RS59907B1

RS59907B1 - Bispecifična antitela koja se vezuju za cd38 i cd3

Info

Publication number: RS59907B1
Application number: RS20200150A
Authority: RS
Inventors: Matthew J Bernett; Seung Y Chu; Gregory Moore; John Desjarlais
Original assignee: Xencor Inc
Priority date: 2014-03-28
Filing date: 2015-03-30
Publication date: 2020-03-31
Also published as: DK3122781T3; ME03666B; PE20161431A1; PL3122781T3; CA2943621A1; US20210309762A1; EA201691925A1; JP2023052766A; AU2015237184A1; PT3122781T; EP3122781A1; KR20210097222A; SG11201607983YA; UA119167C2; ES2775431T3; SI3122781T1; SMT202000141T1; AP2016009475A0; CN111410691A; CR20160506A

Description

Opis

POZIVANJE NA POVEZANE PRIJAVE

[0001] Ova prijava zahteva prioritet pod 35 US. §119 U.S. Provizorne prijave patenta br. 61/972,172, koja je podnesena 28. marta 2014., 62/025,974, podnesena 7. jula 2014., i 62/025,931, podnesena 17. jula 2014.

OBLAST TEHNIKE

[0002] Predmetni pronalazak opisuje nove sastave imunoglobulina koji istovremeno kozahvataju antigene, gde su oba antigena vezana monovalentno. Opisani novi imunoglobulini poželjno koriste heterodimerne Fc regione. Ovde su takođe opisani postupci upotrebe novih sastava imunoglobulina, posebno u terapeutske svrhe.

STANJE TEHNIKE

[0003] Terapeutici na bazi antitela uspešno se koriste za tretman različitih bolesti, uključujući rak i autoimune/upalne poremećaje. Ipak, još uvek su potrebna poboljšanja ove klase lekova, posebno u pogledu povećanja njihove kliničke efikasnosti. Jedan put koji se istražuje je konstruisanje dodatnih i novih mesta vezivanja antigena lekovima zasnovanim na antitelima, tako da jedan molekul imunoglobulina povezuje dva različita antigena. Takvi netipični ili alternativni oblici antitela koji zahvataju dva različita antigena često se nazivaju bispecifici. Budući da velika raznolikost varijabilnog regiona antitela (Fv) omogućava proizvodnju Fv koji prepoznaje gotovo bilo koji molekul, tipičan pristup generisanju bispecifika je uvođenje novih varijabilnih regiona u antitelo.

[0004] Istraženi su brojni alternativni oblici antitela radi bispecifičnog cljanja (Chames & Baty, 2009, mAbs 1[6]:1-9; Holliger & Hudson, 2005, Nature Biotechnology 23[9]:1126-1136; and Kontermann, 2012 MAbs 4(2):182). U početku su bispecifična antitela napravljena spajanjem dve ćelijske linije, tako da bi svaka stvorila jedno monoklonsko antitelo (Milstein i dr., 1983, Nature 305:537-540). Iako su rezultujući hibridni hibridomi ili kvadromi proizveli bispecifična antitela, oni su bili samo mala populacija, i za izolovanje željenog antitela bilo je potrebno prečišćavanje. Inženjersko rešenje za to bila je upotreba fragmenata antitela za pravljenje bispecifika. Kako takvi fragmenti nemaju složenu kvaternarnu strukturu antitela pune dužine, varijabilni laki i teški lanci mogu se povezati u jedinstvene genetske konstrukte. Napravljeni su fragmenti antitela u raznim oblicima, uključujući dijatela, jednolančana dijatela, tandemske scFv i Fab2 bispecifike (Chames & Baty, 2009, mAbs 1[6]:1-9; Holliger & Hudson, 2005, Nature Biotechnology 23[9]:1126-1136). Iako se ovi oblici mogu eksprimirati u visokim nivoima kod bakterija i mogu imati pogodne koristi penetracije usled male veličine, oni se brzo čiste in vivo i mogu predstavljati prepreke prilikom proizvodnje usled svoje proizvodnje i stabilnosti. Glavni uzrok ovih nedostataka je da fragmenti antitela tipično nemaju konstantni region antitela sa pripadajućim funkcionalnim svojstvima, uključujući veću veličinu, veliku stabilnost i vezivanje za različite Fc receptore i ligande koji održavaju dug poluživot u serumu (tj. neonatalni Fc receptor FcRn) ili služe kao vezujuća mesta za prečišćavanje (tj. protein A i protein G).

[0005] Noviji rad pokušao je da reši nedostatke bispecifika na bazi fragmenata konstruisanjem dvostrukog vezivanja u oblike slične antitelu pune dužine (Wu i dr., 2007, Nature Biotechnology 25[11]:1290-1297; US 2009/0311253; Michaelson i dr., 2009, mAbs 1[2]:128-141; WO 2009/032782; Zuo i dr., 2000, Protein Engineering 13[5]:361-367; US 2002/0103345; Shen i dr., 2006, J Biol Chem 281[16]:10706-10714; Lu i dr., 2005, J Biol Chem 280[20]:19665-19672; WO 2006/020258; and Kontermann, 2012 MAbs 4(2):182). Ovi oblici prevazilaze neke prepreke bispecifika fragmenata antitela, uglavnom zato što sadrže Fc region. Jedan značajan nedostatak ovih oblika u tome što, zato što grade nova mesta vezivanja antigena na vrhu homodimernih konstantnih lanaca, vezivanje za novi antigen je uvek dvovalentno.

[0006] Za mnoge antigene koji su privlačni kao ko-ciljevi u obliku bispecifičnih terapeutika, poželjno vezivanje je monovalentno pre nego bivalentno. Za mnoge imuno receptore, ćelijska aktivacija se ostvaruje unakrsno povezivanjem monovalentne vezujuće interakcije.

Mehanizam unakrsnog povezivanja obično je posredovan imuno-kompleksima antitela/antigena, ili preko efektorske ćelije kako bi se ciljalo ćelijsko zahvatanje. Na primer, Fc gama receptori niskog afiniteta (FcyR) kao što su FcyRIIa, FcyRIIb i FcγRIIIa se monovalentno vezuju za Fc region antitela. Monovalentno vezivanje ne aktivira ćelije koje eksprimiraju ove FcyR; međutim, nakon imunog kompleksiranja ili ćelija-ćelija dodira, receptori su umreženi i sjedinjeni na ćelijskoj površini, što dovodi do aktivacije. Kod receptora odgovornih za posredovanje ćelijskog ubijanja, na primer FcγRIIIa na ćelijama prirodnim ubicama (NK), unakrsno povezivanje receptora i ćelijska aktivacija nastaju kada efektorska ćelija zahvata ciljanu ćeliju u izrazito bliskom obliku (Bowles & Weiner, 2005, J Immunol Methods 304:88-99,). Slično tome, na B ćelijama inhibitorni receptor FcyRIIb smanjuje aktivaciju B ćelija samo kada se uključi u imuni kompleks sa B-ćelijskim receptorima ćelijske površine (BCR), mehanizam koji je posredovan imunim kompleksiranjem rastvorljivih IgG sa istim antigenom koji je prepoznat od strane BCR (Heyman 2003, Immunol Lett 88[2]:157-161; Smith and Clatworthy, 2010, Nature Reviews Immunology 10:328-343). Kao još jedan primer, CD3 aktiviranje T-ćelija dešava se samo kada njegov pridruženi T-ćelijski receptor (TCR) zahvata antigen-opterećen MHC na ćelijama koje predstavljaju antigen u veoma bliskoj sinapsi od ćelije do ćelije (Kuhns i dr., 2006, Immunity 24:133-139). Zaista nespecifično bivalentno unakrsno povezivanje CD3 korišćenjem antitela protiv CD3 izaziva oluju citokina i toksičnost (Perruche i dr., 2009, J Immunol 183[2]:953-61; Chatenoud & Bluestone, 2007, Nature Reviews Immunology 7:622-632). Prema tome, za praktičnu kliničku upotrebu, poželjan način CD3 ko-zahvatanja za preusmereno ubijanje ciljanih ćelija je monovalentno vezivanje, što rezultuje aktiviranjem samo nakon zahvatanja sa ciljem ko-zahvatanja.

[0007] CD38, takođe poznat kao hidrolaza ciklične ADP riboze, je transmembranski glikoprotein tipa II sa dugim C-terminalnim ekstracelularnim domenom i kratkim N-terminalnim citoplazmatičnim domenom. Među hematopoetskim ćelijama, funkcionalni efekti pripisani su signalizaciji posredovanoj CD38, uključujući proliferaciju limfocita, otpuštanje citokina, regulaciju razvoja i preživljavanja B i mijeloidnih ćelija i indukciju sazrevanja dendritičnih ćelija. CD38 je neregulisan u mnogim hematopoeitnim malignitetima i u ćelijskim linijama koje potiču od različitih hematopoetskih maligniteta, uključujući ne-Hodgkinov limfom (NHL), Burkitt-ov limfom (BL), multipli mijelom (MM), B hroničnu limfocitnu leukemiju (B-CLL), B i T akutnu limfocitnu leukemiju (ALL), T ćelijski limfom (TCL), akutnu mijeloičnu leukemiju (AML), leukemiju dlakavih ćelija (HCL), Hodgkinov limfom (HL) i hroničnu mijeloidnu leukemija (CML). Sa druge strane, najprimitivnije pluripotentne matične ćelije hematopoetskog sistema su CD38-. Uprkos nedavnom napretku u otkrivanju i razvoju agenasa protiv raka, mnogi oblici raka koji uključuju tumore koji eksprimiraju CD38 i dalje imaju lošu prognozu. Dakle, postoji potreba za poboljšanim postupcima za tretman takvih oblika raka.

[0008] Prema tome, dok bispecifici generisani iz fragmenata antitela trpe biofizičke i farmakokinetičke prepreke, nedostatak onih koji se grade od oblika antitela pune dužine je taj što oni uključuju ko-ciljane antigene multivalentno u odsustvu primarnog ciljanog antigena, što dovodi do nespecifične aktivacije i potencijalne toksičnosti. predmetni pronalazak rešava ovaj problem uvođenjem novog bispecifičnog oblika koji omogućava ko-zahvatanje različitih ciljanih antigena.

[0009] US 2013/209355 A1 obelodanjuje antitela koja se vezuju za ljudski CD38, farmaceutske sastave koji sadrže takva antitela, i upotrebu ovih antitela u postupcima tretmana bolesti ili poremećaja koji uključuju ćelije koje eksprimiraju CD38.

[0010] WO 2012/131555 obelodanjuje konstruisane hetero-dimerne imunoglobuline ili njihove fragmente i postupke njihove proizvodnje.

SAŽETAK PRONALASKA

[0011] Prema tome, predmetni pronalazak pruža heterodimerna antitela koja se vezuju za CD3 i CD38. Heterodimerna antitela sadrže prvi teški lanac koji sadrži prvu varijantu Fc domena i jednolančani Fv region (scFv) koji vezuje CD3. Heterodimerna antitela takođe sadrže drugi teški lanac koji sadrži drugu varijantu Fc domena i prvi varijabilni teški domen. Heterodimerna antitela dalje sadrže prvi laki lanac koji sadrži prvi varijabilni laki domen i prvi konstantni laki domen, gde se prvi varijabilnu teški domen i prvi varijabilni laki domen vezuju za CD38. Drugi teški i prvi laki lanac heterodimernih antitela predmetnog pronalaska su izabrani iz parova sekvenci kao što je definisano u patentnom zahtevu 1.

[0012] Obelodanjenje pruža heterodimerna antitela odabrana iz grupe koju čine XENP13243; XENP13545; XENP13546; XENP13547; XENP13548; XENP13549; XENP13550;

XENP13551; XENP13544; XENP13752; XENP13753; XENP13754; XENP13756;

XENP13757 i XENP13694.

[0013] Kako je ovde opisano, scFv ima sekvencu koja obuhvata vhCDR1 koji ima sekvencu T-Y-A-M-Xaa1, gde Xaa1 je N, S ili H (SEQ ID NO:435), vhCDR2 koji ima sekvencu R-I-R-S-K-Xaa1-N-Xaa2-Y-A-T-Xaa3-Y-Y-A-Xaa4-S-V-K-G, gde Xaa1 je Y ili A, Xaa2 je N ili S, Xaa3 je Y ili A i Xaa4 je D ili A (SEQ ID NO:436), vhCDR3 koji ima sekvencu H-G-N-F-G-Xaa1-S-Y-V-S-W-F-Xaa2-Y, gde Xaa1 je N, D ili Q i Xaa2 je A ili D (SEQ ID NO:437), vlCDR1 koji ima sekvencu Xaal-S-S-T-G-A-V-T-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Y-A-N, gde Xaa1 je G, R ili K, Xaa2 je T ili S, Xaa3 je S ili G i Xaa4 je N ili H, (SEQ ID NO:438), vlCDR2 koji ima sekvencu Xaal-T-N-Xaa2-R-A-Xaa3, gde Xaa1 je G ili D, Xaa2 je K ili N, i Xaa3 je P ili S (SEQ ID NO:439) i vlCDR3 koji ima sekvencu Xaa1-L-W-Y-S-N-Xaa2-W-V, gde Xaa1 je A ili L i Xaa2 je L ili H (SEQ ID NO:440).

[0014] Kako je ovde takođe opisano, scFv je izabran iz grupe koji čine H1.30_L1.47, H1.33_L1.47 i H1.31_L1.47.

[0015] Kako je ovde opisano, anti-CD3 varijabilni region ima sekvencu izabranu iz grupe koju čine:

a) sekvenca koja obuhvata vhCDR1 koji ima SEQ ID NO:411, vhCDR2 koji ima SEQ ID NO:413, vhCDR3 koji ima SEQ ID NO:416, vlCDR1 koji ima SEQ ID NO:420, vlCDR2 koji ima SEQ ID NO:425 i vlCDR3 koji ima SEQ ID NO:430;

b) sekvenca koja obuhvata vhCDR1 koji ima SEQ ID NO:412, vhCDR2 koji ima SEQ ID NO:413, vhCDR3 koji ima SEQ ID NO:416, vlCDR1 koji ima SEQ ID NO:420, vlCDR2 koji ima SEQ ID NO:425 i vlCDR3 koji ima SEQ ID NO:430;

c) sekvenca koja obuhvata vhCDR1 koji ima SEQ ID NO:411, vhCDR2 koji ima SEQ ID NO:414, vhCDR3 koji ima SEQ ID NO:416, vlCDR1 koji ima SEQ ID NO:420, vlCDR2 koji ima SEQ ID NO:425 i vlCDR3 koji ima SEQ ID NO:430;

d) sekvenca koja obuhvata vhCDR1 koji ima SEQ ID NO:411, vhCDR2 koji ima SEQ ID NO:413, vhCDR3 koji ima SEQ ID NO:417, vlCDR1 koji ima SEQ ID NO:420, vlCDR2 koji ima SEQ ID NO:425 i vlCDR3 koji ima SEQ ID NO:430;

e) sekvenca koja obuhvata vhCDR1 koji ima SEQ ID NO:411, vhCDR2 koji ima SEQ ID NO:413, vhCDR3 koji ima SEQ ID NO:418, vlCDR1 koji ima SEQ ID NO:420, vlCDR2 koji ima SEQ ID NO:425 i vlCDR3 koji ima SEQ ID NO:430;

f) sekvenca koja obuhvata vhCDR1 koji ima SEQ ID NO:411, vhCDR2 koji ima SEQ ID NO:413, vhCDR3 koji ima SEQ ID NO:416, vlCDR1 koji ima SEQ ID NO:421, vlCDR2 koji ima SEQ ID NO:425 i vlCDR3 koji ima SEQ ID NO:430;

g) sekvenca koja obuhvata vhCDR1 koji ima SEQ ID NO:411, vhCDR2 koji ima SEQ ID NO:413, vhCDR3 koji ima SEQ ID NO:416, vlCDR1 koji ima SEQ ID NO:422, vlCDR2 koji ima SEQ ID NO:425 i vlCDR3 koji ima SEQ ID NO:430;

h) sekvenca koja obuhvata vhCDR1 koji ima SEQ ID NO:411, vhCDR2 koji ima SEQ ID NO:413, vhCDR3 koji ima SEQ ID NO:416, vlCDR1 koji ima SEQ ID NO:420, vlCDR2 koji ima SEQ ID NO:427 i vlCDR3 koji ima SEQ ID NO:430;

i) sekvenca koja obuhvata vhCDR1 koji ima SEQ ID NO:411, vhCDR2 koji ima SEQ ID NO:413, vhCDR3 koji ima SEQ ID NO:416, vlCDR1 koji ima SEQ ID NO:420, vlCDR2 koji ima SEQ ID NO:428 i vlCDR3 koji ima SEQ ID NO:430;

j) sekvenca koja obuhvata vhCDR1 koji ima SEQ ID NO:411, vhCDR2 koji ima SEQ ID NO:413, vhCDR3 koji ima SEQ ID NO:416, vlCDR1 koji ima SEQ ID NO:420, vlCDR2 koji ima SEQ ID NO:425 i vlCDR3 koji ima SEQ ID NO:431;

k) sekvenca koja obuhvata vhCDR1 koji ima SEQ ID NO:411, vhCDR2 koji ima SEQ ID NO:413, vhCDR3 koji ima SEQ ID NO:416, vlCDR1 koji ima SEQ ID NO:420, vlCDR2 koji ima SEQ ID NO:425 i vlCDR3 koji ima SEQ ID NO:430;

l) sekvenca koja obuhvata vhCDR1 koji ima SEQ ID NO:411, vhCDR2 koji ima SEQ ID NO:413, vhCDR3 koji ima SEQ ID NO:416, vlCDR1 koji ima SEQ ID NO:423, vlCDR2 koji ima SEQ ID NO:425 i vlCDR3 koji ima SEQ ID NO:432;

m) sekvenca koja obuhvata vhCDR1 koji ima SEQ ID NO:411, vhCDR2 koji ima SEQ ID NO:413, vhCDR3 koji ima SEQ ID NO:416, vlCDR1 koji ima SEQ ID NO:424, vlCDR2 koji ima SEQ ID NO:425 i vlCDR3 koji ima SEQ ID NO:432;

n) sekvenca koja obuhvata vhCDR1 koji ima SEQ ID NO:412, vhCDR2 koji ima SEQ ID NO:413, vhCDR3 koji ima SEQ ID NO:417, vlCDR1 koji ima SEQ ID NO:420, vlCDR2 koji ima SEQ ID NO:425 i vlCDR3 koji ima SEQ ID NO:430;

o) sekvenca koja obuhvata vhCDR1 koji ima SEQ ID NO:412, vhCDR2 koji ima SEQ ID NO:414, vhCDR3 koji ima SEQ ID NO:419, vlCDR1 koji ima SEQ ID NO:420, vlCDR2 koji ima SEQ ID NO:425 i vlCDR3 koji ima SEQ ID NO:430;

p) sekvenca koja obuhvata vhCDR1 koji ima SEQ ID NO:411, vhCDR2 koji ima SEQ ID NO:415, vhCDR3 koji ima SEQ ID NO:416, vlCDR1 koji ima SEQ ID NO:420, vlCDR2 koji ima SEQ ID NO:425 i vlCDR3 koji ima SEQ ID NO:430;

q) sekvenca koja obuhvata vhCDR1 koji ima SEQ ID NO:411, vhCDR2 koji ima SEQ ID NO:415, vhCDR3 koji ima SEQ ID NO:416, vlCDR1 koji ima SEQ ID NO:420, vlCDR2 koji ima SEQ ID NO:425 i vlCDR3 koji ima SEQ ID NO:430;

r) sekvenca koja obuhvata vhCDR1 koji ima SEQ ID NO:411, vhCDR2 koji ima SEQ ID NO:413, vhCDR3 koji ima SEQ ID NO:417, vlCDR1 koji ima SEQ ID NO:420, vlCDR2 koji ima SEQ ID NO:425 i vlCDR3 koji ima SEQ ID NO:430;

s) sekvenca koja obuhvata vhCDR1 koji ima SEQ ID NO:411, vhCDR2 koji ima SEQ ID NO:413, vhCDR3 koji ima SEQ ID NO:419, vlCDR1 koji ima SEQ ID NO:420, vlCDR2 koji ima SEQ ID NO:425 i vlCDR3 koji ima SEQ ID NO:430;

t) sekvenca koja obuhvata vhCDR1 koji ima SEQ ID NO:411, vhCDR2 koji ima SEQ ID NO:413, vhCDR3 koji ima SEQ ID NO:417, vlCDR1 koji ima SEQ ID NO:420, vlCDR2 koji ima SEQ ID NO:425 i vlCDR3 koji ima SEQ ID NO:433;

u) sekvenca koja obuhvata vhCDR1 koji ima SEQ ID NO:411, vhCDR2 koji ima SEQ ID NO:413, vhCDR3 koji ima SEQ ID NO:416, vlCDR1 koji ima SEQ ID NO:420, vlCDR2 koji ima SEQ ID NO:425 i vlCDR3 koji ima SEQ ID NO:433 i

v) sekvenca koja obuhvata vhCDR1 koji ima SEQ ID NO:411, vhCDR2 koji ima SEQ ID NO:434, vhCDR3 koji ima SEQ ID NO:416, vlCDR1 koji ima SEQ ID NO:420, vlCDR2 koji ima SEQ ID NO:425 i vlCDR3 koji ima SEQ ID NO:430.

[0016] Kako je ovde opisano, anti-CD3 varijabilni region sadrži varijabilni teški region i varijabilni laki region koji su izabrano iz grupe koju čine:

SEQ ID NO: 5 i 6; SEQ ID NO: 9 i 10; SEQ ID NO: 13 i 14; SEQ ID NO: 17 i 18; SEQ ID NO: 21 i 22; SEQ ID NO: 25 i 26; SEQ ID NO: 29 i 30; SEQ ID NO: 33 i 34; SEQ ID NO: 37 i 38; SEQ ID NO: 41 i 42; SEQ ID NO: 45 i 46; SEQ ID NO: 49 i 50; SEQ ID NO: 53 i 54; SEQ ID NO: 57 i 58; SEQ ID NO: 61 i 62; SEQ ID NO: 65 i 66; SEQ ID NO: 69 i 70; SEQ ID NO: 73 i 74; SEQ ID NO: 77 i 78; SEQ ID NO: 81 i 82; SEQ ID NO: 85 i 86; SEQ ID NO: 89 i 90; SEQ ID NO: 93 i 94; SEQ ID NO: 97 i 98; SEQ ID NO: 101 i 102; SEQ ID NO: 105 i 106; SEQ ID NO: 109 i 110; SEQ ID NO: 113 i 114; SEQ ID NO: 117 i 118; SEQ ID NO: 121 i 122; SEQ ID NO: 125 i 126; SEQ ID NO: 129 i 130; SEQ ID NO: 133 i 134; SEQ ID NO: 137 i 138; SEQ ID NO: 141 i 142; SEQ ID NO: 145 i 146; SEQ ID NO: 149 i 150; SEQ ID NO: 153 i 154; SEQ ID NO: 157 i 158; SEQ ID NO: 161 i 162; SEQ ID NO: 165 i 166; SEQ ID NO: 169 i 170; SEQ ID NO: 173 i 174; SEQ ID NO: 177 i 178; SEQ ID NO: 181 i 182; SEQ ID NO: 185 i 186; SEQ ID NO: 189 i 190; SEQ ID NO: 193 i 194; SEQ ID NO: 197 i 198; SEQ ID NO: 201 i 202; SEQ ID NO: 205 i 206; SEQ ID NO: 209 i 210; SEQ ID NO: 213 i 214; SEQ ID NO: 217 i 218; SEQ ID NO: 221 i 222; SEQ ID NO: 225 i 226; SEQ ID NO: 229 i 230; SEQ ID NO: 233 i 234; SEQ ID NO: 237 i 238; SEQ ID NO: 241 i 242; SEQ ID NO: 245 i 246; SEQ ID NO: 249 i 250; SEQ ID NO: 253 i 254; SEQ ID NO: 257 i 258; SEQ ID NO: 261 i 262; SEQ ID NO: 265 i 266; SEQ ID NO: 269 i 270; SEQ ID NO: 273 i 274; SEQ ID NO: 277 i 278; SEQ ID NO: 281 i 282; SEQ ID NO: 285 i 286; SEQ ID NO: 289 i 290; SEQ ID NO: 293 i 294; SEQ ID NO: 297 i 298; SEQ ID NO: 301 i 302; SEQ ID NO: 305 i 306; SEQ ID NO: 309 i 310; SEQ ID NO: 313 i 314; SEQ ID NO: 317 i 318; SEQ ID NO: 321 i 322; SEQ ID NO: 325 i 326; SEQ ID NO: 329 i 330; SEQ ID NO: 333 i 334; SEQ ID NO: 337 i 338; SEQ ID NO: 341 i 342; SEQ ID NO: 345 i 346; SEQ ID NO: 349 i 350; SEQ ID NO: 353 i 354; SEQ ID NO: 357 i 358; SEQ ID NO: 361 i 362; SEQ ID NO: 365 i 366; SEQ ID NO: 369 i 370; SEQ ID NO: 373 i 374; SEQ ID NO: 377 i 378; SEQ ID NO: 381 i 382; SEQ ID NO: 385 i 386; SEQ ID NO: 389 i 390; SEQ ID NO: 393 i 394; SEQ ID NO: 397 i 398; SEQ ID NO: 401 i 402; SEQ ID NO: 405 i 406; SEQ ID NO: 409 i 410.

[0017] Heterodimerna antitela imaju prvi varijabilni teški domen, i prvi varijabilni laki domen koji su izabrani od parova koji se sastoje od H1 i L1; HI i L1.24; HI i L1.96; H1.77 i L1.96; H1.77 i L1.97; H1.72 i L1.97; H1.71 i L1.96 i H1.77 i L1.24.

[0018] U daljem aspektu, pronalazak pruža heterodimerna antitela kao iznad, gde scFv ima naelektrisani scFv veznik. Naelektrisani scFv veznik može imati pozitivno naelektrisanje od 3 do 8 i izabran je iz grupe koju čine SEQ ID NO: 443 do 451.

[0019] Kako je ovde opisano, scFv ima sekvencu izabranu iz grupe koju čine: SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 24; SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 36; SEQ ID NO: 40; SEQ ID NO: 44; SEQ ID NO: 48; SEQ ID NO: 52; SEQ ID NO: 56; SEQ ID NO: 60; SEQ ID NO: 64; SEQ ID NO: 68; SEQ ID NO: 72; SEQ ID NO: 76; SEQ ID NO: 80; SEQ ID NO: 84; SEQ ID NO: 88; SEQ ID NO: 92; SEQ ID NO: 96; SEQ ID NO: 100; SEQ ID NO: 104; SEQ ID NO: 108; SEQ ID NO: 112; SEQ ID NO: 116; SEQ ID NO: 120; SEQ ID NO: 124; SEQ ID NO: 128; SEQ ID NO: 132; SEQ ID NO: 136; SEQ ID NO: 140; SEQ ID NO: 144; SEQ ID NO: 148; SEQ ID NO: 152; SEQ ID NO: 156; SEQ ID NO: 160; SEQ ID NO: 164; SEQ ID NO: 168; SEQ ID NO: 172; SEQ ID NO: 176; SEQ ID NO: 180; SEQ ID NO: 184; SEQ ID NO: 188; SEQ ID NO: 192; SEQ ID NO: 196; SEQ ID NO: 200; SEQ ID NO: 204; SEQ ID NO: 208; SEQ ID NO: 212; SEQ ID NO: 216; SEQ ID NO: 220; SEQ ID NO: 224; SEQ ID NO: 228; SEQ ID NO: 232; SEQ ID NO: 236; SEQ ID NO: 240; SEQ ID NO: 244; SEQ ID NO: 248; SEQ ID NO: 252; SEQ ID NO: 256; SEQ ID NO: 260; SEQ ID NO: 264; SEQ ID NO: 268; SEQ ID NO: 272; SEQ ID NO: 276; SEQ ID NO: 280; SEQ ID NO: 284; SEQ ID NO: 288; SEQ ID NO: 292; SEQ ID NO: 296; SEQ ID NO: 300; SEQ ID NO: 304; SEQ ID NO: 308; SEQ ID NO: 312; SEQ ID NO: 316; SEQ ID NO: 320; SEQ ID NO: 324; SEQ ID NO: 328; SEQ ID NO: 332; SEQ ID NO: 336; SEQ ID NO: 340; SEQ ID NO: 344; SEQ ID NO: 348; SEQ ID NO: 352; SEQ ID NO: 356; SEQ ID NO: 360; SEQ ID NO: 364; SEQ ID NO: 368; SEQ ID NO: 372; SEQ ID NO: 376; SEQ ID NO: 380; SEQ ID NO: 384; SEQ ID NO: 388; SEQ ID NO: 392; SEQ ID NO: 396; SEQ ID NO: 400; SEQ ID NO: 404; SEQ ID NO: 408.

[0020] Kako je ovde opisano, Fc region teških lanaca dalje sadrži FcRn varijantu, uključujući, ali ne ograničavajući se na, 428L/434S.

[0021] U dodatnom aspektu, pronalazak pruža sastave nukleinske kiseline koji sadrže prvu nukleinsku kiselinu koja kodira prvi teški lanac koji sadrži Fc region i scFv koji se vezuje za CD3, i drugu nukleinsku kiselina koja kodira drugi teški lanac koji sadrži teški konstantni lanac i teški varijabilni lanac i treću nukleinska kiselina koja kodira laki lanac, gde Fv regioni drugog teškog i lakog lanca vezuju CD38. Ove nukleinske kiseline mogu biti u različitim ili istim vektorima eksprimiranja. Pronalazak pruža ćelije domaćina koje sadrže sastave nukleinskih kiselina.

[0022] U daljem aspektu, pronalazak pruža postupke za proizvodnju heterodimernih antitela predmetnog pronalaska koji sadrže prvi vektor eksprimiranja koji sadrži prvu nukleinsku kiselinu koja kodira prvi teški lanac koji sadrži prvi Fc domen i prvi varijabilni teški lanac; pruža drugi vektor eksprimiranja koji sadrži drugu nukleinsku kiselinu koja kodira drugi teški lanac koji sadrži prvi Fc domen i jednolančani Fv region (scFv) koji vezuje CD3; i pruža treći vektor eksprimiranja koji sadrži nukleinsku kiselinu koja sadrži laki lanac; gde navedeni prvi varijabilni teški lanac i varijabilna laki domen navedenog lakog lanca vezuju CD38. Prvi, drugi i treći vektor eksprimiranja se transficiraju u ćelije domaćina u odnosu izabranom iz grupe koju čine 1:1,5:1,5, 1:2:1,5, 1:0,667:2, 1:1:2, 1:1,5:2, i 1:2:2. Prva, druga i treća nukleinska kiselina u ćelijama domaćinima proizvode prvu, drugu i treću aminokiselinsku sekvencu, respektivno, tako da navedena prva, druga i treća aminokiselinska sekvenca formiraju heterodimerno antitelo.

[0023] U dodatnom aspektu, pronalazak pruža heterodimerna antitela za upotrebu u terapiji.

KRATAK OPIS SLIKA

[0024]

Slike 1A i 1B prikazuju sekvencu ljudskog CD38. Slika 1A prikazuje sekvencu pune dužine, i Slika 1B prikazuje ekstracelularni domen.

Slika 2 prikazuje sekvencu ljudskog CD3.

Slike 3A do 3YY prikazuju sekvence aminokiselina stabilnih, humanizovanih anti-CD3 varijanti scFv, varijabilnih teških i varijabilnih lakih sekvenci. (Obratiti pažnju da je prva sekvenca verzija sa oznakom histidina radi lakšeg prečišćavanja). CDR su podvučeni. Treba razumeti da se povećana stabilnost optimizovanih varijabilnih i optimizovanih lakih lanaca

1

(kao i scFv lanca) može pripisati okvirnim regionima, kao i CDR. Stoga bi trebalo shvatiti da obelodanjenje čitavog varijabilnog regiona uključuje obelodanjenje okvirnih regiona, iako oni nisu odvojeno numerisani. Pored toga, scFv veznici su prikazani sivom bojom. Svaki scFv veznik može se zameniti naelektrisanim scFv veznikom kao što je prikazano na Slici 5. To jest, svaki naelektrisani scFv veznik, bilo pozitivan ili negativan, uključujući i one prikazane na Slici 5, može biti zamenjen naznačenim regionom na Slikama 3A do 3YY.

Slike 4A do 4I prikazuju poređenje svih CD3 vhCDR1-3 i vlCDR1-3 sekvenci korisnih u predmetnom pronalasku i konsenzusnih CDR.

Slika 5 prikazuje odgovarajuće pozitivne i negativno naelektrisane scFv veznike. Pojedinačni scFv veznik stanja tehnike sa jednim naelektrisanjem pominje se kao „Whitlow“ od Whitlow i dr., Protein Engineering 6(8):989-995 (1993). Treba napomenuti da se ovaj veznik koristio za smanjenje agregacije i pojačavanje proteolitičke stabilnosti kod scFv.

Slike 6A, 6B, 6C i 6D prikazuju nove steričke varijante. Kao što će razumeti stručnjaci, prva kolona svake tabele predstavlja „odgovarajuće“ parove monomera; to jest, monomer 1 ima 405A, i odgovarajuća sterička varijanta je 394F. Važno je napomenuti da u kontekstu asimetričnog trostrukog F oblika bilo koji monomer može imati bilo koju varijantu. Odnosno, scFv monomer može biti monomer 1 ili monomer 2. Ponovo, ovi setovi mogu biti opciono i nezavisno kombinovani sa drugim steričkim varijantama, kao i sa drugim heterodimerizacionim varijantama, uključujući parove naelektrisanja, izotipske varijante, izoteričke varijante, pI varijante itd., sve dok se održava određena „lančanost“. Pored toga, „monomer“ se odnosi na Fc domene; to jest, u trostrukom F obliku, jedan monomer je scFv konstrukt, i drugi monomer je Fab konstrukt, uprkos činjenici da zapravo postoje dve aminokiselinske sekvence koje čine Fab konstrukt (teški i laki lanac). prikazuje broj odgovarajućih steričkih ili „kosih“ varijanti primene u predmetnom pronalasku. Slika a6 prikazuje brojne steričke varijante koje se mogu koristiti samostalno ili u kombinaciji sa pI varijantama (kao što je slučaj sa svim varijantama na Slici 6); međutim, kao što će primetiti stručnjaci, ako postoje pI varijante, treba da se održi „lančanost“ pI varijanti i steričkih varijanti. To jest, ako na primer, pI varijante S364K/E357Q (monomer 1) i L368D/K370S (monomer 2) treba da se kombinuju sa varijantama na Slici 29C, pI steričkih varijanti treba razmotriti i dodeliti ispravnom monomeru. To jest, steričke varijante koje na primer menjaju naelektrisanje (T411E) dodaju se „negativnom“ monomeru.

Slika 7 prikazuje je spisak konstruisanih heterodimerskih zakrivljenja (npr. „sterička heterodimerizacija“) Fc varijante sa prinosima heterodimera (određenih pomoću HPLC-CIEX) i toplotnom stabilnošću (određeno pomoću DSC). Neodređena toplotna stabilnost označava se sa „n.d.“.

Slike 8A do 8C. Ilustracija „trostrukog F“ oblika za bispecifične imunoglobuline. Slika 8A prikazuje scFv-Fc oblik. Slika 8C prikazuje standardniji bispecifični oblik, takođe koristeći pI varijante predmetnog pronalaska (i opciono i nezavisno ostale varijante heterodimerizacije). Slika 8B prikazuje „trostruki F“ oblik (koji se ponekad naziva i „konfiguracija otvarača za boce“ (i opciono i nezavisno ostale varijante heterodimerizacije). Mnoga otelotvorenja koja su ovde navedene imaju anti-CD3 komponentu bispecifičnog antitela kao scFv, i anti-CD38 komponentu kao Fab fragment, mada kao što će to primetiti stručnjaci, oni se mogu smenjivati, gde će anti-CD38 komponenta biti scFv, opciono sa naelektrisanim veznikom, i Fv regioni scFv anti-CD3 sekvenci ovde su ponovo konstruisani kao Fab fragmenti.

Slika 9 prikazuje brojne pogodne „knock out“ („KO“) varijante kako bi se smanjilo vezivanje za neke ili sve FcγR receptore. Kao što je tačno za mnoge, ako ne i sve varijante ovde, ove KO varijante mogu se nezavisno i opciono kombinovati, kako unutar skupa opisanog na Slici 9, tako i sa bilo kojim varijantama heterodimerizacije koje su ovde navedene, uključujući steričke i pI varijante. Na primer, E233P/L234V/L235A/G236del može se kombinovati sa bilo kojom drugom pojedinačnom ili dvostrukom varijantom sa spiska. Pored toga, iako je u nekim otelotvorenjima poželjno da oba monomera sadrže iste KO varijante, moguće je kombinovati različite KO varijante na različitim monomerima, kao što je moguće imati i samo jedan monomer koji sadrži KO (varijantu) KO. Takođe se poziva na Figures and Legends od USSN 61/913,870, jer se odnosi na „knock out“ ili „ablacione“ varijante.

Slika 10 prikazuje spisak konstruisanih Fc varijanti koje zakrivljuju heterodimere, sa prinosom heterodimera (određeni pomoću HPLC-CIEX) i toplotnom stabilnosti (određena pomoću DSC). Neodređena toplotna stabilnost označava se sa „n.d.“.

Slika 11. Šematski prikaz strukture Anti-CD38 x Anti-CD3 bispecifičnog molekula.

Slika 12. Podaci površinske plazmonske rezonance (SPR) afinitetno/stabilno konstruisane varijante molekula Anti-CD38 x Anti-CD3 bispecifika.

Slika 13. Fluorescentni LDH test citotoksičnosti preusmerenih T-ćelija (RTCC) koji prikazuje ubijanje RPMI8226 ćelija multiplog mijeloma pomoću molekula Anti-CD38 x Anti-CD3 bispecifika.

Slika 14. RTCC test (Aneksin V+), koji prikazuje ubijanje RPMI8226 ćelija multiplih mijeloma pomoću molekula Anti-CD38 x Anti-CD3 bispecifika. Odnos T-ćelija u odnosu na RPMI8226 ćelije i vreme inkubacije variraju.

Slika 15. Tabela sa spiskom svojstava afinitetno/stabilno konstruisane varijante molekula Anti-CD38 x Anti-CD3 bispecifika. Brojanje je prema Kabatu.

Slika 16. Vezivanje molekula Anti-CD38 x Anti-CD3 bispecifika za CD20+ ćelije cinomolgus majmuna (Macaca fascicularis).

Slika 17. Ubijanje ćelija ljudske plazme od strane Anti-CD38 x Anti-CD3 bispecifika kod SCID miševa sa umetnutim huPBMC. Primećena su značajna smanjenja ljudskih izotipa IgG2 i IgE. Prikazane su srednje vrednosti ± SEM na Dan 22. BLQ za IgG2 je <1 µg/mL, i za IgE <16 ng/mL. Tačkama podataka manjim od BLQ dodeljena je BLQ vrednost.

Slika 18. Ubijanje ćelija ljudske plazme od strane Anti-CD38 x Anti-CD3 bispecifika kod SCID miševa sa umetnutim huPBMC. Primećeno je značajno smanjenje ljudskog IgM.

Prikazane su srednje vrednosti ± SEM na Dan 22. BLQ za IgM je <0,03 µg/mL. Tačkama podataka manjim od BLQ dodeljena je BLQ vrednost.

Slika 19. Osiromašenje CD38+ CD138+ ćelija kod MM PBMC od strane Anti-CD38 x Anti-CD3 bispecifičnih antitela.

Slika 20A-20Q prikazuje sekvence CD38 X CD3 scFv otvarača za boce predmetnog pronalaska.

Slika 21 prikazuje varijante nekih korisnih Fc domena CD38 X CD3 otvarača za boce.

Slike 22A i 22B prikazuju aminokiselinske sekvence za anti-CD38 x anti-CD3 bispecifike XENP13243 i XENP13551, sa podvučenim CDR i naelektrisanim veznikom (koji može biti nenaelektrisan ili zamenjen bilo kojim drugim naelektrisanim veznikom, bilo pozitivnim ili negativnim, sa Slike 7).

Slika 23A, 23B, 23C i 23D prikazuju DNK sekvence koje kodiraju anti-CD38 x anti-CD3 bispecifike XENP13243 i XENP13551.

Slika 24 prikazuje dijagram odnosa transfekcije DNK za generisanje stabilne grupe XENP13243 i XENP13551. Navedene su relativne količine transficirane DNK za HC-Fab, HC-scFv i LC.

Slike 25A, 25B, 25C i 25D prikazuju hromatograme katjonske razmene prečišćenog materijala proteina A iz supernanata stabilne grupe prikupljenih posle 7 dana serije kulture za XENP13243 i XENP13551. Koeficijenti transfekcije DNK navedeni su na Slici 24.

Primećene su integrisane vršne površine.

Slika 26. Sažetak različitih vrsta proteina generisanih stabilnim grupama identifikovanih hromatogramima razmene katjona prikazanih na Slici 25. Koeficijenti transfekcije DNK su navedeni kao na Slici 24.

Slika 27. Farmakokinetika Anti-CD38 x Anti-CD3 bispecifika XENP13243 i XENP13551 kod C57BL/6 miševa(n = 5 miševa po grupi). Vrednosti poluživota izračunate nekomparmentalnom analizom su navedene u legendi slike.

1

Slika 28. Citotoksičnost preusmerenih T ćelija od CD38+ RPMI8226 ćelija. Test se sastojao od 24 sata inkubacije na 37°C od 10.000 RPMI8226 ćelija sa 400.000 prečišćenih ljudskih T ćelija. Očitavanje citotoksičnosti je pomoću laktat dehidrogenaze (LDH).

Slika 29. Kinetika vezivanja ljudskih i cino CD38 i CD3 na XENP13243 i XENP13551, određena površinskom plazmonskom rezonancom. Oblik ispitivanja je naveden.

Slika 30. osiromašenje CD20-CD38+ ćelija kod cinomolgus majmuna pomoću XENP13243 (gornji panel) i XENP13551 (donji panel).

Slika 31. Regulacija na gore CD69 u CD8+ T ćelija kod cinomolgus majmuna XENP13243 (gornja ploča) i XENP13551 (donja ploča).

Slika 32 prikazuje spisak konstantnih regiona antitela za izoteričke varijante i njihove odgovarajuće supstitucije. pI_(-) ukazuje na niže pI varijante, dok pI_(+) ukazuje na više pI varijante. One mogu biti opciono i nezavisno kombinovane sa drugim heterodimerizacionim varijantama pronalaska.

Slika 33 prikazuje neke naelektrisane veze i podatke za određene anti-CD3 scFv.

Slika 34 prikazuje šemu povezanu sa upotrebom varijanta razdvajanja, koja se ovde takođe nazivaju „pI varijante“, i kombinuje ih sa heterodimernim varijantama, koje se ovde takođe nazivaju „zakrivljene varijante“. Ove se varijante mogu koristiti u „plug and play“ obliku, tako što se efekti varijanti lako prenose u različita antitela sa različitim Fv regionima i veoma su stabilni.

Slika 35 prikazuje optimizaciju uobičajenog anti-CD3 scFv-Fc. Stabilnost je povećana na različite načine, uključujući zamenu retkih aminokiselina, zamenu aminokiselina neuobičajenim dodirnim ostacima, vršenje sintetičkog povezivanja (za stabilnost i pojačano prečišćavanje, npr. naelektrisane scFv veznike) i konverziju u VL-VH orijentaciju.

Slika 36 prikazuje upotrebu Fc knock-out-a (ili ablacione varijante) koja zadržava stabilnost divljeg tipa, ali uklanja svo FcγR vezivanje.

Slika 37 prikazuje in vitro podatke o ubijanju i stabilnosti za anti-CD3X anti-CD38 oblik otvarača za boce.

Slika 38 prikazuje ubijanje ćelije ljudskog mijeloma. XmAb13551 ima visoki afinitet za CD3, dok XmAb13243 ima niži afinitet. Daratumumab je anti-CD38 bivalentno monospecifično antitelo.

Slika 39 prikazuje aktivnost poluživota bispecifika otvarača za boce prema pronalasku i odgovarajuće suzbijanje ljudskih Ig kod miševa.

Slika 40 prikazuje anti-CD38 X anti-CD3 funkcije od XmAb13551 i XmAb13243, uključujući osiromašenje CD38+ ćelija majmuna u krvi i koštanoj srži.

Slika 41 je prikazuje korelacija CD38+ ćelije koja je u korelaciji sa redistribucijom i aktivacijom T ćelija.

Slika 42 prikazuje razvoj stabilne ćelijske linije za proizvodnju XmAb13551 (visoki afinitet CD3) i njihove odgovarajuće prinose.

Slika 43 prikazuje je određenu optimizaciju ćelijske kulture za poboljšani prinos, gde su dobijeni titri ≥3 g/L, i nije vidljiva značajna razlika u odnosu heterodimera i homodimera u odnosu na veću razmeru.

Slika 44 prikazuje analitičke rezultate iz procesa proizvodnje u tri koraka. Postupak daje visoke prinose preko 55% veoma čistih heterodimernih bispecifičnih molekula i efikasno uklanja homodimerne, HMV i LMV zagađivače kao i HCP.

Slike 45A-45U prikazuju mnoštvo dodatnih oblika heterodimerizacije, od kojih svaki može da sadrži anti-CD3 i anti-CD38 sekvence predmetnog pronalaska. Slike 45A do 45U prikazuju širok spektar multispecifičnih oblika (npr. heterodimerizacija) i kombinacija različitih vrsta heterodimerizacionih varijanti koje se mogu koristiti u predmetnom pronalasku (one se ponekad ovde nazivaju „heterodimerne skele“). Pored toga treba imati na umu da svi ovi oblici mogu sadržati varijante dodavanja u Fc regionu, kao što je detaljnije razmotreno u nastavku, uključujući „ablacione“ ili „knock out“ varijante (Slika 7), Fc varijante za promenu FcγR vezivanja (FcγRIIb, FcγRIIIa, itd.), Fc varijante za promenu vezivanja za FcRn receptor, itd. Slika 45A prikazuje dualni oblik scFv-Fc, koji, kao i svi heterodimerizacioni oblici ovde, može da sadrži heterodimerizacione varijante kao što su pI varijante, „knobs-into-holes“ (KIH, takođe naveden ovde kao steričke varijante ili „zakrivljene varijante), naelektrisani parovi (podskup steričkih varijanti), izosteričke varijante i SEED telo („domen konstruisan razmenom lanaca"; pogledati Klein i dr., mAbs 4:6653-663 (2012) i Davis i dr, Protein Eng Des Sel 201023:195-202) koji se oslanjaju na činjenicu da se CH3 domeni ljudskog IgG i IgA ne vezuju jedan za drugog. Slika 45B prikazuje bispecifični IgG, opet sa opcijom različitih varijanti heterodimerizacije. Slika 45C prikazuje „jednokraku“ verziju DVD-Ig koja koristi dve različite varijabilnog teškog i varijabilnog lakog domena. Slika 45D je slična, osim što se umesto „praznog kraka“, varijabilni teški i laki lanci se nalaze na suprotnim teškim lancima. Slika 45E se generalno naziva „mAb-Fv“. Slika 45F prikazuje multi-scFv oblik; kao što će razumeti stručnjaci, slično oblicima „A, B, C, D“ koji su ovde razmatrani, može postojati bilo koji broj povezanih scFv (ili, u tom slučaju, bilo koji drugi vezivni ligand ili funkcionalnost). Prema tome, Slika 45F može imati 1, 2, 3 ili 4 scFv (npr. za bispecifike, scFv može biti „cis“ ili „trans“, ili oba na jednom „kraju“ molekula). Slika 45G prikazuje heterodimerni FabFc, gde je Fab formiran od dva

1

različita teška lanca, jedan sadrži Fab sekvence teškog lanca, i drugi sadrži Fab sekvence lakog lanca. Slika 45H prikazuje „jednokraki Fab-Fc“, gde jedan teški lanac sadrži Fab. Slika 45I prikazuje „jednokraki scFv-Fc“, gde jedan teški lanac Fc sadrži scFv, i drugi teški lanac je „prazan“. Slika 45J prikazuje scFv-CH3, gde se koriste samo CH3 regioni teškog lanca, svaki sa svojim scFv. Slika 45K prikazuje mAb-scFv, gde jedan kraj molekula bivalentno zahvata antigen, uz monovalentno zahvatanje koje koristi scFv na jednom od teških lanaca. Slika 45L prikazuje istu strukturu osim što oba teška lanca sadrže dodatni scFv, koji može da vezuje isti antigen ili različite antigene. Slika 45M prikazuje „CrossMab“ strukturu, gde se problem formiranja multipleksa zbog dva različita laka lanca rešava prebacivanjem sekvenci u Fab delu. Slika 45N prikazuje scFv, Slika 45O je „BiTE“ ili scFv-scFv koji je povezan veznikom kako je ovde naznačeno, Slika 45P prikazuje DART, Slika 45K prikazuje TandAb, i Slika 45R prikazuje dijatelo. Slike 45S, 45T i 45U prikazuju dodatne alternativne oblike skela koji pronalaze upotrebu u predmetnom pronalasku.

Slike 46A, 46B i 46C prikazuju scFv optimizovane protiv stabilnosti, humanizovanu anti-CD3 varijantu scFv. Supstitucije su date u odnosu na H1.1_L1.4 scFv sekvencu. Numeracija aminokiselina je Kabat numeracija.

Slike 47A i 47B. Varijabilni teški i varijabilni laki lanci za anti-CD3 sekvence upotrebe u predmetnom pronalasku uključuju i „snažne“ i „slabije“ vezujuće sekvence. Kao što će prepoznati stručnjaci, one se mogu koristiti u Fab ili scFv konstruktima u kombinaciji sa bilo kojim ciljanim domenima vezivanja antigena tumora.

Slika 48 prikazuje afinitete vezivanja u Biacore testu.

Slika 49 prikazuje čistoću heterodimera tokom stabilnog generisanja grupa korišćenjem različitih razmera lakog lanca, Fab-Fc i scFv-Fc.

Slika 50. Osiromašenje ljudskog IgM i IgG2 od strane anti-CD38 x anti-CD3 bispecifika u mišem modelu huPBMC.

Slike 51A i 51B prikazuju prečišćavanje XENP13243 i XENP13551, koji su konstruisani sa niskim i visokim afinitetom, za CD38.

Slike 52A, 52B i 52C prikazuju vezivanje za ljudeski i majmunski CD38 i CD3 i Kd.

Slika 53 prikazuje ubijanje ćelija mijeloma.

Slika 54 prikazuje da su T ćelije serijske ubice čak iako ciljanih ćelija ima više

Slika 55 prikazuje da Fc domen produžava poluživot.

Slika 56 prikazuje doziranje za eksperiment na Slici 14.

Slika 57 prikazuje veće osiromašenje hIg u odnosu na daratumumab.

Slika 58 prikazuje je doziranje za eksperiment na Slici 16.

1

Slika 59A i 59B Bispecifici osiromašuju CD38+ ćelije u krvnim i limfoidnim organima kod majmuna.

Slike 60A, 60B i 60C. Slika 60A (redistribucija iz krvi), Slika 60B (CD69 indukcija) i Slika 60C (oslobađanje citokina) prikazuju korelaciju osiromašenja CD38+ ćelija sa preraspodelom i aktivacijom T ćelija.

Slika 61 prikazuje nekoliko otelotvorenja od posebne primene u predmetnom pronalasku.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

I. Pregled

[0025] Predmetni pronalazak je usmeren na nove konstrukte kako bi pružio bispecifična antitela koja se vezuju i za CD3 i za CD38 antigene. Stalni problem u tehnologijama antitela je želja za „bispecifičnim“ (i/ili multispecifičnim) antitelima koja se vezuju za dva (ili više) različitih antigena istovremeno, uopšte omogućavajući tako da se različiti antigeni dovedu u blizinu i rezultuju novim funkcionalnostima i novim terapijama. Generalno, ova antitela se proizvode uključivanjem gena za svaki teški i laki lanac u ćelije domaćina. Ovo generalno rezultuje formiranjem željenog heterodimera (A-B), kao i dva homodimera (A-A i B-B). Međutim, glavna prepreka u stvaranju multispecifičnih antitela je poteškoća u prečišćavanju heterodimernih antitela dalje od homodimernih antitela i/ili prilagođavanje formiranja heterodimera tokom formiranja homodimera.

[0026] Predmetni pronalazak je generalno usmeren na stvaranje heterodimernih proteina, kao što su antitela koja mogu da ko-zahvate antigene na više načina, oslanjajući se na varijante aminokiselina u konstantnim regionima koji su različiti u svakom lancu radi promovisanja heterodimerne formiranja i/ili omogućavanja jednostavnosti prečišćavanja heterodimera preko homodimera.

[0027] Prema tome, predmetni pronalazak je usmeren na nove sastave imunoglobulina koji zajedno uključuju bar prvi i drugi antigen. Prvi i drugi antigeni predmetnog pronalaska su ovde nazvani antigen-1 i antigen-2. Jedan teški lanac antitela sadrži jednolančani Fv („scFv“, kao što je definisano niže), i drugi teški lanac je „pravilnog“ FAb oblika, koji sadrži varijabilni teški i laki lanac. Ova se struktura ponekad naziva „trostrukim F“ oblikom (scFv-FAb-Fc) ili oblikom „otvarača za boce“, zbog grube vizuelne sličnosti sa otvaračem za boce (Slika 8B). Dva lanca su spojena korišćenjem varijanti aminokiselina u konstantnim

1

regionima (npr. Fc domen i/ili zglobni region) koji promovišu stvaranje heterodimernih antitela kao što je detaljnije opisano u nastavku.

[0028] Postoje nekoliko različitih prednosti predmetnog „trostrukog F“ oblika. Kao što je poznato u struci, analozi antitela koji se oslanjaju na dva scFv konstrukta često imaju problema sa stabilnošću i agregacijom, što se u predmetnom pronalasku može ublažiti dodatkom „redovnog“ uparivanja teškog i lakog lanca. Pored toga, za razliku od oblika koji se oslanjaju na dva teška i dva laka lanca, ne postoji problem sa pogrešnim uparivanjem teških i lakih lanaca (npr. uparivanje teškog 1 sa lakim 2, itd.)

[0029] Postoji veliki broj mehanizama koji se mogu koristiti za stvaranje heterodimera predmetnog pronalaska. Pored toga, kao što će stručnjaci razumeti i kako je detaljnije opisano u nastavku, ovi mehanizmi se mogu kombinovati kako bi se osigurala visoka heterodimerizacija.

[0030] Jedan mehanizam se u struci generalno naziva „knobs-and-holes“ („KIH“), ili ponekad ovde kao varijante „nagiba“, koje se odnose na konstruisanje aminokiselina koji stvara sterične uticaje kako bi se favorizovalo formiranje heterodimera, i obeshrabrivanje formiranja homodimera takođe opciono može korišćeno; ovo se ponekad naziva „knobs-andholes“, kako je opisano u USSN 61/596,846, Ridgway i dr., Protein Engineering 9(7):617 (1996); Atwell i dr., J. Mol. Biol.1997 270:26; US Patent No.8,216,805.

[0031] Slike prikazuju brojne „monomer A - monomer B“ parove koji se oslanjaju na „knobs-and-holes“. Pored toga, kako je opisano kod Merchant i dr., Nature Biotech.16:677 (1998), ove „knobs-and-holes“ mutacije mogu se kombinovati sa disulfidnim vezama kako bi se formiranje zakrivilo do heterodimerizacije.

[0032] Dodatni mehanizam koji pronalazi upotrebu u stvaranju heterodimera ponekad se naziva i „elektrostatičkim upravljanjem“ kako je opisano kod Gunasekaran i dr., J. Biol. Chem. 285(25): 19637 (2010). Ovo se ponekad ovde naziva „parovi naelektrisanja“. U predmetnom otelotvorenju, elektrostatika se koristi kako bi se formiranje zakrivilo u smeru heterodimerizacije. Kao što će stručnjaci proceniti, ovo takođe može imati uticaja na pI, i samim tim i na prečišćavanje, pa bi se u nekim slučajevima moglo smatrati i pI varijantima. Međutim, kako su generisane da bi primorale heterodimerizaciju i nisu korišćene kao agensi

1

za prečišćavanje, klasifikovane su kao „steričke varijante“. One uključuju, ali nisu ograničene na, D221E/P228E/L368E uparen sa D221R/P228R/K409R (npr. ovo su „odgovarajući monomerski setovi“) i C220E/P228E/368E upareni sa C220R/E224R/P228R/K409R.

(Obratiti pažnju da je 220 mutacija uklanjanje cisteina koji više nije potreban za stvaranje disulfida teškog i lakog lanca, kao što je detaljnije opisano u nastavku).

[0033] U predmetnom pronalasku, postoji nekoliko osnovnih mehanizama koji mogu dovesti do lakoće prečišćavanja heterodimernih proteina; jedan se oslanja na upotrebu pI varijanti, tako da svaki monomer ima različit pI, omogućavajući izoelektrično prečišćavanje A-A, A-B i B-B dimernih proteina. Alternativno, „trostruki F“ oblik takođe omogućava razdvajanje na osnovu veličine. Kao što je dalje navedeno u nastavku, takođe je moguće „skenirati“ formiranje heterodimera nad homodimerima, kao što je opšte naznačeno u nastavku. Zbog toga, kombinacija steričkih varijanti heterodimerizacije i varijante para pI ili naelektrisanja pronalaze posebnu upotrebu u pronalasku. Pored toga, kao što je detaljnije opisano u nastavku, scFv monomer trostrukog F oblika može da sadrži naelektrisane scFv veznike (bilo pozitivne ili negativne), koji daju dodatno pI pojačanje u svrhu prečišćavanja. Kao što će razumeti stručnjaci, neki trostruki F oblici su korisni sa samo naelektrisanim scFv veznicima i bez dodatnog prilagođavanja pI, mada pronalazak takođe pruža upotrebu zakrivljenih varijanti sa naelektrisanim scFv veznicima (i kombinacije Fc, FcRn i KO varijanti).

[0034] U predmetnom pronalasku koji koristi pI kao mehanizam za razdvajanje za stvaranje heterodimernog trostrukog F oblika, varijante aminokiselina mogu se uvesti u jedan ili oba monomerska polipeptida; to jest, pI jednog monomera (koji se ovde radi jednostavnosti naziva „monomer A“) može se konstruisati dalje od monomera B, ili se mogu promeniti oba monomera A i B, gde se pI monomera A povećava i pI monomera B opada. Kao što je detaljnije opisano u nastavku, pI promene jednog ili oba monomera mogu se izvršiti uklanjanjem ili dodavanjem naelektrisanog ostatka (npr. neutralna aminokiselina je zamenjena pozitivno ili negativno naelektrisanim aminokiselinskim ostatkom, npr. glicin u glutaminskoj kiselini), promena naelektrisanog ostatka iz pozitivnog ili negativnog u suprotno naelektrisanje (aspartanska kiselina u lizin) ili promena naelektrisanog ostatka u neutralni ostatak (npr. gubitak naelektrisanja; lizin u serin). Broj ovih varijanti prikazan je na Slikama.

[0035] Shodno tome, u ovom otelotvorenju predmetnog pronalaska predviđa se stvaranje

1

dovoljne promene pI u bar jednom od monomera, tako da se heterodimeri mogu razdvojiti od homodimera. Kao što će razumeti stručnjaci, i kao što je dalje razmatrano, ovo se može učiniti korišćenjem konstantnog regiona teškog lanca „divljeg tipa“ i varijante regiona koja je projektovana da poveća ili smanji pI (wt A-+B ili wt A- -B), ili povećanjem jednog regiona i smanjenjem drugog regiona (A+ -B- ili A- B+). Treba napomenuti da u ovom razmatranju nije važno koji monomer sadrži scFv, a koji Fab.

[0036] Prema tome, generalno, komponenta predmetnog obelodanjenja su varijante aminokiselina u konstantnim regionima antitela koje su usmerene na izmenu izoelektrične tačke (pI) bar jednog, ako ne i oba, monomera dimerskog proteina kako bi se formirali „pI heterodimeri“ (kada je protein antitelo, oni se nazivaju „pI antitela“) uključivanjem aminokiselinska supstitucija („pI varijante“ ili „pI supstitucije“) u jedan ili oba monomera. Kako je ovde prikazano, razdvajanje heterodimera od dva homodimera može se izvršiti ako se pI od dva monomera razlikuju za samo 0,1 pH jedinicu, sa 0,2, 0,3, 0,4 i 0,5 ili većom upotrebom u predmetnom pronalasku.

[0037] Kao što će razumeti stručnjaci, broj pI varijanti koje treba uključiti na svaki ili oba monomera kako bi se postiglo dobro razdvajanje zavisiće delom od početnog pI od scFv i Fab od interesa. Odnosno, kako bi se odredio koji monomer treba konstruisati ili u kom pravcu (npr. pozitivnije ili negativnije), izračunavaju se Fv sekvence dva ciljana antigena i odatle se donosi odluka. Kao što je poznato u struci, različiti Fv će imati različite početne pI koji se koriste u predmetnom pronalasku. Uopšteno, kako je ovde naznačeno, pI su konstruisani da daju ukupnu pI razliku svakog monomera od najmanje oko 0,1 log, gde je poželjno 0,2 do 0,5 kako je ovde naznačeno.

[0038] Dalje, kao što će razumeti stručnjaci i kako je ovde navedeno, heterodimeri se mogu razdvojiti od homodimera na osnovu veličine. Na primer, kao što je prikazano na Slici 8, heterodimeri sa dva scFv (Slika 8A) mogu se razdvojiti od strane onih u „trostrukom F“ obliku (Slika 8B) i bispecifičnih mAb (Slika 8C). Ovo se može dalje iskoristiti pri višoj valenci uz korišćenje dodatnih mesta vezivanja antigena. Na primer, kao što je dodatno prikazano, jedan monomer će imati dva Fab fragmenta, i drugi će imati jedan scFv, što će rezultovati razlikom u veličini, i samim tim i molekulskoj težini.

[0039] Pored toga, kao što će razumeti stručnjaci i kako je ovde navedeno, oblik koji je ovde

2

prikazan može se proširiti i kako bi pružio trispecifična i tetraspecifična antitela. U ovom otelotvorenju, od kojih su neke varijante prikazane na Slikama, biće prepoznato da je moguće da se neki antigeni vežu dvovalentno (npr. dva mesta vezivanja antigena na jedan antigen; na primer, A i B mogu biti deo jedne tipične bivalentne veze i C i D mogu opciono biti prisutni i opciono isti ili različiti). Kako je poznato, bilo koja kombinacija Fab i scFv može se koristiti za postizanje željenog rezultata i kombinacija.

[0040] U slučaju kada se pI varijante koriste za postizanje heterodimerizacije, korišćenjem konstantnog regiona teškog lanca, pruža se modularniji pristup konstruisanju i prečišćavanju višespecifičnih proteina, uključujući antitela. Zbog toga, u nekim otelotvorenjima, varijante heterodimerizacije (uključujući varijante heterodimerizacije kod prevrtanja i prečišćavanja) nisu obuhvaćene u varijabilnim regionima, tako da svako pojedinačno antitelo mora da se konstruiše. Pored toga, u nekim otelotvorenjima mogućnost imunogenosti koja je rezultat pI varijanti značajno se smanjuje uvozom pI varijanti iz različitih IgG izotipa, tako da se pI menja bez uvođenja značajne imunogenosti. Prema tome, dodatni problem koji treba rešiti je razjašnjenje domena sa niskim pI konstantom sa visokim sadržajem ljudske sekvence, npr. minimizovanje ili izbegavanje ostataka koji nisu ljudski na bilo kom određenom položaju.

[0041] U jednom otelotvorenju, heterodimerno antitelo omogućava monovalentno zahvatanje jednog antigena korišćenjem scFv i monovalentno zahvatanje drugog antigena korišćenjem FAb. Kao što je navedeno u nastavku, ovaj oblik takođe može biti raznovrsan; u nekim otelotvorenjima postoji monovalentno zahvatanje tri antigena, dvovalentno zahvatanje jednog antigena i monovalentno zahvatanje drugog antigena (npr. A i C su istom antigenu, i B je različitom antigenu) itd.

[0042] Nuspojava koja se može javiti kod ovog pI konstruisanja je takođe produženje perioda poluživota u serumu i povećano vezivanje FcRn. To je, kako je opisano u US 2012/0028304, snižavanje pI konstantnih domena antitela (uključujući one koji se nalaze u antitelima i Fc fuzijama) može dovesti do dužeg zadržavanja seruma in vivo. Ove pI varijante za produženi poluživot u serumu takođe olakšavaju promene pI za prečišćavanje.

[0043] Dalje, kako je ovde naznačeno, dodatne varijante aminokiselina mogu se uvesti u bispecifična antitela predmetnog pronalaska, kako bi se dodale dodatne funkcionalnosti. Na primer, promene aminokiselina u Fc regionu mogu se dodati (bilo u jedan monomer ili u oba) kako bi se omogućili povećani ADCC ili CDC (npr. izmenjeno vezivanje za Fcγ receptore); kako bi se dozvolio ili povećao prinos dodavanja toksina i lekova (npr. za ADC), kao i da se poveća vezivanje za FcRn i/ili poveća poluživot dobijenih molekula. Kako je ovde detaljnije opisano i kao što će oni znati u struci, bilo koja ovde navedena varijanta može biti opciono i nezavisno kombinovana sa drugim varijantama.

[0044] Slično tome, druga kategorija funkcionalnih varijanti su „Fcγ ablacione varijante“ ili „Fc knock out (FcKO ili KO) varijante. U ovim otelotvorenjima, za neke terapeutske primene, poželjno je smanjiti ili ukloniti normalno vezivanje Fc domene za jedan ili više ili sve Fcγ receptore (npr. FcγR1, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIIa, itd.) kako bi se izbegli dodatni mehanizmi delovanja. Drugim rečima, na primer, u mnogim otelotvorenjima je opšte poželjno da se ukloni vezivanje FcyRIIIa kako bi se eliminisala ili značajno smanjila ADCC aktivnost.

[0045] Pored toga, obelodanjenje pruža nove humanizovane anti-CD3 sekvence, uključujući grupe CDR, pune varijabilne lake i teške lance, kao i pridružene scFv, koji mogu opciono da uključuju naelektrisane scFv veznike. Ove optimizovane sekvence mogu se koristiti u drugim oblicima antitela.

[0046] Obelodanjenje dalje pruža nove anti-CD38 sekvence, uključujući grupe CDR, pune varijabilne lake i teške lance, kao i pridružene scFv, koji mogu opciono da uključuju naelektrisane scFv veznike. Ove optimizovane sekvence mogu se koristiti u drugim oblicima antitela.

[0047] Prema tome, predmetni pronalazak pruža nove konstrukte za proizvodnju bispecifičnih, bivalentnih antitela koja se vezuju i za CD3 i CD38.

[0048] Pored toga, predmetni pronalazak pruža antigen-vezujuće domene različitih afiniteta. To jest, u nekim indikacijama mogu biti poželjni jači afiniteti, dok u drugima slabiji afiniteti mogu da pronađu upotrebu, kako za anti-CD3, tako i za CD38 sekvence. Prema tome, u nekim otelotvorenjima predmetno obelodanjenje pruža konstrukte antitela koji sadrže domene koji vezuju anti-CD3 antigene koji su „snažni“ ili „visoko afinitetni“ veznici za CD3 (npr. jedan primer su teški i laki varijabilni domeni koji su prikazani kao H1.30_L1.47 (opciono) uključujući naelektrisani veznik prema potrebi)). U drugim otelotvorenjima, predmetno obelodanjenje pruža konstrukte antitela koji sadrže domene koji vezuju anti-CD3 antigene koji su „slabiji“ ili „nisko afinitetni“ veznici za CD3, kao što je prikazano na Slici 47.

II. Definicije

[0049] Kako bi se prijava potpuno razumela, u nastavku je izloženo nekoliko definicija. Takve definicije treba da obuhvate i svoje gramatičke ekvivalente.

[0050] Pod „ablacijom“ ovde se podrazumeva smanjenje ili uklanjanje aktivnosti. Tako, na primer, „ablacija FcγR vezivanja“ znači da varijanta Fc regiona aminokiseline ima manje od 50% polaznog vezivanja u poređenju sa Fc regionom koji ne sadrži specifičnu varijantu, gde je manje od 70-80-90-95-98% gubitka aktivnost poželjno i, uopšteno, aktivnost je ispod nivoa detektabilnog vezivanja u Biacore testu. Varijante od posebne primene kada se koriste ablacione varijante (takođe se ovde ovde nazivaju i „FcγR ablacione varijante“, „Fc ablacione varijante“, „Fc knock outs“ („FcKO“) ili „knock out“ („KO“) varijante) su one prikazane na Slici 35.

[0051] Pod „ADCC“ ili „ćelijski posredovanom citotoksičnošću zavisnom od antitela“ kako se ovde koristi, podrazumeva se ćelijski posredovana reakcija u kojoj nespecifične citotoksične ćelije koje eksprimiraju FcγR prepoznaju vezano antitelo na ciljanoj ćeliji i posle toga izazivaju lizu ciljane ćelije. ADCC je u korelaciji sa vezivanjem za FcγRIIIa; povećano vezivanje za FcγRIIIa dovodi do povećanja ADCC aktivnosti.

[0052] Pod „ADCP“ ili ćelijski posredovanom fagocitozom zavisnom od antitela, kako se ovde koristi, podrazumeva se ćelijski posredovana reakcija u kojoj nespecifične citotoksične ćelije koje eksprimiraju FcγR prepoznaju vezano antitelo na ciljanoj ćeliji, i posle toga izazivaju fagocitozu ciljane ćelije.

[0053] Pod „modifikacijom“ ovde se podrazumeva aminokiselinska supstitucija, umetanje i/ili brisanje u polipeptidnoj sekvenci ili promena u hemijskom delu koji je vezan za protein. Na primer, modifikacija može biti izmenjeni ugljeni hidrat ili PEG struktura vezana za protein. Pod „modifikacijom aminokiselina“ ovde se podrazumeva aminokiselinska supstitucija, umetanje i/ili brisanje u polipeptidnoj sekvenci. Radi jasnoće, ako nije drugačije navedeno, modifikacija aminokiselina je uvek aminokiselina kodirana sa DNK, npr.20 aminokiselina koje sadrže kodone u DNK i RNK.

2

[0054] Pod „aminokiselinskom supstitucijom“ ili „supstitucijom“ ovde se misli na zamenu aminokiseline na određenom položaju u matičnom polipeptidnom nizu sa drugom aminokiselinom. Konkretno, u nekim otelotvorenjima supstitucija je aminokiselina koja se ne odvija prirodno na određenom položaju, ili se prirodno ne odvija u organizmu, ili u bilo kom organizmu. Na primer, supstitucija E272Y se odnosi na varijantu polipeptida, u ovom slučaju Fc varijantu, u kojoj je glutaminska kiselina na položaju 272 zamenjena tirozinom. Radi jasnoće, protein koji je konstruisan da promeni sekvencu kodiranja nukleinske kiseline, ali ne i da izmeni početnu aminokiselinu (na primer, zamena CGG (kodira arginin) sa CGA (još uvek kodira arginin) kako bi povećao nivo eksprimiranja organizma domaćina) nije „aminokiselinska supstitucija“; to jest, uprkos stvaranju novog gena koji kodira isti protein, ako protein ima istu aminokiselinu na određenom položaju sa kojim je započeo, to nije aminokiselinska supstitucija.

[0055] Pod „umetanjem aminokiselina“ ili „umetanjem“ kako se ovde koristi, podrazumeva se dodavanje aminokiselinske sekvence na određenom položaju u matičnoj polipeptidnoj sekvenci. Na primer, -233E ili 233E označava umetanje glutaminske kiseline posle položaja 233 i pre položaja 234. Pored toga, -233ADE ili A233ADE označava umetanje AlaAspGlu posle položaja 233 i pre položaja 234.

[0056] Pod „brisanjem aminokiselina“ ili „brisanjem“, kako se ovde koristi, podrazumeva se uklanjanje aminokiselinske sekvence na određenom položaju u matičnoj polipeptidnoj sekvenci. Na primer, G236- ili G236# ili G236del označava brisanje glicina na položaju 236. Pored toga, EDA233- ili EDA233# označava brisanje sekvence GluAspAla koja počinje na položaju 233. Slično, neke od varijanti heterodimerizacije uključuju „K447del“, što znači da je lizin na položaju 447 izbrisan.

[0057] Pod „ varijantom proteina“ ili „proteinskom varijantom“ ili „varijantom“, kako se ovde koriste, podrazumeva se protein koji se razlikuje od matičnog proteina po najmanje jednoj modifikaciji aminokiselina. Varijanta proteina može se odnositi na sam protein, sastav koja sadrži protein, ili amino sekvencu koja ga kodira. Poželjno, varijanta proteina ima najmanje jednu modifikaciju aminokiselina u poređenju sa matičnim proteinom, npr. od oko jedne do oko sedamdeset modifikacija aminokiselina, i poželjno od oko jedne do oko pet modifikacija aminokiselina u poređenju sa matičnom. Kao što je opisano u nastavku, u nekim otelotvorenjima matični polipeptid, na primer Fc matični polipeptid, je ljudska sekvenca divljeg tipa, kao što je Fc region od IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4, mada ljudske sekvence sa varijantama mogu takođe služiti kao „matični polipeptidi“. Proteinska sekvenca ove varijante će poželjno imati najmanje oko 80% identičnosti sa matičnom proteinskom sekvencom, i najpoželjnije najmanje oko 90% identičnosti, poželjnije najmanje oko 95-98-99% identičnosti. Varijanta proteina može da se odnosi na samu varijantu proteina, sastave koji sadrže varijantu proteina ili DNK sekvencu koja ga kodira. Shodno tome, pod „varijantom antitela“, kako se ovde koristi, podrazumeva se antitelo koje se razlikuje od matičnog antitela po najmanje jednoj modifikaciji aminokiseline, „varijanti IgG“ ili „varijanti IgG“ kako se ovde koristi. Antitelo koje se razlikuje od matičnog IgG (opet, u mnogim slučajevima, od ljudske IgG sekvence) po najmanje jednoj modifikaciji aminokiselina, i „imunoglobulinska varijanta“ ili „varijanta imunoglobulina“, kako se ovde koriste, označavaju imunoglobulinsku sekvencu koja se razlikuje od matične imunoglobulinske sekvence zahvaljujući najmanje jednoj modifikaciji aminokiselina. „Fc varijanta“, kako se ovde koristi, označava protein koji sadrži modifikaciju aminokiselina u Fc domenu. Fc varijante predmetnog pronalaska su definisane prema modifikacijama aminokiselina koje ih čine. Tako, na primer, N434S ili 434S je Fc varijanta sa supstitucionim serinom na položaju 434 u odnosu na matični Fc polipeptid, gde je numeracija prema EU indeksu. Slično tome, M428L/N434S definiše Fc varijantu sa supstitucijama M428L i N434S u odnosu na matični Fc polipeptid. Identitet WT aminokiseline može biti neodređen, u kom slučaju se gore navedena varijanta naziva 428L/434S. Treba napomenuti da je redosled u kome su supstitucije pružene proizvoljan, to jest, na primer, 428L/434S je ista Fc varijanta kao M428L/N434S, i tako dalje. Za sve položaje razmatrane u predmetnom pronalasku koje se odnose na antitela, osim ako nije drugačije naznačeno, numeracija položaja aminokiselina je prema EU indeksu. EU indeks ili EU indeks kao u Kabat ili EU šemi numeracije se odnosi na EU numeracija antitela (Edelman i dr., 1969, Proc Natl Acad Sci USA 63:78-85) Modifikacija može biti umetanje, brisanje ili zamena. Supstitucije mogu da uključuju aminokiseline koje se javljaju u prirodi i, u nekim slučajevima, sintetičke aminokiseline. Primeri uključuju U.S. Pat. No.6,586,207; WO 98/48032; WO 03/073238; US2004-0214988A1; WO 05/35727A2; WO 05/74524A2; J. W. Chin i dr., (2002), Journal of the American Chemical Society 124:9026-9027; J. W. Chin, & P. G. Schultz, (2002), ChemBioChem 11:1135-1137; J. W. Chin, i dr., (2002), PICAS United States of America 99:11020-11024; i, L. Wang, & P. G. Schultz, (2002), Chem. 1-10.

[0058] Kako se ovde koristi, pod „proteinom“ se smatraju najmanje dve kovalentno vezane

2

aminokiseline, koje uključuju proteine, polipeptide, oligopeptide i peptide. Peptidil grupa može da sadrži aminokiseline i peptidne veze koje se javljaju u prirodi, ili sintetičke peptidomimetičke strukture, tj. „analoge“, kao što su peptoidi (pogledati Simon i dr., PNAS USA 89(20):9367 (1992)). Aminokiseline mogu biti prirodne ili sintetičke (na primer, aminokiselina koja je kodirana od strane DNK); što će razumeti stručnjaci. Na primer, homofenilalanin, citrulin, ornitin i noreleucin smatraju se sintetičkim aminokiselinama u svrhu pronalaska, i D- i L-(R ili S) konfigurisane aminokiseline mogu biti korišćene. Varijante predmetnog pronalaska mogu da sadrže modifikacije koje uključuju upotrebu sintetičkih aminokiselina ugrađenih koristeći, na primer, tehnologije koje su razvili Schultz i kolege, uključujući, ali ne ograničavajući se na postupke opisane kod Cropp & Shultz, 2004, Trends Genet. 20(12):625-30, Anderson i dr., 2004, Proc Natl Acad Sci USA 101 (2):7566-71, Zhang i dr., 2003, 303(5656):371-3, i Chin i dr., 2003, Science 301(5635):964-7. Pored toga, polipeptidi mogu da uključuju sintetičku derivatizaciju jednog ili više bočnih lanaca ili terminusa, glikozilaciju, PEGilaciju, kružnu permutaciju, ciklizaciju, veznike za druge molekule, fuziju za proteine ili domene proteina, i dodavanje peptidnih oznaka ili obeležja.

[0059] Pod „ostatkom“, kako se ovde koristi, označava se položaj proteina i njegov pripadajući aminokiselinski identitet. Na primer, Asparagin 297 (koji se takođe naziva Asn297 ili N297) je ostatak na položaju 297 u ljudskom antitelu IgG1.

[0060] Pod „Fab“ ili „Fab regionom“, kako se ovde koristi, podrazumeva se polipeptid koji sadrži VH, CH1, VL i CL domene imunoglobulina. Fab može da se odnosi na ovaj region izolovan, ili na ovaj region u kontekstu antitela pune dužine, fragmenta antitela ili Fab fuzionisanog proteina. Pod „Fv“ ili „Fv fragmentom“ ili „Fv regionom“ kako se ovde koristi, podrazumeva se polipeptid koji sadrži VL i VH domene jednog antitela.

[0061] Pod „modifikacijom IgG potklasa“ ili „modifikacijom izotipa“, kako se ovde koristi, podrazumeva se modifikacija aminokiseline koja pretvara jednu aminokiselinu iz jednog IgG izotipa u odgovarajuću aminokiselinu u drugom, usklađenom izotipu IgG. Na primer, pošto IgG1 sadrži tirozin, i IgG2 fenilalanin na EU položaju 296, supstitucija F296Y u IgG2 smatra se modifikacijom IgG potklase.

[0062] Pod „modifikacijama koje se ne javljaju u prirodi“, kako se ovde koristi, misli se na modifikaciju aminokiselina koja nije izotipska. Na primer, jer nijedan od IgG ne sadrži serin

2

na položaju 434, supstitucija 434S u IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4 (ili njeni hibridi) smatra se modifikacijom koja se ne javlja u prirodi. „Izotipske“ modifikacije se odnose na uvoz jedne izotipske aminokiseline na položaju u kičmi različitog izotipa; na primer, uvoz aminokiseline IgG1 u kičmu IgG2 na istom položaju.

[0063] Pod „aminokiselinama“ i „aminokiselinskim identitetom“, kako se ovde koristi, podrazumeva se jedna od 20 aminokiselina koje se javljaju u prirodi, i koje su kodirane od strane DNK i RNK.

[0064] Pod „efektorskom funkcijom“, kako se ovde koristi, podrazumeva se biohemijski događaj koji je rezultat interakcije Fc regiona antitela i Fc receptora ili liganda. Efektorske funkcije uključuju, ali nisu ograničene na ADCC, ADCP i CDC.

[0065] Pod „IgG Fc ligandom“, kako se ovde koristi, podrazumeva se molekul, poželjno polipeptid, iz bilo kog organizma koji se vezuje za Fc region IgG antitela i formira kompleks Fc/Fc liganda. Fc ligandi uključuju, ali nisu ograničeni na FcyRIs, FcγRIIs, FcγRIIIs, FcRn, C1q, C3, manan vezujući lektin, receptor manoze, stafilokokni protein A, streptokokni protein G i virusni FcγR. Fc ligandi takođe uključuju homologe Fc receptora (FcRH), koji su porodica Fc receptora koji su homologni za FcγRs (Davis i dr., 2002, Immunological Reviews 190:123-136). Fc ligandi mogu da sadrže neotkrivene molekule koji vezuju Fc. Posebni IgG Fc ligandi su FcRn i Fc gama receptori. Pod „Fc ligandom“, kako se ovde koristi, podrazumeva se molekul, poželjno polipeptid, iz bilo kog organizma koji se vezuje za Fc region antitela i formira kompleks Fc/Fc liganda.

[0066] Pod „Fc gama receptorom“, „FcγR“ ili „FcqammaR“, kako se ovde koristi, podrazumeva se svaki član porodice proteina koji vezuje Fc region IgG antitela i kodira FcγR gen. Kod ljudi ova porodica uključuje, ali nije ograničena na FcγRI (CD64), uključujući izoforme FcγRIa, FcγRIb i FcyRIc; FcγRII (CD32), uključujući izoformee FcyRIIa (uključujući alotipove H131 i R131), FcγRIIb (uključujući FcγRIIb-1 i FcγRIIb-2) i FcγRIIc; i FcγRIII (CD16), uključujući izoformu FcγRIIIa (uključujući alotipove V158 i F158) i FcγRIIIb (uključujući alotipove FcγRIIb-NA1 i FcγRIIb-NA2) (Jefferis i dr., 2002, Immunol Lett 82:57-65), kao i sve neotkrivene ljudske FcγRs ili FcγR izoforme ili alotipove. FcγR može biti iz bilo kog organizma, uključujući, ali ne ograničavajući se na ljude, miševe, pacove, zečeve i majmune. Mišji FcγR uključuju, ali nisu ograničeni na FcγRI (CD64),

2

FcyRII (CD32), FcγRIII (CD16) i FcγRIII-2 (CD16-2), kao i sve neotkrivene mišje FcγRs ili FcγR izoforme ili alotipove.

[0067] Pod „FcRn“ ili „neonatalnim Fc receptorom“, kako se ovde koristi, podrazumeva se protein koji vezuje Fc region IgG antitela i bar delimično je kodiran FcRn genom. FcRn može biti iz bilo kog organizma, uključujući, ali ne ograničavajući se na ljude, miševe, pacove, zečeve i majmune. Kao što je poznato u struci, funkcionalni FcRn protein sadrži dva polipeptida, koji se često nazivaju teški i laki lanac. Laki lanac je beta-2-mikroglobulin, i težak lanac je kodiran FcRn genom. Ako ovde nije drugačije naznačeno, FcRn ili FcRn protein odnosi se na kompleks FcRn teškog lanca sa beta-2-mikroglobulinom. Različite FcRn varijante koje se koriste za povećanje vezivanja za FcRn receptor, i u nekim slučajevima i za povećanje poluživota u serumu. Fc varijante koje daju povećano vezivanje za FcRn receptor i odgovarajuća povećanja poluživota u serumu uključuju, ali nisu ograničene na, 434A, 434S, 428L, 308F, 259I, 428L/434S, 259I/308F, 436I/428L, 436I or V/434S, 436V/428L, 252Y, 252Y/254T/256E i 259I/308F/428L. To jest, trostruki F oblik sa Slike 8B može imati bilo koju od ovih FcRn varijanti na bilo kojoj ili na obe sekvence monomera. Radi jasnoće, kako je svaki teški lanac različit, FcRn varijante (kao i Fc varijante) mogu da se nalaze na jednom ili oba monomera.

[0068] Pod „matičnim polipeptidom“, kako se ovde koristi, podrazumeva se početni polipeptid koji se naknadno modifikuje kako bi se dobila varijanta. Matični polipeptid može biti prirodni polipeptid ili varijanta ili konstruisana verzija prirodnog polipeptida. Matični polipeptid može se odnositi na sam polipeptid, sastave koji sadrže matični polipeptid, ili aminokiselinsku sekvencu koja ga kodira. Shodno tome, pod „matičnim imunoglobulinom“, kako se ovde koristi, podrazumeva se nemodifikovani imunoglobulinski polipeptid koji je modifikovan da stvori varijantu, i pod „matičnim antitelom“, kako se ovde koristi, podrazumeva se nemodifikovano antitelo koje je modifikovano tako da stvara varijantu antitela. Treba napomenuti da „matično antitelo“ uključuje poznata komercijalna, rekombinantno proizvedena antitela, kao što je navedeno u nastavku.

[0069] Pod „Fc fuzionim proteinom“ ili „imunoadhezinom“ ovde se podrazumeva protein koji sadrži Fc region, generalno povezan (opciono preko vezničkog dela, kako je ovde opisano) sa različitim proteinima, kao što je vezujući deo za ciljani protein, kao što je opisano ovde).

2

[0070] Pod „položajem“, kako se ovde koristi, podrazumeva se mesto u sekvenci proteina. Položaji se mogu numerisati sekvencijalno, ili prema utvrđenom formatu, na primer, EU indeks za numeracija antitela.

[0071] Pod „lančanošću“ u kontekstu monomera heterodimernih proteina pronalaska ovde se podrazumeva da su, slično kao dva lance DNK koja se „podudaraju“, varijante heterodimerizacije ugrađene u svaki monomer tako da se očuva sposobnost „podudaranja“ kako bi formirali heterodimere. Na primer, ako su neke pI varijante projektovane u monomeru A (npr. Povećavanje pI), tada steričke varijante, koje su „parovi naelektrisanja“ koji se mogu koristiti i ne ometaju pI varijante, npr. varijante naelektrisanja koje povećavaju pI, stavljaju se na isti „lanac“ ili „monomer“ kako bi se očuvale obe funkcionalnosti.

[0072] Pod „ciljanim antigenom“, kako se ovde koristi, podrazumeva se molekul koji je specifično vezan za varijabilni region datog antitela. Ciljani antigen može biti protein, ugljeni hidrat, lipid ili neko drugo hemijsko jedinjenje. Poželjni ciljani antigeni predmetnog pronalaska su CD3 i CD38.

[0073] Pod „ciljanom ćelijom“, kako se ovde koristi, podrazumeva se ćelija koja eksprimira ciljani antigen.

[0074] Pod „varijabilnim regionom“, kako se ovde koristi, podrazumeva se region imunoglobulina koji sadrži jedan ili više Ig domena koji su u značajnoj meri kodirani od bilo kog od V.kapa., V.lambda. i/ili VH gena koji čine kappa, lambda i genetske lokuse imunoglobulina teškog lanca.

[0075] Pod „divljim tipom ili WT“ ovde se misli na aminokiselinsku sekvencu ili nukleotidnu sekvencu koja se pronalazi u prirodi, uključujući alelne varijante. WT protein ima aminokiselinsku sekvencu ili nukleotidnu sekvencu koja nije namerno modifikovana.

[0076] Pod „jednolančanim varijabilnim fragmentom“, „scFv“ ili „jednolančanim Fv“, kao što je dobro poznato u struci, ovde se misli na fuzioni protein varijabilnog teškog i lakog lanca antitela, obično povezan sa peptidnim veznikom. Tipični scFv veznici su dobro poznati u struci, obično su dužine od 10 do 25 aminokiselina i uključuju glicine i serine.

2

[0077] Pod „naelektrisanim scFv veznikom“ ovde se misli na scFv veznik koji koristi naelektrisane aminokiseline za upotrebu u stvaranju i prečišćavanju heterodimernih antitela koja uključuju najmanje jedan scFv. Prikladni naelektrisani scFv veznici prikazani su na Slici 5, iako se mogu koristiti i drugi. Generalno, naelektrisani scFv veznici za upotrebu u predmetnom pronalasku imaju promenu naelektrisanja od 3 do 8 (3, 4, 5, 6, 7 ili 8 su mogući) u poređenju sa standardnim nenaelektrisanim scFv veznicima kao što su (GGGGS)3-5sekvence koje se tradicionalno koriste (bilo negativne ili pozitivne). Kao što će razumeti stručnjaci, heterodimerna antitela koja koriste dva scFv mogu imati jedan naelektrisan i jedan neutralan veznik (npr. pozitivno ili negativno naelektrisan scFv veznik) ili dva suprotno naelektrisana scFv veznika (jedan pozitivan i jedan negativan).

Heterodimerni proteini

[0078] Predmetni pronalazak je usmeren na stvaranje multispecifičnih, posebno bispecifičnih vezujućih proteina, i naročito, multispecifičnih antitela koja imaju jedan monomer koji sadrži scFv, i drugi koji sadrži Fv. Kako je ovde razmatrano, mnoga obelodanjena otelotvorenja koriste scFv koji vezuje CD3 i Fv (ili Fab) koji vezuje CD38. Alternativno, vh i vl anti-CD38 sekvence ovde mogu da se koriste u scFv konstruktima, gde je anti-CD3 monomer Fab. Antitela

[0079] Predmetni pronalazak se odnosi na stvaranje multispecifičnih antitela, uglavnom terapeutskih antitela. Kao što je razmatrano u nastavku, uglavnom se koristi izraz „antitelo“. Antitela koja pronađu upotrebu u predmetnom pronalasku mogu poprimiti brojne oblike kako je ovde opisano, uključujući tradicionalna antitela kao i derivate antitela, fragmente i mimetike, opisane u nastavku. Generalno, izraz „antitelo“ uključuje bilo koji polipeptid koji uključuje najmanje jedan konstantan domen, uključujući, ali bez ograničavanja na, CH1, CH2, CH3 i CL. Posebno poželjna antitela ovde su antitela „trostrukog F“ oblika.

[0080] Tradicionalne strukturne jedinice antitela obično sadrže tetramer. Svaki tetramer se tipično sastoji od dva identična para polipeptidnih lanaca, gde svaki par ima jedan „laki“ (obično ima molekulsku masu od oko 25 kDa) i jedan „teški“ lanac (koji obično ima molekulsku masu od oko 50-70 kDa). Ljudski laki lanci klasifikovani su kao kapa i lambda laki lanci. Predmetni pronalazak je usmeren na IgG klasu koja ima nekoliko potklasa, uključujući, ali ne ograničavajući se na IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4. Dakle, pod „izotipom“, kako se ovde koristi, podrazumeva se bilo koja od potklasa imunoglobulina definisana hemijskim i antigenim karakteristikama svojih konstantnih regiona. Treba razumeti da terapeutska antitela takođe mogu da sadrže hibride izotipa i/ili potklasa. Na primer, kao što je prikazano u US objava 2009/0163699, predmetni pronalazak obuhvata pI konstruisanje IgG1/G2 hibrida.

[0081] Amino-terminalni deo svakog lanca uključuje varijabilni region od oko 100 do 110 ili više aminokiselina koje su primarno odgovorne za prepoznavanje antigena, koji se generalno u struci i ovde naziva „Fv domen“ ili „Fv region“. U varijabilnom regionu, tri petlje su sakupljene za svaki od V domena teškog i lakog lanca kako bi formirali antigen-vezujuće mesto. Svaka petlja naziva se regionom određivanja komplementarnosti (u nastavku „CDR“), u kome je varijanta u aminokiselinskoj sekvenci najznačajnija. „Varijabilno“ se odnosi na činjenicu da se određeni segmenti varijabilnog regiona uveliko razlikuju u sekvenci između antitela. Varijabilnost unutar varijabilnog regiona nije ravnomerno raspoređena. Umesto toga, V regioni se sastoje od relativno nevarijabilnih proteza koji se nazivaju okvirni regioni (FR) od 15-30 aminokiselina, koji su razdvojeni kraćim regionima ekstremne varijabilnosti koji se nazivaju „hipervarijabilni regioni“, koji su dugački 9-15 aminokiselina ili više.

[0082] Svaki VH i VL su sačinjeni od tri hipervarijabilna regiona („region određivanja komplementarnosti“, „CDR“) i četiri FR, raspoređena od amino-terminusa do karboksiterminusa u narednom redosledu: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3 -FR4.

[0083] Hipervarijabilni region obično obuhvata aminokiselinske ostatke od otprilike aminokiselinskih ostataka 24-34 (LCDR1; „L“ označava laki lanac), 50-56 (LCDR2) i 89-97 (LCDR3) u varijabilnom regionu lakog lanca i oko 31-35B (HCDR1; „H“ označava teški lanac), 50-65 (HCDR2) i 95-102 (HCDR3) u varijabilnom regionu teškog lanca;Kabat i dr., SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991) i/ili one ostatke koji formiraju hipervarijabilnu petlju (npr. ostaci 26-32 (LCDR1), 50-52 (LCDR2) i 91-96 (LCDR3) u varijabilnom regionu lakog lanca i 26-32 (HCDR1), 53-55 (HCDR2) i 96-101 (HCDR3) u varijabilnom regionu teškog lanca; Chothia and Lesk (1987) J. Mol. Biol.196:901-917.

Specifični CDR pronalaska su opisani u nastavku.

[0084] Kroz ovu specifikaciju, Kabat sistem numeracije se generalno koristi kada se odnosi na ostatak u varijabilnom domenu (otprilike, ostaci 1-107 varijabilnog regiona lakog lanca i ostaci 1-113 varijabilnog regiona teškog lanca) (npr. Kabat i dr., supra (1991)).

1

[0085] CDR doprinose stvaranju mesta vezivanja antigena, ili tačnije mesta vezivanja epitopa na antitelima. „Epitop“ se odnosi na odrednicu koja stupa u interakciju sa specifičnim mestom vezivanja antigena u varijabilnom regionu molekula antitela poznatog kao paratop. Epitopi su grupe molekula kao što su aminokiseline ili šećerni bočni lanci i obično imaju specifične strukturne karakteristike, kao i specifične karakteristike naelektrisanja. Pojedinačni antigen može imati više od jednog epitopa.

[0086] Epitop može da sadrži aminokiselinske ostatke direktno uključene u vezivanje (koji se takođe nazivaju imunodominantna komponenta epitopa) i ostale aminokiselinske ostatke koji nisu direktno uključeni u vezivanje, kao što su aminokiselinski ostaci koji su efektivno blokirani specifičnim antigen-vezujućim peptidom; drugim rečima, aminokiselinski ostatak je unutar otisaka specifičnog antigen-vezujućeg peptida.

[0087] Epitopi mogu biti ili konformacioni ili linearni. Konformacioni epitop proizvodi se prostorno suprotstavljenim aminokiselinama iz različitih segmenata linearnog polipeptidnog lanca. Ravni epitop je proizveden susednim aminokiselinskim ostacima u polipeptidnom lancu. Konformacioni i nekonformacioni epitopi mogu se razlikovati po tome što se vezivanje za prve, ali ne i za druge, gubi u prisustvu denaturišućih rastvarača.

[0088] Epitop obično uključuje najmanje 3, i češće, najmanje 5 ili 8-10 aminokiselina u jedinstvenoj prostornoj konformaciji. Antitela koja prepoznaju isti epitop mogu se verifikovati u jednostavnom imunološkom ispitivanju koje prikazuje sposobnost jednog antitela da blokira vezivanje drugog antitela za ciljani antigen, na primer „bining“.

[0089] Karboksi-terminalni deo svakog lanca definiše konstantni region primarno odgovoran za efektorsku funkciju. Kabat i dr. su prikupili brojne primarne sekvence varijabilnih regiona teških i lakih lanaca. Na osnovu stepena očuvanja sekvenci, klasifikovali su pojedinačne primarne sekvence u CDR i okvir i napravili njihov popis (pogledati SEQUENCES OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, 5. izdanje, NIH objava, No.91-3242, E.A. Kabat i dr.).

[0090] U IgG potklasi imunoglobulina, postoji nekoliko imunoglobulinskih domena u teškom lancu. Pod „domenom imunoglobulina (Ig)“ ovde se misli na region imunoglobulina koji ima različitu tercijarnu strukturu. Interesantni za predmetni pronalazak su domeni teškog lanca,

2

uključujući, konstantne teške (CH) domene i zglobne domene. U kontekstu IgG antitela, IgG izotipovi imaju tri regiona CH. Prema tome, „CH“ domeni u kontekstu IgG su kako sledi: „CH1“ se odnosi na položaje 118-220 prema EU indeksu kao kod Kabata. „CH2“ se odnosi na položaje 237-340 prema EU indeksu kao kod Kabata, i „CH3“ odnosi se na položaje 341-447 prema EU indeksu kao kod Kabata. Kako je ovde prikazano i opisano u nastavku, pI varijante mogu biti u jednom ili više CH regionu, kao i u zglobnom regionu, koji su navedeni u nastavku.

[0091] Treba napomenuti da ovde prikazane sekvence počinju u CH1 regionu, položaj 118; varijabilni regioni nisu uključene, osim kako je napomenuto. Na primer, prva aminokiselina SEQ ID NO: 2, iako je označena kao položaj „1“ u spisku sekvenci, odgovara položaju 118 u CH1 regionu, prema EU numeraciji.

[0092] Druga vrsta Ig domena teškog lanca je zglobni region. Pod „zglobom“ ili „zglobnim regionom“ ili „zglobnim regionom antitela“ ili „zglobnim regionom imunoglobulina“ ovde se misli na fleksibilni polipeptid koji sadrži aminokiseline između prvog i drugog konstantnog domena antitela. Strukturno, IgG CH1 domen se završava na EU položaju 220, i IgG CH2 domen počinje na ostatku EU položaja 237. Dakle, za IgG je zglob antitela ovde definisan da uključuje položaje 221 (D221 u IgG1) do 236 (G236 u IgG1), gde je numeracija prema EU indeksu kao kod Kabata. U nekim otelotvorenjima, na primer, u kontekstu Fc regiona, uključen je niži zglob, gde se „niži zglob“ generalno odnosi na položaje 226 ili 230. Kako je ovde napomenuto, pI varijante se mogu praviti i u zglobnom regionu.

[0093] Laki lanac obično sadrži dva domena, varijabilni domen lakog lanca (koji sadrži CDR lakog lanca i zajedno sa varijabilnim teškim domenima koji formiraju Fv region) i konstantni region lakog lanca (često nazvan CL ili Cκ).

[0094] Drugi region od interesa za dodatne supstitucije, naveden u nastavku, je Fc region. Pod „Fc“ ili „Fc regionom“ ili „Fc domenom“, kako se ovde koristi, podrazumeva se polipeptid koji sadrži konstantni region antitela isključujući domen imunoglobulina prvog konstantnog regiona, i u nekim slučajevima i deo zgloba. Prema tome, Fc se odnosi na poslednja dva domena imunoglobulina konstantnog regiona od IgA, IgD i IgG, poslednja tri domena imunoglobulina konstantnog regiona IgE i IgM i fleksibilni zgloba N-terminalan za ove domene. Za IgA i IgM, Fc može da obuhvata J lanac. Za IgG, Fc domen sadrži domene imunoglobulina Cγ2 i Cγ3 (Cγ2 i Cγ3) i niži zglobni region između Cγ1 (Cγ1) i Cγ2 (Cγ2). Iako granice Fc regione mogu varirati, Fc regione ljudskog IgG teškog lanca obično je definisan tako da uključuje ostatke C226 ili P230 na svoj karboksilni kraj, gde je numeracija prema EU indeksu kao kod Kabata. U nekim otelotvorenjima, kao što je detaljnije opisano u nastavku, modifikacije aminokiselina su napravljene za Fc region, na primer kako bi se promenilo vezivanje za jedan ili više FcγR receptora ili za FcRn receptor.

[0095] U nekim otelotvorenjima, antitela su pune dužine. Pod „antitelom pune dužine“ ovde se misli na strukturu koja predstavlja prirodni biološki oblik antitela, uključujući varijabilne i konstantne regione, uključujući jednu ili više modifikacija kako je ovde naznačeno.

[0096] Alternativno, antitela mogu da obuhvataju različite strukture, uključujući, ali ne ograničavajući se na, fragmente antitela, monoklonska antitela, bispecifična antitela, minitela, antitela domena, sintetička antitela (koja se ovde ovde nazivaju „mimetici antitela“), himerna antitela, humanizovana antitela, fuzije antitela (koje se ponekad nazivaju i „konjugati antitela“) i fragmenti svakog od njih.

[0097] U jednom aspektu, antitelo je fragment antitela, sve dok sadrži najmanje jedan konstantni domen koji može da se konstruiše za proizvodnju heterodimera, kao što je pI konstruisanje. Drugi fragmenti antitela koji se mogu koristiti uključuju fragmente koji sadrže jedan ili više CH1, CH2, CH3, zglobnog i CL domena pronalaska kojima je konstruisan pI. Na primer, Fc fuzije su fuzije Fc regiona (CH2 i CH3, opciono sa zglobnim regionom) spojene sa drugim proteinom. Brojne Fc fuzije su poznate u struci i mogu se poboljšati dodavanjem varijanti heterodimerizacije predmetnog pronalaska. U ovom slučaju, fuzija antitela može biti napravljena tako da sadrži CH1; CH1, CH2 i CH3; CH2; CH3; CH2 i CH3; CH1 i CH3, od kojih se bilo koji ili svi mogu proizvesti sa zglobnim regionom, koristeći bilo koju kombinaciju heterodimerizacionih varijanti koje su ovde opisane.

[0098] U nekim otelotvorenjima predmetnog pronalaska, jedan monomer sadrži teški lanac, sadrži scFV povezan sa Fc domenom, i drugi monomer sadrži teški lanac koji sadrži Fab povezan sa Fc domenom, npr. „tipičan“ teški lanac i laki lanac. Pod „Fab“ ili „Fab regionom“, kako se ovde koristi, podrazumeva se polipeptid koji sadrži VH, CH1, VL i CL domene imunoglobulina. Fab može da se odnosi na ovaj region kao izolovan, ili na ovaj region u kontekstu antitela pune dužine, fragmenta antitela ili Fab fuzionisanog proteina. Pod

4

„Fv“ ili „Fv fragmentom“ ili „Fv regionom“, kako se ovde koristi, podrazumeva se polipeptid koji sadrži VL i VH domene jednog antitela.

Himerna i humanizovana antitela

[0099] U nekim otelotvorenjima, antitelo može biti mešavina različitih vrsta, npr. Himerno antitelo i/ili humanizovano antitelo. Uopšte, i „himerna antitela“ i „humanizovana antitela“ odnose se na antitela koja kombinuju regione više vrsta. Na primer, „himerna antitela“ tradicionalno sadrže varijabilne regione miša (ili pacova, u nekim slučajevima) i konstantne regione od čoveka. „Humanizovana antitela“ generalno se odnose na ne-ljudska antitela koja su izmenjeni okviri regioni varijabilnog domena sa sekvencama koje se nalaze u ljudskim antitelima. Generalno, u humanizovanom antitelu, celo antitelo, osim CDR, kodirano je polinukleotidom ljudskog porekla ili je identično takvom antitelu osim u njegovim CDR. CDR, od kojih su neki ili svi kodirani nukleinskim kiselinama poreklom iz organizma koji nije čovek, ugrađuju se u okvir beta lista u varijabilnom regionu ljudskog antitela kako bi se stvorilo antitelo, čija se specifičnost utvrđuje sa ugrađenim CDR. Stvaranje takvih antitela je opisano kod npr. WO 92/11018, Jones, 1986, Nature 321:522-525, Verhoeyen i dr., 1988, Science 239:1534-1536. Često je potrebna „povratna mutacija“ odabranih akceptorskih ostataka odgovarajućih ostataka donora kako bi se dobio afinitet koji je izgubljen u inicijalnom graftovanom konstruktu (US 5530101; US 5585089; US 5693761; US 5693762; US 6180370; US 5859205; US 5821337; US 6054297; US 6407213,). Humanizovano antitelo optimalno će takođe sadržati bar deo konstantnog regiona imunoglobulina, obično onog od ljudskog imunoglobulina, i stoga će obično sadržati ljudski Fc region.

Humanizovana antitela se takođe mogu proizvesti korišćenjem miševa sa genetski konstruisanim imunim sistemom. Roque i dr., 2004, Biotechnol. Prog.20:639-654. Različite tehnike i postupci za humanizaciju i preoblikovanje ne-ljudskih antitela su dobro poznati u struci (pogledati Tsurushita & Vasquez, 2004, Humanization of Monoclonal Antibodies, Molecular Biology of B Cells, 533-545, Elsevier Science (USA), i reference koje su tamo navedene,). Postupci humanizacije uključuju, ali nisu ograničeni na postupke opisane kod Jones i dr., 1986, Nature 321:522-525; Riechmann i dr., 1988; Nature 332:323-329;

Verhoeyen i dr., 1988, Science, 239:1534-1536; Queen i dr., 1989, Proc Natl Acad Sci, USA 86:10029-33; He i dr., 1998, J. Immunol. 160: 1029-1035; Carter i dr., 1992, Proc Natl Acad Sci USA 89:4285-9, Presta i dr., 1997, Cancer Res.57(20):4593-9; Gorman i dr., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4181-4185; O'Connor i dr., 1998, Protein Eng 11:321-8.

Humanizacija ili drugi postupci smanjenja imunogenosti varijabilnih regiona ne-ljudskih antitela mogu uključivati resurfacing postupke, kao što je opisano na primer kod Roguska i dr., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:969-973. U jednom otelotvorenju, matično antitelo je afinitetno zrelo, kao što je poznato u struci. Postupci zasnovani na strukturi mogu se koristiti za humanizaciju i sazrevanje afiniteta, na primer kako je opisano u US 2006/0008883. Postupci bazirani na na selekciji mogu se koristiti za humanizaciju i/ili sazrevanje afiniteta varijabilnih regiona antitela, uključujući, ali ne ograničavajući se na postupke opisane kod Wu i dr., 1999, J. Mol. Biol.294:151-162; Baca i dr., 1997, J. Biol. Chem. 272(16):10678-10684; Rosok i dr., 1996, J. Biol. Chem.271(37): 22611-22618; Rader i dr., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 8910-8915; Krauss i dr., 2003, Protein Engineering 16(10):753-759. Ostali postupci humanizacije mogu uključivati graftovanje samo delova CDR, uključujući, ali ne ograničavajući se na postupke opisane kod US 2001/0035606; Tan i dr., 2002, J. Immunol. 169:1119-1125; De Pascalis i dr., 2002, J.

Immunol. 169:3076-3084.

Multispecifični konstrukti antitela

[0100] Kao što će razumeti stručnjaci i kako je detaljnije razmatrano u nastavku, heterodimerni fuzioni proteini predmetnog pronalaska poprimaju više različitih konfiguracija, sa poželjnim otelotvorenjem koja je prikazano na Slici 8B kao „trostruki F“ konstrukt.

Heterodimerni regioni sa teškim lancima

[0101] Shodno tome, predmetni pronalazak pruža heterodimerne proteine zasnovane na upotrebi monomera koji sadrže varijantu konstantnih regiona teškog lanca kao prvi domen. Pod „monomerom“ ovde se misli na polovinu heterodimernog proteina. Treba napomenuti da su tradicionalna antitela zapravo tetramerna (dva teška i dva laka lanca). U kontekstu predmetnog pronalaska, jedan teški-laki lanac par (ako je primenljivo, npr. ako monomer sadrži Fab) smatra se „monomerom“. Slično tome, region teškog lanca koji sadrži scFv smatra se monomerom. U osnovi, svaki monomer sadrži dovoljno konstantnog regiona teškog lanca da omogući konstruisanje heterodimerizacije, bilo da je ceo konstantni region, npr. Ch1-zglob-CH2-CH3, Fc region (CH2-CH3) ili samo CH3 domen.

[0102] Varijante konstantnih regiona teškog lanca mogu da obuhvataju ceo ili deo konstantnog regiona teškog lanca, uključujući konstrukt pune dužine, CH1-zglob-CH2-CH3 ili njegove delove, uključujući na primer CH2-CH3 ili CH3. Pored toga, region teškog lanca svakog monomera može biti ista ili različita kičma (CH1-zglob-CH2-CH3 ili CH2-CH3). Skraćenja i dodaci N- i C-terminala su takođe uključeni u definiciju; na primer, neke pI varijante uključuju dodavanje naelektrisanih aminokiselina u C-terminus domena teškog lanca.

[0103] Prema tome, generalno, jedan monomer ovog „trostrukog F“ konstrukta je scFv region-zglob-Fc domen), i drugi je (VH-CH1-zglob-CH2-CH3 plus pridruženi laki lanac), sa heterodimerizacionim varijantama, uključujući steričke i pI varijante, Fc i FcRn varijante, i dodatne antigen-vezujuće domene (sa opcionim veznicima) koji su uključeni u ovim regionima.

[0104] Pored ovde opisanih varijanti heterodimerizacije (npr. steričke i pI varijante), regioni teškog lanca mogu takođe sadržati dodatne supstitucije aminokiselina, uključujući promene za promenu vezivanja FcγR i FcRn kao što je razmatrano u nastavku.

[0105] Pored toga, neki monomeri mogu da koriste veznike za scFv deo „otvarača za boce“. U obliku trostrukog F, koristi se jedan naelektrisani scFv veznik. Kako je ovde navedeno, u zavisnosti od inherentnog pI od scFv za ciljani antigen i inherentnog pI od Fab drugog ciljanog antigena, naelektrisani scFv veznik može biti pozitivan ili negativan. U dualnim scFv oblicima koristi se ili jedan naelektrisani scFv veznik na jednom monomeru (opet, bilo pozitivan ili negativan) ili oba (jedan pozitivan i jedan negativan). U ovom aspektu, naelektrisanje svakog od dva veznika ne mora biti isto (npr. 3 za jedan i -4 za drugi, itd.).

[0106] U jednom otelotvorenju, scFv je mesto vezivanja anti-CD3 antigena i uključuje pozitivno naelektrisan scFv veznik. Alternativno, to može biti anti-CD38 antigen-vezujuće mesto tako da je scFv od „otvarač za boce“ konstrukta.

[0107] Varijante heterodimerizacije obuhvataju više različitih tipova varijanti, uključujući, ali ne ograničavajući se na, steričke varijante (uključujući varijante naelektrisanja) i pI varijante, koje se mogu opciono i nezavisno kombinovati sa bilo kojim drugim varijantama. U ovim otelotvorenjima važno je da se „monomer A“ podudara sa „monomerom B"; to jest, ako se heterodimerni protein oslanja na steričke varijante i na pI varijante, one se moraju ispravno uskladiti sa svakim monomerom: npr. skup steričkih varijanti koje rade (1 set na monomeru A, 1 set na monomeru B) je kombinovan sa pI varijantama (1 set na monomeru A, 1 set na monomeru B), tako da su varijante na svakom monomeru konstruisane da dostignu željenu funkciju. U slučaju, na primer, kada sterične varijante takođe mogu promeniti naelektrisanje, ispravni grupe moraju biti usklađeni sa ispravnim monomerom.

[0108] Važno je napomenuti da ovde prikazane varijante heterodimerizacije (na primer, uključujući, ali ne ograničavajući se na one varijante prikazane na Slikama), mogu biti opciono i nezavisno kombinovane sa bilo kojom drugom varijantom i bilo kojim drugim monomerom. Tako, na primer, pI varijante monomera 1 sa jedne slike mogu biti dodate u druge heterodimerizacione varijante monomer 1 sa druge slike ili sa monomera 2. To jest, ono što je važno za heterodimerizaciju jeste da postoje „grupe“ varijanti, jedna grupa za jedan monomer i druga za drugi. Nije bitno da li su one kombinovane sa Slika 1 do 1 (npr. spiskovi monomera 1 mogu ići zajedno) ili prebačene (varijante monomera 1 pI sa steričkim varijantama monomera 2). Međutim, kako je ovde napomenuto, „lančanost“ treba da se sačuva kada se naprave kombinacije kao što je ranije opisano, tako da se favorizuje heterodimerizacija; na primer. Varijante naelektrisanja koje povećavaju pI treba koristiti sa povećanim pI varijantama i/ili scFv veznikom sa povećanjem pI itd. Dalje, za dodatne Fc varijante (kao što su FcγR vezivanje, FcRn vezivanje, ablacione varijante itd.), jedan ili oba monomera mogu da sadrže bilo koju od navedenih varijanti, nezavisno i opciono. U nekim slučajevima, oba monomera imaju dodatne varijante, a u nekim samo jedan monomer ima dodatne varijante, ili se mogu kombinovati.

Varijante heterodimerizacije

[0109] Predmetni pronalazak pruža multispecifične oblike antitela, na skeli „trostrukog F“ ili „otvarača za boce“, kako je prikazano na Slici 8B, na primer.

Sterične varijante

[0110] U nekim otelotvorenjima formiranje heterodimera može se olakšati dodatkom steričnih varijanti. Odnosno, promenom aminokiselina u svakom teškom lancu, veća je verovatnoća da se različiti teški lanci udružuju u heterodimernu strukturu, nego da formiraju homodimere sa istim Fc aminokiselinskim nizovima. Pogodne steričke varijante prikazane su na Slikama.

[0111] Jedan mehanizam se u nauci generalno naziva „knobs-and-holes“, i odnosi se na konstruisanje aminokiselina koje stvaraju sterične uticaje kako bi se favorizovalo formiranje heterodimera, i obeshrabrivanje formiranje homodimera takođe opciono može korišćeno; ovo se ponekad naziva „knobs-and-holes“, Ridgway i dr., Protein Engineering 9(7):617 (1996); Atwell i dr., J. Mol. Biol.1997 270:26; US Patent No.8,216,805. Slike 4 i 5, dalje opisane u nastavku, identifikuje brojne parove „monomera A - monomera B“ koji se oslanjaju na „knobs-and-holes“. Pored toga, kako je opisano u Merchant i dr., Nature Biotech.16:677 (1998), ove „knobs-and-holes“ mutacije mogu se kombinovati sa disulfidnim vezama kako bi se formiranje zakrivilo do heterodimerizacije.

[0112] Dodatni mehanizam koji pronalazi upotrebu u stvaranju heterodimera ponekad se naziva i „elektrostatičkim upravljanjem“ kako je opisano kod Gunasekaran i dr., J. Biol. Chem. 285(25):19637 (2010). Ovo se ponekad ovde naziva „parovi naelektrisanja“. U ovom otelotvorenju, elektrostatika se koristi kako bi se formiranje zakrivilo u smeru heterodimerizacije. Kao što će razumeti stručnjaci, ovo takođe može imati uticaja na pI, i samim tim i na prečišćavanje, pa bi se u nekim slučajevima mogle razmatrati i pI varijante. Međutim, kako su generisane da bi primorale heterodimerizaciju i nisu korišćene kao agensi za prečišćavanje, klasifikovane su kao „steričke varijante“. Oni uključuju, ali nisu ograničene na, varijante koje rezultuju heterodimerizacijom većom od 75% na Slikama kao što su D221E/P228E/L368E upareni sa D221R/P228R/K409R (npr. ovo su „grupe koje odgovaraju monomeru“ i C220E/P228E/368E upareni sa C220R/E224R/P228R/K409R.

[0113] Dodatne varijante monomera A i monomera B koje se mogu kombinovati sa drugim varijantama, opciono i nezavisno u bilo kojoj količini, kao što su ovde opisane pI varijante ili druge steričke varijante koje su prikazane na Slici 37 od US 2012/0149876.

[0114] U nekim otelotvorenjima, steričke varijante prikazane ovde mogu biti opciono i nezavisno inkorporirane sa bilo kojom varijantom heterodimerizacije, uključujući pI varijante (ili druge varijante poput Fc varijante, FcRn varijante, ablacione varijante itd.) i jednom ili oba monomera.

pI (izoelektrična tačka) varijante za heterodimere

[0115] Uopšte, kao što će razumeti stručnjaci, postoje dve opšte kategorije pI varijanti: one koje povećavaju pI proteina (bazne promene) i one koje smanjuju pI proteina (kisele promene). Kako je ovde opisano, sve kombinacije ovih varijanti mogu se uraditi: jedan monomer može biti divljeg tipa ili varijanta koja ne prikazuje značajno drugačiji pI od divljeg tipa, i drugi može biti više bazni ili više kiseo. Alternativno, svaki monomer se menja, jedan u više bazni i jedan u više kiseo.

[0116] Poželjne kombinacije pI varijanti su prikazane na Slikama.

Kisele promene pI teškog lanca

[0117] Prema tome, kada jedan monomer koji sadrži varijantu domena teškog lanca treba učiniti pozitivnijim (npr. niži pI), može se izvršiti jedna ili više sledećih supstitucija: S119E, K133E, K133Q, T164E, K205E, K205Q, N208D, K210E, K210Q, K274E, K320E, K322E, K326E, K334E, R355E, K392E, brisanje K447, dodavanjem DEDE peptida na c-terminusu, G137E, N203D, K274Q, R355Q, K392N i Q419E. Kako je ovde navedeno i prikazano na slikama, ove promene su prikazane u odnosu na IgG1, ali svi izotipovi se mogu izmeniti na ovaj način, kao i hibridi izotipa.

[0118] U slučaju kada je konstantan domen teškog lanca od IgG2-4, mogu se koristiti i R133E i R133Q.

Bazne promene pI

[0119] U skladu sa tim, kada jedan monomer koji sadrži varijantu domena teškog lanca treba učiniti negativnijim (npr. povećati pI), može se izvršiti jedna ili više sledećih zamena:

Q196K, P217R, P228R, N276K i H435R. Kako je ovde dato i prikazano na Slikama, ove promene su prikazane u odnosu na IgG1, ali svi izotipovi se mogu izmeniti na ovaj način, kao i hibridi izotipa.

Varijante heterodimera antitela lakog lanca

[0120] U slučaju heterodimera na bazi antitela, npr. gde bar jedan od monomera sadrži laki lanac pored domena teškog lanca, pI varijante se takođe mogu napraviti u lakom lancu.

Supstitucije aminokiselina za spuštanje pI lakog lanca uključuju, ali nisu ograničene na, K126E, K126Q, K145E, K145Q, N152D, S156E, K169E, S202E, K207E i dodavanje peptida DEDE na c-terminusu lakog lanca. Promene u ovoj kategoriji zasnovane na konstantnom lambda lakom lancu uključuju jednu ili više supstitucija na R108Q, Q124E, K126Q, N138D, K145T i Q199E. Pored toga, takođe se može povećati pI lakih lanaca.

Izotipske varijante

[0121] Pored toga, mnoga otelotvorenja predmetnog pronalaska oslanjaju se na „uvoz“ pI aminokiselina na određenim položajima iz jednog IgG izotipa u drugi, smanjujući ili eliminišući mogućnost uvođenja neželjene imunogenosti u varijante. Odnosno, IgG1 je uobičajeni izotip za terapeutska antitela iz različitih razloga, uključujući visoku efektorsku funkciju. Međutim, konstantni teški region IgG1 ima veći pI od IgG2 (8,10 naspram 7,31). Uvođenjem ostataka IgG2 na određenim položajima u kičmu IgG1, pI dobijenog monomera se smanjuje (ili povećava) i dodatno prikazuje duži poluživot u serumu. Na primer, IgG1 ima glicin (pI 5,97) na položaju 137, i IgG2 ima glutaminsku kiselinu (pI 3,22); uvoz glutaminske kiseline će uticati na pI rezultujućeg proteina. Kao što je opisano u nastavku, generalno je potrebno da brojne supstitucije aminokiselina značajno utiču na pI varijante antitela.

Međutim, treba napomenuti kao što je razmatrano u nastavku da čak i promene u molekulima

4

IgG2 omogućavaju produžen poluživot u serumu.

[0122] U drugim otelotvorenjima, izvršavaju se neizotipske promene aminokiselina, bilo da se smanji celokupno stanje naelektrisanja rezultujućih proteina (npr. promenom više pI aminokiseline u nižu pI aminokiselinu), ili da se omogući smeštaj u strukturi za stabilnost, itd. kao što je detaljnije opisano u nastavku.

[0123] Pored toga, pI konstruisanjem i teških i lakih konstantnih domena mogu se pogledati značajne promene u svakom monomeru heterodimera. Kako je ovde razmatrano, kada se pI dva monomera razlikuju za najmanje 0,5, može se omogućiti razdvajanje hromatografijom jona ili izoelektričnim fokusiranjem ili drugim postupcima osetljivim na izoelektričnu tačku.

Izosteričke varijante

[0124] Pored toga, kao što je prikazano na Slici 47, mogu se napraviti pI varijante koje su izosteričke, npr. varijante naelektrisanja otprilike iste veličine kao matične aminokiseline. Izračunavanje pI

[0125] pI svakog monomera može zavisiti od pI od varijante konstantnog domena teškog lanca i pI ukupnog monomera, uključujući varijantu konstantnog domena teškog lanca i fuzioni partner. Stoga se u nekim otelotvorenjima promena pI izračunava na osnovu varijante konstantnog domena teškog lanca, koristeći grafik na Slikama. Alternativno, pI svakog monomera se može uporediti. Slično tome, izračunavaju se pI „početnih“ varijabilnih regiona (npr. ScFv ili Fab) kako bi se saznalo koji će monomer biti konstruisan u kom pravcu.

pI varijante koje takođe omogućavaju bolje FcRn in vivo vezivanje

[0126] U slučaju kada pI varijanta smanjuje pI monomera, oni mogu imati dodatnu korist za poboljšanje zadržavanja u serumu in vivo.

[0127] Iako se to još uvek ispituje, veruje se da Fc regioni imaju duži poluživot in vivo, jer vezivanje za FcRn pri pH 6 u endozomu sekvestira Fc (Ghetie and Ward, 1997 Immunol Today. 18(12): 592-598). Endozomski odeljak zatim reciklira Fc do ćelijske površine.

Jednom kada se odeljak otvori u ekstracelularni prostor, viši pH, ~47,4, indukuje oslobađanje Fc natrag u krv. Kod miševa, Dall' Acqua i dr., pokazali su da Fc mutanti sa povećanim vezivanjem FcRn pri pH 6 i pH 7,4 zapravo imaju smanjene koncentracije u serumu i isti poluživot kao divlji tip Fc (Dall' Acqua i dr.2002, J. Immunol.169:5171-5180). Smatra se da povećani afinitet Fc za FcRn pri pH 7,4 sprečava puštanje Fc natrag u krv. Stoga, Fc mutacije koje će povećati Fc poluživot in vivo, idealno će povećati vezivanje FcRn pri nižem pH, dok istovremeno omogućavaju oslobađanje Fc pri višem pH. Aminokiselina histidin menja stanje naelektrisanja u opsegu pH od 6,0 do 7,4. Stoga nije iznenađujuće da se njegovi ostaci nađu na važnim položajima u kompleksu Fc/FcRn.

[0128] Nedavno je sugerisano da antitela sa varijabilnim regionima koji imau niže izelektrične tačkama mogu takođe da imaju duži poluživot u serumu (Igawa i dr., 2010 PEDS. 23(5): 385-392). Međutim, mehanizam za to je još uvek nije u potpunosti shvaćen. Štaviše, varijabilni regioni se razlikuju od antitela do antitela. Varijante konstantnih regiona sa smanjenim pI i produženim poluživotom pružiće modularniji pristup poboljšanju farmakokinetičkih svojstava antitela, kako je ovde opisano.

[0129] pI varijante koje se koriste u ovom otelotvorenju, kao i njihova upotreba za optimizaciju prečišćavanja, opisane su na Slikama.

Kombinacija varijanti

[0130] Kao što će razumeti stručnjaci, sve navedene verzije heterodimerizacije mogu se opciono i nezavisno kombinovati na bilo koji način, sve dok zadrže svoju „lančanost“ ili „monomernu particiju“. Pored toga, sve ove varijante mogu se kombinovati u bilo koji oblik heterodimerizacije.

[0131] U slučaju pI varijanti, dok su otelotvorenja koja pronalaze određenu upotrebu prikazana na Slikama, mogu se dobiti i druge kombinacije, prateći osnovno pravilo promene pI razlike između dva monomera kako bi se olakšalo prečišćavanje.

[0132] Antitela predmetnog pronalaska su generalno izolovana ili rekombinantna.

„Izolovano“, kada se koristi da bi se opisali ovde obelodanjeni različiti polipeptidi, znači polipeptid koji je identifikovan i odvojen i/ili izvučen iz ćelije ili ćelijske kulture iz koje je eksprimiran. Obično se izolovani polipeptid dobije u najmanje jednom koraku prečišćavanja. „Izolovano antitelo“ odnosi se na antitelo koje je u suštini bez drugih antitela koja imaju različite antigenske specifičnosti.

[0133] „Specifično vezivanje“ ili „specifično se vezuje za“ ili je „specifičan za“ određeni antigen ili epitop znači vezivanje koje se merljivo razlikuje od nespecifične interakcije.

Specifično vezivanje može se meriti, na primer, određivanjem vezivanja molekula u poređenju sa vezivanjem kontrolnog molekula, koji je generalno molekul slične strukture koji nema vezujuću aktivnost. Na primer, specifično vezivanje može se odrediti nadmetanjem sa kontrolnim molekulom koji je sličan cilju.

[0134] Specifično vezivanje za određeni antigen ili epitop može biti izloženo, na primer, od strane antitela koje ima KD za antigen ili epitop od najmanje oko 10-4 M, najmanje oko 10-5 M, najmanje oko 10-6 M, najmanje oko 10-7 M, najmanje oko 10-8 M, najmanje oko 10-9 M, alternativno najmanje oko 10-10 M, najmanje oko 10-11 M, najmanje oko 10-12 M ili više, gde se KD odnosi na brzinu disocijacije određenog antitelo-antigen delovanja. Tipično, antitelo koje specifično vezuje antigen će imati KD koji je 20-, 50-, 100-, 500-, 1000-, 5000-, 10,000- ili više puta veći za kontrolni molekul u odnosu na antigen ili epitop.

[0135] Takođe, specifično vezivanje za određeni antigen ili epitop može biti izloženo, na primer, antitelu koje ima KA ili Ka za antigen ili epitop od najmanje 20-, 50-, 100-, 500-, 1000-, 5.000 -, 10.000- ili više puta veći za epitop u odnosu na kontrolu, gde se KA ili Ka odnosi na brzinu asocijacije za određenu antitelo-antigen interakciju.

Modifikovana antitela

[0136] Pored gore navedenih modifikacija, mogu se izvršiti i druge modifikacije. Na primer, molekuli se mogu stabilizovati ugradnjom disulfidnih mostova koji povezuju VH i VL domene (Reiter i dr., 1996, Nature Biotech. 14:1239-1245). Pored toga, postoje razne kovalentne modifikacije antitela koje se mogu načiniti na način opisan dole.

[0137] Kovalentne modifikacije antitela su uključene u obim predmetnog pronalaska i po pravilu se, ali ne uvek, izvode posle translacije. Na primer, nekoliko vrsta kovalentnih modifikacija antitela se uvodi u molekul reakcijom specifičnih aminokiselinskih ostataka antitela sa organskim derivatima koji mogu da reaguju sa odabranim bočnim lancima ili N- ili C-terminalnim ostacima.

[0138] Cisteinil ostaci najčešće reaguju sa α-haloacetatama (i odgovarajućim aminima), kao što su hlorosirćetna kiselina ili hloroacetamid, dajući karboksimetil ili karboksiamidometil derivate. Cisteinil ostaci se takođe mogu derivatizovati reakcijom sa bromotrifluoroacetonom, α-bromo-β-(5-imidozoil)propionskom kiselinom, hloroacetil fosfatom, N-alkilmaleimidima, 3-nitro-2-piridil disulfidom, metil 2-piridil disulfidom, phloromerkuribenzoatom 2-hloromerkuri-4-nitrofenolom ili hloro-7-nitrobenzo-2-oksa-1,3-diazolom i slično.

4

[0139] Pored toga, modifikacije cisteina su posebno korisne u primenama antitelo-lek konjugata (ADC), koje su dalje opisane u nastavku. U nekim otelotvorenjima, konstantni region antitela može se konstruisati tako da sadrži jedan ili više cisteina koji su posebno „tiol reaktivni“, tako da se omogućava preciznije i kontrolisano postavljanje dela leka. Pogledati na primer US Patent No.7,521,541.

[0140] Histidil ostaci su derivatizovani reakcijom sa dietilpirokarbonatom pri pH 5,5-7,0, jer je ovo sredstvo relativno specifično za bočni lanac histidila. Para-bromofenacil bromid je takođe koristan; reakcija se poželjno izvodi u 0,1M natrijum-kakodilata pri pH 6,0.

[0141] Lizinil i amino terminalni ostaci reaguju sa anhidridima sukcinske ili druge karboksilne kiseline. Derivatizacija ovim agensima ima efekat preokretanja naelektrisanja lizinil ostataka. Drugi pogodni reagensi za derivatizaciju ostataka koji sadrže alfa-amino uključuju imidoestre kao što je metil pikolinimidat; piridoksal fosfat; piridoksal; hloroborohidrid; trinitrobenzensulfonska kiselina; O-metilizourea; 2,4-pentanedion; i reakcija-katalizovana transaminazom sa glioksilatom.

[0142] Arginil ostaci su modifikovani reakcijom sa jednim ili više uobičajenih reagensa, među kojima su fenilglioksal, 2,3-butanedion, 1,2-cikloheksandion i ninhidrin. Derivatizacija ostataka arginina zahteva da se reakcija izvodi u alkalnim uslovima zbog visokog pKa guanidinske funkcionalne grupe. Dalje, ovi reagensi mogu reagovati sa grupama lizina kao i arginin epsilon-amino grupom.

[0143] Specifične modifikacije tirozil ostataka mogu biti napravljene, od posebnog interesa za uvođenje spektralnih oznaka u tirozilne ostatke reakcijom sa aromatičnim diazonijumjedinjenjima ili tetranitrometanom. Najčešće se N-acetilimidizol i tetranitrometan koriste za formiranje O-acetil tirozil vrsta i 3-nitro derivata. Tirozil ostaci su jodovani koristeći 125I ili 131I kako bi se pripremil označeni proteini za upotrebu u radioimuno ispitivanju, gde je odgovarajući gore opisan hloramin T postupak.

[0144] Karboksilne bočne grupe (aspartil ili glutamil) selektivno su modifikovane reakcijom sa karbodiimidima (R'-N=C=N--R'), gde su R i R' opciono različite alkilne grupe, kao što je 1-cikloheksil-3-(2-morfolinil-4-etil)karbodiimid ili 1-etil-3-(4-azonija-4,4-dimetilpentil) karbodiimid. Pored toga, aspartil i glutamil ostaci pretvaraju se u asparaginil i glutaminil ostatke reakcijom sa amonijum-jonima.

[0145] Derivatizacija bifunkcionalnim agensima je korisna za unakrsno povezivanje antitela za matricu ili površinu nerastvorljivu u vodi za upotrebu u raznim postupcima, pored postupaka opisanih u nastavku. Najčešće korišćeni agensi za unakrsno povezivanje uključuju, na primer, 1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletan, glutaraldehid, N-hidroksisukcinimidne estre, na primer, estre sa 4-azidosalicilnom kiselinom, homobifunkcionalne imidoestre, uključujući disukcinimidil estre kao što je 3,3'-dithobis (sukcinimidilpropionat), i bifunkcionalni maleimidi, poput bis-N-maleimido-1,8-oktana. Derivatizacioni agensi kao što su metil-3-[(pazidofenit)ditio]propioimidat daju fotoaktivativne međuproizvode koji mogu da formiraju unakrsne veze u prisustvu svetlosti. Alternativno, reaktivne matrice nerastvorljive u vodi, kao što su ugljeni hidrati aktivirani cinomolgusogen bromidom i reaktivni supstrati opisani u U.S. Pat. Nos.3,969,287; 3,691,016; 4,195,128; 4,247,642; 4,229,537; i 4,330,440 se koriste za imobilizaciju proteina.

[0146] Glutaminil i asparaginil ostaci često su deamidirani u odgovarajuće ostatke glutamila i aspartila. Alternativno, ovi ostaci se deamiduju pod blago kiselim uslovima. Bilo koji oblik ovih ostataka spada u obim predmetnog pronalaska.

[0147] Ostale modifikacije uključuju hidroksilaciju prolina i lizina, fosforilaciju hidroksilnih grupa ostataka serila ili treonila, metilaciju α-amino grupa lizina, arginina i histidinskih bočnih lanaca ((T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H.

Freeman & Co., San Francisco, pp.79-86 [1983]), acetilaciju N-terminalnog amina i amidaciju bilo koje C-terminalne karboksilne grupe.

[0148] Pored toga, kao što će razumeti stručnjaci, oznake (uključujući fluorescentne, enzimske, magnetne, radioaktivne itd.) mogu se dodati u antitela (kao i druge sastave opisane i ovde zahtevane u patentnim zahtevima).

Glikozilacija

[0149] Druga vrsta kovalentne modifikacije su promene u glikozilaciji. U drugom otelotvorenju, ovde obelodanjena antitela mogu biti modifikovana tako da obuhvataju jedan ili više konstruisanih glikoforma. Pod „konstruisanim glikoformom“, kako se ovde koristi, podrazumeva se sastav ugljenih hidrata koji je kovalentno vezan za antitelo, gde se navedeni

4

ugljeni hidrat hemijski razlikuje od matičnog antitela. Konstruisani glikoformi mogu biti korisni u različite svrhe, uključujući, ali ne ograničavajući se na poboljšanje ili smanjenje efektorske funkcije. Poželjni oblik konstruisanog glikoforma je afukozilacija, za koju se pokazalo da je povezana sa povećanjem ADCC funkcije, verovatno kroz pooštravanje vezivanja za FcγRIIIa receptor. U ovom kontekstu, „afukozilacija“ znači da je većina antitela proizvedenih u ćelijama domaćina uglavnom lišena fukoze, npr.90-95-98% generisanih antitela nema značajnu fukozu kao komponentu dela ugljenih hidrata antitela (obično vezanu na N297 u regionu Fc). Definisano funkcionalno, afukozilirana antitela generalno pokazuju najmanje 50% ili veći afinitet prema FcγRIIIa receptoru.

[0150] Umaña i dr., 1999, Nat Biotechnol 17:176-180; Davies i dr., 2001, Biotechnol Bioeng 74:288-294; Shields i dr., 2002, J Biol Chem 277:26733-26740; Shinkawa i dr., 2003, J Biol Chem 278:3466-3473; US 6,602,684; US 2007/0275460; US 2003/0003097; PCT WO 00/61739A1; PCT WO 01/29246A1; PCT WO 02/31140A1; PCT WO 02/30954A1;

(Potelligent® tehnologija [Biowa, Inc., Princeton, NJ]; tehnologija konstruisanja glikozilacije GlycoMAb® [Glycart Biotechnology AG, Zürich, Switzerland]). Mnoge od ovih tehnika se zasnivaju na kontroli nivoa fukoziliranih i/ili bisecirajućih oligosaharida koji su kovalentno vezani za Fc region, na primer eksprimrianjem IgG u različitim organizmima ili ćelijskim linijama, konstruisanim tako ili na neki drugi način (na primer Lec-13 CHO ćelije ili YB2/0 ćelije hibridoma pacova, regulisanjem enzima koji su uključeni u put glikozilacije (na primer FUT8 [α1,6-fukoziltranseraza] i/ili β1-4-N-acetilglukozaminiltransferaza III [GnTIII]) ili modifikovanjem ugljenih hidrata nakon eksprimiranja IgG. Na primer, „antitelo konstruisano od šećera“ ili „SEA tehnologija“ kompanije Seattle Genetics funkcioniše dodavanjem modifikovanih saharida koji inhibiraju fukozilaciju tokom proizvodnje; pogledati na primer US2009317869. Konstruisani glikoform obično se odnosi na različite ugljene hidrate ili oligosaharide; prema tome, antitelo može uključivati konstruisani glikoform.

[0151] Alternativno, konstruisani glikoform može da se odnosi na varijantu IgG koja sadrži različite ugljene hidrate ili oligosaharide. Kao što je poznato u struci, obrasci glikozilacije mogu zavisiti i od redosleda proteina (npr., prisustva ili odsustva određenih aminokiselinskih ostataka glikozilacije, koji su navedeni u nastavku), ili ćelije ili organizma domaćina u kom se protein proizvodi. U nastavku su razmotreni određeni sistemi eksprimiranja.

[0152] Glikozilacija polipeptida je obično N-vezana ili O-vezana. N-vezana se odnosi na

4

vezivanje ugljenog hidrata na bočni lanac ostatka asparagina. Tri-peptidne sekvence asparagin-X-serin i asparagin-X-treonin, gde je X bilo koja aminokiselina osim prolina, su sekvence prepoznavanja za enzimsko vezivanje ugljenog hidrata u bočni lanac asparagina. Prema tome, prisustvo bilo koje od ovih tri-peptidnih sekvenci u polipeptidu stvara potencijalno mesto glikozilacije. O-vezana glikozilacija odnosi se na vezivanje jednog od šećera N-acetilgalaktosamina, galaktoze ili ksiloze na hidroksiaminokiselinu, najčešće serin ili treonin, mada se takođe mogu koristiti i 5-hidroksiprolin ili 5-hidroksilizin.

[0153] Dodavanje mesta glikozilacije antitelu pogodno se vrši menjanjem sekvence aminokiselina tako da sadrži jednu ili više gore opisanih tri-peptidnih sekvenci (za N-vezana mesta glikozilacije). Izmena se takođe može izvršiti dodavanjem ili supstitucijom jednog ili više ostataka serina ili treonina za početnu sekvencu (za O-vezana mesta glikozilacije). Radi jednostavnosti, aminokiselinska sekvenca antitela je po mogućnosti izmenjena promenama na nivou DNK, naročito mutiranjem DNK koja kodira ciljani polipeptid u prethodno odabranim bazama, tako da se stvaraju kodoni koji će se prevesti u željene aminokiseline.

[0154] Drugo sredstvo za povećanje broja delova ugljenih hidrata na antitelu je hemijskim ili enzimskim spajanjem glikozida sa proteinom. Ovi postupci su pogodni po tome što ne zahtevaju proizvodnju proteina u ćeliji domaćinu koja ima sposobnost glikozilacije za N- i O-vezanu glikozilaciju. U zavisnosti od korišćenog načina povezivanja, šećeri se mogu vezati za (a) arginin i histidin, (b) slobodne karboksilne grupe, (c) slobodne sulfhidrilne grupe kao što su one od cisteina, (d) slobodne hidroksilne grupe kao što su one od serina, treonina ili hidroksiprolina, (e) aromatski ostaci kao što su fenilalanin, tirozin ili triptofan, ili (f) amidna grupa glutamina. Ovi postupci su opisani u WO 87/05330 i kod Aplin and Wriston, 1981, CRC Crit. Rev. Biochem., pp.259-306.

[0155] Uklanjanje ostataka ugljenih hidrata prisutnih na početnom antitelu (npr. posle translacije) može se izvršiti hemijski ili enzimski. Hemijska deglikosilacija zahteva izlaganje proteina jedinjenju trifluorometansulfonske kiselina ili ekvivalentnom jedinjenju. Ovim tretmanom dolazi do razdvajanja većine ili svih šećera, osim vezničkog šećera (N-acetilglukozamin ili N-acetilgalaktosamin), i polipeptid ostaje netaknut. Hemijska deglikozilacija je opisana od strane Hakimuddin i dr., 1987, Arch. Biochem. Biophys. 259:52 and by Edge i dr., 1981, Anal. Biochem.118:131. Enzimsko razdvajanje ostataka ugljenih hidrata na polipeptidima može se postići korišćenjem različitih endo- i egzo-glikozidaza kako

4

je opisano kod Thotakura i dr., 1987, Meth. Enzymol.138:350. Glikozilacija na potencijalnim mestima glikozilacije može se sprečiti upotrebom jedinjenja tunicamicina kako je opisano kod Duskin i dr., 1982, J. Biol. Chem.257:3105. Tunicamicin blokira stvaranje proteina-N-glikozidnih veza.

[0156] Druga vrsta kovalentne modifikacije antitela uključuje povezivanje antitela sa različitim neproteinskim polimerima, uključujući, ali ne ograničavajući se na, različite poliole, kao što su polietilen glikol, polipropilen glikol ili polioksialkileni, na način koji je naveden u, na primer, 2005-2006 PEG Catalog od kompanije Nektar Therapeutics (dostupan na Nektar veb sajtu) US Patents 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192 ili 4,179,337. Pored toga, kao što je poznato u struci, supstitucije aminokiselina mogu se izvršiti na različitim položajima unutar antitela kako bi se olakšalo dodavanje polimera kao što je PEG. Pogledati na primer, US objava br.2005/0114037A1.

Dodatne Fc varijante za dodatnu funkcionalnost

[0157] Pored pI varijanti aminokiselina, postoji niz korisnih modifikacija Fc aminokiselina koje se mogu izvesti iz različitih razloga, uključujući, ali ne ograničavajući se na, promenu vezivanja za jedan ili više FcγR receptora, promenu vezivanja za FcRn receptore, itd.

[0158] Prema tome, proteini predmetnog pronalaska mogu da sadrže modifikacije aminokiselina, uključujući ovde prikazane varijante heterodimerizacije, koja uključuje pI varijante

FcγR Varijante

[0159] Shodno tome, postoji veliki broj korisnih Fc supstitucija koje se mogu napraviti za promenu vezivanja za jedan ili više FcγR receptora. Supstitucije koje rezultuju povećanim vezivanjem kao i smanjenim vezivanjem mogu biti korisne. Na primer, poznato je da povećano vezivanje za Fc RIIIa uglavnom dovodi do povećane ADCC (ćelijski posredovana citotoksičnost zavisna od antitela; ćelijski posredovana reakcija gde nespecifične citotoksične ćelije koje eksprimiraju FcγR prepoznaju vezano antitelo na ciljanoj ćeliji i posle toga izazivaju lizu ciljane ćelije). Slično tome, smanjeno vezivanje za FcγRIIb (inhibitorni receptor) može biti korisno i u nekim okolnostima. Supstitucije aminokiseline koje pronalaze upotrebu u predmetnom pronalasku uključuju one navedene u US 2006/0024298 (posebno Slika 41), US 2006/0121032, US 2006/0235208, US 2007/0148170. Konkretne varijante koje pronalaze upotrebu uključuju, ali nisu ograničene na, 236A, 239D, 239E, 332E, 332D, 239D/332E, 267D, 267E, 328F, 267E/328F, 236A/332E, 239D/332E/330Y, 239D,

4

332E/330L i 299T.

[0160] Pored toga, postoje dodatne Fc supstitucije koje pronalaze primenu u povećanom vezivanju na FcRn receptor i povećanom poluživotu u serumu, kao što je posebno obelodanjeno u US 2009/0163699 uključujući, ali ne ograničavajući se na, 434S, 428L, 308F, 259I, 428L/434S, 259I/308F, 436I/428L, 436I or V/434S, 436V/428L i 259I/308F/428L. Fc ablacione varijante

[0161] Dodatne varijante koje pronalaze upotrebu u prikazanom pronalasku su one koje vrše ablaciju (npr. smanjuju ili eliminišu) vezivanje za Fcγ receptore. Ovo može biti poželjno kako bi se smanjio potencijalni mehanizam delovanja (npr. smanjila ADCC aktivnost) heterodimernih antitela predmetnog pronalaska. Na Slici 35 je prikazan veliki broj odgovarajućih varijanti Fc ablacije, i mogu se opciono i nezavisno uključiti ili isključiti u kombinaciji sa bilo kojim drugim heterodimerizacionim varijantama, uključujući pI i steričke varijante.

[0162] Od posebne koristi u nekim otelotvorenjima su prvi monomer („negativna strana“) koji sadrži pI varijante N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D, zakrivljene varijante 368D/370S, i ablacione varijante E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, uparen sa pozitivnom stranom koja ne sadrži pI varijante, sadrži zakrivljene varijante S364K/E357Q i i ablacione varijante E233P/L234V/L235A/G236del/S267K (opciono oba monomera sadrže FcRn varijante 428L/434S), gde je pozitivna strana scFv monomer i sadrži naelektrisan scFv veznik (pogotovo kada je scFv anti-CD3). Drugo otelotvorenje koristi prvi monomer negativne strane koji sadrži I199T/N203D/K274Q/R355Q/Q419E/K447del, zakrivljene varijante S364K/E357Q i ablacione varijante E233P/L234V/L235A/G236del/S267K (opciono oba monomera sadrže FcRn varijante 428L/434S), uparen sa pozitivnom stranom koja sadrži pI varijante Q196K/I199T/P271R/P228R/N276K, zakrivljene varijante S364K/E357Q i ablacione varijante E233P/L234V/L235A/G236del/S267K (opciono oba monomera sadrže FcRn varijante 428L/434S), gde je pozitivna strana scFv monomer i sadrži naelektrisan scFv veznik (pogotovo kada je scFv anti-CD3). Treće otelotvorenje koristi prvi monomer negativne strane koji sadrži I199T/N203D/K274Q/R355Q/N384S/K392N/V397M/Q419E/K447del, zakrivljene varijante S364K/E357Q i i ablacione varijante E233P/L234V/L235A/G236del/S267K (opciono oba monomera sadrže FcRn varijante 428L/434S), uparen sa pozitivnom stranom monomer koji ne sadrži pI varijante, sadrži zakrivljene varijante S364K/E357Q i ablacione varijante

4

E233P/L234V/L235A/G236del/S267K (opciono oba monomera sadrže FcRn varijante 428L/434S), gde je pozitivna strana scFv monomer i sadrži naelektrisan scFv veznik (pogotovo kada je scFv anti-CD3). Četvrto otelotvorenje koristi prvi monomer („negativna strana“) koji sadrži pI varijante N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D, zakrivljene varijante 368D/370S, i ablacione varijante E233P/L234V/L235A/G236del/S239K, uparen sa pozitivnom stranom koja ne sadrži pI varijante, sadrži zakrivljene varijante S364K/E357Q i i ablacione varijante E233P/L234V/L235A/G236del/S239K (opciono oba monomera sadrže FcRn varijante 428L/434S). Peto otelotvorenje koristi prvi monomer negativne strane koji sadrži I199T/N203D/K274Q/R355Q/Q419E/K447del, zakrivljene varijante S364K/E357Q i i ablacione varijante E233P/L234V/L235A/G236del/S239K (opciono oba monomera sadrže FcRn varijante 428L/434S), uparen sa pozitivnom stranom koja sadrži pI varijante Q196K/I199T/P271R/P228R/N276K, zakrivljene varijante S364K/E357Q i ablacione varijante E233P/L234V/L235A/G236del/S239K (opciono oba monomera sadrže FcRn varijante 428L/434S). Šesto otelotvorenje koristi prvi monomer negativne strane koji sadrži I199T/N203D/K274Q/R355Q/N384S/K392N/V397M/Q419E/K447del, zakrivljene varijante S364K/E357Q i i ablacione varijante E233P/L234V/L235A/G236del/S267K (opciono oba monomera sadrže FcRn varijante 428L/434S), uparen sa pozitivnom stranom monomer zakrivljene varijante S364K/E357Q i ablacione varijante E233P/L234V/L235A/G236del/S239K (opciono oba monomera sadrže FcRn varijante 428L/434S), gde je pozitivna strana scFv monomer i sadrži naelektrisan scFv veznik (pogotovo kada je scFv anti-CD3). Sedmo otelotvorenje koristi prvi monomer („negativna strana“) koji sadrži pI varijante N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D, zakrivljene varijante 368D/370S, i ablacione varijante S239K/S267K, uparen sa pozitivnom stranom koja ne sadrži pI varijante, sadrži zakrivljene varijante S364K/E357Q i i ablacione varijante S239K/S267K (opciono oba monomera sadrže FcRn varijante 428L/434S), gde je pozitivna strana scFv monomer i sadrži naelektrisan scFv veznik (pogotovo kada je scFv anti-CD3). Osmo otelotvorenje koristi prvi monomer negativne strane koji sadrži I199T/N203D/K274Q/R355Q/Q419E/K447del, zakrivljene varijante S364K/E357Q i i ablacione varijante S239K/S267K, (opciono oba monomera sadrže FcRn varijante 428L/434S), uparen sa pozitivnom stranom koja sadrži pI varijante Q196K/I199T/P271R/P228R/N276K, zakrivljene varijante S364K/E357Q i ablacione varijante S239K/S267K, (opciono oba monomera sadrže FcRn varijante 428L/434S), gde je pozitivna strana scFv monomer i sadrži naelektrisan scFv veznik (pogotovo kada je scFv anti-CD3). Deveto otelotvorenje koristi prvi monomer negativne strane koji sadrži I199T/N203D/K274Q/R355Q/N384S/K392N/V397M/Q419E/K447del, zakrivljene varijante S364K/E357Q i i ablacione varijante S239K/S267K, (opciono oba monomera sadrže FcRn varijante 428L/434S), uparen sa pozitivnom stranom monomer koji ne sadrži pI varijante, sadrži zakrivljene varijante S364K/E357Q i ablacione varijante S239K/S267K, (opciono oba monomera sadrže FcRn varijante 428L/434S), gde je pozitivna strana scFv monomer i sadrži naelektrisan scFv veznik (pogotovo kada je scFv anti-CD3). Deseto otelotvorenje koristi prvi monomer („negativna strana“) koji sadrži pI varijante N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D, zakrivljene varijante 368D/370S, i ablacione varijante S267K/P329K, uparen sa pozitivnom stranom koja ne sadrži pI varijante, sadrži zakrivljene varijante S364K/E357Q i i ablacione varijante S267K/P329K (opciono oba monomera sadrže FcRn varijante 428L/434S), gde je pozitivna strana scFv monomer i sadrži naelektrisan scFv veznik (pogotovo kada je scFv anti-CD3). Jedanaesto otelotvorenje koristi prvi monomer negativne strane koji sadrži I199T/N203D/K274Q/R355Q/Q419E/K447del, zakrivljene varijante S364K/E357Q i i ablacione varijante S267K/P329K (opciono oba monomera sadrže FcRn varijante 428L/434S), uparen sa pozitivnom stranom koja sadrži pI varijante Q196K/I199T/P271R/P228R/N276K, zakrivljene varijante S364K/E357Q i ablacione varijante S267K/P329K (opciono oba monomera sadrže FcRn varijante 428L/434S), gde je pozitivna strana scFv monomer i sadrži naelektrisan scFv veznik (pogotovo kada je scFv anti-CD3). Dvanaesto otelotvorenje koristi prvi monomer negativne strane koji sadrži I199T/N203D/K274Q/R355Q/N384S/K392N/V397M/Q419E/K447del, zakrivljene varijante S364K/E357Q i i ablacione varijante S267K/P329K (opciono oba monomera sadrže FcRn varijante 428L/434S), uparen sa pozitivnom stranom monomer koji ne sadrži pI varijante, sadrži zakrivljene varijante S364K/E357Q i ablacione varijante S267K/P329K (opciono oba monomera sadrže FcRn varijante 428L/434S), gde je pozitivna strana scFv monomer i sadrži naelektrisan scFv veznik (pogotovo kada je scFv anti-CD3).

Veznici

[0163] predmetno obelodanjenje opciono pruža vezujuće grupe prema potrebi, na primer kao dodatak dodatnih mesta vezivanja antigena, kao što je prikazano na primer na Slikama 11, 12 i 13, gde „drugi kraj“ molekula sadrži dodatne komponente koje vezuju antigen. Pored toga, kao što je navedeno u nastavku, veznici se takođe mogu koristiti u sistemima antitelo-lek konjugata (ADC). Kada se koristi za spajanje komponenti centralnih mAb-Fv konstrukata, veznik je generalno polipeptid koji sadrži dva ili više aminokiselinskih ostataka spojenih peptidnim vezama i koriste se za povezivanje jedne ili više komponenti predmetnog pronalaska. Takvi vezujući polipeptidi su dobro poznati u struci (pogledati npr. Holliger, P., i

1

dr. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak, R. J., i dr. (1994) Structure 2:1121-1123). Mnoštvo veznika može naći upotrebu u nekim otelotvorenjima ovde. Kao što će razumeti stručnjaci, postoje najmanje tri različita tipa veznika koji se koriste u predmetnom pronalasku.

[0164] „Veznik“ se ovde takođe naziva „sekvenca veznika“, „odstojnik“, „sekvenca za vezivanje“ ili njihovi gramatički ekvivalenti. Homo- ili hetero-bifunkcionalni veznici su dobro poznati (pogledati, 1994 Pierce Chemical Company katalog, tehnički odeljak o unakrsnim vezama, strane 155-200). (Obratiti pažnju na razliku između generičkih „veznika“ i „scFv veznika“ i „naelektrisanih scFv veznika“). Mnoge strategije se mogu koristiti za kovalentno povezivanje molekula. One uključuju, ali nisu ograničene na polipeptidne veze između N- i C-terminusa proteina ili domena proteina, povezivanje preko disulfidnih veza i povezivanje preko reagenasa za hemijsko unakrsno povezivanje. U jednom aspektu ovog otelotvorenja, veznik je peptidna veza, generisana rekombinantnim tehnikama ili sintezom peptida. Peptidni veznik može pretežno uključivati naredne aminokiselinske ostatke: Gly, Ser, Ala ili Thr. Peptidni veznik treba da ima dužinu koja je dovoljna da poveže dva molekula na takav način da preuzmu ispravnu konformaciju jedan u odnosu na drugi tako da zadrže željenu aktivnost. U jednom aspektu, veznik je dužine od oko 1 do 50 aminokiselina, poželjno dužine oko 1 do 30 aminokiselina. U jednom otelotvorenju, mogu se koristiti veznici dužine od 1 do 20 aminokiselina. Korisni veznici uključuju glicin-serinske polimere, uključujući na primer (GS)n, (GSGGS)n, (GGGGS)n, i (GGGS)n, gde je n ceo broj od najmanje jednog, glicin-alanin polimera, alanin-serin polimera, i druge fleksibilne veze.

Alternativno, različiti ne-proteinski polimeri, uključujući, ali ne ograničavajući se na polietilen glikol (PEG), polipropilen glikol, polioksialkilene ili kopolimere polietilen glikola i polipropilen glikola, mogu se koristiti kao veznici, to jest mogu pronaći upotrebu kao veznici.

[0165] Ostale sekvence veznika mogu uključivati bilo koju sekvencu bilo koje dužine CL/CH1 domena, ali ne i sve ostatke CL/CH1 domena; na primer prvih 5-12 aminokiselinskih ostataka CL/CH1 domena. Veznici se mogu dobiti iz lakog lanca imunoglobulina, na primer Cκ ili Cλ. veznici se mogu dobiti iz teških lanaca imunoglobulina bilo kog izotipa, uključujući na primer Cγ1, Cγ2, Cγ3, Cγ4, Cα1, Cα2, Cδ, Cε i Cµ. Sekvence veznika mogu takođe da se dobiju iz drugih proteina, kao što su proteini nalik Ig (npr. TCR, FcR, KIR), sekvence izvedene iz zglobnog regionima i druge prirodne sekvence iz drugih proteina.

2

Konjugati antitela i leka

[0166] U nekim otelotvorenjima, multispecifična antitela predmetnog pronalaska se konjuguju sa lekovima kako bi se formirali antitelo-lek konjugati (ADC). Generalno, ADC se koristi u onkološkim primenama, gde upotreba antitelo-lek konjugata za lokalnu isporuku citotoksičnih ili citostatičkih agenasa omogućava ciljano isporučivanje leka u tumore, što može omogućiti veću efikasnost, nižu toksičnost itd. Pregled ove tehnologije je prikazan u Ducry i dr., Bioconjugate Chem., 21:5-13 (2010), Carter i dr., Cancer J.14(3):154 (2008) and Senter, Current Opin. Chem. Biol.13:235-244 (2009).

[0167] Prema tome, pronalazak pruža multispecifična antitela konjugovana sa lekovima. Generalno, konjugacija se vrši kovalentnim vezivanjem na antitelo, kao što je dalje opisano u nastavku, i uglavnom se oslanja na veznik, često peptidni veznik (koji je, kako je opisano u nastavku, konstruisan da bude osetljiva na to da li postoji razdvajanje proteazama na ciljanom mestu ili ne). Pored toga, kao što je gore opisano, povezivanje veznik-lek jedinice (LU-D) može se obaviti vezivanjem na cisteine unutar antitela. Kao što će razumeti stručnjaci, broj delova leka po antitelu može da se menja, zavisno od uslova reakcije, i može da varira od 1:1 do 10:1 odnosa leka: antitelo. Kao što će razumeti stručnjaci, stvarni broj je prosek.

[0168] Prema tome, pronalazak pruža multispecifična antitela konjugovana sa lekovima. Kao što je opisano u nastavku, lek iz ADC može biti bilo koji ili više agenasa, uključujući, ali ne ograničavajući se na citotoksične agense kao što su hemoterapijski agensi, agensi za inhibiciju rasta, toksini (na primer, enzimski aktivni toksin bakterijskog, gljivičnog, biljnog ili životinjskog porekla ili njegovi fragmenti) ili radioaktivni izotop (to jest radiokonjugat). Ovde su takođe opisani postupci korišćenja ADC.

[0169] Lekovi za upotrebu u predmetnom pronalasku uključuju citotoksične lekove, posebno one koji se koriste za terapiju raka. Takvi lekovi, generalno, uključuju agense za oštećenje DNK, anti-metabolite, prirodne proizvode i njihove analoge. Primeri klasa citotoksičnih agenasa uključuju inhibitore enzima kao što su inhibitori dihidrofolat reduktaze i inhibitori timidilat sintaze, DNK interkalilatori, DNK razdvajači, inhibitori topoizomeraze, porodice lekova antraciklina, vinca lekovi, mitomicini, bleomicini, citotoksični nukleozidi, porodica lekova pteridina, dijneni, podofilotoksini, dolastatini, maitansinoidi, induktori diferencijacije i taksoli.

[0170] Pripadnici ovih klasa uključuju, na primer, metotreksat, metopterin, dihlorometotreksat, 5-fluorouracil, 6-merkaptopurin, citozin arabinozid, melfalan, leurozin, leurosidein, aktinomicin, daunorubicin, doksorubicin, mitomicin C, mitomicin A, caminomicin, aminopterin, talisomicin, podofilotoksin i derivate podofilotoksina kao što su etopozid ili etopozid fosfat, vinblastin, vinkristin, vindesin, taksani, uključujući taksol, taksoter retinoinsku kiselina, buternu kiselinu, N8-acetil spermidin, kamptotecin, kalihamicin, esperamicin, ene-dijni, duokarmicin A, duokarmicin SA, kalihamicin, kamptotecin, maitansinoidi (uključujući DM1), monometilauristatin E (MMAE), monometilauristatin F (MMAF) i maitansinoidi (DM4) i njihovi analozi.

[0171] Toksini se mogu koristiti kao antitelo-toksin konjugati i uključuju bakterijske toksine poput toksina difterije, biljne toksine poput ricina, toksine malih molekula kao što su geldanamicin (Mandler i dr (2000) J. Nat. Cancer Inst.92(19):1573-1581; Mandler i dr (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028; Mandler i dr (2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791), maitansinoidi (EP 1391213; Liu i dr., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623), i kaliheamicin (Lode i dr (1998) Cancer Res.58:2928; Hinman i dr (1993) Cancer Res.53:3336-3342). Toksini mogu da pokazuju svoje citotoksične i citostatičke efekte mehanizmima koji uključuju vezivanje tubulina, vezivanje DNK ili inhibiciju topoizomeraze.

[0172] Zamišljeni su konjugati multispecifičnog antitela i jednog ili više toksina malog molekula, kao što su maitansinoidi, dolastatini, auristatini, trihotecen, kaliheamicin i CC1065, i derivati ovih toksina koji imaju aktivnost toksina.

Maitansinoidi

[0173] Jedinjenja maitansina pogodna za upotrebu kao delovi lekova maitansinoida su dobro poznata u struci, i mogu se izolovati iz prirodnih izvora prema poznatim postupcima, proizvesti tehnikama genetskog inženjeringa (pogledati Yu i dr (2002) PNAS 99:7968-7973), ili su maitansinol i analozi maitansinola pripremljeni sintetički prema poznatim postupcima. Kao što je opisano u nastavku, lekovi se mogu modifikovati ugradnjom funkcionalno aktivne grupe kao što je tiol ili aminska grupa radi konjugacije sa antitelom.

[0174] Primeri delova leka sa maitansinoidom uključuju one koji imaju modifikovan aromatski prsten, poput: C-19-dehloro (U.S. Pat. No.4,256,746) (pripremljeno redukcijom litijum-aluminijum hidrida ansamitocina P2); C-20-hidroksi (ili C-20-dimetil) /- C-19-

4

dehloro (U.S. Pat. Nos.4,361,650 i 4,307,016) (pripremljeno demetilacijom koristeći streptomike ili aktinomike ili dehlorinacijom pomoću LAH); i C-20-demetoksi, C-20-aciloksi (--OCOR), /- dehloro (U.S. Pat. No.4,294,757) (pripremljeno acilacijom pomoću acilohlorida) i oni koje imaju modifikacije na drugim položajima

[0175] Primeri delova leka sa maitansinoidom uključuju i one koje imaju modifikacije kao što su: C-9-SH (U.S. Pat. No.4,424,219) (pripremljen reakcijom maitansinola sa H2S ili P2S5); C-14-alkoksimetil (demetoksi/CH2OR) (U.S. Pat. No.4,331,598); C-14-hidroksimetil ili aciloksimetil (CH2OH ili CH2OAc) (U.S. Pat. No.4,450,254) (pripremljeno od Nocardia); C-15-hidroksi/aciloksi (U.S. Pat. No.4,364,866) (pripremljeno konverzijom maitansinola od streptomicima); C-15-metoksi (U.S. Pat. Nos.4,313,946 i 4,315,929) (izolovano od Trewia nudlflora); C-18-N-dimetil (U.S. Pat. Nos.4,362,663 i 4,322,348) (pripremljeno demetilacijom maitansinola streptomicima); i 4,5-dezoksi (U.S. Pat. No.4,371,533) (pripremljeno redukcijom titanijum trihlorida/LAH maitansinola).

[0176] Posebno se koriste DM1 (obelodanjeni u US Patent No.5,208,020, uključeni referencom) i DM4 (obelodanjen u US Patent No.7,276,497). Pogledati takođe brojne dodatne derivate maitansinoida i postupke u 5,416,064, WO/01/24763, 7,303,749, 7,601,354, US 7,303,749, WO02/098883, 6,441,163, 7,368,565, WO02/16368 i WO04/1033272.

[0177] ADC koji sadrže maitansinoide, postupke njihove izrade i njihova terapeutska upotreba obelodanjeni su, na primer, u U.S. Pat. Nos.5,208,020; 5,416,064; 6,441,163 i European Patent EP 0425 235 B1. Liu i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623 (1996) opisuju ADC koji sadrže maitansinoid označen sa DM1 povezan sa monoklonskim antitelom C242 usmerenim protiv ljudskog kolorektalnog raka. Otkriveno je da je konjugat visoko citotoksičan prema kultivisanim ćelijama raka debelog creva i pokazao je antitumorsko delovanje u testu in vivo rasta tumora.

[0178] Chari i dr., Cancer Research 52:127-131 (1992) opisuju ADC kod kojih je maitansinoid konjugovan preko disulfidnog veznika na mišje antitelo A7 koje se vezuje za antigen na ćelijskim linijama raka debelog creva, ili za drugo mišje monoklonsko antitelo TA. 1 koje vezuje HER-2/neu onkogen. Citotoksičnost TA.1-miatansonoid konjugata testirana je in vitro na ćelijskoj liniji raka dojke SK-BR-3, koja eksprimira 3x105 HER-2 površinskih antigena po ćeliji. Konjugat leka je postigao stepen citotoksičnosti sličan slobodnom maitansinoid leku, što se može povećati povećanjem broja molekula maitansinoida po molekulu antitela. Konjugat A7-maitansinoida pokazao je nisku sistemsku citotoksičnost kod miševa.

Auristatini i dolastatini

[0179] U nekim otelotvorenjima, ADC sadrži multispecifično antitelo konjugovano na dolastatine ili peptidne analoge i derivate dolostatina, auristatine (U.S. Pat. Nos.5,635,483; 5,780,588). Pokazalo se da dolastatini i auristatini ometaju dinamiku mikrotubula, hidrolizu GTP-a i nuklearnu i ćelijsku deobu (Woyke i dr (2001) Antimicrob. Agents and Chemother.

45(12):3580-3584) i imaju aktivnost protiv raka (U.S. Pat. No.5,663,149) i protiv gljiva (Pettit i dr (1998) Antimicrob. Agents Chemother.42:2961-2965). Deo leka dolastatina ili auristatina može biti vezan za antitelo preko N (amino) terminusa ili C (karboksil) terminusa dela peptidnog leka (WO 02/088172).

[0180] Primeri otelotvorenja auristatina uključuju N-terminus povezane DE i DF delove leka monometilauristatina, obelodanjene u „Senter i dr, Proceedings of the American Association for Cancer Research, Volume 45, Abstract Number 623, predstavljeno 28. marta 2004 i opisano u United States Patent Publication No.2005/0238648.

[0181] Primerno otelotvorenje auristatina je MMAE (pogledati US Patent No.6,884,869).

[0182] Naredne primereno otelotvorenje auristatina je MMAF (pogledati US 2005/0238649, 5,767,237 i 6,124,431).

[0183] Dodatna primerna otelotvorenja koje sadrže MMAE ili MMAF i razne komponente veznika (ovde opisane dalje) imaju naredne strukture i skraćenice (gde Ab znači antitelo, i p je 1 do oko 8):

[0184] Tipično, ostaci leka na bazi peptida mogu da se pripreme formiranjem peptidne veze između dve ili više aminokiselina i/ili fragmenata peptida. Takve peptidne veze mogu se pripremiti, na primer, postupkom sinteze u tečnoj fazi (pogledati E. Schroder i K. Lubke, „The Peptides“, volume 1, pp 76-136, 1965, Academic Press) koja je dobro poznata u oblasti hemije peptida. Auristatin/dolastatin delovi leka mogu se pripremiti u skladu sa postupcima: U.S. Pat. No.5,635,483; U.S. Pat. No.5,780,588; Pettit i dr (1989) J. Am. Chem. Soc.

111:5463-5465; Pettit i dr (1998) Anti-Cancer Drug Design 13:243-277; Pettit, G. R., i dr.

Synthesis, 1996, 719-725; Pettit i dr (1996) J. Chem. Soc. Perkin Trans.1 5:859-863; i Doronina (2003) Nat Biotechnol 21(7):778-784.

Kaliheamicin

[0185] Kako je ovde opisano, ADC sadrži antitelo pronalaska konjugovano na jedan ili više molekula kaliheamicina. Na primer, Milotarg je prvi komercijalni lek ADC i koristi kaliheamicin γ1 kao korisni teret (pogledati US Patent No.4,970,198). Dodatni derivati kaliheamicina su opisani u US Patent Nos.5,264,586, 5,384,412, 5,550,246, 5,739,116, 5,773,001, 5,767,285 i 5,877,296. Porodica antibiotika kaliheamicina je sposobna da proizvede prekide dvolančane DNK u sub-pikomolarnim koncentracijama. Za pripremu konjugata iz porodice kaliheamicina, pogledati U.S. Pat. Nos.5,712,374, 5,714,586, 5,739,116, 5,767,285, 5,770,701, 5,770,710, 5,773,001, 5,877,296 (sve od strane American Cyanamid Company). Strukturni analozi kaliheamicina koji se mogu koristiti uključuju, ali nisu ograničeni na, γII, α2I, α2I, N-acetil-i1I, PSAG i θI (Hinman i dr., Cancer Research 53:3336-3342 (1993), Lode i dr., Cancer Research 58:2925-2928 (1998) i gore navedeni U.S. patenti za American Cyanamid). Drugi anti-tumorski lek za koji antitelo može da bude konjugovano je QFA koji je antifolat. I kaliheamicin i QFA imaju intracelularna mesta delovanja i ne prelaze lako kroz plazma membranu. Zbog toga, ćelijski unos ovih agenasa putem internalizacije posredovane antitelom značajno pojačava njihove citotoksične efekte.

Duokarmicini

[0186] CC-1065 (pogledati US Patent No.4,169,888) i duokarmicini su članovi porodice antitumorskih antibiotika koji se koriste u ADC-u. Čini se da ovi antibiotici deluju kroz selektivno alkilirajuću DNK na N3 od adenina u sporednom useku, što pokreće kaskadu događaja koji rezultuju apoptozom.

[0187] Važni članovi duokarmicina uključuju duokarmicin A (US Patent No.4,923,990) i duokarmicin SA (U.S. Pat. No.5,101,038), i veliki broj analoga kako je opisano u US Patent No. 7,517,903, 7,691,962, 5,101,038; 5,641,780; 5,187,186; 5,070,092; 5,070,092;

5,641,780; 5,101,038; 5,084,468, 5,475,092, 5,585,499, 5,846,545, WO2007/089149, WO2009/017394A1, 5,703,080, 6,989,452, 7,087,600, 7,129,261, 7,498,302, i 7,507,420. Ostali citotoksični agensi

[0188] Ostali antitumorski agensi koji mogu biti konjugovani na antitela predmetnog pronalaska uključuju BCNU, streptozoicin, vinkristin i 5-fluorouracil, porodicu agenasa poznatih zajedno kao LL-E33288 kompleks opisan u U.S. Pat. Nos.5,053,394, 5,770,710, kao i esperamicini (U.S. Pat. No.5,877,296).

[0189] Enzimski aktivni toksini i njihovi fragmenti koji se mogu koristiti uključuju A lanac difterije, nevezujuće aktivne fragmenti toksina difterije, A lanac egzotoksina (od Pseudomonas aeruginosa), A lanac ricina, A lanac abrina, A lanac modecina, alfa-sarkin, proteine Aleurites fordii, diantin proteine, Phitolaca americana proteine (PAPI, PAPII i PAP-S), momordice charantia inhibitor, kurcin, krotin, sapaonaria officinalis inhibitor, gelonin, mitogelin, restocin, fenomicin, enomicin i trikotecene. Pogledati, na primer, WO 93/21232 objavljen 28. oktobra 1993.

[0190] Ovde je opisan ADC koji se formira između antitela i jedinjenja sa nukleolitičkom aktivnošću (npr. ribonukleaza ili DNK endonukleaza, kao što je deoksiribonukleaza; DNaza).

[0191] Za selektivno uništavanje tumora, antitelo može sadržati visoko radioaktivni atom. Na raspolaganju su razni radioaktivni izotopi za proizvodnju radiokonjugovanih antitela. Primeri uključuju At211, 1131, 1125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 i radioaktivne izotope od Lu.

[0192] Radio- ili druge oznake mogu se ugraditi u konjugat na poznate načine. Na primer, peptid može biti biosintetisan ili se može sintetisati hemijskom sintezom aminokiselina koristeći pogodne prekursore aminokiselina koji uključuju, na primer, fluor-19 umesto vodonika. Oznake kao što su Tc99m ili 1123, Re186, Re188 i In111 mogu se povezati preko cisteinskog ostatka u peptidu. Itrijum-90 se može povezati preko ostatka lizina. IODOGEN postupak (Fraker i dr (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57 can be used to incorporate Iodine-123. „Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy“ (Chatal, CRC Press 1989) detaljno opisuje druge postupke.

[0193] Za sastave koji sadrže više antitela, naelektrisanje leka je predstavljeno sa p, prosečnim brojem molekula leka po antitelu. Naelektrisanje leka može biti u opsegu od 1 do 20 lekova (D) po antitelu. Prosečan broj lekova po antitelu u pripremi reakcija konjugacije može se okarakterisati uobičajenim sredstvima kao što su masna spektroskopija, ELISA test i HPLC. Takođe se može odrediti kvantitativna raspodela antitelo-lek konjugata u smislu p.

[0194] U nekim slučajevima, razdvajanje, prečišćavanje i karakterizacija homogenih antitelolek konjugata gde je p neka vrednost od antitela-konjugata leka sa drugim opterećenjima lekom može se postići sredstvima kao što su obrnuta faza HPLC ili elektroforeza. U priemrnim otelotvorenjima, p je 2, 3, 4, 5, 6, 7, ili 8, ili njihov deo.

[0195] Generisanje jedinjenja antitelo-lek konjugata može da se izvrši bilo kojom tehnikom poznatom stručnjaku. Ukratko, jedinjenja antitelo-lek konjugata mogu da sadrže multispecifično antitelo kao jedinicu antitela, lek i opcioni veznik koji spaja lek i vezujući agens.

[0196] Dostupno je više različitih reakcija za kovalentno vezivanje lekova i/ili veznika za vezujuće agense. To se može postići reakcijom aminokiselinskih ostataka vezujućeg agensa, na primer, molekula antitela, uključujući aminske grupe lizina, grupe slobodne karboksilne kiseline od glutaminske i asparaginske kiseline, sulfhidrilne grupe cisteina i različite grupe aromatičnih aminokiselina. Često korišćeni nespecifični postupci kovalentnog vezivanja su karbodiimidna reakcija koja povezuje karboksi (ili amino) grupu jedinjenja sa amino (ili karboksi) grupama antitela. Pored toga, bifunkcionalni agensi poput dialdehida ili imidoestara korišćeni su za povezivanje amino grupe jedinjenja sa amino grupama molekula antitela.

[0197] Schiff-ova bazna reakcija je takođe dostupna za vezivanje lekova za vezujuće agense. Ovaj postupak uključuje perjodatnu oksidaciju leka koji sadrži glikol ili hidroksi grupe, stvarajući tako aldehid koji zatim reaguje sa vezujućim agensom. Vezivanje nastaje formiranjem Schiff-ove baze sa amino grupama vezujućeg agensa. Izotiocijanati se takođe mogu koristiti kao agensi za spajanje kovalentnog vezivanja lekova za vezujuće agense. Sručnjacima su poznate i druge tehnike, i one su unutar obima predmetnog pronalaska.

[0198] U nekim otelotvorenjima, međuproizvod, koji je prekursor veznika, reaguje sa lekom pod odgovarajućim uslovima. U drugim otelotvorenjima, reaktivne grupe se koriste na leku i/ili međuproizvodu. Proizvod reakcije između leka i međuproizvoda, ili derivatizovanog leka, posle toga reaguje sa multispecifičnim antitelom predmetnog pronalaska pod odgovarajućim uslovima.

[0199] Podrazumeva se da se hemijske modifikacije takođe mogu izvršiti u željenom jedinjenju kako bi se reakcije tog jedinjenja učinile pogodnijima u svrhu pripreme konjugata predmetnog pronalaska. Na primer funkcionalna grupa, npr. amin, hidroksil ili sulfhidril, mogu se dodati leku na položaju koji ima minimalan ili prihvatljiv efekat na aktivnost ili druga svojstva leka

Jedinice veznika

[0200] Tipično, jedinjenja antitelo-lek konjugata sadrže jedinicu veznika između jedinice leka i jedinice antitela. U nekim otelotvorenjima, veznik se može razdvojiti pod intracelularnim ili ekstracelularnim uslovima, tako da razdvajanje veznika oslobađa jedinicu leka iz antitela u odgovarajućoj sredini. Na primer, čvrsti tumori koji luče određene proteaze mogu poslužiti kao cilj razdvojivog veznika; u drugim otelotvorenjima, koriste se intracelularne proteaze. U drugim otelotvorenjima, jedinica veznika nije razdvojiva i lek se oslobađa, na primer, degradacijom antitela u lizozomima.

[0201] U nekim otelotvorenjima, veznik se razdvaja agensom za razdvajanje koji je prisutan u intracelularnom okruženju (na primer, u lizozomu ili endozomu ili kaveoli). Veznik može biti, na primer, peptidil veznik koji se cepa intracelularnim enzimom peptidaze ili proteaze, uključujući, ali ne ograničavajući se na, lizozomsku ili endozomalnu proteazu. U nekim otelotvorenjima, peptidil veznik je dugačak najmanje dve aminokiseline ili je dugačak najmanje tri aminokiseline.

[0202] Agensi za razdvajanje mogu, bez ograničenja, uključivati katepsine B i D i plazmin, za koje se zna da hidrolizuju derivate leka dipeptida, što rezultuje oslobađanjem aktivnog leka unutar ciljanih ćelija (pogledati npr. Dubowchik and Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83:67-123). Peptidil veznici koji se mogu razdvojiti enzimima koji su prisutni u ćelijama koje eksprimiraju CD38. Na primer, može se koristiti peptidil veznik koji se može razdvojiti pomoću tiol-zavisne proteaze katepsin-B, koja se snažno eksprimira u kancerogenom tkivu (npr. Phe-Leu ili Gly-Phe-Leu-Gly veznik (SEQ ID NO: X)). Ostali primeri takvih veznika opisani su, na primer, u U.S. Pat. No.6,214,345.

[0203] U nekim otelotvorenjima, peptidil veznik koji se može razdvojiti intracelularnom proteazom je Val-Cit veznik ili Phe-Lys veznik (pogledati npr. U.S. Pat. No.6,214,345, koji opisuje sintezu doksorubicina sa val-cit veznikom).

[0204] U drugim otelotvorenjima, razdvojivi veznik je osetljiv na pH, odnosno osetljiv je na hidrolizu pri određenim vrednostima pH. Obično se pH-osetljivi veznik hidrolizuje u kiselim uslovima. Na primer, može se koristiti kiseli labilni veznik koji se hidrolizuje u lizozomu (na primer, hidrazon, semkarbazon, tiosemikarbazon, cis-akonitni amid, ortoestar, acetal, ketal ili slično). (Pogledati npr. U.S. Pat. Nos.5,122,368; 5,824,805; 5,622,929; Dubowchik and Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83:67-123; Neville i dr., 1989, Biol. Chem. 264:14653-14661.) Takvi veznici su relativno stabilni u neutralnim uslovima pH, poput onih u krvi, ali su nestabilni pri pH ispod 5,5 ili 5,0, približnom pH lizozoma. U određenim otelotvorenjima, veznik koji se hidrolizuje je tioetrski veznik (kao što je, na primer, tioeter povezan sa terapeutskim agensom preko acilhidrazonske veze (pogledati npr. U.S. Pat. No.5,622,929).

[0205] U drugim otelotvorenjima, veznik se može razdvojiti pod smanjenim uslovima (na primer, disulfidni veznik). U struci su poznati različiti disulfidni veznici, uključujući, na primer, one koji se mogu formirati korišćenjem SATA (N-sukcinimidil-5-acetiltioacetat), SPDP (N-sukcinimidil-3-(2-piridilditio)propionat), SPDB (N-sukcinimidil-3-(2-pirididitio)butirat) i SMPT (N-sukcinimidil-oksikarbonil-alfa-metil-alfa-(2-piridil-ditio) toluen)-, SPDB i SMPT. (Pogledati npr. Thorpe i dr., 1987, Cancer Res.47:5924-5931;

Wawrzynczak i dr., In Immunoconjugates: Antibody Conjugates in Radioimagery and Therapy of Cancer (C. W. Vogel ed., Oxford U. Press, 1987. See also U.S. Pat. No.

4,880,935.)

[0206] U drugim otelotvorenjima, veznik je malonat veznik (Johnson i dr., 1995, Anticancer Res. 15:1387-93), maleimidobenzoil veznik (Lau i dr., 1995, Bioorg-Med-Chem. 3(10):1299-1304), ili 3'-N-amid analog (Lau i dr., 1995, Bioorg-Med-Chem. 3(10):1305-12).

[0207] U drugim otelotvorenjima, jedinica veznika nije razdvojiva i lek se oslobađa degradacijom antitela. (pogledati US objava br.2005/0238649).

[0208] U mnogim otelotvorenjima, veznik je samo-zapaljiv. Kako se ovde koristi, izraz „samo-zapaljiv odstojnik“ odnosi se na bifunkcionalnu hemijsku jedinicu koja je u stanju da kovalentno poveže dva razmaknuta hemijska dela u stabilni tripartitni molekul. Spontano će se razdvojiti od drugog hemijskog dela ako se njegova veza sa prvim delom razdvoji.

Pogledati na primer, WO 2007059404A2, WO06110476A2, WO05112919A2, WO2010/062171, WO09/017394, WO07/089149, WO 07/018431, WO04/043493 i WO02/083180, koji su usmereni na konjugate supstrata koji se mogu razdvojiti lekom, gde su lek i supstrat koji se mogu razdvojiti opciono povezani preko samo-zapaljivog veznika.

[0209] Često veznik nije značajnije osetljiv na ekstracelularno okruženje. Kako se ovde

1

koristi, „nije suštinski osetljiv na ekstracelularno okruženje“, u kontekstu veznika, znači da se ne više od oko 20%, 15%, 10%, 5%, 3%, ili ne više od oko 1% veznika u uzorku jedinjenja antitelo-lek konjugata razdvaja kada se jedinjenje antitelo-lek konjugata nalazi u ekstracelularnom okruženju (na primer, u plazmi).

[0210] Da li veznik nije značajnije osetljiv na ekstracelularno okruženje, može se utvrditi, na primer, inkubiranjem jedinjenja antitelo-lek konjugata sa plazmom tokom unapred određenog vremenskog perioda (na primer, 2, 4, 8, 16 ili 24 sata) i zatim kvantifikovanjem količine slobodnog leka prisutnog u plazmi.

[0211] U drugim otelotvorenjima koja nisu međusobno isključiva, veznik promoviše ćelijsku internalizaciju. U određenim otelotvorenjima, veznik promoviše ćelijsku internalizaciju kada se konjuguje sa terapeutskim agensom (to jest u okruženje veznik-terapeutski agens dela jedinjenja antitelo-lek konjugata kako je ovde opisano). U još nekim otelotvorenjima, veznik promoviše ćelijsku internalizaciju kada se konjuguje sa jedinjenjem auristatina i sa multispecifičnim antitelima predmetnog pronalaska.

[0212] Opisani su različiti primeri veznika koji se mogu koristiti sa predstavljenim sastavima i postupcima WO 2004-010957, US objava br.2006/0074008, US objava br.20050238649, i US objava br.2006/0024317.

Opterećenje leka

[0213] Opterećenje leka je predstavljeno sa p i predstavlja prosečan broj grupa lekova po antitelu u molekulu. Opterećenje leka („p“) može biti 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ili više delova (D) po antitelu, mada je često prosečan broj razlomak ili decimalni broj. Uopšteno, opterećenje leka od 1 do 4 je često korisno, i od 1 do 2 je takođe korisno. Ovde opisani ADC uključuju kolekcije antitela koja su konjugovana sa rasponom delova leka, od 1 do 20. Prosečan broj delova leka po antitelu u preparatima ADC iz reakcija konjugacije može se karakterisati uobičajenim sredstvima kao što su masena spektroskopija i ELISA test.

[0214] Kvantitativna distribucija ADC u smislu p takođe se može odrediti. U nekim slučajevima, razdvajanje, prečišćavanje i karakterizacija homogenog ADC gde je p određena vrednost od ADC sa drugim opterećenjima leka, može se postići sredstvima kao što je elektroforeza.

2

[0215] Za neke antitelo-lek konjugate, p može biti ograničen brojem mesta za vezivanje antitela. Na primer, tamo gde je vezan cistein tiol, kao u gornjim primerima otelotvorenja, antitelo može imati samo jednu ili više cistein tiol grupa, ili može imati samo jednu ili nekoliko dovoljno reaktivnih tiol grupa preko kojih se može povezati veznik. U nekim otelotvorenjima, veće naelektrisanje leka, npr. p> 5, može da izazove agregaciju, nerastvorljivost, toksičnost ili gubitak ćelijske propustljivosti određenih antitelo-lek konjugata. U nekim otelotvorenjima, opterećenje leka za ovde opisano ADC kreće se od 1 do oko 8; od oko 2 do oko 6; od oko 3 do oko 5; od oko 3 do oko 4; od oko 3,1 do oko 3,9; od oko 3,2 do oko 3,8; od oko 3,2 do oko 3,7; od oko 3,2 do oko 3,6; od oko 3,3 do oko 3,8; ili od oko 3,3 do oko 3,7. Zaista, pokazalo se da za određene ADC, optimalni odnos delova leka po antitelu može biti manji od 8, i može biti oko 2 do oko 5. Pogledati US 2005-0238649 A1.

[0216] U određenim otelotvorenjima, manje od teorijskog maksimuma delova leka se konjuguje sa antitelom tokom reakcije konjugacije. Antitelo može sadržati, na primer, lizinske ostatke koji ne reaguju sa međuproizvodom ili veznikom koji reaguje na lek, kao što je razmatrano u nastavku. Generalno, antitela ne sadrže mnogo slobodnih i reaktivnih cistein tiol grupa koje mogu biti povezane sa lekovima; zaista većina cistein tiol ostataka u antitelima postoji kao disulfidni mostovi. U nekim otelotvorenjima, antitelo može biti redukovano redukcionim agensom kao što je ditiotreitol (DTT) ili trikarboniletilfosfin (TCEP), pod delimičnim ili potpunim redukcionim uslovima, kako bi se stvorile reaktivne cistein tiolne grupe. U nekim otelotvorenjima, antitelo je podvrgnuto uslovima za denaturaciju kako bi se otkrile reaktivne nukleofilne grupe kao što su lizin ili cistein.

[0217] Opterećenje (lek/antitelo odnos) od ADC može se kontrolisati na različite načine, npr. (I) ograničavanjem molarnog viška lek-veznik međuproizvoda ili vezujućeg reagensa u odnosu na antitelo, (ii) ograničavanjem vremena reakcije konjugacije ili temperature, (iii) delimični ili ograničavajući reduktivni uslovi za modifikaciju cistein tiola, (iv) konstruisanje rekombinantnim tehnikama aminokiselinske sekvence antitela tako da se menjaju broj i položaj ostataka cisteina radi kontrole broja i/ili položaja veznik-lek dodataka (kao što su thioMab ili thioFab, pripremljeni kako je obelodanjeno ovde i u WO2006/034488).

[0218] Treba razumeti da gde više od jedne nukleofilne grupe reaguje sa lek-veznik međuproizvodom ili vezujućim reagensom, i zatim sa reagensom za delove leka, tada je dobijeni proizvod mešavina ADC jedinjenja sa distribucijom jednog ili više delova leka koji su vezani za antitelo. Prosečan broj lekova po antitelu može se izračunati iz smeše dvostrukim ELISA testom antitela, koji su specifični za antitelo i specifični za lek.

Pojedinačni ADC molekuli mogu se identifikovati u smeši pomoću masene spektroskopije i razdvojiti sa HPLC, npr. hromatografijom hidrofobnih interakcija.

[0219] U nekim otelotvorenjima, homogeni ADC sa jednom vrednosti opterećenja može se izolovati iz smeše konjugacije elektroforezom ili hromatografijom.

Postupci za određivanje citotoksičnog efekta ADC

[0220] Poznati su postupci za utvrđivanje da li lek ili antitelo-lek konjugat vrši citostatički i/ili citotoksični efekat na ćeliju. Generalno, citotoksična ili citostatička aktivnost antitelo-lek konjugata može se meriti: izlaganjem ćelija sisara koji eksprimiraju ciljani protein antitelolek konjugatu u medijumu ćelijske kulture; kultivisanje ćelija u periodu od oko 6 sati do oko 5 dana; i merenje vitalnosti ćelija. In vitro testovi zasnovani na ćelijama mogu se koristiti za merenje vitalnosti (proliferacija), citotoksičnosti i indukcije apoptoze (aktivacije kaspaze) antitelo-lek konjugata.

[0221] Za određivanje da li antitelo-lek konjugat ima citostatički efekat, može se koristiti test uključivanja timidina. Na primer, ćelije raka koje eksprimiraju ciljani antigen pri gustini od 5,000 ćelija/komorica ploče sa 96 komorica mogu biti kultivisane tokom 72 sata i izložene 0,5 µCi od 3H-timidina tokom poslednjih 8 sati 72-časovnog vremenskog perioda.

Ugrađivanje 3H-timidina u ćelije kulture meri se u prisustvu i odsustvu antitelo-lek konjugata.

[0222] Za određivanje citotoksičnosti može se izmeriti nekroza ili apoptoza (programirana ćelijska smrt). Nekroza je obično praćena povećanom propustljivošću plazma membrane; bubrenjem ćelije i rupturom plazma membrane. Apoptozu tipično karakteriše mešavina penušanja membrane, kondenzacija citoplazme i aktiviranje endogenih endonukleaza.

Određivanje bilo kog od ovih efekata na ćelije raka ukazuje da je antitelo-lek konjugat koristan u tretmanu raka.

[0223] Vitalnost ćelije se može meriti određivanjem unosa boje kao što je neutralna crvena, tripan plava ili ALAMAR™ plava (pogledati npr. Page i dr., 1993, Intl. J. Oncology 3:473-476). U takvom testu ćelije se inkubiraju u medijumu koji sadrži boju, ćelije se isperu, i

4

preostala boja, koje odražava ćelijsko prihvatanje boje, meri se spektrofotometrijski. Boja koja se vezuje za protein sulfohodamin B (SRB) se takođe može koristiti za merenje citoksičnosti (Skehan i dr., 1990, J. Natl. Cancer Inst.82:1107-12).

[0224] Alternativno, tetrazolijum so, kao što je MTT, koristi se u kvantitativnom kolorimetrijskom testu za opstanak i proliferaciju ćelija sisara detekcijom živih, ali ne i mrtvih ćelija (pogledati npr. Mosmann, 1983, J. Immunol. Methods 65:55-63).

[0225] Apoptoza se može kvantifikovati merenjem, na primer, DNK fragmentacije. Dostupni su komercijalni fotometrijski postupci za kvantitativno in vitro određivanje fragmentacije DNK. Primeri takvih ispitivanja, uključujući TUNEL (koji otkriva ugradnju obeleženih nukleotida u fragmentisanu DNK) i analize zasnovane na ELISA, opisani su u Biochemica, 1999, no.2, pp.34-37 (Roche Molecular Biochemicals).

[0226] Apoptoza se takođe može utvrditi merenjem morfoloških promena u ćeliji. Na primer, kao i kod nekroze, gubitak integriteta plazma membrane može da se utvrdi merenjem unosa određenih boja (npr. fluorescentna boja, na primer, akridin narandžasti ili editijum bromid). Postupak za merenje broja apoptotskih ćelija opisana je kod Duke i Cohen, Current Protocols in Immunology (Coligan i dr. eds., 1992, pp.3.17.1-3.17.16). Ćelije se takođe mogu obeležiti DNK bojom (npr. akridin narandžasta, etidijum bromid ili propidijum jodid) i ćelije se posmatraju zbog kondenzacije i marginacije hromatina duž unutrašnje nuklearne membrane. Ostale morfološke promene koje se mogu meriti kako bi se utvrdila apoptoza uključuju, na primer, citoplazmatičnu kondenzaciju, pojačano penušanje membrane i ćelijsko skupljanje.

[0227] Prisustvo apoptotskih ćelija može se meriti u priloženim i „lebdećim“ delovima kultura. Na primer, oba odeljka mogu da se sakupe uklanjanjem supernatanta, tripsinizacijom priključenih ćelija, kombinovanjem preparata posle koraka ispiranja centrifugiranjem (npr. 10 minuta pri 2000 o/min) i detektovanjem apoptoze (npr. Merenjem fragmentacije DNK).

(Pogledati npr. Piazza i dr., 1995, Cancer Research 55:3110-16).

[0228] In vivo, efekat terapeutskih sastave multispecifičnog antitela predmetnog pronalaska može se proceniti na pogodnom životinjskom modelu. Na primer, mogu se koristiti ksenogeni modeli raka, gde se eksplanti raka ili pasivno tkivo ksenoplafta uvode u životinje sa kompromitovanim imunim sistemom, kao što su goli ili SCID miševi (Klein i dr., 1997, Nature Medicine 3: 402-408). Efikasnost se može meriti korišćenjem testova koji mere inhibiciju stvaranja tumora, regresiju tumora ili metastazu i slično.

[0229] Terapeutski sastavi korišćeni u praksi prethodnih postupaka mogu se formulisati u farmaceutske sastave koji sadrže nosač pogodan za željeni postupak isporuke. Pogodni nosači uključuju bilo koji materijal koji u kombinaciji sa terapeutskim sastavom zadržava antitumorsku funkciju terapeutskog sastava i generalno nije reaktivan sa imunim sistemom pacijenta. Primeri uključuju, ali nisu ograničeni na, bilo koji od niza standardnih farmaceutskih nosača, kao što su sterilni fosfatom puferisani fiziološki rastvori, bakteriostatička voda i slično (pogledati, generalno, Remington's Pharmaceutical Sciences 16th Edition, A. Osal., Ed., 1980).

Sastavi antitela za in vivo primenu

[0230] Formulacije ovde opisanih antitela pripremaju se za čuvanje mešanjem antitela koja imaju željeni stepen čistoće sa opcionim farmaceutski prihvatljivim nosačima, ekscipijensima ili stabilizatorima (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. [1980]), u obliku liofilizovanih formulacija ili vodenih rastvora. Prihvatljivi nosači, ekscipijensi ili stabilizatori nisu toksični za primaoce u korišćenim dozama i koncentracijama i uključuju pufere kao što su fosfat, citrat i druge organske kiseline; antioksidante koji uključuju askorbinsku kiselinu i metionin; konzervanse (kao što je oktadecilldimetilbenzil amonijum hlorid; heksametonijum hlorid; benzalkonijum hlorid, benzetonijum hlorid; fenol, butil ili benzil alkohol; alkil parabeni kao metil ili propil paraben; katehol; resorcinol; cikloheksanol; 3-pentanol; i m-cresol); polipeptide niske molekulske mase (manje od oko 10 ostataka); proteine, kao što su serumski albumin, želatin ili imunoglobulini; hidrofilne polimere, poput polivinilpirolidona; aminokiseline kao što su glicin, glutamin, asparagin, histidin, arginin ili lizin; monosaharide, disaharide i druge ugljene hidrate uključujući glukozu, manozu ili dekstrine; helatorske agense kao što je EDTA; šećere kao što su saharoza, manitol, trehaloza ili sorbitol; kontra-jone koji stvaraju so kao što je natrijum; metalne komplekse (npr. Znprotein kompleksi); i/ili nejonske surfaktante kao što su TWEEN™, PLURONICS™ ili polietilen glikol (PEG).

[0231] Formulacija ovde može takođe da sadrži više od jednog aktivnog jedinjenja prema potrebi za određenu indikaciju koja se tretira, poželjno ona sa komplementarnim aktivnostima koje ne utiču štetno jedna na drugu. Na primer, može biti poželjno da se antitela dobiju sa drugim specifičnostima. Alternativno, ili dodatno, smeša može da sadrži citotoksični agens, citokin, agens za inhibiciju rasta i/ili antagonist malih molekula. Takvi molekuli su u kombinaciji prikladno prisutni u količinama koje su efikasne za predviđenu svrhu.

[0232] Aktivni sastojci se takođe mogu ugraditi u mikrokapsule pripremljene, na primer, tehnikama koacervacije ili interfacijalnom polimerizacijom, na primer, hidroksimetilcelulozom ili želatinskim mikrokapsulama, odnosno poli-(metilmetacilat) mikrokapsulama, u sistemima za primenu koloidnih lekova (na primer, lipozomi, albuminske mikrosfere, mikroemulzije, nano-čestice i nanokapsule) ili u makroemulzijama. Takve tehnike su obelodanjene u Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980).

[0233] Formulacije koje se koriste za in vivo primenu treba da budu sterične, ili gotovo sterične. To se lako postiže filtracijom kroz sterične filtracione membrane.

[0234] Mogu se pripremiti preparati sa odloženim oslobađanjem. Pogodni primeri preparata sa produženim oslobađanjem uključuju polupropusne matrice čvrstih hidrofobnih polimera koji sadrže antitelo, i matrice su u vidu oblikovanih predmeta, npr. filmova ili mikrokapsula. Primeri matrica sa produženim oslobađanjem uključuju poliestre, hidrogelove (na primer, poli(2-hidroksietil-metakrilat) ili poli(vinilalkohol)), polaktide (U.S. Pat. No.3,773,919) kopolimere L-glutaminske kiseline i .gama. etil-L-glutamat, nerazgradivi etilen-vinil acetat, razgradivi kopolimeri mlečne kiseline i glikolne kiseline kao što je LUPRON DEPOT™ (mikrosfere za injekcije sastavljene od kopolimera mlečne kiseline-glikolne kiseline i leuprolid acetata) i poli-D-(-)-3-hidroksibuterna kiselina. Dok polimeri poput etilen-vinil acetata i mlečne kiseline-glikolne kiseline omogućavaju oslobađanje molekula preko 100 dana, određeni hidrogelovi oslobađaju proteine tokom kraćeg vremenskog perioda.

[0235] Kada inkapsulirana antitela ostanu u telu duže vreme, mogu denaturisati ili se agregirati kao rezultat izloženosti vlazi na 37°C, što rezultuje gubitkom biološke aktivnosti i mogućim promenama imunogenosti. Racionalne strategije mogu se osmisliti za stabilizaciju u zavisnosti od mehanizma koji je uključen. Na primer, ako se utvrdi da mehanizam agregacije formira intermolekulsku S-S vezu kroz tiodisulfidnu razmenu, stabilizacija se može postići modifikovanjem sulfhidril ostataka, liofilizacijom iz kiselih rastvora, kontrolom sadržaja vlage, korišćenjem odgovarajućih aditiva i razvojem specifičnih sastava polimerne matrice.

Modaliteti primene

[0236] Ovde opisana antitela i hemoterapijski agensi daju se pacijentu, u skladu sa poznatim postupcima, kao što su intravenska primena u obliku bolusa ili kontinuiranom infuzijom tokom određenog vremena, intramuskularnom, intraperitonealnom, intracerobrospinalnom, potkožnom, intra-artikularnom, intrasinovijalnom, intratekalnom, oralnom, topikalnom ili inhalacionom primenom. Intravenska ili subkutana primena antitela su poželjne.

Modaliteti tretmana

[0237] Heterodimerna antitela predmetnog pronalaska za upotrebu u terapiji daju pozitivan terapeutski odgovor u odnosu na bolest ili stanje. Pod „pozitivnim terapeutskim odgovorom“ misli se na poboljšanje bolesti ili stanja i/ili poboljšanje simptoma povezanih sa bolesti ili stanjem. Na primer, pozitivan terapeutski odgovor odnosiće se na jedno ili više sledećih poboljšanja bolesti: (1) smanjenje broja neoplastičnih ćelija; (2) porast smrti neoplastičnih ćelija; (3) inhibicija preživljavanja neoplastičnih ćelija; (5) inhibicija (tj. usporavanje do određene mere, poželjno zaustavljanje rasta tumora); (6) povećana stopa preživljavanja pacijenata; i (7) izvesno olakšanje od jednog ili više simptoma povezanih sa bolesti ili stanjem.

[0238] Pozitivni terapeutski odgovori na bilo koju bolest ili stanje mogu se odrediti standardizovanim kriterijumima odgovora specifičnim za tu bolest ili stanje. Reakcija tumora može se proceniti na promene u morfologiji tumora (tj. Celokupno opterećenje tumora, veličina tumora i slično) korišćenjem tehnika skrininga kao što su skeniranje magnetnom rezonancom (MRI), rentgensko snimanje, računarsko tomografsko (CT) skeniranje, snimanje kostiju, endoskopija i biopsija tumora, uključujući aspiraciju koštane srži (BMA) i brojanje ćelija tumora u cirkulaciji.

[0239] Pored ovih pozitivnih terapeutskih odgovora, pacijent koji je podvrgnut terapiji može doživeti blagotvoran efekat na poboljšanje simptoma povezanih sa bolesti.

[0240] Zbog toga, za B ćelijske tumore, pacijent može osetiti smanjenje takozvanih B simptoma, tj. noćno znojenje, groznica, gubitak težine i/ili urtikarija. Za premaligna stanja, terapija multispecifičnim terapeutskim agensom može da blokira i/ili produži vreme pre razvoja srodnog malignog stanja, na primer, razvoj multiplog mijeloma kod pacijenata koji pate od monoklonske gamapatije neodređenog značaja (MGUS).

[0241] Poboljšanje bolesti može se okarakterisati kao potpuni odgovor. Pod „potpunim odgovorom“ podrazumeva se odsustvo klinički primetne bolesti uz normalizaciju bilo kojih prethodno nenormalnih radiografskih studija, koštane srži i cerebrospinalne tečnosti (CSF) ili abnormalnog monoklonskog proteina u slučaju mijeloma.

[0242] Takav odgovor može da traje najmanje 4 do 8 nedelja, ili ponekad i 6 do 8 nedelja, nakon tretmana prema postupcima predmetnog pronalaska. Alternativno, poboljšanje bolesti može se kategorisati kao delimični odgovor. Pod „delimičnim odgovorom“ podrazumeva se bar oko 50% smanjenja celokupnog merljivog opterećenja tumora (tj. broj malignih ćelija prisutnih kod pacijenta, ili izmerena tumorska masa ili količine abnormalnog monoklonskog proteina) u odsustvu novih lezija, koje mogu trajati 4 do 8 nedelja, ili 6 do 8 nedelja.

[0243] Tretman kako je ovde opisano ili tvrđeno uključuje „terapeutski efikasnu količinu“ lekova koji se koriste. „Terapeutski efikasna količina“ odnosi se na količinu koja je efikasna, u dozama i tokom potrebnog perioda, za postizanje željenog terapeutskog rezultata.

[0244] Terapeutski efikasna količina može varirati u zavisnosti od faktora kao što su stanje bolesti, starost, pol i težina pojedinca, i sposobnost lekova da kod pojedinca izazovu željeni odgovor. Terapeutski efikasna količina je takođe ona pri kojoj bilo koji toksični ili štetni efekti antitela ili dela antitela nadmašuju terapeutski blagotvorno dejstvo.

[0245] „Terapeutski efikasna količina“ za terapiju tumora takođe se može meriti svojom sposobnošću da stabilizuje napredovanje bolesti. Sposobnost jedinjenja da inhibira rak može se proceniti u sistemu životinjskog modela koji predviđa efikasnost ljudskog tumora.

[0246] Alternativno, ovo svojstvo sastava može se proceniti ispitivanjem sposobnosti jedinjenja da inhibira rast ćelije ili da indukuje apoptozu pomoću in vitro testova poznatih stručnjaku. Terapeutski efikasna količina terapeutskog jedinjenja može da smanji veličinu tumora ili na drugi način ublaži simptome kod pacijenta. Stručnjak će biti u stanju da odredi takve količine na osnovu faktora kao što su veličina pacijenta, težina simptoma pacijenta i odabrani sastav ili način primene.

[0247] Režimi doziranja se podešavaju tako da daju optimalni željeni odgovor (npr. terapeutski odgovor). Na primer, može se primeniti jedan bolus, može se primeniti više podeljenih doza tokom vremena ili se doza proporcionalno smanjuje ili povećava što je naznačeno potrebama terapeutske situacije. Parenteralni preparati mogu se formulisati u doznoj jedinici za lakšu primenu i ujednačenost doze. Oblik dozne jedinice kao što se ovde koristi odnosi se na fizički diskretne jedinice pogodne kao pojedinačne doze za pacijente koji treba da se tretira; svaka jedinica sadrži unapred određenu količinu aktivnog jedinjenja za koju je izračunato da će proizvesti željeni terapeutski efekat u vezi sa potrebnim farmaceutskim nosačem.

[0248] Specifikaciju za ovde opisane oblike doziranja diktiraju i direktno zavisi od (a) jedinstvenih karakteristika aktivnog jedinjenja i određenog terapeutskog efekta koji se treba postići i (b) ograničenja koja su svojstvena struci pravljenja jedinjenja kao što je aktivno jedinjenje za tretman osetljivosti kod pojedinaca.

[0249] Efikasne doze i režimi doziranja za multispecifična antitela koja su ovde opisana ili zahtevana patentnim zahtevima zavise od bolesti ili stanja koje će se tretirati i može ih odrediti stručnjak.

[0250] Primeran, neograničavajući raspon za terapeutski efikasnu količinu multispecifičnog antitela koje je ovde opisano ili zahtevano patentnim zahtevima je oko 0,1-100 mg/kg, kao što je oko 0,1-50 mg/kg, na primer oko 0,1-20 mg/kg, tako oko 0,1-10 mg/kg, na primer oko 0,5, oko 0,3, oko 1, ili oko 3 mg/kg. Kako je ovde opisano, antitelo za upotrebu u terapiji se primenjuje u dozi od 1 mg/kg ili više, kao što je doza od 1 do 20 mg/kg, npr. doza od 5 do 20 mg/kg, npr. doza od 8 mg/kg.

[0251] Običan medicinski stručnjak može da lako odredi i propiše efikasnu količinu potrebnog farmaceutskog sastavea. Na primer, lekar ili veterinar mogu da započnu doze leka koji se koristi u farmaceutskom sastavu u nivoima nižim od potrebnih kako bi se postigao željeni terapeutski efekat, i da postepeno povećavaju dozu sve dok se ne postigne željeni efekat.

[0252] U jednom otelotvorenju, multispecifično antitelo se primenjuje infuzijom pri nedeljnoj dozi od 10 do 500 mg/kg, kao što je od 200 do 400 mg/kg. Takva primena može se ponoviti, npr. 1 do 8 puta, kao što je 3 do 5 puta. Primena se može obavljati kontinuiranom infuzijom u periodu od 2 do 24 sata, kao što je od 2 do 12 sati.

[0253] U jednom otelotvorenju, multispecifično antitelo se primenjuje sporom kontinuiranom infuzijom tokom dugačkog perioda, poput više od 24 sata, ako je potrebno da se smanje nuspojave, uključujući toksičnost.

[0254] U jednom otelotvorenju, multispecifično antitelo se primenjuje pri nedeljnoj dozi od 250 mg do 2000 mg, kao što je na primer 300 mg, 500 mg, 700 mg, 1000 mg, 1500 mg ili 2000 mg, do 8 puta, kao što je od 4 do 6 puta. Primena se može obavljati kontinuiranom infuzijom u periodu od 2 do 24 sata, kao što je od 2 do 12 sati. Takav režim se može ponoviti jedan ili više puta po potrebi, na primer, nakon 6 meseci ili 12 meseci. Doziranje se može odrediti ili prilagoditi merenjem količine jedinjenja predmetnog pronalaska u krvi nakon primene, na primer uzimanjem biološkog uzorka i korišćenjem anti-idiotipskih antitela koja ciljaju antigen-vezujući region multispecifičnog antitela.

[0255] U narednom otelotvorenju, multispecifično antitelo se primenjuje jednom nedeljno tokom 2 do 12 nedelja, kao što je tokom 3 do 10 nedelja, kao što je tokom 4 do 8 nedelja.

[0256] U jednom otelotvorenju, multispecifično antitelo se primenjuje terapijom održavanja, kao što je, na primer, jednom nedeljno u periodu od 6 meseci ili više.

[0257] U jednom otelotvorenju, multispecifično antitelo se primenjuje režimom koji uključuje jednu infuziju multispecifičnog antitela praćenu infuzijom multispecifičnog antitela konjugovanog na radioizotop. Režim se može ponoviti, na primer, 7 do 9 dana kasnije.

[0258] Kao neograničavajući primeri, tretman prema predmetnom pronalasku može se pružiti kao dnevna doza antitela u količini od oko 0,1-100 mg/kg, kao što su 0,5, 0,9, 1,0, 1,1, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 ili 100 mg/kg, dnevno, barem jednog od dana 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, ili 40, ili alternativno, najmanje jedne od nedelja 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ili 20 nakon započinjanja tretmana, ili bilo koje njihove kombinacije, korišćenjem pojedinačnih ili podeljene doze svaka 24, 12, 8, 6, 4 ili 2 sata, ili bilo koje njihove kombinacije.

1

[0259] U nekim otelotvorenjima, njegov multispecifični molekul antitela se koristi u kombinaciji sa jednim ili više dodatnih terapeutskih agensa, npr. hemoterapijskim agensom. Neograničavajući primeri hemoterapijskih agenasa koji oštećuju DNK uključuju inhibitore topoizomeraze I (npr. irinotekan, topotekan, kamptotecin i njihove analoge ili njihove metabolite i doksorubicin); inhibitore topoizomeraze II (npr. etopozid, teniposid i daunorubicin); alkilacione agense (npr. melfalan, hlorambucil, busulfan, tiotep, ifosfamid, karmustin, lomustin, semustin, streptozocin, dekarbazin, metotreksat, mitomicin C i ciklofosfamid); interkalatore DNK (npr. cisplatin, oksaliplatin i karboplatin); interkalatore DNK i generatore slobodnih radikala kao što je bleomicin; i nukleozidne mimetike (npr.5-fluorouracil, kapecitibin, gemcitabin, fludarabin, citarabin, merkaptopurin, tioguanin, pentostatin i hidroksiurea).

[0260] Hemoterapijski agensi koja remete replikaciju ćelija uključuju: paklitaksel, docetaksel i srodni analozi; vinkristin, vinblastin i srodni analozi; talidomid, lenalidomid i srodni analozi (npr. CC-5013 i CC-4047); inhibitori proteinske tirozin kinaze (npr. imatinib mesilat i gefitinib); inhibitori proteazoma (npr. bortezomib); NF-κB inhibitori, uključujući inhibitore IκB kinaze; antitela koja se vezuju za proteine koji su prekomerno eksprimirani kod raka i na taj način smanjuju ćelijsku replikaciju (npr. trastuzumab, ritukimab, cetuksimab i bevacizumab); i drugi inhibitori proteina ili enzima za koje se zna da su povišeni, prekomerno eksprimirani ili aktivirani kod raka, čija inhibicija smanjuje ćelijsku replikaciju.

[0261] U nekim otelotvorenjima, antitela predmetnog pronalaska mogu se koristiti pre, istovremeno sa ili posle Velcade® (bortezomib) tretmana.

Primeri

[0262] Primeri su dati u nastavku da ilustruju predmetni pronalazak. Ovi primeri nisu zamišljeni da ograniče predmetni pronalazak na bilo koju određenu primenu ili teoriju rada. Za sve položaje konstantnih regiona koji se razmatraju u predmetnom pronalasku, numeracija je prema EU indeksu kao kod Kabata (Kabat i dr., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., United States Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda). Stručnjaci u oblasti antitela će razumeti da se ova konvencija sastoji od nesekvencijalne numeracije u specifičnim regionima sekvence imunoglobulina, što omogućava normalizovanu referencu na sačuvane položaje u porodicama imunoglobulina. Shodno tome, položaji bilo kog imunoglobulina definisani EU indeksom neće nužno odgovarati svojoj sekvencijalnoj sekvenci.

2

PRIMER 1. Prototip „trostrukog F“ bispecifičnog antitela.

[0263] Predmetni pronalazak opisuje nove sastave imunoglobulina koji ko-zahvataju prvi i drugi antigen. Jedan teški lanac antitela sadrži jednolančani Fv („scFv“, kako je ovde definisano), i drugi teški lanac je „pravilnog“ Fab oblika, koji sadrži varijabilni teški i laki lanac (pogledati Sliku 8B). Ova struktura se ponekad ovde naziva „trostrukim F“ oblikom (scFv-Fab-Fc). Dva lanca spojena su dimernim Fc regionom. Fc region može biti modifikovan supstitucijom aminokiselinama kako bi se omogućilo efikasno prečišćavanje „trostrukog F“ heterodimera. Dalje, Fc region može biti modifikovan supstitucijom aminokiselinama kako bi se pospešilo stvaranje „trostrukog F“ heterodimera. Primeri Fc supstitucija opisani su detaljnije u nastavku.

[0264] Fc supstitucije mogu biti uključene u oblik „trostrukog F“ kako bi se omogućilo efikasno prečišćavanje željenog „trostrukog F“ heterodimera preko neželjenih dualnih scFv-Fc i mAb homodimera. Primer toga je uključivanje Fc supstitucija koje menjaju izoelektričnu tačku (pI) svakog monomera tako da svaki monomer ima različitu pI. U ovom slučaju će željeni „trostruki F“ heterodimer imati drugačiji pI od onog kod neželjenih dualnih scFv-Fc i mAb homodimera, omogućavajući tako izoelektrično prečišćavanje „trostrukog F“ heterodimera (npr. kolona anjonske razmene, kolona katjonske razmene). Ove supstitucije takođe pomažu u određivanju i nadgledanju kontaminirajućih dvostrukih scFv-Fc i mAb homodimera posle čišćenja (npr. IEF gelovi, cIEF i analitičke IEX kolone). Pogledati Sliku 6A za spisak supstitucija koje se mogu načiniti u Fc monomeru 1 i Fc monomeru 2 kako bi se omogućilo efikasno prečišćavanje željenog „trostrukog F“ heterodimera.

[0265] Fc supstitucije mogu biti uključene u oblik „trostrukog F“ kako bi se „zakrivilo“ formiranje prema željenom „trostrukom F“ heterodimeru od neželjenih dualnih scFv-Fc i mAb homodimera. Na primer, pogledati Sliku 6 za spisak supstitucija koje se mogu načiniti u Fc monomeru 1 i Fc monomeru 2 kako bi se „zakrivilo“ proizvodnja ka „trostrukom F“ heterodimeru. Supstitucije aminokiselina navedene na Slici 6 mogu se kombinovati, što dovodi do povećanog prinosa „trostrukog F“ heterodimera koji se može lako očistiti od bilo kog kontaminirajućeg dualnog scFv-Fc i mAb homodimera.

[0266] Nakon optimizacije scFv domena radi uključivanja u „trostruki F“ oblik, optimizovani scFv domen može se na pogodan način povezati sa raznim standardnim teškim lancima antitela. Na primer, anti-CD3 scFv za regrutovanje citotoksičnosti T ćelija može biti povezan sa različitim teškim lancima antitela anti-tumorskog antigena (npr. ona koji vezuju CD5, CD20, CD30, CD40, CD33, CD38, EGFR, EpCAM, Her2, HM1.24, ili drugi tumorski antigen). Dalji primeri optimizovanih scFv domena koji se mogu povoljno povezati sa standardnim teškim lancima antitela uključuju anti-CD 16 scFv za prirodnu citotoksičnost ćelija ubica; anti-CD32b scFv za inhibitornu aktivnost (ovde bi se teški lanac povezanog antitela vezao, na primer, CD19, CD40, CD79a, CD79b ili drugi imuni receptori); i antitransferin receptor scFv, anti-insulin receptor ili anti-LRP1 za transport preko krvno-moždane barijere.

PRIMER 2. Multi-specifična antitela izvedena iz „trostrukog F“ oblika.

[0267] Multi-specifična antitela mogu se konstruisati vezujući dodatne scFv ili Fab domene koji vezuju treći antigen na C-terminus jednog od „trostrukih F“ teških lanaca. Alternativno, C-terminalni scFv ili Fab mogu da vezuju prvi ili drugi antigen, dajući tako bivalencu i povećanje ukupnog afiniteta vezivanja za taj antigen.

[0268] Multi-specifična antitela se takođe mogu konstruisati spajanjem scFv-Fc teškog lanca „trostrukog F“ oblika sa preuređenim teškim lancima antitela. Takvi preuređeni teški lanci mogu da obuhvataju dodatni Fv region koji vezuje treći antigen ili dodatni Fv region koji vezuje prvi antigen ili drugi antigen, na taj način dajući bivalencu i povećanje ukupnog afiniteta vezivanja za taj antigen.

PRIMER 3. Anti-CD 19 Fab x anti-CD3 scFv „trostruki F“ bispecifik.

[0269] Aminokiselinske sekvence za anti-CD 19 Fab x anti-CD3 scFv „trostruke F“ bispecifike navedene su na slikama. Podvlačenja aminokiselina su napravljena da omoguće efikasno prečišćavanje željenog „trostrukog F“ heterodimera preko neželjenih dualnih scFv-Fc i mAb homodimera. Neki primeri eksprimiranja i prečišćavanja željenih vrsta „trostrukog F“ i njegove bioaktivnosti su navedeni u nastavku.

[0270] Proizvodnja XENP 11874, „trostrukog F“ bispecifika sa anti-CD 19 Fab i anti-CD3 scFv, prikazana je na Slici 9 od WO 2014/110601. Na Slici 9A, prikazano je prečišćavanje jonsko-izmenjenog gena željenog „trostrukog F“ heterodimera od neželjenih dualnih scFv-Fc i mAb homodimera. Čistoća „trostrukog F“ fragmenta proverena je IEF gelom (podaci prikazani na Slici 9B od WO 2014/110601). Konačno, SEC je korišćen za potvrđivanje homogene veličine „trostrukog F“ proizvoda (podaci prikazani na Slici 9C od WO

2014/110601.

4

[0271] Pokazano je da XENP11874, anti-CD19 Fab x anti-CD3 scFv „trostruki F“ bispecifik ima snažnu bioaktivnost. Sposobnost XENP 11874 da potencira T ćelije za osiromašenje B ćelija prikazana je na Slici 10 od WO 2014/110601.

[0272] Proizvodnja XENP 11924, „trostrukog F“ bispecifika sa anti-CD 19 Fab i anti-CD3 scFv, prikazana je na Slici 11 od WO 2014/110601. Na Slici 11A od WO 2014/110601, prikazano je prečišćavanje jonske razmene željenog „trostrukog F“ heterodimera od neželjenih dualnih scFv-Fc i mAb homodimera. Čistoća „trostrukog F“ fragmenta proverena je IEF gelom, prikazanim na Slici 11B (od WO 2014/110601). Konačno, SEC je korišćen za potvrđivanje homogene veličine „trostrukog F“ proizvoda (pogledati Slike 11C od WO 2014/110601).

[0273] Pokazano je da XENP11924, anti-CD 19 Fab x anti-CD3 scFv „trostruki F“ bispecifik imaju snažnu bioaktivnost. Sposobnost XENP11924 da potentnoregrutuje T ćelije za ubijanje Raji ćelijske linije tumora prikazana je na Slici 12 od WO 2014/110601.

PRIMER 4. Anti-CD38 Fab x anti-CD3 scFv „trostruki F“ bispecifik.

[0274] Aminokiselinske sekvence za anti-CD38 Fab x anti-CD3 scFv „trostruke F“ bispecifike navedene su na Slici 13 od WO 2014/110601. Podvlačenja aminokiselina napravljena su da omoguće efikasno prečišćavanje željenog „trostrukog F“ heterodimera od neželjenih dualnih scFv-Fc i mAb homodimera. Neki primeri eksprimiranja i prečišćavanja željenih vrsta „trostrukog F“ i njegove bioaktivnosti su navedeni u nastavku.

[0275] Proizvodnja XENP11925, „trostrukog F“ bispecifika sa anti-CD38 Fab i anti-CD3 scFv, prikazana je na Slici 14 od WO 2014/110601. Na slici 14A od WO 2014/110601, prikazano je prečišćavanje jonske razmene željenog „trostrukog F“ heterodimera od neželjenih dvostrukih scFv-Fc i mAb homodimera. Čistoća „trostrukog F“ fragmenta je proverena pomoću IEF gela, prikazanog na Slici 14B od WO 2014/110601. Konačno, SEC je korišćen za potvrđivanje homogene veličine „trostrukog F“ proizvoda (pogledati Sliku 14C WO 2014/1106018.

[0276] Pokazano je da XENP11925, anti-CD38 Fab x anti-CD3 scFv „trostruki F“ bispecifik ima snažnu bioaktivnost. Sposobnost XENP 11925 da snažno regrutuje T ćelije za ubijanje ćelijskih linija RPMI8226 prikazana je na Slici 15 WO 2014/110601.

PRIMER 5. Identifikacija i popravljanje destabilizujućih varijanti izotipskih konstantnih regiona koji menjaju PI.

[0277] Kao što je gore opisano, mogu se uložiti napori da se minimizuje rizik da supstitucije koje povećavaju ili smanjuju pI izazovu imunogenost korišćenjem izotipskih razlika između IgG potklasa (IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4). Na osnovu ovog principa konstruisan je novi skup novih izotipa. Ove nove varijante nazivaju se ISO(-), ISO(+), i ISO(+RR). Termička stabilnost ovih novih izotipova je određena u Zglob-CH2-CH3 (H-CH2-CH3) sistemu (samo Fc region). Proteini su eksprimirani i prečišćeni kao što je gore opisano.

[0278] Merenja termičke stabilnosti određena diferencijalnom skenirajućom kalorimetrijom (DSC) otkrila su da je ISO(-)/ISO(+RR) heterodimer (XENP12488) bio manje stabilan od IgG1 divljeg tipa (XENP8156). Naknadni inženjerski napori identifikovali su N384S/K392N/M397V supstitucije u teškom lancu ISO(-) kao izvor destabilizacije. Kao rezultat, konstruisana je i testirana varijanta označena kao ISO(-NKV). U ovoj varijanti, položaji 384, 392 i 397 su vraćeni u IgG1 divljeg tipa (S384N/N392K/M397V). Termička stabilnost ISO(-NKV)/ISO(+RR) heterodimera(XENP12757) je izmerena pomoću DSC i utvrđeno je da je ekvivalentna IgG1 divljeg tipa. Ovaj rezultat podvlači važnost izabiranja ili neizabiranja određenih pI-menjajućih izotipskih supstitucija, kako bi se izbegle one koje se destabilizuju.

PRIMER 6. Dodatne Fc varijante koje zakrivljuju heterodimere.

[0279] Kao što je prethodno opisano, Fc varijante koje zakrivljuju heterodimere mogu biti napravljene da budu pristrasne prema stvaranju željenog heterodimera nasuprot neželjenim homodimerima. Dodatne Fc varijante koje zakrivljuju heterodimere L368D/K370S-S364K/E357Q (XENP12760, pogledati Slika 7 za redosled) su konstruisane i testirane u sistemu Zglob-CH2-CH3 (samo za Fc region). Protein je eksprimiran i prečišćen kao što je gore opisano.

[0280] Proteini prisutni posle samo jednog standardnog koraka prečišćavanja proteina ispitivani su tečnom hromatografijom visokih performansi (HPLC) korišćenjem kolone za katjonsku razmenu (CIEX) (pogledati Sliku 34). Ovo je omogućilo određivanje prinosa željenog heterodimera u odnosu na neželjene homodimere. Prisustvo varijante L368D/K370S-S364K/E357Q (XENP 12760, Slika 34), donji panel) unelo je ekstremnu pristranost prema željenom formiranju heterodimera u poređenju sa nepostojanjem ove varijante (XENP12757, Slika 34, gornji panel). Treba imati na umu da je prinos heterodimera 95,8% kod varijante L368D/K370S-S364K/E357Q nasuprot samo 52,7% bez.

[0281] Takođe su konstruisane i testirane dodatne Fc varijante koje zakrivljuju heterodimere. Slika 10 daje listu konstruisanih Fc varijante koje zakrivljuju heterodimere sa prinosima heterodimera (određenim pomoću HPLC-CIEX) i toplotnom stabilnošću (određeno pomoću DSC). Posebno je poželjna varijanta L368D/K370S-S364K/E357Q sa visokim prinosom heterodimera i visokom termičkom stabilnošću.

PRIMER 7. Dodatne Fc varijante koje zakrivljuju heterodimere u kontekstu Fab-scFv-Fc.

[0282] L368D/K370S-S364K/E357Q Fc varijante koje zakrivljuju heterodimere konstruisane su u anti-CD19 x anti-CD3 Fab-scFv-Fc (pogledati Sliku 15 za aminokiselinske sekvence). Kontrolnom Fab-scFv-Fc XENP 13228 nedostajale su ove Fc varijante koje zakrivljuju heterodimere. Proteini prisutni nakon samo jednog standardnog koraka prečišćavanja proteina ispitivani su izoelektričnim fokusirajućim gelom (IEF). Ovo je omogućilo određivanje prinosa željenog heterodimera u odnosu na neželjene homodimere. Prisustvo L368D/K370S-S364K/E357Q varijante(XENP13122, Slika 22, desna traka) uvelo je ekstremnu pristranost prema željenom formiranju heterodimera (središnji opseg) u poređenju sa nepostojanjem ove varijante (XENP13228, Slika 22, leva traka).

Primer 8. Konstruisanje anti-CD38 x anti-CD3 bispecifičnih antitela

[0283] Anti-CD38 antitelo OKT10 je humanizovano optimizacijom sadržaja ljudskih nizova (Lazar i dr., Mol. Immunol., (2007), 44: 1986-1998), i stvoren je bispecifični molekul koji sadrži humanizovani anti-CD38 Fv i anti-CD3 domen (Slika 37). Željeni segmenti gena sintetizovani su od strane Blue Heron Biotechnologies (Bothell, WA) iz sintetičkih oligonukleotida i PCR proizvoda automatskom sintezom gena. Konstrukti antitela u pTT5 vektoru su eksprimirani u ćelijama 293E i prečišćeni standardnim Proteinom A, nakon čega je usledila IEX hromatografija primenom GE HiTrap SP kolone razmene katjona kako bi se izolovao željeni heterodimerni bispecifik. Fc domeni antitela sadrže heterodimerni Fc region kako bi se olakšalo efikasno prečišćavanje bispecifičnih molekula. Afinitet bispecifika za CD38 je poboljšan pretraživanjem biblioteke varijanti Fv regiona na SPR korišćenjem Biacore 3000 (Slika 38).

Primer 9. In vitro svojstva anti-CD38 x anti-CD3 bispecifičnih antitela

[0284] Optimizovani bispecifični molekuli su ispitivani za svoju sposobnost ubijanja RPMI8226 ćelija multiplog mijeloma (MM) u LDH testu citotoksičnosti preusmerenih T-ćelija (Slika 13) i u Aneksin V+ RTCC testu koristeći različite odnose T-ćelija:RPMI8226 (Slika 14). Optimizovani molekuli su takođe procenjeni za unakrsnu reaktivnost na cinomolgus anti-CD38 korišćenjem testa direktnog vezivanja (Slika 16). Tabela koja sažima različita svojstva optimizovanih molekula Anti-CD38 x Anti-CD3 bispecifika prikazana je na Slici 15.

Primer 10. Ubijanje ćelija ljudske plazma pomoću Anti-CD38 x anti-CD3 bispecifika kod huPBMC-graftovanih SCID miševa

[0285] Optimizovani bispecifični molekuli su ispitivani za svoju sposobnost ubijanja ćelija ljudske plazme u SCID modelu huPBMC-graftovanih SCID miševa. Grupe od po 10 miševa tretirane su sa α-ASGM1 kako bi se osiromašene SCID NK ćelije na Dan 0, nakon čega je usledilo graftovanje 3 x 107 ljudskih PBMC na Dan 1. Grupe su randomizovane na osnovu ukupnog nivoa IgG na Dan 4. Molekuli Anti-CD38 x Anti-CD3 bispecifika ili kontrolne tablete dozirani su na Dane 7 i 15 nakon graftovanja PBMC. IgG2, IgE i IgM titri su određeni na Dane 14 i 21. Daratumumab (anti-CD38 IgG1 antitelo) je uključen kao kontrola u dozi od 5 mg/kg. Primećena su značajna smanjenja ljudskih Ig izotipa kod molekula Anti-CD38 x Anti-CD3 bispecifika u poređenju sa daratumumabom. (Slike 17 i 18).

Primer 11. Osiromašenje CD38+ CD138+ ćelija kod pacijenata sa multiplim mijelomom PBMC pomoću Anti-CD38 x Anti-CD3 bispecifičnih antitela

[0286] PBMC od dva MM davaoca se inkubira sa 1 µg/mL molekula Anti-CD38 x Anti-CD3 bispecifika tokom 24 sata i prebrojavaju se ćelije. CD38+CD138+ ćelije iz unapred zatvorenih živih ćelija (sortirane prema FSC vs SSC) su prebrojane i događaji su normalizovani u odnosu na kontrolu tretiranu sa PBS. Bispecifici su bili u stanju da potentno osiromaše MM ćelije pri ovoj koncentraciji.

PRIMER 12. Aminokiseline i DNK sekvence za anti-CD38 x anti-CD3 bispecifike.

[0287] Aminokiselinske sekvence za anti-CD38 x anti-CD3 bispecifike XENP13243 i XENP13551 navedene su na Slici 20B i 20J, respektivno.

PRIMER 13. Generisanje stabilne grupe anti-CD38 x anti-CD3 bispecifika u jajnim ćelijama kineskog hrčka (CHO).

[0288] Jajne ćelije kineskog hrčka (CHO) transficirane su sa DNK koja kodira XENP13243 i XENP 13551 kako bi se generisale paralelne stabilne grupe prema odnosima navedenim na Slici 25 koristeći Selexis-ovu vlasničku SURE Technology Platform™. Transficirana DNK sastojala se od monocistronskih vektora koji sadrže DNK navedenu na Slici 23. Ćelije stabilne grupe su kultivisane 7 dana u epruvetama od 10 mL, i na Dan 7 ekstrahovano je 5 mL supernatanta kulture, prečišćeno protein A afinitetnom hromatografijom, i analizirano hromatografijom razmene katjona. Kako su mogući proteini koji se mogu generisati konstruisani tako da imaju različite izoelektrične tačke, hromatografija razmene katjona omogućila je analizu koje proteinske vrste luče CHO ćelije u zavisnosti od različitih odnosa DNK. Slika 24 katalozira hromatograme katjonske razmene za svaki od navedenih DNK odnosa navedenih na Slici 25 i za XENP13243 i za XENP13551. Pod uslovima korišćenim za analizu hromatografije razmene katjona, HC-Fab homodimeri eluiraju na ∼15 min; željeni heterodimerni bispecifici eluiraju na ~22 min; HC-scFv monomeri eluiraju na ∼26 min; i HC-scFv homodimeri eluiraju na -29 min. Sažetak količina različitih proteinskih vrsta naveden je na Slici 26.

[0289] Iznenađujuće, formiranje heterodimera može da se pokrene odnosima transfekcije tri nukleinske kiseline u ćeliji domaćinu (HC-scFv, HC i LC). Nekoliko odnosa transfekcije DNK pružilo je formiranje poželjnog bispecifičnog heterodimera u količinama višim od 80% ukupnog materijala prečišćenog proteina A. Poželjni odnosi za formiranje više od 80% heterodimera su 1:1,5:1,5, 1:2:1,5, 1:0,667:2, 1:1:2, 1:1,5:2 i 1:2:2 (svi navedeni kao HC-Fab:HC-scFv:LC). Neki odnosi DNK pružali su formiranje poželjnog bispecifičnog heterodimera u količinama višim od 90%. Poželjni odnosi za stvaranje više od 90% heterodimera su 1:1,5:1,5, 1:2:1,5, 1:1:2 i 1:2:2 (svi navedeni kao HC-Fab: HC-scFv: LC). Jedan odnos DNK pružio je formiranje poželjnog bispecifičnog heterodimera u količini većoj od 95%. Naročito poželjan odnos za formiranje više od 95% heterodimera je 1:2:2 (naveden kao HC-Fab: HC-scFv: LC).

PRIMER 14. Farmakokinetika Anti-CD38 x Anti-CD3 bispecifika kod C57BL/6 miševa.

[0290] C57BL/6 miševima (n = 5 po grupi) primenjene su pojedinačne 2 mg/kg intravenske doze Anti-CD38 x Anti-CD3 bispecifika XENP13243 i XENP 13551. Miševima je odstranjena orbitalna sinusna punkcija (OSP) na 1 sat i na 1, 3, 6, 10, 14, 17 i 21 dana nakon primene testiranog predmeta, i krv je obrađena u serum za utvrđivanje nivoa u testiranom predmetu. Koncentracije u serumu su određene imunološkom analizom i prikazane su na Slici 27. Poluživot testiranog predmeta je određen pomoću modula za ne-komparmentalnu analizu od Phoenix WinNonlin 6.3. Poluživot je naveden na Slici 55. Obratiti pažnju da je uključivanje Fc regiona u dizajn bispecifika rezultovalo poluživotom uporedivim sa tipičnim monoklonskim antitelima. Tipični bispecifični proizvodi koji ne sadrže Fc, poput BiTE ili DART oblika, imaju mnogo kraći poluživot u redu veličine koji se meri satima.

Primer 15. Citotoksičnosti preusmerenih T-ćelija od CD38+ RPMI8226 ćelija posredovana anti-CD38 x anti-CD3 bispecificima.

[0291] Anti-CD38 x anti-CD3 bispecifici XENP13243 i XENP13551 korišćeni su za posredovanje citotoksičnosti preusmerenih T-ćelija od CD38+ RPMI 8226 ćelija. Analiza se sastojala od 24 sata inkubacije na 37°C od 10.000 RPMI 8226 ćelija sa 400.000 prečišćenih ljudskih T ćelija. Očitavanje citotoksičnosti obavljeno je laktat dehidrogenazom (LDH). Rezultati su prikazani na Slikama.

PRIMER 16. Afiniteti vezivanja Anti-CD38 x Anti-CD3 bispecifika.

[0292] Merenja površinske rezonance plazmona pomoću Biacore 3000 obavljena su na osnovu afiniteta XENP13243 i XENP13551 za ljudski i cino CD38 i CD3. Korišćeni su standardni postupci, i kinetički parametri su određivani pomoću BIAevaluation softvera. Rezultati su navedeni na Slikama.

PRIMER 17. Osiromašenje CD38+ ćelija kod cinomolgus majmunima sa anti-CD38 x anti-CD3 bispecificima.

[0293] Šest grupa cinomolgus majmuna (n = 2 po grupi) primilo je intravenoznom infuzijom XENP13243 ili XENP13551. Dve doze su primenjene po majmunu, sa razmakom od 3 nedelje. Početne doze su bile 5, 50 i 500 ng/kg, i sekundarne doze su bile 2, 5, i 20 µg/kg. Primećeno je osiromašenje CD20-CD38+ ćelija na način koji zavisi od doze (pogledati Sliku 30). Dokazi regrutovanja T ćelija videli su se u regulaciji na gore CD69 na CD8+ T ćelijama (pogledati Sliku 30).

Claims

Patentni zahtevi 1. Heterodimerno antitelo koje sadrži: a) prvi teški lanac koji sadrži: i) prvu varijantu Fc domena; ii) jednolančani Fv region (scFv) koji vezuje CD3; i b) drugi teški lanac koji sadrži: i) drugu varijantu Fc domena; i ii) prvi varijabilni teški domena; i c) prvi laki lanac koji sadrži prvi varijabilni laki domen i prvi konstantni laki domen; gde se navedeni prvi varijabilni teški domen i navedeni prvi varijabilni laki domen vezuju za CD38 i gde su drugi teški lanac i prvi laki lanac izabrani od parova koji se sastoje od
2. Heterodimerno antitelo prema patentnom zahtevu 1, gde navedeni prvi teški lanac i navedeni prvi laki lanca jesu H1: EVQLVESGGG LVQPGGSLRLSCAASG FDFSRSWM NWVRQAPG KG LEWVSEIN PDSSTINYATSVKGRFTISRDNSKNTLYLQM NSLRAE DTAVYYCARYG NWFPYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSW NSGALTSGVHTF PAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSDTKVDKKVEPKSCDKTHTCPP CPAPPVAGPSVFL FPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVKH EDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEEYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKG QPREPQVYTLPPSRE EMTKNQVSLTCDVSGFYPSDIAVEWESDGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVD KSRWEQGDVFSC SVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK i L1.24:
3. Heterodimerno antitelo prema patentnom zahtevu 1 ili patentnom zahtevu 2, gde navedeni scFv ima naelektrisan scFv veznik.
4. Heterodimerno antitelo prema patentnom zahtevu 3, gde navedeni naelektrisan scFv veznik ima pozitivno naelektrisanje od 3 do 8, i izabran je iz grupe koju čine IRPRAIGGSKPRVA, GKGGSGKGGSGKGGS, GGKGSGGKGSGGKGS, GGGKSGGGKSGGGKS, GKGKSGKGKSGKGKS, GGGKSGGKGSGKGGS, GKPGSGKPGSGKPGS, GKPGSGKPGSGKPGSGKPGS, i GKGKSGKGKSGKGKSGKGKS.
5. Heterodimerno antitelo prema patentnom zahtevu 1-4, gde prvi teški lanac sadrži sekvencu
6. Sastav nukleinske kiseline koji sadrži: a) prvu nukleinsku kiselinu koja kodira prvi teški lanac prema patentnom zahtevu 1; b) drugu nukleinsku kiselinu koja kodira drugi teški lanac prema patentnom zahtevu 1; i c) treću nukleinsku kiselinu koja kodira prvi laki lanac prema patentnom zahtevu 1; ili a) prvi vektor eksprimiranja koji sadrži prvu nukleinsku kiselinu koja kodira prvi teški lanac prema patentnom zahtevu 1; b) drugi vektor eksprimiranja koji sadrži drugu nukleinsku kiselinu koja kodira drugi teški lanac prema patentnom zahtevu 1; i c) treći vektor eksprimiranja koji sadrži treću nukleinsku kiselinu koja kodira prvi laki lanac prema patentnom zahtevu 1.
7. Ćelija domaćin koja sadrži sastav nukleinske kiseline patentnog zahteva 7.
8. Postupak proizvodnje heterodimernog antitela prema patentnom zahtevu 1 do 5, koji obuhvata: a) pružanje prvog vektora eksprimiranja koji sadrži prvu nukleinsku kiselinu koja kodira drugi teški lanac, koji obuhvata: i) drugu varijantu Fc domena; ii) prvi varijabilni teški lanac; i b) pružanje drugog vektora eksprimiranja koji sadrži drugu nukleinsku kiselinu koja kodira prvi teški lanac, koji obuhvata: i) prvu varijantu Fc domena; i ii) jednolančani Fv region (scFv) koji vezuje CD3; i c) pružanje trećeg vektora eksprimiranja koji sadrži treću nukleinsku kiselinu koja kodira prvi laki lanac; gde navedeni prvi varijabilni teški domen i varijabilni laki domen navedenog prvog lakog lanca vezuju CD38; d) gde su navedeni prvi, drugi i treći vektori eksprimiranja transficirani u ćelije domaćina u odnosu odabranom iz grupe koju čine 1:1,5:1,5, 1:2:1,5, 1:0,667:2, 1:1:2, 1:1.5:2, i 1:2:2 ; e) eksprimiranje navedene prve, druge i treće nukleinske kiseline u navedenim ćelijama domaćina kako bi se proizvele prva, druga i treća aminokiselinska sekvenca, respektivno, tako da navedena prva, druga i treća aminokiselinska sekvenca formiraju navedeno heterodimerno antitelo.
9. Postupak prema patentnom zahtevu 8, koji dalje obuhvata (f) formulisanje heterodimernog antitela u farmaceutski sastav.
10. Heterodimerno antitelo prema patentnom zahtevu 1 do 5 za upotrebu u terapiji.
11. Farmaceutski sastav koji sadrži heterodimerno antitelo prema patentnom zahtevu 1 do 5.