RS65621B1 - Modulatori enzima koji modifikuju metil, sastavi i njihova upotreba - Google Patents

Description

Opis

OSNOVNE INFORMACIJE

[0001] Eukariotski hromatin se sastoji od makromolekulskih kompleksa zvanih nukleozomi. Nukleozom ima 147 baznih parova DNK omotanih oko proteinskog oktamera koji ima dve podjedinice svakog histonskog proteina H2A, H2B, H3 i H4. Histonski proteini podležu posttranslacionim modifikacijama koje zauzvrat utiču na strukturu hromatina i ekspresiju gena. Jedna vrsta post-translacione modifikacije koja se nalazi na histonima je metilacija ostataka lizina i arginina. Metilacija histona igra kritičnu ulogu u regulaciji ekspresije gena kod eukariota. Metilacija utiče na strukturu hromatina i povezana je i sa aktivacijom i sa represijom transkripcije (Zhang and Reinberg, Genes Dev.15:2343-2360, 2001). Enzimi koji katalizuju vezivanje i uklanjanje metil grupa iz histona uključeni su u utišavanje gena, razvoj embriona, proliferaciju ćelija i druge procese.

[0002] Jednu klasu histon metilaza karakteriše prisustvo SET domena, koji se sastoji od oko 130 aminokiselina. EZH2 je primer humanog SET-domena koji sadrži metilazu. EZH2 se asocira sa EED (razvoj embrionskog ektoderma) i SUZ12 (supresor zeste 12 homologa) kako bi se formirao kompleks poznat kao PRC2 (represivni kompleks 2 polikomb grupe ) koji ima sposobnost tri-metilacije histona H3 na lizinu 27 (Cao and Zhang, Mol. Cell 15:57-67, 2004). PRC2 kompleksi takođe mogu uključivati RBAP46 i RBAP48 podjedinice. Drugi primer je srodna metilaza EZH1.

[0003] Onkogene aktivnosti EZH2 pokazale su brojne studije kod različitih tipova raka. ~15-20% GCB-DLBCL imaju mutaciju dobijanja funkcije u EZH2 (Y641 ostatak) i ove ćelije su preosetljive na inhibiciju EZH2 i in vitro i in vivo (McCabe et al, 2012; Bradley et al, 2014). U eksperimentima sa ćelijskim linijama, prekomerna ekspresija EZH2 izaziva ćelijsku invaziju, rast u mekom agaru i motilitet, dok isključivanje EZH2 inhibira ćelijsku proliferaciju i ćelijsku invaziju (Kleer et al., 2003, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 100:11606-11611; Varambally et al., (2002), "The polycomb group protein EZH2 is involved in progression of prostate cancer," Nature 419, 624-629). Pokazano je da EZH2 potiskuje ekspresiju nekoliko supresora tumora, uključujući E-kaderin, DAB2IP i RUNX3 između

ostalih. U ksenografskim modelima, EZH2 isključivanje inhibira rast tumora i metastaze.

Pokazano je da negativna modulacija EZH2 u mišjim modelima blokira metastaze raka

prostate (Min et al., An oncogene-tumor suppressor cascade drives metastatic prostate cancer

by coordinately activating Ras and nuclear factor- kappaB, “Nat Med.2010 Mar; 16(3):286-

94). Nedavno je pokazano da je EZH2 prekomerno eksprimiran u neuroendokrinim tumorima

i da inhibicija EZH2 kod mišjih tumora obnavlja zavisnost od androgena (Ku et al, Science,

355, 2017). Prekomerna ekspresija EZH2 povezana je sa agresivnošću određenih karcinoma

kao što je rak dojke (Kleer et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 100:11606-11611, 2003).

Nedavne studije takođe sugerišu da onkogeni fuzioni gen TMPRSS2-ERG specifičan za rak

prostate indukuje represivne epigenetske programe putem direktne aktivacije EZH2 (Yu et

al., "An Integrated Network of Androgen Receptor, Polycomb, and TMPRSS2-ERG Gene

Fusions in Prostate Cancer Progression," Cancer Cell.2010 May 18;17(5):443-454). Patent

US2017/0073335 A1 se odnosi na jedinjenje sa inhibitornim dejstvom na aktivnost EZH1 i/ili

EZH2.

[0004] S obzirom na njihovu ulogu u regulaciji različitih bioloških procesa, enzimi koji

modifikuju metil, naročito u EZH2 i njegovim mutiranim oblicima, atraktivne su mete za

modulaciju.

SAŽETAK

[0005] Patentirani pronalazak je definisan u priloženim patentnim zahtevima. Konkretno, ono

što se patentira je jedinjenje formule IV ili VI:

ili njihova farmaceutski prihvatljiva so.

R<1>je -SCH3ili hloro;

X je CH;

R<a>je vodonik, (C1-C4)alkil ili halo(C1-C4)alkil;

R<b>je (C1-C4)alkil, halo(C1-C4)alkil ili 4-7-člani heterociklil, pri čemu je navedeni heterociklil opciono supstituisan sa 1 do 3 grupe izabrane između halo, (C1-C4)alkila, halo(C1-C4)alkila, (C1-C4)alkoksija i halo(C1-C4)alkoksija; ili

R<a>i R<b>zajedno sa atomom azota za koji su vezani formiraju 4-7-člani heterociklil opciono supstituisan sa 1 do 3 grupe izabrane između halo, (C1-C4)alkila, halo(C1-C4)alkila i -OR<c>;

R<c>je (C1-C4)alkil, halo(C1-C4)alkil ili (C3-C7)cikloalkil; i

R<6>je halo(C1-C4)alkil.

[0006] Takođe su patentirani farmaceutski sastavi koji se sastoje od ovih jedinjenja, kao i upotreba jedinjenja u lečenju raka kako je definisano u priloženim patentnim zahtevima.

[0007] Pronalazači su otkrili da ova i druga jedinjenja opisana u ovom dokumentu, kao i njihovi farmaceutski prihvatljivi sastavi, moduliraju aktivnost EZH2 (videti npr. Tabelu 5).

Takva jedinjenja uključuju ona koja imaju strukturnu formulu I:

ili njihovu farmaceutski prihvatljivu so, pri čemu je svaki od R<1>, R<2>, R<3>, R<4>, R<5>i X definisan ovde.

[0008] U jednom aspektu, takođe je nađeno da određena jedinjenja opisana u ovom dokumentu imaju povećano vreme zadržavanja (npr. > 100 sati) i poboljšanu permeabilnost. Utvrđeno je da je povećanje vremena zadržavanja (tj. sporija brzina otpuštanja) i/ili permeabilnost u korelaciji sa poboljšanom ćelijskom potentnošću.

[0009] Obelodanjena jedinjenja, farmaceutski prihvatljive soli i farmaceutski prihvatljivi sastavi korisni su za lečenje različitih stanja povezanih sa enzimima koji modifikuju metil. Ova stanja uključuju, npr., jedan ili više karcinoma.

DETALJAN OPIS

1. Opšti opis jedinjenja

[0010] Data su jedinjenja formule I:

ili njihova farmaceutski prihvatljiva so, pri čemu

R<1>je halo, -S(C1-C4)alkil, -S(C3-C7)cikloalkil, ili -S[halo(C1-C4)alkil];

X je CH ili N;

R<2>je vodonik, halo, (C1-C4)alkil ili halo(C1-C4)alkil;

R<3>je halo, (C1-C4)alkil ili halo(C1-C4)alkil;

R<4>je (C3-C7)cikloalkil ili 4-7-člani heterociklil, od kojih je svaki opciono supstituisan sa 1 do 3 grupe izabrane između halo, (C1-C4)alkila, halo(C1-C4)alkila, (C1-C4)alkoksija, halo(C1-C4)alkoksija i -NR<a>R<b>;

R<a>je vodonik, (C1-C4)alkil ili halo(C1-C4)alkil;

R<b>je (C1-C4)alkil, halo(C1-C4)alkil ili 4-7-člani heterociklil, pri čemu je navedeni heterociklil opciono supstituisan sa 1 do 3 grupe izabrane između halo, (C1-C4)alkila, halo(C1-C4)alkila, (C1-C4)alkoksija i halo(C1-C4)alkoksija; ili

R<a>i R<b>zajedno sa atomom azota za koji su vezani formiraju 4-7-člani heterociklil opciono supstituisan sa 1 do 3 grupe izabrane između halo, (C1-C4)alkila, halo(C1-C4)alkila i -OR<c>;

R<c>je (C1-C4)alkil, halo(C1-C4)alkil ili (C3-C7)cikloalkil; i

R<5>je halo, (C1-C4)alkil ili halo(C1-C4)alkil;

2. Definicije

[0011] Kada se koristi u vezi sa opisivanjem hemijske grupe koja može imati više tačaka vezivanja, crtica (-) označava tačku vezivanja te grupe za varijablu za koju je definisana. Na primer, -S(C3-C7)cikloalkil i -S[halo(C1-C4)alkil] znače da se tačka vezivanja za ovu grupu javlja na atomu sumpora.

[0012] Termini „halo“ i „halogen“ koji se ovde koriste odnose se na atom izabran iz grupa koje čine fluor (fluoro, -F), hlor (hloro, -Cl), brom (bromo, -Br) i jod (jodo, -I).

[0013] Termin „alkil“, kako se ovde koristi, odnosi se na monovalentni zasićeni ugljovodonični radikal ravnog ili razgranatog lanca, koji ima, osim ako nije drugačije navedeno, 1-10 atoma ugljenika. Primeri alkil radikala uključuju, ali nisu ograničeni na, metil, etil, n-propil, izopropil, n-butil, izo-butil, sec-butil, sec-pentil, izo-pentil, terc-butil, npentil, neopentil, n-heksil, sec-heksil i slično.

[0014] Termin „haloalkil“ uključuje mono, poli i perhaloalkilne grupe gde se halogeni biraju nezavisno između fluora, hlora, broma i joda.

[0015] „Alkoksi“ je alkil grupa koja je vezana za drugi deo preko kiseoničnog linkera (-O(alkil)). Neograničavajući primeri uključuju metoksi, etoksi, propoksi i butoksi.

[0016] „Haloalkoksi“ je haloalkilna grupa koja je vezana za drugi deo preko atoma kiseonika kao što je, npr, ali nije ograničeno na, -OCHCF2ili -OCF3.

[0017] Termin „cikloalkil“ se odnosi na 3-člani do 12-člani (npr.3-člani do 7-člani) monociklični, biciklični (npr. premošćeni ili spiro biciklični prsten) ili policiklični (npr. triciklični), sistem ugljovodoničnog prstena koji je potpuno zasićen. Monociklične cikloalkilne grupe uključuju, bez ograničenja na, ciklopropil, ciklobutil, ciklopentil, cikloheksil, cikloheptil i ciklooktil. Premošćene biciklične cikloalkilne grupe uključuju, bez ograničenja na, biciklo[3.2.1]oktan, biciklo[2.2.1]heptan, biciklo[3.1.0]heksan, biciklo[1.1.1]pentan i slično. Spiro biciklične cikloalkilne grupe uključuju, npr. spiro[3.6]dekan, spiro[4.5]dekan i slično. Kondenzovani cikloalkilni prstenovi uključuju, npr., dekahidronaftalen, oktahidropentalen i slično. Tamo gde je navedeno da su opciono supstituisani ili supstituisani, supstituenti na cikloalkilu (npr. u slučaju opciono supstituisanog cikloalkila) mogu biti prisutni na bilo kojoj supstituišućoj poziciji i, uključuju, npr, poziciju na kojoj je cikloalkilna grupa priključena.

[0018] Termin „heterociklil“ označava 3-12-člani (npr.4-, 5-, 6- i 7-člani) zasićeni ili delimično nezasićeni heterociklični prsten koji sadrži 1 do 4 heteroatoma nezavisno izabrana između N, O i S. Može biti monociklični, biciklični (npr. premošćeni, kondenzovani ili spiro biciklični prsten) ili triciklični. Termini „heterocikl“, „heterociklil“, „heterociklični prsten“, „heterociklična grupa“, „heterociklični deo“ i „heterociklični radikal“ se ovde koriste naizmenično. Heterociklični prsten može biti vezan za svoju bočnu grupu na bilo kom heteroatomu ili atomu ugljenika što rezultira stabilnom strukturom. Primeri takvih zasićenih ili delimično nezasićenih heterocikličkih radikala uključuju, bez ograničenja na, tetrahidrofuranil, tetrahidrotienil, terahidropiranil, pirolidinil, piridinonil, pirolidonil, piperidinil, oksazolidinil, piperazinil, dioksanil, dioksolanil, morfolinil, dihidrofuranil, dihidropiranil, dihidropiridinil, tetrahidropiridinil, dihidropirimidinil, oksetanil, azetidinil i tetrahidropirimidinil. Heterociklil grupa može biti mono- ili biciklična. Termin „heterociklil“ takođe uključuje, npr. nezasićene heterociklične radikale kondenzovane sa drugim nezasićenim heterocikličnim radikalom ili aril ili heteroaril prstenom, kao što su na primer tetrahidronaftiridin, indolinon, dihidropirolotriazol, imidazopirimidin, hinolinon, dioksaspirodekan. Tamo gde je navedeno da su opciono supstituisani ili supstituisani, supstituenti na heterociklilu (npr. u slučaju opciono supstituisanog heterociklila) mogu biti prisutni na bilo kojoj supstituišućoj poziciji i, uključuju, npr., poziciju na kojoj je heterociklil grupa priključena.

[0019] Termin „spiro“ se odnosi na dva prstena koja dele jedan atom prstena (npr. ugljenik).

[0020] Termin „kondenzovan“ se odnosi na dva prstena koji međusobno dele dva susedna atoma prstena.

[0021] Termin „premošćen“ odnosi se na dva prstena koji međusobno dele tri ili više atoma prstena.

[0022] Kao što se ovde koristi, „geometrijski izomer“ se odnosi na izomere koji se razlikuju u orijentaciji supstituentnih atoma u odnosu na cikloalkilni prsten, tj. cis ili trans izomere. Kada je obelodanjeno jedinjenje imenovano ili prikazano strukturom bez ukazivanja na određeni cis ili trans geometrijski oblik izomera, treba shvatiti da naziv ili struktura obuhvata jedan geometrijski izomer bez drugih geometrijskih izomera, smeše geometrijskih izomera ili smeše obogaćene jednim geometrijskim izomerom u odnosu na njegov odgovarajući geometrijski izomer.

[0023] Osim ako nije drugačije navedeno, kada je stereohemija obelodanjenog jedinjenja imenovana ili prikazana strukturom, imenovani ili prikazani stereoizomer je najmanje 60%, 70%, 80%, 90%, 99% ili 99,9% tež. čist u odnosu na sve ostale stereoizomere. Kada je pojedinačni enantiomer imenovan ili prikazan strukturom, prikazani ili imenovani enantiomer je najmanje 60%, 70%, 80%, 90%, 99% ili 99,9% tež. optički čist. Maseni procenat optičke čistoće je odnos mase enantiomera i mase enantiomera plus mase njegovog optičkog izomera. Enantiomeri se mogu razložiti metodama poznatim stručnjacima u ovoj oblasti, na primer formiranjem dijastereoizomernih soli koje se mogu razdvojiti, na primer, kristalizacijom; formiranjem dijastereoizomernih derivata ili kompleksa koji se mogu razdvojiti, na primer, kristalizacijom, superkritičnim fluidima ili tečnom hromatografijom; selektivnom reakcijom jednog enantiomera sa reagensom specifičnim za enantiomer, na primer enzimatskom esterifikacijom; ili superkritičnim fluidom ili tečnom hromatografijom u hiralnom okruženju, na primer na hiralnom nosaču, na primer, silicijum dioksidom sa vezanim hiralnim ligandom ili u prisustvu hiralnog rastvarača. Specifični enantiomeri se takođe mogu sintetizovati asimetričnom sintezom korišćenjem optički aktivnih reagenasa, supstrata, katalizatora ili rastvarača, ili pretvaranjem jednog enantiomera u drugi asimetričnom transformacijom.

[0024] Ako nije drugačije navedeno, kada je obelodanjeno jedinjenje imenovano ili prikazano po strukturi bez ukazivanja na stereohemiju, a jedinjenje ima najmanje jedan hiralni centar ili najmanje jedan geometrijski izomer, ili oboje, ime ili struktura obuhvataju jedan enantiomer ili geometrijski izomer jedinjenja bez odgovarajućeg optičkog izomera ili geometrijskog izomera, racemsku smešu jedinjenja i smeše obogaćene jednim enantiomerom ili geometrijskim izomerom u odnosu na njegov odgovarajući optički izomer ili geometrijski izomer.

[0025] Ako nije drugačije navedeno, kada su samo neki od stereohemijskih centara u obelodanjenom jedinjenju prikazani ili imenovani po strukturi, imenovana ili prikazana konfiguracija je obogaćena u odnosu na preostale konfiguracije, na primer, molarnim viškom od najmanje 60%, 70%, 80%, 90%, 99% ili 99,9%. Na primer, podstruktura:

znači da je konfiguracija oko hiralnog ugljenika stereohemijski obogaćena kao R (npr. molarnim viškom od najmanje 60%, 70%, 80%, 90%, 99% ili 99,9%) i da geometrija oko cikloheksila može biti cis ili trans, ili njihova smeša.

[0026] U određenim slučajevima, obelodanjeno jedinjenje je prikazano strukturom bez ukazivanja na stereohemiju, ali je identifikovano kao stereohemijski obogaćeno (npr.

„pojedinačni enantiomer; pojedinačni geometrijski izomer“ ili „pojedinačni enantiomer“ u slučajevima kada geometrijski izomeri nisu mogući). Na primer, ako nije drugačije navedeno,

Primer 1 (pojedinačni enantiomer; pojedinačni geometrijski izomer), znači da je konfiguracija oko hiralnog dioksolanil ugljenika stereohemijski obogaćena kao R (npr. molarnim viškom od najmanje 60%, 70%, 80%, 90%, 99% ili 99,9%) ili je stereohemijski obogaćena kao S (npr. molarnim viškom od najmanje 60%, 70%, 80%, 90%, 99% ili 99,9%) i da je geometrijska konfiguracija oko cikloheksilnog prstena obogaćena kao cis (npr. molarnim viškom od najmanje 60%, 70%, 80%, 90%, 99% ili 99,9%) ili je obogaćena kao trans (npr. molarnim viškom od najmanje 60%, 70%, 80%, 90%, 99% ili 99,9%).

[0027] Termin „pacijent“, kako se ovde koristi, označava životinju, kao što je sisar, i kao što je čovek. Termini „ispitanik“ i „pacijent“ mogu se koristiti naizmenično.

[0028] Termin „farmaceutski prihvatljiv nosač“ odnosi se na netoksični nosač, adjuvans ili vehikulum koji ne uništava farmakološku aktivnost jedinjenja sa kojim je formulisan.

Farmaceutski prihvatljivi nosači, adjuvansi ili vehikulumi koji se mogu koristiti u sastavima opisanim ovde uključuju, ali nisu ograničeni na, jonoizmenjivače, aluminijum oksid, aluminijum stearat, lecitin, serumske proteine, kao što je albumin humanog seruma, puferske supstance kao što su fosfati, glicin, sorbinska kiselina, kalijum sorbat, delimične mešavine glicerida zasićenih biljnih masnih kiselina, vode, soli ili elektrolita, kao što su protamin sulfat, dinatrijum hidrogen fosfat, kalijum hidrogen fosfat, natrijum hlorid, soli cinka, koloidni silicijum dioksid, magnezijum trisilikat, polivinilpirolidon, supstance na bazi celuloze, polietilen glikol, natrijum karboksimetilceluloza, poliakrilati, voskovi, polietilenpolioksipropilen-blok polimeri, polietilen glikol i lanolin.

[0029] Termini „tretman“, „tretirati“ i „lečenje“ odnose se na reverziju, ublažavanje ili inhibiranje napretka bolesti ili poremećaja, ili jednog ili više njihovih simptoma, kao što je ovde opisano. Tretman se takođe može nastaviti nakon što se simptomi povuku, na primer, kako bi se odložilo ili sprečilo ponavljanje.

[0030] Ovde se naizmenično koriste izrazi bolest, poremećaj i stanje.

[0031] Termin „efikasna količina“ ili „terapeutski efikasna količina“ odnosi se na količinu jedinjenja opisanu u ovom dokumentu koja će izazvati biološki ili medicinski odgovor ispitanika, npr. dozu između 0,01 - 100 mg/kg telesne mase/dan. Termini „ispitanik“ i „pacijent“ mogu se koristiti naizmenično i označavaju sisara kome je potrebno lečenje, npr. kućne životinje (npr. psi, mačke i slično), domaće životinje (npr. krave, svinje, konji, ovce, koze i slično) i laboratorijske životinje (npr. pacovi, miševi, zamorci i slično). Tipično, ispitanik je čovek kome je potrebna terapija.

[0032] Termini „inhibirati“, „inhibicija“ ili „inhibirajuće“ podrazumevaju redukciju osnovne aktivnosti biološke aktivnosti ili procesa.

[0033] Ovde opisana jedinjenja mogu biti prisutna u obliku farmaceutski prihvatljivih soli. Za primenu u lekovima, soli ovde opisanih jedinjenja odnose se na netoksične "farmaceutski prihvatljive soli". Farmaceutski prihvatljivi oblici soli uključuju farmaceutski prihvatljive kisele/anjonske ili bazne/katjonske soli. Pogodne farmaceutski prihvatljive kisele adicione soli ovde opisanih jedinjenja uključuju npr. soli neorganskih kiselina (kao što su hlorovodonična kiselina, bromovodonična, fosforna, azotna i sumporna kiselina) i organskih kiselina (kao što su sirćetna kiselina, benzensulfonska, benzoeva, metansulfonska i ptoluensulfonska kiselina).

3. Opis primera jedinjenja

[0034] U prvom primeru, ovo obelodanjivanje pruža jedinjenje formule I:

ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, pri čemu su promenljive kao gore za formulu I.

[0035] U drugom primeru, u jedinjenjima formule I,

R<1>je halo ili -S(C1-C4)alkil;

R<2>je halo.

R<3>je (C1-C4)alkil;

R<4>je (C3-C7)cikloalkil ili (C4-C7)heterociklil, od kojih je svaka opciono supstituisana sa 1 do 2 grupe izabrane između halo(C1-C4)alkila i -NR<a>R<b>;

1

R<a>je vodonik ili (C1-C4)alkil;

R<b>je (C1-C4)alkil ili (C4-C7)heterociklil, pri čemu je navedeni heterociklil opciono supstituisan sa halo(C1-C4)alkilom; ili

R<a>i R<b>zajedno sa atomom azota za koji su vezani formiraju 4-7-člani azot koji sadrži heterociklil opciono zamenjen sa 1 do 3 grupe izabrane između halo i -OR<c>;

R<c>je (C1-C4)alkil, halo(C1-C4)alkil ili (C3-C7)cikloalkil; i

R<5>je halo ili (C1-C4)alkil.

[0036] U trećem primeru, jedinjenje formule I je formule II:

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, pri čemu su preostale varijable kao što je gore opisano za Formulu I ili drugi primer.

[0037] U četvrtom primeru, R<1>u jedinjenju iz formule I ili formule II je hloro, pri čemu su preostale varijable kao što je gore opisano za formulu I ili drugi primer.

[0038] U petom primeru, R<1>u jedinjenju iz formule I ili formule II je -SCH3, pri čemu su preostale varijable kao što je gore opisano za formulu I ili drugi primer.

[0039] U šestom primeru, R<4>u jedinjenju iz formule I ili formule II je cikloheksil ili piperidinil, od kojih je svaki opciono supstituisan sa 1 do 2 grupe izabrane između halo(C1-C4)alkila i -NR<a>R<b>, pri čemu su preostale varijable kao što je gore opisano za formulu I ili drugi, četvrti ili peti primer.

[0040] U sedmom primeru, jedinjenje iz formule I ili formule II je formule III:

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, pri čemu je R<6>halo(C1-C4)alkil, i pri čemu su preostale varijable kao što je gore opisano za Formulu I ili drugi, četvrti ili peti primer.

[0041] U osmom primeru, jedinjenje iz formule I, formule II ili formule III je formule IV:

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, pri čemu su preostale varijable kao što je gore opisano za Formulu I ili drugi, četvrti, peti ili sedmi primer.

[0042] U devetom primeru, jedinjenje iz formule I ili formule II je formule V:

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, pri čemu su preostale varijable kao što je gore opisano za Formulu I ili drugi, četvrti ili peti primer.

[0043] U desetom primeru, jedinjenje iz formule I, formule II ili formule V je formule VI ili VII:

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, pri čemu su preostale varijable kao što je gore opisano za Formulu I ili drugi, četvrti ili peti primer.

[0044] U jedanaestom primeru, R<b>u jedinjenjima formule I, formule II, formule V, formule VI i formule VII je (C1-C4)alkil ili oksetanil, pri čemu je navedeni oksetanil opciono supstituisan sa halo(C1-C4)alkilom; ili R<a>i R<b>zajedno sa atomom azota za koji su vezani formiraju azetidinil opciono supstituisan sa halo ili -OR<c>, pri čemu su preostale varijable i karakteristike gore opisane za formulu I ili drugi, četvrti ili peti primer.

[0045] U dvanaestom primeru, R<a>u jedinjenjima formule I, formule II, formule V, formule VI i formule VII je vodonik ili metil; i R<b>je metil ili oksetanil, pri čemu je navedeni oksetanil opciono zamenjen sa -CH2F ili -CF3, pri čemu su preostale varijable i karakteristike opisane gore za formulu I ili drugi, četvrti, peti ili jedanaesti primer.

[0046] U trinaestom primeru, R<a>i R<b>u jedinjenjima formule I, formule II, formule V, formule VI i formule VII zajedno sa atomom azota za koji su vezani formiraju azetidinil opciono zamenjen sa 1 do 2 fluoro ili-OR<c>; a R<c>je -CH3, -CHF2ili ciklopropil, pri čemu su preostale varijable i karakteristike opisane gore za formulu I ili drugi, četvrti, peti ili jedanaesti primer.

[0047] U četrnaestom primeru, konfiguracija 1,3-dioksolanila i NR<a>R<b>grupe u bilo kojoj od formula I, II, V, VI i VII je orijentisana trans oko cikloheksila, pri čemu su preostale karakteristike kao što je gore opisano za formulu I ili drugi, četvrti, peti, šesti, jedanaesti, dvanaesti ili trinaesti primer. Alternativno, konfiguracija 1,3-dioksolanila i NR<a>R<b>grupe iz formula I, II, V, VI i VII su orijentisane cis oko cikloheksila, pri čemu su preostale karakteristike kao što je gore opisano za formulu I ili drugi, četvrti, peti, šesti, jedanaesti, dvanaesti ili trinaesti primer.

[0048] U petnaestom primeru, stereohemijska konfiguracija hiralnog centra 1,3-dioksolanila u bilo kojoj od formula I, II, III, IV, V, VI i VII je R, pri čemu su preostale karakteristike kao što je gore opisano za formulu I ili drugi, četvrti, peti, šesti, jedanaesti, dvanaesti, trinaesti ili četrnaesti primer. Alternativno, stereohemijska konfiguracija hiralnog centra 1,3-dioksolanila u bilo kojoj od formula I, II, III, IV, V, VI i VII je S, pri čemu su preostale karakteristike kao što je gore opisano za formulu I ili drugi, četvrti, peti, šesti, jedanaesti, dvanaesti, trinaesti ili četrnaesti primer.

[0049] Specifični primeri jedinjenja dati su u odeljku sa PRIMERIMA i ovde su uključeni kao deo četrnaestog primera. Uključene su i farmaceutski prihvatljive soli, kao i neutralni

1

oblici ovih jedinjenja. U jednom aspektu, ovo obelodanjivanje uključuje racemske oblike bilo kog jedinjenja opisanog u ovom dokumentu.

4. Upotrebe, formulacija i primena

[0050] U nekim otelotvorenjima, ovo obelodanjivanje pruža sastav koji se sastoji od jedinjenja opisanog u ovom dokumentu ili njegovog farmaceutski prihvatljivog derivata i farmaceutski prihvatljivog nosača. Količina jedinjenja u predviđenom sastavu je takva da je efikasna za merljivo modulisanje enzima koji modifikuje histon metil, ili njegovog mutanta, u biološkom uzorku ili kod pacijenta.

[0051] U određenim otelotvorenjima, ovde opisani sastav je formulisan za primenu kod pacijenta kome je potreban takav sastav. Sastavi opisani u ovom dokumentu mogu se primenjivati oralno, parenteralno, inhalacionim sprejom, topikalno, rektalno, nazalno, bukalno, vaginalno ili putem implantiranog rezervoara. Termin "parenteralno" kako se ovde koristi uključuje tehnike supkutane, intravenske, intramuskularne, intraartikularne, intrasinovijalne, intrasternalne, intratekalne, intrahepatičke, intralezione i intrakranijalne injekcije ili infuzije. U nekim otelotvorenjima, sastavi se primenjuju oralno, intraperitonealno ili intravenski. Sterilni injekcioni oblici ovde opisanih sastava mogu biti vodena ili uljna suspenzija. Ove suspenzije se mogu formulisati u skladu sa tehnikama poznatim u struci koristeći odgovarajuća sredstva za dispergovanje ili vlaženje i sredstva za suspenziju.

[0052] U nekim otelotvorenjima, sastavi se primenjuju oralno.

[0053] Specifična doza i režim tretmana za svakog određenog pacijenta zavisiće od različitih faktora, uključujući aktivnost određenog korišćenog jedinjenja, starost, telesnu masu, opšte zdravlje, pol, ishranu, vreme primene, brzinu izlučivanja, kombinaciju lekova i procenu lekara koji tretira i težinu određene bolesti koja se leči. Količina jedinjenja ovde opisanog u sastavu će takođe zavisiti od određenog jedinjenja u sastavu.

[0054] Ovde opisana jedinjenja i sastavi su generalno korisni za modulaciju aktivnosti jednog ili više enzima uključenih u epigenetsku regulaciju, a posebno EZH1 i EZH2 i, još preciznije, EZH2 i njihovih mutiranih oblika. U nekim otelotvorenjima, ovde opisana jedinjenja smanjuju ili potiskuju aktivnost EZH2. U nekim otelotvorenjima, ovde opisana jedinjenja su antagonisti aktivnosti EZH2. U nekim otelotvorenjima, ovde opisana jedinjenja smanjuju ili potiskuju aktivnost EZH1. U nekim otelotvorenjima, ovde opisana jedinjenja su antagonisti aktivnosti EZH1.

[0055] U nekim otelotvorenjima, ovde opisana jedinjenja i sastavi su korisni u lečenju bolesti i/ili poremećaja povezanih sa prekomernom ekspresijom EZH1 ili EZH2 i/ili ekspresijom mutantnog oblika EZH2, kao što su oni mutantni oblici koji menjaju aktivnost supstrata EZH2. Studija delecija EZH2, misens mutacija (sa pogrešnim kodirajućim značenjem) i mutacija pomeranja okvira čitanja (vanfaznih) sugeriše da EZH2 funkcioniše kao supresor tumora kod poremećaja krvi kao što su mijelodisplastični sindromi (MDS) i mijeloidne maligne bolesti (Ernst et al., Nat Genet.2010 Aug; 42(8):722-6; Nikoloski et al., Nat Genet.

2010 Aug; 42(8):665-7). U nekim otelotvorenjima, jedinjenja i sastavi opisani ovde su korisni u lečenju bolesti i/ili poremećaja povezanih sa prisustvom EZH2 koji ima mutaciju Y641N, Y641C, Y641F, Y641H, Y641S, A677G ili A687. U određenom aspektu ovog otelotvorenja, EZH2 ima mutaciju Y641N.

[0056] U nekim otelotvorenjima, ovo obelodanjivanje obezbeđuje jedinjenje, ili farmaceutski prihvatljivu so ili njen sastav, za upotrebu u lečenju ispitanika koji pati od bolesti i/ili poremećaja povezanih sa prekomernom ekspresijom EZH1 ili EZH2 i/ili ekspresijom mutantnog oblika EZH2. U nekim otelotvorenjima, gorenavedena upotreba dodatno obuhvata preliminarni korak određivanja da li je kod ispitanika prisutno prekomerno eksprimiranje EZH2 ili eksprimiranje mutantnog oblika EZH2. Opisane upotrebe jedinjenja u metodama terapijskog tretmana ljudskog ili životinjskog tela u sledećim stavovima nisu predmet patentnih zahteva i treba ih tumačiti kao jedinjenja za upotrebu u takvoj terapijskoj metodi/upotrebi. Obim pronalaska je definisan u priloženim patentnim zahtevima.

[0057] U nekim otelotvorenjima, bolest ili poremećaj povezan sa prisustvom mutiranog oblika EZH2 je humani limfom B ćelija. U nekim otelotvorenjima, bolest i/ili poremećaj povezan sa prisustvom Y641N EZH2 je folikularni limfom ili difuzni limfom velikih B ćelija. U nekim otelotvorenjima, jedinjenja ili sastavi opisani ovde su korisni u lečenju poremećaja krvi, kao što su mijelodisplastični sindromi, leukemija, anemija i citopenija. Sneeringer et al., "Coordinated activities of wild-type plus mutant EZH2 drive tumor-associated hypertrimethylation of lysine 27 on histone H3 (H3K27) in human B-cell lymphomas," Sneeringer et al., Proc. Natl Acad. Sci.2010 Dec; 109(48):20980-20985.

1

[0058] U nekim otelotvorenjima, jedinjenja i sastavi opisani u ovom dokumentu korisni su u lečenju bolesti i/ili poremećaja povezanih sa ćelijskom proliferacijom. U nekim otelotvorenjima, ovde opisana jedinjenja i sastavi su korisni u lečenju bolesti i/ili poremećaja povezanih sa pogrešnom regulacijom ćelijskog ciklusa ili popravkom DNK. U nekim otelotvorenjima, ovde opisana jedinjenja i sastavi su korisni u lečenju raka.

[0059] U jednom aspektu, kanceri koji se mogu tretirati jedinjenjima, sastavima i metodama ovde objašnjenim uključuju, ali ne i ograničeno na, kardijalne: sarkome (angiosarkom, fibrosarkom, rabdomiosarkom, liposarkom), miksome, rabdomiome, fibrome, lipome i teratome; plućne: bronhogeni karcinom (skvamoznih ćelija, nediferenciranih malih ćelija, nediferenciranih velikih ćelija, adenokarcinom), alveolarni (bronhiolarni) karcinom, bronhijalni adenom, sarkom, limfom, hondromatozni hamartom, mezoteliom; gastrointestinalne: ezofagusa (skvamoznog karcinoma ćelija, adenokarcinoma, leiomiosarkoma, limfoma), želuca (karcinoma, limfoma, leiosarkoma), pankreasa (duktalni adenokarcinom, insulinom, glukagonom, gastrinom, karcinoidni tumor, vipom), tankog creva (adenokarcinom, limfom, karcinoidni tumori, Kapoši sarkom, leiomiom, hemangiom, lipom, neurofibrom, fibrom), debelo crevo (adenokarcinom, tubularni adenom, venski adenom, hamartom, leiomiom); genitourinarnog trakta: bubrega (adenokarcinom, Vilmov tumor (nefroblastom), limfom, leukemija), bešike i uretre (karcinom skvamoznih ćelija, karcinom prelaznih ćelija, adenokarcinom), prostate (adenokarcinom, sarkom), testisa (seminom, teratom, embrionalni karcinom, teratokarcinom, horiokarcinom, sarkom, intersticijalni ćelijski karcinom, fibrom, fibroadenom, adenomatoidni tumori, lipom); jetre: hepatom (hepatocelularni karcinom), holangiokarcinom, hepatoblastom, angiosarkom, hepatocelularni adenom, hemangiom; koštane: osteogeni sarkom (osteosarkom), fibrosarkom, maligni fibrozni histiocitom, hondrosarkom, Evingov sarkom, maligni limfom (sarkom retikulumskih ćelija), multipli mijelom, maligni tumor gigantskih ćelija, hordom, osteohronfroma (osteokartilaginalne egzostoze), benigni hondrom, hondroblastom, hondromiksofibrom, osteoidni osteom i tumori gigantskih ćelija; nervnog sistema: lobanje (osteom, hemangiom, granulom, ksantom, osteitis deformans), moždanih ovojnica (meningiom, meningiosarkom, gliomatoza), mozga (astrocitom, meduloblastom, gliom, ependimom, germinom (pinealom), glioblastom multiform, oligodendrogliom, švanom, retinoblastom, kongenitalni tumori), neurofibrom kičmene moždine, meningiom, gliom, sarkom); ginekološke: materice (endometrijski karcinom), cerviksa (cervikalni karcinom, pretkancerogena cervikalna displazija), jajnika (karcinom jajnika (serozni cistadenokarcinom, mucinozni

1

cistadenokarcinom, bistrocelularni karcinom, neklasifikovani karcinom), tumori granulozatekalnih ćelija, tumori Sertoli-Lejdigovih ćelija, disgerminom, maligni teratom), vulve (karcinom skvamoznih ćelija, intraepitelni karcinom, adenokarcinom, fibrosarkom, melanom), vagine (karcinom bistrih ćelija, karcinom skvamoznih ćelija, botrioidni sarkom (embrionalni rabdomiosarkom), jajovoda (karcinom); hematološke: krvi (mijeloidna leukemija (akutna i hronična), akutna limfoblastna leukemija, hronična limfocitna leukemija, mijeloproliferativne bolesti, multipli mijelom, mijelodisplastični sindrom), Hodžkinova bolest, ne-Hodžkinova limfoma (maligna limfoma); kože: maligni melanom, karcinom bazalnih ćelija, karcinom skvamoznih ćelija, Kapošijev sarkom, mladeži displastični nevusi, lipomi, angiomi, dermatofibrom, keloidi, psorijaza; i nadbubrežne žlezde: neuroblastom.

[0060] U jednom aspektu, kancer tretiran ovde opisanim jedinjenjima, sastavima i metodama izabran je između karcinoma nadbubrežne žlezde, karcinoma acinskih ćelija, akustičnog neuroma, akralnog lentiginalnog melanoma, akrospiroma, akutne eozinofilne leukemije, akutne eritroidne leukemije, akutne limfoblastične leukemije, akutne megakarioblastične leukemije, akutne monocitne leukemije, akutne promielocitne leukemije, adenokarcinoma, adenoidnog cističnog karcinoma, adenoma, adenomatoidnog odontogenog tumora, adenoskvamoznog karcinoma, neoplazme masnog tkiva, adrenokortikalnog karcinoma, leukemije/limfoma odraslih T-ćelija, agresivne NK-ćelijske leukemije, limfoma povezanog sa AIDS-om, alveolarnog rabdomiosarkoma, sarkoma mekog dela alveolarnog tkiva, ameloblastičnog fibroma, anaplastičnog limfoma velikih ćelija, anaplastičnog karcinoma štitne žlezde, angioimunoblastičnog limfoma T-ćelija, angiomiolipoma, angiosarkoma, astrocitoma, atipičnog teratoidnog rabdoidnog tumora, hronične limfocitne leukemije B-ćelija, prolimfocitne leukemije B-ćelija, limfoma B-ćelija, karcinoma bazalnih ćelija, karcinoma bilijarnog trakta, karcinoma bešike, blastoma, karcinoma kostiju, Brenerovog tumora, Braunovog tumora, Burkitovog limfoma, karcinoma dojke, karcinoma mozga, karcinoma, karcinoma in situ, karcinosarkoma, tumora hrskavice, cementoma, mijeloidnog sarkoma, hondroma, hordoma, horiokarcinoma, horoidnog pleksus-papiloma, sarkoma bistrih ćelija bubrega, kraniofaringioma, limfoma kožnih T-ćelija, cervikalnog karcinoma, kolorektalnog karcinoma, Degosove bolesti, desmoplastičnog tumora malih okruglih ćelija, difuznog limfoma velikih B-ćelija, disembrioplastičnog neuroepitelnog tumora, disgerminoma, embrionalnog karcinoma, neoplazme endokrinih žlezda, endodermalnog tumora sinusa, enteropatije povezane sa T-ćelijskim limfomom, karcinoma jednjaka, fetusa in fetu, fibroma, fibrosarkoma, folikularnog limfoma, folikularnog karcinoma štitaste žlezde,

1

ganglioneuroma, gastrointestinalnog karcinoma, tumora zametnih ćelija, gestacijskog horiokarcinom, gigantocelularnog fibroblastoma, gigantocelularnog tumora kostiju, glijalnog tumora, multiformnog glioblastoma, glioma, gliomatoze mozga, glukagonoma, gonadoblastoma, tumora granuloznih ćelija, ginandroblastoma, karcinoma žučne kese, karcinoma želuca, leukemije vlasastih ćelija, hemangioblastoma, karcinoma glave i vrata, hemangiopericitoma, hematološkog maligniteta, hepatoblastoma, limfoma hepatospleničkih T-ćelija, Hodžkinovog limfoma, ne-Hodžkinovog limfoma, invazivnog lobularnog karcinoma, intestinalnog karcinoma, karcinoma bubrega, karcinoma grkljana, lentigo malignog melanoma, smrtonosnog karcinoma srednje linije, leukemije, tumora Lejdigovih ćelija, liposarkoma, karcinoma pluća, limfangioma, limfangiosarkoma, limfoepitelioma, limfoma, akutne limfocitne leukemije, akutne mijelogene leukemije, hronične limfocitne leukemije, karcinoma jetre, karcinoma malih ćelija pluća, karcinoma ne-malih ćelija pluća, MALTA limfoma, malignog fibroznog histiocitoma, malignog tumora ovojnice perifernog nerva, malignog triton tumora, limfoma ćelija plašta, limfoma B-ćelija marginalne zone, leukemije mastocita, tumora mediastinalnih germalnih ćelija, medularnog karcinoma dojke, medularnog karcinoma štitne žlezde, meduloblastoma, melanoma, meningioma, karcinoma Merkelovih ćelija, mezotelioma, metastatskog urotelijalnog karcinoma, mešovitog Milerovog tumora, mucinoznog tumora, multiplog mijeloma, neoplazme mišićnog tkiva, mycosis fungoides, miksoidnog liposarkoma, miksome, miksosarkoma, nazofaringealnog karcinoma, neurinoma, neuroblastoma, neurofibroma, neuroma, nodularnog melanoma, karcinoma oka, oligoastrocitoma, oligodendroglioma, onkocitoma, meningeoma omotača očnog nerva, tumora očnog nerva, karcinoma usne šupljine, osteosarkoma, raka jajnika, Pancoast tumora, papilarnog karcinoma štitaste žlezde, paraganglioma, epifizoblastoma, pineocitoma, pituicitoma, adenoma hipofize, tumora hipofize, plazmacitoma, poliembrioma, prekursor T-limfoblastičnog limfoma, primarnog limfoma centralnog nervnog sistema, primarnog efuzionog limfoma, primarnog peritonealnog karcinoma, raka prostate, raka pankreasa, raka ždrela, pseudomyxoma peritonei, karcinoma bubrežnih ćelija, medularnog karcinoma bubrega, retinoblastoma, rabdomioma, rabdomiosarkoma, Rihterove transformacije, raka rektuma, sarkoma, Švanomatoze, seminoma, tumora Sertolijevih ćelija, seminomatoznih tumora zametnih ćelija, karcinoma ćelija pečatnog prstena, raka kože, tumora malih plavih okruglih ćelija, karcinoma malih ćelija, sarkoma mekog tkiva, somatostatinoma, tumora skrotuma, tumora kičme, limfoma marginalne zone slezine, karcinoma skvamoznih ćelija, sinovijalnog sarkoma, Sezarijeve bolesti, karcinoma tankog creva, skvamoznog karcinoma, karcinoma želuca, limfoma T-ćelija, raka testisa, tekoma, karcinoma štitne žlezde, karcinoma

1

prelaznih ćelija, raka grla, karcinoma mokraćne cevi, urogenitalnog karcinoma, urotelijalnog karcinoma, uvealnog melanoma, karcinoma materice, karcinoma verukoznog puta, glioma optičkog nerva, vulvarnog karcinoma, vaginalnog karcinoma, Valdenstromove makroglobulinemije, Vartinovog tumora i Vilmsovog tumora.

[0061] U jednom aspektu, kancer tretiran jedinjenjima, sastavima i ovde opisanim metodama je izabran iz adenokarcinoma, leukemija/limfoma odrasle T-ćelije, raka mokraćne bešike, blastoma, raka kostiju, raka dojke, raka mozga, karcinoma, mijeloidnog sarkoma, raka grlića materice, kolorektalnog karcinoma, raka jednjaka, karcinoma gastrointestinalnog trakta, multiformnog glioblastoma, glioma, raka žučne kese, raka želuca, raka glave i vrata, Hodžkinovog limfoma, ne-Hodžkinovog limfoma, karcinoma creva, raka bubrega, raka grkljana, leukemije, raka pluća, limfoma, raka jetre, raka malih ćelija pluća, raka ne-malih ćelija pluća, mezotelioma, multiplog mijeloma, akutne mijeloične leukemije (AML), difuznog limfoma velikih B-ćelija (DLBCL), karcinoma oka, tumora očnog nerva, karcinoma usne šupljine, raka jajnika, tumora hipofize, primarnog limfoma centralnog nervnog sistema, raka prostate, raka pankreasa, raka ždrela, karcinoma bubrežnih ćelija, raka rektuma, sarkoma, raka kože, tumora kičme, raka tankog creva, raka želuca, limfoma T-ćelija, raka testisa, raka štitne žlezde, raka grla, urogenitalnog karcinoma, urotelijalnog karcinoma, raka materice, raka vagine, i Vilmsovog tumora.

[0062] U jednom aspektu, rak tretiran jedinjenjima, sastavima i primene ovde opisane izabrane su između raka dojke, raka prostate, raka debelog creva, karcinoma bubrežnih ćelija, multiformnog glioblastoma raka, raka bešike, melanoma, bronhijalnog raka, limfoma i raka jetre.

[0063] Takođe je predviđena upotreba jedinjenja opisanog u ovom dokumentu, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, ili sastava koji se sastoji od obelodanjenog jedinjenja ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, za proizvodnju leka za lečenje stanja opisanog u ovom dokumentu. Takođe je obezbeđeno jedinjenje opisano u ovom dokumentu, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, ili sastav koji se sastoji od obelodanjenog jedinjenja ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, za upotrebu u lečenju stanja opisanog u ovom dokumentu.

PRIMERI

[0064] Reprezentativni primeri koji slede imaju za cilj da pomognu u prikazu pronalaska.

1

PRIPREMA INTERMEDIJERA

Intermedijer 1: 3-(aminometil)-6-metil-4-(metiltio)piridin-2(1H)-on (so hidrohlorida)

[0065]

Korak 1: Sinteza natrijum 3-oksobut-1-en-1,1-bis(tiolat)

[0066] Smeša natrijum terc-butoksida (16,6 g, 172 mmol) u toluenu (30 ml) je degasirana pod vakuumom i očišćena azotom (3 ciklusa). Aceton (5,0 g, 6,4 ml, 86 mmol) je zatim dodat na 0°C, nakon čega je usledilo sporo dodavanje ugljen disulfida (6,6 g, 5,24 ml, 86 mmol). Dobijena smeša je mešana na 0°C tokom 4 sata, a zatim filtrirana. Filter kolač je osušen pod vakuumom da bi se dobilo naslovno jedinjenje (15,4 g, sirovo) u vidu žute čvrste supstance, koja je korišćena u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja.

Korak 2: Sinteza 4,4-bis(metiltio)but-3-en-2-ona

[0067] Rastvoru natrijum 3-oksobut-1-en-1,1-bis(tiolata) (15,4 g, 86,4 mmol) u metanolu (90 ml) polako je dodat jodometan (24,5 g, 10,7 ml, 173 mmol). Smeša je mešana 1 sat na 70°C, a zatim koncentrovana do suva. Dodata je voda (30 ml) i željeni proizvod je ekstrahovan sa etil acetatom (60 ml × 3). Kombinovani organski slojevi su osušeni preko natrijum sulfata i koncentrovani pod smanjenim pritiskom da bi se dobilo naslovno jedinjenje (6,8 g, 42% prinosa) kao braon ulje, koje je korišćeno u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja. LCMS

2

[M+H]<+>m/z: izrač.163,0; dobijeno 163,0.<1>H NMR (400 MHz, hloroform-d) δ 6.02 (s, 1H), 2.45 (s, 3H), 2.43 (s, 3H), 2.15 (s, 3H).

Korak 3: Sinteza 6-metil-4-(metiltio)-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-karbonitrila [0068] Rastvoru 4,4-bis(metiltio)but-3-en-2-ona (2,9 g, 18 mmol) i 2-cijanoacetamida (1,5 g, 18 mmol) u terc-butanolu (50 ml) dodat je natrijum terc-butoksid (1,9 g, 20 mmol). Smeša je tokom 12 sati mešana na 80°C (u ovoj fazi su izvedene i kombinovane dve serije reakcije). Dodata je voda (20 ml) i pH vrednost je podešena na 5-6 sa 10% hlorovodonične kiseline. Dobijena smeša je filtrirana, a filter kolač je ispran petrol etrom (20 ml × 2), zatim je kolač osušen pod vakuumom da bi se dobilo naslovno jedinjenje (4,8 g, 74% prinosa) u vidu čvrste supstance prljavobele boje, koja je korišćena u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja. LCMS [M+H]<+>m/z: izrač.181,0; dobijeno 181,0.<1>H NMR (400 MHz, Dimetilsulfoksid-d6) δ 6.27 (s, 1H), 2.56 (s, 3H), 2.25 (s, 3H).

Korak 4: Sinteza 3-(aminometil)-6-metil-4-(metiltio)piridin-2(1H)-ona

[0069] Smeša 6-metil-4-(metiltio)-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-karbonitrila (3,6 g, 20 mmol) u tetrahidrofuranu (50 ml) je degasirana pod vakuumom i očišćena azotom (3 ciklusa).

Kompleks boran dimetilsulfida (10 M, 8,0 ml, 80 mmol) je zatim polako dodat na 0°C pre nego što je reakciona smeša zagrejana na 70°C i mešana 2 sata. Metanol (15 ml) je polako dodavan na 0°C da bi se ugasila reakcija pre nego što je smeša koncentrovana pod smanjenim pritiskom da bi se dobilo naslovno jedinjenje (3,8 g, sirovo), u vidu svetložute čvrste supstance, koja je korišćena u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja. LCMS [M+H]<+>m/z: izrač.185,1; dobijeno 185,0.

Korak 5: Sinteza terc-butila ((6-metil-4-(metiltio)-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)karbamata

[0070] Rastvoru 3-(aminometil)-6-metil-4-(metiltio)piridin-2(lH)-ona (3,6 g, 20 mmol) u tetrahidrofuranu (80 ml) dodat je trietilamin (5,9 g, 8,1 ml, 59 mmol). Smeša je mešana 30 minuta pre nego što je dodat di-terc-butil dikarbonat (6,4 g, 29 mmol) i reakcija je mešana na 25°C tokom 12 sati. Reakciona smeša je zatim koncentrovana do suva pod smanjenim pritiskom, pre nego što je dodata voda (35 ml) i željeni proizvod ekstrahovan smešom 5:1 petrol etra/etil acetata (30 ml × 3). Kombinovani organski slojevi su osušeni preko natrijum sulfata i koncentrovani da bi se dobilo naslovno jedinjenje (5,8 g, sirovo) u vidu čvrste supstance bele boje, koja je korišćena u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja. LCMS [M+H]<+>m/z: izrač.285,12; dobijeno 284,9.<1>H NMR (400 MHz, Dimetilsulfoksid -d6) δ 6.05 (s, 1H), 4.03 - 4.00 (m, 2H), 2.42 (s, 3H), 2.15 (s, 3H), 1.39 (s, 9H).

Korak 6: Sinteza 3-(aminometil)-6-metil-4-(metiltio)piridin-2(1H)-ona (so hidrohlorida)

[0071] Rastvoru hlorovodonika u 1,4-dioksanu (4 M, 100 ml, 400 mmol) na 25°C dodat je terc-butil ((6-metil-4-(metiltio)-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)karbamat (5,0 g, 17,6 mmol). Reakciona smeša je mešana na 25°C tokom 2 sata, a zatim koncentrovana do suva pod smanjenim pritiskom. Ostatak je ispran dihlorometanom (30 ml × 2) i etil acetatom (30 ml) da bi se dobilo naslovno jedinjenje (4,5 g, sirova, HCl so) u vidu čvrste supstance žute boje, koja je korišćena u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja. LCMS [M+H]<+>m/z: izrač. 185,1; dobijeno 185,0.<1>H NMR (400 MHz, D2O) δ 6.31 (s, 1H), 4.03 (s, 2H), 2.41 (s, 3H), 2.18 (s, 3H).

Intermedijer 2: 5-(aminometil)-2-metil-6-(metiltio)pirimidin-4(3H)-on (so hidrohlorida)

[0072]

Korak 1: Sinteza metil 2-cijano-3,3-bis(metiltio)akrilata

[0073] Suspenzija natrijum hidrida (60% disperzija u mineralnom ulju) (4,23 g, 106 mmol) u tetrahidrofuranu (400 ml) je ohlađena na 0°C pre nego što je metil cijanoacetat (8,90 ml, 101 mmol) dodat kapanjem. Reakciona smeša je snažno mešana 15 minuta pre nego što je ugljen disulfid (6,1 ml, 101 mmol) dodat kap po kap uz održavanje temperature reakcije ispod 20 °C (bela polučvrsta supstanca je postala žuta). Sledeće, jodometan (15,7 ml, 252 mmol) je dodat kap po kap i reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi 15 minuta. Reakcija je zatim koncentrovana pod smanjenim pritiskom i ostatak je sipan u ledenu vodu. Dobijeni talog je filtriran i osušen pod vakuumom da bi se dobilo naslovno jedinjenje (11,9 g, 58% prinosa) u vidu čvrste supstance žute/smeđe boje, koja je korišćena u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja.<1>H NMR (400 MHz, Hloroform-d) δ 3.83 (s, 3H), 2.76 (s, 3H), 2.61 (s, 3H).

Korak 2: Sinteza 2-metil-4-(metiltio)-6-okso-1,6-dihidropirimidin-5-karbonitrila [0074] Metil 2-cijano-3,3-bis(metiltio)akrilat (11,9 g, 58,5 mmol) je rastvoren u etanolu (1000 ml). Acetamidin hidrohlorid (5,53 g, 58,5 mmol) i trietilamin (36,7 ml, 263 mmol) su dodati u smešu i mešani uz refluks preko noći. Zatim je reakcija koncentrovana pod smanjenim pritiskom i ostatak je ispran sa 10% hlorovodonične kiseline. Talog je filtriran, a filter kolač je ispran vodom i dietil etrom pre nego što je osušen pod vakuumom da bi se dobilo naslovno jedinjenje (5g, 47% prinosa) kao čvrsta supstanca, koja je korišćena u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja. LCMS [M+H]<+>m/z: izrač.182,03; dobijeno 182,10.<1>H NMR (400 MHz, Dimetilsulfoksid -d6) δ 2.57 (s, 3H), 2.37 (s, 3H).

Korak 3: Sinteza terc-butil ((2-metil-4-(metiltio)-6-okso-1,6-dihidropirimidin-5-il)metil)karbamata

[0075] Suspenziji 2-metil-4-(metiltio) -6-okso-1,6-dihidropirimidin-5-karbonitrila (1,5 g, 8,27 mmol) u tetrahidrofuranu (50 ml) na 0°C dodat je rastvor litijum aluminijum hidrida u tetrahidrofuranu (2 M, 6,2 ml, 12,4 mmol). Reakcija je polako zagrevana na sobnu temperaturu i, kada je završena, ugašena vodenim rastvorom natrijum hidroksida (1 M, 33 ml, 33,1 mmol). Ovoj smeši su sekvencijalno dodati 1,4-dioksan (50 ml) i di-tercbutildikarbonat (3,61 g, 16,6 mmol). Dvofazna smeša je snažno mešana do potpune zaštite amina. Bifazna smeša je sirćetnom kiselinom zakiseljena do neutralne pH vrednosti, izdvojena i vodeni sloj je ekstrahovan dihlorometanom. Kombinovani organski slojevi su osušeni preko magnezijum sulfata, filtrirani i koncentrovani do suva pod smanjenim pritiskom. Ostatak je isitnjen sa dihlorometanom i filtrat (koji sadrži željeni proizvod) je koncentrovan do suva pod smanjenim pritiskom. Dobijena čvrsta supstanca je prečišćena reverzno-faznom fleš hromatografijom (kolona C18, gradijent 5% do 95% acetonitrila u vodi puferovanoj sa 0,1% trifluoroacetatnom kiselinom), zatim normalnom faznom fleš hromatografijom (silikagel, gradijent 30% do 90% etil acetata u dihlorometanu) da bi se dobilo naslovno jedinjenje (2,57g, 26% prinosa, čistoća >99%) u vidu čvrste supstance bele boje. LCMS [M-(C4H8)+H]<+>m/z: izrač.230,1; dobijeno 230,0.<1>H NMR (400 MHz, Hloroform-d) δ 13.20 (s, 1H), 5.37 (t, J= 5.5 Hz, 1H), 4.26 (d, J= 5.6 Hz, 2H), 2.51 (s, 3H), 2.44 (s, 3H), 1.44 (s, 9H).

2

Korak 4. Sinteza 5-(aminometil)-2-metil-6-(metiltio)pirimidin-4(3H)-ona ( hidrohlorid so)

[0076] Suspenziji terc-butil ((2-metil-4-(metiltio)-6-okso-1,6-dihidropirimidin-5-il)metil) karbamata (300 mg, 1,05 mmol) u 1,4-dioksanu (7,2 ml) na 23°C dodat je rastvor vodonikhlorida u 1,4-dioksanu (4 M, 2,10 ml, 8,40 mmol). Reakcija je tokom 3 sata mešana na 23°C, zatim je dodato još rastvora hlorovodonika u 1,4-dioksanu (4 M, 2,10 ml, 8,40 mmol). Nakon 14 sati reakcija je koncentrovana do suva pod smanjenim pritiskom da bi se dobilo naslovno jedinjenje (254 mg, 94% prinosa) u vidu čvrste supstance bele boje, koja je korišćena u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja. LCMS [M+Na]<+>(slobodna baza) m/z: izrač.

208,1; dobijeno 208,1.

Intermedijer 3: 3-(aminometil)-6-hloro-4-(metiltio)piridin-2(1H)-on (hidrohloridna so)

[0077]

Korak 1: Sinteza 2-(benziloksi)-6-hloronikotinske kiseline

[0078] Suspenziji natrijum hidrida (60% disperzije u mineralnom ulju) (11,5 g, 286 mmol) u tetrahidrofuranu (500 ml) dodat je benzil alkohol (14 ml, 143 mmol) na 0°C. Reakciona smeša je mešana 20 minuta, zatim je dodat rastvor 2,6-dihloropiridin-3-karboksilne kiseline (25 g, 130 mmol) u tetrahidrofuranu (500 ml) i reakciona smeša je mešana 4 sata na 23°C. Reakcija je zatim ugašena 10% hlorovodoničnom kiselinom (300 ml), tretirana čvrstim NaHCO3do pH ~8, zakiseljena sirćetnom kiselinom (50% u vodi) i na kraju ekstrahovana etil acetatom (200 ml × 3). Kombinovani organski slojevi su isprani slanim rastvorom (200 ml), osušeni preko magnezijum sulfata, filtrirani i koncentrovani do suva. Ostatak je prečišćen fleš hromatografijom (silikagel, gradijent 5% do 50% etil acetata u dihlorometanu) da bi se dobilo naslovno jedinjenje (33,68 g, 98% prinosa).

Korak 2: Sinteza 2-(benziloksi)-6-hloronikotinamida

[0079] Rastvoru 2-(benziloksi)-6-hloronikotinske kiseline (33,68 g, 128,2 mmol) u dihlorometanu (500 ml) na 0°C dodat je N,N-dimetilformamid (1 ml), a zatim oksalil hlorid (11,9 ml, 141 mmol). Reakcija je mešana na 23°C tokom 2 sata, a zatim koncentrovana do suva. Ostatak je rastvoren u dihlorometanu (200 ml) i polako dodavan u koncentrovani rastvor amonijum hidroksida (50 ml) na 0°C. Nakon 1 sata, organski sloj je sakupljen i vodena faza je ekstrahovana dihlorometanom (50 ml × 3). Kombinovani organski slojevi su osušeni preko magnezijum sulfata, filtrirani i koncentrovani do suva pod smanjenim pritiskom. Ostatak je prečišćen fleš hromatografijom (silikagel, gradijent 5% do 50% etil acetata u dihlorometanu) da bi se dobilo naslovno jedinjenje (33,68 g, 98% prinosa).

Korak 3: Sinteza 2-(benziloksi)-6-hloro-4-(metiltio)nikotinamida

[0080] Rastvoru 2,2,6,6-tetrametilpiperidina (29,45 ml, 175,1 mmol) u tetrahidrofuranu (300 ml) na -78°C dodat je rastvor n-butillitijuma u heksanu (2,5 M, 70 ml, 175,1 mmol).

Reakciona smeša je zagrevana na 0°C 30 minuta, a zatim ohlađena na -78°C. Zatim je dodat rastvor 2-(benziloksi)-6-hloronikotinamida (11,5 g, 43,8 mmol) u tetrahidrofuranu (100 ml) uz održavanje unutrašnje temperature ispod -60°C. Reakciona smeša je mešana 1 sat na -78°C, a zatim je dodat dimetildisulfid (15,77 ml, 175,1 mmol). Reakcija je mešana na -78°C tokom dodatna 2 sata, a zatim ugašena na -78°C rastvorom sirćetne kiseline u vodi (50% v/v). Željeni proizvod je ekstrahovan etil acetatom (100 ml × 3) i kombinovani organski slojevi su isprani vodom (20 ml), zasićenim vodenim rastvorom natrijum bikarbonata (20 ml), slanim rastvorom (20 ml), osušeni preko magnezijum sulfata, filtrirani i koncentrovani do suva pod smanjenim pritiskom. Ostatak je prečišćen fleš hromatografijom (silikagel, gradijent 0% do 20% etil acetata u dihlorometanu) da bi se dobilo naslovno jedinjenje (4,86 g, 36% prinosa).

Korak 4: Sinteza (2-(benziloksi)-6-hloro-4-(metiltio)piridin-3-il)metanamina

[0081] Rastvoru 2-(benziloksi)-6-hloro-4-(metiltio)nikotinamida (4,86 g, 15,7 mmol) u tetrahidrofuranu (100 ml) na 23°C dodat je rastvor borana u tetrahidrofuranu (1 M, 63 ml, 63 mmol). Reakciona smeša je mešana 15 sati uz refluks, a zatim ugašena sporim dodavanjem

2

metanola na sobnoj temperaturi. Reakciona smeša je koncentrovana do suva pod smanjenim pritiskom i ostatak je prečišćen fleš hromatografijom (silikagel, gradijent 0% do 30% metanola u dihlorometanu) da bi se dobilo naslovno jedinjenje (710 mg, 15% prinosa) u vidu čvrste supstance bele boje.

Korak 5: Sinteza 3-(aminometil)-6-hloro-4-(metiltio)piridin-2(1H)-ona (hidrohloridna so)

[0082] U tikvicu koja sadrži (2-(benziloksi)-6-hloro-4-(metiltio)piridin-3-il)metanamin (710 mg, 2,41 mmol) dodata je koncentrovana hlorovodonična kiselina (12 M, 5,0 ml, 60 mmol). Reakciona smeša je mešana na 23°C tokom 2 sata, a zatim koncentrovana do suva pod smanjenim pritiskom. Ostatak je rekristalisan iz smeše metanola i dietil etra da bi se dobilo naslovno jedinjenje (400 mg, 69% prinosa) u vidu čvrste supstance bele boje.

Korak 6: Sinteza terc-butil ((6-hloro-4-(metiltio)-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il)metil) karbamata

[0083] Suspenziji hidrohlorid soli 3-(aminometil)-6-hloro-4-(metiltio)piridin-2(1H)-ona (1,575 g, 6,53 mmol) u dihlorometanu (50 ml) dodat je di-terc-butildikarbonat (2,85 g, 13,1 mmol), nakon čega je dodat N,N-diizopropiletilamin (3,4 ml, 19,6 mmol) na sobnoj temperaturi. Reakcija je 3 sata mešana na sobnoj temperaturi (dok se sve nije potpuno rastvorilo), a zatim ugašena vodom. Organski sloj je odvojen, osušen preko magnezijum sulfata, filtriran i koncentrovan do suva pod smanjenim pritiskom. Ostatak je prečišćen fleš hromatografijom (silikagel, gradijent 0 do 10% metanola u dihlorometanu) da bi se dobilo naslovno jedinjenje u vidu čvrste supstance bele boje (1,5 g, 75% prinosa). LCMS [M+H]<+>m/z: izrač.305,1; dobijeno 305,1.

Korak 7: Sinteza 3-(aminometil)-6-metil-4-(metiltio)piridin-2(1H)-ona

[0084] Suspenziji terc-butil ((6-hloro-4-(metiltio)-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il) metil)karbamata (300 mg, 984 µmol) u 1,4-dioksanu (4,9 ml) dodat je rastvor hlorovodonika u 1,4-dioksanu (4 M, 1,96 ml, 7,87 mmol) na sobnoj temperaturi. Reakcija je mešana na sobnoj temperaturi tokom 3 sata, zatim je dodato još rastvora hlorovodonika u 1,4-dioksanu (4 M, 1,96 ml, 7,87 mmol). Zatim je, nakon 14 h, reakcija koncentrovana do suva pod smanjenim pritiskom da bi se dobilo naslovno jedinjenje (254 mg, 94% prinosa) u vidu čvrste supstance bele boje, koja je korišćena u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja. LCMS [M+Na]<+>(slobodna baza) m/z: izrač.227,0, dobijeno 227,0.

2

Intermedijer 4: metil 7-hloro-2,4-dimetil-2-(4-oksocikloheksil)benzo[d][1,3]dioksol-5-karboksilat

[0085]

Korak 1: Sinteza metil 5-hloro-3,4-dihidroksi-2-metilbenzoata

[0086] Rastvoru metil 3,4-dihidroksi-2-metilbenzoata (5,11 g, 27,9 mmol) u tetrahidrofuranu (199 ml) na -20°C dodat je kap po kap sulfuril hlorid (2,45 ml, 30,6 mmol). Reakciona smeša je mešana na -20°C tokom 3 sata, a zatim ugašena zasićenim vodenim rastvorom amonijum hlorida (50 ml). Željeni proizvod je ekstrahovan etil acetatom (25 ml × 3). Kombinovani organski slojevi su isprani slanim rastvorom (25 ml), osušeni natrijum sulfatom, filtrirani i koncentrovani do suva pod smanjenim pritiskom. Ostatak je prečišćen fleš hromatografijom (silikagel, gradijent 0% do 60% etil acetata u heptanu) da bi se dobilo naslovno jedinjenje (4,117 g, 68% prinosa) u vidu čvrste supstance bež boje. LCMS [M+H]<+>m/z: izrač.217,0; dobijeno 217,1 (obrazac C1 izotopa).

Korak 2: Sinteza metil 7-hloro-2,4-dimetil-2-(4-oksocikloheksil)-2H-1,3-benzodioksol-5-karboksilata

[0087] Smeša metil 5-hloro-3,4-dihidroksi-2-metilbenzoata (1,2 g, 5,53 mmol), trirutenijum dodekakarbonila (176 mg, 276 µmol) i trifenilfosfina (145 mg, 553 µmol) je degasirana pod vakuumom i očišćena azotom (3 ciklusa). Dodat je toluen (8,1 ml) i reakciona smeša je zagrevana 30 minuta do refluksa. Zatim je dodat rastvor 4-etinilcikloheksan-1-ona (1,34 g, 11,0 mmol) u toluenu (17 ml) kap po kap i reakcija je mešana 23 sata do refluksa. Na kraju, reakciona smeša je ohlađena na sobnu temperaturu i koncentrovana do suva pod smanjenim

2

pritiskom. Ostatak je prečišćen fleš hromatografijom (silikagel, gradijent 0 do 60% etil acetata u heptanu) da bi se dobilo naslovno jedinjenje (1,327 g, 70% prinosa) u vidu žutog ulja. LCMS [M+Na]<+>m/z: izrač.361,1; dobijeno 361,1 (obrazac C1 izotopa).

Korak 3: Separacija metil (R)-7-hloro-2,4-dimetil-2- (4-oksocikloheksil)benzo[d][1,3] dioksol-5-karboksilata i metil (S)-7-hloro-2,4-dimetil-2-(4-oksocikloheksil)benzo[d][1,3] dioksol-5-karboksilata

[0088] Racemska smeša metil-7-hloro-2,4-dimetil-2-(4-oksocikloheksil)benzo[d][1,3] dioksol-5-karboksilata (4,4 g, 13 mmol) je razdvojena preparativnom SFC [kolona: ChiralPak AY od Daicel chemical industries (250 mm ×50 mm, 10 µm veličina pora). Mobilna faza A:CO2/ Mobilna faza B: 0,1% NH4OH u metanolu. Izokratski (85% mobilna faza A i 15% mobilna faza B). Brzina protoka: 80 ml/min. Temperatura kolone: 40 °C]. Intermedijer 4 (pik 1) (neželjeni enantiomer/distomer): Vreme zadržavanja = 6,2 min. Iskorišćenje = 1,4 g, 4,05 mmol, prinos 31%, 90% ee, čistoća 98% (žuta čvrsta supstanca).<1>H NMR (400 MHz, Hloroform-d) δ 7.48 (s, 1H), 3.78 (s, 3H), 2.44 - 2.36 (m, 2H), 2.35 - 2.25 (m, 6H), 2.19 (tdd, J= 2.8, 5.6, 13.1 Hz, 2H), 1.70 - 1.57 (m, 5H). Intermedijer 4 (pik 2) (željeni enantiomer/eutomer): Vreme zadržavanja = 7,0 min. Iskorišćenje = 1,1 g, 3,08 mmol, prinos 23,75%, 99% ee, čistoća 95% (žuta čvrsta supstanca).<1>H NMR (400 MHz, hloroform-d) δ 7,49 (s, 1H), 3,78 (s, 3H), 2,44 - 2,36 (m, 2H), 2,36 - 2,25 (m, 6H), 2,20 (tdd, J= 2,8, 5,6, 13,1 Hz, 2H), 1,72 - 1,59 (m, 5H). SFC analitička metoda: [Kolona: ChiralPak AY-3 (150×4,6 mm, 3µm veličina pora). Mobilna faza A:CO2/ Mobilna faza B: 0,05% Et2NH u iPrOH. Gradijent: od 5 do 40% mobilne faze B (preko 5,5 min). Brzina protoka: 2,5 ml/min. Temperatura kolone: 40 °C].

Intermedijer 4 (pik 1) (neželjeni enantiomer/distomer): Vreme zadržavanja = 2,853 min. Intermedijer 4 (pik 2) (željeni enantiomer/eutomer): Vreme zadržavanja = 2,979 min.

Intermedijer 5: metil 7-hloro-2,4-dimetil-2-(trans-4-((3-(trifluorometil)oksetan-3-il)amino)cikloheksil)benzo[d][1,3]dioksol-5-karboksilat

2

[0090] Smeša 1-hloro-N-[3-(trifluorometil)oksetan-3-il]hidrogenamina (678 mg, 3,82 mmol) i N,N-diizopropiletilamina (698 µl, 4,01 mmol) u dihloroetanu (9,54 ml) mešana je na sobnoj temperaturi 30 minuta pre nego što je dodata sirćetna kiselina (218 µl, 3,82 mmol), a zatim i metil-7-hloro-2,4-dimetil-2- (4-oksocikloheksil)benzo[d][1,3]dioksol-5-karboksilat (650 mg, 1,91 mmol), u ovu reakcionu smešu. Nakon 5 minuta na sobnoj temperaturi, smeša je postala bistra (žuta/smeđa) i dodat je natrijum triacetoksiborohidrid (404 mg, 1,91 mmol). Reakcija je mešana 3 sata na sobnoj temperaturi, a zatim ugašena zasićenim vodenim rastvorom natrijum bikarbonata (30 ml). Željeni proizvod je ekstrahovan dihlorometanom (30 ml × 3) i kombinovani organski slojevi sušeni preko natrijum sulfata, filtrirani i koncentrovani do suva pod smanjenim pritiskom. Ostatak je prečišćen reverzno-faznom fleš hromatografijom (kolona C18, acetonitril/voda 1:1 sa 0,1% trifluoroacetatnom kiselinom) da bi se dobila dva geometrijska izomera (cis i trans). Prvi pik eluiranja odgovara geometrijskom izomeru 1.

Analitička LCMS metoda (za geometrijske izomere)

[0091] [Kolona: Zorbax SB-C8 (75 × 4,6 mm, 3,5 µm veličina pora). Mobilna faza A: 0,1% trifluorosirćetna kiselina u acetonitrilu / Mobilna faza B: trifluorosirćetna kiselina u vodi. Gradijent: od 5 do 100% mobilne faze B (preko 3,0 min) nakon čega sledi 100% mobilne faze B (4,5 min). Brzina protoka: 1,5 ml/min. Temperatura kolone: 20 °C]. Geometrijski izomer 1 (željeni): Vreme zadržavanja = 4,073 min (278 mg, 31%). Geometrijski izomer 2 (neželjen): Vreme zadržavanja = 4,277 min (253 mg, 29%).

[0092] Enantiomeri geometrijskog izomera 1 (željeni na osnovu LCMS metode) razdvojeni su preparativnom SFC [kolona: Chiralcel OX-H (250×21mm I.D.). Mobilna faza A:CO2/ Mobilna faza B: 0,25% izopropilamin u smeši izopropanola/heksana 1:1. Izokratski (85% mobilna faza A i 15% mobilna faza B). Protok: 80 g/min. Temperatura kolone: 25 °C].

Intermedijer 5 (Pik 1): Vreme zadržavanja = 1,84 min. LCMS [M+H]<+>m/z: izrač.464,15;

2

dobijeno 464. Intermedijer 5 (Pik 2): Vreme zadržavanja = 2,1 min. LCMS [M+H]<+>m/z: izrač. 464,15; dobijeno 464,2.

Intermedijer 6: 3-(aminometil)-4-hloro-6-metilpiridin-2(1H)-on

[0093]

Korak 1: Sinteza 2,4-dihloro-6-metilnikotinonitrila

[0094] Rastvor 2,4-dihidroksi-6-metilnikotinonitrila (80 g, 533,3 mmol) u fosfor oksihloridu (150 ml) je mešan na 120°C tokom 2 sata, a zatim ugašen zasićenim vodenim rastvorom natrijum bikarbonata (do pH = 8). Bio je podeljen između vode (2000 ml) i etil acetata (1000 ml), organski sloj je osušen preko natrijum sulfata, filtriran i koncentrovan do suva pod smanjenim pritiskom da bi se dobilo naslovno jedinjenje (85 g, 86% prinosa) kao smeđa čvrsta supstanca, koja je korišćena u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja. LCMS [M+H]<+>m/z: izrač.186,98; dobijeno 186,6.

Korak 2: Sinteza 2-hloro-4-hidroksi-6-metilnikotinonitrila

[0095] Rastvoru 2,4-dihloro-6-metilnikotinonitrila (10 g, 53 mmol) u N,N-dimetilformamidu (50 ml) je dodat cezijum acetat (30,8 g, 160 mmol) na sobnoj temperaturi. Reakcija je mešana na 80°C preko noći, a zatim ugašena vodom (800 ml). Željeni proizvod je ekstrahovan etil acetatom (800 ml) i organski sloj je osušen preko natrijum sulfata, filtriran i koncentrovan do suva pod smanjenim pritiskom. Naslovno jedinjenje (8,8 g, 98% prinosa) dobijeno je kao smeđa čvrsta supstanca i korišćeno u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja. LCMS [M+H]<+>m/z: izrač.169,01; dobijeno 168,8.

Korak 3: Sinteza 4-hidroksi-2-metoksi-6-metilnikotinonitrila

[0096] Smeša 2-hloro-4-hidroksi-6-metilnikotinonitrila (8,8 g, 52,2 mmol) i natrijum metoksida (14,1 g, 261 mmol) u metanolu (50 ml) mešana je na 60°C preko noći. Smeša je ugašena 1 M rastvorom hlorovodonične kiseline do pH = 5. Bila je podeljena između vode (500 ml) i etil acetata (500 ml), organski sloj je osušen preko natrijum sulfata i koncentrovan da bi se dobilo naslovno jedinjenje (8,0 g, 93% prinosa) kao smeđa čvrsta supstanca, koja je korišćena u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja. LCMS [M+H]<+>m/z: izrač.165,1; dobijeno 164,8.

Korak 4: 4-hloro-2-metoksi-6-metilnikotinonitril

[0097] Smeša 4-hidroksi-2-metoksi-6-metilnikotinonitrila (8,0 g, 48,7 mmol), fosfor pentahlorida (20,3 g, 97,5 mmol), fosfor oksihlorida (14,9 g, 9,09 ml, 97,5 mmol) i N,N-dimetilformamida (5 ml) u hloroformu (100 ml) mešana je 30 minuta na 60°C. Reakcija je ugašena zasićenim vodenim rastvorom natrijum bikarbonata (do pH = 8). Bila je podeljena između vode (1000 ml) i etil acetata (1000 ml), organski sloj je osušen preko natrijum sulfata i koncentrovan do suva da bi se dobilo naslovno jedinjenje (8,0 g, 90% prinosa) kao smeđa čvrsta supstanca, koja je korišćena u sledećem koraku direktno bez daljeg prečišćavanja. LCMS [M+H]<+>m/z: izrač.183,0; dobijeno 182,8.

Korak 5: Sinteza (4-hloro-2-metoksi-6-metilpiridin-3-il)metanamina

[0098] Rastvoru 4-hloro-2-metoksi-6-metilnikotinonitrila (8,0 g, 43,8 mmol) u tetrahidrofuranu (50 ml) dodat je kompleks boran dimetilsulfida (10 M, 5,3 ml, 53 mmol). Smeša je mešana na 60°C tokom 2 sata, a zatim ugašena metanolom (10 ml) na 0°C. Smeša je koncentrovana do suva pod smanjenim pritiskom da bi se dobilo naslovno jedinjenje (7,0 g, 93% prinosa) kao smeđa čvrsta supstanca, koja je korišćena u sledećem koraku direktno bez daljeg prečišćavanja. LCMS [M+H]<+>m/z: izrač.187,1; dobijeno 187,1.

Korak 6: terc-butil ((4-hloro-2-metoksi-6-metilpiridin-3-il)metil)karbamat

[0099] Smeša (4-hloro-2-metoksi-6-metilpiridin-3-il)metanamina (7,0 g, 37,5 mmol), di-tercbutil dikarbonata (15,2 g, 75,0 mmol) i trietilamina (11,4 g, 15,7 ml, 113 mmol) u tetrahidrofuranu (50 ml) mešana je na 20°C tokom 16 sati, a zatim ugašena vodom (500 ml). Željeni proizvod je ekstrahovan etil acetatom (500 ml) i organski sloj je osušen preko natrijum sulfata, filtriran i koncentrovan do suva pod smanjenim pritiskom. Ostatak je prečišćen fleš kolonom (kolona silikagela, petroleter: etil acetat 40:1) da bi se dobilo naslovno jedinjenje (3,0 g, 28% prinosa) u vidu bezbojnog ulja. LCMS [M+H]<+>m/z: izrač.

287,1; dobijeno 286,9.

1

Korak 7: 3-(aminometil)-4-hloro-6-metilpiridin-2(1H)-on

[0100] Rastvoru hlorovodonika u vodi (4 M, 10 ml, 10 mmol) dodat je terc-butil ((4-hloro-2-metoksi-6-metilpiridin-3-il)metil)karbamat (3,0 g, 10,5 mmol) na sobnoj temperaturi.

Reakcija je zagrevana na 100°C tokom 2 sata, zatim koncentrovana do suva pod smanjenim pritiskom da bi se dobilo naslovno jedinjenje (1,7 g, 94% prinosa) u vidu čvrste supstance žute boje. LCMS [M+H]<+>m/z: izrač.173,04; dobijeno 173,1.<1>H NMR (400 MHz, Metanold4): δ 6.38 (s, 1H), 4.15 (s, 2H), 2.32 (s, 3H).

Intermedijer 7: metil 7-hloro-2-(4-(3,3-difluoroazetidin-1-il)cikloheksil)-2,4-dimetilbenzo[d][1,3]dioksol-5-karboksilat

[0101]

Korak 1: Sinteza metil 7-hloro-2-(4-(3,3-difluoroazetidin-1-il)cikloheksil)-2,4-dimetilbenzo[d][1,3]dioksol-5-karboksilata

[0102] Rastvor metil 7-hloro-2,4-dimetil-2- (4-oksocikloheksil)benzo[d][1,3]dioksol-5-karboksilata (Intermedijer 4 - racemska smeša) 550 mg, 1,62 mmol), 3,3-difluoroazetidin hidrohloridne soli (839 mg, 6,48 mmol) i trietilamin (895 µl, 6,64 mmol) u metanolu (5 ml) i tetrahidrofuranu (5 ml) mešan je preko noći na sobnoj temperaturi. Sledećeg dana, reakcija je ohlađena na -78°C i kapanjem je dodat rastvor litijum borohidrida (2 M u tetrahidrofuranu, 1,21 ml, 2,43 mmol). Gusta žuta smeša je postepeno zagrevana do sobne temperature, a zatim ugašena zasićenim vodenim rastvorom natrijum karbonata na 0°C. Željeni proizvod je ekstrahovan dihlorometanom (tri puta) i kombinovani organski slojevi su osušeni preko natrijum sulfata, filtrirani i koncentrovani do suva pod smanjenim pritiskom. Ostatak je dva puta prečišćen fleš hromatografijom (silikagel KP-NH kolona, gradijent 0 do 20% etil acetata

2

u heptanu) da bi se dobilo naslovno jedinjenje (354 mg, 53% prinosa) kao racemska smeša jednog geometrijskog izomera (cis ili trans). LCMS [M+H]<+>m/z: izrač.416,9; dobijeno 416,2.

Korak 2: Separacija metil (2R) -7-hloro-2-(4-(3,3-difluoroazetidin-1-il)cikloheksil)-2,4-dimetilbenzo[d][1,3]dioksol-5-karboksilata i metil (2S)-7-hloro-2-(4-(3,3-difluoroazetidin-1-il)cikloheksil)-2,4-dimetilbenzo[d][1,3]dioksol-5-karboksilata [0103] Racemska smeša metil 7-hloro-2-(4-(3,3-difluoroazetidin-1-il)cikloheksil)-2,4-dimetilbenzo[d][1,3]dioksol-5-karboksilata (560 mg) je razdvojena preparativnom SFC [kolona: Chiralpak AD-H od Daicel chemical industries. Mobilna faza A: CO2/ Mobilna faza B: 0,25% izopropilamin u smeši heksana i etanola (1:1). Izokratski (90% mobilna faza A i 10% mobilna faza B). Protok: 80g/min. Temperatura kolone: 25 °C]. SFC analitička metoda: Kolona: Chiralpak AD-H od Daicel chemical industries (100 mm × 4,6 mm. Mobilna faza A: CO2/ Mobilna faza B: 0,1% izopropilamin u smeši heksana i etanola (3:1). Izokratski (85% mobilna faza A i 15% mobilna faza B). Protok: 4 ml/min. Temperatura kolone: 40 °C.

Intermedijer 7 (Pik 1): Vreme zadržavanja = 1,02 min (SFC analitička metoda). Iskorišćenje = 173 mg, prinos 15%, 96% ee.<1>H NMR (400 MHz, Hloroform-d) δ 7.48 (s, 1H), 3.78 (s, 3H), 2.44 - 2.36 (m, 2H), 2.35 - 2.25 (m, 6H), 2.19 (tdd, J= 2.8, 5.6, 13.1 Hz, 2H), 1.70 - 1.57 (m, 5H). Intermedijer 7 (Pik 2): Vreme zadržavanja = 1,16 min (SFC analitička metoda). Iskorišćenje = 150 mg, prinos 13%, 97% ee. LCMS [M+H]<+>m/z: izrač.416,86; dobijeno 416,2.

Intermedijer 8: perfluorofenil 7-hloro-2,4-dimetil-2-(1-(2,2,2-trifluoroetil)piperidin-4-il)benzo[d][1,3]dioksol-5-karboksilat

[0104]

Korak 1: Sinteza terc-butil 4-(7-hloro-5-(metoksikarbonil)-2,4-dimetilbenzo[d][1,3]dioksol-2-il)piperidin-1-karboksilata

[0105] U tikvici od 100 ml opremljenoj kondenzatorom, smeša metil 5-hloro-3,4-dihidroksi-2-metilbenzoata (1,219 g, 5,58 mmol), trifenilfosfina (146 mg, 0,558 mmol) i trirutenijum dodekakarbonila (178 mg, 0,279 mmol) je pročišćena azot/vakuum ciklusima (4 ciklusa), zatim je dodat toluen (12 ml), pročišćen ciklusima azot/vakuum, a zatim mešana na 120°C tokom 30 minuta. Tamnoj smeši je dodata smeša terc-butil 4-etilpiperidin-1-karboksilata (2,32 g, 11,1 mmol) u toluenu (10 ml). Dobijeni narandžasti rastvor je mešan još 2 sata na 120°C. Reakciona smeša je koncentrovana pod smanjenim pritiskom, a zatim prečišćena fleš hromatografijom (silikagel, gradijent 0 do 100% etil acetata u heptanu) da bi se dobilo naslovno jedinjenje (2,33 g, 98%) u vidu žutog ulja. LCMS [M+Na]<+>m/z: izrač.448,2; dobijeno 448,2.

Korak 2: Sinteza metil 7-hloro-2,4-dimetil-2-(piperidin-4-il)benzo[d][1,3]dioksol-5-karboksilata (so trifluorosirćetne kiseline)

[0106] Žutom rastvoru terc-butil 4-[7-hloro-5-(metoksikarbonil) -2,4-dimetil-2H-1,3-benzodioksol-2-il]piperidin-1-karboksilata (2,33 g, 5,47 mmol) u dihlorometanu (2 ml) dodata je TFA (1 ml). Nakon 30 minuta, reakciona smeša je koncentrovana pod smanjenim pritiskom da bi se dobilo naslovno jedinjenje (2,40 g, kvant.) kao guma koja je korišćena u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja. LCMS [M+H]<+>m/z: izrač.326,79; dobijeno 326,2.

4

Korak 3: Sinteza metil 7-hloro-2,4-dimetil-2-(1-(2,2,2-trifluoroetil)piperidin-4-il)benzo[d][1,3]dioksol-5-karboksilata

[0107] Rastvoru metil 7-hloro-2,4-dimetil-2-(piperidin-4-il)-2H-1,3-benzodioksol-5-karboksilata, soli trifluorosirćetne kiseline (2,40 g, 5,45 mmol) u toluenu (20 ml) i acetonitrilu (10 ml) dodati su trietilamin (8 ml, 57,6 mmol) i 2,2,2-trifluoroetil trifluorometansulfonat (3,0 g, 12,9 mmol). Posle 3 sata, reakciona smeša je koncentrisana pod smanjenim pritiskom. Dodata je voda (50 ml) i smeša je ekstrahovana sa EtOAc (etil acetatom) (30 ml × 3).Kombinovani organski slojevi su isprani slanim rastvorom (50 ml × 2), osušeni preko natrijum sulfata, filtrirani i koncentrovani pod smanjenim pritiskom, a zatim prečišćeni fleš hromatografijom (silikagel, gradijent 0 do 50% etil acetata u heptanu) da bi se dobilo naslovno jedinjenje (2,04 g, 92%) u vidu žućkastog ulja. LCMS [M+H]<+>m/z: izrač.

408,81; dobijeno 408,2.

Korak 4: Sinteza 7-hloro-2,4-dimetil-2-(1-(2,2,2-trifluoroetil)piperidin-4-il)benzo[d][1,3]dioksol-5-karboksilne kiseline

[0108] Rastvoru metil 7-hloro-2,4-dimetil-2-[1-(2,2,2-trifluoroetil)piperidin-4-il]-2H-1,3-benzodioksol-5-karboksilata (691 mg, 1,69 mmol) u metanolu (3 ml) dodat je 6 M natrijum hidroksida u vodi (1 ml, 6,00 mmol) i zagrejan na 60°C. Nakon 25 minuta, reakciona smeša je koncentrovana pod smanjenim pritiskom da bi se uklonio veći deo metanola. Smeša je zatim razblažena vodom, ohlađena na 0°C, a zatim neutralizovana na pH = 7 sa 1 M hlorovodonične kiseline. Smeša je ekstrahovana dihlorometanom (3 puta) i kombinovani organski slojevi su osušeni preko natrijum sulfata, filtrirani i koncentrovani pod smanjenim pritiskom da bi se dobilo naslovno jedinjenje kao bela čvrsta supstanca koja je korišćena u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja. LCMS [M+H]<+>m/z: izrač.394,79; dobijeno 394,2.

Korak 5: Sinteza perfluorofenil 7-hloro-2,4-dimetil-2-(1-(2,2,2-trifluoroetil)piperidin-4-il)benzo[d][1,3]dioksol-5-karboksilata

[0109] U mešani rastvor 7-hloro-2,4-dimetil-2-[1-(2,2,2-trifluoroetil)piperidin-4-il]-2H-1,3-benzodioksol-5-karboksilne kiseline (665 mg, 1,68 mmol) u dihlorometanu (5 ml) dodat je piridin (1 ml, 12,4 mmol), nakon čega je dodat 2,3,4,5,6-pentafluorofenil 2,2,2-trifluoroacetat (500 µl, 2,90 mmol). Nakon 20 minuta, reakciona smeša je koncentrovana pod smanjenim pritiskom kako bi se dobilo naslovno jedinjenje koje je korišćeno u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja. LCMS [M+H]<+>m/z: izrač.560,84; dobijeno 560,2.

Intermedijer 9: 7-hloro-2-(4-(3-metoksiazetidin-1-il)cikloheksil)-2,4-dimetilbenzo[d][1,3]dioksol-5-karboksilna kiselina

[0110]

Korak 1: Sinteza metil 7-hloro-2-(4-(3-metoksiazetidin-1-il)cikloheksil)-2,4-dimetilbenzo[d][1,3]dioksol-5-karboksilata

[0111] Rastvor 3-metoksiazetidin hidrohloridne soli (8 g, 64,75 mmol) i N,N-diizopropiletilamin (12 ml, 68,9 mmol) u metanolu (30 ml) mešan je na sobnoj temperaturi 30 minuta pre nego što je dodat rastvor drugog rastvora metil 7-hloro-2,4-dimetil-2-(4-oksocikloheksil)-1,3-benzodioksol-5-karboksilata (Intermedijer 4 - Pik 2) (4,1 g, 12,10 mmol) u tetrahidrofuranu (30 ml). Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi 1 sat, a zatim ohlađena na -70°C. Dodat je litijum borohidrid (500 mg, 22,96 mmol) i reakcija je mešana na -70°C 30 minuta [ili dok nije primećena potpuna potrošnja početnog materijala pomoću TLC, etil acetata/metanola 5:1]. Zatim su dve serije reakcije kombinovane i ugašene zasićenim vodenim rastvorom amonijum hlorida (120 ml) na 0°C i željeni proizvod je ekstrahovan dihlorometanom (200 ml × 3). Kombinovani organski slojevi su osušeni preko natrijum sulfata, filtrirani i koncentrovani do suva pod smanjenim pritiskom. Ostatak je prečišćen fleš hromatografijom (silikagel, gradijent 0 do 14% metanola u dihlorometanu) da bi se dobilo naslovno jedinjenje (8,05 g, prinos 67%; čistoća 83%) u vidu svetlo žutog ulja. Uzorak (50 mg) je dalje prečišćen preparativnom tankoslojnom hromatografijom (silikagel, etil acetat:metanol 15:1). LCMS [M+H]<+>m/z: izrač..410,2; dobijeno 410,1.<1>H NMR (400 MHz, Metanol-d4) δ 7.39 (s, 1H), 3.95 - 3.91 (m, 1H), 3.73 (s, 3H), 3.59 - 3.51 (m, 2H), 3.16 (s, 3H), 2.97 (br dd, J= 6.4, 8.0 Hz, 2H), 2.26 (s, 3H), 2.11 - 2.02 (m, 1H), 1.91 - 1.73 (m, 5H), 1.54 (s, 3H), 1.22 - 1.12 (m, 2H), 0.98 - 0.86 (m, 2H).

Korak 2: Sinteza 7-hloro-2-(4-(3-metoksiazetidin-1-il)cikloheksil)-2,4-dimetilbenzo[d][1,3]dioksol-5-karboksilne kiseline

[0112] Rastvoru metil 7-hloro-2-(4-(3-metoksiazetidin-1-il)cikloheksil)-2,4-dimetilbenzo [d][1,3]dioksol-5-karboksilata (4 g, 9,75 mmol) u metanolu (48 ml) dodat je rastvor litijum hidroksid hidrata (4,03 g, 96,06 mmol) u vodi (12 ml). Reakcija je mešana na 70°C tokom 2 sata, a zatim su dve serije kombinovane i koncentrovane pod smanjenim pritiskom. Dodata je voda (50 ml) i pH vrednost je podešena na 6 pomoću zasićenog vodenog rastvora limunske kiseline na 0°C. Željeni proizvod je ekstrahovan sa 3:1 smešom dihlorometana i izopropanola (300 ml × 5). Kombinovani organski slojevi su osušeni preko natrijum sulfata, filtrirani i koncentrovani do suva pod smanjenim pritiskom da bi se dobilo naslovno jedinjenje (6,1g, sirovo) u vidu čvrste supstance prljavo bele boje, koja je korišćena u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja. LCMS [M+H]<+>m/z: izrač.396,2; dobijeno 396,1.<1>H NMR (400 MHz, Metanol-d4) δ 7.07 (s, 1H), 4.05 - 4.10 (m, 2H), 3.76 - 3.88 (m, 1H), 3.67 (br dd, J= 10, 3.6 Hz, 2H), 3.22 (s, 3H), 2.71 - 2.81 (m, 1H), 2.19 (s, 3H), 1.91 - 1.99 (m, 4H), 1.75 - 1.85 (m, 1H), 1.52 (s, 3H), 1.18 - 1.28 (m, 2H), 1.06 - 1.14 (m, 2H).

Primer #1: 7-hloro-2-(4-(3-(difluorometoksi)azetidin-1-il)cikloheksil)-2,4-dimetil-N-((6-metil-4-(metiltio)-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)benzo [d] [1,3] dioksol-5-karboksamid

Korak 1: Sinteza metil 7-hloro-2-(4-(3-(difluorometoksi)azetidin-1-il)cikloheksil)-2,4-dimetilbenzo[d][1,3]dioksol-5-karboksilata

[0114] Rastvor metil 7-hloro-2,4-dimetil-2-(4-oksocikloheksil)benzo[d][1,3]dioksol-5-karboksilata (Intermedijer 4 - Pik 2) (224 mg, 0,661 mmol), 3-(difluorometoksi)azetidina (336 mg, 2,72 mmol) i soli trietilamin hidrohlorida (373 mg, 2,71 mmol) u smeši metanola (2 ml) i tetrahidrofurana (2 ml) mešan je na sobnoj temperaturi 1,5 sat, zatim ohlađen na -78 °C. Rastvor litijum borohidrida u tetrahidrofuranu (2 M, 500 µl, 1 mmol) je dodat kap po kap na -78°C pre nego što je reakcija ostavljena 15 minuta da se zagreje do sobne temperature. Zatim, smeša je ohlađena na 0°C, a zatim ugašena zasićenim vodenim rastvorom natrijum bikarbonata, razblažena dihlorometanom i zagrejana na sobnu temperaturu. Željeni proizvod je ekstrahovan iz vodenog sloja sa dihlorometanom (tri puta), a kombinovani organski slojevi osušeni pomoću hidrofobnog filtera i koncentrovani do suva pod smanjenim pritiskom.

Ostatak je prečišćen fleš hromatografijom (silikagel, gradijent 10 do 100% etil acetat u heptanu, zatim 0 do 100% etanol u etil acetatu) da bi se dobio jedan geometrijski izomer (cis ili trans) naslovnog jedinjenja (205 mg, 70% prinosa). LCMS [M+H]<+>m/z: izrač.445,9; dobijeno 446,2.

Korak 2: Sinteza 7-hloro-2-(4-(3-(difluorometoksi)azetidin-1-il)cikloheksil)-2,4-dimetilbenzo[d][1,3]dioksol-5-karboksilne kiseline

[0115] U rastvor metil 7-hloro-2-(4- (3-(difluorometoksi)azetidin-1-il) cikloheksil)-2,4-dimetilbenzo[d][1,3]dioksol-5-karboksilata (205 mg, 0,460 mmol) u metanolu (3 ml) dodat je rastvor natrijum hidroksida u vodi (6 M, 1 ml, 6,00 mmol). Reakcija je zagrevana na 60°C tokom 20 minuta, zatim razblažena vodom, ohlađena na 0°C, zakišeljena do pH = 2 sa 1 M hlorovodonične kiseline i zatim neutralizovana na pH = 7 sa 1 M vodenim rastvorom natrijum hidroksida. Željeni proizvod je ekstrahovan dihlorometanom (tri puta), osušen hidrofobnim filterom i koncentrovan do suva pod smanjenim pritiskom da bi se dobilo naslovno jedinjenje (176 mg, 89% prinosa) u vidu čvrste supstance bele boje koja je korišćena u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja. LCMS [M+H]<+>m/z: izrač.431,9; dobijeno 432,2.

Korak 3: Sinteza perfluorofenil 7-hloro-2-((1r,4R)-4-(3-(difluorometoksi)azetidin-1-il)cikloheksil)-2,4-dimetilbenzo[d][1,3]dioksol-5-karboksilat

[0116] U rastvor 7-hloro-2-(4- (3-(difluorometoksi)azetidin-1-il)cikloheksil)-2,4-dimetilbenzo[d][1,3]dioksol-5-karboksilne kiseline (176 mg, 0,408 mmol) u dihlorometanu (0,5 ml) dodat je piridin (1,0 ml, 12,4 mmol), nakon čega je dodat 2,3,4,5,6-pentafluorofenil 2,2,2-trifluoroacetat (150 µl, 0,871 mmol) na sobnoj temperaturi. Nakon 20 minuta, reakciona smeša je koncentrovana do suva pod smanjenim pritiskom da bi se dobila smeša naslovnog jedinjenja (100% teoretski prinos = 243 mg) i nusproizvoda. Sirova smeša je iskorišćena u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja. LCMS [M+H]<+>m/z: izrač.597,91; pronađeno 598,2.

Korak 4: Sinteza 7-hloro-2-(4-(3-(difluorometoksi)azetidin-1-il)cikloheksil)-2,4-dimetil-N-((6-metil-4-(metiltio)-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)benzo[d][1,3]dioksol-5-karboksamid

[0117] U rastvor perfluorofenil 7-hloro-2-(4- (3-(difluorometoksi)azetidin-1-il)cikloheksil)-2,4-dimetilbenzo[d][1,3]dioksol-5-karboksilata (≤243 mg, ≤0,406 mmol) u dimetilsulfoksidu (1 ml) dodati su 3-(aminometil)-6-metil-4-(metiltio)piridin-2(1H)-on (hidrohloridna so) (Intermedijer 1) (222 mg, 1,20 mmol) i N,N-diizopropiletilamin (0,30 ml, 1,71 mmol).

Reakciona smeša je mešana 1 sat na 60°C, zatim koncentrovana do suva pod jakim protokom azota preko noći. Ostatak je dva puta prečišćen reverzno-faznom fleš hromatografijom (kolona C18, gradijent 0 do 100% acetonitrila u vodi sa 0,1% trifluorosirćetne kiseline). Ostatak je razblažen dihlorometanom i zasićenim rastvorom natrijum bikarbonata. Vodeni sloj je ispran dihlorometanom. Kombinovani organski slojevi su osušeni preko natrijum sulfata i koncentrovani pod smanjenim pritiskom da bi se dobilo naslovno jedinjenje (166 mg, 68% prinosa u dva koraka) kao jedan geometrijski izomer (cis ili trans). LCMS [M+H]<+>m/z: izrač.598,1; dobijeno 598,3.<1>H NMR (400 MHz, Metanol-d4) δ 6.88 (s, 1 H), 6.26 (s, 1 H), 6.38 (t, J= 74.3 Hz, 2 H), 4.71 (quin, J= 6.0 Hz, 1 H), 4.48 (s, 2 H), 3.69 - 3.60 (m, 2 H), 3.18 - 3.11 (m, 2 H), 2.52 (s, 3 H), 2.29 (s, 3 H), 2.18 (s, 3 H), 2.10 (tt, J= 3.5, 11.2 Hz, 1 H), 1.98 - 1.86 (m, 4 H), 1.85 - 1.78 (m, 1 H), 1.60 (s, 3 H), 1.32 - 1.21 (m, 2 H), 1.06 - 0.92 (m, 2 H).

Tabela 1. Sledeće jedinjenje je pripremljeno na sličan način kao u primeru 1 korišćenjem odgovarajućeg polaznog materijala.

Primer #3: (R)-7-hloro-N-((6-hloro-4-(metiltio)-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)-Z-(trans-4-(dimetilamino)cikloheksil)-2,4-dimetilbenzo[d] [1,3]dioksol-5-karboksamid

4

[0119] U rastvor (R)-7-hloro-2-(trans-4-(dimetilamino)cikloheksil)-2,4-dimetilbenzo[d][1,3]dioksol-5-karboksilne kiseline (pripremljenom u skladu sa procedurom opisanom u patentnoj prijavi US2017/0073335 A1) (48 mg, 0,1356 mmol) u dimetilsulfoksidu (0,5 ml) dodat je trietilamin (56,6 µl, 0,407 mmol) i O-(7-azabenzotriazol-1-il)- N,N,N’,N’-tetrametiluronijum heksafluorofosfat (41,2 mg, 0,108 mmol) na sobnoj temperaturi. Pošto je formiranje aktiviranog estra bilo nepotpuno prema LCMS-u ([M+H]<+>m/z: 368,2) nakon 5 min, dva puta je dodat O-(7-azabenzotriazol-1-il)- N,N,N’,N’-tetrametiluronijum heksafluorofosfat (16 mg, 0,042 mmol) u dimetilsulfoksidu (1 ml). Nakon završetka aktivacije kiseline, dodata je suspenzija 3-(aminometil)-6-hloro-4-(metilsulfanil)-1,2-dihidropiridin-2-ona hidrohloridne soli (65,3 mg, 0,271 mmol) i trietilamina (56,6 µl, 0,407 mmol) u dimetilsulfoksidu (0,5 ml) na sobnoj temperaturi. Reakciona smeša je zagrevana 45 minuta na 60°C, zatim razblažena dihlorometanom i vodom. Organski sloj je osušen pomoću hidrofobnog filtera i koncentrovan do suva pod smanjenim pritiskom. Ostatak je prečišćen fleš hromatografijom [kolona silikagela KP-NH, gradijent 0 do 100% etil acetata u heptanu, zatim 0 do 100% etanola u dihlorometanu, zatim 0 do 100% metanola (sa 20% amonijum hidroksida) u etil acetatu] da bi se dobilo naslovno jedinjenje (30 mg, 41% prinosa) u vidu čvrste supstance bele boje. LCMS [M+H]<+>m/z: izrač.540,5; dobijeno 540,2.

<1>H NMR (400 MHz, Metanol-d4) δ 6.89 (s, 1H), 6.68 (s, 1H), 4.50 (s, 2H), 3.20 (tt, J= 3.2, 11.9 Hz, 1H), 2.83 (s, 6H), 2.53 (s, 3H), 2.18 (s, 3H), 2.16 - 2.08 (m, 4H), 2.02 - 1.94 (m, 1H), 1.62 (s, 3H), 1.54 (dq, J= 3.4, 12.4 Hz, 2H), 1.47 - 1.37 (m, 2H).

Tabela 2. Sledeća jedinjenja su pripremljena na sličan način kao u primeru 3 korišćenjem odgovarajućeg polaznog materijala.

Primer #6 (enantiomer 1): 7-hloro-N-((6-hloro-4-(metiltio)-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)-2-(4-(dimetilamino)cikloheksil)-2,4-dimetilbenzo[d][1,3]dioksol-5-karboksamid

Korak 1: Sinteza 7-hloro-2,4-dimetil-2-(4-((3-(trifluorometil)oksetan-3-il)amino)cikloheksil)benzo[d][1,3]dioksol-5-karboksilne kiseline

[0121] U rastvor metil 7-hloro-2,4-dimetil-2-[4-{[3-(trifluorometil)oksetan-3-il]amino}cikloheksil]-2H-1,3-benzodioksol-5-karboksilata (Intermedijer 5 - Pik 1) (81 mg, 0,174 mmol) u metanolu (1 ml) dodat je natrijum hidroksid (72 mg, 1,79 mmol). Reakciona smeša je tokom 20 minuta zagrevana na 60°C, ohlađena na 0°C, a zatim zakišeljena na pH = 2 sa 1 M hlorovodonične kiseline. Željeni proizvod je zatim ekstrahovan dihlorometanom (tri puta), a kombinovani organski slojevi osušeni pomoću hidrofobnog filtera. Filtrat je koncentrovan do suva pod smanjenim pritiskom da bi se dobilo naslovno jedinjenje (70 mg, 89% prinosa) u vidu čvrste supstance bele boje, koja je korišćena u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja. LCMS [M+H]<+>m/z: izrač.450,1; dobijeno 450,2.

Korak 2: Sinteza perfluorofenil 7-hloro-2,4-dimetil-2-(4-((3-(trifluorometil)oksetan-3-il)amino)cikloheksil)benzo[d][1,3]dioksol-5-karboksilata

[0122] U rastvor 7-hloro-2,4-dimetil-2-(4-((3-(trifluorometil)oksetan-3-il) amino) cikloheksil)benzo[d][1,3]dioksol-5-karboksilne kiseline (70 mg, 155 µmol) u dihlorometanu (0,5 ml) dodat je piridin (24,9 µl, 310 µmol) i 2,3,4,5,6-pentafluorofenil 2,2,2-trifluoroacetat (39,8 µl, 232 µmol) na sobnoj temperaturi. Nakon 15 minuta reakcija je koncentrovana pod smanjenim pritiskom da bi se dobila smeša naslovnog jedinjenja i nusproizvoda (68 mg,

4

sirova). Sirova smeša je upotrebljena u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja. LCMS [M+H]<+>m/z: izrač.616,1, dobijeno 616,2.

Korak 3: Sinteza 7-hloro-2,4-dimetil-N-((6-metil-4-(metiltio)-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)-2-(4-((3-(trifluorometil)oksetan-3-il)amino)cikloheksil)benzo[d] [1,3]dioksol-5-karboksamida

[0123] U rastvor 2,3,4,5,6-pentafluorofenil 7-hloro-2,4-dimetil-2-[4-{[3-(trifluorometil)oksetan-3-il]amino}cikloheksil]-2H-1,3-benzodioksol-5-karboksilata (≤68 mg, ≤110 µmol) u N,N-dimetilformamidu (1 ml) dodat je 3-(aminometil)-6-metil-4-(metilsulfanil)-1,2-dihidropiridin-2-on (slobodna baza) (30,4 mg, 0,165 mmol) i N, N-diizopropiletilamin (0,1 ml, 574 µmol) na sobnoj temperaturi. Reakcija je mešana na 50°C tokom 30 minuta, a zatim direktno dodata na C18 kolonu za prečišćavanje reverzno-faznom fleš hromatografijom (C18 kolona, gradijent 5 do 50% acetonitrila u vodi sa 0,1% trifluorosirćetnom kiselinom) da bi se dobila so trifluorosirćetne kiseline naslovnog jedinjenja. So je rastvorena u dihlorometanu i organski sloj je ispran zasićenim vodenim rastvorom natrijum bikarbonata. Na kraju, organski sloj je koncentrovan do suva pod smanjenim pritiskom da bi se dobilo naslovno jedinjenje (slobodna baza) (42 mg, 62% prinosa) u vidu čvrste supstance bele boje. LCMS [M+H]<+>m/z: izrač.616,19; dobijeno 616,3.<1>H NMR (400 MHz, Hloroform-d) δ 12.62 - 12.44 (m, 1H), 7.16 (t, J= 5.1 Hz, 1H), 6.91 (s, 1H), 6.04 (s, 1H), 4.76 (s, 3H), 4.62 - 4.46 (m, 4H), 2.72 - 2.63 (m, 1H), 2.49 (s, 3H), 2.32 (s, 3H), 2.27 (s, 3H), 1.92 (d, J= 5.9 Hz, 4H), 1.80 (br. s., 1H), 1.60 (s, 3H), 1.36 - 1.10 (m, 6H).

Tabela 3. Sledeća jedinjenja su pripremljena na sličan način kao u primeru 6 korišćenjem odgovarajućeg polaznog materijala.

Primer 8: 7-hloro-N-((4-hloro-6-metil-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)-2-(4-(3-ciklopropoksiazetidin-1-il)cikloheksil)-2,4-dimetilbenzo[d][1,3]dioksol-5-karboksamid [0124]

4

Korak 1: Sinteza metil 7-hloro-2-(4-(3-ciklopropoksiazetidin-1-il)cikloheksil)-2,4-dimetilbenzo[d][1,3]dioksol-5-karboksilata

[0125] Rastvor 3-(ciklopropoksi)azetidin hidrohloridne soli (1,9 g, 12,7 mmol) i N,N-diizopropiletilamin (2,7 ml, 15,5 mmol) u metanolu (10 ml) mešan je na sobnoj temperaturi 1 sat pre nego što je dodat rastvor drugog rastvora metil 7-hloro-2,4-dimetil-2-(4-oksocikloheksil)-1,3-benzodioksol-5-karboksilata (Intermedijer 4 - Pik 2) (860 mg, 2,54 mmol) u tetrahidrofuranu (30 ml). Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi 1,5 sat, a zatim ohlađena na -70 °C. Dodat je litijum borohidrid (120 mg, 5,51 mmol) i reakcija je 30 minuta mešana na -70°C [ili dok pomoću TLC, etil acetata/metanola 5:1, nije primećena potpuna potrošnja početnog materijala]. Zatim je reakcija ugašena zasićenim vodenim rastvorom amonijum hlorida (100 ml) i željeni proizvod je ekstrahovan etil acetatom (50 ml × 2). Kombinovani organski ekstrakti su isprani slanim rastvorom (400 mL), osušeni preko natrijum sulfata, filtrirani i koncentrovani pod smanjenim pritiskom. Ostatak je prečišćen fleš hromatografijom (silikagel, gradijent 50 do 100% etil acetat u petrol etru) da bi se dobilo naslovno jedinjenje (760 mg, prinos 65%; čistoća 95%) u vidu žutog ulja. LCMS [M+H]<+>m/z: izrač.436,1; dobijeno 436,0.

Korak 2: Sinteza 7-hloro-2-(4-(3-ciklopropoksiazetidin-1-il)cikloheksil)-2,4-dimetilbenzo[d] [1,3]dioksol-5-karboksilne kiseline

[0126] U rastvor metil 7-hloro-2-(4-(3-ciklopropoksiazetidin-1-il)cikloheksil)-2,4-dimetilbenzo[d][1,3] dioksol-5-karboksilata (760 mg, 1,74 mmol) u metanolu (15 ml) i vodi (3 ml) dodat je litijum hidroksid hidrat (962 mg, 22,93 mmol). Reakciona smeša je mešana na

4

70 °C tokom 15 sati, zatim koncentrovana pod smanjenim pritiskom. Dodata je voda (15 ml) i pH vrednost je podešena na 6 zasićenim vodenim rastvorom limunske kiseline na 0°C. Željeni proizvod je ekstrahovan smešom 10:1 dihlorometana i izopropanola (30 ml × 3). Kombinovani organski slojevi su isprani slanim rastvorom (150 ml × 2), osušeni natrijum sulfatom, filtrirani i koncentrovani do suva pod smanjenim pritiskom da bi se dobilo naslovno jedinjenje (720 mg, sirovo) u vidu žute čvrste supstance, koja je korišćena u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja. LCMS [M+H]<+>m/z: izrač.422,1; dobijeno 422,0.

Korak 3: Sinteza 7-hloro-N-((4-hloro-6-metil-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)-2-(4-(3-ciklopropoksiazetidin-1-il)cikloheksil)-2,4-dimetilbenzo[d] [1,3]dioksol-5-karboksamida

[0127] U rastvor 7-hloro-2-[4-[3-(ciklopropoksi)azetidin-1-il]cikloheksil]-2,4-dimetil-1,3-benzodioksol-5-karboksilne kiseline (360 mg, 0,853 mmol) u N,N-dimetilformamidu (4 ml) dodat je O-(7-azabenzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronijum heksafluorofosfat (500 mg, 1,31 mmol) i N,N-diizopropiletilamin (1 ml, 5,74 mmol). Smeša je mešana 30 minuta na 15°C pre nego što je dodata 3-(aminometil)-4-hloro-6-metil-1H-piridin-2-on hidrohloridna so (Intermedijer 6) (250 mg, 1,2 mmol). Reakciona smeša je mešana na 15°C tokom dodatna 4 sata, a zatim filtrirana. Filtrat je prečišćen preparativnom HPLC [kolona: Waters Xbridge (150 mm×25 mm, 5 µm). Mobilna faza A: voda (0,05% amonijak hidroksid v/v / Mobilna faza B: acetonitril. Gradijent (65 do 55% mobilna faza A / 35 do 65% mobilna faza B, tokom 9,5 min). Temperatura kolone: 30 °C] da bi se dobilo naslovno jedinjenje (209 mg, 42% prinosa) u vidu čvrste supstance bele boje. LCMS [M+H]<+>m/z: izrač.576,2; dobijeno 576,2.

<1>H NMR (400 MHz, Metanol-d4) δ 6.90 (s, 1H), 6.30 (s, 1H), 4.52 (s, 2H), 4.22 (quin, J= 6.0 Hz, 1H), 3.61 (dd, J= 6.4, 8.6 Hz, 2H), 3.31 - 3.25 (m, 1H), 2.99 (dd, J= 6.3, 8.4 Hz, 2H), 2.28 (s, 3H), 2.20 (s, 3H), 2.12 - 2.04 (m, 1H), 1.99 - 1.85 (m, 5H), 1.62 (s, 3H), 1.33 - 1.24 (m, 2H), 1.06 - 0.95 (m, 2H), 0.56 - 0.51 (m, 2H), 0.51 - 0.44 (m, 2H).

Tabela 4. Sledeća jedinjenja su pripremljena na sličan način kao u primeru 8 korišćenjem odgovarajućeg polaznog materijala.

4

4

Primer 14: (R)-7-hloro-2,4-dimetil-N-((6-metil-4-(metiltio)-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)-2-(1-(2,2,2-trifluoroetil)piperidin-4-il)benzo[d][1,3]dioksol-5-karboksamid i (S)

4

-7-hloro-2,4-dimetil-N-((6-metil-4-(metiltio)-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)-2-(1-(2,2,2-trifluoroetil)piperidin-4-il)benzo[d][1,3]dioksol-5-karboksamid

Korak 1: Sinteza 7-hloro-2,4-dimetil-N-((6-metil-4-(metiltio)-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)-2-(1-(2,2,2-trifluoroetil)piperidin-4-il)benzo[d][1,3]dioksol-5-karboksamida [0129] U rastvor 2,3,4,5,6-pentafluorofenil 7-hloro-2,4-dimetil-2-[1-(2,2,2-trifluoroetil) piperidin-4-il]-2H-1,3-benzodioksol-5-karboksilata (Intermedijer 8) (752 mg, 1,34 mmol) u dimetilsulfoksidu (4 ml) dodati su 3-(aminometil)-6-metil-4-(metilsulfanil)-1,2-dihidropiridin-2-on (Intermedijer 1) (740 mg, 4,02 mmol) i N,N-diizopropiletilamin (932 µl, 5,36 mmol). Reakciona smeša je zagrejana na 60°C i nakon 1 sata dodata na kolonu C18 radi prečišćavanja. Željeni proizvod je dva puta prečišćen reverzno-faznom fleš hromatografijom (kolona C18, gradijent 0 do 100% acetonitrila u vodi sa 0,1% trifluorosirćetne kiseline) da bi se dobilo naslovno jedinjenje (289 mg, 38% prinosa) kao racemska smeša kao guma.

Korak 2: Separacija (R)-7-hloro-2,4-dimetil-N-((6-metil-4-(metiltio)-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)-2-(1-(2,2,2-trifluoroetil)piperidin-4-il)benzo[d][1,3]dioksol-5-karboksamida i (S)-7-hloro-2,4-dimetil-N-((6-metil-4-(metiltio)-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)-2-(1-(2,2,2-trifluoroetil)piperidin-4-il)benzo[d] [1,3]dioksol-5-karboksamida

[0130] Racemska smeša 7-hloro-2,4-dimetil-N-((6-metil-4- (metiltio)-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il) metil)-2-(1-(2,2,2-trifluoroetil)piperidin-4-il)benzo[d][1,3]dioksol-5karboksamida (289 mg) razdvojena je preparativnom SFC [kolona: ChromegaChiral CC4 od ES Industries (250 mm ×20 mm veličina pora). Mobilna faza A: CO2/ Mobilna faza B: 0,25% izopropilamin u metanolu. Izokratski (55% mobilna faza A i 45% mobilna faza B). Protok: 80 g/min. Temperatura kolone: 25 °C]. SFC analitička metoda: kolona: Chiralcel OX-H od Chiral Technologies (100mm×4,6mm veličina pora). Mobilna faza A: CO2/ Mobilna faza B: 0,1% izopropilamin u metanolu. Izokratski (75% mobilna faza A i 25% mobilna faza B). Protok: 4 ml/min. Temperatura kolone: 40 °C. Primer 16 (enantiomer 1) (željeni enantiomer/eutomer): Vreme zadržavanja = 3,74 min (SFC analitička metoda). Iskorišćenje = 90 mg, prinos 12%, 99% ee (žuta čvrsta supstanca). LCMS [M+H]<+>m/z: izrač.560,2; dobijeno 560,2.<1>H NMR (400 MHz, Metanol-d4) δ 6.89 (s, 1H), 6.27 (s, 1H), 4.49 (s, 2H), 3.08 - 2.98 (m, 4H), 2.52 (s, 3H), 2.34 (br t, J= 11.0 Hz, 2H), 2.29 (s, 3H), 2.20 (s, 3H), 1.93 - 1.84 (m, 1H), 1.83 - 1.76 (m, 2H), 1.62 (s, 3H), 1.60 - 1.47 (m, 2H). Primer 16 (Enantiomer 2) (neželjeni enantiomer/distomer): Vreme zadržavanja = 4,25 min (SFC analitička metoda). Iskorišćenje = 101 mg g, prinos 13%, 98% ee, (žuta čvrsta supstanca). LCMS [M+H]<+>m/z: izračunato 560.2; pronađeno 560.2.<1>H NMR (400 MHz, Metanol-d4) δ 6.89 (s, 1H), 6.27 (s, 1H), 4.49 (s, 2H), 3.08 - 2.98 (m, 4H), 2.52 (s, 3H), 2.34 (br t, J= 11.0 Hz, 2H), 2.29 (s, 3H), 2.20 (s, 3H), 1.93 - 1.84 (m, 1H), 1.83 - 1.76 (m, 2H), 1.62 (s, 3H), 1.60 - 1.47 (m, 2H).

Primer 15: 7-hloro-N-((4-hloro-6-metil-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)-2-(4-(3-metoksiazetidin-1-il)cikloheksil)-2,4-dimetilbenzo[d] [1,3]dioksol-5-karboksamid

[0132] U rastvor 7-hloro-2-(4-(3-metoksiazetidin-1-il)cikloheksil)-2,4-dimetilbenzo[d][1,3] dioksol-5-karboksilne kiseline (900 mg, 2,27 mmol) u N,N-dimetilformamidu (5 ml) dodat je O-(7-azabenzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronijum heksafluorofosfat (1,04 g, 2,73 mmol) i N,N-diizopropiletilamin (2,38 ml, 13,6 mmol). Smeša je mešana 30 minuta na 25°C pre nego što je dodata 3-(aminometil)-4-hloro-6-metil-1H-piridin-2-on hidrohloridna so (Intermedijer 6) (710 mg, 3,4 mmol). Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi

1

dodatnih 1,5 sat, a zatim filtrirana. Filtrat je prečišćen preparativnom HPLC dva puta [kolona: YMC-Actus Triart C18 (100 mm×30 mm, 5 µm). Mobilna faza A: voda (0,05% hlorovodonične kiseline) / Mobilna faza B: acetonitril. Gradijent (85 do 55% mobilna faza A / 15 do 45% mobilna faza B, tokom 10 min). Temperatura kolone: 30°C i kolona: Xtimate C18 (150mm×25mm, 5µm). Mobilna faza A: voda (0,05% amonijak hidroksid v/v) / Mobilna faza B: acetonitril. Gradijent (69 do 39% mobilna faza A / 31 do 61% mobilna faza B, tokom 7 min). Temperatura kolone: 30 °C] da bi se dobilo naslovno jedinjenje (533 mg, prinos 43%, čistoća >99%) u vidu čvrste supstance bele boje. LCMS [M+H]<+>m/z: izrač.550,2; dobijeno 550,1.<1>H NMR (400 MHz, Hloroform-d) δ 11.97 (br, 1H), 7.06 - 7.03 (m, 1H), 6.88 (s, 1H), 6.19 (s, 1H), 4.65 (d, J= 6.0Hz, 2H), 4.05 - 4.01 (m, 1H), 3.66 - 3.62 (m, 2H), 3.25 (s, 3H), 2.93 - 2.90 (m, 2H), 2.28 (s, 3H), 2.25 (s, 3H), 1.93 - 1.81 (m, 6H), 1.60 (s, 3H), 1.25 - 1.02 (m, 4H).

2

Primer 16: (R)-7-hloro-N-((4-hloro-6-metil-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)-2,4-dimetil-2- (l-(2,2,2-trifluoroetil)piperidin-4-il)benzo[d][1,3]dioksol-5-karboksamid i (S)-7-hloro-N-((4-hloro-6-metil-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)-2,4-dimetil-2-(1-(2,2,2-trifluoroetil)piperidin-4-il)benzo[d] [1,3]dioksol-5-karboksamid

Korak 1: Sinteza 7-hloro-N-((4-hloro-6-metil-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)-2,4-dimetil-2-(1-(2,2,2-trifluoroetil)piperidin-4-il)benzo[d] [1,3]dioksol-5-karboksamida [0134] U rastvor 2,3,4,5,6-pentafluorofenil 7-hloro-2,4-dimetil-2-[1-(2,2,2-trifluoroetil) piperidin-4-il]-2H-1,3-benzodioksol-5-karboksilata (Intermedijer 8) (188 mg, 0,3358 mmol) u dimetilsulfoksidu (1 ml) dodati su 3-(aminometil)-4-hloro-6-metil-1,2-dihidropiridin-2-on hidrohloridna so (Intermedijer 6) (70,2 mg, 0,336 mmol) i N,N-diizopropiletilamin (233 µl, 1,34 mmol). Reakciona smeša je zagrejana na 60°C i nakon 1 sata dodata na kolonu C18 radi prečišćavanja. Željeni proizvod je dva puta prečišćen reverzno-faznom fleš hromatografijom (kolona C18, gradijent 0 do 100% acetonitrila u vodi sa 0,1% trifluorosirćetne kiseline) da bi se dobilo naslovno jedinjenje (180 mg, 98% prinosa) kao racemska smeša kao guma.

Korak 2: Separacija (R)-7-hloro-N-((4-hloro-6-metil-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)-2,4-dimetil-2-(1-(2,2,2-trifluoroetil)piperidin-4-il)benzo[d][1,3]dioksol-5-karboksamida i (S)-7-hloro-N-((4-hloro-6-metil-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il)metil) -2,4-dimetil-2-(1-(2,2,2-trifluoroetil)piperidin-4-il)benzo[d] [1,3]dioksol-5-karboksamida [0135] Racemska smeša 7-hloro-N-((4-hloro-6-metil-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il)metil) -2,4-dimetil-2-(1-(2,2,2-trifluoroetil)piperidin-4-il)benzo[d][1,3]dioksol-5-karboksamida (180 mg) razdvojena je preparativnom SFC [kolona: ChromegaChiral CC4 od ES Industries (250 mm ×20 mm veličina pora). Mobilna faza A: CO2/ Mobilna faza B: 0,25% izopropilamin u metanolu. Izokratski (65% mobilna faza A i 35% mobilna faza B). Protok: 80 g/min.

Temperatura kolone: 25 °C]. SFC analitička metoda: kolona: Chiralcel OZ-H od Chiral Technologies (100 mm×4,6 mm, xxµm veličina pora). Mobilna faza A: CO2/ Mobilna faza B: 0,1% izopropilamin u metanolu. Izokratski (65% mobilna faza A i 35% mobilna faza B). Protok: 4 ml/min. Temperatura kolone: 40 °C. Primer 17 (enantiomer 1) (željeni enantiomer/eutomer): Vreme zadržavanja = 0,73 min (SFC analitička metoda). Iskorišćenje = 61 mg, prinos 33%, 100% ee (žuta čvrsta supstanca). Primer 17 (enantiomer 2) (neželjeni enantiomer/distomer): Vreme zadržavanja =0,98 min (SFC analitička metoda). Iskorišćenje = 63 mg, prinos 34%, 97 ee, (žuta čvrsta supstanca). LCMS [M+H]<+>m/z: izrač.548,1; dobijeno 548,2.<1>H NMR (400 MHz, Metanol-d4) δ 6.89 (s, 1H), 6.29 (s, 1H), 4.52 (s, 2H), 3.04 (q, J= 9.8 Hz, 4H), 2.35 (br t, J = 11.0 Hz, H), 2.27 (s, 3H), 2.19 (s, 3H), 1.95 - 1.85 (m, 1H), 1.85 -1.75 (m, 2H), 1.63 (s, 3H), 1.62 - 1.50 (m, 2H).

Primer 17: 7-hloro-2-(4-(3-metoksiazetidin-1-il)cikloheksil)-2,4-dimetil-N-((6-metil-4-(metiltio)-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)benzo[d][1,3]dioksol-5-karboksamid [0136]

[0137] U rastvor 7-hloro-2-(4-(3-metoksiazetidin-1-il)cikloheksil)-2,4-dimetilbenzo[d][1,3]dioksol-5-karboksilne kiseline (Intermedijer 9 - jedan enantiomer i geometrijski izomer) (5 g, 12,63 mmol) u N,N-dimetilformamidu (50 ml) dodat je O-(7-azabenzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronijum heksafluorofosfat (5,7 g, 14,99 mmol) i N,N-diizopropiletilamin (11 ml, 63,15 mmol). Smeša je 30 minuta mešana na 20°C pre nego što je dodata 3-(aminometil)-6-metil-4-(metiltio)piridin-2(1H)-on hidrohloridna so (Intermedijer 1) (4,2 g, 19,03 mmol). Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi dodatnih 1,5 sat, a zatim filtrirana. Filtrat je prečišćen preparativnom HPLC [kolona:

Phenomenex Gemini C18 (250 mm×50 mm, 10 µm). Mobilna faza A: voda (0,04% amonijak hidroksid v/v i 10 mM amonijum bikarbonat) / Mobilna faza B: acetonitril. Gradijent (75 do

4

44% mobilna faza A / 25 do 56% mobilna faza B, tokom 23 min). Temperatura kolone: 30 °C] da bi se dobilo naslovno jedinjenje (4,4 g, prinos 60%, čistoća 96% u vidu čvrste supstance bele boje. LCMS [M+H]<+>m/z: izrač.562,2, pronađeno 562,2.<1>H NMR (400 MHz, Metanol-d4) δ 6.91 (s, 1H), 6.29 (s, 1H), 4.50 (s, 2H), 4.01 (quin, J= 6 Hz, 1H), 3.58 (dd, J = 8.8, 6.4 Hz, 2H), 3.26 (s, 3H), 2.92 - 3.02 (m, 2H), 2.54 (s, 3H), 2.31 (s, 3H), 2.21 (s, 3H), 2.01 - 2.11 (m, 1H), 1.79 - 2.00 (m, 5H), 1.62 (s, 3H), 1.19 - 1.34 (m, 2H), 0.91 - 1.08 (m, 2H).

EZH2 testovi

IC50 merenja za inhibitore koji koriste EZH2

[0138] EZH2 biohemijski test (IC50): Potentnost jedinjenja procenjena je putem inkorporacije<3>H-SAM u biotinisani H3 peptid. Konkretno, 30 pM PRC2 koji sadrži wt EZH2 (pentamerni kompleks pripremljen interno) je preinkubiran sa 450 nM SAM, 450 nM<3>H-SAM, 2 µM H3K27me3 aktivacionim peptidom (H2N-RKQLATKAAR(Kme3)SAPATGGVKKP-amid) i jedinjenjima (kao titracije odgovora na dupliranu dozu u 10 tačaka u DMSO, konačni test 0,8% DMSO (v/v)) tokom 3-5 sati u 50 mM Tris (pH 8,5), 1 mM DTT, 0,07 mM Brij-35, 0,1% BSA i 0,8% DMSO u ukupnoj zapremini od 12,5 µl. Reakcija je inicirana biotinisanim H3 supstrat peptidom (H2N-RKQLATKAAR(Kmel)SAPATGGVKKP-NTPEGBiot) kao 2 µM osnovnog rastvora u 12,5 µl pufera i ostavljena da reaguje na sobnoj temperaturi 18-22 sati. Gašenje je postignuto dodavanjem 20 µl STOP rastvora (50 mM Tris (pH 8,5), 200 mM EDTA, 2 mM SAH).35 µl ugašenog rastvora je prebačeno na FlashPlates (PerkinElmer) obložene streptavidinom, inkubirano 1-2 sata, isprano i očitano u TopCount Reader čitaču (PerkinElmer). IC50su izračunate u Genedata Screener softveru koristeći nelinearnu metodu najmanjih kvadrata za fitovanje u 4 parametra, pri čemu su četiri parametra bila IC50, Hilov nagib, pre-traziciona osnovna linija (0% INH) i post-tranziciona osnovna linija (100% INH).

EC50 merenja za inhibitore u HeLa ćelijskim testovima

[0139] H3K27me3 Alfa Hela test (AlphaLISA). Deset različitih doza svakog ispitivanog jedinjenja (u seriji trostrukih razblaženja) zasejano je u duplikatu na mikrotitar ploče sa 384 bunara tretirane tkivnom kulturom (Katalog # 6007680; Perkin Elmer, Waltham, MA). Hela ćelije kultivisane u kulturi su tripsinizovane i prebrojane pomoću brojača ćelija Countess<®>(katalog # C10281; Life Technologies, Grand Island, NY). Ćelije su razblažene do 67.000 ćelija po ml u 10% DMEM (katalog # 10569-010 Life Technologies, Grand Island, NY) i 15 µl (1.000 ćelija) je zasejano u svaki bunar mikrotitar ploče pomoću Biotek MicroFlo<™>Select Dispenser dozatora (BioTek Instruments, Inc. Vermont, USA). Ploče su inkubirane na 37°C /5% CO2tokom 72 sata. Jedan od duplikata ploče je obrađen za HeLa test, a drugi za test vijabilnosti. 5 µl Cell-Histone Lysis pufera (1X) (katalog # AL009F1 Perkin Elmer;

Waltham, MA) po bunaru je dodato na ploču obrađenu za AlphaLISA i ploča je inkubirana na sobnoj temperaturi 30 minuta na tresilici mikrotitarskih ploča pri maloj brzini (model# 4625-Q Thermo Scientific; Waltham, MA). Zatim je dodato 10 µl po bunaru Histone Extraction pufera (katalog # AL009F2; Perkin Elmer; Waltham, MA) i ploča je dalje inkubirana na sobnoj temperaturi 20 minuta na tresilici mikrotitarskih ploča pri maloj brzini. Zatim, u svaki bunar je dodato 10 µl 5X mešavine anti-K27me3 akceptorskih perli plus biotinisano antihistonsko H3 (C-ter) antitelo (razblaženo do 3nM finalno) (katalog # AL118 Perkin Elmer; Waltham, MA). Razblaženje akceptorskih perli i anti-histona H3 urađeno je u 1X Histone Detection puferu (Katalog # AL009F3 Perkin Elmer; Waltham, MA) koji je proizveden razblaživanjem 10X osnovnog materijala koji je dostavljen. Ploča je zaptivena aluminijumskim zaptivačem ploče i inkubirana 60 minuta na 23°C. Zatim je dodato 10 µl 5X rastvora Streptavidin Donor perli (Katalog #6760002 Perkin Elmer; Waltham, MA) (20 µg/ml finalno u 1X Histone Detection puferu), = ploča je zaptivena aluminijumskim zaptivačem ploče i inkubirana 30 minuta na 23°C. Ploče su zatim očitane pomoću EnVision-Alpha Reader čitača (model # 2104 Perkin Elmer; Waltham, MA).

[0140] Vijabilnost ćelija je ispitana dodavanjem 15 µl Cell Titer Glo ((katalog # G9241 Promega Madison, WI) u svaki bunar sa ćelijama sa podlogom. Ploče su inkubirane na sobnoj temperaturi 15 - 20 minuta na tresilici mikrotitar ploča pri maloj brzini. Ploče su zatim očitane pomoću EnVision-Alpha Reader čitača (model # 2104 Perkin Elmer; Waltham, MA).

GI50 merenja za inhibitore u Karpas-422 testovima vijabilnosti

[0141] Ćelijske linije Karpas-422 pribavljene od DSMZ (Braunschweig, Nemačka) i uzgajane su na RPMI-1640 podlogama. Sve podloge su sadržale 10% fetalnog goveđeg seruma (FBS) i 1% penicilina/streptomicina (Invitrogen).20K ćelija po bunaru je zasejano na 96 ploča obloženih jedinjenjem. Ćelije su podeljene i zasejane prema originalnoj gustini ploče (na osnovu broja DMSO bunara) svaka 4 dana na ploče koje sadrže sveže inhibitore EZH2. Relativni broj ćelija je 8. dana procenjen testom luminiscentne vijabilnosti ćelija Cell Titer-Glo (Promega). GraphPad Prism 5 je korišćen za fitovanje krive i prijavljene su vrednosti GI50. Podaci su prikazani u Tabeli 5.

Tabela 5.

Merenja vremena zadržavanja

[0142] EZH2 test vremena zadržavanja: Vremena zadržavanja jedinjenja procenjena su praćenjem oporavka aktivnosti enzima nakon stostrukog razblaživanja prethodno formiranog kompleksa inhibitora enzima (reakcija razblaživanja) i upoređivanjem sa aktivnošću nerazblaženog kontrolog uzorka sa istim finalnim koncentracijama svih reagensa (kontrolna reakcija). Aktivnost enzima je izmerena inkorporacijom<3>H-SAM u biotinisani H3 peptid. Za reakciju razblaživanja, 20 nM PRC2 koji sadrži wt EZH2 (pentamerni kompleks pripremljen interno) je prethodno inkubiran sa 1 µM aktivacionog peptida (H2N-RKQLATKAAR(Kme3) SAPATGGVKKP-amid) i jedinjenja na 600 puta njegove Kitokom 2 sata u 40 µl pufera (50 mM Tris pH 8,5, 4 mM DTT, 1 mM MgCl2, 0,07 mM Brij-35 i 0,1 mg/ml BSA), zatim razblažen 100 puta i reakcija inicirana prenosom 1,4 µl na 138,6 µl zapremine pufera koji sadrži 1 µM aktivacionog peptida, 5,05 µM supstratnog peptida (H2N-RKQLATKAARKSAPATGGVKKP-NTPEGbiot), 1,01 µM SAM i 1,01 µM<3>H-SAM. Za kontrolnu reakciju, 0,202 nM PRC2 je predinkubirano sa 1 µM aktivacionog peptida, 1,01 µM SAM, 1,01 µM<3>H-SAM i jedinjenjem na 6,06 puta njegove Kitokom 2 sata u 138,6 µl pufera, zatim je reakcija inicirana dodavanjem 1,4 µE 500 µM supstrata peptida u vodi. Reakcije su ugašene u različitim vremenskim tačkama koje se protežu do 10 sati, prenošenjem 8 µl alikvota iz reakcionog suda na ploču koja sadrži 8 µl STOP rastvora po bunaru (50 mM Tris pH 8,5, 200 mM EDTA, 2 mM SAH). Nakon poslednje vremenske

1

tačke, 12 µl ugašenih rastvora je prebačeno na streptavidinom obložen FlashPlate (PerkinElmer) koji sadrži 40 µl STOP rastvora po bunaru, inkubirano 1-8 sati, isprano i očitano u TopCount čitaču ploča (PerkinElmer).

[0143] Korišćen je prilagođeni skript za fitovanje podataka o toku kontrolne reakcije na pravu liniju i podataka o toku reakcije razblaživanja:

Gde je y formirani proizvod, t je vreme reakcije, vije početna brzina, vsje brzina stabilnog stanja, a kobsje konstanta brzine za tranziciju iz faze početne brzine krive u fazu brzine stabilnog stanja krive. Pri fitovanju podataka o toku reakcije razblaživanja, vsje bio ograničen na nagib linije fitovane na podatke o toku kontrolne reakcije. Fitovana vrednost kobsje zatim transformisana u vreme zadržavanja:

Gde je τ vreme zadržavanja, Kije konstanta inhibicije, [EI] je izračunata ravnotežna koncentracija kompleksa inhibitora enzima, [E] je izračunata ravnotežna koncentracija slobodnog enzima, a [I] je izračunata ravnotežna koncentracija slobodnog inhibitora.

Merenja ćelijske propusnosti za inhibitore u MDCK testu

[0144] Ćelijska kultura: MDCK II ćelije (pribavljene od Piet Borst-a sa Netherlands Cancer Institute) zasejane su na polietilenske membrane (PET) u BD insert sistemima sa 96 bunara pri 2,5 × 105 ćelija/ ml do 4-7 dana za formiranje konfluentnog ćelijskog monosloja.

[0145] Eksperimentalni postupak: Ispitna i referentna jedinjenja (nadolol, metoprolol i digoksin) su razblažena transportnim puferom (HBSS sa 10mM Hepes, pH 7,4) iz osnovnog rastvora do koncentracije od 2 µM (<1% DMSO) i aplikovana na apikalnu (A) ili bazolateralnu (B) stranu ćelijskog monosloja. Propuštanje testnih jedinjenja iz smera A ka B ili iz smera B ka A određeno je u duplikatu sa P-gp inhibitorom (GF120918, 10 µM).

Digoksin je takođe testiran pri 10 µM u A ka B smeru ili B ka A smeru sa/bez P-gp inhibitora (GF120918, 10 µM), dok su nadolol i metoprolol testirani pri 2 µM u A ka B smeru bez P-gp inhibitora (GF120918, 10 µM) u duplikatu. Ploča je inkubirana 2,5 sata u CO2inkubatoru na 37±1°C, sa 5% CO2pri zasićenoj vlažnosti bez protresanja. Pored toga, određen je i odnos

2

efluksa za svako jedinjenje. Testna i referentna jedinjenja su kvantifikovana LC/MS/MS analizom na osnovu odnosa površine pika analita/IS. Nakon testa transporta, Lucifer žuto test odbacivanja se primenjuje za određivanje integriteta ćelijskog monosloja. Puferi su uklonjeni i iz apikalnih i iz bazolateralnih komora, nakon čega sledi dodavanje 75 µl od 100 µM jedinjenja Lucifer žuto u transportnom puferu i 250 µl transportnog pufera u apikalne i bazolateralne komore, respektivno. Ploča se inkubira 30 minuta na 37°C sa 5% CO2i 95% relativne vlažnosti bez protresanja. Nakon 30 minuta inkubacije, sa apikalnih strana se uzima 20 µl uzorka Lucifer žutog, nakon čega se dodaje 60 µl transportnog pufera. A zatim se sa bazolateralnih strana uzima 80 µl uzorka Lucifer žutog. Relativna fluorescentna jedinica (RFU) Lucifer žutog meri se na 425/528 nm (pobuda/emisija) pomoću čitača ploča Molecular Device M2e.

[0146] Analiza podataka: Prividni koeficijent permeabilnosti Papp (cm/s) izračunat je pomoću jednačine:

Gde je dCr/dt kumulativna koncentracija jedinjenja u prijemnoj komori u funkciji vremena (µM/s); Vrje zapremina rastvora u prijemnoj komori (0,075 ml na apikalnoj strani, 0,25 ml na bazolateralnoj strani); A je površina za transport, tj.0,0804 cm2 za površinu monosloja; C0je početna koncentracija u komori donora (µM).

[0147] Odnos efluksa je izračunat pomoću jednačine:

Odnos efluksa = Papp(BA)/Papp(AB)

% povraćaja je izračunat pomoću jednačine:

Gde je Vdzapremina u komorama donora (0,075 ml na apikalnoj strani, 0,25 ml na bazolateralnoj strani); Cdi Crsu konačne koncentracije transportnog jedinjenja u komori donora i prijemnoj komori, respektivno.

[0148] Procenat Lucifer žutog u bazolateralnom bunaru izračunava se pomoću jednačine:

gde su RFU apikalno i RFU bazolateralno jedinične vrednosti relativne fluorescencije Lucifer žutog u apikalnim i bazolateralnim bunarima; V apikalno i V bazolateralno su zapremine apikalnih i bazolateralnih bunara (0,075 ml i 0,25 ml), respektivno. Procenat Lucifer žutog treba da bude manji od 2. Podaci su prikazani u Tabeli 6.

Tabela 6

Primer Vreme Ćelijska propusnost (10<-6>

4

Primer Vreme Ćelijska propusnost (10<-6>

Primer Vreme Ćelijska propusnost (10<-6>zadržavanja cm/s)/ Odnos efluksa

Primer Vreme Ćelijska propusnost (10<-6>zadržavanja cm/s)/ Odnos efluksa

Claims (15)

1. Patentni zahtevi 1. Jedinjenje formule IV ili VI:

   ili njihova farmaceutski prihvatljiva so. R<1>je -SCH3ili hloro; X je CH; R<a>je vodonik, (C1-C4)alkil ili halo(C1-C4)alkil; R<b>je (C1-C4)alkil, halo(C1-C4)alkil ili 4-7-člani heterociklil, pri čemu je navedeni heterociklil opciono supstituisan sa 1 do 3 grupe izabrane između halo, (C1-C4)alkila, halo(C1-C4)alkila, (C1-C4)alkoksija i halo(C1-C4)alkoksija; ili R<a>i R<b>zajedno sa atomom azota za koji su vezani formiraju 4-7-člani heterociklil opciono supstituisan sa 1 do 3 grupe izabrane između halo, (C1-C4)alkila, halo(C1-C4)alkila i -OR<c>; R<c>je (C1-C4)alkil, halo(C1-C4)alkil ili (C3-C7)cikloalkil; R<6>je halo(C1-C4)alkil.
2. 2. Jedinjenje iz zahteva 1, pri čemu je jedinjenje ove formule:

   ili njegove farmaceutski prihvatljive soli.
3. 3. Jedinjenje iz bilo kog od patentnih zahteva 1 ili 2, pri čemu je R<b>(C1-C4)alkil ili oksetanil, pri čemu je navedeni oksetanil opciono supstituisan sa halo(C1-C4)alkilom; ili R<a>i R<b>zajedno sa atomom azota za koji su vezani formiraju azetidinil opciono supstituisan sa halo ili -OR<c>.
4. 4. Jedinjenje iz bilo kog od patentnih zahteva 1 do 3, pri čemu je R<a>vodonik ili metil; i R<b>je metil ili oksetanil, pri čemu je navedeni oksetanil opciono supstituisan sa -CH2F ili - CF3.
5. 5. Jedinjenje iz bilo kog od patentnih zahteva 1 do 4, pri čemu R<a>i R<b>zajedno sa atomom azota za koji su vezani formiraju azetidinil opciono supstituisan sa 1 do 2 fluora ili -OR<c>; a R<c>je -CH3, -CHF2ili ciklopropil.
6. 6. Jedinjenje iz zahteva 1, pri čemu je jedinjenje formule:

   ili njihovih farmaceutski prihvatljivih soli. 1
7. 7. Jedinjenje iz bilo kog od zahteva 1 do 6, pri čemu grupa

   i NR<a>R<b>su trans orijentisani oko cikloheksila.
8. 8. Jedinjenje bilo kog od zahteva 1 do 6, pri čemu grupa

   i NR<a>R<b>su cis orijentisani oko cikloheksila.
9. 9. Jedinjenje iz bilo kog od zahteva 1 do 8, pri čemu stereohemijska konfiguracija hiralnog centra 1,3-dioksolanila je R.
10. 10. Jedinjenje bilo kog od zahteva 1 do 8, pri čemu stereohemijska konfiguracija hiralnog centra 1,3-dioksolanila je S.
11. 11. Jedinjenje iz zahteva 1, pri čemu je jedinjenje formule:

    ili njegove farmaceutski prihvatljive soli.
12. 12. Jedinjenje iz zahteva 1, pri čemu je jedinjenje formule:

    ili njegove farmaceutski prihvatljive soli. 2
13. 13. Farmaceutski sastav koji se sastoji od jedinjenja iz bilo kog od zahteva 1 do 12, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli; i farmaceutski prihvatljivog nosača.
14. 14. Jedinjenje prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 12 ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, za upotrebu u tretmanu kancera u ispitaniku.
15. 15. Jedinjenje za upotrebu iz zahteva 14, pri čemu je karcinom izabran između karcinoma dojke, karcinoma prostate, karcinoma debelog creva, karcinoma bubrežnih ćelija, multiformnog glioblastoma, karcinoma bešike, melanoma, bronhijalnog karcinoma, limfoma, holangiosarkoma, multiplog mijeloma, karcinoma pluća, karcinoma jajnika i karcinoma jetre. Izdaje i štampa: Zavod za intelektualnu svojinu, Beograd, Kneginje Ljubice 5