ES3028090T3 - Methods and compositions for rna-directed target dna modification and for rna-directed modulation of transcription - Google Patents

Methods and compositions for rna-directed target dna modification and for rna-directed modulation of transcription Download PDF

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Emmanuelle Charpentier
Martin Jinek
Cate James Harrison Doudna
Wendell Lim
Lei Qi
Krzysztof Chylinski
Jennifer Doudna
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Universitaet Wien
University of California Berkeley
University of California San Diego UCSD
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Universitaet Wien
University of California Berkeley
University of California San Diego UCSD
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Abstract

La presente divulgación proporciona un ARN dirigido a ADN que comprende una secuencia de diana y, junto con un polipéptido modificador, proporciona una modificación específica del sitio de un ADN diana y/o un polipéptido asociado con el ADN diana. La presente divulgación proporciona además polipéptidos modificadores específicos del sitio. La presente divulgación proporciona además métodos de modificación específica del sitio de un ADN diana y/o un polipéptido asociado con el ADN diana. La presente divulgación proporciona métodos para modular la transcripción de un ácido nucleico diana en una célula diana, que generalmente implican poner en contacto el ácido nucleico diana con un polipéptido Cas9 enzimáticamente inactivo y un ARN dirigido a ADN. También se proporcionan kits y composiciones para llevar a cabo los métodos. La presente divulgación proporciona células modificadas genéticamente que producen Cas9; y organismos multicelulares no humanos transgénicos Cas9. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

b) un segmento de unión a proteínas que interactúa con un polipéptido polipéptido modificador dirigido a un sitio que es una endonucleasa Cas9 de origen natural, en donde el segmento de unión a proteínas comprende dos tramos complementarios de nucleótidos que se hibridan para formar un dúplex de ARN bicatenario (ARNbc),
en donde dicha secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia en dicho ADN diana tiene al menos aproximadamente 15 nucleótidos.
La invención proporciona un polinucleótido de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el ARN de localización específica de ADN, de cualquiera de las formas de realización anteriores.
La invención proporciona un vector de expresión recombinante que comprende el polinucleótido de ADN anterior. La invención proporciona un ARN de localización específica de ADN que comprende:
a) un segmento de localización específica de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria de una secuencia diana en un ADN diana, y
b) un segmento de unión a proteínas que interactúa con un polipéptido Cas9 de origen natural, en donde el segmento de unión a proteínas comprende dos tramos complementarios de nucleótidos que se hibridan para formar un dúplex de ARN bicatenario (ARNbc),
en donde el ARN de localización específica de ADN comprende modificaciones de ácidos nucleicos seleccionadas del grupo que consta de cadenas principales modificadas y enlaces internucleosídicos modificados, miméticos de ácidos nucleicos, restos de azúcar modificados, modificaciones y sustituciones de bases y conjugados.
La invención proporciona un complejo que está formado por
(i) un ARN de localización específica de ADN de molécula única de cualquiera de las formas de realización anteriores o un ARN de localización específica de ADN de cualquiera de las formas de realización anteriores, y (ii) un polipéptido modificador dirigido a un sitio que es una endonucleasa Cas9 de origen natural.
La invención proporciona una composición que comprende:
(i) un ARN de localización específica de ADN de molécula única de cualquiera de las formas de realización anteriores o un ARN de localización específica de ADN de cualquiera de las formas de realización anteriores, y (ii) un polipéptido modificador dirigido a un sitio que es una endonucleasa Cas9 de origen natural.
La presente descripción proporciona un ARN de localización específica de ADN que comprende una secuencia dirigida y que, junto con un polipéptido modificador, proporciona una modificación específica de sitio de un ADN diana y/o un polipéptido asociado al ADN diana. También se proporcionan composiciones.
Las características de la presente descripción incluyen un ARN de localización específica de ADN que comprende: (i) un primer segmento que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia en un ADN diana; y (¡i) un segundo segmento que interactúa con un polipéptido modificador dirigido al sitio. En algunos casos, el primer segmento comprende 8 nucleótidos que tienen el 100 % de complementariedad con una secuencia en el ADN diana. En algunos casos, el segundo segmento comprende una secuencia de nucleótidos con al menos el 60 % de identidad sobre un tramo de al menos 8 nucleótidos contiguos con una cualquiera de las secuencias de nucleótidos expuestas en las Id. de sec. n.° 431-682 (p. ej., 431-562). En algunos casos, el segundo segmento comprende una secuencia de nucleótidos con al menos el 60 % de identidad sobre un tramo de al menos 8 nucleótidos contiguos con una cualquiera de las secuencias de nucleótidos expuestas en las Id. de sec. n.° 563-682. En algunos casos, el polipéptido modificador dirigido al sitio comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 75 % de identidad de secuencia de aminoácidos con los aminoácidos 7-166 o 731-1003 de la secuencia de aminoácidos de Cas9/Csn1 representada en la Figura 3, o con las porciones correspondientes en cualquiera de las secuencias de aminoácidos expuestas como Id. de sec. n.° 1-256 y 795-1346.
Las características de la presente descripción incluyen un polinucleótido de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el ARN de localización específica de ADN. En algunos casos, un vector de expresión recombinante comprende el polinucleótido de ADN. En algunos casos, la secuencia de nucleótidos que codifica el ARN de localización específica de ADN está unida operativamente a un promotor. En algunos casos, el promotor es un promotor inducible. En algunos casos, la secuencia de nucleótidos que codifica el ARN de localización específica de ADN comprende además un sitio de clonación múltiple.
Las características de la presente descripción incluyen un vector de expresión recombinante que comprende: (i) una secuencia de nucleótidos que codifica un ARN de localización específica de ADN, en donde el ARN de localización
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específica de ADN comprende: (a) un primer segmento que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia en un ADN diana; y (b) un segundo segmento que interactúa con un polipéptido modificador dirigido al sitio; y (ii) una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido modificador dirigido al sitio que comprende: (a) una porción de unión a ARN que interactúa con el ARN de localización específica de ADN; y (b) una porción de actividad que presenta actividad enzimática dirigida al sitio, en donde el sitio de actividad enzimática está determinado por el ARN de localización específica de ADN.
Las características de la presente memoria incluyen una composición que comprende: (i) un ARN de localización específica de ADN, comprendiendo el ARN de localización específica de ADN: (a) un primer segmento que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia en un ADN diana; y (b) un segundo segmento que interactúa con un polipéptido modificador dirigido al sitio; y (ii) el polipéptido modificador dirigido a un sitio, comprendiendo el polipéptido modificador dirigido a un sitio: (a) una porción de unión a ARN que interactúa con el ARN de localización específica de ADN; y (b) una porción de actividad que muestra actividad enzimática dirigida a un sitio, en donde el sitio de actividad enzimática está determinado por el ARN de localización específica de ADN y en donde el polipéptido modificador dirigido a un sitio es una endonucleasa Cas9 de origen natural. En algunos casos, el primer segmento del ARN de localización específica de ADN comprende 8 nucleótidos que tienen al menos el 100 % de complementariedad con una secuencia en el ADN diana. En algunos casos, el segundo segmento del ARN de localización específica de ADN comprende una secuencia de nucleótidos con al menos el 60 % de identidad sobre un tramo de al menos 8 nucleótidos contiguos con una cualquiera de las secuencias de nucleótidos expuestas en las Id. de sec. n.°431-682 (p. ej., Id. de sec. n.° 563-682). En algunos casos, el segundo segmento del ARN de localización específica de ADN comprende una secuencia de nucleótidos con al menos el 60 % de identidad sobre un tramo de al menos 8 nucleótidos contiguos con una cualquiera de las secuencias de nucleótidos expuestas en las Id. de sec. n.° 431-562. La actividad enzimática modifica el ADN diana. La actividad enzimática es actividad nucleasa. En algunos casos, el ARN de localización específica de ADN es un ARN de localización específica de ADN de molécula doble y la composición comprende tanto un ARN localizador específico como un ARN activador, cuyos segmentos formadores de dúplex son complementarios y se hibridan para formar el segundo segmento del ARN de localización específica de ADN. En algunos casos, el segmento formador de dúplex del ARN activador comprende una secuencia de nucleótidos con al menos el 60 % de identidad sobre un tramo de al menos 8 nucleótidos contiguos con una cualquiera de las secuencias de nucleótidos expuestas en las Id. de sec. n.° 431-682.
Breve descripción de los dibujos
LasFiguras 1A-Bproporcionan un dibujo esquemático de dos ARN de localización específica de ADN en cuestión ilustrativos, cada uno asociado a un polipéptido modificador dirigido al sitio y con un ADN diana.
LaFigura 2representa la edición de ADN diana a través de roturas de ADN bicatenario introducidas usando un polipéptido modificador dirigido al sitio Cas9/Csn1 y un ARN de localización específica de ADN.
LasFiguras 3A-Brepresentan la secuencia de aminoácidos de una proteína Cas9/Csn1 deStreptococcus pyogenes(Id. de sec. n.° 8). Cas9 tiene dominios homólogos a ambas endonucleasas HNH y RuvC.(A)Los Motivos 1-4 tienen una línea superior(B)Los Dominios 1 y 2 tienen una línea superior.
LasFiguras 4A-Brepresentan el porcentaje de identidad entre las proteínas Cas9/Csn1 de múltiples especies. (A) Identidad de secuencia con respecto aStreptococcus pyogenes.Por ejemplo, el Dominio 1 es los aminoácidos 7-166 y el Dominio 2 es los aminoácidos 731-1003 de Cas9/Csn1 deStreptococcus pyogenescomo se representa en la Figura 3B. (B) Identidad de secuencia con respecto aNeisseria meningitidis.Por ejemplo, el Dominio 1 es los aminoácidos 13-139 y el Dominio 2 es los aminoácidos 475-750 de Cas9/Csn1 deNeisseria meningitidis(Id. de sec. n.° 79).
LaFigura 5representa una alineación de secuencia múltiple de motivos 1-4 de proteínas Cas9/Csn1 de diversas especies diversas seleccionadas de la tabla filogenética de la Figura 32 (véanse la Figura 32, la Figura 3A y la Tabla 1) (Streptococcus pyogenes (Id. de sec. n.°8), Legionella pneumophila (Id. de sec. n.° 17),Gamma proteobacterium (Id. de sec. n.° 107), Listeria innocua (Id. de sec. n.° 3), Lactobacillus gasseri (Id. de sec. n.° 152), Eubacterium rectale (Id. de sec. n.° 99), Staphytococcus lugdunensis (Id. de sec. n.° 185), Mycoplasma synoviae(Id. de sec. n.°22), Mycoplasma mobile (Id. de sec. n.° 16), Wolinella succinogenes (Id. de sec. n.° 10), Ftavobacterium columnare (Id. de sec. n.° 235),Fibrobacter succinogenes(Id. de sec. n.° 121),Bacteroides fragilis(Id. de sec. n.° 21),Acidothermus cellulolyticus(Id. de sec. n.° 42) yBifidobacterium dentium(Id. de sec. n.° 131).
LasFiguras 6A-Bproporcionan alineaciones de secuencias de ARNcrtra de origen natural (“ARN activador” ) de diversas especies (L.innocua(Id. de sec. n.° 268); S.pyogenes(Id. de sec. n.° 267); S.mutans(Id. de sec. n.° 269); S.thermophilusl(Id. de sec. n.° 270);M. mobile(Id. de sec. n.° 274);N. meningitides(Id. de sec. n.° 272);P. multocida(Id. de sec. n.° 273); S.thermophilus2(Id. de sec. n.° 271); y S.pyogenes(Id. de sec. n.° 267). (A) alineación de secuencia múltiple de ortólogos de ARNcrtra seleccionados (AlignX, paquete de VectorNTI, Invitrogen) asociados a loci de CRISPR/Cas de arquitectura similar y secuencias de Cas9/Csn1 muy similares. Las cajas de color negro representan nucleótidos compartidos(B)alineación de secuencia múltiple de ortólogos de ARNcrtra seleccionados
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(AlignX, paquete de VectorNTI, Invitrogen) asociado a loci de CRISPR/Cas de arquitectura diferente y secuencias de Cas9/Csn1 no relacionadas estrechamente. Nótese la similitud de secuencia de los ortólogos de ARNcrtra deN. meningitidisyP. multocida.Las cajas de color negro representan nucleótidos compartidos. Para consultar más secuencias de ARN-activador ilustrativas, véanse las Id. de sec. n.° 431-562.
LasFiguras 7A-Bproporcionan alineaciones de segmentos formadores de dúplex de origen natural de secuencias de ARNcr (“ARN localizador específico” ) de diversas especies (L.innocua(Id. de sec. n.° //); S.pyogenes(Id. de sec. n.° //); S.mutans(Id. de sec. n.° //); S.thermophilusl(Id. de sec. n.° //);C. jejuni(Id. de sec. n.° //); S.pyogenes(Id. de sec. n.° //);F. novicida(Id. de sec. n.° //);M. mobile(Id. de sec. n.° //);N. meningitides(Id. de sec. n.° //);P. multocida(Id. de sec. n.° //); y S.thermophilus2(ld.de sec. n.° //). (A) múltiples alineaciones de secuencia del segmento formador de dúplex ejemplar de secuencias de ARN localizador específico (AlignX, paquete de VectorNTI, Invitrogen) asociadas a los loci de arquitectura similar y secuencias de Cas9/Csn1 muy similares.(A)múltiples alineaciones de secuencia del segmento formador de dúplex ilustrativo de secuencias de ARN localizador específico (AlignX, paquete de VectorNTI, Invitrogen) asociados a los loci de arquitectura diferente y secuencias de Cas9 diversas. Las cajas de color negro representan nucleótidos compartidos. Para consultar más secuencias de ARN localizador específico de segmentos formadores de dúplex ilustrativas, véanse las Id. de sec. n.° 563-679.
LaFigura 8proporciona un esquema de hibridación para segmentos formadores de dúplex de origen natural del ARNcr (“ARN localizados específico” ) con el segmento formador de dúplex del ortólogo de ARNcrtra correspondiente (“ARN activador” ). Secuencia superior, ARN localizador específico; secuencia inferior, segmento formador de dúplex del ARN activador correspondiente. Los loci de CRISPR pertenecen al sistema CRISPR/Cas de Tipo II (Nmeni/CASS4). La Nomenclatura es según la base de datos de CRISPR (CRISPR DB). S.pyogenes(Id. de sec. n.° // y //); S.mutans(Id. de sec. n.° // y //); S.thermophilusl(Id. de sec. n.° // y //); S.thermophilus2(Id. de sec. n.° // y //);L. innocua(Id. de sec. n.° // y //);T. denticola(Id. de sec. n.° // y //);N. meningitides(Id. de sec. n.° // y //); S.gordonii(Id. de sec. n.° // y //);B. bifidum(Id. de sec. n.° // y //);L. salivarius(Id. de sec. n.° // y //);F. tularensis(Id. de sec. n.° // y //); yL. pneumophila(Id. de sec. n.° // yII).Nótese que algunas especies contienen cada uno de los dos loci de CRISPR de Tipo II. Para consultar más secuencias de ARN-activador ilustrativas, véanse las Id. de sec. n.° 431-562. Para consultar más secuencias de ARN localizador específico de segmentos formadores de dúplex ilustrativas, véanse las Id. de sec. n.° 563-679.
LaFigura 9representa secuencias de ARNcrtra (ARN activador) y ARNcr (ARN localizador específico) de ejemplo de dos especies. Existe un grado de intercambiabilidad; por ejemplo, la proteína Cas9/Csn1 de S.pyogeneses funcional con ARNcrtra y ARNcr derivados deL. innocua.(|) indica un par de bases de Watson-Crick canónicas mientras (•) indica un par de bases con oscilación de G-U. “ 20nt variables” o “20nt” representa el segmento de localización específica de ADN que es complementario a un ADN diana (esta región puede tener hasta aproximadamente 100nt de longitud). También se muestra el diseño de ARN de localización específica de ADN de molécula única que incorpora características del ARN localizador específico y el ARN activador. (Las secuencias de la proteína Cas9/Csn1 de una amplia diversidad de especies se representan en la Figura 3 y se exponen como Id. de sec. n.° 1-256 y 795 1346)Streptococcus pyogenes:de arriba a abajo: (Id. de sec. n.° //, //, //);Listeria innocua:de arriba a abajo: (Id. de sec. n.° //, //, //). Las secuencias proporcionadas son ejemplos no limitativos y tienen por objeto ilustrar cómo los ARN de localización específica de ADN de molécula única y ARN de localización específica de ADN de dos moléculas pueden diseñarse basándose en secuencias existentes de forma natural de una amplia diversidad de especies. Se exponen diversos ejemplos de secuencias adecuadas de una amplia diversidad de especies se exponen de la siguiente manera (proteína Cas9: Id. de sec. n.° 1-259; ARNcrtra: Id. de sec. n.° 431-562, o los complementos de las mismas; ARNcr: Id. de sec. n.° 563-679 o los complementos de las mismas; y ARN de localización específica de ADN de molécula única de ejemplo: Id. de sec. n.° 680-682).
LasFiguras 10A-Emuestran que Cas9 es una endonucleasa de ADN guiada por dos moléculas de ARN. Figura E (de arriba a abajo, Id. de sec. n.° 278-280 yII).
LasFiguras 11A-Bdemuestran que Cas9 usa dos dominios nucleasa para escindir las dos cadenas en el ADN diana.
LasFiguras 12A-Eilustran que la escisión catalizada por Cas9 de ADN diana requiere un dominio de activación en el ARNcrtra y se rige por una secuencia semilla en el ARNcr. Figura 12C (de arriba a abajo, Id. de sec. n.° 278-280 y //); Figura 12D (de arriba a abajo, Id. de sec. n.° 281-290); y la Figura 12E (de arriba a abajo, Id. de sec. n.° 291-292, 283, 293-298).
LasFiguras 13A-Cmuestran que se requiere un PAM para la escisión de la escisión de ADN diana por el complejo Cas9-ARNcrtra:ARNcr.
LasFiguras 14A-Cilustran que Cas9 puede programarse usando una única molécula de ARN modificada por ingeniería genética que combina las características de ARNcrtra y ARNcr. Quimera A (Id. de sec. n.° 299); Quimera B (Id. de sec. n.° 300).
LaFigura 15representa la vía inmunitaria de CRISPR/Cas mediada por ARN de tipo II.
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LasFiguras 16A-Brepresentan la purificación de nucleasas de Cas9.
LasFiguras 17A-Cmuestran que Cas9 guiada por ARNcrtra:ARNcr dual escinde el plásmido protoespaciador y el ADN de oligonucleótido. La Figura 17B (de arriba a abajo, Id. de sec. n.° 301-303 y //); y la Figura 17C (de arriba a abajo, Id. de sec. n.° 304-306 y //).
LasFiguras 18A-Bmuestran que Cas9 es una endonucleasa dependiente de Mg2+ con actividad de exonucleasa 3'-5'.
LasFiguras 19A-Cilustran que la escisión por Cas9 dirigida por ARNcrtra:ARNcr dual del ADN diana es específica de sitio. La Figura 19C (de arriba a abajo, Id. de sec. n.° 307-309, //, 337-339y II).
LasFiguras 20A-Bmuestran que la escisión por Cas9 dirigida por ARNcrtra:ARNcr dual del ADN diana es rápida y eficiente.
LasFiguras 21A-Bmuestran que los dominios similares a FINH y RuvC de la escisión directa por Cas9 de la cadena de ADN complementaria y no complementaria, respectivamente.
LaFigura 22demuestra que el ARNcrtra es necesario para el reconocimiento del ADN diana.
LasFiguras 23A-Bmuestran que una región mínima del ARNcrtra es capaz de guiar la escisión dirigida por ARNcrtra:ARNcr dual del ADN diana.
LasFiguras 24A-Ddemuestran que la escisión de ADN diana guiada por ARNcrtra:ARNcr dual por Cas9 puede ser específica de especie.
LasFiguras 25A-Cmuestran que una secuencia semilla en el ARNcr gobierna la escisión dirigida por ARNcrtra:ARNcr dual de ADN diana por Cas9. Figura 25A: sonda 1 de ADN diana (Id. de sec. n.° 310); ARNcr del espaciador 4 (1-42) (Id. de sec. n.° 311); ARNcrtra (15-89) (Id. de sec. n° II).Figura 25B panel izquierdo (Id. de sec. n.° 310).
LasFiguras 26A-Cdemuestran que la secuencia de PAM es esencial para la escisión de ADN plasmídico protoespaciador mediante Cas9-ARNcrtra:ARNcr y para la interferencia de ADN plasmídico mediada por Cas9 en células bacterianas. Figura 26B (de arriba a abajo, Id. de sec. n.° 312-314); y Figura 26C (de arriba a abajo, Id. de sec. n.° 315-320).
LasFiguras 27A-Cmuestran que Cas9 guiada por un único ARN quimérico que imita ARNrARNc:ARNcr dual escinde el ADN protoespaciador. Figura 27C (de arriba a abajo, Id. de sec. n.° 321-324).
LasFiguras 28A-Drepresentan el diseñode novode ARN quiméricos que localizan específicamente la secuencia génica de la Proteína fluorescente verde (GFP). Figura 28B (de arriba a abajo, Id. de sec. n.° 325-326). Figura 28C: Secuencia diana de GFP1 (Id. de sec. n.° 327); Secuencia diana de GFP2 (Id. de sec. n.° 328); Secuencia diana de GFP3 (Id. de sec. n.° 329); Secuencia diana de GFP4 (Id. de sec. n.° 330); Secuencia diana de GFP5 (Id. de sec. n.° 331); ARN quimérico de GFP1 (Id. de sec. n.° 332); ARN quimérico de GFP2 (Id. de sec. n.° 333); ARN quimérico de GFP3 (Id. de sec. n.° 334); ARN quimérico de GFP4 (Id. de sec. n.° 335); ARN quimérico de GFP5 (Id. de sec. n.° 336).
LasFiguras 29A-Edemuestran que la coexpresión de Cas9 y ARN guía en células humanas genera roturas de ADN bicatenario en el locus diana. Figura 29C (de arriba a abajo, Id. de sec. n.° 425-428).
LasFiguras 30A-Bdemuestran que los lisados celulares contienen Cas9:ARNgu activo y respaldan la escisión de ADN específica de sitio.
LasFiguras 31A-Bdemuestran que la extensión 3' de los constructos de ARNgu potencia la mutagénesis mediada por NHEJ específica de sitio. Figura 31A (de arriba a abajo, Id. de sec. n.° 428-430).
LasFiguras 32A-Brepresentan un árbol filogenético de secuencias de Cas9 representativas de diversos organismos (A), así como arquitecturas de locus de Cas9 para los grupos principales del árbol (B).
LasFiguras 33A-Erepresentan la arquitectura de CRISPR-Cas de tipo II a partir de especies bacterianas seleccionadas.
LasFiguras 34A-Brepresentan el coprocesamiento de ARNcrtra y pre-ARNcr en sistemas de CRISPR Cas de tipo II seleccionados. Figura 34A (de arriba a abajo, Id. de sec. n.°//,//,//,//,//,//,//,//); Figura 34B (de arriba a abajo, Id. de sec. n.°II,II,II,II).
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LaFigura 35representa una alineación de secuencia de ortólogos de ARNcrtra que demuestran la diversidad de secuencias de ARNcrtra.
LasFiguras 36A-Frepresentan la expresión de ortólogos de ARNcrtra bacteriano y ARNcr revelados por secuenciación de ARN profundo.
LasFiguras 37A-0enumeran todos los ortólogos de ARNcrtra y ARNcr maduros recuperados por secuenciación para las especies bacterianas estudiadas, incluyendo las coordenadas (región de interés) y las secuencias de ADNc (5' a 3') correspondientes.
LasFiguras 38 A-Bpresentan una tabla de especies bacterianas que contienen loci de CRISPR-Cas de tipo II caracterizados por la presencia del gen distintivocas9.Estas secuencias se usaron para análisis filogenéticos.
LasFiguras 39A-Bdemuestran que las secuencias artificiales que comparten aproximadamente el 50 % de identidad con ARNcrtra y ARNcr de origen natural pueden actuar con Cas9 para escindir el ADN diana siempre que la estructura del dominio de unión a proteínas del ARN de localización específica de ADN esté conservada.
Definiciones - Parte I
Las expresiones “ polinucleótido” y “ ácido nucleico” utilizados indistintamente en la presente memoria, se refieren a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, ya sea ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos. Por lo tanto, estas expresiones incluyen, pero no se limitan a, ADN o ARN monocatenario, bicatenario o multicatenario, ADN genómico, ADNc, híbridos de ADN-ARN o un polímero que comprende bases de purina y pirimidina u otras bases de nucleótidos naturales, modificadas químicas o bioquímicamente, no naturales o derivatizadas. “ Oligonucleótido” generalmente se refiere a polinucleótidos de entre aproximadamente 5 y aproximadamente 100 nucleótidos de ADN monocatenario o bicatenario. Sin embargo, para los fines de esta descripción, no hay límite superior para la longitud de un oligonucleótido. Los oligonucleótidos también se conocen como “oligómeros” u “ oligos” y pueden aislarse de genes o pueden sintetizarse químicamente mediante métodos conocidos en la técnica. Debe entenderse que las expresiones “ polinucleótido” y “ácido nucleico” incluyen, según corresponda a las realizaciones que se describen, polinucleótidos monocatenarios (tales como sentido o antisentido) y bicatenarios.
Una “ estructura de tallo-bucle" se refiere a un ácido nucleico que tiene una estructura secundaria que incluye una región de nucleótidos que se sabe o se predice que forma una cadena doble (porción de tallo) que se une por un lado por una región de nucleótidos predominantemente monocatenarios (porción de bucle). Las expresiones estructuras de “ horquilla” y “ plegada hacia atrás” también se usan en la presente memoria para referirse a estructuras de tallobucle. Dichas estructuras son bien conocidas en la técnica y estas expresiones se usan de manera coherente con sus significados conocidos en la técnica. Como se sabe en la técnica, una estructura de tallo-bucle no requiere emparejamiento de bases exacto. Por lo tanto, el tallo puede incluir uno o más emparejamientos erróneos de bases. Alternativamente, el emparejamiento de bases puede ser exacto, es decir, no incluir ningún emparejamiento erróneo.
Por “ hibridable” o “ complementario” o “ sustancialmente complementario” se entiende que un ácido nucleico (p. ej., ARN) comprende una secuencia de nucleótidos que le permite unirse no covalentemente, es decir, formar pares de bases de Watson-Crick y/o pares de bases G/U, “ hibridar” o “ hibridarse” con otro ácido nucleico de una manera específica de secuencia y antiparalela (es decir, un ácido nucleico se une específicamente a un ácido nucleico complementario) en las condiciones adecuadasin vitroy/oin vivode temperatura y fuerza iónica de solución. Como se sabe en la técnica, el emparejamiento de bases de Watson-Crick estándar incluye: el emparejamiento de adenina (A) con timidina (T), el emparejamiento de adenina (A) con uracilo (U) y el emparejamiento de guanina (G) con citosina (C) [ADN, ARN]. Además, también se sabe en la técnica que para la hibridación entre dos moléculas de ARN (p. ej., ARNbc), la base guanina (G) se empareja con uracilo (U). Por ejemplo, el emparejamiento de bases G/U es parcialmente responsable de la degeneración (es decir, redundancia) del código genético en el contexto del emparejamiento de bases anti-codón de ARNt con codones en ARNm. En el contexto de esta descripción, una guanina (G) de un segmento de unión a proteínas (dúplex de ARNbc) de una molécula de ARN de localización específica de ADN en cuestión se considera complementaria a un uracilo (U) y viceversa. Como tal, cuando puede hacerse un par de bases G/U en una posición de nucleótidos dada, un segmento de unión a proteínas (dúplex de ARNbc) de una molécula de ARN de localización específica de ADN en cuestión, la posición no se considera no complementaria, sino que en cambio se considera complementaria.
Las condiciones de hibridación y lavado son bien conocidas y se ilustran en Sambrook, J., Fritsch, E. F. y Maniatis, T.Molecular Cloning: A Laboratory Manual,Segunda Edición, Coid Spring Harbor Laboratory Press, Coid Spring Harbor (1989), particularmente el Capítulo 11 y la Tabla 11.1 en el mismo; y Sambrook, J. y Russell, W.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual,Tercera Edición, Coid Spring Harbor Laboratory Press, Coid Spring Harbor (2001). Las condiciones de temperatura y fuerza iónica determinan la “ rigurosidad” de la hibridación.
La hibridación requiere que los dos ácidos nucleicos contengan secuencias complementarias, aunque son posibles emparejamientos erróneos entre bases. Las condiciones adecuadas para la hibridación entre dos ácidos nucleicos dependen de la longitud de los ácidos nucleicos y del grado de complementación, variables bien conocidas en la
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técnica. Cuanto mayor es el grado de complementación entre dos secuencias de nucleótidos, mayor es el valor de la temperatura de fusión (Tf) para híbridos de ácidos nucleicos que tienen esas secuencias. Para hibridaciones entre ácidos nucleicos con tramos cortos de complementariedad (p. ej., complementariedad en más de 35 o menos, 30 o menos, 25 o menos, 22 o menos, 20 o menos, o 18 o menos nucleótidos) la posición de los emparejamientos erróneos se vuelve importante (véase Sambrook y col., citado anteriormente, 11.7-11.8). Típicamente, la longitud para un ácido nucleico hibridable es de al menos aproximadamente 10 nucleótidos. Las longitudes mínimas ilustrativas para un ácido nucleico hibridable son: al menos aproximadamente 15 nucleótidos; al menos aproximadamente 20 nucleótidos; al menos aproximadamente 22 nucleótidos; al menos aproximadamente 25 nucleótidos; y al menos aproximadamente 30 nucleótidos). Además, el experto en la técnica reconocerá que la temperatura y la concentración de sal de la solución de lavado pueden ajustarse según sea necesario según factores tales como la longitud de la región de complementación y el grado de complementación.
Se entiende en la técnica que no es necesario que la secuencia del polinucleótido sea complementaria al 100 % con la de su ácido nucleico diana para que sea específicamente hibridable o hibridable. Además, un polinucleótido puede hibridarse sobre uno o más segmentos de tal modo que los segmentos intermedios o adyacentes no estén implicados en el evento de hibridación (p. ej., una estructura de bucle o estructura de horquilla). Un polinucleótido puede comprender al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 99 % o el 100 % de complementariedad de secuencia con una región diana dentro de la secuencia de ácido nucleico diana que localiza específicamente. Por ejemplo, un ácido nucleico antisentido en el que 18 de 20 nucleótidos del compuesto antisentido son complementarios a una región diana y, por lo tanto, se hibridaría específicamente, representaría un 90 por ciento de complementariedad. En este ejemplo, los nucleótidos no complementarios restantes pueden agruparse o intercalarse con nucleótidos complementarios y no necesitan ser contiguos entre sí o a nucleótidos complementarios. El porcentaje de complementariedad entre tramos particulares de secuencias de ácido nucleico dentro de ácidos nucleicos puede determinarse rutinariamente usando programas BLAST (herramientas básicas de búsqueda de alineación local) y programas PowerBLAST conocidos en la técnica (Altschul y col.,J. Mol. Biol.,1990, 215, 403 410; Zhang y Madden,Genome Res.,1997, 7, 649-656) o usando el programa Gap (Wisconsin Sequence Analysis Package, Versión 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wl), usando las configuraciones predeterminadas, que usa el algoritmo de Smith y Waterman(Adv. Appl. Math.,1981,2, 482-489).
Los términos “ péptido” , “ polipéptido” y “ proteína” se usan indistintamente en la presente memoria, y se refieren a una forma polimérica de aminoácidos de cualquier longitud, que puede incluir aminoácidos codificados y no codificados, aminoácidos químicamente o bioquímicamente modificados y polipéptidos que tienen cadenas principales peptídicas modificadas.
“ Unión” como se usa en la presente memoria (p. ej., con referencia a un dominio de unión a ARN de un polipéptido) se refiere a una interacción no covalente entre macromoléculas (p. ej., entre una proteína y un ácido nucleico). Mientras están en un estado de interacción no covalente, se dice que las macromoléculas están “asociadas” o “que interactúan” o “que se unen” (p. ej., cuando se dice que una molécula X interactúa con una molécula Y, se entiende que la molécula X se une a la molécula Y de manera no covalente). No es necesario que todos los componentes de una interacción de unión sean específicos de secuencia (p. ej., contactos con residuos de fosfato en una cadena principal de ADN), pero algunas porciones de una interacción de unión pueden ser específicas de secuencia. Las interacciones de unión se caracterizan generalmente por una constante de disociación (Kd) inferior a 10'6 M, inferior a 10'7 M, inferior a 10' 8 M, inferiora 10'9 M, inferiora 10'1° M, inferiora 10'11 M, inferiora 10'12 M, inferiora 10'13 M, inferiora 10'14 M o inferior a 10-15. “Afinidad” se refiere a la fuerza de unión, correlacionándose la afinidad de unión aumentada con una Kd más baja.
Por “ dominio de unión” se entiende un dominio de proteína que es capaz de unirse de forma no covalente a otra molécula. Un dominio de unión puede unirse, por ejemplo, a una molécula de ADN (una proteína de unión a ADN), una molécula de ARN (una proteína de unión a ARN) y/o una molécula de proteína (una proteína de unión a proteínas). En el caso de una proteína de unión a dominio de proteína, puede unirse a sí misma (para formar homodímeros, homotrímeros, etc.) y/o puede unirse a una o más moléculas de una proteína o proteínas diferentes.
La expresión “sustitución conservadora de aminoácidos” se refiere a la intercambiabilidad en proteínas de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares. Por ejemplo, un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticas consiste en glicina, alanina, valina, leucina y isoleucina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales de hidroxilo alifático consiste en serina y treonina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen amida consiste en asparagina y glutamina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales aromáticas consiste en fenilalanina, tirosina y triptófano; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales básicas consiste en lisina, arginina e histidina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales ácidas consiste en glutamato y aspartato; y un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen azufre consiste en cisterna y metionina. Son grupos de sustitución conservadora de aminoácidos ilustrativos: valina-leucinaisoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina y asparagina-glutamina.
Un polinucleótido o polipéptido tiene un determinado porcentaje de “ identidad de secuencia” con otro polinucleótido o polipéptido, lo que significa que, cuando se alinean, ese porcentaje de bases o aminoácidos son iguales, y están en la misma posición relativa, cuando se comparan las dos secuencias. La identidad de secuencia puede determinarse
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de varias maneras diferentes. Para determinar la identidad de secuencia, las secuencias pueden alinearse usando diversos métodos y programas informáticos (p. e jB LA S T , T-COFFEE, MUSCLE, MAFFT, etc.), disponibles en la web mundial en sitios que incluyen ncbi.nlm.nili.gov/BLAST, ebi.ac.uk/Tools/msa/tcoffee/, ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/, mafft.cbrc.jp/alignment/software/. Véase, p. ej., Altschul y col. (1990),J. Mol. Biol.215:403-10.
Una secuencia de ADN que “ codifica” un ARN particular es una secuencia de ácido nucleico de ADN que se transcribe en ARN. Un polinucleótido de ADN puede codificar un ARN (ARNm) que se traduce en proteína, o un polinucleótido de ADN puede codificar un ARN que no se traduce en proteína (p. ej., ARNt, ARNr o un ARN de localización específica de ADN; también llamado ARN “ no codificante” o “ARNnc” ).
Una “ secuencia codificante de proteína” o una secuencia que codifica una proteína o polipéptido particular, es una secuencia de ácido nucleico que se transcribe en ARNm (en el caso del ADN) y se traduce (en el caso de ARNm) en un kpolipéptidoin vitrooin vivocuando se pone bajo el control de secuencias reguladoras adecuadas. Los límites de la secuencia codificante están determinados por un codón de inicio en el extremo 5' (N-terminal) y un codón sin sentido de terminación de la traducción en el extremo 3' (C-terminal). Una secuencia codificante puede incluir, pero no se limita a, ADNc a partir de ARNm procariota o eucariota, secuencias de ADN genómico a partir de ADN procariota o eucariota y ácidos nucleicos sintéticos. Una secuencia de terminación de la transcripción usualmente se ubicará en 3' con respecto a la secuencia codificante.
Como se usa en la presente memoria, una “ secuencia promotora” es una región reguladora de ADN capaz de unirse a la ARN polimerasa e iniciar la transcripción de una secuencia codificante o no codificante corriente abajo (en dirección 3'). Para los fines de definir la presente invención, la secuencia promotora está limitada en su extremo 3' por el sitio de inicio de la transcripción y se extiende corriente arriba (dirección 5') para incluir el número mínimo de bases o elementos necesarios para iniciar la transcripción a niveles detectables por encima del fondo. Dentro de la secuencia promotora se encontrará un sitio de inicio de la transcripción, así como también dominios de unión a proteínas responsables de la unión de la ARN polimerasa. Los promotores eucariotas frecuentemente, pero no siempre, contienen cajas “TATA” y cajas “ CAT” . Pueden usarse diversos promotores, incluyendo promotores inducibles, para impulsar los diversos vectores de la presente invención.
Un promotor puede ser un promotor activo constitutivamente (es decir, un promotor que está constitutivamente en un estado activo/” Encendido” ), puede ser un promotor inducible (es decir, un promotor cuyo estado, activo/” Encendido” o inactivo/”Apagado” , es controlado por un estímulo externo, p. ej., la presencia de una temperatura particular, compuesto o proteína), puede ser un promotor restringido espacialmente (es decir, un elemento de control de la transcripción, un potenciador, etc.) (p. ej., un promotor específico de tejido, un promotor específico de tipo celular, etc.) y puede ser un promotor restringido temporalmente (es decir, el promotor está en el estado “ Encendido” o en el estado “Apagado” durante las etapas específicas del desarrollo embrionario o durante las etapas específicas de un proceso biológico, p. ej., el ciclo del folículo piloso en ratones).
Los promotores adecuados pueden derivar de virus y, por lo tanto, pueden denominarse promotores víricos, o pueden derivar de cualquier organismo, incluyendo organismos procariotas o eucariotas. Pueden usarse promotores adecuados para impulsar la expresión por cualquier ARN polimerasa (p. ej., pol I, pol II, pol III). Los promotores ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, el promotor temprano de SV40, promotor de repetición terminal larga (LTR) de virus de tumor mamario de ratón; promotor tardío principal de adenovirus (Ad MLP); un promotor del virus del herpes simple (VHS), un promotor de citomegalovirus (CMV) tal como la región promotora temprana inmediata de CMV (CMVIE), un promotor del virus del sarcoma de Rous (RSV), un promotor nuclear pequeño U6 humano (U6) (Miyagishie ta l. , Nature Biotechnology 20,497 - 500 (2002)), un promotor U6 mejorado (p. ej., Xiaetal.,Nucleic Acids Res. 1 de septiembre de 2003;31 (17)), un promotor H1 humano (H1) y similares.
Los ejemplos de promotores inducibles incluyen, pero no se limitan a, el promotor de ARN polimerasa T7, el promotor de ARN polimerasa T3, el promotor regulado por Isopropil-beta-D-tiogalactopiranósido (IPTG), el promotor inducido por lactosa, el promotor de choque térmico, el promotor regulado por tetraciclina, el promotor regulado por esteroides, el promotor regulado por metales, el promotor regulado por receptor de estrógeno, etc. Los promotores inducibles pueden regularse, por lo tanto, por moléculas que incluyen, pero no se limitan a, doxiciclina; ARN polimerasa, p. ej., ARN polimerasa T7; un receptor de estrógeno; una fusión del receptor de estrógeno; etc.
En algunas realizaciones, el promotor es un promotor restringido espacialmente (es decir, promotor específico de tipo celular, promotor específico de tejido, etc.) de tal modo que en un organismo multicelular, el promotor está activo (es decir, “ Encendido” ) en un subconjunto de células específicas. Los promotores restringidos espacialmente también se pueden denominar potenciadores, elementos de control de la transcripción, secuencias de control, etc. Puede usarse cualquier promotor restringido espacialmente conveniente y la elección del promotor adecuado (p. ej., un promotor específico del cerebro, un promotor que impulsa la expresión en un subconjunto de neuronas, un promotor que impulsa la expresión en un subconjunto de neuronas, un promotor que impulsa la expresión en la línea germinal, un promotor que impulsa la expresión en los pulmones, un promotor que impulsa la expresión en los músculos, un promotor que impulsa la expresión en células de los islotes del páncreas, etc.) dependerá del organismo. Por ejemplo, se conocen diversos promotores restringidos espacialmente para plantas, moscas, gusanos, mamíferos, ratones, etc. Por lo tanto, un promotor restringido espacialmente puede usarse para regular la expresión de un ácido nucleico que codifica un
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polipéptido modificador dirigido al sitio en cuestión en una amplia diversidad de tejidos y tipos celulares diferentes, dependiendo del organismo. Algunos promotores restringidos espacialmente también están restringidos temporalmente de tal modo que el promotor está en el estado “ Encendido” o el estado “Apagado” durante las etapas específicas del desarrollo embrionario o durante las etapas específicas de un proceso biológico (p. ej., ciclo del folículo piloso en ratones).
Con fines ilustrativos, los ejemplos de promotores restringidos espacialmente incluyen, pero no se limitan a, promotores específicos de neuronas, promotores específicos de adipocitos, promotores específicos de cardiomiocitos, promotores específicos de músculo liso, promotores específicos de fotorreceptores, etc. Los promotores restringidos espacialmente específicos de neuronas incluyen, pero no se limitan a, un promotor de enolasa (NSE) específico de neuronas (véase, p. ej., EMBL HSEN02, X51956); un promotor de aminoácido aromático descarboxilasa (AADC); un promotor de neurofilamentos (véase, p. ej., GenBank HUMNFL, L04147); un promotor de sinapsina (véase, p. ej., GenBank HUMSYNIB, M55301); un promotor de thy-1 (véase, p. ej., Chen y col. (1987)Cell51:7 -19; y Llewlyn y col. (2010)Nat. Med.16(10):1161-1166); un promotor del receptor de serotonina (véase, p. ej., GenBank S62283); un promotor de tirosina hidroxilasa (TH) (véase, p. ej., Oh y col. (2009)Gene Ther16:437; Sasaoka y col. (1992)Mol. Brain Res.16:274; Boundy y col. (1998)J. Neurosci.18:9989; y Kaneda y col. (1991)Neuron6:583-594); un promotor de GnRH (véase, p. ej., Radovik y col. (1991)Proc. Nati. Acad. Sci. USA88:3402-3406); un promotor de L7 (véase, p. ej., Oberdick y col. (1990)Science248:223-226); un promotor de DNMT (véase, p. ej., Bartge y col. (1988)Proc. Nati. Acad. Sci. USA85:3648-3652); un promotor de encefalina (véase, p. ej., Cob y col. (1988)EMBO J.17:3793-3805); un promotor de proteína básica de mielina (MBP); un promotor de proteína quinasa Il-alfa dependiente de Ca2+-calmodulina (CamKlla) (véase, p. ej., Mayford y col. (1996)Proc. Nati. Acad. Sci. USA93:13250; y Casanova y col. (2001)Génesis31:37); un potenciador de CMV/promotor de factor de crecimiento-P derivado de plaquetas (véase, p. ej., Liu y col. (2004)Gene Therapy11:52-60); y similares.
Los promotores restringidos espacialmente específicos de adipocitos incluyen, pero no se limitan a, promotor/potenciador del gen aP2, p. ej., una región de -5,4 kb a 21 pb de un gen aP2 humano (véase, p. ej., Tozzo y col. (1997)Endocrinol.138:1604; Ross y col. (1990)Proc. Nati. Acad. Sci. USA87:9590; y Pavjani y col. (2005)Nat. Med.11:797); un promotor del transportador de glucosa-4 (GLUS4) (véase, p. ej., Knight y col. (2003)Proc. Nati. Acad. Sci. USA100:14725); un promotor de translocasa de ácido graso (FAT/CD36) (véase, p. ej., Kuriki y col. (2002)Biol. Pharm. Bull.25:1476; y Sato y col. (2002)J. Biol. Chem.277:15703); un promotor de estearoil-CoA desaturasa-1 (SCD1) (Tabor y col. (1999)J. Biol. Chem.274:20603); un promotor de leptina (véase, p. ej., Masón y col. (1998)Endocrinol.139:1013; y Chen y col. (1999)Biochem. Biophys. Res. Comm.262:187); un promotor de adiponectina (véase, p. ej., Kita y col. (2005)Biochem. Biophys. Res. Comm.331:484; y Chakrabarti (2010)Endocrinol.151:2408); un promotor de adipisina (véase, p. ej., Platt y col. (1989)Proc. Nati. Acad. Sci. USA86:7490); un promotor de resistina (véase, p. ej., Seo y col. (2003)Moiec. Endocrinol.17:1522); y similares.
Los promotores restringidos espacialmente específicos de cardiomiocitos incluyen, pero no se limitan a, secuencias de control derivadas de los siguientes genes: cadena ligera de miosina 2, cadena pesada de a-miosina, AE3, troponina C cardíaca, actina cardíaca y similares. Franz y col. (1997)Cardiovasc. Res.35:560-566; Robbins y col. (1995)Ann. N.Y. Acad. Sci.752:492-505; Linn y col. (1995)Circ. Res.76:584-591; Pemaek y col. (1994)Mol. Cell. Biol.14:1870-1885; Hunter y col. (1993)Hypertension22:608-617; y Sartorelli y col. (1992)Proc. Nati. Acad. Sci. USA89:4047-4051.
Los promotores restringidos espacialmente específicos del músculo liso incluyen, pero no se limitan a, un promotor de SM22a (véase, p. ej., Akyürek y col. (2000)Mol. Med.6:983; y la patente US-7.169.874); un promotor de smoothelina (véase, p. ej., el documento WO 2001/018048); un promotor de actina de músculo liso a; y similares. Por ejemplo, se ha demostrado que una región de 0,4 kb del promotor de SM22a, dentro del cual se encuentran dos elementos CArG, media en la expresión específica de células de músculo liso vascular (véase, p. ej., Kim, y col. (1997)Mol. Cell. Biol.
17, 2266-2278; Li, y col., (1996)J. Cell Biol.132, 849-859; y Moessler, y col. (1996)Deveiopment122, 2415-2425).
Los promotores restringidos espacialmente específicos de fotorreceptores incluyen, pero no se limitan a, un promotor de rodopsina; un promotor de rodopsina quinasa (Young y col. (2003)Ophthalmol. Vis. Sci.44:4076); un promotor del gen de lafosfodiesterasa beta (Nioud y col. (2007)J. Gene Med.9:1015); un promotor del gen de la retinitis pigmentosa (Nioud y col. (2007) citado anteriormente); un potenciador del gen de la proteína de unión a retinoide interfotorreceptor (IRBP) (Nioud y col. (2007) citado anteriormente); un promotor del gen de IRBP (Yokyama y col. (1992)Exp Eye Res.
55:225); y similares.
Las expresiones “secuencias reguladoras de ADN” , “ elementos de control” y “elementos reguladores” utilizadas indistintamente en la presente memoria, se refieren a secuencias de control de la transcripción y de la traducción, tales como promotores, potenciadores, señales de poliadenilación, terminadores, señales de degradación de proteínas y similares, que proporcionan y/o regulan la transcripción de una secuencia no codificante (p. ej., ARN de localización específica de ADN) o una secuencia codificante (p. ej., polipéptido modificador dirigido al sitio o polipéptido Cas9/Csn1) y/o regulan la traducción de un polipéptido codificado.
La expresión “de origen natural” o “ sin modificar” como se usa en la presente memoria como se aplica a un ácido nucleico, un polipéptido, una célula o un organismo, se refiere a un ácido nucleico, polipéptido, célula u organismo que
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se encuentra en la naturaleza. Por ejemplo, una secuencia polipeptídica o polinucleotídica que está presente en un organismo (que incluye virus) que puede aislarse de una fuente en la naturaleza y que no ha sido modificada intencionalmente por un ser humano en el laboratorio es de origen natural.
El término “quimérico” , como se usa en la presente memoria, como se aplica a un ácido nucleico o polipéptido se refiere a dos componentes que se definen por estructuras derivadas de diferentes fuentes. Por ejemplo, cuando “ quimérico” se usa en el contexto de un polipéptido quimérico (p. ej., una proteína Cas9/Csn1 quimérica), el polipéptido quimérico incluye secuencias de aminoácidos que derivan de polipéptidos diferentes. Un polipéptido quimérico puede comprender secuencias polipeptídicas modificadas o de origen natural (p. ej., una primera secuencia de aminoácidos de una proteína Cas9/Csn1 modificada o sin modificar; y una segunda secuencia de aminoácidos distinta de la proteína Cas9/Csn1). Similarmente, “quimérico” en el contexto de un polinucleótido que codifica un polipéptido quimérico incluye secuencias de nucleótidos derivadas de regiones codificantes diferentes (p. ej., una primera secuencia de nucleótidos que codifica una proteína Cas9/Csn1; y una segunda secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido distinto de una proteína Cas9/Csn1).
La expresión “ polipéptido quimérico” se refiere a un polipéptido que se prepara mediante la combinación (es decir, “ fusión” ) de dos segmentos de secuencia de aminoácidos separados de cualquier otro modo, usualmente a través de intervención humana. Un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos quimérica es un polipéptido quimérico. Algunos polipéptidos quiméricos pueden denominarse “variantes de fusión” .
“ Heterólogo” , como se usa en la presente memoria, significa una secuencia de nucleótidos o polipéptidos que no se encuentra en el ácido nucleico o proteína nativos, respectivamente. Por ejemplo, en una proteína Cas9/Csn1 quimérica, el dominio de unión a ARN de un polipéptido Cas9/Csn1 bacteriano de origen natural (o una variante del mismo) puede fusionarse con una secuencia polipeptídica heteróloga (es decir, una secuencia polipeptídica de una proteína distinta de Cas9/Csn1 o una secuencia polipeptídica de otro organismo). La secuencia polipeptídica heteróloga puede presentar una actividad (p. ej., actividad enzimática) que también será presentada por la proteína Cas9/Csn1 quimérica (p. ej., actividad metiltransferasa, actividad acetiltransferasa, actividad quinasa, actividad ubiquitinante, etc.). Una secuencia de ácido nucleico heteróloga puede unirse a una secuencia de ácido nucleico natural (o una variante de la misma) (p. ej., mediante ingeniería genética) para generar una secuencia de nucleótidos quimérica que codifica un polipéptido quimérico. Como otro ejemplo, en un polipéptido dirigido al sitio Cas9 variante de fusión, un polipéptido dirigido al sitio Cas9 variante puede fusionarse con un polipéptido heterólogo (es decir, un polipéptido distinto de Cas9), que presenta una actividad que también será presentada por el polipéptido dirigido al sitio Cas9 variante de fusión. Una secuencia de ácido nucleico heteróloga puede unirse a un polipéptido dirigido al sitio Cas9 variante (p. ej., mediante ingeniería genética) para generar una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido dirigido al sitio Cas9 variante de fusión.
“ Recombinante” , como se usa en la presente memoria, significa que un ácido nucleico particular (ADN o ARN) es el producto de diversas combinaciones de clonación, restricción, reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y/o etapas de ligadura que dan como resultado un constructo que tiene una secuencia estructural codificante o no codificante distinguible de los ácidos nucleicos endógenos que se encuentran en los sistemas naturales. Las secuencias de ADN que codifican polipéptidos pueden ensamblarse a partir de fragmentos de ADNc o a partir de una serie de oligonucleótidos sintéticos, para proporcionar un ácido nucleico sintético que es capaz de expresarse a partir de una unidad transcripcional recombinante contenida en una célula o en un sistema de transcripción y traducción exento de células. El ADN genómico que comprende las secuencias relevantes también puede usarse en la formación de un gen recombinante o una unidad transcripcional. Las secuencias de ADN no traducido pueden estar presentes en 5' o 3' del marco de lectura abierto, donde dichas secuencias no interfieren con la manipulación o expresión de las regiones codificantes, y de hecho pueden actuar para modular la producción de un producto deseado por diversos mecanismos (véanse “ secuencias reguladoras de ADN” , a continuación). Alternativamente, las secuencias de ADN que codifican ARN (p. ej., ARN de localización específica de ADN) que no se traducen también pueden considerarse recombinantes. Por lo tanto, p. ej., la expresión ácido nucleico “ recombinante” se refiere a uno que no es de origen natural, p. ej., se hace por la combinación artificial de dos segmentos de secuencia separados de cualquier otro modo a través de intervención humana. Esta combinación artificial frecuentemente se logra mediante medios de síntesis química, o mediante la manipulación artificial de segmentos aislados de ácidos nucleicos, p. ej., mediante técnicas de ingeniería genética. Esto usualmente se hace para reemplazar un codón con un codón que codifica el mismo aminoácido, un aminoácido conservador o un aminoácido no conservador. Alternativamente, se realiza para unir entre sí segmentos de ácido nucleico de las funciones deseadas para generar una combinación deseada de funciones. Esta combinación artificial frecuentemente se logra mediante medios de síntesis química, o mediante la manipulación artificial de segmentos aislados de ácidos nucleicos, p. ej., mediante técnicas de ingeniería genética. Cuando un polinucleótido recombinante codifica un polipéptido, la secuencia del polipéptido codificado puede ser de origen natural (de “ tipo silvestre” ) o puede ser una variante (p. ej., un mutante) de la secuencia de origen natural. Por lo tanto, la expresión polipéptido “ recombinante” no se refiere necesariamente a un polipéptido cuya secuencia no se produce de forma natural. En cambio, un polipéptido “ recombinante” está codificado por una secuencia de ADN recombinante, pero la secuencia del polipéptido puede ser de origen natural (de “ tipo silvestre” ) o de origen no natural (p. ej., una variante, un mutante, etc.). Por lo tanto, un polipéptido “ recombinante” es el resultado de la intervención humana, pero puede ser una secuencia de aminoácidos de origen natural.
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Un “vector” o “vector de expresión” es un replicón, tal como un plásmido, fago, virus o cósmido, al que puede unirse otro segmento de ADN, es decir, un “ inserto” , para provocar la replicación del segmento unido en una célula.
Un “ casete de expresión” comprende una secuencia codificante de ADN unida operativamente a un promotor. “ Unido operativamente” se refiere a una yuxtaposición en donde los componentes descritos de este modo están en una relación que les permite actuar de la manera prevista. Por ejemplo, un promotor está unido operativamente a una secuencia codificante si el promotor afecta a su transcripción o expresión.
Las expresiones “vector de expresión recombinante” o “ constructo de ADN” se usan indistintamente en la presente memoria para referirse a una molécula de ADN que comprende un vector y al menos un inserto. Los vectores de expresión recombinantes usualmente se generan con el fin de expresar y/o propagar el inserto o insertos, o para la construcción de otras secuencias de nucleótidos recombinantes. El inserto o insertos pueden o no estar unidos operativamente a una secuencia promotora y pueden o no estar unidos operativamente a secuencias reguladoras de ADN.
Una célula se ha “ modificado genéticamente” o “ transformado” o “ transfectado” por ADN exógeno, p. ej., un vector de expresión recombinante, cuando dicho ADN se ha introducido dentro de la célula. La presencia de ADN exógeno da como resultado un cambio genético permanente o transitorio. El ADN transformante puede o no estar integrado (unido covalentemente) en el genoma de la célula. En células procariotas, de levadura y de mamífero, por ejemplo, el ADN transformante puede mantenerse en un elemento episómico tal como un plásmido. Con respecto a las células eucariotas, una célula transformada de manera estable es una en la que el ADN transformante se ha integrado en un cromosoma de modo que las células hijas lo hereden a través de la replicación cromosómica. Esta estabilidad se demuestra por la capacidad de la célula eucariota para establecer líneas celulares o clones que comprenden una población de células hijas que contienen el ADN transformante. Un “clon” es una población de células derivadas de una única célula o ancestro común por mitosis. Una “ línea celular” es un clon de una célula primaria que es capaz de crecer establein vitrodurante muchas generaciones.
Los métodos adecuados de modificación genética (también denominados “transformación” ) incluyen, p. ej., infección vírica o por bacteriófagos, transfección, conjugación, fusión de protoplastos, lipofección, electroporación, precipitación con fosfato de calcio, transfección mediada por polietilenimina (PEI), transfección mediada por DEAE-dextrano, transfección mediada por liposomas, tecnología de cañón de partículas, precipitación con fosfato de calcio, microinyección directa, administración de ácido nucleico mediada por nanopartículas (véase, p. ej., Panyam y col.,Adv Drug Deliv Rev.13 de septiembre de 2012. piii: S0169-409X(12)00283-9. doi: 10.1016/j.addr.2012.09.023) y similares.
La elección del método de modificación genética depende generalmente del tipo de célula que se transforma y las circunstancias en las que se tiene lugar la transformación (p. ej.,in vitro, ex vivooin vivo).Un análisis general de estos métodos puede encontrarse en Ausubel, y col.,Short Protocols in Molecular Biology,3ra ed., Wiley&Sons, 1995.
Un “ADN diana” , como se usa en la presente memoria, es un polinucleótido de ADN que comprende un “sitio diana" o “ secuencia diana” Las expresiones “ sitio diana” o “secuencia diana” o “ADN protoespaciador diana” se usan indistintamente en la presente memoria para referirse a una secuencia de ácido nucleico presente en un ADN diana al que se unirá un segmento de localización específica de ADN de un ARN de localización específica de ADN en cuestión (véase la Figura 1 y la Figura 39), siempre que existan condiciones suficientes para la unión. Por ejemplo, el sitio diana (o secuencia diana) 5'-GAGCATATC-3' (Id. de sec. n.° //) dentro de un ADN diana se localiza específicamente por (o se une por, o se hibrida con, o es complementario a) la secuencia de ARN 5-GAUAUGCUC-3' (Id. de sec. n.°II).Las condiciones de unión a ADN/ARN adecuadas incluyen condiciones fisiológicas normalmente presentes en una célula. Se conocen en la técnica otras condiciones de unión ADN/ARN adecuadas (p. ej., afecciones en un sistema exento de células); véase, p. ej., Sambrook, citado anteriormente. La cadena del ADN diana que es complementaria y se hibrida con el ARN de localización específica de ADN se denomina “ cadena complementaria” y la cadena del ADN diana que es complementaria a la “ cadena complementaria” (y, por lo tanto, no es complementaria al ARN de localización específica de ADN) se denomina “cadena no complementaria” o “cadena no-complementaria” (véase la Figura 12).
Por “ polipéptido modificador dirigido al sitio” o “ polipéptido dirigido al sitio de unión a ARN” o “ polipéptido modificador dirigido al sitio de unión a ARN” o “ polipéptido dirigido al sitio” se entiende un polipéptido que se une a ARN y se localiza específicamente a una secuencia de ADN específica. Un polipéptido modificador dirigido al sitio como se describe en la presente memoria se localiza específicamente a una secuencia de ADN específica por la molécula de ARN a la que está unido. La molécula de ARN comprende una secuencia que es complementaria a una secuencia diana dentro del ADN diana, localizando específicamente de este modo el polipéptido unido a una ubicación específica dentro del ADN diana (la secuencia diana).
Por “escisión” se entiende la rotura de la cadena principal covalente de una molécula de ADN. La escisión puede iniciarse mediante una diversidad de métodos que incluyen, pero no se limitan a, hidrólisis enzimática o química de un enlace fosfodiéster. Tanto la escisión monocatenaria como la escisión bicatenaria son posibles, y la escisión bicatenaria puede producirse como resultado de dos eventos de escisión monocatenarios distintos. La escisión de
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ADN puede dar como resultado la producción de extremos romos o extremos escalonados. En determinadas realizaciones, se usa un complejo que comprende un ARN de localización específica de ADN y un polipéptido modificador dirigido al sitio para la escisión de ADN bicatenario localizada específicamente.
“ Nucleasa” y “endonucleasa” se usan indistintamente en la presente memoria con el significado de una enzima que posee actividad catalítica para la escisión de ADN.
Por “ dominio de escisión” o “dominio activo” o “dominio nucleasa” de una nucleasa se entiende la secuencia polipeptídica o dominio dentro de la nucleasa que posee la actividad catalítica para la escisión de ADN. Un dominio de escisión puede estar contenido en una única cadena polipeptídica o la actividad de escisión puede ser el resultado de la asociación de dos (o más) polipéptidos. Un dominio nucleasa único puede consistir en más de un tramo aislado de aminoácidos dentro de un polipéptido dado.
La molécula de ARN que se une al polipéptido modificador dirigido al sitio y localiza específicamente el polipéptido a una ubicación específica dentro del ADN diana se denomina en la presente memoria “ARN de localización específica de ADN” o “ polinucleótido de ARN de localización específica de ADN” (también denominado en la presente memoria “ARN guía” o “ARNg” ). Un ARN de localización específica de ADN en cuestión comprende dos segmentos, un “ segmento de localización específica de ADN” y un “segmento de unión a proteínas” . Por “segmento” se entiende un segmento/sección/región de una molécula, p. ej., un tramo contiguo de nucleótidos en un ARN. Un segmento también puede significar una región/sección de un complejo de tal modo que un segmento puede comprender regiones de más de una molécula. Por ejemplo, en algunos casos, el segmento de unión a proteínas (que se describe a continuación) de un ARN de localización específica de ADN es una molécula de ARN y el segmento de unión a proteínas comprende, por lo tanto, una región de esa molécula de ARN. En otros casos, el segmento de unión a proteínas (que se describe a continuación) de un ARN de localización específica de ADN comprende dos moléculas separadas que se hibridan a lo largo de una región de complementariedad. Como ejemplo ilustrativo, no limitativo, un segmento de unión a proteínas de un ARN de localización específica de ADN que comprende dos moléculas separadas puede comprender (i) los pares de bases 40-75 de una primera molécula de ARN que tiene 100 pares de bases de longitud; y (ii) los pares de bases 10-25 de una segunda molécula de ARN que tiene 50 pares de bases de longitud. La definición de “ segmento” , a menos que se defina específicamente de otro modo en un contexto particular, no se limita a un número específico de pares de bases totales, no se limita a ningún número particular de pares de bases de una molécula de ARN dada, no se limita a un número particular de moléculas separadas dentro de un complejo, y puede incluir regiones de moléculas de ARN que tienen cualquier longitud total y pueden no incluir regiones con complementariedad con otras moléculas.
El segmento de localización específica de ADN (o “secuencia de localización específica de ADN” ) comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia específica dentro de un ADN diana (la cadena complementaria del ADN diana). El segmento de unión a proteínas (o “ secuencia de unión a proteínas” ) interactúa con un polipéptido modificador dirigido al sitio. Cuando el polipéptido modificador dirigido al sitio es un polipéptido relacionado con Cas9 o Cas9 (que se describe con más detalle a continuación), la escisión específica de sitio del ADN diana se produce en ubicaciones determinadas por (i) la complementariedad de emparejamiento de bases entre el ARN de localización específica de ADN y el ADN diana; y (ii) un motivo corto (denominado motivo adyacente protoespaciador (PAM)) en el ADN diana.
El segmento de unión a proteínas de un ARN de localización específica de ADN en cuestión comprende dos tramos complementarios de nucleótidos que se hibridan entre sí para formar un dúplex de ARN bicatenario (dúplex de ARNbc).
En algunas realizaciones, un ácido nucleico en cuestión (p. ej., un ARN de localización específica de ADN, un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un ARN de localización específica de ADN; un ácido nucleico que codifica un polipéptido dirigido al sitio; etc.) comprende una modificación o secuencia que proporciona una característica deseable adicional (p. ej., estabilidad modificada o regulada; localización específica subcelular; seguimiento, p. ej., un marcador fluorescente; un sitio de unión para una proteína o complejo de proteínas; etc.). Los ejemplos no limitativos incluyen: una caperuza 5' (p. ej., una caperuza de 7-metilguanilato (m7G)); una cola poliadenilada en 3' (es decir, una cola de poli(A) 3'; una secuencia de ribointerruptor (p. ej., para permitir la estabilidad regulada y/o la accesibilidad regulada por proteínas y/o complejos de proteínas); una secuencia de control de estabilidad; una secuencia que forma un dúplex de ARNbc (es decir, una horquilla)); una modificación o secuencia que localiza específicamente el ARN a una ubicación subcelular (p. ej., núcleo, mitocondrias, cloroplastos y similares); una modificación o secuencia que proporciona el seguimiento (p. ej., conjugación directa con una molécula fluorescente, conjugación con un resto que facilita la detección fluorescente, una secuencia que permite la detección fluorescente, etc.); una modificación o secuencia que proporciona un sitio de unión para proteínas (p. ej., proteínas que actúan sobre ADN, que incluyen activadores de la transcripción, represores de la transcripción, ADN metiltransferasas, ADN desmetilasas, histona acetiltransferasas, histona desacetilasas y similares); y combinaciones de los mismos.
En algunas realizaciones, un ARN de localización específica de ADN comprende un segmento adicional en el extremo 5' o 3' que proporciona cualquiera de las características descritas anteriormente. Por ejemplo, un tercer segmento adecuado puede comprender una caperuza 5' (p. ej., una caperuza de 7-metilguanilato (m7G)); una cola poliadenilada
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en 3' (es decir, una cola de poli(A) 3'; una secuencia de ribointerruptor (p. ej., para permitir la estabilidad regulada y/o la accesibilidad regulada por proteínas y complejos de proteínas); una secuencia de control de estabilidad; una secuencia que forma un dúplex de ARNbc (es decir, una horquilla)); una secuencia que localiza específicamente el ARN a una ubicación subcelular (p. ej., núcleo, mitocondrias, cloroplastos y similares); una modificación o secuencia que proporciona el seguimiento (p. ej., conjugación directa con una molécula fluorescente, conjugación con un resto que facilita la detección fluorescente, una secuencia que permite la detección fluorescente, etc.); una modificación o secuencia que proporciona un sitio de unión para proteínas (p. ej., proteínas que actúan sobre ADN, que incluyen activadores de la transcripción, represores de la transcripción, ADN metiltransferasas, ADN desmetilasas, histona acetiltransferasas, histona desacetilasas y similares); y combinaciones de los mismos.
Un ARN de localización específica de ADN en cuestión y un polipéptido modificador dirigido al sitio en cuestión (es decir, polipéptido dirigido al sitio) forman un complejo (es decir, se unen a través de interacciones no covalentes). El ARN de localización específica de ADN proporciona una especificidad diana al complejo al comprender una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de un ADN diana. El polipéptido modificador dirigido al sitio del complejo proporciona la actividad específica de sitio. En otras palabras, el polipéptido modificador dirigido al sitio se guía a una secuencia de ADN diana (p. ej., una secuencia diana en un ácido nucleico cromosómico; una secuencia diana en un ácido nucleico extracromosómico, p. ej., un ácido nucleico episómico, un minicírculo, etc.; una secuencia diana en un ácido nucleico mitocondrial; una secuencia diana en un ácido nucleico de cloroplasto; una secuencia diana en un plásmido; etc.) en virtud de su asociación con el segmento de unión a proteínas del ARN de localización específica de ADN.
En algunas realizaciones, un ARN de localización específica de ADN en cuestión comprende dos moléculas de ARN separadas (polinucleótidos de ARN: un “ARN activador” y un “ARN localizador específico” , véase a continuación) y se denomina en la presente memoria “ARN de localización específica de ADN de molécula doble” o un “ARN de localización específica de ADN de dos moléculas” . En otras realizaciones, el ARN de localización específica de ADN en cuestión es una molécula de ARN única (polinucleótido de ARN único) y se denomina en la presente memoria un “ARN de localización específica de ADN de molécula única” , un “ARN de guía único” o un “ARNgu” . La expresión “ARN de localización específica de ADN” o “ARNg” incluye, con referencia tanto a ARN de localización específica de ADN de molécula doble como a ARN de localización específica de ADN de molécula única (es decir, ARNgu).
Un ARN de localización específica de ADN de dos moléculas ilustrativo comprende una molécula similar a ARNcr (“ARN de CRISPR” o “ARN localizador específico” o “ARNcr" o “ repetición de ARNcr” ) y una molécula similar a ARNcrtra (“ARN de CRISPR de acción trans” o “ARN activador” o “ARNcrtra” ) correspondiente. Una molécula similar a ARNcr (ARN localizador específico) comprende tanto el segmento de localización específica de ADN (monocatenario) del ARN de localización específica de ADN como un tramo (“ segmento formador de dúplex” ) de nucleótidos que forma una mitad del dúplex de ARNbc del segmento de unión a proteínas del ARN de localización específica de ADN. Una molécula similar a ARNcrtra (ARN activador) correspondiente comprende un tramo de nucleótidos (segmento formador de dúplex) que forma la otra mitad del dúplex de ARNbc del segmento de unión a proteínas del ARN de localización específica de ADN. En otras palabras, un tramo de nucleótidos de una molécula similar a ARNcr es complementario y se híbrida con un tramo de nucleótidos de una molécula similar a ARNcrtra para formar el dúplex de ARNbc del dominio de unión a proteínas del ARN de localización específica de ADN. Como tal, se puede decir que cada molécula similar a ARNcr tiene una molécula similar a ARNcrtra correspondiente. La molécula similar a ARNcr proporciona de forma adicional el segmento de localización específica de ADN monocatenario. Por lo tanto, una molécula similar a ARNcr y una molécula similar a ARNcrtra (en forma de un par correspondiente) se hibridan para formar un ARN de localización específica de ADN. La secuencia exacta de una molécula de ARNcr o ARNcrtra dada es característica de la especie en la que se encuentran las moléculas de ARN. Se representan diversos ARNcr y ARNcrtra en pares complementarios correspondientes en las Figuras 8. Un ARN de localización específica de ADN de molécula doble en cuestión puede comprender cualquier par de ARNcr y ARNcrtra correspondiente. Un ARN de localización específica de ADN de molécula doble en cuestión puede comprender cualquier par de ARNcr y ARNcrtra correspondiente.
La expresión “ARN activador” se usa en la presente memoria con el significado de una molécula similar a ARNcrtra de un ARN de localización específica de ADN de molécula doble. La expresión “ARN localizador específico” se usa en la presente memoria con el significado de una molécula similar a ARNcr de un ARN de localización específica de ADN de molécula doble. La expresión “ segmento formador de dúplex” se usa en la presente memoria con el significado del tramo de nucleótidos de un ARN activador o un ARN localizador específico que contribuye a la formación del dúplex de ARNbc mediante la hibridación con un tramo de nucleótidos de una molécula de ARN activador o ARN localizador específico correspondiente. En otras palabras, un ARN activador comprende un segmento formador de dúplex que es complementario al segmento formador de dúplex del ARN localizador específico correspondiente. Como tal, un ARN activador comprende un segmento formador de dúplex mientras que un ARN localizador específico comprende tanto un segmento formador de dúplex como el segmento de localización específica de ADN del ARN de localización específica de ADN. Por lo tanto, un ARN de localización específica de ADN de molécula doble en cuestión puede estar compuesto por cualquier par de ARN activador y de ARN localizador específico correspondiente.
La expresión “célula madre” se usa en la presente memoria para referirse a una célula (p. ej., célula madre vegetal, célula madre de vertebrado) que tiene la capacidad de autorrenovarse y generar un tipo celular diferenciado (véase
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Morrison y col. (1997)Cell88:287-298). En el contexto de la ontogenia celular, el adjetivo “ diferenciado” o “ diferenciación” es un término relativo. Una “ célula diferenciada” es una célula que ha progresado más en la vía de desarrollo que la célula con la que se está comparando. Por lo tanto, las células madre pluripotentes (que se describen a continuación) pueden diferenciarse en células progenitoras de linaje restringido (p. ej., células madre mesodérmicas), que a su vez pueden diferenciarse en células que se restringen adicionalmente (p. ej., progenitores neuronales), que pueden diferenciarse en células en fase final (es decir, células diferenciadas terminalmente, p. ej., neuronas, cardiomiocitos, etc.), que desempeñan una función característica en un determinado tipo tisular, y pueden o no conservar la capacidad de proliferar adicionalmente. Las células madre pueden caracterizarse tanto por la presencia de marcadores específicos (p. ej., proteínas, ARN, etc.) y la ausencia de marcadores específicos. Las células madre también pueden identificarse mediante ensayos funcionales tantoin vitrocomoin vivo,particularmente ensayos relacionados con la capacidad de las células madre para proporcionar lugar a una progenie diferenciada múltiple.
Las células madre de interés incluyen células madre pluripotentes (PSC, por sus siglas en inglés). La expresión “célula madre pluripotente” o “ PSC” se usa en la presente memoria con el significado de una célula madre capaz de producir todos los tipos celulares del organismo. Por lo tanto, una PSC puede dar lugar a células de todas las capas germinales del organismo (p. ej., el endodermo, mesodermo y ectodermo de un vertebrado). Las células pluripotentes son capaces de formar teratomas y de contribuir a los tejidos del ectodermo, mesodermo o endodermo en un organismo vivo. Las células madre pluripotentes de las plantas son capaces de dar lugar a todos los tipos celulares de la planta (p. ej., células de la raíz, tallo, hojas, etc.).
Las PSC de los animales pueden derivar en un número de formas diferentes. Por ejemplo, las células madre embrionarias (ESC, por sus siglas en inglés) derivan de la masa celular interna de un embrión, mientras que las células madre pluripotentes inducidas (¡PSC, por sus siglas en inglés) derivan de células somáticas (Takahashi y col.,Cell.30 de noviembre de 2007;131(5):861-72; Takahashi y col.,Nat Protoc.2007;2(12):3081 -9; Yu y col.,Science.21 de diciembre de 2007;318(5858):1917-20. Epub 20 de noviembre de 2007). Debido a que el término PSC se refiere a células madre pluripotentes, independientemente de su derivación, el término PSC abarca los términos ESC e ¡PSC. Las PSC pueden estar en forma de una línea celular establecida, pueden obtenerse directamente del tejido embrionario primario, o pueden derivar de una célula somática. Las PSC pueden ser células diana de los métodos descritos en la presente memoria.
Por “ célula madre embrionaria” (ESC) se entiende una PSC que se aisló de un embrión, típicamente de la masa celular interna del blastocisto. Las células madre de interés también incluyen células madre embrionarias de otros primates, tales como células madre de Rhesus y células madre de tamarín. Las células madre pueden obtenerse de cualquier especie de mamífero, p. ej., ser humano, equino, bovino, porcino, canino, felino, roedor, p. ej., ratones, ratas, hámster, primate, etc. (Thomson y col. (1998)Science282:1145; Thomson y col. (1995)Proc. Nati. Acad. Sci USA92:7844; Thomson y col. (1996)Biol. Reprod.55:254; Shamblott y col.,Proc. Nati. Acad. Sci.USA 95:13726, 1998). En el cultivo, las ESC típicamente crecen como colonias planas con grandes relaciones nucleocitoplasmáticas, bordes definidos y nucléolos prominentes. Además, las ESC expresan SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81 y fosfatasa alcalina, pero no SSEA-1. Pueden encontrarse ejemplos de métodos para generar y caracterizar ESC, por ejemplo, en la patente US-7.029.913, la patente US-5.843.780 y la patente US-6.200.806. Los métodos para las hESC en proliferación en la forma indiferenciada se describen en los documentos WO 99/20741, WO 01/51616 y WO 03/020920.
Por “célula madre germinal embrionaria” (EGSC, por sus siglas en inglés) o “célula germinal embrionaria” o “célula EG” se entiende una PSC que deriva de células germinales y/o progenitores de células germinales, p. ej., células germinales primordiales, es decir, aquellas que se volverían esperma y óvulos. Se cree que las células germinales embrionarias (células EG) tienen propiedades similares a las células madre embrionarias como se ha descrito anteriormente. Pueden encontrarse ejemplos de métodos para generar y caracterizar células de EG, por ejemplo, en la patente US-7.153.684; Matsui, Y., Y col., (1992) Ce//70:841; Shamblott, M.,y col. (2001) Proc. Nati. Acad. Sci. USA98:113; Shamblott, M., y col. (1998)Proc. Nati. Acad. Sci. USA,95:13726; y Koshimizu, U., y col. (1996)Development,122:1235.
Por “ célula madre pluripotente inducida” o “ ¡PSC” se entiende una PSC que deriva de una célula que no es una PSC (es decir, de una célula que está diferenciada con respecto a una PSC). Las ¡PSC pueden derivar de múltiples tipos de células diferentes, que incluyen las células diferenciadas terminalmente. Las ¡PSC tienen una morfología similar a las células ES, que crecen como colonias planas con relaciones nucleocitoplasmáticas grandes, bordes definidos y núcleos prominentes. Además, las ¡PSC expresan uno o más marcadores clave de pluripotencia conocidos por un experto en la técnica, que incluyen, aunque no de forma limitativa, fosfatasa alcalina, SSEA3, SSEA4, Sox2, Oct3/4, Nanog, TRA160, TRA181, TDGF 1, Dnmt3b, FoxD3, GDF3, Cyp26a1, TERT y zfp42. Pueden encontrarse ejemplos de métodos para generar y caracterizar ¡PSC en, por ejemplo, las publicaciones de patente de los Estados Unidos n.° US-20090047263, US-20090068742, US-20090191159, US-20090227032, US-20090246875 y US-20090304646. Generalmente, para generar ¡PSC, las células somáticas se proporcionan con factores de reprogramación (p. ej., Oct4, SOX2, KLF4, MYC, Nanog, Lin28, etc.) conocidos en la técnica para reprogramar las células somáticas para convertirse en células madre pluripotentes.
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Por “célula somática” se entiende cualquier célula en un organismo que, en ausencia de manipulación experimental, no da lugar habitualmente a todos los tipos de células en un organismo. En otras palabras, las células somáticas son células que se han diferenciado de manera suficiente de modo que no generan de forma natural células de las tres capas germinales del cuerpo, es decir, ectodermo, mesodermo y endodermo. Por ejemplo, las células somáticas incluirían tanto neuronas como progenitores neurales, éstos últimos pueden ser capaces de dar lugar de forma natural a todos o algunos tipos celulares del sistema nervioso central, pero no pueden dar lugar a células de los linajes del mesodermo o endodermo.
Por “ célula mitótica” se entiende una célula que se somete a mitosis. La mitosis es el proceso por el cual una célula eucariota separa los cromosomas en su núcleo en dos conjuntos idénticos en dos núcleos separados. Generalmente va seguida inmediatamente de citocinesls, que divide los núcleos, el citoplasma, los orgánulos y la membrana celular en dos células que contienen partes aproximadamente iguales de estos componentes celulares.
Por “ célula postmitótica” se entiende una célula que ha salido de mitosis, es decir, es “quiescente” , es decir, ya no experimenta divisiones. Este estado de reposo puede ser temporal, es decir, reversible, o puede ser permanente.
Por “ célula meiótica” se entiende una célula que experimenta meiosis. La meiosis es el proceso mediante el cual una célula divide su material nuclear con el fin de producir gametos o esporas. A diferencia de la mitosis, en la meiosis, los cromosomas experimentan una etapa de recombinación que redistribuye el material genético entre los cromosomas. Además, el resultado de la meiosis es cuatro células haploides (genéticamente únicas), en comparación con las dos células diploides (genéticamente idénticas) producidas a partir de la mitosis.
Por “ recombinación” se entiende un proceso de intercambio de información genética entre dos polinucleótidos. Como se usa en la presente memoria, “ reparación dirigida por homología (HDR)” se refiere a la forma especializada de reparación de ADN que tiene lugar, por ejemplo, durante la reparación de roturas bicatenarias en células. Este proceso requiere homología de secuencia de nucleótidos, usa una molécula “donante” para la reparación de moldes de una molécula “ diana” (es decir, la que experimenta la rotura bicatenaria), y conduce a la transferencia de información genética del donante a la diana. La reparación dirigida por homología puede dar como resultado una alteración de la secuencia de la molécula diana (p. ej., inserción, deleción, mutación), si el polinucleótido donante difiere de la molécula diana y parte o la totalidad de la secuencia del polinucleótido donante se incorpora en el ADN diana. En algunas realizaciones, el polinucleótido donante, una porción del polinucleótido donante, una copia del polinucleótido donante o una porción de una copia del polinucleótido donante se integra en el ADN diana.
Por “ unión de extremos no homólogos (NHEJ, por sus siglas en inglés)” se entiende la reparación de roturas bicatenarias en el ADN mediante ligadura directa de los extremos de rotura entre sí sin la necesidad de un molde homólogo (a diferencia de la reparación dirigida por homología, que requiere una secuencia homologa para guiar la reparación). La NHEJ frecuentemente da como resultado la pérdida (deleción) de la secuencia de nucleótidos cerca del sitio de la rotura bicatenaria.
Los términos “ tratamiento” , “ tratar” y similares se usan en la presente memoria generalmente con el significado de obtener un efecto farmacológico y/o fisiológico deseado. El efecto puede ser profiláctico en términos de prevenir total o parcialmente una enfermedad o síntoma de la misma y/o puede ser terapéutico en términos de una cura parcial o completa para una enfermedad y/o efecto adverso atribulóle a la enfermedad. “Tratamiento” , como se usa en la presente memoria, cubre cualquier tratamiento de una enfermedad o síntoma en un mamífero, e incluye: (a) prevenir que la enfermedad o síntoma se produzca en un sujeto que puede estar predispuesto a adquirir la enfermedad o síntoma, pero al que aún no se le ha diagnosticado como que la tiene; (b) inhibir la enfermedad o síntoma, es decir, detener su desarrollo; o (c) aliviar la enfermedad, es decir, provocar la regresión de la enfermedad. El agente terapéutico puede administrarse antes, durante o después del inicio de la enfermedad o lesión. El tratamiento de la enfermedad en curso, donde el tratamiento estabiliza o reduce los síntomas clínicos indeseables del paciente, es de particular interés. Dicho tratamiento se realiza deseablemente antes de completar la pérdida de función en los tejidos afectados. La terapia no reivindicada se administrará deseablemente durante la fase sintomática de la enfermedad y, en algunos casos, después de la fase sintomática de la enfermedad.
Los términos “ individuo” , “ sujeto” , “ hospedador” y “ paciente” se usan indistintamente en la presente memoria y se refieren a cualquier sujeto mamífero para el que se desea diagnóstico, tratamiento o terapia, particularmente seres humanos.
Pueden encontrarse métodos generales en bioquímica molecular y celular en dichos libros de texto estándar comoMolecular Cloning: A Laboratory Manual,3a Ed. (Sambrook y col., HaRBor Laboratory Press 2001);Short Protocols in Molecular Biology,4a Ed. (Ausubel y col., eds., John Wiley & Sons 1999);Protein Methods(Bollag y col., John Wiley & Sons 1996);Nonviral Vectors forGene Therapy(Wagnery col. eds., Academic Press 1999);Viral Vectors(Kaplift & Loewy eds., Academic Press 1995);Immunology Methods Manual(I. Lefkovits ed., Academic Press 1997); yCell and Tissue Culture: Laboratory Procedures in Biotechnology(Doyle & Griffiths, John Wiley & Sons 1998).
Antes de que se describa de forma adicional la presente invención, debe entenderse que esta invención no se limita a realizaciones particulares descritas, ya que, por supuesto, pueden variar. También debe entenderse que la
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terminología utilizada en la presente memoria tiene el fin de describir solamente realizaciones particulares, y no pretende ser limitativa, ya que el alcance de la presente invención estará limitado únicamente por las reivindicaciones adjuntas.
Cuando se proporciona un intervalo de valores, se entiende que cada valor intermedio, hasta la décima parte de la unidad del límite inferior, a menos que el contexto indique claramente cualquier otra cosa, entre el límite superior e inferior de ese intervalo y cualquier otro valor indicado o intermedio en ese intervalo indicado, está abarcado por la invención. Los límites superior e inferior de estos intervalos más pequeños pueden incluirse independientemente en los intervalos más pequeños y también están abarcados por la invención, sujeto a cualquier límite específicamente excluido en el intervalo indicado. Cuando el intervalo indicado incluye uno o ambos límites, los intervalos que excluyen cualquiera o ambos de esos límites incluidos también se incluyen en la invención.
En la presente memoria se presentan determinados intervalos con valores numéricos antecedidos por el término “ aproximadamente” . El término “ aproximadamente” se usa en la presente memoria para proporcionar respaldo literal para el número exacto que antecede, así como un número que está cerca o es aproximadamente el número que el término antecede. Al determinar si un número está cerca o es aproximadamente un número específicamente mencionado, el número no mencionado cercano o aproximado puede ser un número que, en el contexto en el que se presenta, proporciona el equivalente sustancial del número mencionado específicamente.
A menos que se defina de cualquier otro modo
, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente memoria tienen el mismo significado que entiende habitualmente un experto en la técnica a la que pertenece esta invención. Aunque cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en la presente memoria también puede usarse en la práctica o ensayo de la presente invención, ahora se describen los métodos y materiales preferidos.
La mención de cualquier publicación es para su descripción antes de la fecha de presentación y no debe interpretarse como una admisión de que la presente invención no tiene derecho a anteceder dicha publicación en virtud de la invención anterior. Además, las fechas de publicación proporcionadas pueden ser diferentes de las fechas de publicación reales que pueden necesitar ser confirmadas independientemente.
Se observa que, como se usa en la presente memoria y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares “ un” , “ una” y “el/la” incluyen referentes en plural a menos que el contexto indique claramente cualquier otra cosa. Por lo tanto, por ejemplo, la referencia a “ un polinucleótido” incluye una pluralidad de dichos polinucleótidos y la referencia a “el polipéptido” incluye la referencia a uno o más polipéptidos y equivalentes de los mismos conocidos por los expertos en la técnica, y así sucesivamente. Se observa además que las reivindicaciones pueden redactarse para excluir cualquier elemento opcional. Como tal, esta declaración pretende servir como base antecedente para el uso de terminología exclusiva como “ únicamente” , “ solamente” y similares en relación con la mención de elementos de reivindicación, o el uso de una limitación “ negativa” .
Se aprecia que determinadas características de la invención, que, para mayor claridad, se describen en el contexto de realizaciones separadas, también pueden proporcionarse en combinación en una única realización. Por el contrario, diversas características de la invención, que, por brevedad, se describen en el contexto de una única realización, también pueden proporcionarse por separado o en cualquier subcombinación adecuada. Todas las combinaciones de las realizaciones que pertenecen a la invención se incluyen específicamente por la presente invención y se describen en la presente memoria como si cada una de las combinaciones se describiese individual y explícitamente. Además, todas las subcombinaciones de las diversas realizaciones y elementos de las mismas también se incluyen específicamente en la presente invención y se describen en la presente memoria como si cada una de dichas subcombinaciones se describiese individual y explícitamente en la presente memoria.
Las publicaciones analizadas en la presente memoria se proporcionan únicamente para su descripción antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. Nada en la presente memoria debe interpretarse como una admisión de que la presente invención no tiene derecho a anteceder dicha publicación en virtud de la invención anterior. Además, las fechas de publicación proporcionadas pueden ser diferentes de las fechas de publicación reales que pueden necesitar ser confirmadas independientemente.
Descripción detallada - Parte I
La presente descripción proporciona un ARN de localización específica de ADN que comprende una secuencia dirigida y que, junto con un polipéptido modificador que es una endonucleasa Cas9 de origen natural, proporciona una modificación específica de sitio de un ADN diana y/o un polipéptido asociado al ADN diana. También se proporcionan composiciones que comprenden el ARN de localización específica de ADN.
Ácidos nucleicos
ARN de localización específica de ADN
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La presente descripción proporciona un ARN de localización específica de ADN que dirige las actividades de un polipéptido asociado (p. ej., un polipéptido modificador dirigido a un sitio) a una secuencia diana específica dentro de un ADN diana. Un ARN de localización específica de ADN en cuestión comprende: un primer segmento (también denominado en la presente memoria “segmento de localización específica de ADN” o una “secuencia de localización específica de ADN” ) y un segundo segmento (también denominado en la presente memoria “ segmento de unión a proteínas” o una “secuencia de unión a proteínas” ).
Segmento de localización específica de ADN de un ARN de localización específica de ADN
El segmento de localización específica de ADN de un ARN de localización específica de ADN de un sujeto comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia en un ADN diana. En otras palabras, el segmento de localización específica de ADN de un ARN de localización específica de ADN en cuestión interactúa con un ADN diana de una manera específica de secuencia a través de hibridación (es decir, emparejamiento de bases). Como tal, la secuencia de nucleótidos del segmento de localización específica de ADN puede variar y determina la ubicación dentro del ADN diana donde interactuará el ARN de localización específica de ADN y el ADN diana. El segmento de localización específica de ADN de un ARN de localización específica de ADN en cuestión puede modificarse (p. ej., mediante ingeniería genética) para hibridarse con cualquier secuencia deseada dentro de un ADN diana.
El segmento de localización específica de ADN puede tener una longitud de aproximadamente 12 nucleótidos a aproximadamente 100 nucleótidos. Por ejemplo, el segmento de localización específica de ADN puede tener una longitud de aproximadamente 12 nucleótidos (nt) a aproximadamente 80 nt, de aproximadamente 12 nt a aproximadamente 50 nt, de aproximadamente 12 nt a aproximadamente 40 nt, de aproximadamente 12 nt a aproximadamente 30 nt, de aproximadamente 12 nt a aproximadamente 25 nt, de aproximadamente 12 nt a aproximadamente 20 nt o de aproximadamente 12 nt a aproximadamente 19 nt. Por ejemplo, el segmento de localización específica de ADN puede tener una longitud de aproximadamente 19 nt a aproximadamente 20 nt, de aproximadamente 19 nt a aproximadamente 25 nt, de aproximadamente 19 nt a aproximadamente 30 nt, de aproximadamente 19 nt a aproximadamente 35 nt, de aproximadamente 19 nt a aproximadamente 40 nt, de aproximadamente 19 nt a aproximadamente 45 nt, de aproximadamente 19 nt a aproximadamente 50 nt, de aproximadamente 19 nt a aproximadamente 60 nt, de aproximadamente 19 nt a aproximadamente 70 nt, de aproximadamente 19 nt a aproximadamente 80 nt, de aproximadamente 19 nt a aproximadamente 90 nt, de aproximadamente 19 nt a aproximadamente 100 nt, de aproximadamente 20 nt a aproximadamente 25 nt, de aproximadamente 20 nt a aproximadamente 30 nt, de aproximadamente 20 nt a aproximadamente 35 nt, de aproximadamente 20 nt a aproximadamente 40 nt, de aproximadamente 20 nt a aproximadamente 45 nt, de aproximadamente 20 nt a aproximadamente 50 nt, de aproximadamente 20 nt a aproximadamente 60 nt, de aproximadamente 20 nt a aproximadamente 70 nt, de aproximadamente 20 nt a aproximadamente 80 nt, de aproximadamente 20 nt a aproximadamente 90 nt, de aproximadamente 20 nt a aproximadamente 100 nt. La secuencia de nucleótidos (la secuencia de localización específica de ADN) del segmento de localización específica de ADN que es complementaria a una secuencia de nucleótidos (secuencia diana) del ADN diana puede tener una longitud de al menos aproximadamente 12 nt. Por ejemplo, la secuencia de localización específica de ADN del segmento de localización específica de ADN que es complementaria a una secuencia diana del ADN diana puede tener una longitud de al menos aproximadamente 12 nt, al menos aproximadamente 15 nt, al menos aproximadamente 18 nt, al menos aproximadamente 19 nt, al menos aproximadamente 20 nt, al menos aproximadamente 25 nt, al menos aproximadamente 30 nt, al menos aproximadamente 35 nt o al menos aproximadamente 40 nt. Por ejemplo, la secuencia de localización específica de ADN del segmento de localización específica de ADN que es complementaria a una secuencia diana del ADN diana puede tener una longitud de aproximadamente 12 nucleótidos (nt) a aproximadamente 80 nt, de aproximadamente 12 nt a aproximadamente 50 nt, de aproximadamente 12 nt a aproximadamente 45 nt, de aproximadamente 12 nt a aproximadamente 40 nt, de aproximadamente 12 nt a aproximadamente 35 nt, de aproximadamente 12 nt a aproximadamente 30 nt, de aproximadamente 12 nt a aproximadamente 25 nt, de aproximadamente 12 nt a aproximadamente 20 nt, de aproximadamente 12 nt a aproximadamente 19 nt, de aproximadamente 19 nt a aproximadamente 20 nt, de aproximadamente 19 nt a aproximadamente 25 nt, de aproximadamente 19 nt a aproximadamente 30 nt, de aproximadamente 19 nt a aproximadamente 35 nt, de aproximadamente 19 nt a aproximadamente 40 nt, de aproximadamente 19 nt a aproximadamente 45 nt, de aproximadamente 19 nt a aproximadamente 50 nt, de aproximadamente 19 nt a aproximadamente 60 nt, de aproximadamente 20 nt a aproximadamente 25 nt, de aproximadamente 20 nt a aproximadamente 30 nt, de aproximadamente 20 nt a aproximadamente 35 nt, de aproximadamente 20 nt a aproximadamente 40 nt, de aproximadamente 20 nt a aproximadamente 45 nt, de aproximadamente 20 nt a aproximadamente 50 nt o de aproximadamente 20 nt a aproximadamente 60 nt. La secuencia de nucleótidos (la secuencia de localización específica de ADN) del segmento de localización específica de ADN que es complementaria a una secuencia de nucleótidos (secuencia diana) del ADN diana puede tener una longitud de al menos aproximadamente 12 nt.
En algunos casos, la secuencia de localización específica de ADN del segmento de localización específica de ADN que es complementaria a una secuencia diana del ADN diana tiene 20 nucleótidos de longitud. En algunos casos, la secuencia dirigida a ADN del segmento de localización específica de ADN que es complementaria de una secuencia diana del ADN diana tiene 19 nucleótidos de longitud.
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El porcentaje de complementariedad entre la secuencia de localización específica de ADN del segmento de localización específica de ADN y la secuencia diana del ADN diana puede ser al menos de al menos el 60 % (p. ej., al menos el 65 %, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % o el 100 %). En algunos casos, el porcentaje de complementariedad entre la secuencia de localización específica de ADN del segmento de localización específica de ADN y la secuencia diana del ADN diana es del 100 % sobre los siete nucleótidos más 5' contiguos de la secuencia diana de la cadena complementaria del ADN diana. En algunos casos, el porcentaje de complementariedad entre la secuencia de localización específica de ADN del segmento de localización específica de ADN y la secuencia diana del ADN diana es al menos el 60 % sobre aproximadamente 20 nucleótidos contiguos. En algunos casos, el porcentaje de complementariedad entre la secuencia de localización específica de ADN del segmento de localización específica de ADN y la secuencia diana del ADN diana es del 100 % sobre los catorce nucleótidos más 5' contiguos de la secuencia diana de la cadena complementaria del ADN diana y tan bajo como del 0 % en el resto. En un caso de este tipo, la secuencia de localización específica de ADN puede considerarse como de 14 nucleótidos de longitud (véase la Figura 12D-E). En algunos casos, el porcentaje de complementariedad entre la secuencia de localización específica de ADN del segmento de localización específica de ADN y la secuencia diana del ADN diana es del 100 % sobre los siete nucleótidos más 5' contiguos de la secuencia diana de la cadena complementaria del ADN diana y tan bajo como del 0 % en el resto. En un caso de este tipo, la secuencia de localización específica de ADN puede considerarse como de 7 nucleótidos de longitud.
Segmento de unión a proteínas de un ARN de localización específica de ADN
El segmento de unión a proteínas de un ARN de localización específica de ADN de un sujeto interactúa con un polipéptido modificador dirigido al sitio. El ARN de localización específica de ADN en cuestión guía el polipéptido unido a una secuencia de nucleótidos específica dentro del ADN diana a través del segmento de localización específica de ADN mencionado anteriormente. El segmento de unión a proteínas de un ARN de localización específica de ADN en cuestión comprende dos tramos de nucleótidos que son complementarios entre sí. Los nucleótidos complementarios del segmento de unión a proteínas se hibridan para formar un dúplex de ARN bicatenario (ARNbc) (véanse las Figuras 1A y 1B).
Un ARN de localización específica de ADN de molécula doble de un sujeto comprende dos moléculas de ARN separadas. Cada una de las dos moléculas de ARN de un ARN de localización específica de ADN de molécula doble en cuestión comprende un tramo de nucleótidos que son complementarios entre sí de tal modo que los nucleótidos complementarios de las dos moléculas de ARN se hibridan para formar el dúplex de ARN bicatenario del segmento de unión a proteínas (Figura 1 A).
En algunas realizaciones, el segmento formador de dúplex del ARN activador es al menos aproximadamente el 60 % idéntico a una de las moléculas de ARN activador (ARNcrtra) expuestas en las Id. de sec. n.° 431-562, o un complemento de las mismas, sobre un tramo de al menos 8 nucleótidos contiguos. Por ejemplo, el segmento formador de dúplex del ARN activador (o el ADN que codifica el segmento formador de dúplex del ARN activador) es al menos aproximadamente el 60 % idéntico, al menos aproximadamente el 65 % idéntico, al menos aproximadamente el 70 % idéntico, al menos aproximadamente el 75 % idéntico, al menos aproximadamente el 80 % idéntico, al menos aproximadamente el 85 % idéntico, al menos aproximadamente el 90 % idéntico, al menos aproximadamente el 95 % idéntico, al menos aproximadamente el 98 % idéntico, al menos aproximadamente el 99 % idéntico o el 100 % idéntico, a una de las secuencias de ARNcrtra expuestas en las Id. de sec. n.° 431-562, o un complemento de las mismas, sobre un tramo de al menos 8 nucleótidos contiguos.
En algunas realizaciones, el segmento formador de dúplex del ARN localizador específico es al menos aproximadamente el 60 % idéntico a una de las secuencias de ARN localizador específico (ARNcr) expuestas en las Id. de sec. n.° 563-679, o un complemento de las mismas, sobre un tramo de al menos 8 nucleótidos contiguos. Por ejemplo, el segmento formador de dúplex del ARN localizador específico (o el ADN que codifica el segmento formador de dúplex del ARN localizador específico) es al menos aproximadamente el 65 % idéntico, al menos aproximadamente el 70 % idéntico, al menos aproximadamente el 75 % idéntico, al menos aproximadamente el 80 % idéntico, al menos aproximadamente el 85 % idéntico, al menos aproximadamente el 90 % idéntico, al menos aproximadamente el 95 % idéntico, al menos aproximadamente el 98 % idéntico, al menos aproximadamente el 99 % idéntico o el 100 % idéntico a una de las secuencias de ARNcr expuestas en las Id. de sec. n.° 563-679, o un complemento de las mismas, sobre un tramo de al menos 8 nucleótidos contiguos.
Un ARN de localización específica de ADN de dos moléculas puede diseñarse para permitir la unión controlada (es decir, condicional) de un ARN localizador específico con un ARN activador. Debido a que un ARN de localización específica de ADN de dos moléculas no es funcional a menos que tanto el ARN activador como el ARN localizador específico estén unidos en un complejo funcional con dCas9, un ARN de localización específica de ADN de dos moléculas puede ser inducible (p. ej., inducible por fármacos) haciendo que la unión entre el ARN activador y el ARN localizador específico sea inducible. Como ejemplo no limitativo, pueden usarse aptámeros de ARN para regular (es decir, controlar) la unión del ARN activador con el ARN localizador específico. En consecuencia, el ARN activador y/o el ARN localizador específico pueden comprender una secuencia de aptámero de ARN.
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Los aptámeros de ARN son conocidos en la técnica y son generalmente una versión sintética de un ribointerruptor. Las expresiones “aptámero de ARN” y “ ribointerruptor” se usan indistintamente en la presente memoria para abarcar secuencias de ácido nucleico tanto sintéticas como naturales que proporcionan la regulación inducible de la estructura (y por lo tanto la disponibilidad de secuencias específicas) de la molécula de ARN de la que son parte. Los aptámeros de ARN generalmente comprenden una secuencia que se pliega en una estructura particular (p. ej., una horquilla), que se une específicamente a un fármaco particular (p. ej., una molécula pequeña). La unión del fármaco provoca un cambio estructural en el plegamiento del ARN, que cambia una característica del ácido nucleico del cual el aptámero es una parte. Como ejemplos no limitativos: (i) un ARN activador con un aptámero puede no ser capaz para unirse al ARN localizador específico afín a menos que el aptámero esté unido por el fármaco adecuado; (ii) un ARN localizador específico con un aptámero puede no ser capaz para unirse al ARN activador afín a menos que el aptámero esté unido por el fármaco adecuado; y (iii) un ARN localizador específico y un ARN activador, cada uno de los cuales comprende un aptámero diferente que se une a un fármaco diferente, puede no ser capaz de unirse entre sí a menos que ambos fármacos estén presentes. Como se ilustra por estos ejemplos, puede diseñarse un ARN de localización específica de ADN de dos moléculas para que sea inducible.
Pueden encontrarse ejemplos de aptámeros y ribointerruptores, por ejemplo, en: Nakamura y col.,Genes Cells.Mayo de 2012;17(5):344-64; Vavalina y col.,Future Cardiol.Mayo de 2012;8(3):371-82; Citartan y col.,Biosens Bioelectron.
15 de abril de 2012;34(1): 1-11; y Liberman y col.,Wiley Interdisp Rev RNA.Mayo-Junio de 2012;3(3):369-84.
Los ejemplos no limitativos de secuencias de nucleótidos que pueden incluirse en un ARN de localización específica de ADN de dos moléculas incluyen cualquiera de las secuencias expuestas en las Id. de sec. n.° 431-562, o complementos de las mismas que se emparejan con cualquier secuencia expuesta en las Id. de sec. n.° 563-679, o complementos de las mismas que pueden hibridarse para formar un segmento de unión a proteínas.
Un ARN de localización específica de ADN de molécula única de un sujeto comprende dos tramos de nucleótidos (un ARN localizador específico y un ARN activador) que son complementarios entre sí, que están unidos covalentemente por nucleótidos intervinientes (“en lazad o res” o “ nucleótidos enlazadores” ) y que se hibridan para formar el dúplex de ARN bicatenario (dúplex de ARNbc) del segmento de unión a proteínas, dando como resultado una estructura tallobucle (Figura 1B). El ARN localizador específico y el ARN activador pueden unirse covalentemente a través del extremo 3' del ARN localizador específico y el extremo 5' del ARN activador. Alternativamente, el ARN localizador específico y el ARN activador pueden unirse covalentemente a través del extremo 5' del ARN localizador específico y el extremo 3' del ARN activador.
El enlazador de un ARN de localización específica de ADN de molécula única puede tener una longitud de aproximadamente 3 nucleótidos a aproximadamente 100 nucleótidos. Por ejemplo, el enlazador puede tener una longitud de aproximadamente 3 nucleótidos (nt) a aproximadamente 90 nt, de aproximadamente 3 nucleótidos (nt) a aproximadamente 80 nt, de aproximadamente 3 nucleótidos (nt) a aproximadamente 70 nt, de aproximadamente 3 nucleótidos (nt) a aproximadamente 60 nt, de aproximadamente 3 nucleótidos (nt) a aproximadamente 50 nt, de aproximadamente 3 nucleótidos (nt) a aproximadamente 40 nt, de aproximadamente 3 nucleótidos (nt) a aproximadamente 30 nt, de aproximadamente 3 nucleótidos (nt) a aproximadamente 20 nt o de aproximadamente 3 nucleótidos (nt) a aproximadamente 10 nt. Por ejemplo, el enlazador puede tener una longitud de aproximadamente 3 nt a aproximadamente 5 nt, de aproximadamente 5 nt a aproximadamente 10 nt, de aproximadamente 10 nt aproximadamente 15 nt, de aproximadamente 15 nt a aproximadamente 20 nt, de aproximadamente 20 nt aproximadamente 25 nt, de aproximadamente 25 nt aproximadamente 30 nt, de aproximadamente 30 nt aproximadamente 35 nt, de aproximadamente 35 nt aproximadamente 40 nt, de aproximadamente 40 nt aproximadamente 50 nt, de aproximadamente 50 nt aproximadamente 60 nt, de aproximadamente 60 nt aproximadamente 70 nt, de aproximadamente 70 nt aproximadamente 80 nt, de aproximadamente 80 nt aproximadamente 90 nt o de aproximadamente 90 nt aproximadamente 100 nt. En algunas realizaciones, enlazador de un ARN de localización específica de ADN de molécula única tiene 4 nt.
Un ARN de localización específica de ADN de molécula única ilustrativo comprende dos tramos complementarios de nucleótidos que se hibridan para formar un dúplex de ARNbc. En algunas realizaciones, uno de los dos tramos complementarios de nucleótidos del ARN de localización específica de ADN de molécula única (o el ADN que codifica el tramo) es al menos aproximadamente el 60 % idéntico a una de las moléculas de ARN activador (ARNcrtra) expuestas en las Id. de sec. n.°431-562, o un complemento de las mismas, sobre un tramo de al menos 8 nucleótidos contiguos. Por ejemplo, uno de los dos tramos complementarios de nucleótidos del ARN de localización específica de ADN de molécula única (o el ADN que codifica el tramo) es al menos aproximadamente el 65 % idéntico, al menos aproximadamente el 70 % idéntico, al menos aproximadamente el 75 % idéntico, al menos aproximadamente el 80 % idéntico, al menos aproximadamente el 85 % idéntico, al menos aproximadamente el 90 % idéntico, al menos aproximadamente el 95 % idéntico, al menos aproximadamente el 98 % idéntico, al menos aproximadamente el 99 % idéntico o el 100 % idéntico a una de las secuencias de ARNcrtra expuestas en las Id. de sec. n.° 431-562, o un complemento de las mismas, sobre un tramo de al menos 8 nucleótidos contiguos.
En algunas realizaciones, uno de los dos tramos complementarios de nucleótidos del ARN de localización específica de ADN de molécula única (o el ADN que codifica el tramo) es al menos aproximadamente el 60 % idéntico a una de
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las secuencias de ARN localizador específico (ARNcr) expuestas en las Id. de sec. n.° 563-679, o un complemento de las mismas, sobre un tramo de al menos 8 nucleótidos contiguos. Por ejemplo, uno de los dos tramos complementarios de nucleótidos del ARN de localización específica de ADN de molécula única (o el ADN que codifica el tramo) es al menos aproximadamente el 65 % idéntico, al menos aproximadamente el 70 % idéntico, al menos aproximadamente el 75 % idéntico, al menos aproximadamente el 80 % idéntico, al menos aproximadamente el 85 % idéntico, al menos aproximadamente el 90 % idéntico, al menos aproximadamente el 95 % idéntico, al menos aproximadamente el 98 % idéntico, al menos aproximadamente el 99 % idéntico o el 100 % idéntico a una de las secuencias de ARNcr expuestas en las Id. de sec. n.° 563-679, o un complemento de las mismas, sobre un tramo de al menos 8 nucleótidos contiguos.
Los pares afines adecuados de ARNcr y ARNcrtra de origen natural pueden determinarse rutinariamente para las Id. de sec. n.°431-679 teniendo en cuenta el nombre de especie y el emparejamiento de bases (para el dúplex de ARNbc del dominio de unión a proteínas) cuando se determinan pares afines adecuados (véase la Figura 8 como ejemplo no limitativo).
Con respecto tanto a un ARN de localización específica de ADN de molécula única de un sujeto como a un ARN de localización específica de ADN de molécula doble de un sujeto, laFigura 57demuestra que secuencias artificiales que comparten muy poco (aproximadamente el 50 % de identidad) con ARNcrtra y ARNcr de origen natural pueden actuar con Cas9 para escindir el ADN diana siempre que la estructura del dominio de unión a proteínas del ARN de localización específica de ADN esté conservada. Por lo tanto, la estructura de plegamiento de ARN de un dominio de unión a proteínas de origen natural de un ARN de localización específica de ADN puede tenerse en cuenta con el fin de diseñar dominios de unión a proteínas artificiales (versiones de dos moléculas o de molécula única). Como ejemplo no limitativo, el ARN de localización específica de ADN artificial funcional de la Figura 57 se diseñó basándose en la estructura del segmento de unión a proteínas del ARN de localización específica de ADN de origen natural (p. ej., que Incluye el mismo número de pares de bases a lo largo del dúplex de ARN e Incluye la misma región “abultada” que está presente en el ARN de origen natural). Como las estructuras pueden ser producidas fácilmente por un experto en la técnica para cualquier par de ARNcnARNcrtra de origen natural de cualquier especie (véanse las Id. de sec. n.° 431-679 para consultar secuencias de ARNcr y ARNcrtra de una amplia diversidad de especies), puede diseñarse un ARN de localización específica de ADN artificial para imitar la estructura natural para una especie dada cuando se usa la Cas9 (o una Cas9 relacionada, véase la Figura 32A) de esa especie, (véase la Figura 24D y detalles relacionados en el Ejemplo 1). Por lo tanto, un ARN de localización específica de ADN adecuado puede ser un ARN diseñado artificialmente (de origen no natural) que comprende un dominio de unión a proteínas que se diseñó para imitar la estructura de un dominio de unión a proteínas de un ARN de localización específica de ADN de origen natural, (véanse las Id. de sec. n.° 431-679, teniendo en cuenta el nombre de la especie cuando se determinan pares afines adecuados).
El segmento de unión a proteínas puede tener una longitud de aproximadamente 10 nucleótidos a aproximadamente 100 nucleótidos. Por ejemplo, el segmento de unión a proteínas puede tener una longitud de aproximadamente 15 nucleótidos (nt) a aproximadamente 80 nt, de aproximadamente 15 nt a aproximadamente 50 nt, de aproximadamente 15 nt a aproximadamente 40 nt, de aproximadamente 15 nt a aproximadamente 30 nt o de aproximadamente 15 nt a aproximadamente 25 nt.
También con respecto a un ARN de localización específica de ADN de molécula única de un sujeto y con respecto a un ARN de localización específica de ADN de molécula doble de un sujeto, el dúplex de ARNbc del segmento de unión a proteínas puede tener una longitud de aproximadamente 6 pares de bases (pb) a aproximadamente 50 pb. Por ejemplo, el dúplex de ARNbc del segmento de unión a proteínas puede tener una longitud de aproximadamente 6 pb a aproximadamente 40 pb, de aproximadamente 6 pb a aproximadamente 30 pb, de aproximadamente 6 pb a aproximadamente 25 pb, de aproximadamente 6 pb a aproximadamente 20 pb, de aproximadamente 6 pb a aproximadamente 15 pb, de aproximadamente 8 pb a aproximadamente 40 pb, de aproximadamente 8 pb a aproximadamente 30 pb, de aproximadamente 8 pb a aproximadamente 25 pb, de aproximadamente 8 pb a aproximadamente 20 pb o de aproximadamente 8 pb a aproximadamente 15 pb. Por ejemplo, el dúplex de ARNbc del segmento de unión a proteínas puede tener una longitud de aproximadamente 8 pb a aproximadamente 10 pb, de aproximadamente 10 pb a aproximadamente 15 pb, de aproximadamente 15 pb a aproximadamente 18 pb, de aproximadamente 18 pb a aproximadamente 20 pb, de aproximadamente 20 pb a aproximadamente 25 pb, de aproximadamente 25 pb a aproximadamente 30 pb, de aproximadamente 30 pb a aproximadamente 35 pb, de aproximadamente 35 pb a aproximadamente 40 pb o de aproximadamente 40 pb a aproximadamente 50 pb. En algunas realizaciones, el dúplex de ARNbc del segmento de unión a proteínas tiene una longitud de 36 pares de bases. El porcentaje de complementariedad entre las secuencias de nucleótidos que se hlbridan para formar el dúplex de ARNbc del segmento de unión a proteínas puede ser de al menos aproximadamente el 60 %. Por ejemplo, el porcentaje de complementariedad entre las secuencias de nucleótidos que se hibridan para formar el dúplex de ARNbc del segmento de unión a proteínas puede ser de al menos aproximadamente el 65 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 98 % o al menos aproximadamente el 99 %. En algunos casos, el porcentaje de complementariedad entre las secuencias de nucleótidos que se hibridan para formar el dúplex de ARNbc del segmento de unión a proteínas es del 100 %.
Polipéptido modificador dirigido al sitio
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Un ARN de localización específica de ADN de un sujeto y un polipéptido modificador dirigido a un sitio que es una endonucleasa Cas9 de origen natural forman un complejo. El ARN de localización específica de ADN proporciona una especificidad diana al complejo al comprender una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de un ADN diana (como se ha indicado anteriormente). El polipéptido modificador dirigido al sitio del complejo proporciona la actividad específica de sitio. En otras palabras, el polipéptido modificador dirigido al sitio es guiado a una secuencia de ADN (p. ej., una secuencia cromosómica o una secuencia extracromosómica, p. e j u n a secuencia episómica, una secuencia de minicírculo, una secuencia mitocondrial, una secuencia del cloroplasto, etc.) en virtud de su asociación con al menos el segmento de unión a proteínas del ARN de localización específica de ADN (descrito anteriormente).
Un polipéptido modificador dirigido a un sitio (no reivindicado como tal) modifica el ADN diana (por ejemplo, escisión). Un polipéptido modificador dirigido a un sitio (no reivindicado como tal) también se denomina en la presente memoria un “ polipéptido dirigido al sitio” o un “ polipéptido modificador dirigido al sitio de unión a ARN”
El polipéptido modificador dirigido a un sitio (no reivindicado como tal) es un polipéptido modificador de origen natural.
Se exponen polipéptidos modificadores dirigidos al sitio de origen natural ejemplares en las Id. de sec. n.° 1-255 como una lista no limitativa y no exhaustiva de endonucleasas Cas9/Csn1 de origen natural. Estos polipéptidos de origen natural (no reivindicados como tales), como se describe en la presente memoria, se unen a un ARN de localización específica de ADN, se dirigen así a una secuencia específica dentro de un ADN diana y escinden el ADN diana para generar una rotura bicatenaria. Un polipéptido modificador dirigido a un sitio (no reivindicado como tal) comprende dos porciones: una porción de unión a ARN y una porción de actividad. En algunas realizaciones, un polipéptido modificador dirigido al sitio en cuestión comprende: (i) una porción de unión a ARN que interactúa con un ARN de localización específica de ADN, en donde el ARN de localización específica de ADN comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia en un ADN diana; y (ii) una porción de actividad que presenta actividad enzimática dirigida a un sitio (actividad para la escisión del ADN), en donde el sitio de actividad enzimática está determinado por el ARN de localización específica de ADN.
Un polipéptido modificador dirigido a un sitio de un sujeto (no reivindicado como tal) tiene una actividad enzimática que modifica el ADN diana mediante actividad nucleasa.
Polipéptidos modificadores dirigidos al sitio ilustrativos
En algunos casos, el polipéptido modificador dirigido al sitio (no reivindicado como tal) comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 99 % o el 100 % de identidad de secuencia de aminoácidos con los aminoácidos 7-166 o 731 -1003 de la secuencia de aminoácidos de Cas9/Csn1 representada en la Figura 3, o con las porciones correspondientes en cualquiera de las secuencias de aminoácidos expuestas como Id. de sec. n.° 1-256 y 795-1346.
Modificaciones de ácido nucleico
En algunas realizaciones, un ARN de localización específica de ADN de un sujeto comprende una o más modificaciones, p. ej., una modificación de bases, una modificación de la cadena principal, etc., para proporcionar al ácido nucleico una característica nueva o potenciada (p. ej., estabilidad mejorada). Como se sabe en la técnica, un nucleósido es una combinación de base-azúcar. La porción de base del nucleósido es normalmente una base heterocíclica. Las dos clases más comunes de dichas bases heterocíclicas son las purinas y las pirimidinas. Los nucleótidos son nucleósidos que incluyen además un grupo fosfato unido covalentemente a la porción de azúcar del nucleósido. Para aquellos nucleósidos que incluyen un azúcar pentofuranosilo, el grupo fosfato se puede unir al resto hidroxilo 2', 3' o 5' del azúcar. En la formación de oligonucleótidos, los grupos fosfato unen covalentemente los nucleósidos adyacentes entre sí para formar un compuesto polimérico lineal. A su vez, los extremos respectivos de este compuesto polimérico lineal pueden unirse adicionalmente para formar un compuesto circular, sin embargo, los compuestos lineales son generalmente adecuados. Además, los compuestos lineales pueden tener una complementariedad interna de bases de nucleótidos y, por lo tanto, pueden plegarse de modo que produzcan un compuesto total o parcialmente bicatenario. Dentro de los oligonucleótidos, los grupos fosfato se denominan habitualmente como la formación de la cadena principal internucleosídica del oligonucleótido. El enlace o cadena principal normal de ARN y ADN es un enlace fosfodiéster 3' a 5'.
Cadenas principales modificadas y enlaces internucleosídicos modificados
Los ejemplos de ARN de localización específica de ADN adecuados que contienen modificaciones incluyen ARN de localización específica de ADN que contienen cadenas principales modificadas o enlaces internucleósidos no naturales. Los ARN de localización específica de ADN que tienen cadenas principales modificadas incluyen aquellos que conservan un átomo de fósforo en la cadena principal y aquellos que no tienen un átomo de fósforo en la cadena principal.
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Las cadenas principales oligonucleotídicas modificadas adecuadas que contienen un átomo de fósforo en la misma incluyen, por ejemplo, fosforotioatos, fosforotioatos quirales, fosforoditioatos, fosfotriésteres, aminoalquilfosfotriésteres, fosfonatos de metil y otros alquilos que incluyen fosfonatos de 3'-alquileno, fosfonatos de 5'-alquileno y fosfonatos quirales, fosfinatos, fosforamidatos que incluyen 3'-amino fosforamidato y aminoalquilfosforamidatos, fosforodiamidatos, tionfosforamidatos, tionoalquilfosfonatos, tionoalquilfosfotriésteres, selenofosfatos y boranofosfatos que tienen enlaces 3'-5'normales, análogos unidos a 2'-5' de estos, y aquellos que tienen polaridad invertida en donde uno o más enlaces internucleotídicos es un enlace 3' a 3', 5' a 5' o 2' a 2'. Los ARN de localización específica de ADN adecuados que tienen polaridad invertida comprenden un único enlace 3' a 3' en el enlace internucleotídico más 3', es decir, un único residuo de nucleósido invertido que puede ser básico (la nucleobase falta o tiene un grupo hidroxilo en lugar de la misma). También se incluyen diversas sales (tales como, por ejemplo, potasio o sodio), sales mixtas y formas de ácido libre.
En algunas realizaciones, un ARN de localización específica de ADN de un sujeto comprende uno o más enlaces internucleosídicos de fosforotioato y/o heteroátomos, en particular -CH<2>-NH-O-CH<2>-, CH2-N(CH3)-0-CH2- (conocido como metileno (metilimino) o cadena principal de MMI), -CH2-0-N(CH3)-CH2-, -CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2- y -0-N(CH3)-CH<2>-CH<2>- (en donde el enlace internucleotídico de fosfodiéster nativo se representa como -0-P(=0)(0H)-0-CH2-). Se describen enlaces internucleosídicos de tipo MMI en la patente US-5.489.677. Se describen enlaces internucleosídicos de amida adecuados en la patente US-5.602.240.
También son adecuados ARN de localización específica de ADN que tienen estructuras de cadena principal de morfolino como se describen, p. ej., en la patente US-5.034.506. Por ejemplo, en algunas formas de realización, un ARN de localización específica de ADN de un sujeto comprende un anillo morfolino de 6 miembros en vez de un anillo de ribosa. En algunas de estas realizaciones, un fosforodiamidato u otro enlace internucleosídico no fosfodiéster reemplaza un enlace fosfodiéster.
Las cadenas principales de polinucleótidos modificados adecuados que no incluyen un átomo de fósforo en los mismos tienen cadenas principales que están formadas por enlaces internucleosídicos de alquilo o cicloalquilo de cadena corta, enlaces internucleosídicos mixtos de heteroátomo y alquilo o cicloalquilo, o uno o más enlaces internucleosídicos heteroatómicos o heterocíclicos de cadena corta. Estos incluyen aquellos que tienen enlaces morfolino (formados en parte de la porción de azúcar de un nucleósido); cadenas principales de siloxano; cadenas principales de sulfuro, sulfóxido y sulfona; cadenas principales de formacetilo y tioformacetilo; cadenas principales de metileno formacetilo y tioformacetilo; cadenas principales de riboacetilo; cadenas principales que contienen alqueno; cadenas principales de sulfamato; cadenas principales de metilenimino y metilenhidrazino; cadenas principales de sulfonato y sulfonamida; cadenas principales de amida; y otros que tienen partes componentes mixtas de N, O, S y CH<2>.
Miméticos
Un ARN de localización específica de ADN en cuestión puede ser un mimético de ácido nucleico. El término “ mimético” como se aplica a los polinucleótidos tiene por objeto incluir polinucleótidos en donde solamente el anillo de furanosa o tanto el anillo de furanosa como el enlace internucleotídico se reemplazan con grupos no furanosos, el reemplazo de solamente el anillo de furanosa también se denomina en la técnica como que es un sustituto de azúcar. El resto de base heterocíclica o un resto de base heterocíclica modificado se mantiene para la hibridación con un ácido nucleico diana adecuado. Uno de dichos ácidos nucleicos, un polinucleótido mimético que ha demostrado tener excelentes propiedades de hibridación, se denomina ácido nucleico peptídico (PNA). En el PNA, la cadena principal de azúcar de un polinucleótido se reemplaza con una cadena principal que contiene amida, en particular una cadena principal de aminoetilglicina. Los nucleótidos se conservan y se unen directa o indirectamente a átomos de nitrógeno aza de la porción amida de la cadena principal.
Un polinucleótido mimético que se ha publicado que tiene excelentes propiedades de hibridación es un ácido nucleico peptídico (PNA). La cadena principal en los compuestos de PNA es dos o más unidades de aminoetilglicina unidas que proporcionan PNA a una cadena principal que contiene amida. Los restos de base heterocíclica se unen directa o indirectamente a átomos de nitrógeno aza de la porción amida de la cadena principal. Las patentes representativas de Estados Unidos que describen la preparación de compuestos de PNA incluyen, pero no se limitan a: patente US-5.539.082; US-5.714.331; y US-5.719.262.
Otra clase de mimético de polinucleótido que se ha estudiado se basa en unidades de morfolino unidas (ácido nucleico de morfolino) que tienen bases heterocíclicas unidas al anillo de morfolino. Se ha publicado un número de grupos de unión que unen las unidades monoméricas de morfolino en un ácido nucleico de morfolino. Se ha seleccionado una clase de grupos de unión para proporcionar un compuesto oligomérico no iónico. Los compuestos oligoméricos a base de morfolino no iónicos son menos propensos a tener interacciones no deseadas con proteínas celulares. Los polinucleótidos basados en morfolino son miméticos no iónicos de oligonucleótidos que son menos propensos a formar interacciones no deseadas con proteínas celulares (Dwaine A. Braasch y David R. Corey,Biochemistry,2002, 41(14), 4503-4510). Se describen polinucleótidos a base de morfolino en la patente US-5.034.506. Se ha preparado una diversidad de compuestos dentro de la clase morfolino de polinucleótidos, que tiene una diversidad de diferentes grupos de unión que unen las subunidades monoméricas.
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Una clase adicional de mimético de polinucleótido se denomina ácidos nucleicos de ciclohexenilo (CeNA). El anillo de furanosa normalmente presente en una molécula de ADN/ARN se reemplaza con un anillo de ciclohexenilo. Se han preparado y utilizado monómeros de fosforamidita protegidos por DMT de CeNA para la síntesis de compuestos oligoméricos después de la química clásica de fosforamidita. Se han preparado y estudiado compuestos oligoméricos de CeNA totalmente modificados y ollgonucleótidos que tienen posiciones específicas modificadas con CeNA (véase Wang y col.,J. Am. Chem. Soc.,2000, 122, 8595-8602). En general, la incorporación de monómeros de CeNA en una cadena de ADN aumenta su estabilidad de un híbrido de ADN/ARN. Los oligoadenilatos de CeNA formaron complejos con complementos de ARN y ADN con una estabilidad similar a los complejos nativos. El estudio de incorporación de estructuras de CeNA en estructuras de ácido nucleico natural se mostró mediante RMN y dicroísmo circular para proceder con una adaptación conformacional fácil.
Una modificación adicional incluye ácidos nucleicos bloqueados (LNA) en los que el grupo 2'-hidroxilo está unido al átomo de carbono 4' del anillo de azúcar, formando de este modo un enlace 2'-C,4'-C-oximetileno formando de este modo un resto de azúcar bicíclico. El enlace puede ser un grupo metileno (-CH (-CH<2>-) que une el átomo de oxígeno 2' y el átomo de carbono 4' en donde n es 1 o 2 (Singh y col.,Chem. Commun.,1998, 4, 455-456). Los LNA y análogos de LNA muestran estabilidades térmicas dúplex muy altas con ADN y ARN complementarlos (Tf = 3 a 10 °C), estabilidad hacia la degradación 3' exonucleolítica y buenas propiedades de solubilidad. Se han descrito oligonucleótidos antisentido potentes y no tóxicos que contienen LNA (Wahlestedty col.,Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A.,2000, 97, 5633-5638).
La síntesis y preparación de los monómeros de LNA adenina, citosina, guanina, 5-metilcitosina, timina y uracilo, junto con su oligomerización y propiedades de reconocimiento de ácido nucleico se han descrito (Koshkin y col.,Tetrahedron,1998, 54, 3607-3630). También se describen LNA y la preparación de los mismos en los documentos WO 98/39352 y WO 99/14226.
Restos de azúcar modificados
Un ARN de localización específica de ADN en cuestión para el uso también puede incluir uno o más restos de azúcar sustituidos. Los polinucleótidos adecuados comprenden un grupo sustituyente de azúcar seleccionado de: OH; F; O-, S- o N-alquilo; O-, S- o N-alquenilo; O-, S- o N-alquinilo; u O-alquil-O-alquilo, en donde el alquilo, alquenilo y alquinilo pueden ser alquilo C<1>a C<10>o alquenilo y alquinilo C<2>a C<10>sustituidos o sin sustituir. Son particularmente adecuados 0((CH2)n0)mCH3, 0(CH2)nOCH3, 0(CH2)nNH2, 0(CH2)nCH3, 0(CH2)n0NH2 y 0(CH2)n0N((CH2)nCH3)2, donde n y m son de 1 a aproximadamente 10. Otros polinucleótidos adecuados comprenden un grupo sustituyente de azúcar seleccionado de: alquilo inferior C<1>a C<10>, alquilo inferior sustituido, alquenilo, alquinilo, aleadlo, aralquilo, O-alcarilo u O-aralquilo, SH, SCHa, OCN, Cl, Br, CN, CFa, OCF3, SOCH3, S 02CH3, ONO<2>, N 02, Na, NH2, heterocicloalquilo, heterocicloalcarilo, aminoalquilamino, polialquilamino, sililo sustituido, un grupo de escisión de ARN, un grupo indicador, un intercalador, un grupo para mejorar las propiedades farmacocinéticas de un oligonucleótido o un grupo para mejorar las propiedades farmacodinámicas de un oligonucleótido, y otros sustituyentes que tienen propiedades similares. Una modificación adecuada incluye 2'-metoxietoxi (2'-0-CH2 CH2OCH3, también conocido como 2'-0-(2-metoxietilo) O 2'-MOE) (Martin y col.,Helv. Chim. Acta,1995, 78, 486-504) es decir, un grupo alcoxialcoxi. Una modificación adecuada adicional incluye 2'-dimetilaminooxietoxi, es decir, un grupo 0(CH2)20N(CH3)2, también conocido como 2'-DMAOE, como se describe en los ejemplos a continuación en la presente memoria, y 2'-dimetilaminoetoxietoxi (también conocido en la técnica como 2'-0-dimetil-amino-etoxi-etilo o 2'-DMAEOE), es decir, 2'-0-CH2-0-CH2-N(CH3)2.
Otros grupos sustituyentes de azúcar adecuados incluyen metoxi (-O-CH<3>), aminopropoxi ( - 0 CH<2>CH2 CH<2>NH<2>), alilo (-CH<2>-CH=CH<2>), -O-alilo (--0--CH2-CH=CH2) y fluoro (F). Los grupos sustituyentes de 2'-azúcar pueden estar en la posición arabino (u) o la posición ribo (abajo). Una modificación de 2-arabino adecuada es 2'-F. También pueden hacerse modificaciones similares en otras posiciones del compuesto oligomérico, particularmente la posición 3' del azúcar en el nucleósido terminal 3' o en oligonucleótidos unidos 2'-5' y la posición 5' del nucleótido terminal 5'. Los compuestos oligoméricos también pueden tener miméticos de azúcar tales como restos ciclobutilo en lugar del azúcar pentofuranosilo.
Modificaciones y sustituciones de bases
Un ARN de localización específica de ADN de un sujeto también puede incluir modificaciones o sustituciones de nucleobases (frecuentemente denominadas en la técnica simplemente “ bases” ). Como se usa en la presente memoria, las nucleobases “ sin modificar” o “ naturales” incluyen las bases de purina adenina (A) y guanina (G), y las bases de pirimidina timina (T), citosina (C) y uracilo (U). Las nucleobases modificadas incluyen otras nucleobases sintéticas y naturales tales como 5-metilcitosina (5-me-C), 5-hidroximetil citosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, derivados de 6-metilo y otros alquilos de adenina y guanina, derivados de 2-propilo y otros alquilos de adenina y guanina, 2-tiouracilo, 2-tiotimina y 2-tiocitosina, 5-halodiacilo y citosina, 5-propinilo (-C=C-CH3) uracilo y citosina y otros derivados de alquinilo de bases de pirimidina, 6-azo uracilo, citosina y timina, 5-uracilo (pseudouracilo), 4-tiouracilo, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquil, 8-hidroxil adeninas y guaninas y otras 8-sustituidas, 5-halo particularmente 5-bromo, 5-trifluorometil uracilos y citosinas y otros 5-sustituidos, 7-metilguanina y 7-metiladenina, 2-F-adenina, 2-aminoadenina, 8-azaguanina y 8-azaadenina, 7-desazaguanina y 7-desazaadenina y 3-desazaguanina
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y 3-desazaadenina. Las nucleobases modificadas adicionales incluyen pirimidinas tricíclicas tales como fenoxazina citidina (1H-pirimido(5,4-b)(1,4)benzoxazin-2(3H)-ona), fenotiazina citidina (1H-pirimido(5,4-b)(1,4)benzotiazin-2(3H)-ona), abrazaderas G tales como fenoxazina citidina sustituida (p. ej., 9-(2-aminoetoxi)-H-pirimido(5,4-(b) (1,4)benzoxazin-2(3H)-ona), carbazol citidina (2H-pirimido (4,5-b)indol-2-ona), piridoindol citidina (H-pirido(3',2':4,5)pirrolo(2,3-d)pirimidin-2-ona).
Los restos de base heterocíclicos también pueden incluir aquellos en los que la base de purina o pirimidina se reemplaza con otros heterociclos, por ejemplo 7-desaza-adenina, 7-desazaguanosina, 2-aminopiridina y 2-piridona. Otras nucleobases incluyen aquellas descritas en la patente US-3.687.808, aquellas descritas enThe Consese Encydopedia Of Polymer Science and Engineering,páginas 858-859, Kroschwitz, J. I., ed. John Wiley & Sons, 1990, aquellas descritas en Inglsch y col.,Angewandte Chemie,Edición internacional, 1991, 30, 613, y aquellas descritas por Sanghvi, Y. S., Capítulo 15,Antisense Research and Applications,páginas 289-302, Crooke, S. T. y Lebleu, B., ed., CRC Press, 1993. Algunas de estas nucleobases son útiles para aumentar la afinidad de unión de un compuesto oligomérico. Estas incluyen pirimidinas 5-sustituidas, 6-azapirimidinas y purinas N-2, N-6 y 0-6 sustituidas, que incluyen 2-aminopropiladenina, 5-propiniluracilo y 5-propinilcitosina. Se ha demostrado que las sustituciones de 5-metilcitosina aumentan la estabilidad del dúplex de ácido nucleico en 0,6-1,2 °C. (Sanghvi y col., eds.,Antisense Research and Applications,CRC Press, Boca Ratón, 1993, págs. 276-278) y son sustituciones de bases adecuadas, p. ej., cuando se combinan con modificaciones de 2'-0-metoxietil azúcar.
Conjugados
Otra posible modificación de un ARN de localización específica de ADN de un sujeto implica unir químicamente al polinucleótido una o más restos o conjugados que potencian la actividad, la distribución celular o la captación celular del oligonucleótido. Estos restos o conjugados pueden incluir grupos conjugados unidos covalentemente a grupos funcionales tales como grupos hidroxilo primarios o secundarios. Los grupos conjugados incluyen, pero no se limitan a, intercaladores, moléculas indicadoras, poliaminas, poliamidas, polietilenglicoles, poliéteres, grupos que potencian las propiedades farmacodinámicas de los oligómeros y grupos que potencian las propiedades farmacocinéticas de los oligómeros. Los grupos conjugados adecuados incluyen, pero no se limitan a, colesteroles, lípidos, fosfolípidos, biotina, fenazina, folato, fenantridina, antraquinona, acridina, fluoresceínas, rodaminas, cumarinas y colorantes. Los grupos que potencian las propiedades farmacodinámicas incluyen grupos que potencian la absorción, potencian la resistencia a la degradación y/o refuerzan la hibridación específica de secuencia con el ácido nucleico diana. Los grupos que potencian las propiedades farmacocinéticas incluyen grupos que mejoran la absorción, distribución, metabolismo o excreción de un ácido nucleico en cuestión.
Los restos conjugados incluyen, pero no se limitan a, restos lipidíeos tales como un resto de colesterol (Letsinger y col.,Proc. Nati. Acad. Sci. USA,1989, 86, 6553-6556), ácido cólico (Manoharan y col.,Bioorg. Med. Chem. Let.,1994, 4, 1053-1060), un tioéter, p. ej., hexil-S-tritiltiol (Manoharan y col.,Ann. N.Y. Acad. Sci.,1992, 660, 306 309; Manoharan y col.,Bioorg. Med. Chem. Let.,1993, 3, 2765-2770), un tiocolesterol (Oberhausery col.,Nucí. Acids Res.,1992,20, 533-538), una cadena alifática, p. ej., restos dodecanodiol o undecilo (Saison-Behmoaras y col.,EMBO J.,1991, 10, 1111-1118; Kabanov y col.,FEBS Lett.,1990, 259, 327-330; Svinarchuk y col.,Biochimie,1993, 75, 49 54), un fosfolípido, p. ej., di-hexadecil-rac-glicerol o trietilamonio 1,2-di-0-hexadecil-rac-glicero-3-H-fosfonato (Manoharan y col.,Tetrahedron Lett.,1995, 36, 3651-3654; Shea y col.,Nucí. Acids Res.,1990, 18, 3777-3783), una poliamina o una cadena de polietilenglicol (Manoharan y col.,Nucleosides & Nucleotides,1995, 14, 969-973) o ácido adamantano acético (Manoharan y col.,Tetrahedron Lett.,1995, 36, 3651-3654), un resto palmitilo (Mishra y col.,Biochim. Biophys. Acta,1995, 1264, 229-237) o una porción de octadecilamina o hexilamino-carbonil-oxicolesterol (Crooke y col.,J. Pharmacol. Exp. Ther.,1996, 277, 923-937.\
Un conjugado puede incluir un “dominio de transducción de proteínas” o PTD (también conocido como un péptido de penetración de células CPP), que puede referirse a un polipéptido, polinucleótido, carbohidrato o compuesto orgánico 0 inorgánico que facilita atravesar una bicapa lipídica, micela, membrana celular, membrana de orgánulo, o membrana de vesícula. Un PTD unido a otra molécula, que puede variar desde una pequeña molécula polar a una macromolécula grande y/o una nanopartícula, facilita que la molécula atraviese una membrana, por ejemplo, que va desde el espacio extracelular hasta el espacio intracelular, o del citosol hacia dentro de un orgánulo. En algunas formas de realización, un PTD se une covalentemente a un ácido nucleico (p. ej., un ARN de localización específica de ADN, un polinucleótido que codifica un ARN de localización específica de ADN, etc.). Los PTD ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, un dominio de transducción de proteínas de undecapéptido mínimo (correspondiente a los residuos 47-57 de TAT de VIH-1 que comprende YGRKKRRQRRR; Id. de sec. n.° 264); una secuencia de poliarginina que comprende un número de argininas suficientes para dirigir la entrada en una célula (p. ej., 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o 10-50 argininas); un dominio VP22 (Zender y col. (2002)Cáncer Gene Ther.9(6):489-96); un dominio de transducción de proteínasDrosophila Antennapedia(Noguchi y col. (2003) Diabetes 52(7): 1732-1737); un péptido de calcitonina humana truncada (Trehin y col. (2004)Pharm.Research 21:1248-1256); polilisina (Wender y col. (2000)Proc. Nati. Acad. Sci. USA97:13003-13008); RRQRRTSKLMKR (Id. de sec. n.° 265); Transportano GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL (Id. de sec. n.° 266); KALAWEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKCEA (Id. de sec. n.° 267); y RQIKIWFQNRRMKWKK (Id. de sec. n.° 268). Los PTD ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, YGRKKRRQRRR (Id. de sec. n.° 264), RKKRRQRRR (Id. de sec. n.° 269); un homopolímero de arginina de 3 residuos de arginina a 50 residuos de arginina; las secuencias de aminoácidos del dominio PTD ilustrativas incluyen, pero no se limitan a, cualquiera de las siguientes: YGRKKRRQRRR
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(Id. de sec. n.° 264); RKKRRQRR (Id. de sec. n.° 270); YARAAARQARA (Id. de sec. n.° 271); THRLPRRRRRR (Id. de sec. n.° 272); y GGRRARRRRRR (Id. de sec. n.° 273). En algunas realizaciones, el PTD es un CPP activable (ACPP) (Aguileray col.(2009)Integr Bioi (Camb)Junio; 1(5-6): 371-381). Los ACPP comprenden un CPP policatiónico (p. ej., Arg9 o “ R9” ) conectado a través de un enlazador escindible a un polianión coincidente (p. ej., Glu9 o “ E9” ), lo que reduce la carga neta a casi cero y, por lo tanto, inhibe la adhesión y absorción en las células. Tras la escisión del enlazador, el polianión se libera, desenmascarando localmente la poliarginina y su capacidad de adhesión inherente, por lo tanto “ activando” el ACPP para atravesar la membrana.
ARN de localización específica de ADN ilustrativos
En algunas realizaciones, un ARN de localización específica de ADN adecuado comprende dos moléculas de polinucleótidos de ARN separadas. La primera de las dos moléculas de polinucleótidos de ARN separadas (el ARN activador) comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 65 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o el 100 % de identidad de secuencia de nucleótidos sobre un tramo de al menos 8 nucleótidos contiguos con una cualquiera de las secuencias de nucleótidos expuestas en las Id. de sec. n.° 431-562, o complementos de las mismas. La segunda de las dos moléculas de polinucleótidos de ARN separadas (el ARN localizador específico) comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 65 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o el 100 % de identidad de secuencia de nucleótidos sobre un tramo de al menos 8 nucleótidos contiguos con una cualquiera de las secuencias de nucleótidos expuestas en las Id. de sec. n.° 563-679, o complementos de las mismas.
En algunas realizaciones, un ARN de localización específica de ADN adecuado es un polinucleótido de ARN único y comprende una primera secuencia de nucleótidos que tiene al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 65 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o el 100 % de identidad de secuencia de nucleótidos sobre un tramo de al menos 8 nucleótidos contiguos con una cualquiera de las secuencias de nucleótidos expuestas en las Id. de sec. n.° 431-562 y una segunda secuencia de nucleótidos que tiene al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 65 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o el 100 % de identidad de secuencia de nucleótidos en un tramo de al menos 8 nucleótidos contiguos con una cualquiera de las secuencias de nucleótidos expuestas en las Id. de sec. n.° 463-679.
En algunas realizaciones, el ARN de localización específica de ADN es un ARN de localización específica de ADN de molécula doble y el ARN localizador específico comprende la secuencia 5'GUUUUAGAGCUA-3' (Id. de sec. n.° 679) unida en su extremo 5' a un tramo de nucleótidos que son complementarios a un ADN diana. En algunas realizaciones, el ARN de localización específica de ADN es un ARN de localización específica de ADN de molécula doble y el ARN activador comprende la secuencia 5' UAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCG-3' (Id. de sec. n.° //).
En algunas realizaciones, el ARN de localización específica de ADN es un ARN de localización específica de ADN de molécula única y comprende la secuencia 5'-GUUUUAGAGCUA-enlazador-UAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCG-3' unido en su extremo 5' a un tramo de nucleótidos que son complementarios a un ADN diana (donde “ enlazador” indica cualquier secuencia de nucleótidos enlazadora que puede comprender cualquier secuencia de nucleótidos) (Id. de sec. n.° //). Otros ARN de localización específica de ADN de molécula única ilustrativos incluyen los expuestos en las Id. de sec. n.° 680-682.
Ácidos nucleicos que codifican ARN de localización específica de ADN de un sujeto
La presente descripción proporciona un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un ARN de localización específica de ADN de molécula única de un sujeto. En algunas formas de realización, un ácido nucleico que codifica ARN de localización específica de ADN de molécula única de un sujeto es un vector de expresión, p. ej., un vector de expresión recombinante.
El vector de expresión recombinante puede ser un constructo vírico, p. ej., un constructo de virus adenoasociado recombinante (véase, p. ej., la patente estadounidense n.° 7.078.387), un constructo adenovírico recombinante, un constructo lentivírico recombinante, un constructo retrovírico recombinante, etc.
Los vectores de expresión adecuados incluyen, pero no se limitan a, vectores víricos (p. ej., vectores víricos basados en virus vaccinia; poliovirus; adenovirus (véase, p. ej., Li y col.,Invest Optalmol Vis Sci35:25432549, 1994; Borras y col.,Gene Ther6:515 524, 1999; Li y Davidson,PNAS92:7700 7704, 1995; Sakamoto y col.,H Gene Ther5:1088
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1097, 1999; los documentos WO 94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 y WO 95/00655); virus adenoasociado (véase, p. ej., Ali y col.,Hum Gene Ther9:81 86, 1998, Flannnery y col.,PNAS94:69166921, 1997; Bennett y col.,Invest Optalmol VisSe/'38:28572863, 1997; Jomary y col.,Gene Ther4:683690, 1997, Rolling y col.,Hum Gene Ther10:641 648, 1999; Ali y col.,Hum Mol Genet5:591 594, 1996; Srivastava en el documento WO 93/09239, Samulski y col.,J. Vir.(1989) 63:3822-3828; Mendelson y col.,Viro!.(1988) 166:154-165; y Flotte y col.,PNAS(1993) 90:10613-10617); SV40; virus del herpes simple; virus de inmunodeficiencia humana (véase, p. ej., Miyoshi y col.,PNAS94:10319 23, 1997; Takahashi y col.,J Virol73:7812 7816, 1999); un vector retrovírico (p. ej., virus de la leucemia murina, virus de necrosis del bazo y vectores derivados de retrovirus tales como virus del sarcoma de Rous, virus del sarcoma de Harvey, virus de la leucosis aviar, un lentivirus, virus de inmunodeficiencia humana, virus del sarcoma mieloproliterativo y virus tumoral mamario); y similares.
Los expertos en la técnica conocen numerosos vectores de expresión adecuados, y muchos están disponibles en el mercado. Los siguientes vectores se proporcionan a modo de ejemplo; para células hospedadoras eucariotas, pXT1, pSG5 (Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG y pSVLSV40 (Pharmacia). Sin embargo, puede usarse cualquier otro vector siempre que sea compatible con la célula hospedadora.
Dependiendo del sistema hospedador/vector utilizado, puede usarse cualquiera de un número de elementos de control de transcripción y traducción adecuados, incluyendo promotores constitutivos e inducibles, elementos potenciadores de la transcripción, terminadores de la transcripción, etc., en el vector de expresión (véase, p. ej., Bitter y col. (1987)Methods in Enzymology,153:516-544).
En algunas formas de realización, una secuencia de nucleótidos que codifica un ARN de localización específica de ADN de molécula única está unida operativamente a un elemento de control, por ejemplo, un elemento de control de la transcripción, tal como un promotor. El elemento de control de la transcripción puede ser funcional en una célula eucariota, p. ej., una célula de mamífero; o una célula procariota (p. ej., célula bacteriana o de arquea). En algunas formas de realización, una secuencia de nucleótidos que codifica un ARN de localización específica de ADN de molécula única está unida operativamente a múltiples elementos de control que permiten la expresión de la secuencia de nucleótidos que codifica un ARN de localización específica de ADN de molécula única en células procarióticas y eucarióticas.
Los ejemplos no limitativos de promotores eucariotas adecuados (promotores funcionales en una célula eucariota) incluyen aquellos del citomegalovirus (CMV) inmediato temprano, la timidina quinasa del virus del herpes simple (VHS), el SV40 temprano y tardío, las repeticiones terminales largas (LTR) de retrovirus y la metalotioneína-l de ratón. La selección del vector y promotor adecuados está dentro del nivel de experiencia ordinaria en la técnica. El vector de expresión también puede contener un sitio de unión al ribosoma para el inicio de la traducción y un terminador de la transcripción. El vector de expresión también puede incluir secuencias adecuadas para amplificar la expresión. El vector de expresión también puede incluir secuencias de nucleótidos que codifican marcadores de proteínas (p. ej., marcador 6xHis, marcador de hemaglutinina, proteína fluorescente verde, etc.) que se fusionan con el polipéptido modificador dirigido al sitio, dando como resultado un polipéptido quimérico.
En algunas formas de realización, una secuencia de nucleótidos que codifica ARN de localización específica de ADN de molécula única está unida operativamente a un promotor inducible. En algunas formas de realización, una secuencia de nucleótidos que codifica ARN de localización específica de ADN de molécula única está unida operativamente a un promotor constitutivo.
Se conocen en la técnica métodos para introducir un ácido nucleico en una célula hospedadora, y puede usarse cualquier método conocido para introducir un ácido nucleico (p. ej., un constructo de expresión) en una célula. Los métodos adecuados incluyen, p. ej., infección vírica o por bacteriófagos, transfección, conjugación, fusión de protoplastos, lipofección, electroporación, precipitación con fosfato de calcio, transfección mediada por polietilenimina (PEI), transfección mediada por DEAE-dextrano, transfección mediada por liposomas, tecnología de cañón de partículas, precipitación con fosfato de calcio, microinyección directa, administración de ácido nucleico mediada por nanopartículas (véase, p. ej., Panyam y col.,Adv Drug Deliv Rev.13 de septiembre de 2012. piii: S0169-409X( 12)00283-9. doi: 10.1016/j.addr.2012.09.023) y similares.
Como se ha descrito anteriormente, un ARN de localización específica de ADN de un sujeto y un polipéptido Cas9 de origen natural forman un complejo. El ARN de localización específica de ADN proporciona una especificidad diana al complejo al comprender una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de un ADN diana. El polipéptido Cas9 de origen natural del complejo proporciona la actividad específica de sitio. Un complejo de un sujeto modifica un ADN diana, lo que conduce a la escisión del ADN. El ADN diana puede ser, por ejemplo, ADN cromosómico en célulasin vitro,etc.
En algunos casos, el polipéptido modificador dirigido al sitio presenta actividad nucleasa que escinde el ADN diana en una secuencia de ADN diana definida por la región de complementariedad entre el ARN de localización específica de ADN y el ADN diana. El polipéptido modificador dirigido al sitio es un polipéptido Cas9 de origen natural, y la escisión específica de sitio del ADN diana se produce en ubicaciones determinadas por (i) la complementariedad de emparejamiento de bases entre el ARN de localización específica de ADN y el ADN diana; y (ii) un motivo corto
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[denominado motivo adyacente protoespaciador (PAM)] en el ADN diana. En algunas realizaciones (p. ej., cuando se usa Cas9 de S.pyogenes,o un Cas9 estrechamente relacionado (véanse las Id. de sec. n.° 1-256 y 795-1346), la secuencia de PAM de la cadena no complementaria es 5'-XGG-3', donde X es cualquier nucleótido de ADN y X está inmediatamente en 3' de la secuencia diana de la cadena no complementaria del ADN diana (véase la Figura 10). Como tal, la secuencia de PAM de la cadena complementaria es 5'-CCY-3', donde Y es cualquier nucleótido de ADN e Y está inmediatamente en 5' de la secuencia diana de la cadena complementaria del ADN diana (véase la Figura 10 donde el PAM de la cadena no complementaria es 5'-GGG-3' y el PAM de la cadena complementaria es 5'-CCC-3'). En algunas de dichas realizaciones, X e Y pueden ser complementarios y el par de bases X-Y puede ser cualquier par de bases (p. ej., X=C e Y=G; X=G e Y=C; X=A e Y=T, X=T e Y=A).
En algunos casos, diferentes proteínas Cas9 (es decir, proteínas Cas9 de diversas especies) pueden ser ventajosas para su uso en los diversos métodos proporcionados para capitalizar diversas características enzimáticas de las diferentes proteínas Cas9 (p. ej., para diferentes preferencias de secuencia de PAM; para una actividad enzimática aumentada o disminuida; para un nivel aumentado o disminuido de toxicidad celular; para cambiar el equilibrio entre NHEJ, la reparación dirigida por homología, las roturas monocatenarias, las roturas bicatenarias, etc.). Las proteínas Cas9 de diversas especies (véanse las Id. de sec. n.° 1-256 y 795-1346) pueden requerir diferentes secuencias de PAM en el ADN diana. Por lo tanto, para una proteína Cas9 particular de elección, el requisito de secuencia de PAM puede ser diferente de la secuencia 5'-XGG-3' descrita anteriormente.
En la presente memoria se han identificado muchos ortólogos de Cas9 de una amplia diversidad de especies y las proteínas comparten solamente unos pocos aminoácidos idénticos. Todos los ortólogos de Cas9 identificados tienen la misma arquitectura de dominio con un dominio de endonucleasa HNH central y un dominio RuvC/RNasaFI dividido (véanse las Figuras 3A, 3B, Figura 5 y Tabla 1). Las proteínas Cas9 comparten 4 motivos clave con una arquitectura conservada. Los motivos 1,2 y 4 son motivos similares a RuvC, mientras que el motivo 3 es un motivo HNFI.
La actividad nucleasa escinde el ADN diana para producir roturas bicatenarias. Después, estas roturas son reparadas por la célula en una de dos formas: unión de extremos no homólogos y reparación dirigida por homología (Figura 2). En la unión de extremos no homólogos (NFIEJ), las roturas bicatenarias se reparan mediante ligadura directa de los extremos de rotura entre sí. Como tal, no se inserta ningún nuevo material de ácido nucleico en el sitio, aunque puede perderse algo de material de ácido nucleico, dando como resultado una deleción. En la reparación dirigida por homología, se usa un polinucleótido donante con homología con la secuencia de ADN diana escindida como molde para la reparación de la secuencia de ADN diana escindida, dando como resultado la transferencia de información genética del polinucleótido donante al ADN diana. Como tal, puede insertarse/copiarse nuevo material de ácido nucleico en el sitio. En algunos casos, un ADN diana se pone en contacto con un polinucleótido donante en cuestión. Las modificaciones del ADN diana debidas a NFIEJ y/o la reparación dirigida por homología conducen, por ejemplo, a la corrección génica, el reemplazo génico, el mareaje de genes, la inserción transgénica, la deleción de nucleótidos, la alteración génica, la mutación génica, etc.
En consecuencia, la escisión de ADN por un polipéptido Cas9 de origen natural puede usarse para delecionar (eliminar) material de ácido nucleico de una secuencia de ADN diana (p. ej., para alterar un gen que hace que las células sean susceptibles a la infección [p. ej., el gen CCR5 o CXCR4, que hace que las células T sean susceptibles a la infección por VIH], para eliminar de las neuronas las secuencias de repetición de trinucleótidos que provocan enfermedad, para crear inactivaciones de genes y mutaciones como modelos de enfermedad en investigación, etc.) escindiendo la secuencia de ADN diana y permitiendo que la célula repare la secuencia en ausencia de un polinucleótido donante proporcionado exógenamente.
En algunas formas de realización, un polipéptido Cas9 de origen natural de un sujeto puede ser optimizado por codones. Este tipo de optimización es conocido en la técnica e implica la mutación de ADN derivado de extraño para imitar las preferencias de codones del organismo o la célula hospedadores previstos mientras que codifica la misma proteína. Por lo tanto, los codones se cambian, pero la proteína codificada permanece sin cambios. Por ejemplo, si la célula diana prevista era una célula humana, un Cas9 con codones optimizados (o variante, p. ej., variante enzimáticamente inactiva) sería un polipéptido modificador dirigido al sitio adecuado (véase la Id. de sec. n.° 256 para consultar un ejemplo). Cualquier polipéptido modificador adecuado dirigido a un sitio (p. ej., cualquier Cas9 de origen natural tal como cualquiera de las secuencias expuestas en las Id. de sec. n.° 1-256 y 795-1346) puede optimizarse con codones. Como otro ejemplo no limitativo, si la célula hospedadora prevista era una célula de ratón, entonces un Cas9 (o variante, p. ej., variante inactiva enzimáticamente) con codones optimizados sería un polipéptido modificador dirigido al sitio adecuado. Aunque no se requiere optimización de codones, es aceptable y puede ser preferible en determinados casos.
Ácidos nucleicos que codifican ARN de localización específica de ADN de molécula única de un sujeto
En algunas formas de realización, un método en un sujeto implica poner en contacto un ADN diana o introducir en una célula (o una población de células) uno o más ácidos nucleicos que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican ARN de localización específica de ADN de molécula única. Los ácidos nucleicos adecuados que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican ARN de localización específica de ADN de molécula única incluyen vectores
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de expresión, donde un vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un ARN de localización específica de ADN de molécula única es un “vector de expresión recombinante” .
En algunas formas de realización, el vector de expresión recombinante es un constructo vírico, p. ej., un constructo de virus adenoasociado recombinante (véase, p. ej., la patente estadounidense n.° 7.078.387), un constructo adenovírico recombinante, un constructo lentivírico recombinante, etc.
Los vectores de expresión adecuados incluyen, pero no se limitan a, vectores víricos (p. ej., vectores víricos basados en virus vaccinia; poliovirus; adenovirus (véase, p. ej., Li y col.,Invest Optalmol Vis Sci35:25432549, 1994; Borras y col.,Gene Ther6:515 524, 1999; Li y Davidson,PNAS92:7700 7704, 1995; Sakamoto y col.,H Gene Ther5:1088 1097, 1999; los documentos WO 94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 y WO 95/00655); virus adenoasociado (véase, p. ej., Ali y col.,Hum Gene Ther9:81 86, 1998, Flannnery y col.,PNAS94:69166921, 1997; Bennett y col.,Invest Optalmol Vis Sci38:28572863, 1997; Jomaryycol.,Gene77?er4:683690, 1997, Rolling y col.,Hum Gene Ther10:641 648, 1999; Ali y col.,Hum Mol Genet5:591 594, 1996; Srivastava en el documento WO 93/09239, Samulski y col.,J. Vir.(1989) 63:3822-3828; Mendelson y col.,Viro!.(1988) 166:154-165; y Flotte y col.,PNAS(1993) 90:10613-10617); SV40; virus del herpes simple; virus de inmunodeficiencia humana (véase, p. ej., Miyoshi y col.,PNAS94:10319 23, 1997; Takahashi y col.,J Virol73:7812 7816, 1999); un vector retrovírico (p. ej., virus de la leucemia murina, virus de necrosis del bazo y vectores derivados de retrovirus tales como virus del sarcoma de Rous, virus del sarcoma de Harvey, virus de la leucosis aviar, un lentivirus, virus de inmunodeficiencia humana, virus del sarcoma mieloproliferativo y virus tumoral mamario); y similares.
Los expertos en la técnica conocen numerosos vectores de expresión adecuados, y muchos están disponibles en el mercado. Los siguientes vectores se proporcionan a modo de ejemplo; para células hospedadoras eucariotas, pXT1, pSG5 (Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG y pSVLSV40 (Pharmacia). Sin embargo, puede usarse cualquier otro vector siempre que sea compatible con la célula hospedadora.
En algunas formas de realización, una secuencia de nucleótidos que codifica un ARN de localización específica de ADN de molécula única está unida operativamente a un elemento de control, por ejemplo, un elemento de control de la transcripción, tal como un promotor. El elemento de control transcripcional puede ser funcional en una célula eucariota, p. ej., una célula de mamífero o una célula procariota (p. ej., célula bacteriana o de arquea). En algunas formas de realización, una secuencia de nucleótidos que codifica un ARN de localización específica de ADN de molécula única está unida operativamente a múltiples elementos de control que permiten la expresión de la secuencia de nucleótidos que codifica un ARN de localización específica de ADN y/o un polipéptido modificador dirigido al sitio tanto en células procarióticas como eucarióticas.
Dependiendo del sistema hospedador/vector utilizado, puede usarse cualquiera de un número de elementos de control de transcripción y traducción adecuados, incluyendo promotores constitutivos e inducibles, elementos potenciadores de la transcripción, terminadores de la transcripción, etc., en el vector de expresión (p. ej., promotor U6, promotor FU, etc.; véase anteriormente) (véase, p. ej., Bittery col. (1987)Methods in Enzymology,153:516-544).
Los nucleótidos que codifican un ARN de localización específica de ADN de molécula única (introducido como ADN) pueden proporcionarse a las células utilizando técnicas de transfección bien desarrolladas; véase, p. ej., Angel y Yanik (2010)PLoS ONE5(7): e11756, y los siguientes productos comercialmente disponibles: reactivos TransMessenger® de Qiagen, Kit de transfección de ARN Stemfect™ de Stemgent y Kit de transfección de ARNm-TransIT® de Mirus Bio LLC. Véase también Beumery col. (2008)Efficient gene targeting in Drosophila bydirect embryo injection with zinc-finger nucleases.PNAS 105(50): 19821-19826. Alternativamente, los ácidos nucleicos que codifican ARN de localización específica de ADN de molécula única pueden proporcionarse en vectores de ADN. Hay disponibles muchos vectores, p. ej., plásmidos, cósmidos, minicírculos, fagos, virus, etc., útiles para transferir ácidos nucleicos a células diana. Los vectores que comprenden el ácido nucleico o ácidos nucleicos pueden mantenerse episómicamente, p. ej., como plásmidos, ADN en minicírculo, virus tales como citomegalovirus, adenovirus, etc., o pueden integrarse en el genoma de la célula diana, a través de recombinación homologa o integración aleatoria, por ejemplo vectores derivados de retrovirus tales como MMLV, VIH-1, ALV, etc.
Los vectores pueden proporcionarse directamente a las células en cuestión. En otras palabras, las células se ponen en contacto con vectores que comprenden el ácido nucleico que codifica el ARN de localización específica de ADN de molécula única, de tal modo que las células captan los vectores. Se conocen bien en la técnica métodos para poner en contacto células con vectores de ácido nucleico que son plásmidos, que incluyen electroporación, transfección con cloruro de calcio, microinyección y lipofección. Para la administración del vector viral, las células se ponen en contacto con partículas víricas que comprenden el ácido nucleico que codifica un ARN de localización específica de ADN de molécula única. Los retrovirus, por ejemplo, los lentivirus, son particularmente adecuados para el método de la invención. Los vectores retrovíricos utilizados habitualmente son “ defectuosos” , es decir, incapaces de producir proteínas víricas requeridas para una infección productiva. Más bien, la replicación del vector requiere el crecimiento en una línea celular de empaquetamiento. Para generar partículas víricas que comprenden ácidos nucleicos de interés, los ácidos nucleicos retrovíricos que comprenden el ácido nucleico se empaquetan en cápsides víricas mediante una línea celular de empaquetamiento. Diferentes líneas celulares de empaquetamiento proporcionan una proteína de envoltura diferente (ecotrópica, anfotrópica o xenotrópica) que ha de incorporarse en la cápside, determinando esta
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proteína de envoltura la especificidad de la partícula vírica para las células (ecotrópica para murino y rata; anfotrópica para la mayoría de los tipos celulares de mamíferos, incluyendo ser humano, perro y ratón; y xenotrópica para la mayoría de los tipos celulares de mamífero, excepto las células de murino). La línea celular de empaquetamiento adecuada puede usarse para garantizar que las células sean localizadas específicamente por las partículas víricas empaquetadas. Se conocen bien en la técnica métodos para introducir los vectores retrovíricos que comprenden el ácido nucleico que codifica los factores de reprogramación en las líneas celulares de empaquetamiento y para recoger las partículas víricas que son generadas por las líneas de empaquetamiento. Los ácidos nucleicos también pueden introducirse mediante microinyección directa (p. ej., inyección de ARN en un embrión de pez cebra).
Los vectores usados para proporcionar los ácidos nucleicos que codifican ARN de localización específica de ADN de molécula única a las células del sujeto comprenden habitualmente promotores adecuados para impulsar la expresión, es decir, la activación transcripcional, del ácido nucleico de interés. En otras palabras, el ácido nucleico de interés estará unido operativamente a un promotor. Esto puede incluir promotores que actúan de forma ubicua, por ejemplo, el promotor de CMV-(3-actina, o promotores inducibles, tales como promotores que son activos en poblaciones celulares particulares o que responden a la presencia de fármacos tales como tetraciclina. Mediante la activación de la transcripción, se prevé que la transcripción aumentará por encima de los niveles básales en la célula diana al menos aproximadamente 10 veces, al menos aproximadamente 100 veces, más usualmente al menos aproximadamente 1000 veces. Además, los vectores utilizados para proporcionar ARN de localización específica de ADN de molécula única a las células del sujeto pueden incluir secuencias de ácidos nucleicos que codifican marcadores seleccionables en las células diana, a fin de identificar las células que han absorbido el ARN de localización específica de ADN de molécula única.
Puede también usarse un ARN de localización específica de ADN de un sujeto para contactar con el ADN o introducirse en las células como ARN. Se conocen en la técnica métodos para introducir ARN en células y pueden incluir, por ejemplo, inyección directa, transfección o cualquier otro método utilizado para la introducción de ADN.
En la presente invención también se incluyen ARN de localización específica de ADN que se han modificado usando técnicas de biología molecular ordinarias y química de síntesis para cambiar la especificidad de la(s) secuencia(s) diana, para optimizar las propiedades de solubilidad o para hacerlas más adecuadas como agente terapéutico.
La endonucleasa Cas9 de origen natural también puede aislarse y purificarse con arreglo a los métodos convencionales de síntesis recombinante. Puede prepararse un Usado del hospedador de expresión y el lisado se purifica usando HPLC, cromatografía de exclusión, electroforesis en gel, cromatografía de afinidad u otra técnica de purificación. En la mayoría de los casos, las composiciones que se usan comprenderán al menos el 20 % en peso del producto deseado, más usualmente al menos aproximadamente el 75 % en peso, preferiblemente al menos aproximadamente el 95 % en peso, y con fines terapéuticos, usualmente al menos aproximadamente el 99,5 % en peso, con respecto a los contaminantes relacionados con el método de preparación del producto y su purificación. Usualmente, los porcentajes se basarán en la proteína total.
Para inducir la escisión y recombinación de ADN, o cualquier modificación deseada a un ADN diana, el ARN de localización específica de ADN y/o la endonucleasa Cas9 de origen natural y/o el polinucleótido donante, ya sea que se introduzcan como ácidos nucleicos o polipéptidos, se proporcionan a las células durante aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 24 horas, p. ej., 1 hora, 1,5 horas, 2 horas, 2,5 horas, 3 horas, 3,5 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 12 horas, 16 horas, 18 horas, 20 horas, o cualquier otro período de aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 24 horas, que puede repetirse con una frecuencia de aproximadamente cada día a aproximadamente cada 4 días, p. ej., cada 1,5 días, cada 2 días, cada 3 días, o cualquier otra frecuencia de aproximadamente cada día a aproximadamente cada cuatro días. El agente o agentes pueden proporcionarse a las células una o más veces, p. ej., una vez, dos veces, tres veces o más de tres veces, y las células se dejan incubar con el agente o agentes durante una cantidad de tiempo después de cada evento de contacto, p. ej., 16-24 horas, tiempo después del cual el medio se reemplaza por medio fresco y las células se cultivan adicionalmente.
En los casos en los que se proporcionan dos o más complejos de localización específica diferentes a la célula (p. ej., dos ARN de localización específica de ADN diferentes que son complementarios a diferentes secuencias dentro del mismo o diferente ADN diana), los complejos pueden proporcionarse simultáneamente (p. ej., como dos polipéptidos y/o ácidos nucleicos), o suministrarse simultáneamente. Alternativamente, pueden proporcionarse consecutivamente, p. ej., proporcionándose en primer lugar el complejo de localización específica, seguido del segundo complejo de localización específica, etc. o viceversa.
Típicamente, se proporciona una cantidad eficaz del ARN de localización específica de ADN y/o endonucleasa Cas9 de origen natural y/o polipéptido donante al ADN o células diana para inducir la escisión. Una cantidad eficaz del ARN de localización específica de ADN y/o endonucleasa Cas9 de origen natural y/o polinucleótido donante es la cantidad para inducir un aumento de 2 veces o más en la cantidad de modificación diana observada entre dos secuencias homologas con respecto a un control negativo, p. ej., una célula en contacto con un vector vacío o polipéptido irrelevante. Es decir, una cantidad o dosis eficaz del ARN de localización específica de ADN y/o endonucleasa Cas9 de origen natural y/o polinucleótido donante inducirán un aumento de 2 veces, un aumento de 3 veces, un aumento de 4 veces o más en la cantidad de modificación diana observada en una región de ADN diana, en algunos casos, un
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aumento de 5 veces, un aumento de 6 veces o más, en ocasiones un aumento de 7 veces u 8 veces o más en la cantidad de recombinación observada, p. ej., un aumento de 10 veces, 50 veces o 100 veces o más, en algunos casos, un aumento de 200 veces, 500 veces, 700 veces o 1000 veces o más, p. ej., un aumento de 5000 veces o 10.000 veces en la cantidad de recombinación observada. La cantidad de modificación diana puede medirse mediante cualquier método conveniente. Por ejemplo, un constructo informador silencioso que comprende una secuencia complementaria al segmento dirigido (secuencia dirigida) del ARN de localización específica de ADN flanqueado por secuencias repetidas que, cuando se recombinan, reconstituyen un ácido nucleico que codifica un informador activo puede cotransfectarse en las células, y evaluarse la cantidad de proteína informadora después del contacto con el ARN de localización específica de ADN y/o endonucleasa Cas9 de origen natural y/o polinucleótido donante, p. ej., 2 horas, 4 horas, 8 horas, 12 horas, 24 horas, 36 horas, 48 horas, 72 horas o más después del contacto con el ARN de localización específica de ADN y/o endonucleasa Cas9 de origen natural y/o polinucleótido donante. Como otro ensayo con mayor sensibilidad, p. ej., el grado de recombinación en una región de interés de ADN genómico que comprende secuencias de ADN diana puede evaluarse mediante PCR o hibridación Southern de la región después del contacto con un ARN de localización específica de ADN y/o endonucleasa Cas9 de origen natural y/o polinucleótido donante, p. ej., 2 horas, 4 horas, 8 horas, 12 horas, 24 horas, 36 horas, 48 horas, 72 horas o más después del contacto con el ARN de localización específica de ADN y/o polipéptido modificador dirigido a un sitio y/o polinucleótido donante.
El contacto de las células con un ARN de localización específica de ADN y/o endonucleasa Cas9 de origen natural y/o polinucleótido donante puede producirse en cualquier medio de cultivo y en cualesquiera condiciones de cultivo que promuevan la supervivencia de las células. Por ejemplo, las células pueden suspenderse en cualquier medio nutriente adecuado que sea conveniente, tal como DMEM modificado de Iscove o RPMI 1640, suplementado con suero fetal de ternero o suero de cabra inactivado por calor (aproximadamente al 5-10 %), L-glutamina, un tiol, particularmente 2-mercaptoetanol, y antibióticos, p. ej., penicilina y estreptomicina. El cultivo puede contener factores de crecimiento a los que responden las células. Los factores de crecimiento, como se definen en la presente memoria, son moléculas capaces de promover la supervivencia, el crecimiento y/o la diferenciación de las células, ya sea en cultivo o en el tejido intacto, a través de efectos específicos sobre un receptor transmembrana. Los factores de crecimiento incluyen polipéptidos y factores no polipeptídicos. Las condiciones que promueven la supervivencia de las células son típicamente permisivas de la unión de extremos no homólogos y la reparación dirigida por homología.
En aplicaciones en las que es deseable insertar una secuencia polinucleotídica en una secuencia de ADN diana, también se proporciona a la célula un polinucleótido que comprende una secuencia donante que ha de insertarse. Por una “ secuencia donante” o “ polinucleótido donante” se entiende una secuencia de ácido nucleico que se inserta en el sitio de escisión inducido por un polipéptido modificador dirigido al sitio. El polinucleótido donante contendrá suficiente homología con una secuencia genómica en el sitio de escisión, p. ej., el 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 % de homología con las secuencias de nucleótidos que flanquean el sitio de escisión, p. ej., dentro de aproximadamente 50 bases o menos del sitio de escisión, p. ej., dentro de aproximadamente 30 bases, dentro de aproximadamente 15 bases, dentro de aproximadamente 10 bases, dentro de aproximadamente 5 bases, o que flaquean inmediatamente el sitio de escisión, para respaldar la reparación dirigida por homología entre ella y la secuencia genómica que porta homología. Aproximadamente 25, 50,100 o 200 nucleótidos, o más de 200 nucleótidos, de homología de secuencia entre un donante y una secuencia genómica (o cualquier valor integral entre 10 y 200 nucleótidos, o más) respaldarán la reparación dirigida por homología. Las secuencias donantes pueden tener cualquier longitud, p. ej., 10 nucleótidos o más, 50 nucleótidos o más, 100 nucleótidos o más, 250 nucleótidos o más, 500 nucleótidos o más, 1000 nucleótidos o más, 5000 nucleótidos o más, etc.
La secuencia donante típicamente no es idéntica a la secuencia genómica que reemplaza. Más bien, la secuencia donante puede contener al menos uno o más cambios, inserciones, deleciones, inversiones o reordenamientos de base única con respecto a la secuencia genómica, siempre que haya presente suficiente homología para respaldar la reparación dirigida por homología. En algunas realizaciones, la secuencia donante comprende una secuencia no homologa flanqueada por dos regiones de homología, de tal modo que la reparación dirigida por homología entre la región de ADN diana y las dos secuencias flanqueantes da como resultado la inserción de la secuencia no homologa en la región diana. Las secuencias donantes también pueden comprender una cadena principal de vector que contiene secuencias que no son homologas con la región de ADN de interés y que no están destinadas a la inserción en la región de ADN de interés. Generalmente, la región o regiones homologas de una secuencia donante tendrán al menos el 50 % de identidad de secuencia con una secuencia genómica con la que se desea la recombinación. En determinadas realizaciones, hay presente un 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 99,9 % de identidad de secuencia. Puede haber presente cualquier valor entre el 1 % y el 100 % de identidad de secuencia, dependiendo de la longitud del polinucleótido donante.
La secuencia donante puede comprender determinadas diferencias de secuencia en comparación con la secuencia genómica, p. ej., sitios de restricción, polimorfismos de nucleótidos, marcadores seleccionables (p. ej., genes de resistencia a fármacos, proteínas fluorescentes, enzimas, etc.), etc., que pueden usarse para evaluar la inserción exitosa de la secuencia donante en el sitio de escisión o en algunos casos pueden usarse para otros fines (p. ej., para indicar la expresión en el locus genómico diana). En algunos casos, si se ubican en una región codificante, dichas diferencias de secuencia de nucleótidos no cambiarán la secuencia de aminoácidos, o harán cambios de aminoácidos silenciosos (es decir, cambios que no afectan a la estructura o función de la proteína). Alternativamente, estas
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diferencias de secuencias pueden incluir secuencias de recombinación flanqueantes tales como FLP, secuencias loxP, o similares, que pueden activarse en un momento posterior para la eliminación de la secuencia marcadora.
La secuencia donante puede proporcionarse a la célula como ADN monocatenario, ARN monocatenario, ADN bicatenario o ARN bicatenario. Puede introducirse en una célula en forma lineal o circular. Si se introduce en forma lineal, los extremos de la secuencia donante pueden protegerse (p. ej., de la degradación exonucleolítica) mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, se añaden uno o más residuos de didesoxinucleótido al extremo 3' de una molécula lineal y/o se ligan oligonucleótidos autocomplementarios a uno o ambos extremos. Véase, por ejemplo, Chang y col. (1987)Proc. Nati. Acad Sci USA84:4959-4963; Nehls y col. (1996)Science272:886-889. Los métodos adicionales para proteger polinucleótidos exógenos de la degradación incluyen, pero no se limitan a, la adición de uno o más grupos amino terminales y el uso de enlaces internucleotídicos modificados tales como, por ejemplo, fosforotioatos, fosforamidatos y residuos de O-metil ribosa O desoxirribosa. Como alternativa a proteger los extremos de una secuencia donante lineal, pueden incluirse longitudes adicionales de secuencia fuera de las regiones de homología que pueden degradarse sin repercutir en la recombinación. Puede introducirse una secuencia donante en una célula como parte de una molécula de vector que tiene secuencias adicionales tales como, por ejemplo, orígenes de replicación, promotores y genes que codifican resistencia a antibióticos. Además, las secuencias donantes pueden introducirse como ácido nucleico desnudo, como ácido nucleico complejado con un agente tal como un liposoma o poloxámero, o pueden suministrarse mediante virus (p. ej., adenovirus, AAV), como se ha descrito anteriormente para ácidos nucleicos que codifican un ARN de localización específica de ADN y/o polipéptido modificador dirigido al sitio y/o polinucleótido donante.
Las preparaciones farmacéuticas son composiciones que incluyen uno o más ARN de localización específica de ADN y/o polipéptido modificador dirigido al sitio y/o polinucleótido donante presentes en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Los “vehículos farmacéuticamente aceptables” pueden ser vehículos aprobados por una agencia reguladora del gobierno Federal o estatal o enumerados en la Farmacopea de los EE.UU. u otra farmacopea generalmente reconocida para su uso en mamíferos, tales como seres humanos. El término “vehículo” se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o portados con el que se formula un compuesto de la invención para su administración a un mamífero. Dichos vehículos farmacéuticos pueden ser lípidos, p. ej., liposomas, p. ej., dendrímeros de liposomas; líquidos, tales como agua y aceites, incluyendo aquellos de origen petrolífero, animal, vegetal o sintético, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares, solución salina; goma arábiga, gelatina, pasta de almidón, talco, queratina, sílice coloidal, urea y similares. Además, pueden usarse agentes auxiliares, estabilizantes, espesantes, lubricantes y colorantes. Las composiciones farmacéuticas pueden formularse en preparaciones en formas sólidas, semisólidas, líquidas o gaseosas, tales como comprimidos, cápsulas, polvos, gránulos, pomadas, soluciones, supositorios, inyecciones, inhaladores, geles, microesferas y aerosoles. Como tal, la administración de un ARN de localización específica de ADN y/o endonucleasa Cas9 de origen natural y/o polinucleótido donante puede lograrse de diversas maneras, incluidas la administración oral, bucal, rectal, parenteral, intraperitoneal, intradérmica, transdérmica, intratraqueal, intraocular, etc. El agente activo puede ser sistémico después de la administración o puede localizarse usando administración regional, administración intramural o uso de un implante que actúa reteniendo la dosis activa en el sitio de implantación. El agente activo puede formularse para actividad inmediata o puede formularse para liberación sostenida.
Para algunas afecciones, particularmente las condiciones del sistema nervioso central, puede ser necesario formular agentes para cruzar la barrera hematoencefálica (BHE). Una estrategia para el suministro de fármacos a través de la barrera hematoencefálica (BHE) implica la alteración de la BHE, ya sea por medios osmóticos tales como manitol o leucotrienos, o bioquímicamente mediante el uso de sustancias vasoactivas tales como bradicinina. El potencial para usar la abertura de BHE para localizar específicamente agentes específicos en tumores cerebrales también es una opción. Un agente de alteración de la BHE puede coadministrarse con las composiciones terapéuticas de la invención cuando las composiciones se administran mediante inyección intravascular. Otras estrategias para pasara través de la BHE pueden implicar el uso de sistemas de transporte endógenos, incluyendo la transcitosis mediada por Caveolina-1, transportadores mediados por portadores tales como portadores de glucosa y aminoácidos, transcitosis mediada por receptor para insulina o transferrina, y transportadores de flujo activo tales como p-glucoproteína. Los restos de transporte activo también pueden conjugarse con los compuestos terapéuticos para su uso en la invención para facilitar el transporte a través de la pared endotelial del vaso sanguíneo. Alternativamente, el suministro de fármacos de agentes terapéuticos detrás de la BHE puede ser mediante suministro local, por ejemplo, mediante suministro intratecal, p. ej., a través de un depósito Ommaya (véanse, p. ej., las patentes estadounidenses n.° 5.222.982 y 5385582); mediante inyección en embolada, p. ej., mediante una jeringa, p. ej., porvía intravítreao por vía intracraneal; por infusión continua, p. ej., por canulación, p. ej., con convección (véase, p. ej., la solicitud estadounidense n.° 20070254842); o implantando un dispositivo sobre el cual se ha fijado el agente de manera reversible (véanse, p. ej., las solicitudes estadounidenses 20080081064 y 20090196903).
Típicamente, se proporciona una cantidad eficaz de un ARN de localización específica de ADN y/o polipéptido modificador dirigido al sitio y/o polinucleótido donante. Como se ha descrito anteriormente con respecto a métodos exvivono reivindicados, una cantidad eficaz o dosis eficaz de un ARN de localización específica de ADN y/o polipéptido modificador dirigido al sitio y/o polinucleótido donantein vivoes la cantidad que induce un aumento de 2 veces o más en la cantidad de recombinación observada entre dos secuencias homologas con respecto a un control negativo, p. ej., una célula en contacto con un vector vacío o polipéptido irrelevante. La cantidad de recombinación puede medirse
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mediante cualquier método conveniente, p. ej., como se ha descrito anteriormente y se conoce en la técnica. El cálculo de la cantidad eficaz o dosis eficaz de un ARN de localización específica de ADN y/o polipéptido modificador dirigido al sitio y/o polinucleótido donante que ha de administrarse está dentro de la habilidad de un experto en la técnica, y será rutinario para los expertos en la técnica. La cantidad final que ha de administrarse dependerá de la vía de administración y de la naturaleza del trastorno o afección que ha de tratarse.
La cantidad eficaz proporcionada a un paciente particular dependerá de una diversidad de factores, varios de los cuales diferirán de un paciente a otro. Un médico competente podrá determinar una cantidad eficaz de un agente terapéutico para administrar aun paciente para detener o revertir la progresión de la afección de la enfermedad según sea necesario. Utilizando datos de animales DL50, y otra información disponible para el agente, un médico puede determinar la dosis segura máxima para un individuo, dependiendo de la vía de administración. Por ejemplo, una dosis administrada por vía intravenosa puede ser más que una dosis administrada por vía intratecal, dado el mayor cuerpo de fluido en el que se está administrando la composición terapéutica. Similarmente, pueden administrarse composiciones que se aclaran rápidamente del cuerpo a dosis más altas, o en dosis repetidas, para mantener una concentración terapéutica. Utilizando habilidades ordinarias, el médico competente será capaz de optimizar la dosificación de un terapéutico particular en el curso de ensayos clínicos de rutina.
Para su inclusión en un medicamento, puede obtenerse un ARN de localización específica de ADN y/o una endonucleasa Cas9 de origen natural y/o un polinucleótido donante de una fuente comercial adecuada. Como una proposición general, la cantidad total farmacéuticamente eficaz del ARN de localización específica de ADN y/o endonucleasa Cas9 de origen natural y/o polinucleótido donante administrada por vía parenteral por dosis estará en un intervalo que puede medirse mediante una curva de respuesta a la dosis.
Las terapias basadas en un ARN de localización específica de ADN y/o una endonucleasa Cas9 de origen natural y/o polinucleótidos donantes, es decir, preparaciones de un ARN de localización específica de ADN y/o endonucleasa Cas9 de origen natural y/o polinucleótido donante que se vayan a usar para la administración terapéutica, deben ser estériles. La esterilidad se logra fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración estériles (p. ej., membranas de 0,2 pm). Las composiciones terapéuticas generalmente se colocan en un recipiente que tiene un puerto de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa o vial de solución intravenosa que tiene un tapón perforable mediante una aguja de inyección hipodérmica. Las terapias basadas en un ARN de localización específica de ADN y/o endonucleasa Cas9 de origen natural y/o polinucleótido donante pueden almacenarse en recipientes unitarios o multidosis, por ejemplo, ampollas o viales sellados, en forma de una solución acuosa o como formulación liofilizada para su reconstitución. Como ejemplo de una formulación liofilizada, se cargan viales de 10 mi con 5 mi de solución acuosa estéril al 1 % (p/v) de compuesto, y la mezcla resultante se liofiliza. La solución de infusión se prepara reconstituyendo el compuesto liofilizado usando agua bacteriostática para inyección.
Las composiciones farmacéuticas pueden incluir, dependiendo de la formulación deseada, portadores no tóxicos farmacéuticamente aceptables de diluyentes, que se definen como vehículos utilizados habitualmente para formular composiciones farmacéuticas para la administración a animales o seres humanos. El diluyente se selecciona para no afectar a la actividad biológica de la combinación. Son ejemplos de dichos diluyentes agua destilada, agua tamponada, solución salina fisiológica, PBS, solución de Ringer, solución de dextrosa y solución de Hank. Además, la composición farmacéutica o formulación puede incluir otros portadores, adyuvantes, o estabilizadores no tóxicos, no terapéuticos, no inmunogénicos, excipientes y similares. Las composiciones también pueden incluir sustancias adicionales para aproximar las condiciones fisiológicas, tales como agentes de ajuste y tamponamiento del pH, agentes de ajuste de la toxicidad, agentes humectantes y detergentes.
La composición también puede incluir cualquiera de una diversidad de agentes estabilizantes, tales como un antioxidante, por ejemplo. Cuando la composición farmacéutica incluye un polipéptido, el polipéptido puede complejarse con diversos compuestos bien conocidos que potencian la estabilidadin vivodel polipéptido, o potenciar de cualquier otro modo sus propiedades farmacológicas (p. ej., aumentar la semivida del polipéptido, reducir su toxicidad, potenciar la solubilidad o absorción). Los ejemplos de dichas modificaciones o agentes formadores de complejos incluyen sulfato, gluconato, citrato y fosfato. Los ácidos nucleicos o polipéptidos de una composición también pueden complejarse con moléculas que potencian sus atributosin vivo.Dichas moléculas incluyen, por ejemplo, carbohidratos, poliaminas, aminoácidos, otros péptidos, iones (p. ej., sodio, potasio, calcio, magnesio, manganeso) y lípidos.
Pueden encontrarse directrices adicionales con respecto a las formulaciones que son adecuadas para diversos tipos de administración enRemington's Pharmaceutical Sciences,Mace Publishing Company, Filadelfia, Pa., 17a ed. (1985). Para una revisión breve de métodos para la administración de fármacos, véase, Langer,Science249:1527-1533 (1990).
Las composiciones farmacéuticas pueden administrarse para tratamientos profilácticos y/o terapéuticos. La toxicidad y la eficacia terapéutica del ingrediente activo pueden determinarse según procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares y/o animales experimentales, incluyendo, por ejemplo, determinar la DL50 (la dosis letal para el 50 % de la población) y la DE50 (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50 % de la población). La relación de dosis entre los
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efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y puede expresarse como la relación DL50/DE50. Se prefieren las terapias que presentan índices terapéuticos grandes.
Los datos obtenidos del cultivo celular y/o los estudios en animales pueden usarse en la formulación de un intervalo de dosificaciones para seres humanos. La dosificación del ingrediente activo típicamente se alinea dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluyen la DE50 con baja toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificación empleada y la vía de administración utilizada.
Los componentes utilizados para formular las composiciones farmacéuticas son preferiblemente de alta pureza y están prácticamente exentos de contaminantes potencialmente nocivos (p. ej., al menos el grado Nacional de Alimentos (NF, por sus siglas en inglés), generalmente al menos de grado analítico, y de forma más típica al menos el grado farmacéutico). Además, las composiciones destinadas al usoin vivousualmente son estériles. En la medida en que deba sintetizarse un compuesto dado antes de su uso, el producto resultante típicamente está prácticamente exento de cualquier agente potencialmente tóxico, particularmente cualquier endotoxina, que pueda estar presente durante el proceso de síntesis o purificación. Las composiciones para administración parental también son estériles, sustancialmente isotónicas y se preparan en condiciones de GMP.
La cantidad eficaz de una composición terapéutica que ha de proporcionarse a un paciente particular dependerá de una diversidad de factores, varios de los cuales diferirán de un paciente a otro. Un médico competente podrá determinar una cantidad eficaz de un agente terapéutico para administrar a un paciente para detener o revertir la progresión de la afección de la enfermedad según sea necesario. Utilizando datos de animales DL50, y otra información disponible para el agente, un médico puede determinar la dosis segura máxima para un individuo, dependiendo de la vía de administración. Por ejemplo, una dosis administrada por vía intravenosa puede ser más que una dosis administrada por vía intratecal, dado el mayor cuerpo de fluido en el que se está administrando la composición terapéutica. Similarmente, pueden administrarse composiciones que se aclaran rápidamente del cuerpo a dosis más altas, o en dosis repetidas, para mantener una concentración terapéutica. Utilizando habilidades ordinarias, el médico competente será capaz de optimizar la dosificación de un terapéutico particular en el curso de ensayos clínicos de rutina.
Composiciones
La presente invención proporciona una composición que comprende un ARN de localización específica de ADN de un sujeto y una endonucleasa Cas9 de origen natural. Una composición para un sujeto es útil para llevar a cabo un método no reivindicado de la presente descripción, p. ej., un método no reivindicado para la modificación específica de sitio de un ADN diana; etc.
Composiciones que comprenden un ARN de localización específica de ADN y un polipéptido modificador dirigido al sitio
La presente invención proporciona una composición que comprende: (i) un ARN de localización específica de ADN o un polinucleótido de ADN que codifica el mismo; y ii) una endonucleasa Cas9 de origen natural. En algunos casos
La presente invención proporciona una composición que comprende: (i) un ARN de localización específica de ADN, como se ha descrito anteriormente, comprendiendo el ARN de localización específica de ADN: (a) un primer segmento que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia en un ADN diana; y (b) un segundo segmento que interactúa con un polipéptido modificador dirigido a un sitio que es una endonucleasa Cas9 de origen natural; y (ii) el polipéptido modificador dirigido al sitio, o un polinucleótido que codifica el mismo, comprendiendo el polipéptido modificador dirigido al sitio: (a) una porción de unión a ARN que interactúa con el ARN de localización específica de ADN; y (b) una porción de actividad que presenta actividad enzimática dirigida al sitio, en donde el sitio de actividad enzimática está determinado por el ARN de localización específica de ADN.
En algunos casos, una composición en cuestión comprende: una composición que comprende: (i) un ARN de localización específica de ADN en cuestión, comprendiendo el ARN de localización específica de ADN: (a) un primer segmento que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia en un ADN diana; y (b) un segundo segmento que interactúa con un polipéptido modificador dirigido a un sitio que es una endonucleasa Cas9 de origen natural; y (¡i) el polipéptido modificador dirigido a un sitio, comprendiendo el polipéptido modificador dirigido a un sitio: (a) una porción de unión a ARN que interactúa con el ARN de localización específica de ADN; y (b) una porción de actividad que presenta actividad enzimática dirigida al sitio, en donde el sitio de actividad enzimática está determinado por el ARN de localización específica de ADN.
En algunas realizaciones, una composición en cuestión incluye ambas moléculas de ARN de un ARN de localización específica de ADN de molécula doble. Como tal, en algunas realizaciones, una composición en cuestión incluye un ARN activador que comprende un segmento formador de dúplex que es complementario al segmento formador de dúplex de un ARN localizador específico (véase la Figura 1A). Los segmentos formadores de dúplex del ARN activador y el ARN localizador específico se hibridan para formar el dúplex de ARNbc del segmento de unión a proteínas del ARN de localización específica de ADN. El ARN localizador específico proporciona además el segmento de
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localización específica de ADN (monocatenario) del ARN de localización específica de ADN y, por lo tanto, dirige el ARN de localización específica de ADN a una secuencia específica dentro del ADN diana. Como un ejemplo no limitativo, el segmento formador de dúplex del ARN activador comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95%, al menos aproximadamente el 98% o el 100% de identidad con la secuencia 5'-UAGCAAGUUAAAAU-3' (Id. de sec. n.° 562). Como otro ejemplo no limitativo, el segmento formador de dúplex del ARN localizador específico comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 98 % o el 100 % de identidad con la secuencia 5'-GUUUUAGAGCUA-3' (Id. de sec. n.° 679).
Una composición en cuestión puede comprender, además de i) un ARN de localización específica de ADN en cuestión; y ii) una endonucleasa Cas9 de origen natural, uno o más de: una sal, p. ej., NaCI, MgCh, KCI, MgS04, etc.; un agente tamponador, p. ej., un tampón Tris, HEPES, MES, sal de sodio de MES, MOPS, TAPS, etc.; un agente solubilizante; un detergente, p. ej., un detergente no Iónico tal como Tween-20, etc.; un inhibidor de proteasas; un agente reductor (p. ej., ditiotreitol); y similares.
En algunos casos, los componentes de la composición son individualmente puros, p. ej., cada uno de los componentes es al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 %, o al menos el 99 %, puro. En algunos casos, los componentes individuales de una composición en cuestión son puros antes de añadirlos a la composición.
Por ejemplo, en algunas realizaciones, un polipéptido modificador dirigido al sitio presente en una composición en cuestión es puro, p. ej., al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o más del 99 % puro, donde el“ %de pureza” significa que el polipéptido modificador dirigido al sitio está en el porcentaje mencionado exento de otras proteínas (p. ej., proteínas distintas del polipéptido modificador dirigido al sitio), otras macromoléculas o contaminantes que pueden estar presentes durante la producción del polipéptido modificador dirigido al sitio.
Definiciones - parte II
La expresión “de origen natural” o “ sin modificar” como se usa en la presente memoria como se aplica a un ácido nucleico, un polipéptido, una célula o un organismo, se refiere a un ácido nucleico, polipéptido, célula u organismo que se encuentra en la naturaleza. Por ejemplo, una secuencia polipeptídica o polinucleotídica que está presente en un organismo (que incluye virus) que puede aislarse de una fuente en la naturaleza y que no ha sido modificada intencionalmente por un ser humano en el laboratorio es de origen natural.
“ Heterólogo” , como se usa en la presente memoria, significa una secuencia de nucleótidos o polipéptidos que no se encuentra en el ácido nucleico o proteína nativos, respectivamente. Por ejemplo, en un polipéptido dirigido al sitio Cas9 variante de fusión, un polipéptido dirigido al sitio Cas9 variante puede fusionarse con un polipéptido heterólogo (es decir, un polipéptido distinto de Cas9). El polipéptido heterólogo puede presentar una actividad (p. ej., actividad enzimática) que también presentará el polipéptido dirigido al sitio Cas9 variante de fusión. Una secuencia de ácido nucleico heteróloga puede unirse a un polipéptido dirigido al sitio Cas9 variante (p. ej., mediante ingeniería genética) para generar una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido dirigido al sitio Cas9 variante de fusión.
La expresión “ polipéptido quimérico” se refiere a un polipéptido que no es de origen natural, p. ej., se produce mediante la combinación artificial de dos segmentos de secuencia de aminoácidos separados de cualquier otro modo a través de intervención humana. Por lo tanto, un polipéptido quimérico también es el resultado de la intervención humana. Por lo tanto, un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos quimérica es un polipéptido quimérico.
Por “ polipéptido dirigido al sitio” o “ polipéptido dirigido al sitio de unión a ARN” o “ polipéptido dirigido al sitio de unión a ARN” se entiende un polipéptido que se une a ARN y se localiza específicamente a una secuencia de ADN específica. Un polipéptido dirigido al sitio como se describe en la presente memoria se localiza específicamente a una secuencia de ADN específica por la molécula de ARN a la que está unido. La molécula de ARN comprende una secuencia que es complementaria a una secuencia diana dentro del ADN diana, localizando específicamente de este modo el polipéptido unido a una ubicación específica dentro del ADN diana (la secuencia diana).
En algunas formas de realización, un ácido nucleico de un sujeto (p. ej., un ARN de localización específica de ADN, un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un ARN de localización específica de ADN de molécula única; etc.) comprende una modificación o secuencia que proporciona una característica deseable adicional (p. ej., estabilidad modificada o regulada; localización específica subcelular; seguimiento, p. ej., un marcador fluorescente; un sitio de unión para una proteína o complejo de proteínas; etc.). Los ejemplos no limitativos incluyen: una caperuza 5' (p. ej., una caperuza de 7-metilguanilato (m7G)); una cola poliadenilada en 3' (es decir, una cola de poli(A) 3'; una secuencia de ribointerruptor (p. ej., para permitir la estabilidad regulada y/o la accesibilidad regulada
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por proteínas y/o complejos de proteínas); una modificación o secuencia que localiza específicamente el ARN a una ubicación subcelular (p. ej., núcleo, mitocondrias, cloroplastos y similares); una modificación o secuencia que proporciona el seguimiento (p. ej., conjugación directa con una molécula fluorescente, conjugación con un resto que facilita la detección fluorescente, una secuencia que permite la detección fluorescente, etc.); una modificación o secuencia que proporciona un sitio de unión para proteínas (p. ej., proteínas que actúan sobre ADN, que incluyen activadores de la transcripción, represores de la transcripción, ADN metiltransferasas, ADN desmetilasas, histona acetiltransferasas, histona desacetilasas y similares); y combinaciones de los mismos.
En algunas realizaciones, un ARN de localización específica de ADN comprende un segmento adicional en el extremo 5' o 3' que proporciona cualquiera de las características descritas anteriormente. Por ejemplo, un tercer segmento adecuado puede comprender una caperuza 5' (p. ej., una caperuza de 7-metilguanilato (m7G)); una cola poliadenilada en 3' (es decir, una cola de poli(A) 3'; una secuencia de ribointerruptor (p. ej., para permitir la estabilidad regulada y/o la accesibilidad regulada por proteínas y complejos de proteínas); una secuencia que localiza específicamente el ARN a una ubicación subcelular (p. ej., núcleo, mitocondrias, cloroplastos y similares); una modificación o secuencia que proporciona el seguimiento (p. ej., conjugación directa con una molécula fluorescente, conjugación con un resto que facilita la detección fluorescente, una secuencia que permite la detección fluorescente, etc.); una modificación o secuencia que proporciona un sitio de unión para proteínas (p. ej., proteínas que actúan sobre ADN, que incluyen activadores de la transcripción, represores de la transcripción, ADN metiltransferasas, ADN desmetilasas, histona acetiltransferasas, histona desacetilasas y similares); y combinaciones de los mismos.
Un ARN de localización específica de ADN de un sujeto y un polipéptido dirigido a un sitio de un sujeto que es una endonucleasa Cas9 de origen natural forman un complejo (es decir, se unen mediante interacciones no covalentes). El ARN de localización específica de ADN proporciona una especificidad diana al complejo al comprender una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de un ADN diana. El polipéptido dirigido al sitio del complejo proporciona la actividad específica de sitio. En otras palabras, el polipéptido dirigido al sitio se guía a una secuencia de ADN diana (p. ej., una secuencia diana en un ácido nucleico cromosómico; una secuencia diana en un ácido nucleico extracromosómico, p. ej., un ácido nucleico episómico, un minicírculo, etc.; una secuencia diana en un ácido nucleico mitocondrial; una secuencia diana en un ácido nucleico de cloroplasto; una secuencia diana en un plásmido; etc.) en virtud de su asociación con el segmento de unión a proteínas del ARN de localización específica de ADN.
En algunas formas de realización, un ARN de localización específica de ADN de un sujeto comprende dos moléculas de ARN separadas (polinucleótidos de ARN) y se denomina en la presente memoria “ARN de localización específica de ADN de molécula doble’’ o un “ARN de localización específica de ADN de dos moléculas” . En otras formas de realización, un ARN de localización específica de ADN de un sujeto es una molécula de ARN única (polinucleótido de ARN único) y se denomina en la presente memoria un “ARN de localización específica de ADN de molécula única” . Si no se especifica de cualquier otro modo, la expresión “ARN de localización específica de ADN” es inclusivo, con referencia tanto a ARN de localización específica de ADN de molécula única como a ARN de localización específica de ADN de molécula doble.
Un ARN de localización específica de ADN de dos moléculas de un sujeto comprende dos moléculas de ARN separadas (un “ARN localizador específico” y un “ARN activador” ). Cada una de las dos moléculas de ARN de un ARN de localización específica de ADN de dos moléculas en cuestión comprende un tramo de nucleótidos que son complementarios entre sí de tal modo que los nucleótidos complementarios de las dos moléculas de ARN se hibridan para formar el dúplex de ARN bicatenario del segmento de unión a proteínas.
Un ARN de localización específica de ADN de molécula única de un sujeto comprende dos tramos de nucleótidos (un ARN localizador específico y un ARN activador) que son complementarios entre sí, están unidos covalentemente por nucleótidos intervinientes (“enlazadores” o “ nucleótidos enlazadores” ) y se hibridan para formar el dúplex de ARN bicatenario (dúplex de ARNbc) del segmento de unión a proteínas, dando como resultado una estructura de tallobucle. El ARN localizador específico y el ARN activador pueden unirse covalentemente a través del extremo 3' del ARN localizador específico y el extremo 5' del ARN activador. Alternativamente, el ARN localizador específico y el ARN activador pueden unirse covalentemente a través del extremo 5' del ARN localizador específico y el extremo 3' del ARN activador.
Un ARN de localización específica de ADN de dos moléculas ilustrativo comprende una molécula similar a ARNcr (“ARN de CRISPR” o “ARN localizador específico” o “ARNcr" o “ repetición de ARNcr” ) y una molécula similar a ARNcrtra (“ARN de CRISPR de acción trans” o “ARN activador” o “ARNcrtra") correspondiente. Una molécula similar a ARNcr (ARN localizador específico) comprende tanto el segmento de localización específica de ADN (monocatenario) del ARN de localización específica de ADN como un tramo (“ segmento formador de dúplex” ) de nucleótidos que forma una mitad del dúplex de ARNbc del segmento de unión a proteínas del ARN de localización específica de ADN. Una molécula similar a ARNcrtra (ARN activador) correspondiente comprende un tramo de nucleótidos (segmento formador de dúplex) que forma la otra mitad del dúplex de ARNbc del segmento de unión a proteínas del ARN de localización específica de ADN. En otras palabras, un tramo de nucleótidos de una molécula similar a ARNcr es complementario y se híbrida con un tramo de nucleótidos de una molécula similar a ARNcrtra para formar el dúplex de ARNbc del dominio de unión a proteínas del ARN de localización específica de ADN. Como tal, se
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puede decir que cada molécula similar a ARNcr tiene una molécula similar a ARNcrtra correspondiente. La molécula similar a ARNcr proporciona de forma adicional el segmento de localización específica de ADN monocatenario. Por lo tanto, una molécula similar a ARNcr y una molécula similar a ARNcrtra (en forma de un par correspondiente) se hibridan para formar un ARN de localización específica de ADN. La secuencia exacta de una molécula de ARNcr o ARNcrtra dada es característica de la especie en la que se encuentran las moléculas de ARN.
La expresión “ARN activador” se usa en la presente memoria con el significado de una molécula similar a ARNcrtra de un ARN de localización específica de ADN de molécula doble. La expresión “ARN localizador específico” se usa en la presente memoria con el significado de una molécula similar a ARNcr de un ARN de localización específica de ADN de molécula doble. La expresión “ segmento formador de dúplex” se usa en la presente memoria con el significado del tramo de nucleótidos de un ARN activador o un ARN localizador específico que contribuye a la formación del dúplex de ARNbc mediante la hibridación con un tramo de nucleótidos de una molécula de ARN activador o ARN localizador específico correspondiente. En otras palabras, un ARN activador comprende un segmento formador de dúplex que es complementario al segmento formador de dúplex del ARN localizador específico correspondiente. Como tal, un ARN activador comprende un segmento formador de dúplex mientras que un ARN localizador específico comprende tanto un segmento formador de dúplex como el segmento de localización específica de ADN del ARN de localización específica de ADN. Por lo tanto, un ARN de localización específica de ADN de molécula doble en cuestión puede estar compuesto por cualquier par de ARN activador y de ARN localizador específico correspondiente.
Un ARN de localización específica de ADN de dos moléculas puede diseñarse para permitir la unión controlada (es decir, condicional) de un ARN localizador específico con un ARN activador. Debido a que un ARN de localización específica de ADN de dos moléculas no es funcional a menos que tanto el ARN activador como el ARN localizador específico estén unidos en un complejo funcional con Cas9, un ARN de localización específica de ADN de dos moléculas puede ser inducible (p. ej., inducible por fármacos) haciendo que la unión entre el ARN activador y el ARN localizador específico sea inducible. Como ejemplo no limitativo, pueden usarse aptámeros de ARN para regular (es decir, controlar) la unión del ARN activador con el ARN localizador específico. En consecuencia, el ARN activador y/o el ARN localizador específico pueden comprender una secuencia de aptámero de ARN.
Los aptámeros de ARN son conocidos en la técnica y son generalmente una versión sintética de un ribointerruptor. Las expresiones “aptámero de ARN” y “ ribointerruptor” se usan indistintamente en la presente memoria para abarcar secuencias de ácido nucleico tanto sintéticas como naturales que proporcionan la regulación inducible de la estructura (y por lo tanto la disponibilidad de secuencias específicas) de la molécula de ARN de la que son parte. Los aptámeros de ARN generalmente comprenden una secuencia que se pliega en una estructura particular (p. ej., una horquilla), que se une específicamente a un fármaco particular (p. ej., una molécula pequeña). La unión del fármaco provoca un cambio estructural en el plegamiento del ARN, que cambia una característica del ácido nucleico del cual el aptámero es una parte. Como ejemplos no limitativos: (i) un ARN activador con un aptámero puede no ser capaz para unirse al ARN localizador específico afín a menos que el aptámero esté unido por el fármaco adecuado; (ii) un ARN localizador específico con un aptámero puede no ser capaz para unirse al ARN activador afín a menos que el aptámero esté unido por el fármaco adecuado; y (iii) un ARN localizador específico y un ARN activador, cada uno de los cuales comprende un aptámero diferente que se une a un fármaco diferente, puede no ser capaz de unirse entre sí a menos que ambos fármacos estén presentes. Como se ilustra por estos ejemplos, puede diseñarse un ARN de localización específica de ADN de dos moléculas para que sea inducible.
Pueden encontrarse ejemplos de aptámeros y ribointerruptores, por ejemplo, en: Nakamura y col.,Genes Cells.Mayo de 2012;17(5):344-64; Vavalina y col.,Future Cardiol.Mayo de 2012;8(3):371-82; Citartan y col.,Biosens Bioelectron.
15 de abril de 2012;34(1): 1 -11; y Liberman y col.,Wiley Interdisp Rev RNA.Mayo-Junio de 2012;3(3):369-84.
Los ejemplos no limitativos de secuencias de nucleótidos que pueden incluirse en un ARN de localización específica de ADN de dos moléculas incluyen ARN localizador específico (p. ej., Id. de sec. n.° 566-567) que pueden emparejarse con el segmento formador de dúplex de uno cualquiera de los ARN activadores expuestos en las Id. de sec. n.° 671 -678.
Un ARN de localización específica de ADN de molécula única ilustrativo comprende dos tramos complementarios de nucleótidos que se hibridan para formar un dúplex de ARNbc. En algunas realizaciones, uno de los dos tramos complementarios de nucleótidos del ARN de localización específica de ADN de molécula única (o el ADN que codifica el tramo) es al menos aproximadamente el 60 % idéntico a una de las secuencias de ARN activador (ARNcrtra) expuestas en las Id. de sec. n.° 431-562 sobre un tramo de al menos 8 nucleótidos contiguos. Por ejemplo, uno de los dos tramos complementarios de nucleótidos del ARN de localización específica de ADN de molécula única (o el ADN que codifica el tramo) es al menos aproximadamente el 65 % idéntico, al menos aproximadamente el 70 % idéntico, al menos aproximadamente el 75 % idéntico, al menos aproximadamente el 80 % idéntico, al menos aproximadamente el 85 % idéntico, al menos aproximadamente el 90 % idéntico, al menos aproximadamente el 95 % idéntico, al menos aproximadamente el 98 % idéntico, al menos aproximadamente el 99 % idéntico o el 100 % idéntico a una de las secuencias de ARNcrtra expuestas en las Id. de sec. n.° 431-562 sobre un tramo de al menos 8 nucleótidos contiguos.
En algunas realizaciones, uno de los dos tramos complementarios de nucleótidos del ARN de localización específica de ADN de molécula única (o el ADN que codifica el tramo) es al menos aproximadamente el 60 % idéntico a una de
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las secuencias de ARN localizador específico (ARNcr) expuestas en las Id. de sec. n.° 563-679 sobre un tramo de al menos 8 nucleótidos contiguos. Por ejemplo, uno de los dos tramos complementarios de nucleótidos del ARN de localización específica de ADN de molécula única (o el ADN que codifica el tramo) es al menos aproximadamente el 65 % idéntico, al menos aproximadamente el 70 % idéntico, al menos aproximadamente el 75 % idéntico, al menos aproximadamente el 80 % idéntico, al menos aproximadamente el 85 % idéntico, al menos aproximadamente el 90 % idéntico, al menos aproximadamente el 95 % idéntico, al menos aproximadamente el 98 % idéntico, al menos aproximadamente el 99 % idéntico o el 100 % idéntico a una de las secuencias de ARNcr expuestas en las Id. de sec. n.° 563-679 sobre un tramo de al menos 8 nucleótidos contiguos.
Las definiciones proporcionadas en “ Definiciones - Parte I” también son aplicables a la presente sección; véase “ Definiciones - Parte I” para la clarificación adicional de términos.
Antes de que se describa de forma adicional la presente invención, debe entenderse que esta invención no se limita a realizaciones particulares descritas, ya que, por supuesto, pueden variar. También debe entenderse que la terminología utilizada en la presente memoria tiene el fin de describir solamente realizaciones particulares, y no pretende ser limitativa, ya que el alcance de la presente invención estará limitado únicamente por las reivindicaciones adjuntas.
Cuando se proporciona un intervalo de valores, se entiende que cada valor intermedio, hasta la décima parte de la unidad del límite inferior, a menos que el contexto indique claramente cualquier otra cosa, entre el límite superior e inferior de ese intervalo y cualquier otro valor indicado o intermedio en ese intervalo indicado, está abarcado por la invención. Los límites superior e inferior de estos intervalos más pequeños pueden incluirse independientemente en los intervalos más pequeños y también están abarcados por la invención, sujeto a cualquier límite específicamente excluido en el intervalo indicado. Cuando el intervalo indicado incluye uno o ambos límites, los intervalos que excluyen cualquiera o ambos de esos límites incluidos también se incluyen en la invención.
A menos que se defina de cualquier otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente memoria tienen el mismo significado que entiende habitualmente un experto en la técnica a la que pertenece esta invención. Aunque cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en la presente memoria también puede usarse en la práctica o ensayo de la presente invención, ahora se describen los métodos y materiales preferidos.
Debe observarse que, como se usa en la presente memoria y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares “ un” , “ una” y “ el/la” incluyen referentes en plural a menos que el contexto indique claramente cualquier otra cosa. Por lo tanto, por ejemplo, la referencia a “ un polipéptido Cas9 enzimáticamente inactivo” incluye una pluralidad de dichos polipéptidos y la referencia a “ el ácido nucleico diana” incluye la referencia a uno o más ácidos nucleicos diana y equivalentes de los mismos conocidos por los expertos en la técnica, y así sucesivamente. Se observa además que las reivindicaciones pueden redactarse para excluir cualquier elemento opcional. Como tal, esta declaración pretende servir como base antecedente para el uso de terminología exclusiva como “ únicamente” , “ solamente” y similares en relación con la mención de elementos de reivindicación, o el uso de una limitación “ negativa” .
Se aprecia que determinadas características de la invención, que, para mayor claridad, se describen en el contexto de realizaciones separadas, también pueden proporcionarse en combinación en una única realización. Por el contrario, diversas características de la invención, que, por brevedad, se describen en el contexto de una única realización, también pueden proporcionarse por separado o en cualquier subcombinación adecuada. Todas las combinaciones de las realizaciones que pertenecen a la invención se incluyen específicamente por la presente invención y se describen en la presente memoria como si cada una de las combinaciones se describiese individual y explícitamente. Además, todas las subcombinaciones de las diversas realizaciones y elementos de las mismas también se incluyen específicamente en la presente invención y se describen en la presente memoria como si cada una de dichas subcombinaciones se describiese individual y explícitamente en la presente memoria.
Las publicaciones analizadas en la presente memoria se proporcionan únicamente para su descripción antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. Nada en la presente memoria debe interpretarse como una admisión de que la presente invención no tiene derecho a anteceder dicha publicación en virtud de la invención anterior. Además, las fechas de publicación proporcionadas pueden ser diferentes de las fechas de publicación reales que pueden necesitar ser confirmadas independientemente.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos se presentan para proporcionar a los expertos en la técnica una descripción completa y descripción de cómo preparar y usar la presente invención, y no tienen por objeto limitar el alcance de lo que los inventores consideran su invención ni pretenden representar que los experimentos siguientes son todos o los únicos experimentos realizados. Se han realizado esfuerzos para garantizar la precisión con respecto a los números utilizados (p. ej., cantidades, temperatura, etc.) pero deben tenerse en cuenta algunos errores experimentales y desviaciones. Salvo que se indique lo contrario, las partes son partes en peso, el peso molecular es el peso molecular promedio en peso, la temperatura está en grados Celsius y la presión es la atmosférica o está próxima a ella. Pueden usarse abreviaturas estándar, p. ej., pb, par(es) de bases; kb, kilobase(s); pl, picolitros(s); s o sec, segundo(s); min, minuto(s);
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h o h, hora(s); aa, aminoácido(s); kb, kilobase(s); pb, par(es) de bases; nt, nucleótidos(s); i.m., (por vía) intramuscular; i.p., (por vía) intraperitoneal; s.c., (por vía) subcutánea; y similares.
Ejemplo 1: Uso de Cas9 para generar modificaciones en ADN diana.
Materiales y métodos
Cepas bacterianas y condiciones de cultivo
Se incubóStreptococcus pyogenes,en medio THY (Caldo Todd Hewitt (THB, Bacto, Becton Dickinson) suplementado con extracto de levadura al 0,2 % (Oxoid) o en TSA (tripticasa de agar de soja, BBL, Becton Dickinson) suplementado con sangre de oveja al 3 %, a 37 °C en una atmósfera suplementada con CO<2>al 5 % sin agitar. Se cultivóEscheñchia coli,cultivado en medio Luria-Bertani (LB) y agar, se incubó a 37 °C con agitación. Cuando se requirió, se añadieron antibióticos adecuados al medio a las siguientes concentraciones finales: ampicilina, 100 pg/ml paraE.coli; cloranfenicol, 33 pg/ml paraEscheñchia coli; kanamicina, 25 pg/ml paraE.coli y 300 pg/ml para S.pyogenes.El crecimiento de las células bacterianas se monitorizó periódicamente midiendo la densidad óptica de alícuotas de cultivo a 620 nm usando un lector de microplacas (Lector de espectros SLT).
Transformación de células bacterianas
La transformación de ADN plasmídico en células deE.coli se realizó según un protocolo de choque térmico estándar. La transformación de S.pyogenesse realizó como se ha descrito anteriormente, con algunas modificaciones. El ensayo de transformación realizado para monitorizar la actividad CRISPR/Casin vivoen el mantenimiento del plásmido se realizó prácticamente como se ha descrito anteriormente. Brevemente, se igualaron células electrocompetentes de S.pyogenesa la misma densidad celular y se sometieron a electroporación con 500 ng de ADN plasmídico. Cada transformación se sembró en placa en dos a tres veces y el experimento se realizó tres veces independientemente con diferentes lotes de células competentes para el análisis estadístico. Las eficiencias de transformación se calcularon como UFC (unidades formadoras de colonias) por pg de ADN. Se realizaron transformaciones de control con agua estéril y vector de cadena principal pEC85.
Manipulaciones de ADN
Las manipulaciones de ADN que incluyen la preparación, la amplificación, la digestión, la ligadura, la purificación, la electroforesis en gel de agarosa de ADN se realizaron según técnicas estándar con modificaciones menores. Se construyeron plásmidos protoespaciadores para la escisiónin vitroy se construyeron ensayos de transformación de S.pyogenescomo se ha descrito anteriormente (4). Se generaron plásmidos protoespaciadores basados en pUC19 adicionales para ensayos de escisiónin vitroligando oligonucleótidos hibridados entre sitios EcoRI y BamHI digeridos en pUC19. El plásmido que contiene el gen GFP se ha descrito anteriormente (41). Se usaron Kits (Qiagen) para la purificación de ADN y la preparación de plásmidos. La mutagénesis del plásmido se realizó usando el kit QuikChange® II XL (Stratagene) o kit de mutagénesis dirigida al sitio QuikChange (Agilent). VBC-Biotech Servicios, Sigma-Aldrich e Integrated DNA Technologies suministraron los oligonucleótidos sintéticos y los ARN.
Oligonucleótidos para plantillas de transcripciónin vitro
Plantillas para ARNcrtra y ARNcr CRISPR de Tipo ll-A transcritos ¡n v itro de S. p y o g e n e s (para ARNcrtra - PCR en ADN de cr. SF370; para el ARNcr - hibridación de dos oligonucleótidos)
ARNcrtra-T7 (75 nt)
OLEC1521 (ARNcrtra 5' D): Id. de sec. n.° 340
OLEC1522 (ARNcrtra 3' I): Id. de sec. n.° 341
ARNcr-T7 (molde)
OLEC2176 (ARNcr-sp1 D): Id. de sec. n.° 342
OLEC2178 (ARNcr-sp1 I): Id. de sec. n.° 343
OLEC2177 (ARNcr-sp2 D): Id. de sec. n.° 344
OLEC2179 (ARNcr-sp2 I): Id. de sec. n.° 345
Moldes para el ARNcrtra de N. m e n in g itid is transcrito in v itro y ARNcr-sp2 modificado por ingeniería genética (para ARNcrtra - PCR en ADN Z2491 para cr.; para el ARNcr - hibridación de dos oligonucleótidos)
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ARNcrtra-T7
OLEC2205 (5' previsto D): Id. de sec. n.° 346
OLEC2206 (3' previsto I): Id. de sec. n.° 347
ARNcr-T7 (molde)
OLEC2209(sp2(speM)D repetición deN.m.):Id. de sec. n.° 348
OLEC2214(sp2(speM)I repetición deN.m.):Id. de sec. n.° 349
Moldes para el ARNcrtra de L. in n o c u a transcrito in v itro y ARNcr-sp2 modificado por ingeniería genética (para ARNcrtra - PCR en ADN Clipl 1262 para cr.; para el ARNcr - hibridación de dos oligonucleótidos)ARNcrtra-T7
OLEC2203 (5' previsto D): Id. de sec. n.° 350
OLEC2204 (3' previsto I): Id. de sec. n.° 351
ARNcr-T7 (molde)
OLEC2207(sp2(speM)D repetición deL.in.):Id. de sec. n.° 352
OLEC2212(sp2(speM)I repetición deL.in.):Id. de sec. n.° 353
Oligonucleótidos para construir plásmidos con protoespaciador para estudiosin vitro e in vivo
Plásmidos para el análisis de s p e M (espaciador 2 (CRISPR de Tipo ll-A, SF370; profago protoespaciador 08232.3 de MGAS8232) in v itro y en S. p y o g e n e s (plantilla: de ADN de cr. MGAS8232 o plásmidos que contienen fragmentos de sp eM )
pEC287
OLEC1555 (speMD): Id. de sec. n.° 354
OLEC1556 (speMI): Id. de sec. n.° 355
pEC488
OLEC2145 (speMD): Id. de sec. n.° 356
OLEC2146 (speMI): Id. de sec. n.° 357
pEC370
OLEC1593 (protoespaciador 2 A22G de pEC488 D): Id. de sec. n.° 358
OLEC1594 (protoespaciador 2 A22G de pEC488 I): Id. de sec. n.° 359
pEC371
OLEC1595 (protoespaciador 2 T10C de pEC488 D): Id. de sec. n.° 360
OLEC1596 (protoespaciador 2 T10C de pEC488 I): Id. de sec. n.° 361
pEC372
OLEC2185 (protoespaciador 2 T7A de pEC488 D): Id. de sec. n.° 362
OLEC2186 (protoespaciador 2 T7A de pEC488 I): Id. de sec. n.° 363
pEC373
OLEC2187 (protoespaciador 2 A6T de pEC488 D): Id. de sec. n.° 364
40
OLEC2188 (protoespaciador 2 A6T de pEC488 I): Id. de sec. n.° 365
pEC374
OLEC2235 (protoespaciador 2 A5T de pEC488 D): Id. de sec. n.° 366
OLEC2236 (protoespaciador 2 A5T de pEC488 I): Id. de sec. n.° 367
pEC375
OLEC2233 (protoespaciador 2 A4T de pEC488 D): Id. de sec. n.° 368
OLEC2234 (protoespaciador 2 A4T de pEC488 I): Id. de sec. n.° 369
pEC376
OLEC2189 (protoespaciador 2 A3T de pEC488 D): Id. de sec. n.° 370
OLEC2190 (protoespaciador 2 A3T de pEC488 I): Id. de sec. n.° 371
pEC377
OLEC2191 (protoespaciador 2 PAM G1C de pEC488 D): Id. de sec. n.° 372
OLEE2192 (protoespaciador 2 PAM G1C de pEC488 I): Id. de sec. n.° 373
pEC378
OLEC2237 (protoespaciador 2 PAM GG1, 2CC de pEC488 D): Id. de sec. n.° 374
OLEC2238 (protoespaciador 2 PAM GG1, 2CC de pEC488 I): Id. de sec. n.° 375
Plásmidos para el análisis de SPy_0700 (espaciador 1 (CRISPR de Tipo ll-A, SF370; profago protoespaciador 0370.1 de SF370 in v i t r o y en S. p y o g e n e s (plantilla: ADN SF370 o plásmidos para cr. que contienen fragmentos de SPy_0700)
pEC489
OLEC2106 (Spy_0700 D): Id. de sec. n.° 376
OLEC2107 (Spy_0700 I): Id. de sec. n.° 377
pEC573
OLEC2941 (PAM TG1,2GG D): Id. de sec. n.° 378
OLEC2942 (PAM TG1, 2GG I): Id. de sec. n.° 379
Oligonucleótidos para la verificación de constructos plasmídicos y sitios de corte mediante análisis de secuenciación ColE1 (pEC85)
poliRN228 (secuenciación I): Id. de sec. n.° 380
speM (pEC287)
OLEC1557 (secuenciación D): Id. de sec. n.° 381
OLEC1556 (secuenciación I): Id. de sec. n.° 382
repDEG-pAMbetal (pEC85)
OLEC787 (secuenciación D): Id. de sec. n.° 383
Oligonucleótidos para ensayos de escisiónin vitro
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ARNcr
ARNcr de espaciador 1 (1-42): Id. de sec. n.° 384
ARNcr del espaciador 2 (1-42): Id. de sec. n.° 385
ARNcr del espaciador 4 (1-42): Id. de sec. n.° 386
ARNcr del espaciador 2 (1-36): Id. de sec. n.° 387
ARNcr del espaciador 2 (1-32): Id. de sec. n.° 388
ARNcr del espaciador 2 (11-42): Id. de sec. n.° 389
ARNcrtra
(4-89): Id. de sec. n.° 390
(15-89): Id. de sec. n.° 391
(23-89): Id. de sec. n.° 392
(15-53): Id. de sec. n.° 393
(15-44): Id. de sec. n.° 394
(15-36): Id. de sec. n.° 395
(23-53): Id. de sec. n.° 396
(23-48): Id. de sec. n.° 397
(23-44): Id. de sec. n.° 398
(1-26): ld.de sec. n.° 399
ARN quiméricos
Espaciador 1 - quimera A: Id. de sec. n.° 400
Espaciador 1 - quimera B: Id. de sec. n.° 401
Espaciador 2 - quimera A: Id. de sec. n.° 402
Espaciador 2 - quimera B: Id. de sec. n.° 403
Espaciador 4 - quimera A: Id. de sec. n.° 404
Espaciador 4 - quimera B: Id. de sec. n.° 405
GFP1: Id. de sec. n.° 406
GFP2: Id. de sec. n.° 407
GFP3: Id. de sec. n.°408
GFP4: Id. de sec. n.° 409
GFP5: Id. de sec. n.°410
Oligonucleótidos de ADN como sustratos para ensayos de escisión (protoespaciador en negrita, PAM subrayado) protoespaciador 1 - complementario - TS: Id. de sec. n.° 411
protoespaciador 1 - no complementario - TS: Id. de sec. n.° 412
42
protoespaciador 2 - complementario - TS: Id. de seo. n.° 413
protoespaciador 2 - no complementario - TS: Id. de sec. n.° 414
protoespaciador 4 - complementario - TS: Id. de sec. n.° 415
protoespaciador 4 - no complementario - TS: Id. de sec. n.° 416
protoespaciador 2 - complementario - PAM1: Id. de sec. n.° 417
protoespaciador 2 - no complementario - PAM1: Id. de sec. n.° 418
protoespaciador 2 - complementario - PAM2: Id. de sec. n.° 419
protoespaciador 2 - no complementario - PAM2: Id. de sec. n.° 420
protoespaciador 4 - complementario - PAM1: Id. de sec. n.° 421
protoespaciador 4 - no complementario - PAM1: Id. de sec. n.° 422
protoespaciador 4 - complementario - PAM2: Id. de sec. n.° 423
protoespaciador 4 - no complementario - PAM2: Id. de sec. n.° 424
Transcripciónin vitroy purificación de ARN
Se transcribió ARNin vitrousando el Kit de transcripciónin vitro 17Flash (Epicentre, lllumina company) y moldes de ADN generados por PCR que portaban una secuencia promotora T7. El ARN se purificó en gel y se verificó la calidad antes de su uso. Los cebadores utilizados para la preparación de moldes de ARN A partir de S. pyogenes SF370, Listeria innocua Clip 11262 y Neisseria meningitidis A Z2491 se han descrito anteriormente.
Purificación de proteínas
La secuencia que codifica Cas9 (residuos 1-1368) fue amplificada por PCR a partir del ADN genómico de S. pyogenes SF370 y se insertó en un vector de expresión basado en pET personalizado usando clonación independiente de ligadura (LIC). El constructo de fusión resultante contenía un marcador de proteína de unión a hexahistidina-maltosa N-terminal (His 6- MBP), seguido de una secuencia peptídica que contenía un sitio de escisión de proteasa del virus del grabado del tabaco (TEV). La proteína se expresó en la cepa de E. coli BL21 Rosetta 2 (DE3) (EMD Biosciences), cultivada en medio 2xTY a 18 °C durante 16 h después de la inducción con IPTG 0,2 mM. La proteína se purificó mediante una combinación de etapas cromatográficas de afinidad, intercambio iónico y exclusión por tamaño. Brevemente, las células se lisaron en Tris 20 mM pH 8,0, NaCI 500 mM, TCEP 1 mM (suplementado con cóctel inhibidor de proteasa (Roche)) en un homogeneizador (Avestin). El lisado clarificado se unió en lote a agarosa Ni-NTA (Qiagen). La resina se lavó exhaustivamente con Tris 20 mM pH 8,0, NaCI 500 mM y la proteína unida se eluyó en Tris 20 mM pH 8,0, NaCI 250 mM, glicerol al 10 %. El marcador de afinidad de Flis6-MBP se retiró por escisión con proteasa TEV, mientras que la proteína se dializó durante la noche contra HEPES 20 mM pH 7,5, KCI 150 mM, TCEP 1 mM, glicerol al 10 %. La proteína Cas9 escindida se separó del marcador de fusión mediante purificación en una columna SP Sepharose HiTrap de 5 mi (GE Life Sciences), eluyendo con un gradiente lineal de KC1100 mM -1 M. La proteína se purificó adicionalmente mediante cromatografía de exclusión por tamaño en una columna Superdex 200 16/60 en FIEPES 20 mM pH 7,5, KCI 150 mM y TCEP 1 mM. La proteína eluida se concentró a -8 mg/ml, se congeló rápidamente en nitrógeno líquido y se almacenó a -80 °C. Los mutantes puntuales Cas9 D10A, FI840A y D10A/FI840A se generaron usandol kit de mutagénesis dirigida al sitio QuikChange (Agilent) y se confirmaron mediante secuenciación de ADN. Las proteínas se purificaron siguiendo el mismo procedimiento que para la proteína Cas9 de tipo silvestre.
Los ortólogos de Cas9 deStreptococcus thermofilus(LMD-9,YP_820832.1), L.innocua(Clipl 1262, NP_472073.1),Campylobacter jejuni(subesp.jejuniNCTC 11168, YP_002344900.1) y N.meningitidis(Z2491, YP_002342100.1) se expresaron en células BL21 Rosetta (DE3) pLysS (Novagen) como proteínas de fusión His6-MBP (N.meningitidisy C.yjejuni),His6-Tiorredoxina (L.innocua)e His6-GST (S.thermofilus),y se purificaron esencialmente como para Cas9 de S.pyogenescon las siguientes modificaciones. Debido a grandes cantidades de ácidos nucleicos de copurificación, las cuatro proteínas Cas9 se purificaron mediante una etapa adicional de sefarosa de hepañna antes de la filtración en gel, eluyendo la proteína unida con un gradiente lineal de KCI 100mM-2M. Esto retiró exitosamente la contaminación de ácidos nucleicos de las proteínas de C. jejuni, N. meningitidis y L. innocua, pero no pudo retirar los ácidos nucleicos de copurificación de la preparación de Cas9 de S. thermophilus. Todas las proteínas se concentraron a 1-8 mg/ml en HEPES 20 mM pH 7,5, KCI 150 mM y TCEP 1 mM, se congelaron rápidamente en N2 líquido y se almacenaron a -80 °C.
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Ensayo de escisión de ADN plasmídico
Se prehibridaron ARNcrtra y ARNcr sintéticos o transcritosin vitroantes de la reacción calentando a 95 °C y enfriando lentamente hasta temperatura ambiente. El ADN plasmídico linealizado nativo o digerido por restricción (300 ng (~8 nM)) se incubó durante 60 minutos a 37 °C con proteína Cas9 purificada (50-500 nM) y dúplex ARNcrtra:ARNcr (50 500 nM, 1: 1) en un tampón de escisión del plásmido Cas9 (HEPES 20 mM pH 7,5, KCI 150 mM, DTT 0,5 mM, EDTA 0,1 mM) con o sin MgCh 10 mM. Las reacciones se detuvieron con tampón de carga de ADN 5X que contenía EDTA 250 mM, se resolvieron mediante electroforesis en gel de agarosa al 0,8 o 1 % y se visualizaron mediante tinción con bromuro de etidio. Para los ensayos de escisión de mutantes de Cas9, las reacciones se detuvieron con tampón de carga de SDS 5X (glicerol al 30 %, SDS al 1,2 %, EDTA 250 mM) antes de la carga en el gel de agarosa.
Ensayo de escisión dependiente de metal
Se incubó ADN plasmídico protoespaciador 2 (5 nM) durante 1 h a 37 °C con Cas9 (50 nM) preincubado con ARNcrtra:ARNcr-sp250 nM en tampón de escisión (HEPES 20 mM pH 7,5, KCI 150 mM, DTT 0,5 mM, EDTA 0,1 mM) suplementado con MgCL 1, 5 o 10 mM, MnCh 1 o 10 mM, CaChZnChCoCL, NiSCU o CuSCU. La reacción se detuvo añadiendo tampón de carga de SDS 5X (glicerol al 30 %, SDS al 1,2 %, EDTA 250 mM), se resolvió mediante electroforesis en gel de agarosa al 1 % y se visualizó mediante tinción con bromuro de etidio.
Ensayo de recambio único
Se preincubó Cas9 (25 nM) durante 15 min a 37 °C en tampón de escisión (HEPES 20 mM pH 7,5, KC1150 mM, MgCh 10 mM, DTT 0,5 mM, EDTA 0,1 mM) con ARNcrtra:ARNcr-sp2 prehibridados (25 nM, 1: 1) o ambos ARN (25 nM) no prehibridados y la reacción se inició añadiendo ADN plasmídico de protoespaciador 2 (5 nM). La mezcla de reacción se incubó a 37 °C. En intervalos de tiempo definidos, las muestras se extrajeron de la reacción, se añadió tampón de carga SDS 5X (glicerol al 30 %, SDS al 1,2 %, EDTA 250 mM) para detener la reacción y se monitorizó la escisión mediante electroforesis en gel de agarosa al 1 % y tinción con bromuro de etidio. Lo mismo se realizó para la cinética de recambio único sin preincubación de Cas9 y ARN, donde el ADN plasmídico protoespaciador 2 (5 nM) se mezcló en tampón de escisión con dúplex ARNcrtra:ARNcr-sp2 (25 nM) o ambos ARN (25 nM) no prehibridados, y la reacción se inició mediante la adición de Cas9 (25 nM). El porcentaje de escisión se analizó por densitometría y el promedio de tres experimentos independientes se representó frente al tiempo. Los datos se ajustaron mediante análisis de regresión no lineal y se calcularon las velocidades de escisión (kobs [min-1]).
Ensayo de recambio múltiple
Se preincubó Cas9 (1 nM) durante 15 min a 37 °C en tampón de escisión (HEPES 20 mM pH 7,5, KC1150 mM, MgCh 10 mM, DTT 0,5 mM, EDTA 0,1 mM) con ARNrRNA:ARNcr-sp2 prehibridados (1 nM, 1: 1). La reacción se inició mediante la adición de ADN plasmídico protoespaciador 2 (5 nM). En intervalos de tiempo definidos, se extrajeron muestras y la reacción se detuvo añadiendo tampón de carga de SDS 5X (glicerol al 30 %, SDS al 1,2 %, EDTA 250 mM). La reacción de escisión se resolvió mediante electroforesis en gel de agarosa al 1 %, se tiñó con bromuro de etidio y el porcentaje de escisión se analizó por densitometría. Los resultados de cuatro experimentos independientes se representaron frente al tiempo (min).
Ensayo de escisión de ADN de oligonucleótido
Se radiomarcaron oligonucleótidos de ADN (10 pmol) incubando con 5 unidades de polinucleótido quinasa T4 (New England Biolabs) y ~3-6 pmol (2040 mCi) [y-32P]-ATP (Promega) en tampón de reacción de polinucleótido quinasa T4 1X a 37 °C durante 30 min, en una reacción de 50 pl. Después de la inactivación por calor (65 °C durante 20 min), las reacciones se purificaron a través de una columna Ilustra MicroSpin G-25 (GE Healthcare) para retirar el marcador no incorporado. Se generaron sustratos dúplex (100 nM) mediante hibridación de oligonucleótidos marcados con cantidades equimolares de oligonucleótido complementario sin marcar a 95 °C durante 3 min, seguido de enfriamiento lento a temperatura ambiente. Para los ensayos de escisión, se hibridaron ARNcrtra y ARNcr mediante calentamiento a 95 °C durante 30 s, seguido de enfriamiento lento a temperatura ambiente. Se preincubó Cas9 (concentración final 500 nM) con el dúplex ARNcrtra:ARNcr hibridado (500 nM) en tampón de ensayo de escisión (HEPES 20 mM pH 7,5, KC1100 mM, MgCh 5 mM, DTT 1 mM, glicerol al 5 %)en un volumen total de 9 pl. Las reacciones se iniciaron mediante la adición de 1 pl de ADN diana (10 nM) y se incubaron durante 1 h a 37 °C. Las reacciones se inactivaron mediante la adición de 20 pl de colorante de carga (EDTA 5 mM, SDS al 0,025 %, glicerol al 5 % en formamida) y se calentaron a 95 °C durante 5 min. Los productos de escisión se resolvieron en geles de poliacrilamida desnaturalizantes al 12 % que contenían urea 7 M y se visualizaron mediante formación de imágenes por fósforo (Storm, GE Life Sciences). Se realizaron ensayos de escisión que someten a ensayo los requisitos de PAM (Figura 13B) usando sustratos dúplex de ADN que se habían prehibridado y purificado en un gel de acrilamida nativo al 8 %, y posteriormente radiomarcado en ambos extremos 5'. Las reacciones se establecieron y analizaron como anteriormente.
Ensayos de desplazamiento de movilidad electroforética
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Se formaron dúplex de ADN diana mezclando cada cadena (10 nmol) en agua desionizada, calentando a 95 °C durante 3 min y enfriamiento lentamente a temperatura ambiente. Todos los ADN se purificaron en geles nativos al 8 % que contenían TBE 1X. Se visualizaron bandas de ADN mediante sombreado UV, se extrajeron y se eluyeron mediante trozos de gel de empapado en H<2>O tratada con DEPC. El ADN eluido se precipitó con etanol y se disolvió en H<2>O tratada con DEPC. Las muestras de ADN se marcaron en el extremo 5' con [y-32P]-ATP usando polinucleótido quinasa T4 (New England Biolabs) durante 30 min a 37 °C. Se desnaturalizó por calor PNK a 65 °C durante 20 min, y el radiomarcador no incorporado se retiró usando una columna Ilustra MicroSpin G-25 (GE Healthcare). Se realizaron en tampón que contenía HEPES 20 mM pH 7,5, KC1100 mM, MgCh 5 mM, DTT 1 mM y gllcerol al 10 % en un volumen total de 10 pl. El muíante doble D10A/H840A de Cas9 se programó con cantidades equimolares de dúplex ARNcrtra:ARNcr prehibridado y se valoró volumétricamente de 100 pM a 1 pM. Se añadió ADN radiomarcado a una concentración final de 20 pM. Las muestras se incubaron durante 1 h a 37 °C y se resolvieron a 4 °C en un gel de poliacrilamida nativo al 8 % que contenía TBE 1Xy MgCh 5 mM. Los geles se secaron y el ADN se visualizó mediante formación de imágenes por fósforo.
Análisis informático de secuencias de ADN y proteínas
Se usó el paquete Vector NTI (Invitrogen) para el análisis de la secuencia de ADN (Vector NTI) y el análisis comparativo de secuencias de las proteínas (AlignX).
Modelado informático de la estructura de ARN y coplegamiento
Se realizaron predicciones informáticas usando los algoritmos del paquete de ARN Vienna (42, 43). Se predijeron estructuras secundarias de ARN y modelos de coplegamiento se predijeron con RNAfoId and RNAcofoId, respectivamente y se visualizaron con VARNA (44).
Resultados
Las bacterias y arqueas tienen sistemas de defensa adaptativo mediados por ARN que se denominan grupos de repeticiones palindrómicas cortas en intervalos regulares (CRISPR)/CRISPR-asociado (Cas) que protegen a los organismos de los virus y los plásmidos invasores (1-3). Se muestra que en un subconjunto de estos sistemas, el ARNcr maduro que tiene pares emparejados con el ARNcr de activación trans (ARNcrtra) forma una estructura de dos ARN que dirige la proteína Cas9 asociada a CRISPR para introducir roturas bicatenarias (be) en el ADN diana. En sitios complementarios a la secuencia guía de ARNcr, el dominio nucleasa HNH de Cas9 escinde la cadena complementaria, mientras que el dominio similar a RuvC de Cas9 escinde la cadena no complementaria. El ARNcrtra:ARNcrdual, cuando se modifica por ingeniería genética como una única quimera de ARN, también dirige la escisión de ADNbc de Cas9 específica de secuencia. Estos estudios revelan una familia de endonucleasas que usan ARN duales para la escisión de ADN específica de sitio y destacan la capacidad de aprovechar el sistema para la edición genómica programable por ARN.
Los sistemas de defensa de CRISPR/Cas dependen de ARN pequeños para la detección específica de secuencia y el silenciamiento de ácidos nucleicos extraños. Los sistemas CRISPR/Cas se componen de genes cas organizados en un operón u operones y la matriz o matrices de CRISPR que consisten en secuencias de localización específica al genoma (denominadas espaciadores) intercaladas con repeticiones idénticas (1-3). La inmunidad mediada por CRISPR/Cas se produce en tres etapas. En la fase adaptativa, las bacterias y arqueas que albergan uno o más loci de CRISPR responden a la exposición vírica o del plásmido integrando fragmentos cortos de secuencia extraña (protoespaciadores) en el cromosoma hospedador en el extremo proximal de la matriz de CRISPR (1-3). En las fases de expresión e interferencia, la transcripción del elemento espaciador de repetición en moléculas de ARN de CRISPR (pre-ARNcr) precursoras seguido de escisión enzimática produce los ARNcr cortos que pueden emparejarse con secuencias protoespaciadoras complementarias de dianas víricas o plasmídicas invasoras (4-11). El reconocimiento objetivo por ARNcr dirige el silenciamiento de las secuencias extrañas por medio de proteínas Cas que actúan en complejo con los ARNcr (10, 12-20).
Existen tres tipos de sistemas CRISPR/Cas (21-23). Los sistemas de tipo I y III comparten algunas características generales: las endonucleasas Cas especializadas procesan los pre-ARNcr y, una vez maduro, cada ARNcr se ensambla en un complejo de múltiples proteínas Cas grande capaz de reconocer y escindir ácidos nucleicos complementarios al ARNcr. Por el contrario, los sistemas de tipo II procesan preARNcr por un mecanismo diferente en el que un ARNcr de trans-activación (ARNcrtra) complementario a las secuencias de repetición en el procesamiento de los accionadores de pre-ARNcr por la ribonucleasa RNasa III específica de ARN bicatenario (be) en presencia de la proteína Cas9 (anteriormente Csn1) (Figura 15) (4, 24). Se cree que Cas9 es la única proteína responsable del silenciamiento guiado por ARNcr de ADN extraño (25-27).
Se muestra que en los sistemas de tipo II, las proteínas Cas9 constituyen una familia de enzimas que requieren una estructura de bases emparejadas formada entre el ARNcrtra activador y el ARNcr de localización específica para escindir el ADNbc diana. La escisión específica de sitio se produce en ubicaciones determinadas por la complementariedad de emparejamiento de bases entre el ARNcr y el ADN protoespaciador diana y un motivo corto [denominado motivo adyacente protoespaciador (PAM)] yuxtapuesto a la región complementaria en el ADN diana. El
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estudio de los presentes inventores demuestra además que la familia de endonucleasas Cas9 puede programarse con moléculas de ARN único para escindir sitios de ADN específicos, facilitando de este modo el desarrollo de un sistema dirigido a ARN simple y versátil para generar roturas de ADNbc para la localización específica y la edición del genoma.
Cas9 es una endonucleasa de ADN guiada por dos ARN
Se ha hipotetizado que Cas9, la proteína distintiva de los sistemas de tipo II, está implicada tanto en la maduración de ARNcr como en la interferencia de ADN guiada por ARNcr (Figura 15) (4,25-27). Cas9 está implicada en la maduración de ARNcr (4), pero no se ha investigado su participación directa en la destrucción de ADN diana. Para probar si Cas9 podría ser capaz escindir el ADN diana y cómo, los presentes inventores usaron un sistema de sobreexpresión para purificar la proteína Cas9 derivada del patógenoStreptococcus pyogenes(Figura 16, véanse los materiales y métodos suplementarios) y probar su capacidad para escindir un ADN plasmídico o un dúplex de oligonucleótido que porta una secuencia protoespaciadora complementaria a un ARNcr maduro y un PAM auténtico. Los presentes inventores descubrieron que el ARNcr maduro solo fue incapaz de dirigir la escisión de ADN plasmídico catalizada por Cas9 (Figura 10Ay Figura 17A). Sin embargo, la adición de ARNcrtra, que puede emparejarse con la secuencia de repetición de ARNcr y es esencial para la maduración de ARNcr en este sistema, accionó Cas9 para escindir el ADN plasmídico (Figura 10A y Figura 17A). La reacción de escisión requirió tanto magnesio como la presencia de una secuencia de ARNcr complementaria al ADN; un ARNcr susceptible de emparejamiento de bases de ARNcrtra, pero que contiene una secuencia de unión a ADN diana no afín, no respaldó la escisión del plásmido catalizada por Cas9 (Figura 10A; Figura 17A, comparar ARNcr-sp2 con ARNcr-sp1; y Figura 18A). Los presentes inventores obtuvieron resultados similares con un sustrato de ADNbc lineal corto (Figura 10B y Figura 17, B y C). Por lo tanto, el ARNcrtra transactivador es un ARN no codificante pequeño con dos funciones críticas: accionar el procesamiento de pre-ARNcr por la enzima RNasa III (4) y posteriormente activar la escisión de ADN guiada por ARNcr por Cas9.
La escisión tanto de plásmido como de ADNbc lineal corto por Cas9 guiada por ARNcrtra:ARNcr es específica de sitio (Figura 10, C A E y Figura 19, A y B). La escisión de ADN plasmídico produjo extremos romos en una posición tres pares de bases en dirección 5' de la secuencia de PAM (Figura 10, C y E, y Figura 19, A y C) (26). Similarmente, dentro de dúplex de ADNbc cortos, la cadena de ADN que es complementaria a la secuencia de unión a la diana en el ARNcr (la cadena complementaria) se escinde en un sitio tres pares de bases en dirección 5' del PAM (Figura 10, D y E, y Figura 19, B y C). La cadena de ADN no complementaria se escinde en uno o más sitios dentro de tres a ocho pares de bases en dirección 5' del PAM. Una investigación adicional reveló que la cadena no complementaria se escinde en primer lugar endolíticamente y posteriormente se recorta por una actividad exonucleasa 3'-5' (Figura 18B). Las velocidades de escisión por Cas9 en condiciones de recambio único variaron de 0,3 a 1 min-1, comparables a las de las endonucleasas de restricción (Figura 20A), mientras que la incubación de complejo Cas9-ARNcrtra:ARNcr de tipo silvestre (TS) con un exceso molar de cinco veces de ADN sustrato proporcionó evidencia de que la Cas9 guiada por ARN dual es una enzima de recambio múltiple (Figura 20B). En contraste con el complejo de CRISPR de tipo I Cascada (18), Cas9 escinde tanto los plásmidos linealizados como superenrollados (Figuras 10A y 11A). Por lo tanto, un plásmido invasor puede, en principio, ser escindido múltiples veces por las proteínas Cas9 programadas con diferentes ARNcr.
Figura 10 (A)Se programó Cas9 con un ARNcr-sp2 de 42 nucleótidos (ARNcr que contenía una secuencia espaciadora 2) en presencia o ausencia de ARNcrtra de 75 nucleótidos. El complejo se añadió a ADN plasmídico circular o linealizado con Xhol que porta una secuencia complementaria al espaciador 2 y un PAM funcional. ARNcrsp1, control de especificidad; M, marcador de ADN; kpb, kilo par de bases. Véase la Figura 17A.(B)Se programó Cas9 con ARNcr-sp2 y ARNcrtra (nucleótidos 4 a 89). El complejo se incubó con ADN bicatenarios o monocatenarios que albergan una secuencia complementaria al espaciador 2 y un PAM funcional (4). Las cadenas complementarias o no complementarias del ADN se radiomarcaron en 5' y se hibridaron con una cadena compañera no marcada, nt, nucleótidos. Véase la Figura 17, B y C.(C)Análisis de secuenciación de los productos de escisión de la Figura 10A. La terminación de la extensión del cebador en la reacción de secuenciación indica la posición del sitio de escisión. El saliente A 3' terminal (asteriscos) es un artefacto de la reacción de secuenciación. Véase la Figura 19, A y C.(D)Los productos de escisión de la Figura 10B se analizaron junto con marcadores de tamaño marcados en el extremo 5' derivados de las cadenas complementarias y no complementarias del dúplex de ADN diana. M, marcador; P, producto de escisión. Véase la Figura 19, B y C.(E)Representación esquemática de secuencias de ADN de ARNcrtra, ARNcrsp2 y protoespaciador 2. Se representan regiones de complementariedad de ARNcr con ADN de ARNcrtra (línea superior) y protoespaciador (línea inferior). La secuencia de PAM está etiquetada; los sitios de escisión mapeados en (C) y (D) se representan por flechas rellenas de color blanco (C), una flecha rellena de color negro [(D), cadena complementaria] y una barra de color negro [(D), cadena no complementaria].
LaFigura 15representa la vía inmunitaria de CRISPR/Cas mediada por ARN de tipo II. Las etapas de expresión e interferencia se representan en el dibujo. Los loci de CRISPR/Cas de tipo II se componen de un operón de cuatro genes que codifican las proteínas Cas9, Casi, Cas2 y Csn2, una matriz de CRISPR que consiste en una secuencia líder seguida de repeticiones idénticas (rectángulos de color negro) intercaladas con espaciadores de localización específica de genoma únicos (diamantes) y una secuencia que codifica el ARNcrtra transactivador. En la presente memoria se representa el locus de CRISPR/Cas de tipo II de S.pyogenesSF370 (Número de registro NC_002737) (4). Se indican en este locus promotores y un terminador de la transcripción confirmados experimentalmente (4). La
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matriz de CRISPR se transcribe como una molécula de ARN de CRISPR precursor (pre-ARNcr) que experimenta un proceso de maduración específico para los sistemas de tipo II (4). En S.pyogenesSF370, ARNcrtra se transcribe como dos transcritos primarios de 171 y 89 nt de longitud que tienen complementariedad con cada repetición del pre-ARNcr. El primer evento de procesamiento implica el emparejamiento de ARNcrtra con pre-ARNcr, formando un ARN dúplex que es reconocido y escindido por la endorribonucleasa constitutiva RNasa III en presencia de la proteína Cas9. La escisión mediada por ARNasa III del ARN dúplex genera un ARNcrtra procesado de 75 nt y un ARNcr intermedio de 66 nt que consiste en una región central que contiene una secuencia de un espaciador, flanqueado por porciones de la secuencia de repetición. Un segundo evento de procesamiento, mediado por una o más ribonucleasas desconocidas, conduce a la formación de ARNcr maduros de 39 A 42 nt de longitud que consisten en una secuencia guía derivada del espaciador 5'-terminal y una secuencia 3'-terminal derivada de repetición. Después de los eventos de procesamiento primero y segundo, el ARNcrtra maduro permanece emparejado con los ARNcr maduros y unido a la proteína Cas9. En este complejo ternario, la estructura ARNcrtra:ARNcr dual actúa como ARN guía que dirige la endonucleasa Cas9 al ADN diana afín. El reconocimiento de diana por el complejo Cas9-ARNcra:ARNcr se inicia mediante el barrido de la molécula de ADN invasora para determinar la homología entre la secuencia protoespaciadora en el ADN diana y la secuencia derivada del espaciador en el ARNcr. Además de la complementariedad protoespaciador de ADN-espaciador de ARNcr, la localización específica de ADN requiere la presencia de un motivo corto (NGG, donde N puede ser cualquier nucleótido) adyacente al protoespaciador (motivo adyacente al protoespaciador - PAM). Después del emparejamiento entre el ARN dual y la secuencia protoespaciadora, se forma un bucle R y Cas9 posteriormente introduce una rotura bicatenaria (DSB) en el ADN. La escisión de ADN diana por Cas9 requiere dos dominios catalíticos en la proteína. En un sitio específico con respecto al PAM, el dominio HNH escinde la cadena complementaria del ADN mientras que el dominio similar a RuvC escinde la cadena no complementaria.
Figura 16 (A) Se expresó Cas9 de S.pyogenesenE. colicomo una proteína de fusión que contiene un marcador de His6-MBP N-terminal y se purificó mediante una combinación de etapas cromatográficas de afinidad, intercambio iónico y exclusión por tamaño. El marcador de afinidad se retiró por escisión de la proteasa TEV después de la etapa de purificación por afinidad. Se muestra un cromatograma de la etapa final de cromatografía de exclusión por tamaño en una columna Superdex 200 (16/60). Cas9 eluye como un único pico monomérico desprovisto de ácidos nucleicos contaminantes, según lo juzgado por la relación de absorbancias a 280 y 260 nm. Inserción; las fracciones eluidas se resolvieron mediante SDS-PAGE en un gel de poliacrilamida al 10% y se tiñeron con SirnplyBlue Safe Stain (Invitrogen). (B) Análisis por SDS-PAGE de ortólogos de Cas9 purificados. Los ortólogos de Cas9 se purificaron como se describe en Materiales suplementarios y métodos. Se analizaron 2,5 pg de cada Cas9 purificada en un gel de poliacrilamida con gradiente del 4-20 % y se tiñeron con SirnplyBlue Safe Stain.
Figura 17 (véase también la Figura 10). La secuencia protoespaciadora 1 se origina a partir de SPy_0700 de S.pyogenesSF370 (M1), diana de ARNcrspI de S.pyogenesSF370 (4). En la presente memoria, la secuencia protoespaciadora 1 se manipuló cambiando el PAM a partir de una secuencia no funcional (TTG) a una funcional (TGG). La secuencia protoespaciadora 4 se origina a partir de MGAS10750_Spy1285 de S.pyogenesMGAS10750 (M4), diana de ARNcr-sp4 de S.pyogenesSF370 (4). (A) Escisión de ADN plasmídico de protoespaciador 1 guiada por dúplex ARNcrtra:ARNcr afines. Los productos de escisión se resolvieron mediante electroforesis en gel de agarosa y se visualizaron mediante tinción con bromuro de etidio. M, marcador de ADN; se indican los tamaños de los fragmentos en pares de bases. (B) Escisión de ADN de oligonucleótido protoespaciador 1 guiada por dúplex ARNcrtra:ARNcr-sp1 afín. Los productos de escisión se resolvieron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante y se visualizaron mediante formación de imágenes por fósforo. Se indican tamaños de fragmentos en nucleótidos. (C) Escisión de ADN de oligonucleótido protoespaciador 4 guiada por dúplex ARNcrtra:ARNcr-sp4 afín. Los productos de escisión se resolvieron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante y se visualizaron mediante formación de imágenes por fósforo. Se indican tamaños de fragmentos en nucleótidos. (A, B, C) Los experimentos en (A) se realizaron como en la Figura 10A; en (B) y en (C) como en la Figura 10B. (B, C) A continuación se muestra un esquema de la interacción de ADN diana de ARNcrtra:ARNcr. Las regiones de complementariedad de ARNcr con ARNcrtra y el ADN protoespaciador tienen una línea superior y una línea inferior, respectivamente. La secuencia de PAM está etiquetada.
Figura 18 (véase también la Figura 10). (A) Se incubó ADN plasmídico protoespaciador 2 con Cas9 complejada con ARNcrtra:ARNcr-sp2 en presencia de diferentes concentraciones de Mg2+, Mn2+, Ca2+, Zn2+, Co2+, N¡2+ o Cu2+. Los productos de escisión se resolvieron mediante electroforesis en gel de agarosa y se visualizaron mediante tinción con bromuro de etidio. Se indican las formas plasmídicas. (B) Un dúplex de ADN oligonucleotídico protoespaciador 4 que contiene un motivo PAM se hibridó y se purificó en gel antes del radiomarcaje en ambos extremos 5'. El dúplex (concentración final 10 nM) se incubó con Cas9 programada con ARNcrtra (nucleótidos 23-89) y ARNcrsp4 (concentración final 500 nM, 1:1). En los puntos temporales indicados (min), se inactivaron alícuotas de 10 pl de la reacción de escisión con tampón de formamida que contenía SDS al 0,025%y EDTA 5 mM, y se analizaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante como en la Figura 10B. Se indican los tamaños en nucleótidos.
Figura 19 (A) Mapeo de la escisión de ADN plasmídico de protoespaciador 1. Los productos de escisión de la Figura 17A se analizaron mediante secuenciación como en la Figura 10C. Nótese que el saliente A terminal 3'(asterisco) es un artefacto de la reacción de secuenciación. (B) Mapeo de la escisión de ADN oligonucleotídico protoespaciador 4. Los productos de escisión de la Figura 17C se analizaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida
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desnaturalizante junto con marcadores de tamaño de oligonucleótido marcados en los extremos 5' derivados de las cadenas complementarias y no complementarias del ADN dúplex protoespaclador 4. M, marcador; P, producto de escisión. Calles 1-2: cadena complementaria. Calles 3-4: cadena no complementaria. Se indican tamaños de fragmentos en nucleótidos. (C) Representaciones esquemáticas de las secuencias de ADN de ARNcrtra, ARNcr-sp1 y protoespaciador 1 (parte superior) y las secuencias de ADN de ARNcrtra, ARNcrsp4 y protoespaciador 4 (parte inferior). ARNcrtra:ARNcr forma una estructura de ARN dual dirigida al ADN de protoespaciador complementario a través del emparejamiento ARNcr-ADN de protoespaciador. Las regiones complementarias de ARNcr con ARNcrtra y el ADN protoespaciador tienen una línea superior y una línea inferior, respectivamente. Los sitios de escisión en las cadenas de ADN complementarias y no complementarias mapeados en (a) (parte superior) y (B) (parte inferior) se representan con flechas (A y B, cadena complementaria) y una barra de color negro (B, cadena no complementaria) por encima de las secuencias, respectivamente.
Figura 20 (A) Cinética de conversión única de Cas9 en diferentes condiciones de prehibridación de ARN y preincubación de proteína-ARN. Se incubó ADN plasmídico de protoespaciador 2 con Cas9 preincubada con ARNcrtra:ARNcr-sp2 prehibridado (°), Cas9 no preincubada con ARNcrtra:ARNcr-sp2 prehibridado (•), Cas9 preincubada con ARNcrtra y ARNcr-sp2 no prehibridados (□) o Cas9 no preincubada con ARN no prehibridados (■). La actividad de escisión se controló de una manera dependiente del tiempo y se analizó mediante electroforesis en gel de agarosa seguida de tinción con bromuro de etidio. El porcentaje promedio de escisión de tres experimentos independientes se representa frente al tiempo (min) y se ajustó con una regresión no lineal. Las velocidades de escisión calculadas(ko b s )se muestran en la tabla. Los resultados sugieren que la unión de Cas9 a los ARN no está limitada por la velocidad en las condiciones probadas. Se indican las formas plasmídicas. Los valores dekobsobtenidos son comparables a los de las endonucleasas de restricción que son típicamente del orden de 1-10 por minuto (45 47). (B) Cas9 es una endonucleasa de recambio múltiple. Se incubó Cas9 cargada con ARNcrtra:ARNcr-sp2 duplexado (1 nM, 1:1:1 - indicado con línea gris en el gráfico) con un exceso de 5 veces del ADN plasmídico de protoespaciador 2 nativo. La escisión se controló extrayendo muestras de la reacción a intervalos de tiempo definidos (0 a 120 min) seguido de análisis de electroforesis en gel de agarosa (parte superior) y determinación de la cantidad del producto de escisión (nM) (parte inferior). Se indican las desviaciones estándar de tres experimentos independientes. En el intervalo de tiempo investigado, Cas9 1 nM fue capaz de escindir ADN plasmídico ~2,5 nM. Cada dom inio nucleasa de Cas9 escinde una cadena de ADN
Cas9 contiene dominios homólogos a las endonucleasas HNH y RuvC (Figura 11A y Figura 3) (21-23, 27, 28). Los presentes inventores diseñaron y purificaron variantes de Cas9 que contenían mutaciones puntuales inactivadoras en los residuos catalíticos de los dominios HNH o similar a RuvC (Figura 11A y Figura 3) (23, 27). La incubación de estas variantes de proteínas Cas9 con ADN plasmídico nativo mostró que las proteínas Cas9 mutantes guiadas por ARN dual produjeron plásmidos circulares abiertos mellados, mientras que el complejo proteína Cas9 TS-ARNcra:ARNcr produjo un producto de ADN lineal (Figuras 10A y 11A y Figuras 17A y 25A). Este resultado indica que los dominios HNH y similar a RuvC de Cas9 escinden cada uno una cadena de ADN plasmídico. Para determinar qué cadena del ADN diana es escindida por cada dominio catalítico de Cas9, los presentes inventores incubaron los complejos Cas9-ARNcrtra:ARNcr mutantes con sustratos de ADNbc cortos en los que la cadena complementaria o no complementaria estaba radiomarcada en su extremo 5'. Los productos de escisión resultantes indicaron que el dominio HNH de Cas9 escinde la cadena de ADN complementaria, mientras que el dominio similar a RuvC de Cas9 escinde la cadena de ADN no complementaria (Figura 11B y Figura 21B).
Figura 11(A) (Parte superior) Representación esquemática de la estructura del dominio Cas9 que muestra las posiciones de las mutaciones del dominio. D10A, Asp10^Ala10; H840A; His840-Ala840. Se ensayaron omplejos de proteínas Cas9 TS o mutantes de nucleasa con ARNcr: ARNcr-sp2 para determinar la actividad endonucleasa como en la Figura 10A. (B) Se probaron complejos de Cas9 TS o mutantes de dominio nucleasa con ARNcrtra y ARNcr-sp2 para determinar la actividad como en la Figura 10B.
Figura 3 Se representa la secuencia de aminoácidos de Cas9 de S.pyogenes(Id. de seo. n.° 8). Las proteínas Cas9/Csn1 de varias especies diversas tienen 2 dominios que incluyen motivos homólogos a ambas endonucleasas HNH y RuvC. (A) Se muestran los motivos 1-4 (los números de motivo están marcados en el lado izquierdo de la secuencia) para Cas9/Csn1 de S.pyogenes.Los tres motivos de similar a RuvC predichos (1,2 ,4) y el motivo de HNH (3) predicho tienen una línea superior. Los residuos Asp10 e His840, que estaban sustituidos por Ala en este estudio, se destacaron con un asterisco por encima de la secuencia. Los residuos subrayados están altamente conservados entre las proteínas Cas9 de diferentes especies. Es probable que las mutaciones en los residuos subrayados tengan consecuencias funcionales en la actividad de Cas9. Nótese que en el presente estudio se demuestra experimentalmente el acoplamiento de las dos actividades similares a nucleasas (Figura 11 y Figura 21). (B) Se representan los dominios 1 (aminoácidos 7-166) y 2 (aminoácidos 731-1003), que incluyen los motivos 1-4, para Cas9/Csn1 de S.pyogenes.Refiérase a la Tabla 1 y la Figura 5 para consultar información adicional.
Figura 21 Escisión de ADN protoespaciador por mutantes de Cas9 dirigidos por ARNcrtra:ARNcr afines que contienen mutaciones en el dominio HNH o similar a RuvC. (A) Escisión de ADN plasmídico protoespaciador 1. El experimento se realizó como en la Figura 11 A. Se indican las conformaciones de ADN plasmídico y los tamaños en pares de bases. (B) Clonación de ADN oligonucleotídico espaciador 4. El experimento se realizó como en la Figura 11B. Se indican los tamaños en nucleótidos.
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Requisitos de ARN Dual para la unión y escisión de ADN diana
Podría ser necesario ARNcrtra para la unión a ADN diana y/o para estimular la actividad nucleasa de Cas9 corriente abajo del reconocimiento de la diana. Para distinguir entre estas posibilidades, los presentes inventores usaron un ensayo de desplazamiento de movilidad electroforética para monitorizar la unión del ADN diana por Cas9 catalíticamente inactiva en presencia o ausencia de ARNcr y/o ARNcrtra. La adición de ARNcrtra potenció sustancialmente la unión a ADN diana por Cas9, mientras que se observó poca unión a ADN específica con Cas9 sola o Cas9- ARNcr (Figura 22). Esto indica que es necesario ARNcrtra para el reconocimiento de ADN diana, posiblemente al orientar adecuadamente el ARNcr para la interacción con la cadena complementaria del ADN diana. La estructura secundaria de ARNcrtra:ARNcr predicha incluye el emparejamiento de bases entre los 22 nucleótidos en el extremo 3' del ARNcr y un segmento cerca del extremo 5' del ARNcrtra maduro (Figura 10E). Esta interacción crea una estructura en la que los 20 nucleótidos 5'-terminales del ARNcr, que varían en su secuencia en diferentes ARNcr, están disponibles para la unión a ADN diana. La mayor parte del ARNcrtra en dirección 5' de la región de emparejamiento de bases de ARNcr está libre para formar una estructura o estructuras de ARN adicionales y/o para interactuar con Cas9 o el sitio de ADN diana. Para determinar si la longitud completa del ARNcrtra es necesaria para la escisión de ADN catalizada por Cas9 específica de sitio, los presentes inventores probaron complejos Cas9-ARNcra-ARNcr reconstituidos usando ARNcr maduro de longitud completa (42 nucleótidos) y diversas formas truncadas de ARNcrtra que carecían de secuencias en sus extremos 5' o 3'. Estos complejos se probaron para determinar la escisión usando un ADNbc diana corto. Una versión sustancialmente truncada del ARNcrtra que retiene los nucleótidos 23 a 48 de la secuencia nativa fue capaz de respaldar una escisión robusta de ADN catalizada por Cas9 guiada por ARN dual (Figura 12, A y C, y Figura 23, A y B). El truncamiento del ARNcr de cualquier extremo demostró que la escisión catalizada por Cas9 en presencia de ARNcrtra podría accionarse con ARNcr en los que faltan los 10 nucleótidos 3'-terminales (Figura 12, B y C). Por el contrario, una deleción de 10 nucleótidos del extremo 5' de ARNcr impidió la escisión de ADN por Cas9 (Figura 12B). Los presentes inventores también analizaron ortólogos de Cas9 de diversas especies bacterianas para determinar su capacidad para respaldar la escisión de ADN guiada por ARNcrtra:ARNcr de S.pyogenes.A diferencia de los ortólogos de Cas9 de S.pyogenesestrechamente relacionados, los ortólogos relacionados más distantemente no fueron funcionales en la reacción de escisión (Figura 24). Similarmente, la Cas9 de S.pyogenesguiada por dúplex ARNcrtra:ARNcr originados a partir de sistemas más distantes no fue capaz de escindir el ADN eficientemente (Figura 24). La especificidad de especie de la escisión guiada por ARN de ADN indica la evolución conjunta de Cas9, ARNcrtra y la repetición de ARNcr, así como la existencia de una estructura y/o secuencia todavía desconocida en el ARN dual que es fundamental para la formación del complejo ternario con ortólogos de Cas9 específicos.
Para investigar los requisitos de la secuencia protoespaciadora para la inmunidad de CRISPR/Cas de tipo II en células bacterianas, los presentes inventores analizaron una serie de ADN plasmídicos que contenían protoespaciador que albergaban mutaciones de nucleótido único para su mantenimiento después de la transformación en S.pyogenesy su susceptibilidad para ser escindidos por Cas9in vitro.A diferencia de las mutaciones puntuales introducidas en el extremo 5' del protoespaciador, las mutaciones en la región próxima al PAM y los sitios de escisión por Cas9 no se toleraronin vivoy dieron como resultado una disminución de la eficiencia de escisión del plásmidoin vitro(Figura 12D). Los resultados de los presentes inventores concuerdan con una publicación anterior de mutantes de escape de protoespaciador seleccionados en el sistema CRISPR de tipo II de S. thermophilusin vivo(27, 29). Además, el mantenimiento del plásmido y los resultados de escisión indican la existencia de una región “ semilla” ubicada en el extremo 3' de la secuencia del protoespaciador que es crucial para la interacción con el ARNcr y la posterior escisión por Cas9. Respaldando esta noción, Cas9 potenció la hibridación de la cadena de ADN complementaria con el ARNcr; esta potenciación fue la más fuerte en la región 3'-terminal de la secuencia de localización específica de ARNcr (Figura 25A-C). Corroborando este descubrimiento, se requiere un tramo contiguo de al menos 13 pares de bases entre el ARNcr y el sitio de ADN diana proximal al PAM para la escisión eficiente de la diana, mientras que se toleran hasta seis emparejamientos erróneos contiguos en la región 5'-terminal del protoespaciador (Figura 12E). Estos descubrimientos recuerdan a los requisitos de secuencia de siembra observados anteriormente para el reconocimiento de ácido nucleico diana en proteínas Argonauta (30, 31) y los complejos CRISPR Cascada y Csy (13, 14).
Figura 12 (A) Se reconstituyeron complejos Cas9-ARNcrtra ARNcr usando constructos de 42-nucleótidos de ARNcrsp2 y ARNcrtra truncado y se ensayó su actividad de escisión como en la Figura 10B. (B) Se ensayó Cas9 programada con truncamientos de ARNcr-sp2 y ARNcrtra de longitud completa para determinar su actividad como en (A).(C)Regiones mínimas de ARNcrtra y ARNcr capaces de guiar la escisión de ADN mediada por Cas9 (región sombreada). (D) Se escindieronin vitroplásmidos que contenían secuencias de protoespaciador 2 TS o mutantes con mutaciones puntuales indicadas mediante Cas9 programada como en la Figura 10A y se usaron para ensayos de transformación de S.pyogenesTS o deficiente en pre-ARNcr. La eficacia de transformación se calculó como unidades formadoras de colonias (UFC) por microgramo de ADN plasmídico. Las barras de error representan las DE para tres réplicas biológicas. (E) Se escindieronin vitroplásmidos que contenían insertos de protoespaciador 2 TS y mutantes con una extensión variable de los emparejamientos erróneos de ARNcr-ADN diana (parte inferior) mediante Cas9 programada (parte superior). Las reacciones de escisión se digirieron adicionalmente con Xmnl. Los fragmentos de 1880 y 800 pb son productos de escisión generados por Cas9. M, marcador de ADN.
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Figura 22 Se realizaron ensayos de desplazamiento de movilidad electroforétlca usando dúplex de ADN diana protoespaciador 4 y Cas9 (que contenía mutaciones inactivadoras de dominio nucleasa D10A y H840) sola o en presencia de ARNcr-sp4, ARNcrtra (75 nt), o ambos. El dúplex de ADN diana estaba radiomarcado en ambos extremos 5'. Cas9 (D10/H840A) y los complejos se valoraron volumétricamente de 1 nM a 1 pM. La unión se analizó mediante electroforesis en gel de poliacrilamida nativa al 8 % y se visualizó mediante formación de imágenes por fósforo. Nótese que Cas9 sola se une a ADN diana con afinidad moderada. Esta unión no se ve afectada por la adición de ARNcr, lo que sugiere que esto representa la interacción no específica de secuencia con el ADNbc. Además, esta interacción puede ser superada por ARNcrtra solo en ausencia de ARNcr. En presencia tanto de ARNcr como de ARNcrtra, la unión a ADN diana se potencia sustancialmente y produce una especie con movilidad electroforética distinta, indicativa del reconocimiento específico de ADN diana.
Figura 23 Un fragmento de ARNcrtra que abarca una parte de la región emparejada por ARNcr y una porción de la región en dirección 3' es suficiente para dirigir la escisión de ADN oligonucleotídico protoespaciador por Cas9. (A) Escisión de ADN oligonucleotídico de protoespaciador 1 y (B) Escisión de ADN oligonucleotídico de protoespaciador 4 por Cas9 guiada con un ARNcr maduro afín y diversos fragmentos de ARNcrtra. (A, B) Se indican los tamaños en los nucleótidos.
Figura 24 Como Cas9 de S.pyogenes,los ortólogos de Cas9 estrechamente relacionados de las bacterias grampositivasL. innocuay S.thermophilusescinden el ADN de protoespaciador cuando es localizado específicamente por ARNcrtra:ARNcr de S.pyogenes.Sin embargo, en las mismas condiciones, no se observa escisión de ADN por los ortólogos Cas9 menos estrechamente relacionados de las bacterias gramnegativas C.jejuniyN. meningitidis.Spy S.pyogenesSF370 (Número de registro NC_002737); Sth, S.thermophilusLMD-9 (ortólogo de Cas9 STER_1477; Número de registro NC_008532); Lin,L. innocuaClipl 1262 (Número de registro NC_003212); Cje, C.jejuniNCTC 11168 (Número de registro NC_002163); Nme,N. meningitidis AZ2491 (Número de registro NC_003116). (A) Escisión de ADN plasmídico protoespaciador. Se sometió ADN plasmídico de protoespaciador 2 (300 ng) a escisión por diferentes ortólogos de Cas9 (500 nM) guiados por dúplex híbridos ARNcrtra:ARNcr-sp2 (500 nM, 1: 1) de diferentes especies. Para diseñar los dúplex de ARN, los presentes inventores predijeron secuencias de ARNcrtra deL. innocuayN. meningitidisbasándose en datos de transferencia Northern publicados anteriormente(4).Los dúplex de ARN híbridos duales consisten en ARNcrtra específico de especie y un ARNcr heterólogo. La secuencia de ARNcr heterólogo se modificó por ingeniería genética para que contuviera la secuencia sp2 de localización específica de ADN de S.pyogenes en el extremo 5' fusionado a la secuencia de repetición de unión a ARNcrtra deL. innocuaoN. meningitidis enel extremo 3'. Los ortólogos de Cas9 de S.thermophilusyL. innocua,pero no deN. meningitidis o C. jejuni,pueden ser guiados por ARNcrtra:ARNcr-sp2 de S.pyogenespara escindir el ADN plasmídico de protoespaciador 2, aunque con una eficacia ligeramente disminuida. De forma similar, el ARNcrtra:ARNcr-sp2 híbrido de L.innocuapuede guiar a la Cas9 de S.pyogenespara escindir el ADN diana con una eficiencia alta, mientras que el ARNcrtra:ARNcr-sp2 híbrido deN. meningitidisdesencadena solamente una ligera actividad de escisión de ADN por Cas9 de S.pyogenes.Como controles, los ortólogos de Cas9 deN. meningitidisyL. innocuaescinden el ADN plasmídico protoespaciador 2 cuando son guiados por el ARNcrtra-ARNcr-sp2 híbrido afín. Obsérvese que, como se ha mencionado anteriormente, la secuencia de ARNcrtra deN.meningitidissolamente se predice y aún no se ha confirmado mediante secuenciación de ARN. Por lo tanto, la eficacia de escisión baja podría ser el resultado de una actividad baja de los ortólogos de Cas9 o el uso de una secuencia de ARNcrtra no diseñada de manera óptima. (B) Escisión de ADN oligonucleotídico protoespaciador. El oligonucleótido de cadena complementaria radiomarcado en el extremo 5' (10 nM) prehibridado con oligonucleótido de cadena no complementaria sin marcar (protoespaciador 1) (10 nM) (izquierda) o el oligonucleótido de cadena no complementaria radiomarcado en el extremo 5' (10 nM) prehibridado con oligonucleótido de cadena complementaria sin marcar (10 nM) (derecha) (protoespaciador 1) se sometió a escisión por diversos ortólogos de Cas9 (500 nM) guiados por dúplex ARNcrtra:ARNcr-sp1 de S.pyogenes(500 nM, 1:1). Los ortólogos de Cas9 de S.thermophilusyL. innocua,pero no deN. meningitidiso C.jejuni,pueden ser guiados por ARN dual afín de S.pyogenespara escindir el ADN oligonucleotídico de protoespaciador, aunque con una eficiencia disminuida. Nótese que el sitio de escisión en la cadena de ADN complementaria es idéntico para los tres ortólogos. La escisión de la cadena no complementaria se produce en posiciones distintas. (C) Identidad de secuencia de aminoácidos de ortólogos de Cas9. Los ortólogos Cas9 de S.pyogenes, S. thermophilusyL. innocuacomparten un alto porcentaje de identidad de aminoácidos. En cambio, las proteínas Cas9 deC. jejuniyN. meningitidisdifieren en secuencia y longitud (-300-400 aminoácidos más cortas). (D) Coplegamientos de secuencias de ARNcr heterólogas específicas de especie modificadas por ingeniería genética con los ortólogos de ARNcrtra correspondientes de S.pyogenes(confirmados experimentalmente,(4)), L. innocua(predichos) oN. meningitidis(predichos). ARNcrtra; los fragmentos del espaciador 2 de ARNcr; y los fragmentos de repeticiones de ARNcr están trazados y etiquetados. Los dúplex ARNcrtra:ARNcrsp2 híbridos deL. innocuay S.pyogenescomparten características estructurales muy similares, aunque distintas de las del ARNcrtra:ARNcr híbrido deN. meningitidis.Junto con los datos de escisión descritos anteriormente en (A) y (B) , las predicciones de plegamiento indicarían que la escisión con especificidad de especie del ADN diana por Cas9-ARNcrtra:ARNcr está dictada por una característica estructural aún desconocida en el dúplex ARNcrtra:ARNcr que es reconocida específicamente por un ortólogo de Cas9 afín. Se predijo que la especificidad de especie de la escisión observada en (A) y (B) se produce al nivel de unión de Cas9 a ARNcrtra:ARNcr dual. La escisión por Cas9 guiada por ARN dual del ADN diana puede ser específica de especie. Dependiendo del grado de diversidad/evolución entre las proteínas Cas9 y los dúplex ARNrARN:ARNcr, Cas9 y los ortólogos de ARN dual son parcialmente intercambiables.
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Figura 25 Se analizó una serie de sondas de ADN de 8 nucleótidos complementarlas a las regiones en el ARNcr que abarcan la región de localización específica de ADN y la región de unión a ARNcrtra para determinar su capacidad para hibridarse con el ARNcr en el contexto de un dúplex ARNcrtra:ARNcr y el complejo ternario Cas9-ARNcrtra:ARNcr. (A) Representación esquemática de las secuencias de sondas de ADN utilizadas en el ensayo y sus sitios de unión en ARNcr-sp4. (B-C) Ensayos de desplazamiento de movilidad electroforética de sondas de ADN diana con ARNcrtra:ARNcr-sp4 o Cas9-traARNcr:ARNcr-sp4. El constructo de ARNcrtra (15-89) se usó en el experimento. La unión de los dúplex o complejos a los ADN oligonucleotídicos diana se analizó en un gel de poliacrilamida nativo al 16 % y se visualizó mediante formación de Imágenes por fósforo.
Un motivo de secuencia corta dicta la formación de bucles R
En múltiples sistemas CRISPR/Cas, se ha demostrado que el reconocimiento de lo propio frente a lo no propio implica un motivo de secuencia corta que está conservado en el genoma extraño, denominado PAM (27, 29, 32-34). Los motivos PAM tienen solamente unos pocos pares de bases de longitud, y su secuencia y posición precisas varían según el tipo de sistema CRISPR/Cas (32). En el sistema de tipo II de S.pyogenes,el PAM se adapta a una secuencia consenso de NGG, que contiene dos pares de bases G: C que se producen un par de bases en dirección 3' de la secuencia de unión a ARNcr, dentro del ADN diana (4). Los ensayos de transformación demostraron que el motivo GG es esencial para la eliminación del ADN plasmídico protoespaciador por CRISPR/Cas en células bacterianas (Figura 26A), lo que es coherente con observaciones anteriores en S.thermophilus(27). El motivo también es esencial para la escisión del plásmido protoespaciadorin vitropor Cas9 guiada por ARNcrtra:ARNcr (Figura 26B). Para determinar el papel de la PAM en la escisión de ADN diana por el complejo Cas9-ARNcrtra:ARNcr, los presentes inventores probaron una serie de mutaciones que contenían dúplex de ADNbc en la secuencia de PAM en las cadenas complementarias o no complementarias, o ambas (Figura 13A). Los ensayos de escisión usando estos sustratos mostraron que la escisión de ADN catalizada por Cas 9 fue particularmente sensible a las mutaciones en la secuencia de PAM en la cadena no complementaria del ADN, a diferencia del reconocimiento de PAM de cadena complementaria por los sistemas CRISPR/Cas de tipo I (18, 34). La escisión de los ADN monocatenarios diana no se vio afectada por las mutaciones del motivo PAM. Esta observación sugiere que el motivo PAM solamente se requiere en el contexto de ADNbc diana y, por lo tanto, puede ser necesario para permitir el desenrollamiento del dúplex, la invasión de cadenas y la formación de una estructura de bucle R. Cuando los presentes inventores usaron un par ARNcr-ADN diana diferente (ARNcr-sp4 y ADN protoespaciador 4), seleccionado debido a la presencia de un PAM canónico no presente en el ADN diana protoespaciador 2, los presentes inventores descubrieron que ambos nucleótidos G del PAM fueron necesarios para la escisión eficiente de ADN catalizada por Cas9 (Figura 13B y Figura 26C). Para determinar si el PAM desempeña una función directa en el reclutamiento del complejo Cas9-ARNcrtra:ARNcr con el sitio de ADN diana correcto, los presentes inventores analizaron las afinidades de unión del complejo por las secuencias de ADN diana mediante ensayos de desplazamiento de movilidad en gel nativo (Figura 13C). La mutación de G en la secuencia de PAM redujo sustancialmente la afinidad de Cas9-ARNcrtra: ARNcr por el ADN diana. Este descubrimiento ilustra una función para la secuencia de PAM en la unión a ADN diana por Cas9.
Figura 13 (A) Se probó Cas9 programada por ARN dual para determinar su actividad como en la Figura 10B. Las secuencias de PAM TS y mutantes en el ADN diana se indican con líneas. (B) Se incubaron dúplex de ADN diana protoespaciador 4 (marcados en ambos extremos 5') que contenían motivos PAM TS y mutantes con Cas9 programada con ARNcrtra:ARNcr-sp4 (nucleótidos 23 a 89). En los puntos temporales indicados (en minutos), se tomaron alícuotas de la reacción de escisión y se analizaron como en la Figura 10B. (C) Se realizaron ensayos de desplazamiento de movilidad electroforética usando dúplex de Cas9 programada por ARN (D10A/H840A)y ADN diana protoespaciador 4 [igual que en (B)]que contenían motivos PAM TS y mutados. El complejo Cas9 (D10A/H840A)-ARN se valoró volumétricamente de 100 pM a 1 mM.
Figura 26 (A) Las mutaciones de la secuencia de PAM en ADN plasmídico de protoespaciador 2 impiden la interferencia del mantenimiento del plásmido por el sistema CRISPR/Cas de Tipo II en células bacterianas. Se transformaron plásmidos de protoespaciador 2 de tipo silvestre con un PAM funcional o mutado en S.pyogenesde tipo silvestre (cepa SF370, también denominada EC904) y mutante deficiente en pre-ARNcr (EC1479)como en la Figura 12D. El sistema CRISPR/Cas de Tipo IIin vivono tolera mutaciones de PAM. Se muestran los valores medios y las desviaciones estándar de tres réplicas biológicas. (B) Las mutaciones de la secuencia de PAM en ADN plasmídico protoespaciador impiden la escisión por Cas9-traARNcr:ARNcr. Se sometió plásmido protoespaciador 2 de tipo silvestre con un PAM funcional o mutado a escisión por Cas9 como en la Figura 10A. Los plásmidos de PAM mutantes no son escindidos por el complejo Cas9-ARNcrtra:ARNcr. (C) Las mutaciones de la secuencia de PAM canónica impiden la interferencia del mantenimiento del plásmido por el sistema CRISPR/Cas de Tipo II en células bacterianas. Se escindieron plásmidos protoespaciadores 4 de tipo silvestre con un PAM funcional o mutado con Cas9 programada con ARNcrtra y ARNcr-sp2. Las reacciones de escisión se realizaron en presencia de la endonucleasa de restricción Xmnl para visualizar los productos de escisión por Cas9 como dos fragmentos (-1880 y -800 pb). Se indican los tamaños de los fragmentos en pares de bases.
Cas9 puede programarse con un ARN quimérico único
El examen de la estructura secundaria probable del dúplex ARNcrtra:ARNcr (Figuras 10E y 12C) sugirió la posibilidad de que las características requeridas para la escisión de ADN catalizada por Cas9 específica de sitio podrían
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capturarse en un ARN quimérico único. Aunque el mecanismo de selección de diana de ARNcrtra:ARNcr funciona eficientemente en la naturaleza, la posibilidad de una Cas9 guiada por ARN único es atractiva debido a su potencial utilidad para la escisión de ADN programada y la edición del genoma (Figura 1A-B). Los presentes inventores diseñaron dos versiones de un ARN quimérico que contenía una secuencia de reconocimiento diana en el extremo 5' seguida de una estructura de horquilla que retenía las interacciones de emparejamiento de bases que se producen entre el ARNcrtra y el ARNcr (Figura 14A). Este transcrito único fusiona eficazmente el extremo 3' del ARNcr con el extremo 5' del ARNcrtra, imitando de este modo la estructura de ARN dual requerida para guiar la escisión de ADN específica de sitio por Cas9. En los ensayos de escisión usando ADN plasmídico, se observó que el ARN quimérico más largo fue capaz de guiar la escisión de ADN catalizada por Cas9 de una manera similar A la observada para el dúplex ARNcrtra:ARNcr truncado (Figura 14A y Figura 27, A y C). El ARN quimérico más corto no funcionó eficientemente en este ensayo, lo que confirma que los nucleótidos que tienen de 5 a 12 posiciones más allá de la interacción de emparejamiento de bases de ARNcrtra:ARNcr son importantes para la unión eficiente de Cas9 y/o el reconocimiento de la diana. Se obtuvieron resultados similares en ensayos de escisión usando ADNbc corto como sustrato, lo que indica además que la posición del sitio de escisión en el ADN diana es idéntica a la observada usando el ARNcrtra:ARNcr dual como guía (Figura 14B y Figura 27, B y C). Por último, para establecer si el diseño del ARN quimérico podría ser universalmente aplicable, lo presentes inventores modificaron por ingeniería genética cinco ARN guía quiméricos diferentes para la localización específica en una porción del gen que codifica la proteína verde fluorescente (GFP) (Figura 28, A a C) y probaron su eficacia contra un plásmido que porta la secuencia codificante de GFPin vitro.En los cinco casos, la Cas9 programada con estos ARN quiméricos escindió eficazmente el plásmido en el sitio diana correcto (Figura 14C y Figura 28D), lo que indica que el diseño racional de ARN quiméricos es robusto y podría, en principio, permitir la localización específica de cualquier secuencia de ADN de interés con pocas restricciones más allá de la presencia de un dinucleótido GG adyacente a la secuencia localizada específicamente.
Figura 1Un ARN de localización específica de ADN comprende un “segmento de localización específica de ADN” monocatenario y un “ segmento de unión a proteínas” , que comprende un tramo de ARN bicatenario. (A) Un ARN de localización específica de ADN puede comprender dos moléculas de ARN separadas (denominadas ARN de localización específica de ADN “de molécula doble" o “de dos moléculas” ). Un ARN de localización específica de ADN de molécula doble comprende un “ARN localizador específico” y un “ARN activador” (B) Un ARN de localización específica de ADN puede comprender una molécula única de ARN (denominada ARN de localización específica de ADN de “ molécula única” ). Un ARN de localización específica de ADN de molécula única comprende “ nucleótidos enlazadores”
Figura 14 (A)Un plásmido que albergaba la secuencia diana del protoespaciador 4 y una PAM TS se sometieron a escisión por Cas9 programada con dúplex ARNcrtra(4-89):ARNcr-sp4 o ARN quiméricos transcritosin vitroconstruidos uniendo el extremo 3' del ARNcr al extremo 5' del ARNcrtra con un tetrabucle GAAA. Las reacciones de escisión se analizaron mediante mapeo de restricción con Xmnl. Las secuencias de los ARN quiméricos A y B se muestran con secuencias de localización específica de ADN (línea inferior), secuencias derivadas de repeticiones de ARNcr (línea superior) y secuencias derivadas de ARNcrtra (subrayado discontinuo).(B)Las reacciones de escisión de dúplex de ADN de protoespaciador 4 se realizaron como en la Figura 10B.(C)Se usaron cinco ARN quiméricos diseñados para localizar específicamente el gen de GFP para programar Cas9 para escindir un plásmido que contenía el gen de GFP. Se realizaron reacciones de escisión de plásmidos como en la Figura 12E, excepto por que el ADN plasmídico se mapeó por restricción con Avrll después de la escisión por Cas9.
Figura 27 (A)Un ARN quimérico único guía la escisión catalizada por Cas9 de ADN plasmídico de protoespaciador afín (protoespaciador 1 y protoespaciador 2). Las reacciones de escisión se realizaron en presencia de la endonucleasa de restricción Xmnl para visualizar los productos de escisión por Cas9 como dos fragmentos (-1880 y -800 pb). Se indican los tamaños de los fragmentos en pares de bases.(B)Un ARN quimérico único guía la escisión catalizada por Cas9 de ADN oligonucleotídico protoespaciador afín (protoespaciador 1 y protoespaciador 2). Se indican tamaños de fragmentos en nucleótidos.(C)Representaciones esquemáticas de los ARN quiméricos utilizados en el experimento. Las secuencias de los ARN quiméricos A y B se muestran con la secuencia de localización específica de ADN protoespaciador 5' de ARNcr (subrayado), la secuencia de unión a ARNcrtra de ARNcr (línea superior) y la secuencia derivada de ARNcrtra (subrayado discontinuo).
Figura 28 (A)Representación esquemática del plásmido de expresión de GFP pCFJ127. La porción de localización específica del marco de lectura abierto de GFP se indica con una punta de flecha de color negro.(B)Primer plano de la secuencia de la región localizada específicamente. Se muestran secuencias localizadas específicamente por los ARN quiméricos con barras de color gris. Los dinucleótidos PAM están recuadrados. Un sitio de restricción Salí único se ubica 60 pb antes del locus diana.(C)Izquierda: Se muestran secuencias de ADN diana junto con sus motivos PAM adyacentes. Derecha: Secuencias de los ARN guía quiméricos.(D)Se escindió pCFJ127 porCas9 programada con ARN quiméricos GFP 1-5, como se indica. El plásmido se digirió de forma adicional con Salí y las reacciones se analizaron mediante electroforesis en un gel de agarosa al 3 % y se visualizaron mediante tinción con SYBR Safe.
Conclusiones
Se identificó un mecanismo de interferencia de ADN, que implica una estructura de ARN dual que dirige una endonucleasa Cas9 para introducir roturas bicatenarias específicas de sitio en el ADN diana. La proteína Cas9 guiada
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por ARNcrtra:ARNcr hace uso de dominios de endonucleasa distintos (dominios HNH y similar a RuvC) para escindir las dos cadenas en el ADN diana. El reconocimiento diana por Cas9 requiere tanto una secuencia semilla en el ARNcr como una secuencia de PAM que contenga dinucleótido GG adyacente a la región de unión a ARNcr en el ADN diana. Se demuestra además que la endonucleasa Cas9 puede programarse con ARN guía modificado por ingeniería genética como un único transcrito para localizar específicamente y escindir cualquier secuencia de ADNbc de interés. El sistema es eficiente, versátil y programable cambiando la secuencia de unión al ADN diana en el ARN quimérico guía. Las nucleasas de dedos de cinc y las nucleasas efectoras similares a activador de la transcripción han atraído un interés considerable como enzimas artificiales modificadas por ingeniería genética para manipular genomas (35 38). Esto representa una metodología alternativa basada en Cas9 programada por ARN que facilita aplicaciones de localización específica de genes y edición genómica.
Referencias citadas
1. B. Wiedenheft, S. H. Sternberg, J. A. Doudna,Nature482, 331 (2012).
2. D. Bhaya, M. Davison, R. Barrangou,Annu. Rev. Genet.45, 273 (2011).
3. M. P. Terns, R. M. Terns,Curr. Opin. Microbio!.14, 321 (2011).
4. E. Deltcheva y col.,Nature471, 602 (2011).
5. J. Carie, R. Wang, H. Li, R. M. Terns, M. P. Terns,Genes Dev.22, 3489 (2008).
6. R. E. Haurwitz, M. Jinek, B. Wiedenheft, K. Zhou, J. A. Doudna,Science329, 1355 (2010).
7. R. Wang, G. Preamplume, M. P. Terns, R. M. Terns, H. Li,Structure19, 257 (2011).
8. E. M. Gesner, M. J. Schellenberg, E. L. Garside, M. M. George, A. M. Macmillan,Nat. Struct. Mol. Biol.18, 688<(>2011<).>
9. A. Hatoum-Aslan, I. Maniv, L. A. Marraffini,Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A.108, 21218 (2011).
10. S. J. J. Brouns y col.,Science321,960 (2008).
11. D. G. Sashital, M. Jinek, J. A. Doudna,Nat. Struct. Mol. Biol.18, 680 (2011).
12. N. G. Lintnery col.,J. Biol. Chem.286, 21643 (2011).
13. E. Semenova y col.,Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A.108, 10098 (2011).
14. B. Wiedenheft y col.,Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A.108, 10092 (2011).
15. B. Wiedenheft y col.,Nature477, 486 (2011).
16. C. R. Hale y col., Ce//139, 945 (2009).
17. J. A. L. Howard, S. Delmas, I. Ivancic-Bace, E. L. Bolt,Biochem. J.439, 85 (2011).
18. E. R. Westra y col.,Mol.Ce//46, 595 (2012).
19. C. R. Hale y col.,Mol.Ce//45, 292 (2012).
20. J. Zhang y col.,Mol.Ce//45, 303 (2012).
21. K. S. Makarova y col.,Nat. Rev. Microbiol.9, 467 (2011).
22. K. S. Makarova, N. V. Grishin, S. A. Shabalina, Y. I. Wolf, E. V. Koonin,Biol. D ire c ta ,!(2006).
23. K. S. Makarova, L. Aravind, Y. I. Wolf, E. V. Koonin,Biol. Direct6,38 (2011).
24. S. Gottesman,Nature471,588 (2011).
25. R. Barrangou y col.,Science315, 1709 (2007).
26. J. E. Garneau y col.,Nature468, 67 (2010).
53
27. R. Sapranauskas y col.,Nucleic Acids Res.39, 9275 (2011).
28. G. K. Taylor, D. F. Heiter, S. Pietrokovski, B. L. Stoddard,Nucleic Acids Res.39, 9705 (2011).
29. H. Deveau y col.,J. BacterioI.190, 1390 (2008).
30. B. P. Lewis, C. B. Burge, D. P. Bartel,Cell120, 15 (2005).
31. G. Hutvagner, M. J. Simard,Nat. Rev. Mol. Cell Blol.9, 22 (2008).
32. F. J. M. Mojica, C. Diez-Villaseñor, J. Garcia-Martínez, C. Almendros,Microbiology155, 733 (2009).
33. L. A. Marraffini, E. J. Sontheimer,Nature463, 568 (2010).
34. D. G. Sashital, B. Wiedenheft, J. A. Doudna,Mol. Cell46, 606 (2012).
35. M. Christian y col.,Genetics186, 757 (2010).
36. J. C. Millery col.,Nat. Biotechnol.29, 143 (2011).
37. F. D. Umov, E. J. Rebar, M. C. Flolmes, H. S. Zhang, P. D. Gregory,Nat. Rev. Genet.11, 636 (2010).
38. D. Carroll,Gene Ther.15, 1463 (2008).
39. J. Sambrook, E. F. Fritsch, T. Maniatis,Molecular Cloning: A Laboratory Manual(Coid Spring Harbor Laboratory Press, Coid Spring Harbor, NY, ed. 2, 1989).
40. M. G. Caparon, J. R. Scott,Genetic manipularon of pathogenlc streptococci. Methods Enzymol.204, 556 (1991). doi: 10.1016/0076-6879(91 )04028-M Medline
41. C. Frakjaer-Jensen y col.,Single-copy insertion of transgenes in Caenorhabditis elegans. Nat. Genet.40, 1375 (2008). doi:10.1038/ng.248 Medline
42. R. B. Denman,Using RNAFOLD to predict the activity of small catalytic RNAs. Biotechniques15, 1090 (1993). Medline
43. I. L. Hofacker, P. F. Stadler,Memory efficient folding algorithms for circular RNA secondary structures. Bioinformatics22, 1172 (2006). doi:10.1093/bioinformatics/btp250 Medline
44. K. Darty, A. Denise, Y. Ponty, VARNA:Interactive drawing and editing o f the RNA secondary structure. Bioinformatics25, 1974 (2009). do¡:10.1093/bioinformatics/btp250 Medline
Ejemplo 2: Edición del genoma programado por ARN en células humanas
Los datos proporcionados a continuación demuestran que Cas9 puede expresarse y localizarse en el núcleo de células humanas, y que se ensambla con ARN guía único (“ARNgu” ; que abarca las características requeridas para la unión de Cas9 y el reconocimiento del sitio diana de ADN) en una célula humana. Estos complejos pueden generar roturas bicatenarias y estimular la reparación de la unión de extremos no homólogos (NHEJ) en el ADN genómico en un sitio complementario a la secuencia de ARNgu, una actividad que requiere tanto Cas9 como el ARNgu. La extensión de la secuencia de ARN en su extremo 3' potencia la actividad de localización específica de ADN en células vivas. Además, los experimentos que usan extractos de células transfectadas muestran que el ensamblaje de ARNgu en Cas9 es el factor limitante para la escisión de ADN mediada por Cas9. Estos resultados demuestran que la edición genómica programada por ARN funciona en células vivas ein vivo.
Materiales y métodos
Diseño y construcción de plásmidos
La secuencia que codifica Cas9de Streptococcus pyogenes(residuos 1-1368) fusionada con un epítopo de HA (secuencia de aminoácidos DAYPYDVPDYASL (Id. de sec. n.° 274), una señal de localización nuclear (secuencia de aminoácidos PKKKRKVEDPKKKRKVD (Id. de sec. n.° 275) con codones optimizados para la expresión humana y se sintetizó mediante GeneArt. La secuencia de ADN es la Id. de sec. n.° 276 y la secuencia de proteína es la Id. de sec. n.° 277. Se usó clonación independiente de la ligadura (LIC) para insertar esta secuencia en vectores de LIC de GFP derivado de pcDNA3.1 y de mCherry (vectores 6D y 6B, respectivamente, obtenidos de UC Berkeley MacroLab), dando como resultado fusiones Cas9-HA-NLS-GFP y Cas9-HA-NLS-mCherry expresadas con el control del promotor CMV. Se expresaron ARNgu guía usando vector de expresión pSilcer 2.1-U6 puro (Life Technologies) y pSuper (Oligomotor).
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Se generaron constructos de expresión de ARN mediante la hibridación de oligonucleótidos complementarios para formar la secuencia de ADN codificante de ARN y ligar el fragmento de ADN hibridado entre los sitios BamHI y Hindlll en pSilencer 2.1-U6 puro y los sitios Hindlll y Hindlll en pSuper.
Condiciones de cultivo celular y transfecciones de ADN
Se mantuvieron células HEK293T en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con suero bovino fetal al 10 % (FBS) en una incubadora humidificada a 37 °C con CO<2>al 5 %. Las células se transfectaron transitoriamente con ADN plasmídico usando el reactivo de transfección de ADN X-tremeGENE (Roche) o el reactivo de transfección Turbofect (Thermo Scientific) con protocolos recomendados. Brevemente, las células HEK293T se transfectaron a una confluencia del 60-80 % en placas de 6 pocilios usando 0,5 pg del plásmido de expresión de Cas9 y 2,0 pg del plásmido de expresión de ARN. Se estimó que las eficiencias de transfección eran del 30-50 % para Tubofect (Figuras 29E y 37A-B) y del 80-90 % para X-tremex (Figura 31B), basándose en la fracción de células positivas para GFP observadas por microscopía de fluorescencia. 48 horas después de la transfección, las células se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se Usaron aplicando 250 pl de tampón de lisis (Hepes 20 mM pH 7,5, cloruro de potasio 100 mM (KCI), cloruro de magnesio 5 mM (MgCh), ditiotreitol (DTT) 1 mM, glicerol al 5 %, Tritón X-100 al 0,1 %, suplementado con cóctel de inhibidor de proteasa Roche) y después se agitaron durante 10 min a 4 °C. El lisado celular resultante se dividió en alícuotas para su análisis adicional. Se aisló ADN genómico de 200 pl de lisado celular usando el Kit DNeasy Blood and Tissue (Qiagen) según el protocolo del fabricante.
Análisis por transferencia Western de la expresión de Cas9
Se recogieron HEK293T, transfectadas con el plásmido de expresión Cas9-HA-NLS-GFP, y se lisaron 48 horas después de la transfección como se indicó anteriormente. Se sometieron a electroforesis 5 ul de lisado en un gel de SDS poliacrilamida al 10 %, se secaron sobre una membrana de PVDF y se sondearon con anticuerpo anti-HA conjugado con peroxidasa de rábano (PBS) (Sigma, dilución 1: 1000 en 1x PBS).
Ensayo Surveyor
El ensayo Surveyor se realizó como se ha descrito anteriormente [10,12,13], Brevemente, el locus de la cadena ligera A de clatrina humana (CLTA) se amplificó por PCR a partir de 200 ng de ADN genómico usando una polimerasa de alta fidelidad, ADN polimerasa de fusión Herculase II (Agilent Technologies) y cebador directo 5'-GCAGCAGAAGAAGCCTTTGT-3' (Id. de sec. n.° //) y cebador inverso 5'-TTCCTCCTCTCCCTCCTCTC-3' (Id. de sec. n.° //). Después, se desnaturalizaron 300 ng del amplicón de 360 pb por calentamiento a 95 °C y se volvieron a hibridar lentamente usando un bloque de calor para rehibridar aleatoriamente cadenas de ADN de tipo silvestre y mutantes. Después, las muestras se incubaron con nucleasa Cel-1 (Kit Surveyor, Transgenomic) durante 1 hora a 42 °C. Cel-1 reconoce y escinde hélices de ADN que contienen emparejamientos erróneos (hibridación tipo silvestre:mutante). Los productos de digestión con nucleasa Cel-1 se separaron en un gel de acrilamida al 10 % y se visualizaron mediante tinción con SYBR Safe (Life Technologies). La cuantificación de las bandas de escisión se realizó usando el software ImageLab (Bio-Rad). El porcentaje de escisión se determinó dividiendo la intensidad promedio de los productos de escisión (160-200 pb) por la suma de las intensidades del producto de PCR sin escindir (360 pb) y el producto de escisión.
Transcripciónin vitro
se transcribióin vitroARN guía usando ARN polimerasa T7 recombinante y un molde de ADN generada por hibridación de oligonucleótidos sintéticos complementarios como se ha descrito anteriormente [14], Los ARN se purificaron mediante electroforesis en gel de acrilamida desnaturalizante de urea 7M, precipitaron etanol y se disolvieron en agua tratada con DEPC.
Análisis por transferencia Northern
Se purificó ARN a partir de células HEK293T usando el kit de aislamiento de ARN pequeño mirVana (Ambion). Para cada muestra, se separaron 800 ng de ARN en un gel de urea-PAGE al 10%después de la desnaturalización durante 10 min a 70 °C en tampón de carga de ARN (TBE 0,5X (pH7,5), azul de bromofenol 0,5 mg/ml, 0,5 mg de xileno cianol y formamida al 47 %). Después de la electroforesis a 10W en tampón de TBE 0,5X hasta que el tinte azul de bromofenol alcanzó el fondo del gel, las muestras se electrosecaron sobre una membrana de Nytran a 20 Voltios durante 1,5 horas en TBE 0,5X. Los ARN transferidos se reticularon sobre la membrana de Nytran en UV-CrossIinker (Strategene) y se prehibridaron a 45 °C durante 3 horas en un tampón que contenía formamida al 40 %, SSC 5X, Dnhardt 3X (0,1 % de cada uno de ficoll, polivinilpirrolidona y BSA) y ADN de esperma de salmón 200 pg/ml. Las membranas prehibridadas se incubaron durante la noche en el tampón de prehibridación suplementado con sonda oligo de ADN antisentido marcada con 5'-32P a 1 millón de rpm/ml. Después de varios lavados en tampón de SSC (lavado final en SCC 0,2X), se tomaron imágenes mediante formación de imágenes por fósforo de las membranas.
Ensayo de escisiónin vitro
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Se prepararon lisados celulares como se ha descrito anteriormente y se incubaron con el plásmido donante CLTA-RFP [10]. Las reacciones de escisión se realizaron en un volumen total de 20 pl y contenían 10 pl de lisado, 2 pl de tampón de escisión 5X (HEPES 100 mM pH 7,5, KCI 500 mM, MgCb 25 mM, DTT 5 mM, glicerol al 25 %) y 300 ng de plásmido. Donde se indica, las reacciones se suplementaron con 10 pmol de ARNgu de CLTA1 transcritoin vitro.Las reacciones se incubaron a 37 °C durante una hora y posteriormente se digirieron con 10 U de Xhol (NEB) durante 30 min adicionales a 37 °C. Las reacciones se detuvieron mediante la adición de Proteinase K (Thermo Scientific) y se incubaron a 37 °C durante 15 min. Los productos de escisión se analizaron mediante electroforesis en un gel de agarosa al 1 % y se tiñeron con SYBR Safe. La presencia de fragmentos de -2230 y -3100 pb es indicativa de escisión mediada por Cas9.
Resultados
Para probar si Cas9 podría programarse para escindir el ADN genómico en células vivas, se coexpresó Cas9 junto con un ARNgu diseñado para la localización específica del gen de la cadena ligera de clatrina humana (CLTA). El locus genómico de CLTA se ha localizado específicamente y editado anteriormente usando ZFN [10]. En primer lugar, los presentes inventores probaron la expresión de una versión con codones humanos optimizados de la proteína Cas9 deStreptococcus pyogenesy ARNgu en células HEK293T humanas. La proteína Cas9 de 160 kDa se expresó como una proteína de fusión que porta un epítopo de HA, una señal de localización nuclear (NLS) y una proteína fluorescente verde (GFP) unida al extremo C-terminal de Cas9 (Figura 29A). El análisis de células transfectadas con un vector que codifica la Cas9 fusionada con GFP reveló abundante expresión y localización nuclear de Cas9 (Figura 29B). La transferencia Western confirmó que la proteína Cas9 se expresa en gran medida intacta en extractos de estas células (Figura 29A). Para programar Cas9, se expresó ARNgu que portaba una secuencia de 20 nucleótidos de 5'-terminal complementaria a la secuencia de ADN diana, y una estructura de bucle de tallo 3'-terminal de 42 nucleótidos necesaria para la unión a Cas9 (Figura 29C). Esta secuencia 3'-terminal corresponde a la estructura de bucle de tallo mínima que se ha utilizado anteriormente para programar Cas9in vitro[ 8 ]. La expresión de este ARNgu fue impulsada por el promotor humano U6 (ARN polimerasa III) [11]. El análisis por transferencia Northern del ARN extraído de células transfectadas con el vector de expresión plasmídico de ARNgu impulsado por promotor U6 mostró que el ARNgu de hecho se expresa, y que su estabilidad se potencia por la presencia de Cas9 (Figura 29D).
Figura 29 demuestra que la coexpresión de Cas9 y ARN guía en células humanas genera roturas de ADN bicatenario en el locus diana. (A) Parte superior; diagrama esquemático del constructo de expresión Cas9-HA-NLS-GFP. Parte inferior; el lisado de células HEK293T transfectadas con el plásmido de expresión de Cas9 se analizó mediante transferencia Western usando un anticuerpo anti-HA. (B) Microscopía de fluorescencia de células HEK293T que expresan Cas9-HA-NLS-GFP.(C)Diseño de un ARN guía único (ARNgu, es decir, un ARN de localización específica de ADN de molécula única) dirigido al locus de CLTA humano. Parte superior; diagrama esquemático del sitio diana de ARNgu en el exón 7 del gen de CLTA humano. La secuencia diana que se híbrida con el segmento guía del ARNgu de CLTA1 se indica mediante “ARNgu de CLTAT’ El motivo adyacente de protoespaciador (PAM) de di-nucleótido GG está marcado por una flecha. Las líneas de color negro indican las regiones de unión a ADN de la proteína ZFN de control. El codón de terminación de la traducción del marco de lectura abierto de CLTA está marcado con una línea de puntos por referencia. Mitad; diagrama esquemático del constructo de expresión de ARNgu. El ARN se expresa con el control del promotor U6 Pol III y un tracto poli(T) que sirve como señal de terminación de la transcripción de Pol III. Parte inferior; escisión guiada por ARNgu de ADN diana por Cas9. El ARNgu consiste en un segmento guía 5'-terminal de 20 nt seguido de una estructura de tallo-bucle de 42 nt necesaria para la unión a Cas9. La escisión mediada por Cas9 de las dos cadenas de ADN diana se produce tras desenrollar el ADN diana y la formación de un dúplex entre el segmento guía del ARNgu y el ADN diana. Esto depende de la presencia de un motivo PAM (adecuado para la Cas9 que se usa, p. ej., dinucleótido GG, véase el Ejemplo 1 anterior) en dirección 3' de la secuencia diana en el ADN diana. Nótese que la secuencia diana se invierte con respecto al diagrama superior. (D) Análisis por transferencia Northern de la expresión de ARNgu en células HEK239T. (E) Ensayo de nucleasa Surveyor de ADN genómico aislado de células HEK293T que expresan Cas9 y/o ARNgu de CLTA. Un constructo de ZFN utilizado anteriormente para localizar específicamente el locus de CLTA [10] se usó como un control positivo para detectar la reparación de ADN inducida por DSB por unión de extremos no homólogos.
A continuación, los presentes inventores investigaron si se generan DSB específicas de sitio en células HEK293T transfectadas con Cas9-HA-NLS-mCherry y el ARNgu de CLTA1. Para hacer esto, los presentes inventores sondearon para determinar inserciones y deleciones menores en el locus resultante de la reparación imperfecta mediante NHEJ inducida por DSB usando el ensayo de nucleasa Surveyor [12]. La región de ADN genómico localizado específicamente por Cas9:ARNgu se amplifica mediante PCR y los productos resultantes se desnaturalizan y rehibridan. Los productos de PCR rehibridados se incuban con la endonucleasa de reconocimiento de emparejamiento erróneo Cel-1 y se resuelven en un gel de acrilamida para identificar las bandas de escisión de Cel-1. Como la reparación del ADN mediante NHEJ se induce típicamente por una DSB, una señal positiva en el ensayo Surveyor indica que se ha producido la escisión de ADN genómico. Usando este ensayo, los presentes inventores detectaron la escisión del locus de CLTA en una posición localizada específicamente por el ARNgu de CLTA1 (Figura 29E). Un par de ZFN que localizan específicamente un sitio vecino en el locus de CLTA proporcionó un control positivo en estos experimentos [10].
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Para determinar si la expresión de Cas9 o ARNgu es un factor limitante en las reacciones de edición genómica observadas, los lisados preparados a partir de las células transfectadas se incubaron con ADN plasmídico que albergaba un fragmento del gen de CLTA dirigido por el ARNgu de CLTA1. No se observó escisión de ADN plasmídico tras la incubación con lisado preparado a partir de células transfectadas con el vector de expresión Cas9-HA-NLS-GFP solo, lo que es coherente con los resultados del ensayo Surveyor. Sin embargo, se detectó una escisión de plásmido robusta cuando el lisado se sumplementó con ARNgu de CLTA1 transcritoin vitro(Figura 30A). Además, el lisado preparado a partir de células transfectadas con vectores de expresión de Cas9 y ARNgu respaldó la escisión de plásmidos, mientras que los lisados de células transfectadas con el vector que codifica ARNgu solo no lo hizo (Figura 30A). Estos resultados sugieren que un factor limitante para la función de Cas9 en células humanas podría ensamblarse con el ARNgu. Los presentes inventores probaron esta posibilidad directamente analizando la escisión del plásmido en lisados de células transfectadas como antes en presencia y ausencia de ARNgu exógeno añadido. En particular, cuando se añadió ARNgu exógeno a lisado de células transfectadas con los vectores de expresión de Cas9 y ARNgu, se observó un aumento sustancial en la actividad de escisión de ADN (Figura 30B). Este resultado indica que el factor limitante para la función de Cas9 en células HEK293T es la expresión del ARNgu o su carga en Cas9.
La Figura 30 demuestra que los lisados celulares contienen Cas9:ARNgu activo y respaldan la escisión de ADN específica de sitio. (A) Los lisados de células transfectadas con el plásmido o plásmidos indicados a la izquierda se incubaron con ADN plasmídico que contenía un PAM y la secuencia diana complementaria al ARNgu de CLTA1; donde se indica, la reacción se suplemento con 10 pmol de ARNgu de CLTA1 transcritoin vitro\escisión secundaria con fragmentos generados de Xhol de fragmentos de -2230 y -3100 pb indicativos de escisión mediada por Cas9. Una reacción de control usando lisado de células transfectadas con un constructo de expresión de ZFN muestra fragmentos de un tamaño ligeramente diferente que refleja el desplazamiento del sitio diana de ZFN con respecto al sitio diana de CLTA1. (B) Se incubaron lisados de células transfectadas con plásmido de expresión Cas9-GFP y, cuando se indica, el plásmido de expresión de ARNgu de CLTA1, con ADN plasmídico diana como en (A) en ausencia o presencia de ARNgu de CLTA1 transcritoin vitro.
Como medio para potenciar el ensamblaje de Cas9:ARNguen células vivas, a continuación se sometió a ensayo el efecto de prolongar la presunta región de unión a Cas9 del ARN guía. Se diseñaron dos nuevas versiones del ARNgu de CLTA1 para incluir seis o doce pares de bases adicionales en la hélice que imita las interacciones de emparejamiento de bases entre el ARNcr y el ARNcrtra (Figura 31 A). De forma adicional, el extremo 3' del ARN guía se extendió en cinco nucleótidos basándose en la secuencia nativa del ANRcrtra de S.pyogenes[9], Los vectores que codifican estos ARNgu extendidos en 3' con el control de los promotores U6 o H1 Pol III se transfectaron en células junto con el vector de expresión Cas9-HA-NLS-GFP y se probó la escisión del genoma específico de sitio usando el ensayo Surveyor (Figura 31B). Los resultados confirmaron que la escisión requirió tanto Cas9 como el ARNgu de CLTA1, pero no se produjo cuando Cas9 o ARNgu se expresaron solos. Además, los presentes inventores observaron sustancialmente frecuencias aumentadas de NHEJ, según lo detectado por la escisión de la nucleasa Cel-1, mientras que la frecuencia de la mutagénesis de NFIEJ obtenida con el par de ZFN de control no cambió en gran medida.
La Figura 31 demuestra que la extensión 3' de los constructos de ARNgu potencia la mutagénesis mediada por NFIEJ específica de sitio. (A) El constructo para la expresión de ARNgu de CLTA1 (parte superior) se diseñó para generar transcritos que contenían la secuencia de unión a Cas9 original (v1,0), o dúplex de ARNbc extendidos por 4 pares de bases (v2.1) o 10 pares de bases (v2.2). (B) Ensayo de nucleasa Surveyor de ADN genómico aislado de células FIEK293T que expresan Cas9 y/o ARNgu de CLTA v1.0, v2.1 o v2.2. Un constructo de ZFN utilizado anteriormente para localizar específicamente el locus de CLTA [10] se usó como un control positivo para detectar la reparación de ADN inducida por DSB por unión de extremos no homólogos.
Por lo tanto, los resultados proporcionan el marco para ¡mplementar Cas9 como una herramienta molecular fácil para diversas aplicaciones de edición genómica. Una característica potente de este sistema es el potencial de programar Cas9 con múltiples ARNgu en la misma célula, ya sea para aumentar la eficiencia de la localización específica en un locus único, o como un medio para localizar específicamente varios loci simultáneamente. Dichas estrategias encontrarían una amplia aplicación en experimentos de todo el genoma y esfuerzos de investigación a gran escala tales como el desarrollo de modelos de enfermedad multigénicos.
Ejemplo 3: Las familias de ARNcrtra y Cas9 de los sistemas de inmunidad CRISPR-Cas de tipo II
Se buscaron todos los supuestos loci de CRISPR-Cas de tipo II actualmente existentes en genomas bacterianos disponibles públicamente cribando secuencias homologas a Cas9, la proteína distintiva del sistema de tipo II. Los presentes inventores construyeron un árbol filogenético de una alineación de secuencia múltiple de los ortólogos de Cas9 identificados. La longitud de repetición de CRISPR y la organización génica de los operones cas de los sistemas de tipo II asociados se analizaron en los diferentes sugabrupamientos de Cas9. Se propuso una subclasificación de loci de tipo II y se dividió de forma adicional en subgrupos basándose en la selección de 75 ortólogos representativos de Cas9. Después, los presentes inventores predijeron que las secuencias de ARNcrtra recuperaban las secuencias de repetición de CRISPR y el cribado de anti-repeticiones dentro o en el área adyacente a los genes cas y las matrices de CRISPR de loci de tipo II seleccionados. Se realizó un análisis comparativo de secuencias y estructuras predichas
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de ortólogos de ARNcrtra elegidos. Por último, los presentes inventores determinaron los perfiles de expresión y procesamiento de ARNcrtra y ARNcr de cinco especies bacterianas.
Materiales y métodos
Cepas bacterianas y condiciones de cultivo
Se usaron los siguientes medios para cultivar bacterias en placas: TSA (agartripticasa soja, agarTryticase™ soja (TSA II) BD BBL, Becton (Dickinson) suplementado con sangre de oveja al 3% paraS.mutans(UA159) y BHI (infusión corazón-cerebro, BD Bacto™ Brain Heart Infusión, Becton Dickinson) agar paraL. innocua(Clipl 1262). Cuando se cultivó en cultivos líquidos, el medio THY (Caldo Todd Hewitt (THB, Bacto, Becton Dickinson) suplementado con extracto de levadura al 0,2 % (Servabobacter®) se usó paraS.mutans,caldo BHI paraL. innocua,medio líquido BHI que contenía una mezcla de vitaminas al 1 % VX (Difeo, Becton Dickinson) paraN. meningitidis(A Z2491), MH (caldo Mueller Hinton, Oxoid) que incluye 1 % de mezcla de vitaminas VX para C.jejuni(NCTC 11168; ATCC 700819) y TSB (caldo de soja tríptico, Caldo de soja BD BBL™ Tryticasa™) paraF. novicida(U112). Se incubó S.mutansa 37 °C, C02 al 5 % sin agitar. Las cepas deL. innocua, N. meningitidisyF. novicidase cultivaron aeróbicamente a 37 °C con agitación.C. jejunise cultivó a 37 °C en condiciones microaerófilas usando una atmósfera de campígeno (Oxoide). Al crecimiento de las células bacterianas le siguió la medición de la densidad óptica de los cultivos a 620 nm (DCteo nm) a intervalos de tiempo regulares usando un lector de microplacas (BioTek PowerWave™).
Secuenciación de bibliotecas bacterianas de ARN pequeño.
Se cultivaronC. jejuniNCTC 11168 (ATCC 700819),F. novicidaU112,L. innocuaClipl 1262,N. meningitidisAZ2491 y S.mutansUA159 hasta la fase de crecimiento medio logarítmico y se extrajo el ARN total con TRIzol (Sigma-Aldrich). Se trataron 10 pg de ARN total de cada cepa con DNasa TURBO™ (Ambion) para retirar cualquier ADN genómico residual. Los ARN ribosómicos se retiraron usando los kits Ribo-Zero™ rRNA Removal Kits® para bacterias grampositivas o gramnegativas (Epicentre) según las instrucciones del fabricante. Después de la purificación con el kit RNA Clean & Concentrator™-5 (Zymo Research), las bibliotecas se prepararon usando el kit ScriptMiner™ Small RNA-Seq Library Preparation Kit (Multiplex, compatible con lllumina®, compatible) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los ARN se trataron con la Pirofosfatasa ácida del tababo (TAP) (Epicentre). Se usaron columnas de RNA Clean & Concentrador™-5 (Zymo Research) para la purificación posterior del ARN y la ADN polimerasa de alta fidelidad Phusion® (New England Biolabs) para la amplificación por POR. Se añadieron códigos de barras definidos por el usuario específicos de cada biblioteca (cebadores de código de barras de Sec-ARN (compatibles con lllumina®-) Epicentre) y las muestras se secuenciaron en la secuenciación de próxima generación (unidad de NGS de CSF; en la web en “ csf.” seguido de “ ac.at” ) instalaciones del Vienna Biocenter, Viena, Austria (secuenciación de un solo extremo lllumina).
Análisis de datos de secuenciación de ARNcrtra y ARNcr
Las lecturas de secuenciación de ARN se dividieron usando la herramienta de ilumina2bam y se recortaron mediante (i) la retirada de las secuencias del adaptador lllumina (cutadapt 1.0) y (ii) la retirada de 15 nt en el extremo 3' para mejorar la calidad de las lecturas. Después de la retirada las lecturas más cortas de 15 nt, las lecturas de ADNc se alinearon con su genoma respectivo usando Bowtie al permitir 2 emparejamientos erróneos: C.jejuni(GenBank: NC_002163),F. novicida(GenBank: NC_008601),N. meningitidis(GenBank: NC_003116),L. innocua(GenBank: NC_003212) yS.mutans(GenBank: NC_004350). La cobertura de las lecturas se calculó en cada posición de nucleótidos por separado para ambas cadenas de ADN usando BEDTools-Versión-2.15.0. Se creó una cobertura normalizada que contenía una cobertura de lectura por millón (rpm) y se visualizó usando Integrative Genomics Viewer (IFV) (“www.” seguido de” “ broadinstitute.org/igv/” ) (Figura 36). Usando SAMTools flagstat80 se calculó la proporción de lecturas mapeadas sobre un total de 9914184 lecturas mapeadas paraC. jejuni,48205 lecturas paraF. novicida,13110087 lecturas paraN. meningitidis,161865 lecturas praL. innocuay 1542239 lecturas para S.mutans.Se creó un archivo que contenía el número de lecturas que comienzan (5') y terminan (3') en cada posición de nucleótido única y se visualizó en IGV. Para cada ortólogo de ARNcrtra y ARNcr, el número total de lecturas recuperadas se calculó usando SAMtools.
Análisis de secuencia de Cas9, alineación de múltiples secuencias y constructo de árbol guía
Se usó el programa Iterado específico de posición (PSI)-BLAST para recuperar homólogos de la familia Cas9 en la base de datos no redundante de NCBI. Se descartaron las secuencias más cortas de 800 aminoácidos. El programa BLASTCIust configurado con un límite de cobertura de longitud de 0,8 y un umbral de cobertura de puntuación (puntuación de bits dividida por longitud de alineación) de 0,8 se usó para agrupar las secuencias restantes (Figura 38). Este procedimiento produjo 78 agrupamientos (48 de esos se representaron por una sola secuencia). Se seleccionó uno (o rara vez unos pocos representantes) de cada grupo y se construyó una alineación múltiple para estas secuencias usando el programa MUSCLE con parámetros predeterminados, seguido de una corrección manual sobre la base de alineaciones locales obtenidas usando los programas PSI-BLAST y HHpred. Unas pocas secuencias más eran alineables y también se excluyeron de las alineaciones finales. Se usaron los bloques alineados con seguridad con 272 posiciones informativas para la reconstrucción del árbol de máxima verosimilitud usando el
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programa FastTree con los parámetros predeterminados: Modelo evolutivo JTT, modelo gamma discreto con 20 categorías de velocidad. Se usó el mismo programa para calcular los valores de arranque.
La Figura 38 representa secuencias que se agruparon según el programa de agrupamiento BLASTclust. Solamente las secuencias más largas de 800 aminoácidos se seleccionaron para el análisis por BLASTclust (véase Materiales y Métodos). Se usaron cepas representativas que albergaban genes ortólogoscas9.Algunas secuencias no se agruparon, pero se verificaron como secuencias de Cas9 debido a la presencia de motivos conservados y/u otros genescasen su área adyacente inmediata.
Análisis de loci de CRISPR-Cas
Las secuencias de repetición CRISPR se recuperaron de la base de datos CRISPRdb o se predijo usando la herramienta CRISPRFinder (Grissa I y col.,BMC Bioinformatics2007; 8:172; Grissa I y col.,Nucleic Acids Res2007). Los genes cas se identificaron mediante el algoritmo BLASTp y/o se verificaron con la base de datos kegg (en la trama en “www.” seguido de kegg.jp/).
Predicción informática y análisis de ortólogos de ARNcrtra
Las supuestas anti-repeticiones se identificaron usando el software Vector NTI® software (Invitrogen) mediante el cribado de secuencias de repetición adicionales degeneradas que no pertenecían a la matriz de repetición-espaciador en ambas cadenas de los genomas respectivos permitiendo hasta 15 emparejamientos erróneos. Los promotores de la transcripción y los terminadores independientes del factor rho se predijeron usando el programa de predicción del promotor de red neural BDGP (“www.” seguido de fruitfly.org/seq_tools/promoter.html) y el software TransTermHP, respectivamente. Las múltiples alineaciones de secuencia se realizaron usando el programa MUSCLE con parámetros predeterminados. Las alineaciones se analizaron para determinar la presencia de motivos de estructura conservada usando el algoritmo RNAalifoid del paquete de ARN Vienna 2.0.
Resultados
Los sistemas CRISPR-Cas de Tipo II están extendidos en bacterias.
Además del ADN que codifica el ARNcrtra y la matriz de repetición-espaciador, los loci de CRISPR-cas de tipo II se componen típicamente de tres a cuatro genes organizados en un operón (Figura 32A-B). Cas9 es la proteína distintiva característica para el tipo II y está implicada en las etapas de expresión e interferencia. Casi y Cas2 son proteínas centrales que son compartidas por todos los sistemas CRISPR-Cas y están implicadas en la adquisición de espaciadores. Csn2 y Cas4 están presentes solamente en un subconjunto de sistemas de tipo II y se sugirió que desempeñan una función en la adaptación. Para recuperar un número máximo de loci de CRISPR-Cas de tipo II, que contienen ARNcrtra, en primer lugar los presentes inventores cribaron genomas disponibles públicamente para determinar secuencias homologas a las proteínas Cas9 ya anotadas. Se identificaron 235 ortólogos de Cas9 en 203 especies bacterianas. Se seleccionó un conjunto de 75 secuencias diversas representativas de todos los ortólogos de Cas9 recuperados para su posterior análisis (Figura 32, Figura 38 y Materiales y Métodos).
La Figura 32 representa (a) un árbol filogenético de secuencias de Cas9 representativas de diversos organismos, así como (B) una arquitectura de locus de Cas9 representativa. Se indican los valores de arranque calculados para cada nodo. Las ramas del mismo color representan subgrupos seleccionados de ortólogos de Cas9 similares. Se muestra la longitud de repetición de CRISPR en nucleótidos, el tamaño promedio de la proteína Cas9 en aminoácidos (aa) y la arquitectura del locus consenso para cada subagrupamiento. *- gi| 1116628213 *-gi| 116627542 f - g¡|34557790t -gi|34557932. El Tipo ll-A se caracteriza porcas9- csx12, casi, cas2, cas4.El tipo ll-B se caracteriza porcas9, casi, cas2seguido de una variantecsn2.El tipo ll-C se caracteriza por un operón decas9, casi, cas2conservado (véase también la Figura 38).
A continuación, los presentes inventores realizaron una alineación de secuencia múltiple de los ortólogos de Cas9 seleccionados. El análisis comparativo reveló altas diversidades en la composición de aminoácidos y el tamaño de la proteína. Los ortólogos de Cas9 comparten solamente unos pocos aminoácidos idénticos y todas las secuencias recuperadas tienen la misma arquitectura de dominio con un dominio de endonucleasa FINH central y un dominio RuvC/RNasaFI dividido. Las longitudes de las proteínas Cas9 oscilan entre 984 (Campylobacter jejuni)y 1629(Francisella novicida)aminoácidos, con tamaños típicos de -1100 o -1400 aminoácidos. Debido a la alta diversidad de secuencias de Cas9, especialmente en la longitud de las regiones entre dominios, los presentes inventores seleccionaron solamente posiciones informativas bien alineadas de la alineación preparada para reconstruir un árbol filogenético de las secuencias analizadas (Figura 32 y Materiales y Métodos). Ortólogos de Cas9 agrupados en tres grupos monofiléticos principales con algunas secuencias atípicas. La topología observada del árbol de Cas9 concuerda bien con la clasificación actual de los loci de tipo II, en la que el tipo ll-A y el tipo ll-B, previamente definidos, forman agrupamientos monofiléticos separados. Para caracterizar adicionalmente los agrupamientos, los presentes inventores examinaron en detalle las composiciones del operón cas y las secuencias de repetición de CRISPR de todas las cepas enumeradas.
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El subagrupamiento de Cas9 refleja la diversidad en la arquitectura de loci de CRISPR-Cas de tipo II
Un análisis más profundo de los loci de tipo II seleccionados reveló que el agrupamiento de secuencias de ortólogos de Cas9 se correlaciona con la diversidad en la longitud de repetición de CRISPR. Para la mayoría de los sistemas CRISPR-Cas de tipo II, la longitud de repetición es de 36 nucleótidos (nt) con algunas variaciones para dos de los subgrupos de árbol de Cas9. En el grupo de tipo ll-A (Figura 32) que comprende loci que codifican el ortólogo de Cas9 largo, anteriormente llamado Csx12, las repeticiones de CRISPR tienen 37 nt de longitud. El subgrupo pequeño compuesto por secuencias de bacterias que pertenecen al filo Bacteroidetes (Figura 32) se caracteriza por repeticiones CRISPR inusualmente largas, de hasta 48 nt de tamaño. Además, los presentes inventores observaron que el subagrupamiento de secuencias de Cas9 se correlaciona con arquitecturas de operón cas distintas, como se representa en la Figura 32. El tercer agrupamiento principal (Figura 32) y los loci atípicos (Figura 32), consisten principalmente en el operón mínimo compuesto por los genes cas9, casi y cas2, con una excepción de algunos loci incompletos que se analizan más adelante. Todos los demás loci de los dos primeros agrupamientos principales están asociados con un cuarto gen, principalmente cas4, específico de tipo ll-A o similar a csn2, específico de tipo ll-B (Figura 32). Los presentes inventores identificaron genes que codificaban variantes más cortas de la proteína Csn2, Csn2a, dentro de los loci similares a CRISPR01 de S.pyogenesde tipo ll-B y CRISPR3 de S.thermophilus(Figura 32). La variante más larga de Csn2, Csn2b, se encontró asociada con loci similares a los de CRISPR1 de S.thermophilusde tipo ll-B (Figura 32). Curiosamente, los presentes inventores identificaron supuestos genes adicionales que codifican proteínas sin similitud de secuencia obvia con las variantes de Csn2 descritas anteriormente. Una de esas proteínas no caracterizadas está asociada exclusivamente con loci de tipo ll-B de especies deMycoplasma(Figura 32 y Figura 33). Se descubrieron otros dos codificados en los loci de tipo ll-B de especies deStaphylococcus(Figura 33). En todos los casos, la diversidad de arquitectura del operón cas es, por lo tanto, coherente con el subagrupamiento de secuencias de Cas9. Estas características junto con la topología general del árbol de Cas9 dividido en tres agrupamientos monofiléticos principales, distintos, condujeron a proponer una nueva división adicional del sistema CRISPR-Cas de tipo II en tres subtipos. El tipo ll-A se asocia con Cas9 y Cas4 similares a Csx12, el tipo ll-B se asocia con similar a Csn2 y el tipo ll-C solamente contiene el conjunto mínimo de los genes cas9, casi y cas2, como se representa en la Figura 32.
La Figura 33 representa la arquitectura de CRISPR-Cas de tipo II a partir de especies bacterianas seleccionadas. Las barras verticales agrupan los loci que codifican los ortólogos de Cas9 que pertenecen al mismo subagrupamiento de árbol (compárese con la Figura 32). Barra de color negro horizontal, secuencia líder; rectángulos y diamantes de color negro, matriz de separador de repetición. Las anti-repeticiones predichas están representadas por flechas que indican la dirección de la transcripción del supuesto ortólogo de ARNcrtra. Nótese que para los loci que no se verificaron experimentalmente, la matriz de repetición-espaciador de CRISPR se considera en la presente memoria que se transcribe a partir de la misma cadena que el operóncas.La dirección de la transcripción del supuesto ortólogo de ARNcrtra se indica en consecuencia.
Predicciones informáticas de ortólogos de ARNcrtra novedosos
Se seleccionaron loci de tipo II seleccionados antes basándose en los 75 ortólogos representativos de Cas9 para detectar la presencia de supuestos ortólogos de ARNcrtra. El análisis previo de los presentes inventores realizado en un número restringido de secuencias de ARNcrtra reveló que ni las secuencias de ARNcrtra ni su ubicación dentro de los loci de CRISPR-Cas parecían conservadas. Sin embargo, como se mencionó anteriormente, los ARNcrtra también se caracterizan por una secuencia anti-repetición susceptible de emparejamiento de bases con cada una de las repeticiones de pre-ARNcr para formar dúplex de repetición ARNcrtra:preARNcr que son escindidos por ARNasa III en presencia de Cas9. Para predecir ARNcrtra novedosos, se aprovechó esta característica y se usó el siguiente flujo de trabajo: (i) cribar para posibles anti-repeticiones (emparejamiento de bases de secuencias con repeticiones de CRISPR) dentro de los loci de CRISPR-Cas, (¡i) seleccionar anti-repeticiones ubicadas en las regiones intergénicas, (iii) validar el emparejamiento de bases anti-repet¡ción:repet¡ción de CRISPR y (iv) predecir los promotores y terminadores de la transcripción independientes del factor Rho asociados a los ARNcrtra identificados.
Para cribar las supuestas anti-repeticiones, los presentes inventores recuperaron secuencias de repetición de la base de datos CRISPRdb o, cuando la información no estaba disponible, predijeron las secuencias de repetición usando el software CRISPRfinder. En su estudio anterior, los presentes inventores mostraron experimentalmente que la dirección de transcripción de la matriz de repetición-espaciador en comparación con la del operón cas varió entre los loci. En este caso, el análisis de secuenciación de ARN confirmó esta observación. En algunos de los loci analizados, a saber, enF. novicida, N. meningitidisy C.jejuni,la matriz de repetición-espaciador se transcribe en la dirección opuesta del operón cas (véase el párrafo “ La secuenciación profunda de ARN valida la expresión de ortólogos de ARNcrtra novedosos” y las Figuras 33 y 34) mientras que en S.pyogenes, S. mutans,S.thermophilusyL. innocua,la matriz y el operón cas se transcriben en la misma dirección. Estos son los únicos datos de expresión de la matriz de espaciadores de tipo II disponibles hasta la fecha. Para predecir la dirección de transcripción de otras matrices de repetición-espaciador, los presentes inventores consideraron la observación anterior según la cual las últimas repeticiones de las matrices usualmente están mutadas. Esta observación concuerda con el modelo actual de adquisición de espaciadores, en el que típicamente la primera repetición de la matriz se duplica tras insertar una secuencia espaciadora durante la fase de adaptación. Para las matrices espadadoras de 37 repeticiones, los presentes inventores pudieron identificar la repetición mutada en el supuesto extremo de las matrices. Se observó que
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la orientación predicha de transcripción para la matriz de espaciador-espaciador deN. meningitidisyC. jejunisería opuesta a la orientación determinada experimentalmente (secuenciación de ARN y análisis por transferencia Northern). Como la orientación predicha no es coherente dentro de los agrupamientos y como en la mayoría de los casos podría detectar promotores potenciales en ambos extremos de las matrices, los presentes inventores consideraron que la transcripción de las matrices de repetición-espaciador están en la misma dirección que la transcripción del operón cas, si no se validó de cualquier otro modo.
LaFigura 34representa el coprocesamiento de ARNcrtra y pre-ARNcr en sistemas de CRISPR Cas de tipo II seleccionados. Se muestran arquitecturas de loci de CRISPR con posiciones verificadas y direcciones de transcripción de ARNcrtra y pre-ARNcr. Secuencias superiores, repeticiones de pre-ARNcr; secuencias inferiores, emparejamiento de bases de secuencias de ARNcrtra con repeticiones de ARNcr. Los supuestos sitios de procesamiento de ARN descritos por secuenciación de ARN se indican con puntas de flecha. Para cada locus, los tamaños de las puntas de flecha representan cantidades relativas de los extremos 5' y 3' recuperados (véase también laFigura 37).
LaFigura 37enumera todos los ortólogos de ARNcrtra y ARNcr maduros recuperados por secuenciación para las especies bacterianas estudiadas, incluyendo las coordenadas (región de interés) y las secuencias de ADNc (5' a 3') correspondientes. Las flechas representan la dirección de la transcripción (cadena). Se indica el número de lecturas de ADNc (calculadas usando SAMtools), números de cobertura (porcentaje de lecturas mapeadas) y extremos predominantes asociados con cada transcrito. Se muestran números de lecturas que comienzan o se detienen en cada posición de nucleótidos alrededor de los extremos 5' y 3' de cada transcrito. Se indican los tamaños de cada forma madura de ARNcr. El número asignado a cada especie de ARNcr corresponde a la posición de secuencia espaciadora en el pre-ARNcr, según CRISPRdb. El número asignado a cada especie de ARNcrtra corresponde a diferentes formas del mismo transcrito.
Después, los presentes inventores cribaron los loci de CRISPR-Cas seleccionados, incluyendo secuencias ubicadas 1 kb en dirección 5' y en dirección 3' en ambas cadenas para posibles secuencias de repetición que no pertenecían a la matriz repetición-espaciador, lo que permitió hasta 15 emparejamientos erróneos. En promedio, los presentes inventores descubrieron de una a tres secuencias de repetición degeneradas por locus que corresponderían a las anti repeticiones de los ortólogos de ARNcrtra y seleccionaron las secuencias ubicadas dentro de las regiones intergénicas. Las supuestas anti-repeticiones se descubrieron en cuatro ubicaciones típicas, en dirección 5' del gen cas9, en la región entre cas9 y casi, y en dirección 5' o en dirección 3' de la matriz de repetición-espaciador (Figura 33). Para cada secuencia recuperada, los presentes inventores validaron el grado de emparejamiento de bases formado entre la repetición y la anti-repetición (Figura 44) mediante la predicción de la posible interacción ARN:ARN y centrándose especialmente en candidatos con una región de complementariedad más larga y perfecta que forma una estructura bicatenaria óptima para el procesamiento de ARNasa III. Para predecir los promotores y los terminadores de la transcripción que flanquean la anti-repetición, los presentes inventores fijaron los supuestos sitios de inicio y terminación de la transcripción que se incluirán dentro de una región ubicada como máximo 200 nt en dirección 5' y 100 nt en dirección 3' de la secuencia anti-repetición, respectivamente, basándose en sus observaciones anteriores26. Como se ha mencionado anteriormente, falta la información experimental sobre la dirección de la transcripción de la mayoría de las matrices de repetición-espaciador de los sistemas de tipo II. Los algoritmos informáticos de predicción de promotores frecuentemente proporcionan resultados falsos positivos y apuntan a supuestos promotores que conducirían a la transcripción de matrices de repetición-espaciador de ambas cadenas. En algunos casos, los presentes inventores no pudieron predecir los terminadores de la transcripción, aunque la expresión del ortólogo de ARNcrtra pudo validarse experimentalmente, como se ilustra por el locus de C.jejuni(véase el párrafo “ La secuenciación profunda de ARN valida la expresión de ortólogos de ARNcrtra novedosos” ). Los presentes inventores sugieren considerar las predicciones del promotor y del terminadorde la transcripción solamente como una etapa de soporte, pero no esencial, de la directriz descrita anteriormente.
LaFigura 44representa el emparejamiento de bases predicho de pre-ARNcr:anti-repetición de ARNcrtra en especies bacterianas seleccionadas. bLos loci de CRISPR pertenecen al sistema CRISPR-Cas de tipo II (Nmeni/CASS4). La Nomenclatura es según la base de datos CRISPR (CSPIRdb). Nótese que S.thermophilusLMD-9 yW. succinogenescontienen dos loci de tipo II. GSecuencia superior, secuencia consenso de repetición de pre-ARNcr (5' a 3'); secuencia inferior, hibridación de la secuencia homologa de ARNcrtra con la repetición (anti-repetición; 3 “ a 5'). Nótese que la secuencia de repetición proporcionada se basa en la suposición de que la matriz de repetición-espaciador de CRISPR se transcribe a partir de la misma cadena que el operón cas. Para las secuencias que se validaron experimentalmente en este estudio, se tomaron en cuenta datos de secuenciación de ARN para determinar el emparejamiento de bases. Véase la Figura 33. dSe identificaron dos posibles anti-repeticiones en los loci de tipo ll-A deF. tularensis subsp. novicida, W. succinogenes yprotobacteria gamma HTCC5015. Emparejamiento de secuencia superior, anti-repetición dentro de la supuesta secuencia líder; emparejamiento de secuencia inferior, anti-repetición en dirección 3' de la matriz de repetición-espaciador. Véase la Figura 33. eSe identificaron dos posibles anti-repeticiones en el locus de tipo ll-A de S.wadsworthensis.Emparejamiento de secuencia superior, anti-repetición; emparejamiento de secuencia inferior, anti-repetición dentro de la supuesta secuencia líder. Véase la Figura 33. fSe identificaron dos posibles anti repeticiones en el locus de tipo ll-B deL. gaseri.Emparejamiento de secuencia superior, anti-repetición en dirección 5' de cas9; emparejamiento de secuencia inferior, anti-repetición entre los genes cas9 y ca s i. Véase la Figura 33.9Se identificaron dos posibles anti-repeticiones en loci de tipo ll-C deC. jejuni.Emparejamiento de secuencia superior, anti-repetición en dirección 5' de cas9; emparejamiento de secuencia inferior, anti-repetición en dirección 3' de la matriz
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de repetición-espaciador. Véase la Figura 33. hSe identificaron dos posibles anti-repeticiones en el locus de tipo ll-C deR. rubrum.Emparejamiento de secuencia superior, anti-repetición en dirección 3' de la matriz de repeticiónespaciador; emparejamiento de secuencia inferior, anti-repetición en dirección 5' de casi. Véase la Figura 33.
Una plétora de ortólogos de ARNcrtra
Los presentes inventores predijeron supuestos ortólogos de ARNcrtra para 56 de los 75 loci seleccionados anteriormente. Los resultados de las predicciones se representan en la Figura 33. Como ya se ha mencionado, la dirección de la transcripción de ARNcrtra indicada en esta figura es hipotética y se basa en la dirección indicada de transcripción de la matriz repetición-espaciador. Como se indicó anteriormente, las secuencias que codifican los supuestos ortólogos de ARNcrtra se identificaron en dirección 5', dentro y en dirección 3' del operón cas, así como en dirección 3' de las matrices espaciadoras repetidas, incluyendo las supuestas secuencias líderes, habitualmente encontradas en loci de tipo ll-A (Figura 33). Sin embargo, los presentes inventores observaron que las anti-repeticiones de ubicación similar dentro de los loci de CRISPR-Cas pueden transcribirse en diferentes direcciones (como se observa cuando se comparan, p. ej.,Lactobacillus rhamnosusyEubacterium rectaleoMycoplasma mobiley S.pyogenesoN. meningitidis)(Figura 33). En particular, los loci agrupados dentro de un mismo subagrupamiento del árbol de guía de Cas9 comparten una arquitectura común con respecto a la posición del gen que codifica ARNcrtra. Los presentes inventores identificaron anti-repeticiones alrededor de la matriz de repetición-espaciador en loci de tipo ll-A, y principalmente en dirección 5' del gen cas9 en los tipos ll-B y ll-C con varias excepciones notables para el supuesto ARNcrtra ubicado entre cas9 y casi en tres subagrupamientos distintos de tipo ll-B.
Algunos loci de CRISPR-Cas de tipo II tienen matrices repetición-espaciador defectuosas y/u ortólogos de ARNcrtra
Para seis loci de tipo II (Fusobacteríum nucleatum, Aminomonas paucivorans, Helicobactermustelae, Azospirillum sp., Prevotella ruminicolayAkkermansia muciniphila),los presentes inventores identificaron posibles anti-repeticiones con emparejamiento de bases débil con la secuencia de repetición o ubicados dentro de los marcos de lectura abiertos. En particular, en estos loci, se identificaron una anti-repetición débil dentro del marco de lectura abierto del gen que codifica una supuesta ATPasa enA. paucivorans, una anti-repetición fuerte dentro de los primeros 100 nt del gen cas9 enAzopirillum sp.B510 y una fuerte anti-repetición fuerte con cas9 y casi enA. muiincilla(Figura 33). Para doce loci adicionales (Peptoniphilus duerdenii, Coprococcus catus, Acidaminococcus intestini, Catenibacterium mitsuokai, Staphylococcus pseudintermedius, llyobacter polytropus, Elusimicrobium minutum, Bacteroides fragilis, Acidothermus cellulolyticus, Corynebacterium diphteriae, Bifidobacterium longumandBifidobacterium dentium),los presentes inventores no pudieron detectar ninguna supuesta anti-repetición. No hay información disponible sobre la expresión y el procesamiento de pre-ARNcr en estos loci de CRISPR-Cas. Por lo tanto, se debe abordar la funcionalidad de los sistemas de tipo II en ausencia de un ortólogo de ARNcrtra claramente definido. Para siete loci analizados, los presentes inventores no pudieron identificar ninguna matriz repetición-espaciador (Parasutterella excrementihominis, Badil us cereus, Ruminococcus al bus, Rhodopseudomonas palustrls, Nltrobacter hamburgensis, Bradyrhizoblum sp.yPrevotella micans)(Figura 33) y en tres de ellas (Bradyrhizobium sp.BTAÍ1,N. hamburgensisyB. cereus)los presentes inventores detectaron cas9 como un gen único sin otros genes cas en el área adyacente. Para estos tres loci, los presentes inventores no consiguieron predecir ninguna secuencia de ARN pequeño en dirección 5' o en dirección 3' del gen cas9. En el caso deR. albusyP. excrementihominis,el cas9 que contiene contig genómico es demasiado corto para permitir la predicción de la matriz repetición-espaciador.
La secuenciación profunda de ARN valida la expresión de ortólogos de ARNcrtra novedosos
Para verificar las predicciones de ARNcrtra informáticas y determinar los patrones de coprocesamiento de ARNcrtra:pre-ARNcr, se analizaron ARN de bacterias grampositivas (S.mutansy L.innocua)y gramnegativas (N. meningitidis, C.jejuniyF. novicida)seleccionadas mediante secuenciación profunda. Se recuperaron secuencias de ortólogos de ARNcrtra y ARNcr procesados (Figura 36 y Figura 37). De forma coherente con los datos de secuenciación de ARNcrtra diferencial publicados anteriormente en S.pyogenes26,los ortólogos de ARNcrtra estaban altamente representados en las bibliotecas, variando del 0,08 al 6,2 % de las lecturas mapeadas totales. Los ARNcrtra procesados también fueron más abundantes que los transcritos primarios, variando del 66 % a más del 95 % de la cantidad total de lecturas de ARNcrtra (Figura 36 y Figura 37).
La Figura 36 representa la expresión de ortólogos de ARNcrtra bacteriano y ARNcr revelados por secuenciación de ARN profundo. Se representan perfiles de expresión de los ortólogos de ARNcrtra y los ARNcr de cepas bacterianas seleccionadas a lo largo de los genomas correspondientes mediante gráficos de barras (imágenes capturadas a partir de la herramienta Integrative Genomics Viewer (IGV).Campylobacter jejuni(GenBank: NC_002163),Francisella novicida(GenBank: NC_008601),Neisseria meningitidis(GenBank: NC_003116),Listeria innocua(GenBank: NC_003212) yStreptococcus mutans(GenBank: NC_004350). Se proporcionan coordenadas genómicas. aCobertura de secuencia calculada usando BEDTools-Versión-2.15.0 (Escala proporcionada en lecturas por millón). bSe indica la distribución de las lecturas que comienzan (5') y terminan (3') en cada posición de nucleótidos (Escala proporcionada en números de lecturas). Los paneles superiores corresponden a transcritos de la cadena positiva y los paneles inferiores corresponden a transcritos de la cadena negativa. Los valores de cobertura negativos y los picos presentados por debajo de los ejes indican la transcripción desde la cadena negativa del genoma. Los extremos 5' y 3' predominantes de las lecturas se representan gráficamente para todos los ARN. Nótese que dada la baja calidad
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de la biblioteca de ADNc deL. innocua,las lecturas se acortan para los ARNcr y se observa una acumulación de las lecturas en el extremo 3' de ARNcrtra, presumiblemente debido a la degradación del ARN.
Para evaluar los extremos 5' de los transcritos primarios de ARNcrtra, los presentes inventores analizaron la abundancia de todas las lecturas de extremo 5' de ARNcrtra y recuperaron las lecturas más prominentes en dirección 5' o en el área adyacente del extremo 5' de la secuencia anti-repetición predicha. Los extremos 5' de los ortólogos de ARNcrtra se confirmaron adlcionalmente usando el algoritmo de predicción de promotores. Los extremos 5' identificados de ARNcrtra deS.mutans, L. innocuayN. meningitidisse correlacionaron con las predicciones informáticas y el análisis por transferencia Northern de la expresión de ARNcrtra26. El extremo 5' más prominente del ARNcrtra deC. jejunise identificó en el medio de la secuencia anti-repetición. Se detectaron cinco nucleótidos en dirección 5', un supuesto extremo 5' adicional que se correlaciona con la predicción informática y que proporciona una secuencia más larga de interacción con la secuencia de repetición de CRISPR. Se recuperó una cantidad relativamente baja de lecturas de la biblioteca deF. novicidaque correspondía casi exclusivamente a transcritos procesados. El análisis de la cantidad muy pequeña de lecturas de transcritos primarios proporcionó un extremo 5' que correspondía a las fuertes predicciones informáticas del promotor. El sondeo por transferencia Northern de ARNcrtra deF. novicidaconfirmó además la validez de las predicciones que muestran la baja abundancia de transcritos de aproximadamente 90 nt de longitud. Los resultados se enumeran en la Tabla 2. Para todas las especies examinadas, exceptoN. meningitidis,los transcritos primarios de ARNcrtra se identificaron como especies de ARN pequeño único de 75 a 100 nt de longitud. En el caso deN. meningitidis,los presentes inventores descubrieron una forma de ARNcrtra primario predominante de ~110 nt y un supuesto transcrito más largo de -170 nt representado por una cantidad muy baja de lecturas y detectado anteriormente como una banda débil mediante análisis por transferencia Northern.
Tabla 2. Ortólogos de ARNcrtra seleccionados
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Los sitios de coprocesamiento de ARNcrtra y pre-ARNcr se encuentran en la región anti-repetición:repetición.
Los presentes inventores examinaron los transcritos de ARNcrtra procesados mediante el análisis de extremos 5' de ARNcrtra abundantes dentro de la secuencia anti-repetición predicha y abundantes extremos de ARNcr 3' maduros (Figura 34 y 45). En todas las especies, los presentes inventores identificaron los extremos 5' prominentes de ortólogos de ARNcrtra que podrían ser resultado del procesamiento conjunto de los dúplex de repetición de ARNcrtra:pre-ARNcr por ARNasa III. Los presentes inventores también identificaron los extremos 5' procesados de los ARNcr que más probablemente son resultado de un segundo evento de maduración mediante el supuesto recorte, de forma coherente con observaciones anteriores. Cabe destacar que en los pares de ARN estrechamente relacionados de S.pyogenes, S. mutansyL. innocua,los presentes inventores observaron el mismo sitio de procesamiento alrededor del par de bases G:C en el medio de la secuencia anti-repetición. Tanto en S.mutanscomo enL. innocua,los presentes inventores detectaron extremos prominentes adicionales 5' de ARNcrtra y extremos de ARNcr 3' que podrían sugerir un recorte adicional del dúplex ARNcrtra:ARNcr, con el extremo 3' de ARNcr acortado de forma adicional al recorte de extremo 5' ya mencionado, siguiendo el evento de procesamiento catalizado por ARNasa III. Similarmente, enC.jejunilos presentes inventores descubrieron solamente una pequeña cantidad de extremos de ARNcr 3' que se ajustarían a los patrones de procesamiento de ARNasa III y recuperarían los extremos 5' correspondientes de ARNcrtra procesado. Por lo tanto, el supuesto recorte de dúplex ARNcrtra:ARNcr después de la escisión inicial por RNasa III daría como resultado una parte derivada de repetición más corta en ARNcr maduros, produciendo dúplex ARNcrtra:ARNcr más cortos estabilizados por un emparejamiento de bases triple G:C para la interacción con la endonucleasa Cas9 y la posterior escisión de ADN diana. El dúplex de ARN deN. meningitidisparece procesarse en dos sitios primarios más hacia el extremo 3' de la repetición de CRISPR, dando como resultado una parte derivada de repetición larga en ARNcr maduro y la interacción estable de ARN:ARN a pesar de la protuberancia central dentro del dúplex. Curiosamente, el dúplex ARNcrtra:pre-ARNcr deF. novicidaparece escindirse dentro de la región de baja complementariedad y algunos de los extremos 5' abundantes recuperados de ARNcrtra sugieren su recorte adicional sin recorte concomitante de ARNcr. Las diferencias en los tamaños de los transcritos primarios y en la ubicación de los sitios de procesamiento dan como resultado diversas longitudes de ARNcrtra procesados que varían de ~65 a 85 nt. Las coordenadas y tamaños de los transcritos de ARNcrtra procesados prominentes se muestran en la Tabla 2 y la Figura 37. Los patrones de procesamiento observados de ARNcrtra y ARNcr concuerdan con el modelo propuesto anteriormente de dos eventos de maduración. El supuesto recorte adicional de algunos de los extremos 5' de ARNcrtra y extremos 3' de ARNcr puede provenir del segundo evento de maduración o, alternativamente, puede ser un artefacto de la preparación de la biblioteca de ADNc o la secuenciación de ARN. Queda por investigar más a fondo la naturaleza de estos procesos.
Las secuencias de los ortólogos de ARNcrtra son muy diversas
También se determinaron similitudes de secuencias de ortólogos de ARNcrtra seleccionados. Los presentes investigadores realizaron múltiples alineaciones de secuencias de transcritos primarios de ARNcrtra de S.pyogenes(solo forma de 89 nt), S.mutans, L. innocuayN. meningitidis(forma de 110 nt solamente), S.thermophilus, P. multocidayM. mobile(Tabla 2, Figura 35).Los presentes inventores observaron una alta diversidad en las secuencias de ARNcrtra, pero una conservación significativa de secuencias de loci de CRISPR-Cas estrechamente relacionados. Los ARNcrtra deL. innocua, S. pyogenes, S. mutansy S.thermophiluscomparten una identidad global del 77 % y los ARNcrtra deN. meningitidisyP. multocidacomparten una identidad del 82 % según alineaciones por pares. La identidad promedio de las secuencias de ARNcrtra analizadas es del 56 %, comparable a la identidad de las secuencias de ARN aleatorias. Esta observación confirma además que la predicción de ortólogos de ARNcrtra basándose en la similitud de secuencia puede realizarse solamente en el caso de loci estrechamente relacionados. Los presentes inventores también buscaron una posible conservación de la estructura de ARNcrtra, pero no pudieron encontrar ninguna similitud significativa, excepto una covariación y la estructura conservada del terminador de la transcripción(Figura 35).
LaFigura 35representa la diversidad de secuencias de ortólogos de ARNcrtra. Alineación múltiple de secuencias de ARNcrtra. ARNcrtra de S.thermophilusy S.thermophilus2,asociado con ortólogos de Cas9 de Id. de sec. n.° 41 y Id. de sec. n.° 40, en consecuencia. Color negro, altamente conservado; color gris oscuro, conservado; color gris claro, débilmente conservado. La estructura consenso predicha se representa en la parte superior de la alineación. Las flechas indican las variaciones de nucleótidos. Los ARNcrtra de S.pyogenesSF370, S.mutansUA159,L. innocuaClipl 1262, C.jejuniNCTC 11168,F. novicidaU112 yN. meningitidisA Z2491 se validaron mediante secuenciación de ARN y análisis por transferencia Northern. El ARNcrtra de S.thermophilasLMD-9 se validó mediante análisis por transferencia Northern. El ARNcrtra deP. multocidaPm70 se predijo a partir de la alta similitud del locus de CRISPR-
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Cas con el deN. meningitidisA Z2491. El ARNcrtra deM. mobile163K se predijo Informáticamente a partir de fuertes predicciones de promotor y terminador de la transcripción.
Ejemplo 4: Cas9 puede usar ARN guía artificiales, no existentes en la naturaleza, para realizar la escisión de ADN diana
Se diseñó un ARNcr artificial y un ARNcrtra artificial basándose en el segmento de unión a proteínas de transcriptos de origen natural de ARNcr y ARNcrtra de S.pyogenes,modificados para imitar la protuberancia asimétrica dentro del dúplex ARNcrARNcrtra de S.pyogenesnatural (véase la protuberancia en el dominio de unión a proteínas de las moléculas de ARN artificiales (parte superior) y naturales (parte inferior) representadas en la Figura 39A). La secuencia artificial de ARNcrtra comparte menos del 50 % de identidad con el ARNcrtra natural. La estructura secundaria predicha del dúplex de unión a proteínas ARNcr-ARNcrtra es la misma para ambos pares de ARN, pero la estructura predicha del resto de los ARN es muy diferente.
La Figura 39 demuestra que las secuencias artificiales que muy poca (aproximadamente el 50 %) identidad con ARNcrtra y ARNcr de origen natural pueden actuar con Cas9 para escindir el ADN diana siempre que la estructura del dominio de unión a proteínas del ARN de localización específica de ADN esté conservada. (A) Coplegamiento de ARNcrtra y ARNcr de S.pyogenesy de ARNcrtra y ARNcr artificiales. (B) Se usaron combinaciones de ortólogos de Cas9 de S.pyogenesy ARNcrtra:ARNcr para realizar ensayos de escisión de ADN plasmídico. Spy - S.pyogenes,Lin -L. innocua,Nme -N. meningitidis,Pmu -P. multocida.Algunos ortólogos de ARNcrtra:ARNcr que se producen de forma natural en especies bacterianas seleccionadas, pero no todos, pueden guiara Cas9 de S.pyogenes.Notablemente, la Cas9 de S.pyogenespuede ser guiada por el par ARNcrtra:ARNcr artificial, que se diseñó basándose en la estructura del segmento de unión a proteínas del ARN de localización específica de ADN de origen natural usando una secuencia totalmente no relacionada con el sistema CRISPR.
El “ARNcrtra” artificial (ARN activador) utilizado fue 5'-GUUUUCCCUUUUCAAAGAAAUCUCCUGGGCACCUAUCUUCUUAGGUGCCCUCCCU UGUUUAAACCUGACCAGUUAACCGGCUGGUUAGGUUUUU-3' (Id. de sec. n.° 1347). El “ARNcr” artificial (ARN localizador específico) utilizado fue: 5'- GAGAUUUAUGAAAAGGGAAAAC-3' (Id. de sec. n.° 1348).
Ejemplo 5: Generación de organismos transgénicos no humanos
Un ratón transgénico que expresa Cas9 (ya sea sin modificar, modificada para tener una actividad enzimática reducida, modificada como una proteína de fusión para cualquiera de los fines generales) se genera usando un método conveniente conocido por un experto en la técnica (p. ej., (i) la inactivación génica en un locus localizado específicamente (p. ej., ROSA 26) de una célula madre embrionaria de ratón (célula ES) seguida de inyección de blastocistos y la generación de ratones quiméricos; (ii) inyección de un transgén de integración aleatoria en el pronúcleo de un ovocito de ratón fertilizado seguido de la implantación del óvulo en una hembra pseudopreñada; etc.). La proteína Cas9 está bajo el control de un promotor que se expresa al menos en células madre embrionarias, y puede estar de forma adicional bajo el control temporal o específico de tejido (p. ej., inducible por fármacos, controlado por un sistema promotor basado en Cre/Lox, etc.). Una vez que se genera una línea de ratones transgénicos que expresan Cas9, las células madre embrionarias se aíslan y cultivan y, en algunos casos, las células ES se congelan para su uso futuro. Debido a que las células ES aisladas expresan Cas9 (y en algunos casos la expresión está bajo control temporal (p. ej., inducible por fármacos), se generan rápidamente nuevas células con inactivación o activación génica (y, por lo tanto, ratones) en cualquier locus deseado en el genoma mediante la introducción de un ARN de localización específica de ADN diseñado adecuadamente que localiza específicamente la Cas9 a un locus particular de elección. Un sistema de este tipo y muchas variaciones de los mismos se usan para generar nuevos organismos modificados genéticamente en cualquier locus de elección. Cuando se usa Cas9 modificada para modular la transcripción y/o modificar el ADN y/o modificar los polipéptidos asociados con el ADN, las propias células ES (o cualesquier células diferenciadas derivadas de las células ES (p. ej., un ratón completo, una línea celular diferenciada, etc.) se usan para estudiar las propiedades de cualquier gen de elección (o cualquier producto de expresión de elección, o cualquier locus genómico de elección) simplemente introduciendo un ARN de localización específica de ADN adecuado en una célula que expresa Cas9 deseada.
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REIVINDICACIONES
1. Un ARN de localización específica de ADN de molécula única que se une a un polipéptido modificador dirigido a un sitio y dirige dicho polipéptido modificador dirigido a un sitio a una ubicación específica dentro de un ADN diana, en donde dicho ARN de localización específica de ADN de molécula única comprende:
(a) un segmento de localización específica de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria de una secuencia en dicho ADN diana, y
(b) un segmento de unión a proteínas que interactúa con dicho polipéptido modificador dirigido a un sitio que es una endonucleasa Cas9 de origen natural, en el que el segmento de unión a proteínas comprende dos tramos complementarios de nucleótidos que se hibridan para formar un dúplex de ARN bicatenario (ARNbc), y
en donde dicho ARN de localización específica de ADN de molécula única, junto con dicho polipéptido modificador dirigido a un sitio que es una endonucleasa Cas9 de origen natural, proporcionan la escisión específica de sitio de dicho ADN diana para generar una ruptura bicatenaria.
2.El ARN de localización específica de ADN de molécula única de la reivindicación 1, en donde dicha secuencia de nucleótidos de dicho segmento de localización específica de ADN que es complementario a una secuencia de dicho ADN diana es superior a 15 nucleótidos.
3. Un ARN de localización específica de ADN de molécula única que se une a un polipéptido modificador dirigido a un sitio y dirige dicho polipéptido modificador dirigido a un sitio a una ubicación específica dentro de un ADN diana, en donde dicho ARN de localización específica de ADN de molécula única comprende:
(a) un segmento de localización específica de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria de una secuencia diana en un ADN diana, y
(b) un segmento de unión a proteínas que interactúa con dicho polipéptido modificador dirigido a un sitio que es una endonucleasa Cas9 de origen natural, en donde el segmento de unión a proteínas comprende dos tramos complementarios de nucleótidos que se hibridan para formar un dúplex de ARN bicatenario (ARNbc),
en donde dicha secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia en dicho ADN diana tiene más de 15 nucleótidos.
4. El ARN de localización específica de ADN de molécula única según la reivindicación 3,
en donde dicho ARN de localización específica de ADN de molécula única, junto con un polipéptido modificador dirigido a un sitio que es una endonucleasa Cas9 de origen natural, proporcionan la escisión específica de sitio de dicho ADN diana para generar una ruptura bicatenaria.
5. El ARN de localización específica de ADN de molécula única según una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 4, en donde se dice que el ARN de localización específica de ADN de molécula única es el que proporciona especificidad a un complejo formado por dicho ARN de localización específica de ADN y dicha endonucleasa Cas9 de origen natural, para el ADN diana mediante la secuencia del segmento de localización específica de ADN que es complementario a la secuencia del ADN diana, y en donde se dice que la endonucleasa Cas9 de origen natural de dicho complejo es la que proporciona actividad nucleasa a dicho complejo, actividad nucleasa que escinde el ADN diana en una secuencia de ADN diana definido por la región de complementariedad entre el ARN de localización específica de ADN y el ADN diana.
6. El ARN de localización específica de ADN de molécula única de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde dichos dos tramos complementarios de nucleótidos están unidos covalentemente mediante nucleótidos intervinientes.
7. El ARN de localización específica de ADN de molécula única de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el primero de dichos dos tramos complementarios de dicho segmento de unión a proteínas comprende un tramo repetido de ARNcr y en donde el segundo de dichos dos tramos complementarios de dicho segmento de unión a proteínas comprende un tramo de ARNcrtra.
8.El ARN de localización específica de ADN de molécula única de la reivindicación 7, en donde dicho tramo repetido de ARNcr y dicho tramo de ARNcrtra provienen de S.pyogenes.
9. El ARN de localización específica de ADN de molécula única de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde dicha endonucleasa Cas9 de origen natural es de S.pyogenes.
10. El ARN de localización específica de ADN de molécula única de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde dicho ARN de localización específica de ADN de molécula única comprende modificaciones de
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Claims (1)

  1. ácidos nucleicos seleccionadas del grupo que consta de cadenas principales modificadas y enlaces internucleosídicos modificados, miméticos de ácidos nucleicos, restos de azúcar modificados, modificaciones y sustituciones de bases, y conjugados. 11. Un polinucleótido de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el ARN de localización específica de ADN de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9. 12. Un vector de expresión recombinante que comprende el polinucleótido de ADN de la reivindicación 11. 13. El vector de expresión recombinante de la reivindicación 12, en donde la secuencia de nucleótidos que codifica el ARN de localización específica de ADN está unida operativamente a un promotor. 14. El vector de expresión recombinante de la reivindicación 13, en donde el promotor es un promotor inducible. 15. Un ARN de localización específica de ADN que se une a un polipéptido modificador dirigido a un sitio y dirige dicho polipéptido modificador dirigido a un sitio a una ubicación específica dentro de un ADN diana, en donde dicho ARN de localización específica de ADN comprende: (a) un segmento de localización específica de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria de una secuencia diana en un ADN diana, y (b) un segmento de unión a proteínas que interactúa con dicho polipéptido modificador dirigido a un sitio que es una endonucleasa Cas9 de origen natural, en el que el segmento de unión a proteínas comprende dos tramos complementarios de nucleótidos que se hibridan para formar un dúplex de ARN bicatenario (ARNbc), en donde el ARN de localización específica de ADN comprende modificaciones de ácidos nucleicos seleccionadas del grupo que consta de cadenas principales modificadas y enlaces internucleosídicos modificados, miméticos de ácidos nucleicos, restos de azúcar modificados, modificaciones y sustituciones de bases, y conjugados. 16. El ARN de localización específica de ADN de la reivindicación 15, en donde dicho ARN de localización específica de ADN es un ARN de localización específica de ADN de doble molécula. 17. El ARN de localización específica de ADN de la reivindicación 15, en donde dicho ARN de localización específica de ADN es un ARN de localización específica de ADN de molécula única. 18. El ARN de localización específica de ADN de molécula única de la reivindicación 17, en donde dichos dos tramos complementarios de nucleótidos están unidos covalentemente mediante nucleótidos intervinientes. 19. El ARN de localización específica de ADN de una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18, en donde dicho ARN de localización específica de ADN, junto con un polipéptido modificador dirigido a un sitio que es una endonucleasa Cas9 de origen natural, proporcionan la escisión específica de sitio de dicho ADN diana para generar una ruptura bicatenaria. 20. El ARN de localización específica de ADN de la reivindicación 18, en donde se dixex que dicho ARN de localización específica de ADN es el que proporciona especificidad a un complejo formado por dicho ARN de localización específica de ADN y dicha endonucleasa Cas9 de origen natural, para el ADN diana mediante la secuencia del segmento de localización específica de ADN que es complementario de la secuencia del ADN diana, y en donde se dice que la endonucleasa Cas9 de origen natural de dicho complejo es la que proporciona actividad nucleasa a dicho complejo, actividad nucleasa que escinde el ADN diana en una secuencia de ADN diana definida por la región de complementariedad entre el ARN de localización específica de ADN y el ADN diana. 21.El ARN de localización específica de ADN de una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 20, en donde el primero de dichos dos tramos complementarios de dicho segmento de unión a proteínas comprende un tramo repetido de ARNcr y en donde el segundo de dichos dos tramos complementarios de dicho segmento de unión a proteínas comprende un tramo de ARNcrtra. 22. El ARN de localización específica de ADN de la reivindicación 21, en donde dicho tramo repetido de ARNcr y dicho tramo de ARNcrtra son de S.pyogenes. 23. El ARN de localización específica de ADN de una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 22, en donde dicha endonucleasa Cas9 de origen natural es de S.pyogenes. 67 24. Un complejo que está formado por (i) un ARN de localización específica de ADN de molécula única de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 o un ARN de localización específica de ADN de una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 23, y (ii) un polipéptido modificador dirigido a un sitio que es una endonucleasa Cas9 de origen natural. 25. Una composición que comprende: (i) un ARN de localización específica de ADN de molécula única de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 o un ARN de localización específica de ADN de una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 23, y (ii) un polipéptido modificador dirigido a un sitio que es una endonucleasa Cas9 de origen natural. 68
    69
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Families Citing this family (1639)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8399643B2 (en) 2009-02-26 2013-03-19 Transposagen Biopharmaceuticals, Inc. Nucleic acids encoding hyperactive PiggyBac transposases
DK3622815T3 (da) 2009-07-08 2023-06-26 Kymab Ltd Gnavermodeller og terapeutiske molekyler
US9445581B2 (en) 2012-03-28 2016-09-20 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
US9585920B2 (en) 2011-02-04 2017-03-07 Katherine Rose Kovarik Method and system for treating cancer cachexia
US9457077B2 (en) 2009-11-18 2016-10-04 Katherine Rose Kovarik Method and system for targeting the microbiome to promote health and treat allergic and inflammatory diseases
US9719068B2 (en) 2010-05-06 2017-08-01 Children's Hospital Medical Center Methods and systems for converting precursor cells into intestinal tissues through directed differentiation
US12257272B2 (en) 2015-12-24 2025-03-25 Seed Health, Inc. Method and system for reducing the likelihood of developing depression in an individual
US10086018B2 (en) 2011-02-04 2018-10-02 Joseph E. Kovarik Method and system for reducing the likelihood of colorectal cancer in a human being
US10010568B2 (en) 2011-02-04 2018-07-03 Katherine Rose Kovarik Method and system for reducing the likelihood of a spirochetes infection in a human being
US10085938B2 (en) 2011-02-04 2018-10-02 Joseph E. Kovarik Method and system for preventing sore throat in humans
US10842834B2 (en) 2016-01-06 2020-11-24 Joseph E. Kovarik Method and system for reducing the likelihood of developing liver cancer in an individual diagnosed with non-alcoholic fatty liver disease
US12533312B2 (en) 2011-02-04 2026-01-27 Seed Health, Inc. Method and system for preventing sore throat in humans
US10111913B2 (en) 2011-02-04 2018-10-30 Joseph E. Kovarik Method of reducing the likelihood of skin cancer in an individual human being
US10548761B2 (en) 2011-02-04 2020-02-04 Joseph E. Kovarik Method and system for reducing the likelihood of colorectal cancer in a human being
US10245288B2 (en) 2011-02-04 2019-04-02 Joseph E. Kovarik Method and system for reducing the likelihood of developing NASH in an individual diagnosed with non-alcoholic fatty liver disease
US10940169B2 (en) 2015-11-30 2021-03-09 Joseph E. Kovarik Method for reducing the likelihood of developing cancer in an individual human being
US10687975B2 (en) 2011-02-04 2020-06-23 Joseph E. Kovarik Method and system to facilitate the growth of desired bacteria in a human's mouth
US12279989B2 (en) 2011-02-04 2025-04-22 Seed Health, Inc. Method and system for increasing beneficial bacteria and decreasing pathogenic bacteria in the oral cavity
US11951140B2 (en) 2011-02-04 2024-04-09 Seed Health, Inc. Modulation of an individual's gut microbiome to address osteoporosis and bone disease
US10314865B2 (en) 2011-02-04 2019-06-11 Katherine Rose Kovarik Method and system for treating cancer and other age-related diseases by extending the healthspan of a human
US9730967B2 (en) 2011-02-04 2017-08-15 Katherine Rose Kovarik Method and system for treating cancer cachexia
US11357722B2 (en) 2011-02-04 2022-06-14 Seed Health, Inc. Method and system for preventing sore throat in humans
US11998479B2 (en) 2011-02-04 2024-06-04 Seed Health, Inc. Method and system for addressing adverse effects on the oral microbiome and restoring gingival health caused by sodium lauryl sulphate exposure
US9987224B2 (en) 2011-02-04 2018-06-05 Joseph E. Kovarik Method and system for preventing migraine headaches, cluster headaches and dizziness
US10583033B2 (en) 2011-02-04 2020-03-10 Katherine Rose Kovarik Method and system for reducing the likelihood of a porphyromonas gingivalis infection in a human being
US10512661B2 (en) 2011-02-04 2019-12-24 Joseph E. Kovarik Method and system for reducing the likelihood of developing liver cancer in an individual diagnosed with non-alcoholic fatty liver disease
US11523934B2 (en) 2011-02-04 2022-12-13 Seed Health, Inc. Method and system to facilitate the growth of desired bacteria in a human's mouth
US11191665B2 (en) 2011-02-04 2021-12-07 Joseph E. Kovarik Method and system for reducing the likelihood of a porphyromonas gingivalis infection in a human being
US11273187B2 (en) 2015-11-30 2022-03-15 Joseph E. Kovarik Method and system for reducing the likelihood of developing depression in an individual
US11844720B2 (en) 2011-02-04 2023-12-19 Seed Health, Inc. Method and system to reduce the likelihood of dental caries and halitosis
US11951139B2 (en) 2015-11-30 2024-04-09 Seed Health, Inc. Method and system for reducing the likelihood of osteoporosis
US11419903B2 (en) 2015-11-30 2022-08-23 Seed Health, Inc. Method and system for reducing the likelihood of osteoporosis
US10835560B2 (en) 2013-12-20 2020-11-17 Joseph E. Kovarik Reducing the likelihood of skin cancer in an individual human being
CA2831144A1 (en) 2011-03-23 2012-09-27 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods for producing a complex transgenic trait locus
EA024762B9 (ru) 2011-06-30 2017-04-28 Эрроухэд Рисерч Корпорейшн Композиции и способы ингибирования экспрессии генов вируса гепатита в
US10323236B2 (en) 2011-07-22 2019-06-18 President And Fellows Of Harvard College Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity
BR112014006394A2 (pt) 2011-09-19 2017-03-28 Kymab Ltd manipulação de diversidade genética de imunoglobulina e terapêuticos multi-anticorpos
WO2013045916A1 (en) 2011-09-26 2013-04-04 Kymab Limited Chimaeric surrogate light chains (slc) comprising human vpreb
EP3604555B1 (en) 2011-10-14 2024-12-25 President and Fellows of Harvard College Sequencing by structure assembly
US9253965B2 (en) 2012-03-28 2016-02-09 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
US10465042B2 (en) 2011-12-02 2019-11-05 Yale University Poly(amine-co-ester) nanoparticles and methods of use thereof
UA115772C2 (uk) 2011-12-16 2017-12-26 Таргітджин Байотекнолоджиз Лтд Композиція програмованого нуклеопротеїнового молекулярного комплексу і спосіб модифікування заданої послідовності нуклеїнової кислоти-мішені
ES2991004T3 (es) 2011-12-22 2024-12-02 Harvard College Métodos para la detección de analitos
GB201122458D0 (en) 2011-12-30 2012-02-08 Univ Wageningen Modified cascade ribonucleoproteins and uses thereof
US9637739B2 (en) * 2012-03-20 2017-05-02 Vilnius University RNA-directed DNA cleavage by the Cas9-crRNA complex
GB2502127A (en) 2012-05-17 2013-11-20 Kymab Ltd Multivalent antibodies and in vivo methods for their production
US10251377B2 (en) 2012-03-28 2019-04-09 Kymab Limited Transgenic non-human vertebrate for the expression of class-switched, fully human, antibodies
SG11201406547YA (en) 2012-04-25 2014-11-27 Regeneron Pharma Nuclease-mediated targeting with large targeting vectors
WO2013163628A2 (en) 2012-04-27 2013-10-31 Duke University Genetic correction of mutated genes
WO2013177560A1 (en) 2012-05-25 2013-11-28 The Regents Of The University Of California Microfluidic systems for particle trapping and separation
AU2013266968B2 (en) 2012-05-25 2017-06-29 Emmanuelle CHARPENTIER Methods and compositions for RNA-directed target DNA modification and for RNA-directed modulation of transcription
CN104540382A (zh) * 2012-06-12 2015-04-22 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 用于产生条件性敲除等位基因的方法和组合物
US20150225734A1 (en) 2012-06-19 2015-08-13 Regents Of The University Of Minnesota Gene targeting in plants using dna viruses
AU2013293270B2 (en) * 2012-07-25 2018-08-16 Massachusetts Institute Of Technology Inducible DNA binding proteins and genome perturbation tools and applications thereof
KR102909884B1 (ko) * 2012-10-23 2026-01-09 주식회사 툴젠 표적 DNA에 특이적인 가이드 RNA 및 Cas 단백질을 암호화하는 핵산 또는 Cas 단백질을 포함하는, 표적 DNA를 절단하기 위한 조성물 및 이의 용도
AU2013335451C1 (en) * 2012-10-23 2024-07-04 Toolgen Incorporated Composition for cleaving a target DNA comprising a guide RNA specific for the target DNA and Cas protein-encoding nucleic acid or Cas protein, and use thereof
CA2891510C (en) 2012-11-16 2022-10-18 Transposagen Biopharmaceuticals, Inc. Site-specific enzymes and methods of use
CN109554350B (zh) 2012-11-27 2022-09-23 儿童医疗中心有限公司 用于胎儿血红蛋白再诱导的靶向bcl11a远端调控元件
PL3360964T3 (pl) 2012-12-06 2020-03-31 Sigma-Aldrich Co. Llc Modyfikacja i regulacja genomu oparta na crispr
EP3031921B1 (en) 2012-12-12 2025-03-12 The Broad Institute, Inc. Delivery, engineering and optimization of systems, methods and compositions for sequence manipulation and therapeutic applications
IL239344B2 (en) * 2012-12-12 2024-06-01 Broad Inst Inc Systems engineering, methods and optimal guiding components for sequence manipulation
WO2014093655A2 (en) 2012-12-12 2014-06-19 The Broad Institute, Inc. Engineering and optimization of systems, methods and compositions for sequence manipulation with functional domains
US20140186843A1 (en) 2012-12-12 2014-07-03 Massachusetts Institute Of Technology Methods, systems, and apparatus for identifying target sequences for cas enzymes or crispr-cas systems for target sequences and conveying results thereof
EP2931899A1 (en) * 2012-12-12 2015-10-21 The Broad Institute, Inc. Functional genomics using crispr-cas systems, compositions, methods, knock out libraries and applications thereof
US20140310830A1 (en) 2012-12-12 2014-10-16 Feng Zhang CRISPR-Cas Nickase Systems, Methods And Compositions For Sequence Manipulation in Eukaryotes
WO2014093709A1 (en) 2012-12-12 2014-06-19 The Broad Institute, Inc. Methods, models, systems, and apparatus for identifying target sequences for cas enzymes or crispr-cas systems for target sequences and conveying results thereof
CN113355357B (zh) * 2012-12-12 2024-12-03 布罗德研究所有限公司 对用于序列操纵的改进的系统、方法和酶组合物进行的工程化和优化
EP2840140B2 (en) * 2012-12-12 2023-02-22 The Broad Institute, Inc. Crispr-Cas based method for mutation of prokaryotic cells
US8697359B1 (en) * 2012-12-12 2014-04-15 The Broad Institute, Inc. CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products
DK2931891T3 (da) * 2012-12-17 2019-08-19 Harvard College Rna-styret modificering af menneskelige genomer
CA2898184A1 (en) 2013-01-16 2014-07-24 Emory University Cas9-nucleic acid complexes and uses related thereto
US10660943B2 (en) 2013-02-07 2020-05-26 The Rockefeller University Sequence specific antimicrobials
US11135273B2 (en) 2013-02-07 2021-10-05 The Rockefeller University Sequence specific antimicrobials
CN103981147B (zh) 2013-02-08 2017-11-10 中国科学院上海生命科学研究院 一种新的制备肝实质细胞的方法
PT2963113T (pt) * 2013-02-14 2020-02-14 Univ Osaka Método para isolar região genómica específica utilizando molécula que se liga especificamente a sequência de adn endógena
MX384291B (es) 2013-02-20 2025-03-14 Regeneron Pharma Modificación genética de ratas.
EP2922393B2 (en) 2013-02-27 2022-12-28 Helmholtz Zentrum München - Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit und Umwelt (GmbH) Gene editing in the oocyte by cas9 nucleases
EP2971184B1 (en) 2013-03-12 2019-04-17 President and Fellows of Harvard College Method of generating a three-dimensional nucleic acid containing matrix
RU2662932C2 (ru) 2013-03-14 2018-07-31 Карибо Биосайенсиз, Инк. Композиции и способы с участием нуклеиновых кислот, нацеленных на нуклеиновые кислоты
US9957515B2 (en) 2013-03-15 2018-05-01 Cibus Us Llc Methods and compositions for targeted gene modification
EP4136963B1 (en) * 2013-03-15 2026-01-21 Cibus US LLC Methods and compositions for increasing efficiency of targeted gene modification using oligonucleotide-mediated gene repair
US10760064B2 (en) 2013-03-15 2020-09-01 The General Hospital Corporation RNA-guided targeting of genetic and epigenomic regulatory proteins to specific genomic loci
US20140349400A1 (en) * 2013-03-15 2014-11-27 Massachusetts Institute Of Technology Programmable Modification of DNA
US20140273230A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 Sigma-Aldrich Co., Llc Crispr-based genome modification and regulation
CA2905135C (en) * 2013-03-15 2022-10-25 Cibus Us Llc Targeted gene modification using oligonucleotide-mediated gene repair
US9234213B2 (en) * 2013-03-15 2016-01-12 System Biosciences, Llc Compositions and methods directed to CRISPR/Cas genomic engineering systems
CN112301024A (zh) * 2013-03-15 2021-02-02 通用医疗公司 使用RNA引导的FokI核酸酶(RFN)提高RNA引导的基因组编辑的特异性
US12331303B2 (en) 2013-03-15 2025-06-17 Cibus Us Llc Methods and compositions for increasing efficiency of targeted gene modification using oligonucleotide-mediated gene repair
WO2014144155A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 Regents Of The University Of Minnesota Engineering plant genomes using crispr/cas systems
WO2014204578A1 (en) 2013-06-21 2014-12-24 The General Hospital Corporation Using rna-guided foki nucleases (rfns) to increase specificity for rna-guided genome editing
US9788534B2 (en) 2013-03-18 2017-10-17 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
US9828582B2 (en) 2013-03-19 2017-11-28 Duke University Compositions and methods for the induction and tuning of gene expression
DK3456831T3 (da) 2013-04-16 2021-09-06 Regeneron Pharma Målrettet modifikation af rottegenom
US20160186208A1 (en) * 2013-04-16 2016-06-30 Whitehead Institute For Biomedical Research Methods of Mutating, Modifying or Modulating Nucleic Acid in a Cell or Nonhuman Mammal
US9783618B2 (en) 2013-05-01 2017-10-10 Kymab Limited Manipulation of immunoglobulin gene diversity and multi-antibody therapeutics
US9783593B2 (en) 2013-05-02 2017-10-10 Kymab Limited Antibodies, variable domains and chains tailored for human use
US11707056B2 (en) 2013-05-02 2023-07-25 Kymab Limited Animals, repertoires and methods
EP2994531B1 (en) 2013-05-10 2018-03-28 Sangamo Therapeutics, Inc. Delivery methods and compositions for nuclease-mediated genome engineering
WO2014186435A2 (en) 2013-05-14 2014-11-20 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Compositions and methods for reducing neointima formation
CN105683376A (zh) * 2013-05-15 2016-06-15 桑格摩生物科学股份有限公司 用于治疗遗传病状的方法和组合物
WO2014186686A2 (en) * 2013-05-17 2014-11-20 Two Blades Foundation Targeted mutagenesis and genome engineering in plants using rna-guided cas nucleases
CA2913234A1 (en) * 2013-05-22 2014-11-27 Northwestern University Rna-directed dna cleavage and gene editing by cas9 enzyme from neisseria meningitidis
US9873907B2 (en) 2013-05-29 2018-01-23 Agilent Technologies, Inc. Method for fragmenting genomic DNA using CAS9
EP3004339B1 (en) * 2013-05-29 2021-07-07 Cellectis New compact scaffold of cas9 in the type ii crispr system
AU2014273082B2 (en) * 2013-05-29 2018-11-08 Cellectis A method for producing precise DNA cleavage using Cas9 nickase activity
US9267135B2 (en) 2013-06-04 2016-02-23 President And Fellows Of Harvard College RNA-guided transcriptional regulation
SG10201913068PA (en) * 2013-06-04 2020-02-27 Harvard College Rna-guided transcriptional regulation
WO2014197748A2 (en) * 2013-06-05 2014-12-11 Duke University Rna-guided gene editing and gene regulation
US9982277B2 (en) 2013-06-11 2018-05-29 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for target DNA modification
JP2016521561A (ja) 2013-06-14 2016-07-25 セレクティス 植物における非トランスジェニックのゲノム編集のための方法
WO2014204724A1 (en) * 2013-06-17 2014-12-24 The Broad Institute Inc. Delivery, engineering and optimization of tandem guide systems, methods and compositions for sequence manipulation
RU2716420C2 (ru) 2013-06-17 2020-03-11 Те Брод Инститьют Инк. Доставка и применение систем crispr-cas, векторов и композиций для целенаправленного воздействия и терапии в печени
MX374532B (es) 2013-06-17 2025-03-06 Broad Inst Inc Suministro, uso y aplicaciones terapéuticas de los sistemas y composiciones crispr-cas, para actuar sobre trastornos y enfermedades utilizando componentes víricos.
CN105683379A (zh) * 2013-06-17 2016-06-15 布罗德研究所有限公司 用于对有丝分裂后细胞的疾病和障碍进行靶向和建模的系统、方法和组合物的递送、工程化和优化
EP3725885A1 (en) 2013-06-17 2020-10-21 The Broad Institute, Inc. Functional genomics using crispr-cas systems, compositions methods, screens and applications thereof
CN105492611A (zh) 2013-06-17 2016-04-13 布罗德研究所有限公司 用于序列操纵的优化的crispr-cas双切口酶系统、方法以及组合物
ES2929143T3 (es) * 2013-07-09 2022-11-25 Harvard College Ingeniería genómica guiada por ARN múltiplex
EP3666892A1 (en) * 2013-07-10 2020-06-17 President and Fellows of Harvard College Orthogonal cas9 proteins for rna-guided gene regulation and editing
JP6482546B2 (ja) * 2013-07-19 2019-03-13 ラリクス・バイオサイエンス・リミテッド・ライアビリティ・カンパニーＬａｒｉｘ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ， Ｌｌｃ 二重対立遺伝子ノックアウトを生成するための方法および組成物
US11306328B2 (en) 2013-07-26 2022-04-19 President And Fellows Of Harvard College Genome engineering
US10421957B2 (en) 2013-07-29 2019-09-24 Agilent Technologies, Inc. DNA assembly using an RNA-programmable nickase
US9944925B2 (en) 2013-08-02 2018-04-17 Enevolv, Inc. Processes and host cells for genome, pathway, and biomolecular engineering
US9163284B2 (en) 2013-08-09 2015-10-20 President And Fellows Of Harvard College Methods for identifying a target site of a Cas9 nuclease
WO2015021426A1 (en) * 2013-08-09 2015-02-12 Sage Labs, Inc. A crispr/cas system-based novel fusion protein and its application in genome editing
CN120574876A (zh) 2013-08-22 2025-09-02 纳幕尔杜邦公司 使用向导rna/cas内切核酸酶系统的植物基因组修饰及其使用方法
US9359599B2 (en) 2013-08-22 2016-06-07 President And Fellows Of Harvard College Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof
EP4074330A1 (en) * 2013-09-05 2022-10-19 Massachusetts Institute of Technology Tuning microbial populations with programmable nucleases
US9322037B2 (en) 2013-09-06 2016-04-26 President And Fellows Of Harvard College Cas9-FokI fusion proteins and uses thereof
US9228207B2 (en) * 2013-09-06 2016-01-05 President And Fellows Of Harvard College Switchable gRNAs comprising aptamers
US9526784B2 (en) 2013-09-06 2016-12-27 President And Fellows Of Harvard College Delivery system for functional nucleases
IL312865B2 (en) 2013-09-11 2025-06-01 Eagle Biologics Inc Liquid protein formulations containing viscosity-lowering agents
EP3988649B1 (en) 2013-09-18 2024-11-27 Kymab Limited Methods, cells and organisms
AU2014330922A1 (en) 2013-10-01 2016-03-03 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
WO2015065964A1 (en) 2013-10-28 2015-05-07 The Broad Institute Inc. Functional genomics using crispr-cas systems, compositions, methods, screens and applications thereof
WO2015066119A1 (en) 2013-10-30 2015-05-07 North Carolina State University Compositions and methods related to a type-ii crispr-cas system in lactobacillus buchneri
NZ746567A (en) * 2013-11-04 2019-09-27 Dow Agrosciences Llc Optimal soybean loci
US10752906B2 (en) * 2013-11-05 2020-08-25 President And Fellows Of Harvard College Precise microbiota engineering at the cellular level
CN106459995B (zh) 2013-11-07 2020-02-21 爱迪塔斯医药有限公司 使用统治型gRNA的CRISPR相关方法和组合物
US11326209B2 (en) * 2013-11-07 2022-05-10 Massachusetts Institute Of Technology Cell-based genomic recorded accumulative memory
CA2930877A1 (en) * 2013-11-18 2015-05-21 Crispr Therapeutics Ag Crispr-cas system materials and methods
US9074199B1 (en) 2013-11-19 2015-07-07 President And Fellows Of Harvard College Mutant Cas9 proteins
US10787684B2 (en) * 2013-11-19 2020-09-29 President And Fellows Of Harvard College Large gene excision and insertion
EP3080279B1 (en) 2013-12-11 2018-09-26 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for the targeted modification of a genome
KR102170502B1 (ko) 2013-12-11 2020-10-28 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 게놈의 표적화된 변형을 위한 방법 및 조성물
SG10201804975PA (en) 2013-12-12 2018-07-30 Broad Inst Inc Delivery, Use and Therapeutic Applications of the Crispr-Cas Systems and Compositions for HBV and Viral Diseases and Disorders
WO2015089427A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 The Broad Institute Inc. Crispr-cas systems and methods for altering expression of gene products, structural information and inducible modular cas enzymes
EP3470089A1 (en) * 2013-12-12 2019-04-17 The Broad Institute Inc. Delivery, use and therapeutic applications of the crispr-cas systems and compositions for targeting disorders and diseases using particle delivery components
WO2015089364A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 The Broad Institute Inc. Crystal structure of a crispr-cas system, and uses thereof
JP7103750B2 (ja) * 2013-12-12 2022-07-20 ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッド ゲノム編集のためのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系及び組成物の送達、使用及び治療適用
JP6712948B2 (ja) * 2013-12-12 2020-06-24 ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッド 組成物、及びヌクレオチドリピート障害におけるｃｒｉｓｐｒ−ｃａｓ系の使用方法
EP3835419A1 (en) * 2013-12-12 2021-06-16 The Regents of The University of California Methods and compositions for modifying a single stranded target nucleic acid
EP3080259B1 (en) 2013-12-12 2023-02-01 The Broad Institute, Inc. Engineering of systems, methods and optimized guide compositions with new architectures for sequence manipulation
US20150165054A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 President And Fellows Of Harvard College Methods for correcting caspase-9 point mutations
JP6793547B2 (ja) 2013-12-12 2020-12-02 ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッド 最適化機能ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系による配列操作のための系、方法および組成物
US20160304893A1 (en) * 2013-12-13 2016-10-20 Cellectis Cas9 nuclease platform for microalgae genome engineering
WO2015089375A1 (en) 2013-12-13 2015-06-18 The General Hospital Corporation Soluble high molecular weight (hmw) tau species and applications thereof
US20150191744A1 (en) * 2013-12-17 2015-07-09 University Of Massachusetts Cas9 effector-mediated regulation of transcription, differentiation and gene editing/labeling
EP3083958B1 (en) 2013-12-19 2019-04-17 Amyris, Inc. Methods for genomic integration
ES2918501T3 (es) 2013-12-19 2022-07-18 Novartis Ag Receptores de antígenos quiméricos de mesotelina humana y usos de los mismos
US12318377B2 (en) 2013-12-20 2025-06-03 Seed Health, Inc. Method and system for reducing the likelihood of a porphyromonas gingivalis infection in a human being
US11826388B2 (en) 2013-12-20 2023-11-28 Seed Health, Inc. Topical application of Lactobacillus crispatus to ameliorate barrier damage and inflammation
EP3087101B1 (en) 2013-12-20 2024-06-05 Novartis AG Regulatable chimeric antigen receptor
US11672835B2 (en) 2013-12-20 2023-06-13 Seed Health, Inc. Method for treating individuals having cancer and who are receiving cancer immunotherapy
US11026982B2 (en) 2015-11-30 2021-06-08 Joseph E. Kovarik Method for reducing the likelihood of developing bladder or colorectal cancer in an individual human being
US11969445B2 (en) 2013-12-20 2024-04-30 Seed Health, Inc. Probiotic composition and method for controlling excess weight, obesity, NAFLD and NASH
US11642382B2 (en) 2013-12-20 2023-05-09 Seed Health, Inc. Method for treating an individual suffering from bladder cancer
US12329783B2 (en) 2013-12-20 2025-06-17 Seed Health, Inc. Method and system to improve the health of a person's skin microbiome
US11980643B2 (en) 2013-12-20 2024-05-14 Seed Health, Inc. Method and system to modify an individual's gut-brain axis to provide neurocognitive protection
US11213552B2 (en) 2015-11-30 2022-01-04 Joseph E. Kovarik Method for treating an individual suffering from a chronic infectious disease and cancer
US11833177B2 (en) 2013-12-20 2023-12-05 Seed Health, Inc. Probiotic to enhance an individual's skin microbiome
NZ759969A (en) 2013-12-20 2022-12-23 Fred Hutchinson Cancer Center Tagged chimeric effector molecules and receptors thereof
US11529379B2 (en) 2013-12-20 2022-12-20 Seed Health, Inc. Method and system for reducing the likelihood of developing colorectal cancer in an individual human being
US11998574B2 (en) 2013-12-20 2024-06-04 Seed Health, Inc. Method and system for modulating an individual's skin microbiome
US12246043B2 (en) 2013-12-20 2025-03-11 Seed Health, Inc. Topical application to treat acne vulgaris
US12005085B2 (en) 2013-12-20 2024-06-11 Seed Health, Inc. Probiotic method and composition for maintaining a healthy vaginal microbiome
US11839632B2 (en) 2013-12-20 2023-12-12 Seed Health, Inc. Topical application of CRISPR-modified bacteria to treat acne vulgaris
CA2935032C (en) * 2013-12-26 2024-01-23 The General Hospital Corporation Multiplex guide rnas
EP3089989B1 (en) * 2013-12-31 2020-06-24 The Regents of The University of California Cas9 crystals and methods of use thereof
WO2015105928A1 (en) * 2014-01-08 2015-07-16 President And Fellows Of Harvard College Rna-guided gene drives
KR20160128306A (ko) 2014-01-14 2016-11-07 램 테라퓨틱스, 인코포레이티드 돌연변이유발 방법
US10787654B2 (en) 2014-01-24 2020-09-29 North Carolina State University Methods and compositions for sequence guiding Cas9 targeting
JP2017503514A (ja) * 2014-01-24 2017-02-02 ノースカロライナ ステート ユニバーシティーＮｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃａｓ９ターゲッティングをガイドする配列に関する方法および組成物
US11315659B2 (en) * 2014-01-27 2022-04-26 Georgia Tech Research Corporation Methods and systems for identifying nucleotide-guided nuclease off-target sites
WO2015113063A1 (en) 2014-01-27 2015-07-30 Georgia Tech Research Corporation Methods and systems for identifying crispr/cas off-target sites
US9850525B2 (en) * 2014-01-29 2017-12-26 Agilent Technologies, Inc. CAS9-based isothermal method of detection of specific DNA sequence
ES2833299T3 (es) * 2014-02-04 2021-06-14 Jumpcode Genomics Inc Fraccionamiento del genoma
US20180142307A1 (en) * 2014-02-11 2018-05-24 California Institute Of Technology Recording and mapping lineage information and molecular events in individual cells
EP3690044B1 (en) 2014-02-11 2024-01-10 The Regents of the University of Colorado, a body corporate Crispr enabled multiplexed genome engineering
US10287590B2 (en) * 2014-02-12 2019-05-14 Dna2.0, Inc. Methods for generating libraries with co-varying regions of polynuleotides for genome modification
EP3105325B2 (en) * 2014-02-13 2024-10-23 Takara Bio USA, Inc. Methods of depleting a target molecule from an initial collection of nucleic acids, and compositions and kits for practicing the same
US10286084B2 (en) * 2014-02-18 2019-05-14 Duke University Compositions for the inactivation of virus replication and methods of making and using the same
WO2015127439A1 (en) * 2014-02-24 2015-08-27 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for nuclease-mediated targeted integration
ES2898460T3 (es) 2014-02-27 2022-03-07 Monsanto Technology Llc Composiciones y procedimientos para la modificación genómica dirigida al sitio
CN103820454B (zh) * 2014-03-04 2016-03-30 上海金卫生物技术有限公司 CRISPR-Cas9特异性敲除人PD1基因的方法以及用于特异性靶向PD1基因的sgRNA
EP3115457B1 (en) * 2014-03-05 2019-10-02 National University Corporation Kobe University Genomic sequence modification method for specifically converting nucleic acid bases of targeted dna sequence, and molecular complex for use in same
US11028388B2 (en) 2014-03-05 2021-06-08 Editas Medicine, Inc. CRISPR/Cas-related methods and compositions for treating Usher syndrome and retinitis pigmentosa
ES2745769T3 (es) 2014-03-10 2020-03-03 Editas Medicine Inc Procedimientos y composiciones relacionados con CRISPR/CAS para tratar la amaurosis congénita de Leber 10 (LCA10)
US11141493B2 (en) 2014-03-10 2021-10-12 Editas Medicine, Inc. Compositions and methods for treating CEP290-associated disease
US11339437B2 (en) 2014-03-10 2022-05-24 Editas Medicine, Inc. Compositions and methods for treating CEP290-associated disease
KR102450868B1 (ko) 2014-03-14 2022-10-06 시버스 유에스 엘엘씨 올리고뉴클레오타이드 매개 유전자 보수를 사용한 표적화된 유전자 변형의 효율을 증가시키기 위한 방법 및 조성물
US20170335281A1 (en) 2014-03-15 2017-11-23 Novartis Ag Treatment of cancer using chimeric antigen receptor
ES2857226T3 (es) 2014-03-15 2021-09-28 Novartis Ag Receptor de antígeno quimérico regulable
PL3628334T3 (pl) * 2014-03-21 2023-12-18 Genzyme Corporation Terapia genowa w retinopatii barwnikowej
HUE054419T2 (hu) 2014-03-24 2021-09-28 Immco Diagnostics Inc Javított antinukleárisellenanyag-kimutatás és diagnosztika szisztémás és nem szisztémás autoimmun betegségekhez
WO2015148680A1 (en) * 2014-03-25 2015-10-01 Ginkgo Bioworks, Inc. Methods and genetic systems for cell engineering
EP3122880B1 (en) 2014-03-26 2021-05-05 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating sickle cell disease
CA2944141C (en) * 2014-03-28 2023-03-28 Aposense Ltd. Compounds and methods for trans-membrane delivery of molecules
US11318206B2 (en) 2014-03-28 2022-05-03 Aposense Ltd Compounds and methods for trans-membrane delivery of molecules
WO2015153791A1 (en) * 2014-04-01 2015-10-08 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating herpes simplex virus type 2 (hsv-2)
EP3540061A1 (en) 2014-04-02 2019-09-18 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating primary open angle glaucoma
CN106170550A (zh) * 2014-04-03 2016-11-30 麻省理工学院 用于产生导引rna的方法和组合物
AU2015244039B2 (en) 2014-04-07 2021-10-21 Novartis Ag Treatment of cancer using anti-CD19 chimeric antigen receptor
JP2017512481A (ja) 2014-04-08 2017-05-25 ノースカロライナ ステート ユニバーシティーＮｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｒｉｓｐｒ関連遺伝子を用いた、ｒｎａ依存性の転写抑制のための方法および組成物
WO2015161276A2 (en) * 2014-04-18 2015-10-22 Editas Medicine, Inc. Crispr-cas-related methods, compositions and components for cancer immunotherapy
MX375592B (es) 2014-04-25 2025-03-06 The Children´S Medical Center Corp Composiciones y su uso para tratar hemoglobinopatias.
BR112016024945A2 (pt) 2014-04-28 2017-10-24 Recombinetics Inc edição de gene multiplex em suínos
WO2015168404A1 (en) * 2014-04-30 2015-11-05 Massachusetts Institute Of Technology Toehold-gated guide rna for programmable cas9 circuitry with rna input
US11918695B2 (en) 2014-05-09 2024-03-05 Yale University Topical formulation of hyperbranched polymer-coated particles
ES2966886T3 (es) 2014-05-09 2024-04-24 Univ Yale Partículas recubiertas con poliglicerol hiperramificado y métodos de elaboración y uso de las mismas
WO2015175642A2 (en) * 2014-05-13 2015-11-19 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for prevention or treatment of a disease
PL3145934T3 (pl) 2014-05-19 2021-08-16 Pfizer Inc. Podstawione związki 6,8-dioksabicyklo[3.2.1]oktano-2,3-diolu jako środki kierujące do ASGPR
US20170175143A1 (en) * 2014-05-20 2017-06-22 Regents Of The University Of Minnesota Method for editing a genetic sequence
SG10201801654RA (en) 2014-05-28 2018-04-27 Childrens Hospital Med Ct Methods and systems for converting precursor cells into gastric tissues through directed differentiation
WO2015184259A1 (en) 2014-05-30 2015-12-03 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Compositions and methods to treat latent viral infections
WO2015188056A1 (en) * 2014-06-05 2015-12-10 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for nuclease design
HRP20200529T1 (hr) 2014-06-06 2020-09-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Postupci i pripravci za modificiranje ciljnog lokusa
US11274302B2 (en) * 2016-08-17 2022-03-15 Diacarta Ltd Specific synthetic chimeric Xenonucleic acid guide RNA; s(XNA-gRNA) for enhancing CRISPR mediated genome editing efficiency
EP3155116A4 (en) * 2014-06-10 2017-12-27 Massachusetts Institute Of Technology Method for gene editing
AU2015324564B2 (en) 2014-06-11 2021-07-01 Duke University Compositions and methods for rapid and dynamic flux control using synthetic metabolic valves
CN106536056B (zh) 2014-06-13 2021-07-16 儿童医学中心公司 分离线粒体的产品和方法
US20170107541A1 (en) * 2014-06-17 2017-04-20 Poseida Therapeutics, Inc. A method for directing proteins to specific loci in the genome and uses thereof
CN106604994B (zh) 2014-06-23 2021-12-14 通用医疗公司 通过测序评估的DSBs的全基因组无偏鉴定(GUIDE-Seq)
ES2781323T3 (es) 2014-06-23 2020-09-01 Regeneron Pharma Montaje de ADN mediado por nucleasas
SI3161128T1 (sl) 2014-06-26 2019-02-28 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Postopki in sestavki za ciljano genetsko spremembo in postopki uporabe
US10676754B2 (en) 2014-07-11 2020-06-09 E I Du Pont De Nemours And Company Compositions and methods for producing plants resistant to glyphosate herbicide
WO2016007839A1 (en) 2014-07-11 2016-01-14 President And Fellows Of Harvard College Methods for high-throughput labelling and detection of biological features in situ using microscopy
CA2954791C (en) * 2014-07-14 2025-11-18 The Regents Of The University Of California CRISPR/CAS TRANSCRIPTIONAL MODULATION
US20170219596A1 (en) * 2014-07-14 2017-08-03 The Regents Of The University Of California A protein tagging system for in vivo single molecule imaging and control of gene transcription
KR20170032406A (ko) 2014-07-15 2017-03-22 주노 쎄러퓨티크스 인코퍼레이티드 입양 세포 치료를 위한 조작된 세포
US20160053272A1 (en) * 2014-07-18 2016-02-25 Whitehead Institute For Biomedical Research Methods Of Modifying A Sequence Using CRISPR
US20160053304A1 (en) * 2014-07-18 2016-02-25 Whitehead Institute For Biomedical Research Methods Of Depleting Target Sequences Using CRISPR
BR112017001183A2 (pt) 2014-07-21 2017-11-28 Novartis Ag tratamento de câncer usando receptor de antígeno quimérico anti-bcma humanizado
US11542488B2 (en) 2014-07-21 2023-01-03 Novartis Ag Sortase synthesized chimeric antigen receptors
JP2017528433A (ja) 2014-07-21 2017-09-28 ノバルティス アーゲー 低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤とＣＡＲの組み合わせ
CA2955382C (en) * 2014-07-21 2023-07-18 Illumina, Inc. Polynucleotide enrichment using crispr-cas systems
TWI719942B (zh) 2014-07-21 2021-03-01 瑞士商諾華公司 使用ｃｄ３３嵌合抗原受體治療癌症
US10077453B2 (en) 2014-07-30 2018-09-18 President And Fellows Of Harvard College CAS9 proteins including ligand-dependent inteins
EP4205749A1 (en) 2014-07-31 2023-07-05 Novartis AG Subset-optimized chimeric antigen receptor-containing cells
US20160076093A1 (en) * 2014-08-04 2016-03-17 University Of Washington Multiplex homology-directed repair
EP4194557A1 (en) 2014-08-06 2023-06-14 Institute for Basic Science Genome editing using campylobacter jejuni crispr/cas system-derived rgen
WO2016022866A1 (en) * 2014-08-07 2016-02-11 Agilent Technologies, Inc. Cis-blocked guide rna
US10513711B2 (en) 2014-08-13 2019-12-24 Dupont Us Holding, Llc Genetic targeting in non-conventional yeast using an RNA-guided endonuclease
WO2016025759A1 (en) 2014-08-14 2016-02-18 Shen Yuelei Dna knock-in system
AU2015301460B2 (en) 2014-08-14 2021-04-08 Novartis Ag Treatment of cancer using GFR alpha-4 chimeric antigen receptor
US9879270B2 (en) * 2014-08-15 2018-01-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Constructs and methods for genome editing and genetic engineering of fungi and protists
EP3633047B1 (en) 2014-08-19 2022-12-28 Pacific Biosciences of California, Inc. Method of sequencing nucleic acids based on an enrichment of nucleic acids
EP3183358B1 (en) 2014-08-19 2020-10-07 President and Fellows of Harvard College Rna-guided systems for probing and mapping of nucleic acids
MX2017002205A (es) 2014-08-19 2017-08-21 Novartis Ag Receptor quimerico de antigeno (car) anti-cd123 para uso en el tratamiento de cancer.
US10435685B2 (en) 2014-08-19 2019-10-08 Pacific Biosciences Of California, Inc. Compositions and methods for enrichment of nucleic acids
SG11201701245QA (en) 2014-08-27 2017-03-30 Caribou Biosciences Inc Methods for increasing cas9-mediated engineering efficiency
EP3186375A4 (en) * 2014-08-28 2019-03-13 North Carolina State University Novel CAS9 PROTEINS AND CHARACTERISTICS FOR DNA TARGETING AND GENOME EDITING
EP3188763B1 (en) 2014-09-02 2020-05-13 The Regents of The University of California Methods and compositions for rna-directed target dna modification
MX2017002930A (es) 2014-09-12 2017-06-06 Du Pont Generacion de sitios de integracion especifica de sitio para loci de rasgos complejos en maiz y soja, y metodos de uso.
JP6839074B2 (ja) 2014-09-17 2021-03-03 ノバルティス アーゲー 養子免疫療法のためのキメラ受容体での細胞毒性細胞のターゲティング
WO2016049024A2 (en) * 2014-09-24 2016-03-31 The Broad Institute Inc. Delivery, use and therapeutic applications of the crispr-cas systems and compositions for modeling competition of multiple cancer mutations in vivo
WO2016049531A1 (en) 2014-09-26 2016-03-31 Purecircle Usa Inc. Single nucleotide polymorphism (snp) markers for stevia
JP2017534295A (ja) 2014-09-29 2017-11-24 ザ ジャクソン ラボラトリー エレクトロポレーションによる遺伝子改変哺乳動物の高効率ハイスループット生成
US20170233762A1 (en) * 2014-09-29 2017-08-17 The Regents Of The University Of California Scaffold rnas
AU2015325055B2 (en) 2014-10-01 2021-02-25 Eagle Biologics, Inc. Polysaccharide and nucleic acid formulations containing viscosity-lowering agents
WO2016050512A1 (en) 2014-10-03 2016-04-07 Bayer Cropscience Nv Methods and means for increasing stress tolerance and biomass in plants
AU2015330699B2 (en) 2014-10-10 2021-12-02 Editas Medicine, Inc. Compositions and methods for promoting homology directed repair
BR112017007770A2 (pt) 2014-10-15 2018-01-16 Regeneron Pharma cultura in vitro, população de hipscs, método para modificar um locus-alvo genômico, e, hipsc.
WO2016061523A1 (en) * 2014-10-17 2016-04-21 Howard Hughes Medical Institute Genomic probes
WO2016065364A1 (en) * 2014-10-24 2016-04-28 Life Technologies Corporation Compositions and methods for enhancing homologous recombination
GB201418965D0 (es) 2014-10-24 2014-12-10 Ospedale San Raffaele And Fond Telethon
US20170335331A1 (en) 2014-10-31 2017-11-23 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Altering Gene Expression in CART Cells and Uses Thereof
TWI716367B (zh) * 2014-10-31 2021-01-21 麻省理工學院 用於常間回文重複序列叢集（ｃｒｉｓｐｒ）之大量平行組合性基因學
WO2016073559A1 (en) * 2014-11-05 2016-05-12 The Regents Of The University Of California Methods for autocatalytic genome editing and neutralizing autocatalytic genome editing
JP6823593B2 (ja) 2014-11-06 2021-02-03 イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニーＥ．Ｉ．Ｄｕ Ｐｏｎｔ Ｄｅ Ｎｅｍｏｕｒｓ Ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｒｎａ誘導型エンドヌクレアーゼの細胞へのペプチド媒介輸送
EP4464338A3 (en) 2014-11-07 2025-02-12 Editas Medicine, Inc. Systems for improving crispr/cas-mediated genome-editing
WO2016080097A1 (ja) * 2014-11-17 2016-05-26 国立大学法人東京医科歯科大学 簡便で高効率の遺伝子改変非ヒト哺乳動物の作製方法
CN104531632A (zh) * 2014-11-18 2015-04-22 李云英 快速降解的Cas9-ODC422-461融合蛋白及其应用
KR102531016B1 (ko) 2014-11-21 2023-05-10 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 쌍 형성된 가이드 rna를 사용하는 표적화된 유전자 변형을 위한 방법 및 조성물
CN107208070B (zh) * 2014-11-26 2021-09-07 技术创新动力基金（以色列）有限合伙公司 细菌基因的靶向消除
GB201421096D0 (en) 2014-11-27 2015-01-14 Imp Innovations Ltd Genome editing methods
WO2016089883A1 (en) * 2014-12-01 2016-06-09 Novartis Ag Compositions and methods for diagnosis and treatment of prostate cancer
CA2969619A1 (en) 2014-12-03 2016-06-09 Agilent Technologies, Inc. Guide rna with chemical modifications
CN116059378A (zh) 2014-12-10 2023-05-05 明尼苏达大学董事会 用于治疗疾病的遗传修饰的细胞、组织和器官
US12359197B2 (en) 2014-12-12 2025-07-15 Etagen Pharma, Inc. Compositions and methods for editing nucleic acids in cells utilizing oligonucleotides
EP3889260A1 (en) 2014-12-12 2021-10-06 The Broad Institute, Inc. Protected guide rnas (pgrnas)
WO2016094874A1 (en) * 2014-12-12 2016-06-16 The Broad Institute Inc. Escorted and functionalized guides for crispr-cas systems
WO2016093668A2 (ko) * 2014-12-12 2016-06-16 한국한의학연구원 일체형 유전자 치료 유도만능줄기세포 제작방법
CN113215115B (zh) 2014-12-16 2024-07-02 C3J治疗公司 用于体外病毒基因组工程的组合物和方法
KR102424626B1 (ko) * 2014-12-17 2022-07-25 이 아이 듀폰 디 네모아 앤드 캄파니 원형 폴리뉴클레오티드 변형 주형과 함께 가이드 RNA/Cas 엔도뉴클레아제 시스템을 이용하여 대장균에서 효율적으로 유전자 편집을 하기 위한 조성물 및 방법
CA2970683A1 (en) 2014-12-18 2016-06-23 Integrated Dna Technologies, Inc. Crispr-based compositions and methods of use
WO2016097751A1 (en) * 2014-12-18 2016-06-23 The University Of Bath Method of cas9 mediated genome engineering
US10196613B2 (en) 2014-12-19 2019-02-05 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Stem cells for modeling type 2 diabetes
WO2016098078A2 (en) 2014-12-19 2016-06-23 Novartis Ag Dimerization switches and uses thereof
ES2947714T3 (es) 2014-12-19 2023-08-17 Regeneron Pharma Métodos y composiciones para la modificación genética dirigida a través de múltiples direccionamientos en un solo paso
WO2016100955A2 (en) 2014-12-20 2016-06-23 Identifygenomics, Llc Compositions and methods for targeted depletion, enrichment, and partitioning of nucleic acids using crispr/cas system proteins
WO2016106121A1 (en) 2014-12-23 2016-06-30 Syngenta Participations Ag Methods and compositions for identifying and enriching for cells comprising site specific genomic modifications
CA2970370A1 (en) 2014-12-24 2016-06-30 Massachusetts Institute Of Technology Crispr having or associated with destabilization domains
JP2018500037A (ja) 2014-12-31 2018-01-11 シンセティック ジェノミクス インコーポレーテッド 高効率なインビボゲノム編集のための組成物及び方法
WO2016110453A1 (en) * 2015-01-06 2016-07-14 Dsm Ip Assets B.V. A crispr-cas system for a filamentous fungal host cell
EP3245232B1 (en) 2015-01-12 2021-04-21 The Regents of The University of California Heterodimeric cas9 and methods of use thereof
MA41349A (fr) * 2015-01-14 2017-11-21 Univ Temple Éradication de l'herpès simplex de type i et d'autres virus de l'herpès associés guidée par arn
US10059940B2 (en) * 2015-01-27 2018-08-28 Minghong Zhong Chemically ligated RNAs for CRISPR/Cas9-lgRNA complexes as antiviral therapeutic agents
JP2018503392A (ja) 2015-01-27 2018-02-08 中国科学院遺▲伝▼与▲発▼育生物学研究所Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ 遺伝子一過性発現により完全な植物において部位特異的改変を行うための方法
EP3250689B1 (en) 2015-01-28 2020-11-04 The Regents of The University of California Methods and compositions for labeling a single-stranded target nucleic acid
US9650617B2 (en) 2015-01-28 2017-05-16 Pioneer Hi-Bred International. Inc. CRISPR hybrid DNA/RNA polynucleotides and methods of use
WO2016123578A1 (en) * 2015-01-30 2016-08-04 The Regents Of The University Of California Protein delivery in primary hematopoietic cells
KR102699584B1 (ko) 2015-02-02 2024-08-28 메이라지티엑스 유케이 Ii 리미티드 대안적 스플라이싱의 압타머 매개 조절에 의한 유전자 발현 제어
KR102763121B1 (ko) 2015-02-06 2025-02-04 내셔널 유니버시티 오브 싱가포르 치료적 면역 세포의 효능의 향상 방법
WO2016130600A2 (en) 2015-02-09 2016-08-18 Duke University Compositions and methods for epigenome editing
JP6354100B2 (ja) * 2015-02-19 2018-07-11 国立大学法人徳島大学 Ｃａｓ９ ｍＲＮＡを哺乳動物の受精卵にエレクトロポレーションにより導入する方法
WO2016135559A2 (en) 2015-02-23 2016-09-01 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for treatment of human genetic diseases including hemoglobinopathies
WO2016137949A1 (en) * 2015-02-23 2016-09-01 Voyager Therapeutics, Inc. Regulatable expression using adeno-associated virus (aav)
BR112017017812A2 (en) 2015-02-23 2018-04-10 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for treatment of hemoglobinopathies
US10968536B2 (en) 2015-02-25 2021-04-06 Jumpcode Genomics, Inc. Methods and compositions for sequencing
KR20230156800A (ko) 2015-03-03 2023-11-14 더 제너럴 하스피탈 코포레이션 변경된 PAM 특이성을 갖는 조작된 CRISPR-Cas9 뉴클레아제
WO2016142427A1 (en) 2015-03-10 2016-09-15 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Method ank kit for reprogramming somatic cells
EP3858992A1 (en) 2015-03-13 2021-08-04 The Jackson Laboratory A three-component crispr/cas complex system and uses thereof
JP2018508221A (ja) 2015-03-16 2018-03-29 中国科学院遺▲伝▼与▲発▼育生物学研究所Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ 植物ゲノムの部位特異的改変の実施に非遺伝物質を適用する方法
WO2016149422A1 (en) * 2015-03-16 2016-09-22 The Broad Institute, Inc. Encoding of dna vector identity via iterative hybridization detection of a barcode transcript
EP3929291A1 (en) 2015-03-17 2021-12-29 Bio-Rad Laboratories, Inc. Detection of genome editing
JP6836999B2 (ja) 2015-03-24 2021-03-03 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニアＴｈｅ Ｒｅｇｅｎｔｓ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ アデノ随伴ウイルス変異体及びその使用方法
EP3274454B1 (en) * 2015-03-25 2021-08-25 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods, compositions and components
BR112017017260A2 (pt) 2015-03-27 2018-04-17 Du Pont construções de dna, vetor, célula, plantas, semente, método de expressão de rna e método de modificação de local alvo
JP2018513681A (ja) 2015-03-31 2018-05-31 エクセリゲン サイエンティフィック, インコーポレイテッドExeligen Scientific, Inc. 細胞または生物のゲノムへのＤＮＡ配列の標的化組み込みのためのＣａｓ９レトロウイルスインテグラーゼおよびＣａｓ９レコンビナーゼ系
KR102888521B1 (ko) 2015-04-06 2025-11-19 더 보드 어브 트러스티스 어브 더 리랜드 스탠포드 주니어 유니버시티 Crispr/cas-매개 유전자 조절을 위한 화학적으로 변형된 가이드 rna
EP3284749B1 (en) * 2015-04-13 2024-08-14 The University of Tokyo Set of polypeptides exhibiting nuclease activity or nickase activity with dependence on light or in presence of drug or suppressing or activating expression of target gene
EP3283090B1 (en) 2015-04-15 2023-06-07 Synthetic Genomics, Inc. Algal chloroplastic srp54 mutants
US11674144B2 (en) * 2015-04-16 2023-06-13 California Institute Of Technology Fractional regulation of transcription
EP3286211A1 (en) 2015-04-23 2018-02-28 Novartis AG Treatment of cancer using chimeric antigen receptor and protein kinase a blocker
JP2018522249A (ja) * 2015-04-24 2018-08-09 エディタス・メディシン、インコーポレイテッド Ｃａｓ９分子／ガイドｒｎａ分子複合体の評価
EP3288570A4 (en) 2015-04-29 2018-11-21 Fred Hutchinson Cancer Research Center Modified stem cells and uses thereof
WO2016178207A1 (en) * 2015-05-04 2016-11-10 Ramot At Tel-Aviv University Ltd. Methods and kits for fragmenting dna
EP3711488A1 (en) 2015-05-06 2020-09-23 Snipr Technologies Limited Altering microbial populations & modifying microbiota
US11572543B2 (en) 2015-05-08 2023-02-07 The Children's Medical Center. Corporation Targeting BCL11A enhancer functional regions for fetal hemoglobin reinduction
US11253616B2 (en) 2017-09-06 2022-02-22 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Small molecules for dual function positron emission tomography (PET) and cell suicide switches
CA2986310A1 (en) 2015-05-11 2016-11-17 Editas Medicine, Inc. Optimized crispr/cas9 systems and methods for gene editing in stem cells
WO2016183402A2 (en) * 2015-05-13 2016-11-17 President And Fellows Of Harvard College Methods of making and using guide rna for use with cas9 systems
CN107614680A (zh) * 2015-05-14 2018-01-19 南加利福尼亚大学 利用重组核酸内切酶系统的最佳化基因编辑
JP2018515142A (ja) * 2015-05-15 2018-06-14 ダーマコン，インコーポレイテッド． Ｃａｓ９介在遺伝子編集用の合成シングルガイドｒｎａ
AU2016263026A1 (en) 2015-05-15 2017-11-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Guide RNA/Cas endonuclease systems
EP3095870A1 (en) 2015-05-19 2016-11-23 Kws Saat Se Methods for the in planta transformation of plants and manufacturing processes and products based and obtainable therefrom
US10966414B2 (en) 2015-05-26 2021-04-06 California Institute Of Technology Population control using engineered translocations
US10117911B2 (en) 2015-05-29 2018-11-06 Agenovir Corporation Compositions and methods to treat herpes simplex virus infections
EA201792663A1 (ru) 2015-05-29 2018-04-30 Норт Каролина Стейт Юниверсити Способы скрининга бактерий, архей, водорослей и дрожжей с использованием нуклеиновых кислот crispr
US10883103B2 (en) 2015-06-02 2021-01-05 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for delivery of a polynucleotide into a plant
WO2016196655A1 (en) 2015-06-03 2016-12-08 The Regents Of The University Of California Cas9 variants and methods of use thereof
EP3303585A4 (en) * 2015-06-03 2018-10-31 Board of Regents of the University of Nebraska Dna editing using single-stranded dna
EP3302525A2 (en) 2015-06-05 2018-04-11 Novartis AG Methods and compositions for diagnosing, treating, and monitoring treatment of shank3 deficiency associated disorders
CN108026526B (zh) 2015-06-09 2023-05-12 爱迪塔斯医药公司 用于改善移植的crispr/cas相关方法和组合物
US20160362667A1 (en) 2015-06-10 2016-12-15 Caribou Biosciences, Inc. CRISPR-Cas Compositions and Methods
US20160362705A1 (en) 2015-06-12 2016-12-15 Lonza Walkersville, Inc. Methods for Nuclear Reprogramming Using Synthetic Transcription Factors
GB201510296D0 (en) * 2015-06-12 2015-07-29 Univ Wageningen Thermostable CAS9 nucleases
WO2016205276A1 (en) 2015-06-15 2016-12-22 North Carolina State University Methods and compositions for efficient delivery of nucleic acids and rna-based antimicrobials
IL316159A (en) 2015-06-15 2024-12-01 Mpeg La Llc Defined Oligonucleotide Multimers and Methods for Manufacture Thereof
JP2018518182A (ja) 2015-06-17 2018-07-12 ザ ユーエービー リサーチ ファンデーション ゲノム編集のためのｃｒｉｓｐｒ／ｃａｓ９複合体
US11473082B2 (en) * 2015-06-17 2022-10-18 Poseida Therapeutics, Inc. Compositions and methods for directing proteins to specific loci in the genome
JP2018518181A (ja) 2015-06-17 2018-07-12 ザ ユーエービー リサーチ ファンデーション 血液細胞系列の細胞に機能的ポリペプチドを導入するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体
WO2016205759A1 (en) 2015-06-18 2016-12-22 The Broad Institute Inc. Engineering and optimization of systems, methods, enzymes and guide scaffolds of cas9 orthologs and variants for sequence manipulation
WO2016205749A1 (en) * 2015-06-18 2016-12-22 The Broad Institute Inc. Novel crispr enzymes and systems
TWI906646B (zh) 2015-06-18 2025-12-01 美商博得學院股份有限公司 降低脫靶效應的ｃｒｉｓｐｒ酶突變
US9790490B2 (en) 2015-06-18 2017-10-17 The Broad Institute Inc. CRISPR enzymes and systems
WO2017004261A1 (en) 2015-06-29 2017-01-05 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modified crispr rna and modified single crispr rna and uses thereof
US11279928B2 (en) 2015-06-29 2022-03-22 Massachusetts Institute Of Technology Compositions comprising nucleic acids and methods of using the same
JP6765665B2 (ja) * 2015-07-13 2020-10-07 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 不稔化植物、不稔化植物の作出方法、及びベクター
JP7044373B2 (ja) 2015-07-15 2022-03-30 ラトガース，ザ ステート ユニバーシティ オブ ニュージャージー ヌクレアーゼ非依存的な標的化遺伝子編集プラットフォームおよびその用途
HK1255161A1 (zh) 2015-07-15 2019-08-09 Juno Therapeutics, Inc. 用於过继性细胞治疗的工程细胞
WO2017015101A1 (en) * 2015-07-17 2017-01-26 University Of Washington Methods for maximizing the efficiency of targeted gene correction
US10676735B2 (en) 2015-07-22 2020-06-09 Duke University High-throughput screening of regulatory element function with epigenome editing technologies
GB2592821B (en) 2015-07-31 2022-01-12 Univ Minnesota Modified cells and methods of therapy
WO2017024047A1 (en) * 2015-08-03 2017-02-09 Emendobio Inc. Compositions and methods for increasing nuclease induced recombination rate in cells
WO2017024318A1 (en) 2015-08-06 2017-02-09 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Targeted protein degradation to attenuate adoptive t-cell therapy associated adverse inflammatory responses
US9580727B1 (en) 2015-08-07 2017-02-28 Caribou Biosciences, Inc. Compositions and methods of engineered CRISPR-Cas9 systems using split-nexus Cas9-associated polynucleotides
AU2016306275A1 (en) 2015-08-07 2018-02-08 Arrowhead Pharmaceuticals, Inc. RNAi therapy for Hepatitis B virus infection
US11667691B2 (en) 2015-08-07 2023-06-06 Novartis Ag Treatment of cancer using chimeric CD3 receptor proteins
AU2016309392A1 (en) * 2015-08-14 2018-02-22 Institute Of Genetics And Developmental Biology, Chinese Academy Of Sciences Method for obtaining glyphosate-resistant rice by site-directed nucleotide substitution
CA3033909A1 (en) 2015-08-14 2017-02-23 The University Of Sydney Connexin 45 inhibition for therapy
US10538758B2 (en) 2015-08-19 2020-01-21 Arc Bio, Llc Capture of nucleic acids using a nucleic acid-guided nuclease-based system
US10898522B2 (en) 2015-08-19 2021-01-26 Children's Research Institute, Children's National Medical Center Compositions and methods for treating graft versus host disease
WO2017035416A2 (en) * 2015-08-25 2017-03-02 Duke University Compositions and methods of improving specificity in genomic engineering using rna-guided endonucleases
US9512446B1 (en) 2015-08-28 2016-12-06 The General Hospital Corporation Engineered CRISPR-Cas9 nucleases
DK3341483T3 (da) 2015-08-28 2020-03-16 Pioneer Hi Bred Int Ochrobactrum-medieret transformation af planter
JP6799586B2 (ja) 2015-08-28 2020-12-16 ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション 遺伝子操作ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ヌクレアーゼ
US9926546B2 (en) 2015-08-28 2018-03-27 The General Hospital Corporation Engineered CRISPR-Cas9 nucleases
WO2017040511A1 (en) 2015-08-31 2017-03-09 Agilent Technologies, Inc. Compounds and methods for crispr/cas-based genome editing by homologous recombination
WO2017040709A1 (en) 2015-08-31 2017-03-09 Caribou Biosciences, Inc. Directed nucleic acid repair
CA3036409C (en) * 2015-09-08 2023-07-11 Erik J. Sontheimer Dnase h activity of neisseria meningitidis cas9
US11773455B2 (en) * 2015-09-09 2023-10-03 Psomagen, Inc. Method and system for microbiome-derived diagnostics and therapeutics infectious disease and other health conditions associated with antibiotic usage
WO2017044885A1 (en) * 2015-09-09 2017-03-16 uBiome, Inc. Method and system for microbiome-derived diagnostics and therapeutics for conditions associated with cerebro-craniofacial health
ES2938623T3 (es) * 2015-09-09 2023-04-13 Univ Kobe Nat Univ Corp Método para convertir una secuencia del genoma de una bacteria gram-positiva mediante una conversión específica de una base de ácido nucleico de una secuencia de ADN seleccionada como diana y el complejo molecular utilizado en el mismo
WO2017044776A1 (en) * 2015-09-10 2017-03-16 Texas Tech University System Single-guide rna (sgrna) with improved knockout efficiency
WO2017044843A1 (en) 2015-09-11 2017-03-16 The General Hospital Corporation Full interrogation of nuclease dsbs and sequencing (find-seq)
WO2017048789A1 (en) 2015-09-14 2017-03-23 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Lipocationic dendrimers and uses thereof
US20180237800A1 (en) * 2015-09-21 2018-08-23 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for target nucleic acid modification
EP3353296B1 (en) 2015-09-24 2020-11-04 Editas Medicine, Inc. Use of exonucleases to improve crispr/cas-mediated genome editing
WO2017053729A1 (en) 2015-09-25 2017-03-30 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Nuclease-mediated genome editing of primary cells and enrichment thereof
EP3356533A1 (en) 2015-09-28 2018-08-08 North Carolina State University Methods and compositions for sequence specific antimicrobials
US20170088828A1 (en) * 2015-09-29 2017-03-30 Agenovir Corporation Compositions and methods for treatment of latent viral infections
JP2018529353A (ja) 2015-09-30 2018-10-11 ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション 配列決定法による切断事象の包括的生体外報告（ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑ）
EP3356520B1 (en) 2015-10-02 2022-03-23 The U.S.A. as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Lentiviral protein delivery system for rna-guided genome editing
CN116555254A (zh) * 2015-10-09 2023-08-08 孟山都技术公司 新颖的rna导向性核酸酶及其用途
EP4144844B1 (en) 2015-10-12 2025-09-10 DuPont US Holding, LLC Protected dna templates for gene modification and increased homologous recombination in cells and methods of use
EP4089175A1 (en) 2015-10-13 2022-11-16 Duke University Genome engineering with type i crispr systems in eukaryotic cells
US9862941B2 (en) 2015-10-14 2018-01-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Single cell microfluidic device
AU2016337525B2 (en) 2015-10-16 2022-01-20 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Compositions and methods for inhibition of lineage specific antigens
FR3042506B1 (fr) * 2015-10-16 2018-11-30 IFP Energies Nouvelles Outil genetique de transformation de bacteries clostridium
BR112018008134A2 (pt) 2015-10-20 2018-11-06 Pioneer Hi Bred Int método para restaurar a função de um produto gênico não funcional no genoma de uma célula, método para editar uma sequência nucleotídica no genoma de uma célula, planta ou planta de progênie, método para editar uma sequência nucleotídica no genoma de uma célula sem o uso de um molde polinucleotídico de modificação e método para entregar um complexo de rna guia/endonuclease cas numa célula
WO2017068077A1 (en) 2015-10-20 2017-04-27 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Methods and products for genetic engineering
EP3365461B1 (en) 2015-10-22 2020-10-14 Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale (INSERM) Endonuclease-barcoding
CN116814590A (zh) 2015-10-22 2023-09-29 布罗德研究所有限公司 Vi-b型crispr酶和系统
IL310721B2 (en) 2015-10-23 2025-11-01 Harvard College Nucleobase editors and uses thereof
WO2017070598A1 (en) 2015-10-23 2017-04-27 Caribou Biosciences, Inc. Engineered crispr class 2 cross-type nucleic-acid targeting nucleic acids
AU2016344609B2 (en) 2015-10-28 2022-05-12 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Materials and methods for treatment of duchenne muscular dystrophy
AU2016349288A1 (en) 2015-11-03 2018-05-31 President And Fellows Of Harvard College Method and apparatus for volumetric imaging of a three-dimensional nucleic acid containing matrix
US12043843B2 (en) 2015-11-04 2024-07-23 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Materials and methods for treatment of hemoglobinopathies
WO2017079026A1 (en) 2015-11-06 2017-05-11 E. I. Du Pont De Nemours And Company Generation of complex trait loci in soybean and methods of use
BR112018008971A2 (pt) 2015-11-06 2018-11-27 Crispr Therapeutics Ag materiais e métodos para tratamento de doença de armazenamento de glicogênio tipo 1a
CN108471731A (zh) 2015-11-06 2018-08-31 杰克逊实验室 大型基因组dna敲入及其用途
EP3374501B1 (en) 2015-11-11 2023-07-12 Lonza Ltd Crispr-associated (cas) proteins with reduced immunogenicity
CA2947904A1 (en) * 2015-11-12 2017-05-12 Pfizer Inc. Tissue-specific genome engineering using crispr-cas9
WO2017083766A1 (en) * 2015-11-13 2017-05-18 Massachusetts Institute Of Technology High-throughput crispr-based library screening
KR102877920B1 (ko) 2015-11-16 2025-10-30 더 리서치 인스티튜트 앳 네이션와이드 칠드런스 하스피탈 티틴-기반 근증 및 다른 티틴성병증의 치료를 위한 물질 및 방법
US10669320B2 (en) 2015-11-18 2020-06-02 The Regents Of The University Of Michigan Mps1 and KNL1 phosphorylation system
JP6923205B2 (ja) 2015-11-27 2021-08-18 国立大学法人神戸大学 標的化したｄｎａ配列の核酸塩基を特異的に変換する、単子葉植物のゲノム配列の変換方法、及びそれに用いる分子複合体
US11903974B2 (en) 2015-11-30 2024-02-20 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Methods and compositions relating to chondrisomes from cultured cells
US12239706B2 (en) 2015-11-30 2025-03-04 Seed Health, Inc. Method and system for protecting monarch butterflies from pesticides
US11529412B2 (en) 2015-11-30 2022-12-20 Seed Health, Inc. Method and system for protecting honey bees from pesticides
US10933128B2 (en) 2015-11-30 2021-03-02 Joseph E. Kovarik Method and system for protecting honey bees from pesticides
US10675347B2 (en) 2015-11-30 2020-06-09 Joseph E. Kovarik Method and system for protecting honey bees from fipronil pesticides
US10086024B2 (en) 2015-11-30 2018-10-02 Joseph E. Kovarik Method and system for protecting honey bees, bats and butterflies from neonicotinoid pesticides
US10568916B2 (en) 2015-11-30 2020-02-25 Joseph E. Kovarik Method and system for protecting honey bees, bats and butterflies from neonicotinoid pesticides
KR102787119B1 (ko) 2015-11-30 2025-03-27 듀크 유니버시티 유전자 편집에 의한 인간 디스트로핀 유전자의 교정을 위한 치료용 표적 및 사용 방법
US10946042B2 (en) 2015-12-01 2021-03-16 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for selective phagocytosis of human cancer cells
CN109715801B (zh) 2015-12-01 2022-11-01 克里斯普治疗股份公司 用于治疗α1抗胰蛋白酶缺乏的材料和方法
CN108473981B (zh) 2015-12-04 2022-04-12 卡里布生物科学公司 工程化靶向核酸的核酸
US11208649B2 (en) 2015-12-07 2021-12-28 Zymergen Inc. HTP genomic engineering platform
BR112018011503A2 (pt) 2015-12-07 2018-12-04 Zymergen Inc promotores da corynebacterium glutamicum
AU2016365720B2 (en) 2015-12-07 2020-11-26 Arc Bio, Llc Methods and compositions for the making and using of guide nucleic acids
US9988624B2 (en) 2015-12-07 2018-06-05 Zymergen Inc. Microbial strain improvement by a HTP genomic engineering platform
DK3387134T3 (da) 2015-12-11 2020-12-21 Danisco Us Inc Fremgangsmåder og sammensætninger til øget nukleasemedieret genommodifikation og reducerede virkninger uden for målstedet
WO2017106767A1 (en) * 2015-12-18 2017-06-22 The Scripps Research Institute Production of unnatural nucleotides using a crispr/cas9 system
EP3390643B8 (en) 2015-12-18 2023-08-02 OncoSec Medical Incorporated Plasmid constructs for heterologous protein expression and methods of use
US20190075770A1 (en) * 2015-12-18 2019-03-14 Japan Science And Technology Agency Genetic modification non-human organism, egg cells, fertilized eggs, and method for modifying target genes
EP3390624A4 (en) 2015-12-18 2019-07-10 The Regents of The University of California Modified site-directed modifying polypeptides and methods of use thereof
WO2017106414A1 (en) * 2015-12-18 2017-06-22 Danisco Us Inc. Methods and compositions for polymerase ii (pol-ii) based guide rna expression
EP3390631B1 (en) 2015-12-18 2020-04-08 Danisco US Inc. Methods and compositions for t-rna based guide rna expression
US11542466B2 (en) 2015-12-22 2023-01-03 North Carolina State University Methods and compositions for delivery of CRISPR based antimicrobials
WO2017112944A1 (en) 2015-12-23 2017-06-29 Fred Hutchinson Cancer Research Center High affinity t cell receptors and uses thereof
KR20180118111A (ko) 2015-12-23 2018-10-30 크리스퍼 테라퓨틱스 아게 근위축성 측색 경화증 및/또는 전두측두엽 퇴행의 치료 물질 및 방법
RU2018127657A (ru) 2015-12-30 2020-01-31 Новартис Аг Виды терапии на основе иммуноэффекторных клеток с улучшенной эффективностью
US11441146B2 (en) 2016-01-11 2022-09-13 Christiana Care Health Services, Inc. Compositions and methods for improving homogeneity of DNA generated using a CRISPR/Cas9 cleavage system
MX2018008345A (es) 2016-01-11 2018-12-06 Univ Leland Stanford Junior Proteínas quiméricas y métodos de inmunoterapia.
IL260532B2 (en) 2016-01-11 2023-12-01 Univ Leland Stanford Junior Chimeric proteins- containing systems and uses thereof in regulating gene expression
US11427837B2 (en) * 2016-01-12 2022-08-30 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for enhanced genome editing
CN109414001A (zh) 2016-01-15 2019-03-01 杰克逊实验室 通过cas9蛋白的多循环电穿孔产生的遗传修饰的非人哺乳动物
WO2017124037A1 (en) 2016-01-15 2017-07-20 The Children's Medical Center Corporation Therapeutic use of mitochondria and combined mitochondrial agents
WO2017132239A1 (en) 2016-01-26 2017-08-03 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Waxy corn
EP3199632A1 (en) 2016-01-26 2017-08-02 ACIB GmbH Temperature-inducible crispr/cas system
CN109072224B (zh) * 2016-01-30 2022-07-15 株式会社博纳克 人工单导rna及其用途
US20190038771A1 (en) 2016-02-02 2019-02-07 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for treatment of severe combined immunodeficiency (scid) or omenn syndrome
WO2017136794A1 (en) 2016-02-03 2017-08-10 Massachusetts Institute Of Technology Structure-guided chemical modification of guide rna and its applications
CN109072248A (zh) 2016-02-09 2018-12-21 希博斯美国有限公司 采用寡核苷酸介导的基因修复提高靶向基因修饰的效率的方法和组合物
EP4155397B1 (en) * 2016-02-10 2024-06-26 The Regents of The University of Michigan Detection of nucleic acids
US10876129B2 (en) 2016-02-12 2020-12-29 Ceres, Inc. Methods and materials for high throughput testing of mutagenized allele combinations
US11339427B2 (en) 2016-02-12 2022-05-24 Jumpcode Genomics, Inc. Method for target specific RNA transcription of DNA sequences
US9896696B2 (en) 2016-02-15 2018-02-20 Benson Hill Biosystems, Inc. Compositions and methods for modifying genomes
JP2019508037A (ja) 2016-02-16 2019-03-28 イェール ユニバーシティーＹａｌｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔ 標的化遺伝子編集を増強するための組成物およびその使用方法
US20200308590A1 (en) 2016-02-16 2020-10-01 Yale University Compositions and methods for treatment of cystic fibrosis
US20190249172A1 (en) 2016-02-18 2019-08-15 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for gene editing in stem cells
EP3416689B1 (en) 2016-02-18 2023-01-18 CRISPR Therapeutics AG Materials and methods for treatment of severe combined immunodeficiency (scid) or omenn syndrome
ES2847252T3 (es) 2016-02-22 2021-08-02 Caribou Biosciences Inc Procedimientos de modulación de resultados de reparación de ADN
CN105646719B (zh) * 2016-02-24 2019-12-20 无锡市妇幼保健院 一种高效定点转基因的工具及其应用
WO2017147278A1 (en) 2016-02-25 2017-08-31 The Children's Medical Center Corporation Customized class switch of immunoglobulin genes in lymphoma and hybridoma by crispr/cas9 technology
EP3420089B1 (en) * 2016-02-26 2021-12-29 LanzaTech NZ, Inc. Crispr/cas systems for c-1 fixing bacteria
WO2017151444A1 (en) 2016-02-29 2017-09-08 Agilent Technologies, Inc. Methods and compositions for blocking off-target nucleic acids from cleavage by crispr proteins
JP2019507610A (ja) 2016-03-04 2019-03-22 インドア バイオテクノロジーズ インコーポレイテッド ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓゲノム編集に基づく、Ｆｅｌ ｄ１ノックアウト並びに関連組成物及び方法
EP3426778A1 (en) 2016-03-11 2019-01-16 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Novel cas9 systems and methods of use
WO2017155715A1 (en) 2016-03-11 2017-09-14 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Novel cas9 systems and methods of use
EP3426780A1 (en) 2016-03-11 2019-01-16 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Novel cas9 systems and methods of use
CN109152848B (zh) * 2016-03-15 2022-12-09 马萨诸塞大学 抗-crispr化合物以及使用方法
CN109414414A (zh) 2016-03-16 2019-03-01 戴维·格拉德斯通研究所 用于治疗肥胖症和/或糖尿病以及用于鉴定候选治疗剂的方法和组合物
EP3429632B1 (en) 2016-03-16 2023-01-04 CRISPR Therapeutics AG Materials and methods for treatment of hereditary haemochromatosis
EP3219799A1 (en) 2016-03-17 2017-09-20 IMBA-Institut für Molekulare Biotechnologie GmbH Conditional crispr sgrna expression
US11597924B2 (en) 2016-03-25 2023-03-07 Editas Medicine, Inc. Genome editing systems comprising repair-modulating enzyme molecules and methods of their use
US11512311B2 (en) 2016-03-25 2022-11-29 Editas Medicine, Inc. Systems and methods for treating alpha 1-antitrypsin (A1AT) deficiency
GB2565461B (en) * 2016-03-31 2022-04-13 Harvard College Methods and compositions for the single tube preparation of sequencing libraries using Cas9
US20190117799A1 (en) 2016-04-01 2019-04-25 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Stimuli-responsive nanoparticles for biomedical applications
US11236313B2 (en) 2016-04-13 2022-02-01 Editas Medicine, Inc. Cas9 fusion molecules, gene editing systems, and methods of use thereof
US20190127713A1 (en) 2016-04-13 2019-05-02 Duke University Crispr/cas9-based repressors for silencing gene targets in vivo and methods of use
AU2017250683A1 (en) * 2016-04-14 2018-11-01 Boco Silicon Valley, Inc. Genome editing of human neural stem cells using nucleases
CN109715808A (zh) 2016-04-15 2019-05-03 诺华股份有限公司 用于选择性蛋白质表达的组合物和方法
EP4628587A3 (en) 2016-04-15 2026-02-25 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Transgenic t cell and chimeric antigen receptor t cell compositions and related methods
WO2017181107A2 (en) * 2016-04-16 2017-10-19 Ohio State Innovation Foundation Modified cpf1 mrna, modified guide rna, and uses thereof
AU2017252023B2 (en) 2016-04-18 2024-05-02 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Materials and methods for treatment of hemoglobinopathies
KR20180134412A (ko) * 2016-04-22 2018-12-18 인텔리아 테라퓨틱스, 인크. 전사 인자 4에서 트라이뉴클레오타이드 반복부와 연관된 질환의 치료를 위한 조성물 및 방법
EP4613756A3 (en) 2016-04-25 2025-11-12 President And Fellows Of Harvard College Hybridization chain reaction methods for in situ molecular detection
JP2019514377A (ja) 2016-04-26 2019-06-06 マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー 拡張可能なリコンビナーゼカスケード
WO2017189870A1 (en) 2016-04-27 2017-11-02 Massachusetts Institute Of Technology Stable nanoscale nucleic acid assemblies and methods thereof
WO2017189914A1 (en) 2016-04-27 2017-11-02 Massachusetts Institute Of Technology Sequence-controlled polymer random access memory storage
WO2017191503A1 (en) 2016-05-05 2017-11-09 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for treatment of hemoglobinopathies
EP3452094B1 (en) 2016-05-06 2021-11-17 The Brigham and Women's Hospital, Inc. Binary self assembled gels for controlled delivery of encapsulated agents to cartilage
CA3022319A1 (en) * 2016-05-06 2017-11-09 Tod M. Woolf Improved methods for genome editing with and without programmable nucleases
WO2017197128A1 (en) 2016-05-11 2017-11-16 Yale University Poly(amine-co-ester) nanoparticles and methods of use thereof
CN109152343A (zh) 2016-05-13 2019-01-04 株式会社钟化 转化植物的制备方法
EP3456825A4 (en) * 2016-05-13 2020-03-18 Kaneka Corporation Plant genome editing method
US11499158B2 (en) 2016-05-13 2022-11-15 Kaneka Corporation Method for modifying plant
CN113831407B (zh) 2016-05-20 2024-06-11 瑞泽恩制药公司 用于使用多个引导rna来破坏免疫耐受性的方法
CA3025523A1 (en) * 2016-05-27 2017-11-30 Aadigen, Llc Peptides and nanoparticles for intracellular delivery of genome-editing molecules
EP3463484B1 (en) 2016-05-27 2026-01-07 The Regents of the University of California Methods and compositions for targeting rna polymerases and non-coding rna biogenesis to specific loci
CA3209273A1 (en) 2016-06-02 2017-12-07 Sigma-Aldrich Co. Llc Using programmable dna binding proteins to enhance targeted genome modification
GB201609811D0 (en) 2016-06-05 2016-07-20 Snipr Technologies Ltd Methods, cells, systems, arrays, RNA and kits
US10767175B2 (en) * 2016-06-08 2020-09-08 Agilent Technologies, Inc. High specificity genome editing using chemically modified guide RNAs
WO2017222834A1 (en) * 2016-06-10 2017-12-28 City Of Hope Compositions and methods for mitochondrial genome editing
MX2018014993A (es) 2016-06-14 2019-09-06 Pioneer Hi Bred Int Uso de endonucleasa cpf1 para modificaciones de genoma de planta.
WO2017217768A1 (ko) * 2016-06-15 2017-12-21 주식회사 툴젠 온타겟 및 오프타겟의 다중 타겟 시스템을 이용하는, 표적 특이적 유전자 가위 스크리닝 방법 및 이의 용도
US10337051B2 (en) 2016-06-16 2019-07-02 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for detecting a target RNA
CN109642231A (zh) * 2016-06-17 2019-04-16 博德研究所 Vi型crispr直向同源物和系统
WO2017222773A1 (en) 2016-06-20 2017-12-28 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Novel cas systems and methods of use
US11293021B1 (en) 2016-06-23 2022-04-05 Inscripta, Inc. Automated cell processing methods, modules, instruments, and systems
AU2017280353B2 (en) 2016-06-24 2021-11-11 Inscripta, Inc. Methods for generating barcoded combinatorial libraries
WO2018005445A1 (en) 2016-06-27 2018-01-04 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods for detecting and treating diabetes
WO2018005589A1 (en) 2016-06-28 2018-01-04 Cellectis Altering expression of gene products in plants through targeted insertion of nucleic acid sequences
US11174469B2 (en) 2016-06-29 2021-11-16 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for treatment of Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) and other related disorders
EP4484443A3 (en) 2016-06-29 2025-03-26 CRISPR Therapeutics AG Materials and methods for treatment of friedreich ataxia and other related disorders
US11427838B2 (en) 2016-06-29 2022-08-30 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Materials and methods for treatment of myotonic dystrophy type 1 (DM1) and other related disorders
US12595478B2 (en) * 2016-06-29 2026-04-07 The Broad Institute, Inc. Crispr-Cas systems having destabilization domain
US10544390B2 (en) 2016-06-30 2020-01-28 Zymergen Inc. Methods for generating a bacterial hemoglobin library and uses thereof
EP3478845A4 (en) 2016-06-30 2019-07-31 Zymergen, Inc. METHOD OF GENERATING A GLUCOSE PERMEASE LIBRARY AND USES THEREOF
JP7305534B2 (ja) 2016-07-06 2023-07-10 バーテックス ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド 疼痛関連障害を処置するための物質及び方法
CN109843914B (zh) 2016-07-06 2024-03-15 沃泰克斯药物股份有限公司 用于治疗疼痛相关病症的材料和方法
WO2018007871A1 (en) 2016-07-08 2018-01-11 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for treatment of transthyretin amyloidosis
EP4321623A3 (en) 2016-07-15 2024-05-15 Salk Institute for Biological Studies Methods and compositions for genome editing in non-dividing cells
SG11201900344YA (en) 2016-07-15 2019-02-27 Novartis Ag Treatment and prevention of cytokine release syndrome using a chimeric antigen receptor in combination with a kinase inhibitor
JP7490211B2 (ja) 2016-07-19 2024-05-27 デューク ユニバーシティ Ｃｐｆ１に基づくゲノム編集の治療適用
WO2018015444A1 (en) 2016-07-22 2018-01-25 Novozymes A/S Crispr-cas9 genome editing with multiple guide rnas in filamentous fungi
WO2018020323A2 (en) 2016-07-25 2018-02-01 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for treatment of fatty acid disorders
CN109790527A (zh) 2016-07-26 2019-05-21 通用医疗公司 普氏菌属和弗朗西斯氏菌属的CRISPR1(Cpf1)的变体
CN106191043B (zh) * 2016-07-26 2019-07-02 吉林大学 一种基因片段、载体pPlasmid-Clearance及应用
EP3491014B1 (en) 2016-07-28 2023-04-05 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Allele-specific primer or probe hybridized to a nucleic acid molecule encoding a gpr156 variant
JP2019523009A (ja) 2016-07-29 2019-08-22 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドＲｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． Ｃ末端切断型フィブリリン−１の発現をもたらす変異を有するマウス
BR112019001887A2 (pt) 2016-08-02 2019-07-09 Editas Medicine Inc composições e métodos para o tratamento de doença associada a cep290
CN110214183A (zh) 2016-08-03 2019-09-06 哈佛大学的校长及成员们 腺苷核碱基编辑器及其用途
US11078481B1 (en) 2016-08-03 2021-08-03 KSQ Therapeutics, Inc. Methods for screening for cancer targets
JOP20190015A1 (ar) 2016-08-04 2019-02-04 Arrowhead Pharmaceuticals Inc عوامل (ار ان ايه آي) لعدوى فيروس الالتهاب الكبدي الوبائي ب
WO2018031683A1 (en) 2016-08-09 2018-02-15 President And Fellows Of Harvard College Programmable cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof
KR101710026B1 (ko) 2016-08-10 2017-02-27 주식회사 무진메디 Cas9 단백질 및 가이드 RNA의 혼성체를 함유하는 나노 리포좀 전달체 조성물
BR112019002779A2 (pt) 2016-08-12 2019-05-14 Toolgen Incorporated elemento imunorregulador manipulado e imunidade alterada por este
WO2018031950A1 (en) 2016-08-12 2018-02-15 Caribou Biosciences, Inc. Protein engineering methods
US11046995B2 (en) * 2016-08-16 2021-06-29 The Regents Of The University Of California Method for finding low abundance sequences by hybridization (FLASH)
AU2017312132A1 (en) * 2016-08-19 2019-03-21 Bluebird Bio, Inc. Genome editing enhancers
CA3034369A1 (en) 2016-08-19 2018-02-22 Whitehead Institute For Biomedical Research Methods of editing dna methylation
JP2019524149A (ja) * 2016-08-20 2019-09-05 アベリノ ラボ ユーエスエー インコーポレイテッドＡｖｅｌｌｉｎｏ Ｌａｂ ＵＳＡ， Ｉｎｃ． 一本鎖ガイドＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム、及びそれらの使用方法
US11542509B2 (en) 2016-08-24 2023-01-03 President And Fellows Of Harvard College Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing
JP7179354B2 (ja) 2016-08-29 2022-11-29 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 皮膚処置のためのイオン種に基づく局所処方物
CN118853848A (zh) 2016-08-31 2024-10-29 哈佛学院董事及会员团体 将生物分子的检测组合到使用荧光原位测序的单个试验的方法
US11078483B1 (en) 2016-09-02 2021-08-03 KSQ Therapeutics, Inc. Methods for measuring and improving CRISPR reagent function
CN106399311A (zh) * 2016-09-07 2017-02-15 同济大学 用于Chip‑seq全基因组结合谱的内源蛋白标记的方法
JP2019533139A (ja) 2016-09-08 2019-11-14 アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル ネフローゼ症候群を診断及び処置するための方法
ES2985812T3 (es) 2016-09-09 2024-11-07 The Board Of Trustees Of The Leland Stanfordjunior Univ Edición genómica de precisión de alto rendimiento
WO2018053035A1 (en) 2016-09-13 2018-03-22 The Jackson Laboratory Targeted dna demethylation and methylation
WO2018057837A1 (en) * 2016-09-23 2018-03-29 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Gene therapy and targeted delivery of conjugated compounds
CN109996868A (zh) 2016-09-23 2019-07-09 弗雷德哈钦森癌症研究中心 特异性用于次要组织相容性(h)抗原ha-1的tcr及其用途
US20190225974A1 (en) 2016-09-23 2019-07-25 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Targeted genome optimization in plants
CN109844126A (zh) 2016-09-28 2019-06-04 诺华股份有限公司 基于多孔膜的大分子递送系统
EP3519570B1 (en) * 2016-09-29 2022-06-08 F. Hoffmann-La Roche AG Method to analyze and optimize gene editing modules and delivery approaches
GB201616590D0 (en) * 2016-09-29 2016-11-16 Oxford Nanopore Technologies Limited Method
BR112019006388A2 (pt) * 2016-09-30 2019-06-25 Univ California enzimas modificadoras de ácido nucleico guiadas por rna e métodos de uso das mesmas
MX2019003674A (es) * 2016-09-30 2021-01-08 Univ California Enzimas modificadoras de ácido nucleico guiadas por arn y métodos de uso de estas.
US10669539B2 (en) 2016-10-06 2020-06-02 Pioneer Biolabs, Llc Methods and compositions for generating CRISPR guide RNA libraries
BR112019006781A2 (pt) 2016-10-07 2019-07-30 Novartis Ag receptores de antígeno quiméricos para o tratamento de câncer
WO2018069232A1 (en) 2016-10-10 2018-04-19 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for predicting the risk of having cardiac hypertrophy
US11090653B2 (en) 2016-10-11 2021-08-17 The Regents Of The University Of California Systems and methods to encapsulate and preserve organic matter for analysis
US12012605B2 (en) 2016-10-13 2024-06-18 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Generating northern leaf blight resistant maize
KR102622411B1 (ko) 2016-10-14 2024-01-10 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 핵염기 에디터의 aav 전달
KR20190067209A (ko) 2016-10-14 2019-06-14 더 제너럴 하스피탈 코포레이션 후성적으로 조절되는 부위-특이적 뉴클레아제
GB201617559D0 (en) 2016-10-17 2016-11-30 University Court Of The University Of Edinburgh The Swine comprising modified cd163 and associated methods
CN110520530A (zh) 2016-10-18 2019-11-29 明尼苏达大学董事会 肿瘤浸润性淋巴细胞和治疗方法
WO2018081138A1 (en) 2016-10-24 2018-05-03 Yale University Biodegradable contraceptive implants
WO2018081531A2 (en) 2016-10-28 2018-05-03 Ariad Pharmaceuticals, Inc. Methods for human t-cell activation
US20180119141A1 (en) 2016-10-28 2018-05-03 Massachusetts Institute Of Technology Crispr/cas global regulator screening platform
EP3535396A1 (en) 2016-11-01 2019-09-11 Novartis AG Methods and compositions for enhancing gene editing
US11732258B2 (en) * 2016-11-02 2023-08-22 President And Fellows Of Harvard College Engineered guide RNA sequences for in situ detection and sequencing
CN109689693B (zh) * 2016-11-03 2022-06-28 深圳华大生命科学研究院 提高基因编辑效率的方法和系统
CN109906030B (zh) 2016-11-04 2022-03-18 安健基因公司 用于产生仅重链抗体的经基因修饰的非人动物和方法
US20190264218A1 (en) 2016-11-04 2019-08-29 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Novel Plant Cells, Plants, and Seeds
EP4553082A3 (en) 2016-11-04 2025-08-20 Children's Hospital Medical Center Liver organoid compositions and methods of making and using same
US20190345500A1 (en) 2016-11-14 2019-11-14 |Nserm (Institut National De La Santé Et De La Recherche Médicale) Methods and pharmaceutical compositions for modulating stem cells proliferation or differentiation
WO2018094356A2 (en) * 2016-11-18 2018-05-24 Genedit Inc. Compositions and methods for target nucleic acid modification
NZ752984A (en) 2016-11-22 2026-03-27 Nat Univ Singapore Blockade of cd7 expression and chimeric antigen receptors for immunotherapy of t-cell malignancies
AU2017364106A1 (en) 2016-11-28 2019-06-20 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Prevention of muscular dystrophy by CRISPR/Cpfl-mediated gene editing
US20200081010A1 (en) 2016-12-02 2020-03-12 Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) Methods and compositions for diagnosing renal cell carcinoma
US9816093B1 (en) 2016-12-06 2017-11-14 Caribou Biosciences, Inc. Engineered nucleic acid-targeting nucleic acids
WO2018107003A1 (en) 2016-12-08 2018-06-14 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Dmd reporter models containing humanized duschene muscular dystrophy mutations
US20200149039A1 (en) 2016-12-12 2020-05-14 Whitehead Institute For Biomedical Research Regulation of transcription through ctcf loop anchors
CN110191955B (zh) 2016-12-13 2024-05-31 西雅图儿童医院（Dba西雅图儿童研究所） 在体外和体内对工程化的细胞中表达的化学物质诱导的信号传导复合物进行外源性药物激活的方法
AU2017378427A1 (en) 2016-12-14 2019-06-20 Ligandal, Inc. Methods and compositions for nucleic acid and protein payload delivery
BR112019012155A2 (pt) * 2016-12-14 2019-11-12 Wageningen Universiteit uso de pelo menos uma molécula-guia de rna e uma proteína cas, método de ligação, clivagem, marcação ou modificação de um polinucleotídeo alvo de fita dupla, célula transformada, e, complexo de nucleoproteína
WO2018112470A1 (en) 2016-12-16 2018-06-21 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Co-delivery of nucleic acids for simultaneous suppression and expression of target genes
EP3555297A1 (en) 2016-12-19 2019-10-23 Editas Medicine, Inc. Assessing nuclease cleavage
CN110213961A (zh) 2016-12-22 2019-09-06 孟山都技术公司 基于基因组编辑的作物工程化和生产矮秆植物
WO2018118585A1 (en) * 2016-12-22 2018-06-28 Agenovir Corporation Antiviral compositions
KR20230125856A (ko) * 2016-12-23 2023-08-29 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 Pcsk9의 유전자 편집
WO2018119359A1 (en) 2016-12-23 2018-06-28 President And Fellows Of Harvard College Editing of ccr5 receptor gene to protect against hiv infection
US11597947B2 (en) 2016-12-29 2023-03-07 Asc Therapeutics Inc. Gene editing method using virus
EP3342868B1 (en) 2016-12-30 2019-12-25 Systasy Bioscience GmbH Constructs and screening methods
US11859219B1 (en) 2016-12-30 2024-01-02 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Methods of altering a target nucleotide sequence with an RNA-guided nuclease and a single guide RNA
EP3565608A4 (en) 2017-01-05 2020-12-16 Rutgers, The State University of New Jersey TARGETED GENE EDITING PLATFORM INDEPENDENT OF BICATENARY DNA BREAKAGE AND ITS USES
JOP20190166A1 (ar) 2017-01-05 2019-07-02 Univ Texas استراتيجية مثلى من أجل تعديلات تخطي إكسون باستخدام crispr/cas9 مع متواليات توجيه ثلاثي
JP7229923B2 (ja) 2017-01-06 2023-02-28 エディタス・メディシン、インコーポレイテッド ヌクレアーゼ切断を評価する方法
EP3346001A1 (en) 2017-01-06 2018-07-11 TXCell Monospecific regulatory t cell population with cytotoxicity for b cells
WO2018127585A1 (en) 2017-01-06 2018-07-12 Txcell Monospecific regulatory t cell population with cytotoxicity for b cells
WO2018127927A1 (en) 2017-01-09 2018-07-12 Aposense Ltd. Compounds and methods for trans-membrane delivery of molecules
DK3565891T3 (da) 2017-01-09 2023-07-24 Whitehead Inst Biomedical Res Fremgangsmåder til ændring af genekspression ved forstyrrelse af transkriptionsfaktor-multimere, der strukturerer regulatoriske sløjfer
ES2928176T3 (es) 2017-01-10 2022-11-16 Christiana Care Gene Editing Inst Llc Métodos para mutagénesis dirigida al sitio in vitro mediante el uso de tecnologías de edición de genes
JP7215716B2 (ja) * 2017-01-13 2023-01-31 学校法人自治医科大学 肝臓ゲノム上の凝固関連因子遺伝子を破壊するためのａａｖベクター
CA3047416A1 (en) 2017-01-20 2018-07-26 The Regents Of The University Of California Targeted gene activation in plants
RU2019126483A (ru) 2017-01-23 2021-02-24 Ридженерон Фармасьютикалз, Инк. Варианты 17-бета-гидроксистероиддегидрогеназы 13 (hsd17b13) и их применение
ES2912408T3 (es) 2017-01-26 2022-05-25 Novartis Ag Composiciones de CD28 y métodos para terapia con receptores quiméricos para antígenos
AU2018213044B2 (en) 2017-01-26 2024-08-01 The Regents Of The University Of California Targeted gene demethylation in plants
WO2018140899A1 (en) 2017-01-28 2018-08-02 Inari Agriculture, Inc. Novel plant cells, plants, and seeds
CN110582509A (zh) 2017-01-31 2019-12-17 诺华股份有限公司 使用具有多特异性的嵌合t细胞受体蛋白治疗癌症
US11345938B2 (en) 2017-02-02 2022-05-31 Cargill, Incorporated Genetically modified cells that produce C6-C10 fatty acid derivatives
EP3577220A2 (en) 2017-02-06 2019-12-11 Zymergen, Inc. Engineered biosynthetic pathways for production of tyramine by fermentation
TW201839136A (zh) 2017-02-06 2018-11-01 瑞士商諾華公司 治療血色素異常症之組合物及方法
US10995333B2 (en) * 2017-02-06 2021-05-04 10X Genomics, Inc. Systems and methods for nucleic acid preparation
JP7227912B2 (ja) 2017-02-08 2023-02-24 ダナ－ファーバー キャンサー インスティテュート，インコーポレイテッド キメラ抗原受容体の調節
WO2018146253A1 (en) 2017-02-10 2018-08-16 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and pharmaceutical compositions for the treatment of cancers associated with activation of the mapk pathway
JP2020507312A (ja) 2017-02-10 2020-03-12 ザイマージェン インコーポレイテッド 複数の宿主用の複数のｄｎａコンストラクトのアセンブリ及び編集のためのモジュラーユニバーサルプラスミド設計戦略
MY193581A (en) 2017-02-21 2022-10-19 Univ Duke Compositions and methods for robust dynamic metabolic control
EP3585900B1 (en) 2017-02-22 2022-12-21 CRISPR Therapeutics AG Materials and methods for treatment of spinocerebellar ataxia type 2 (sca2) and other spinocerebellar ataxia type 2 protein (atxn2) gene related conditions or disorders
WO2018154459A1 (en) 2017-02-22 2018-08-30 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for treatment of primary hyperoxaluria type 1 (ph1) and other alanine-glyoxylate aminotransferase (agxt) gene related conditions or disorders
EP3585898A1 (en) 2017-02-22 2020-01-01 CRISPR Therapeutics AG Materials and methods for treatment of spinocerebellar ataxia type 1 (sca1) and other spinocerebellar ataxia type 1 protein (atxn1) gene related conditions or disorders
EP3585895A1 (en) 2017-02-22 2020-01-01 CRISPR Therapeutics AG Compositions and methods for gene editing
EP3585807A1 (en) 2017-02-22 2020-01-01 CRISPR Therapeutics AG Materials and methods for treatment of early onset parkinson's disease (park1) and other synuclein, alpha (snca) gene related conditions or disorders
RU2019130504A (ru) 2017-02-28 2021-03-30 Вор Байофарма, Инк. Композиции и способы ингибирования линиеспецифических белков
WO2018160731A1 (en) 2017-02-28 2018-09-07 Novartis Ag Shp inhibitor compositions and uses for chimeric antigen receptor therapy
WO2018165309A1 (en) 2017-03-08 2018-09-13 The Regents Of The University Of Michigan Analyte detection
EP3592853A1 (en) 2017-03-09 2020-01-15 President and Fellows of Harvard College Suppression of pain by gene editing
US12390514B2 (en) 2017-03-09 2025-08-19 President And Fellows Of Harvard College Cancer vaccine
US11542496B2 (en) 2017-03-10 2023-01-03 President And Fellows Of Harvard College Cytosine to guanine base editor
WO2018170184A1 (en) 2017-03-14 2018-09-20 Editas Medicine, Inc. Systems and methods for the treatment of hemoglobinopathies
WO2018170015A1 (en) * 2017-03-14 2018-09-20 The Regents Of The University Of California Engineering crispr cas9 immune stealth
US20200087403A1 (en) 2017-03-15 2020-03-19 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Pharmaceutical compositions for the treatment of thrombosis in patients suffering from a myeloproliferative neoplasm
JP7037577B2 (ja) 2017-03-15 2022-03-16 フレッド ハッチンソン キャンサー リサーチ センター 高親和性ｍａｇｅ－ａ１特異的ｔｃｒ及びその使用
KR20240116572A (ko) 2017-03-23 2024-07-29 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 핵산 프로그램가능한 dna 결합 단백질을 포함하는 핵염기 편집제
WO2018172570A1 (en) 2017-03-24 2018-09-27 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Gfi1 inhibitors for the treatment of hyperglycemia
SG11201906297QA (en) * 2017-03-24 2019-10-30 Curevac Ag Nucleic acids encoding crispr-associated proteins and uses thereof
US20210186982A1 (en) 2017-03-24 2021-06-24 Universite Nice Sophia Antipolis Methods and compositions for treating melanoma
US10876101B2 (en) 2017-03-28 2020-12-29 Locanabio, Inc. CRISPR-associated (Cas) protein
EP3600308A1 (en) 2017-03-30 2020-02-05 INSERM - Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Methods for the treatment of mitochondrial genetic diseases
EP3601610A1 (en) 2017-03-30 2020-02-05 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods of identifying and characterizing gene editing variations in nucleic acids
WO2018187493A1 (en) 2017-04-04 2018-10-11 Yale University Compositions and methods for in utero delivery
KR20190139869A (ko) 2017-04-11 2019-12-18 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 하이드록시스테로이드 (17-베타) 탈수소효소(hsd17b) 패밀리의 구성원의 조절인자의 활성도를 스크리닝하기 위한 검정
JP7248586B2 (ja) 2017-04-14 2023-03-29 チルドレンズ ホスピタル メディカル センター 複数ドナー幹細胞組成物およびそれを作製する方法
WO2018195129A1 (en) 2017-04-17 2018-10-25 University Of Maryland, College Park Embryonic cell cultures and methods of using the same
US11834670B2 (en) * 2017-04-19 2023-12-05 Global Life Sciences Solutions Usa Llc Site-specific DNA modification using a donor DNA repair template having tandem repeat sequences
KR102746223B1 (ko) 2017-04-20 2024-12-27 이제네시스, 인크. 유전자 변형 동물의 생성 방법
WO2018195540A1 (en) 2017-04-21 2018-10-25 The General Hospital Corporation Inducible, tunable, and multiplex human gene regulation using crispr-cpf1
US11591589B2 (en) 2017-04-21 2023-02-28 The General Hospital Corporation Variants of Cpf1 (Cas12a) with altered PAM specificity
WO2018193075A1 (en) 2017-04-21 2018-10-25 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and pharmaceutical compositions for the treatment of diseases associated with reduced cftr function
WO2018197520A1 (en) 2017-04-24 2018-11-01 Dupont Nutrition Biosciences Aps Methods and compositions of anti-crispr proteins for use in plants
US11499151B2 (en) 2017-04-28 2022-11-15 Editas Medicine, Inc. Methods and systems for analyzing guide RNA molecules
EP3615055A1 (en) 2017-04-28 2020-03-04 Novartis AG Cells expressing a bcma-targeting chimeric antigen receptor, and combination therapy with a gamma secretase inhibitor
US20200179511A1 (en) 2017-04-28 2020-06-11 Novartis Ag Bcma-targeting agent, and combination therapy with a gamma secretase inhibitor
CN110997705B (zh) 2017-05-05 2026-04-10 巴塞罗那自治大学 纳米结构蛋白及其用途
WO2018204722A1 (en) * 2017-05-05 2018-11-08 Califorinia Institute Of Technology Dna sequence modification-based gene drive
JP7235391B2 (ja) 2017-05-08 2023-03-08 ツールゲン インコーポレイテッド 人工的に操作された免疫細胞
EP3622070A2 (en) 2017-05-10 2020-03-18 Editas Medicine, Inc. Crispr/rna-guided nuclease systems and methods
US11560566B2 (en) 2017-05-12 2023-01-24 President And Fellows Of Harvard College Aptazyme-embedded guide RNAs for use with CRISPR-Cas9 in genome editing and transcriptional activation
MX2019013514A (es) 2017-05-12 2020-01-20 Crispr Therapeutics Ag Materiales y metodos para modificar celulas por ingenieria genetica y usos de los mismos en inmunooncologia.
US11692184B2 (en) 2017-05-16 2023-07-04 The Regents Of The University Of California Thermostable RNA-guided endonucleases and methods of use thereof
JP2020519665A (ja) 2017-05-17 2020-07-02 アンセルム（アンスティテュト ナショナル ド ラ サンテ エ ド ラ ルシェルシュ メディカル） オピオイドによる痛みの処置を改善する為のｆｌｔ３阻害剤
US11439692B2 (en) 2017-05-17 2022-09-13 Modalis Therapeutics Corporation Method of treating diseases associated with MYD88 pathways using CRISPR-GNDM system
CA3064000A1 (en) 2017-05-24 2018-11-29 Effector Therapeutics, Inc. Methods and compositions for cellular immunotherapy
US11788087B2 (en) 2017-05-25 2023-10-17 The Children's Medical Center Corporation BCL11A guide delivery
EP3630849A4 (en) 2017-05-25 2021-01-13 The General Hospital Corporation BIPARTITE BASIC EDITOR (BBE) AND TYPE II-C-CAS9 ZINC FINGER EDITOR ARCHITECTURES
CN108977442B (zh) * 2017-06-05 2023-01-06 广州市锐博生物科技有限公司 用于dna编辑的系统及其应用
US10738284B2 (en) 2017-06-05 2020-08-11 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. B4GALT1 cDNA variants and compositions comprising the same
WO2018226900A2 (en) 2017-06-06 2018-12-13 Zymergen Inc. A htp genomic engineering platform for improving fungal strains
WO2018226880A1 (en) 2017-06-06 2018-12-13 Zymergen Inc. A htp genomic engineering platform for improving escherichia coli
US20210079100A1 (en) 2017-06-08 2021-03-18 Inserm (Institute National De La Sante Et De La Recherche Medicale) Methods and compositions for treating hyperpigmentation disorders
MX2019014640A (es) 2017-06-09 2020-10-05 Editas Medicine Inc Nucleasas de repeticiones palíndromicas agrupadas y regularmente interespaciadas de proteina asociada 9 (cas9) genomanipuladas.
WO2018227210A1 (en) 2017-06-09 2018-12-13 The Regents Of The University Of California High-efficiency encapsulation in droplets based on hydrodynamic vortices control
US11517901B2 (en) 2017-06-09 2022-12-06 The Regents Of The University Of California High-efficiency particle encapsulation in droplets with particle spacing and downstream droplet sorting
EP3638789A4 (en) * 2017-06-12 2021-03-10 California Institute of Technology CONDITIONAL GUIDE RNAS
IL271275B1 (en) 2017-06-13 2026-04-01 Flagship Pioneering Innovations V Inc Preparations containing croons and their uses
WO2018232356A1 (en) 2017-06-15 2018-12-20 The Regents Of The University Of California Targeted non-viral dna insertions
US9982279B1 (en) 2017-06-23 2018-05-29 Inscripta, Inc. Nucleic acid-guided nucleases
EP3916086A1 (en) 2017-06-23 2021-12-01 Inscripta, Inc. Nucleic acid-guided nucleases
US10011849B1 (en) 2017-06-23 2018-07-03 Inscripta, Inc. Nucleic acid-guided nucleases
JP2020525049A (ja) 2017-06-25 2020-08-27 エスエヌアイピーアール・テクノロジーズ・リミテッドＳｎｉｐｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ 微生物集団の変更及び細菌叢の改変
ES2996886T3 (en) 2017-06-27 2025-02-13 Regeneron Pharma Rodents comprising a humanized asgr1 locus
US20200140896A1 (en) 2017-06-30 2020-05-07 Novartis Ag Methods for the treatment of disease with gene editing systems
EP3645021A4 (en) 2017-06-30 2021-04-21 Intima Bioscience, Inc. ADENO-ASSOCIATED VIRAL VECTORS FOR GENE THERAPY
US10392616B2 (en) 2017-06-30 2019-08-27 Arbor Biotechnologies, Inc. CRISPR RNA targeting enzymes and systems and uses thereof
EP3645712A4 (en) 2017-06-30 2021-07-07 Codexis, Inc. T7 RNA POLYMERASE VARIANTS
JP2020530979A (ja) 2017-06-30 2020-11-05 インスクリプタ， インコーポレイテッド 自動細胞処理方法、モジュール、機器及びシステム
KR20250028535A (ko) 2017-06-30 2025-02-28 코덱시스, 인코포레이티드 T7 rna 폴리머라제 변이체
JP7325341B2 (ja) 2017-07-11 2023-08-14 シンソークス，インク． 非天然ヌクレオチドの組み込み及びその方法
EP3427756A1 (en) 2017-07-14 2019-01-16 Universidad Autónoma De Barcelona (UAB) Therapeutic nanoconjugates and uses thereof
US11866726B2 (en) 2017-07-14 2024-01-09 Editas Medicine, Inc. Systems and methods for targeted integration and genome editing and detection thereof using integrated priming sites
WO2019036140A1 (en) 2017-07-17 2019-02-21 Zymergen Inc. METALLO-ORGANIC STRESS MATERIALS
US20190316101A1 (en) 2017-07-18 2019-10-17 Howard Hughes Medical Institute Methods and compositions for genetically manipulating genes and cells
WO2019016310A1 (en) 2017-07-20 2019-01-24 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) METHODS AND COMPOSITIONS FOR TREATING CANCERS
WO2019020593A1 (en) 2017-07-25 2019-01-31 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) METHODS AND PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS FOR MODULATION OF MONOCYTOPOISIS
CN109295054B (zh) * 2017-07-25 2024-02-06 广州普世利华科技有限公司 用于靶向病原体基因RNA的gRNA及基于C2c2的病原体基因的检测方法及试剂盒
CN111801345A (zh) 2017-07-28 2020-10-20 哈佛大学的校长及成员们 使用噬菌体辅助连续进化(pace)的进化碱基编辑器的方法和组合物
CN110891420B (zh) 2017-07-31 2022-06-03 瑞泽恩制药公司 Cas转基因小鼠胚胎干细胞和小鼠及其应用
SG11202000840YA (en) 2017-07-31 2020-02-27 Reflection Biotechnologies Ltd Cellular models of and therapies for ocular diseases
KR20200033259A (ko) 2017-07-31 2020-03-27 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 생체내에서 CRISPR/Cas-매개된 파괴 또는 삭제 및 외인성 도너 핵산과의 CRISPR/Cas-유도된 재조합을 평가하기 위한 방법 및 조성물
EP3585161A1 (en) 2017-07-31 2020-01-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Assessment of crispr/cas-induced recombination with an exogenous donor nucleic acid in vivo
EP3663310A4 (en) 2017-08-04 2021-08-11 Peking University TALE RVD SPECIFICALLY RECOGNIZING A DNA BASE MODIFIED BY METHYLATION AND CORRESPONDING APPLICATION
EP3625356B1 (en) 2017-08-08 2021-05-19 Depixus In vitro isolation and enrichment of nucleic acids using site-specific nucleases
WO2019028686A1 (zh) 2017-08-08 2019-02-14 北京大学 基因敲除方法
EP3665279B1 (en) 2017-08-09 2023-07-19 Benson Hill, Inc. Compositions and methods for modifying genomes
US12398191B2 (en) 2017-08-11 2025-08-26 Fred Hutchinson Cancer Center BRAF-specific TCRs and uses thereof
US20200260698A1 (en) 2017-08-18 2020-08-20 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Exon deletion correction of duchenne muscular dystrophy mutations in the dystrophin actin binding domain 1 using crispr genome editing
US20210054404A1 (en) * 2017-08-22 2021-02-25 Napigen, Inc. Organelle genome modification using polynucleotide guided endonuclease
CA3073448A1 (en) 2017-08-23 2019-02-28 The General Hospital Corporation Engineered crispr-cas9 nucleases with altered pam specificity
US10738327B2 (en) 2017-08-28 2020-08-11 Inscripta, Inc. Electroporation cuvettes for automation
EP3676376B1 (en) 2017-08-30 2025-01-15 President and Fellows of Harvard College High efficiency base editors comprising gam
EP3678680A4 (en) * 2017-09-05 2021-12-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. ADMINISTRATION OF A GENE EDITING SYSTEM CONTAINING A SINGLE RETROVIRAL PARTICLE AND METHODS OF GENERATION AND USE
MX2020002643A (es) 2017-09-06 2020-09-25 Regeneron Pharma Variantes relacionadas con el receptor de inmunoglobulina interleucina 1 simple (sigirr) y usos de estas.
US12350312B2 (en) 2017-09-06 2025-07-08 Fred Hutchinson Cancer Center Methods for improving adoptive cell therapy
CN111051349A (zh) 2017-09-06 2020-04-21 弗雷德哈钦森癌症研究中心 Strep-tag特异性嵌合受体及其用途
CN111278851A (zh) 2017-09-07 2020-06-12 雷杰纳荣制药公司 溶质运载体家族14成员1(slc14a1)变体及其用途
US11649442B2 (en) 2017-09-08 2023-05-16 The Regents Of The University Of California RNA-guided endonuclease fusion polypeptides and methods of use thereof
EP3679143A1 (en) 2017-09-08 2020-07-15 Life Technologies Corporation Methods for improved homologous recombination and compositions thereof
US20190076814A1 (en) * 2017-09-11 2019-03-14 Synthego Corporation Biopolymer synthesis system and method
WO2019051428A1 (en) * 2017-09-11 2019-03-14 The Regents Of The University Of California CAS9 ANTIBODY MEDIA ADMINISTRATION TO MAMMALIAN CELLS
CN110168093B (zh) * 2017-09-12 2023-08-15 中科蓝华(广州)生物医药技术有限公司 一种转染细胞内寄生虫的试剂盒及其应用
WO2019055862A1 (en) 2017-09-14 2019-03-21 Fred Hutchinson Cancer Research Center HIGH AFFINITY T CELL RECEPTORS AND USES THEREOF
EP3686275A4 (en) 2017-09-18 2021-09-29 Edigene Inc. GENE EDITING LYMPHOCYTE T AND RELATED USE
IL272713B2 (en) 2017-09-18 2024-10-01 Futuragene Israel Ltd Tissue-specific expression control of della polypeptides
AU2018336988B2 (en) 2017-09-19 2023-06-22 Advaxis, Inc. Compositions and methods for lyophilization of bacteria or Listeria strains
SG11202002520UA (en) 2017-09-19 2020-04-29 Univ British Columbia Anti-hla-a2 antibodies and methods of using the same
US11453865B2 (en) * 2017-09-19 2022-09-27 Massachusetts Institute Of Technology Applications of engineered Streptococcus canis Cas9 variants on single-base PAM targets
WO2019057649A1 (en) 2017-09-19 2019-03-28 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) METHODS AND PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT OF ACUTE MYELOID LEUKEMIA
WO2019060469A2 (en) * 2017-09-19 2019-03-28 Massachusetts Institute Of Technology CAS9 STREPTOCOCCUS CANIS AS A GENOMIC ENGINEERING PLATFORM WITH NEW PAM SPECIFICITY
CN111655340A (zh) 2017-09-20 2020-09-11 国家医疗保健研究所 用于调节自噬的方法和药物组合物
EP3684822A4 (en) 2017-09-20 2021-06-16 The University of British Columbia NEW ANTI-HLA-A2 ANTIBODIES AND USES THEREOF
IT201700105372A1 (it) * 2017-09-20 2019-03-20 Fondazione St Italiano Tecnologia Molecola di acido nucleico funzionale e relativo uso
CA3073449A1 (en) 2017-09-25 2019-03-28 Agrospheres, Inc. Compositions and methods for scalable production and delivery of biologicals
US11572574B2 (en) * 2017-09-28 2023-02-07 Toolgen Incorporated Artificial genome manipulation for gene expression regulation
WO2019067910A1 (en) * 2017-09-29 2019-04-04 Intellia Therapeutics, Inc. POLYNUCLEOTIDES, COMPOSITIONS AND METHODS FOR GENOMIC EDITION
US20190098879A1 (en) 2017-09-29 2019-04-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-Human Animals Comprising A Humanized TTR Locus And Methods Of Use
US11845951B2 (en) * 2017-09-29 2023-12-19 Toolgen Incorporated Gene manipulation for treatment of retinal dysfunction disorder
JP6985508B2 (ja) 2017-09-30 2021-12-22 インスクリプタ， インコーポレイテッド フロースルーエレクトロポレーション機器編成
BR112020006601A2 (pt) 2017-10-02 2020-12-08 Genedit Inc. Rna guia de cpf1 modificado
US12441841B2 (en) 2017-10-05 2025-10-14 Akron Polymer Systems, Inc. Optically transparent polyimides
EP3691656A1 (en) 2017-10-06 2020-08-12 Camp4 Therapeutics Corporation Methods and compositions for treating urea cycle disorders, in particular otc deficiency
EP3694603B1 (en) 2017-10-10 2026-04-08 Children's Hospital Medical Center Esophageal tissue and/or organoid compositions and methods of making same
WO2019075197A1 (en) 2017-10-11 2019-04-18 The General Hospital Corporation METHODS OF DETECTION OF INDIVIDUAL SITE-SPECIFIC PARASITE GENOMIC DEAMINATION BY BASE EDITING TECHNOLOGIES
AU2018348195B2 (en) 2017-10-11 2025-05-15 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Inhibition of HSD17B13 in the treatment of liver disease in patients expressing the PNPLA3 I148M variation
WO2019075409A1 (en) 2017-10-12 2019-04-18 The Regents Of The University Of California ISOLATION AND IDENTIFICATION WITHOUT MICROFLUIDIC LABEL OF CELLS USING FLUORESCENCE LIFE IMAGING (FLIM)
KR20250107288A (ko) 2017-10-16 2025-07-11 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 아데노신 염기 편집제의 용도
AU2018352234A1 (en) 2017-10-16 2020-04-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Cornulin (CRNN) variants and uses thereof
MA50833A (fr) 2017-10-17 2020-08-26 Bayer Healthcare Llc Compositions et méthodes pour l'édition génique pour l'hémophilie a
US11499127B2 (en) 2017-10-20 2022-11-15 The Regents Of The University Of California Multi-layered microfluidic systems for in vitro large-scale perfused capillary networks
WO2019079787A1 (en) * 2017-10-20 2019-04-25 The Regents Of The University Of California MICROFLUIDIC SYSTEMS AND METHODS FOR CELL TRANSFECTION VIA LIPOFLEX
US20210069241A1 (en) 2017-10-20 2021-03-11 Fred Hutchinson Cancer Research Center Compositions and methods of immunotherapy targeting tigit and/or cd112r or comprising cd226 overexpression
WO2019135816A2 (en) * 2017-10-23 2019-07-11 The Broad Institute, Inc. Novel nucleic acid modifiers
US11690856B2 (en) 2017-10-23 2023-07-04 Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) Compounds for treating CMV related diseases
KR102013798B1 (ko) 2017-10-25 2019-08-23 성균관대학교산학협력단 노화 모델 제조 방법 및 이에 의해 제조된 세포 또는 동물 노화 모델
MA50849A (fr) 2017-10-26 2020-09-02 Vertex Pharma Substances et procédés pour le traitement d'hémoglobinopathies
CN109722414A (zh) 2017-10-27 2019-05-07 博雅辑因（北京）生物科技有限公司 一种高效制备成熟红细胞的方法以及用于制备成熟红细胞的培养基
JP7101419B2 (ja) 2017-10-27 2022-07-15 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 内因性ｔ細胞受容体の標的置換
US20210179709A1 (en) 2017-10-31 2021-06-17 Novartis Ag Anti-car compositions and methods
WO2019089804A1 (en) 2017-11-01 2019-05-09 The Regents Of The University Of California Casy compositions and methods of use
AU2018358051B2 (en) 2017-11-01 2025-01-09 The Regents Of The University Of California CasZ compositions and methods of use
EP3704245A1 (en) 2017-11-01 2020-09-09 Novartis AG Synthetic rnas and methods of use
US11970719B2 (en) 2017-11-01 2024-04-30 The Regents Of The University Of California Class 2 CRISPR/Cas compositions and methods of use
WO2019090175A1 (en) * 2017-11-02 2019-05-09 Arbor Biotechnologies, Inc. Novel crispr-associated transposon systems and components
EP3707155A2 (en) 2017-11-09 2020-09-16 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Crispr/cas systems for treatment of dmd
US10940171B2 (en) 2017-11-10 2021-03-09 Massachusetts Institute Of Technology Microbial production of pure single stranded nucleic acids
JP7097440B2 (ja) 2017-11-10 2022-07-07 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド Ｓｌｃ３０ａ８変異を含む非ヒト動物および使用方法
IL317505A (en) * 2017-11-10 2025-02-01 Univ Massachusetts CRISPR-directed delivery platforms
EP3707252A1 (en) 2017-11-10 2020-09-16 Novozymes A/S Temperature-sensitive cas9 protein
CN120310773A (zh) 2017-11-16 2025-07-15 阿斯利康(瑞典)有限公司 用于改善基于Cas9的敲入策略的有效性的组合物和方法
EP3713644B1 (en) 2017-11-20 2024-08-07 University of Georgia Research Foundation, Inc. Compositions and methods for modulating hif-2a to improve muscle generation and repair
WO2019101995A1 (en) 2017-11-27 2019-05-31 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and pharmaceutical compositions for cardiac regeneration
US20190160120A1 (en) * 2017-11-29 2019-05-30 Snipr Biome Aps Dna, methods etc
JP7361031B2 (ja) 2017-11-30 2023-10-13 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド ヒト化ｔｒｋｂ遺伝子座を含む非ヒト動物
US20220267403A1 (en) 2017-12-01 2022-08-25 Fred Hutchinson Cancer Research Center Binding proteins specific for 5t4 and uses thereof
US20210002609A1 (en) 2017-12-05 2021-01-07 Caribou Biosciences, Inc. Modified lymphocytes
AU2018379996A1 (en) * 2017-12-05 2020-06-25 BioPlx, Inc. Methods and compositions to prevent microbial infection
AU2018378479B2 (en) 2017-12-05 2025-03-13 Vertex Pharmaceuticals Incorporated CRISPR-Cas9 modified CD34+ human hematopoietic stem and progenitor cells and uses thereof
CA3084263A1 (en) 2017-12-07 2019-06-13 Zymergen Inc. Engineered biosynthetic pathways for production of (6e)-8-hydroxygeraniol by fermentation
CA3082956A1 (en) 2017-12-08 2019-06-13 Synthetic Genomics, Inc. Improving algal lipid productivity via genetic modification of a tpr domain containing protein
JP2021506251A (ja) * 2017-12-14 2021-02-22 クリスパー セラピューティクス アーゲー 新規ｒｎａプログラム可能エンドヌクレアーゼ系、ならびにゲノム編集および他の適用におけるその使用
US11661599B1 (en) 2017-12-14 2023-05-30 National Technology & Engineering Solutions Of Sandia, Llc CRISPR-Cas based system for targeting single-stranded sequences
EP3724327A4 (en) 2017-12-14 2022-01-12 EZY Biotech LLC SUBJECT-SPECIFIC TUMOR-INHIBITING CELLS AND THEIR USE
BR112020011011A2 (pt) 2017-12-15 2020-11-17 Danisco Us Inc. variantes de cas9 e métodos de uso
CN111819185A (zh) 2017-12-15 2020-10-23 旗舰创业创新第六有限责任公司 包含环状多核糖核苷酸的组合物及其用途
US12406749B2 (en) 2017-12-15 2025-09-02 The Broad Institute, Inc. Systems and methods for predicting repair outcomes in genetic engineering
AU2018393050A1 (en) 2017-12-21 2020-06-18 Bayer Healthcare Llc Materials and methods for treatment of Usher Syndrome Type 2A
EP3727394A4 (en) 2017-12-21 2021-09-08 Children's Hospital Medical Center DIGITALIZED HUMAN ORGANOIDS AND METHOD OF USING THEREOF
SG11202006101WA (en) * 2017-12-29 2020-07-29 Scripps Research Inst Unnatural base pair compositions and methods of use
JP7295864B2 (ja) 2017-12-29 2023-06-21 シンセティック ジェノミクス インコーポレーテッド 成長を改善するための光合成生物の遺伝子調節方法
WO2019133881A1 (en) 2017-12-29 2019-07-04 Rubius Therapeutics, Inc. Gene editing and targeted transcriptional modulation for enginerering erythroid cells
WO2019130319A1 (en) 2018-01-01 2019-07-04 Aposense Ltd. Compounds and methods for trans-membrane delivery of molecules
EP3735590A1 (en) 2018-01-04 2020-11-11 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for treating melanoma resistant
EP3735462A1 (en) 2018-01-05 2020-11-11 The Board of Regents of The University of Texas System Therapeutic crispr/cas9 compositions and methods of use
CN118830491A (zh) 2018-01-09 2024-10-25 希博斯美国有限公司 防碎基因和突变
WO2019140278A1 (en) 2018-01-11 2019-07-18 Fred Hutchinson Cancer Research Center Immunotherapy targeting core binding factor antigens
CA3088180A1 (en) 2018-01-12 2019-07-18 Crispr Therapeutics Ag Compositions and methods for gene editing by targeting transferrin
US11268092B2 (en) 2018-01-12 2022-03-08 GenEdit, Inc. Structure-engineered guide RNA
AU2019207409B2 (en) 2018-01-12 2023-02-23 Basf Se Gene underlying the number of spikelets per spike qtl in wheat on chromosome 7a
JP7466448B2 (ja) * 2018-01-17 2024-04-12 バーテックス ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド Ｄｎａ－ｐｋ阻害剤
BR112020013626A2 (pt) 2018-01-17 2020-12-01 Vertex Pharmaceuticals Incorporated compostos de quinoxalinona, composições, métodos e kits para aumentar a eficiência de edição de genoma
EP3740580A4 (en) 2018-01-19 2021-10-20 Duke University GENOME ENGINEERING WITH CRISPR-CAS SYSTEMS IN EUKARYONTS
WO2019145413A1 (en) 2018-01-25 2019-08-01 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Antagonists of il-33 for use in methods for preventing ischemia reperfusion injury in an organ
WO2019147275A1 (en) * 2018-01-26 2019-08-01 Integrated Dna Technologies, Inc. Crispr-based compositions and methods of use
WO2019147302A1 (en) * 2018-01-26 2019-08-01 Bauer Daniel E Targeting bcl11a distal regulatory elements with a cas9-cas9 fusion for fetal hemoglobin reinduction
US11926835B1 (en) 2018-01-29 2024-03-12 Inari Agriculture Technology, Inc. Methods for efficient tomato genome editing
US11497752B2 (en) 2018-01-30 2022-11-15 Foghorn Therapeutics Inc. Compounds and uses thereof
AR114350A1 (es) 2018-01-31 2020-08-26 Res Institute At Nationwide Children’S Hospital Terapia genética para la distrofia muscular de cinturas del tipo 2c
AU2019216321A1 (en) 2018-01-31 2020-07-30 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Compositions and methods for correcting dystrophin mutations in human cardiomyocytes
WO2019150309A1 (en) 2018-02-02 2019-08-08 Hammack Scott Modulators of gpr68 and uses thereof for treating and preventing diseases
US11268077B2 (en) 2018-02-05 2022-03-08 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Materials and methods for treatment of hemoglobinopathies
WO2019152941A1 (en) 2018-02-05 2019-08-08 Caribou Biosciences, Inc. Engineered gut microbes for reduction of reactivation of detoxified drugs
US11566236B2 (en) 2018-02-05 2023-01-31 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Materials and methods for treatment of hemoglobinopathies
CN111699254A (zh) 2018-02-08 2020-09-22 齐默尔根公司 使用crispr在棒状杆菌属中进行基因组编辑
KR102465067B1 (ko) 2018-02-15 2022-11-10 시그마-알드리치 컴퍼니., 엘엘씨 진핵 게놈 변형을 위한 조작된 cas9 시스템
MA51869A (fr) 2018-02-16 2020-12-23 Bayer Healthcare Llc Compositions et méthodes pour l'édition génique par ciblage du fibrinogène-alpha
JP7384811B2 (ja) 2018-02-16 2023-11-21 アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル 白斑を処置するための方法及び組成物
US11718849B2 (en) 2018-02-19 2023-08-08 Agilent Technologies, Inc. Phosphopeptide-encoding oligonucleotide libraries and methods for detecting phosphorylation-dependent molecular interactions
WO2019165168A1 (en) 2018-02-23 2019-08-29 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Novel cas9 orthologs
AU2019224051A1 (en) 2018-02-26 2020-09-03 Fred Hutchinson Cancer Center Compositions and methods for cellular immunotherapy
US11713472B2 (en) 2018-03-06 2023-08-01 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Genome editing in Archaea
AU2019231783B2 (en) 2018-03-09 2023-11-16 Advaxis, Inc. Compositions and methods for evaluating attenuation and infectivity of Listeria strains
US11332752B2 (en) * 2018-03-12 2022-05-17 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Use of morphogenic factors for the improvement of gene editing
KR102907245B1 (ko) 2018-03-14 2026-01-05 에디타스 메디신, 인코포레이티드 혈색소병증 치료를 위한 시스템 및 방법
US20190284553A1 (en) 2018-03-15 2019-09-19 KSQ Therapeutics, Inc. Gene-regulating compositions and methods for improved immunotherapy
MA52074A (fr) * 2018-03-19 2021-01-27 Bayer Healthcare Llc Nouveaux systèmes d'endonucléase à arn programmable et leurs utilisations
EP3592140A1 (en) * 2018-03-19 2020-01-15 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Transcription modulation in animals using crispr/cas systems
US20210037798A1 (en) 2018-03-20 2021-02-11 Tsinghua University Alzheimers disease animal model and use thereof
AU2019239971B2 (en) 2018-03-21 2025-09-11 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. 17beta-hydroxysteroid dehydrogenase type 13 (HSD17b13) iRNA compositions and methods of use thereof
US10760075B2 (en) 2018-04-30 2020-09-01 Snipr Biome Aps Treating and preventing microbial infections
KR102287880B1 (ko) * 2018-03-26 2021-08-09 고쿠리츠다이가쿠호진 고베다이가쿠 세포에서 이중 가닥 dna의 표적 부위를 변형시키기 위한 방법
US11447769B2 (en) 2018-03-27 2022-09-20 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Modified immune cells having enhanced function and methods for screening for same
CN112533627A (zh) * 2018-03-27 2021-03-19 G+Flas 生命科学公司 序列特异性体内细胞靶向
GB201805287D0 (en) 2018-03-29 2018-05-16 Univ Edinburgh Haematoietic stem cell treatment
US10443031B1 (en) 2018-03-29 2019-10-15 Inscripta, Inc. Methods for controlling the growth of prokaryotic and eukaryotic cells
UA129286C2 (uk) 2018-04-04 2025-03-12 Сайбас Юес Ллс Гени fad2 і мутації
WO2019193375A1 (en) 2018-04-04 2019-10-10 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Use of fzd7 inhibitors for the treatment of retinal neovascularization
JP7522038B2 (ja) 2018-04-06 2024-07-24 ザ チルドレンズ メディカル センター コーポレーション 体細胞リプログラミングおよびインプリンティングのモジュレートのための組成物および方法
AU2019250692A1 (en) 2018-04-13 2020-11-05 Sangamo Therapeutics France Chimeric antigen receptor specific for Interleukin-23 receptor
WO2019200004A1 (en) 2018-04-13 2019-10-17 Inscripta, Inc. Automated cell processing instruments comprising reagent cartridges
US11898203B2 (en) 2018-04-17 2024-02-13 The General Hospital Corporation Highly sensitive in vitro assays to define substrate preferences and sites of nucleic-acid binding, modifying, and cleaving agents
WO2019204668A1 (en) 2018-04-18 2019-10-24 Casebia Therapeutics Limited Liability Partnership Compositions and methods for knockdown of apo(a) by gene editing for treatment of cardiovascular disease
KR102922694B1 (ko) 2018-04-19 2026-02-03 더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아 유전자 편집을 위한 조성물 및 방법
US10557216B2 (en) 2018-04-24 2020-02-11 Inscripta, Inc. Automated instrumentation for production of T-cell receptor peptide libraries
US10858761B2 (en) 2018-04-24 2020-12-08 Inscripta, Inc. Nucleic acid-guided editing of exogenous polynucleotides in heterologous cells
WO2019209926A1 (en) 2018-04-24 2019-10-31 Inscripta, Inc. Automated instrumentation for production of peptide libraries
WO2019210153A1 (en) 2018-04-27 2019-10-31 Novartis Ag Car t cell therapies with enhanced efficacy
US20210239681A1 (en) 2018-04-27 2021-08-05 Advaxis, Inc. Compositions and methods for evaluating potency of listeria-based immunotherapeutics
WO2019210057A1 (en) 2018-04-27 2019-10-31 Seattle Children's Hospital (dba Seattle Children's Research Institute) Rapamycin resistant cells
WO2019213273A1 (en) 2018-05-01 2019-11-07 The Children's Medical Center Corporation Enhanced bcl11a rnp / crispr delivery & editing using a 3xnls-cas9
WO2019213013A1 (en) 2018-05-02 2019-11-07 The Children's Medical Center Corporation Improved bcl11a micrornas for treating hemoglobinopathies
EP3790974A1 (en) 2018-05-10 2021-03-17 Auxolytic Ltd Gene therapy methods and compositions using auxotrophic regulatable cells
WO2019213910A1 (en) * 2018-05-10 2019-11-14 Syngenta Participations Ag Methods and compositions for targeted editing of polynucleotides
AU2019265019B2 (en) 2018-05-11 2025-11-06 Beam Therapeutics Inc. Methods of substituting pathogenic amino acids using programmable base editor systems
CA3100050A1 (en) 2018-05-11 2019-11-14 Lupagen, Inc. Systems and methods for closed loop, real-time modifications of patient cells
KR20210045360A (ko) 2018-05-16 2021-04-26 신테고 코포레이션 가이드 rna 설계 및 사용을 위한 방법 및 시스템
CN112839671A (zh) 2018-05-17 2021-05-25 明尼苏达大学董事会 抗药性免疫细胞及其使用方法
US11946049B2 (en) 2018-05-22 2024-04-02 The Regents Of The University Of California tRNA/pre-miRNA compositions and use in treating cancer
US12157760B2 (en) 2018-05-23 2024-12-03 The Broad Institute, Inc. Base editors and uses thereof
EP3784776A4 (en) 2018-05-23 2022-01-26 National University of Singapore Blockade of cd2 surface expression and expression of chimeric antigen receptors for immunotherapy of t-cell malignancies
EP3572512A1 (en) 2018-05-24 2019-11-27 B.R.A.I.N. Ag A method for engineering a protein
US11866719B1 (en) 2018-06-04 2024-01-09 Inari Agriculture Technology, Inc. Heterologous integration of regulatory elements to alter gene expression in wheat cells and wheat plants
PL3802807T3 (pl) 2018-06-05 2025-03-31 Life Edit Therapeutics, Inc. Nukleazy kierowane rna i ich aktywne fragmenty oraz warianty i sposoby ich zastosowania
WO2019236893A2 (en) * 2018-06-07 2019-12-12 Allen Institute Stem cell lines containing endogenous, differentially-expressed tagged proteins, methods of production, and use thereof
FR3082208A1 (fr) 2018-06-11 2019-12-13 Fondation Mediterranee Infection Methode de modification d'une sequence cible d'acide nucleique d'une cellule hote
TWI890660B (zh) 2018-06-13 2025-07-21 瑞士商諾華公司 Bcma 嵌合抗原受體及其用途
WO2019246488A1 (en) 2018-06-21 2019-12-26 Duke University Compositions and methods for the production of pyruvic acid and related products using dynamic metabolic control
EP3823633A4 (en) 2018-06-29 2023-05-03 Editas Medicine, Inc. SYNTHETIC LEAD MOLECULES, COMPOSITIONS AND METHODS RELATED THERETO
EP3814369A1 (en) 2018-06-29 2021-05-05 Stichting Het Nederlands Kanker Instituut- Antoni van Leeuwenhoek Ziekenhuis Tweak-receptor agonists for use in combination with immunotherapy of a cancer
KR20210028162A (ko) 2018-06-29 2021-03-11 더 리서치 인스티튜트 앳 네이션와이드 칠드런스 하스피탈 지대근 이영양증 2a형을 치료하기 위한 재조합 아데노 연관 바이러스 생성물 및 방법
CA3108767A1 (en) 2018-06-30 2020-01-02 Inscripta, Inc. Instruments, modules, and methods for improved detection of edited sequences in live cells
WO2020014235A1 (en) 2018-07-09 2020-01-16 The Regents Of The University Of California Gene targets for t-cell-based immunotherapy
US12522807B2 (en) 2018-07-09 2026-01-13 The Broad Institute, Inc. RNA programmable epigenetic RNA modifiers and uses thereof
JP2021530212A (ja) 2018-07-13 2021-11-11 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニアThe Regents Of The University Of California レトロトランスポゾンベースの送達媒体及びその使用方法
CN113039276A (zh) 2018-07-16 2021-06-25 密歇根大学董事会 核酸酶介导的核酸修饰
WO2020018918A1 (en) 2018-07-19 2020-01-23 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Methods for exon skipping and gene knockout using base editors
WO2020018964A1 (en) 2018-07-20 2020-01-23 Fred Hutchinson Cancer Research Center Compositions and methods for controlled expression of antigen-specific receptors
WO2020023655A1 (en) * 2018-07-24 2020-01-30 Flagship Pioneering, Inc. Compositions comprising circular polyribonucleotides and uses thereof
EP4678727A3 (en) 2018-07-26 2026-03-11 Children's Hospital Medical Center Hepato-biliary-pancreatic tissues and methods of making same
MX2021001070A (es) * 2018-07-31 2021-05-27 Intellia Therapeutics Inc Composiciones y métodos para editar el gen hidroxiácido oxidasa 1 (hao1) para tratar la hiperoxaluria primaria tipo 1 (ph1).
EP3830301B1 (en) 2018-08-01 2024-05-22 Mammoth Biosciences, Inc. Programmable nuclease compositions and methods of use thereof
US20210290727A1 (en) * 2018-08-01 2021-09-23 University Of Maryland, Baltimore MODULATION OF mTORCI ACTIVITY AND AUTOPHAGY VIA CIB2-RHEB INTERACTION
US11939593B2 (en) 2018-08-01 2024-03-26 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Compositions and methods for improving embryo development
AU2019317066A1 (en) 2018-08-07 2021-02-18 Modalis Therapeutics Corporation Novel transcription activator
KR20210046006A (ko) 2018-08-10 2021-04-27 상가모 테라퓨틱스 프랑스 Tnfr2 도메인을 포함하는 신규한 car 작제물
US10752874B2 (en) 2018-08-14 2020-08-25 Inscripta, Inc. Instruments, modules, and methods for improved detection of edited sequences in live cells
US10532324B1 (en) 2018-08-14 2020-01-14 Inscripta, Inc. Instruments, modules, and methods for improved detection of edited sequences in live cells
US11142740B2 (en) 2018-08-14 2021-10-12 Inscripta, Inc. Detection of nuclease edited sequences in automated modules and instruments
CA3107002A1 (en) 2018-08-15 2020-04-30 Zymergen Inc. Applications of crispri in high throughput metabolic engineering
US12497611B2 (en) 2018-08-17 2025-12-16 Yale University Compositions and methods for high-throughput activation screening to boost T cell effector function
WO2020055547A2 (en) 2018-08-18 2020-03-19 Seed Health, Inc. Methods and compositions for honey bee health
US12421507B2 (en) * 2018-08-20 2025-09-23 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for optochemical control of CRISPR-CAS9
CN112912387A (zh) 2018-08-22 2021-06-04 弗雷德哈钦森癌症研究中心 靶向kras或her2抗原的免疫疗法
US12275964B2 (en) 2018-08-22 2025-04-15 The Regents Of The University Of California Variant type V CRISPR/Cas effector polypeptides and methods of use thereof
AU2019326408A1 (en) 2018-08-23 2021-03-11 Sangamo Therapeutics, Inc. Engineered target specific base editors
CA3110089A1 (en) 2018-08-28 2020-03-05 Fred Hutchinson Cancer Research Center Methods and compositions for adoptive t cell therapy incorporating induced notch signaling
CA3110837A1 (en) 2018-08-28 2020-03-05 Vor Biopharma Inc. Genetically engineered hematopoietic stem cells and uses thereof
MX2021002418A (es) 2018-08-30 2021-04-28 Univ North Carolina Chapel Hill Genes sinteticos activados por retroalimentacion, casetes de coincidencia de semilla objetivo y sus usos.
WO2020081149A2 (en) 2018-08-30 2020-04-23 Inscripta, Inc. Improved detection of nuclease edited sequences in automated modules and instruments
EP3844287B1 (en) 2018-08-31 2024-05-22 Yale University Compositions and methods for enhancing donor oligonucleotide-based gene editing
US12534743B2 (en) 2018-08-31 2026-01-27 Inari Agriculture Technology, Inc. Compositions, systems, and methods for genome editing
US11479762B1 (en) 2018-08-31 2022-10-25 Inari Agriculture Technology, Inc. Compositions, systems, and methods for genome editing
CA3111186A1 (en) 2018-08-31 2020-03-05 Yale University Compositions and methods for enhancing triplex and nuclease-based gene editing
US12545910B2 (en) 2018-08-31 2026-02-10 Inari Agriculture Technology, Inc. Compositions, systems, and methods for genome editing
WO2020048942A1 (en) 2018-09-04 2020-03-12 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and pharmaceutical compositions for enhancing cytotoxic t lymphocyte-dependent immune responses
WO2020049026A1 (en) 2018-09-05 2020-03-12 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for treating asthma and allergic diseases
WO2020051562A2 (en) 2018-09-07 2020-03-12 Beam Therapeutics Inc. Compositions and methods for improving base editing
CN112654702B (zh) 2018-09-07 2025-05-13 阿斯利康(瑞典)有限公司 改进的核酸酶的组合物和方法
EP3847254A4 (en) 2018-09-07 2022-08-10 Beam Therapeutics Inc. COMPOSITIONS AND METHODS FOR DELIVERING A NUCLEOBASE EDITING SYSTEM
US12378572B2 (en) 2018-09-07 2025-08-05 Crispr Therapeutics Ag Universal donor cells
EP3849545A1 (en) 2018-09-10 2021-07-21 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) Methods for the treatment of neurofibromatosis
CA3112026A1 (en) 2018-09-12 2020-03-19 Children's Hospital Medical Center Organoid compositions for the production of hematopoietic stem cells and derivatives thereof
JP7222075B2 (ja) 2018-09-13 2023-02-14 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド Ｃ３糸球体症のモデルとしての補体因子ｈ遺伝子ノックアウトラット
RU2706298C1 (ru) * 2018-09-14 2019-11-15 Закрытое Акционерное Общество "Биокад" НУКЛЕАЗА PaCas9
US12097239B2 (en) 2018-09-21 2024-09-24 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for treating diabetes, and methods for enriching MRNA coding for secreted proteins
US20240165232A1 (en) 2018-09-24 2024-05-23 Fred Hutchinson Cancer Research Center Chimeric receptor proteins and uses thereof
EP3856772A1 (en) 2018-09-25 2021-08-04 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) Use of antagonists of th17 cytokines for the treatment of bronchial remodeling in patients suffering from allergic asthma
GB201815820D0 (en) 2018-09-28 2018-11-14 Univ Wageningen Off-target activity inhibitors for guided endonucleases
WO2020072254A1 (en) 2018-10-01 2020-04-09 North Carolina State University Recombinant type i crispr-cas system and uses thereof for killing target cells
WO2020072250A1 (en) 2018-10-01 2020-04-09 North Carolina State University Recombinant type i crispr-cas system and uses thereof for genome modification and alteration of expression
WO2020070062A1 (en) 2018-10-01 2020-04-09 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Use of tim-3 inhibitors for the treatment of exacerbations in patients suffering from severe asthma
WO2020072248A1 (en) 2018-10-01 2020-04-09 North Carolina State University Recombinant type i crispr-cas system
US12203123B2 (en) 2018-10-01 2025-01-21 North Carolina State University Recombinant type I CRISPR-Cas system and uses thereof for screening for variant cells
EP3862430A4 (en) 2018-10-04 2022-06-15 Kaneka Corporation DNA CONSTRUCT FOR USE IN PLANT GENO EDITING
JP2022512648A (ja) 2018-10-09 2022-02-07 アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル 心筋線維化の処置のためのαＶ－インテグリン（ＣＤ５１）阻害剤の使用
WO2020076976A1 (en) 2018-10-10 2020-04-16 Readcoor, Inc. Three-dimensional spatial molecular indexing
US11851663B2 (en) 2018-10-14 2023-12-26 Snipr Biome Aps Single-vector type I vectors
JP2022505139A (ja) 2018-10-15 2022-01-14 フォンダッツィオーネ・テレソン ゲノム編集の方法及び構築物
WO2020081173A1 (en) 2018-10-16 2020-04-23 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Genome edited fine mapping and causal gene identification
JP7520826B2 (ja) 2018-10-17 2024-07-23 クリスパー・セラピューティクス・アクチェンゲゼルシャフト 導入遺伝子を送達するための組成物および方法
WO2020081588A1 (en) 2018-10-17 2020-04-23 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Swi/snf family chromatin remodeling complexes and uses thereof
WO2020079162A1 (en) 2018-10-18 2020-04-23 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for inducing full ablation of hematopoiesis
CN113272428A (zh) 2018-10-18 2021-08-17 英特利亚治疗股份有限公司 核酸构建体和使用方法
US20200270617A1 (en) 2018-10-18 2020-08-27 Intellia Therapeutics, Inc. Compositions and methods for transgene expression from an albumin locus
AU2019360270B2 (en) 2018-10-18 2025-08-07 Intellia Therapeutics, Inc. Compositions and methods for expressing factor IX.
WO2020082047A1 (en) 2018-10-18 2020-04-23 Intellia Therapeutics, Inc. Compositions and methods for treating alpha-1 antitrypsin deficiencey
US11214781B2 (en) 2018-10-22 2022-01-04 Inscripta, Inc. Engineered enzyme
WO2020086475A1 (en) 2018-10-22 2020-04-30 Inscripta, Inc. Engineered enzymes
US11946047B2 (en) * 2018-10-23 2024-04-02 Texas Tech University System Treatment strategies against anthrax by interfering with critical host factors
UY38427A (es) 2018-10-26 2020-05-29 Novartis Ag Métodos y composiciones para terapia con células oculares
US11407995B1 (en) 2018-10-26 2022-08-09 Inari Agriculture Technology, Inc. RNA-guided nucleases and DNA binding proteins
WO2020092453A1 (en) 2018-10-29 2020-05-07 The Broad Institute, Inc. Nucleobase editors comprising geocas9 and uses thereof
WO2020092057A1 (en) 2018-10-30 2020-05-07 Yale University Compositions and methods for rapid and modular generation of chimeric antigen receptor t cells
SG11202104409YA (en) 2018-10-31 2021-05-28 Zymergen Inc Multiplexed deterministic assembly of dna libraries
EP3874048A1 (en) 2018-11-01 2021-09-08 Keygene N.V. Dual guide rna for crispr/cas genome editing in plants cells
US11434477B1 (en) 2018-11-02 2022-09-06 Inari Agriculture Technology, Inc. RNA-guided nucleases and DNA binding proteins
US11965172B2 (en) 2018-11-05 2024-04-23 California Institute Of Technology DNA sequence modification-based gene drive
WO2020097445A1 (en) 2018-11-09 2020-05-14 Inari Agriculture, Inc. Rna-guided nucleases and dna binding proteins
CA3119188A1 (en) 2018-11-09 2020-05-14 Fred Hutchinson Cancer Research Center T cell receptors specific for mesothelin and their use in immunotherapy
US12194327B2 (en) 2018-11-14 2025-01-14 University Of Florida Research Foundation, Inc. Materials and methods for modifying Wolbachia and paratransformation of arthropods
WO2020101042A1 (en) 2018-11-16 2020-05-22 Astellas Pharma Inc. Method for treating muscular dystrophy by targeting utrophin gene
RU2712497C1 (ru) * 2018-11-26 2020-01-29 Автономная некоммерческая образовательная организация высшего образования Сколковский институт науки и технологий Средство разрезания ДНК на основе Cas9 белка из биотехнологически значимой бактерии Clostridium cellulolyticum
TWI850282B (zh) 2018-11-27 2024-08-01 香港商弘年發展有限公司 用於治療癌症之質體建構體和使用方法
CN113710799B (zh) 2018-11-28 2024-11-12 克里斯珀医疗股份公司 用于在LNP中使用的编码CAS9的优化mRNA
WO2020109412A1 (en) 2018-11-28 2020-06-04 Keygene N.V. Targeted enrichment by endonuclease protection
JP2022513159A (ja) * 2018-11-29 2022-02-07 フラッグシップ パイオニアリング イノベーションズ ブイ， インコーポレイテッド Ｒｎａを調節する方法
WO2020112195A1 (en) 2018-11-30 2020-06-04 Yale University Compositions, technologies and methods of using plerixafor to enhance gene editing
KR20200071198A (ko) 2018-12-10 2020-06-19 네오이뮨텍, 인코퍼레이티드 Nrf2 발현 조절 기반 T 세포 항암면역치료법
US11166996B2 (en) 2018-12-12 2021-11-09 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Anellovirus compositions and methods of use
JP7553100B2 (ja) * 2018-12-12 2024-09-18 国立大学法人九州大学 ゲノム編集された細胞の製造方法
WO2020123887A2 (en) 2018-12-14 2020-06-18 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Novel crispr-cas systems for genome editing
CN113544266A (zh) * 2018-12-17 2021-10-22 博德研究所 Crispr相关转座酶系统和其使用方法
AU2019400930A1 (en) 2018-12-19 2021-07-01 King's College London Immunotherapeutic methods and compositions
KR102925054B1 (ko) 2018-12-20 2026-02-10 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 뉴클레아제-매개 반복부 팽창
WO2020132647A1 (en) 2018-12-21 2020-06-25 Northwestern University Use of annexins in preventing and treating muscle membrane injury
AU2019417720A1 (en) * 2018-12-24 2021-07-08 Visterra, Inc. Methods for identifying epitopes and paratopes
WO2020136216A1 (en) 2018-12-27 2020-07-02 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods of identifying subjects having or at risk of having a coagulation related disorder
KR20210149686A (ko) 2018-12-27 2021-12-09 라이프에디트 테라퓨틱스, 인크. 유전자 편집에 유용한 폴리펩티드 및 사용 방법
EP3906321A1 (en) * 2018-12-31 2021-11-10 HTG Molecular Diagnostics, Inc. Methods of detecting dna and rna in the same sample
CN113574386A (zh) 2019-01-03 2021-10-29 国家医疗保健研究所 用于增强癌症患者的cd8+t细胞依赖性免疫应答的方法和药物组合物
EP3931313A2 (en) 2019-01-04 2022-01-05 Mammoth Biosciences, Inc. Programmable nuclease improvements and compositions and methods for nucleic acid amplification and detection
TWI852977B (zh) * 2019-01-10 2024-08-21 美商健生生物科技公司 前列腺新抗原及其用途
WO2020148206A1 (en) 2019-01-14 2020-07-23 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and kits for generating and selecting a variant of a binding protein with increased binding affinity and/or specificity
AU2020208190B2 (en) 2019-01-15 2022-07-28 Seminis Vegetable Seeds, Inc. Green bean plants with improved disease resistance
JP2022522265A (ja) 2019-01-16 2022-04-15 アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル エリスロフェロンの変異体及びその使用
CN113597318A (zh) 2019-01-17 2021-11-02 巴塞罗那自治大学(Uab) 治疗性纳米缀合物及其用途
US12351837B2 (en) 2019-01-23 2025-07-08 The Broad Institute, Inc. Supernegatively charged proteins and uses thereof
WO2020154595A1 (en) 2019-01-24 2020-07-30 Massachusetts Institute Of Technology Nucleic acid nanostructure platform for antigen presentation and vaccine formulations formed therefrom
US20220249625A1 (en) * 2019-01-29 2022-08-11 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Compositions comprising an endonuclease and methods for purifying an endonuclease
US12384776B2 (en) 2019-01-29 2025-08-12 Foghorn Therapeutics Inc. Compounds and uses thereof
US12509453B2 (en) 2019-01-29 2025-12-30 Foghorn Therapeutics Inc. BRM/BRG1 inhibitors and uses thereof
AU2020215730A1 (en) 2019-01-31 2021-07-29 Beam Therapeutics Inc. Nucleobase editors having reduced non-target deamination and assays for characterizing nucleobase editors
US12600943B2 (en) 2019-02-01 2026-04-14 The University Of Hong Kong Innervated organoid compositions and methods of making same
EP3921031A1 (en) 2019-02-04 2021-12-15 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) Methods and compositions for modulating blood-brain barrier
US11946040B2 (en) 2019-02-04 2024-04-02 The General Hospital Corporation Adenine DNA base editor variants with reduced off-target RNA editing
WO2020163856A1 (en) 2019-02-10 2020-08-13 The J. David Gladstone Institutes, A Testamentary Trust Established Under The Will Of J. David Gladstone Modified mitochondrion and methods of use thereof
CN120174005A (zh) 2019-02-13 2025-06-20 比姆医疗股份有限公司 具有用于修饰靶标序列中核碱基的腺苷脱氨酶碱基编辑器的经修饰的免疫细胞
SG11202108357PA (en) 2019-02-15 2021-08-30 Crispr Therapeutics Ag Gene editing for hemophilia a with improved factor viii expression
US10947517B2 (en) 2019-02-15 2021-03-16 Sigma-Aldrich Co. Llc CRISPR/Cas fusion proteins and systems
WO2020169472A2 (en) 2019-02-18 2020-08-27 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods of inducing phenotypic changes in macrophages
GB201902277D0 (en) 2019-02-19 2019-04-03 King S College London Therapeutic agents
CN114026116A (zh) 2019-02-20 2022-02-08 弗雷德哈钦森癌症研究中心 Ras新抗原特异性结合蛋白及其用途
WO2020176389A1 (en) 2019-02-25 2020-09-03 Caribou Biosciences, Inc. Plasmids for gene editing
AU2020229340A1 (en) 2019-02-26 2021-09-16 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Adeno-associated virus vector delivery of B-sarcoglycan and the treatment of muscular dystrophy
WO2020176564A1 (en) 2019-02-26 2020-09-03 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Method and composition for treating gastrointestinal inflammatory disorders
US20220049273A1 (en) * 2019-03-01 2022-02-17 Arbor Biotechnologies, Inc. Novel crispr dna targeting enzymes and systems
WO2020178759A1 (en) 2019-03-04 2020-09-10 King Abdullah University Of Science And Technology Compositions and methods of targeted nucleic acid enrichment by loop adapter protection and exonuclease digestion
MX2021010559A (es) * 2019-03-07 2021-12-15 Univ California Polipéptidos efectores de crispr-cas y métodos de uso de estos.
US11053515B2 (en) 2019-03-08 2021-07-06 Zymergen Inc. Pooled genome editing in microbes
CN113728106A (zh) 2019-03-08 2021-11-30 齐默尔根公司 微生物中的迭代基因组编辑
CN113825834A (zh) 2019-03-11 2021-12-21 索伦托药业有限公司 使用rna引导的核酸内切酶进行dna构建体整合的改进工艺
WO2020185796A1 (en) 2019-03-11 2020-09-17 Fred Hutchinson Cancer Research Center High avidity wt1 t cell receptors and uses thereof
SG11202109741VA (en) * 2019-03-12 2021-10-28 Crispr Therapeutics Ag Novel high fidelity rna-programmable endonuclease systems and uses thereof
EP3769090B1 (en) 2019-03-18 2023-11-15 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Crispr/cas dropout screening platform to reveal genetic vulnerabilities associated with tau aggregation
CN120648640A (zh) 2019-03-18 2025-09-16 瑞泽恩制药公司 用于鉴定tau接种或聚集的基因修饰因子的CRISPR/Cas筛选平台
WO2020191233A1 (en) 2019-03-19 2020-09-24 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for editing nucleotide sequences
WO2020198403A2 (en) 2019-03-25 2020-10-01 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Compositions comprising modified circular polyribonucleotides and uses thereof
US11001831B2 (en) 2019-03-25 2021-05-11 Inscripta, Inc. Simultaneous multiplex genome editing in yeast
AU2020247900A1 (en) 2019-03-25 2021-11-04 Inscripta, Inc. Simultaneous multiplex genome editing in yeast
EP3947425A1 (en) 2019-03-27 2022-02-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Plant explant transformation
WO2020193740A1 (en) 2019-03-28 2020-10-01 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) New strategy for treating pancreatic cancer
WO2020201073A1 (en) 2019-03-29 2020-10-08 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for the treatment of keloid, hypertrophic scars and/or hyperpigmentation disorders
EP3947737A2 (en) 2019-04-02 2022-02-09 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods of predicting and preventing cancer in patients having premalignant lesions
AU2020256225B9 (en) 2019-04-03 2025-04-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for insertion of antibody coding sequences into a safe harbor locus
KR102661779B1 (ko) 2019-04-04 2024-04-30 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 인간화 응고 인자 12 좌위를 포함하는 비-인간 동물
RU2771374C1 (ru) 2019-04-04 2022-05-04 Редженерон Фармасьютикалс, Инк. Способы для бесшовного внесения целевых модификаций в направленные векторы
CN113646429B (zh) 2019-04-05 2025-07-11 国立大学法人大阪大学 敲入细胞的制作方法
KR102931179B1 (ko) 2019-04-05 2026-02-25 다니스코 유에스 인크. 선형 재조합 dna 작제물 및 이의 조성물을 이용하여 공여 dna 서열을 바실러스 게놈 내에 통합시키기 위한 방법
EP3947656A1 (en) 2019-04-05 2022-02-09 Danisco US Inc. Methods for polynucleotide integration into the genome of bacillus using dual circular recombinant dna constructs and compositions thereof
WO2020208082A1 (en) 2019-04-09 2020-10-15 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Method for treating cmv related diseases
JP7641233B2 (ja) 2019-04-12 2025-03-06 アストラゼネカ・アクチエボラーグ 改善された遺伝子編集のための組成物及び方法
GB201905360D0 (en) 2019-04-16 2019-05-29 Univ Nottingham Fungal strains, production and uses thereof
US12473543B2 (en) 2019-04-17 2025-11-18 The Broad Institute, Inc. Adenine base editors with reduced off-target effects
EP3959320A1 (en) 2019-04-24 2022-03-02 Novartis AG Compositions and methods for selective protein degradation
EP3963109A1 (en) 2019-04-30 2022-03-09 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for treating melanoma
AU2020265060A1 (en) 2019-04-30 2021-12-16 Edigene (Guangzhou) Inc. Method for predicting effectiveness of treatment of hemoglobinopathy
BR112021021912A2 (pt) * 2019-04-30 2022-01-18 Emendobio Inc Nova nuclease omni-50 crispr
US11692197B2 (en) 2019-05-06 2023-07-04 Inari Agriculture Technology, Inc. Delivery of biological molecules to plant cells
US20210047649A1 (en) 2019-05-08 2021-02-18 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Crispr/cas all-in-two vector systems for treatment of dmd
EP3966334A1 (en) 2019-05-10 2022-03-16 Basf Se Regulatory nucleic acid molecules for enhancing gene expression in plants
JP2022533713A (ja) 2019-05-21 2022-07-25 サンガモ セラピューティクス， インコーポレイテッド 調節性ｔ細胞における制御された導入遺伝子発現
AU2020280103A1 (en) 2019-05-23 2021-12-23 Vor Biopharma Inc. Compositions and methods for CD33 modification
WO2020239623A1 (en) 2019-05-24 2020-12-03 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Use of ngal inhibitors for the treating chronic wound
BR112021021149A2 (pt) 2019-05-29 2021-12-14 Monsanto Technology Llc Métodos e composições para a geração de alelos dominantes utilizando a edição de genomas
US12497597B2 (en) 2019-05-31 2025-12-16 Children's Hospital Medical Center Methods of generating and expanding hematopoietic stem cells
AU2020283048A1 (en) 2019-05-31 2021-12-23 Children's Hospital Medical Center Shaped organoid compositions and methods of making same
US11891618B2 (en) 2019-06-04 2024-02-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mouse comprising a humanized TTR locus with a beta-slip mutation and methods of use
WO2020245208A1 (en) 2019-06-04 2020-12-10 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Use of cd9 as a biomarker and as a biotarget in glomerulonephritis or glomerulosclerosis
EP3980012A1 (en) 2019-06-04 2022-04-13 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) A neuropilin antagonist in combination with a p38alpha-kinase inhibitor for the treatment of cancer
AU2020288623A1 (en) 2019-06-06 2022-01-06 Inscripta, Inc. Curing for recursive nucleic acid-guided cell editing
MX2021015122A (es) 2019-06-07 2022-04-06 Regeneron Pharma Animales no humanos que comprenden un locus de albumina humanizado.
EP3980533A1 (en) 2019-06-07 2022-04-13 Scribe Therapeutics Inc. Engineered casx systems
CN113906134B (zh) 2019-06-14 2025-06-24 瑞泽恩制药公司 Tau蛋白病模型
WO2020249769A1 (en) 2019-06-14 2020-12-17 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for treating ocular diseases related to mitochondrial dna maintenance
US10907125B2 (en) 2019-06-20 2021-02-02 Inscripta, Inc. Flow through electroporation modules and instrumentation
WO2020257395A1 (en) 2019-06-21 2020-12-24 Inscripta, Inc. Genome-wide rationally-designed mutations leading to enhanced lysine production in e. coli
IL267614A (en) 2019-06-24 2019-09-26 Lotem Michal Nucleic acids to modulate SLAMF6 isoforms
CN114630910A (zh) 2019-06-25 2022-06-14 伊纳瑞农业技术有限公司 改善的同源依赖修复基因组编辑
US10927385B2 (en) 2019-06-25 2021-02-23 Inscripta, Inc. Increased nucleic-acid guided cell editing in yeast
US11905532B2 (en) 2019-06-25 2024-02-20 Massachusetts Institute Of Technology Compositions and methods for molecular memory storage and retrieval
EP3990475A1 (en) 2019-06-27 2022-05-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Modeling tdp-43 proteinopathy
WO2021001427A1 (en) 2019-07-02 2021-01-07 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for the prophylactic treatment of cancer in patients suffering from pancreatitis
WO2021001431A1 (en) 2019-07-02 2021-01-07 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Use of pi3ka-selective inhibitors for treating metastatic disease in patients suffering from pancreatic cancer
GB201909597D0 (en) 2019-07-03 2019-08-14 Univ Wageningen Crispr type v-u1 system from mycobacterium mucogenicum and uses thereof
AU2020313004A1 (en) 2019-07-12 2022-03-10 Riken Therapeutic agent for disease caused by dominant mutant gene
US10653731B1 (en) 2019-07-15 2020-05-19 Vigene Biosciences Inc. Recombinantly-modified adeno-associated virus (rAAV) having improved packaging efficiency
WO2021009692A1 (en) 2019-07-15 2021-01-21 Medimmune Limited Tripartite systems for protein dimerization and methods of use
US10557149B1 (en) 2019-07-15 2020-02-11 Vigene Biosciences, Inc. Recombinantly-modified adeno-associated virus helper vectors and their use to improve the packaging efficiency of recombinantly-modified adeno-associated virus
US10801042B1 (en) 2019-07-15 2020-10-13 Vigene Biosciences, Inc. Use of ion concentrations to increase the packaging efficiency of recombinant adeno-associated virus
WO2021009299A1 (en) 2019-07-17 2021-01-21 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Bcl-xl:fkbp12 fusion proteins suitable for screening agents capable of slowing down the aging process
EP3999103A4 (en) 2019-07-19 2023-11-22 Inari Agriculture Technology, Inc. GENOMIC EDITING FOR ENHANCED HOMOLOGY-DIRECTED REPAIR
EP4003325A1 (en) 2019-07-24 2022-06-01 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Inhibitors of the sting pathway for the treatment of hidradenitis suppurativa
US20220275105A1 (en) 2019-08-02 2022-09-01 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Neutralizing granzyme b for providing cardioprotection in a subject who experienced a myocardial infarction
US12179199B2 (en) 2019-08-09 2024-12-31 The Regents Of The University Of California Microfluidic single-cell pairing array for studying cell-cell interactions in isolated compartments
WO2021028359A1 (en) 2019-08-09 2021-02-18 Sangamo Therapeutics France Controlled expression of chimeric antigen receptors in t cells
WO2021030344A1 (en) * 2019-08-12 2021-02-18 Lifeedit, Inc. Rna-guided nucleases and active fragments and variants thereof and methods of use
US12612657B2 (en) 2019-08-16 2026-04-28 The Jackson Laboratory Extrachromosomal DNA labeling
JP7737978B2 (ja) 2019-08-20 2025-09-11 フレッド ハッチンソン キャンサー センター Ｗｔ－１に特異的なｔ細胞免疫療法
RS65421B1 (sr) 2019-08-21 2024-05-31 Res Inst Nationwide Childrens Hospital Isporuka adeno-asociranog virusnog vektora alfa-sarkoglikana i lečenje mišićne distrofije
US20220288176A1 (en) * 2019-08-28 2022-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Circular rna modification and methods of use
AU2020338011A1 (en) 2019-08-28 2022-03-10 Vor Biopharma Inc. Compositions and methods for CLL1 modification
WO2021041977A1 (en) 2019-08-28 2021-03-04 Vor Biopharma, Inc. Compositions and methods for cd123 modification
WO2021042060A1 (en) 2019-08-30 2021-03-04 Yale University Compositions and methods for delivery of nucleic acids to cells
WO2021046155A1 (en) 2019-09-03 2021-03-11 Voyager Therapeutics, Inc. Vectorized editing of nucleic acids to correct overt mutations
JP2022547105A (ja) 2019-09-04 2022-11-10 博雅▲輯▼因（北京）生物科技有限公司 オフターゲット評価に基づく遺伝子編集治療の評価方法
PH12022550542A1 (en) 2019-09-05 2023-03-20 Crispr Therapeutics Ag Universal donor cells
CA3150235A1 (en) 2019-09-05 2021-03-11 Alireza Rezania Universal donor cells
EP4025712A1 (en) 2019-09-05 2022-07-13 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) Method of treatment and pronostic of acute myeloid leukemia
MX2022002642A (es) 2019-09-05 2022-06-14 Benson Hill Inc Composiciones y metodos para modificar genomas.
MX2022002919A (es) * 2019-09-10 2022-09-09 Science Solutions Llc Nuevas endonucleasas guiadas por rna crispr-cas tipo ii y tipo v de clase 2.
WO2021047775A1 (en) 2019-09-12 2021-03-18 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Use of inhibitors of tgfb/activinb signaling pathway for the treatment of patients suffering from medulloblastoma group 3
CN114729382A (zh) 2019-09-12 2022-07-08 巴斯夫欧洲公司 增强植物中基因表达的调节性核酸分子
EP4028063A1 (en) 2019-09-13 2022-07-20 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Transcription modulation in animals using crispr/cas systems delivered by lipid nanoparticles
EP4048807A1 (en) 2019-09-23 2022-08-31 Omega Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating apolipoprotein b (apob) gene expression
CN114729376A (zh) 2019-09-23 2022-07-08 欧米茄治疗公司 用于调节肝细胞核因子4α(HNF4α)基因表达的组合物和方法
SG10202008262UA (en) 2019-09-26 2021-04-29 Seminis Vegetable Seeds Inc Lettuce plants having resistance to nasonovia ribisnigri biotype nr:1
EP4034138A4 (en) 2019-09-27 2024-07-31 Beam Therapeutics, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS FOR THE TREATMENT OF LIQUID CANCERS
US20210095273A1 (en) * 2019-09-30 2021-04-01 Sigma-Aldrich Co. Llc Modulation of microbiota compositions using targeted nucleases
WO2021063968A1 (en) 2019-09-30 2021-04-08 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Method and composition for diagnosing chronic obstructive pulmonary disease
WO2021064180A1 (en) 2019-10-03 2021-04-08 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for modulating macrophages polarization
JP7689949B2 (ja) 2019-10-03 2025-06-09 アーティサン ディベロップメント ラブズ インコーポレイテッド 操作されたデュアルガイド核酸を有するｃｒｉｓｐｒシステム
WO2021069387A1 (en) 2019-10-07 2021-04-15 Basf Se Regulatory nucleic acid molecules for enhancing gene expression in plants
US12435330B2 (en) 2019-10-10 2025-10-07 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for prime editing RNA
JP7640461B2 (ja) 2019-10-11 2025-03-05 住友化学株式会社 核酸オリゴマーの製造方法
JP7680440B2 (ja) * 2019-10-15 2025-05-20 エージェンシー フォー サイエンス， テクノロジー アンド リサーチ 核酸修飾酵素活性を測定するためのアッセイ法
EP3808766A1 (en) 2019-10-15 2021-04-21 Sangamo Therapeutics France Chimeric antigen receptor specific for interleukin-23 receptor
WO2021078359A1 (en) 2019-10-21 2021-04-29 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Use of inhibitors of cubilin for the treatment of chronic kidney diseases
WO2021081264A1 (en) 2019-10-24 2021-04-29 Pairwise Plants Services, Inc. Optimized crispr-cas nucleases and base editors and methods of use thereof
EP4051286A1 (en) 2019-10-29 2022-09-07 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) Methods and compositions for treating uveal melanoma
US12521451B2 (en) 2019-11-08 2026-01-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. CRISPR and AAV strategies for x-linked juvenile retinoschisis therapy
CN114929862A (zh) * 2019-11-13 2022-08-19 克里斯珀医疗股份公司 用于制备表达嵌合抗原受体的t细胞的生产方法
KR20220097985A (ko) * 2019-11-13 2022-07-08 크리스퍼 테라퓨틱스 아게 Car-t 세포의 제조 방법
US12612649B2 (en) 2019-11-19 2026-04-28 Danisco Us Inc. Selection marker free methods for modifying the genome of bacillus and compositions thereof
US11203762B2 (en) 2019-11-19 2021-12-21 Inscripta, Inc. Methods for increasing observed editing in bacteria
WO2021102139A1 (en) 2019-11-20 2021-05-27 Corbion Biotech, Inc. Sucrose invertase variants
CN110938659B (zh) * 2019-11-22 2022-05-10 广东省微生物研究所（广东省微生物分析检测中心） 一种提高纤维堆囊菌埃博霉素产量的dCas9载体及其构建方法
WO2021099600A1 (en) 2019-11-22 2021-05-27 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Inhibitors of adrenomedullin for the treatment of acute myeloid leukemia by eradicating leukemic stem cells
WO2021108363A1 (en) 2019-11-25 2021-06-03 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Crispr/cas-mediated upregulation of humanized ttr allele
EP4065157A1 (en) 2019-11-26 2022-10-05 Novartis AG Cd19 and cd22 chimeric antigen receptors and uses thereof
KR20220121816A (ko) 2019-11-27 2022-09-01 프로메가 코포레이션 다분할 루시퍼라제 펩타이드 및 폴리펩타이드
EP4065701A4 (en) 2019-11-27 2023-11-29 Danmarks Tekniske Universitet CONSTRUCTS, COMPOSITIONS AND METHODS THEREOF WITH IMPROVED GENOMEDITING EFFICIENCY AND SPECIFICITY
WO2021105368A1 (en) 2019-11-27 2021-06-03 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Use of neuropilin antagonists for the treatment of endometriosis
CN114945273B (zh) 2019-11-29 2025-08-12 巴斯夫欧洲公司 增加植物对抗真菌感染的抗性
US20230055682A1 (en) 2019-12-03 2023-02-23 Beam Therapeutics lnc. Synthetic guide rna, compositions, methods, and uses thereof
CA3159805A1 (en) 2019-12-03 2021-06-10 Frank Meulewaeter Regulatory nucleic acid molecules for enhancing gene expression in plants
CA3157131A1 (en) 2019-12-10 2021-06-17 Inscripta, Inc. Novel mad nucleases
US10704033B1 (en) 2019-12-13 2020-07-07 Inscripta, Inc. Nucleic acid-guided nucleases
GB201918586D0 (en) 2019-12-17 2020-01-29 Patterson James Engineered platelets for targeted delivery of a therapeutic agent
AU2020407048A1 (en) 2019-12-18 2022-06-09 Inscripta, Inc. Cascade/dCas3 complementation assays for in vivo detection of nucleic acid-guided nuclease edited cells
EP4058032A4 (en) 2019-12-19 2024-01-10 Entrada Therapeutics, Inc. Compositions for delivery of antisense compounds
EP4077699A1 (en) 2019-12-19 2022-10-26 Basf Se Increasing space-time-yield, carbon-conversion-efficiency and carbon substrate flexibility in the production of fine chemicals
US20230041211A1 (en) 2019-12-20 2023-02-09 Basf Se Decreasing toxicity of terpenes and increasing the production potential in micro-organisms
IL271656A (en) 2019-12-22 2021-06-30 Yeda Res & Dev System and methods for identifying cells that have undergone genome editing
EP3842452A1 (en) 2019-12-26 2021-06-30 Universitat Autònoma de Barcelona Scaffold proteins and therapeutic nanoconjugates based on nidogen
EP4086341A1 (en) 2019-12-30 2022-11-09 Edigene Biotechnology Inc. Method for purifying ucart cell and use thereof
CN114901813A (zh) 2019-12-30 2022-08-12 博雅缉因（北京）生物科技有限公司 一种靶向t细胞淋巴瘤细胞的通用型car-t及其制备方法和应用
US11859172B2 (en) 2020-01-02 2024-01-02 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Programmable and portable CRISPR-Cas transcriptional activation in bacteria
CN110982820A (zh) * 2020-01-03 2020-04-10 云南中烟工业有限责任公司 一种烟草单倍体的基因编辑方法
US10689669B1 (en) 2020-01-11 2020-06-23 Inscripta, Inc. Automated multi-module cell processing methods, instruments, and systems
US20230076415A1 (en) 2020-01-17 2023-03-09 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for treating melanoma
EP4093187A1 (en) 2020-01-21 2022-11-30 Limagrain Europe Wheat haploid inducer plant and uses
WO2021151085A2 (en) 2020-01-24 2021-07-29 The General Hospital Corporation Crispr-cas enzymes with enhanced on-target activity
WO2021151073A2 (en) * 2020-01-24 2021-07-29 The General Hospital Corporation Unconstrained genome targeting with near-pamless engineered crispr-cas9 variants
US11225674B2 (en) 2020-01-27 2022-01-18 Inscripta, Inc. Electroporation modules and instrumentation
WO2021154791A1 (en) 2020-01-28 2021-08-05 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a humanized pnpla3 locus and methods of use
AU2021213811A1 (en) 2020-01-29 2022-07-28 Foghorn Therapeutics Inc. Compounds and uses thereof
EP4097251A1 (en) 2020-01-29 2022-12-07 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for analyte detection
JP7667788B2 (ja) 2020-01-29 2025-04-23 住友化学株式会社 核酸オリゴマーの製造方法
WO2021152402A1 (en) * 2020-01-29 2021-08-05 Jenthera Therapeutics Inc. Nuclease-scaffold composition delivery platform
EP4098655A4 (en) 2020-01-29 2024-02-28 Sumitomo Chemical Company, Limited METHOD FOR PRODUCING NUCLEIC ACID OLIGOMERS
EP4099821A1 (en) 2020-02-07 2022-12-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. <smallcaps/>? ? ?klkb1? ? ? ? ?non-human animals comprising a humanizedlocus and methods of use
WO2021165508A1 (en) 2020-02-21 2021-08-26 Biogemma Prime editing technology for plant genome engineering
CA3168986A1 (en) 2020-02-26 2021-09-02 Sorrento Therapeutics, Inc. Activatable antigen binding proteins with universal masking moieties
KR20230004456A (ko) 2020-03-04 2023-01-06 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. 면역 요법에 대한 종양 세포의 감작화를 위한 방법 및 조성물
EP4114952A4 (en) * 2020-03-05 2024-05-08 Board of Regents of the University of Nebraska Crispr/cas9 system for multistrain hiv-1 treatment
CA3173528A1 (en) 2020-03-11 2021-09-16 Omega Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating forkhead box p3 (foxp3) gene expression
US20230058352A1 (en) * 2020-03-11 2023-02-23 Sigma-Aldrich Co. Llc High Fidelity SpCas9 Nucleases for Genome Modification
KR20210116324A (ko) 2020-03-12 2021-09-27 기초과학연구원 게놈 서열 변이를 가지는 세포 사멸 유도용 조성물 및 상기 조성물을 이용한 세포 사멸 유도 방법
JP2023518395A (ja) 2020-03-19 2023-05-01 インテリア セラピューティクス，インコーポレイテッド 指向性ゲノム編集のための方法及び組成物
WO2021186056A1 (en) 2020-03-20 2021-09-23 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Chimeric antigen receptor specific for human cd45rc and uses thereof
US20230102342A1 (en) 2020-03-23 2023-03-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a humanized ttr locus comprising a v30m mutation and methods of use
EP4129050A4 (en) 2020-03-26 2024-05-08 National Agriculture And Food Research Organization METHOD FOR PRODUCING A TEMPERATURE SENSITIVE MALE STERILE PLANT
EP4130018A4 (en) 2020-03-27 2024-04-17 Sumitomo Chemical Company, Limited METHOD FOR PRODUCING A NUCLEIC ACID OLIGOMER
US12057197B2 (en) 2020-04-03 2024-08-06 Creyon Bio, Inc. Oligonucleotide-based machine learning
EP4133069A2 (en) 2020-04-08 2023-02-15 Astrazeneca AB Compositions and methods for improved site-specific modification
EP4132954A1 (en) 2020-04-08 2023-02-15 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) Use of cdon inhibitors for the treatment of endothelial dysfunction
EP4139345A1 (en) 2020-04-24 2023-03-01 Sorrento Therapeutics, Inc. Memory dimeric antigen receptors
US20210332388A1 (en) 2020-04-24 2021-10-28 Inscripta, Inc. Compositions, methods, modules and instruments for automated nucleic acid-guided nuclease editing in mammalian cells
TW202208626A (zh) * 2020-04-24 2022-03-01 美商生命編輯公司 Rna引導核酸酶及其活性片段與變體，以及使用方法
JP2023522784A (ja) 2020-04-27 2023-05-31 ノバルティス アーゲー 眼細胞療法のための方法及び組成物
WO2021222328A1 (en) * 2020-04-27 2021-11-04 Duke University Targeted genomic integration to restore neurofibromin coding sequence in neurofibromatosis type 1 (nf1)
EP4146798A4 (en) 2020-05-04 2025-02-12 Saliogen Therapeutics, Inc. TRANSPOSITION-BASED THERAPIES
JP2023524976A (ja) * 2020-05-04 2023-06-14 エディタス・メディシン、インコーポレイテッド 必須遺伝子ノックインによる選択
CA3179710A1 (en) 2020-05-05 2021-11-11 Andrew Mark CIGAN Methods for improving the health of porcine species by targeted inactivation of cd163
EP4146797A1 (en) 2020-05-06 2023-03-15 Orchard Therapeutics (Europe) Limited Treatment for neurodegenerative diseases
WO2021224401A1 (en) 2020-05-07 2021-11-11 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for determining a reference range of β-galactose exposure platelet
IL297761A (en) 2020-05-08 2022-12-01 Broad Inst Inc Methods and compositions for simultaneously editing two helices of a designated double-helix nucleotide sequence
US20230279438A1 (en) 2020-05-13 2023-09-07 Inserm (Institut National De La Santé Et La Recherche Médicale) Base editing approaches for the treatment of betahemoglobinopathies
WO2021230385A1 (en) 2020-05-15 2021-11-18 Astellas Pharma Inc. Method for treating muscular dystrophy by targeting utrophin gene
US11787841B2 (en) 2020-05-19 2023-10-17 Inscripta, Inc. Rationally-designed mutations to the thrA gene for enhanced lysine production in E. coli
US12383555B2 (en) 2020-05-20 2025-08-12 Foghorn Therapeutics Inc. Methods of treating cancers
US11263022B2 (en) * 2020-05-21 2022-03-01 Microsoft Technology Licensing, Llc Mechanism to turn on/off post-processing features in the device media foundation transform
WO2021245224A1 (en) 2020-06-05 2021-12-09 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and pharmaceutical compositions for treating ocular diseases
JP2023530234A (ja) 2020-06-05 2023-07-14 ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッド 新生物を治療するための組成物および方法
JP2023529211A (ja) 2020-06-11 2023-07-07 ノバルティス アーゲー Ｚｂｔｂ３２阻害剤及びその使用
CN111748539B (zh) * 2020-06-11 2021-10-22 中国农业科学院农产品加工研究所 CRISPR/LpCas9基因编辑系统及其应用
WO2021255204A1 (en) 2020-06-18 2021-12-23 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) New strategy for treating pancreatic cancer
EP4168593A4 (en) 2020-06-23 2024-11-27 The Regents of the University of Colorado, a body corporate METHODS FOR DIAGNOSIS OF RESPIRATORY PATHOGENS AND PREDICTION OF EVOLUTIONS ASSOCIATED WITH COVID-19
WO2021263146A2 (en) 2020-06-26 2021-12-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a humanized ace2 locus
EP4175664A2 (en) 2020-07-06 2023-05-10 Janssen Biotech, Inc. Prostate neoantigens and their uses
KR20230037043A (ko) * 2020-07-08 2023-03-15 더 잭슨 래보라토리 인간 선천적 면역 기능을 지원하는 트랜스제닉 마우스 모델
WO2022008597A1 (en) 2020-07-08 2022-01-13 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and pharmaceutical composition for the treatment of infectious diseases
CA3182390A1 (en) 2020-07-09 2022-01-13 Iain Robert THOMPSON Method for treating alzheimer's disease by targeting mapt gene
WO2022008935A1 (en) 2020-07-10 2022-01-13 Horizon Discovery Limited Method for producing genetically modified cells
AU2021204717A1 (en) 2020-07-15 2022-02-03 Seminis Vegetable Seeds, Inc. Green Bean Plants with Improved Disease Resistance
US20240247242A1 (en) 2020-07-15 2024-07-25 LifeEDIT Therapeutics, Inc. Uracil stabilizing proteins and active fragments and variants thereof and methods of use
EP4189071A1 (en) 2020-08-03 2023-06-07 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) Population of treg cells functionally committed to exert a regulatory activity and their use for adoptive therapy
US20230295615A1 (en) 2020-08-07 2023-09-21 The Jackson Laboratory Targeted Sequence Insertion Compositions and Methods
AU2021325947A1 (en) 2020-08-13 2023-03-02 Yale University Compositions and methods for engineering and selection of CAR T cells with desired phenotypes
US20220049303A1 (en) 2020-08-17 2022-02-17 Readcoor, Llc Methods and systems for spatial mapping of genetic variants
BR112023002885A2 (pt) 2020-08-18 2023-03-21 Pioneer Hi Bred Int Genes de resistência a múltiplas doenças e seus empilhamentos genômicos
CA3188867A1 (en) 2020-08-20 2022-02-24 Xueyin Wang Compositions and methods for treating ceacam positive cancers
WO2022040444A1 (en) 2020-08-20 2022-02-24 A2 Biotherapeutics, Inc. Compositions and methods for treating egfr positive cancers
IL300500A (en) 2020-08-20 2023-04-01 A2 Biotherapeutics Inc Preparations and methods for the treatment of mesothelin positive cancer
CN116438302A (zh) * 2020-08-24 2023-07-14 宏基因组学公司 用于对货物核苷酸序列转位的系统和方法
US20240238344A1 (en) 2020-08-28 2024-07-18 Vor Biopharma Inc. Compositions and methods for cd123 modification
WO2022047168A1 (en) 2020-08-28 2022-03-03 Vor Biopharma Inc. Compositions and methods for cll1 modification
CN116529266A (zh) 2020-08-31 2023-08-01 耶鲁大学 用于将核酸递送到细胞的组合物和方法
CN116134141A (zh) 2020-09-04 2023-05-16 国立大学法人神户大学 包含小型化胞苷脱氨酶的双链dna修饰用复合体
MX2023002848A (es) 2020-09-11 2023-03-22 Lifeedit Therapeutics Inc Enzimas modificadoras del acido desoxirribonucleico (adn) y fragmentos activos y sus variantes y metodos de uso.
JP2023541457A (ja) 2020-09-14 2023-10-02 ブイオーアール バイオファーマ インコーポレーテッド Ｃｄ３８修飾のための化合物および方法
WO2022056459A1 (en) 2020-09-14 2022-03-17 Vor Biopharma, Inc. Compositions and methods for cd5 modification
US11299731B1 (en) 2020-09-15 2022-04-12 Inscripta, Inc. CRISPR editing to embed nucleic acid landing pads into genomes of live cells
CA3193089A1 (en) 2020-09-18 2022-03-24 Jamie KERSHNER Constructs and uses thereof for efficient and specific genome editing
WO2022061115A1 (en) 2020-09-18 2022-03-24 Vor Biopharma Inc. Compositions and methods for cd7 modification
WO2022066973A1 (en) 2020-09-24 2022-03-31 Fred Hutchinson Cancer Research Center Immunotherapy targeting pbk or oip5 antigens
KR20230074205A (ko) 2020-09-24 2023-05-26 스미또모 가가꾸 가부시끼가이샤 핵산 올리고머의 제조 방법
CN116724053A (zh) 2020-09-24 2023-09-08 弗雷德哈钦森癌症中心 靶向sox2抗原的免疫治疗
AU2021350024A1 (en) * 2020-09-24 2023-05-04 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Compositions and methods for inhibiting gene expression
CA3196831A1 (en) 2020-09-25 2022-03-31 Beam Therapeutics Inc. Fratricide resistant modified immune cells and methods of using the same
US20230364233A1 (en) 2020-09-28 2023-11-16 Vor Biopharma Inc. Compositions and methods for cd6 modification
US10947552B1 (en) 2020-09-30 2021-03-16 Alpine Roads, Inc. Recombinant fusion proteins for producing milk proteins in plants
AU2021353004A1 (en) 2020-09-30 2023-04-13 Nobell Foods, Inc. Recombinant milk proteins and food compositions comprising the same
WO2022072643A1 (en) 2020-09-30 2022-04-07 Vor Biopharma Inc. Compositions and methods for cd30 gene modification
US10894812B1 (en) 2020-09-30 2021-01-19 Alpine Roads, Inc. Recombinant milk proteins
EP4222264A1 (en) 2020-09-30 2023-08-09 CRISPR Therapeutics AG Materials and methods for treatment of amyotrophic lateral sclerosis
WO2022069756A1 (en) 2020-10-02 2022-04-07 Limagrain Europe Crispr-mediated directed codon re-write
WO2022073915A1 (en) 2020-10-05 2022-04-14 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Gdf3 as biomarker and biotarget in post-ischemic cardiac remodeling
WO2022076353A1 (en) 2020-10-06 2022-04-14 Fred Hutchinson Cancer Research Center Compositions and methods for treating mage-a1-expressing disease
WO2022074058A1 (en) 2020-10-06 2022-04-14 Keygene N.V. Targeted sequence addition
US20240016855A1 (en) 2020-10-13 2024-01-18 Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) Targeted-antibacterial-plasmids combining conjugation and crispr/cas systems and uses thereof
EP4232583A1 (en) 2020-10-21 2023-08-30 Massachusetts Institute of Technology Systems, methods, and compositions for site-specific genetic engineering using programmable addition via site-specific targeting elements (paste)
WO2022084531A1 (en) 2020-10-23 2022-04-28 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for treating glioma
WO2022093983A1 (en) 2020-10-27 2022-05-05 Vor Biopharma, Inc. Compositions and methods for treating hematopoietic malignancy
WO2022094245A1 (en) 2020-10-30 2022-05-05 Vor Biopharma, Inc. Compositions and methods for bcma modification
CN116670271A (zh) * 2020-11-04 2023-08-29 埃门多生物公司 新型omni-50 crispr核酸酶-rna复合物
CN112553195B (zh) * 2020-11-05 2022-04-05 南方医科大学 一种用于CRISPR-Cas9定点突变编辑DNMT1基因的试剂及其应用
WO2022097663A1 (ja) 2020-11-06 2022-05-12 エディットフォース株式会社 ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインの変異体
US11512297B2 (en) 2020-11-09 2022-11-29 Inscripta, Inc. Affinity tag for recombination protein recruitment
KR102875461B1 (ko) 2020-11-09 2025-10-24 삼성전자주식회사 전자 장치 및 그의 연락처를 관리하는 방법
EP4243858A1 (en) 2020-11-13 2023-09-20 Vor Biopharma Inc. Methods and compositions relating to genetically engineered cells expressing chimeric antigen receptors
CA3198447A1 (en) 2020-11-13 2022-05-19 Novartis Ag Combination therapies with chimeric antigen receptor (car)-expressing cells
US20230416830A1 (en) 2020-11-16 2023-12-28 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for predicting and treating uveal melanoma
WO2022115506A2 (en) 2020-11-24 2022-06-02 University Of Houston System Salicylic acid-inducible gene expression compositions and systems for cells
WO2022112316A1 (en) 2020-11-24 2022-06-02 Keygene N.V. Targeted enrichment using nanopore selective sequencing
US11459372B2 (en) 2020-11-30 2022-10-04 Crispr Therapeutics Ag Gene-edited natural killer cells
WO2022120022A1 (en) 2020-12-02 2022-06-09 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Crispr sam biosensor cell lines and methods of use thereof
KR20230128289A (ko) 2020-12-03 2023-09-04 스크라이브 테라퓨틱스 인크. 조작된 클래스 2 유형 v crispr 시스템
WO2022132836A2 (en) 2020-12-14 2022-06-23 Fred Hutchinson Cancer Research Center Compositions and methods for cellular immunotherapy
TW202235622A (zh) 2020-12-23 2022-09-16 美商旗艦先鋒創新公司 包裹rna之指環病毒(anellovirus)蛋白殼之活體外組裝
WO2022144632A1 (en) 2020-12-30 2022-07-07 Crispr Therapeutics Ag Compositions and methods for differentiating stem cells into nk cells
CN116848235A (zh) 2020-12-30 2023-10-03 因特利亚治疗公司 工程化t细胞
WO2022144855A1 (en) 2020-12-31 2022-07-07 Crispr Therapeutics Ag Universal donor cells
JP2024502820A (ja) 2020-12-31 2024-01-23 ブイオーアール バイオファーマ インコーポレーテッド Ｃｄ３４遺伝子改変のための組成物及び方法
AU2021415461A1 (en) * 2021-01-04 2023-08-17 Inscripta, Inc. Mad nucleases
CA3207144A1 (en) 2021-01-05 2022-07-14 Horizon Discovery Limited Method for producing genetically modified cells
EP4274890A4 (en) 2021-01-07 2024-11-27 Inscripta, Inc. MAD-NUCLEASES
JP2024502630A (ja) 2021-01-12 2024-01-22 マーチ セラピューティクス， インコーポレイテッド コンテキスト依存性二本鎖ｄｎａ特異的デアミナーゼ及びその使用
WO2022158898A1 (ko) * 2021-01-21 2022-07-28 한국생명공학연구원 Francisella novicida cas9 모듈 기반의 역전사 효소를 사용한 유전체 치환 및 삽입 기술
WO2022164796A1 (en) 2021-01-26 2022-08-04 California Institute Of Technology Allosteric conditional guide rnas for cell-selective regulation of crispr/cas
US12171813B2 (en) 2021-02-05 2024-12-24 Christiana Care Gene Editing Institute, Inc. Methods of and compositions for reducing gene expression and/or activity
US20240425885A1 (en) * 2021-02-08 2024-12-26 Emendobio Inc. OMNI 90-99, 101, 104-110, 114, 116, 118-123, 125, 126, 128, 129, and 131-138 CRISPR NUCLEASE
JP2024506608A (ja) 2021-02-08 2024-02-14 エメンドバイオ・インコーポレイテッド Ｏｍｎｉ－１０３ ｃｒｉｓｐｒヌクレアーゼ
WO2022177979A1 (en) 2021-02-16 2022-08-25 A2 Biotherapeutics, Inc. Compositions and methods for treating her2 positive cancers
US11884924B2 (en) 2021-02-16 2024-01-30 Inscripta, Inc. Dual strand nucleic acid-guided nickase editing
AU2022227650A1 (en) 2021-02-25 2023-10-12 Celyntra Therapeutics Sa Compositions and methods for targeting, editing, or modifying genes
WO2022180153A1 (en) 2021-02-25 2022-09-01 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Allele-specific genome editing of the nr2e3 mutation g56r
WO2022187125A1 (en) * 2021-03-01 2022-09-09 The Regents Of The University Of California Methods for generating a crispr array
GB202103131D0 (en) 2021-03-05 2021-04-21 Biosystems Tech Limited Method for preparation of research organisms
US12606553B2 (en) 2021-03-09 2026-04-21 Foghorn Therapeutics Inc. Crystalline forms, compositions containing same, and methods of their use
US20240165094A1 (en) 2021-03-17 2024-05-23 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Methods and compositions for treating melanoma
US20240301385A1 (en) 2021-03-22 2024-09-12 LifeEDIT Therapeutics, Inc. Dna modifying enzymes and active fragments and variants thereof and methods of use
WO2022214522A2 (en) 2021-04-07 2022-10-13 Astrazeneca Ab Compositions and methods for site-specific modification
WO2022214632A1 (en) 2021-04-07 2022-10-13 Neoplants Sas Compositions and methods for indoor air remediation
US20240200059A1 (en) 2021-04-09 2024-06-20 Vor Biopharma Inc. Photocleavable guide rnas and methods of use thereof
EP4320153A1 (en) 2021-04-09 2024-02-14 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for the treatment of anaplastic large cell lymphoma
WO2022219175A1 (en) 2021-04-15 2022-10-20 Keygene N.V. Mobile endonucleases for heritable mutations
AU2022256793A1 (en) 2021-04-15 2023-09-28 Keygene N.V. Co-regeneration recalcitrant plants
KR20240007651A (ko) 2021-04-16 2024-01-16 빔 테라퓨틱스, 인크. 간세포의 유전적 변형
JP2024516168A (ja) 2021-04-22 2024-04-12 デイナ ファーバー キャンサー インスティチュート，インコーポレイテッド がんを治療するための組成物および方法
EP4326903A1 (en) 2021-04-23 2024-02-28 Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) Methods and compositions for treating cell senescence accumulation related disease
CA3218511A1 (en) 2021-05-10 2022-11-17 Sqz Biotechnologies Company Methods for delivering genome editing molecules to the nucleus or cytosol of a cell and uses thereof
US20240384246A1 (en) 2021-05-27 2024-11-21 Astrazeneca Ab Ca s9 effector proteins with enhanced stability
WO2022251644A1 (en) 2021-05-28 2022-12-01 Lyell Immunopharma, Inc. Nr4a3-deficient immune cells and uses thereof
EP4419672A2 (en) 2021-06-01 2024-08-28 Artisan Development Labs, Inc. Compositions and methods for targeting, editing, or modifying genes
TW202307210A (zh) 2021-06-01 2023-02-16 瑞士商諾華公司 Ｃｄ１９和ｃｄ２２嵌合抗原受體及其用途
EP4347818A2 (en) 2021-06-01 2024-04-10 Arbor Biotechnologies, Inc. Gene editing systems comprising a crispr nuclease and uses thereof
EP4347826A1 (en) 2021-06-02 2024-04-10 Lyell Immunopharma, Inc. Nr4a3-deficient immune cells and uses thereof
AU2022285744A1 (en) 2021-06-02 2023-12-14 Beam Therapeutics Inc. Circular guide rnas for crispr/cas editing systems
US20240279687A1 (en) 2021-06-07 2024-08-22 Yale University Peptide nucleic acids for spatiotemporal control of crispr-cas binding
EP4352215A1 (en) 2021-06-11 2024-04-17 LifeEDIT Therapeutics, Inc. Rna polymerase iii promoters and methods of use
GB202108585D0 (en) 2021-06-16 2021-07-28 Rockend Ltd Methods and compositions
EP4370676A2 (en) 2021-06-18 2024-05-22 Artisan Development Labs, Inc. Compositions and methods for targeting, editing or modifying human genes
WO2022272293A1 (en) * 2021-06-23 2022-12-29 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Compositions and methods for efficient retron production and genetic editing
WO2022269393A1 (en) 2021-06-23 2022-12-29 Crispr Therapeutics Ag Engineered cells with improved protection from natural killer cell killing
WO2023283585A2 (en) 2021-07-06 2023-01-12 Vor Biopharma Inc. Inhibitor oligonucleotides and methods of use thereof
EP4367242A2 (en) 2021-07-07 2024-05-15 Omega Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating secreted frizzled receptor protein 1 (sfrp1) gene expression
WO2023283495A1 (en) * 2021-07-09 2023-01-12 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Crispr-based protein barcoding and surface assembly
TW202317602A (zh) 2021-07-15 2023-05-01 福瑞德哈金森腫瘤中心 嵌合多肽
KR20240037299A (ko) 2021-07-23 2024-03-21 빔 테라퓨틱스, 인크. Crispr/cas 편집 시스템용 가이드 rna
CA3227103A1 (en) 2021-07-30 2023-02-02 Matthew P. GEMBERLING Compositions and methods for modulating expression of frataxin (fxn)
US20240252684A1 (en) 2021-07-30 2024-08-01 Tune Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating expression of methyl-cpg binding protein 2 (mecp2)
AU2022324093A1 (en) 2021-08-02 2024-02-08 Vor Biopharma Inc. Compositions and methods for gene modification
KR102574819B1 (ko) 2021-08-09 2023-09-04 경상국립대학교산학협력단 P34와 이의 상동체 동시 타겟 유전자교정 시스템 및 이의 용도
KR102584891B1 (ko) 2021-08-09 2023-10-04 경상국립대학교산학협력단 GmIPK1 유전자교정 시스템 및 이의 용도
KR102573952B1 (ko) 2021-08-09 2023-09-01 경상국립대학교산학협력단 E2와 이의 상동체 동시 타겟 유전자교정 시스템 및 이의 용도
KR102573947B1 (ko) 2021-08-09 2023-09-01 경상국립대학교산학협력단 콩 유전자교정 효율 증대를 위한 유전자교정 시스템 및 이의 용도
KR102573948B1 (ko) 2021-08-09 2023-09-01 경상국립대학교산학협력단 Mips1과 이의 상동체 동시 타겟 유전자교정 시스템 및 이의 용도
EP4144841A1 (en) * 2021-09-07 2023-03-08 Bayer AG Novel small rna programmable endonuclease systems with impoved pam specificity and uses thereof
AU2022344256A1 (en) 2021-09-08 2024-02-29 Arbor Biotechnologies, Inc. Compositions comprising a crispr nuclease and uses thereof
JP2024534945A (ja) 2021-09-10 2024-09-26 アジレント・テクノロジーズ・インク 化学修飾を有するプライム編集のためのガイドｒｎａ
GB2625500B (en) * 2021-09-21 2026-04-01 Scribe Therapeutics Inc Engineered CasX repressor systems
AR127144A1 (es) 2021-09-27 2023-12-20 Monsanto Technology Llc Composiciones y métodos para la transformación de explantes de embriones extirpados de semillas de monocotiledóneas
US20240417755A1 (en) 2021-09-27 2024-12-19 Vor Biopharma Inc. Fusion polypeptides for genetic editing and methods of use thereof
EP4409000A1 (en) 2021-09-28 2024-08-07 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Base editing approaches for the treatment of beta-hemoglobinopathies
CN117980285A (zh) 2021-09-28 2024-05-03 住友化学株式会社 纯化二氯乙酸的制造方法
EP4596696A3 (en) 2021-09-28 2025-08-27 Acrigen Biosciences Compositions and methods for nucleic acid modifications
JP2024537775A (ja) 2021-09-30 2024-10-16 アコーオス インコーポレイテッド Ｋｃｎｑ４関連難聴を治療するための組成物及び方法
WO2023052508A2 (en) 2021-09-30 2023-04-06 Astrazeneca Ab Use of inhibitors to increase efficiency of crispr/cas insertions
WO2023059115A1 (ko) 2021-10-06 2023-04-13 주식회사 진코어 유전자 편집을 위한 target 시스템 및 이의 용도
WO2023064813A2 (en) * 2021-10-13 2023-04-20 University Of Massachusetts Modified guide rnas for neisseria meningitidis cas9
IL311962A (en) 2021-10-14 2024-06-01 Lonza Sales Ag Modified producer cells for extracellular vesicle production
JP2024537991A (ja) 2021-10-14 2024-10-18 アーセナル バイオサイエンシズ インコーポレイテッド 共発現されるｓｈＲＮＡと論理ゲートシステムとを有する免疫細胞
EP4219726A1 (en) 2021-10-15 2023-08-02 Research Institute at Nationwide Children's Hospital Self-complementary adeno-associated virus vector and its use in treatment of muscular dystrophy
US20250241999A1 (en) 2021-10-15 2025-07-31 Georgia State University Research Foundation, Inc. Delivery of therapeutic recombinant uricase using nanoparticles
CA3234809A1 (en) 2021-10-20 2023-04-27 Steven Goldman Isolated glial progenitor cells for use in the competition treatment of age-related white matter loss
WO2023070043A1 (en) 2021-10-20 2023-04-27 Yale University Compositions and methods for targeted editing and evolution of repetitive genetic elements
US20240407344A1 (en) 2021-10-22 2024-12-12 Tokyo Metropolitan Institute Of Medical Science Neurodegenerative and amyotrophic model animal
WO2023076944A1 (en) 2021-10-26 2023-05-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Overexpression of lemd2, lemd3, or chmp7 as a therapeutic modality for tauopathy
US20230149563A1 (en) 2021-10-27 2023-05-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for expressing factor ix for hemophilia b therapy
US20240415980A1 (en) 2021-10-28 2024-12-19 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for knocking out c5
EP4426828A1 (en) 2021-11-01 2024-09-11 Tome Biosciences, Inc. Single construct platform for simultaneous delivery of gene editing machinery and nucleic acid cargo
US20240426823A1 (en) 2021-11-03 2024-12-26 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Methods and compositions for treating triple negative breast cancer (tnbc)
CA3237482A1 (en) 2021-11-03 2023-05-11 The J. David Gladstone Institutes, A Testamentary Trust Established Under The Will Of J. David Gladstone Precise genome editing using retrons
IL312505A (en) 2021-11-04 2024-07-01 Regeneron Pharma Non-human animals comprising a modified cacng1 locus
JP2024543369A (ja) 2021-11-09 2024-11-21 ブイオーアール バイオファーマ インコーポレーテッド Ｅｍｒ２修飾のための化合物及び方法
EP4433512A4 (en) 2021-11-19 2025-12-31 Univ Pennsylvania Genetically modified pan-leukocyte-specific CD45 antigen to facilitate T-lymphocyte therapy
GB202117314D0 (en) 2021-11-30 2022-01-12 Clarke David John Cyclic nucleic acid fragmentation
WO2023099591A1 (en) 2021-12-01 2023-06-08 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for increasing fetal hemoglobin content by editing the +55-kb region of the erythroid-specific bcl11a enhancer
KR20240117571A (ko) 2021-12-08 2024-08-01 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 돌연변이 마이오실린 질환 모델 및 이의 용도
EP4444874A1 (en) 2021-12-09 2024-10-16 Zygosity Limited Vector
US20230193310A1 (en) 2021-12-10 2023-06-22 Seminis Vegetabe Seeds, Inc. Lettuce plants having resistance to downy mildew
US20250064032A1 (en) 2021-12-10 2025-02-27 Pig Improvement Company Uk Limited Editing tmprss2/4 for disease resistance in livestock
GB202118058D0 (en) 2021-12-14 2022-01-26 Univ Warwick Methods to increase yields in crops
US20230279442A1 (en) 2021-12-15 2023-09-07 Versitech Limited Engineered cas9-nucleases and method of use thereof
WO2023111173A1 (en) 2021-12-16 2023-06-22 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) An ezh2 degrader or inhibitor for use in the treatment of resistant acute myeloid leukemia
EP4447649A1 (en) 2021-12-17 2024-10-23 Keygene N.V. Double decapitation of plants
US20250049006A1 (en) 2021-12-20 2025-02-13 C/O Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising humanized ace2 and tmprss loci
CA3243006A1 (en) 2021-12-21 2025-02-27 Alia Therapeutics Srl TYPE II CAS PROTEINS AND THEIR APPLICATIONS
EP4452257A1 (en) 2021-12-21 2024-10-30 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for treating melanoma
EP4453199A1 (en) 2021-12-21 2024-10-30 Benson Hill, Inc. Compositions and methods for modifying genomes
AU2022420615A1 (en) 2021-12-22 2024-07-04 Tome Biosciences, Inc. Co-delivery of a gene editor construct and a donor template
JP2025501755A (ja) 2021-12-23 2025-01-23 ユニバーシティー オブ マサチューセッツ 脆弱ｘ関連障害に対する治療的処置
AU2022424002A1 (en) 2021-12-29 2024-06-13 Bristol-Myers Squibb Company Generation of landing pad cell lines
US20250134999A1 (en) 2022-01-14 2025-05-01 Tune Therapeutics, Inc. Compositions, systems, and methods for programming t cell phenotypes through targeted gene activation
US20250154503A1 (en) 2022-01-14 2025-05-15 Tune Therapeutics, Inc. Compositions, systems, and methods for programming t cell phenotypes through targeted gene repression
WO2023141602A2 (en) 2022-01-21 2023-07-27 Renagade Therapeutics Management Inc. Engineered retrons and methods of use
CA3243220A1 (en) 2022-01-24 2023-07-27 LifeEDIT Therapeutics, Inc. RNA-GUIDED NUCLEASE AND ACTIVE FRAGMENTS, ASSOCIATED VARIANTS AND METHODS OF USE
WO2023144104A1 (en) 2022-01-25 2023-08-03 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Base editing approaches for the treatment of βeta-thalassemia
WO2023144235A1 (en) 2022-01-27 2023-08-03 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for monitoring and treating warburg effect in patients with pi3k-related disorders
US20250230412A1 (en) 2022-02-01 2025-07-17 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for treating cancer
CA3242731A1 (en) 2022-02-02 2023-08-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-tfr:gaa and anti-cd63:gaa insertions for treatment of pompe disease
WO2023150798A1 (en) 2022-02-07 2023-08-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for defining optimal treatment timeframes in lysosomal disease
EP4223877A1 (en) * 2022-02-08 2023-08-09 Eberhard Karls Universität Tübingen Medizinische Fakultät System and method for editing genomic dna to modulate splicing
AU2023218391A1 (en) 2022-02-11 2024-07-11 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for screening 4r tau targeting agents
US20250152677A1 (en) 2022-02-14 2025-05-15 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Treatment of liver cancers by disrupting the beta-catenin/tcf-4 binding site located upstreatm of meg3 in the dlk1/dio3 locus
WO2023159103A1 (en) 2022-02-17 2023-08-24 The Board Of Regents Of The University Of Texas System CRISPR/SpCas9 VARIANT AND METHODS FOR ENHANCED CORRECTON OF DUCHENNE MUSCULAR DYSTROPHY MUTATIONS
EP4479143A1 (en) 2022-02-18 2024-12-25 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) Use of tcr-deficient car-tregs in combination with anti-tcr complex monoclonal antibodies for inducing durable tolerance
AU2022201166B2 (en) * 2022-02-21 2024-02-22 Zhuhai Shu Tong Medical Technology Co., Ltd. Type ii crispr/cas9 genome editing system and the application thereof
US12157886B2 (en) * 2022-02-21 2024-12-03 Zhuhai Shu Tong Medical Technology Co., Ltd. Type II CRISPR/Cas9 genome editing system and the application thereof
EP4482955A2 (en) * 2022-02-25 2025-01-01 Duke University Crispr-cas9 compositions and methods with a novel cas9 protein for genome editing and gene regulation
US20250179531A1 (en) 2022-02-25 2025-06-05 Vor Biopharma Inc. Compositions and methods for homology-directed repair gene modification
EP4486881A1 (en) 2022-03-01 2025-01-08 Celyntra Therapeutics SA Composition and methods for transgene insertion
WO2023166425A1 (en) 2022-03-01 2023-09-07 Crispr Therapeutics Ag Methods and compositions for treating angiopoietin-like 3 (angptl3) related conditions
US12509485B2 (en) 2022-03-23 2025-12-30 Sumitomo Chemical Company, Limited Method for producing nucleic acid oligomer
US20230302423A1 (en) 2022-03-28 2023-09-28 Massachusetts Institute Of Technology Rna scaffolded wireframe origami and methods thereof
WO2023194359A1 (en) 2022-04-04 2023-10-12 Alia Therapeutics Srl Compositions and methods for treatment of usher syndrome type 2a
AU2023251040A1 (en) 2022-04-04 2024-10-17 Vor Biopharma Inc. Compositions and methods for mediating epitope engineering
WO2023205744A1 (en) 2022-04-20 2023-10-26 Tome Biosciences, Inc. Programmable gene insertion compositions
CN114864002B (zh) * 2022-04-28 2023-03-10 广西科学院 一种基于深度学习的转录因子结合位点识别方法
WO2023212677A2 (en) 2022-04-29 2023-11-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Identification of tissue-specific extragenic safe harbors for gene therapy approaches
WO2023215725A1 (en) 2022-05-02 2023-11-09 Fred Hutchinson Cancer Center Compositions and methods for cellular immunotherapy
EP4518907A1 (en) 2022-05-02 2025-03-12 Fondazione Telethon ETS Homology independent targeted integration for gene editing
WO2023215831A1 (en) 2022-05-04 2023-11-09 Tome Biosciences, Inc. Guide rna compositions for programmable gene insertion
US20250302998A1 (en) 2022-05-09 2025-10-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Vectors and methods for in vivo antibody production
US20250241956A1 (en) 2022-05-10 2025-07-31 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Base editing approaches for correcting the cd39 (cag>tag) mutation in patients suffering from beta-thalassemia
JP2025516462A (ja) * 2022-05-13 2025-05-30 エスアールアイ インターナショナル 内因性遺伝子への転写因子のプログラム可能なリクルートメント
JP2025516823A (ja) 2022-05-19 2025-05-30 ライエル・イミュノファーマ・インコーポレイテッド Ｎｒ４ａ３を標的とするポリヌクレオチド及びその使用
WO2023225670A2 (en) 2022-05-20 2023-11-23 Tome Biosciences, Inc. Ex vivo programmable gene insertion
US20250308637A1 (en) 2022-05-20 2025-10-02 Celyntra Therapeutics Sa Systems and methods for assessing risk of genome editing events
WO2023230570A2 (en) 2022-05-25 2023-11-30 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Compositions and methods for modulating genetic drivers
US20250319115A1 (en) 2022-05-25 2025-10-16 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Compositions and Methods for Modulating Cytokines
AU2023276757A1 (en) 2022-05-25 2024-11-21 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Compositions and methods for modulation of tumor suppressors and oncogenes
CA3254388A1 (en) 2022-05-25 2023-11-30 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc COMPOSITIONS AND METHODS OF MODULATING TRAFFIC FACTORS
CN119563038A (zh) 2022-05-25 2025-03-04 旗舰创业创新七公司 用于调节免疫应答的组合物和方法
JP2025521154A (ja) 2022-05-31 2025-07-08 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド Ｃ９ｏｒｆ７２反復伸長疾患のためのｃｒｉｓｐｒ干渉療法
US20250344681A1 (en) 2022-05-31 2025-11-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Animal model of tdp-43 proteinopathy
WO2023235725A2 (en) 2022-05-31 2023-12-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Crispr-based therapeutics for c9orf72 repeat expansion disease
WO2023233342A2 (en) 2022-06-01 2023-12-07 Crispr Therapeutics Ag Gene-edited natural killer cells
WO2023233339A1 (en) 2022-06-01 2023-12-07 Crispr Therapeutics Ag Compositions and methods for differentiating stem cells into nk cells
GB2634837A (en) 2022-06-07 2025-04-23 Scribe Therapeutics Inc Compositions and methods for the targeting of PCSK9
WO2023250288A2 (en) 2022-06-21 2023-12-28 Seminis Vegetable Seeds, Inc. Novel qtls conferring resistance to cucumber mosaic virus
IL317874A (en) 2022-06-24 2025-02-01 Tune Therapeutics Inc Compounds, systems and methods for reducing low density lipoproteins through targeted gene suppression
WO2024006955A1 (en) 2022-06-29 2024-01-04 Intellia Therapeutics, Inc. Engineered t cells
GB202209518D0 (en) 2022-06-29 2022-08-10 Snipr Biome Aps Treating & preventing E coli infections
WO2024005863A1 (en) 2022-06-30 2024-01-04 Inari Agriculture Technology, Inc. Compositions, systems, and methods for genome editing
WO2024005864A1 (en) 2022-06-30 2024-01-04 Inari Agriculture Technology, Inc. Compositions, systems, and methods for genome editing
JP7152094B1 (ja) 2022-06-30 2022-10-12 リージョナルフィッシュ株式会社 ｔｒａｃｒＲＮＡユニット、及びゲノム編集方法
EP4299733A1 (en) 2022-06-30 2024-01-03 Inari Agriculture Technology, Inc. Compositions, systems, and methods for genome editing
EP4548351A1 (en) 2022-06-30 2025-05-07 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Artificial intelligence-mediated methods and systems for genome editing
GB2621813A (en) 2022-06-30 2024-02-28 Univ Newcastle Preventing disease recurrence in Mitochondrial replacement therapy
EP4299739A1 (en) 2022-06-30 2024-01-03 Inari Agriculture Technology, Inc. Compositions, systems, and methods for genome editing
US20260000658A1 (en) 2022-07-06 2026-01-01 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Methods for the treatment of proliferative glomerulonephritis
CA3261865A1 (en) 2022-07-12 2024-01-18 Tune Therapeutics, Inc. TARGETED TRANSCRIPTIONAL ACTIVATION COMPOSITIONS, SYSTEMS AND METHODS
WO2024015925A2 (en) 2022-07-13 2024-01-18 Vor Biopharma Inc. Compositions and methods for artificial protospacer adjacent motif (pam) generation
WO2024013514A2 (en) 2022-07-15 2024-01-18 Pig Improvement Company Uk Limited Gene edited livestock animals having coronavirus resistance
JP2025525569A (ja) 2022-07-18 2025-08-05 レナゲード セラピューティクス マネージメント インコーポレイテッド 遺伝子編集成分、システム、及び使用方法
CA3262625A1 (en) 2022-07-22 2024-01-25 The Johns Hopkins University ADMINISTRATION OF TARGETED INTRACELLULAR CRISPR/CAS SYSTEM ACTIVATED BY DENDRIMER AND GENE EDITING
WO2024018056A1 (en) 2022-07-22 2024-01-25 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Base editing approaches for correcting the ivs2-1 (g>a) mutation in patients suffering from βeta-thalassemia
WO2024020587A2 (en) 2022-07-22 2024-01-25 Tome Biosciences, Inc. Pleiopluripotent stem cell programmable gene insertion
US20260015580A1 (en) 2022-07-25 2026-01-15 The Regents Of The University Of California Methods of Producing and Using Avian Embryonic Stem Cells and Avian Telencephalic Organoids
WO2024023734A1 (en) 2022-07-26 2024-02-01 Bit Bio Limited MULTI-gRNA GENOME EDITING
JPWO2024024873A1 (es) 2022-07-28 2024-02-01
CN120659627A (zh) 2022-07-29 2025-09-16 瑞泽恩制药公司 用于转铁蛋白受体（tfr）介导的脑和肌肉递送的组合物和方法
IL317261A (en) 2022-07-29 2025-01-01 Regeneron Pharma Non-human animals containing a modified transferrin receptor locus
EP4565217A1 (en) 2022-08-04 2025-06-11 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Methods for the treatment of lymphoproliferative disorders
JP2025525745A (ja) 2022-08-05 2025-08-07 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド Ｔｄｐ－４３の凝集耐性バリアント
WO2024036190A2 (en) 2022-08-09 2024-02-15 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Guide polynucleotide multiplexing
EP4569093A1 (en) 2022-08-12 2025-06-18 Life Edit Therapeutics, Inc. Rna-guided nucleases and active fragments and variants thereof and methods of use
KR20250077608A (ko) 2022-08-19 2025-05-30 튠 쎄라퓨틱스, 인코포레이티드 표적 유전자 억제를 통한 b형 간염 바이러스 조절용 조성물, 시스템 및 방법
WO2024044723A1 (en) 2022-08-25 2024-02-29 Renagade Therapeutics Management Inc. Engineered retrons and methods of use
CA3265664A1 (en) 2022-08-25 2024-02-29 Life Edit Therapeutics, Inc. CHEMICAL MODIFICATION OF GUIDE RNA WITH A LOCKED NUCLEIC ACID FOR RNA-GUIDED NUCLEASE-MEDIATED GENE EDITING
WO2024042165A2 (en) 2022-08-26 2024-02-29 UCB Biopharma SRL Novel rna-guided nucleases and nucleic acid targeting systems comprising such rna-guided nucleases
WO2024042168A1 (en) 2022-08-26 2024-02-29 UCB Biopharma SRL Novel rna-guided nucleases and nucleic acid targeting systems comprising such rna-guided nucleases
EP4580658A1 (en) 2022-08-31 2025-07-09 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Method to generate more efficient car-t cells
WO2024047247A1 (en) 2022-09-02 2024-03-07 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Base editing approaches for the treatment of amyotrophic lateral sclerosis
EP4583905A1 (en) 2022-09-06 2025-07-16 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Novel dual split car-t cells for the treatment of cd38-positive hematological malignancies
WO2024056659A1 (en) 2022-09-13 2024-03-21 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Method for treating prostate cancer and other epithelial cancers
CA3267752A1 (en) 2022-09-16 2024-03-21 Alia Therapeutics Srl ENQP TYPE II CAS PROTEINS AND THEIR APPLICATIONS
WO2024064642A2 (en) 2022-09-19 2024-03-28 Tune Therapeutics, Inc. Compositions, systems, and methods for modulating t cell function
US20260097121A1 (en) * 2022-09-19 2026-04-09 Emendobio Inc. Biallelic Knockout of CISH
WO2024064824A2 (en) 2022-09-21 2024-03-28 Yale University Compositions and methods for identification of membrane targets for enhancement of nk cell therapy
WO2024064958A1 (en) 2022-09-23 2024-03-28 Lyell Immunopharma, Inc. Methods for culturing nr4a-deficient cells
WO2024064952A1 (en) 2022-09-23 2024-03-28 Lyell Immunopharma, Inc. Methods for culturing nr4a-deficient cells overexpressing c-jun
KR20250075694A (ko) 2022-09-28 2025-05-28 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 세포 기반 요법을 강화하기 위한 항체 저항성 변형 수용체
WO2024073751A1 (en) 2022-09-29 2024-04-04 Vor Biopharma Inc. Methods and compositions for gene modification and enrichment
EP4593590A1 (en) 2022-09-29 2025-08-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Correction of hepatosteatosis in humanized liver animals through restoration of il6/il6r/gp130 signaling in human hepatocytes
WO2024077174A1 (en) 2022-10-05 2024-04-11 Lyell Immunopharma, Inc. Methods for culturing nr4a-deficient cells
EP4602078A2 (en) 2022-10-11 2025-08-20 Yale University Compositions and methods of using cell-penetrating antibodies
JP7353602B1 (ja) 2022-10-14 2023-10-02 株式会社インプランタイノベーションズ ゲノム編集方法およびゲノム編集用組成物
EP4605524A1 (en) 2022-10-20 2025-08-27 Basf Se Regulatory nucleic acid molecules for enhancing gene expression in plants
AU2023364547A1 (en) 2022-10-21 2025-04-10 Watchmaker Genomics, Inc. Methods and compositions for sequencing library normalization
EP4605000A1 (en) 2022-10-21 2025-08-27 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Methods and pharmaceutical compositions for the treatment of osteoarthritis
WO2024089953A1 (ja) 2022-10-27 2024-05-02 住友化学株式会社 オリゴヌクレオチドの製造方法
CN115678903B (zh) * 2022-11-03 2024-04-02 贵州大学 一种白背飞虱Ago1基因、合成dsRNA的方法及其应用
KR20250126155A (ko) 2022-11-04 2025-08-22 라이프 에디트 테라퓨틱스, 인크. 내부 삽입 부위를 갖는 진화된 아데닌 데아미나제 및 rna-가이드 뉴클레아제 융합 단백질 및 사용 방법
EP4612184A1 (en) 2022-11-04 2025-09-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Calcium voltage-gated channel auxiliary subunit gamma 1 (cacng1) binding proteins and cacng1-mediated delivery to skeletal muscle
WO2024102434A1 (en) 2022-11-10 2024-05-16 Senda Biosciences, Inc. Rna compositions comprising lipid nanoparticles or lipid reconstructed natural messenger packs
KR20250116795A (ko) 2022-11-14 2025-08-01 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 별아교세포로의 섬유아세포 성장 인자 수용체 3-매개된 전달을 위한 조성물 및 방법
WO2024105162A1 (en) 2022-11-16 2024-05-23 Alia Therapeutics Srl Type ii cas proteins and applications thereof
CN120112547A (zh) 2022-11-16 2025-06-06 瑞泽恩制药公司 包含膜结合il-12和蛋白酶可裂解接头的嵌合蛋白
AU2023380182A1 (en) 2022-11-18 2025-07-03 Kyoto Prefectural Public University Corporation Compositions for mitophagy induction and uses thereof
EP4627077A1 (en) 2022-12-01 2025-10-08 Danisco US Inc. Iterative multiplex genome engineering in microbial cells using a selection marker swapping system
EP4627078A1 (en) 2022-12-01 2025-10-08 Danisco US Inc. Iterative muliplex genome engineering in microbial cells using a bidirectional selection marker system
EP4627076A1 (en) 2022-12-01 2025-10-08 Danisco Us Inc Iterative multiplex genome engineering in microbial cells using a recombinant self-excisable selection marker system
JP2025540052A (ja) 2022-12-01 2025-12-11 イェール ユニバーシティー 細胞内ペイロード送達用刺激応答性トレースレス操作プラットフォーム
WO2024123786A1 (en) 2022-12-06 2024-06-13 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods and compositions for co-delivery of t-dnas expressing multiple guide polynucleotides into plants
CN120457489A (zh) 2022-12-07 2025-08-08 赛诺菲 预测插入缺失频率
EP4634383A1 (en) 2022-12-16 2025-10-22 Life Edit Therapeutics, Inc. Guide rnas that target foxp3 gene and methods of use
WO2024127370A1 (en) 2022-12-16 2024-06-20 LifeEDIT Therapeutics, Inc. Guide rnas that target trac gene and methods of use
WO2024133723A1 (en) 2022-12-22 2024-06-27 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Methods for decreasing therapeutic acquired resistance to chemotherapy and/or radiotherapy
EP4638783A2 (en) 2022-12-22 2025-10-29 Intellia Therapeutics, Inc. Methods for analyzing nucleic acid cargos of lipid nucleic acid assemblies
WO2024138194A1 (en) 2022-12-22 2024-06-27 Tome Biosciences, Inc. Platforms, compositions, and methods for in vivo programmable gene insertion
CA3275398A1 (en) 2022-12-22 2024-06-27 Keygene N.V. REGENERATION BY PROTOPLASTIC CALL GRAFTING
JPWO2024143276A1 (es) 2022-12-26 2024-07-04
CN120882867A (zh) 2023-01-11 2025-10-31 阿利亚治疗有限公司 Ii型cas蛋白及其应用
JP2026502532A (ja) 2023-01-12 2026-01-23 ナショナル ユニバーシティ オブ シンガポール Ｔ細胞及びｎｋ細胞悪性腫瘍の免疫療法のためのｃｄ８発現及びキメラ抗原受容体の遮断
WO2024159071A1 (en) 2023-01-27 2024-08-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Modified rhabdovirus glycoproteins and uses thereof
WO2024163683A2 (en) 2023-02-01 2024-08-08 Tune Therapeutics, Inc. Systems, compositions, and methods for modulating expression of methyl-cpg binding protein 2 (mecp2) and x-inactive specific transcript (xist)
AU2024214456A1 (en) 2023-02-01 2025-07-03 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Animals comprising a modified klhdc7b locus
WO2024163678A2 (en) 2023-02-01 2024-08-08 Tune Therapeutics, Inc. Fusion proteins and systems for targeted activation of frataxin (fxn) and related methods
WO2024163615A1 (en) 2023-02-02 2024-08-08 University Of Florida Research Foundation, Incorporated Brain-derived neurotrophic factor-nano luciferase transgenic rodents and methods of use thereof
JP2026506554A (ja) 2023-02-06 2026-02-25 アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル 多重塩基編集による遺伝子改変造血幹細胞の濃縮
WO2024168097A2 (en) * 2023-02-07 2024-08-15 Applied Stemcell, Inc. Integrase variants for gene insertion in human cell
WO2024168312A1 (en) 2023-02-09 2024-08-15 Vor Biopharma Inc. Methods for treating hematopoietic malignancy
WO2024168348A1 (en) * 2023-02-10 2024-08-15 Tryptagenix, Inc. Production of monoterpene indole alkaloid compounds in a heterologous host
KR20250151430A (ko) 2023-02-15 2025-10-21 아버 바이오테크놀로지스, 인크. 스타스민 2(stmn2) 전사체에서 비정상적인 스플라이싱을 억제하는 유전자 편집 방법
IT202300004443A1 (it) 2023-03-09 2024-09-09 Int Centre For Genetic Engineering And Biotechnology Icgeb Sequenza codificante per alfa galattosidasi a umana per il trattamento della malattia di fabry
AU2024239266A1 (en) 2023-03-20 2025-09-25 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Cas polypeptides with altered pam recognition
US12383615B2 (en) 2023-03-23 2025-08-12 Carbon Biosciences, Inc. Protoparvovirus compositions comprising a protoparvovirus variant VP1 capsid polypeptide and related methods
WO2024196965A1 (en) 2023-03-23 2024-09-26 Carbon Biosciences, Inc. Parvovirus compositions and related methods for gene therapy
EP4689155A1 (en) 2023-03-29 2026-02-11 Astrazeneca AB Use of inhibitors to increase efficiency of crispr/cas insertions
WO2024206911A2 (en) 2023-03-30 2024-10-03 Children's Hospital Medical Center Clinical-grade organoids
WO2024206714A1 (en) * 2023-03-31 2024-10-03 Mammoth Biosciences, Inc. Engineered effector proteins, compositions, systems and methods of use thereof
WO2024211287A1 (en) 2023-04-03 2024-10-10 Seagen Inc. Production cell lines with targeted integration sites
CN121241136A (zh) * 2023-04-07 2025-12-30 基因泰克公司 经修饰的指导rna
AU2024202284B2 (en) 2023-04-14 2025-08-14 Seminis Vegetable Seeds, Inc. Methods and compositions for Peronospora resistance in spinach
WO2024220135A1 (en) 2023-04-17 2024-10-24 University Of Massachusetts Prime editing systems having pegrna with reduced auto-inhibitory interaction
IT202300007968A1 (it) 2023-04-21 2024-10-21 Fond Telethon Ets Metodi di editing genomico e costrutti
EP4697940A1 (en) 2023-04-21 2026-02-25 Vib Vzw Allelic combinations in crops for yield increase
WO2024226499A1 (en) 2023-04-24 2024-10-31 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods for modifying fertility
EP4703472A1 (en) 2023-04-26 2026-03-04 Eurus Therapeutics Inc. Non-natural polynucleotides for modification of target nucleotide sequence
CN121712899A (zh) * 2023-04-27 2026-03-20 伦斯勒理工学院 用于在真核细胞中准确插入dna序列的重组酶
EP4688814A1 (en) 2023-04-27 2026-02-11 University of Massachusetts Cas-embedded cytidine deaminase ribonucleoprotein complexes having improved base editing specificity and efficiency
WO2024233328A1 (en) * 2023-05-05 2024-11-14 Insmed Incorporated Nannochloropsis-producing viruses and methods and compositions for making the same
WO2024234006A1 (en) 2023-05-11 2024-11-14 Tome Biosciences, Inc. Systems, compositions, and methods for targeting liver sinusodial endothelial cells (lsecs)
EP4709860A1 (en) * 2023-05-11 2026-03-18 University of Massachusetts Compositions and methods for improved genome editing with nme2cas9 and nme2-smucas9 variants
AU2024270764A1 (en) 2023-05-15 2025-12-04 Nchroma Bio, Inc. Compositions and methods for epigenetic regulation of hbv gene expression
WO2024235991A1 (en) 2023-05-15 2024-11-21 UCB Biopharma SRL Rna-guided nucleases and nucleic acid targeting systems comprising such rna-guided nucleases
EP4713003A1 (en) 2023-05-17 2026-03-25 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Lipc variant in the treatment of hypercholesterolemia and atherosclerotic cardiovascular disease
WO2024238977A2 (en) 2023-05-18 2024-11-21 Children's Hospital Medical Center Liver organoids with intrahepatic sympathetic nerves, and methods of use thereof
EP4716741A2 (en) 2023-05-23 2026-04-01 Flagship Labs 114, Inc. Compositions and methods for reducing cxcl9, cxcl10, and cxcl11 gene expression
WO2024245951A1 (en) 2023-05-26 2024-12-05 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Combination of slc8a1 inhibitor and mitochondria-targeted antioxidant for treating melanoma
CN121773211A (zh) 2023-05-30 2026-03-31 哈皮西兹研发有限公司 通过抑制aip10/abap1调控网络基因改善农艺性状的植物
EP4719423A1 (en) 2023-05-30 2026-04-08 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Method and pharmaceutical composition for use in the treatment of focal cortical dysplasia
WO2024254376A1 (en) 2023-06-08 2024-12-12 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Animal model with rapid onset of alzheimer's amyloid beta plaque pathology
WO2024259135A1 (en) 2023-06-13 2024-12-19 Intellia Therapeutics, Inc. Assays for analysis of ribonucleic acid (rna) molecules
KR20260026049A (ko) 2023-06-15 2026-02-25 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. 청력 장애에 대한 유전자 치료
WO2024256635A1 (en) 2023-06-15 2024-12-19 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Dpm1 inhibitor for treating cancer
CN118475621A (zh) 2023-06-19 2024-08-09 杭州恩和生物科技有限公司 生产7-脱氢胆固醇的融合多肽及其使用方法
WO2024261302A1 (en) 2023-06-22 2024-12-26 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Nlrp3 inhibitors, pak1/2 inhibitors and/or caspase 1 inhibitors for use in the treatment of rac2 monogenic disorders
EP4731750A2 (en) 2023-06-23 2026-04-29 Children's Hospital Medical Center Methods of matrix-free suspension culture
WO2024261323A1 (en) 2023-06-23 2024-12-26 Astrazeneca Ab Molecular switches
WO2025003344A1 (en) 2023-06-28 2025-01-02 Alia Therapeutics Srl Type ii cas proteins and applications thereof
KR20260032927A (ko) 2023-06-30 2026-03-10 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 상동성 지향 복구를 증가시키는 방법 및 조성물
WO2025012316A2 (en) 2023-07-10 2025-01-16 Universiteit Gent Method of genome-editing
WO2025017030A1 (en) 2023-07-17 2025-01-23 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Prime editing of the -200 region in the hbg1 and/or hbg2 promoter for increasing fetal hemoglobin content in a eukaryotic cell
WO2025017033A1 (en) 2023-07-17 2025-01-23 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Prime editing of the -115 region in the hbg1 and/or hbg2 promoter for increasing fetal hemoglobin content in a eukaryotic cell
WO2025021839A1 (en) 2023-07-25 2025-01-30 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Method to treat metabolic disorders
WO2025022367A2 (en) 2023-07-27 2025-01-30 Life Edit Therapeutics, Inc. Rna-guided nucleases and active fragments and variants thereof and methods of use
IL326018A (en) 2023-07-28 2026-03-01 Regeneron Pharma Introduction of anti-TFR:GAA and anti-CD63:GAA for the treatment of Pompe disease
US20250049896A1 (en) 2023-07-28 2025-02-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-tfr:acid sphingomyelinase for treatment of acid sphingomyelinase deficiency
CN121693566A (zh) 2023-07-28 2026-03-17 瑞泽恩制药公司 使用bGH-SV40L串联PolyA在单向基因插入期间增强转基因表达
WO2025029840A1 (en) 2023-07-31 2025-02-06 Tune Therapeutics, Inc. Compositions and methods for multiplexed activation and repression of t cell gene expression
CN121909284A (zh) 2023-07-31 2026-04-21 图恩疗法股份有限公司 用于调节il-2基因表达的组合物和方法
WO2025027165A1 (en) 2023-08-01 2025-02-06 Basf Plant Science Company Gmbh Increased resistance by expression of an ics protein
CN121605117A (zh) 2023-08-01 2026-03-03 巴斯夫植物科学有限公司 通过表达msbp1蛋白增加抗性
WO2025030010A1 (en) 2023-08-01 2025-02-06 Vor Biopharma Inc. Compositions comprising genetically engineered hematopoietic stem cells and methods of use thereof
WO2025032112A1 (en) 2023-08-08 2025-02-13 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Methods for the treatment of type 2-mediated diseases
WO2025038494A1 (en) 2023-08-11 2025-02-20 Tune Therapeutics, Inc. Compositions, systems, and methods for lymphoid cell differentiation using targeted gene activation
WO2025038750A2 (en) 2023-08-14 2025-02-20 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for treating cancer
WO2025038948A2 (en) * 2023-08-16 2025-02-20 The Regents Of The University Of California Alpha-crystalline domain proteins and their use in genome modification
EP4512403A1 (en) 2023-08-22 2025-02-26 Friedrich-Schiller-Universität Jena Neuropeptide b and w-receptor as a target for treating mood disorders and/or chronic stress
WO2025049524A1 (en) 2023-08-28 2025-03-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Cxcr4 antibody-resistant modified receptors
AU2024335327A1 (en) 2023-09-01 2026-03-26 Renagade Therapeutics Management Inc. Gene editing systems, compositions, and methods for treatment of vexas syndrome
WO2025050069A1 (en) 2023-09-01 2025-03-06 Tome Biosciences, Inc. Programmable gene insertion using engineered integration enzymes
WO2025059073A1 (en) 2023-09-11 2025-03-20 Tune Therapeutics, Inc. Epigenetic editing methods and systems for differentiating stem cells
WO2025059215A1 (en) 2023-09-12 2025-03-20 Aadigen, Llc Methods and compositions for treating or preventing cancer
WO2025059184A1 (en) 2023-09-12 2025-03-20 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods and compositions for generating genome-edited paternal doubled haploids
WO2025064408A1 (en) 2023-09-18 2025-03-27 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods for treating cardiovascular disease
GB202314578D0 (en) 2023-09-22 2023-11-08 Univ Manchester Methods of producing homoplasmic modified plants or parts thereof
WO2025072803A1 (en) 2023-09-29 2025-04-03 Children's Hospital Medical Center Ntrk2 signaling-mediated alveolar capillary injury and repair
WO2025076141A1 (en) 2023-10-03 2025-04-10 Inari Agriculture Technology, Inc. Viral delivery of grna to the scion
WO2025076306A1 (en) 2023-10-06 2025-04-10 University Of Massachusetts Prime editors having improved prime editing efficiency
WO2025078851A1 (en) 2023-10-11 2025-04-17 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Methods of treating cognitive deficit
AU2024357861A1 (en) 2023-10-12 2026-04-23 Renagade Therapeutics Management Inc. Nickase-retron template-based precision editing system and methods of use
WO2025081123A1 (en) 2023-10-12 2025-04-17 Fred Hutchinson Cancer Center Methods and compositions for improving t cell immunotherapy
WO2025078632A1 (en) 2023-10-12 2025-04-17 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Methods of prognosis and treatment of patients suffering from cancer
WO2025083169A1 (en) 2023-10-17 2025-04-24 Tenpoint Therapeutics Limited Combination of a vegf inhibitor and a complement pathway inhibitor for treating ocular disorders
WO2025090427A1 (en) 2023-10-23 2025-05-01 University Of Rochester Glial-targeted relief of hyperexcitability in neurodegenerative diseases
WO2025096638A2 (en) 2023-10-30 2025-05-08 Turnstone Biologics Corp. Genetically modified tumor infilitrating lymphocytes and methods of producing and using the same
WO2025101820A1 (en) 2023-11-08 2025-05-15 Fred Hutchinson Cancer Center Compositions and methods for cellular immunotherapy
US20250161347A1 (en) 2023-11-22 2025-05-22 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Methods and compositions for treating non-alcoholic fatty liver disease
WO2025122754A1 (en) 2023-12-07 2025-06-12 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Gaa knockout non-human animals
WO2025132479A1 (en) 2023-12-18 2025-06-26 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Flt3 inhibitor for modulating macrophages polarization
WO2025137439A2 (en) 2023-12-20 2025-06-26 Intellia Therapeutics, Inc. Engineered t cells
WO2025155753A2 (en) 2024-01-17 2025-07-24 Renagade Therapeutics Management Inc. Improved gene editing system, guides, and methods
WO2025153608A1 (en) 2024-01-18 2025-07-24 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Wip1 inhibitor for the treatment of glomerular disease
WO2025158400A1 (en) 2024-01-24 2025-07-31 Yale University Compositions and methods of natural killer cell hyperboosts for enhancement of nk cell therapy
WO2025160324A2 (en) 2024-01-26 2025-07-31 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for using plasma cell depleting agents and/or b cell depleting agents to suppress host anti-aav antibody response and enable aav transduction and re-dosing
US20250242018A1 (en) 2024-01-26 2025-07-31 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Combination immunosuppression for inhibiting an immune response and enabling immunogen administration and re-administration
WO2025162980A1 (en) 2024-01-30 2025-08-07 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Methods for the treatment of breast cancer using a jnk-1 inhibitor
WO2025162985A1 (en) 2024-01-30 2025-08-07 Basf Plant Science Company Gmbh Increased plant disease resistance by expression of a glycine-rich protein
WO2025168705A1 (en) 2024-02-08 2025-08-14 Vib Vzw Means and methods for the production of saponins with endosomal escape-enhancing properties
WO2025171210A1 (en) 2024-02-09 2025-08-14 Arbor Biotechnologies, Inc. Compositions and methods for gene editing via homology-mediated end joining
WO2025174908A1 (en) 2024-02-12 2025-08-21 Life Edit Therapeutics, Inc. Novel rna-guided nucleases and proteins for polymerase editing
WO2025174765A1 (en) 2024-02-12 2025-08-21 Renagade Therapeutics Management Inc. Lipid nanoparticles comprising coding rna molecules for use in gene editing and as vaccines and therapeutic agents
WO2025184603A2 (en) 2024-03-01 2025-09-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. The use of cd40 inhibitors for inhibiting an immune response and enabling immunogen administration and re-administration
US20250276092A1 (en) 2024-03-01 2025-09-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for re-dosing aav using anti-cd40 antagonistic antibody to suppress host anti-aav antibody response
WO2025184759A1 (en) 2024-03-04 2025-09-12 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Maize plants comprising resistance to gray leaf spot and compositions and methods for selecting and producing the same
WO2025191018A1 (en) 2024-03-13 2025-09-18 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Mrgpre binding agent for use in the treatment of inflammatory and pain disorders
WO2025194019A1 (en) 2024-03-14 2025-09-18 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Methods for treating liver fibrosis and non-alcoholic fatty liver disease
WO2025202874A1 (en) 2024-03-25 2025-10-02 Crispr Therapeutics Ag Genetically modified cells expressing glp-1 receptor agonist
WO2025202473A1 (en) 2024-03-28 2025-10-02 Revvity Discovery Limited A nucleic acid deaminase, a base editor and uses thereof
WO2025210123A1 (en) 2024-04-03 2025-10-09 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Methods and pharmaceutical composition for treating cancers
WO2025212920A1 (en) 2024-04-03 2025-10-09 Children's Hospital Medical Center Multi-zonal liver organoids
WO2025217202A1 (en) 2024-04-08 2025-10-16 Children's Hospital Medical Center Bile duct organoid
WO2025217398A1 (en) 2024-04-10 2025-10-16 Lyell Immunopharma, Inc. Methods for culturing cells with improved culture medium
WO2025217503A1 (en) * 2024-04-12 2025-10-16 Georgetown University Assay for in-vivo characterization of genotoxicity
EP4677108A1 (en) 2024-04-22 2026-01-14 Basecamp Research Ltd Method and compositions for detecting off-target editing
WO2025224182A2 (en) 2024-04-23 2025-10-30 Basecamp Research Ltd Single construct platform for simultaneous delivery of gene editing machinery and nucleic acid cargo
WO2025226912A1 (en) * 2024-04-26 2025-10-30 Sri International Cell-type specific delivery of gene editors and methods of use thereof
WO2025224297A1 (en) 2024-04-26 2025-10-30 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Antibodies having specificity to tgfbi and uses thereof
WO2025224715A1 (en) 2024-04-26 2025-10-30 King Abdullah Univeristy Of Science And Technology Methods for improving precise genome modification and reducing unwanted mutations by crispr-cas editing
EP4643858A1 (en) 2024-04-29 2025-11-05 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Methods and pharmaceutical composition for the treatment of uterine disease
WO2025228998A1 (en) 2024-04-30 2025-11-06 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Use of hdac4 inhibitors for the treatment of melanoma
CN118127022B (zh) * 2024-04-30 2024-07-12 四川大学 变异链球菌环状RNA circcsbD及应用、其过表达菌株及构建方法和应用
WO2025235388A1 (en) 2024-05-06 2025-11-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Transgene genomic identification by nuclease-mediated long read sequencing
WO2025240947A1 (en) 2024-05-17 2025-11-20 University Of Massachusetts Therapeutic treatment for fragile x-associated disorder
WO2025245169A1 (en) 2024-05-21 2025-11-27 Fred Hutchinson Cancer Center Immunotherapy cells equipped with a collagen-targeting payload
WO2025245188A2 (en) 2024-05-21 2025-11-27 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Methods of treating liver steatosis and non-alcoholic fatty liver disease
WO2025247829A1 (en) 2024-05-27 2025-12-04 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Methods and pharmaceutical composition for treating prostate cancer
WO2025250454A1 (en) 2024-05-28 2025-12-04 University Of Rochester Adeno-associated viruses evolved to specifically target human glial progenitor cells in vivo
WO2025250495A1 (en) 2024-05-28 2025-12-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Acceleration of human hepatocyte engraftment in humanized liver animals by supplementing paracrine ligands or agonists that activate human liver regeneration signals
WO2025248102A1 (en) 2024-05-31 2025-12-04 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Tbk1 inhibitor for use in the treatment of vitiligo
WO2025257151A1 (en) 2024-06-10 2025-12-18 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Methods and pharmaceutical composition for treating ciliopathies
WO2025259669A1 (en) 2024-06-10 2025-12-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and systems for characterizing modified oligonucleotides
WO2025257212A1 (en) 2024-06-11 2025-12-18 Keygene N.V. Screening and regeneration of protoplast callus
WO2025260068A1 (en) 2024-06-14 2025-12-18 Tune Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle formulation for delivery of nucleic acids to cells
CN121160664B (zh) * 2024-06-17 2026-04-24 南京诺唯赞生物科技股份有限公司 Rna聚合酶变体
WO2025261741A1 (en) 2024-06-19 2025-12-26 Albert-Ludwigs-Universitaet Freiburg Koerperschaft Des Oeffentlichen Rechts Synthetic lethality to treat autosomal dominant polycystic kidney disease (adpkd)
EP4667628A1 (en) 2024-06-19 2025-12-24 Albert-Ludwigs-Universität Freiburg Körperschaft des öffentlichen Rechts Synthetic lethality to treat autosomal dominant polycystic kidney disease (adpkd)
WO2025265017A1 (en) 2024-06-20 2025-12-26 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Ass1 gene insertion for the treatment of citrullinemia type i
WO2026002934A1 (en) 2024-06-25 2026-01-02 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Combination of a slc16a1 inhibitor and a smad3 inhibitor for treating cancer
WO2026003754A1 (en) 2024-06-25 2026-01-02 Life Edit Therapeutics, Inc. Novel reverse transcriptases and uses thereof
WO2026006542A2 (en) 2024-06-26 2026-01-02 Yale University Compositions and methods for crispr/cas9 based reactivation of human angelman syndrome
WO2026006832A1 (en) 2024-06-28 2026-01-02 University Of Connecticut Gene modulation for treating cancer
WO2026012976A1 (en) 2024-07-08 2026-01-15 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Use of inhibitor of gasdermind for treatment of rac2 monogenic disorders
WO2026013071A1 (en) 2024-07-09 2026-01-15 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Setdb1 inhibitor for use in the treatment of uveal melanoma
WO2026015647A1 (en) 2024-07-09 2026-01-15 Tune Therapeutics, Inc. Compositions, systems, and methods for cell differentiation using targeted gene activation of dll4 and/or vcam1
WO2026015829A2 (en) 2024-07-12 2026-01-15 Arbor Biotechnologies, Inc. Small reverse transcriptases and gene editing systems comprising such
WO2026015832A2 (en) 2024-07-12 2026-01-15 Arbor Biotechnologies, Inc. Reverse transcriptases and gene editing systems comprising such
WO2026020120A1 (en) 2024-07-19 2026-01-22 University Of Massachusetts Increasing cas9 genome editing fidelity through attenuation of guide rna watson-crick base pairing potential
WO2026036000A1 (en) 2024-08-08 2026-02-12 Invaio Sciences, Inc. Nature-derived lipid particles for use in agriculture
US20260071285A1 (en) 2024-09-11 2026-03-12 Seminis Vegetable Seeds, Inc. Novel qtls conferring resistance to cucurbit aphid-borne yellow virus
WO2026057679A1 (en) 2024-09-11 2026-03-19 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Inhibitor of rab30 for use in a method of treatment of metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease (masld)
WO2026077659A1 (en) 2024-09-17 2026-04-16 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Enrichment of genetically modified hematopoietic stem cells through epigenome editing
WO2026064425A2 (en) 2024-09-17 2026-03-26 Dxome Co., Ltd. Mirror image crispr-cas compositions
WO2026064736A1 (en) 2024-09-23 2026-03-26 Carbon Biosciences, Inc. Parvovirus compositions and related methods for gene therapy
WO2026064753A1 (en) 2024-09-23 2026-03-26 Tune Therapeutics, Inc. Dna methyltransferase-like protein (dnmt3l) or dna methyltransferase 3a (dnmt3a) repressor systems for epigenetic editing
WO2026064739A1 (en) 2024-09-23 2026-03-26 Carbon Biosciences, Inc. Parvovirus compositions and related methods for gene therapy
WO2026072529A1 (en) 2024-09-24 2026-04-02 University Of Florida Research Foundation, Incorporated Mettl7a for improved embryo competence
WO2026069163A1 (en) 2024-09-25 2026-04-02 Crispr Therapeutics Ag Differentiation method for producing immature beta cells
WO2026080515A2 (en) 2024-10-08 2026-04-16 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Crispr sam biosensor cells and cell lines and methods of use thereof
WO2026083309A1 (en) 2024-10-17 2026-04-23 Astrazeneca Ab Use of inhibitors or modulators of artemis in gene editing
CN119867017B (zh) * 2025-01-13 2025-11-18 西南医科大学 一种同时检测果蝇采食量和排泄物面积的方法

Family Cites Families (212)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US106048A (en) 1870-08-02 Materials of different
DE1133825B (de) 1960-06-15 1962-07-26 Danfoss Ved Ing M Clausen Elektromagnetisches Relais
US3687808A (en) 1969-08-14 1972-08-29 Univ Leland Stanford Junior Synthetic polynucleotides
US4952496A (en) 1984-03-30 1990-08-28 Associated Universities, Inc. Cloning and expression of the gene for bacteriophage T7 RNA polymerase
US5034506A (en) 1985-03-15 1991-07-23 Anti-Gene Development Group Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages
WO1988008450A1 (en) 1987-05-01 1988-11-03 Birdwell Finlayson Gene therapy for metabolite disorders
US5350689A (en) 1987-05-20 1994-09-27 Ciba-Geigy Corporation Zea mays plants and transgenic Zea mays plants regenerated from protoplasts or protoplast-derived cells
US5585362A (en) 1989-08-22 1996-12-17 The Regents Of The University Of Michigan Adenovirus vectors for gene therapy
US5451513A (en) 1990-05-01 1995-09-19 The State University of New Jersey Rutgers Method for stably transforming plastids of multicellular plants
US5767367A (en) 1990-06-23 1998-06-16 Hoechst Aktiengesellschaft Zea mays (L.) with capability of long term, highly efficient plant regeneration including fertile transgenic maize plants having a heterologous gene, and their preparation
US5489677A (en) 1990-07-27 1996-02-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleoside linkages containing adjacent oxygen and nitrogen atoms
US5602240A (en) 1990-07-27 1997-02-11 Ciba Geigy Ag. Backbone modified oligonucleotide analogs
US5222982A (en) 1991-02-11 1993-06-29 Ommaya Ayub K Spinal fluid driven artificial organ
JPH06505186A (ja) 1991-02-11 1994-06-16 オマーヤ，アユブ　ケー． 脊髄液駆動式人工器官
US5539082A (en) 1993-04-26 1996-07-23 Nielsen; Peter E. Peptide nucleic acids
US5719262A (en) 1993-11-22 1998-02-17 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having amino acid side chains
US5714331A (en) 1991-05-24 1998-02-03 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having enhanced binding affinity, sequence specificity and solubility
DE69233013T2 (de) 1991-08-20 2004-03-04 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of National Institute Of Health, Office Of Technology Transfer Adenovirus vermittelter gentransfer in den gastrointestinaltrakt
US7150982B2 (en) 1991-09-09 2006-12-19 Third Wave Technologies, Inc. RNA detection assays
US5252479A (en) 1991-11-08 1993-10-12 Research Corporation Technologies, Inc. Safe vector for gene therapy
FR2688514A1 (fr) 1992-03-16 1993-09-17 Centre Nat Rech Scient Adenovirus recombinants defectifs exprimant des cytokines et medicaments antitumoraux les contenant.
US7153684B1 (en) 1992-10-08 2006-12-26 Vanderbilt University Pluripotential embryonic stem cells and methods of making same
EP1024198A3 (en) 1992-12-03 2002-05-29 Genzyme Corporation Pseudo-adenoviral vectors for the gene therapy of haemophiliae
EP0705344B8 (en) 1993-06-24 2006-05-10 Advec Inc. Adenovirus vectors for gene therapy
AU687117B2 (en) 1993-10-25 1998-02-19 Canji, Inc. Recombinant adenoviral vector and methods of use
US5576198A (en) 1993-12-14 1996-11-19 Calgene, Inc. Controlled expression of transgenic constructs in plant plastids
US5545817A (en) 1994-03-11 1996-08-13 Calgene, Inc. Enhanced expression in a plant plastid
US5545818A (en) 1994-03-11 1996-08-13 Calgene Inc. Expression of Bacillus thuringiensis cry proteins in plant plastids
US5843780A (en) 1995-01-20 1998-12-01 Wisconsin Alumni Research Foundation Primate embryonic stem cells
US6583336B1 (en) 1995-08-30 2003-06-24 Basf Plant Science Gmbh Stimulation of homologous recombination in eukaryotic organisms or cells by recombination promoting enzymes
DE69728793T2 (de) 1996-08-29 2004-09-23 Bausch & Lomb Surgical, Inc. Frequenz- und leistungsregelunganordnung mit doppelkreis
JP3756313B2 (ja) 1997-03-07 2006-03-15 武 今西 新規ビシクロヌクレオシド及びオリゴヌクレオチド類縁体
JP4236812B2 (ja) 1997-09-12 2009-03-11 エクシコン エ／エス オリゴヌクレオチド類似体
CA2307807C (en) 1997-10-23 2008-09-02 Andrea G. Bodnar Methods and materials for the growth of primate-derived primordial stem cells in feeder-free culture
US20040186071A1 (en) 1998-04-13 2004-09-23 Bennett C. Frank Antisense modulation of CD40 expression
US20020182673A1 (en) 1998-05-15 2002-12-05 Genentech, Inc. IL-17 homologous polypedies and therapeutic uses thereof
US6667176B1 (en) 2000-01-11 2003-12-23 Geron Corporation cDNA libraries reflecting gene expression during growth and differentiation of human pluripotent stem cells
US7410798B2 (en) 2001-01-10 2008-08-12 Geron Corporation Culture system for rapid expansion of human embryonic stem cells
US7078387B1 (en) 1998-12-28 2006-07-18 Arch Development Corp. Efficient and stable in vivo gene transfer to cardiomyocytes using recombinant adeno-associated virus vectors
CA2361191A1 (en) 1999-02-03 2000-08-10 The Children's Medical Center Corporation Gene repair involving the induction of double-stranded dna cleavage at a chromosomal target site
US7229961B2 (en) 1999-08-24 2007-06-12 Cellgate, Inc. Compositions and methods for enhancing drug delivery across and into ocular tissues
US6593292B1 (en) 1999-08-24 2003-07-15 Cellgate, Inc. Compositions and methods for enhancing drug delivery across and into epithelial tissues
EP1083231A1 (en) 1999-09-09 2001-03-14 Introgene B.V. Smooth muscle cell promoter and uses thereof
US7256286B2 (en) 1999-11-30 2007-08-14 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Bryostatin analogues, synthetic methods and uses
US20020119570A1 (en) 2000-09-25 2002-08-29 Kyonggeun Yoon Targeted gene correction by single-stranded oligodeoxynucleotides
CA2881568C (en) 2000-10-27 2019-09-24 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Nucleic acids and proteins from streptococcus groups a & b
DE60233137D1 (de) 2001-02-16 2009-09-10 Univ R Transporter mit beabstandeten arginin-teilchen
IL159756A0 (en) 2001-07-12 2004-06-20 Univ Massachusetts IN VIVO PRODUCTION OF SMALL INTERFERING RNAs THAT MEDIATE GENE SILENCING
US7169874B2 (en) 2001-11-02 2007-01-30 Bausch & Lomb Incorporated High refractive index polymeric siloxysilane compositions
US20060253913A1 (en) 2001-12-21 2006-11-09 Yue-Jin Huang Production of hSA-linked butyrylcholinesterases in transgenic mammals
WO2003087341A2 (en) 2002-01-23 2003-10-23 The University Of Utah Research Foundation Targeted chromosomal mutagenesis using zinc finger nucleases
WO2003080809A2 (en) 2002-03-21 2003-10-02 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for using zinc finger endonucleases to enhance homologous recombination
US7539579B2 (en) 2002-04-09 2009-05-26 Beattie Kenneth L Oligonucleotide probes for genosensor chips
EP2806025B1 (en) 2002-09-05 2019-04-03 California Institute of Technology Use of zinc finger nucleases to stimulate gene targeting
US20070134796A1 (en) 2005-07-26 2007-06-14 Sangamo Biosciences, Inc. Targeted integration and expression of exogenous nucleic acid sequences
US8053232B2 (en) 2004-01-23 2011-11-08 Virxsys Corporation Correction of alpha-1-antitrypsin genetic defects using spliceosome mediated RNA trans splicing
US7972854B2 (en) 2004-02-05 2011-07-05 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for targeted cleavage and recombination
US7919277B2 (en) 2004-04-28 2011-04-05 Danisco A/S Detection and typing of bacterial strains
US7892224B2 (en) 2005-06-01 2011-02-22 Brainlab Ag Inverse catheter planning
US7534819B2 (en) 2005-06-10 2009-05-19 University Of Washington Compositions and methods for intracellular delivery of biotinylated cargo
US10022457B2 (en) 2005-08-05 2018-07-17 Gholam A. Peyman Methods to regulate polarization and enhance function of cells
KR20080045141A (ko) 2005-08-24 2008-05-22 톰슨 라이센싱 지상 방송 수신기를 갖는 로우빙 디바이스용 팝 스크린다이얼로그를 위한 방법 및 장치
DK2341149T3 (en) 2005-08-26 2017-02-27 Dupont Nutrition Biosci Aps Use of CRISPR-associated genes (Cas)
US20090227032A1 (en) 2005-12-13 2009-09-10 Kyoto University Nuclear reprogramming factor and induced pluripotent stem cells
US8278104B2 (en) 2005-12-13 2012-10-02 Kyoto University Induced pluripotent stem cells produced with Oct3/4, Klf4 and Sox2
US8048999B2 (en) 2005-12-13 2011-11-01 Kyoto University Nuclear reprogramming factor
US9677123B2 (en) 2006-03-15 2017-06-13 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Degenerate nucleobase analogs
DK2019683T4 (da) 2006-04-25 2022-08-29 Univ California Indgivelse af vækstfaktorer til behandling af CNS-lidelser
WO2007128338A1 (en) 2006-05-10 2007-11-15 Deinove Process for chromosomal engineering using a novel dna repair system
DK2426220T3 (en) 2006-05-19 2016-09-26 Dupont Nutrition Biosci Aps Labeled microorganisms, and methods for labeling
ES2465996T3 (es) 2006-05-25 2014-06-09 Sangamo Biosciences, Inc. Métodos y composiciones para la inactivación genética
WO2007144770A2 (en) 2006-06-16 2007-12-21 Danisco A/S Bacterium
US8481272B2 (en) 2006-08-04 2013-07-09 Georgia State University Research Foundation, Inc. Enzyme sensors, methods for preparing and using such sensors, and methods of detecting protease activity
WO2008060360A2 (en) 2006-09-28 2008-05-22 Surmodics, Inc. Implantable medical device with apertures for delivery of bioactive agents
CN101688241B (zh) 2007-03-02 2015-01-21 杜邦营养生物科学有限公司 具有改善的噬菌体抗性的培养物
WO2008148304A1 (en) 2007-05-31 2008-12-11 Xiamen University Rna interference target for treating aids
JP2008307007A (ja) 2007-06-15 2008-12-25 Bayer Schering Pharma Ag 出生後のヒト組織由来未分化幹細胞から誘導したヒト多能性幹細胞
ES2638977T3 (es) * 2007-12-04 2017-10-24 Biogen Chesapeake Llc Formulaciones y procedimientos mejorados para liofilización y liofilizados obtenidos por los mismos
US9683232B2 (en) 2007-12-10 2017-06-20 Kyoto University Efficient method for nuclear reprogramming
WO2009097468A2 (en) 2008-01-29 2009-08-06 Kliman Gilbert H Drug delivery devices, kits and methods therefor
WO2010011961A2 (en) * 2008-07-25 2010-01-28 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Prokaryotic rnai-like system and methods of use
SG191561A1 (en) * 2008-08-22 2013-07-31 Sangamo Biosciences Inc Methods and compositions for targeted single-stranded cleavage and targeted integration
US8383604B2 (en) 2008-09-15 2013-02-26 Children's Medical Center Corporation Modulation of BCL11A for treatment of hemoglobinopathies
US20100076057A1 (en) * 2008-09-23 2010-03-25 Northwestern University TARGET DNA INTERFERENCE WITH crRNA
US9404098B2 (en) 2008-11-06 2016-08-02 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Method for cleaving a target RNA using a Cas6 polypeptide
US10662227B2 (en) 2008-11-07 2020-05-26 Dupont Nutrition Biosciences Aps Bifidobacteria CRISPR sequences
WO2010066907A1 (en) 2008-12-12 2010-06-17 Danisco A/S Genetic cluster of strains of streptococcus thermophilus having unique rheological properties for dairy fermentation
WO2010075424A2 (en) 2008-12-22 2010-07-01 The Regents Of University Of California Compositions and methods for downregulating prokaryotic genes
GB0823658D0 (en) 2008-12-30 2009-02-04 Angiomed Ag Stent delivery device
EP2206723A1 (en) 2009-01-12 2010-07-14 Bonas, Ulla Modular DNA-binding domains
WO2010117646A1 (en) 2009-04-09 2010-10-14 Motorola, Inc. Retransmission technique for a communication network
EP2419511B1 (en) 2009-04-09 2018-01-17 Sangamo Therapeutics, Inc. Targeted integration into stem cells
PL2424571T3 (pl) 2009-04-30 2020-10-19 Ospedale San Raffaele S.R.L Wektor genowy
EP2456877A4 (en) 2009-07-24 2012-05-30 Sigma Aldrich Co Llc METHOD OF GENOMIC PROCESSING
US20120192298A1 (en) 2009-07-24 2012-07-26 Sigma Aldrich Co. Llc Method for genome editing
CA2769262C (en) 2009-07-28 2019-04-30 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for treating trinucleotide repeat disorders
US8586526B2 (en) 2010-05-17 2013-11-19 Sangamo Biosciences, Inc. DNA-binding proteins and uses thereof
US20110104787A1 (en) 2009-11-05 2011-05-05 President And Fellows Of Harvard College Fusion Peptides That Bind to and Modify Target Nucleic Acid Sequences
US20110294114A1 (en) 2009-12-04 2011-12-01 Cincinnati Children's Hospital Medical Center Optimization of determinants for successful genetic correction of diseases, mediated by hematopoietic stem cells
WO2011072246A2 (en) 2009-12-10 2011-06-16 Regents Of The University Of Minnesota Tal effector-mediated dna modification
EP2660318A1 (en) 2010-02-09 2013-11-06 Sangamo BioSciences, Inc. Targeted genomic modification with partially single-stranded donor molecules
US10087431B2 (en) 2010-03-10 2018-10-02 The Regents Of The University Of California Methods of generating nucleic acid fragments
MX2012013037A (es) 2010-05-10 2013-07-29 Univ California Composiciones de endorribonucleasa y metodos de uso de las mismas.
US20140148361A1 (en) 2010-06-07 2014-05-29 Barry L. Stoddard Generation and Expression of Engineered I-ONUI Endonuclease and Its Homologues and Uses Thereof
US9512444B2 (en) 2010-07-23 2016-12-06 Sigma-Aldrich Co. Llc Genome editing using targeting endonucleases and single-stranded nucleic acids
DK2601611T3 (da) 2010-08-02 2021-02-01 Integrated Dna Tech Inc Fremgangsmåder til forudsigelse af stabilitet og smeltetemperaturer for nukleinsyreduplekser
CN103261213A (zh) 2010-10-20 2013-08-21 杜邦营养生物科学有限公司 乳球菌CRISPR-Cas序列
KR20120096395A (ko) 2011-02-22 2012-08-30 주식회사 툴젠 뉴클레아제에 의해 유전자 변형된 세포를 농축시키는 방법
WO2012164565A1 (en) 2011-06-01 2012-12-06 Yeda Research And Development Co. Ltd. Compositions and methods for downregulating prokaryotic genes
CA2848417C (en) 2011-09-21 2023-05-02 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for regulation of transgene expression
US8450107B1 (en) 2011-11-30 2013-05-28 The Broad Institute Inc. Nucleotide-specific recognition sequences for designer TAL effectors
US9046593B2 (en) 2011-12-15 2015-06-02 The Boeing Company Method and apparatus for detecting and classifying signals
GB201122458D0 (en) 2011-12-30 2012-02-08 Univ Wageningen Modified cascade ribonucleoproteins and uses thereof
US20150166969A1 (en) 2012-02-24 2015-06-18 Fred Hutchinson Cancer Research Center Compositions and methods for the treatment of hemoglobinopathies
WO2013130824A1 (en) 2012-02-29 2013-09-06 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for treating huntington's disease
WO2013141680A1 (en) 2012-03-20 2013-09-26 Vilnius University RNA-DIRECTED DNA CLEAVAGE BY THE Cas9-crRNA COMPLEX
US9637739B2 (en) 2012-03-20 2017-05-02 Vilnius University RNA-directed DNA cleavage by the Cas9-crRNA complex
AU2013204327B2 (en) 2012-04-20 2016-09-01 Aviagen Cell transfection method
CN104245940A (zh) 2012-04-23 2014-12-24 拜尔作物科学公司 植物中的靶向基因组工程
SG11201406547YA (en) 2012-04-25 2014-11-27 Regeneron Pharma Nuclease-mediated targeting with large targeting vectors
MX369788B (es) 2012-05-02 2019-11-21 Dow Agrosciences Llc Modificacion dirigida de deshidrogenasa de malato.
AU2013259647B2 (en) 2012-05-07 2018-11-08 Corteva Agriscience Llc Methods and compositions for nuclease-mediated targeted integration of transgenes
US11120889B2 (en) 2012-05-09 2021-09-14 Georgia Tech Research Corporation Method for synthesizing a nuclease with reduced off-site cleavage
AU2013266968B2 (en) * 2012-05-25 2017-06-29 Emmanuelle CHARPENTIER Methods and compositions for RNA-directed target DNA modification and for RNA-directed modulation of transcription
CA2876860A1 (en) 2012-05-30 2013-12-05 Baylor College Of Medicine Supercoiled minivectors as a tool for dna repair, alteration and replacement
WO2013188037A2 (en) 2012-06-11 2013-12-19 Agilent Technologies, Inc Method of adaptor-dimer subtraction using a crispr cas6 protein
CN104540382A (zh) 2012-06-12 2015-04-22 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 用于产生条件性敲除等位基因的方法和组合物
EP2674501A1 (en) 2012-06-14 2013-12-18 Agence nationale de sécurité sanitaire de l'alimentation,de l'environnement et du travail Method for detecting and identifying enterohemorrhagic Escherichia coli
WO2013188638A2 (en) 2012-06-15 2013-12-19 The Regents Of The University Of California Endoribonucleases and methods of use thereof
US20150225734A1 (en) 2012-06-19 2015-08-13 Regents Of The University Of Minnesota Gene targeting in plants using dna viruses
EP3196301B1 (en) 2012-07-11 2018-10-17 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for the treatment of monogenic diseases
JP6329537B2 (ja) 2012-07-11 2018-05-23 サンガモ セラピューティクス， インコーポレイテッド 生物学的薬剤の送達のための方法および組成物
AU2013293270B2 (en) 2012-07-25 2018-08-16 Massachusetts Institute Of Technology Inducible DNA binding proteins and genome perturbation tools and applications thereof
WO2014022702A2 (en) 2012-08-03 2014-02-06 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for controlling gene expression by rna processing
SG10201701601WA (en) 2012-08-29 2017-04-27 Sangamo Biosciences Inc Methods and compositions for treatment of a genetic condition
UA119135C2 (uk) 2012-09-07 2019-05-10 ДАУ АГРОСАЙЄНСІЗ ЕлЕлСі Спосіб отримання трансгенної рослини
UA118090C2 (uk) 2012-09-07 2018-11-26 ДАУ АГРОСАЙЄНСІЗ ЕлЕлСі Спосіб інтегрування послідовності нуклеїнової кислоти, що представляє інтерес, у ген fad2 у клітині сої та специфічний для локусу fad2 білок, що зв'язується, здатний індукувати спрямований розрив
US9914930B2 (en) 2012-09-07 2018-03-13 Dow Agrosciences Llc FAD3 performance loci and corresponding target site specific binding proteins capable of inducing targeted breaks
EP3789405A1 (en) 2012-10-12 2021-03-10 The General Hospital Corporation Transcription activator-like effector (tale) - lysine-specific demethylase 1 (lsd1) fusion proteins
AU2013335451C1 (en) 2012-10-23 2024-07-04 Toolgen Incorporated Composition for cleaving a target DNA comprising a guide RNA specific for the target DNA and Cas protein-encoding nucleic acid or Cas protein, and use thereof
AP2015008495A0 (en) 2012-10-30 2015-05-31 Ct For Aquaculture Technologies Inc Control of sexual maturation in animals
CA2890160A1 (en) 2012-10-31 2014-05-08 Cellectis Coupling herbicide resistance with targeted insertion of transgenes in plants
US20140127752A1 (en) 2012-11-07 2014-05-08 Zhaohui Zhou Method, composition, and reagent kit for targeted genomic enrichment
PL3360964T3 (pl) 2012-12-06 2020-03-31 Sigma-Aldrich Co. Llc Modyfikacja i regulacja genomu oparta na crispr
WO2014093479A1 (en) 2012-12-11 2014-06-19 Montana State University Crispr (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) rna-guided control of gene regulation
WO2014093655A2 (en) 2012-12-12 2014-06-19 The Broad Institute, Inc. Engineering and optimization of systems, methods and compositions for sequence manipulation with functional domains
US20140310830A1 (en) 2012-12-12 2014-10-16 Feng Zhang CRISPR-Cas Nickase Systems, Methods And Compositions For Sequence Manipulation in Eukaryotes
WO2014093709A1 (en) 2012-12-12 2014-06-19 The Broad Institute, Inc. Methods, models, systems, and apparatus for identifying target sequences for cas enzymes or crispr-cas systems for target sequences and conveying results thereof
US20140186843A1 (en) 2012-12-12 2014-07-03 Massachusetts Institute Of Technology Methods, systems, and apparatus for identifying target sequences for cas enzymes or crispr-cas systems for target sequences and conveying results thereof
EP2931899A1 (en) 2012-12-12 2015-10-21 The Broad Institute, Inc. Functional genomics using crispr-cas systems, compositions, methods, knock out libraries and applications thereof
EP3031921B1 (en) 2012-12-12 2025-03-12 The Broad Institute, Inc. Delivery, engineering and optimization of systems, methods and compositions for sequence manipulation and therapeutic applications
CN113355357B (zh) 2012-12-12 2024-12-03 布罗德研究所有限公司 对用于序列操纵的改进的系统、方法和酶组合物进行的工程化和优化
EP2840140B2 (en) 2012-12-12 2023-02-22 The Broad Institute, Inc. Crispr-Cas based method for mutation of prokaryotic cells
US8697359B1 (en) 2012-12-12 2014-04-15 The Broad Institute, Inc. CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products
IL239344B2 (en) 2012-12-12 2024-06-01 Broad Inst Inc Systems engineering, methods and optimal guiding components for sequence manipulation
AR093946A1 (es) 2012-12-13 2015-07-01 Dow Agrosciences Llc Un proceso mejorado para el aislamiento del acido 4-amino-3-cloro-6-(4-cloro-2-fluor-3-metoxi-fenil)piridina-2-carboxilico
CN105074061B (zh) 2012-12-13 2021-03-09 美国陶氏益农公司 位点特异性核酸酶活性的dna检测方法
US8939652B2 (en) 2012-12-13 2015-01-27 Us Synthetic Corporation Roller bearing apparatuses including compliant rolling elements, and related methods of manufacture
DK2931891T3 (da) 2012-12-17 2019-08-19 Harvard College Rna-styret modificering af menneskelige genomer
NL2010038C2 (en) 2012-12-21 2014-06-24 Koni Bv Shock absorber.
ES2953523T3 (es) 2012-12-27 2023-11-14 Keygene Nv Método para inducir una translocación dirigida en una planta
CA2898184A1 (en) 2013-01-16 2014-07-24 Emory University Cas9-nucleic acid complexes and uses related thereto
CN103233028B (zh) 2013-01-25 2015-05-13 南京徇齐生物技术有限公司 一种无物种限制无生物安全性问题的真核生物基因打靶方法及螺旋结构dna序列
WO2014127287A1 (en) 2013-02-14 2014-08-21 Massachusetts Institute Of Technology Method for in vivo tergated mutagenesis
MX384291B (es) 2013-02-20 2025-03-14 Regeneron Pharma Modificación genética de ratas.
US10227610B2 (en) 2013-02-25 2019-03-12 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for enhancing nuclease-mediated gene disruption
US20140273230A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Sigma-Aldrich Co., Llc Crispr-based genome modification and regulation
WO2014144155A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Regents Of The University Of Minnesota Engineering plant genomes using crispr/cas systems
US20140364333A1 (en) 2013-03-15 2014-12-11 President And Fellows Of Harvard College Methods for Live Imaging of Cells
US9234213B2 (en) 2013-03-15 2016-01-12 System Biosciences, Llc Compositions and methods directed to CRISPR/Cas genomic engineering systems
US10760064B2 (en) 2013-03-15 2020-09-01 The General Hospital Corporation RNA-guided targeting of genetic and epigenomic regulatory proteins to specific genomic loci
US11332719B2 (en) 2013-03-15 2022-05-17 The Broad Institute, Inc. Recombinant virus and preparations thereof
CN112301024A (zh) 2013-03-15 2021-02-02 通用医疗公司 使用RNA引导的FokI核酸酶(RFN)提高RNA引导的基因组编辑的特异性
EP4286517A3 (en) 2013-04-04 2024-03-13 President and Fellows of Harvard College Therapeutic uses of genome editing with crispr/cas systems
CN105263312A (zh) 2013-04-05 2016-01-20 美国陶氏益农公司 用于在植物基因组内整合外源序列的方法和组合物
DK3456831T3 (da) 2013-04-16 2021-09-06 Regeneron Pharma Målrettet modifikation af rottegenom
CN103224947B (zh) 2013-04-28 2015-06-10 陕西师范大学 一种基因打靶系统
EP2994531B1 (en) 2013-05-10 2018-03-28 Sangamo Therapeutics, Inc. Delivery methods and compositions for nuclease-mediated genome engineering
CA2913234A1 (en) 2013-05-22 2014-11-27 Northwestern University Rna-directed dna cleavage and gene editing by cas9 enzyme from neisseria meningitidis
WO2014191021A1 (en) 2013-05-28 2014-12-04 Telefonaktiebolaget L M Ericsson (Publ) Method, apparatus and computer program for updating a prioritization level of a service data flow based on traffic size per time unit of said data flow
US9873907B2 (en) 2013-05-29 2018-01-23 Agilent Technologies, Inc. Method for fragmenting genomic DNA using CAS9
US9267135B2 (en) 2013-06-04 2016-02-23 President And Fellows Of Harvard College RNA-guided transcriptional regulation
WO2014204724A1 (en) 2013-06-17 2014-12-24 The Broad Institute Inc. Delivery, engineering and optimization of tandem guide systems, methods and compositions for sequence manipulation
EP3725885A1 (en) 2013-06-17 2020-10-21 The Broad Institute, Inc. Functional genomics using crispr-cas systems, compositions methods, screens and applications thereof
CN105492611A (zh) 2013-06-17 2016-04-13 布罗德研究所有限公司 用于序列操纵的优化的crispr-cas双切口酶系统、方法以及组合物
CN105683379A (zh) 2013-06-17 2016-06-15 布罗德研究所有限公司 用于对有丝分裂后细胞的疾病和障碍进行靶向和建模的系统、方法和组合物的递送、工程化和优化
NL2010994C2 (en) 2013-06-17 2014-12-18 Fuji Seal Europe Bv Container sleeving method and device.
RU2716420C2 (ru) 2013-06-17 2020-03-11 Те Брод Инститьют Инк. Доставка и применение систем crispr-cas, векторов и композиций для целенаправленного воздействия и терапии в печени
MX374532B (es) 2013-06-17 2025-03-06 Broad Inst Inc Suministro, uso y aplicaciones terapéuticas de los sistemas y composiciones crispr-cas, para actuar sobre trastornos y enfermedades utilizando componentes víricos.
WO2014204723A1 (en) 2013-06-17 2014-12-24 The Broad Institute Inc. Oncogenic models based on delivery and use of the crispr-cas systems, vectors and compositions
CN103343120B (zh) 2013-07-04 2015-03-04 中国科学院遗传与发育生物学研究所 一种小麦基因组定点改造方法
EP3666892A1 (en) 2013-07-10 2020-06-17 President and Fellows of Harvard College Orthogonal cas9 proteins for rna-guided gene regulation and editing
US10421957B2 (en) 2013-07-29 2019-09-24 Agilent Technologies, Inc. DNA assembly using an RNA-programmable nickase
NZ746567A (en) 2013-11-04 2019-09-27 Dow Agrosciences Llc Optimal soybean loci
UY35812A (es) 2013-11-04 2015-05-29 Dow Agrosciences Llc ?loci de maíz óptimos?.
CN105980395A (zh) 2013-11-04 2016-09-28 美国陶氏益农公司 最优大豆座位
CN106459995B (zh) 2013-11-07 2020-02-21 爱迪塔斯医药有限公司 使用统治型gRNA的CRISPR相关方法和组合物
CA2930877A1 (en) 2013-11-18 2015-05-21 Crispr Therapeutics Ag Crispr-cas system materials and methods
US10787684B2 (en) 2013-11-19 2020-09-29 President And Fellows Of Harvard College Large gene excision and insertion
KR102170502B1 (ko) 2013-12-11 2020-10-28 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 게놈의 표적화된 변형을 위한 방법 및 조성물
EP3470089A1 (en) 2013-12-12 2019-04-17 The Broad Institute Inc. Delivery, use and therapeutic applications of the crispr-cas systems and compositions for targeting disorders and diseases using particle delivery components
US20150165054A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 President And Fellows Of Harvard College Methods for correcting caspase-9 point mutations
CA2935032C (en) 2013-12-26 2024-01-23 The General Hospital Corporation Multiplex guide rnas
US9850525B2 (en) 2014-01-29 2017-12-26 Agilent Technologies, Inc. CAS9-based isothermal method of detection of specific DNA sequence
US20150291969A1 (en) 2014-01-30 2015-10-15 Chromatin, Inc. Compositions for reduced lignin content in sorghum and improving cell wall digestibility, and methods of making the same
US20150225801A1 (en) 2014-02-11 2015-08-13 California Institute Of Technology Recording and mapping lineage information and molecular events in individual cells
WO2015127439A1 (en) 2014-02-24 2015-08-27 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for nuclease-mediated targeted integration
CN106459894B (zh) 2014-03-18 2020-02-18 桑格摩生物科学股份有限公司 用于调控锌指蛋白表达的方法和组合物
WO2015153789A1 (en) 2014-04-01 2015-10-08 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating herpes simplex virus type 1 (hsv-1)
DE102015226614A1 (de) 2015-12-23 2017-06-29 Robert Bosch Gmbh Verfahren zum Betreiben eines Kraftfahrzeugs, Steuerungseinheit für ein Antriebssystem und ein Antriebssystem
US10250380B2 (en) 2016-12-12 2019-04-02 Qualcomm Incorporated Techniques for unified synchronization channel design in new radio
US11352698B2 (en) 2019-04-25 2022-06-07 Samsung Electronics Co., Ltd. Atomic layer deposition apparatus and methods of fabricating semiconductor devices using the same

Also Published As

Publication number Publication date
US11473108B2 (en) 2022-10-18
CN107603976A (zh) 2018-01-19
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US10227611B2 (en) 2019-03-12
MX369077B (es) 2019-10-25
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US20190169648A1 (en) 2019-06-06
HRP20171163T1 (hr) 2017-10-06
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US10421980B2 (en) 2019-09-24
TN2014000493A1 (en) 2016-03-30
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US10428352B2 (en) 2019-10-01
US20210062224A1 (en) 2021-03-04
GB2537000A (en) 2016-10-05
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SI3241902T1 (en) 2018-07-31
US20190169642A1 (en) 2019-06-06
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DK3597749T5 (da) 2024-09-02
US20250122537A1 (en) 2025-04-17
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US20210230639A1 (en) 2021-07-29
US20220267808A1 (en) 2022-08-25
IL261563A (en) 2018-10-31
GB2518764A (en) 2015-04-01
JP6692856B2 (ja) 2020-05-13
GB2518764C (en) 2016-08-24
IL261570B (en) 2021-10-31
IL261567A (en) 2018-10-31
GB2537000C (en) 2019-10-09
US20220119846A1 (en) 2022-04-21
US20210340575A1 (en) 2021-11-04
US20190169641A1 (en) 2019-06-06
US20170166893A1 (en) 2017-06-15
AU2021200952A1 (en) 2021-03-04
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AU2013266968A1 (en) 2014-11-20
ES2636902T3 (es) 2017-10-10
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US10669560B2 (en) 2020-06-02
US20220119848A1 (en) 2022-04-21
PE20190842A1 (es) 2019-06-17
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US20190169645A1 (en) 2019-06-06
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US10676759B2 (en) 2020-06-09
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