de aminoácidos del agente de unión, por ejemplo, molécula de anticuerpo, que incluye los grupos amina de lisina, los grupos ácido carboxílico libre de ácido glutámico y aspártico, los grupos sulfhidrilo de cisteína y los diversos restos de los aminoácidos aromáticos. Un método de unión covalente no específico comúnmente usado es la reacción de carbodiimida para enlazar un grupo carboxi (o amino) de un compuesto con grupos amino (o carboxi) del anticuerpo. Además, se han usado agentes bifuncionales tales como dialdehídos o imidoésteres para enlazar el grupo amino de un compuesto con grupos amino de una molécula de anticuerpo.

También está disponible para la unión de fármacos a agentes de unión la reacción de base de Schiff. Este método implica la oxidación con peryodato de un fármaco que contiene grupos glicol o hidroxi, formando así un aldehído que entonces se hace reaccionar con el agente de unión. La unión ocurre mediante la formación de una base de Schiff con grupos amino del agente de unión. También se pueden usar isotiocianatos como agentes de acoplamiento para unir covalentemente los fármacos con los agentes de unión. El experto conoce otras técnicas y están dentro del alcance de la presente invención.

En algunas realizaciones, se hace reaccionar un producto intermedio, que es el precursor del conector, con el fármaco bajo condiciones apropiadas. En otras realizaciones, se usan grupos reactivos en el fármaco y/o el producto intermedio. El producto de la reacción entre el fármaco y el producto intermedio, o el fármaco derivado, se hace reaccionar posteriormente con un anticuerpo multiespecífico de la invención bajo condiciones apropiadas.

Se entenderá que también se pueden hacer modificaciones químicas al compuesto deseado para hacer reacciones de ese compuesto más convenientes para los fines de preparación de los conjugados de la invención. Por ejemplo, se puede unir un grupo funcional, por ejemplo amina, hidroxilo, o sulfhidrilo, al fármaco en una posición que tiene un efecto mínimo o aceptable sobre la actividad u otras propiedades del fármaco

Unidades de conector

Normalmente, los compuestos de conjugado de anticuerpo-fármaco comprenden una unidad de conector entre la unidad de fármaco y la unidad de anticuerpo. En algunas realizaciones, el conector es escindible bajo condiciones intracelulares o extracelulares, de forma que la escisión del conector libere la unidad de fármaco del anticuerpo en el entorno apropiado. Por ejemplo, tumores sólidos que secretan ciertas proteasas pueden servir de diana del conector escindible; en otras realizaciones, son las proteasas intracelulares las que se utilizan. En aún otras realizaciones, la unidad de conector no es escindible y se libera el fármaco, por ejemplo, por degradación de anticuerpos en lisosomas.

En algunas realizaciones, el conector es escindible por un agente de escisión que está presente en el entorno intracelular (por ejemplo, dentro de un lisosoma o endosoma o caveolas). El conector puede ser, por ejemplo, un conector de peptidilo que se escinde por una enzima peptidasa o proteasa intracelular, que incluye, pero no se limita a, una proteasa lisosomal o endosómica. En algunas realizaciones, el conector de peptidilo tiene al menos dos aminoácidos de longitud o al menos tres aminoácidos de longitud o más.

Los agentes de escisión pueden incluir, sin limitación, catepsinas B y D y plasmina, todas las cuales se conocen por hidrolizar derivados de fármacos de dipéptido dando como resultado la liberación de fármaco activo dentro de células diana (véase, por ejemplo, Dubowchik y Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83:67-123). Los conectores de peptidilo son escindibles por enzimas que están presentes en células que expresan CD38. Por ejemplo, se puede usar un conector de peptidilo que es escindible por la proteasa dependiente de tiol catepsina B, que es altamente expresada en tejido canceroso (por ejemplo, un conector de Phe-Leu o de Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID NO: X)). Otros ejemplos de dichos conectores se describen, por ejemplo, en la patente de EE. UU. N° 6.214.345.

En algunas realizaciones, el conector de peptidilo escindible por una proteasa intracelular es un conector de Val-Cit o un conector de Phe-Lys (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. N° 6.214.345, que describe la síntesis de doxorubicina con el conector de val-cit).

En otras realizaciones, el conector escindible es sensible al pH, es decir, sensible a la hidrólisis a ciertos valores de pH. Normalmente, el conector sensible al pH hidrolizable bajo condiciones ácidas. Por ejemplo, se puede usar un conector lábil al ácido que es hidrolizable en el lisosoma (por ejemplo, una hidrazona, semicarbazona, tiosemicarbazona, amida cis-aconítica, ortoéster, acetal, cetal, o similares) (véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. N25.122.368; 5.824.805; 5.622.929; Dubowchik y Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83:67-123; Neville et al., 1989, Biol. Chem. 264:14653-14661.) Dichos conectores son relativamente estables bajo condiciones de pH neutro, tales como aquellas en la sangre, pero son inestables por debajo de pH 5,5 o 5,0, el pH aproximado del lisosoma. En ciertas realizaciones, el conector hidrolizable es un conector de tioéter (tal como, por ejemplo, un tioéter unido al agente terapéutico mediante un enlace acilhidrazona (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. N° 5.622.929).

En aún otras realizaciones, el conector es escindible bajo condiciones reductoras (por ejemplo, un conector de disulfuro). Se conocen en la técnica una variedad de conectores de disulfuro, que incluyen, por ejemplo, los que se pueden formar usando SATA (N-succinimidil-5-acetiltioacetato), SPDP (N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato), SPDB (N-succinimidil-3-(2-piridilditio)butirato) y SMPT (N-succinimidil-oxicarbonil-alfa-metil-alfa-(2-piridilditio)tolueno)-, SPDB y Sm Pt (véanse, por ejemplo, Thorpe et al., 1987, Cancer Res. 47:5924-5931; Wawrzynczak et al., en Immunoconjugates: Antibody Conjugates in Radioimagery and Therapy of Cancer (C. W. Vogel ed., Oxford U. Press, 1987. Véase también la patente de EE. UU. N° 4.880.935)

En otras realizaciones, el conector es un conector de malonato (Johnson et al., 1995, Anticancer Res. 15:1387-93), un conector de maleimidobenzoílo (Lau et al., 1995, Bioorg-Med-Chem. 3(10):1299-1304), o un análogo de 3'-N-amida (Lau et al., 1995, Bioorg-Med-Chem. 3(10) :1305-12).

En aún otras realizaciones, la unidad de conector no es escindible y el fármaco se libera por degradación del anticuerpo (véase la publicación de EE. UU. N° 2005/0238649).

En muchas realizaciones, el conector es auto-inmolativo. Como se usa en el presente documento, el término "espaciador auto-inmolativo" se refiere a un resto químico bifuncional que es capaz de unir covalentemente juntos dos restos químicos separados en una molécula tripartita estable. Se separará espontáneamente del segundo resto químico si se escinde su enlace con el primer resto. Véanse, por ejemplo, los documentos de patente WO 2007059404A2, WO06110476A2, WO05112919A2, WO2010/062171, WO09/017394, WO07/089149, WO 07/018431, WO04/043493 y WO02/083180, que se dirigen a conjugados de fármaco-sustrato escindible donde el fármaco y el sustrato escindible se enlazan opcionalmente a través de un conector auto-inmolativo.

Frecuentemente, el conector no es sustancialmente sensible al entorno extracelular. Como se usa en el presente documento, "no sustancialmente sensible al entorno extracelular", en el contexto de un conector, significa que no más de aproximadamente 20 %, 15 %, 10 %, 5 %, 3 %, o no más de aproximadamente 1 % de los conectores, en una muestra de compuesto de conjugado de anticuerpo-fármaco, se escinden cuando el compuesto de conjugado de anticuerpo-fármaco se presenta en un entorno extracelular (por ejemplo, en plasma).

Si un conector no es sustancialmente sensible al entorno extracelular, se puede determinar, por ejemplo, incubando con plasma el compuesto de conjugado de anticuerpo-fármaco durante un periodo de tiempo predeterminado (por ejemplo, 2, 4, 8, 16 o 24 horas) y luego cuantificando la cantidad de fármaco libre presente en el plasma.

En otras realizaciones no mutuamente excluyentes, el conector promueve la internalización celular. En ciertas realizaciones, el conector promueve la internalización celular cuando se conjuga con el agente terapéutico (es decir, en el medio del resto de conector-agente terapéutico del compuesto de conjugado de anticuerpo-fármaco como se describe en el presente documento). En aún otras realizaciones, el conector promueve la internalización celular cuando se conjuga con tanto el compuesto de auristatina como los anticuerpos multiespecíficos de la invención.

Una variedad de conectores a modo de ejemplo que se pueden usar con las presentes composiciones y métodos se describen en el documento de patente WO 2004-010957, la publicación de EE. UU. N° 2006/0074008, la publicación de EE. UU. N° 20050238649 y la publicación de EE. UU. N° 2006/0024317.

Carga de fármaco

La carga de fármaco se representa por p y es el número promedio de restos de fármaco por anticuerpo en una molécula. La carga de fármaco ("p") puede ser 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más restos (D) por anticuerpo, aunque frecuentemente el número promedio es una fracción o un decimal. En general, es frecuentemente útil la carga de fármaco de desde 1 hasta 4, y también es útil desde 1 hasta 2. Los ADCs descritos en el presente documento incluyen conjuntos de anticuerpos conjugados con un intervalo de restos de fármaco, desde 1 hasta 20. El número promedio de restos de fármaco por anticuerpo en las preparaciones de ADC de las reacciones de conjugación se puede caracterizar por medios convencionales tales como espectroscopía de masas y, ensayo de ELISA.

También se puede determinar la distribución cuantitativa de ADC en términos de p. En algunos casos, la separación, purificación y caracterización de ADC homogéneos donde p es un cierto valor de ADC con otras cargas de fármaco se puede lograr por medios tales como electroforesis.

Para algunos conjugados de anticuerpo-fármaco, p se puede limitar por el número de sitios de unión en el anticuerpo. Por ejemplo, donde la unión es un tiol de cisteína, como en las realizaciones a modo de ejemplo anteriormente, un anticuerpo puede tener solo uno o varios grupos tiol de cisteína, o puede tener solo uno o varios grupos tiol suficientemente reactivos mediante los que se puede unir un conector. En ciertas realizaciones, carga de fármaco más alta, por ejemplo p>5, puede provocar la agregación, insolubilidad, toxicidad, o pérdida de permeabilidad celular de ciertos conjugados de anticuerpo-fármaco. En ciertas realizaciones, la carga de fármaco para un ADC descrito en el presente documento varía desde 1 hasta aproximadamente 8; desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 6; desde aproximadamente 3 hasta aproximadamente 5; desde aproximadamente 3 hasta aproximadamente 4; desde aproximadamente 3,1 hasta aproximadamente 3,9; desde aproximadamente 3,2 hasta aproximadamente 3,8; desde aproximadamente 3,2 hasta aproximadamente 3,7; desde aproximadamente 3,2 hasta aproximadamente 3,6; desde aproximadamente 3,3 hasta aproximadamente 3,8; o desde aproximadamente 3,3 hasta aproximadamente 3,7. De hecho, se ha mostrado que para ciertos ADCs, la relación óptima entre restos de fármaco por anticuerpo puede ser inferior a 8, y puede ser aproximadamente 2 a aproximadamente 5. Véase el documento de patente US 2005-0238649 A1.

En ciertas realizaciones, menos del máximo teórico de restos de fármaco está conjugado con un anticuerpo durante una reacción de conjugación. Un anticuerpo puede contener, por ejemplo, restos de lisina que no reaccionan con el producto intermedio de fármaco-conector o reactivo de conector, como se trata más adelante. En general, los anticuerpos no contienen muchos grupos tiol de cisteína libres y reactivos que se puedan unir a un resto de fármaco; de hecho la mayoría de los restos de tiol de cisteína en los anticuerpos existen como puentes disulfuro. En ciertas realizaciones, un anticuerpo se puede reducir con un agente reductor tal como ditiotreitol (DTT) o tricarboniletilfosfina (TCEP), bajo condiciones reductoras parciales o totales, para generar grupos tiol de cisteína reactivos. En ciertas realizaciones, un anticuerpo se somete a condiciones desnaturalizantes para revelar grupos nucleófilos reactivos tales como lisina o cisteína.

La carga (relación fármaco/anticuerpo) de un ADC se puede controlar en diferentes formas, por ejemplo: (i) limitando el exceso molar de producto intermedio de fármaco-conector o reactivo de conector con respecto al anticuerpo, (ii) limitando el tiempo o la temperatura de la reacción de conjugación, (iii) condiciones reductoras parciales o limitantes para modificación de tiol de cisteína, (iv) manipulando por técnicas recombinantes la secuencia de aminoácidos del anticuerpo de forma que el número y la posición de los restos de cisteína se modifiquen para controlar el número y/o la posición de acoplamientos conector-fármaco (tales como tioMab o tioFab preparados como se desvela en el presente documento y en el documento de patente WO2006/034488).

Se debe entender que donde más de un grupo nucleófilo reacciona con un producto intermedio de fármaco-conector o reactivo de conector seguido por reactivo de resto de fármaco, entonces el producto resultante es una mezcla de compuestos de ADC con una distribución de uno o más restos de fármaco unidos a un anticuerpo. El número promedio de fármacos por anticuerpo se puede calcular a partir de la mezcla por un ensayo de anticuerpo de ELISA dual, que es específico para anticuerpo y específico para el fármaco. Las moléculas de ADC individuales se pueden identificar en la mezcla por espectroscopía de masas y separar por HPLC, por ejemplo cromatografía de interacción hidrófoba.

En algunas realizaciones, se puede aislar un ADC homogéneo con un único valor de carga de la mezcla de conjugación por electroforesis o cromatografía.

Métodos de determinación del efecto citotóxico de ADCs

Se conocen los métodos de determinación de si un fármaco o conjugado de anticuerpo-fármaco ejerce un efecto citostático y/o citotóxico en una célula. En general, la actividad citotóxica o citostática de un conjugado de anticuerpofármaco se puede medir por: exposición de células de mamífero que expresan una proteína diana del conjugado de anticuerpo-fármaco en un medio de cultivo celular; cultivo de las células durante un periodo desde aproximadamente 6 horas hasta aproximadamente 5 días; y medición de la viabilidad celular. Se pueden usar ensayos in vitro basados en célula para medir la viabilidad (proliferación), citotoxicidad e inducción de la apoptosis (activación de caspasas) del conjugado de anticuerpo-fármaco.

Para determinar si un conjugado de anticuerpo-fármaco ejerce un efecto citostático, se puede usar un ensayo de incorporación de timidina. Por ejemplo, se pueden cultivar células cancerosas que expresan un antígeno diana a una densidad de 5.000 células/pocillo de una placa de 96 pocillos durante un periodo de 72 horas y exponer a 0,5 gCi de 3H-timidina durante las 8 horas finales del periodo de 72 horas. La incorporación de 3H-timidina en células del cultivo se mide en presencia y ausencia del conjugado de anticuerpo-fármaco.

Para determinar la citotoxicidad, se puede medir la necrosis o apoptosis (muerte celular programada). La necrosis normalmente va acompañada por elevada permeabilidad de la membrana plasmática; hinchamiento de la célula, y ruptura de la membrana plasmática. La apoptosis normalmente se caracteriza por vesiculación de la membrana, condensación del citoplasma y activación de endonucleasas endógenas. La determinación de cualquiera de estos efectos sobre células cancerosas indica que un conjugado de anticuerpo-fármaco es útil en el tratamiento de cánceres.

Se puede medir la viabilidad celular determinando en una célula la captación de un colorante tal como rojo neutro, azul de tripano, o azul ALAMAR™ (véase, por ejemplo, Page et al., 1993, Intl. J. Oncology 3:473-476). En dicho ensayo, las células se incuban en medios que contienen el colorante, se lavan las células, y se mide espectrofotométricamente el colorante restante, que refleja la captación celular del colorante. También se puede usar el colorante que se une a la proteína sulforodamina B (SRB), para medir la citoxicidad (Skehan et al., 1990, J. Natl. Cancer Inst. 82:1107-12).

Alternativamente, se usa una sal de tetrazolio, tal como MTT, en un ensayo colorimétrico cuantitativo para la supervivencia y proliferación de células de mamífero detectando células vivas, pero no muertas (véase, por ejemplo, Mosmann, 1983, J. Immunol. Methods 65:55-63).

Se puede cuantificar la apoptosis midiendo, por ejemplo, la fragmentación del ADN. Están disponibles métodos fotométricos comerciales para la determinación cuantitativa in vitro de la fragmentación de ADN. Los ejemplos de dichos ensayos, que incluyen TUNEL (que detecta la incorporación de nucleótidos marcados en ADN fragmentado) y ensayos basados en ELISA, se describen en Biochemica, 1999, no. 2, pp. 34-37 (Roche Molecular Biochemicals).

La apoptosis también se puede determinar midiendo los cambios morfológicos en una célula. Por ejemplo, al igual que la necrosis, se puede determinar la pérdida de integridad de la membrana plasmática midiendo la captación de ciertos colorantes (por ejemplo, un colorante fluorescente tal como, por ejemplo, naranja de acridina o bromuro de etidio). Se ha descrito un método de medición del número de células apoptósicas por Duke y Cohen, Current Protocols in Immunology (Coligan et al. eds., 1992, pp. 3.17.1-3.17.16). Las células también se pueden marcar con un colorante de ADN (por ejemplo, naranja de acridina, bromuro de etidio o yoduro de propidio) y las células se observan para condensación de cromatina y marginación a lo largo de la membrana nuclear interna. Otros cambios morfológicos que se pueden medir para determinar la apoptosis incluyen, por ejemplo, condensación citoplásmica, vesiculación de membrana aumentada y encogimiento celular.

La presencia de células apoptósicas se puede medir en tanto los compartimentos unidos como "flotantes" de los cultivos. Por ejemplo, ambos compartimentos se pueden recoger retirando el sobrenadante, tripsinando las células unidas, combinando las preparaciones tras una etapa de lavado por centrifugación (por ejemplo, 10 minutos a 2000 rpm), y detectando la apoptosis (por ejemplo, midiendo la fragmentación del ADN) (véase, por ejemplo, Piazza et al., 1995, Cancer Research 55:3110-16).

In vivo, el efecto de una composición terapéutica del anticuerpo multiespecífico de la invención se puede evaluar en un modelo animal adecuado. Por ejemplo, se pueden usar modelos de cáncer xenogénico, en donde explantes de cáncer o tejidos de xenoinjerto sometidos a pases se introducen en animales inmunodeprimidos, tales como ratones desnudos o SCID (Klein et al., 1997, Nature Medicine 3: 402-408). Se pueden medir usando ensayos de eficacia que miden la inhibición de la formación de tumores, regresión o metástasis tumoral, y similares.

Las composiciones terapéuticas usadas en la práctica de los métodos anteriores se pueden formular en composiciones farmacéuticas que comprenden un vehículo adecuado para el método de administración deseado. Los vehículos adecuados incluyen cualquier material que cuando se combina con la composición terapéutica retiene la función antitumoral de la composición terapéutica y, en general, no es reactiva con el sistema inmunitario del paciente. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, cualquiera de los varios vehículos farmacéuticos estándar, tales como soluciones salinas tamponadas con fosfato estériles, agua bacteriostática, y similares (véase, en general, Remington's Pharmaceutical Sciences 16a Edición, A. Osal., Ed., 1980).

Composiciones de anticuerpo para administración in vivo

Las formulaciones de los anticuerpos descritos en el presente documento se preparan para almacenamiento mezclando un anticuerpo que tiene el grado deseado de pureza con vehículos, excipientes o estabilizadores farmacéuticamente aceptables opcionales (Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edición, Osol, A. Ed. [1980]), en forma de formulaciones liofilizadas o disoluciones acuosas. Los vehículos, excipientes o estabilizadores aceptables son no tóxicos para los receptores a las dosis y concentraciones empleadas, e incluyen tampones tales como fosfato, citrato, y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquilparabenos tales como metil- o propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (inferior a aproximadamente 10 restos); proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina, o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, o lisina; monosacáridos, disacáridos, y otros hidratos de carbono que incluyen glucosa, manosa, o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azúcares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sales tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos de Zn-proteína); y/o tensioactivos no iónicos tales como TWEEN™, PLURONICS™ o polietilenglicol (PEG).

La formulación en el presente documento también puede contener más de un compuesto activo según sea necesario para la indicación particular que está tratándose, preferentemente aquellos con actividades complementarias que no se afectan adversamente entre sí. Por ejemplo, se puede desear proporcionar anticuerpos con otras especificidades. Alternativamente, o además, la composición puede comprender un agente citotóxico, citocina, agente inhibidor del crecimiento y/o antagonista de molécula pequeña. Dichas moléculas están adecuadamente presentes en combinación en cantidades que son eficaces para el fin previsto.

Los principios activos también pueden ser atrapados en microcápsulas preparadas, por ejemplo, por técnicas de coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y microcápsulas de poli-(metilmetacilato), respectivamente, en sistemas coloidales de administración de fármacos (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Dichas técnicas se desvelan en Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edición, Osol, A. Ed. (1980).

Las formulaciones que se van a usar para la administración in vivo deberían ser estériles, o casi. Esto se logra fácilmente por filtración a través de membranas de filtración estériles.

Se pueden preparar preparaciones de liberación sostenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el anticuerpo, matrices que están en forma de artículos moldeados, por ejemplo películas, o microcápsulas. Los ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato), o poli(alcohol vinílico)), polilactidas (patente de EE. UU. N° 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutámico y .gamma.etil-L-glutamato, copolímeros no degradables de etileno-acetato de vinilo, degradables de ácido láctico-ácido glicólico, tales como LUPRON DEPOT™ (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolida), y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Aunque polímeros tales como etileno-acetato de vinilo y ácido lácticoácido glicólico permiten la liberación de moléculas durante más de 100 días, ciertos hidrogeles liberan proteínas durante periodos de tiempo más cortos.

Cuando los anticuerpos encapsulados permanecen en el cuerpo durante un tiempo prolongado, se pueden desnaturalizar o aglomerar como resultado de la exposición a humedad a 37 °C, dando como resultado una pérdida de actividad biológica y posibles cambios en la inmunogenicidad. Se pueden idear estrategias racionales para la estabilización dependiendo del mecanismo implicado. Por ejemplo, si se descubre que el mecanismo de aglomeración es la formación de enlaces S--S intermoleculares mediante intercambio de tiodisulfuro, se puede lograr la estabilización modificando los restos sulfhidrilo, liofilizando a partir de disoluciones ácidas, controlando el contenido de humedad, usando aditivos apropiados, y desarrollando composiciones de matriz de polímero específicas.

Modalidades de administración

Los anticuerpos y agentes quimioterapéuticos descritos en el presente documento se administran a un sujeto, de acuerdo con métodos conocidos, tales como administración intravenosa como un bolo o por infusión continua durante un periodo de tiempo, por vías intramuscular, intraperitoneal, intracerobroespinal, subcutánea, intrarticular, intrasinovial, intratecal, oral, tópica, o por inhalación. Se prefiere la administración intravenosa o subcutánea del anticuerpo.

Modalidades de tratamiento

Los anticuerpos heterodiméricos de la invención para su uso en una terapia proporcionan una respuesta terapéutica positiva con respecto a una enfermedad o afección. Por "respuesta terapéutica positiva" está previsto una mejora en la enfermedad o afección, y/o una mejora en los síntomas asociados a la enfermedad o afección. Por ejemplo, una respuesta terapéutica positiva se referiría a una o más de las siguientes mejoras en la enfermedad: (1) una reducción en el número de células neoplásicas; (2) un aumento en la muerte celular neoplásica; (3) inhibición de la supervivencia celular neoplásica; (5) inhibición (es decir, ralentizamiento de algún modo, preferentemente detención) del crecimiento tumoral; (6) un aumento de la tasa de supervivencia del paciente; y (7) cierto alivio de uno o más síntomas asociados a la enfermedad o afección.

Las respuestas terapéuticas positivas en cualquier enfermedad o afección dada se pueden determinar por criterios de respuesta normalizados específicos para esa enfermedad o afección. Se puede evaluar la respuesta tumoral para cambios en la morfología del tumor (es decir, carga tumoral total, tamaño del tumor, y similares) usando técnicas de cribado tales como imagen por resonancia magnética (IRM), obtención de imágenes x-radiográficas, tomografía computarizada (CT), gammagrafía ósea, endoscopía y muestreo mediante biopsia tumoral que incluye aspiración de médula ósea (BMA) y recuento de células tumorales en la circulación.

Además de estas respuestas terapéuticas positivas, el sujeto que se somete a la terapia puede experimentar el efecto beneficioso de una mejora en los síntomas asociados a la enfermedad.

Así, para tumores de linfocitos B, el sujeto puede experimentar una disminución en los denominados síntomas B, es decir, sudoraciones nocturnas, fiebre, pérdida de peso y/o urticaria. Para afecciones premalignas, la terapia con un agente terapéutico multiespecífico puede bloquear y/o prolongar el tiempo antes del desarrollo de una afección maligna relacionada, por ejemplo, desarrollo de mieloma múltiple en sujetos que padecen gammapatía monoclonal de significado incierto (MGUS).

Una mejora en la enfermedad se puede caracterizar por una respuesta completa. Por "respuesta completa" está prevista una ausencia de enfermedad clínicamente detectable con normalización de cualquier estudio radiográfico previamente anormal, médula ósea y líquido cefalorraquídeo (CSF), o proteína monoclonal anormal en el caso de mieloma.

Dicha respuesta puede persistir durante al menos 4 a 8 semanas, o algunas veces 6 a 8 semanas, tras el tratamiento según los métodos de la invención. Alternativamente, una mejora en la enfermedad se puede clasificar por ser una respuesta parcial. Por "respuesta parcial" está prevista al menos aproximadamente una disminución de 50 % en toda la carga tumoral medible (es decir, el número de células malignas presentes en el sujeto, o el volumen medido de masas tumorales o la cantidad de proteína monoclonal anormal) en ausencia de nuevas lesiones, que pueden persistir durante 4 a 8 semanas, o 6 a 8 semanas.

El tratamiento como se describe o reivindica en el presente documento incluye una "cantidad terapéuticamente eficaz" de los medicamentos usados. Una "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad eficaz, a dosis y durante periodos de tiempo necesarios, para lograr un resultado terapéutico deseado.

Una cantidad terapéuticamente eficaz puede variar según factores tales como el estado de enfermedad, edad, sexo y peso del individuo, y la capacidad de los medicamentos para provocar una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente eficaz también es una en la que cualquier efecto tóxico o perjudicial del anticuerpo o porción de anticuerpo es compensado por los efectos terapéuticamente beneficiosos.

Una "cantidad terapéuticamente eficaz" para terapia tumoral también se puede medir por su capacidad para estabilizar la progresión de la enfermedad. La capacidad de un compuesto para inhibir el cáncer se puede evaluar en un sistema de modelo animal predictivo de eficacia en tumores humanos.

Alternativamente, esta propiedad de una composición se puede evaluar examinando la capacidad del compuesto para inhibir el crecimiento celular o para inducir la apoptosis por ensayos in vitro conocidos por el médico habitual. Una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto terapéutico puede disminuir el tamaño del tumor, o mejorar de otro modo los síntomas en un sujeto. Un experto habitual en la técnica sería capaz de determinar dichas cantidades basándose en dichos factores tales como el tamaño del sujeto, la gravedad de los síntomas del sujeto, y la composición particular o vía de administración seleccionada.

Las pautas posológicas se ajustan para proporcionar la respuesta deseada óptima (por ejemplo, una respuesta terapéutica). Por ejemplo, se puede administrar un único bolo, se pueden administrar varias dosis divididas con el tiempo, o la dosis se puede reducir o incrementar proporcionalmente como se indica por las exigencias de la situación terapéutica. Las composiciones parentales se pueden formular en forma unitaria de dosificación para facilitar la administración y uniformidad de la dosificación. Forma unitaria de dosificación como se usa en el presente documento se refiere a unidades físicamente discretas aptas como dosificaciones unitarias para los sujetos que se van a tratar; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido.

La especificación para las formas unitarias de dosificación descritas en el presente documento se estipula y es directamente dependiente de (a) las características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico particular a lograr, y (b) las limitaciones inherentes en la materia de dicho compuesto activo para el tratamiento de sensibilidad en individuos.

Las dosificaciones eficaces y las pautas posológicas para los anticuerpos multiespecíficos descritos o reivindicados en el presente documento dependen de la enfermedad o afección que se va a tratar y se pueden determinar por los expertos en la técnica.

Un intervalo no limitante a modo de ejemplo para una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo multiespecífico descrito o reivindicado en el presente documento es aproximadamente 0,1-100 mg/kg, tal como aproximadamente 0,1-50 mg/kg, por ejemplo aproximadamente 0,1-20 mg/kg, tal como aproximadamente 0,1 10 mg/kg, por ejemplo aproximadamente 0,5, aproximadamente tal como 0,3, aproximadamente 1, o aproximadamente 3 mg/kg. Como se describe en el presente documento, el anticuerpo para su uso en terapia se administra en una dosis de 1 mg/kg o más, tal como una dosis de desde 1 hasta 20 mg/kg, por ejemplo una dosis de desde 5 hasta 20 mg/kg, por ejemplo una dosis de 8 mg/kg.

Un profesional médico con experiencia en la técnica puede determinar y recetar fácilmente la cantidad eficaz de la composición farmacéutica requerida. Por ejemplo, un médico o un veterinario podría empezar dosis del medicamento empleado en la composición farmacéutica a niveles inferiores a los requeridos para lograr el efecto terapéutico deseado y aumentar gradualmente la dosificación hasta que se logre el efecto deseado.

En una realización, el anticuerpo multiespecífico se administra por infusión en una dosificación semanal de desde 10 hasta 500 mg/kg, tal como de desde 200 hasta 400 mg/kg. Dicha administración se puede repetir, por ejemplo, 1 a 8 veces, tal como 3 a 5 veces. La administración se puede realizar por infusión continua durante un periodo de desde 2 hasta 24 horas, tal como de desde 2 hasta 12 horas.

En una realización, el anticuerpo multiespecífico se administra por infusión continua lenta durante un largo periodo, tal como superior a 24 horas, si se requiere para reducir los efectos secundarios que incluyen toxicidad.

En una realización, el anticuerpo multiespecífico se administra en una dosificación semanalmente de desde 250 mg hasta 2000 mg, tal como por ejemplo 300 mg, 500 mg, 700 mg, 1000 mg, 1500 mg o 2000 mg, durante hasta 8 veces, tal como desde 4 hasta 6 veces. La administración se puede realizar por infusión continua durante un periodo de desde 2 hasta 24 horas, tal como de desde 2 hasta 12 horas. Dicha pauta se puede repetir una o más veces según sea necesario, por ejemplo, después de 6 meses o 12 meses. La dosificación se puede determinar o ajustar midiendo la cantidad de compuesto de la presente invención en la sangre tras la administración, por ejemplo, tomando una muestra biológica y usando anticuerpos antiidiotípicos que se dirigen a la región de unión al antígeno del anticuerpo multiespecífico.

En una realización adicional, el anticuerpo multiespecífico se administra una vez a la semana durante 2 a 12 semanas, tal como durante 3 a 10 semanas, tal como durante 4 a 8 semanas.

En una realización, el anticuerpo multiespecífico se administra por terapia de mantenimiento, tal como, por ejemplo, una vez a la semana durante un periodo de 6 meses o más.

En una realización, el anticuerpo multiespecífico se administra por una pauta que incluye una infusión de un anticuerpo multiespecífico seguido por una infusión de un anticuerpo multiespecífico conjugado con un radioisótopo. La pauta se puede repetir, por ejemplo, 7 a 9 días después.

Como ejemplos no limitantes, el tratamiento según la presente invención se puede proporcionar como una dosis diaria de un anticuerpo en una cantidad de aproximadamente 0,1-100 mg/kg, tal como 0,5, 0,9, 1,0, 1,1, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 mg/kg, por día, en al menos uno del día 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, o 40, o alternativamente, al menos una de la semana 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 después del inicio del tratamiento, o cualquier combinación de los mismos, usando dosis unitarias o divididas cada 24, 12, 8, 6, 4, o 2 horas, o cualquier combinación de los mismos.

En algunas realizaciones, la molécula de anticuerpo multiespecífico del mismo se usa en combinación con uno o más agentes terapéuticos adicionales, por ejemplo un agente quimioterapéutico. Los ejemplos no limitantes de ADN agentes quimioterapéuticos que lo dañan incluyen inhibidores de la topoisomerasa I (por ejemplo, irinotecán, topotecán, camptotecina y análogos o metabolitos de la misma, y doxorubicina); inhibidores de la topoisomerasa II (por ejemplo, etopósido, tenipósido y daunorubicina); agentes alquilantes (por ejemplo, melfalán, clorambucilo, busulfán, tiotepa, ifosfamida, carmustina, lomustina, semustina, estreptozocina, decarbazina, metotrexato, mitomicina C y ciclofosfamida); intercaladores de ADN (por ejemplo, cisplatino, oxaliplatino y carboplatino); intercaladores de ADN y generadores de radicales libres tales como bleomicina; y miméticos de nucleósido (por ejemplo, 5-fluorouracilo, capecitibina, gemcitabina, fludarabina, citarabina, mercaptopurina, tioguanina, pentostatina e hidroxiurea).

Los agentes quimioterapéuticos que interrumpen la replicación celular incluyen: paclitaxel, docetaxel y análogos relacionados; vincristina, vinblastina y análogos relacionados; talidomida, lenalidomida y análogos relacionados (por ejemplo, CC-5013 y CC-4047); inhibidores de proteína tirosina cinasa (por ejemplo, mesilato de imatinib y gefitinib); inhibidores del proteasoma (por ejemplo, bortezomib); inhibidores de NF-kB, que incluyen inhibidores de IkB cinasa; anticuerpos que se unen a proteínas expresadas en exceso en cánceres y así regulan por disminución la replicación celular (por ejemplo, trastuzumab, rituximab, cetuximab y bevacizumab); y otros inhibidores de proteínas o enzimas conocidas por estar reguladas por incremento, expresadas en exceso o activadas en cánceres, cuya inhibición regula por disminución la replicación celular.

En algunas realizaciones, los anticuerpos de la invención se pueden usar antes de, concurrentemente con, o después del tratamiento con Velcade® (bortezomib).

Ejemplos

A continuación se proporcionan ejemplos para ilustrar la presente invención. Estos ejemplos no pretenden limitar la presente invención a ninguna aplicación o teoría de operación específica. Para todas las posiciones de región constante tratadas en la presente invención, la numeración es según el índice EU como en Kabat (Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed., United States Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda). Los expertos en la técnica de los anticuerpos apreciarán que esta convención consiste en la numeración de secuencial en regiones específicas de una secuencia de inmunoglobulina, que permite una referencia normalizada a posiciones conservadas en familias de inmunoglobulina. Por consiguiente, las posiciones de cualquier inmunoglobulina dada como se define por el índice EU no corresponderán necesariamente a su secuencia secuencial.

Ejemplo 1. Prototipo de anticuerpo biespecífico de "triple F".

La presente invención describe novedosas composiciones de inmunoglobulina que co-acoplan un primer y segundo antígeno. Una cadena pesada del anticuerpo contiene un Fv de cadena simple ("scFv", como se define en el presente documento) y la otra cadena pesada es un formato de Fab "regular", que comprende una cadena pesada variable y una cadena ligera (véase la Fig. 8B). Esta estructura se denomina algunas veces en el presente documento como formato de "triple F" (scFv-Fab-Fc). Las dos cadenas se ponen juntas por la región Fc dimérica. La región Fc se puede modificar por sustitución de aminoácidos para permitir la eficiente purificación del heterodímero de "triple F". Además, la región Fc se puede modificar por sustitución de aminoácidos para promover la formación del heterodímero de "triple F". Los ejemplos de sustituciones de Fc se describen más completamente más adelante.

Se pueden incluir sustituciones de Fc en el formato de "triple F" para permitir la eficiente purificación del heterodímero de "triple F" deseado con respecto a los homodímeros dobles scFv-Fc y mAb no deseados. Un ejemplo de esto está en la inclusión de sustituciones de Fc que alteran el punto isoeléctrico (pI) de cada monómero de manera que cada monómero tenga un pI diferente. En este caso, el heterodímero de "triple F" deseado tendrá un pI diferente que aquél de los homodímeros dobles scFv-Fc y mAb no deseados, facilitando así la purificación isoeléctrica del heterodímero de "triple F" (por ejemplo, columnas de intercambio aniónico, columnas de intercambio catiónico). Estas sustituciones también ayudan en la determinación y monitorización de cualquier homodímero doble de scFv-Fc y mAb contaminante después de la purificación (por ejemplo, geles de IEF, cIEF, y columnas analíticas de IEX). Véase la Fig. 6A para una lista de sustituciones que se pueden hacer en Fc del monómero 1 y Fc del monómero 2 para permitir una eficiente purificación del heterodímero de "triple F" deseado.

Se pueden incluir sustituciones de Fc en el formato de "triple F" para "sesgar" la formación hacia el heterodímero de "triple F" deseado con respecto a los homodímeros dobles de scFv-Fc y mAb no deseados. Por ejemplo, véase la Fig. 6 para una lista de sustituciones que se pueden hacer en Fc del monómero 1 y Fc del monómero 2 para "sesgar" la producción hacia el heterodímero de "triple F". Se pueden combinar las sustituciones de aminoácidos enumeradas en la Fig.6, que conducen a un aumento del rendimiento de heterodímero de "triple F" que puede ser fácilmente purificado de cualquier homodímero doble de scFv-Fc y mAb contaminante.

Después de la optimización de un dominio scFv para inclusión en el formato de "triple F", se puede acoplar un dominio scFv optimizado con una variedad de cadenas pesadas estándar del anticuerpo en un modo conveniente. Por ejemplo, se puede acoplar un scFv anti-CD3 para reclutar citotoxicidad de linfocitos T con una variedad de cadenas pesadas del anticuerpo para antígeno antitumoral (por ejemplo, los que se unen a CD5, CD20, CD30, CD40, CD33, CD38, EGFR, EpCAM, Her2, HM1.24, u otro antígeno tumoral). Los ejemplos adicionales de dominios scFv optimizados que pueden ser convenientemente acoplados con cadenas pesadas del anticuerpo estándar incluyen scFv anti-CD 16 para citotoxicidad de linfocitos citolíticos espontáneos; scFv anti-CD32b para actividad inhibidora (aquí la cadena pesada del anticuerpo acoplada se uniría, por ejemplo, a CD19, CD40, CD79a, CD79b, u otros receptores inmunitarios); y scFv de receptor anti-transferrina, receptor anti-insulina, o anti-LRP1 para transporte a través de la barrera hematoencefálica.

Ejemplo 2. Anticuerpos multiespecíficos derivados del formato de "triple F".

Se pueden construir anticuerpos multiespecíficos uniendo dominios scFv o Fab adicionales que unen un tercer antígeno al extremo C de una de las cadenas pesadas de "triple F". Alternativamente, el scFv o Fab de extremo C se puede unir al primer o segundo antígeno, confiriendo así bivalencia y un aumento en la afinidad de unión general por ese antígeno.

También se pueden construir anticuerpos multiespecíficos acoplando la cadena pesada de scFv-Fc del formato de "triple F" con cadenas pesadas del anticuerpo reordenadas. Dichas cadenas pesadas reordenadas pueden incluir una región Fv adicional que une un tercer antígeno o una región Fv adicional que une el primer antígeno o segundo antígeno, confiriendo así bivalencia y un aumento en la afinidad de unión general por ese antígeno.

Ejemplo 3. Biespecífico de "triple F" Fab anti-CD19 x scFv anti-CD3.

Se enumeran en las figuras secuencias de aminoácidos para biespecíficos de "triple F" anti-CD 19 Fab x anti-CD3 scFv. Se subrayan sustituciones de aminoácidos hechas para permitir la eficiente purificación del heterodímero de "triple F" deseado con respecto a los homodímeros dobles de scFv-Fc y mAb no deseados. Se dan a continuación algunos ejemplos de expresión y purificación de las especies de "triple F" deseadas y su bioactividad.

La producción de XENP 11874, un biespecífico de "triple F" con un Fab anti-CD 19 y scFv anti-CD3, se expone brevemente en la Fig. 9 del documento de patente WO 2014/110601. En la Fig. 9A, se muestra la purificación por intercambio iónico del heterodímero de "triple F" deseado de los homodímeros dobles scFv-Fc y mAb no deseados. Se comprobó la pureza de la fracción de "triple F" por gel de IEF (datos mostrados en la Figura 9b del documento de patente WO 2014/110601). Finalmente, se usó SEC para confirmar el tamaño homogéneo del producto de "triple F" (datos mostrados en la Figura 9C del documento de patente WO 2014/110601.

Se mostró que XENP11874, el biespecífico Fab anti-CD19 x scFv anti-CD3 "triple F", tenía una potente bioactividad. La capacidad de XENP 11874 para reclutar potentemente linfocitos T para el empobrecimiento de linfocitos B se muestra en la Fig. 10 del documento de patente WO 2014/110601.

La producción de XENP 11924, un biespecífico "triple F" con un Fab anti-CD 19 y scFv anti-CD3, se expone brevemente en la Fig. 11 del documento de patente WO 2014/110601. En la Fig. 11A del documento de patente WO 2014/110601, se muestra la purificación por intercambio iónico del heterodímero de "triple F" deseado de los homodímeros dobles scFv-Fc y mAb no deseados. Se comprobó la pureza de la fracción de "triple F" por gel de IEF, mostrada en la Fig. 11B (del documento de patente WO 2014/110601). Finalmente, se usó SEC para confirmar el tamaño homogéneo del producto de "triple F" (véase la Fig. 11C del documento de patente WO 2014/110601).

Se mostró que XENP11924, el biespecífico de "triple F" Fab anti-CD 19 x scFv anti-CD3, tenía potente bioactividad. La capacidad de XENP11924 para reclutar potentemente linfocitos T para la destrucción de la línea de células tumorales Raji se muestra en la Fig. 12 del documento de patente WO 2014/110601.

Ejemplo 4. Biespecífico de "triple F" Fab anti-CD38 x scFv anti-CD3.

Las secuencias de aminoácidos para biespecíficos de "triple F" Fab anti-CD38 x scFv anti-CD3 se enumeran en la Fig. 13 del documento de patente WO 2014/110601. Están subrayadas las sustituciones de aminoácidos hechas para permitir la eficiente purificación del heterodímero de "triple F" deseado con respecto a los homodímeros dobles de scFv-Fc y mAb no deseados. Se dan a continuación algunos ejemplos de expresión y purificación de las especies de "triple F" deseadas y su bioactividad.

La producción de XENP11925, un biespecífico de "triple F" con un Fab anti-CD38 y scFv anti-CD3, se expone brevemente en la Fig. 14 del documento de patente WO 2014/110601. En la Fig. 14A del documento de patente WO 2014/110601 se muestra la purificación por intercambio iónico del heterodímero de "triple F" de los homodímeros dobles de scFv-Fc y mAb no deseados. Se comprobó la pureza de la fracción de "triple F" por gel de IEF, mostrado en la Fig. 14B del documento de patente WO 2014/110601. Finalmente, se usó SEC para confirmar el tamaño homogéneo del producto de "triple F" (véase la Fig. 14C del documento de patente WO 2014/1106018.

Se mostró que XENP11925, el biespecífico de "triple F" Fab anti-CD38 x scFv anti-CD3, tenía potente bioactividad. La capacidad de XENP 11925 para reclutar potentemente linfocitos T para la destrucción de la línea de células tumorales RPMI8226 se muestra en la Fig. 15 del documento de patente WO 2014/110601.

Ejemplo 5. Identificación y reparación de variantes de la región constante isotípicas que alteran el pl desestabilizantes.

Como se ha descrito anteriormente, se pueden hacer esfuerzos para minimizar el riesgo de que las sustituciones que aumentan o reducen el pI provoquen inmunogenicidad utilizando las diferencias isotípicas entre las subclases IgG (IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4). Se diseñó un nuevo conjunto de isotipos novedosos basado en este principio. Estas nuevas variantes se denominan ISO(-), ISO(+) e ISO(+RR). La estabilidad térmica de estos isotipos novedosos se determinó en un sistema Bisagra-CH2-CH3 (H-CH2-CH3) (solo la región Fc). Se expresaron proteínas y se purificaron como se ha descrito anteriormente.

Las mediciones de estabilidad térmica determinada por calorimetría diferencial de barrido (DSC) revelaron que el heterodímero ISO(-)/ISO(+RR) (XENP1 2488) era menos estable que IgG1 no mutante (XENP8156). Los esfuerzos de manipulación posteriores identificaron las sustituciones N384S/K392N/M397V en la cadena pesada de ISO(-) como la fuente de la desestabilización. Como resultado, se diseñó y probó la variante designada ISO(-NKV). En esta variante, se invirtieron las posiciones 384, 392 y 397 a IgG1 no mutante (S384N/N392K/M397V). Se midió la estabilidad térmica del heterodímero ISO(-NKV)/ISO(+RR) (XENP12757) por DSC y se encontró que era equivalente a la de IgG1 no mutante. Este resultado remarca la importancia de elegir o no elegir sustituciones isotípicas que alteran el pl particular para evitar las que son desestabilizadoras.

Ejemplo 6. Variantes de Fc adicionales de sesgo hacia el heterodímero.

Como se ha descrito anteriormente, se pueden producir variantes de Fc de sesgo hacia el heterodímero para sesgar hacia la formación del heterodímero deseado frente a los homodímeros no deseados. Se diseñaron y probaron variantes de Fc adicionales de sesgo hacia heterodímero L368D/K370S-S364K/E357Q (XENP12760, véase la Fig. 7 para la secuencia) en un sistema Bisagra-CH2-CH3 (solo la región Fc). Se expresó la proteína y se purificó como se ha descrito anteriormente.

Se examinaron las proteínas presentes después de solo una única etapa de purificación con proteína A estándar por cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC) usando una columna de intercambio catiónico (CIEX) (véase la Fig. 34). Esto permitió la determinación del rendimiento del heterodímero deseado frente a homodímeros no deseados. La presencia de la variante L368D/K370S-S364K/E357Q (XENP 12760, Fig. 34), panel inferior) introdujo un sesgo extremo hacia la formación deseada de heterodímero en comparación con la ausencia de esta variante (XENP12757, Fig. 34, panel superior). Obsérvese que el rendimiento de heterodímero es 95,8 % con la variante L368D/K370S-S364K/E357Q frente a solo 52,7 % sin.

También se diseñaron y probaron variantes de Fc adicionales de sesgo hacia heterodímero. La Fig. 10 proporciona una lista de variantes de Fc de sesgo hacia heterodímero manipuladas con rendimientos de heterodímero (determinados por HPLC-CIEX) y las estabilidades térmicas (determinadas por DSC). Es especialmente preferida la variante L368D/K370S-S364K/E357Q con alto rendimiento de heterodímero y alta estabilidad térmica.

Ejemplo 7. Variantes de Fc adicionales de sesgo hacia heterodímero en el contexto Fab-scFv-Fc.

Se manipularon variantes de Fc de sesgo hacia heterodímero L368D/K370S-S364K/E357Q en un anti-CD19 x anti-CD3 Fab-scFv-Fc (véase la Fig. 15 para secuencias de aminoácidos). El control Fab-scFv-Fc XENP 13228 careció de estas variantes de Fc de sesgo hacia heterodímero. Se examinaron las proteínas presentes después de solo una única etapa de purificación con proteína A estándar por un gel de isoelectroenfoque (IEF). Esto permitió la determinación de rendimiento del heterodímero deseado frente a homodímeros no deseados. La presencia de la variante L368D/K370S-S364K/E357Q (XENP13122, Fig. 22, carril derecho) introdujo un sesgo extremo hacia la formación del heterodímero deseado (banda central) en comparación con la ausencia de esta variante (XENP13228, Fig. 22, carril izquierdo).

Ejemplo 8. Construcción de anticuerpos biespecíficos Anti-CD38 x Anti-CD3

Se humanizó anticuerpo anti-CD38 OKT10 por optimización del contenido de la cadena humana (Lazar et al., Mol. Immunol., (2007), 44: 1986-1998), y se creó una molécula biespecífica que contenía el Fv anti-CD38 humanizado y un dominio anti-CD3 (Figura 37). Se sintetizaron los segmentos de gen deseados por Blue Heron Biotechnologies (Bothell, WA) a partir de oligonucleótidos sintéticos y productos de PCR por síntesis génica automatizada. Se expresaron las construcciones de anticuerpo en el vector pTT5 en células 293E y se purificaron por proteína A estándar, seguido por cromatografía IEX usando una columna de intercambio catiónico GE HiTrap SP para aislar el biespecífico heterodimérico deseado. Los dominios Fc de anticuerpo contenían una región Fc heterodimérica manipulada para facilitar la eficiente purificación de las moléculas biespecíficas. La afinidad de los biespecíficos por CD38 mejoró por barrido de una biblioteca de variantes de región Fv en SPR usando un Biacore 3000 (Figura 38).

Ejemplo 9. Propiedades in v itro de anticuerpos biespecíficos Anti-CD38 x Anti-CD3

Se cribaron moléculas biespecíficas optimizadas para su capacidad para destruir células de mieloma múltiple (MM) RPMI8226 en un ensayo de citotoxicidad de linfocitos T redirigida con LDH (RTCC) (Figura 13) y en un ensayo RTCC Anexina V+ utilizando diferentes relaciones de linfocitos T:RPMI8226 (Figura 14). También se evaluaron moléculas optimizadas para reactividad cruzada con anti-CD38 de cinomolgo usando un ensayo de unión directa (Figura 16). En la Figura 15 se muestra una tabla que resume diversas propiedades de las moléculas biespecíficas Anti-CD38 x Anti-CD3 optimizadas.

Ejemplo 10. Destrucción de células plasmáticas humanas por biespecíficos Anti-CD38 x Anti-CD3 en ratones SCID injertados con CMSPhu

Se cribaron moléculas biespecíficas optimizadas para su capacidad para destruir células plasmáticas en un modelo de ratón SCID injertado con CMSPhu. Se trataron grupos de 10 ratones cada uno con a-ASGM1 para empobrecer las células SCID NK en el día 0, seguido por injerto de 3 x 107 CMSPs humanas en el día 1. Los grupos se aleatorizaron basándose en los niveles de IgG totales en el Día 4. Se administraron moléculas biespecíficas Anti-CD38 x Anti-CD3 0 controles en el Día 7 y 15 después del injerto de CMSP. Se determinaron los títulos de IgG2, IgE e IgM en el Día 14 y 21. Se incluyó daratumumab (un anticuerpo de IgG1anti-CD38) como control a una dosis de 5 mg/kg. Se observaron reducciones significativas en los isotipos de Ig humana con moléculas biespecíficas Anti-CD38 x Anti-CD3 en comparación con daratumumab. (Figuras 17 y 18).

Ejemplo 11. Empobrecimiento de células CD38+CD138+ en CMSPs de pacientes con mieloma múltiple por anticuerpos biespecíficos Anti-CD38 x Anti-CD3

Se incubaron CMSPs de dos donantes con MM con 1 pg/mL de moléculas biespecíficas Anti-CD38 x Anti-CD3 durante 24 horas y se contaron las células. Se contaron las células CD38+CD138+ de células vivas previamente reguladas (clasificadas por FSC frente a SSC) y se normalizaron los acontecimientos contra el control tratado con PBS. Los biespecíficos fueron capaces de empobrecer potentemente las células de MM a esta concentración.

Ejemplo 12. Secuencias de aminoácidos y de ADN para biespecíficos anti-CD38 x anti-CD3.

Las secuencias de aminoácidos para los biespecíficos anti-CD38 x anti-CD3 XENP13243 y XENP13551 se enumeran en la Fig. 20B y 20J, respectivamente.

Ejemplo 13. Generación de conjuntos estables en células de ovario de hámster chino (CHO) para biespecíficos anti-CD38 x anti-CD3.

Se transfectaron células de ovario de hámster chino (CHO) con ADN que codificaba XENP13243 y XENP 13551 para generar conjuntos estables paralelos según las relaciones enumeradas en la Fig. 25 usando SURE Technology Platform™ propiedad de Selexis. El ADN transfectado consistió en vectores monocistrónicos que contenían el ADN enumerado en la Fig. 23. Se cultivaron células de conjuntos estables durante 7 días en tubos de centrifugación de 10 mL, y en el 7° día, se extrajeron 5 mL del sobrenadante de cultivo, se purificaron por cromatografía de afinidad por proteína A, y se analizaron por cromatografía de intercambio catiónico. Como las posibles proteínas que se podrían generar se diseñaron para tener diferentes puntos isoeléctricos, la cromatografía de intercambio catiónico permitió el análisis de las especies de proteínas secretadas por las células CHO en función de las diferentes relaciones de ADN. La Fig. 24 cataloga los cromatogramas de intercambio catiónico para cada una de las relaciones de ADN especificadas en la Fig. 25 para tanto XENP13243 como XENP13551. En las condiciones usadas para el análisis cromatográfico de intercambio catiónico, los heterodímeros HC-Fab eluyen a ~15 min; los biespecíficos heterodiméricos deseados eluyen a ~22 min; los monómeros HC-scFv eluyen a ~26 min; y los homodímeros HC-scFv eluyen a ~29 min. En la Fig. 26 se enumera un resumen de las cantidades de las diferentes especies de proteínas.

Sorprendentemente, la formación de heterodímeros se puede accionar por las relaciones de transfección de los tres ácidos nucleicos en una célula hospedadora (el HC-scFv, el HC y el LC). Varias relaciones de transfección de ADN proporcionaron la formación del heterodímero biespecífico preferido en cantidades superiores a 80 % del material total purificado por proteína A. Las relaciones preferidas para la formación de más de 80 % de heterodímero son 1:1,5:1,5, 1:2:1,5, 1:0,667:2, 1:1:2, 1:1,5:2, y 1:2:2 (todas indicadas como HC-Fab:HC-scFv:LC). Algunas relaciones de a Dn proporcionaron la formación del heterodímero biespecífico preferido en cantidades superiores a 90 %. Las relaciones preferidas para la formación de más de 90% de heterodímeros son 1:1,5:1,5, 1:2:1,5, 1:1:2, y 1:2:2 (todas indicadas como HC-Fab:HC-scFv:LC). Una relación de ADN proporcionó la formación del heterodímero biespecífico preferido en una cantidad superior a 95 %. Una relación especialmente preferida para la formación de más de 95 % de heterodímero es 1:2:2 (indicado como HC-Fab:HC-scFv:LC).

Ejemplo 14. Farmacocinética de biespecíficos anti-CD38 x anti-CD3 en ratones C57BL/6.

Se administró a ratones C57BL/6 (n = 5 por grupo) dosis intravenosas unitarias de 2 mg/kg de los biespecíficos anti-CD38 x anti-CD3 XENP13243 y x En P 13551. Los ratones se sangraron a través de punción en el seno orbital (OSP) 1 h y a 1,3, 6, 10, 14, 17 y 21 días después de la administración del artículo de prueba, y la sangre se procesó hasta suero para la determinación de los niveles del artículo de prueba. Se determinaron las concentraciones en suero por inmunoensayo y se representan en la Fig. 27. Se determinaron las semividas del artículo de prueba usando el módulo de análisis no compartimental de Phoenix WinNonlin 6.3. Las semividas se enumeran en la Fig. 55. Obsérvese que la inclusión de una región Fc en el diseño de los biespecíficos produjo semividas comparables a anticuerpos monoclonales típicos. Los biespecíficos típicos que no contienen Fc, tales como los formatos BiTE o DART, tienen semividas mucho más cortas del orden de horas.

Ejemplo 15. Citotoxicidad de linfocitos T redirigida de células RPMI8226 CD38+ mediada por biespecíficos anti-CD38 x anti-CD3.

Se usaron biespecíficos anti-CD38 x anti-CD3 XENP13243 y XENP13551 para mediar en la citotoxicidad de linfocitos T redirigida de células RPMI 8226 CD38+. El ensayo consistió de una incubación de 24 h a 37 °C de 10.000 células RPMI 8226 con 400.000 linfocitos T humanos purificados. La lectura de la citotoxicidad fue por lactato deshidrogenasa (LDH). Los resultados se muestran en las figuras.

Ejemplo 16. Afinidades de unión de biespecíficos anti-CD38 x anti-CD3.

Se hicieron mediciones de resonancia de plasmones superficiales mediante Biacore 3000 de las afinidades de XENP13243 y XENP13551 para CD38 y CD3 humano y de cino. Se usaron métodos convencionales, y los parámetros cinéticos se determinaron usando el software BIAevaluation. Los resultados se enumeran en las figuras.

Ejemplo 17. Empobrecimiento de células CD38+ en monos cinomolgos por biespecíficos anti-CD38 x anti-CD3.

Se administró a seis grupos de monos cinomolgos (n = 2 por grupo) por infusión intravenosa o XENP13243 o XENP13551. Se administraron dos dosis por mono, separadas por 3 semanas. Las dosis iniciales fueron 5, 50 y 500 ng/kg, y las dosis secundarias fueron 2, 5 y 20 pg/kg. Se observó el empobrecimiento de células CD20-CD38+ en un modo dependiente de la dosis (véase la Figura 30). Se observó evidencia del reclutamiento de linfocitos T en la regulación por incremento de CD69 en linfocitos T CD8+ (véase la Figura 30).

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo heterodimérico que comprende:

a) una primera cadena pesada que comprende:

i) una primera variante de dominio Fc;

ii) una región Fv de cadena sencilla (scFv) que se une a CD3; y

b) una segunda cadena pesada que comprende:

i) una segunda variante de dominio Fc; y

ii) un primer dominio pesado variable; y

c) una primera cadena ligera que comprende un primer dominio ligero variable y un primer dominio ligero constante;

en donde dicho primer dominio pesado variable y dicho primer dominio ligero variable se unen a CD38, y en donde dicha segunda cadena pesada y dicha primera cadena ligera se seleccionan de los pares que consisten en H1: EVQLVESGGG LVGPGGSLRLSCAASG FDFSRSWM NWVRQAPG KG LEWVSEIN PDSSTINYATSVKGRFTISRDNSKNTLYLQM NSLRAE DTAVYYCARYG NWFPYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTS GVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSDTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPA PPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVKH EDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEEYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTL PPSREEMTKNQVSLTCDVSGFYPSDIAVEWESDGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR WEQGDVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK y L1.24;

DIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQNVDTWVAWYGQKPGQSPKAUYSASYRYSGVPDRFTGS GSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQYDSYPLTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASV VCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVT HQGLSSPVTKSFNRGEC;

H1: EVQLVESGGG LVQPGGSLRLSCAASG FD FS RSWM NWVRQAPG KG LEWVSEIN PDSSTINYATSVKGRFTISRDNSKNTLYLQM NS LRAE DTAVYY CAR Y G NWFPYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTS GVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSDTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPA PPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVKH EDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEEYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSN KALPAP I EKTISKAKG QPREPQVYTLPPSREEMTKN QVS LTCDVSG FYPSD IAVEWESDG QPEN NYKTTP PVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWEQG DVFSCSVM HEALHNHYTQKSLSLSPG Ky L1.96:

DIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQNVDYWVAWYQQKPGQSPKALIYAASWRYSGVPDRFTG SGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQYDVYPLTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTAS WCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYE KH KVYACEVTHQG LSSPVTKSFN RG EC;

H1.77: EVQLVESGGG LVQPGGSLRLSCAASGFTFSYSWM NWVRQAPGKGLEWVSEIN

PQSSTINYATSVKGRFTISRDNSKNTLYLQM NSLRAEDTAVYYCARYGNWFPYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD YFP EPVTVSW NSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSDTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPP KPKDTLM ISRTPEVTCVWDVKH EDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEEYNSTYRWSVLTVLHQDWLNG KEYKCKVS NKALPAP I E KTISKAKGQPRE PQVYTLPPSREEMTKN QVSLTCDVSG FYPSDIAVEWES DGGPE NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWEQG DV FSCSVM HEALH N HYTQKSLSLSPG K y L1.96:

DIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQNVDYVWAWYQQKPGQSPKALIYAASWRYSGVPDRFTG SGSGTDFTLTISSLQP EDFATYFCQQYDVYP LTFGGGTKLE I KRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLN N FYPREAKVQWKVDNALQSG NSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKH KVYACEVTHQG LSSPVTKSFN RG EC;

H1.77: EVQLVESGGG LVQPGGSLRLSCAASGFTFSYSWM NWVRQAPG KG LEWVSE IN

PQSSTI NYATSVKG RFTISRD NSKNTLYLQM NSLRAEDTAVYYCARYGNWFPYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSDTKVDKK VEPKSCDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVKH E DPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEEYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEK TISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCDVSGFYPSDIAVEWESDGQPENNYKTTP PVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWEQG DVFSCSVMH EALHN HYTQKSLSLSPGK y L1.97:

DIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQNVDYWVAWYQQKPGQSPKALIYSASWRYSGVPD RFTGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQYDVYPLTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKS GTASWCLLNN FYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKH KVYACEVTHQG LSSPVTKSFN RG EC;

H1.72: EVQLVESGGG LVQPGGSLRLSCAASG FDFSYSWM NWVRQAPG KG LEWVSE I

NPQSSTINYATSVKGRFTISRDNSKNTLYLQM NSLRAEDTAVYYCARYG NWFPYWGQGTLVTVSSASTKG PSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFP EPVTVS WNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSDTKVDKKVEPKSCDKT HTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVKHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEEYNSTYRWSVLTVLHQDWLNG KEYKCKVSN KALPAP I EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKN QVSLTCDVSG FYPSD IAVEWESDGQPE N NYKTTP PVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWEQGDVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK y L1.97:

DIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQNVDYWVAWYQQKPGQSPKALIYSASWRYSGVPDRFTG SGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQYDVYPLTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTAS WCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEV THQG LSSPVTKSFN RG EC;

H1.71: EVQLVESGGG LVQPG GSLRLSCAASG FTFSRSW M NWVRQAPG KG LEVWSEI

NPQSSTINYATSVKG RFTISRDNSKNTLYLQM NS LRAE DTAVYYCARYG NWFPYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTS GVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSDTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPA PPVAGPSVFLFPPKPKDTLM IS RTPEVTCVWDVKH E DP EVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEEYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTL PPSREEMTKNQVSLTCDVSG FYPSD IAVEWESDGQPENNYKTTPPVLDS DGSFFLYSKLTVD KS RW EQGDVFSCSVM HEALHNHYTQKSLSLSPGK y L1.96:

DIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQNVDYWVAWYQQKPGQSPKALIYAASWRYSGVPDRFTG SGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQYDVYPLTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTAS WCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYE KH KVYACEVTHQG LSSPVTKSFN RG EC y

H1.77:

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSYSWMNWVRQAPGKGLEVWSEINPQSSTINYATSV KGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYGNWFPYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAP SSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGT QTYICNVNHKPSDTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPPVAGPSVF LFPP KP KDTLM ISRTPEVTCVWDVKH EDP EVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEEYNSTYRWSVLTVLHQDWLN G KEYKCKVSNKALPAP I E KTISKAKGQP REPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCDVSGFYPSDIAVEWESDGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS KLTVDKSRWEQG DVFSCSVMH EALHNHYTQKSLSLSPGK y L1.24:

DIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQNVDTWVAWYQQKPGQSPKALIYSASYRYSGVPDRFTGS GSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQYDSYPLTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASV VCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKH KVYACEVTHQGLSSPVTKS FN RG EC.

2. Un anticuerpo heterodimérico según la reivindicación 1, en donde dicha segunda cadena pesada y dicha primera cadena ligera son H1: EVQLVESGGG LVQPGGSLRLSCAASG FDFSRSWM NWVRQAPG KG LEWVSEIN PDSSTINYATSVKGRFTISRDNSKNTLYLQM NSLRAE DTAVYYCARYG NWFPYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTF PAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSDTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFL FPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVKH EDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEEYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRE EMTKNQVSLTCDVSGFYPSDIAVEWESDGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWEQGDVFSC SVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK y L1.24:

DIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQNVDTWVAWYQQKPGQSPKALIYSASYRYSGVPDRFTGSGSGT OFTLTISSLQPEDFATYFCQQYDSYPLTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYP REAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC.

3. Un anticuerpo heterodimérico según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde dicho scFv tiene un conector de scFv cargado.

4. Un anticuerpo heterodimérico según la reivindicación 3, en donde dicho conector de scFv cargado tiene una carga positiva desde 3 hasta 8 y se selecciona del grupo que consiste en IRPRAIGGSKPRVA, GKGGSGKGGSGKGGS, GGKGSGGKGSGGKGS, GGGKSGGGKSGGGKS, GKGKSGKGKSGKGKS, GGGKSGGKGSGKGGS, GKPGSGKPGSGKPGS, GKPGSGKPGSGKPGSGKPGS y GKGKSGKGKSGKGKSGKGKS.

5. Un an ticu e rp o he te ro d im é rico seg ún u n a cu a lq u ie ra de las re iv in d ica c io n e s 1 -4, en do n d e la p rim e ra ca d e n a p e sad a co m p re n d e la se cu e n c ia

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQAPGKGLEWVGRIRSKYNNYATYYADSVK

GRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHGNFGDSYVSWFAYWGQGTLVTVSSGKPGSGKPG SGKPGSGKPGSQAWTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYANWVQQKPGKSPRGLIGGTNKR APGVPARFSGSLLGGKAALTISGAQPEDEADYYCALWYSNHWVFGGGTKLTVLEPKSSDKTHTCPPCP APPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVKHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTY RWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREQMTKNQVKLTCLV KGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPGK.

6. Una composición de ácido nucleico que comprende:

a) un primer ácido nucleico que codifica la primera cadena pesada de la reivindicación 1;

b) un segundo ácido nucleico que codifica la segunda cadena pesada de la reivindicación 1; y

c) un tercer ácido nucleico que codifica la primera cadena ligera de la reivindicación 1;

o

a) un primer vector de expresión que comprende un primer ácido nucleico que codifica la primera cadena pesada de la reivindicación 1;

b) un segundo vector de expresión que comprende un segundo ácido nucleico que codifica la segunda cadena pesada de la reivindicación 1; y

c) un tercer vector de expresión que comprende un tercer ácido nucleico que codifica la primera cadena ligera de la reivindicación 1.

7. Una célula hospedadora que comprende la composición de ácido nucleico de la reivindicación 7.

8. Un método de producción de un anticuerpo heterodimérico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 que comprende:

a) proporcionar un primer vector de expresión que comprende un primer ácido nucleico que codifica la segunda cadena pesada que comprende:

i) la segunda variante de dominio Fc;

ii) la primera cadena pesada variable; y

b) proporcionar un segundo vector de expresión que comprende un segundo ácido nucleico que codifica la primera cadena pesada que comprende:

i) la primera variante de dominio Fc; y

ii) la región Fv de cadena sencilla (scFv) que se une a CD3;

y

c) proporcionar un tercer vector de expresión que comprende un tercer ácido nucleico que codifica la primera cadena ligera; en donde dicho primer dominio pesado variable y el dominio ligero variable de dicha primera cadena ligera se une a CD38;

d) en donde dicho primer, segundo y tercer vectores de expresión se transfectan en células hospedadoras a una relación seleccionada del grupo que consiste en 1:1,5:1,5, 1:2:1,5, 1:0,667:2, 1:1:2, 1:1,5:2, y 1:2:2 ;

e) que expresa dicho primer, segundo y tercer ácidos nucleicos en dichas células hospedadoras para producir una primera, segunda y tercera secuencia de aminoácidos, respectivamente, de forma que dichas primera, segunda y tercera secuencias de aminoácidos formen dicho anticuerpo heterodimérico.

9. El método de la reivindicación 8, que comprende además (f) formular el anticuerpo heterodimérico en una composición farmacéutica.

10. Un anticuerpo heterodimérico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para su uso en terapia.

11. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo heterodimérico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.