ES2983344T3 - Moduladores de enzimas modificadoras de metilo, composiciones y usos de los mismos - Google Patents

Abstract

Se proporcionan nuevos compuestos de Fórmula (I): y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, que son útiles para tratar una variedad de enfermedades, trastornos o afecciones, asociadas con enzimas modificadoras de metilo. También se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden los nuevos compuestos de Fórmula (I), sales farmacéuticamente aceptables de los mismos y métodos para su uso en el tratamiento de una o más enfermedades, trastornos o afecciones, asociadas con enzimas modificadoras de metilo. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Moduladores de enzimas modificadoras de metilo, composiciones y usos de los mismos

ANTECEDENTES

La cromatina eucariótica está compuesta de complejos macromoleculares denominados nucleosomas. Un nucleosoma tiene 147 pares de bases de ADN envueltos alrededor de un octámero de proteína que tiene dos subunidades de cada una de las proteínas histonas H2A, H2B, H3 y H4. Las proteínas histonas están sujetas a modificaciones postraduccionales que a su vez afectan a la estructura de la cromatina y la expresión génica. Un tipo de modificación postraduccional que se encuentra en las histonas es la metilación de los residuos de lisina y arginina. La metilación de histonas juega un papel fundamental en la regulación de la expresión génica en eucariotas. La metilación afecta a la estructura de la cromatina y se ha relacionado tanto con la activación como con la represión de la transcripción (Zhang y Reinberg, Genes Dev. 15:2343-2360, 2001). Las enzimas que catalizan la unión y eliminación de grupos metilo de las histonas están implicadas en el silenciamiento de genes, el desarrollo embrionario, la proliferación celular y otros procesos.

Una clase de histona metilasas se caracteriza por la presencia de un dominio SET, que comprende aproximadamente 130 aminoácidos. EZH2 es un ejemplo de un dominio SET humano que contiene metilasa. EZH2 se asocia con EED (siglas inglesas de desarrollo de ectodermo embrionario) y SUZ12 (supresor del homólogo de zeste 12) para formar un complejo conocido como PRC2 (siglas inglesas de complejo represivo 2 del grupo Polycomb) que tiene la capacidad de trimetilar la histona H3 en la lisina 27 (Cao y Zhang, Mol. Cell 15:57-67, 2004). Los complejos PRC2 también pueden incluir subunidades RBAP46 y RBAP48. Otro ejemplo es la metilasa relacionada EZH1.

Las actividades oncogénicas de EZH2 han sido demostradas por un cierto número de estudios en diversos tipos de cáncer diferentes. ~15-20 % de GCB-DLBCLs albergan una mutación de ganancia de función en EZH2 (residuo Y641) y estas células son hipersensibles a la inhibición de EZH2 tantoin vitrocomoin vivo(McCabe et al, 2012; Bradley et al, 2014). En experimentos con líneas celulares, la sobre-expresión de EZH2 induce la invasión celular, el crecimiento en agar blando y la motilidad, mientras que la reducción de EZH2 inhibe la proliferación celular y la invasión celular (Kleer et al., 2003, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 100:11606-11611; Varambally et al., (2002), "The polycomb group protein EZH2 is involved in progression of prostate cancer," Nature 419, 624-629). Se ha demostrado que EZH2 reprime la expresión de varios supresores de tumores, incluidos E-cadherina, DAB2IP y RUNX3, entre otros. En modelos de xenoinjerto, la reducción de EZH2 inhibe el crecimiento del tumor y la metástasis. Se ha demostrado que la modulación descendente de EZH2 en modelos murinos bloquea la metástasis del cáncer de próstata (Min et al., "An oncogenetumor suppressor cascade drives metastatic prostate cancer by coordinately activating Ras and nuclear factorkappaB," Nat Med. marzo de 2010; 16(3):286-94). Recientemente, se demostró que EZH2 está sobre-expresado en tumores neuroendocrinos y la inhibición de EZH2 en tumores de ratón restablece la dependencia de andrógenos (Ku et al, Science, 355, 2017). La sobre-expresión de EZH2 se asocia con la agresividad de determinados cánceres tales como el cáncer de mama (Kleer et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 100:11606-11611,2003). Estudios recientes también sugieren que el gen de fusión oncogénico específico del cáncer de próstata TMPRSS2-ERG induce programas epigenéticos represivos a través de la activación directa de EZH2 (Yu et al., "An Integrated Network of Androgen Receptor, Polycomb, and TMPRSS2-ERG Gene Fusions in Prostate Cancer Progression," Cancer Cell. 18 de mayo de 2010; 17(5):443-454). El documento US2017/0073335 A1 se refiere a un compuesto con un efecto inhibidor sobre la actividad de EZH1 y/o EZH2.

Dado su papel en la regulación de diversos procesos biológicos, las enzimas modificadoras de metilo, en particular EZH2 y sus formas mutantes, son objetivos atractivos para la modulación.

SUMARIO

La invención reivindicada se define en las reivindicaciones adjuntas. Específicamente, lo que se reivindica es un compuesto de FórmulaIVoVI:

R1 es -SCH<3>o cloro;

X es CH;

Ra es hidrógeno, alquilo (C<1>-C<4>) o haloalquilo (C<1>-C<4>);

Rb es alquilo (C<1>-C<4>), haloalquilo (C<1>-C<4>) o heterociclilo de 4-7 miembros, en donde dicho heterociclilo está opcionalmente sustituido con 1 a 3 grupos seleccionados de halo, alquilo (C<1>-C<4>), haloalquilo (C<1>-C<4>), alcoxi (C<1>-C<4>) y haloalcoxi (C<1>-C<4>); o

Ra y Rb, junto con el átomo de nitrógeno al que están fijados, forman un heterociclilo de 4-7 miembros opcionalmente sustituido con 1 a 3 grupos seleccionados de halo, alquilo (C<1>-C<4>), haloalquilo (C<1>-C<4>) y -ORc; Rc es alquilo (C<1>-C<4>), haloalquilo (C<1>-C<4>) o cicloalquilo (C<3>-C<7>); y

R6 es haloalquilo (C<1>-C<4>).

También se reivindican composiciones farmacéuticas que comprenden estos compuestos, así como el uso de los compuestos en el tratamiento del cáncer como se define en las reivindicaciones adjuntas.

Los autores de la invención han descubierto que estos y otros compuestos descritos en esta memoria, y composiciones farmacéuticamente aceptables de los mismos, modulan la actividad de EZH2 (véase, p. ej., laTabla 5).Compuestos de este tipo incluyen los de Fórmula estructuralI:

o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, en donde cada uno de R1, R2, R3, R4, R5 y X se definen en esta memoria.

En un aspecto, también se ha encontrado que determinados compuestos descritos en esta memoria tienen un tiempo de permanencia incrementado (p. ej., > 100 horas) y una permeabilidad potenciada. Se ha encontrado que un aumento en el tiempo de permanencia (es decir, una tasa de eliminación más lenta) y/o la permeabilidad se correlaciona con una potencia celular mejorada.

Los compuestos descritos, sales farmacéuticamente aceptables y composiciones farmacéuticamente aceptables son útiles para tratar una diversidad de afecciones asociadas con enzimas modificadoras de metilo. Estas condiciones incluyen, p. ej., uno o más cánceres.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

1. Descripción General de Compuestos

Se proporcionan compuestos de FórmulaI:

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde:

R1 es halo, -Salquilo (C<1>-C<4>), -Scicloalquilo (C<3>-C<7>) o -S[haloalquilo (C<1>-C<4>)];

X es CH o N;

R2 es hidrógeno, halo, alquilo (C<1>-C<4>) o haloalquilo (C<1>-C<4>);

R3 es halo, alquilo (C<1>-C<4>) o haloalquilo (C<1>-C<4>);

R<4>es cicloalquilo (C<3>-C<7>) o heterociclilo de 4-7 miembros, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido con 1 a 3 grupos seleccionados de halo, alquilo (C<1>-C<4>), haloalquilo (C<1>-C<4>), alcoxi (C<1>-C<4>), haloalcoxi (C<1>-C<4>) y -NR<a>R<b>;

R<a>es hidrógeno, alquilo (C1-C4) o alquilo (C<1>-C<4>);

R<b>es alquilo (C<1>-C<4>), haloalquilo (C<1>-C<4>) o heterociclilo de 4-7 miembros, en donde dicho heterociclilo está opcionalmente sustituido con 1 a 3 grupos seleccionados de halo, alquilo (C<1>-C<4>), haloalquilo (C<1>-C<4>), alcoxi (C<1>-C<4>) y haloalcoxi (C<1>-C<4>); o

R<a>y R<b>, junto con el átomo de nitrógeno al que están fijados, forman un heterociclilo de 4-7 miembros opcionalmente sustituido con 1 a 3 grupos seleccionados de halo, alquilo (C<1>-C<4>), haloalquilo (C<1>-C<4>) y -OR<c>;

R<c>es alquilo (C<1>-C<4>), haloalquilo (C<1>-C<4>) o cicloalquilo (C<3>-C<7>); y

R<5>es halo, alquilo (C<1>-C<4>) o haloalquilo (C<1>-C<4>.

2. Definiciones

Cuando se utiliza en conexión para describir un grupo químico que puede tener múltiples puntos de fijación, un guión (-) designa el punto de fijación de ese grupo a la variable a la que está definido. Por ejemplo, -Scicloalquilo (C<3>-C<7>) y -S[haloalquilo (C<1>-C<4>)] significan que el punto de fijación de este grupo se produce en el átomo de azufre.

Los términos "halo" y "halógeno", tal como se utilizan en esta memoria, se refieren a un átomo seleccionado de flúor (fluoro, -F), cloro (cloro, -Cl), bromo (bromo, -Br) y yodo (yodo, -I).

El término "alquilo", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a un radical hidrocarburo monovalente saturado, de cadena lineal o ramificada, que tiene, a menos que se especifique lo contrario, 1 -10 átomos de carbono. Ejemplos de radicales alquilo incluyen, pero no se limitan a metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, iso-butilo, sec.-butilo, sec.-pentilo, iso-pentilo, terc.-butilo, n-pentilo, neopentilo, n-hexilo, sec.-hexilo y similares.

El término "haloalquilo" incluye grupos monohaloalquilo, polihaloalquilo y perhaloalquilo en los que los halógenos se seleccionan independientemente de entre flúor, cloro, bromo y yodo.

"Alcoxi" es un grupo alquilo que está fijado a otro resto mediante un enlazador de oxígeno (-O(alquilo)). Ejemplos no limitantes incluyen metoxi, etoxi, propoxi y butoxi.

"Haloalcoxi" es un grupo haloalquilo que está fijado a otro resto mediante un átomo de oxígeno tal como, p. ej., pero no limitado a -OCHCF<2>u -OCF<3>.

El término "cicloalquilo" se refiere a un sistema de anillos hidrocarbonados monocíclico de 3 a 12 miembros (p. ej., de 3 a 7 miembros), bicíclico (p. ej., un anillo puenteado o espirobicíclico) o policíclico (p. ej., tricíclico) que está completamente saturado. Grupos cicloalquilo monocíclicos incluyen, sin limitación, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, cicloheptilo y ciclooctilo. Grupos cicloalquilo bicíclicos puenteados incluyen, sin limitación, biciclo[3.2.1]octano, biciclo[2.2.1]heptano, biciclo[3.1.0]hexano, biciclo[1.1.1]pentano y similares. Grupos cicloalquilo espirobicíclicos incluyen, p. ej., espiro[3,6]decano, espiro[4,5]decano y similares. Anillos de cicloalquilo condensados incluyen, p. ej., decahidronaftaleno, octahidropentaleno y similares. Cuando se especifica que están opcionalmente sustituidos o sustituidos, los sustituyentes en un cicloalquilo (p. ej., en el caso de un cicloalquilo opcionalmente sustituido) pueden estar presentes en cualquier posición sustituible e incluyen, p. ej., la posición en la que está fijado el grupo cicloalquilo.

El término "heterociclilo" significa un anillo heterocíclico saturado o parcialmente insaturado de 3-12 miembros (p. ej., de 4, 5, 6 y 7 miembros) que contiene 1 a 4 heteroátomos seleccionados independientemente de N, O y S. Puede ser monocíclico, bicíclico (p. ej., un anillo puenteado, condensado o espirobicíclico) o tricíclico. Los términos "heterociclo", "heterociclilo", y las expresiones "anillo de heterociclilo", "grupo heterocíclico", "resto heterocíclico" y "radical heterocíclico" se utilizan indistintamente en esta memoria. Un anillo heterociclilo puede estar fijado a su grupo colgante en cualquier heteroátomo o átomo de carbono que dé como resultado una estructura estable. Ejemplos de radicales heterocíclicos saturados o parcialmente insaturados de este tipo incluyen, sin limitación, tetrahidrofuranilo, tetrahidrotienilo, terahidropiranilo, pirrolidinilo, piridinonilo, pirrolidonilo, piperidinilo, oxazolidinilo, piperazinilo, dioxanilo, dioxolanilo, morfolinilo, dihidrofuranilo, dihidropiranilo, dihidropiridinilo, tetrahidropiridinilo, dihidropirimidinilo, oxetanilo, azetidinilo y tetrahidropirimidinilo. Un grupo heterociclilo puede ser monocíclico o bicíclico. El término "heterociclilo" también incluye, p. ej., radicales heterocíclicos insaturados condensados a otro radical heterocíclico insaturado o anillo arilo o heteroarilo, tales como, por ejemplo, tetrahidronaftiridina, indolinona, dihidropirrolotriazol, imidazopirimidina, quinolinona, dioxaespirodecano. Cuando se especifica que están opcionalmente sustituidos o sustituidos, los sustituyentes en un heterociclilo (p. ej., en el caso de un heterociclilo opcionalmente sustituido) pueden estar presentes en cualquier posición sustituible e incluyen,p.ej.,la posición en la que está fijado el grupo heterociclilo.

El término "espiro" se refiere a dos anillos que comparten un átomo del anillo (p. ej., carbono).

El término "condensado" se refiere a dos anillos que comparten dos átomos del anillo adyacentes entre sí.

El término "puenteado" se refiere a dos anillos que comparten tres o más átomos del anillo entre sí.

Tal como se utiliza en esta memoria, "isómero geométrico" se refiere a isómeros que difieren en la orientación de los átomos sustituyentes en relación con un anillo cicloalquilo, es decir, isómeros cis o trans. Cuando un compuesto descrito se nombra o se representa por su estructura, sin indicar una forma de isómero geométrico cis o trans particular, se debe entender que el nombre o la estructura abarca un isómero geométrico libre de otros isómeros geométricos, mezclas de isómeros geométricos o mezclas enriquecidas en un isómero geométrico con respecto a su isómero geométrico correspondiente.

A menos que se especifique lo contrario, cuando la estereoquímica de un compuesto descrito se nombra o representa por su estructura, el estereoisómero nombrado o representado es al menos 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 99 % o 99,9 % en peso puro con respecto a todos los otros estereoisómeros. Cuando un único enantiómero se nombra o se representa por su estructura, el enantiómero representado o nombrado es al menos 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 99 % o 99,9 % en peso ópticamente puro. El porcentaje de pureza óptica en peso es la relación entre el peso del enantiómero sobre el peso del enantiómero más el peso de su isómero óptico. Los enantiómeros pueden resolverse mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo mediante formación de sales diastereoisoméricas que pueden separarse, por ejemplo, mediante cristalización; formación de derivados o complejos diastereoisoméricos que pueden separarse, por ejemplo, mediante cristalización, cromatografía líquida o de fluido supercrítico; reacción selectiva de un enantiómero con un reactivo específico de enantiómero, por ejemplo esterificación enzimática; o cromatografía líquida o de fluido supercrítico en un entorno quiral, por ejemplo sobre un soporte quiral, por ejemplo sílice con un ligando quiral unido o en presencia de un disolvente quiral. Enantiómeros específicos también se pueden sintetizar mediante síntesis asimétrica utilizando reactivos, sustratos, catalizadores o disolventes ópticamente activos, o convirtiendo un enantiómero en otro mediante transformación asimétrica.

A menos que se especifique lo contrario, cuando un compuesto descrito se nombra o representa por su estructura sin indicar la estereoquímica, y el compuesto tiene al menos un centro quiral o al menos un isómero geométrico, o ambos, el nombre o la estructura abarca un enantiómero o isómero geométrico del compuesto libre del isómero óptico o isómero geométrico correspondiente, una mezcla racémica del compuesto y mezclas enriquecidas en un enantiómero o isómero geométrico con respecto a su isómero óptico o isómero geométrico correspondiente.

A menos que se especifique lo contrario, cuando solo algunos de los centros estereoquímicos en un compuesto divulgado se representan o nombran por estructura, la configuración nombrada o representada se enriquece con respecto a las configuraciones restantes, por ejemplo, por un exceso molar de al menos 60 %, 70 % , 80 %, 90 %, 99 % o 99,9 %. Por ejemplo, la subestructura:

significa que la configuración alrededor del carbono quiral está estereoquímicamente enriquecida como R (p. ej., por un exceso molar de al menos 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 99 % o 99,9 %) y que la geometría alrededor del ciclohexilo puede ser cis o trans, o una mezcla de los mismos.

En determinados casos, un compuesto descrito se representa por su estructura sin indicar la estereoquímica, pero se identifica como estereoquímicamente enriquecido (p. ej., "enantiómero único; isómero geométrico único" o "enantiómero único" en casos en los que los isómeros geométricos no son posibles). Por ejemplo, a menos que se especifique lo contrario,

Ejemplo 1(enantiómero único; isómero geométrico único), significa que la configuración alrededor del carbono de dioxolanilo quiral está estereoquímicamente enriquecida como R (p. ej., por un exceso molar de al menos 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 99 % o 99,9 %) o está estereoquímicamente enriquecido como S (p. ej., por un exceso molar de al menos 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 99 % o 99,9 %) y que la configuración geométrica alrededor del anillo ciclohexilo está enriquecida como cis (p. ej., por un exceso molar de al menos 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 99 % o 99,9 %) o está enriquecido como trans (p. ej., por un exceso molar de al menos 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 99 % o 99,9 %).

El término "paciente", tal como se utiliza en esta memoria, significa un animal, tal como un mamífero, y tal como un ser humano. Los términos "sujeto" y "paciente" pueden utilizarse indistintamente.

La expresión "soporte farmacéuticamente aceptable" se refiere a un soporte, adyuvante o vehículo no tóxico que no destruye la actividad farmacológica del compuesto con el que se formula. Soportes, adyuvantes o vehículos farmacéuticamente aceptables que pueden utilizarse en las composiciones descritas en esta memoria incluyen, pero no se limitan a intercambiadores de iones, alúmina, estearato de aluminio, lecitina, proteínas séricas, tales como albúmina sérica humana, sustancias tampón tales como fosfatos, glicina, ácido sórbico, sorbato de potasio, mezclas de glicéridos parciales de ácidos grasos vegetales saturados, agua, sales o electrolitos, tales como sulfato de protamina, hidrógeno-fosfato de disodio, hidrógeno-fosfato de potasio, cloruro sódico, sales de zinc, sílice coloidal, trisilicato de magnesio, polivinil pirrolidona, sustancias a base de celulosa, polietilenglicol, carboximetilcelulosa sódica, poliacrilatos, ceras, polímeros de bloque de polietileno-polioxipropileno, polietilenglicol y grasa de lana.

Los términos "tratamiento", "tratar" y "tratando" se refieren a revertir, aliviar o inhibir el progreso de una enfermedad o trastorno, o uno o más síntomas del mismo, como se describe en esta memoria. El tratamiento también puede continuarse después de que los síntomas hayan desaparecido, por ejemplo para retrasar la recurrencia.

En este memoria, enfermedad, trastorno y afección se utilizan indistintamente.

La expresión "cantidad eficaz" o "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad de un compuesto descrito en esta memoria que provocará una respuesta biológica o médica de un sujeto, p. ej., una dosis de entre 0,01 - 100 mg/kg de peso corporal/día. Los términos "sujeto" y "paciente" pueden utilizarse indistintamente y significan un mamífero que necesita tratamiento,p. ej.,animales de compañía(p. ej.,perros, gatos y similares), animales de granja(p. ej.,vacas, cerdos, caballos, ovejas, cabras y similares) y animales de laboratorio(p. ej.,ratas, ratones, cobayas y similares). Normalmente, el sujeto es un ser humano que necesita tratamiento. Típicamente, el sujeto es un ser humano que necesita tratamiento.

El término "inhibir", "inhibición" o "inhibiendo" incluye una disminución en la actividad inicial de una actividad o proceso biológico.

Los compuestos descritos en esta memoria pueden estar presentes en forma de sales farmacéuticamente aceptables. Para uso en medicamentos, las sales de los compuestos descritos en esta memoria se refieren a "sales farmacéuticamente aceptables" no tóxicas. Formas de sal farmacéuticamente aceptables incluyen sales ácidas/aniónicas o básicas/catiónicas farmacéuticamente aceptables. Sales por adición de ácidos farmacéuticamente aceptables adecuadas de los compuestos descritos en esta memoria incluyen, p. ej., sales de ácidos inorgánicos (tales como ácido clorhídrico, ácidos bromhídrico, fosfórico, nítrico y sulfúrico) y de ácidos orgánicos (tales como ácido acético, ácidos bencenosulfónico, benzoico, metanosulfónico). y ácidos p-toluenosulfónicos).

3. Descripción de Compuestos Ejemplares

En un primer ejemplo, la presente divulgación proporciona un compuesto de FórmulaI:

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde las variables son las anteriores para la FórmulaI.

En un segundo ejemplo, en los compuestos de FórmulaI,

R1 es halo o -Salquilo (C<1>-C<4>);

R2 es halo;

R3 es alquilo (C<1>-C<4>);

R4 es cicloalquilo (C<3>-C<7>) o heterociclilo (C<4>-C<7>), cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido con 1 a 2 grupos seleccionados de haloalquilo (C<1>-C<4>) y -NRaRb;

Ra es hidrógeno o alquilo (C<1>-C<4>);

Rb es alquilo (C<1>-C<4>) o heterociclilo (C<4>-C<7>), en donde dicho heterociclilo está opcionalmente sustituido con haloalquilo (C<1>-C<4>); o

Ra y Rb, junto con el átomo de nitrógeno al que están fijados, forman un heterociclilo de 4-7 miembros que contiene nitrógeno, opcionalmente sustituido con 1 a 3 grupos seleccionados de halo y -ORc;

Rc es alquilo (C<1>-C<4>), haloalquilo (C<1>-C<4>) o cicloalquilo (C<3>-C<7>); y

R5 es halo o alquilo (C<1>-C<4>).

En un tercer ejemplo, el compuesto de Fórmula I es de Fórmula II:

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde las variables restantes son como se describen arriba para la Fórmula I o el segundo ejemplo.

En un cuarto ejemplo, R1 en el compuesto de Fórmula I o Fórmula II es cloro, en donde las variables restantes son como se describen arriba para la Fórmula I o el segundo ejemplo.

En un quinto ejemplo, R1 en el compuesto de Fórmula I o Fórmula II es -SCH<3>, en donde las variables restantes son como se describen arriba para la Fórmula I o el segundo ejemplo.

En un sexto ejemplo, R4 en el compuesto de Fórmula I o Fórmula II es ciclohexilo o piperidinilo, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido con 1 a 2 grupos seleccionados de haloalquilo (C<1>-C<4>) y -NRaRb. en donde las variables restantes son como se describen arriba para la Fórmula I o el segundo, cuarto o quinto ejemplo.

En un séptimo ejemplo, el compuesto de Fórmula I o Fórmula II es de la Fórmula III:

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde R6 es haloalquilo (C<1>-C<4>) y en donde las variables restantes son como se describen arriba para la Formula I o el segundo, cuarto o quinto ejemplo.

En un octavo ejemplo, el compuesto de Fórmula I o Fórmula II o Fórmula III es de la Fórmula IV:

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde las variables restantes son como se describen arriba para la Fórmula I o el segundo, cuarto, quinto o séptimo ejemplo.

En un noveno ejemplo, el compuesto de Fórmula I o Fórmula II es de la Fórmula V:

NR R

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde las variables restantes son como se describen arriba para la FórmulaIo el segundo, cuarto o quinto ejemplo.

En un décimo ejemplo, el compuesto de FórmulaI,FórmulaIIo FórmulaVes de la FórmulaVIoVII:

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde las variables y características restantes son como se describen arriba para la Fórmula I o el segundo, cuarto o quinto ejemplo.

En un undécimo ejemplo, Rb en los compuestos de FórmulaI,FórmulaII,FórmulaV,FórmulaVIy FórmulaVIIes alquilo (C<1>-C<4>) u oxetanilo, en donde dicho oxetanilo está opcionalmente sustituido con haloalquilo (C<1>-C<4>); o Ra y Rb, junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos, forman un azetidinilo opcionalmente sustituido con halo u -ORc, en donde las variables y características restantes son como se describen arriba para la FórmulaI oel segundo, cuarto o quinto ejemplo.

En un duodécimo ejemplo, Ra en los compuestos de FórmulaI,FórmulaII,FórmulaV,FórmulaVIy FórmulaVIIes hidrógeno o metilo; y Rb es metilo u oxetanilo, en donde dicho oxetanilo está opcionalmente sustituido con -CH<2>F or -CF<3>, en donde las variables y características restantes son como se describen arriba para la FórmulaIo el segundo, cuarto, quinto o undécimo ejemplo.

En un decimotercer ejemplo, Ra and Rb en los compuestos de FórmulaI,FórmulaII,FórmulaV,FórmulaVIy FórmulaVII, junto con el átomo de nitrógeno al que están fijados forman un azetidinilo opcionalmente sustituido con 1 a 2 fluoro u -ORc; y Rc es -CH<3>, -CHF<2>o ciclopropilo, en donde las variables y características restantes son como se describen arriba para la FórmulaI oel segundo, cuarto, quinto o undécimo ejemplo.

En un decimocuarto ejemplo, la configuración del 1,3-dioxolanilo y el grupo NRaRb en cualquiera de las FórmulasI, II, V, VIyVIIestán orientadas en posición trans alrededor del ciclohexilo, en donde las características restantes son como se describen arriba para la Fórmula I o los ejemplos segundo, cuarto, quinto, sexto, undécimo, duodécimo o decimotercero. Alternativamente, la configuración del 1,3-dioxolanilo y el grupo NRaRb de las FórmulasI, II, V, VIyVIIestán orientadas en posición cis alrededor del ciclohexilo, en donde las características restantes son como se describen arriba para la FórmulaIo los ejemplos segundo, cuarto, quinto, sexto, undécimo, duodécimo o decimotercero.

En un decimoquinto ejemplo, la configuración estereoquímica del centro quiral del 1,3-dioxolanilo en una cualquiera de las FórmulasI, II, III, IV, V, VIyVIIes R, en donde las características restantes son como se describen arriba para la Fórmula I o los ejemplos segundo, cuarto, quinto, sexto, undécimo, duodécimo, decimotercero o decimocuarto. Alternativamente, la configuración estereoquímica del centro quiral del 1,3-dioxolanilo en una cualquiera de las FórmulasI, II, III, IV, V, VIyVIIes S, en donde las características restantes son como se describen arriba para la Fórmula I o los ejemplos segundo, cuarto, quinto, sexto, undécimo, duodécimo, decimotercero o decimocuarto.

En la sección EJEMPLIFICACIÓN se proporcionan ejemplos específicos de compuestos y se incluyen como parte de un decimocuarto ejemplo en esta memoria. También se incluyen sales farmacéuticamente aceptables así como las formas neutras de estos compuestos. En un aspecto, la presente divulgación incluye formas racémicas de cualquier compuesto descrito en esta memoria.

4. Usos, Formulación y Administración

En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona una composición que comprende un compuesto descrito en esta memoria o un derivado farmacéuticamente aceptable del mismo y un soporte farmacéuticamente aceptable. La cantidad de compuesto en una composición proporcionada es tal que es eficaz para modular de manera mensurable una enzima modificadora de metilo de histona, o un mutante de la misma, en una muestra biológica o en un paciente.

En determinadas realizaciones, una composición descrita en esta memoria se formula para administración a un paciente que necesita una composición de este tipo. Las composiciones descritas en esta memoria se pueden administrar por vía oral, parenteral, mediante espray para inhalación, por vía tópica, rectal, nasal, bucal, vaginal o mediante un depósito implantado. El término "parenteral", tal como se utiliza en esta memoria, incluye técnicas de inyección o infusión subcutánea, intravenosa, intramuscular, intra-articular, intra-sinovial, intraesternal, intratecal, intrahepática, intralesional e intracraneal. En algunas realizaciones, las composiciones se administran por vía oral, intraperitoneal o intravenosa. Formas inyectables estériles de las composiciones descritas en esta memoria pueden ser una suspensión acuosa u oleaginosa. Estas suspensiones se pueden formular de acuerdo con técnicas conocidas en la técnica utilizando agentes dispersantes o humectantes y agentes de suspensión adecuados.

En algunas realizaciones, las composiciones se administran por vía oral.

Una dosificación específica y un régimen de tratamiento para cualquier paciente en particular dependerán de una diversidad de factores, incluyendo la actividad del compuesto específico empleado, la edad, el peso corporal, la salud general, el sexo, la dieta, el tiempo de administración, la tasa de excreción y la combinación de fármacos y el criterio del médico tratante y la gravedad de la enfermedad particular que se esté tratando. La cantidad de un compuesto descrito en esta memoria en la composición también dependerá del compuesto particular en la composición.

Compuestos y composiciones descritos en esta memoria son generalmente útiles para modular la actividad de una o más enzimas implicadas en la regulación epigenética y, en particular, EZH1 y EZH2 e, incluso más específicamente, EZH2 y sus formas mutantes. En algunas realizaciones, los compuestos descritos en esta memoria regulan negativamente o suprimen la actividad de EZH2. En algunas realizaciones, los compuestos descritos en esta memoria son antagonistas de la actividad de EZH2. En algunas realizaciones, los compuestos descritos en esta memoria regulan negativamente o suprimen la actividad de EZH1. En algunas realizaciones, los compuestos descritos en esta memoria son antagonistas de la actividad de EZH1.

En algunas realizaciones, los compuestos y las composiciones descritos en esta memoria son útiles en el tratamiento de enfermedades y/o trastornos asociados con la sobre-expresión de EZH1 o EZH2 y/o la expresión de una forma mutante de EZH2, como las formas mutantes que alteran la actividad del sustrato de EZH2. El estudio de las deleciones, las mutaciones sin sentido y de cambio de marco de EZH2 sugiere que EZH2 funciona como un supresor de tumores en trastornos sanguíneos tales como los síndromes mielodisplásicos (MDS, por sus siglas en inglés) y las neoplasias malignas mieloides (Ernst et al., Nat Genet. Agosto de 2010; 42(8):722-6; Nikoloski et al., Nat Genet. Agosto de 2010; 42(8):665-7). En algunas realizaciones, los compuestos y las composiciones descritos en esta memoria son útiles en el tratamiento de enfermedades y/o trastornos asociados con la presencia de EZH2 que tiene una mutación Y641N, Y641C, Y641F, Y641H, Y641S, a 677G o A687. En un aspecto particular de esta realización, EZH2 tiene una mutación Y641N.

En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un compuesto, o una sal farmacéuticamente aceptable o una composición del mismo, para uso en el tratamiento de un sujeto que padece una enfermedad y/o trastorno asociado con la sobre-expresión de EZH1 o EZH2 y/o la expresión de un forma mutante de EZH2. En algunas realizaciones, el uso anterior comprende, además, la etapa preliminar de determinar si el sujeto sobre-expresa EZH2 o expresa una forma mutante de EZH2. Los usos descritos de los compuestos en métodos de tratamiento terapéutico del cuerpo humano o animal en los siguientes párrafos no son la materia objeto de las reivindicaciones y deben interpretarse en el sentido del o de los compuestos para uso en método/uso terapéutico de este tipo. El alcance de la invención se define en las reivindicaciones adjuntas.

En algunas realizaciones, la enfermedad o el trastorno asociado con la presencia de una forma mutante de EZH2 es un linfoma de células B humano. En algunas realizaciones, la enfermedad o el trastorno asociado con la presencia de Y641N EZH2 es linfoma folicular o linfoma difuso de células B grandes. En algunas realizaciones, compuestos o composiciones descritos en esta memoria son útiles en el tratamiento de trastornos sanguíneos, tales como síndromes mielodisplásicos, leucemia, anemia y citopenia. Sneeringer et al., "Coordinated activities of wild-type plus mutant EZH2 drive tumor-associated hypertrimethylation of lysine 27 on histone H3 (H3K27) in human B-cell lymphomas," Sneeringer et al., Proc. Natl Acad. Sci. Diciembre de 2010; 109(48):20980-20985.

En algunas realizaciones, los compuestos y las composiciones descritos en esta memoria son útiles para tratar enfermedades y/o trastornos asociados con la proliferación celular. En algunas realizaciones, los compuestos y las composiciones descritos en esta memoria son útiles para tratar enfermedades y/o trastornos asociados con la mala regulación del ciclo celular o la reparación del ADN. En algunas realizaciones, los compuestos y las composiciones descritos en esta memoria son útiles en el tratamiento del cáncer.

En un aspecto, los cánceres que pueden tratarse mediante los compuestos, las composiciones y los métodos descritos en esta memoria incluyen, pero no se limitan a Cardíaco: sarcoma (angiosarcoma, fibrosarcoma, rabdomiosarcoma, liposarcoma), mixoma, rabdomioma, fibroma, lipoma y teratoma; Pulmón: carcinoma broncogénico (células escamosas, células pequeñas indiferenciadas, células grandes indiferenciadas, adenocarcinoma), carcinoma alveolar (bronquiolar), adenoma bronquial, sarcoma, linfoma, hamartoma condromatoso, mesotelioma; Gastrointestinal: esófago (carcinoma de células escamosas, adenocarcinoma, leiomiosarcoma, linfoma), estómago (carcinoma, linfoma, leiomiosarcoma), páncreas (adenocarcinoma ductal, insulinoma, glucagonoma, gastrinoma, tumores carcinoides, vipoma), intestino delgado (adenocarcinoma, linfoma, tumores carcinoides), sarcoma de Kaposi, leiomioma, hemangioma, lipoma, neurofibroma, fibroma), intestino grueso (adenocarcinoma, adenoma tubular, adenoma velloso, hamartoma, leiomioma); Tracto genitourinario: riñón (adenocarcinoma, tumor de Wilm (nefroblastoma), linfoma, leucemia), vejiga y uretra (carcinoma de células escamosas, carcinoma de células de transición, adenocarcinoma), próstata (adenocarcinoma, sarcoma), testículos (seminoma, teratoma, carcinoma embrionario, teratocarcinoma, coriocarcinoma, sarcoma, carcinoma de células intersticiales, fibroma, fibroadenoma, tumores adenomatoides, lipoma); Hígado: hepatoma (carcinoma hepatocelular), colangiocarcinoma, hepatoblastoma, angiosarcoma, adenoma hepatocelular, hemangioma; Hueso: sarcoma osteogénico (osteosarcoma), fibrosarcoma, histiocitoma fibroso maligno, condrosarcoma, sarcoma de Ewing, linfoma maligno (sarcoma de células del retículo), mieloma múltiple, cordoma de tumor maligno de células gigantes, osteocronfroma (exostosis osteocartilaginosa), condroma benigno, condroblastoma, condromixofibroma, osteoide osteoma y tumores de células gigantes; Sistema nervioso: cráneo (osteoma, hemangioma, granuloma, xantoma, osteítis deformante), meninges (meningioma, meningiosarcoma, gliomatosis), cerebro (astrocitoma, meduloblastoma, glioma, ependimoma, germinoma (pinealoma), glioblastoma multiforme, oligodendroglioma, schwannoma, retinoblastoma, tumores congénitos), neurofibroma de médula espinal, meningioma, glioma, sarcoma); Ginecológicos: útero (carcinoma endometrial), cuello uterino (carcinoma cervical, displasia cervical pre-tumoral), ovarios (carcinoma de ovario (cistadenocarcinoma seroso, cistadenocarcinoma mucinoso, carcinoma de células claras, carcinoma no clasificado), tumores de células granulosatecales, tumores de células de Sertoli-Leydig, disgerminoma, teratoma maligno), vulva (carcinoma de células escamosas, carcinoma intraepitelial, adenocarcinoma, fibrosarcoma, melanoma), vagina (carcinoma de células claras, carcinoma de células escamosas, sarcoma botrioide (rabdomiosarcoma embrionario), trompas de Falopio (carcinoma); Hematológico: sangre (leucemia mieloide (aguda y crónica), leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfocítica crónica, enfermedades mieloproliferativas, mieloma múltiple, síndrome mielodisplásico), enfermedad de Hodgkin, linfoma no Hodgkin (linfoma maligno); Piel: melanoma maligno, carcinoma de células basales, carcinoma de células escamosas, sarcoma de Kaposi, lunares, nevos displásicos, lipoma, angioma, dermatofibroma, queloides, psoriasis y glándulas suprarrenales: neuroblastoma.

En un aspecto, el cáncer tratado mediante los compuestos, las composiciones y los métodos descritos en esta memoria se selecciona entre cáncer suprarrenal, carcinoma de células acínicas, neuroma acústico, melanoma lentiginoso acral, acrospiroma, leucemia eosinofílica aguda, leucemia eritroide aguda, leucemia linfoblástica aguda, leucemia megacarioblástica aguda, leucemia monocítica aguda, leucemia promielocítica aguda, adenocarcinoma, carcinoma adenoide quístico, adenoma, tumor odontogénico adenomatoide, carcinoma adenoescamoso, neoplasia de tejido adiposo, carcinoma adrenocortical, leucemia/linfoma de células T en adultos, leucemia agresiva de células NK, linfoma relacionado con el SIDA, rabdomiosarcoma alveolar, sarcoma alveolar de partes blandas, fibroma ameloblástico, linfoma anaplásico de células grandes, cáncer anaplásico de tiroides, linfoma angioinmunoblástico de células T, angiomiolipoma, angiosarcoma, astrocitoma, tumor rabdoide teratoide atípico, leucemia linfocítica crónica de células B, leucemia prolinfocítica de células B, linfoma de células B, carcinoma de células basales, cáncer de vías biliares, cáncer de vejiga, blastoma, cáncer de huesos, tumor de Brenner, tumor de Brown, linfoma de Burkitt, cáncer de mama, cáncer de cerebro, carcinoma, carcinoma in situ, carcinosarcoma, tumor de cartílago, cementoma, sarcoma mieloide, condroma, cordoma, coriocarcinoma, papiloma del plexo coroideo, sarcoma de células claras del riñón, craneofaringioma, linfoma cutáneo de células T, cáncer de cuello uterino, cáncer colorrectal, enfermedad de Degos, tumor desmoplásico de células redondas pequeñas, linfoma difuso de células B grandes, tumor neuroepitelial disembrioplásico, disgerminoma, carcinoma embrionario, neoplasia de glándula endocrina, tumor del seno endodérmico, linfoma de células T asociado a enteropatía, cáncer de esófago, feto en feto, fibroma, fibrosarcoma, linfoma folicular, cáncer folicular de tiroides, ganglioneuroma, cáncer gastrointestinal, tumor de células germinales, coriocarcinoma gestacional, fibroblastoma de células gigantes, tumor óseo de células gigantes, tumor glial, glioblastoma multiforme, glioma, gliomatosis cerebral, glucagonoma, gonadoblastoma, tumor de células de la granulosa, ginandroblastoma, cáncer de vesícula biliar, cáncer gástrico, leucemia de células pilosas, hemangioblastoma, cáncer de cabeza y cuello, hemangiopericitoma, neoplasia maligna hematológica, hepatoblastoma, linfoma hepatoesplénico de células T, linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, carcinoma lobular invasivo, cáncer intestinal, cáncer de riñón, cáncer de laringe, lentigo maligno, carcinoma letal de la línea media, leucemia, tumor de células de Leydig, liposarcoma, cáncer de pulmón, linfangioma, linfangiosarcoma, linfoepitelioma, linfoma, leucemia linfocítica aguda, leucemia mielógena aguda, leucemia linfocítica crónica, cáncer de hígado, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, linfoma MALT, histiocitoma fibroso maligno, tumor de la vaina nerviosa periférica maligna, tumor maligno de tritón, linfoma de células del manto, linfoma de células B de la zona marginal, leucemia de mastocitos, tumor mediastínico de células germinales, carcinoma medular de mama, cáncer medular de tiroides, meduloblastoma, melanoma, meningioma, cáncer de células de Merkel, mesotelioma, carcinoma urotelial metastásico, tumor mulleriano mixto, tumor mucinoso, mieloma múltiple, neoplasia del tejido muscular, micosis fungoide, liposarcoma mixoide, mixoma, mixosarcoma, carcinoma nasofaríngeo, neurinoma, neuroblastoma, neurofibroma, neuroma, melanoma nodular, cáncer ocular, oligoastrocitoma, oligodendroglioma, oncocitoma, meningioma de la vaina del nervio óptico, tumor del nervio óptico, cáncer oral, osteosarcoma, cáncer de ovario, tumor de Pancoast, cáncer papilar de tiroides, paraganglioma, pinealoblastoma, pineocitoma, pituicitoma, adenoma pituitario, tumor pituitario, plasmocitoma, poliembrioma, precursor de linfoma tlinfoblástico, linfoma primario del sistema nervioso central, linfoma de derrame primario, cáncer peritoneal primario, cáncer de próstata, cáncer de páncreas, cáncer de faringe, pseudomixoma peritoneal, carcinoma de células renales, carcinoma medular renal, retinoblastoma, rabdomioma, rabdomiosarcoma, transformación de Richter, cáncer de recto, sarcoma, schwannomatosis, seminoma, tumor de células de Sertoli, tumor del estroma gonadal del cordón sexual, carcinoma de células en anillo de sello, cáncer de piel, tumores de células pequeñas redondas azules, carcinoma de células pequeñas, sarcoma de tejido blando, somatostatinoma, verruga de hollín, tumor espinal, linfoma de la zona marginal esplénica, carcinoma de células escamosas, sarcoma sinovial, enfermedad de Sezary, cáncer de intestino delgado, carcinoma escamoso, cáncer de estómago, linfoma de células T, cáncer testicular, tecoma, cáncer de tiroides, carcinoma de células transicionales, cáncer de garganta, cáncer de uraco, cáncer urogenital, carcinoma urotelial, melanoma uveal, cáncer de útero, carcinoma verrugoso, glioma de las vías visuales, cáncer de vulva, cáncer de vagina, macroglobulinemia de Waldenstrom, tumor de Warthin y tumor de Wilms.

En un aspecto, el cáncer tratado mediante los compuestos, las composiciones y los métodos descritos en esta memoria se selecciona de adenocarcinoma, leucemia/linfoma de células T adultas, cáncer de vejiga, blastoma, cáncer de huesos, cáncer de mama, cáncer de cerebro, carcinoma, sarcoma mieloide, cáncer de cuello uterino, cáncer colorrectal, cáncer de esófago, cáncer gastrointestinal, glioblastoma multiforme, glioma, cáncer de vesícula biliar, cáncer gástrico, cáncer de cabeza y cuello, linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, cáncer intestinal, cáncer de riñón, cáncer de laringe, leucemia, cáncer de pulmón, linfoma, cáncer de hígado, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, mesotelioma, mieloma múltiple, leucemia mieloide aguda (AML, por sus siglas en inglés), linfoma difuso de células B grandes (DLBCL, por sus siglas en inglés), cáncer ocular, tumor del nervio óptico, cáncer oral, cáncer de ovario, tumor pituitario, linfoma primario del sistema nervioso central, cáncer de próstata, cáncer de páncreas, cáncer de faringe, carcinoma de células renales, cáncer de recto, sarcoma, cáncer de piel, tumor espinal, cáncer de intestino delgado, cáncer de estómago, linfoma de células T, cáncer testicular, cáncer de tiroides, cáncer de garganta, cáncer urogenital, carcinoma urotelial, cáncer de útero, cáncer de vagina y tumor de Wilms.

En un aspecto, el cáncer tratado mediante los compuestos, las composiciones y los usos descritos en esta memoria se selecciona de cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de colon, carcinoma de células renales, glioblastoma cáncer multiforme, cáncer de vejiga, melanoma, cáncer bronquial, linfoma y cáncer de hígado.

También se proporciona el uso de un compuesto descrito en esta memoria, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o una composición que comprende un compuesto descrito o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para la fabricación de un medicamento para tratar una afección descrita en esta memoria. También se proporciona un compuesto descrito en esta memoria, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o una composición que comprende un compuesto descrito o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para uso en el tratamiento de una afección descrita en esta memoria.

EJEMPLIFICACIÓN

Los ejemplos representativos que siguen pretenden ayudar a ilustrar la invención.

PREPARACIÓN DE COMPUESTOS INTERMEDIOS

Compuesto Intermedio 1: 3-(aminometil)-6-metil-4-(metiltio)piridin-2(1H)-ona (sal hidrocloruro)

Etapa 1: Síntesis de 3-oxobut-1-eno-1,1-bis(tiolato) de sodio

Se desgasificó al vacío una mezcla de terc.-butóxido de sodio (16,6 g, 172 mmol) en tolueno (30 mL) y se purgó con nitrógeno (3 ciclos). Luego se añadió acetona (5,0 g, 6,4 mL, 86 mmol) a 0 °C, seguido de la lenta adición de disulfuro de carbono (6,6 g, 5,24 mL, 86 mmol). La mezcla resultante se agitó a 0 °C durante 4 h y luego se filtró. La torta de filtración se secó al vacío para dar el compuesto del título (15,4 g, bruto) en forma de un sólido amarillo, que se utilizó en la siguiente etapa sin purificación adicional.

Etapa 2: Síntesis de 4,4-bis(metiltio)but-3-en-2-ona

A una solución de 3-oxobut-1-eno-1,1-bis(tiolato) de sodio (15,4 g, 86,4 mmol) en metanol (90 mL) se añadió lentamente yodometano (24,5 g, 10,7 mL, 173 mmol). La mezcla se agitó a 70 °C durante 1 h y luego se concentró a sequedad. Se añadió agua (30 mL) y el producto deseado se extrajo con acetato de etilo (60 mL x 3). Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre sulfato de sodio y se concentraron a presión reducida para dar el compuesto del título (6,8 g, rendimiento del 42 %) en forma de un aceite pardo, que se utilizó en la siguiente etapa sin purificación adicional. LCMS [M+H]+ m/z: calc. 163,0; encontrado 163,0. 1H RMN (400 MHz, cloroformo-d) 56,02 (s, 1H), 2,45 (s, 3H), 2,43 (s, 3H), 2,15 (s, 3H).

Etapa 3: Síntesis de 6-metil-4-(metiltio)-2-oxo-1,2-dihidropiridina-3-carbonitrilo

A una solución de 4,4-bis(metiltio)but-3-en-2-ona (2,9 g, 18 mmol) y 2-cianoacetamida (1,5 g, 18 mmol) en terc.-butanol (50 mL) se añadió terc.-butóxido de sodio (1,9 g, 20 mmol). La mezcla se agitó a 80 °C durante 12 h (se realizaron y combinaron dos lotes de la reacción en esta etapa). Se añadió agua (20 mL) y el pH se ajustó a 5-6 con ácido clorhídrico al 10 %. La mezcla resultante se filtró y la torta de filtración se lavó con éter de petróleo (20 mL x 2) y luego la torta se secó al vacío para dar el compuesto del título (4,8 g, rendimiento del 74 %) en forma de un sólido blanquecino, que se utilizó en la siguiente etapa sin purificación adicional. LCMS [M+H]+ m/z: calc. 181,0; encontrado 181,0. 1H RMN (400 MHz, Dimetilsulfóxido-de) 56,27 (s, 1H), 2,56 (s, 3H), 2,25 (s, 3H).

Etapa 4: Síntesis de 3-(aminometil)-6-metil-4-(metiltio)piridin-2(1H)-ona

Se desgasificó al vacío una mezcla de 6-metil-4-(metiltio)-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-carbonitrilo (3,6 g, 20 mmol) en tetrahidrofurano (50 mL) y se purgó con nitrógeno (3 ciclos). Luego se añadió lentamente complejo de borano dimetilsulfuro (10 M, 8,0 mL, 80 mmol) a 0 °C antes de que la mezcla de reacción se calentara a 70 °C y se agitara durante 2 h. Se añadió lentamente metanol (15 mL) a 0 °C para extinguir la reacción antes de que la mezcla se concentrara a presión reducida para dar el compuesto del título (3,8 g, bruto), en forma de un sólido amarillo claro, que se utilizó en la siguiente etapa sin purificación adicional. LCMS [M+H]+ m/z: calc. 185,1; encontrado 185,0.

Etapa 5: Síntesis de ((6-metil-4-(metiltio)-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)carbamato de terc.-butilo

A una solución de 3-(aminometil)-6-metil-4-(metiltio)piridin-2(1 H)-ona (3,6 g, 20 mmol) en tetrahidrofurano (80 mL) se añadió trietilamina (5,9 g, 8,1 mL, 59 mmol). La mezcla se agitó durante 30 min antes de añadir dicarbonato de diterc.-butilo (6,4 g, 29 mmol) y la reacción se agitó a 25 °C durante 12 h. Luego se concentró la mezcla de reacción a sequedad a presión reducida, antes de añadir agua (35 mL) y el producto deseado se extrajo con una mezcla 5:1 de éter de petróleo/acetato de etilo (30 mL x 3). Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre sulfato de sodio y se concentraron para dar el compuesto del título (5,8 g, bruto) en forma de un sólido blanco, que se utilizó en la siguiente etapa sin purificación adicional. LCMS [M+H]+ m/z: calc. 285,12; encontrado 284,9. 1H RMN (400 MHz, Dimetilsulfóxido-cfe) 56,05 (s, 1H), 4,03 - 4,00 (m, 2H), 2,42 (s, 3H), 2,15 (s, 3H), 1,39 (s, 9H).

Etapa 6: Síntesis de 3-(aminometil)-6-metil-4-(metiltio)piridin-2(1H)-ona (sal hidrocloruro)

A una solución de cloruro de hidrógeno en 1,4-dioxano (4 M, 100 mL, 400 mmol) a 25 °C se añadió ((6-metil-4-(metiltio)-2-oxo-1,2 -dihidropiridin-3-il)metil)carbamato de terc.-butilo (5,0 g, 17,6 mmol). La mezcla de reacción se agitó a 25 °C durante 2 h y luego se concentró a sequedad a presión reducida. El residuo se lavó con diclorometano (30 mL x 2) y acetato de etilo (30 mL) para dar el compuesto del título (4,5 g, bruto, sal HCl) en forma de un sólido amarillo, que se utilizó en la siguiente etapa sin purificación adicional. LCMS [M+H]+ m/z: calc. 185,1; encontrado 185,0. 1H<r>M<n>(400 MHz, D<2>O) 56,31 (s, 1H), 4,03 (s, 2H), 2,41 (s, 3H), 2,18 (s, 3H).

Compuesto Intermedio 2: 5-(aminometil)-2-metil-6-(metiltio)pirimidin-4(3H)-ona (sal hidrocloruro)

Una suspensión de hidruro de sodio (dispersión al 60 % en aceite mineral) (4,23 g, 106 mmol) en tetrahidrofurano (400 mL) se enfrió a 0 °C antes de añadir gota a gota cianoacetato de metilo (8,90 mL, 101 mmol). La mezcla de reacción se agitó vigorosamente durante 15 minutos antes de añadir gota a gota disulfuro de carbono (6,1 mL, 101 mmol) mientras se mantenía la temperatura de reacción por debajo de 20 °C (el semisólido blanco se volvió amarillo). A continuación se añadió gota a gota yodometano (15,7 mL, 252 mmol) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 15 minutos. Luego se concentró la reacción a presión reducida y el residuo se vertió en agua con hielo. El precipitado resultante se filtró y se secó al vacío para dar el compuesto del título (11,9 g, rendimiento del 58 %) en forma de un sólido amarillo/pardo, que se utilizó en la siguiente etapa sin purificación adicional. 1H RMN (400 MHz, Cloroformo-d) 53,83 (s, 3H), 2,76 (s, 3H), 2,61 (s, 3H).

Etapa 2: Síntesis de 2-metil-4-(metiltio)-6-oxo-1,6-dihidropirimidina-5-carbonitrilo

2-ciano-3,3-bis(metiltio)acrilato de metilo (11,9 g, 58,5 mmol) se disolvió en etanol (1000 mL). A la mezcla se añadieron hidrocloruro de acetamidina (5,53 g, 58,5 mmol) y trietilamina (36,7 mL, 263 mmol) y se agitó a reflujo durante la noche. Luego la reacción se concentró a presión reducida y el residuo se lavó con ácido clorhídrico al 10 %. El precipitado se filtró y la torta de filtración se lavó con agua y dietil éter antes de secarse al vacío para dar el compuesto del título (5 g, 47 % de rendimiento) en forma de un sólido, que se utilizó en la siguiente etapa sin purificación adicional. LCMS [M+H]+ m/z: calc. 182,03; encontrado 182,10. 1H RMN (400 MHz, Dimetilsulfóxido-cfe) 52,57 (s, 3H), 2,37 (s, 3H).

Etapa 3: Síntesis de ((2-metil-4-(metiltio)-6-oxo-1,6-dihidropirimidin-5-il)metil)carbamato de terc.-butilo

A una suspensión de 2-metil-4-(metiltio)-6-oxo-1,6-dihidropirimidina-5-carbonitrilo (1,5 g, 8,27 mmol) en tetrahidrofurano (50 mL) a 0 °C se añadió una solución de hidruro de litio y aluminio en tetrahidrofurano (2 M, 6,2 mL, 12,4 mmol). La reacción se calentó lentamente hasta temperatura ambiente y una vez completada se extinguió con una solución acuosa de hidróxido de sodio (1 M, 33 mL, 33,1 mmol). A esta mezcla se añadieron secuencialmente 1,4-dioxano (50 mL) y dicarbonato de di-terc.-butilo (3,61 g, 16,6 mmol). La mezcla bifásica se agitó vigorosamente hasta la completa protección de la amina. La mezcla bifásica se acidificó hasta pH neutro con ácido acético, se separó y la capa acuosa se extrajo con diclorometano. Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre sulfato de magnesio, se filtraron y se concentraron a sequedad a presión reducida. El residuo se trituró con diclorometano y el filtrado (que contenía el producto deseado) se concentró a sequedad a presión reducida. El sólido resultante se purificó mediante cromatografía de resolución instantánea de fase inversa (columna C18, gradiente del 5 % al 95 % de acetonitrilo en agua tamponada con ácido trifluoroacético al 0,1 %) y luego mediante cromatografía de resolución instantánea en fase normal (gel de sílice, gradiente del 30 % al 90 % de acetato de etilo en diclorometano) para dar el compuesto del título (2,57 g, 26 % de rendimiento, > 99 % de pureza) en forma de un sólido blanco. LCMS [M(C<4>H<8>)+H]+ m/z: calc. 230,1; encontrado 230,0. 1H RMN (400 MHz, Cloroformo-a) 5 13,20 (s, 1H), 5,37 (t,J=5,5 Hz, 1H), 4,26 (d, J= 5,6 Hz, 2H), 2,51 (s, 3H), 2,44 (s, 3H), 1,44 (s, 9H).

Etapa 4. Síntesis de 5-(aminometil)-2-metil-6-(metiltio)pirimidin-4(3H)-ona (sal hidrocloruro)

A una suspensión de ((2-metil-4-(metiltio)-6-oxo-1,6-dihidropirimidin-5-il)metil) carbamato deterc.-butilo(300 mg, 1,05 mmol) en 1,4-dioxano (7,2 mL) a 23 °C se añadió una solución de cloruro de hidrógeno en 1,4-dioxano (4 M, 2,10 mL, 8,40 mmol). La reacción se agitó a 23 °C durante 3 h, luego se añadió más solución de cloruro de hidrógeno en 1,4-dioxano (4 M, 2,10 mL, 8,40 mmol). Después de 14 h, la reacción se concentró a sequedad a presión reducida para dar el compuesto del título (254 mg, 94 % de rendimiento) en forma de un sólido blanco, que se utilizó en la siguiente etapa sin purificación adicional LCMS [M+Na]+ (base libre) m/z: calc. 208,1; encontrado 208,1.

Compuesto Intermedio 3: 3-(aminometil)-6-cloro-4-(metiltio)piridin-2(1H)-ona (sal hidrocloruro)

A una suspensión de hidruro de sodio (dispersión al 60 % en aceite mineral) (11,5 g, 286 mmol) en tetrahidrofurano (500 mL) se añadió alcohol bencílico (14 mL, 143 mmol) a 0 °C. La mezcla de reacción se agitó durante 20 min, luego se añadió una solución de ácido 2,6-dicloropiridin-3-carboxílico (25 g, 130 mmol) en tetrahidrofurano (500 mL) y la mezcla de reacción se agitó durante 4 horas a 23 °C. Luego, la reacción se extinguió con ácido clorhídrico al 10 % (300 mL), se trató con NaHCÜ<3>sólido hasta pH ~8, se acidificó con ácido acético (50 % en agua) y finalmente se extrajo con acetato de etilo (200 mL x 3). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera (200 mL), se secaron sobre sulfato de magnesio, se filtraron y se concentraron a sequedad. El residuo se purificó mediante cromatografía de resolución instantánea (gel de sílice, gradiente del 5 % al 50 % de acetato de etilo en diclorometano) para dar el compuesto del título (33,68 g, rendimiento del 98 %).

Etapa 2: Síntesis de 2-(benciloxi)-6-cloronicotinamida

A una solución de ácido 2-(benciloxi)-6-cloronicotínico (33,68 g, 128,2 mmol) en diclorometano (500 mL) a 0 °C se añadió N,N-dimetilformamida (1 mL) seguido de cloruro de oxalilo (11,9 mL, 141 mmol). La reacción se agitó a 23 °C durante 2 horas y luego se concentró a sequedad. El residuo se disolvió en diclorometano (200 mL) y se añadió lentamente a una solución concentrada de hidróxido de amonio (50 mL) a 0 °C. Después de 1 h, se recogió la capa orgánica y la fase acuosa se extrajo con diclorometano (50 mL x 3). Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre sulfato de magnesio, se filtraron y se concentraron a sequedad a presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía de resolución instantánea (gel de sílice, gradiente del 0 % al 50 % de acetato de etilo en diclorometano) para dar el compuesto del título en forma de un sólido (rendimiento cuantitativo).

Etapa 3: Síntesis de 2-(benciloxi)-6-cloro-4-(metiltio)nicotinamida

A una solución de 2,2,6,6-tetrametilpiperidina (29,45 mL, 175,1 mmol) en tetrahidrofurano (300 mL) a -78 °C se añadió una solución de n-butil-litio en hexano (2,5 M, 70 mL, 175,1 mmol). La mezcla de reacción se calentó a 0 °C durante 30 min y luego se enfrió nuevamente a -78 °C. Luego se añadió una solución de 2-(benciloxi)-6-cloronicotinamida (11,5 g, 43,8 mmol) en tetrahidrofurano (100 mL) mientras se mantenía la temperatura interna por debajo de -60 °C. La mezcla de reacción se agitó durante 1 h a -78 °C y luego se añadió disulfuro de dimetilo (15,77 mL, 175,1 mmol). La reacción se agitó a -78 °C durante 2 h más, luego se extinguió a -78 °C con una solución de ácido acético en agua (50 % v/v). El producto deseado se extrajo con acetato de etilo (100 mL x 3) y las capas orgánicas combinadas se lavaron con agua (20 mL, una solución acuosa saturada de bicarbonato de sodio (20 mL, salmuera (20 mL, se secaron sobre sulfato de magnesio,se filtró y se concentró a sequedad a presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía de resolución instantánea (gel de sílice, gradiente del 0 % al 20 % de acetato de etilo en diclorometano) para proporcionar el compuesto del título (4,86 g, rendimiento del 36 %).

Etapa 4: Síntesis de (2-(benciloxi)-6-cloro-4-(metiltio)piridin-3-il)metanamina

A una solución de 2-(benciloxi)-6-cloro-4-(metiltio)nicotinamida (4,86 g, 15,7 mmol) en tetrahidrofurano (100 mL) a 23 °C se añadió una solución de borano en tetrahidrofurano (1 M, 63 mL, 63 mmol). La mezcla de reacción se agitó a reflujo durante 15 h y luego se inactivó mediante la adición lenta de metanol a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se concentró a sequedad a presión reducida y el residuo se purificó mediante cromatografía de resolución instantánea (gel de sílice, gradiente del 0 % al 30 % de metanol en diclorometano) para dar el compuesto del título (710 mg, rendimiento del 15 %) en forma de un sólido blanco.

Etapa 5: Síntesis de 3-(aminometil)-6-cloro-4-(metiltio)piridin-2(1H)-ona (sal hidrocloruro)

A un matraz que contenía (2-(benciloxi)-6-cloro-4-(metiltio)piridin-3-il)metanamina (710 mg, 2,41 mmol) se añadió ácido clorhídrico concentrado (12 M, 5,0 mL, 60 mmol). La mezcla de reacción se agitó a 23 °C durante 2 h y luego se concentró a sequedad a presión reducida. El residuo se recristalizó en una mezcla de metanol y dietil éter para dar el compuesto del título (400 mg, rendimiento del 69 %) en forma de un sólido blanco.

Etapa 6: Síntesis de ((6-cloro-4-(metiltio)-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)carbamato de terc.-butilo

A una suspensión de 3-(aminometil)-6-cloro-4-(metiltio)piridin-2(1H)-ona sal hidrocloruro (1,575 g, 6,53 mmol) en diclorometano (50 mL) se añadió dicarbonato de di-terc.-butilo (2,85 g, 13,1 mmol) seguido de N,N-diisopropiletilamina (3,4 mL, 19,6 mmol) a temperatura ambiente. La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 3 h (hasta que todo se disolvió) y luego se extinguió con agua. La capa orgánica se separó, se secó sobre sulfato de magnesio, se filtró y se concentró a sequedad a presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía de resolución instantánea (gel de sílice, gradiente de 0 a 10 % de metanol en diclorometano) para dar el compuesto del título en forma de un sólido blanco (1,5 g, rendimiento del 75 %). LCMS [M+H]+ m/z: calc. 305,1; encontrado 305,1.

Etapa 7: Síntesis de 3-(aminometil)-6-cloro-4-(metiltio)piridin-2(1H)-ona (sal hidrocloruro)

A una suspensión de ((6-cloro-4-(metiltio)-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)carbamato de terc.-butilo (300 mg, 984 pmol) en 1,4-dioxano (4,9 mL) se añadió una solución de cloruro de hidrógeno en 1,4-dioxano (4 M, 1,96 mL, 7,87 mmol) a temperatura ambiente. La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 3 h y luego se añadió más solución de cloruro de hidrógeno en 1,4-dioxano (4 M, 1,96 mL, 7,87 mmol). Después de 14 h, la reacción se concentró a sequedad a presión reducida para dar el compuesto del título (253 mg, rendimiento cuantitativo) en forma de un sólido blanco, que se utilizó en la siguiente etapa sin purificación adicional. LCMS [M+Na]+ (base libre) m/z: calc.227,0; encontrado 227,0.

Compuesto intermedio 4: 7-cloro-2,4-dimetil-2-(4-oxociclohexil)benzo[d][1,3]dioxol-5-carboxilato de metilo

Etapa 1: Síntesis de 5-cloro-3,4-dihidroxi-2-metilbenzoato de metilo

A una solución de 3,4-dihidroxi-2-metilbenzoato de metilo (5,11 g, 27,9 mmol) en tetrahidrofurano (199 mL) a -20 °C se añadió gota a gota cloruro de sulfurilo (2,45 mL, 30,6 mmol). La mezcla de reacción se agitó a -20 °C durante 3 h y luego se inactivó con una solución acuosa saturada de cloruro de amonio (50 mL). El producto deseado se extrajo con acetato de etilo (25 mL x 3). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera (25 mL), se secaron sobre sulfato de sodio, se filtraron y se concentraron a sequedad a presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía de resolución instantánea (gel de sílice, gradiente del 0 % al 60 % de acetato de etilo en heptano) para dar el compuesto del título (4,117 g, rendimiento del 68 %) en forma de un sólido beige. LCMS [M+H]<+>m/z: calc.

217,0; encontrado 217,1 (patrón de isótopos C1).

Etapa 2: Síntesis de 7-cloro-2,4-dimetil-2-(4-oxociclohexil)-2H-1,3- benzodioxol-5-carboxilato de metilo

Una mezcla de 5-cloro-3,4-dihidroxi-2-metilbenzoato de metilo (1,2 g, 5,53 mmol), trirrutenio dodecacarbonilo (176 mg, 276 pmol) y trifenilfosfina (145 mg, 553 pmol) se desgasificó al vacío y se purgó. con nitrógeno (3 ciclos). Se añadió tolueno (8,1 mL) y la mezcla de reacción se calentó a reflujo durante 30 min. Luego se añadió gota a gota una solución de 4-etinilciclohexan-1-ona (1,34 g, 11,0 mmol) en tolueno (17 mL) y la reacción se agitó durante 23 h a reflujo. Finalmente, la mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente y se concentró a sequedad a presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía de resolución instantánea (gel de sílice, gradiente de 0 a 60 % de acetato de etilo en heptano) para dar el compuesto del título (1,327 g, 70 % de rendimiento) en forma de un aceite amarillo. LCMS [M+Na]<+>m/z: calc. 361,1; encontrado 361,1 (patrón de isótopos C1).

Etapa 3: Separación de (R)-7-cloro-2,4-dimetil-2-(4-oxociclohexil)benzo[d][1,3]dioxol-5-carboxilato de metilo y (S)-7-cloro-2,4-dimetil-2-(4-oxociclohexil)benzo[d][1,3]dioxol-5-carboxilato de metilo

La mezcla racémica de 7-cloro-2,4-dimetil-2-(4-oxociclohexil)benzo[d][1,3]dioxol-5-carboxilato de metilo (4,4 g, 13 mmol) se resolvió mediante SFC preparativa [Columna: ChiralPak AY de Daicel chemical industries (250 mm x 50 mm D.I., 10 pm). Fase móvil A: CO<2>/ Fase móvil B: NH<4>OH al 0,1 % en metanol. Isocrático (85 % fase móvil A y 15 % fase móvil B). Caudal: 80 mL/min. Temperatura de la columna: 40 °C]. Compuesto Intermedio 4 (Pico 1) (enantiómero/distómero no deseado): Tiempo de retención = 6,2 min. Recuperación = 1,4 g, 4,05 mmol, 31 % de rendimiento, 90 % de ee, 98 % de pureza (sólido amarillo). 1H RMN (400 MHz, Cloroformo-d) 57,48 (s, 1H), 3,78 (s, 3H), 2,44 - 2,36 (m, 2H), 2,35 - 2,25 (m, 6H), 2,19 (tdd, J= 2,8, 5,6, 13,1 Hz, 2H), 1,70 - 1,57 (m, 5H). Compuesto Intermedio 4 (Pico 2) (enantiómero/eutómero deseado): Tiempo de retención = 7,0 min. Recuperación = 1,1 g, 3,08 mmol, 23,75 % de rendimiento, 99 % de ee, 95 % de pureza (sólido amarillo). 1H RMN (400 MHz, Cloroformo-d) 57,49 (s, 1H), 3,78 (s, 3H), 2,44 - 2,36 (m, 2H), 2,36 - 2,25 (m, 6H), 2,20 (tdd, J= 2,8, 5,6, 13,1 Hz, 2H), 1,72 - 1,59 (m, 5H). Método analítico<s>F<c>: [Columna: ChiralPak AY-3 (150 x 4,6 mm D.I., 3 pm). Fase móvil A: CO<2>/ Fase móvil B: Et<2>NH al 0,05 % en iPrOH. Gradiente: del 5 al 40 % de la fase móvil B (a lo largo de 5,5 min). Caudal: 2,5 mL/min. Temperatura de la columna: 40 °C]. Compuesto Intermedio 4 (Pico 1- enantiómero/distómero no deseado): Tiempo de retención = 2,853 min. Compuesto Intermedio 4 (Pico 2- enantiómero/eutómero deseado): Tiempo de retención = 2,979 min.

Compuesto intermedio 5: 7-cloro-2,4-dimetil-2-(trans-4-((3-(trifluorometil)oxetan-3-il)amino)ciclohexil)benzo[d][1,3]dioxol-5-carboxilato de metilo

Una mezcla de 1-cloro-N-[3-(trifluorometil)oxetan-3-il]hidrogenamina (678 mg, 3,82 mmol) y N,N-diisopropiletilamina (698 pL, 4,01 mmol) en dicloroetano (9,54 mL) se agitó a temperatura ambiente durante 30 min antes de añadir a esta mezcla de reacción ácido acético (218 pL, 3,82 mmol) seguido de metil-7-cloro-2,4-dimetil-2-(4-oxociclohexil)benzo[d][1,3]dioxol-5-carboxilato de metilo (650 mg, 1,91 mmol). Después de 5 min a temperatura ambiente, la mezcla se volvió transparente (amarilla/parda) y se añadió triacetoxiborohidruro de sodio (404 mg, 1,91 mmol). La reacción se agitó durante 3 h a temperatura ambiente y luego se extinguió con una solución acuosa saturada de bicarbonato de sodio (30 mL). El producto deseado se extrajo con diclorometano (30 mL x 3) y las capas orgánicas combinadas se secaron sobre sulfato de sodio, se filtraron y se concentraron a sequedad a presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía de resolución instantánea de fase inversa (columna C18, acetonitrilo/agua 1:1 con ácido trifluoroacético al 0,1 %) para dar dos isómeros geométricos (cis y trans). El primer pico de elución corresponde al Isómero geométrico 1.

Método analítico LCMS (para isómeros geométricos)

[Columna: Zorbax SB-C8 (75 * 4,6 mm D.I., 3,5 pm). Fase móvil A: ácido trifluoroacético al 0,1%en acetonitrilo / Fase móvil B: ácido trifluoroacético en agua. Gradiente: de 5 a 100 % de la fase móvil B (a lo largo de 3,0 min) seguido del 100 % de la fase móvil B (4,5 min). Caudal: 1,5 mL/min. Temperatura de la columna: 20 °C.] Isómero geométrico 1 (deseado): Tiempo de retención = 4,073 min (278 mg, 31 %). Isómero geométrico 2 (no deseado): Tiempo de retención = 4,277 min (253 mg, 29 %). ;;Los enantiómeros del Isómero geométrico 1 (deseado en base al método LCMS) se separaron mediante SFC preparativa [Columna: Chiralcel OX-H (250 * 21 mm D.I.). Fase móvil A: CO<2>/ Fase móvil B: 0,25 % de isopropilamina en una mezcla de isopropanol/hexano 1:1. Isocrático (85 % fase móvil A y 15 % fase móvil B). Caudal: 80 g/min. Temperatura de la columna: 25 °C]. Compuesto intermedio 5 (Pico 1): Tiempo de retención = 1,84 min. LCMS [M+H]+ m/z: calc. 464,15; encontrado 464. Compuesto intermedio 5 (Pico 2): Tiempo de retención = 2,1 min. LCMS [M+H]+ m/z: calc. 464,15; encontrado 464,2.

Compuesto Intermedio 6: 3-(ammometM)-4-cloro-6-metMpiridm-2(1H)-ona

Etapa 1: Síntesis de 2,4-dicloro-6-metilnicotinonitrilo

Una solución de 2,4-dihidroxi-6-metilnicotinonitrilo (80 g, 533,3 mmol) en oxicloruro de fósforo (150 mL) se agitó a 120 °C durante 2 h y luego se inactivó con una solución acuosa saturada de bicarbonato de sodio (hasta pH = 8). Se repartió entre agua (2000 mL) y acetato de etilo (1000 mL), la capa orgánica se secó sobre sulfato de sodio, se filtró y se concentró a sequedad a presión reducida para dar el compuesto del título (85 g, 86 % de rendimiento) en forma de una mezcla parda sólida, que se utilizó en la siguiente etapa sin purificación adicional. LCMS [M+H]+ m/z: calc. 186,98; encontrado 186,6.

Etapa 2: Síntesis de 2-cloro-4-hidroxi-6-metilnicotinonitrilo

A una solución de 2,4-dicloro-6-metilnicotinonitrilo (10 g, 53 mmol) en N,N-dimetilformamida (50 mL) se añadió acetato de cesio (30,8 g, 160 mmol) a temperatura ambiente. La reacción se agitó a 80 °C durante la noche y luego se extinguió con agua (800 mL). El producto deseado se extrajo con acetato de etilo (800 mL) y la capa orgánica se secó sobre sulfato de sodio, se filtró y se concentró a sequedad a presión reducida. El compuesto del título (8,8 g, rendimiento del 98 %) se obtuvo en forma de un sólido pardo y se utilizó en la siguiente etapa sin purificación adicional. LCMS [M+H]+ m/z: calc. 169,01; encontrado 168,8.

Etapa 3: Síntesis de 4-hidroxi-2-metoxi-6-metilnicotinonitrilo

Una mezcla de 2-cloro-4-hidroxi-6-metilnicotinonitrilo (8,8 g, 52,2 mmol) y metóxido de sodio (14,1 g, 261 mmol) en metanol (50 mL) se agitó a 60 °C durante la noche. La mezcla se inactivó con una solución 1 M de ácido clorhídrico hasta pH = 5. Se repartió entre agua (500 mL) y acetato de etilo (500 mL), la capa orgánica se secó sobre sulfato de sodio y se concentró para dar el compuesto del título (8,0 g, rendimiento del 93 %) en forma de un sólido pardo, que se utilizó en la siguiente etapa sin purificación adicional. LCMS [M+H]+ m/z: calc. 165,1; encontrado 164,8.

Etapa 4: 4-cloro-2-metoxi-6-metilnicotinonitrilo

Una mezcla de 4-hidroxi-2-metoxi-6-metilnicotinonitrilo (8,0 g, 48,7 mmol), pentacloruro de fósforo (20,3 g, 97,5 mmol), oxicloruro de fósforo (14,9 g, 9,09 mL, 97,5 mmol) y N,N-dimetilformamida (5 mL) en cloroformo (100 mL) se agitó a 60 °C durante 30 min. La reacción se extinguió con una solución acuosa saturada de bicarbonato de sodio (hasta pH = 8). Se repartió entre agua (1000 mL) y acetato de etilo (1000 mL), la capa orgánica se secó sobre sulfato de sodio y se concentró a sequedad para dar el compuesto del título (8,0 g, rendimiento del 90 %) en forma de un sólido pardo, que se utilizó en la siguiente etapa directamente sin purificación adicional. LCMS [M+H]+ m/z: calc. 183,0; encontrado 182,8.

Etapa 5: Síntesis de (4-cloro-2-metoxi-6-(metilpiridin-3-il)metanamina

A una solución de 4-cloro-2-metoxi-6-metilnicotinonitrilo (8,0 g, 43,8 mmol) en tetrahidrofurano (50 mL) se añadió complejo de borano-dimetilsulfuro (10 M, 5,3 mL, 53 mmol). La mezcla se agitó a 60 °C durante 2 h y luego se inactivó con metanol (10 mL) a 0 °C. La mezcla se concentró a sequedad a presión reducida para dar el compuesto del título (7,0 g, rendimiento del 93 %) en forma de un sólido pardo, que se utilizó en la siguiente etapa directamente sin purificación adicional. LCMS [M+H]+ m/z: calc. 187,1; encontrado 187,1.

Etapa 6: ((4-cloro-2-metoxi-6-metilpiridin-3-il)metil)carbamato de terc.-butilo

Una mezcla de (4-cloro-2-metoxi-6-metilpiridin-3-il)metanamina (7,0 g, 37,5 mmol), dicarbonato de di-terc.-butilo (15,2 g, 75,0 mmol) y trietilamina (11,4 g, 15,7 mL, 113 mmol) en tetrahidrofurano (50 mL) se agitó a 20 °C durante 16 h y luego se inactivó con agua (500 mL). El producto deseado se extrajo con acetato de etilo (500 mL) y la capa orgánica se secó sobre sulfato de sodio, se filtró y se concentró a sequedad a presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía de resolución instantánea (columna de gel de sílice, éter de petróleo:acetato de etilo 40:1) para dar el compuesto del título (3,0 g, rendimiento del 28 %) en forma de un aceite incoloro. LCMS [M+H]+ m/z: calc. 287,1; encontrado 286,9.

Etapa 7: 3-(aminometil)-4-cloro-6-metilpiridin-2(1 H)-ona

A una solución de cloruro de hidrógeno en agua (4 M, 10 mL, 10 mmol) se añadió ((4-cloro-2-metoxi-6-metilpiridin-3-il)metil)carbamato de terc.-butilo (3,0 g, 10,5 mmol) a temperatura ambiente. La reacción se calentó a 100 °C durante 2 h, luego se concentró a sequedad bajo presión reducida para dar el compuesto del título (1,7 g, rendimiento del 94 %) en forma de un sólido amarillo. LCmS [M+H]+ m/z: calc. 173,04; encontrado 173,1. 1H RMN (400 MHz, Metanol-04): 56,38 (s, 1H), 4,15 (s, 2H), 2,32 (s, 3H).

Compuesto intermedio 7: 7-cloro-2-(4-(3,3-difluoroazetidin-1-il)ciclohexil)-2,4-dimetilbenzo[d][1,3]dioxol-5-carboxilato de metilo

Etapa 1: Síntesis de 7-cloro-2-(4-(3,3-difluoroazetidin-1-il)ciclohexil)-2,4-dimetilbenzo[d][1,3]dioxol-5-carboxilato de metilo

Una solución de 7-cloro-2,4-dimetil-2-(4-oxociclohexil)benzo[d][1,3]dioxol-5-carboxilato de metilo (Compuesto intermedio 4 - mezcla racémica) 550 mg, 1,62 mmol), sal hidrocloruro de 3,3-difluoroazetidina (839 mg, 6,48 mmol) y trietilamina (895 pL, 6,64 mmol) en metanol (5 mL) y tetrahidrofurano (5 mL) se agitó durante la noche a temperatura ambiente. Al día siguiente, la reacción se enfrió a -78 °C y se añadió gota a gota una solución de borohidruro de litio (2 M en tetrahidrofurano, 1,21 mL, 2,43 mmol). La mezcla espesa de color amarillo se calentó gradualmente hasta temperatura ambiente y luego se inactivó con una solución acuosa saturada de carbonato de sodio a 0 °C. El producto deseado se extrajo con diclorometano (tres veces) y las capas orgánicas combinadas se secaron sobre sulfato de sodio, se filtraron y se concentraron hasta sequedad bajo presión reducida. El residuo se purificó dos veces mediante cromatografía de resolución instantánea (columna KP-NH de gel de sílice, gradiente de 0 a 20 % de acetato de etilo en heptano) para dar el compuesto del título (354 mg, 53 % de rendimiento) en forma de una mezcla racémica de un único isómero geométrico (cis o trans). LCm S [M+H]+ m/z: calc. 416,9; encontrado 416,2.

Etapa 2: Separación de (2R)-7-cloro-2-(4-(3,3-difluoroazetidin-1-il)ciclohexil)-2,4-dimetilbenzo[d][1,3]dioxol-5-carboxilato de metilo y (2S)-7-cloro-2-(4-(3,3-difluoroazetidin-1-il)ciclohexil)-2,4-dimetilbenzo[d][1,3]dioxol-5-carboxilato de metilo

La mezcla racémica de 7-cloro-2-(4-(3,3-difluoroazetidin-1 -il)ciclohexil)-2,4-dimetilbenzo[d][1,3]dioxol-5-carboxilato de metilo (560 mg) se resolvió mediante SFC preparativa [Columna: Chiralpak AD-H de Daicel chemical industries. Fase móvil A: CO<2>/ Fase móvil B: 0,25 % de isopropilamina en una mezcla de hexano y etanol (1:1). Isocrático (90 % fase móvil A y 10 % fase móvil B). Caudal: 80 g/min. Temperatura de la columna: 25 °C]. Método analítico SFC: Columna: Chiralpak AD-H de Daicel chemical industries (100 mm x 4,6 mm. Fase móvil A: CO2 / Fase móvil B: 0,1 % de isopropilamina en una mezcla de hexano y etanol (3:1). Isocrático (85 % fase móvil A y 15 % fase móvil B). Caudal: 4 mL/min. Temperatura de la columna: 40 °C. Compuesto intermedio 7 (Pico 1): Tiempo de retención = 1,02 min (método analítico SfC). Recuperación = 173 mg, rendimiento del 15 %, 96 % ee. 1H RMN (400 MHz, Cloroformo-d) 57,48 (s, 1H), 3,78 (s, 3H), 2,44 - 2,36 (m, 2H), 2,35 - 2,25 (m, 6H), 2,19 (tdd, J= 2,8, 5,6, 13,1 Hz, 2H), 1,70 - 1,57 (m, 5H). Compuesto intermedio 7 (Pico 2): Tiempo de retención = 1,16 min (método analítico SFC). Recuperación = 150 mg, rendimiento del 13 %, 97 % ee. LCMS [M+H]+ m/z: calc. 416,86; encontrado 416,2.

Compuesto intermedio 8: 7-cloro-2,4-dimetil-2-(1-(2,2,2-(trifluoroetil)piperidin-4-il)benzo[d][1,3]dioxol-5-carboxilato de perfluorofenilo

Etapa 1: Síntesis de 4-(7-cloro-5-(metoxicarbonil)-2,4-dimetilbenzo[d][1,3]dioxol-2-il)piperidina-1-carboxilato de terc.-butilo

En un matraz en forma de pera de 100 mL equipado con un condensador, una mezcla de 5-cloro-3,4-dihidroxi-2-metilbenzoato de metilo (1,219 g, 5,58 mmol), trifenilfosfina (146 mg, 0,558 mmol) y trirrutenio dodecacarbonilo (178 mg, 0,279 mmol) se purgó con ciclos de nitrógeno/vacío (4 ciclos), luego se añadió tolueno (12 mL), se purgó con ciclos de nitrógeno/vacío y luego se agitó a 120 °C durante 30 min. A la mezcla oscura se añadió una mezcla de 4-etinilpiperidina-1 -carboxilato de terc.-butilo (2,32 g, 11,1 mmol) en tolueno (10 mL). La solución naranja resultante se agitó durante otras 2 horas a 120 °C. La mezcla de reacción se concentró a presión reducida y luego se purificó mediante cromatografía de resolución instantánea (gel de sílice, gradiente de 0 a 100 % de acetato de etilo en heptano) para dar el compuesto del título (2,33 g, 98 %) en forma de un aceite amarillo. LCMS [M+Na]+ m/z: calc. 448,2; encontrado 448,2.

Etapa 2: Síntesis de 7-cloro-2,4-dimetil-2-(piperidin-4-il)benzo[d][1,3]dioxol-5-carboxilato de metilo (sal de ácido trifluoroacético)

A una solución amarilla de 4-[7-cloro-5-(metoxicarbonil)-2,4-dimetil-2H-1,3-benzodioxol-2-il]piperidina-1 -carboxilato de terc.-butilo (2,33 g, 5,47 mmol) en diclorometano (2 mL) se añadió TFA (1 mL). Después de 30 min, la reacción se concentró a presión reducida para dar el compuesto del título (2,40 g, cuant.) en forma de una goma, que se utilizó en la siguiente etapa sin purificación adicional. LCMS [M+H]+ m/z: calc. 326,79; encontrado 326,2.

Etapa 3: Síntesis de 7-cloro-2,4-dimetil-2-(1-(2,2,2-(trifluoroetil)piperidin-4-il)benzo[d][1,3]dioxol-5-carboxilato de metilo

<a>una solución ae /-cioro-2,4-aimetii-2-(piperiain-4-ii)-2H-i,3-Denzoaioxoi-5-carDoxnato ae metilo, sal ael aciao trifluoroacético (2,40 g, 5,45 mmol) en tolueno (20 mL) y acetonitrilo (10 mL) se añaaieron trietilamina (8 mL, 5/,6 mmol) y trifluorometanosulfonato ae 2,2,2-trifluoroetilo (3,0 g, 12,9 mmol). Después ae 3 h, la mezcla ae reacción se concentró a presión reauciaa. Se añaaió agua (50 ml) y la mezcla se extrajo con EtOAc (30 ml x 3). Las capas orgánicas combinaaas se lavaron con salmuera (50 ml x 2), se secaron sobre sulfato ae soaio, se filtraron y se concentraron a presión reauciaa y luego se purificaron meaiante cromatografía ae resolución instantánea (gel ae sílice, graaiente ae 0 a 50 % ae acetato ae etilo en heptano) para aar el compuesto ael título (2,04 g, 92 %) en forma ae un aceite amarillento. LCMS [M+H]+ m/z: calc. 408,81; encontrado 408,2.

Etapa 4: Síntesis de ácido 7-cloro-2,4-dimetil-2-(1-(2,2,2-(trifluoroetil)piperidin-4-il)benzo[d][1,3]dioxol-5-carboxílico

A una solución ae /-cloro-2,4-aimetil-2-[1-(2,2,2-trifluoroetil)piperiain-4-il]-2H-1,3-benzoaioxol-5-carboxilato ae metilo (691 mg, 1,69 mmol) en metanol (3 mL) se añaaió hiaróxiao ae soaio 6 M en agua (1 mL, 6,00 mmol) y se calentó a 60 °C. Después ae 25 min, la mezcla ae reacción se concentró a presión reauciaa para eliminar la mayor parte ael metanol. Luego la mezcla se ailuyó con agua, se enfrió a 0 °C y luego se neutralizó a pH = 7 con áciao clorhíarico 1 M. La mezcla se extrajo con aiclorometano (3 veces) y las capas orgánicas combinaaas se secaron sobre sulfato ae soaio, se filtraron y se concentraron a presión reauciaa para aar el compuesto ael título en forma ae un sóliao blanco que se utilizó en la siguiente etapa sin purificación aaicional. LCMS [M+H]+ m/z: calc. 394,79; encontrado 394,2.

Etapa 5: Síntesis de 7-cloro-2,4-dimetil-2-(1-(2,2,2-(trifluoroetil)piperidin-4-il)benzo[d][1,3]dioxol-5-carboxilato de perfluorofenilo

A una solución agitaaa ae áciao 7-cloro-2,4-aimetil-2-[1-(2,2,2-trifluoroetil)piperiain-4-il]-2H-1,3-benzoaioxol-5-carboxílico (665 mg, 1,68 mmol) en aiclorometano (5 mL) se añaaió piriaina (1 mL, 12,4 mmol) seguiao ae la aaición ae 2,2,2-trifluoroacetato ae 2,3,4,5,6-pentafluorofenilo (500 pL, 2,90 mmol). Después ae 20 min, la mezcla ae reacción se concentró a presión reauciaa para proporcionar el compuesto ael título, que se utilizó en la siguiente etapa sin purificación aaicional. LCMS [M+H]+ m/z: calc. 560,84; encontrado 560,2.

Compuesto Intermedio 9: Ácido 7-cloro-2-(4-(3-metoxiazetidin-1-il)ciclohexil)-2,4-dimetilbenzo[d][1,3]dioxol-5-carboxílico

Etapa 1: Síntesis de 7-cloro-2-(4-(3-metoxiazetidin-1-il)ciclohexil)-2,4-dimetilbenzo[d][1,3]dioxol-5-carboxilato de metilo

Una solución ae sal hiarocloruro ae 3-metoxiazetiaina (8 g, 64,75 mmol) y N,N-aiisopropiletilamina (12 mL, 68,9 mmol) en metanol (30 mL) se agitó a temperatura ambiente aurante 30 min antes ae que se añaaiera una solución ae otra solución ae 7-cloro-2,4-aimetil-2-(4-oxociclohexil)-1,3-benzoaioxol-5-carboxilato ae metilo (Compuesto intermeaio 4 -Pico 2) (4,1 g, 12,10 mmol) en tetrahiarofurano (30 mL). La mezcla ae reacción se agitó a temperatura ambiente aurante 1 h y luego se enfrió a -70 °C. Se añaaió borohiaruro ae litio (500 mg, 22,96 mmol) y la reacción se agitó a -70 °C aurante 30 min [o hasta que se observó el consumo completo ael material ae partiaa meaiante CCF, acetato ae etilo/metanol 5:1]. A continuación, se combinaron aos tanaas ae la reacción y se inactivaron con una solución acuosa saturaaa ae cloruro ae amonio (120 mL) a 0 °C y el proaucto aeseaao se extrajo con aiclorometano (200 mL x 3). Las capas orgánicas combinaaas se secaron sobre sulfato ae soaio, se filtraron y se concentraron a sequeaaa a presión reauciaa. El resiauo se purificó meaiante cromatografía ae resolución instantánea (gel ae sílice, graaiente ae 0 a 14 % de metanol en diclorometano) para dar el compuesto del título (8,05 g, rendimiento del 67 %, pureza del 83 %) en forma de un aceite amarillo. Se purificó adicionalmente una muestra (50 mg) mediante cromatografía preparativa en capa fina (gel de sílice, acetato de etilo:metanol 15:1). LCMS [M+H]+ m/z: calc. 410,2; encontrado 410,1. 1H RMN (400 MHz, Metanol-^) 57,39 (s, 1H), 3,95 - 3,91 (m, 1H), 3,73 (s, 3H), 3,59 - 3,51 (m, 2H), 3,16 (s, 3H), 2,97 (a dd, J= 6,4, 8,0 Hz, 2H), 2,26 (s, 3H), 2,11 - 2,02 (m, 1 H), 1,91 - 1,73 (m, 5H), 1,54 (s, 3H), 1,22 - 1,12 (m, 2H), 0,98 - 0,86 (m, 2H).

Etapa 2: Síntesis de ácido 7-cloro-2-(4-(3-metoxiazetidin-1-il)ciclohexil)-2,4-dimetilbenzo[d][1,3]dioxol-5-carboxílico

A una solución de 7-cloro-2-(4-(3-metoxiazetidin-1-il)ciclohexil)-2,4-dimetilbenzo[d][1,3]dioxol-5-carboxilato de metilo (4 g, 9,75 mmol ) en metanol (48 mL) se añadió una solución de hidróxido de litio hidrato (4,03 g, 96,06 mmol) en agua (12 mL). La reacción se agitó a 70 °C durante 2 h y luego se combinaron dos tandas y se concentraron a presión reducida. Se añadió agua (50 mL) y el pH se ajustó a 6 con una solución acuosa saturada de ácido cítrico a 0 °C. El producto deseado se extrajo con una mezcla 3:1 de diclorometano e isopropanol (300 mL x 5). Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre sulfato de sodio, se filtraron y se concentraron a sequedad a presión reducida para dar el compuesto del título (6,1 g, bruto) en forma de un sólido blanquecino, que se utilizó en la siguiente etapa sin purificación adicional.<l>C<m>S [M+H]+ m/z: calc. 396,2; encontrado 396,1. 1H RMN (400 MHz, Metanol-a4) 57,07 (s, 1 H), 4,05 - 4,10 (m, 2H), 3,76 - 3,88 (m, 1H), 3,67 (a dd,J=10, 3,6 Hz, 2H), 3,22 (s, 3H), 2,71 - 2,81 (m, 1 H), 2,19 (s, 3H), 1,91 - 1,99 (m, 4H), 1,75 - 1,85 (m, 1H), 1,52 (s, 3H), 1,18 - 1,28 (m, 2H), 1,06 - 1,14 (m, 2H).

Ejemplo n° 1: 7-cloro-2-(4-(3-(difluorometoxi)azetidin-1-il)ciclohexil)-2,4-dimetil-N-((6-metil-4-(metiltio)-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)benzo[d][1,3]dioxol-5-carboxamida

Etapa 1: Síntesis de 7-cloro-2-(4-(3-(difluorometoxi)azetidin-1-il)ciclohexil)-2,4-dimetilbenzo[d][1,3]dioxol-5-carboxilato de metilo

Una solución de 7-cloro-2,4-dimetil-2-(4-oxociclohexil)benzo[d][1,3]dioxol-5-carboxilato de metilo (Compuesto intermedio 4 - Pico 2) (224 mg, 0,661 mmol), 3-(difluorometoxi)azetidina (336 mg, 2,72 mmol) y sal hidrocloruro de trietilamina (373 mg, 2,71 mmol) en una mezcla de metanol (2 mL) y tetrahidrofurano (2 mL) se agitó a temperatura ambiente durante 1,5 h y luego se enfrió hasta -78 °C. Se añadió gota a gota una solución de borohidruro de litio en tetrahidrofurano (2 M, 500 pL, 1 mmol) a -78 °C antes de dejar que la reacción se calentara a temperatura ambiente durante 15 min. A continuación, la mezcla se enfrió a 0 °C y luego se inactivó con una solución acuosa saturada de bicarbonato de sodio, se diluyó con diclorometano y se calentó a temperatura ambiente. El producto deseado se extrajo de la capa acuosa con diclorometano (tres veces) y las capas orgánicas combinadas se secaron utilizando un filtro hidrófobo y se concentraron a sequedad a presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía de resolución instantánea (gel de sílice, gradiente de 10 a 100 % de acetato de etilo en heptano y luego de 0 a 100 % de etanol en acetato de etilo) para dar un único isómero geométrico (cis o trans) del compuesto del título (205 mg, rendimiento del 70 %). L<c>MS [M+H]+ m/z: calc. 445,9; encontrado 446,2.

Etapa 2: Síntesis de ácido 7-doro-2-(4-(3-(difluorometoxi)azetidm-1-M)ciclohexN)-2,4-dimetilbenzo[d][1,3]dioxol-5-carboxílico

A una solución de 7-doro-2-(4-(3-(difluorometoxi)azetidin-1-il)cidohexil)-2,4-dimetilbenzo[d][1,3]dioxol-5-carboxilato de metilo (205 mg, 0,460 mmol) en metanol (3 mL) se añadió una solución de hidróxido de sodio en agua (6 M, 1 mL, 6,00 mmol). La reacción se calentó a 60 °C durante 20 min, luego se diluyó con agua, se enfrió a 0 °C, se acidificó a pH = 2 con ácido clorhídrico 1 M y luego se neutralizó a pH = 7 con una solución acuosa de hidróxido de sodio 1 M. El producto deseado se extrajo con diclorometano (tres veces), se secó utilizando un filtro hidrófobo y se concentró a sequedad a presión reducida para dar el compuesto del título (176 mg, 89 % de rendimiento) en forma de un sólido blanco que se utilizó en la siguiente etapa sin purificación adicional. LCMS [M+H]+ m/z: calc. 431,9; encontrado 432,2.

Etapa 3: Síntesis de 7-doro-2-((1r,4R)-4-(3-(difluorometoxi)azetidm-1-M)ddohexN)-2,4-dimetilbenzo[d][1,3]dioxol-5-carboxilato de perfluorofenilo

A una solución de ácido 7-cloro-2-(4-(3-(difluorometoxi)azetidin-1-il)ciclohexil)-2,4-dimetilbenzo[d][1,3]dioxol-5-carboxílico (176 mg, 0,408 mmol) en diclorometano (0,5 mL) se añadió piridina (1,0 mL, 12,4 mmol) seguido de la adición de 2,2,2-trifluoroacetato de 2,3,4,5,6-pentafluorofenilo (150 |<j>L, 0,871 mmol) a temperatura ambiente. Después de 20 min, la mezcla de reacción se concentró a sequedad bajo presión reducida para dar una mezcla del compuesto del título (rendimiento teórico del 100 % = 243 mg) y subproductos. La mezcla bruta se utilizó en la siguiente etapa sin purificación adicional LCMS [M+H]+ m/z: calc. 597,91; encontrado 598,2.

Etapa 4: Síntesis de 7-doro-2-(4-(3-(difluorometoxi)azetidm-1-N)ddohexM)-2,4-dimetN-N-((6-metN-4-(metNtio)-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)benzo[d][1,3]dioxol-5-carboxamida

A una solución de 7-cloro-2-(4-(3-(difluorometoxi)azetidin-1-il)ciclohexil)-2,4-dimetilbenzo[d][1,3]dioxol-5-carboxilato de perfluorofenilo (< 243 mg, < 0,406 mmol) en dimetilsulfóxido (1 mL) se añadió 3-(aminometil)-6-metil-4-(metiltio)piridin-2(1 H)-ona (sal hidrocloruro) (Compuesto intermedio 1) (222 mg, 1,20 mmol) y N,N-diisopropiletilamina (0,30 mL 1,71 mmol). La mezcla de reacción se agitó a 60 °C durante 1 h y luego se concentró a sequedad bajo un fuerte flujo de nitrógeno durante la noche. El residuo se purificó dos veces mediante cromatografía de resolución instantánea de fase inversa (columna C18, gradiente de 0 a 100 % de acetonitrilo en agua con ácido trifluoroacético al 0,1 %). El residuo se diluyó con diclorometano y una solución saturada de bicarbonato de sodio. La capa acuosa se lavó con diclorometano. Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre sulfato de sodio y se concentraron a presión reducida para dar el compuesto del título (166 mg, rendimiento del 68 % en dos etapas) como un único isómero geométrico (cis o trans). LCMS [M+H]+ m/z: calc. 598,1; encontrado 598,3. 1H RMN (400 MHz, Metanol-d4) 56,88 (s, 1 H), 6,26 (s, 1 H), 6,38 (t, J= 74,3 Hz, 2 H), 4,71 (quin, J= 6,0 Hz, 1 H), 4,48 (s, 2 H), 3,69 - 3,60 (m, 2 H), 3,18 - 3,11 (m, 2 H), 2,52 (s, 3 H), 2,29 (s, 3 H), 2,18 (s, 3 H), 2,10 (tt,J=3,5, 11,2 Hz, 1 H), 1,98 - 1,86 (m, 4 H), 1,85 - 1,78 (m, 1 H), 1,60 (s, 3 H), 1,32 - 1,21 (m, 2 H), 1,06 - 0,92 (m, 2 H).

Tabla 1.El siguiente compuesto se preparó de manera similar al Ejemplo 1 utilizando el material de partida apropiado.

Ejemplo n° 3: (R)-7-doro-N-((6-doro-4-(metMtio)-2-oxo-1,2-dihidropiridm-3-M)metM)-Z-(trans-4-(dimetilamino)ciclohexil)-2,4-dimetilbenzo[d][1,3]dioxol-5-carboxamida

A una solución de ácido (R)-7-cloro-2-(trans-4-(dimetilamino)ciclohexil)-2,4-dimetilbenzo[d][1,3]dioxol-5-carboxílico (preparada de acuerdo con el procedimiento descrito en la solicitud de patente US2017/0073335 A1) (48 mg, 0,1356 mmol) en dimetilsulfóxido (0,5 mL) se añadió trietilamina (56,6 ^L, 0,407 mmol) y hexafluorofosfato de O-(7-azabenzotriazol-1-il)-N,N,W,W-tetrametiluronio (41,2 mg, 0,108 mmol) a temperatura ambiente. Dado que la formación del éster activado fue incompleta por LCMS ([M+H]+ m/z: 368,2) después de 5 min, se añadió dos veces hexafluorofosfato de 0-(7-azabenzotriazol-1-il)-N,N,W,N'-tetrametiluronio adicional (16 mg, 0,042 mmol) en dimetilsulfóxido (1 mL). Después de completar la activación del ácido, se añadió una suspensión de sal hidrocloruro de 3-(aminometil)-6-cloro-4-(metilsulfanil)-1,2-dihidropiridin-2-ona (65,3 mg, 0,271 mmol) y trietilamina (56,6 ^L, 0,407 mmol) en dimetilsulfóxido (0,5 mL) a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se calentó a 60 °C durante 45 min y luego se diluyó con diclorometano y agua. La capa orgánica se secó utilizando un filtro hidrófobo y se concentró a sequedad a presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía de resolución instantánea [columna KP-NH de gel de sílice, gradiente de 0 a 100%de acetato de etilo en heptano, luego de 0 a 100%de etanol en diclorometano, luego de 0 a 100 % de metanol (con 20 % de hidróxido de amonio) en acetato de etilo] para dar el compuesto del título (30 mg, rendimiento del 41 %) en forma de un sólido blanco. LCMS [M+H]+ m/z: calc. 540,5; encontrado 540,2. 1H RMN (400 MHz, M etano ld) 56,89 (s, 1H), 6,68 (s, 1H), 4,50 (s, 2H), 3,20 (tt,J=3,2, 11,9 Hz, 1H), 2,83 (s, 6H), 2,53 (s, 3H), 2,18 (s, 3H), 2,16 - 2,08 (m, 4H), 2,02 - 1,94 (m, 1H), 1,62 (s, 3H), 1,54 (dq,J=3,4, 12,4 Hz, 2H), 1,47 - 1,37 (m, 2H).

Tabla 2.Los siguientes compuestos se prepararon de manera similar al Ejemplo 3 utilizando el material de partida apropiado.

Ejemplo n° 6 (Enantiómero 1): 7-cloro-N-((6-cloro-4-(metiltio)-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)-2-(4-(dimetilamino)ciclohexil)-2,4-dimetilbenzo[d][1,3]dioxol-5-carboxamida

Etapa 1: Síntesis de ácido 7-cloro-2,4-dimetil-2-(4-((3-(trifluorometil)oxetan-3-il)amino)ciclohexil)benzo[d][1,3]dioxol-5-carboxílico

A una solución de 7-cloro-2,4-dimetil-2-[4-{[3-(trifluorometil)oxetan-3-il]amino}ciclohexil]-2H-1,3-benzodioxol-5-carboxilato de metilo (Compuesto intermedio 5 - Pico 1) (81 mg, 0,174 mmol) en metanol (1 mL) se añadió hidróxido de sodio (72 mg, 1,79 mmol). La mezcla de reacción se calentó a 60 °C durante 20 min, se enfrió a 0 °C y luego se acidificó a pH = 2 con ácido clorhídrico 1 M. Luego se extrajo el producto deseado con diclorometano (tres veces) y las capas orgánicas combinadas se secaron utilizando un filtro hidrófobo. El filtrado se concentró a sequedad a presión reducida para dar el compuesto del título (70 mg, 89 % de rendimiento) en forma de un sólido blanco, que se utilizó en la siguiente etapa sin purificación adicional. LCMS [M+H]+ m/z: calc. 450,1; encontrado 450,2.

Etapa 2: Síntesis de 7-cloro-2,4-dimetil-2-(4-((3-(trifluorometil)oxetan-3-il)amino)ciclohexil)benzo[d][1,3]dioxol-5-carboxilato de perfluorofenilo

A una solución de ácido 7-cloro-2,4-dimetil-2-(4-((3-(trifluorometil)oxetan-3-il)amino)ciclohexil)benzo[d][1,3]dioxol-5-carboxílico (70 mg, 155 |jmol) en diclorometano (0,5 mL) se añadió piridina (24,9 |jL, 310 |jmol) y 2,2,2-trifluoroacetato de 2,3,4,5,6-pentafluorofenilo (39,8 pL, 232 pmol) a temperatura ambiente. Después de 15 min, la reacción se concentró a presión reducida para dar una mezcla del compuesto del título y los subproductos (68 mg, bruta). La mezcla bruta se utilizó en la siguiente etapa sin purificación adicional LCMS [M+H]+ m/z: calc. 616,1; encontrado 616,2.

Etapa 3: Síntesis de 7-cloro-2,4-dimetil-N-((6-metil-4-(metiltio)-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)-2-(4-((3-(trifluorometil)oxetan-3-il)amino)ciclohexil)benzo[d] [1,3]dioxol-5-carboxamida

A una solución de 7-cloro-2,4-dimetil-2-[4-{[3-trifluorometil)oxetan-3-il]amino}ciclohexil]-2H-1,3-benzodioxol-5-carboxilato de 2,3,4,5,6-pentafluorofenilo (< 68 mg, < 110 pmol) en N,N-dimetilformamida (1 mL) se añadió 3-(aminometil)-6-metil-4-(metilsulfanil)-1,2-dihidropiridin-2-ona (base libre) (30,4 mg, 0,165 mmol) y N,N-diisopropiletilamina (0,1 mL, 574 pmol) a temperatura ambiente. La reacción se agitó a 50 °C durante 30 min y luego se añadió directamente a una columna C18 para su purificación mediante cromatografía de resolución instantánea de fase inversa (columna C18, gradiente de 5 a 50 % de acetonitrilo en agua con ácido trifluoroacético al 0,1 %) para dar la sal de ácido trifluoroacético del compuesto del título. La sal se disolvió en diclorometano y la capa orgánica se lavó con una solución acuosa saturada de bicarbonato de sodio. Finalmente, la capa orgánica se concentró a sequedad bajo presión reducida para dar el compuesto del título (base libre) (42 mg, rendimiento del 62 %) en forma de un sólido blanco. LCMS [M+H]+ m/z: calc. 616,19; encontrado 616,3. 1H RMN (400 MHz, Cloroformo-d) 512,62 - 12,44 (m, 1H), 7,16 (t, J= 5,1 Hz, 1H), 6,91 (s, 1H), 6,04 (s, 1H), 4,76 (s, 3H), 4,62 - 4,46 (m, 4H), 2,72 - 2,63 (m, 1H), 2,49 (s, 3H), 2,32 (s, 3H), 2,27 (s, 3H), 1,92 (d, J= 5,9 Hz, 4H), 1,80 (s a., 1H), 1,60 (s, 3H), 1,36 - 1,10 (m, 6H).

Tabla 3.Los siguientes compuestos se prepararon de manera similar alEjemplo 6utilizando el material de partida apropiado.

Ejemplo 8: 7-cloro-N-((4-cloro-6-metil-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)-2-(4-(3-ciclopropoxiazetidin-1-il)ciclohexil)-2,4-dimetilbenzo[d][1,3]dioxol-5-carboxamida

Etapa 1: Síntesis de 7-cloro-2-(4-(3-ciclopropoxiazetidin-1-il)ciclohexil)-2,4-dimetilbenzo[d][1,3]dioxol-5-carboxilato de metilo

Una solución de sal hidrocloruro de 3-(ciclopropoxi)azetidina (1,9 g, 12,7 mmol) y N,N-diisopropiletilamina (2,7 mL, 15,5 mmol) en metanol (10 mL) se agitó a temperatura ambiente durante 1 h antes de que se añadiera una solución de otra solución de 7-cloro-2,4-dimetil-2-(4-oxociclohexil)-1,3-benzodioxol-5-carboxilato de metilo (Compuesto intermedio 4 - Pico 2) (860 mg, 2,54 mmol) en tetrahidrofurano (30 mL). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1,5 h y luego se enfrió a -70 °C. Se añadió borohidruro de litio (120 mg, 5,51 mmol) y la reacción se agitó a -70 °C durante 30 min [o hasta que se observó el consumo completo del material de partida mediante CCF, acetato de etilo/metanol 5:1]. A continuación, la reacción se extinguió con una solución acuosa saturada de cloruro de amonio (100 mL) y el producto deseado se extrajo con acetato de etilo (50 mL x 2). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera (30 mL), se secaron sobre sulfato de sodio, se filtraron y se concentraron a sequedad a presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía de resolución instantánea (gel de sílice, gradiente de 50 a 100 % de acetato de etilo en éter de petróleo) para dar el compuesto del título (760 mg, rendimiento del 65 %, pureza del 95 %) en forma de un aceite amarillo.<l>C<m>S [M+H]+ m/z: calc. 436,1; encontrado 436,0.

Etapa 2: Síntesis de ácido 7-cloro-2-(4-(3-ciclopropoxiazetidin-1-il)ciclohexil)-2,4-dimetilbenzo[d][1,3]dioxol-5-carboxílico

A una solución de 7-cloro-2-(4-(3-ciclopropoxiazetidin-1-il)ciclohexil)-2,4-dimetilbenzo[d][1,3]dioxol-5-carboxilato de metilo (760 mg, 1,74 mmol) en metanol (15 mL) y agua (3 mL) se añadió hidróxido de litio hidrato (962 mg, 22,93 mmol). La reacción se agitó a 70 °C durante 15 h y luego se concentró a sequedad a presión reducida. Se añadió agua (15mL) y el pH se ajustó a 6 con una solución acuosa saturada de ácido cítrico a 0 °C. El producto deseado se extrajo con una mezcla 10:1 de diclorometano e isopropanol (30 mL x 3). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera (150 mL x 2), se secaron sobre sulfato de sodio, se filtraron y se concentraron a sequedad a presión reducida para dar el compuesto del título (720 mg, bruto) en forma de un sólido blanquecino, que se utilizó en la siguiente etapa sin purificación adicional.<l>C<m>S [M+H]+ m/z: calc. 422,1; encontrado 422,0.

Etapa 3: Síntesis de 7-cloro-N-((4-cloro-6-metil-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)-2-(4-(3-ciclopropoxiazetidin-1-il)ciclohexil)-2,4-dimetilbenzo[d][1,3]dioxol-5-carboxamida

A una solución de ácido 7-cloro-2-[4-[3-(ciclopropoxi)azetidin-1-il]ciclohexil]-2,4-dimetil-1,3-benzodioxol-5-carboxílico (360 mg, 0,853 mmol) en N,N-dimetilformamida (4 mL) se añadieron hexafluorofosfato de O-(7-azabenzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio (500 mg, 1,31 mmol) y N,N-diisopropiletilamina (1 mL, 5,74 mmol). La mezcla se agitó a 15 °C durante 30 min antes de añadir la sal hidrocloruro de 3- (aminometil)-4-cloro-6-metil-1H-piridin-2-ona (Compuesto intermedio 6) (250 mg, 1,2 mmol). La mezcla de reacción se agitó a 15 °C durante 4 h adicionales y luego se filtró. El filtrado se purificó mediante HPLC preparativa [Columna: Waters Xbridge (150 mm x 25 mm, 5 pm). Fase móvil A: agua (0,05 % de hidróxido de amonio v/v / Fase móvil B: acetonitrilo. Gradiente (65 a 55 % de fase móvil A / 35 a 65 % de fase móvil B, a lo largo de 9,5 min). Temperatura de la columna: 30 °C] para dar el compuesto del título (209 mg, rendimiento del 42 %) en forma de un sólido blanco. LCMS [M+H]+ m/z: calc. 576.2; encontrado 576,2. 1H RMN (400 MHz, Metanol-a4) 56,90 (s, 1H), 6,30 (s, 1H), 4,52 (s, 2H), 4,22 (quin, J= 6,0 Hz, 1H), 3,61 (dd, J= 6,4, 8,6 Hz, 2H), 3,31 - 3,25 (m, 1H), 2,99 (dd,J=6,3, 8,4 Hz, 2H), 2,28 (s, 3H), 2,20 (s, 3H), 2,12 - 2,04 (m, 1H), 1,99 - 1,85 (m, 5H), 1,62 (s, 3H), 1,33 - 1,24 (m, 2H), 1,06 - 0,95 (m, 2H), 0,56 - 0,51 (m, 2H), 0,51 - 0,44 (m, 2H).

Tabla 4. Los siguientes compuestos se prepararon de manera similar al Ejemplo8utilizando el material de partida apropiado.

Ejemplo 14: (R)-7-doro-2,4-dimetM-N-((6-metM-4-(metMtio)-2-oxo-1,2-dihidropiridm-3-M)metM)-2-(1-(2,2,2-trifluoroetil)piperidin-4-il)benzo[d][1,3]dioxol-5-carboxamida y (S)-7-doro-2,4-dimetN-N-((6-metN-4-(metNtio)-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)-2-(1-(2,2,2-trifluoroetil)piperidin-4-il)benzo[d][1,3]dioxol-5-carboxamida

Etapa 1: Síntesis de 7-doro-2,4-dimetM-N-((6-metM-4-(metMtio)-2-oxo-1,2-dihidropiridm-3-M)metM)-2-(1-(2,2,2-trifluoroetil)piperidin-4-il)benzo[d][1,3]dioxol-5-carboxamida

A una solución de 7-doro-2,4-dimetil-2-[1-(2,2,2-trifluoroetil) piperidin-4-il]-2H-1,3-benzodioxol-5-carboxilato de 2,3,4,5,6-pentafluorofenilo (Compuesto intermedio 8) (752 mg, 1,34 mmol) en dimetilsulfóxido (4 mL) se añadieron 3-(aminometil)-6-metil-4-(metilsulfanil)-1,2-dihidropiridin-2-ona (Compuesto intermedio 1) (740 mg, 4,02 mmol) y N,N-diisopropiletilamina (932 pL, 5,36 mmol). La mezcla de reacción se calentó a 60 °C y después de 1 h, se añadió a una columna C18 para su purificación. El producto deseado se purificó dos veces mediante cromatografía de resolución instantánea de fase inversa (columna C18, gradiente de 0 a 100 % de acetonitrilo en agua con ácido trifluoroacético al 0,1 %) para dar el compuesto del título (289 mg, rendimiento del 38 %) en forma de una mezcla racémica como una goma.

Etapa 2: Separación de (R)-7-cloro-2,4-dimetil-N-((6-metil-4-(metiltio)-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)-2-(1-(2,2,2-trifluoroetil)piperidin-4-il)benzo[d][1,3]dioxol-5-carboxamida y (S)-7-cloro-2,4-dimetil-N-((6-metil-4-(metiltio)-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)-2-(1-(2,2,2-trifluoroetil)piperidin-4-il)benzo[d][1,3]dioxol-5-carboxamida

La mezcla racémica de 7-cloro-2,4-dimetil-N-((6-metil-4-(metiltio)-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)-2-(1- (2,2,2-trifluoroetil)piperidin-4-il)benzo[d][1,3]dioxol-5-carboxamida (289 mg) se resolvió mediante SFC preparativa [Columna: ChromegaChiral CC4 de ES Industries (250 mm x 20 mm D.I.). Fase móvil A: CO<2>/ Fase móvil B: 0,25 % de isopropilamina en metanol. Isocrático (55 % fase móvil A y 45 % fase móvil B). Caudal: 80 g/min. Temperatura de la columna: 25 °C]. Método analítico SFC: Columna: Chiralcel OX-H de Chiral Technologies (100 mm x 4,6 mm D.I.). Fase móvil A: CO2 / Fase móvil B: 0,1 % de isopropilamina en metanol. Isocrático (75 % fase móvil A y 25 % fase móvil B). Caudal: 4 mL/min. Temperatura de la columna: 40 °C. Ejemplo 16 (Enantiómero 1) (enantiómero/eutómero deseado): Tiempo de retención = 3,74 min (método analítico SFC). Recuperación = 90 mg, rendimiento del 12 %, 99 % ee (sólido amarillo). LCMS [M+H]+ m/z: calc. 560,2; encontrado 560,2. 1H RMN (400 MHz, Metanol-a4) 56,89 (s, 1H), 6,27 (s, 1H), 4,49 (s, 2H), 3,08 - 2,98 (m, 4H), 2,52 (s, 3H), 2,34 (a t,J=11,0 Hz, 2H), 2,29 (s, 3H), 2,20 (s, 3H), 1,93 -1,84 (m, 1H), 1,83 - 1,76 (m, 2H), 1,62 (s, 3H), 1,60 - 1,47 (m, 2H). Ejemplo 16 (Enantiómero 2) (enantiómero/distómero no deseado): Tiempo de retención = 4,25 min (método analítico SFC). Recuperación = 101 mg g, rendimiento del 13 %, 98 % ee, (sólido amarillo). LCMS [M+H]+ m/z: calculado 560,2; encontrado 560,2. 1H RMN (400 MHz, Metanol-a4) 5 6,89 (s, 1H), 6,27 (s, 1H), 4,49 (s, 2H), 3,08 - 2,98 (m, 4H), 2,52 (s, 3H), 2,34 (a t,J=11,0 Hz, 2H), 2,29 (s, 3H), 2,20 (s, 3H), 1,93 - 1,84 (m, 1H), 1,83 - 1,76 (m, 2H), 1,62 (s, 3H), 1,60 - 1,47 (m, 2H).

Ejemplo 15: 7-cloro-N-((4-cloro-6-metil-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)-2-(4-(3-metoxiazetidin-1-il)ciclohexil)-2,4-dimetilbenzo[d][1,3]dioxol-5-carboxamida

A una solución de ácido 7-cloro-2-(4-(3-metoxiazetidin-1-il)ciclohexil)-2,4-dimetilbenzo[d][1,3]dioxol-5-carboxílico (900 mg, 2,27 mmol) en N,N-dimetilformamida (5 mL) se añadieron hexafluorofosfato de O-(7-azabenzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio (1,04 g, 2,73 mmol) y N,N-diisopropiletilamina (2,38 mL, 13,6 mmol). La mezcla se agitó a 25 °C durante 30 min antes de añadir la sal hidrocloruro de 3- (aminometil)-4-cloro-6-metil-1 H-piridin-2-ona (Compuesto intermedio 6) (710 mg, 3,4 mmol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1,5 h adicionales y luego se filtró. El filtrado se purificó dos veces mediante HPLC preparativa [Columna: YMC-Actus Triart C18 (100 mm x 30 mm, 5 pm). Fase móvil A: agua (ácido clorhídrico al 0,05 % / Fase móvil B: acetonitrilo. Gradiente (85 a 55 % de fase móvil A / 15 a 45 % de fase móvil B, a lo largo de 10 min). Temperatura de la columna: 30 °C y Columna: Xtimate C18 (150 mm x 25 mm, 5 pm). Fase móvil A: agua (0,05 % de hidróxido de amonio v/v / Fase móvil B: acetonitrilo. Gradiente (69 a 39 % de fase móvil A / 31 a 61 % de fase móvil B, a lo largo de 7 min). Temperatura de la columna: 30 °C] para dar el compuesto del título (533 mg, rendimiento del 43 %,> 99% de pureza) en forma de un sólido blanco. Lc Ms [M+H]+ m/z: calc. 550,2; encontrado 550,1. 1H RMN (400 MHz, Cloroformo-a) 5 11,97 (a, 1H), 7,06 - 7,03 (m, 1H), 6,88 (s, 1H), 6,19 (s, 1H), 4,65 (d, J= 6,0Hz, 2H), 4,05 - 4,01 (m, 1H), 3,66 - 3,62 (m, 2H), 3,25 (s, 3H), 2,93 - 2,90 (m, 2H), 2,28 (s, 3H), 2,25 (s, 3H), 1,93 - 1,81 (m, 6H), 1,60 (s, 3H), 1,25 - 1,02 (m, 4H).

Ejemplo 16: (R)-7-cloro-N-((4-cloro-6-metil-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)-2,4-dimetil-2-(1-(2,2,2-trifluoroetil)piperidin-4-il)benzo[d][1,3]dioxol-5-carboxamida y (S)-7-cloro-N-((4-cloro-6-metil-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)-2,4-dimetil-2-(1-(2,2,2-trifluoroetil)piperidin-4-il)benzo[d][1,3]dioxol-5-carboxamida

Etapa 1: Síntesis de 7-cloro-N-((4-cloro-6-metil-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)-2,4-dimetil-2-(1-(2,2,2-trifluoroetil)piperidin-4-il)benzo[d][1,3]dioxol-5-carboxamida

A una solución de 7-cloro-2,4-dimetil-2-[1-(2,2,2-trifluoroetil) piperidin-4-il]-2H-1,3-benzodioxol-5-carboxilato de 2,3,4,5,6-pentafluorofenilo (Compuesto intermedio 8) (188 mg, 0,3358 mmol) en dimetilsulfóxido (1 mL) se añadieron sal hidrocloruro de 3-(aminometil)-4-cloro-6-metil-1,2-dihidropiridin-2-ona (Compuesto intermedio 6) (70,2 mg, 0,336 mmol) y N,N-diisopropiletilamina (233 pL, 1,34 mmol). La mezcla de reacción se calentó a 60 °C y después de 1 h, se añadió a una columna C18 para su purificación. El producto deseado se purificó dos veces mediante cromatografía de resolución instantánea de fase inversa (columna C18, gradiente de 0 a 100 % de acetonitrilo en agua con ácido trifluoroacético al 0,1 %) para dar el compuesto del título (180 mg, rendimiento del 98 %) en forma de una mezcla racémica como una goma.

Etapa 2: Separación de (R)-7-cloro-N-((4-cloro-6-metil-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)-2,4-dimetil-2-(1-(2,2,2-trifluoroetil)piperidin-4-il)benzo[d][1,3]dioxol-5-carboxamida y (S)-7-cloro-N-((4-cloro-6-metil-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)-2,4-dimetil-2-(1-(2,2,2-trifluoroetil)piperidin-4-il)benzo[d][1,3]dioxol-5-carboxamida

La mezcla racémica de 7-cloro-N-((4-cloro-6-metil-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)-2,4-dimetil-2-(1-(2,2,2-trifluoroetil)piperidin-4-il)benzo[d][1,3]dioxol-5-carboxamida (180 mg) se resolvió mediante SFC preparativa [Columna: ChromegaChiral CC4 de ES Industries (250 mm x 20 mm D.I.). Fase móvil A: CO<2>/ Fase móvil B: 0,25 % de isopropilamina en metanol. Isocrático (65 % fase móvil A y 35 % fase móvil B). Caudal: 80 g/min. Temperatura de la columna: 25 °C]. Método analítico SFC: Columna: Chiralcel OZ-H de Chiral Technologies (100 mm x 4,6 mm D.I., xxpm). Fase móvil A: CO2 / Fase móvil B: 0,1 % de isopropilamina en metanol. Isocrático (65 % fase móvil A y 35 % fase móvil B). Caudal: 4 mL/min. Temperatura de la columna: 40 °C. Ejemplo 17 (Enantiómero 1) (enantiómero/eutómero deseado): Tiempo de retención = 0,73 min (método analítico SFC). Recuperación = 61 mg, rendimiento del 33 %, 100 % ee (sólido amarillo). Ejemplo 17 (Enantiómero 2) (enantiómero/distómero no deseado): Tiempo de retención = 0,98 min (método analítico SFC). Recuperación = 63 mg, rendimiento del 34 %, 97 ee, (sólido amarillo). LCMS [M+H]+ m/z: calc. 548,1; encontrado 548,2. 1H RMN (400 MHz, M etano l^) 56,89 (s, 1H), 6,29 (s, 1H), 4,52 (s, 2H), 3,04 (c, J= 9,8 Hz, 4H), 2,35 (a t,J= 11,0 Hz, H), 2,27 (s, 3H), 2,19 (s, 3H), 1,95 - 1,85 (m, 1H), 1,85 - 1,75 (m, 2H), 1,63 (s, 3H), 1,62 - 1,50 (m, 2H).

Ejemplo 17: 7-cloro-2-(4-(3-metoxiazetidin-1-il)ciclohexil)-2,4-dimetil-N-((6-metil-4-(metiltio)-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)benzo[d][1,3]dioxol-5-carboxamida

A una solución de ácido 7-cloro-2-(4-(3-metoxiazetidin-1-il)ciclohexil)-2,4-dimetilbenzo[d][1,3]dioxol-5-carboxílico (Compuesto intermedio 9 - enantiómero único e isómero geométrico) (5 g, 12,63 mmol) en N,N-dimetilformamida (50 mL) se añadió hexafluorofosfato de O-(7-azabenzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio (5,7 g, 14,99 mmol) y N,N-diisopropiletilamina (11 mL, 63,15 mmol). La mezcla se agitó a 20 °C durante 30 min antes de añadir la sal hidrocloruro de 3-(aminometil)-6-metil-4-(metiltio)piridin-2(1H)-ona (Compuesto intermedio 1) (4,2 g, 19,03 mmol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1,5 h adicionales y luego se filtró. El filtrado se purificó mediante HPLC preparativa [Columna: Phenomenex Gemini C18 (250 mm x 50 mm, 10 pm). Fase móvil A: agua (0,04 % de hidróxido de amonio v/v y bicarbonato de amonio 10 mM / Fase móvil B: acetonitrilo. Gradiente (75 a 44 % de fase móvil A / 25 a 56 % de fase móvil B, a lo largo de 23 min). Temperatura de la columna: 30 °C] para dar el compuesto del título (4,4 g, rendimiento del 60 %, 96 % de pureza) en forma de un sólido blanco. LCMS [M+H]<+>m/z: calc. 562.2; encontrado 562,2.<1>H RMN (400 MHz, Metanol-a<4>) 56,91 (s, 1H), 6,29 (s, 1H), 4,50 (s, 2H), 4,01 (quin,J=6 Hz, 1H), 3,58 (dd,J= 8,8, 6,4 Hz, 2H), 3,26 (s, 3H), 2,92 - 3,02 (m, 2H), 2,54 (s, 3H), 2,31 (s, 3H), 2,21 (s, 3H), 2,01 - 2,11 (m, 1H), 1,79 - 2,00 (m, 5H), 1,62 (s, 3H), 1,19 - 1,34 (m, 2H), 0,91 - 1,08 (m, 2H).

Ensayos EZH2

Mediciones de CI<50>para inhibidores utilizando EZH2

Ensayo bioquímico EZH2(CI<50>): Las potencias de los compuestos se evaluaron mediante la incorporación de<3>H-SAM en un péptido H3 biotinilado. Específicamente, se preincubó PRC2 30 pM que contenía EZH2 wt (complejo pentamérico preparado internamente) con SAM 450 nM,<3>H-SAM 450 nM, péptido activador H3K27me3 2 mM (H<2>N-RKQLATKAAR(Kme3)SAPATGGVKKP-amida) y compuestos (como valoraciones de dosis-respuesta duplicadas de 10 puntos en DMSO, ensayo final DMSO al 0,8 % (v/v)) durante 3-5 h en Tris 50 mM (pH 8,5), DTT 1 mM, Brij-350,07 mM, BSA al 0,1 % y DMSO al 0,8% en un volumen total de 12,5<m>I. La reacción se inició con péptido sustrato H3 biotinilado (H<2>N-RKQLATKAAR(Kmel)SAPATGGVKKP-NTPEGBiot) como una solución madre 2<m>M en 12,5 |M de tampón y se dejó reaccionar a temperatura ambiente durante 18-22 h. La extinción se logró mediante la adición de 20 Ml de solución STOP (Tris 50 mM (pH 8,5), EDTA 200 mM, SAH 2 mM). Se transfirieron 35 |M de la solución inactivada a FlashPlates recubiertas con estreptavidina (PerkinElmer), se incubaron durante 1-2 h, se lavaron y se leyeron en un lector TopCount (PerkinElmer). Las Cl<50>s se calcularon en Genedata Screener utilizando ajustes de cuatro parámetros de mínimos cuadrados no lineales, en que los cuatro parámetros fueron CI<50>, pendiente de Hill, valor inicial pretransicional (0 % INH) y valor inicial post-transicional (100 % INH).

Mediciones de CE<50>para Inhibidores en Ensayos de Células HeLa

Ensayo H3K27me3 Alpha Hela (AlphaLISA).Se sembraron diez dosis diferentes de cada uno de los compuestos de ensayo (en una serie de diluciones de 3 veces) por duplicado en placas tratadas con cultivo de tejidos de 384 pocillos (n° de catálogo 6007680; Perkin Elmer, Waltham, MA). Las células Hela cultivadas en cultivo se tripsinizaron y se contaron utilizando un contador de células Countess<®>(n° de catálogo C10281; Life Technologies, Grand Island, NY). Las células se diluyeron a razón de 67.000 células por mL en DMEM al 10 % (n° de catálogo 10569-010 Life Technologies, Grand Island, NY) y se sembraron 15<m>L (1.000 células) en cada uno de los pocillos utilizando el dispensador Biotek MicroFlo<™>Select (BioTek Instruments, Inc. Vermont, EE.UU.) de la placa de 384 pocillos. Las placas se incubaron a 37 °C/5 % de CO<2>durante 72 h. Una de las placas duplicadas se procesó para el ensayo HeLa y la otra para determinar la viabilidad. Se añadieron 5<m>L de tampón de lisis de histonas celulares (1X) (n° de catálogo AL009F1 Perkin Elmer; Waltham, MA) por pocillo a la placa procesada para AlphaLISA y la placa se incubó a TA durante 30 minutos en un agitador de placas a baja velocidad (modelo n° 4625-Q Thermo Scientific; Waltham, MA). Luego, se añadieron 10 mL por pocillo de tampón de extracción de histonas (n° de catálogo AL009F2; Perkin Elmer; Waltham, MA) y la placa se incubó adicionalmente a TA durante 20 min en un agitador de placas a baja velocidad. A continuación, se añadieron a cada uno de los pocillos 10 mL de una mezcla 5X de perlas aceptoras anti-K27me3 más anticuerpo anti-histona H3 (C-ter) biotinilado (diluido a 3 nM final) (n° de catálogo AL118 Perkin Elmer; Waltham, MA). La dilución de las perlas aceptoras y la anti-histona H3 se realizó en tampón de detección de histonas 1X (n° de catálogo AL009F3 Perkin Elmer; Waltham, MA) que se produjo diluyendo la solución madre 10X proporcionada. La placa se selló con un sellador de placas de aluminio y se incubó a 23 °C durante 60 min. A continuación, se añadieron 10 mL de solución 5X de perlas de donante de estreptavidina (n° de catálogo 6760002 Perkin Elmer; Waltham, MA) (20 Mg/mL final en tampón de detección de histonas 1X), = la placa se selló con sellador de placas de aluminio y se incubó a 23 °C durante 30 mín. Luego se leyeron las placas utilizando un lector EnVision-Alpha (modelo n° 2104 Perkin Elmer; Waltham, MA).

La viabilidad celular se analizó añadiendo 15 mL de Cell Titer Glo (n° de catálogo G9241 Promega Madison, WI) a cada uno de los pocillos con células con medio. Las placas se incubaron a TA durante 15-20 minutos en un agitador de placas a baja velocidad. Luego se leyeron las placas utilizando un lector EnVision-Alpha (modelo n° 2104 Perkin Elmer; Waltham, MA).

Mediciones de GI<50>para Inhibidores en Ensayos de Viabilidad Karpas-422

Líneas celulares Karpas-422 se obtuvieron de DSMZ (Braunschweig, Alemania) y se cultivaron en medio RPMI-1640. Todos los medios contenían suero bovino fetal (FBS) al 10 % y 1% de penicilina/estreptomicina (Invitrogen). Se sembraron 20.000 células por pocillo en placas recubiertas de compuesto de 96 pocillos. Las células se dividieron y se sembraron a la densidad de siembra original (basado en los recuentos de pocillos de DMSO) cada 4 días en placas que contenían inhibidores de EZH2 nuevos. Los números relativos de células se evaluaron mediante el ensayo de viabilidad de células luminiscentes Cell Titer-Glo (Promega) el Día 8. Se utilizó GraphPad Prism 5 para ajustar la curva y se informaron los valores de GI<50>. Los datos se muestran en laTabla 5.

Tabla 5.

Mediciones del Tiempo de Permanencia

Ensayo de tiempo de permanencia EZH2:Los tiempos de permanencia de los compuestos se evaluaron monitorizando la recuperación de la actividad enzimática después de una dilución de 100 veces del complejo enzima-inhibidor pre conformado (reacción de dilución) y comparándolo con la actividad de un control sin diluir con las mismas concentraciones finales de todos los reactivos (reacción de control). La actividad enzimática se midió mediante mediante la incorporación de 3H-SAM en un péptido H3 biotinilado. Para la reacción de dilución, se preincubó PRC2 20 nM que contenía EZH2 puro (complejo pentamérico preparado internamente) con péptido activador 1 |jM (H<2>N-RKQLATKAAR(Kme3)SAPATGGVKKP-amida) y el compuesto a 600 veces su Ki durante 2 h en 40 j L de tampón (Tris 50 mM, pH 8,5, DTT 4 mM, MgCh 1 mM, Brij-350,07 mM y BSA 0,1 mg/mL), luego se diluyó 100 veces y la reacción se inició transfiriendo 1,4 j L a un volumen de 138,6 j L de tampón que contiene péptido activador 1 j M, péptido sustrato 5,05<j>M (H<2>N-RKQLATKAARKSAPATGGVKKP-NTPEGbiot), SAM 1,01<j>M y 3H-SAM 1.01<j>M. Para la reacción de control, se preincubó PRC2 0,202 nM con péptido activador 1<j>M, SAM 1,01<j>M, 3H-SAM 1,01<j>M y compuesto a 6,06 veces su Ki durante 2 h en 138,6 j L de tampón, luego se inició la reacción mediante la adición de 1,4<j>E 500<j>M de péptido sustrato en agua. Las reacciones se extinguieron en diversos momentos que abarcaron hasta 10 horas, transfiriendo partes alícuotas de 8 j L del recipiente de reacción a una placa que contenía 8 j L por pocillo de solución STOP (Tris 50 mM, pH 8,5, EDTA 200 mM, SAH 2 mM). Después del último momento, se transfirieron 12<j>L de las soluciones inactivadas a un FlashPlate recubierto con estreptavidina (PerkinElmer) que contenía 40 j L por pocillo de solución STOP, se incubaron durante 1-8 h, se lavaron y se leyeron en un lector de placas TopCount (PerkinElmer).

Se utilizó un script personalizado para ajustar los datos del progreso de la reacción de control a una línea recta y los datos del progreso de la reacción de dilución:

en queyes el producto formado,tes el tiempo de reacción,Vies la velocidad inicial,vses la velocidad en estado estacionario ykobses la constante de velocidad para la transición de la fase de velocidad inicial de la curva al estado estacionario. fase de velocidad de la curva. Al ajustar los datos del progreso de la reacción de dilución,Vsse limitó a la pendiente de la línea ajustada a los datos del progreso de la reacción de control. El valor ajustado dekobsse transformó luego en tiempo de permanencia:

en que t es el tiempo de permanencia,Kies la constante de inhibición,[El]es la concentración de equilibrio calculada del complejo enzima-inhibidor, [E] es la concentración de equilibrio calculada de la enzima libre y [l] es la concentración de equilibrio calculada del inhibidor libre.

Mediciones de Permeabilidad Celular para Inhibidores en el ensayo MDCK

Cultivo celular:se sembraron células MDCK II (obtenidas de Piet Borst en el Instituto del Cáncer de los Países Bajos) sobre membranas de polietileno (PET) en sistemas de inserción BD de 96 pocillos a razón de 2,5 x 105 células/mL hasta 4-7 días para la formación de monocapa de células confluentes.

Procedimiento experimental:Los compuestos de ensayo y de referencia (nadolol, metoprolol y digoxina) se diluyeron con tampón de transporte (HBSS con Hepes 10 mM, pH 7,4) de la solución madre hasta una concentración de 2 |jM (DMSO al < 1 %) y se aplicaron al lado apical (A) o basolateral (B) de la monocapa celular. La permeación de los compuestos de ensayo desde la dirección A a B o desde la dirección B a A se determinó por duplicado con inhibidor de P-gp (GF120918, 10 j M). La digoxina también se testó a 10 j M en la dirección de A a B o la dirección de B a A con/sin inhibidor de P-gp (GF120918, 10 j M), mientras que nadolol y metoprolol se testaron a 2 j M en la dirección A a B sin inhibidor de P-gp (GF120918, 10 j M) por duplicado. La placa se incubó durante 2,5 horas en una incubadora de CO<2>a 37 ± 1 °C, con 5 % de CO<2>a humedad saturada sin agitación. Además, también se determinó la relación de eflujo de cada uno de los compuestos. Los compuestos de ensayo y de referencia se cuantificaron mediante análisis LC/MS/MS basándose en la relación del área del pico de analito/lS. Después del ensayo de transporte, se aplica el ensayo de rechazo del amarillo Lucifer para determinar la integridad de la monocapa celular. Los tampones se eliminan de las cámaras tanto apical como basolateral, seguido de la adición de 75<j>L de amarillo lucifer 100<j>M en tampón de transporte y 250<j>L de tampón de transporte en las cámaras apical y basolateral, respectivamente. La placa se incuba durante 30 minutos a 37 °C con 5 % de CO<2>y 95 % de humedad relativa sin agitación. Después de 30 minutos de incubación, se toman 20 j L de muestras de amarillo lucifer de los lados apicales, seguido de la adición de 60 j L de tampón de transporte. Y luego se toman 80<j>L de muestras de amarillo lucifer de los lados basolaterales. La unidad de fluorescencia relativa (RFU, por sus siglas en inglés) del amarillo lucifer se mide a 425/528 nm (excitación/emisión) con un lector de placas M2e de Molecular Device.

Análisis de datos:El coeficiente de permeabilidad aparente Papp (cm/s) se calculó utilizando la ecuación:

Papp = (dCr/dt)<X>V r / (A<X>Cfl)

en que dCr/dt es la concentración acumulada de compuesto en la cámara receptora en función del tiempo (|jM/s); Vr es el volumen de solución en la cámara receptora (0,075 mL en el lado apical, 0,25 mL en el lado basolateral); A es el área de superficie de transporte, es decir 0,0804 cm2 para el área de la monocapa; C<0>es la concentración inicial en la cámara del donante (jM).

La relación de eflujo se calculó utilizando la ecuación:

Relación Eflujo = Papp (BA) / Papp (AB)

El porcentaje de recuperación se calculó utilizando la ecuación:

% Recuperación = 100 x [(Vr v Cr) (Vd x Cd)] / (Vd x C<0>)

en que Vd es el volumen en las cámaras donantes (0,075 mL en el lado apical, 0,25 mL en el lado basolateral); Cd y Cr son las concentraciones finales del compuesto de transporte en las cámaras donante y receptora, respectivamente.

El porcentaje de amarillo lucifer en el pocillo basolateral se calcula utilizando la ecuación:

en que RFUApical y RFUBasolateralson los valores de unidad de fluorescencia relativa del amarillo lucifer en los pocillos apical y basolateral, respectivamente; VApical y VBasolateral son el volumen de los pocillos apicales y basolaterales (0,075 mL y 0,25 mL), respectivamente. El porcentaje de amarillo lucifer debe ser inferior a 2. Los datos se muestran en la Tabla 6.

Tabla 6

Claims (15)

1. REIVINDICACIONES 1. Un compuesto de Fórmula IV o VI:

   o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde: R1 es -SCH<3>o cloro; X es CH; Ra es hidrógeno, alquilo (C<1>-C<4>) o haloalquilo (C<1>-C<4>); Rb es alquilo (C<1>-C<4>), haloalquilo (C<1>-C<4>) o heterociclilo de 4-7 miembros, en donde dicho heterociclilo está opcionalmente sustituido con 1 a 3 grupos seleccionados de halo, alquilo (C<1>-C<4>), haloalquilo (C<1>-C<4>), alcoxi (C<1>-C<4>) y haloalcoxi (C<1>-C<4>); o Ra y Rb, junto con el átomo de nitrógeno al que están fijados, forman un heterociclilo de 4-7 miembros opcionalmente sustituido con 1 a 3 grupos seleccionados de halo, alquilo (C<1>-C<4>), haloalquilo (C<1>-C<4>) y -ORc; Rc es alquilo (C<1>-C<4>), haloalquilo (C<1>-C<4>) o cicloalquilo (C<3>-C<7>); R6 es haloalquilo (C<1>-C<4>).
2. 2. El compuesto de la reivindicación 1, en donde el compuesto tiene la Fórmula:

   o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
3. 3. El compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en donde Rb es alquilo (C<1>-C<4>) u oxetanilo, en donde dicho oxetanilo está opcionalmente sustituido con haloalquilo (C<1>-C<4>); o Ra y Rb junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos forman un azetidinilo opcionalmente sustituido con halo u -ORc.
4. 4. El compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde Raes hidrógeno o metilo; y Rb es metilo u oxetanilo, en donde dicho oxetanilo está opcionalmente sustituido con -CH<2>F o - CF<3>.
5. 5. El compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde Ra y Rb, junto con el átomo de nitrógeno al que están fijados, forman un azetidinilo opcionalmente sustituido con 1 a 2 fluoro u -ORc; y Rc es -CH<3>, -CHF<2>, o ciclopropilo.
6. 6. El compuesto de la reivindicación 1, en el que el compuesto tiene la fórmula:

   o

   o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
7. 7. El compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el grupo

   y NRaRb están orientados trans alrededor del ciclohexilo.
8. 8. El compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el grupo

   y NRaRb están orientados cis alrededor del ciclohexilo.
9. 9. El compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde la configuración estereoquímica del centro quiral del 1,3-dioxolanilo es R.
10. 10. El compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde la configuración estereoquímica del centro quiral del 1,3-dioxolanilo es S.
11. 11. El compuesto de la reivindicación 1, en donde el compuesto tiene la Fórmula:

    o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
12. 12. El compuesto de la reivindicación 11, en donde el compuesto tiene la Fórmula:

    o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
13. 13. Una composición farmacéutica que comprende el compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; y un soporte farmacéuticamente aceptable.
14. 14. Un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para uso en el tratamiento del cáncer en un sujeto.
15. 15. El compuesto para uso de la reivindicación 14, en donde el cáncer se selecciona de cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de colon, carcinoma de células renales, glioblastoma cáncer multiforme, cáncer de vejiga, melanoma, cáncer de bronquios, linfoma, colangiosarcoma, mieloma múltiple, cáncer de pulmón, cáncer de ovario y cáncer de hígado.