ES2991182T3 - Un anticuerpo monoclonal y un método de uso para el tratamiento del lupus - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a composiciones y métodos útiles para el tratamiento del lupus utilizando un anticuerpo monoclonal anti-CD6 IgG1 humanizado (T1h) que se une al dominio SRCR 1(D1) de CD6 sin bloquear la interacción de CD6 con el ligando CD6, la molécula de adhesión de células leucocitarias activadas (ALCAM). (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Un anticuerpo monoclonal y un método de uso para el tratamiento del lupus

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un anticuerpo monoclonal anti-CD6 de isotipo IgG1 humanizado (T1h) que se une al dominio 1(D1) rico en cisteína del receptor Scavenger (SRCR) de CD6 presente en la superficie de las células epiteliales del timo, monocitos, linfocitos T activados y diversos otros tipos de células. La invención se refiere además a métodos para inhibir la proliferación de linfocitos T sin bloquear la interacción de CD6 con la molécula de adhesión a células leucocitarias activadas por ligando CD6 (ALCAM). También se refiere a composiciones y métodos útiles para el tratamiento del lupus usando el anticuerpo monoclonal anti-CD6 que se une al dominio SRCR 1(D1) de CD6.

Antecedentes de la invención

El lupus, un prototipo de enfermedad autoinmunitaria sistémica humana, se caracteriza por una amplia variedad de lesiones multiorgánicas. Es una enfermedad autoinmunitaria que implica a anticuerpos que atacan el tejido conjuntivo. Se estima que la enfermedad afecta a casi 1 millón de estadounidenses, principalmente mujeres entre 20 y 40 años. La forma principal de lupus es sistémica (lupus eritematoso sistémico; LES) y está asociada con la producción de anticuerpos antinucleares, complejos inmunitarios circulantes y activación del sistema del complemento. Si bien la patogenia del LES aún no se comprende bien, se sabe que los linfocitos B, los linfocitos T y los monocitos desempeñan un papel fundamental en la progresión de la enfermedad. Concretamente, hay un marcado aumento en la actividad policlonal de los linfocitos B y T y dicho aumento puede caracterizarse por el desarrollo de linfocitos T y respuestas de anticuerpos contra diversos de autoantígenos. Se ha teorizado que la activación de los linfocitos T estimula la producción de linfocitos B autorreactivos en un epítopo específico y luego pueden extenderse a otros epítopos. Dicha respuesta de anticuerpos puede incluir, como se ha indicado anteriormente, la producción de autoanticuerpos contra antígenos propios, tales como anticuerpos antinucleares (ANA) y anticuerpos anti-ADN bicatenarios.

El LES se puede tratar modulando la respuesta inmunitaria mediante el antagonismo de un proceso/vía perjudicial o la estimulación de un proceso/vía beneficioso. El uso de anticuerpos neutralizantes que inhiben las moléculas que tienen actividad estimulante del sistema inmunitario o que inhiben directamente la respuesta inmunitaria son formas eficaces de mejorar las enfermedades relacionadas con el sistema inmunitario.

CD6 es una importante proteína de la superficie celular expresada predominantemente por linfocitos T humanos y un subconjunto de linfocitos B, así como por algunas leucemias linfocíticas crónicas de linfocitos B y neuronas. El CD6 es miembro de una gran familia de proteínas caracterizadas por tener al menos un dominio homólogo al dominio rico en cisteína del receptor Scavenger (SRCR) de los macrófagos tipo I. Los estudios de bloqueo que utilizan anticuerpos monoclonales (mAb) anti-CD6 sugieren que CD6 desempeña un papel importante en el desarrollo de linfocitos T al regular las interacciones adhesivas de los linfocitos T con las células epiteliales del timo (ET).

Estudios adicionales han demostrado que CD6 puede funcionar como una molécula accesoria importante en la activación de los linfocitos T. Por ejemplo, ciertos mAb anti-CD6 son directamente mitogénicos para los linfocitos T [1, 2], mientras que otros son capaces de coestimular la proliferación de linfocitos T junto con anti-CD3, anti-CD2 o 12 miristato 13 acetato de forbol (PMA) [1, 3, 4]. Sin embargo, evidencia adicional del papel de CD6 en la activación de los linfocitos T proviene de estudios que muestran que CD6 se hiperfosforila en los residuos Ser y Thr [5, 6, 7] y se fosforila en los residuos Tyr [8] después de la activación de los linfocitos T. Estos y otros estudios implican al CD6 como un modulador importante de la función de los linfocitos T tanto inmaduros como madurosin vivo,afectando tanto a la activación de los linfocitos T como a la transducción de señales.

El dominio extracelular de la proteína CD6 madura está compuesto por tres dominios SRCR (en adelante denominados D1, D2 y D3). D3 correspondiente al dominio SRCR proximal a la membrana seguido de una región corta del tallo de 33 aminoácidos. Estos dominios extracelulares están anclados a la membrana celular a través de un dominio transmembrana corto seguido de un dominio citoplasmático de longitud variable [19].

Los estudios que utilizan proteínas de fusión CD6-inmunoglobulina, que contiene dominios extracelulares seleccionados de CD6 fusionados a dominios constantes de IgGi humana (CD6-Rgs), condujeron a la identificación y clonación de un ligando de CD6, denominada "molécula de adhesión de células leucocitarias activada" (ALCAM) [11, 12]. ALCAM se une al dominio 3 de CD6 correspondiente al dominio SRCR proximal a la membrana [13].

Los estudios sobre el papel de las interacciones CD6/ALCAM en la regulación de los linfocitos T han demostrado que este par receptor-ligando es capaz de mediar en la adhesión de las células que expresan CD6 a las células epiteliales del timo [12]. Esta y otras pruebas sugieren que las interacciones CD6/ALCAM son importantes para modular el desarrollo y la activación de los linfocitos T.

Aunque la caracterización funcional de CD6 sigue siendo incompleta, se ha aplicado con éxito un mAb anti-CD6 en un entorno clínico para purgar la médula ósea de linfocitos T y precursores de linfocitos T. Estos hallazgos respaldan aún más la hipótesis de que CD6 desempeña un papel importante en la modulación de la función de los linfocitos Tin vivo.También se informa que CD6 forma parte de la sinapsis inmunológica que media la interacción temprana y tardía entre linfocitos T y células presentadoras de antígeno (APC). [14]

La patente de Estados Unidos n.° 6.372.215 desvela anticuerpos y otros agentes de unión que se unen específicamente a los dominios SRCR 3 (D3) de la CD6 humana (hCD6) o al dominio del tallo de la CD6 humana (CD6S) e inhiben la unión de la molécula de adhesión de células leucocitarias activadas (ALCAM) a CD6.

Publicaciones y patentes anteriores describieron secuencias del anticuerpo monoclonal murino anti-CD6 (IOR-T1) y las modificaciones de aminoácidos que se llevaron a cabo para humanizar IOR-T1 a T1h (IOR-T1 humanizado). La patente de Estados Unidos n.° 5.712.120 y su equivalente el documento EP 0699755 desvelan métodos específicos para humanizar anticuerpos monoclonales murinos y la secuencia de IOR-T1 y T1h. La patente de Estados Unidos n.° 6.572.857 y su equivalente, el documento EP 0807125, desvelan la secuencia de IOR-T1 y T1h (IOR-T1 humanizada). La publicación de Roque-Navarro [15] analiza métodos específicos para humanizar los anticuerpos monoclonales murinos y la secuencia de IOR-T1 y T1h. El documento PCT/IN2008/00562, titulado "A Monoclonal Antibody and a Method Thereof", analiza la orientación de CD6 como tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria como la esclerosis múltiple, el rechazo de trasplantes y enfermedades de injerto contra huésped.

Existe una necesidad urgente de composiciones y métodos terapéuticos mejorados para el tratamiento del lupus. En la actualidad, el lupus generalmente se trata con corticosteroides e inmunosupresores. En algunas realizaciones, se usan anticuerpos que agotan significativamente los linfocitos y en otras realizaciones los linfocitos no se agotan. Sería ventajoso proporcionar un anticuerpo monoclonal anti-CD6 que inhiba la activación de los linfocitos T uniéndose a CD6, el dominio D1, sin interferir con la unión de ALCAM a CD6 y en donde el anticuerpo monoclonal anti-CD6 tiene la capacidad de tratar el lupus e inhibir la proliferación de linfocitos T que generalmente ocurre en una enfermedad de tipo lupus.

Sumario de la invención

En el presente documento se divulga un anticuerpo monoclonal anti-CD6 (T1h) que reduce o previene la activación de los linfocitos T, inhibe la proliferación de linfocitos T, reduce la inducción de citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) y se une al dominio 1 (D1) de CD6 sin interferir con la unión de ALCAM a CD6 y en el que el anticuerpo monoclonal anti-CD6 comprende secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 o secuencias que tienen al menos aproximadamente un 97 % de identidad con las mismas.

La presente invención se refiere a un anticuerpo monoclonal anti-CD6 para su uso en el tratamiento del lupus. El anticuerpo monoclonal anti-CD6 comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 o un fragmento de unión a antígeno de las mismas.

Además, se desvela una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo monoclonal anti-CD6 para su uso en un método de tratamiento del lupus. El uso comprende administrar a un sujeto que sufre los efectos del lupus una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo monoclonal anti-CD6 que comprende o consiste en secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2.

El uso de la presente invención puede ser para tratar a un sujeto que tiene una o más manifestaciones o sistemas de lupus, que incluyen, sin limitación, lupus eritematoso sistémico, nefritis lúpica, lupus eritematoso cutáneo, lupus del sistema nervioso central (SNC), manifestaciones cardiovasculares, manifestaciones pulmonares, manifestaciones hepáticas, manifestaciones hematológicas, manifestaciones gastrointestinales, manifestaciones musculoesqueléticas, lupus eritematoso neonatal, lupus eritematoso sistémico infantil, lupus eritematoso inducido por fármacos, síndrome antifosfolípidos o síndromes de deficiencia del complemento que dan como resultado manifestaciones de lupus.

Además, se desvela un polinucleótido que codifica un anticuerpo monoclonal anti-CD6 que comprende secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, un vector que incluye los polinucleótidos que codifican las secuencias de aminoácidos, y una célula huésped que incluye el vector. La célula puede ser eucariota (por ejemplo, de mamífero tal como de ser humano, ratón, célula de mono o de conejo) o puede ser procariota (por ejemplo, una célula bacteriana como una célula deE. coli).

En otro aspecto más, la presente invención proporciona un método para tratar el lupus en un sujeto, comprendiendo el método administrar al sujeto un anticuerpo monoclonal anti-CD6 que comprende secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 o un fragmento de unión a antígeno de los mismos, en donde el uso del anticuerpo monoclonal anti-CD6 muestra una reducción de citocinas proinflamatorias.

También se desvela el uso de un anticuerpo monoclonal anti-CD6 que comprende secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 en un método para modular estados inflamatorios. El anticuerpo monoclonal se puede combinar con un agente quimioterapéutico, un agente inmunosupresor, un medicamento contra la malaria, un agente citotóxico, un antagonista de integrina, un antagonista de citocinas o una hormona.

El inmunosupresor puede incluir prednisona, metotrexato, azatioprina o ciclofosfamida. De forma importante, la administración del anticuerpo monoclonal anti-CD6 del presente proporciona una cantidad reducida de inmunosupresor evitando así los efectos negativos de los inmunosupresores que pueden debilitar las defensas del cuerpo contra otros patógenos potenciales, haciendo así al sujeto extremadamente susceptible a infecciones y otras enfermedades potencialmente fatales, tales como cáncer.

También se divulga el uso de un anticuerpo monoclonal anti-CD6 que comprende secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 en un método para reducir la activación de linfocitos T en un sujeto con un nivel elevado de anticuerpos antinucleares. (ANA) y/o anticuerpos anti-ADN bicatenario (ADNbc). El uso comprende administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo monoclonal anti-CD6.

También se desvela el uso de un anticuerpo monoclonal anti-CD6 en métodos para tratar a un paciente con lupus que lo necesita. El uso comprende administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo anti-CD6 en combinación con al menos un segundo compuesto. El segundo compuesto suele ser un agente terapéutico que se utiliza para tratar el lupus, por ejemplo, un tratamiento estándar o experimental. En los métodos de terapia de combinación de la presente invención, el anticuerpo anti-CD6 y el agente terapéutico adicional se pueden administrar en cualquier orden según sea apropiado para el paciente. El anticuerpo anti-CD6 y el/los agente(s) adicional(es) se pueden administrar de forma concurrente o secuencial. Por ejemplo, el o los agentes adicionales pueden administrarse antes o después de la terapia anti-CD6. También se proporcionan en la invención kits útiles para dicha terapia combinada.

Además, se desvela un anticuerpo monoclonal que se une específicamente al dominio 1 (D1) rico en cisteína del receptor Scavenger (SRCR) de CD6 que comprende una cadena pesada y una cadena ligera codificadas por la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 3 o un complemento de las mismas; y (b) una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 4 o una complementaria de la misma.

Además, se desvela el uso del anticuerpo anti-CD6 descrito anteriormente en la fabricación de un medicamento útil para el tratamiento del lupus.

También se desvela el uso en un método de tratamiento para un sujeto que no tiene una enfermedad autoinmunitaria distinta del lupus.

Además, se desvela un artículo de fabricación que comprende: (a) un recipiente que comprende el anticuerpo monoclonal anti-CD6 de la presente invención; y (b) un prospecto con instrucciones para tratar el lupus en un sujeto, en donde las instrucciones indican que se administra al sujeto una cantidad del anticuerpo que es eficaz para reducir los efectos negativos del lupus.

El anterior y otros objetos y aspectos de la presente invención y de la presente divulgación se explican con detalle en los dibujos del presente documento y en la memoria descriptiva que se expone a continuación.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 muestra el examen externo de los ganglios linfáticos de ratones normales y con LES: Los ratones con LES (panel derecho) muestran ganglios linfáticos inflamados (marcados con flechas) y glándulas salivales agrandadas.

La Figura 2 muestra la comparación del peso de los órganos y la linfadenopatía: Los animales (n=6) se trataron con 60 o 600 |jg de a-mCD6 o 60 |jg de IgG de rata (control de isotipo) por vía intraperitoneal (i.p.) durante 10 días (3 semanas por dosis, días alternos). Al final del estudio se midió la linfadenopatía (a) (Escala 0-3; ganglios linfáticos bajos/sin inflamación a grave) y se midieron los pesos de los órganos (b-d). Se observó una reducción significativa en la puntuación de linfadenopatía (a) y el tamaño del bazo (c) y las glándulas salivales (d) (p<0,05, ANOVA unidireccional seguido de prueba de comparación múltiple).

La Figura 3 muestra los resultados del ensayo de proliferación celular: Se sometieron suspensiones de células individuales de células linfáticas de cada grupo a proliferación mediada por anti-mCD3. El grupo tratado con amCD6 mostró resultados significativos (p<0,05; ANOVA unidireccional seguido de prueba de comparación múltiple) hiporreactividad a la proliferación mediada por anti-CD3.

La Figura 4 muestra los resultados del análisis de citocinas: Los sobrenadantes del ensayo de proliferación se utilizan para medir la liberación de citocinas mediante el análisis Cytokine Bead Array (CBA). a-mCD6 mostró una disminución significativa en la liberación de IFN-y (p<0,05; prueba de Mann-Whitney) en el grupo tratado (ambos grupos se combinaron para fines de análisis) en comparación con el grupo de isotipo. El TNF-a también fue menor en el grupo tratado en comparación con el grupo tratado con isotipo, pero la diferencia no fue estadísticamente significativa (p<0,09).

La Figura 5 muestra los resultados del análisis de ANA y anticuerpos anti-ADN ds en suero: El suero de los ratones tratados con isotipo y a-mCD6 se utilizaron para analizar (dilución 1:100) los anticuerpos ANA y anti-ADN ds mediante ELISA.

La Figura 6 muestra el régimen de dosificación para el tratamiento de los ratones.

La Figura 7 (A) Secuencia de nucleótidos de VH (SEQ ID NO: 3) y Vk (SEQ ID NO: 4) de T1h derivada de plásmido y ADN genómico; (B) Secuencia de aminoácidos de VH (SEQ ID NO: 1) y Vk (Se Q ID NO: 2); (C) Comparación de la secuencia de aminoácidos de Vk divulgada en publicaciones anteriores (SEQ ID NO: 5) con la secuencia divulgada en esta patente (SEQ ID NO: 2) para resaltar las diferencias de secuencia.

La Figura 8 muestra la lectura de ELISA de una placa unida con CD6-Fc en presencia de T1h y ALCAM o T1h solo.

La Figura 9 muestra la inhibición dependiente de la dosis de T1h en linfocitos como un gráfico de barras. La figura representa el % de inhibición de T1h en los linfocitos activados por PHA en diversas concentraciones (50 ug/ml, 25 ug/ml, 12,5 ug/ml, 6,25 ug/ml). Se usó hR3 (anticuerpo no específico) en la misma concentración.

La Figura 10 muestra la diferencia de citotoxicidad entre Rituxan y T1h en el ensayo de CDC utilizando Alamar Blue.

La Figura 11 muestra los resultados de células HUT 78 tratadas con anticuerpo T1h (5 ug/ml), anticuerpo hR3 (5 ug/ml) y rapamicina (1,2 ug/ml) o sin anticuerpo (como control) que se incubaron durante la noche a 37 ° en un incubador con atmósfera de CO<2>. Luego, las células se trataron con una solución de marcado de Anexina V seguido de un análisis de citometría de flujo. Registro FITC de anexina V en el eje horizontal, rojo texas PI/PE en el eje vertical.

La Figura 12 muestra los resultados del tratamiento de PBMC con anticuerpo T1h (10 ug/ml), hR3 (control de isotipo) o sin anticuerpo (como control) y se incubaron durante 5 días a 37 °C en un incubador de CO<2>. Las células se estimularon con el toxoide del tétanos antes de la incubación. La proliferación se midió con colorante azul Alamar. No se observó inhibición de la proliferación en presencia de T1h.

La Figura 13 muestra que, mediante inmunofluorescencia, las células Raji son verdaderas linfocitos B y también expresan antígenos MHC II.

La Figura 14 muestra PBMC proliferativas en presencia de células Raji tratadas con mitomicina. El control positivo muestra que las PBMC crecen en presencia de PHA. sT1h inhibe la proliferación de linfocitos T (significativamente según la prueba t) en comparación con controles sin anticuerpo o hR3. Cada experimento es una media y una desviación estándar obtenidas de seis pocillos diferentes.

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona un anticuerpo monoclonal anti-CD6 capaz de unirse al dominio 1 (D1) de CD6 e inhibe la proliferación de linfocitos T sin interferir con la unión de ALCAM, y en el que el anticuerpo monoclonal anti-CD6 reduce las afecciones inflamatorias debidas al lupus sistémico. Además, se ha descubierto que el anticuerpo monoclonal anti-CD6 no induce citotoxicidad dependiente del complemento (CDC)in vitro.

La práctica de los métodos y usos divulgados en el presente documento empleará, salvo que se indique lo contrario, técnicas convencionales de inmunología, biología molecular, microbiología, biología celular y ADN recombinante, que están dentro de la experiencia de la materia. Véase, por ejemplo, Sambrook,et al.CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2a edición (1989); CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel,et al.eds., (1987)); the series METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc MOLECULAR.): PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (M. J. MacPherson, B. D. Hames y G. R. Taylor eds. (1995)), Harlow y Lane, eds. (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL y ANIMAL CELL CULTURE (R. I. Freshney, ed. (1987)).

Definiciones

A menos que se defina de otro modo en el presente documento, los términos científicos y técnicos utilizados en el presente documento tendrán los significados que entienden normalmente los expertos en la materia. Además, a menos que el contexto requiera lo contrario, los términos en singular incluirán pluralidades y los términos en plural incluirán el singular.

En la descripción y las reivindicaciones de la presente invención, se usará la siguiente terminología según las definiciones que se exponen en el presente documento.

Como se usa en el presente documento, el "lupus" es una enfermedad o trastorno autoinmunitario que implica a anticuerpos que atacan al tejido conjuntivo. La forma principal de lupus es sistémica, lupus eritematoso sistémico (LES), que incluye LES cutáneo y LES cutáneo subagudo, así como otros tipos de lupus (incluyendo nefritis, exfrarrenal, cerebritis, pediátrico, no renal, discoide y alopecia).

Como se usa en el presente documento, "Anticuerpo anti-CD6" es generalmente un anticuerpo que se une específicamente al dominio SRCR 1 (D1) de CD6 humano (hCD6). En aspectos preferidos de la invención, los anticuerpos y otras inmunoglobulinas, incluyendo anticuerpos y fragmentos de anticuerpos nativos y modificados artificialmente, se utilizan que se unen específicamente al dominio 1 SRCR humano de<c>D6 y que no interfieren con la unión de la molécula de adhesión de células leucocitarias activadas (ALCAM) a CD6.

Como se usa en el presente documento, un "sujeto" es un sujeto humano. En general, dicho sujeto es elegible para el tratamiento del lupus. Para los fines del presente documento, dicho sujeto elegible es uno que está experimentando o ha experimentado uno o más signos, síntomas u otros indicadores de lupus o ha sido diagnosticado con lupus, ya sea, por ejemplo, recién diagnosticado, previamente diagnosticado con un nuevo brote o crónicamente dependiente de esteroides con un nuevo brote o está en riesgo de desarrollar lupus.

Como se usa en el presente documento, los "síntomas" u otros indicadores utilizados para diagnosticar el lupus pueden incluir erupciones en las mejillas, erupción discoide o parches rojos elevados; fotosensibilidad, tal como la reacción a la luz solar; úlceras orales, tal como úlceras en la nariz o la boca; artritis, tales como artritis no erosiva que afecta a dos o más articulaciones periféricas; trastornos renales, tal como exceso de proteínas en la orina; signos neurológicos, tales como ataques (convulsiones); y síntomas hematológicos, tal como anemia hemolítica, leucopenia, linfopenia o trombocitopenia.

Como se usa en el presente documento, "anticuerpo monoclonal" (mAb) se refiere a un anticuerpo de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos; esto es, los anticuerpos individuales en dicha población son idénticos excepto por mutaciones de origen natural que pueden estar presentes en cantidades minoritarias. Los anticuerpos monoclonales son sumamente específicos, estando dirigidos contra un único determinante antigénico, un "epítopo". Por consiguiente, el modificador "monoclonal" es indicativo de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos dirigidos al epítopo idéntico y no debe interpretarse como que requiere la producción del anticuerpo mediante ningún método particular. Debe entenderse que los anticuerpos monoclonales pueden prepararse mediante cualquier técnica o metodología conocida en la técnica; incluyendo, por ejemplo, métodos de a Dn recombinante conocidos en la técnica, o métodos de aislamiento de ADN monoclonal producido de forma recombinante usando bibliotecas de anticuerpos de fagos.

Como se usa en el presente documento, la "citotoxicidad dependiente de complemento" o "CDC" se refiere a la capacidad de una molécula para lisar una diana en presencia del complemento. La ruta de activación del complemento se inicia por la unión del primer componente del sistema del complemento a una molécula (por ejemplo un anticuerpo) que forma un complejo con un antígeno análogo.

Como se usa en el presente documento, por "citocina" se entiende un término genérico para proteínas liberadas por una población celular que actúan sobre otra célula como mediadores intercelulares. Ejemplos de dichas citocinas son linfocinas, monocinas; interleucinas (IL) tales como IL-1, IL,-la, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, lL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, IL-15; un factor de necrosis tumoral, tal como TNF-a o TNF-p.

Como se usa en el presente documento, los anticuerpos "inhibidores del crecimiento" son aquellos que evitan o reducen la proliferación de una célula que expresa un antígeno al que se une el anticuerpo. Por ejemplo, el anticuerpo puede prevenir o reducir la proliferación de linfocitos Tin vitroy/oin vivo.

Como se usa en el presente documento, "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad eficaz, a las dosis y durante los periodos de tiempo necesarios, para lograr un resultado terapéutico deseado.

Como se usa en el presente documento, una "enfermedad autoinmunitaria" es una enfermedad o trastorno que surge y se dirige contra los propios tejidos u órganos de un individuo y resulta de, o es agravado por, la producción por parte de los linfocitos B de anticuerpos que reaccionan con los tejidos y antígenos del cuerpo normal, tal como, secreción de un autoanticuerpo que es específico para un epítopo de un autoantígeno (por ejemplo, un antígeno nuclear).

Como se usa en el presente documento, la determinación de la apoptosis (muerte celular programada) mediante anticuerpos específicos, que son aquellos que "inducen o no inducen apoptosis, por ejemplo, de un linfocito T, puede determinarse mediante ensayos de apoptosis estándar, tal como la unión de la anexina V, fragmentación de ADN, reducción del volumen celular, dilatación del retículo endoplásmico, fragmentación celular y/o formación de vesículas de membrana (denominadas cuerpos apoptóticos).

Se entiende que los aspectos de la presente invención descritos en el presente documento también incluyen aspectos "que consisten en" y "que consisten esencialmente en".

De acuerdo con el primer aspecto, se desvela un anticuerpo monoclonal anti-CD6 que es capaz de unirse específicamente al dominio D1 de CD6 sin interferir con la unión de ALCAM a CD6 que comprende la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2. Las secuencias de nucleótidos que codifican el anticuerpo monoclonal anti-CD6 incluyen la SEQ ID NO: 3 y la SEQ ID NO: 4, respectivamente, o las secuencias de nucleótidos tienen al menos un 90 % de identidad con las mismas y codifican la s Eq ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2.

Métodos para producir anticuerpos monoclonales anti-CD6

Se desvelan métodos para producir los anticuerpos anti-CD6 desvelados. Estos métodos abarcan el cultivo de una célula huésped que contiene ácido(s) nucleico aislado(s) que codifican los anticuerpos desvelados en el presente documento. Como apreciarán los expertos en la materia, esto se puede lograr mediante varias maneras, dependiendo de la naturaleza del anticuerpo.

De manera general, se divulgan ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos del uso de la invención. Los polinucleótidos pueden encontrarse en forma de ARN o ADN. Los polinucleótidos en forma de ADN, ADNc, ADN genómico, análogos de ácidos nucleicos y ADN sintético se encuentran dentro del alcance de la divulgación. El ADN puede ser bicatenario o monocatenario y, en caso de ser monocatenario, puede ser la hebra codificante (sentido) o la hebra no codificante (antisentido). La secuencia codificante que codifica un anticuerpo monoclonal anti-CD6 puede ser idéntica a la secuencia codificante proporcionada en el presente documento o puede ser una secuencia codificante diferente, cuya secuencia, como resultado de la redundancia y degeneración del código genético, codifica el mismo polipéptido que el ADN proporcionado en el presente documento.

En algunas realizaciones, el o los ácidos nucleicos que codifican el anticuerpo monoclonal anti-CD6 del uso de la presente invención se incorporan en vectores de expresión, que puede ser extracromosómico o estar diseñado para integrarse en el genoma de la célula huésped en la que se introduce. Los vectores de expresión pueden contener cualquier número de secuencias reguladoras apropiadas (incluyendo, pero sin limitación, secuencias de control transcripcional y traduccional, promotores, sitios de unión a ribosomas, potenciadores, orígenes de replicación, etc.) u otros componentes (genes de selección, etc.), todos los cuales están operativamente unidos como es bien conocido en la técnica. En algunos casos se utilizan dos ácidos nucleicos y cada uno se coloca en un vector de expresión diferente (por ejemplo, cadena pesada en un primer vector de expresión, cadena ligera en un segundo vector de expresión), o alternativamente se pueden poner en el mismo vector de expresión. Los expertos en la materia apreciarán que el diseño del vector o vectores de expresión, incluyendo la selección de secuencias reguladoras, puede depender de factores tales como la elección de la célula hospedadora, el nivel de expresión de proteína deseado, etc.

De manera general, los ácidos nucleicos y/o la expresión se pueden introducir en una célula huésped adecuada para crear una célula huésped recombinante usando cualquier método apropiado para la célula huésped seleccionada (por ejemplo, transformación, transfección, electroporación, infección), de tal forma que las moléculas de ácido nucleico se unen operativamente a uno o más elementos de control de la expresión (por ejemplo, en un vector, en una construcción creada mediante procesos en la célula, integrada en el genoma de la célula hospedadora). La célula hospedadora recombinante resultante puede mantenerse en condiciones adecuadas para la expresión (por ejemplo, en presencia de un inductor, en un animal no humano adecuado, en medio de cultivo adecuado suplementado con sales adecuadas, factores de crecimiento, antibióticos, suplementos nutritivos, etc.), mediante lo cual se producen los polipéptidos codificados. En algunos casos, las cadenas pesadas se producen en una célula y la cadena ligera en otra.

Los vectores de expresión pueden transfectarse en células huésped tales como célulasE. coli,células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO) o células de mieloma que de otro modo no producen proteína inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células hospedadoras recombinantes. También se pueden utilizar células de levaduras, insectos y plantas para expresar anticuerpos recombinantes. En algunas realizaciones, los anticuerpos se pueden producir en animales transgénicos como vacas o pollos.

Los métodos generales para la biología molecular de anticuerpos. la expresión, la purificación y el cribado se describen, por ejemplo, en Antibody Engineering, editado por Kontermann y Dubel, Springer, Heidelberg, 2001 y 2010.

Modo de administración

Para la administración en los métodos de uso descritos a continuación, el anticuerpo monoclonal anti-CD6 puede mezclarse, antes de la administración, con una sustancia portadora no tóxica farmacéuticamente aceptable (por ejemplo, solución salina normal o solución salina tamponada con fosfato) y puede administrarse mediante cualquier procedimiento médicamente apropiado, por ejemplo, administración parenteral (por ejemplo, inyección) tal como mediante inyección intravenosa o intraarterial.

Las formulaciones del anticuerpo monoclonal anti-CD6 utilizadas de acuerdo con la presente invención se pueden preparar mezclando un anticuerpo que tenga el grado de pureza deseado con vehículos farmacéuticamente aceptables opcionales, excipientes o estabilizadores en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los vehículos, excipientes o estabilizantes aceptables no son tóxicos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas e incluyen tampones tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes incluyendo ácido ascórbico y metionina; conservantes tales como cloruro de octadecildimetilbencil amonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquil parabenos, tales como metil o propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol y m-cresol; polipéptidos de bajo peso molecular (de menos de aproximadamente 10 restos); proteínas, tales como seroalbúmina, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos, incluyendo glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes, tales como EDTA; azúcares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sales, tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos de Zn-proteína); y/o tensioactivos no iónicos, tales como TWEEN™, PLURONICS™ o polietilenglicol (PEG).

El anticuerpo monoclonal anti-CD6 también puede quedar atrapado en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcápsulas de poli(metilmetacrilato), respectivamente, en sistemas de suministro de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Dichas técnicas son bien conocidas en la técnica.

Pueden prepararse preparaciones de liberación sostenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación mantenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el anticuerpo monoclonal anti-CD6, cuyas matrices están en forma de artículos conformados, por ejemplo, películas o microcápsulas. Ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles, copolímeros de ácido L-glutámico, copolímeros de etileno-acetato de vinilo no degradables y copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradables.

El anticuerpo monoclonal anti-CD6 se puede administrar a un sujeto, de acuerdo con métodos conocidos, tales como administración intravenosa en embolada o mediante infusión continua durante un período de tiempo, por vía intramuscular, intraperitoneal, intracerebroespinal, subcutánea, intraarticular, intrasinovial, intratecal u oral. Se prefiere la administración intravenosa o subcutánea del anticuerpo monoclonal anti-CD6.

El tratamiento de enfermedades relacionadas con el lupus según el uso de la presente invención incluye una "cantidad terapéuticamente eficaz" del anticuerpo monoclonal anti-CD6 utilizado. De manera notable, una cantidad terapéuticamente eficaz puede variar de acuerdo con factores tales como el grado de la enfermedad, la edad, el sexo y el peso del individuo y de la capacidad del anticuerpo monoclonal anti-CD6 para desencadenar una respuesta deseada en el individuo.

Las pautas posológicas se ajustan para proporcionar la respuesta óptima deseada (por ejemplo, una respuesta terapéutica). Por ejemplo, se puede administrar una sola inyección en embolada, se pueden administrar varias dosis divididas a lo largo del tiempo o la dosis puede reducirse o aumentarse proporcionalmente según se indique por las exigencias de la situación terapéutica. Las dosis eficaces y los regímenes de dosificación para los anticuerpos monoclonales anti-CD6 usados en la presente invención dependen de la gravedad de la enfermedad de tipo lupus y pueden ser determinados por los expertos en la técnica.

Un intervalo no limitante de ejemplo para una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo monoclonal anti-CD6 utilizado en la presente invención es aproximadamente 0,01-100 mg/kg por peso corporal del sujeto, tal como aproximadamente 0,01-50 mg/kg, por ejemplo aproximadamente 0,01-25 mg/kg. Un profesional médico normalmente versado en la materia puede determinar y prescribir fácilmente la cantidad eficaz de la composición farmacéutica requerida. Por ejemplo, un médico podría comenzar con dosis del anticuerpo monoclonal anti-CD6 a niveles más bajos que los requeridos con el fin de lograr el efecto terapéutico deseado y aumentar de forma gradual la dosificación hasta que se logre el efecto deseado.

En una realización, el anticuerpo monoclonal anti-CD6 se administra mediante infusión en una dosis semanal de 1 a 500 mg/kg por peso corporal del sujeto, tal como, de 20 a 200 mg/kg. Dicha administración puede repetirse, por ejemplo, de 1 a 8 veces, tal como de 3 a 5 veces. Como alternativa, la administración se puede realizar por infusión continua durante un período de 2 a 24 horas, tal como, de 2 a 12 horas.

En una realización, el anticuerpo monoclonal anti-CD6 se administra en una dosis semanal de 10 mg a 200 mg, hasta 7 veces, tal como de 4 a 6 veces. La administración se puede realizar por infusión continua durante un período de 2 a 24 horas, tal como, de 2 a 12 horas. Dicha pauta se puede repetir una o más veces, según sea necesario, por ejemplo, después de 6 meses o 12 meses.

Los Ejemplos siguientes se exponen para ayudar en la comprensión de la invención, pero no pretenden ser ni deben limitarse como una limitación de su alcance de ninguna manera. Los Ejemplos no incluyen descripciones detalladas de los métodos convencionales empleados en los procedimientos de ensayo. Dichos métodos son bien conocidos por los expertos en la materia y se describen en numerosas publicaciones incluidas a modo de ejemplos.

Ejemplo 1

CD6 es una molécula coestimuladora, que se expresa predominantemente en linfocitos y se asocia con muchas enfermedades autoinmunitarias [16, 17]. El CD6 anti-ratón (a-mCD6) se une específicamente al dominio 1 de CD6 y es un anticuerpo sustituto de Itolizumab. Estudios anteriores que utilizaron este anticuerpo demostraron una mejora significativa de la EAE (encefalomielitis autoinmune experimental), un modelo para la esclerosis múltiple en ratones. En el presente estudio, el anticuerpo se evalúa en ratones MRL fas/lpr, un modelo de ratón relevante para enfermedades similares al lupus en seres humanos. El tratamiento con a-mCD6 mostró una reducción significativa de la linfadenopatía, los pesos del bazo y de las glándulas salivales (p<0,05) en comparación con el control de isotipo. Los animales tratados con a-mCD6 mostraron una hipoproliferación significativa en los ensayos de proliferación de linfocitos T mediada por anti-CD3 con una reducción simultánea en la liberación de citocinas proinflamatorias como IFN-<y>(p<0,04) y TNF-a (p<0,09).

MRL fas/lpr es un modelo animal muy conocido utilizado en lupus como enfermedades autoinmunitarias [18-21]. Este modelo tiene una mutación espontánea en el gen Fas, que afecta predominantemente a la proliferación de linfocitos B y T. Esta mutación previene la apoptosis con proliferación incontrolada de linfocitos, lo que da como resultado un agrandamiento masivo de los ganglios linfáticos (linfadenopatía), las glándulas salivales y el bazo como se muestra en la Figura 1. Este modelo también muestra una glomerulonefritis que se parece a la nefritis lúpica en humanos [22]. En ratones, el inicio de la enfermedad es a partir de las 8 semanas hasta la mortalidad entre las semanas 16-18 [20, 21].

El lupus eritematoso sistémico (LES) es una enfermedad inflamatoria autoinmunitaria que afecta principalmente a mujeres de mediana edad (proporción 9:1 de mujeres a hombres). Las características del LES incluyen erupciones cutáneas, dolor articular, pleuresía recurrente y enfermedad renal.

Este estudio describe el uso de a-mCD6 en este modelo de lupus. Los animales (n=6 por grupo, edad: 12 semanas) fueron tratados con 60 y 600 jg/dosis de a-mCD6 o 60 |jg de IgG de rata (control de isotipo) por vía intraperitoneal (i.p.) durante 10 días (3 semanas por dosis). Los animales fueron sacrificados a la edad de 16 semanas. El régimen de pruebas se muestra en la Figura 6. Al final del estudio se evaluaron los siguientes parámetros:

Medición de linfadenopatía seguida de recolección de órganos y evaluación al final del estudio.

Proteinuria: medida durante la duración del estudio.

Recolección de sangre al final del estudio.

Ensayos de proliferación con ganglios linfáticos y bazo.

Medición de anticuerpos antinucleares y anticuerpos anti-ADN ds a partir de suero de ratón.

Análisis de citocinas del ensayo de proliferación.

Resultados:

Disminución de las linfadenopatías con reducción asociada de ciertos órganos linfoides con a-mCD6.

Los ratones con lupus tratados con el anticuerpo a-mCD6 mostraron una reducción significativa en la puntuación de linfadenopatía y el peso de los órganos, es decir, el bazo, las glándulas salivales en comparación con el control de isotipo como se muestra en la Figura 2. No hubo diferencia en la proteinuria, el tamaño del riñón y del timo medido entre grupos (datos no mostrados).

El tratamiento con a-mCD6 muestra hiporreactividad a la proliferación mediada por anti-CD3 con reducción asociada de citocinas proinflamatorias

Las células derivadas de ganglios linfáticos de animales tratados con a-mCD6 muestran una hiporreactividad a la proliferación de linfocitos T mediada por anti-CD3 (p<0,05) en comparación con el grupo tratado con isotipo, indicando la supresión de la activación de los linfocitos T probablemente asociada con la supresión de la enfermedad, como se muestra en la Figura 3.

Las citocinas desempeñan un papel importante en la patogenia del LES [23 - 26]. Se midieron las citocinas Th1/Th2/Th17 a partir de los sobrenadantes del ensayo de proliferación. Los grupos tratados con a-mCD6 mostraron una menor liberación de citocinas proinflamatorias como IFN-y y TNF-a en comparación con el grupo de control, como se muestra en la Figura 4. Sin embargo, no hubo diferencias en las otras citocinas (IL-2, IL-6, IL-10 e IL-17) evaluadas entre los grupos.

Los animales tratados con a-mCD6 posiblemente afecten a la respuesta de los linfocitos B

Los anticuerpos antinucleares (ANA) y el ADN anti-ds son los autoanticuerpos clave que generalmente se observan en la enfermedad del lupus. Esto también se observa en este modelo animal [18, 20, 21, 27]. El tratamiento con amCD6 mostró menores anticuerpos ANA y anti-ADN ds en el suero de los ratones, como se muestra en la figura 5, en comparación con el grupo tratado con isotipo. Sin embargo, la reducción no fue estadísticamente significativa.

En este estudio inicial de búsqueda de dosis, tanto 60 como 600 jg/dosis mostraron una eficacia comparable en los criterios de valoración físicos y biológicos medidos. Esto sugeriría una saturación de dosis de 60 jg/dosis. Por lo tanto, se ha demostrado que el uso del anticuerpo a-mCD6 puede aliviar los síntomas similares al lupus en este modelo de ratón.

Ejemplo 2

T1h y ALCAM no se unen al mismo dominio en CD6 mediante ELISA

Cuando se incubaron concentraciones variables de ALCAM-Fc junto con una concentración fija de T1h en una placa ELISA recubierta con CD6-Fc, se detectó T1h en todas las concentraciones de ALCAM-Fc. Este experimento sugirió que T1h se une a un dominio diferente del dominio de unión ALCAM (Dominio 3).

Se diluyó rhCD6FC/Chimera (sistemas R y D) (100 |jg/ml) en tampón de recubrimiento y se añadieron 100 j l a cada pocillo de una placa Nunc-Maxisorp de 96 pocillos. Luego la placa se incubó a 4 °C durante la noche. La placa se lavó tres veces con PBS Tween 20. Posteriormente, se añadieron 200 j l de solución de bloqueo (2 % BSA 0,1 % de Tween 20 en 1x PBS) y se incubaron durante 1 hora a 37 °C. Después de la incubación, la placa se lavó nuevamente con PBS Tween tres veces, seguido de la adición de anticuerpo monoclonal T1h (0,2 mg/ml) y rhALCAMFc (sistemas R y D) en concentraciones variables. Luego se incubó durante una hora a 37 °C. Posteriormente la placa se lavó 3 veces con PBS Tween. A los pocillos se añadieron 200 j l de ALP IgG anti-humana (Fab)2(1:20000) diluida en tampón de bloqueo y se incubó durante 1 hora a 37 °C. La placa se lavó tres veces con PBS Tween y se añadieron 200 j l de sustrato de fosfato de p-nitrofenilo (PNPP) a cada pocillo y se incubaron a 37 °C hasta que se desarrolló el color, aproximadamente 15 minutos. La lectura se realizó a 405 nm utilizando un lector de microplacas BIOTEK. El experimento indica que la presencia de ALCAM en concentraciones variables no impide que T1h se una a un receptor c D6. La ausencia de competencia entre ALCAM y T1h sugiere que los dominios de unión de los dos son diferentes, como se muestra en la Figura 8.

Ejemplo 3

Inhibición de la proliferación de linfocitos mediante citometría de flujo mediante CFSE

Las PBMC se recogieron y se lavaron en PBS. Las células (7,5 * 106) se resuspendieron en 1 ml a una concentración de éster succinimidílico de carboxifluoresceína (CFSE) de 2 jM en PBS. Las células se incubaron durante 10 minutos exactamente a 37 °C. Se añadieron 10 ml de medio del Roswell Park Memorial Institute (RPMI), 10 % de FBS para detener la reacción. Las células se lavaron dos veces con 10 ml de PBS. Luego, la preparación celular se resuspendió en 5 ml de PBS a una densidad celular de 1,5 x 106 células/ml y se añadieron 200 ul a cada tubo BD FAC<s>. Se añadieron 200 ul de anticuerpo requerido y no específico en varias concentraciones (50 ug/ml, 25 ug/ml, 12,5 ug/ml y 6,25 ug/ml respectivamente) y se incubaron durante 30 minutos a 37 °C. Se añadieron 2 ml de PBS a cada tubo y se centrifugaron a 1200 RPM durante 5 minutos a temperatura ambiente para eliminar el anticuerpo no unido. Se añadió 1 ml de RPMI, 10 % de FBS al sedimento en cada tubo. Se añadió 1 ml de PHA 20 jg/m l en RPMI 10 % de FBS al tubo respectivo para estimular la proliferación. El volumen total en el tubo es de 2 ml y la concentración final de PHA fue de 10 jg/ml. El tubo se agitó y se incubó durante 3 días a 37 °C en incubador con CO<2>. Las células se lavaron con PBS y se centrifugaron a 1200<r>P<m>a 4 °C durante 5 minutos. El sobrenadante se descartó y se resuspendió en 500 ul de 1x PBS. Se adquirieron un total de 20.000 eventos a aproximadamente 200 eventos/s y se vieron en el canal FITC.

% de Inhibición = {[PHA-(T1h-PHA)]/PHA}*100

(Donde PHA=PHA-células solas PHA T1h=(PHA T1h)-células solas PHA hR3=(PHA hR3)-células solas)

Las células por sí solas son células CFSE+.

Estos datos sugieren que el anticuerpo T1h media la inhibición de la proliferación de linfocitos estimulados por PHA de una manera dependiente de la dosis. El porcentaje de inhibición puede variar entre los individuos debido a la variación inherente entre los individuos normales. Sin embargo, en general, se observó una inhibición dosis dependiente de los linfocitos estimulados por PHA con T1h pero no con un anticuerpo inespecífico hR3, como se muestra en la Figura 9.

Ejemplo 4

T1h no media la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC)

El ensayo basado en Alamar Blue (Resazurina) se utiliza para medir la capacidad de un anticuerpo para promover la destrucción celular. Esta es inducida por la unión del anticuerpo a un antígeno de la superficie celular, fijando y activando así el complemento, lo que da como resultado la lisis de la célula diana. La resazurina es un colorante activo redox que, cuando se reduce, cambia de color de azul a rosa.

Se recogió suero humano combinado (mínimo tres) de sangre completa en un tubo estéril, se dejó que la sangre coagulara a temperatura ambiente durante al menos 4 horas y se centrifugó a 900 g durante 20 minutos. Se recogió el suero; se dividieron en alícuotas y se almacenaron a -80 °C. Las células diana (Wil-2S/HUT-78) se lavaron en tampón de dilución y se resuspendieron a 2 x 105 células/ml. El anticuerpo se diluyó en tampón de dilución a 4 veces la concentración final deseada. El complemento se diluyó a 4 veces la concentración final deseada (es decir, diluciones 1:2,5 para una concentración final de 1:10). Se añadieron 50 j l de cada uno de anticuerpo diluido, complemento diluido y 50 j l de suspensión celular (10.000 células/pocillo) a cada pocillo de una placa de fondo plano de 96 pocillos. Se incluyeron los siguientes pocillos de control: células diana Ab solo (muerte celular espontánea), células diana suero únicamente (lisis de fondo) y SDS al 10 % células diana (para una muerte celular máxima). El control positivo fueron células Wil-2S tratadas con Rituxan en diferentes concentraciones. La placa de 96 pocillos se incubó durante 2 horas a 37 °C. Se añadieron 50 ul/pocillo de Alamar Blue a cada pocillo y la placa se incubó durante la noche a 37 °C. La fluorescencia se midió en un espectrofotómetro Biotek Synergy.TM. HT con excitación de 530 nm, emisión de 590 nm y sensibilidad = 35. Los resultados sugieren que T1h no induce CDC en comparación con Rituxan, como se muestra en la Figura 10. Por lo tanto, los resultados de este experimento demuestran de manera concluyente que el anticuerpo monoclonal anti-CD6 no induce CDC en una línea celular que expresa CD6, concretamente HUT 78.

Ejemplo 5

T1h no induce apoptosis en células HUT 78

Una de las características de la apoptosis es la translocación de fosfatidilserina (PS) desde la parte interna de la membrana plasmática hacia el exterior. El análisis de fosfatidilserina en la valva exterior de las membranas celulares apoptóticas se realiza utilizando anexina-V-fluoresceína y yoduro de propidio (PI) para la diferenciación de células apoptóticas y necróticas. La anexina V es una proteína de unión a fosfolípidos dependiente de Ca2+ con alta afinidad por la fosfatidilserina. Mientras que la PI se une a distintas células necróticas, la anexina-V-fluoresceína se une a las células apoptóticas. Este método ayuda a distinguir las poblaciones de células apoptóticas y necróticas. La población apoptótica temprana solo es positiva para Anexina V, mientras que la apoptosis tardía es positiva tanto para Anexina V como para PI.

Las células se recogieron y se añadieron 1,5 ml de 3,3 x 105 células/ml (células finales: 5*105 células) se sembró en cada placa de 35 mm. Se añadió la cantidad requerida de anticuerpo a las respectivas placas para obtener una concentración final de (5 jg/ml). En la placa de control, no se añadió ningún anticuerpo. Como control positivo, las células se incubaron con rapamicina a una concentración de 1,2 jg/m l. Las células se incubaron durante la noche a 37 °C en incubador con 5 % de CO<2>. Luego, las células se transfirieron a un tubo FACS BD Falcon n.° cat.: 352054 y se centrifugó a 1200 RPM durante 5 minutos a temperatura ambiente (TA). El sobrenadante se descartó y se resuspendió en 2 ml de PBS y se centrifugó a 1200 RPM durante 5 minutos a temperatura ambiente. Se descartó el sobrenadante y se añadieron 100 j l de solución de marcado de Anexina-V-Fluoresceína y se incubaron durante 10 15 minutos a temperatura ambiente. Las células se lavaron con 2 ml de PBS y se centrifugaron a 1200 RPM durante 5 minutos. Luego se descartó el sobrenadante. Las células se resuspendieron en 0,5 ml de PBS y se adquirieron mediante citómetro de flujo (se controlaron 3000 células) con excitación de 488 nm. Las muestras se leyeron en el canal FITC para Anexina V y en el canal rojo PE Texas para PI. Las muestras de anexina V sola y PI sola en el grupo tratado con rapamicina se pasaron para permitir la compensación.

Las células HUT 78 que fueron tratadas con T1h mostraron un 40% de apoptosis, que es casi igual al control no tratado en el canal FITC de anexina V. Las células no tratadas y tratadas con el anticuerpo no específico (anticuerpo hR3) mostraron un 35,3 % y un 36,5 % de apoptosis respectivamente, mientras que la rapamicina de control positivo mostró un 54,3 % de apoptosis. Estos datos sugieren que T1h no media en la apoptosis en las células HUT 78, como se muestra en la Figura 11.

Ejemplo 6

Sin inhibición de los linfocitos T de memoria por T1h en un ensayo de proliferación de linfocitos T mediado por toxoide del tétanos

Las PBMC se aislaron mediante Ficoll-Paque (Amersham n.° cat.: 17-14403-03), centrifugación en gradiente de densidad. Las capas leucocitarias se obtuvieron de donantes sanos y siempre se cosecharon frescas. Luego se lavaron las PBMC en PBS (Invitrogen). Luego, las PBMC se resuspendieron en 2 ml de medio RPMI con 5 % de FBS suplementado con una densidad celular de 0,3 x 106 células/ml. Luego, las células se incubaron durante 30 minutos con o sin T1h 10 ug/ml y hR3 que se usa como control no específico en un tubo BD FACS estéril de 5 ml. Después de la incubación, las células se agitaron y se añadieron 100 j l de la suspensión celular a los pocillos respectivos. Se añadieron 100 ul de solución de trabajo de toxoide del tétanos (n.° de catálogo 582231, CALBIOCHEM) (10 ug/ml) (medio RPMI con 5 % de FBS) a los pocillos respectivos para estimular la proliferación de linfocitos T de memoria. Las placas se incubaron durante cinco días en incubador de CO<2>a 37 °C. Se añadieron 65 j l de azul de Alamar a cada pocillo y se incubaron durante la noche en un incubador de CO<2>a 37 °C. La fluorescencia se midió en un espectrofotómetro Biotek Synergy.TM. HT con excitación de 530 nm, emisión a 590 nm y sensibilidad = 35.

Los resultados experimentales expuestos en la Figura 12 muestran que el toxoide del tétanos estimula la proliferación de linfocitos T de una manera dependiente de la dosis, pero T1h no muestra ninguna inhibición de la proliferación de estas células. Esto sugiere fuertemente que T1h no inhibe la proliferación de linfocitos T de memoria. Esto es favorable para la terapia con T1h porque la proliferación de linfocitos T de memoria circulantes no se ve afectada y los pacientes que reciben terapia con T1h no se volverían susceptibles a la infección.

Ejemplo 7

T1h inhibe la proliferación de linfocitos T en una reacción mixta de linfocitos mediada por PBMC y células Raji

Se recogieron células Raji/PBMC y se resuspendieron en IxPBS. Se resuspendieron 8 * 105células/ml de células Raji/PBMC en 1 ml de mitomicina (25 ug/ml). Las células se incubaron durante 30 minutos en un incubador de CO<2>a 37 °C. Después de la incubación, se añadieron 2 ml de RPMI con FBS al 5 % a cada tubo y se centrifugaron a 1200 RPM durante 5 minutos a temperatura ambiente para eliminar la mitomicina. Se descartó el sobrenadante y nuevamente se añadieron 2 ml de RPMI con 5 FBS y se centrifugaron. Se descartó el sobrenadante y las células se resuspendieron en el medio RPMI.

Se añadieron 50 ul de PBMC (4 * 105 células/ml) a los pocillos respectivos de placas de fondo redondo de 96 pocillos. Se añadieron 100 pl de dilución de anticuerpo T1h o hR3 (10 ug/ml) a los pocillos respectivos y se incubaron durante 30 minutos en un incubador de CO<2>a 37 °C. Se añadieron 50 ul de células Raji tratadas con mitomicina (4 * 105 células/ml) a los pocillos respectivos. Junto con el ensayo, los controles que se incluyeron fueron células Raji tratadas con mitomicina solo, PBMC solo, células Raji tratadas con mitomicina PHA, PBMC PHA, Raji tratadas con mitomicina y PBMC. La placa se incubó durante 5 días en incubador de CO<2>a 37 °C. Se añadieron 65 pl de azul de Alamar a cada pocillo y se incubaron durante la noche en un incubador de CO<2>a 37 °C. La fluorescencia se midió en un espectrofotómetro Biotek Synergy.TM. HT con excitación de 530 nm, emisión de 590 nm y sensibilidad = 35. En conclusión se observó, véanse los resultados de las Figuras 13 y 14, que T1h puede inhibir específicamente la MLR unidireccional cuando las células Raji son las células presentadoras de antígeno y las PBMC.

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25. Poole, B.D.,et al.,Cytokines in systemic lupus erythematosus. J Biomed Biotechnol. 2010: p. 735169.

26. Richards, H.B.,et al.,Interleukin 6 dependence of anti-DNA antibody production: evidence for two pathways of autoantibody formation in pristane-induced lupus. J Exp Med, 1998. 188(5): p. 985-90.

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Patente de Estados Unidos n.° 6.372.215

Patente de Estados Unidos n.° 5.712.120

Documento EP 0699755

Patente de Estados Unidos n.° 6.572.857

Documento EP 0807125

Documento PCT/IN2008/00562

Claims (10)

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo monoclonal anti-CD6 para su uso en el tratamiento del lupus, en donde el anticuerpo monoclonal anti-CD6 comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 o un fragmento de unión a antígeno de las mismas.

2. El anticuerpo monoclonal anti-CD6 para uso de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo consiste en las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2.

3. El anticuerpo monoclonal anti-CD6 o fragmento de unión a antígeno del mismo para uso de la reivindicación 1 o 2, en donde el lupus comprende lupus eritematoso sistémico, nefritis lúpica, lupus eritematoso cutáneo, lupus del sistema nervioso central (SNC), lupus eritematoso neonatal, lupus eritematoso sistémico infantil, lupus eritematoso inducido por fármacos o síndromes de deficiencia del complemento que dan lugar a manifestaciones de lupus.

4. El anticuerpo monoclonal anti-CD6 o fragmento de unión a antígeno del mismo para uso de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el anticuerpo monoclonal anti-CD6 está codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4 o secuencias de nucleótidos que tienen al menos un 90 % de identidad con las mismas y que codifican SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2.

5. El anticuerpo monoclonal anti-CD6 o fragmento de unión a antígeno del mismo para uso de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en donde el uso comprende administrar el anticuerpo monoclonal anti-CD6 en una cantidad terapéuticamente eficaz a un sujeto para reducir los síntomas del lupus, en donde la cantidad terapéuticamente eficaz es de 0,01 a 100 mg/kg por peso corporal del sujeto.

6. El anticuerpo monoclonal anti-CD6 o un fragmento de unión a antígeno del mismo para uso de la reivindicación 5, en donde el uso comprende administrar el anticuerpo monoclonal anti-CD6 en combinación con un agente quimioterapéutico, un agente inmunosupresor, un medicamento contra la malaria, un agente citotóxico, un antagonista de integrina, un antagonista de citocinas o una hormona.

7. El anticuerpo monoclonal anti-CD6 o un fragmento de unión a antígeno del mismo para uso de la reivindicación 5, en donde el anticuerpo está comprendido en una composición en donde la composición comprende además un vehículo farmacéuticamente aceptable.

8. El anticuerpo monoclonal anti-CD6 o un fragmento de unión a antígeno del mismo para uso de la reivindicación 7, en donde en la composición el anticuerpo monoclonal anti-CD6 se combina con un agente quimioterapéutico, un agente inmunosupresor, un medicamento contra la malaria, un agente citotóxico, un antagonista de integrina, un antagonista de citocinas o una hormona.

9. El anticuerpo monoclonal anti-CD6 o un fragmento de unión a antígeno del mismo para uso de la reivindicación 8, en donde el inmunosupresor es prednisona, metotrexato, azatioprina o ciclofosfamida.

10. El anticuerpo monoclonal anti-CD6 o fragmento de unión a antígeno del mismo para uso de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el sujeto no tiene una enfermedad autoinmunitaria distinta del lupus.