RS66774B1 - Postupci i kompozicije za modifikaciju ciljane dnk upravljenu pomoću rnk i za modulaciju transkripcije upravljanu rnk - Google Patents

Postupci i kompozicije za modifikaciju ciljane dnk upravljenu pomoću rnk i za modulaciju transkripcije upravljanu rnk

Info

Publication number
RS66774B1
RS66774B1 RS20250443A RSP20250443A RS66774B1 RS 66774 B1 RS66774 B1 RS 66774B1 RS 20250443 A RS20250443 A RS 20250443A RS P20250443 A RSP20250443 A RS P20250443A RS 66774 B1 RS66774 B1 RS 66774B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
dna
rna
target
sequence
targeting
Prior art date
Application number
RS20250443A
Other languages
English (en)
Inventor
Emmanuelle Charpentier
Martin Jinek
Cate James Harrison Doudna
Wendell Lim
Lei Qi
Krzysztof Chylinski
Jennifer Doudna
Original Assignee
Univ California
Univ Wien
Emmanuelle Charpentier
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=49624232&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS66774(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Univ California, Univ Wien, Emmanuelle Charpentier filed Critical Univ California
Publication of RS66774B1 publication Critical patent/RS66774B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H6/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their botanic taxonomy
    • A01H6/46—Gramineae or Poaceae, e.g. ryegrass, rice, wheat or maize
    • A01H6/4684—Zea mays [maize]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/465—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1), e.g. lipases, ribonucleases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/746—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for lactic acid bacteria (Streptococcus; Lactococcus; Lactobacillus; Pediococcus; Enterococcus; Leuconostoc; Propionibacterium; Bifidobacterium; Sporolactobacillus)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases [RNase]; Deoxyribonucleases [DNase]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases [RNase]; Deoxyribonucleases [DNase]
    • C12N9/222—Clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPR]-associated [CAS] enzymes
    • C12N9/226—Class 2 CAS enzyme complex, e.g. single CAS protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • H—ELECTRICITY
    • H10—SEMICONDUCTOR DEVICES; ELECTRIC SOLID-STATE DEVICES NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • H10H—INORGANIC LIGHT-EMITTING SEMICONDUCTOR DEVICES HAVING POTENTIAL BARRIERS
    • H10H20/00—Individual inorganic light-emitting semiconductor devices having potential barriers, e.g. light-emitting diodes [LED]
    • H10H20/01—Manufacture or treatment
    • H10H20/011—Manufacture or treatment of bodies, e.g. forming semiconductor layers
    • H10H20/013—Manufacture or treatment of bodies, e.g. forming semiconductor layers having light-emitting regions comprising only Group III-V materials
    • H10H20/0137—Manufacture or treatment of bodies, e.g. forming semiconductor layers having light-emitting regions comprising only Group III-V materials the light-emitting regions comprising nitride materials
    • H—ELECTRICITY
    • H10—SEMICONDUCTOR DEVICES; ELECTRIC SOLID-STATE DEVICES NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • H10P—GENERIC PROCESSES OR APPARATUS FOR THE MANUFACTURE OR TREATMENT OF DEVICES COVERED BY CLASS H10
    • H10P14/00—Formation of materials, e.g. in the shape of layers or pillars
    • H10P14/20—Formation of materials, e.g. in the shape of layers or pillars of semiconductor materials
    • H—ELECTRICITY
    • H10—SEMICONDUCTOR DEVICES; ELECTRIC SOLID-STATE DEVICES NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • H10P—GENERIC PROCESSES OR APPARATUS FOR THE MANUFACTURE OR TREATMENT OF DEVICES COVERED BY CLASS H10
    • H10P14/00—Formation of materials, e.g. in the shape of layers or pillars
    • H10P14/60—Formation of materials, e.g. in the shape of layers or pillars of insulating materials
    • H10P14/65—Formation of materials, e.g. in the shape of layers or pillars of insulating materials characterised by treatments performed before or after the formation of the materials
    • H10P14/6502—Formation of materials, e.g. in the shape of layers or pillars of insulating materials characterised by treatments performed before or after the formation of the materials of treatments performed before formation of the materials
    • H10P14/6512—Formation of materials, e.g. in the shape of layers or pillars of insulating materials characterised by treatments performed before or after the formation of the materials of treatments performed before formation of the materials by exposure to a gas or vapour
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/71—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing domain for transcriptional activaation, e.g. VP16
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/85—Fusion polypeptide containing an RNA binding domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/13—Decoys
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering nucleic acids [NA]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/33—Chemical structure of the base
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C12N2310/3519—Fusion with another nucleic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/50—Physical structure
    • C12N2310/53—Physical structure partially self-complementary or closed
    • C12N2310/531—Stem-loop; Hairpin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/80—Vectors containing sites for inducing double-stranded breaks, e.g. meganuclease restriction sites
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/04—Phosphoric diester hydrolases (3.1.4)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)

Description

Opis
Osnova pronalaska
Oko 60% bakterija i 90% arheja poseduje CRISPR (skupljena, redovno raspoređena kratka palindromna ponavljanja)/CRISPR-povezane (Cas) sistemske sisteme kako bi se pružili otpornost na strane elemente DNK. CRISPR sistem tipa II iz Streptococcus pyogenes uključuje samo jedan gen koji kodira protein Cas9 i dve RNK - zrelu CRISPR RNK (crRNK) i delimično komplementarnu trans delujuću RNK (tracrRNK) - koje su neophodne i dovoljne za utišavanje stranih DNK vođeno sa RNK. Deltcheva (Nature 471, 2011) se odnosi na sazrevanje CRSPR RNK transkodiranom malom RNK i faktorom domaćina RNase III.
Poslednjih godina, projektovani enzimi nukleaze dizajnirani da ciljaju specifične DNK sekvence privukli su značajnu pažnju kao moćno oruđe za genetsku manipulaciju ćelija i celih organizama, omogućavajući ciljano brisanje, zamenu i popravku gena, kao i umetanje egzogenih sekvenci (transgena) u genom. Pojavile su se dve glavne tehnologije za projektovanje DNK nukleaza specifičnih za mesto, a obe su zasnovane na konstrukciji himernih enzima endonukleaze u kojima je domen nespecifične DNK endonukleaze spojen sa projektovanim domenom za vezivanje DNK. Međutim, ciljanje na svaki novi genomski lokus zahteva dizajn novog enzima nukleaze, što ove pristupe čini dugotrajnim i skupim. Pored toga, obe tehnologije pate od ograničene preciznosti, što može dovesti do nepredvidivih učinaka van cilja. WO 2011/072246 se odnosi na ciljanje gena sa nukleazama sličnim aktivatoru transkripcije.
Sistematsko ispitivanje genoma i genetsko reprogramiranje ćelija uključuje ciljanje skupova gena za ekspresiju ili represiju. Trenutno najčešći pristup za ciljanje proizvoljnih gena za regulaciju je korišćenje RNK interferencije (RNAi). Ovaj pristup ima ograničenja. Na primer, RNAi može pokazati značajne efekte van cilja i toksičnost.
Postoji potreba u oblasti za tehnologijom koja omogućava precizno ciljanje aktivnosti nukleaze (ili drugih proteinskih aktivnosti) na različite lokacije unutar ciljne DNK na način koji ne zahteva dizajn novog proteina za svaku novu ciljnu sekvencu. Pored toga, u predmetnoj oblasti postoji potreba za postupkom kontrole ekspresije gena sa minimalnim efektima van cilja.
Sažetak
Bilo kakvo pominjanje genetske modifikacije ćelija ne obuhvata modifikaciju zametne linije ljudskih bića. Kompozicije pronalaska ne sadrže ljudske zametne ćelije, ljudske embrione ili ljudske embrionalne zametne ćelije. Postupci pronalaska ne obuhvataju upotrebu ljudskih embriona zametnih ćelija ljudskih embriona.
Pronalazak obezbeđuje jednomolekulsku DNK ciljanu RNK koja se vezuje za modifikovani polipeptid usmeren na mesto i cilja pomenuti modifikovani polipeptid usmeren na mesto na određenu lokaciju unutar ciljne DNK, pri čemu pomenuta jednomolekulska DNK ciljana RNK sadrži:
a) segment koji cilja DNK koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja je komplementarna sekvenci u ciljnoj DNK, i
b) segment za vezivanje proteina koji stupa u interakciju sa navedenim polipeptidom za modifikovanje usmerenim na mesto koji je prirodna Cas9 endonukleaza, pri čemu segment koji se vezuje za protein sadrži dva komplementarna dela nukleotida koji se hibridizuju da bi formirali dupleks RNK (dsRNA) i
pri čemu pomenuta jednomolekulska DNK ciljana RNK, zajedno sa navedenim polipeptidom za modifikovanje usmerenom na mesto, koji je prirodna Cas9 endonukleaza, obezbeđuje mesto-specifično cepanje navedene ciljne DNK da bi se stvorio dvolančani prekid.
Pronalazak obezbeđuje jednomolekulsku DNK ciljanu RNK koja sadrži:
(i) segment koji cilja na DNK koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja je komplementarna ciljanoj sekvenci u ciljnoj DNK, i
(ii) segment koji se vezuje za protein koji je u interakciji sa Cas9 polipeptidom, naznačeno time što se segment koji se vezuje za protein sastoji od dva komplementarna dela nukleotida koji se hibridizuju da bi formirali dvolančani RNK (dsRNK) dupleks,
pri čemu navedena nukleotidna sekvenca koja je komplementarna sekvenci u navedenoj ciljnoj DNK ima najmanje oko 15 nukleotida.
Pronalazak obezbeđuje DNK polinukleotid koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira RNK ciljanu na DNK bilo koje od gornjih varijanti.
Pronalazak obezbeđuje rekombinantni ekspresioni vektor koji sadrži gornji DNK polinukleotid.
Pronalazak obezbeđuje RNK ciljanu na DNK koja sadrži:
(i) segment koji cilja na DNK koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja je komplementarna ciljanoj sekvenci u ciljnoj DNK, i
(ii) segment koji se vezuje za protein koji je u interakciji sa Cas9 polipeptidom, koji se nalazi u prirodi, naznačeno time, da se segment koji se vezuje za protein sastoji od dva komplementarna dela nukleotida koji se hibridizuju da bi formirali dvolančani RNK (dsRNK) dupleks
pri čemu RNK ciljana na DNK sadrži modifikacije nukleinske kiseline izabrane iz grupe koju čine modifikovane okosnice i modifikovane internukleozidne veze, mimetike nukleinske kiseline, modifikovane delove šećera, modifikacije i supstitucije baze i konjugati.
Pronalazak obezbeđuje kompleks koji se formira od
(i) jednomolekulske DNK koja cilja RNK bilo kog od gornjih oblika ili RNK ciljanu na DNK bilo kog od gore navedenih oblika, i
(ii) polipeptida za modifikovanje koji je usmeren na mesto koji je prirodna Cas9 endonukleaza.
Pronalazak obezbeđuje kompoziciju koja sadrži:
(i) jednomolekulske DNK koja cilja RNK bilo kog od gornjih oblika ili RNK ciljanu na DNK bilo kog od gore navedenih oblika, i
(ii) polipeptida za modifikovanje koji je usmeren na mesto koji je prirodna Cas9 endonukleaza.
Predmetno obelodanjivanje obezbeđuje DNK ciljanu RNK koja sadrži ciljanu sekvencu i, zajedno sa modifikujućim polipeptidom, obezbeđuje modifikaciju specifičnu za mesto ciljne DNK i/ili polipeptida povezanog sa ciljnom DNK. Obezbeđene su i kompozicije.
Karakteristike predmetnog obelodanjivanja uključuju RNK ciljanu na DNK koja sadrži: (i) prvi segment koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja je komplementarna sekvenci u ciljnoj DNK; i (ii) drugi segment koji je u interakciji sa polipeptidom za modifikovanje usmerenim na mesto. U nekim slučajevima, prvi segment se sastoji od 8 nukleotida koji imaju 100% komplementarnost sa sekvencom u ciljnoj DNK. U nekim slučajevima, drugi segment sadrži nukleotidnu sekvencu sa najmanje 60% identičnosti u nizu od najmanje 8 uzastopnih nukleotida sa bilo kojom od sekvenci nukleotida navedenih u SEQ ID NO: 431-682 (npr. 431-562) . U nekim slučajevima, drugi segment sadrži nukleotidnu sekvencu sa najmanje 60% identičnosti preko dela od najmanje 8 susednih nukleotida do bilo koje od sekvenci nukleotida navedenih u SEQ ID NO: 563-682. U nekim slučajevima, polipeptid za modifikovanje usmeren na mesto sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje oko 75% identičnosti aminokiselinske sekvence sa aminokiselinama 7-166 ili 731-1003 aminokiselinske sekvence Cas9/Csn1 prikazane na Slici 3, ili odgovarajuće delove u bilo kojoj od sekvenci aminokiselina navedenih kao SEQ ID NO: 1-256 i 795-1346.
Karakteristike predmetnog obelodanjivanja uključuju DNK polinukleotid koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira RNK koja cilja na DNK. U nekim slučajevima, rekombinantni ekspresioni vektor sadrži DNK polinukleotid. U nekim slučajevima, nukleotidna sekvenca koja kodira RNK koja cilja DNK je operativno povezana sa promoterom. U nekim slučajevima, promoter je inducirani promoter. U nekim slučajevima, nukleotidna sekvenca koja kodira RNK ciljanu na DNK dalje sadrži mesto za višestruko kloniranje.
Karakteristike predmetnog obelodanjivanja uključuju rekombinantni ekspresioni vektor koji sadrži: (i) nukleotidnu sekvencu koja kodira RNK koja cilja na DNK, naznačeno time što RNK koja cilja na DNK sadrži: (a) prvi segment koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja je komplementarna sekvenci u ciljnoj DNK; i (b) drugi segment koji je u interakciji sa polipeptidom za modifikovanje usmerenim na mesto; i (ii) nukleotidnu sekvencu koja kodira modifikovani polipeptid usmeren na mesto, a koji sadrži: (a) deo koji se vezuje za RNK koji je u interakciji sa RNK koja cilja na DNK; i (b) deo aktivnosti koji pokazuje enzimsku aktivnost usmerenu na mesto, naznačeno time što je mesto enzimske aktivnosti određeno RNK koja cilja na DNK.
Karakteristike predmetnog obelodanjivanja uključuju kompoziciju koja sadrži: (i) RNK koja cilja na DNK, pri čemu RNK koji cilja na DNK sadrži: (a) prvi segment koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja je komplementarna sekvenci u ciljnoj DNK; i (b) drugi segment koji je u interakciji sa polipeptidom za modifikovanje usmerenim na mesto; i (ii) modifikujući polipeptid usmeren na mesto, pri čemu polipeptid za modifikovanje usmeren na mesto sadrži: (a) deo koji se vezuje za RNK koji je u interakciji sa RNK koja cilja na DNK; i (b) deo aktivnosti koji pokazuje enzimsku aktivnost usmerenu na mesto, pri čemu je mesto enzimske aktivnosti određeno RNK koja cilja na DNK i gde je polipeptid usmeren na modifikovanje mesta prirodno prisutna Cas9 endonukleaza. U nekim slučajevima, prvi segment RNK ciljane na DNK se sastoji od 8 nukleotida koji imaju najmanje 100% komplementarnosti sa sekvencom u ciljnoj DNK. U nekim slučajevima, drugi segment RNK ciljane na DNK sadrži nukleotidnu sekvencu sa najmanje 60% identičnosti u nizu od najmanje 8 uzastopnih nukleotida sa bilo kojom od nukleotidnih sekvenci navedenih u SEQ ID NO: 431-682 (npr. SEQ ID NO:563-682). U nekim slučajevima, drugi segment RNK ciljane na DNK sadrži nukleotidnu sekvencu sa najmanje 60% identičnosti preko dela od najmanje 8 susednih nukleotida do bilo koje od nukleotidnih sekvenci navedenih u SEQ ID NO: 431-562. Enzimska aktivnost modifikuje ciljnu DNK. Enzimska aktivnost je aktivnost nukleaze. U nekim slučajevima, RNK koja cilja na DNK je RNK koja cilja na DNK sa dvostrukim molekulom i kompozicija sadrži i ciljnu RNK i aktivatorsku RNK, čiji su segmenti koji formiraju dupleks komplementarni i hibridizuju se da bi formirali drugi segment RNK koja cilja na DNK. U nekim slučajevima, segment koji formira dupleks aktivatorske RNK sadrži nukleotidnu sekvencu sa najmanje 60% identičnosti u nizu od najmanje 8 uzastopnih nukleotida do bilo koje od nukleotidnih sekvenci navedenih u SEQ ID NO:SEQ ID NO:431-682.
Kratak opis crteža
Slike 1A-B daju šematski crtež dve primerne RNK ciljane na DNK, od kojih je svaka povezana sa polipeptidom usmerenim na modifikovanje i sa ciljnom DNK.
Slika 2 prikazuje uređivanje ciljne DNK putem dvolančanih prekida DNK uvedenih korišćenjem polipeptida za modifikovanje usmerenog ka Cas9/Csn1 mestu i RNK ciljane na DNK.
Slike 3A-B prikazuju sekvencu aminokiselina Cas9/Csn1 proteina iz Streptococcus pyogenes (SEQ ID NO:8). Cas9 ima domene homologne i HNH i RuvC endonukleazama. (A) Motivi 1-4 su precrtani (B) Domeni 1 i 2 su precrtani.
Slike 4A-B prikazuju procenat identičnosti između Cas9/Csn1 proteina iz više vrsta. (A) Identičnost sekvence u odnosu na Streptococcus pyogenes. Na primer, domen 1 su aminokiseline 7-166, a domen 2 su aminokiseline 731-1003 Cas9/Csn1 iz Streptococcus pyogenes kao što je prikazano na Slici 3B. (B) Identičnost sekvence u odnosu na Neisseria meningitidis. Na primer, domen 1 je aminokiselina 13-139, a domen 2 je aminokiselina 475-750 Cas9/Csn1 iz Neisseria meningitidis (SEQ ID NO:79).
Slika 5 prikazuje višestruko poravnanje sekvenci motiva 1-4 proteina Cas9/Csn1 iz raznih različitih vrsta odabranih iz filogenetske tabele na Slici 32 (videti Sliku 32, sliku 3A i Tabelu 1) (Streptococcus pyogenes (SEQ ID NO:8), Legionella pneumophila (SEQ ID NO: 17), Gamma proteobacterium (SEQ ID NO: 107), Listeria innocua (SEQ ID NO: 3), Lactobacillus gasseri (SEQ ID NO: 152), Eubacterium rectale (SEQ ID NO: 99), Staphilococcus lugdunensis (SEQ ID NO: 185), Mycoplasma synoviae (SEQ ID NO: 22), Mycoplasma mobile (SEQ ID NO: 16), Wolinella succinogenes (SEQ ID NO: 10), Flavobacterium columnare (SEQ ID NO: 235), Fibrobacter succinoges (SEQ ID NO: 121), Bacteroides fragilis (SEQ ID NO: 21), Acidothermus cellulolyticus (SEQ ID NO:42) i Bifidobacterium dentium (SEQ ID NO: 131).
Slike 6A-B daju poravnanja prirodnih sekvenci tracrRNK („aktivatorska RNK“) iz različitih vrsta (L. innocua (SEQ ID NO:268); S. pyogenes (SEQ ID NO: 267); S. mutans (SEQ ID NO: 269); S. thermophilus1 (SEQ ID NO: 270); M. mobile (SEQ ID NO: 274); N. meningitides (SEQ ID NO: 272); P. multocida (SEQ ID NO:273); S. thermophilus2 (SEQ ID NO:271); i S. pyogenes (SEQ ID NO: 267). (A) višestruko poravnanje sekvenci odabranih tracrRNK ortologa (AlignX, VectorNTI paket, Invitrogen) povezanih sa CRISPR/Cas lokusima slične arhitekture i veoma sličnim Cas9/Csn1 sekvencama. Crne kutije predstavljaju zajedničke nukleotide (B) višestruko poravnanje sekvenci odabranih tracrRNK ortologa (AlignX, VectorNTI paket, Invitrogen) povezanih sa CRISPR/Cas lokusima različite arhitekture i nebliskim Cas9/Csn1 sekvencama. Obratite pažnju na sličnost sekvenci ortologa N. meningitidisa i P. multocida tracrRNK. Crne kutije predstavljaju zajedničke nukleotide. Za više primera sekvenci aktivatorske RNK, videti SEQ ID NO:431-562.
Slike 7A-B daju poravnanja segmenata koji formiraju duplekse crRNK („ciljna RNK“) sekvenci koji se prirodno pojavljuju (L. innocua (SEQ ID NO://); S. pyogenes (SEQ ID NO://); S. mutans (SEQ ID NO://); S. thermophilus1 (SEQ ID NO://); C. jejuni (SEQ ID NO://); S. pyogenes (SEQ ID NO://); F. novicida (SEQ ID NO://); M. mobile (SEQ ID NO://); N. meningitides (SEQ ID NO://); P. multocida (SEQ ID NO://); i S. thermophilus2 (SEQ ID NO://); (A) višestruka poravnanja sekvenci primernog segmenta ciljne RNK sekvence koji formira dupleks (AlignX, VectorNTI paket, Invitrogen) povezanih sa lokusima slične arhitekture i veoma sličnim Cas9/Csn1 sekvencama. (B) višestruka poravnanja sekvenci primernog segmenta ciljne RNK sekvence koji formira dupleks (AlignX, VectorNTI paket, Invitrogen) povezanih sa lokusima različite arhitekture i različitim Cas9 sekvencama. Crne kutije predstavljaju zajedničke nukleotide. Za više primera sekvenci ciljne RNK segmenata koji formiraju dupleks, videti SEQ ID NO: 563-679.
Slika 8 daje šemu hibridizacije za prirodno prisutne segmente crRNK koji formiraju dupleks („ciljna RNK“) sa segmentom koji formira dupleks odgovarajućeg tracrRNK ortologa („aktivatorska RNK“). Gornja sekvenca, ciljna RNK; niža sekvenca, segment koji formira dupleks odgovarajućeg aktivatorskog RNK. CRISPR lokusi pripadaju sistemu CRISPR/Cas tipa II (Nmeni/CASS4).
Nomenklatura je prema bazi podataka CRISPR (CRISPR DB). S. pyogenes (SEQ ID NO:// i //); S. mutans (SEQ ID NO:// i //); S. thermophilus1 (SEQ ID NO:// i //); S. thermophilus2 (SEQ ID NO:// i //); L. innocua (SEQ ID NO:// i //); T. denticola (SEQ ID NO:// i //); N. meningitides (SEQ ID NO:// i //); S. gordonii (SEQ ID NO:// i //); B. bifidum (SEQ ID NO:// i //); L. salivarius (SEQ ID NO:// i //); F. tularensis (SEQ ID NO:// i //); i L. pneumophila (SEQ ID NO:// i //). Imajte na umu da neke vrste sadrže svaka dva lokusa tipa II CRISPR. Za više primera sekvenci aktivatorske RNK, videti SEQ ID NO:431-562. Za više primera sekvenci ciljne RNK segmenata koji formiraju dupleks, videti SEQ ID NO: 563-679.
Slika 9 prikazuje primere sekvenci tracrRNK (aktivatorska RNK) i crRNK (ciljna RNK) iz dve vrste. Postoji određeni stepen zamenljivosti; na primer, protein S.pyogenes Cas9/Csn1 je funkcionalan sa tracrRNK i crRNK izvedenom iz L.innocua. (|) označava kanonski Votson-Krik bazni par dok (•) označava GU nestabilni bazni par. „Varijabla 20nt“ ili „20nt“ predstavlja segment koji cilja DNK koji je komplementaran ciljnoj DNK (ovaj region može biti dužine do oko 100nt). Takođe je prikazan dizajn RNK sa jednim molekulom koji cilja na DNK koji uključuje karakteristike ciljne RNK i aktivatorske RNK. (Cas9/Csn1 sekvence proteina iz širokog spektra vrsta prikazane su na Slici 3 i navedene kao SEQ ID NO: 1-256 i 795-1346) Streptococcus pyogenes: od vrha do dna: (SEQ ID NO://, //, //); Listeria innocua: od vrha do dna: (SEQ ID NO://, //, //). Navedene sekvence su neograničavajući primeri i imaju za cilj da ilustruju kako RNK sa jednim molekulom koji ciljaju DNK i RNK sa dva molekula DNK mogu biti dizajnirani na osnovu prirodno postojećih sekvenci iz širokog spektra vrsta. Različiti primeri pogodnih sekvenci iz širokog spektra vrsta su navedeni u nastavku (Cas9 protein: SEQ ID NO: 1-259; tracrRNK: SEQ ID NO: 431-562, ili njihovi komplementi; crRNK: SEQ ID NO: 563-679, ili njihovi komplementi; i primer RNK koje ciljaju jednu molekulu DNK: SEQ ID NO:680-682).
Slike 10A-E pokazuju da je Cas9 DNK endonukleaza vođena sa dva RNK molekula. Slika E (od vrha do dna, SEQ ID NO: 278-280, i //).
Slike 11A-B pokazuju da Cas9 koristi dva domena nukleaze za brazdanje dva lanca u ciljnoj DNK.
Slike 12A-E ilustruju da brazdanje ciljne DNK katalizovano Cas9 zahteva aktivirajući domen u tracrRNK i da je regulisano sekvencom semena u crRNK. Slika 12C (od vrha do dna, SEQ ID NO: 278-280, i //); Slika 12D (od vrha do dna, SEQ ID NO: 281-290); i Slika 12E (od vrha do dna, SEQ ID NO: 291-292, 283, 293-298).
Slike 13A-C pokazuju da je PAM neophodan za licenciranje brazdanja ciljne DNK kompleksom Cas9-tracrRNK:crRNK.
Slike 14A-C ilustruju da se Cas9 može programirati korišćenjem jednog projektovanog RNK molekula koji kombinuje karakteristike tracrRNK i crRNK. Chimera A (SEQ ID NO:299); Chimera B (SEQ ID NO:300).
Slika 15 prikazuje CRISPR/Cas imuni put posredovan sa RNK tipa II.
Slike 16A-B prikazuju prečišćavanje Cas9 nukleaza.
Slike 17A-C pokazuju da Cas9 vođen dual-tracrRNK:crRNK brazda plazmid protospacera i oligonukleotidnu DNK. Slika 17B (od vrha do dna, SEQ ID NO: 301-303, i //); i Slika 17C (od vrha do dna, SEQ ID NO: 304-306, i //).
Slike 18A-B pokazuju da je Cas9 endonukleaza zavisna od Mg2+ sa aktivnošću 3'-5' egzonukleaze.
Slike 19A-C ilustruju da je brazdanje dual-tracrRNK:crRNK usmereno Cas9 ciljne DNK specifično za mesto. Slika 19C (od vrha do dna, SEQ ID NO: 307-309, //, 337-339 i //).
Slike 20A-B pokazuju da je dual-tracrRNK:crRNK usmereno Cas9 brazdanje ciljne DNK brzo i efikasno.
Slike 21A-B pokazuju da domeni Cas9 slični HNH i RuvC direktno brazdaju komplementarni i nekomplementarni DNK lanac, respektivno.
Slika 22 pokazuje da je tracrRNK potrebna za prepoznavanje ciljne DNK.
Slike 23A-B pokazuju da je minimalni region tracrRNK sposoban da vodi dualtracrRNK: crRNK usmereno cepanje ciljne DNK.
Slike 24A-D pokazuju da dual-tracrRNK:crRNK vođeno brazdanje ciljne DNK pomoću Cas9 može biti specifično za vrstu.
Slike 25A-C pokazuju da sekvenca semena u crRNK upravlja dvostrukim tracrRNK:crRNK usmerenim brazdanjem ciljne DNK pomoću Cas9. Slika 25A: ciljna DNK sonda 1 (SEQ ID NO: 310); spacer 4 crRNK (1-42) (SEQ ID NO:311); tracrRNK (15-89) (SEQ ID NO://). Slika 25B levi panel (SEQ ID NO:310).
Slike 26A-C pokazuju da je PAM sekvenca neophodna za brazdanje DNK plazmida protospacera pomoću Cas9-tracrRNK:crRNK i za interferenciju DNK plazmida posredovanu Cas9 u bakterijskim ćelijama. Slika 26B (od vrha do dna, SEQ ID NO:312-314); i Slika 26C (od vrha do dna, SEQ ID NO: 315-320).
Slike 27A-C pokazuju da Cas9 vođen jednom himernom RNK koja oponaša dvostruku tracrRNK:crRNK brazda DNK protospacera. Slika 27C (od vrha do dna, SEQ ID NO: 321-324).
Slike 28A-D prikazuju de novo dizajn himernih RNK koje ciljaju na sekvencu gena Green Fluorescent Protein (GFP). Slika 28B (od vrha do dna, SEQ ID NO:325-326). Slika 28C GFP1 ciljna sekvenca (SEQ ID NO:327); GFP2 ciljna sekvenca (SEQ ID NO:328); GFP3 ciljna sekvenca (SEQ ID NO:329); GFP4 target sequence (SEQ ID NO:330); GFP5 target sequence (SEQ ID NO:331); GFP1 himerna RNK (SEQ ID NO:332); GFP2 himerna RNK (SEQ ID NO: 333); GFP3 himerna RNK (SEQ ID NO: 334); GFP4 himerna RNA (SEQ ID NO:335); GFP5 himerna RNA (SEQ ID NO:336).
Slike 29A-E pokazuju da ko-ekspresija Cas9 i vodeće RNK u ljudskim ćelijama generiše dvolančane prekide DNK na ciljnom lokusu. Slika 29C (od vrha do dna, SEQ ID NO: 425-428).
Slike 30A-B pokazuju da ćelijski lizati sadrže aktivnu Cas9:sgRNK i podržavaju brazdanje DNK specifično za mesto.
Slike 31A-B pokazuju da 3' ekstenzija sgRNK konstrukata pojačava mutagenezu posredovanu NHEJ-om, specifičnu za mesto. Slika 31A (od vrha do dna, SEQ ID NO: 428-430).
Slike 32A-B prikazuju filogenetsko stablo reprezentativnih Cas9 sekvenci iz različitih organizama (A) kao i Cas9 lokusne arhitekture za glavne grupe stabla (B).
Slike 33A-E prikazuju arhitekturu tipa II CRISPR-Cas od odabranih vrsta bakterija.
Slike 34A-B prikazuju ko-procesiranje tracrRNK i pre-crRNK u odabranim sistemima tipa II CRISPR Cas. Slika 34A (od vrha do dna, SEQ ID NO://,//,//,//,//,//,//,//); Slika 34B (od vrha do dna, SEQ ID NO://,//,//,//).
Slika 35 prikazuje poravnanje sekvenci tracrRNK ortologa što demonstrira raznolikost sekvenci tracrRNK.
Slike 36A-F prikazuju ekspresiju bakterijskih tracrRNK ortologa i crRNK otkrivene dubokim sekvenciranjem RNK.
Na slikama 37A-O su navedeni svi ortolozi tracrRNK i zrele crRNK dobijeni sekvenciranjem za proučavane bakterijske vrste, uključujući koordinate (područje od interesa) i odgovarajuće sekvence cDNK (5' do 3').
Slike 38 A-B predstavljaju tabelu bakterijskih vrsta koje sadrže lokuse tipa II CRISPR-Cas koje karakteriše prisustvo signaturnog gena cas9. Ove sekvence su korišćene za filogenetsku analizu.
Slike 39A-B pokazuju da veštačke sekvence koje dele otprilike 50% identičnosti sa prirodnim tracrRNK i crRNK mogu da funkcionišu sa Cas9 da brazdaju ciljnu DNK sve dok je struktura domena za vezivanje proteina RNK koja cilja DNK očuvana.
Definicije deo
Izrazi „polinukleotid“ i „nukleinska kiselina“, koji se ovde koriste naizmenično, odnose se na polimerni oblik nukleotida bilo koje dužine, bilo ribonukleotida ili deoksiribonukleotida. Dakle, ovaj termin uključuje, ali nije ograničen na, jedno-, dvo- ili višelančanu DNK ili RNK, genomsku DNK, cDNK, DNK-RNK hibride ili polimer koji sadrži purinske i pirimidinske baze ili druge prirodne, hemijski ili biohemijski modifikovane, neprirodne ili derivatizovane nukleotidne baze. „Oligonukleotid“ se generalno odnosi na polinukleotide od oko 5 do oko 100 nukleotida jednolančane ili dvolančane DNK. Međutim, za potrebe ovog obelodanjivanja, ne postoji gornja granica dužine oligonukleotida.
Oligonukleotidi koji su takođe poznati kao „oligomeri“ ili „oligosi“ i mogu biti izolovani iz gena, ili hemijski sintetisani postupcima poznatim u predmetnoj oblasti. Trebalo bi razumeti da termini „polinukleotid“ i „nukleinska kiselina“ uključuju, kako je primenljivo na otelotvorenja koja se opisuju, jednolančane (kao što je sense ili antisense) i dvolančane polinukleotide.
„Struktura matične petlje“ odnosi se na nukleinsku kiselinu koja ima sekundarnu strukturu koja uključuje područje nukleotida za koje je poznato ili se predviđa da formiraju dvostruki lanac (deo koraka) koji je na jednoj strani povezan područjem pretežno jednolančanih nukleotida (deo petlje). Izrazi „ukosnica“ i „preklopna“ struktura se takođe koriste ovde kada se govori o strukturi u obliku petlje. Takve strukture su dobro poznate u predmetnoj oblasti i ovi termini se koriste u skladu sa njihovim poznatim značenjima u predmetnoj oblasti. Kao što je poznato u predmetnoj oblasti, struktura matične petlje ne zahteva tačno uparivanje baza. Dakle, petlja može uključivati jedno ili više nepodudaranja baza.
Alternativno, uparivanje baza može biti tačno, tj. da ne uključuje nikakve nepodudarnosti.
Pod „hibridizirajućim“ ili „komplementarnim“ ili „suštinski komplementarnim“ podrazumeva se da nukleinska kiselina (npr. RNK) sadrži sekvencu nukleotida koja joj omogućava da se nekovalentno vezuje, odnosno formira Votson-Krik bazne parove i/ili G/ U bazne parove, „žari“ ili „hibridizuje“ sa drugom nukleinskom kiselinom na specifičan za sekvencu, antiparalelan način (tj. nukleinska kiselina se specifično vezuje za komplementarnu nukleinsku kiselinu) pod odgovarajućim in vitro i/ili in vivo uslovima temperature i jonske snage rastvora. Kao što je poznato u predmetnoj oblasti, standardno Votson-Krikovo uparivanje baza uključuje: uparivanje adenina (A) sa timidinom (T), uparivanje adenina (A) sa uracilom (U) i uparivanje gvanina (G) sa citozinom (C) [ DNK, RNK]. Pored toga, u predmetnoj oblasti je takođe poznato da za hibridizaciju između dva molekula RNK (npr. dsRNK), gvanin (G) se bazno pari sa uracilom (U). Na primer, G/U bazno uparivanje je delimično odgovorno za degeneraciju (tj. redundantnost) genetskog koda u kontekstu tRNK antikodonskog baznog uparivanja sa kodonima u mRNK. U kontekstu ovog obelodanjivanja, gvanin (G) segmenta koji se vezuje za protein (dsRNK dupleks) predmetnog DNK ciljanog RNK molekula se smatra komplementarnim uracilu (U), i obrnuto. Kao takav, kada se G/U bazni par može napraviti na datom nukleotidnom položaju segmenta koji se vezuje za protein (dsRNK dupleks) predmetne DNK ciljane RNK molekule, pozicija se ne smatra nekomplementarnom, već je umesto toga se smatra komplementarnom.
Uslovi hibridizacije i pranja su dobro poznati i prikazani u Sambrook, J., Fritsch, E. F. i Maniatis, T. Molecular Cloning: Laboratorijski priručnik, drugo izdanje, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (1989), posebno poglavlje 11 i tabela 11.1 u njemu; i Sambrook, J. and Russell, W., Molecular Cloning: Laboratorijski priručnik, treće izdanje, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (2001). Uslovi temperature i jonske jačine određuju „strogost“ hibridizacije.
Hibridizacija zahteva da dve nukleinske kiseline sadrže komplementarne sekvence, iako su nepoklapanja između baza moguća. Uslovi odgovarajući za hibridizaciju između dve nukleinske kiseline zavise od dužine nukleinskih kiselina i stepena komplementarnosti, varijabli koje su dobro poznate u predmetnoj oblasti. Što je veći stepen komplementacije između dve nukleotidne sekvence, veća je vrednost temperature topljenja (Tm) za hibride nukleinskih kiselina koji imaju te sekvence. Za hibridizacije između nukleinskih kiselina sa kratkim delovima komplementarnosti (npr. komplementarnost preko 35 ili manje, 30 ili manje, 25 ili manje, 22 ili manje, 20 ili manje, ili 18 ili manje nukleotida) pozicija nepoklapanja postaje važna (videti Sambrook i sar., supra, 11.7-11.8). Tipično, dužina nukleinske kiseline koja se može hibridizovati je najmanje oko 10 nukleotida. Ilustrativne minimalne dužine za nukleinsku kiselinu koja se može hibridizovati su: najmanje oko 15 nukleotida; najmanje oko 20 nukleotida; najmanje oko 22 nukleotida; najmanje oko 25 nukleotida; i najmanje oko 30 nukleotida). Dalje, stručnjak u predmetnoj oblasti će prepoznati da se temperatura i koncentracija soli u rastvoru za pranje mogu podesiti prema potrebi prema faktorima kao što su dužina područja komplementarnosti i stepen komplementacije.
Podrazumeva se u predmetnoj oblasti da sekvenca polinukleotida ne mora da bude 100% komplementarna sekvenci njegove ciljne nukleinske kiseline da bi se mogla specifično hibridizovati ili hibridizovati. Štaviše, polinukleotid može da se hibridizuje preko jednog ili više segmenata tako da umešani ili susedni segmenti nisu uključeni u događaj hibridizacije (npr. struktura petlje ili struktura ukosnice). Polinukleotid može da sadrži najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 99% ili 100% komplementarnosti sekvence sa ciljnim područjem unutar ciljne sekvence nukleinske kiseline na koju su ciljani. Na primer, antisense nukleinska kiselina u kojoj je 18 od 20 nukleotida antisense jedinjenja komplementarno ciljnom području, i stoga bi se specifično hibridizovala, predstavljala bi 90 procenata komplementarnosti. U ovom primeru, preostali nekomplementarni nukleotidi mogu biti grupisani ili ispresecani komplementarnim nukleotidima i ne moraju da budu povezani jedan sa drugim ili sa komplementarnim nukleotidima. Procenat komplementarnosti između određenih delova sekvenci nukleinskih kiselina unutar nukleinskih kiselina može se rutinski odrediti korišćenjem BLAST programa (osnovni alati za pretragu lokalnog poravnanja) i PowerBLAST programa poznatih u predmetnoj oblasti (Altschul i sar., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403-410; Zhang and Madden, Genome Res., 1997, 7, 649-656) ili korišćenjem programa Gap (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wis.), koristeći podrazumevana podešavanja, koja koriste Smith i Waterman algoritam (Adv. Appl. Math., 1981, 2, 482-489).
Termini „peptid“, „polipeptid“ i „protein“ se ovde koriste naizmenično i odnose se na polimerni oblik amino kiselina bilo koje dužine, koji može uključivati kodirane i nekodirane amino kiseline, hemijski ili biohemijski modifikovane ili derivatizovane aminokiseline i polipeptide koji imaju modifikovane peptidne okosnice.
„Vezivanje“ kako se ovde koristi (npr. u vezi sa domenom polipeptida koji se vezuje za RNK) odnosi se na nekovalentnu interakciju između makromolekula (npr. između proteina i nukleinske kiseline). Dok su u stanju nekovalentne interakcije, za makromolekule se kaže da su „povezani“ ili „u interakciji“ ili „se vezuju“ (npr. kada se kaže da molekul X reaguje sa molekulom Y, misli se da se molekul X vezuje na molekul Y na nekovalentan način). Ne moraju sve komponente vezujuće interakcije biti specifične za sekvencu (npr. kontakti sa talogom fosfata u kičmi DNK), ali neki delovi interakcije vezivanja mogu biti specifični za sekvencu. Interakcije vezivanja se generalno karakterišu konstantom disocijacije (Kd) manjom od 10<-6>M, manje od 10<-7>M, manje od 10<-8>M, manje od 10<-9>M, manje od 10<-10>M, manje od 10<-11>M, manje od 10<-12>M, manje od 10<-11>M, manje od 10<-14>M ili manje od 10<-15>M. „Afinitet“ se odnosi na jačinu vezivanja, povećani afinitet vezivanja je u korelaciji sa nižim Kd.
Pod „domenom vezivanja“ podrazumeva se proteinski domen koji je u stanju da se nekovalentno vezuje za drugi molekul. Vezujući domen se može vezati za, na primer, molekul DNK (protein koji vezuje DNK), molekul RNK (protein koji vezuje RNK) i/ili proteinski molekul (protein koji vezuje protein). U slučaju proteina koji vezuje domen proteina, on može da se veže za sebe (da formira homodimere, homotrimere, itd.) i/ili može da se veže za jedan ili više molekula drugog proteina ili proteina.
Termin „konzervativna supstitucija aminokiselina“ odnosi se na zamenljivost u proteinima aminokiselinskih taloga koji imaju slične bočne lance. Na primer, grupa amino kiselina koje imaju alifatične bočne lance sastoji se od glicina, alanina, valina, leucina i izoleucina; grupa amino kiselina koje imaju alifatičko-hidroksilne bočne lance sastoji se od serina i treonina; grupa aminokiselina sa bočnim lancima koji sadrže amid koji se sastoji od asparagina i glutamina; grupa aminokiselina sa aromatičnim bočnim lancima sastoji se od fenilalanina, tirozina i triptofana; grupa aminokiselina sa baznim bočnim lancima sastoji se od lizina, arginina i histidina; grupa aminokiselina sa kiselim bočnim lancima sastoji se od glutamata i aspartata; a grupa amino kiselina koje imaju bočne lance koji sadrže sumpor čine cistein i metionin. Primeri konzervativnih supstitucionih grupa amino kiselina su: valin-leucin-izoleucin, fenilalanin-tirozin, lizin-arginin, alanin-valin i asparagin-glutamin.
Polinukleotid ili polipeptid ima određeni procenat „identičnosti sekvence“ sa drugim polinukleotidom ili polipeptidom, što znači da je, kada su poređani, taj procenat baza ili aminokiselina isti, i u istom relativnom položaju, kada se uporede dve sekvence. Identičnost sekvence se može odrediti na više različitih načina. Da bi se utvrdila identičnost sekvence, sekvence se mogu poravnati korišćenjem različitih postupaka i kompjuterskih programa (npr. BLAST, T-COFFEE, MUSCLE, MAFFT, itd.), dostupnih na internetu na veb lokacijama uključujući ncbi.nlm.nili.gov/BLAST, ebi.ac.uk/Tools/msa/tcoffee/, ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/, mafft.cbrc.jp/alignment/software/. Videti, npr., Altschul i sar. (1990), J. Mol. Bioi.215:403-10.
DNK sekvenca koja „kodira“ određenu RNK je sekvenca DNK nukleinske kiseline koja se transkribuje u RNK. DNK polinukleotid može da kodira RNK (mRNK) koja je prevedena u protein, ili DNK polinukleotid može da kodira RNK koja nije prevedena u protein (npr. tRNK, rRNK ili RNK koja cilja na DNK; takođe nazvana „nekodirajuća“ RNK ili „ncRNK“).
„Sekvenca kodiranja proteina“ ili sekvenca koja kodira određeni protein ili polipeptid je sekvenca nukleinske kiseline koja se transkribuje u mRNK (u slučaju DNK) i prevodi se (u slučaju mRNK) u polipeptid in vitro ili in vivo kada se stavi pod kontrolu odgovarajućih regulatornih sekvenci. Granice kodirajuće sekvence određene su početnim kodonom na 5' terminusu (N-terminus) i translacionim kodonom za prekidanje besmisla na 3' terminusu (C-terminus). Sekvenca kodiranja može uključivati, ali nije ograničena na, cDNK iz prokariotske ili eukariotske mRNK, sekvence genomske DNK iz prokariotske ili eukariotske DNK, i sintetičke nukleinske kiseline. Sekvenca terminacije transkripcije obično se nalazi 3' od sekvence kodiranja.
Kako se ovde koristi, „promotorska sekvenca“ je DNK regulatorno područje sposobno da veže RNK polimerazu i započne transkripciju nizvodne (3' smer) kodirajuće ili nekodirajuće sekvence. Za potrebe definisanja predmetnog pronalaska, promotorska sekvenca je ograničena na svom 3' terminusu mestom inicijacije transkripcije i proteže se uzvodno (smer 5') da bi uključila minimalni broj baza ili elemenata neophodnih za iniciranje transkripcije na nivoima koji se mogu detektovati iznad pozadine. Unutar promotorske sekvence će se naći mesto inicijacije transkripcije, kao i domeni za vezivanje proteina odgovorni za vezivanje RNK polimeraze. Eukariotski promoteri će često, ali ne uvek, sadržati „TATA“ kutije i „CAT“ kutije. Različiti promoteri, uključujući inducibilne promotere, mogu se koristiti za pokretanje različitih vektora predmetnog pronalaska.
Promoter može biti konstitutivno aktivan promoter (tj. promoter koji je konstitutivno u aktivnom/„ON“ stanju), može biti inducibilni promoter (tj. promoter čije je stanje aktivno/„ON“ ili neaktivno/„OFF“ ", kontroliše se spoljnim stimulusom, npr. prisustvom određene temperature, jedinjenja ili proteina.), može biti prostorno ograničen promoter (tj. element za kontrolu transkripcije, pojačivač, itd.) (npr.
tkivno specifičan promoter), promotor specifičan za ćelijski tip, itd.), a može biti i vremenski ograničen promoter (tj. promoter je u „ON“ stanju ili „OFF“ stanju tokom određenih faza embrionalnog razvoja ili tokom specifičnih faza biološkog procesa, npr. ciklus folikula dlake kod miševa).
Pogodni promoteri mogu biti izvedeni iz virusa i stoga se mogu nazvati virusnim promoterima, ili mogu biti izvedeni iz bilo kog organizma, uključujući prokariotske ili eukariotske organizme. Pogodni promoteri se mogu koristiti za pokretanje ekspresije bilo kojom RNK polimerazom (npr. pol I, pol II, pol III).
Primeri promotera uključuju, ali nisu ograničeni na SV40 rani promoter, promotor dugog terminalnog ponavljanja (LTR) virusa tumora dojke miša; adenovirus glavni kasni promoter (Ad MLP); promoter virusa herpes simpleks (HSV), promoter citomegalovirusa (CMV) kao što je područje neposrednog ranog promotera CMV (CMVIE), promoter virusa sarkoma Rous (RSV), ljudski U6 mali nuklearni promoter (U6) (Miyagishi et al, Nature Biotechnology 20, 497 - 500 (2002)), poboljšani promotor U6 (npr. Xia i sar., Nucleic Acids Res.2003 Sep 1;31(17)), ljudski H1 promoter (H1) i slično.
Primeri inducibilnih promotera uključuju, ali nisu ograničeni na, promoter T7 RNK polimeraze, promoter T3 RNK polimeraze, promoter regulisan izopropil-beta-D-tiogalaktopiranozidom (IPTG), promoter izazvan laktozom, promoter toplotnog šoka, promoter regulisan tetraciklinom, steroidom regulisan promoter, promoer regulisan metalom, promoter regulisan receptorom estrogena, itd. Inducibilni promoteri se stoga mogu regulisati molekulima uključujući, ali bez ograničenja na, doksiciklin; RNK polimeraze, npr., T7 RNK polimeraze; receptor estrogena; fuzija receptora estrogena; itd.
U nekim otelotvorenjima, promoter je prostorno ograničen promoter (tj. promoter specifičan za ćelijski tip, promoter specifičan za tkivo, itd.) tako da je u višećelijskom organizmu promoter aktivan (tj. „ON“) u podskupu specifične ćelije. Prostorno ograničeni promoteri se takođe mogu nazvati pojačivači, elementi kontrole transkripcije, kontrolne sekvence, itd. Može se koristiti bilo koji pogodan prostorno ograničen promoter i izbor odgovarajućeg promotera (npr. promoter specifičan za mozak, promoter koji pokreće ekspresiju u podskupu neurona, promoter koji pokreće ekspresiju u zametnoj liniji, promoter koji pokreće ekspresiju u plućima, promoter koji pokreće ekspresiju u mišićima, promoter koji pokreće ekspresiju u ćelijama ostrvcima pankreasa, itd.) zavisiće od organizma. Na primer, poznati su različiti prostorno ograničeni promoteri za biljke, muhe, crve, sisare, miševe, itd. Stoga, prostorno ograničen promoter može da se koristi za regulisanje ekspresije nukleinske kiseline koja kodira predmetni polipeptid usmeren na modifikovanje na mestu kod raznih problema i ćelijskih tipova, u zavisnosti od organizma. Neki prostorno ograničeni promoteri su takođe vremenski ograničeni tako da je promoter u „ON“ stanju ili „OFF“ stanju tokom specifičnih faza embrionalnog razvoja ili tokom specifičnih faza biološkog procesa (npr. ciklus folikula dlake kod miševa).
U svrhu ilustracije, primeri prostorno ograničenih promotera uključuju, ali nisu ograničeni na, promotere specifične za neurone, promotere specifične za adipocite, promotere specifične za kardiomiocite, promotere specifične za glatke mišiće, promotere specifične za fotoreceptor, itd. promoteri uključuju, ali nisu ograničeni na, promoter enolaze specifične za neuron (NSE) (videti, npr., EMBL HSENO2, X51956); promoter dekarboksilaze aromatične amino kiseline (AADC); promoter neurofilamenta (videti, npr., GenBank HUMNFL, L04147); promotor sinapsina (videti, npr. GenBank HUMSYNIB, M55301); thy-1 promoter (videti, npr., Chen i sar. (1987) Cell 51:7-19; i Llewellyn, i sar. (2010) Nat. Med.
16(10):1161-1166); promoter receptora serotonina (videti, npr. GenBank S62283); promotor tirozin hidroksilaze (TH) (videti, npr., Oh i sar. (2009) Gene Ther 16:437; Sasaoka i sar. (1992) Mol. Brain Res.16:274; Boundy i sar. (1998) J. Neurosci.18:9989; i Kaneda i sar. (1991) Neuron 6:583-594); GnRH promoter (videti, npr., Radovick i sar. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:3402-3406); L7 promoter (videti, npr., Oberdick i sar. (1990) Science 248:223-226); DNMT promoter (videti, npr., Bartge i sar. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:3648-3652); enkefalin promoter (videti, npr., Comb i sar. (1988) EMBO J.17:3793-3805); promotor bazičnog proteina mijelina (MBP); Ca2+-kalmodulin-zavisni promotor protein kinaze II-alfa (CamKIIα) (videti, npr., Mayford i sar. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:13250; i Casanova i sar. (2001) Genesis 31:37); CMV pojačivač/promotor faktora rasta-β izveden iz trombocita (videti, npr. Liu i sar. (2004) Gene Therapy 11:52-60); i slično.
Prostorno ograničeni promoteri specifični za adipocite uključuju, ali nisu ograničeni na promoter/pojačivač aP2 gena, npr. region od -5,4 kb do 21 bp ljudskog aP2 gena (videti, npr., Tozzo i sar. (1997) Endocrinol.138:1604; Ross i sar. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:9590; i Pavjani i sar. (2005) Nat. Med.
11:797); promotor transportera glukoze-4 (GLUT4) (videti, npr., Knight i sar.
(2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:14725); promoter translokaze masnih kiselina (FAT/CD36) (videti, npr. Kuriki i sar. (2002) Biol. Pharm. Bull.25:1476; i Sato i sar. (2002) J. Biol. Chem.277:15703); promotor stearoil-CoA desaturaze-1 (SCD1) (Tabor i sar. (1999) J. Biol. Chem.274:20603); promoter leptina (videti, npr., Mason i sar. (1998) Endocrinol.139:1013; i Chen i sar. (1999) Biochem. Biophys. Res. Comm.262:187); promoter adiponektina (videti, npr. Kita i sar.
(2005) Biochem. Biophys. Res. Comm.331:484; i Chakrabarti (2010) Endocrinol.
151:2408); promotor adipsina (videti, npr., Platt i sar. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:7490); promoter rezistina (videti, npr., Seo i sar. (2003) Molec. Endocrinol.
17:1522); i slično.
Prostorno ograničeni promoteri specifični za kardiomiocite uključuju, ali nisu ograničeni na kontrolne sekvence izvedene iz sledećih gena: laki lanac miozina-2, teški lanac α-miozina, AE3, srčani troponin C, srčani aktin i
slično. Franz i sar. (1997) Cardiovasc. Res.35:560-566; Robbins i sar. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci.752:492-505; Linn i sar. (1995) Circ. Res.76:584-591; Parmacek i sar. (1994) Mol. Cell. Biol.14:1870-1885; Hunter i sar. (1993) Hypertension 22:608-617; i Sartorelli i sar. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4047-4051.
Prostorno ograničeni promoteri specifični za glatke mišiće uključuju, ali nisu ograničeni na SM22α promoter (videti, npr., Akyürek i sar. (2000) Mol. Med.
6:983; i US patent br.7,169,874); promoter smoothelina (videti, npr., WO 2001/018048); promotor aktina α-glatkih mišića; i slično. Na primer, pokazalo se da područje od 0,4 kb SM22α promotora, unutar kojeg leže dva CArG elementa, posreduje u ekspresiji vaskularnih glatkih mišića specifičnoj za ćelije (videti, npr.
Kim, i sar. (1997) Mol. Cell. Biol.17, 2266-2278; Li, i sar., (1996) J. Cell Biol.132, 849-859; i Moessler, i sar. (1996) Development 122, 2415-2425).
Prostorno ograničeni promoteri specifični za fotoreceptor uključuju, ali nisu ograničeni na, promotor rodopsina; promotor rodopsin kinaze (Young i sar. (2003) Ophthalmol. Vis. Sci.44:4076); promotor gena beta fosfodiesteraze (Nicoud i sar. (2007) J. Gene Med.9:1015); promoter gena retinitis pigmentosa (Nicoud i sar. (2007) supra); pojačivač gena za interfotoreceptorski retinoidvezujući protein (IRBP) (Nicoud i sar. (2007) supra); promotor gena IRBP (Yokoyama i sar. (1992) Exp Eye Res.55:225); i slično.
Termini „regulatorne sekvence DNK“, „kontrolni elementi“ i „regulatorni elementi“, koji se ovde koriste naizmenično, odnose se na transkripcione i translacione kontrolne sekvence, kao što su promoteri, pojačivači, signali poliadenilacije, terminatori, signali degradacije proteina i slično, koji obezbeđuju i/ili regulišu transkripciju nekodirajuće sekvence (npr. RNK koja cilja na DNK) ili kodirajuće sekvence (npr. modifikovani polipeptid usmeren na mesto, ili polipeptid Cas9/Csn1) i/ili regulišu translaciju kodiranog polipeptida.
Izraz „prirodno prisutan“ ili „nemodifikovan“ kako se ovde koristi u primeni na nukleinsku kiselinu, polipeptid, ćeliju ili organizam, odnosi se na nukleinsku kiselinu, polipeptid, ćeliju ili organizam koji se nalazi u prirodi. Na primer, polipeptidna ili polinukleotidna sekvenca koja je prisutna u organizmu (uključujući viruse) koja se može izolovati iz izvora u prirodi i koju čovek nije namerno modifikovao u laboratoriji, prirodno se javlja.
Termin „himerni“ kako se ovde koristi u primeni na nukleinsku kiselinu ili polipeptid odnosi se na dve komponente koje su definisane strukturama izvedenim iz različitih izvora. Na primer, naznačeno time što se „himerni“ koristi u kontekstu himernog polipeptida (npr. himernog Cas9/Csn1 proteina), himerni polipeptid uključuje sekvence amino kiselina koje su izvedene iz različitih polipeptida.
Himerni polipeptid može da sadrži ili modifikovane ili prirodno prisutne polipeptidne sekvence (npr. prvu amino kiselinsku sekvencu iz modifikovanog ili nemodifikovanog Cas9/Csn1 proteina; i drugu sekvencu aminokiselina koja nije Cas9/Csn1 protein). Slično, „himerno“ u kontekstu polinukleotida koji kodira himerni polipeptid uključuje nukleotidne sekvence izvedene iz različitih kodirajućih područja (npr., prva nukleotidna sekvenca koja kodira modifikovani ili nemodifikovani Cas9/Csn1 protein; i drugu nukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid koji nije Cas9/Csn1 protein).
Termin „himerni polipeptid“ se odnosi na polipeptid koji je napravljen kombinacijom (tj. „fuzijom“) dva inače odvojena segmenta amino sekvence, obično uz pomoć ljudske intervencije. Polipeptid koji sadrži himernu amino kiselinsku sekvencu je himerni polipeptid. Neki himerni polipeptidi se mogu nazvati „varijantama fuzije“.
„Heterologan“, kako se ovde koristi, označava nukleotidnu ili polipeptidnu sekvencu koja se ne nalazi u nativnoj nukleinskoj kiselini ili proteinu, respektivno. Na primer, u himernom Cas9/Csn1 proteinu, domen koji se vezuje za RNK prirodnog bakterijskog Cas9/Csn1 polipeptida (ili njegove varijante) može biti fuzionisan sa heterolognom polipeptidnom sekvencom (tj. polipeptidnom sekvencom iz proteina koji nije Cas9/Csn1 ili polipeptidnom sekvencom iz drugog organizma). Heterologna polipeptidna sekvenca može da pokaže aktivnost (npr. enzimsku aktivnost) koju će takođe ispoljiti himerni Cas9/Csn1 protein (npr. aktivnost metiltransferaze, aktivnost acetiltransferaze, aktivnost kinaze, ubikvitinirajuća aktivnost, itd.). Heterologna sekvenca nukleinske kiseline može biti povezana sa sekvencom nukleinske kiseline koja se javlja u prirodi (ili njenom varijantom) (npr. genetskim inženjeringom) da bi se stvorila himerna nukleotidna sekvenca koja kodira himerni polipeptid. Kao drugi primer, u fuzionoj varijanti polipeptida Cas9 usmerenog na mesto, varijantni Cas9 polipeptid usmeren na mesto može biti fuzionisan sa heterolognim polipeptidom (tj. polipeptidom koji nije Cas9), koji pokazuje aktivnost koju će takođe pokazati fuziona varijanta Cas9 polipeptida usmerenog na mesto. Heterologna sekvenca nukleinske kiseline može biti povezana sa Cas9 varijantnim polipeptidom usmerenim na mesto (npr. genetskim inženjeringom) da bi se stvorila nukleotidna sekvenca koja kodira fuzionu varijantu polipeptida usmerenog na Cas9 mesto.
„Rekombinantna“, kako se ovde koristi, znači da je određena nukleinska kiselina (DNK ili RNK) produkt različitih kombinacija kloniranja, restrikcije, lančane reakcije polimeraze (PCR) i/ili koraka ligacije što rezultira konstruktom koji ima strukturno kodiranje ili nekodirajuća sekvenca koja se razlikuje od endogenih nukleinskih kiselina koje se nalaze u prirodnim sistemima. DNK sekvence koje kodiraju polipeptide mogu se sastaviti od cDNK fragmenata ili iz serije sintetičkih oligonukleotida, da bi se obezbedila sintetička nukleinska kiselina koja je sposobna da se ekspresuje iz rekombinantne transkripcione jedinice sadržane u ćeliji ili u sistemu za transkripciju i translaciju bez ćelija. Genomska DNK koja sadrži relevantne sekvence takođe se može koristiti u formiranju rekombinantnog gena ili transkripcione jedinice. Sekvence neprevedene DNK mogu biti prisutne 5' ili 3' od otvorenog okvira za čitanje, naznačeno time što takve sekvence ne ometaju manipulaciju ili ekspresiju kodirajućih regiona, i mogu zaista delovati na modulaciju produkcije željenog produkta različitim mehanizmima (vidi „regulatorne sekvence DNK“, ispod). Alternativno, DNK sekvence koje kodiraju RNK (npr. DNK ciljanu RNK) koja nije prevedena mogu se takođe smatrati rekombinantnim. Tako, na primer, termin „rekombinantna“ nukleinska kiselina se odnosi na onu koja se ne pojavljuje u prirodi, na primer, napravljena je veštačkom kombinacijom dva inače odvojena segmenta sekvence putem ljudske intervencije. Ova veštačka kombinacija se često postiže ili sredstvima hemijske sinteze, ili veštačkom manipulacijom izolovanih segmenata nukleinskih kiselina, npr. tehnikama genetskog inženjeringa. To se obično radi da bi se kodon zamenio kodonom koji kodira istu amino kiselinu, konzervativnu amino kiselinu ili nekonzervativnu amino kiselinu. Alternativno, izvodi se da se spoje zajedno segmenti nukleinske kiseline željenih funkcija da bi se stvorila željena kombinacija funkcija. Ova veštačka kombinacija se često postiže ili sredstvima hemijske sinteze, ili veštačkom manipulacijom izolovanih segmenata nukleinskih kiselina, npr. tehnikama genetskog inženjeringa. Kada rekombinantni polinukleotid kodira polipeptid, sekvenca kodiranog polipeptida može biti prirodno prisutna („divlji tip“) ili može biti varijanta (npr. mutant) sekvence koja se pojavljuje u prirodi. Prema tome, izraz „rekombinantni“ polipeptid ne odnosi se nužno na polipeptid čija se sekvenca ne javlja prirodno. Umesto toga, „rekombinantni“ polipeptid je kodiran rekombinantnom DNK sekvencom, ali sekvenca polipeptida može biti prirodna („divlji tip“) ili neprirodna (npr. varijanta, mutant, itd.). Dakle,
„rekombinantni“ polipeptid je rezultat ljudske intervencije, ali može biti prirodna sekvenca aminokiselina.
„Vektor“ ili „ekspresioni vektor“ je replikon, kao što je plazmid, fag, virus ili kosmid, na koji se može pričvrstiti još jedan DNK segment, odnosno „unosak“, kako bi se ostvarila replikacija pričvršćenog segmenta u ćeliji.
„Kaseta za ekspresiju“ sadrži DNK kodirajuću sekvencu koja je operativno povezana sa promoterom. „Operabilno povezani“ se odnosi na jukstapoziciju naznačeno time što su tako opisane komponente u odnosu koji im omogućava da funkcionišu na njihov predviđeni način. Na primer, promoter je operativno vezan za kodirajuću sekvencu ako promoter utiče na njegovu transkripciju ili ekspresiju.
Termini „rekombinantni ekspresioni vektor“ ili „DNK konstrukt“ se ovde koriste naizmenično za označavanje molekula DNK koji sadrži vektor i najmanje jedan unosak. Rekombinantni ekspresioni vektori se obično generišu u svrhu ekspresije i/ili propagiranja unosaka, ili za konstrukciju drugih rekombinantnih nukleotidnih sekvenci. Unosak može ili ne mora biti operativno vezan za sekvencu promotera i može ili ne mora biti operativno vezan za DNK regulatorne sekvence.
Ćelija je „genetski modifikovana“ ili „transformisana“ ili „transfektovana“ egzogenom DNK, npr. rekombinantnim ekspresionim vektorom, kada je takva DNK uvedena unutar ćelije. Prisustvo egzogene DNK dovodi do trajne ili prolazne genetske promene. DNK koja se transformiše može ili ne mora biti integrisana (kovalentno povezana) u genom ćelije. U ćelijama prokariota, kvasca i sisara, na primer, DNK koja se transformiše može se održati na epizomalnom elementu kao što je plazmid. Što se tiče eukariotskih ćelija, stabilno transformisana ćelija je ona u kojoj je transformišuća DNK postala integrisana u hromozom tako da je nasleđuju ćerke ćelije putem replikacije hromozoma. Ova stabilnost je demonstrirana sposobnošću eukariotske ćelije da uspostavi ćelijske linije ili klonove koji čine populaciju ćerki ćelija koje sadrže transformišuću DNK.
„Klon“ je populacija ćelija dobijenih iz jedne ćelije ili zajedničkog pretka mitozom. „Ćelijska linija“ je klon primarne ćelije koja je sposobna za stabilan rast in vitro tokom mnogih generacija.
Pogodni postupci genetske modifikacije (takođe nazvane „transformacija“) uključuju npr. virusnu ili bakteriofagnu infekciju, transfekciju, konjugaciju, fuziju protoplasta, lipofekciju, elektroporaciju, taloženje kalcijum fosfata, transfekciju posredovanu polietileniminom (PEI), transfekciju posredovanu DEAE-dekstranom, transfekciju posredovanu lipozomima, tehnologiju pištolja za čestice, taloženje kalcijum fosfata, direktnu mikro injekciju, isporuku nukleinske kiseline posredovanu nanočesticama (videti, npr. Panyam et., al Adv Drug Deliv Rev. 2012 Sep 13. pii: S0169-409X(12)00283-9. doi:
10.1016/j.addr.2012.09.023 ), i sl.
Izbor postupka genetske modifikacije generalno zavisi od tipa ćelije koja se transformiše i okolnosti pod kojima se transformacija odvija (npr. in vitro, ex vivo ili in vivo). Opšta diskusija o ovim postupcima može se naći u Ausubel, i sar., Short Protocols in Molecular Biology, 3rd ed., Wiley & Sons, 1995.
„Ciljna DNK“ kako se ovde koristi je DNK polinukleotid koji sadrži „ciljano mesto“ ili „ciljnu sekvencu“. Termini „ciljano mesto“ ili „ciljana sekvenca“ ili „ciljani protospacer DNK“ se ovde koriste naizmenično za označavanje sekvence nukleinske kiseline prisutne u ciljnoj DNK za koju će se vezati segment DNK ciljane na RNK subjekta (videti Sliku 1 i Sliku 39), pod uslovom da postoje dovoljni uslovi za vezivanje. Na primer, ciljno mesto (ili ciljna sekvenca) 5'-GAGCATATC-3' (SEQ ID NO://) unutar ciljne DNK je ciljano (ili je vezano za, ili hibridizuje sa, ili je komplementarno) RNK sekvenci 5'-GAUAUGCUC-3' (SEQ ID NO://). Pogodni uslovi vezivanja DNK/RNK uključuju fiziološka stanja koja su normalno prisutna u ćeliji. Drugi pogodni uslovi vezivanja DNK/RNK (npr. uslovi u sistemu bez ćelija) su poznati u predmetnoj oblasti; videti, npr., Sambrook, supra. Lanac ciljne DNK koji je komplementaran i hibridizuje se sa RNK ciljanom na DNK naziva se „komplementarni lanac“ i lanac ciljne DNK koji je komplementaran „komplementarnom lancu“ (i stoga nije komplementaran sa RNK koja cilja na DNK) se naziva „nekomplementarni lanac“ ili „nekomplementarni lanac“ (videti Sliku 12).
Pod „polipeptidom usmerenim na modifikovanje” ili „polipeptidom usmerenim na mesto vezivanja za RNK” ili „modifikujućim polipeptidom usmerenim na mesto vezivanja” ili „polipeptidom usmerenom na mesto” podrazumeva se polipeptid koji vezuje RNK i cilja na određenu DNK sekvencu. Modifikovani polipeptid usmeren na mesto, kao što je ovde opisan, cilja na specifičnu DNK sekvencu pomoću molekula RNK za koji je vezan. Molekul RNK sadrži sekvencu koja je komplementarna ciljnoj sekvenci unutar ciljne DNK, ciljajući tako vezani polipeptid na određenu lokaciju unutar ciljne DNK (ciljna sekvenca).
Pod „brazdanjem“ se podrazumeva lomljenje kovalentne kičme molekula DNK. Brazdanje se može pokrenuti različitim postupcima uključujući, ali ne ograničavajući se na, enzimsku ili hemijsku hidrolizu fosfodiestarske veze. Moguće je i jednolančano i dvolančano brazdanje, a dvolančano brazdanje može nastati kao rezultat dva različita događaja jednolančanog brazdanja. Brazdanje DNK može da dovede do stvaranja ili tupih krajeva ili raspoređenih krajeva. U određenim otelotvorenjima, kompleks koji sadrži RNK ciljanu na DNK i polipeptid koji je usmeren na mesto se koristi za ciljano cepanje dvolančane DNK.
„Nukleaza“ i „endonukleaza“ se ovde koriste naizmenično da označavaju enzim koji poseduje katalitičku aktivnost za brazdanje DNK.
Pod „domenom brazdanja“ ili „aktivnim domenom“ ili „domenom nukleaze“ pod nukleazom se podrazumeva polipeptidna sekvenca ili domen unutar nukleaze koji poseduje katalitičku aktivnost za brazdanje DNK. Domen brazdanja može biti sadržan u jednom polipeptidnom lancu ili aktivnost brazdanja može biti rezultat asocijacije dva (ili više) polipeptida. Jedan domen nukleaze može se sastojati od više od jednog izolovanog dela aminokiselina unutar datog polipeptida.
Molekul RNK koji se vezuje za modifikovani polipeptid usmeren na mesto i cilja polipeptid na određenoj lokaciji unutar ciljne DNK ovde se naziva „RNK ciljana na DNK“ ili „polinukleotid RNK koji cilja na DNK“ (ovde se takođe naziva „vodeća RNK“ ili „gRNK“). RNK koja cilja na DNK se sastoji od dva segmenta, „segmenta ciljanog na DNK“ i „segmenta koji se vezuje za proteine“. Pod „segmentom“ se podrazumeva segment/sekcija/područje molekula, na primer, susedni deo nukleotida u RNK. Segment takođe može značiti region/sekciju kompleksa tako da segment može da sadrži regione od više od jednog molekula. Na primer, u nekim slučajevima segment koji se vezuje za protein (opisan u nastavku) RNK ciljane na DNK je jedan molekul RNK i segment koji se vezuje za protein stoga obuhvata područje tog RNK molekula. U drugim slučajevima, segment koji se vezuje za protein (opisan u nastavku) RNK ciljane na DNK se sastoji od dva odvojena molekula koja su hibridizovana duž regiona komplementarnosti. Kao ilustrativan, neograničavajući primer, segment koji se vezuje za protein RNK ciljane na DNK koji se sastoji od dva odvojena molekula može da sadrži (i) parove baza 40-75 prvog molekula RNK koji je dužine 100 parova baza; i (ii) parove baza 10-25 drugog molekula RNK koji je dužine 50 parova baza. Definicija „segmenta“, osim ako je drugačije posebno definisana u određenom kontekstu, nije ograničena na određeni broj ukupnih baznih parova, nije ograničena na bilo koji određeni broj baznih parova iz datog molekula RNK, nije ograničena na određeni broj odvojenih molekula unutar kompleksa, i može uključivati područja RNK molekula koje su bilo koje ukupne dužine i mogu ili ne mogu uključivati regije sa komplementarnošću prema drugim molekulima.
Segment za ciljanje DNK (ili „sekvenca za ciljanje DNK“) sadrži nukleotidnu sekvencu koja je komplementarna specifičnoj sekvenci unutar ciljne DNK (komplementarni lanac ciljne DNK). Segment koji se vezuje za protein (ili „sekvenca koja vezuje protein“) stupa u interakciju sa polipeptidom za modifikovanje usmerenim na mesto. Kada je modifikovani polipeptid usmeren na mesto Cas9 ili polipeptid srodan Cas9 (detaljnije opisan u nastavku), brazdanje ciljne DNK specifično za mesto se dešava na lokacijama koje su određene i (i) komplementarnošću uparivanja baza između RNK koja cilja DNK i ciljna DNK; i (ii) kratki motiv (koji se naziva protospacer susedni motiv (PAM)) u ciljnoj DNK.
Segment koji se vezuje za protein predmetne RNK ciljane na DNK obuhvata dva komplementarna dela nukleotida koji se hibridizuju jedan sa drugim da bi formirali dvolančani RNK dupleks (dsRNK dupleks).
U nekim otelotvorenjima, predmetna nukleinska kiselina (npr. RNK koja cilja na DNK, nukleinska kiselina koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira RNK koja cilja DNK; nukleinska kiselina koja kodira polipeptid usmeren na mesto; itd.) sadrži modifikaciju ili sekvencu koja obezbeđuje dodatnu poželjnu osobinu (npr. modifikovana ili regulisana stabilnost; subcelularno ciljanje; praćenje, npr. fluorescentna oznaka; mesto vezivanja za protein ili proteinski kompleks; itd.). Neograničavajući primeri uključuju: 5' kap (npr. kap od 7-metilgvanilata (m7G)); 3' poliadenilovani rep (tj.3' poli(A) rep); sekvencu riboprekidača (npr. da bi se omogućila regulisana stabilnost i/ili regulisana dostupnost proteinima i/ili proteinskim kompleksima); sekvencu kontrole stabilnosti; sekvencu koja formira dsRNK dupleks (tj. ukosnicu)); modifikacija ili sekvenca koja cilja RNK na subćelijsku lokaciju (npr. jezgro, mitohondrije, hloroplaste i slično); modifikacija ili sekvenca koja obezbeđuje praćenje (npr. direktnu konjugaciju sa fluorescentnim molekulom, konjugaciju sa ostatkom koji olakšava fluorescentnu detekciju, sekvencu koja omogućava fluorescentnu detekciju, itd.); modifikacija ili sekvenca koja obezbeđuje mesto vezivanja za proteine (npr. proteini koji deluju na DNK, uključujući transkripcione aktivatore, transkripcione represore, DNK metiltransferaze, DNK demetilaze, histon acetiltransferaze, histon deacetilaze i slično); i njihove kombinacije.
U nekim otelotvorenjima, RNK ciljana na DNK sadrži dodatni segment na 5' ili 3' kraju koji obezbeđuje bilo koju od karakteristika opisanih gore. Na primer, pogodan treći segment može da sadrži 5' kap (npr. kap od 7-metilgvanilata (m7G)); 3' poliadenilovani rep (tj.3' poli(A) rep); sekvencu riboprekidača (npr. da bi se omogućila regulisana stabilnost i/ili regulisana dostupnost proteinima i proteinskim kompleksima); sekvencu kontrole stabilnosti; sekvencu koja formira dsRNK dupleks (tj. ukosnicu)); sekvencu koja cilja RNK na subćelijsku lokaciju (npr. jezgro, mitohondrije, hloroplaste i slično); modifikacija ili sekvenca koja obezbeđuje praćenje (npr. direktnu konjugaciju sa fluorescentnim molekulom, konjugaciju sa ostatkom koji olakšava fluorescentnu detekciju, sekvencu koja omogućava fluorescentnu detekciju, itd.); modifikacija ili sekvenca koja obezbeđuje mesto vezivanja za proteine (npr. proteini koji deluju na DNK, uključujući transkripcione aktivatore, transkripcione represore, DNK metiltransferaze, DNK demetilaze, histon acetiltransferaze, histon deacetilaze i slično); i njihove kombinacije.
RNK koja cilja na DNK subjekta i polipeptid za modifikovanje usmeren na mesto subjekta (tj. polipeptid usmeren na mesto) formiraju kompleks (tj. vezuju se preko nekovalentnih interakcija). RNK koja cilja na DNK obezbeđuje ciljnu specifičnost kompleksu tako što sadrži nukleotidnu sekvencu koja je komplementarna sekvenci ciljne DNK. Modifikovani polipeptid kompleksa usmeren na mesto obezbeđuje aktivnost specifičnu za mesto. Drugim rečima, modifikovani polipeptid usmeren na mesto je vođen do ciljne DNK sekvence (npr. ciljne sekvence u hromozomskoj nukleinskoj kiselini; ciljne sekvence u ekstrahromozomalnoj nukleinskoj kiselini, npr. epizomalnu nukleinsku kiselinu, mali krug, itd.; ciljnu sekvencu u mitohondrijskoj nukleinskoj kiselini; ciljnu sekvencu u hloroplastnoj nukleinskoj kiselini; ciljne sekvence u plazmidu; itd.) na osnovu njegove povezanosti sa segmentom RNK koji cilja na DNK.
U nekim otelotvorenjima, predmetna RNK koja cilja na DNK sadrži dva odvojena molekula RNK (RNK polinukleotidi: „aktivatorska RNK“ i „ciljna RNK“, videti dole) i ovde se pominje kao „ciljanje DNK sa dvostrukim molekulom RNK“ ili „RNK sa dva molekula ciljana na DNK“. U drugim otelotvorenjima, predmetna RNK koja cilja na DNK je jedan molekul RNK (pojedinačni RNK polinukleotid) i ovde se pominje kao „RNK ciljana na DNK sa jednim molekulom“, „RNK sa jednim vodičem“ ili „sgRNK.“ Izraz „RNK koja cilja DNK“ ili „gRNK“ je inkluzivan, odnosi se i na RNK sa dvostrukim molekulom DNK i na RNK koje ciljaju na DNK sa jednim molekulom (tj. sgRNK).
Primer RNK koji cilja na DNK sa dva molekula sadrži molekul nalik crRNK („CRISPR RNK“ ili „ciljna RNK“ ili „crRNK“ ili „crRNK repeat“) i odgovarajući tracrRNK sličan („trans-aktivna CRISPR RNK“ ili „aktivatorska RNK“ ili „tracrRNK“) molekul. Molekul sličan crRNK (ciljna RNK) sadrži i segment koji cilja na DNK (jednolančani) RNK ciljane DNK i deo („segment koji formira dupleks“) nukleotida koji formira polovinu dupleksa dsRNK u segment RNK koji cilja na DNK.
Odgovarajući molekul sličan tracrRNK (aktivatorska RNK) sadrži deo nukleotida (segment koji formira dupleks) koji formira drugu polovinu dsRNK dupleksa segmenta koji se vezuje za protein RNK ciljane na DNK. Drugim rečima, deo nukleotida molekula sličnog crRNK je komplementaran i hibridizuje se sa delom nukleotida molekula sličnog tracrRNK da bi se formirao dsRNK dupleks domena koji se vezuje za protein DNK ciljane RNK. Kao takav, može se reći da svaki molekul sličan crRNK ima odgovarajući molekul sličan tracrRNK. Molekul sličan crRNK dodatno obezbeđuje segment za ciljanje jednolančane DNK. Dakle, molekul sličan crRNK i molekul sličan tracrRNK (kao odgovarajući par) se hibridizuju da bi formirali RNK koja cilja na DNK. Tačna sekvenca datog molekula crRNK ili tracrRNK je karakteristična za vrstu u kojoj se nalaze molekuli RNK. Različite crRNK i tracrRNK su prikazane u odgovarajućim komplementarnim parovima na Slikama 8. RNK koja cilja na DNK sa dvostrukim molekulom može da sadrži bilo koji odgovarajući par crRNK i tracrRNK. RNK koja cilja na DNK sa dvostrukim molekulom može da sadrži bilo koji odgovarajući par crRNK i tracrRNK.
Termin „aktivatorska RNK“ se ovde koristi za označavanje molekula nalik tracrRNK dvomolekularne DNK ciljane na RNK. Termin „ciljna RNK“ se ovde koristi da označi molekul sličan crRNK sa dvostrukim RNK molekulom koji cilja DNK. Termin „segment koji formira dupleks“ se ovde koristi da označi deo nukleotida aktivatorske RNK ili ciljne RNK koji doprinosi formiranju dupleksa dsRNK hibridizacijom sa nizom nukleotida odgovarajuće aktivatorske RNK ili ciljni molekul RNK. Drugim rečima, aktivatorska RNK sadrži segment koji formira dupleks koji je komplementaran segmentu koji formira dupleks odgovarajuće ciljne RNK. Kao takva, aktivatorska RNK sadrži segment koji formira dupleks, dok ciljna RNK sadrži i segment koji formira dupleks i segment koji cilja na DNK od RNK koja cilja DNK. Prema tome, RNK koja cilja na DNK sa dvostrukim molekulom može se sastojati od bilo kog odgovarajućeg para aktivatorske RNK i ciljne RNK.
Termin „matična ćelija“ se ovde koristi da se odnosi na ćeliju (npr. matična ćelija biljke, matična ćelija kičmenjaka) koja ima sposobnost i da se samostalno obnavlja i da generiše diferencirani tip ćelije (videti Morrison i sar. (1997) Cell 88:287-298). U kontekstu ćelijske ontogenije, pridev „diferencirani“ ili „diferencirajući“ je relativan pojam. „Diferencirana ćelija“ je ćelija koja je napredovala dalje niz razvojni put od ćelije sa kojom se poredi. Dakle, pluripotentne matične ćelije (opisane u nastavku) mogu da se diferenciraju u rodno ograničene progenitorske ćelije (npr. mezodermalne matične ćelije), koje zauzvrat mogu da se diferenciraju u ćelije koje su dalje ograničene (npr. neuronski progenitori), koje se mogu diferencirati u završnu fazu ćelije (tj. terminalno diferencirane ćelije, npr. neuroni, kardiomiociti, itd.), koje igraju karakterističnu ulogu u određenom tipu tkiva i mogu ili ne moraju zadržati sposobnost daljeg razmnožavanja. Matične ćelije se mogu karakterisati i prisustvom specifičnih markera (npr. proteini, RNK, itd.) i odsustvom specifičnih markera. Matične ćelije se takođe mogu identifikovati funkcionalnim testovima i in vitro i in vivo, posebno testovima koji se odnose na sposobnost matičnih ćelija da daju višestruko diferencirano potomstvo.
Matične ćelije od interesa uključuju pluripotentne matične ćelije (PSC). Termin „pluripotentna matična ćelija“ ili „PSC“ se ovde koristi za označavanje matične ćelije sposobne da proizvodi sve tipove ćelija organizma. Prema tome, PSC može dovesti do ćelija svih zametnih slojeva organizma (npr. endoderma, mezoderma i ektoderma kičmenjaka). Pluripotentne ćelije su sposobne da formiraju teratome i da doprinose tkivima ektoderma, mezoderma ili endoderma u živom organizmu. Pluripotentne matične ćelije biljaka su sposobne da stvore sve tipove ćelija biljke (npr. ćelije korena, stabljike, listova, itd.).
PSC životinja može se dobiti na više različitih načina. Na primer, embrionalne matične ćelije (ESC) su izvedene iz unutrašnje ćelijske mase embriona, dok su indukovane pluripotentne matične ćelije (iPSC) izvedene iz somatskih ćelija (Takahashi i sar., Cell.2007 Nov 30;131(5):861-72; Takahashi i sar., Nat Protoc.2007;2(12):3081-9; Yu i sar., Science.2007 Dec 21;318(5858):1917-20. Epub 2007 Nov 20). Pošto se termin PSC odnosi na pluripotentne matične ćelije bez obzira na njihovo poreklo, termin PSC obuhvata termine ESC i iPSC. PSC mogu biti u obliku uspostavljene ćelijske linije, mogu se dobiti direktno iz primarnog embrionalnog tkiva ili mogu biti izvedene iz somatske ćelije. PSC mogu biti ciljne ćelije ovde opisanih postupaka.
Pod „embrionalnom matičnom ćelijom“ (ESC) se podrazumeva PSC koji je izolovan iz embriona, tipično iz unutrašnje ćelijske mase blastociste. Matične ćelije od interesa takođe uključuju embrionalne matične ćelije drugih primata, kao što su rezus matične ćelije i matične ćelije marmozeta. Matične ćelije se mogu dobiti od bilo koje vrste sisara, npr. čoveka, konja, goveda, svinja, pasa, mačaka, glodara, npr. miševa, pacova, hrčaka, primata, itd. (Thomson i sar. (1998) Science 282:1145; Thomson i sar. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci USA 92:7844; Thomson i sar. (1996) Biol. Reprod.55:254; Shamblott i sar., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13726, 1998). U kulturi, ESC obično rastu kao ravne kolonije sa velikim nukleocitoplazmatskim odnosima, definisanim granicama i istaknutim jezgrama. Pored toga, ESC eksprimiraju SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81 i alkalnu fosfatazu, ali ne i SSEA-1. Primeri postupaka za generisanje i karakterizaciju ESC-a mogu se naći u, na primer, US patentu br.7,029,913, US patentu br.5,843,780 i US patentu br.6,200,806. Postupci za proliferaciju hESC u nediferenciranoj formi su opisani u WO 99/20741, WO 01/51616 i WO 03/020920.
Pod „embrionalne matične zametne ćelije” (EGSC) ili „embrionalne zametne ćelije” ili „EG ćelije” podrazumeva se PSC koji je izveden iz zametnih ćelija i/ili progenitora zametnih ćelija, npr. primordijalne zametne ćelije, odnosno one koje bi postale spermatozoidi i jaja. Smatra se da embrionalne zametne ćelije (EG ćelije) imaju svojstva slična embrionalnim matičnim ćelijama kao što je gore opisano. Primeri postupaka za generisanje i karakterizaciju EG ćelija mogu se naći u, na primer, US patentu br.7,153,684; Matsui, Y., i sar., (1992) Cell
70:841; Shamblott, M., i sar. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98;
113; Shamblott, M., i sar. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13726;
i Koshimizu, U., i sar. (1996) Development, 122:1235.
Pod „indukovanom pluripotentnom matičnom ćelijom“ ili
„iPSC“ podrazumeva se PSC koji je izveden iz ćelije koja nije PSC (tj. od ćelije koja se razlikuje u odnosu na PSC). iPSC-ovi mogu biti izvedeni iz više različitih tipova ćelija, uključujući terminalno diferencirane ćelije. iPSC imaju morfologiju sličnu ES ćeliji, rastu kao ravne kolonije sa velikim nukleo-citoplazmatskim odnosima, definisanim granicama i istaknutim jezgrima. Pored toga, iPSC-ovi izražavaju jedan ili više ključnih markera pluripotencije poznatih osobi sa uobičajenim znanjem u predmetnoj oblasti, uključujući, ali ne ograničavajući se na alkalnu fosfatazu, SSEA3, SSEA4, Sox2, Oct3/4, Nanog, TRA160, TRA181, TDGF 1, Dnmt3b, FoxD3, GDF3, Cyp26a1, TERT i zfp42. Primeri postupaka za generisanje i karakterizaciju iPSC-a mogu se naći u, na primer, US Patentnoj publikaciji br.
US20090047263, US20090068742, US20090191159, US20090227032, US20090 246875, and US20090304646. Generalno, za generisanje iPSC-ova, somatske ćelije su obezbeđene faktorima reprogramiranja (npr. Oct4, SOX2, KLF4, MYC, Nanog, Lin28, itd.) poznatim u predmetnoj oblasti da reprogramiraju somatske ćelije da postanu pluripotentne matične ćelije.
Pod „somatskom ćelijom“ se podrazumeva svaka ćelija u organizmu koja, u odsustvu eksperimentalne manipulacije, obično ne stvara sve tipove ćelija u organizmu. Drugim rečima, somatske ćelije su ćelije koje su se dovoljno diferencirale da neće prirodno generisati ćelije sva tri zametna sloja tela, odnosno ektoderma, mezoderma i endoderma. Na primer, somatske ćelije bi uključivale i neurone i nervne progenitore, od kojih bi ovi drugi mogli prirodno da proizvedu sve ili neke tipove ćelija centralnog nervnog sistema, ali ne mogu dovesti do ćelija mezoderma ili endoderma.
Pod „mitotskom ćelijom“ se misli na ćeliju koja prolazi kroz mitozu. Mitoza je proces kojim eukariotska ćelija razdvaja hromozome u svom jezgru u dva identična skupa u dva odvojena jezgra. Obično je praćena odmah citokinezom, koja deli jezgra, citoplazmu, organele i ćelijsku membranu u dve ćelije koje sadrže približno jednak udeo ovih ćelijskih komponenti.
Pod „postmitotskom ćelijom“ podrazumeva se ćelija koja je proizišla iz mitoze, odnosno „miruje“, odnosno više se ne deli. Ovo stanje mirovanja može biti privremeno, odnosno reverzibilno, ili može biti trajno.
Pod „mejotskom ćelijom“ podrazumeva se ćelija koja prolazi kroz mejozu. Mejoza je proces kojim ćelija deli svoj nuklearni materijal u svrhu produkcije gameta ili spora. Za razliku od mitoze, u mejozi, hromozomi prolaze kroz korak rekombinacije koji meša genetski materijal između hromozoma. Pored toga, ishod mejoze su četiri (genetski jedinstvene) haploidne ćelije, u poređenju sa dve (genetski identične) diploidne ćelije proizvedene mitozom.
Pod „rekombinacijom“ se podrazumeva proces razmene genetskih informacija između dva polinukleotida. Kako se ovde koristi, „popravka usmerena na homologiju (HDR)“ se odnosi na specijalizovanu formu popravke DNK koja se dešava, na primer, tokom popravke dvolančanih prekida u ćelijama. Ovaj proces zahteva homologiju nukleotidne sekvence, koristi molekul „donora“ za popravku „ciljnog“ molekula (tj. onog koji je doživeo prekid dvostrukog lanca) i dovodi do prenosa genetskih informacija sa donora na cilj. Popravka usmerena na homologiju može dovesti do promene sekvence ciljnog molekula (npr. umetanje, brisanje, mutacija), ako se polinukleotid donora razlikuje od ciljnog molekula i deo ili cela sekvenca donorskog polinukleotida je ugrađena u ciljnu DNK. U nekim otelotvorenjima, donorski polinukleotid, deo donorskog polinukleotida, kopija donorskog polinukleotida, ili deo kopije donorskog polinukleotida integriše se u ciljnu DNK.
Pod „nehomolognim spajanjem krajeva (NHEJ)“ podrazumeva se popravka dvolančanih prekida u DNK direktnim vezivanjem krajeva prekida jedan na drugi bez potrebe za homolognim šablonom (za razliku od popravke usmerene na homologiju, koja zahteva homolognu sekvencu za vođenje popravke). NHEJ često dovodi do gubitka (brisanja) nukleotidne sekvence u blizini mesta prekida dvostrukog lanca.
Izrazi „tretman“, „lečenje“ i slično se ovde koriste da uopšteno označavaju postizanje željenog farmakološkog i/ili fiziološkog efekta. Efekat može biti profilaktički u smislu potpunog ili delimičnog sprečavanja bolesti ili njenih simptoma i/ili može biti terapeutski u smislu delimičnog ili potpunog izlečenja bolesti i/ili neželjenog efekta koji se može pripisati bolesti. „Lečenje“ kako se ovde koristi obuhvata bilo koji tretman bolesti ili simptoma kod sisara, i uključuje: (a) sprečavanje pojave bolesti ili simptoma kod subjekta koji može biti predisponiran za dobijanje bolesti ili simptoma, ali mu još nije dijagnostikovano da ga ima; (b) inhibiranje bolesti ili simptoma, tj. zaustavljanje njegovog razvoja; ili (c) ublažavanje bolesti, tj. izazivanje regresije bolesti. Terapeutski agens se može primeniti pre, tokom ili posle pojave bolesti ili povrede. Posebno je interesantno lečenje bolesti koje je u toku, naznačeno time što tretman stabilizuje ili smanjuje neželjene kliničke simptome pacijenta. Takav tretman se poželjno izvodi pre potpunog gubitka funkcije u zahvaćenim tkivima. Terapija za koju nije tražena će se poželjno primenjivati tokom simptomatske faze bolesti, au nekim slučajevima i nakon simptomatske faze bolesti.
Termini „pojedinac“, „subjekat“, „domaćin“ i „pacijent“ se ovde koriste naizmenično i odnose se na bilo kog subjekta sisara za koga je poželjna dijagnoza, lečenje ili terapija, posebno ljude.
Opšti postupci u molekularnoj i ćelijskoj biohemiji mogu se naći u standardnim udžbenicima kao što je Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3. izdanje. (Sambrook i sar., HaRBor Laboratory Press 2001); Short Protocols in Molecular Biology, 4. izdanje. (Ausubel i sar. eds., John Wiley & Sons
1999); Protein Methods (Bollag i sar., John Wiley & Sons 1996); Nonviral Vectors for Gene Therapy (Wagner i sar. eds., Academic Press 1999); Viral Vectors (Kaplift & Loewy eds., Academic Press 1995); Immunology Methods Manual (I. Lefkovits ed., Academic Press 1997); i kultura ćelija i tkiva: Laboratory Procedures in Biotechnology (Doyle & Griffiths, John Wiley & Sons 1998).
Pre nego što se predmetni pronalazak dodatno opiše, treba razumeti da ovaj pronalazak nije ograničen na određena opisana otelotvorenja, jer takva mogu, naravno, da variraju. Takođe treba razumeti da je terminologija korišćena ovde samo u svrhu opisivanja određenih otelotvorenja, i nije namera da bude ograničavajuća, pošto će obim predmetnog pronalaska biti ograničen samo priloženim patentnim zahtevima.
Naznačeno time što je naveden raspon vrednosti, podrazumeva se da je svaka intervenciona vrednost, do desetine jedinice donje granice, osim ako kontekst jasno ne nalaže drugačije, između gornje i donje granice tog opsega i bilo koje druge navedene ili intervencione vrednosti u taj navedeni opseg obuhvaćena pronalaskom. Gornje i donje granice ovih manjih opsega mogu nezavisno biti uključene u manje opsege, a takođe su obuhvaćene pronalaskom, podložno bilo kojoj posebno isključenoj granici u navedenom opsegu. Naznačeno time što navedeni opseg uključuje jednu ili obe granice, opsezi koji isključuju jednu ili obe uključene granice takođe su uključeni u pronalazak.
Određeni opsezi su ovde predstavljeni sa numeričkim vrednostima kojima prethodi termin „o“. Termin „o“ se ovde koristi da obezbedi doslovnu podršku za tačan broj kojem prethodi, kao i za broj koji je blizu ili približno broju kojem prethodi termin. Prilikom utvrđivanja da li je broj blizak ili približno blizak specifično recitiranom broju, bliski ili približni nerecitiran broj može biti broj koji, u kontekstu u kome je predstavljen, pruža suštinski ekvivalent specifično recitiranom broju.
Osim ako nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni termini korišćeni ovde generalno imaju isto značenje kao i kada ih koriste osobe sa uobičajenim znanjem u predmetnoj oblasti kojoj ovaj pronalazak pripada. Iako se bilo koji postupci i materijali slični ili ekvivalentni onima koji su ovde opisani mogu koristiti u praksi ili testiranju predmetnog pronalaska, opisani su poželjni postupci i materijali.
Citiranje bilo koje publikacije je za njeno obelodanjivanje pre datuma podnošenja i ne treba se tumačiti kao priznanje da predmetni pronalazak nema pravo da prethodi takvoj publikaciji na osnovu prethodnog pronalaska. Dalje, dati datumi objavljivanja mogu se razlikovati od stvarnih datuma objavljivanja koji će možda morati da budu nezavisno potvrđeni.
Napominje se da, kako se ovde koriste i u priloženim patentnim zahtevima, oblici jednine uključuju množinu, osim ako kontekst jasno ne nalaže drugačije. Tako, na primer, referenca na „polinukleotid“ uključuje mnoštvo takvih polinukleotida, a referenca na „polipeptid“ uključuje referencu na jedan ili više polipeptida i njihovih ekvivalenata poznatih stručnjacima u predmetnoj oblasti, i tako dalje. Dalje se napominje da patentni zahtevi mogu biti sastavljeni tako da isključe bilo koji opcioni element. Kao takva, ova izjava treba da posluži kao prethodna osnova za upotrebu takve ekskluzivne terminologije kao što su „isključivo“, „samo“ i slično u vezi sa navođenjem elemenata patentnih zahteva ili upotrebom „negativnog“ ograničenja.
Smatra se da određene karakteristike pronalaska, koje su, radi jasnoće, opisane u kontekstu odvojenih otelotvorenja, takođe mogu biti obezbeđene u kombinaciji u jednom otelotvorenju. Nasuprot tome, različite karakteristike pronalaska, koje su, radi kratkoće, opisane u kontekstu jednog otelotvorenja, takođe mogu biti obezbeđene odvojeno ili u bilo kojoj pogodnoj podkombinaciji. Sve kombinacije otelotvorenja koje se odnose na pronalazak su posebno obuhvaćene predmetnim pronalaskom i ovde su objavljene baš kao da je svaka kombinacija pojedinačno i eksplicitno objavljena. Pored toga, sve podkombinacije različitih otelotvorenja i njihovih elemenata su takođe posebno obuhvaćene predmetnim pronalaskom i ovde su otkrivene baš kao da je svaka takva podkombinacija pojedinačno i eksplicitno objavljena ovde.
Publikacije o kojima se ovde govori su obezbeđene isključivo radi njihovog obelodanjivanja pre datuma podnošenja predmetne prijave. Ništa ovde se ne može tumačiti kao priznanje da predmetni pronalazak nema pravo da prethodi takvom objavljivanju na osnovu prethodnog pronalaska. Dalje, dati datumi objavljivanja mogu se razlikovati od stvarnih datuma objavljivanja koji će možda morati da budu nezavisno potvrđeni.
Detaljni opis deo
Predmetno obelodanjivanje obezbeđuje RNK ciljanu na DNK koja sadrži ciljanu sekvencu i, zajedno sa modifikujućim polipeptidom koji je prirodni Cas9, obezbeđuje specifičnu modifikaciju ciljne DNK i/ili polipeptida povezanog sa ciljnom DNK. Takođe su obezbeđene kompozicije koje sadrže RNK ciljanu na DNK.
Nukleinske kiseline
RNK koja cilja na DNK
Predmetno obelodanjivanje obezbeđuje DNK ciljanu RNK koja usmerava aktivnosti pridruženog polipeptida (npr. polipeptid za modifikovanje usmeren na mesto) na specifičnu ciljnu sekvencu unutar ciljne DNK. RNK koja cilja na DNK sadrži: prvi segment (koji se ovde takođe pominje kao „segment koji cilja na DNK“ ili „sekvenca za ciljanje DNK“) i drugi segment (koji se ovde takođe naziva „segment koji se vezuje za proteine“ ili „sekvenca koja vezuje proteine“).
DNK-ciljani segment RNK-ciljane DNK
Segment koji cilja DNK predmetne DNK ciljane na RNK sadrži nukleotidnu sekvencu koja je komplementarna sekvenci u ciljnoj DNK. Drugim rečima, segment koji cilja na DNK subjektne RNK ciljane na DNK interaguje sa ciljnom DNK na način specifičan za sekvencu putem hibridizacije (tj. uparivanje baza). Kao takva, nukleotidna sekvenca segmenta ciljanog na DNK može da varira i određuje lokaciju unutar ciljne DNK na kojoj će RNK koja cilja DNK i ciljna DNK interagovati. Segment koji cilja DNK predmetne DNK ciljane RNK može biti modifikovan (npr. genetskim inženjeringom) da bi se hibridizovao sa bilo kojom željenom sekvencom unutar ciljne DNK.
Segment koji cilja DNK može imati dužinu od oko 12 nukleotida do oko 100 nukleotida. Na primer, segment koji cilja DNK može imati dužinu od oko 12 nukleotida (nt) do oko 80 nt, od oko 12 nt do oko 50 nt, od oko 12 nt do oko 40 nt, od oko 12 nt do oko 30 nt, od oko 12 nt do oko 25 nt, od oko 12 nt do oko 20 nt, ili od oko 12 nt do oko 19 nt. Na primer, segment koji cilja DNK može imati dužinu od oko 19 nt do oko 20 nt, od oko 19 nt do oko 25 nt, od oko 19 nt do oko 30 nt, od oko 19 nt do oko 35 nt, od oko 19 nt do oko 40 nt, od oko 19 nt do oko 45 nt, od oko 19 nt do oko 50 nt, od oko 19 nt do oko 60 nt, od oko 19 nt do oko 70 nt, od oko 19 nt do oko 80 nt, od oko 19 nt do oko 90 nt, od oko 19 nt do oko 100 nt, od oko 20 nt do oko 25 nt, od oko 20 nt do oko 30 nt, od oko 20 nt do oko 35 nt, od oko 20 nt do oko 40 nt, od oko 20 nt do oko 45 nt, od oko 20 nt do oko 50 nt, od oko 20 nt do oko 60 nt, od oko 20 nt do oko 70 nt, od oko 20 nt do oko 80 nt, od oko 20 nt do oko 90 nt, ili od oko 20 nt do oko 100 nt. Nukleotidna sekvenca (sekvenca za ciljanje DNK) segmenta za ciljanje DNK koja je komplementarna nukleotidnoj sekvenci (ciljnoj sekvenci) ciljne DNK može imati dužinu najmanje oko 12 nt. Na primer, sekvenca ciljanja DNK segmenta za ciljanje DNK koja je komplementarna ciljnoj sekvenci ciljne DNK može imati dužinu najmanje oko 12 nt, najmanje oko 15 nt, najmanje oko 18 nt, najmanje oko 19 nt, najmanje oko 20 nt, najmanje oko 25 nt, najmanje oko 30 nt, najmanje oko 35 nt ili najmanje oko 40 nt. Na primer, sekvenca ciljanja DNK segmenta za ciljanje DNK koja je komplementarna ciljnoj sekvenci ciljne DNK može imati dužinu od oko 12 nukleotida (nt) do oko 80 nt, od oko 12 nt do oko 50 nt, od oko 12 nt do oko 45 nt, od oko 12 nt do oko 40 nt, od oko 12 nt do oko 35 nt, od oko 12 nt do oko 30 nt, od oko 12 nt do oko 25 nt, od oko 12 nt do oko 20 nt, od oko 12 nt do oko 19 nt, od oko 19 nt do oko 20 nt, od oko 19 nt do oko 25 nt, od oko 19 nt do oko 30 nt, od oko 19 nt do oko 35 nt, od oko 19 nt do oko 40 nt, od oko 19 nt do oko 45 nt, od oko 19 nt do oko 50 nt, od oko 19 nt do oko 60 nt, od oko 20 nt do oko 25 nt, od oko 20 nt do oko 30 nt, od oko 20 nt do oko 35 nt, od oko 20 nt do oko 40 nt, od oko 20 nt do oko 45 nt, od oko 20 nt do oko 50 nt, ili od oko 20 nt do oko 60 nt. Nukleotidna sekvenca (sekvenca za ciljanje DNK) segmenta za ciljanje DNK koja je komplementarna nukleotidnoj sekvenci (ciljnoj sekvenci) ciljne DNK može imati dužinu najmanje oko 12 nt.
U nekim slučajevima, DNK-ciljana sekvenca segmenta za ciljanje DNK koja je komplementarna ciljnoj sekvenci ciljne DNK je duga 20 nukleotida. U nekim slučajevima, DNK-ciljana sekvenca segmenta za ciljanje DNK koja je komplementarna ciljnoj sekvenci ciljne DNK je duga 19 nukleotida.
Procenat komplementarnosti između DNK ciljane sekvence segmenta za ciljanje DNK i ciljne sekvence ciljne DNK može biti najmanje 60% (npr. najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% ili 100%). U nekim slučajevima, procenat komplementarnosti između DNK-ciljane sekvence segmenta za ciljanje DNK i ciljne sekvence ciljne DNK je 100% u odnosu na sedam uzastopnih 5'-najviše nukleotida ciljne sekvence komplementarnog lanca ciljane DNK. U nekim slučajevima, procenat komplementarnosti između DNK-ciljane sekvence segmenta za ciljanje DNK i ciljne sekvence ciljne DNK je najmanje 60% na oko 20 susednih nukleotida. U nekim slučajevima, procenat komplementarnosti između DNK-ciljane sekvence segmenta za ciljanje DNK i ciljne sekvence ciljne DNK je 100% u odnosu na četrnaest uzastopnih 5'-najviše nukleotida ciljne sekvence komplementarnog lanca mete DNK i samo 0% preko ostatka. U takvom slučaju, sekvenca koja cilja DNK može se smatrati dužinom od 14 nukleotida (vidi Sliku 12D-E). U nekim slučajevima, procenat komplementarnosti između DNK-ciljane sekvence segmenta za ciljanje DNK i ciljne sekvence ciljne DNK je 100% u odnosu na sedam uzastopnih 5'-najviše nukleotida ciljne sekvence komplementarnog lanca ciljne DNK i samo 0% preko ostatka. U tom slučaju, sekvenca koja cilja DNK može se smatrati dugom 7 nukleotida.
Segment RNK koji cilja DNK koji vezuje proteine
Segment koji se vezuje za protein predmetne RNK ciljane na DNK je u interakciji sa polipeptidom za modifikovanje usmerenim na mesto. RNK koja cilja na DNK vodi vezani polipeptid do specifične nukleotidne sekvence unutar ciljne DNK preko gore pomenutog segmenta za ciljanje DNK. Segment koji se vezuje za protein predmetne RNK ciljane na DNK sastoji se od dva dela nukleotida koji su komplementarni jedan drugom. Komplementarni nukleotidi segmenta koji se vezuje za protein hibridizuju se da bi formirali dvolančani RNK dupleks (dsRNK) (videti Slike 1A i 1B).
Predmetna RNK koja cilja na DNK sa dvostrukim molekulom sadrži dva odvojena RNK molekula. Svaki od dva molekula RNK predmetne dvomolekularne DNK ciljane RNK sadrži deo nukleotida koji su komplementarni jedan drugom tako da se komplementarni nukleotidi dva RNK molekula hibridizuju da bi formirali dvolančani RNK dupleks segmenta koji vezuje protein (Slika 1A).
U nekim otelotvorenjima, segment koji formira dupleks aktivatorske RNK je najmanje oko 60% identičan jednom od molekula aktivatorske RNK (tracrRNK) navedenih u SEQ ID NO: 431-562, ili njegovom komplementu, preko dela od najmanje 8 susednih nukleotida. Na primer, segment aktivatora RNK koji formira dupleks (ili DNK koji kodira segment koji formira dupleks aktivatorske RNK) je najmanje oko 60% identičan, najmanje oko 65% identičan, najmanje oko 70% identičan, najmanje oko 75% identičan, najmanje oko 80% identičan, najmanje oko 85% identičan, najmanje oko 90% identičan, najmanje oko 95% identičan, najmanje oko 98% identičan, najmanje oko 99% identičan, ili 100% identičan, jednoj od tracrRNK sekvenci navedenih u SEQ ID NO: 431-562, ili njenom komplementu, preko dela od najmanje 8 susednih nukleotida.
U nekim otelotvorenjima, segment ciljne RNK koji formira dupleks je najmanje oko 60% identičan jednoj od sekvenci ciljne RNK (crRNK) navedenih u SEQ ID NO: 563-679, ili njenom komplementu, preko dela od najmanje 8 susednih nukleotida. Na primer, segment ciljne RNK koji formira dupleks (ili DNK koji kodira segment ciljne RNK koji formira dupleks) je najmanje oko 65% identičan, najmanje oko 70% identičan, najmanje oko 75% identičan, najmanje oko 80% identičan, najmanje oko 85% identičan, najmanje oko 90% identičan, najmanje oko 95% identičan, najmanje oko 98% identičan, najmanje oko 99% identičan ili 100% identičan jednoj od crRNK sekvenci navedenih u SEQ ID NO: 563-679, ili njihovom komplementu, preko dela od najmanje 8 susednih nukleotida.
RNK sa dva molekula DNK može biti dizajnirana da omogući kontrolisano (tj. uslovno) vezivanje ciljne RNK sa aktivatorskom RNK. Pošto RNK koji cilja DNK sa dva molekula nije funkcionalna osim ako i aktivatorska RNK i ciljna RNK nisu vezane u funkcionalni kompleks sa dCas9, RNK koji cilja DNK sa dva molekula može biti inducibilna (npr. inducibilna lekom) pomoću pravljenja vezivanja između aktivatorske RNK i ciljne RNK inducibilnim. Kao jedan neograničavajući primer, RNK aptameri se mogu koristiti za regulisanje (tj. kontrolu) vezivanja aktivatorske RNK sa ciljnom RNK. Shodno tome, aktivatorska RNK i/ili ciljna RNK mogu sadržati sekvencu RNK aptamera.
RNK aptameri su poznati u predmetnoj oblasti i generalno su sintetička verzija riboprekidača. Termini „RNK aptamer“ i „riboprekidač“ se ovde koriste naizmenično da obuhvate i sintetičke i prirodne sekvence nukleinskih kiselina koje obezbeđuju inducibilnu regulaciju strukture (i stoga dostupnost specifičnih sekvenci) molekula RNK čiji su deo. RNK aptameri obično sadrže sekvencu koja se savija u određenu strukturu (npr. ukosnicu), koja specifično vezuje određeni lek (npr. mali molekul). Vezivanje leka izaziva strukturnu promenu u savijanju RNK, čime se menja karakteristika nukleinske kiseline čiji je deo aptamer. Kao neograničavajući primeri: (i) aktivatorska RNK sa aptamerom možda neće moći da se veže za srodnu ciljnu RNK osim ako aptamer nije vezan odgovarajućim lekom; (ii) ciljna RNK sa aptamerom možda neće moći da se veže za srodnu aktivatorsku RNK osim ako aptamer nije vezan odgovarajućim lekom; i (iii) ciljna RNK i aktivatorska RNK, od kojih svaka sadrži drugačiji aptamer koji vezuje drugačiji lek, možda neće moći da se vežu jedno za drugo osim ako nisu prisutna oba leka. Kao što je ilustrovano ovim primerima, RNK koji cilja DNK sa dva molekula može biti dizajnirana da bude inducibilna.
Primeri aptamera i riboprekidača mogu se naći, na primer, u: Nakamura i sar., Genes Cells.2012 Maj;17(5):344-64; Vavalle i sar., Future Cardiol. 2012 May;8(3):371-82; Citartan i sar., Biosens Bioelectron.2012 Apr 15;34(1):1-11; 1-11; i Liberman i sar., Wiley Interdiscip Rev RNA.2012 May-Jun;3(3):369-84.
Neograničavajući primeri nukleotidnih sekvenci koje mogu biti uključene u RNK koji cilja DNK sa dva molekula obuhvataju bilo koju od sekvenci navedenih u SEQ ID NO: 431-562, ili njihove komplemente, uparivanje sa bilo kojom sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 563-679, ili njihovim komplementima koji mogu da se hibridizuju da bi formirali segment koji se vezuje za protein.
Predmetna jednomolekulska DNK ciljana RNK sadrži dva dela nukleotida (ciljnu RNK i aktivatorsku RNK) koji su komplementarni jedan drugom, kovalentno su povezani intervenišućim nukleotidima („linkeri“ ili „linker nukleotidi“), i hibridizuju se da bi se formirao dvolančani RNK dupleks (dsRNK dupleks) segmenta koji se vezuje za protein, što rezultira strukturom matične petlje (Slika 1B). Ciljna RNK i aktivatorska RNK mogu biti kovalentno povezani preko 3' kraja ciljne RNK i 5' kraja aktivatorske RNK. Alternativno, ciljna RNK i aktivatorska RNK mogu biti kovalentno povezane preko 5' kraja ciljne RNK i 3' kraja aktivatorske RNK.
Linker jednomolekulske DNK ciljane RNK može imati dužinu od oko 3 nukleotida do oko 100 nukleotida. Na primer, linker može imati dužinu od oko 3 nukleotida (nt) do oko 90 nt, od oko 3 nukleotida (nt) do oko 80 nt, od oko 3 nukleotida (nt) do oko 70 nt, od oko 3 nukleotida (nt) do oko 60 nt, od oko 3 nukleotida (nt) do oko 50 nt, od oko 3 nukleotida (nt) do oko 40 nt, od oko 3 nukleotida (nt) do oko 30 nt, od oko 3 nukleotida (nt) do oko 20 nt ili od oko 3 nukleotida (nt) do oko 10 nt. Na primer, linker može imati dužinu od oko 3 nt do oko 5 nt, od oko 5 nt do oko 10 nt, od oko 10 nt do oko 15 nt, od oko 15 nt do oko 20 nt, od oko 20 nt do oko 25 nt, od oko 25 nt do oko 30 nt, od oko 30 nt do oko 35 nt, od oko 35 nt do oko 40 nt, od oko 40 nt do oko 50 nt, od oko 50 nt do oko 60 nt, od oko 60 nt do oko 70 nt, od oko 70 nt do oko 80 nt, od oko 80 nt do oko 90 nt, ili od oko 90 nt do oko 100 nt. U nekim otelotvorenjima, linker jednomolekulske RNK koja cilja DNK je 4 nt.
Primer RNK sa jednim molekulom koji cilja DNK sadrži dva komplementarna dela nukleotida koji se hibridizuju da bi formirali dsRNK dupleks. U nekim otelotvorenjima, jedan od dva komplementarna dela nukleotida jednomolekulske DNK ciljane RNK (ili DNK koja kodira deo) je najmanje oko 60% identičan jednom od molekula aktivatorske RNK (tracrRNK) navedenih u SEQ ID NO.: 431-562, ili njegovom komplementu, preko dela od najmanje 8 susednih nukleotida. Na primer, jedan od dva komplementarna dela nukleotida jednomolekulske DNK ciljane RNK (ili DNK koja kodira deo) je najmanje oko 65% identičan, najmanje oko 70% identičan, najmanje oko 75% identičan, najmanje oko 80% identičan, najmanje oko 85% identičan, najmanje oko 90% identičan, najmanje oko 95% identičan, najmanje oko 98% identičan, najmanje oko 99% identičan ili 100% identičan jednoj od tracrRNK sekvenci navedenih u SEQ ID NO.: 431-562, ili njihovom komplementu, preko dela od najmanje 8 uzastopnih nukleotida.
U nekim otelotvorenjima, jedan od dva komplementarna dela nukleotida jednomolekulske DNK ciljane RNK (ili DNK koja kodira deo) je najmanje oko 60% identičan jednoj od sekvenci ciljne RNK (crRNK) navedenoj u SEQ ID NO.: 563-679, ili njegovom komplementu, preko dela od najmanje 8 susednih nukleotida. Na primer, jedan od dva komplementarna dela nukleotida jednomolekulske DNK ciljane RNK (ili DNK koja kodira deo) je najmanje oko 65% identičan, najmanje oko 70% identičan, najmanje oko 75% identičan, najmanje oko 80% identičan, najmanje oko 85% identičan, najmanje oko 90% identičan, najmanje oko 95% identičan, najmanje oko 98% identičan, najmanje oko 99% identičan ili 100% identičan jednoj od crRNK sekvenci navedenih u SEQ ID NO.: 563-679, ili njihovom komplementu, preko dela od najmanje 8 uzastopnih nukleotida.
Odgovarajući prirodni parovi crRNK i tracrRNK mogu se rutinski odrediti za SEQ ID NO: 431-679 uzimajući u obzir naziv vrste i uparivanje baza (za dsRNK dupleks domena koji se vezuje za protein) kada se određuju odgovarajući srodni parovi (vidi Sliku 8 kao neograničavajući primer).
Što se tiče upotrebe subjekta za RNK za ciljanje DNK sa jednom molekulom ili upotrebe subjekta za RNK za ciljanje na DNK sa dvostrukom molekulom, Slika 57 pokazuje da veštačke sekvence koje imaju vrlo malo zajedničkog (oko 50% identičnosti) sa prirodnim tracrRNK i crRNK mogu funkcionisati sa Cas9-om kako bi brazdale ciljnu DNK sve dok se struktura domena vezivanja proteina RNK za ciljanje DNK očuva. Tako se preklopna RNK struktura prirodnog domena vezivanja proteina RNK koja cilja na DNK može uzeti u obzir kako bi se dizajnirali veštački domeni vezivanja proteina (dve molekule ili verzije sa jednim molekulom). Kao neograničavajući primer, funkcionalna veštačka RNK koja cilja DNK sa Slike 57 je dizajnirana na osnovu strukture segmenta vezivanja proteina prirodnog DNK ciljanja (npr., uključujući isti broj baznih parova duž RNK dupleksa i uključujući isti „izbočeni“ region koji je prisutan u prirodnoj RNK). Pošto osoba sa uobičajenim znanjem u predmetnoj oblasti lako može da proizvede strukture za bilo koji prirodni par crRNK:tracrRNK iz bilo koje vrste (videti SEQ ID NO:431-679 za sekvence crRNK i tracrRNK iz širokog spektra vrsta), veštačka DNK-ciljna RNK može biti dizajnirana da oponaša prirodnu strukturu za datu vrstu kada se koristi Cas9 (ili srodni Cas9, videti Sliku 32A) od te vrste. (pogledajte Sliku 24D i povezane detalje u Primeru 1). Prema tome, odgovarajuća RNK koja cilja na DNK može biti veštački dizajnirana RNK (koja se ne pojavljuje u prirodi) koja sadrži domen vezivanja za protein koji je dizajniran da oponaša strukturu domena vezivanja proteina prirodne RNK koja cilja na DNK. (videti SEQ ID NO: 431-679, uzimajući u obzir naziv vrste pri određivanju odgovarajućih srodnih parova).
Segment koji se vezuje za protein može imati dužinu od oko 10 nukleotida do oko 100 nukleotida. Na primer, segment vezivanja za protein može imati dužinu od oko 15 nukleotida (nt) do oko 80 nt, od oko 15 nt do oko 50 nt, od oko 15 nt do oko 40 nt, od oko 15 nt do oko 30 nt. nt ili od oko 15 nt do oko 25 nt.
Takođe, u odnosu na RNK koja cilja DNK sa jednom molekulom i RNK koja cilja DNK sa dvostrukom molekulom, dsRNK dupleks segmenta vezivanja za protein može imati dužinu od oko 6 baznih parova (bp) do oko 50 bp. Na primer, dsRNK dupleks segmenta vezivanja za protein može imati dužinu od oko 6 bp do oko 40 bp, od oko 6 bp do oko 30 bp, od oko 6 bp do oko 25 bp, od oko 6 bp do oko 20 bp, od oko 6 bp do oko 15 bp, od oko 8 bp do oko 40 bp, od oko 8 bp do oko 30 bp, od oko 8 bp do oko 25 bp, od oko 8 bp do oko 20 bp ili od oko 8 bp do oko 15 bp. Na primer, dsRNK dupleks segmenta vezivanja za protein može imati dužinu od oko 8 bp do oko 10 bp, od oko 10 bp do oko 15 bp, od oko 15 bp do oko 18 bp, od oko 18 bp do oko 20, od oko 20 bp do oko 25 bp, od oko 25 bp do oko 30 bp, od oko 30 bp do oko 35 bp, od oko 35 bp do oko 40 bp, ili od oko 40 bp do oko 50 bp. U nekim otelotvorenjima, dsRNK dupleks segmenta vezivanja za protein ima dužinu od 36 parova baza. Procenat komplementarnosti između nukleotidnih sekvenci koje se hibridizuju da bi formirale dsRNK dupleks segmenta vezivanja za protein može biti najmanje oko 60%. Na primer, procenat komplementarnosti između nukleotidnih sekvenci koje se hibridizuju da bi formirale dsRNK dupleks segmenta koji se vezuje za protein može biti najmanje oko 65%, najmanje oko 70%, najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 98%, ili najmanje oko 99%. U nekim slučajevima, procenat komplementarnosti između nukleotidnih sekvenci koje se hibridizuju da bi formirale dsRNK dupleks segmenta koji se vezuje za protein je 100%.
Na mesto usmereni modifikujući polipeptid
RNK koja cilja na DNK i polipeptid za modifikovanje usmerenog ka mestu koji je prirodna Cas9 endonukleaza formiraju kompleks. RNK koja cilja na DNK obezbeđuje ciljnu specifičnost kompleksu tako što sadrži nukleotidnu sekvencu koja je komplementarna sekvenci ciljne DNK (kao što je gore navedeno). Modifikovani polipeptid kompleksa usmeren na mesto obezbeđuje aktivnost specifičnu za mesto. Drugim rečima, polipeptid za modifikovanje usmeren na mesto je vođen do DNK sekvence (npr. hromozomske sekvence ili ekstrahromozomske sekvence, npr. epizomalne sekvence, sekvence minokruga, mitohondrijalne sekvence, sekvence hloroplasta, itd.) na osnovu njegove povezanosti sa najmanje segmentom koji se vezuje za proteine RNK koja cilja na DNK (opisano gore).
Polipeptid za modifikovanje usmeren na mesto (koji kao takav nije prema pronalasku) modifikuje ciljnu DNK (npr. cepanje). Polipeptid za modifikovanje (koji kao takav nije prema pronalasku) usmeren na mesto se takođe pominje ovde kao „polipeptid usmeren na mesto“ ili „polipeptid za modifikovanje usmeren na mesto vezivanja RNK“.
Modifikovani polipeptid usmeren na mesto (koji kao takav nije prema pronalasku) je prirodni modifikujući polipeptid.
Primeri prirodno prisutnih modifikujućih polipeptida (koji kao takav nije prema pronalasku) usmerenih ka mestu navedeni su u SEQ ID NO: 1-255 kao neograničavajuća i neiscrpna lista endonukleaza Cas9/Csn1 koje se pojavljuju u prirodi. Ovi prirodni polipeptidi (koji kao takav nije prema pronalasku), kao što je ovde objavljeno, vezuju RNK koja cilja na DNK, na taj način se usmeravaju na specifičnu sekvencu unutar ciljne DNK i brazdaju ciljnu DNK da bi generisali prekid dvostrukog lanca. Polipeptid za modifikovanje (koji kao takav nije prema pronalasku) usmeren na mesto za upotrebu sadrži dva dela, deo koji se vezuje za RNK i deo za aktivnost. U nekim otelotvorenjima, predmetni polipeptid za modifikovanje usmeren na mesto sadrži: (i) deo koji se vezuje za RNK koji je u interakciji sa RNK ciljanom DNK, naznačeno time što DNK ciljana RNK sadrži nukleotidnu sekvencu koja je komplementarna sekvenci u ciljnoj DNK; i (ii) deo aktivnosti koji pokazuje enzimsku aktivnost usmerenu na mesto (aktivnost za cepanje DNK), pri čemu je mesto enzimske aktivnosti određeno RNK koja cilja na DNK.
Predmetni modifikujući polipeptid (koji kao takav nije prema pronalasku) usmeren na mesto za upotrebu ima enzimsku aktivnost koja modifikuje ciljnu DNK aktivnošću nukleaze.
Primeri polipeptida za modifikovanje usmerenih na mesto
U nekim slučajevima, polipeptid za modifikovanje (koji kao takav nije prema pronalasku) usmeren na mesto sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 99%, ili 100%, identičnost aminokiselinske sekvence sa aminokiselinama 7-166 ili 731-1003 aminokiselinske sekvence Cas9/Csn1 prikazane na Slici 3, ili sa odgovarajućim delovima u bilo kojoj od sekvenci aminokiselina navedenih kao SEQ ID NO: 1-256 i 795-1346.
Modifikacije nukleinske kiseline
U nekim otelotvorenjima, predmetna DNK koja cilja RNK sadrži jednu ili više modifikacija, npr. modifikaciju baze, modifikaciju kičme, itd, da bi se nukleinskoj kiselini obezbedila nova ili poboljšana karakteristika (npr. poboljšana stabilnost). Kao što je poznato u predmetnoj oblasti, nukleozid je kombinacija baza-šećer. Bazni deo nukleozida je normalno heterociklična baza. Dve najčešće klase takvih heterocikličnih baza su purini i pirimidini. Nukleotidi su nukleozidi koji dalje uključuju fosfatnu grupu kovalentno povezanu sa šećernim delom nukleozida. Za one nukleozide koji uključuju pentofuranozil šećer, fosfatna grupa može biti povezana sa 2', 3' ili 5' hidroksilnim delom šećera. U formiranju oligonukleotida, fosfatne grupe kovalentno povezuju susedne nukleozide jedne sa drugima da bi se formiralo linearno polimerno jedinjenje. Zauzvrat, odgovarajući krajevi ovog linearnog polimernog jedinjenja mogu se dalje spojiti da bi se formiralo kružno jedinjenje, međutim, linearna jedinjenja su generalno pogodna. Pored toga, linearna jedinjenja mogu imati internu komplementarnost nukleotidnih baza i stoga se mogu savijati na način da proizvedu potpuno ili delimično dvolančano jedinjenje. Unutar oligonukleotida, fosfatne grupe se obično nazivaju formiranjem internukleozidne kičme oligonukleotida. Normalna veza ili kičma RNK i DNK je 3' do 5' fosfodiestarska veza.
Modifikovane kičme i modifikovane internukleozidne veze
Primeri pogodnih RNK ciljanih na DNK koje sadrže modifikacije uključuju DNK ciljane RNK koje sadrže modifikovane kičme ili neprirodne internukleozidne veze. RNK ciljane na DNK koje imaju modifikovane kičme uključuju one koje zadržavaju atom fosfora u kičmi i one koje nemaju atom fosfora u kičmi.
Odgovarajuće modifikovane oligonukleotidne kičme koje sadrže atom fosfora u sebi uključuju, na primer, fosforotioate, hiralne fosforotioate, fosforoditioate, fosfotriestre, aminoalkilfosfotriestre, metil i druge alkil fosfonate uključujući 3'-alkilen fosfonate, 5'-alkilen fosfonate i hiralne fosfonate, fosfinate, fosforamidate uključujući 3'-amino fosforamidate i aminoalkilfosforamidate, fosforodiamidate, tionofosforamidate, tionoalkilfosfonate, tionoalkilfosfotriestre, selenofosfate i boranofosfate koji imaju normalne 3'-5' veze, 2'-5' povezani analozi ovih, i oni koji imaju obrnuti polaritet naznačeno time što je jedna ili više internukleotidnih veza 3' prema 3', 5' do 5' ili 2' do 2' veza. Pogodne RNK koje ciljaju DNK sa obrnutim polaritetom sadrže jednu vezu od 3' do 3' na 3'-naj internukleotidnoj vezi, tj. jedan invertovani nukleozidni talog koji može biti bazni (nukleobaza nedostaje ili ima hidroksilnu grupu na svom mestu). Uključene su i različite soli (kao što su, na primer, kalijum ili natrijum), mešane soli i oblici slobodnih kiselina.
U nekim otelotvorenjima, predmetna RNK ciljana na DNK sadrži jednu ili više fosforotioatnih i/ili heteroatomskih internukleozidnih veza, posebno -CH2-NH-O-CH2-, -CH2-N(CH3)-O- CH2- (poznat kao metilenska (metilimino) ili MMI kičma), -CH2-ON(CH3)-CH2-, -CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2- i -ON(CH3)-CH2-CH2-(naznačeno time što je nativna fosfodiestarska internukleotidna veza predstavljena kao -OP(=O)(OH)-O-CH2-). Internukleozidne veze tipa MMI su otkrivene u gore navedenom US Pat. br.5,489,677. Pogodne amidne internukleozidne veze su otkrivene u US Pat. br.5,602,240.
Takođe su pogodne RNK koje ciljaju DNK koje imaju morfolino strukture kičme kao što je opisano u, npr., US Pat. br.5,034,506. Na primer, u nekim otelotvorenjima, predmetne RNK ciljane na DNK sadrže 6-člani morfolino prsten umesto riboznog prstena. U nekim od ovih otelotvorenja, fosforodiamidatna ili druga nefosfodiestarska internukleozidna veza zamenjuje fosfodiestarsku vezu.
Pogodne modifikovane polinukleotidne kičme koje ne uključuju atom fosfora u sebi imaju kičme koje su formirane kratkolančanim alkil ili cikloalkil internukleozidnim vezama, mešanim heteroatomom i alkil ili cikloalkil internukleozidnim vezama, ili jednom ili više kratkih lančanih heteroatomskih ili heterocikličnih veza međunukleozidnih veza. Ovo uključuje one koji imaju morfolino veze (formirane delimično od šećera u delu nukleozida); siloksanske kičme; sulfidne, sulfoksidne i sulfonske kičme; formacetil i tioformacetil kičme; metilen formacetil i tioformacetil kičme; riboacetil kičme; kičme koje sadrže alken; sulfamatne kičme; metileneimino i metilenhidrazino kičme; sulfonatne i sulfonamidne kičme; amidne kičme; i drugi koji imaju pomešane delove N, O, S i CH2 komponenti.
Mimetika
RNK koje ciljaju na DNK mogu biti mimetik nukleinske kiseline. Termin „mimetički“ kako se primenjuje na polinukleotide treba da obuhvati polinukleotide naznačeno time što su samo furanozni prsten ili i furanozni prsten i internukleotidna veza zamenjeni nefuranoznim grupama, zamena samo furanoznog prstena se takođe pominje u predmetnoj oblasti kao surogat šećera. Heterociklični bazni deo ili modifikovani heterociklični bazni deo se održava za hibridizaciju sa odgovarajućom ciljnom nukleinskom kiselinom. Jedna takva nukleinska kiselina, polinukleotidni mimetik za koji se pokazalo da ima odlična svojstva hibridizacije, naziva se peptidna nukleinska kiselina (PNA). U PNA, šećerna kičma polinukleotida je zamenjena kičmom koja sadrži amid, posebno aminoetilglicin kičmom. Nukleotidi se zadržavaju i vezuju direktno ili indirektno za atome aza azota u amidnom delu kičme.
Jedan polinukleotidni mimetik za koji je prijavljeno da ima odlična svojstva hibridizacije je peptidna nukleinska kiselina (PNA). Kičma u jedinjenjima PNA su dve ili više povezanih aminoetilglicinskih jedinica koje daju PNA kičmu koja sadrži amid. Heterociklični bazni delovi su vezani direktno ili indirektno za atome aza azota u amidnom delu kičme. Reprezentativni U.S. patenti koji opisuju pripremu PNA jedinjenja uključuju, ali nisu ograničeni na: US Pat. br.
5,539,082; 5714331; i 5,719,262.
Druga klasa polinukleotidnih mimetika koja je proučavana zasniva se na povezanim morfolino jedinicama (morfolino nukleinska kiselina) koje imaju heterociklične baze vezane za morfolino prsten. Izvestan je broj grupa za vezivanje koje povezuju morfolino monomerne jedinice u morfolino nukleinskoj kiselini. Jedna klasa grupa za vezivanje je odabrana da bi se dobilo nejonsko oligomerno jedinjenje. Manja je verovatnoća da će nejonska oligomerna jedinjenja na bazi morfolina imati neželjene interakcije sa ćelijskim proteinima. Polinukleotidi zasnovani na morfolinu su nejonski mimici oligonukleotida za koje je manja verovatnoća da formiraju neželjene interakcije sa ćelijskim proteinima (Dwaine A. Braasch and David R. Corey, Biochemistry, 2002, 41(14), 4503-4510).
Polinukleotidi na bazi morfolina su objavljeni u US Pat. br.5,034,506. Pripremljena su različita jedinjenja u okviru morfolino klase polinukleotida, koja imaju niz različitih veznih grupa koje spajaju monomerne podjedinice.
Sledeća klasa polinukleotidnih mimetika se naziva cikloheksenil nukleinske kiseline (CeNA). Furanozni prsten koji je normalno prisutan u molekulu DNK/RNK je zamenjen cikloheksenil prstenom. Monomeri fosforamidita zaštićeni CeNA DMT su pripremljeni i korišćeni za sintezu oligomernih jedinjenja prema klasičnoj hemiji fosforamidita. Pripremljena su i proučavana potpuno modifikovana CeNA oligomerna jedinjenja i oligonukleotidi koji imaju specifične pozicije modifikovane sa CeNA (videti Wang i sar., J. Am. Chem. Soc., 2000, 122, 8595-8602). Generalno, ugradnja CeNA monomera u lanac DNK povećava njegovu stabilnost hibrida DNK/RNK. CeNA oligoadenilati su formirali komplekse sa RNK i DNK komplementima sa sličnom stabilnošću kao prirodni kompleksi. NMR i kružni dihroizam su pokazali da proučavanje inkorporiranja CeNA struktura u strukture prirodnih nukleinskih kiselina nastavlja sa lakom konformacionom adaptacijom.
Dalja modifikacija uključuje zaključane nukleinske kiseline (LNA) u kojima je 2'-hidroksilna grupa povezana sa 4' atomom ugljenika u šećernom prstenu formirajući tako 2'-C,4'-C-oksimetilensku vezu čime se formira biciklični šećerni deo. Veza može biti metilen (-CH2-), grupa koja premošćuje 2' atom kiseonika i 4' atom ugljenika naznačeno time što je n 1 ili 2 (Singh i sar., Chem. Commun., 1998, 4, 455-456). LNA i LNA analozi pokazuju veoma visoku dupleks termičku stabilnost sa komplementarnim DNK i RNK (Tm=+3 do 10 °C), stabilnost prema 3'-egzonukleolitičkoj degradaciji i dobra svojstva rastvorljivosti. Opisani su moćni i netoksični antisens oligonukleotidi koji sadrže LNA (Wahlestedt i sar., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 2000, 97, 5633-5638).
Opisana je sinteza i priprema LNA monomera adenina, citozina, guanina, 5-metilcitozina, timina i uracila, zajedno sa njihovom oligomerizacijom i osobinama prepoznavanja nukleinske kiseline (Koshkin i sar., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630). LNA i njihova priprema su takođe opisani u WO 98/39352 i WO 99/14226.
Modifikovani delovi šećera
Predmetna DNK ciljana RNK za upotrebu takođe može uključiti jedan ili više supstituisanih šećernih delova. Pogodni polinukleotidi obuhvataju grupu supstituenata šećera izabranu od: OH; F; O-, S- ili N-alkil; O-, S- ili N-alkenil; O-, S- ili N-alkinil; ili O-alkil-O-alkil, naznačeno time što alkil, alkenil i alkinil mogu biti supstituisani ili nesupstituisani C.sub.1 do C10 alkil ili C2 do C10 alkenil i alkinil. Posebno su pogodni O((CH2)nO)mCH3, O(CH2)nOCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2, i O(CH2)nON((CH2)nCH3)2, naznačeno time što su n i m od 1 do oko 10. Drugi pogodni polinukleotidi obuhvataju grupu supstituenata šećera izabranu od: C1 do C10 niži alkil, supstituisani niži alkil, alkenil, alkinil, alkaril, aralkil, O-alkaril ili O-aralkil, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, heterocikloalkil, heterocikloalkaril, aminoalkilamino, polialkilamino, supstituisani silil, grupa koja brazda RNK, reporterska grupa, interkalator, grupa za poboljšanje farmakokinetičkih svojstava oligonukleotida, ili grupa za poboljšanje farmakodinamičkih svojstava oligonukleotida, i drugih supstituenata koji imaju slična svojstva. Pogodna modifikacija uključuje 2'-metoksietoksi (2'-O-CH2CH2OCH3, takođe poznat kao 2'-O-(2-metoksietil) ili 2'-MOE) (Martin i sar.,Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504), tj. alkoksialkoksi grupa. Dalja pogodna modifikacija uključuje 2'-dimetilaminooksietoksi, tj.
O(CH2)2ON(CH3)2 grupu, takođe poznatu kao 2'-DMAOE, kao što je opisano u primerima u nastavku, i 2'-dimetilaminoetoksietoksi (takođe poznat u predmetnoj oblasti kao 2'-O-dimetil-amino-etoksi-etil ili 2'-DMAEOE), tj.2'-O-CH2-O-CH2-N(CH3)2.
Druge pogodne grupe supstituenata za šećer uključuju metoksi (-O-CH3), aminopropoksi (--O CH2 CH2 CH2NH2), alil (-CH2-CH=CH2), -O-alil (--O--CH2-CH=CH2) i fluoro (F). grupe supstituenta 2'-šećera mogu biti u arabino (gore) ili ribo (dole) položaju. Pogodna 2'-arabino modifikacija je 2'-F. Slične modifikacije se takođe mogu napraviti na drugim pozicijama oligomernog jedinjenja, posebno na 3' poziciji šećera na 3' terminalnom nukleozidu ili u 2'-5' povezanim oligonukleotidima i 5' poziciji 5' terminalnog nukleotida. Oligomerna jedinjenja mogu takođe imati mimetike šećera kao što su ciklobutil delovi umesto pentofuranozil šećera.
Modifikacije i zamene baze
Predmetna DNK ciljana RNK može takođe uključiti modifikacije ili supstitucije nukleobaze (često se u predmetnoj oblasti pominju jednostavno kao „baza“). Kako se ovde koriste, „nemodifikovane“ ili „prirodne“ nukleobaze uključuju purinske baze adenin (A) i gvanin (G), i pirimidinske baze timin (T), citozin (C) i uracil (U). Modifikovane nukleobaze uključuju druge sintetičke i prirodne nukleobaze kao što su 5-metilcitozin (5-me-C), 5-hidroksimetil citozin, ksantin, hipoksantin, 2-aminoadenin, 6-metil i drugi alkil derivati adenina i guanina, 2-propil i drugi alkil derivati adenina i guanina, 2-tiouracil, 2-tiotimin i 2-tiocitozin, 5-halouracil i citozin, 5-propinil (-C=C-CH3) uracil i citozin i drugi alkinil derivati pirimidinskih baza, 6-azo uracil, citozin i timin, 5-uracil (pseudouracil), 4-tiouracil, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalkil, 8-hidroksil i drugi 8-supstituisani adenini i gvanini, 5-halo posebno 5-bromo, 5-trifluorometil i drugi 5-supstituisani uracili i citozini, 7-metilgvanin i 7-metiladenin, 2-F-adenin, 2-aminoadenin, 8-azagvanin i 8-azaadenin, 7-deazagvanin i 7-deazadenin i 3-deazagvanin i 3-deazaadenin. Dalje modifikovane nukleobaze uključuju triciklične pirimidine kao što su fenoksazin citidin(1H-pirimido(5,4-b)(1,4)benzoksazin-2(3H)-on), fenotiazin citidin (1H-pirimido(5,4-b)(1,4)benzotiazin-2(3H)-on), G-stezaljke kao što je supstituisani fenoksazin citidin (npr.9-(2-aminoetoksi)-H-pirimido(5,4-(b) (1,4)benzoksazin -2(3H)-on), karbazol citidin (2H-pirimido(4,5-b)indol-2-on), piridoindol citidin (H-pirido(3',2':4,5)pirolo(2, 3-d)pirimidin-2-on).
Heterociklične bazne grupe mogu takođe uključiti one u kojima je purinska ili pirimidinska baza zamenjena drugim heterociklima, na primer 7-deazaadenin, 7-deazagvanozin, 2-aminopiridin i 2-piridon. Dalje nukleobaze uključuju one objavljene u US Pat. br.3,687,808, one objavljene u The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, strane 858-859, Kroschwitz, J. I., ed. John Wiley & Sons, 1990, one koje su objavili Englisch i sar., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613, i one koje je objavio Sanghvi, Y.S., Poglavlje 15, Antisense Research and Applications, strane 289-302, Crooke, S.T. i Lebleu, B., ur., CRC Press, 1993. Neke od ovih nukleobaza su korisne za povećanje afiniteta vezivanja oligomernog jedinjenja. Ovo uključuje 5-supstituisane pirimidine, 6-azapirimidine i N-2, N-6 i O-6 supstituisane purine, uključujući 2-aminopropiladenin, 5-propiniluracil i 5-propinilcitozin. Pokazalo se da supstitucije 5-metilcitozina povećavaju stabilnost dupleksa nukleinske kiseline za 0,6-1,2 °C. (Sanghvi i sar., ur., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, str.276-278) i pogodne su bazne supstitucije, npr. kada se kombinuju sa modifikacijama 2'-O-metoksietil šećera.
Konjugati
Druga moguća modifikacija predmetne DNK ciljane RNK uključuje hemijsko povezivanje sa polinukleotidom jedne ili više grupa ili konjugata koji pojačavaju aktivnost, ćelijsku distribuciju ili ćelijsko preuzimanje oligonukleotida. Ovi delovi ili konjugati mogu uključiti konjugatne grupe kovalentno vezane za funkcionalne grupe kao što su primarne ili sekundarne hidroksilne grupe.
Konjugatne grupe uključuju, ali nisu ograničene na, interkalatore, reporterske molekule, poliamine, poliamide, polietilen glikole, polietre, grupe koje poboljšavaju farmakodinamička svojstva oligomera i grupe koje poboljšavaju farmakokinetička svojstva oligomera. Pogodne grupe konjugata uključuju, ali nisu ograničene na, holesterol, lipide, fosfolipide, biotin, fenazin, folat, fenantridin, antrahinon, akridin, fluoresceine, rodamine, kumarine i boje. Grupe koje poboljšavaju farmakodinamička svojstva uključuju grupe koje poboljšavaju apsorpciju, povećavaju otpornost na degradaciju i/ili jačaju hibridizaciju specifičnu za sekvencu sa ciljnom nukleinskom kiselinom. Grupe koje poboljšavaju farmakokinetička svojstva uključuju grupe koje poboljšavaju unos, distribuciju, metabolizam ili izlučivanje predmetne nukleinske kiseline.
Konjugovani delovi uključuju ali nisu ograničeni na lipidne delove kao što je deo holesterola (Letsinger i sar., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6553-6556), holna kiselina (Manoharan i sar., Bioorg. Med. Chem. Let., 1994, 4, 1053-1060), tioetar, na primer, heksil-S-tritiltiol (Manoharan i sar., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660, 306-309; Manoharan i sar., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3, 2765-2770), tioholesterol (Oberhauser i sar., Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533-538), alifatski lanac, npr. talozi dodekandiola ili undecila (Saison-Behmoaras i sar., EMBO J., 1991, 10, 1111-1118; Kabanov i sar., FEBS Lett., 1990, 259, 327-330; Svinarchuk i sar., Biochimie, 1993, 75, 49-54), fosfolipid, npr. di-heksadecilrac-glicerol ili trietilamonijum 1,2-di-0-heksadecil-rac-glicero-3-H-fosfonat (Manoharan i sar., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654; Shea i sar., Nucl.
Acids Res., 1990, 18, 3777-3783), poliamin ili polietilen glikol lanac (Manoharan i sar., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969-973), ili adamantna sirćetna kiselina (Manoharan i sar., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654), palmitilni deo (Mishra i sar., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229-237), ili oktadecilamin ili heksilamino-karbonil-oksiholesterol deo (Crooke i sar., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277, 923-937.\
Konjugat može uključivati „domen transdukcije proteina“ ili PTD (takođe poznat kao CPP - peptid koji prodire u ćeliju), što se može odnositi na polipeptid, polinukleotid, ugljene hidrate ili organsko ili neorgansko jedinjenje koje olakšava prolazak kroz lipidni dvosloj, micelu, ćelijsku membranu, membranu organela ili membranu vezikula. PTD vezan za drugi molekul, koji može da se kreće od malog polarnog molekula do velikog makromolekula i/ili nanočestice, olakšava molekulu da prolazi kroz membranu, na primer da ide od ekstracelularnog prostora do intracelularnog prostora, ili citosola do unutar organele. U nekim otelotvorenjima, PTD je kovalentno vezan za nukleinsku kiselinu (npr. RNK koja cilja DNK, polinukleotid koji kodira RNK ciljanu na DNK itd.). Primeri PTD uključuju, ali nisu ograničeni na, minimalni domen transdukcije undekapeptidnog proteina (koji odgovara talozima 47-57 HIV-1 TAT koji sadrži YGRKKRRQRRR; SEQ ID NO:264); poliargininska sekvenca koja sadrži određeni broj arginina dovoljan da usmeri ulazak u ćeliju (npr.3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili 10-50 arginina); VP22 domen (Zender i sar. (2002) Cancer Gene Ther.9(6):489-96); domen transdukcije proteina Drosophila Antennapedia (Noguchi i sar. (2003) Diabetes 52(7):1732-1737); skraćeni ljudskii kalcitonin peptid (Trehin i sar. (2004) Pharm. Research 21:1248-1256); polilizin (Wender i sar. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:13003-13008); RRQRRTSKLMKR (SEQ ID NO:265); Transportan GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL (SEQ ID NO:266);
KALAWEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKCEA (SEQ ID NO:267); i RQIKIWFQNRRMKWKK (SEQ ID NO:268). Primeri PTD uključuju, ali nisu ograničeni na, YGRKKRRQRRR (SEQ ID NO:264), RKKRRQRRR (SEQ ID NO:269); homopolimer arginina od 3 argininska taloga do 50 argininskih taloga; Primeri aminokiselinskih sekvenci PTD domena uključuju, ali nisu ograničeni na, bilo šta od sledećeg: YGRKKRRQRRR (SEQ ID NO:264); RKKRRQRR (SEQ ID NO:270); YARAAARQARA (SEQ ID NO:271); THRLPRRRRRR (SEQ ID NO:272); i GGRRARRRRRR (SEQ ID NO:273). U nekim otelotvorenjima, PTD je aktivirajući CPP (ACPP) (Aguilera i sar. (2009) Integr Biol (Camb) June; 1(5-6): 371-381). ACPP sastoje se od polikationskog CPP (npr. Arg9 ili „R9“) koji je povezan preko spojnice koja se može brazdati sa odgovarajućim polianjonom (npr. Glu9 ili „E9“), koji smanjuje neto naelektrisanje na skoro nulu i na taj način inhibira adheziju i upijanje u ćelije. Nakon brazdanja linkera, polianion se oslobađa, lokalno demaskira poliarginin i njegovu inherentnu adhezivnost, čime se „aktivira“ ACPP da prolazi kroz membranu.
Primeri RNK koji ciljaju DNK
U nekim otelotvorenjima, pogodna RNK koja cilja na DNK sadrži dva odvojena RNK polinukleotidna molekula. Prvi od dva odvojena RNK polinukleotidnih molekula (aktivatorska RNK) sadrži nukleotidnu sekvencu koja ima najmanje oko 60%, najmanje oko 65%, najmanje oko 70%, najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 98%, najmanje oko 99%, ili 100% identičnost nukleotidne sekvence na potezu od najmanje 8 susednih nukleotida prema bilo kojoj od nukleotidnih sekvenci navedenih u SEQ ID NO: 431-562, ili njihovih komplemenata. Drugi od dva odvojena RNK polinukleotidnih molekula (ciljna RNK) sadrži nukleotidnu sekvencu koja ima najmanje oko 60%, najmanje oko 65%, najmanje oko 70%, najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 98%, najmanje oko 99%, ili 100% identičnost nukleotidne sekvence na potezu od najmanje 8 susednih nukleotida prema bilo kojoj od nukleotidnih sekvenci navedenih u SEQ ID NO: 563-679, ili njihovih komplemenata.
U nekim otelotvorenjima, pogodna RNK koja cilja na DNK je jedan polinukleotid RNK i sadrži prvu nukleotidnu sekvencu koja ima najmanje oko 60%, najmanje oko 65%, najmanje oko 70%, najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 98%, najmanje oko 99%, ili 100% identičnost nukleotidne sekvence na potezu od najmanje 8 uzastopnih nukleotida do bilo koje od nukleotidnih sekvenci navedenih u SEQ ID NO: 431-562 i drugu nukleotidnu sekvencu koja ima najmanje oko 60%, najmanje oko 65%, najmanje oko 70%, najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 98%, najmanje oko 99%, ili 100% identičnost nukleotidne sekvence na potezu od najmanje 8 susednih nukleotida prema bilo kojoj od nukleotidnih sekvenci navedenih u SEQ ID NO: 463-679.
U nekim otelotvorenjima, RNK koja cilja na DNK je RNK sa dvostrukim molekulom, a ciljna RNK sadrži sekvencu 5'GUUUUAGAGCUA-3' (SEQ ID NO:679) povezanu na svom 5' kraju za deo nukleotida koji su komplementarni ciljnoj DNK. U nekim otelotvorenjima, RNK koja cilja na DNK je RNK koja cilja na DNK sa dvostrukim molekulom, a aktivatorska RNK sadrži sekvencu 5' UAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCG-3' (SEQ ID NO://).
U nekim otelotvorenjima, RNK koja cilja na DNK je RNK koja cilja na DNK sa jednim molekulom i sadrži sekvencu 5'-GUUUUAGAGCUA-linker-UAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCG-3' povezanu na svom 5' kraju za deo nukleotida komplementarnih na ciljnu DNK (naznačeno time što „linker“ označava bilo koju linker nukleotidnu sekvencu koja može da sadrži bilo koju nukleotidnu sekvencu) (SEQ ID NO://). Drugi primeri RNK koji ciljaju jednomolekulsku DNK uključuju one navedene u SEQ ID NO: 680-682.
Nukleinske kiseline koje kodiraju predmetnu DNK ciljanu RNK
Predmetno obelodanjivanje obezbeđuje nukleinsku kiselinu koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira predmetnu RNK sa jednim molekulom DNK. U nekim otelotvorenjima, predmetna nukleinska kiselina koja kodira RNK sa jednim molekulom DNK je vektor ekspresije, npr. rekombinantni ekspresioni vektor.
Rekombinantni ekspresioni vektor može biti virusni konstrukt, npr., rekombinantni adeno-povezani virusni konstrukt (videti, npr. US Patent br.
7,078,387), rekombinantni adenovirusni konstrukt, rekombinantni lentivirusni konstrukt, rekombinantni retrovirusni konstrukt, itd.
Pogodni ekspresioni vektori uključuju, ali nisu ograničeni na, virusne vektore (npr. virusne vektore zasnovane na virusu vakcinije; poliovirus; adenovirus (videti, npr., Li i sar., Invest Opthalmol Vis Sci 35:25432549, 1994; Borras i sar., Gene Ther 6:515524, 1999; Li and Davidson, PNAS 92:77007704,
1995; Sakamoto i sar., H Gene Ther 5:10881097, 1999; WO 94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 i WO 95/00655); virus povezan sa adeno (videti, npr., Ali i sar., Hum Gene Ther 9:8186, 1998, Flannery i sar., PNAS 94:69166921, 1997; Bennett i sar., Invest Opthalmol Vis Sci 38:2857 2863, 1997; Jomary i sar., Gene Ther 4:683690, 1997, Rolling i sar., Hum Gene Ther 10:641648, 1999; Ali i sar., Hum Mol Genet 5:591594, 1996; Srivastava u WO 93/09239, Samulski i sar., J. Vir. (1989) 63:3822-3828; Mendelson i sar., Virol. (1988) 166:154-165; i Flotte i sar., PNAS (1993) 90:10613-10617); SV40; virus herpes simpleksa; virus ljudske imunodeficijencije (videti, npr., Miyoshi i sar., PNAS 94:1031923, 1997; Takahashi i sar., J Virol 73:78127816, 1999); retrovirusni vektor (npr. virus mišje leukemije, virus nekroze slezine i vektori izvedeni iz retrovirusa kao što su Rousov sarkomski virus, Harvey sarkomski virus, virus leukoze ptica, lentivirus, virus ljudske imunodeficijencije, virus mijeloproliferativnog sarkoma i virus tumora dojke); i slično.
Stručnjacima u predmetnoj oblasti su poznati brojni pogodni ekspresioni vektori, a mnogi su komercijalno dostupni. Sledeći vektori su dati kao primer; za eukariotske ćelije domaćine: pXT1, pSG5 (Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG i pSVLSV40 (Pharmacia). Međutim, može se koristiti bilo koji drugi vektor sve dok je kompatibilan sa ćelijom domaćinom.
U zavisnosti od sistema domaćin/vektor koji se koristi, bilo koji od brojnih pogodnih elemenata za kontrolu transkripcije i translacije, uključujući konstitutivne i inducibilne promotere, elemente pojačivača transkripcije, terminatore transkripcije, itd. može se koristiti u vektoru ekspresije (videti npr.
Bitter i sar. (1987) Methods in Enzymology, 153:516-544).
U nekim otelotvorenjima, nukleotidna sekvenca koja kodira jednomolekulsku DNK ciljanu RNK je operativno povezana sa kontrolnim elementom, npr., elementom za kontrolu transkripcije, kao što je promoter.
Element kontrole transkripcije može biti funkcionalan bilo u eukariotskoj ćeliji, npr. u ćeliji sisara; ili prokariotskoj ćeliji (npr. bakterijska ili arhealna ćelija). U nekim otelotvorenjima, nukleotidna sekvenca koja kodira jednomolekulsku DNK ciljanu RNK je operativno povezana sa višestrukim kontrolnim elementima koji omogućavaju ekspresiju nukleotidne sekvence koja kodira jednomolekulsku DNK ciljanu RNK u prokariotskim i eukariotskim ćelijama.
Neograničavajući primeri pogodnih eukariotskih promotera (promoteri funkcionalni u eukariotskoj ćeliji) uključuju one iz citomegalovirusa (CMV) neposredno ranog, herpes simpleks virusa (HSV) timidin kinaze, ranog i kasnog SV40, dugih terminalnih ponavljanja (LTR) iz retrovirusa, i mišji metalotionein-I. Izbor odgovarajućeg vektora i promotera je u okviru nivoa uobičajene veštine u predmetnoj oblasti. Ekspresioni vektor može takođe da sadrži mesto vezivanja ribozoma za iniciranje translacije i terminator transkripcije. Ekspresioni vektor može takođe uključiti odgovarajuće sekvence za pojačavanje ekspresije.
Ekspresioni vektor može takođe uključiti nukleotidne sekvence koje kodiraju proteinske oznake (npr.6xHis oznaku, hemaglutininsku oznaku, zeleni fluorescentni protein, itd.) koje su fuzionisane sa polipeptidom za modifikovanje usmerenim na mesto, čime se dobija himerni polipeptid.
U nekim otelotvorenjima, nukleotidna sekvenca koja kodira jednomolekulsku DNK ciljanu RNK je operativno povezana sa inducibilnim promoterom. U nekim otelotvorenjima, nukleotidna sekvenca koja kodira jednomolekulsku DNK ciljanu RNK je operativno povezana sa konstitutivnim promoterom.
Postupci uvođenja nukleinske kiseline u ćeliju domaćina su poznati u predmetnoj oblasti, i bilo koji poznati postupak se može koristiti za uvođenje nukleinske kiseline (npr. ekspresioni konstrukt) u ćeliju. Pogodni postupci uključuju npr. virusnu ili bakteriofagnu infekciju, transfekciju, konjugaciju, fuziju protoplasta, lipofekciju, elektroporaciju, taloženje kalcijum fosfata, transfekciju posredovanu polietileniminom (PEI), transfekciju posredovanu DEAE-dekstranom, transfekciju posredovanu lipozomima, tehnologiju pištolja za čestice, taloženje kalcijum fosfata, direktnu mikro injekciju, isporuku nukleinske kiseline posredovanu nanočesticama (videti, npr. Panyam et., al Adv Drug Deliv Rev. 2012 Sep 13. pii: S0169-409X(12)00283-9. doi: 10.1016/j.addr.2012.09.023 ), i sl.
Kao što je gore diskutovano, RNK koja cilja na DNK i prirodni Cas9 polipeptid formiraju kompleks. RNK koja cilja na DNK obezbeđuje ciljnu specifičnost kompleksu tako što sadrži nukleotidnu sekvencu koja je komplementarna sekvenci ciljne DNK. Prirodni Cas9 polipeptid kompleksa obezbeđuje aktivnost specifičnu za mesto. Kompleks subjekta modifikuje ciljnu DNK, što dovodi do cepanja DNK. Ciljna DNK može biti, na primer, hromozomska DNK u ćelijama in vitro itd.
U nekim slučajevima, modifikovani polipeptid usmeren na mesto pokazuje aktivnost nukleaze koja brazda ciljnu DNK na ciljnoj DNK sekvenci definisanoj regionom komplementarnosti između RNK ciljane na DNK i ciljne DNK. Polipeptid za modifikovanje usmeren na mesto je prirodni polipeptid Cas9, a brazdanje specifično za mesto ciljne DNK se dešava na lokacijama koje su određene i (i) komplementarnošću uparivanja baza između RNK koja cilja na DNK i ciljne DNK; i (ii) kratkim motivom [koji se naziva protospacer susedni motiv (PAM)] u ciljnoj DNK. U nekim otelotvorenjima (npr. kada se koristi Cas9 iz S. pyogenes, ili blisko srodan Cas9 (videti SEQ ID NO: 1-256 i 795-1346)), PAM sekvenca nekomplementarnog lanca je 5'- XGG-3', naznačeno time što je X bilo koji nukleotid DNK, a X je odmah 3' ciljne sekvence nekomplementarnog lanca ciljne DNK (videti Sliku 10). Kao takva, PAM sekvenca komplementarnog lanca je 5'-CCY-3', naznačeno time što je Y bilo koji nukleotid DNK, a Y je odmah 5' ciljne sekvence komplementarnog lanca ciljne DNK (pogledajte Sliku 10 gde je PAM nekomplementarnog lanca 5'-GGG-3', a PAM komplementarnog lanca je 5'-CCC-3'). U nekim takvim otelotvorenjima, X i Y mogu biti komplementarni i X-Y bazni par može biti bilo koji bazni par (npr. X=C i Y=G; X=G i Y=C; X=A i Y=T, X=T i Y=A).
U nekim slučajevima, različiti Cas9 proteini (tj. Cas9 proteini različitih vrsta) mogu biti korisni za korišćenje u različitim obezbeđenim postupcima kako bi se iskoristile različite enzimske karakteristike različitih Cas9 proteina (npr. za različite preferencije PAM sekvence; za povećanu ili smanjenu enzimsku aktivnost; za povećan ili smanjen nivo ćelijske toksičnosti; da promeni ravnotežu između NHEJ-a, popravke usmerene na homologiju, prekida jednog lanca, prekida dvostrukog lanca, itd.). Cas9 proteini iz različitih vrsta (videti SEQ ID NO: 1-256 i 795-1346) mogu zahtevati različite PAM sekvence u ciljnoj DNK. Stoga, za određeni Cas9 protein po izboru, zahtev za PAM sekvencom može biti drugačiji od 5'-XGG-3' sekvence opisane gore.
Mnogi Cas9 ortolozi iz širokog spektra vrsta su identifikovani ovde i proteini dele samo nekoliko identičnih aminokiselina. Svi identifikovani Cas9 ortolozi imaju istu arhitekturu domena sa centralnim domenom HNH endonukleaze i podeljenim RuvC/RNaseH domenom (vidi Slike 3A, 3B, Sliku 5 i Tabelu 1).
Proteini Cas9 dele 4 ključna motiva sa očuvanom arhitekturom. Motivi 1, 2 i 4 su RuvC motivi, dok je motiv 3 HNH-motiv.
Aktivnost nukleaze brazda ciljnu DNK da bi došlo do prekida dvostrukih lanaca. Ove lomove zatim ćelija popravlja na jedan od dva načina: nehomologno spajanje krajeva i popravka usmerena na homologiju (Slika 2). U nehomolognom spajanju krajeva (NHEJ), dvolančani prekidi se popravljaju direktnim ligacijom krajeva prekida jedan na drugi. Kao takav, novi materijal nukleinske kiseline se ne unosi na mesto, iako se deo materijala nukleinske kiseline može izgubiti, što rezultira brisanjem. U homološki usmerenoj popravci, donorski polinukleotid sa homologijom na brazdanu ciljnu DNK sekvencu se koristi kao šablon za popravku brazdane ciljne DNK sekvence, što rezultira prenosom genetskih informacija sa polinukleotida donora na ciljnu DNK. Kao takav, novi materijal nukleinske kiseline može biti umetnut/kopiran na mesto. U nekim slučajevima, ciljna DNK je u kontaktu sa polinukleotidom subjekta donora. Modifikacije ciljne DNK usled NHEJ i/ili popravke usmerene na homologiju dovode do, na primer, korekcije gena, zamene gena, obeležavanja gena, umetanja transgena, brisanja nukleotida, poremećaja gena, mutacije gena itd.
Shodno tome, brazdanje DNK od strane prirodnog Cas9 polipeptida može se koristiti za brisanje materijala nukleinske kiseline iz ciljne DNK sekvence (npr. da se poremeti gen koji čini ćelije podložnim infekciji (npr. CCRS ili CXCR4 gen, koji čini T ćelije podložnim HIV infekciji), da se uklone ponavljajuće sekvence trinukleotida koje izazivaju bolesti u neuronima, da se stvore genski nokauti i mutacije kao modeli bolesti u istraživanju, itd.) brazdanjem ciljne DNK sekvence i omogućavanjem ćeliji da popravi sekvencu u odsustvu egzogeno obezbeđenog donora polinukleotida.
U nekim otelotvorenjima, predmetni prirodni polipeptid Cas9 može biti optimizovan kodonom. Ovaj tip optimizacije je poznat u predmetnoj oblasti i podrazumeva mutaciju DNK stranog porekla da bi se oponašala preferencija kodona predviđenog organizma domaćina ili ćelije dok kodira isti protein. Dakle, kodoni se menjaju, ali kodirani protein ostaje nepromenjen. Na primer, ako je nameravana ciljna ćelija bila ljudska ćelija, Cas9 optimizovan za ljudski kodon (ili varijanta, npr. enzimski neaktivna varijanta) bi bio pogodan polipeptid za modifikovanje usmereno ka mestu (videti SEQ ID NO: 256 za primer). Bilo koji pogodan modifikujući polipeptid koji je usmeren na mesto (npr. bilo koji prirodni Cas9 kao što je bilo koja od sekvenci navedenih u SEQ ID NO: 1-256 i 795-1346) može biti optimizovan kodonom. Kao još jedan neograničavajući primer, ako bi nameravana ćelija domaćina bila ćelija miša, onda bi Cas9 optimizovan kodonom miša (ili varijanta, npr. enzimski neaktivna varijanta) bio pogodan polipeptid za modifikovanje usmereno na mesto. Iako optimizacija kodona nije potrebna, ona je prihvatljiva i može biti poželjnija u određenim slučajevima.
Nukleinske kiseline koje kodiraju predmetnu RNK sa jednim molekulom DNK
U nekim otelotvorenjima, predmetni postupak uključuje kontaktiranje ciljne DNK ili uvođenje u ćeliju (ili populaciju ćelija) jedne ili više nukleinskih kiselina koje sadrže nukleotidne sekvence koje kodiraju jednomolekulsku DNK ciljanu RNK. Pogodne nukleinske kiseline koje sadrže nukleotidne sekvence koje kodiraju jednomolekulsku DNK ciljanu RNK uključuju ekspresione vektore, naznačeno time što je vektor ekspresije koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira jednomolekulsku DNK ciljanu RNK „rekombinantni ekspresioni vektor“.
U nekim otelotvorenjima rekombinantni ekspresioni vektor može biti virusni konstrukt, npr., rekombinantni adeno-povezani virusni konstrukt (videti, npr. US Patent br.7,078,387), rekombinantni adenovirusni konstrukt, rekombinantni lentivirusni konstrukt, itd.
Pogodni ekspresioni vektori uključuju, ali nisu ograničeni na, virusne vektore (npr. virusne vektore zasnovane na virusu vakcinije; poliovirus; adenovirus (videti, npr., Li i sar., Invest Opthalmol Vis Sci 35:25432549, 1994; Borras i sar., Gene Ther 6:515524, 1999; Li and Davidson, PNAS 92:77007704,
1995; Sakamoto i sar., H Gene Ther 5:10881097, 1999; WO 94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 i WO 95/00655); virus povezan sa adeno (videti, npr., Ali i sar., Hum Gene Ther 9:8186, 1998, Flannery i sar., PNAS 94:69166921, 1997; Bennett i sar., Invest Opthalmol Vis Sci 38:2857 2863, 1997; Jomary i sar., Gene Ther 4:683690, 1997, Rolling i sar., Hum Gene Ther 10:641648, 1999; Ali i sar., Hum Mol Genet 5:591594, 1996; Srivastava u WO 93/09239, Samulski i sar., J. Vir. (1989) 63:3822-3828; Mendelson i sar., Virol. (1988) 166:154-165; i Flotte i sar., PNAS (1993) 90:10613-10617); SV40; virus herpes simpleksa; virus ljudske imunodeficijencije (videti, npr., Miyoshi i sar., PNAS 94:1031923, 1997; Takahashi i sar., J Virol 73:78127816, 1999); retrovirusni vektor (npr. virus mišje leukemije, virus nekroze slezine i vektori izvedeni iz retrovirusa kao što su Rousov sarkomski virus, Harvey sarkomski virus, virus leukoze ptica, lentivirus, virus ljudske imunodeficijencije, virus mijeloproliferativnog sarkoma i virus tumora dojke); i slično.
Stručnjacima u predmetnoj oblasti su poznati brojni pogodni ekspresioni vektori, a mnogi su komercijalno dostupni. Sledeći vektori su dati kao primer; za eukariotske ćelije domaćine: pXT1, pSG5 (Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG i pSVLSV40 (Pharmacia). Međutim, može se koristiti bilo koji drugi vektor sve dok je kompatibilan sa ćelijom domaćinom.
U nekim otelotvorenjima, nukleotidna sekvenca koja kodira jednomolekulsku DNK ciljanu RNK je operativno povezana sa kontrolnim elementom, npr., elementom za kontrolu transkripcije, kao što je promoter.
Kontrolni element transkripcije može biti funkcionalan ili u eukariotskoj ćeliji, npr. u ćeliji sisara, ili u prokariotskoj ćeliji (npr. bakterijskoj ili arhealnoj ćeliji). U nekim otelotvorenjima, nukleotidna sekvenca koja kodira jednomolekulsku DNK ciljanu RNK je operativno povezana sa višestrukim kontrolnim elementima koji omogućavaju ekspresiju nukleotidne sekvence koja kodira RNK ciljanu na DNK i/ili polipeptid koji je usmeren na mesto i u prokariotskim i u eukariotskim ćelijama.
U zavisnosti od sistema domaćin/vektor koji se koristi, bilo koji od brojnih pogodnih elemenata za kontrolu transkripcije i translacije, uključujući konstitutivne i inducibilne promotere, elemente pojačivača transkripcije, terminatore transkripcije, itd. može se koristiti u vektoru ekspresije (npr. U6 promoter, H1 promoter itd.; vidi gore) (videti npr. Bitter i sar. (1987) Methods in Enzymology, 153:516-544).
Nukleotidi koji kodiraju jednomolekulsku DNK ciljanu RNK (uvedenu kao DNK) mogu se obezbediti ćelijama korišćenjem dobro razvijenih tehnika transfekcije; videti, npr. Angel and Yanik (2010) PLoS ONE 5(7): e11756, i komercijalno dostupne TransMessenger<®>reagense kompanije Qiagen, Stemfect<™>RNA Transfection Kit od Stemgent-a i TransIT<®>-mRNA Transfection Kit od Mirus Bio LLC. Videti takođe Beumer i sar. (2008) Efikasno ciljanje gena kod drozofile direktnom injekcijom embriona sa nukleazama cink-prsta. PNAS 105(50):19821-19826. Alternativno, nukleinske kiseline koje kodiraju jednomolekulsku DNK ciljanu RNK mogu biti obezbeđene na DNK vektorima. Dostupni su mnogi vektori, npr. plazmidi, kosmidi, minikrugovi, fagi, virusi, itd., korisni za transfer nukleinskih kiselina u ciljne ćelije. Vektori koji sadrže nukleinsku(e) kiselinu(e) mogu se održavati epizomalno, npr. kao plazmidi, DNK u obliku malih krugova, virusi kao što su citomegalovirus, adenovirus, itd., ili mogu biti integrisani u genom ciljne ćelije, kroz homolognu rekombinaciju ili slučajnu integraciju, npr. vektori izvedeni iz retrovirusa kao što su MMLV, HIV-1, ALV, itd.
Vektori se mogu obezbediti direktno ćelijama subjekta. Drugim rečima, ćelije su u kontaktu sa vektorima koji sadrže nukleinsku kiselinu koja kodira jednomolekulsku DNK ciljanu RNK tako da te vektore preuzimaju ćelije. Postupci za kontaktiranje ćelija sa vektorima nukleinske kiseline koji su plazmidi, uključujući elektroporaciju, transfekciju kalcijum hloridom, mikroinjekciju i lipofekciju su dobro poznati u predmetnoj oblasti. Za isporuku virusnog vektora, ćelije se dovode u kontakt sa virusnim česticama koje sadrže nukleinsku kiselinu koja kodira jednomolekulsku DNK ciljanu RNK. Retrovirusi, na primer, lentivirusi, su posebno pogodni za postupak pronalaska. Često korišćeni retrovirusni vektori su „defektni“, tj. nesposobni da proizvode virusne proteine potrebne za produktivnu infekciju. Umesto toga, replikacija vektora zahteva rast u ćelijskoj liniji za pakovanje. Da bi se generisale virusne čestice koje sadrže nukleinske kiseline od interesa, retrovirusne nukleinske kiseline koje sadrže nukleinsku kiselinu se pakuju u virusne kapside pomoću ćelijske linije za pakovanje. Različite ćelijske linije za pakovanje obezbeđuju različite proteine omotača (ekotropne, amfotropne ili ksenotropne) koji se ugrađuju u kapsid, pri čemu ovaj protein omotača određuje specifičnost virusne čestice za ćelije (ekotropan za miševe i pacove; amfotropno za većinu tipova ćelija sisara uključujući ljude, psa i miša; i ksenotropno za većinu tipova ćelija sisara osim mišjih ćelija). Odgovarajuća ćelijska linija za pakovanje se može koristiti da bi se osiguralo da su ćelije ciljane virusnim česticama za pakovanje. Postupci uvođenja retrovirusnih vektora koji sadrže nukleinsku kiselinu koja kodira faktore reprogramiranja u ćelijske linije za pakovanje i prikupljanja virusnih čestica koje su generisane linijama za pakovanje su dobro poznati u predmetnoj oblasti. Nukleinske kiseline se takođe mogu uneti direktnim mikroinjektiranjem (npr. injekcijom RNK u embrion zebrice).
Vektori koji se koriste za obezbeđivanje nukleinskih kiselina koje kodiraju jednomolekulsku DNK ciljanu RNK u ćelije subjekta će tipično sadržati pogodne promotere za pokretanje ekspresije, odnosno aktivacije transkripcije, nukleinske kiseline od interesa. Drugim rečima, nukleinska kiselina od interesa biće operativno povezana sa promoterom. Ovo može uključivati sveprisutno delujuće promotere, na primer, promoter CMV-β-aktina, ili inducibilne promotere, kao što su promoteri koji su aktivni u određenim populacijama ćelija ili koji reaguju na prisustvo lekova kao što je tetraciklin. Aktivacijom transkripcije, predviđeno je da se transkripcija poveća iznad bazalnih nivoa u ciljnoj ćeliji za najmanje oko 10 puta, za najmanje oko 100 puta, češće za najmanje oko 1000 puta. Pored toga, vektori koji se koriste za obezbeđivanje jednomolekulske DNK ciljane RNK ćelijama subjekta mogu uključiti sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju za selektivne markere u ciljnim ćelijama, tako da identifikuju ćelije koje su preuzele RNK ciljanu na DNK sa jednim molekulom.
RNK koja cilja na DNK može se umesto toga koristiti da kontaktira DNK ili da se uvede u ćelije kao RNK. Postupci uvođenja RNK u ćelije su poznati u predmetnoj oblasti i mogu uključivati, na primer, direktnu injekciju, transfekciju ili bilo koji drugi postupak koji se koristi za uvođenje DNK.
U predmetni pronalazak su takođe uključene RNK koje ciljaju DNK koje su modifikovane korišćenjem običnih molekularno-bioloških tehnika i sintetičke hemije da bi se promenila specifičnost ciljne sekvence, optimizovala svojstva rastvorljivosti ili da bi se učinila pogodnijom kao terapeutsko sredstvo.
Endonukleaza Cas9 koja se nalazi u prirodi takođe može biti izolovana i prečišćena u skladu sa konvencionalnim postupcima rekombinantne sinteze. Lizat se može pripremiti od domaćina ekspresije i lizata prečišćenog korišćenjem HPLC, ekskluzijske hromatografije, gel elektroforeze, afinitetne hromatografije ili druge tehnike prečišćavanja. U većini slučajeva, kompozicije koji se koriste će sadržati najmanje 20% po težini željenog produkta, najčešće najmanje oko 75% po težini, poželjno najmanje oko 95% po težini, a za terapeutske svrhe, obično najmanje oko 99,5% po težini, u odnosu na zagađivače vezane za način pripreme produkta i njegovo prečišćavanje. Obično će se procenti zasnivati na ukupnom proteinu.
Da bi se izazvalo cepanje i rekombinacija DNK, ili bilo koja željena modifikacija ciljne DNK, RNK koja cilja DNK i/ili prirodna Cas9 endonukleaza i/ili donor polinukleotid, bilo da se uvode kao nukleinske kiseline ili polipeptidi, se daju ćelijama na oko 24 sata, npr.1 sat, 1,5 sat, 2 sata, 2,5 sata, 3 sata, 3,5 sata, 4 sata, 5 sati, 6 sati, 7 sati, 8 sati, 12 sati, 16 sati, 18 sati, 20 sati ili bilo koji drugi period od oko 30 minuta do oko 24 sata, koji se može ponavljati sa učestalošću od otprilike svakog dana do otprilike svaka 4 dana, npr., svakih 1,5 dana, svaka 2 dana, svaka 3 dana, ili bilo kojom drugom učestalošću od otprilike svakog dana do otprilike svaka četiri dana. Sredstvo(a) se može dati ćelijama jednom ili više puta, npr. jednom, dvaput, tri puta ili više od tri puta, a ćelijama se može dozvoliti da inkubiraju sa agensom(ima) neko vreme nakon svakog kontaktnog događaja, npr.
16-24 sata, nakon čega se medijum zamenjuje svežim medijumom i ćelije se dalje uzgajaju.
U slučajevima u kojima su dva ili više različitih ciljanih kompleksa obezbeđeni ćeliji (npr. dve različite RNK ciljane na DNK koje su komplementarne različitim sekvencama unutar iste ili različite ciljne DNK), kompleksi se mogu obezbediti istovremeno (npr. kao dva polipeptida i/ili nukleinske kiseline) ili se isporučuju istovremeno. Alternativno, oni se mogu obezbediti uzastopno, npr.
kompleks za ciljanje se daje prvi, a zatim sledi drugi kompleks ciljanja, itd. ili obrnuto.
Tipično, efikasna količina RNK ciljane na DNK i/ili prirodne Cas9 endonukleaze i/ili donorskog polinukleotida se obezbeđuje ciljnoj DNK ili ćelijama da izazove cepanje. Efektivna količina RNK ciljane na DNK i/ili prirodne Cas9 endonukleaze i/ili donorskog polinukleotida je količina koja izaziva dvostruko ili veće povećanje količine ciljne modifikacije uočeno između dve homologne sekvence u odnosu na negativnu kontrolu, npr. ćelija u kontaktu sa praznim vektorom ili irelevantnim polipeptidom. To znači da će efikasna količina ili doza RNK ciljane na DNK i/ili prirodne Cas9 endonukleaze i/ili polinukleotida donora izazvati dvostruko povećanje, trostruko povećanje, četverostruko povećanje ili više u količini ciljne modifikacije uočene na ciljnom DNK regionu, u nekim slučajevima povećanje od 5 puta, povećanje od 6 puta ili više, ponekad 7 ili 8 puta ili više u količini uočene rekombinacije, npr. povećanje od 10 puta, 50 puta ili 100 puta ili više, u nekim slučajevima, povećanje od 200 puta, 500 puta, 700 puta ili 1000 puta ili više, npr.5000 puta, ili 10.000 puta povećanje količine uočene rekombinacije. Količina ciljne modifikacije može se meriti bilo kojim pogodnim postupkom. Na primer, tihi reporterski konstrukt koji sadrži komplementarnu sekvencu ciljanom segmentu (ciljanu sekvencu) RNK koja cilja na DNK, okružen ponovljenim sekvencama koje će, kada se rekombinuju, rekonstituisati nukleinsku kiselinu koja kodira aktivni reporter, može se ko-transfektovati u ćelije, i količina proteina reportera procenjena nakon kontakta sa RNK koja cilja na DNK i/ili prirodnom Cas9 endonukleazom i/ili polinukleotidom donora, npr.2 sata, 4 sata, 8 sati, 12 sati, 24 sata, 36 sati, 48 sati, 72 sata ili više nakon kontakta sa RNK koja cilja na DNK i/ili modifikovanim polipeptidom usmerenim na mesto i/ili polinukleotidom donora. Kao još jedan, test više osetljivosti, na primer, stepen rekombinacije u genomskom DNK regionu od interesa koji sadrži ciljne DNK sekvence može se proceniti PCR ili Saudern hibridizacijom regiona nakon kontakta sa RNK koja cilja na DNK i/ili prirodnom Cas9 endonukleazom i/ili donorskim polinukleotidom, npr.2 sata, 4 sata, 8 sati, 12 sati, 24 sata, 36 sati, 48 sati, 72 sata ili više nakon kontakta sa RNK koja cilja na DNK i/ili modifikovanim polipeptidom usmerenim na mesto i/ili donorskim polinukleotidom.
Kontaktiranje ćelija sa RNK koja cilja na DNK i/ili prirodnom Cas9 endonukleazom i/ili polinukleotidom donora može se desiti u bilo kojem medijumu kulture i pod bilo kojim uslovima kulture koji promovišu preživljavanje ćelija. Na primer, ćelije se mogu suspendovati u bilo kom odgovarajućem hranljivom medijumu koji je pogodan, kao što je Iscove-ov modifikovani DMEM ili RPMI 1640, dopunjen fetalnim telećim serumom ili toplotno inaktiviranim kozjim serumom (oko 5-10%), L-glutaminom, tiolom, posebno 2-merkaptoetanolom i antibioticima, npr. penicilin i streptomicin. Kultura može da sadrži faktore rasta na koje ćelije reaguju. Faktori rasta, kako je ovde definisano, su molekuli sposobni da promovišu preživljavanje, rast i/ili diferencijaciju ćelija, bilo u kulturi ili u intaktnom tkivu, kroz specifične efekte na transmembranski receptor. Faktori rasta uključuju polipeptide i ne-polipeptidne faktore. Uslovi koji promovišu preživljavanje ćelija obično dozvoljavaju nehomologno spajanje krajeva i popravku usmerenu na homologiju.
U prijavama u kojima je poželjno ubaciti polinukleotidnu sekvencu u ciljnu DNK sekvencu, polinukleotid koji sadrži sekvencu donora koja se ubacuje takođe se daje ćeliji. Pod „sekvencijom donora“ ili „donorskim
polinukleotidom“ podrazumeva se sekvenca nukleinske kiseline koja se ubacuje na mesto brazdanja indukovano polipeptidom usmerenim na modifikovanje.
Donorski polinukleotid će sadržati dovoljnu homologiju sa genomskom sekvencom na mestu brazdanja, npr.70%, 80%, 85%, 90%, 95% ili 100% homologije sa nukleotidnim sekvencama koje okružuju mesto brazdanja, npr. unutar oko 50 baza ili manje od mesta brazdanja, npr. unutar oko 30 baza, unutar oko 15 baza, unutar oko 10 baza, unutar oko 5 baza, ili neposredno sa bočne strane mesta brazdanja, da bi se podržala popravka usmerena na homologiju između njega i genomske sekvence na koju nosi homologiju. Približno 25, 50, 100 ili 200 nukleotida, ili više od 200 nukleotida, homologije sekvence između donora i genomske sekvence (ili bilo koja integralna vrednost između 10 i 200 nukleotida, ili više) će podržati popravku usmerenu na homologiju. Donorske sekvence mogu biti bilo koje dužine, npr. 10 nukleotida ili više, 50 nukleotida ili više, 100 nukleotida ili više, 250 nukleotida ili više, 500 nukleotida ili više, 1000 nukleotida ili više, 5000 nukleotida ili više, itd.
Donorska sekvenca obično nije identična genomskoj sekvenci koju zamenjuje. Umesto toga, donorska sekvenca može sadržati najmanje jednu ili više pojedinačnih promena baze, umetanja, brisanja, inverzija ili preuređivanja u odnosu na genomsku sekvencu, sve dok je prisutna dovoljna homologija da podrži popravku usmerenu na homologiju. U nekim otelotvorenjima, donorska sekvenca sadrži nehomolognu sekvencu okruženu sa dva regiona homologije, tako da homološki usmerena popravka između ciljnog DNK regiona i dve bočne sekvence rezultira umetanjem nehomologne sekvence u ciljni region. Donorske sekvence takođe mogu da sadrže vektorsku kičmu koja sadrži sekvence koje nisu homologne sa DNK regionom od interesa i koje nisu namenjene za umetanje u DNK region od interesa. Generalno, homologni region(i) donorske sekvence će imati najmanje 50% identičnosti sekvence sa genomskom sekvencom sa kojom je poželjna rekombinacija. U određenim otelotvorenjima, prisutna je 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% ili 99,9% identičnost sekvence. Može biti prisutna bilo koja vrednost između 1% i 100% identičnosti sekvence, u zavisnosti od dužine donorskog polinukleotida.
Donorska sekvenca može sadržati određene razlike u sekvenci u poređenju sa genomskom sekvencom, npr. restrikciona mesta, polimorfizmi nukleotida, selektivni markeri (npr. geni otpornosti na lekove, fluorescentni proteini, enzimi itd.), itd., koji se mogu koristiti za procenu uspešnosti umetanja donorske sekvence na mesto brazdanja ili u nekim slučajevima može se koristiti u druge svrhe (npr. da označi ekspresiju na ciljanom genomskom lokusu). U nekim slučajevima, ako se nalaze u kodirajućem regionu, takve razlike u nukleotidnoj sekvenci neće promeniti sekvencu aminokiselina, ili će napraviti tihe promene amino kiselina (tj. promene koje ne utiču na strukturu ili funkciju proteina).
Alternativno, ove razlike u sekvencama mogu uključivati bočne rekombinacione sekvence kao što su FLP, loxP sekvence ili slično, koje se mogu aktivirati kasnije za uklanjanje markerske sekvence.
Donorska sekvenca se može obezbediti ćeliji kao jednolančana DNK, jednolančana RNK, dvolančana DNK ili dvolančana RNK. Može se uvesti u ćeliju u linearnom ili kružnom obliku. Ako se uvede u linearnom obliku, krajevi donorske sekvence mogu biti zaštićeni (npr. od egzonukleolitičke degradacije) postupcima poznatim stručnjacima u predmetnoj oblasti. Na primer, jedan ili više dideoksinukleotidnih taloga se dodaje na 3' terminus linearnog molekula i/ili samokomplementarni oligonukleotidi su vezani za jedan ili oba kraja. Videti, na primer, Chang i sar. (1987) Proc. Natl. Acad Sci USA 84:4959-4963; Nehls i sar. (1996) Science 272:886-889. Dodatni postupci za zaštitu egzogenih polinukleotida od degradacije uključuju, ali nisu ograničeni na, dodavanje terminalne amino grupe(e) i upotrebu modifikovanih internukleotidnih veza kao što su, na primer, fosforotioati, fosforamidati i talozi O-metil riboze ili dezoksiriboze. Kao alternativa zaštiti završetaka linearne donorske sekvence, dodatne dužine sekvence mogu biti uključene izvan regiona homologije koji se mogu degradirati bez uticaja na rekombinaciju. Donorska sekvenca se može uvesti u ćeliju kao deo vektorskog molekula koji ima dodatne sekvence kao što su, na primer, poreklo replikacije, promoteri i geni koji kodiraju otpornost na antibiotike. Štaviše, donorske sekvence mogu biti uvedene kao gola nukleinska kiselina, kao nukleinska kiselina u kompleksu sa agensom kao što je lipozom ili poloksamer, ili se mogu isporučiti virusima (npr. adenovirus, AAV), kao što je gore opisano za nukleinske kiseline koje kodiraju RNK koja cilja na DNK i/ili na mesto usmereni modifikujući polipeptid i/ili donorski polinukleotid.
Farmaceutski preparati su kompozicije koje uključuju jednu ili više RNK ciljane na DNK i/ili modifikujući polipeptid usmeren na mesto i/ili polinukleotid donora prisutnih u farmaceutski prihvatljivom nosaču. „Farmaceutski prihvatljivi prenosnik“ može biti prenosnik koji je odobrila regulatorna agencija savezne ili državne vlade ili je naveden u američkoj farmakopeji ili drugoj opšte priznatoj farmakopeji za upotrebu kod sisara, kao što su ljudi. Termin „prenosnik“ se odnosi na razblaživač, pomoćno sredstvo, ekscipijent ili nosač sa kojim je jedinjenje pronalaska formulisano za primenu kod sisara. Takvi farmaceutski prenosnici mogu biti lipidi, npr. lipozomi, npr. dendrimeri lipozoma; tečnosti, kao što su voda i ulja, uključujući one naftnog, životinjskog, biljnog ili sintetičkog porekla, kao što je ulje od kikirikija, sojino ulje, mineralno ulje, susamovo ulje i slično, fiziološki rastvor; guma akacija, želatin, skrobna pasta, talk, keratin, koloidni silicijum dioksid, urea i slično. Pored toga, mogu se koristiti pomoćna sredstva, sredstva za stabilizaciju, zgušnjavanje, podmazivanje i bojenje. Farmaceutske kompozicije mogu biti formulisane u preparate u čvrstim, polučvrstim, tečnim ili gasovitim oblicima, kao što su tablete, kapsule, praškovi, granule, masti, rastvori, supozitorije, injekcije, inhalanti, gelovi, mikrosfere i aerosoli. Kao takva, primena RNK ciljane na DNK i/ili prirodne Cas9 endonukleaze i/ili donorskog polinukleotida može se postići na različite načine, uključujući oralno, bukalno, rektalno, parenteralno, intraperitonealno, intradermalno, transdermalno, intratrahealno, intraokularno, itd. Aktivni agens može biti sistemski nakon primene ili može biti lokalizovan korišćenjem regionalne primene, intramuralne primene ili upotrebe implantata koji deluje tako da zadrži aktivnu dozu na mestu implantacije. Aktivni agens može biti formulisan za trenutnu aktivnost ili se može formulisati za produženo oslobađanje.
Za neka stanja, posebno stanja centralnog nervnog sistema, možda će biti potrebno formulisati agense koji će preći krvno-moždanu barijeru (BBB). Jedna strategija za isporuku leka kroz krvno-moždanu barijeru (BBB) podrazumeva poremećaj BBB, bilo osmotskim putem kao što su manitol ili leukotrieni, ili biohemijski upotrebom vazoaktivnih supstanci kao što je bradikinin. Potencijal za korišćenje BBB otvora za ciljanje specifičnih agenasa na tumorima mozga je takođe opcija. Sredstvo za remećenje BBB-a može se davati zajedno sa terapeutskim kompozicijama pronalaska kada se kompozicije daju intravaskularnom injekcijom. Druge strategije za prolazak kroz BBB mogu podrazumevati upotrebu endogenih transportnih sistema, uključujući transcitozu posredovanu kaveolinom-1, transportere posredovane nosačem kao što su nosači glukoze i aminokiselina, transcitozu posredovanu receptorima za insulin ili transferin, i aktivne transportere efluksa kao što su p-glikoprotein. Aktivni transportni delovi takođe mogu biti konjugovani sa terapeutskim jedinjenjima za upotrebu u pronalasku da bi se olakšao transport kroz endotelni zid krvnog suda. Alternativno, isporuka terapeutskih agenasa iza BBB-a može biti lokalna isporuka, na primer intratekalnom isporukom, npr. kroz Ommaya rezervoar (videti npr. US patente br.5,222,982 i 5385582); bolusnom injekcijom, npr. špricem, npr. intravitrealno ili intrakranijalno; kontinuiranom infuzijom, npr. kanilacijom, npr. konvekcijom (videti npr. US Prijavu br.20070254842); ili implantacijom uređaja na koji je sredstvo reverzibilno pričvršćeno (pogledajte npr. US Prijave br.
20080081064 i 20090196903).
Tipično, obezbeđena je efikasna količina RNK koja cilja na DNK i/ili polipeptida za modifikovanje usmerenog na mesto i/ili polinukleotida donora. Kao što je gore objašnjeno u vezi sa ex vivo postupcima koji nisu u skladu sa pronalaskom, efikasna količina ili efektivna doza RNK ciljane na DNK i/ili modifikovanog polipeptida usmerenog na mesto i/ili donorskog polinukleotida in vivo je količina koja izaziva dvostruko ili višestruko povećanje u količinama rekombinacije primećenim između dve homologne sekvence u odnosu na negativnu kontrolu, npr. ćelija u kontaktu sa praznim vektorom ili irelevantnim polipeptidom. Količina rekombinacije se može meriti bilo kojim pogodnim postupkom, na primer kako je gore opisano i poznato u predmetnoj oblasti.
Proračun efikasne količine ili efektivne doze RNK ciljane na DNK i/ili modifikovanog polipeptida usmerenog na mesto i/ili polinukleotida donora koji će se primeniti je u okviru veštine osoba sa uobičajenim znanjem u predmetnoj oblasti i biće rutinski za stručnjake u predmetnoj oblasti. Konačna količina koja će biti primenjena zavisiće od načina primene i od prirode poremećaja ili stanja koje treba lečiti.
Efikasna količina koja se daje određenom pacijentu zavisiće od niza faktora, od kojih će se nekoliko razlikovati od pacijenta do pacijenta. Kompetentan lekar će moći da odredi efikasnu količinu terapeutskog agensa za primenu kod pacijenta da zaustavi ili preokrene napredovanje stanja bolesti prema potrebi. Koristeći podatke o LD50 životinjama i druge informacije dostupne za agens, lekar može odrediti maksimalnu bezbednu dozu za pojedinca, u zavisnosti od vrste primene. Na primer, intravenozno primenjena doza može biti veća od intratekalno primenjene doze, s obzirom na veće telo tečnosti na koje se primenjuje terapeutska kompozicija. Slično, kompozicije koje se brzo uklanjaju iz tela mogu se davati u većim dozama, ili u ponovljenim dozama, da bi se održala terapeutska koncentracija. Koristeći uobičajeno znanje, kompetentni lekar će moći da optimizuje dozu određenog terapeutika tokom rutinskih kliničkih ispitivanja.
Za uključivanje u lek, RNK koja cilja DNK i/ili prirodna Cas9 endonukleaza i/ili donorski polinukleotid mogu se dobiti iz odgovarajućeg komercijalnog izvora. Kao opšta tvrdnja, ukupna farmaceutski efikasna količina RNK ciljane na DNK i/ili prirodne Cas9 endonukleaze i/ili donorskog polinukleotida primenjenih parenteralno po dozi biće u opsegu koji se može meriti krivom odgovora na dozu.
Terapije zasnovane na RNK koja cilja na DNK i/ili prirodnoj Cas9 endonukleazi i/ili polinukleotidima donora, odnosno preparati RNK ciljane na DNK i/ili prirodne Cas9 endonukleaze i/ili polinukleotida donora koji se koriste za terapijsku primenu, moraju biti sterilne. Sterilnost se lako postiže filtriranjem kroz sterilne filtracione membrane (npr. membrane od 0,2 µm). Terapeutske kompozicije se generalno stavljaju u spremnik koji ima sterilni pristupni otvor, na primer, vrećicu za intravenski rastvor ili bočicu sa čepom koji se može probiti iglom za hipodermičku injekciju. Terapije zasnovane na RNK ciljanoj na DNK i/ili prirodnoj Cas9 endonukleazi i/ili polinukleotidu donora mogu se čuvati u jediničnim ili višedoznim spremnicima, na primer, zapečaćene ampule ili bočice, kao vodeni rastvor ili kao liofilizovana formulacija za rekonstituciju. Kao primer liofilizovane formulacije, bočice od 10 ml se pune sa 5 ml sterilno filtriranog 1% (w/v) vodenog rastvora jedinjenja, a dobijena smeša je liofilizovana. Rastvor za infuziju se priprema rekonstituisanjem liofilizovanog jedinjenja korišćenjem bakteriostatske vode za injekcije.
Farmaceutske kompozicije mogu uključivati, u zavisnosti od željene formulacije, farmaceutski prihvatljive, netoksične nosače razblaživača, koji su definisani kao nosači koji se obično koriste za formulisanje farmaceutskih kompozicija za primenu na životinjama ili ljudima. Razblaživač se bira tako da ne utiče na biološku aktivnost kombinacije. Primeri takvih razblaživača su destilovana voda, puferovana voda, fiziološki rastvor, PBS, Ringerov rastvor, rastvor dekstroze i Henkov rastvor. Pored toga, farmaceutska kompozicija ili formulacija može uključivati druge nosače, adjuvante ili netoksične, neterapeutske, neimunogene stabilizatore, ekscipijente i slično. Kompozicije takođe mogu uključiti dodatne supstance za približne fiziološke uslove, kao što su sredstva za podešavanje pH i puferovanje, sredstva za podešavanje toksičnosti, sredstva za vlaženje i deterdženti.
Kompozicija takođe može uključiti bilo koji od raznih stabilizujućih agenasa, kao što je na primer antioksidans. Kada farmaceutska kompozicija uključuje polipeptid, polipeptid može biti u kompleksu sa različitim dobro poznatim jedinjenjima koja poboljšavaju in vivo stabilnost polipeptida, ili na drugi način poboljšavaju njegova farmakološka svojstva (npr., produžavaju poluraspad polipeptida, smanjuju njegovu toksičnost, poboljšavaju rastvorljivost ili apsorpciju). Primeri takvih modifikacija ili agenasa za stvaranje kompleksa uključuju sulfat, glukonat, citrat i fosfat. Nukleinske kiseline ili polipeptidi kompozicije takođe mogu biti u kompleksu sa molekulima koji poboljšavaju njihove in vivo atribute. Takvi molekuli uključuju, na primer, ugljene hidrate, poliamine, aminokiseline, druge peptide, jone (npr. natrijum, kalijum, kalcijum, magnezijum, mangan) i lipide.
Dalja uputstva u vezi sa formulacijama koje su pogodne za različite vrste primene mogu se naći u Remington's Pharmaceutical Sciences, Mace Publishing Company, Philadelphia, Pa., 17th ed. (1985). Za kratak pregled postupaka za isporuku lekova, videti Langer, Science 249:1527-1533 (1990).
Farmaceutske kompozicije se mogu davati za profilaktičke i/ili terapeutske tretmane. Toksičnost i terapeutska efikasnost aktivnog sastojka mogu se odrediti prema standardnim farmaceutskim procedurama u ćelijskim kulturama i/ili eksperimentalnim životinjama, uključujući, na primer, određivanje LD50 (doza smrtonosna za 50% populacije) i ED50 (doza terapeutski efikasna kod 50% populacije). Odnos doze između toksičnih i terapijskih efekata je terapijski indeks i može se izraziti kao odnos LD50/ED50. Poželjne su terapije koje pokazuju velike terapeutske indekse.
Podaci dobijeni iz ćelijske kulture i/ili studija na životinjama mogu se koristiti u formulisanju niza doza za ljude. Doziranje aktivnog sastojka se obično kreće u opsegu cirkulišućih koncentracija koje uključuju ED50 sa niskom toksičnošću. Doziranje može da varira unutar ovog opsega u zavisnosti od upotrebljenog doznog oblika i načina primene.
Komponente koje se koriste za formulisanje farmaceutskih kompozicija su poželjno visoke čistoće i suštinski su bez potencijalno štetnih zagađivača (npr. imaju najmanje prehrambeni (jestivi) kvalitet po nacionalnim regulativama (NF), generalno najmanje analitički, a uobičajeno barem farmaceutski). Štaviše, kompozicije namenjene za in vivo upotrebu su obično sterilne. U meri u kojoj se dato jedinjenje mora sintetizovati pre upotrebe, rezultujući produkt je obično u suštini bez bilo kakvih potencijalno toksičnih agenasa, posebno bilo kojih endotoksina, koji mogu biti prisutni tokom procesa sinteze ili prečišćavanja.
Kompozicije za parenteralnu primenu su takođe sterilne, suštinski izotonične i napravljene pod GMP uslovima.
Efikasna količina terapijske kompozicije koja se daje određenom pacijentu zavisiće od niza faktora, od kojih će se nekoliko razlikovati od pacijenta do pacijenta. Kompetentan lekar će moći da odredi efikasnu količinu terapeutskog agensa za primenu kod pacijenta da zaustavi ili preokrene napredovanje stanja bolesti prema potrebi. Koristeći podatke o LD50 životinjama i druge informacije dostupne za agens, lekar može odrediti maksimalnu bezbednu dozu za pojedinca, u zavisnosti od vrste primene. Na primer, intravenozno primenjena doza može biti veća od intratekalno primenjene doze, s obzirom na veće telo tečnosti na koje se primenjuje terapeutsku kompoziciju. Slično, kompozicije koje se brzo uklanjaju iz tela mogu se davati u većim dozama, ili u ponovljenim dozama, da bi se održala terapeutska koncentracija. Koristeći uobičajeno znanje, kompetentni lekar će moći da optimizuje dozu određenog terapeutika tokom rutinskih kliničkih ispitivanja.
Kompozicije
Predmetni pronalazak obezbeđuje kompoziciju koja sadrži predmetnu DNK ciljanu RNK i prirodnu Cas9 endonukleazu. Predmetna kompozicija je korisna za sprovođenje postupka predmetnog obelodanjivanja koji nije prema pronalasku, na primer, postupka koji nije prema pronalasku za, za mesto specifičnu modifikaciju ciljne DNK; itd.
Kompozicije koje sadrže RNK ciljanu na DNK i polipeptid za modifikovanje usmeren na mesto
Predmetni pronalazak obezbeđuje kompoziciju koja sadrži: (i) RNK koja cilja na DNK ili DNK polinukleotid koji kodira istu; i ii) prirodnu Cas9 endonukleazu. U nekim slučajevima
predmetni pronalazak obezbeđuje kompoziciju koja sadrži: (i) RNK koja cilja na DNK, kao što je gore opisano, RNK koja cilja na DNK koja sadrži: (a) prvi segment koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja je komplementarna sekvenci u ciljnoj DNK; i (b) drugi segment koji je u interakciji sa polipeptidom za modifikovanje usmerenim na mesto koji je prirodna Cas9 endonukleaza; i (ii) modifikujući polipeptid usmeren na mesto, ili polinukleotid koji kodira isti, polipeptid usmeren na mesto modifikacije koji sadrži: (a) deo koji se vezuje za RNK koji je u interakciji sa RNK koja cilja na DNK; i (b) deo aktivnosti koji pokazuje enzimsku aktivnost usmerenu na mesto, naznačeno time što je mesto enzimske aktivnosti određeno RNK koja cilja na DNK.
U nekim slučajevima, predmetna kompozicija sadrži: kompoziciju koja sadrži: (i) RNK koja cilja na DNK, pri čemu RNK cilja na DNK koja sadrži: (a) prvi segment koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja je komplementarna sekvenci u ciljnoj DNK; i (b) drugi segment koji je u interakciji sa polipeptidom za modifikovanje usmerenim na mesto koji je prirodna Cas9 endonukleaza; i (ii) modifikujući polipeptid usmeren na mesto, pri čemu polipeptid za modifikovanje usmeren na mesto sadrži: (a) deo koji se vezuje za RNK koji je u interakciji sa RNK koja cilja na DNK; i (b) deo aktivnosti koji pokazuje enzimsku aktivnost usmerenu na mesto, naznačeno time što je mesto enzimske aktivnosti određeno RNK koja cilja na DNK.
U nekim otelotvorenjima, predmetna kompozicija uključuje oba molekula RNK i RNK koja cilja na DNK sa dvostrukim molekulom. Kao takav, u nekim otelotvorenjima, predmetna kompozicija uključuje aktivatorsku RNK koja sadrži segment koji formira dupleks koji je komplementaran segmentu ciljne RNK koji formira dupleks (videti Sliku 1A). Segmenti koji formiraju dupleks aktivatorske RNK i ciljne RNK se hibridizuju da bi formirali dsRNK dupleks segmenta koji se vezuje za protein RNK koja cilja na DNK. Ciljna RNK dalje obezbeđuje segment koji cilja DNK (jednolančani) RNK koja cilja DNK i stoga cilja RNK koja cilja na DNK na specifičnu sekvencu unutar ciljne DNK. Kao jedan neograničavajući primer, segment koji formira dupleks aktivatorske RNA sadrži nukleotidnu sekvencu koja ima najmanje oko 70%, najmanje oko 80%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 98%, ili 100% identičnost sa sekvencom 5'-UAGCAAGUUAAAAU-3' (SEQ ID NO:562). Kao još jedan neograničavajući primer, segment koji formira dupleks ciljne RNK sadrži nukleotidnu sekvencu koja ima najmanje oko 70%, najmanje oko 80%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 98%, ili 100% identičnosti sa sekvencom 5'-GUUUUAGAGCUA-3' (SEQ ID NO:679).
Kompozicija subjekta može da sadrži, pored i) RNK koja cilja na DNK subjekta; i ii) a koji je prirodna Cas9 endonukleaza, jedna ili više od: soli, npr., NaCl, MgCl2, KCl, MgSO4 itd.; puferski agens, npr. Tris pufer, HEPES, MES, MES natrijumova so, MOPS, TAPS, itd.; sredstvo za rastvaranje; deterdžent, npr. nejonski deterdžent kao što je Tween-20, itd.; inhibitor proteaze; redukciono sredstvo (npr. ditiotreitol); i slično.
U nekim slučajevima, komponente kompozicije su pojedinačno čiste, na primer, svaka od komponenti je najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 98%, najmanje oko 99%, ili najmanje 99%, čista. U nekim slučajevima, pojedinačne komponente predmetne kompozicije su čiste pre nego što se dodaju u kompoziciju.
Na primer, u nekim otelotvorenjima, polipeptid za modifikovanje usmeren na mesto prisutan u predmetnoj kompoziciji je čist, npr., najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 98%, najmanje oko 99% ili više od 99% čistoće, naznačeno time što „% čistoće“ znači da je modifikujući polipeptid usmeren na mesto navedeni procenat oslobođen od drugih proteina (npr. proteina koji nisu modifikujući polipeptid usmeren na mesto), drugih makromolekula ili kontaminanta koji mogu biti prisutni tokom produkcije polipeptida za modifikovanje usmerenog na mesto.
Definicije deo
Izraz „prirodno prisutan“ ili „nemodifikovan“ kako se ovde koristi u primeni na nukleinsku kiselinu, polipeptid, ćeliju ili organizam, odnosi se na nukleinsku kiselinu, polipeptid, ćeliju ili organizam koji se nalazi u prirodi. Na primer, polipeptidna ili polinukleotidna sekvenca koja je prisutna u organizmu (uključujući viruse) koja se može izolovati iz izvora u prirodi i koju čovek nije namerno modifikovao u laboratoriji, prirodno se javlja.
„Heterologan“, kako se ovde koristi, označava nukleotidnu ili polipeptidnu sekvencu koja se ne nalazi u nativnoj nukleinskoj kiselini ili proteinu, respektivno. Na primer, u fuzionoj varijanti Cas9 polipeptida usmerenog ka mestu, varijantni polipeptid usmeren ka Cas9 mestu može biti fuzionisan sa heterolognim polipeptidom (tj. polipeptidom koji nije Cas9). Heterologni polipeptid može da ispolji aktivnost (npr. enzimsku aktivnost) koju će takođe ispoljiti fuziona varijanta polipeptida usmerenog na Cas9 mesto. Heterologna sekvenca nukleinske kiseline može biti povezana sa Cas9 varijantnim polipeptidom usmerenim na mesto (npr. genetskim inženjeringom) da bi se stvorila nukleotidna sekvenca koja kodira fuzionu varijantu polipeptida usmerenog na Cas9 mesto.
Termin „himerni polipeptid“ se odnosi na polipeptid koji se ne pojavljuje u prirodi, na primer, napravljen je veštačkom kombinacijom dva inače odvojena segmenta amino sekvence putem ljudske intervencije. Dakle, himerni polipeptid je takođe rezultat ljudske intervencije. Dakle, polipeptid koji sadrži himernu aminokiselinsku sekvencu je himerni polipeptid.
Pod „polipeptidom usmerenim na mesto“ ili „polipeptidom usmerenim na mesto vezivanja za RNK“ ili „polipeptidom usmerenim na mesto vezivanja za RNK“ podrazumeva se polipeptid koji vezuje RNK i cilja na specifičnu DNK sekvencu. Polipeptid usmeren na mesto, kao što je ovde opisan, cilja na specifičnu sekvencu DNK pomoću molekula RNK za koji je vezan. Molekul RNK sadrži sekvencu koja je komplementarna ciljnoj sekvenci unutar ciljne DNK, ciljajući tako vezani polipeptid na određenu lokaciju unutar ciljne DNK (ciljna sekvenca).
U nekim otelotvorenjima, predmetna nukleinska kiselina (npr. RNK koja cilja na DNK, nukleinska kiselina koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira RNK koja cilja jednomolekularnu DNK; itd.) sadrži modifikaciju ili sekvencu koja obezbeđuje dodatnu poželjnu osobinu (npr. modifikovana ili regulisana stabilnost; subcelularno ciljanje; praćenje, npr. fluorescentna oznaka; mesto vezivanja za protein ili proteinski kompleks; itd.). Neograničavajući primeri uključuju: 5' kap (npr. kap od 7-metilgvanilata (m<7>G)); 3' poliadenilovani rep (tj.3' poli(A) rep); sekvencu riboprekidača (npr. da bi se omogućila regulisana stabilnost i/ili regulisana dostupnost proteinima i/ili proteinskim kompleksima); modifikacija ili sekvenca koja cilja RNK na subćelijsku lokaciju (npr. jezgro, mitohondrije, hloroplaste i slično); modifikacija ili sekvenca koja obezbeđuje praćenje (npr. direktnu konjugaciju sa fluorescentnim molekulom, konjugaciju sa ostatkom koji olakšava fluorescentnu detekciju, sekvencu koja omogućava fluorescentnu detekciju, itd.); modifikacija ili sekvenca koja obezbeđuje mesto vezivanja za proteine (npr. proteini koji deluju na DNK, uključujući transkripcione aktivatore, transkripcione represore, DNK metiltransferaze, DNK demetilaze, histon acetiltransferaze, histon deacetilaze i slično); i njihove kombinacije.
U nekim otelotvorenjima, RNK ciljana na DNK sadrži dodatni segment na 5' ili 3' kraju koji obezbeđuje bilo koju od karakteristika opisanih gore. Na primer, pogodan treći segment može da sadrži 5' kap (npr. kap od 7-metilgvanilata (m<7>G)); 3' poliadenilovani rep (tj.3' poli(A) rep); sekvencu riboprekidača (npr. da bi se omogućila regulisana stabilnost i/ili regulisana dostupnost proteinima i proteinskim kompleksima); sekvencu koja cilja RNK na subćelijsku lokaciju (npr. jezgro, mitohondrije, hloroplaste i slično); modifikacija ili sekvenca koja obezbeđuje praćenje (npr. direktnu konjugaciju sa fluorescentnim molekulom, konjugaciju sa ostatkom koji olakšava fluorescentnu detekciju, sekvencu koja omogućava fluorescentnu detekciju, itd.); modifikacija ili sekvenca koja obezbeđuje mesto vezivanja za proteine (npr. proteini koji deluju na DNK, uključujući transkripcione aktivatore, transkripcione represore, DNK metiltransferaze, DNK demetilaze, histon acetiltransferaze, histon deacetilaze i slično); i njihove kombinacije.
RNK koja cilja na DNK i polipeptid usmeren na mesto subjekta koji je prirodna Cas9 endonukleaza formiraju kompleks (tj. vezuju se preko nekovalentnih interakcija). RNK koja cilja na DNK obezbeđuje ciljnu specifičnost kompleksu tako što sadrži nukleotidnu sekvencu koja je komplementarna sekvenci ciljne DNK. Polipeptid kompleksa usmeren na mesto obezbeđuje aktivnost specifičnu za mesto. Drugim rečima, polipeptid usmeren na mesto je vođen do ciljne DNK sekvence (npr. ciljne sekvence u hromozomskoj nukleinskoj kiselini; ciljne sekvence u ekstrahromozomalnoj nukleinskoj kiselini, npr. epizomalnu nukleinsku kiselinu, mali krug, itd.; ciljnu sekvencu u mitohondrijskoj nukleinskoj kiselini; ciljnu sekvencu u hloroplastnoj nukleinskoj kiselini; ciljne sekvence u plazmidu; itd.) na osnovu njegove povezanosti sa segmentom RNK koji cilja na DNK.
U nekim otelotvorenjima, predmetna RNK ciljana na DNK sadrži dva odvojena molekula RNK (RNK polinukleotidi) i ovde se pominje kao „RNK koja cilja na DNK sa dva molekula“ ili „RNK koja cilja na DNK sa dva molekula“. U drugim otelotvorenjima, predmetna RNK koja cilja na DNK je jedan molekul RNK (pojedinačni RNK polinukleotid) i ovde se pominje kao „RNK koja cilja na DNK sa jednim molekulom“. Ako nije drugačije naznačeno, termin „RNK koja cilja na DNK“ je inkluzivan, koji se odnosi na RNK koja cilja DNK sa jednim molekulom te RNK koja cilja na DNK sa dvostrukim molekulom.
Predmetna dvomolekulska RNK koja cilja na DNK sadrži dva odvojena molekula RNK („ciljnu RNK“ i „aktivatorsku RNK“). Svaki od dva RNK molekula predmetne RNK koja cilja dvomolekulsku DNK sadrži deo nukleotida koji su komplementarni jedan drugom tako da se komplementarni nukleotidi dva RNK molekula hibridizuju da bi formirali dvolančani RNK dupleks koji se vezuje za proteinski segment.
Predmetna RNK koja cilja jednomolekulsku DNK za upotrebu sadrži dva dela nukleotida (ciljnu RNK i aktivatorsku RNK) koji su komplementarni jedan drugom, kovalentno su povezani intervenišućim nukleotidima („linkeri“ ili „linker nukleotidi“), i hibridizuju se da bi se formirao dvolančani RNK dupleks (dsRNK dupleks) segmenta koji se vezuje za protein, što rezultira strukturom matične petlje. Ciljna RNK i aktivatorska RNK mogu biti kovalentno povezani preko 3' kraja ciljne RNK i 5' kraja aktivatorske RNK. Alternativno, ciljna RNK i aktivatorska RNK mogu biti kovalentno povezane preko 5' kraja ciljne RNK i 3' kraja aktivatorske RNK.
Primer RNK koji cilja na DNK sa dva molekula sadrži molekul nalik crRNK („CRISPR RNK“ ili „ciljna RNK“ ili „crRNK“ ili „crRNK repeat“) i odgovarajući tracrRNK sličan („trans-aktivna CRISPR RNK“ ili "aktivatorska RNK" ili "tracrRNK") molekul. Molekul sličan crRNK (ciljna RNK) sadrži i segment koji cilja na DNK (jednolančani) RNK ciljane DNK i deo („segment koji formira dupleks“) nukleotida koji formira polovinu dupleksa dsRNK u segment RNK koji cilja na DNK.
Odgovarajući molekul sličan tracrRNK (aktivatorska RNK) sadrži deo nukleotida (segment koji formira dupleks) koji formira drugu polovinu dsRNK dupleksa segmenta koji se vezuje za protein RNK ciljane na DNK. Drugim rečima, deo nukleotida molekula sličnog crRNK je komplementaran i hibridizuje se sa delom nukleotida molekula sličnog tracrRNK da bi se formirao dsRNK dupleks domena koji se vezuje za protein DNK ciljane RNK. Kao takav, može se reći da svaki molekul sličan crRNK ima odgovarajući molekul sličan tracrRNK. Molekul sličan crRNK dodatno obezbeđuje segment za ciljanje jednolančane DNK. Dakle, molekul sličan crRNK i molekul sličan tracrRNK (kao odgovarajući par) se hibridizuju da bi formirali RNK koja cilja na DNK. Tačna sekvenca datog molekula crRNK ili tracrRNK je karakteristična za vrstu u kojoj se nalaze molekuli RNK.
Termin „aktivatorska RNK“ se ovde koristi za označavanje molekula nalik tracrRNK dvomolekularne DNK ciljane na RNK. Termin „ciljna RNK“ se ovde koristi da označi molekul sličan crRNK sa dvostrukim RNK molekulom koji cilja DNK. Termin „segment koji formira dupleks“ se ovde koristi da označi deo nukleotida aktivatorske RNK ili ciljne RNK koji doprinosi formiranju dupleksa dsRNK hibridizacijom sa nizom nukleotida odgovarajuće aktivatorske RNK ili ciljni molekul RNK. Drugim rečima, aktivatorska RNK sadrži segment koji formira dupleks koji je komplementaran segmentu koji formira dupleks odgovarajuće ciljne RNK. Kao takva, aktivatorska RNK sadrži segment koji formira dupleks, dok ciljna RNK sadrži i segment koji formira dupleks i segment koji cilja na DNK od RNK koja cilja DNK. Prema tome, RNK koja cilja na DNK sa dvostrukim molekulom može se sastojati od bilo kog odgovarajućeg para aktivatorske RNK i ciljne RNK.
RNK sa dva molekula DNK može biti dizajnirana da omogući kontrolisano (tj. uslovno) vezivanje ciljne RNK sa aktivatorskom RNK. Pošto RNK koji cilja DNK sa dva molekula nije funkcionalna osim ako i aktivatorska RNK i ciljna RNK nisu vezane u funkcionalni kompleks sa Cas9, RNK koji cilja DNK sa dva molekula može biti inducibilna (npr. inducibilna lekom) pomoću pravljenja vezivanja između aktivatorske RNK i ciljne RNK inducibilnim. Kao jedan neograničavajući primer, RNK aptameri se mogu koristiti za regulisanje (tj. kontrolu) vezivanja aktivatorske RNK sa ciljnom RNK. Shodno tome, aktivatorska RNK i/ili ciljna RNK mogu sadržati sekvencu RNK aptamera.
RNK aptameri su poznati u predmetnoj oblasti i generalno su sintetička verzija riboprekidača. Termini „RNK aptamer“ i „riboprekidač“ se ovde koriste naizmenično da obuhvate i sintetičke i prirodne sekvence nukleinskih kiselina koje obezbeđuju inducibilnu regulaciju strukture (i stoga dostupnost specifičnih sekvenci) molekula RNK čiji su deo. RNK aptameri obično sadrže sekvencu koja se savija u određenu strukturu (npr. ukosnicu), koja specifično vezuje određeni lek (npr. mali molekul). Vezivanje leka izaziva strukturnu promenu u savijanju RNK, čime se menja karakteristika nukleinske kiseline čiji je deo aptamer. Kao neograničavajući primeri: (i) aktivatorska RNK sa aptamerom možda neće moći da se veže za srodnu ciljnu RNK osim ako aptamer nije vezan odgovarajućim lekom; (ii) ciljna RNK sa aptamerom možda neće moći da se veže za srodnu aktivatorsku RNK osim ako aptamer nije vezan odgovarajućim lekom; i (iii) ciljna RNK i aktivatorska RNK, od kojih svaka sadrži drugačiji aptamer koji vezuje drugačiji lek, možda neće moći da se vežu jedno za drugo osim ako nisu prisutna oba leka. Kao što je ilustrovano ovim primerima, RNK koji cilja DNK sa dva molekula može biti dizajnirana da bude inducibilna.
Primeri aptamera i riboprekidača mogu se naći, na primer, u: Nakamura i sar., Genes Cells.2012 Maj;17(5):344-64; Vavalle i sar., Future Cardiol. 2012 May;8(3):371-82; Citartan i sar., Biosens Bioelectron.2012 Apr 15;34(1):1-11; i Liberman i sar., Wiley Interdiscip Rev RNA.2012 May-Jun;3(3):369-84.
Neograničavajući primeri nukleotidnih sekvenci koje mogu biti uključene u RNK koja cilja dvomolekulsku DNK uključuju ciljne RNK (npr. SEQ ID NO: 566-567) koje se mogu upariti sa segmentom koji formira dupleks bilo kog od skupa aktivatorskih RNK dalje u SEQ ID NO: 671-678.
Primer RNK sa jednim molekulom koji cilja DNK sadrži dva komplementarna dela nukleotida koji se hibridizuju da bi formirali dsRNK dupleks. U nekim otelotvorenjima, jedan od dva komplementarna dela nukleotida RNK koja cilja na jednomolekulsku DNK (ili DNK koja kodira deo) je najmanje oko 60% identičan jednoj od sekvenci aktivatorske RNK (tracrRNK) koja je navedena u SEQ ID NO: 431-562 preko dela od najmanje 8 susednih nukleotida. Na primer, jedan od dva komplementarna dela nukleotida jednomolekulske DNK ciljane RNK (ili DNK koja kodira deo) je najmanje oko 65% identičan, najmanje oko 70% identičan, najmanje oko 75% identičan, najmanje oko 80% identičan, najmanje oko 85% identičan, najmanje oko 90% identičan, najmanje oko 95% identičan, najmanje oko 98% identičan, najmanje oko 99% identičan ili 100% identičan jednoj od tracrRNK sekvenci navedenih u SEQ ID NO.:431-562 preko dela od najmanje 8 uzastopnih nukleotida.
U nekim otelotvorenjima, jedan od dva komplementarna dela nukleotida RNK koja cilja na jednomolekulsku DNK (ili DNK koja kodira deo) je najmanje oko 60% identičan jednoj od sekvenci ciljane RNK (cRNK) koja je navedena u SEQ ID NO: 563-679 preko dela od najmanje 8 susednih nukleotida. Na primer, jedan od dva komplementarna dela nukleotida RNK koja cilja jednomolekulsku DNK (ili DNK koja kodira deo) je najmanje oko 65% identičan, najmanje oko 70% identičan, najmanje oko 75% identičan, najmanje oko 80% identičan, najmanje oko 85% identičan, najmanje oko 90% identičan, najmanje oko 95% identičan, najmanje oko 98% identičan, najmanje oko 99% identičan ili 100% identičan jednoj od cRNK sekvenci navedenih u SEQ ID NO.:563-679 preko dela od najmanje 8 uzastopnih nukleotida.
Definicije date u "Definicije - I deo" su takođe primenljive na trenutni odeljak; pogledajte „Definicije – I deo“ za dodatna pojašnjenja pojmova.
Pre nego što se predmetni pronalazak dodatno opiše, treba razumeti da ovaj pronalazak nije ograničen na određena opisana otelotvorenja, jer takva mogu, naravno, da variraju. Takođe treba razumeti da je terminologija korišćena ovde samo u svrhu opisivanja određenih otelotvorenja, i nije namera da bude ograničavajuća, pošto će obim predmetnog pronalaska biti ograničen samo priloženim patentnim zahtevima.
Naznačeno time što je naveden raspon vrednosti, podrazumeva se da je svaka intervenciona vrednost, do desetine jedinice donje granice, osim ako kontekst jasno ne nalaže drugačije, između gornje i donje granice tog opsega i bilo koje druge navedene ili intervencione vrednosti u taj navedeni opseg obuhvaćena pronalaskom. Gornje i donje granice ovih manjih opsega mogu nezavisno biti uključene u manje opsege, a takođe su obuhvaćene pronalaskom, podložno bilo kojoj posebno isključenoj granici u navedenom opsegu. Naznačeno time što navedeni opseg uključuje jednu ili obe granice, opsezi koji isključuju jednu ili obe uključene granice takođe su uključeni u pronalazak.
Osim ako nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni termini korišćeni ovde generalno imaju isto značenje kao i kada ih koriste osobe sa uobičajenim znanjem u predmetnoj oblasti kojoj ovaj pronalazak pripada. Iako se bilo koji postupci i materijali slični ili ekvivalentni onima koji su ovde opisani mogu koristiti u praksi ili testiranju predmetnog pronalaska, opisani su poželjni postupci i materijali.
Mora se napomenuti da, kako se ovde koriste i u priloženim patentnim zahtevima, oblici jednine uključuju množinu, osim ako kontekst jasno ne nalaže drugačije. Tako, na primer, referenca na "enzimski neaktivan Cas9 polipeptid" uključuje mnoštvo takvih polipeptida, a referenca na „ciljnu nukleinsku kiselinu“ uključuje upućivanje na jednu ili više ciljnih nukleinskih kiselina i njihovih ekvivalenata poznatih stručnjacima u predmetnoj oblasti, i tako dalje. Dalje se napominje da patentni zahtevi mogu biti sastavljeni tako da isključe bilo koji opcioni element. Kao takva, ova izjava treba da posluži kao prethodna osnova za upotrebu takve ekskluzivne terminologije kao što su „isključivo“, „samo“ i slično u vezi sa navođenjem elemenata patentnih zahteva ili upotrebom
„negativnog“ ograničenja.
Smatra se da određene karakteristike pronalaska, koje su, radi jasnoće, opisane u kontekstu odvojenih otelotvorenja, takođe mogu biti obezbeđene u kombinaciji u jednom otelotvorenju. Nasuprot tome, različite karakteristike pronalaska, koje su, radi kratkoće, opisane u kontekstu jednog otelotvorenja, takođe mogu biti obezbeđene odvojeno ili u bilo kojoj pogodnoj podkombinaciji. Sve kombinacije otelotvorenja koje se odnose na pronalazak su posebno obuhvaćene predmetnim pronalaskom i ovde su objavljene baš kao da je svaka kombinacija pojedinačno i eksplicitno objavljena. Pored toga, sve podkombinacije različitih otelotvorenja i njihovih elemenata su takođe posebno obuhvaćene predmetnim pronalaskom i ovde su otkrivene baš kao da je svaka takva podkombinacija pojedinačno i eksplicitno objavljena ovde.
Publikacije o kojima se ovde govori su obezbeđene isključivo radi njihovog obelodanjivanja pre datuma podnošenja predmetne prijave. Ništa ovde se ne može tumačiti kao priznanje da predmetni pronalazak nema pravo da prethodi takvom objavljivanju na osnovu prethodnog pronalaska. Dalje, dati datumi objavljivanja mogu se razlikovati od stvarnih datuma objavljivanja koji će možda morati da budu nezavisno potvrđeni.
Primeri
Sledeći primeri su izneti tako da osobama sa uobičajenim znanjem u predmetnoj oblasti pruže potpuno obelodanjivanje i opis kako da naprave i koriste predmetni pronalazak, i nemaju za cilj da ograniče obim onoga što pronalazači smatraju svojim pronalaskom niti da su namenjeni da predstavljaju da su eksperimenti u nastavku svi ili jedini izvedeni eksperimenti. Uloženi su napori da se osigura tačnost u pogledu korišćenih brojeva (npr. količine, temperature, itd.), ali neke eksperimentalne greške i odstupanja treba uzeti u obzir. Osim ako nije drugačije naznačeno, delovi su delovi po težini, molekulska težina je prosečna molekulska težina, temperatura je u stepenima Celzijusa, a pritisak je na ili blizu atmosferskog. Mogu se koristiti standardne skraćenice, npr. bp, bazni par(ovi); kb, kilobaza(e); pl, pikolitar(i); s ili sek, sekunda(e); min, minuta(e); h ili hr, sat(i); aa, amino kiselina(e); kb, kilobaza(e); bp, bazni par(i); nt, nukleotid(i); im, intramuskularno; ip, intraperitonealno; sc, subkutano; i slično.
Primer 1: Upotreba Cas9 za generisanje modifikacija ciljne DNK.
Materijali i postupci
Sojevi bakterija i uslovi kulture
Streptococcus pyogenes, kultivisan u THY medijumu (Todd Hewitt Broth (THB, Bacto, Becton Dickinson) sa dodatkom 0,2% ekstrakta kvasca (Oksoid)) ili na TSA (triptikaza soja agar, BBL, Becton Dickinson) sa dodatkom 3% ovčije krvi. inkubirano na 37 °C u atmosferi sa dodatkom 5%CO2bez mućkanja. Escherichia coli, uzgojena u Luria-Bertani (LB) medijumu i agaru, inkubirana je na 37 °C uz mućkanje. Po potrebi, odgovarajući antibiotici su dodavani u medijum u sledećim konačnim koncentracijama: ampicilin, 100 µg/ml za E. coli; hloramfenikol, 33 µg/ml za Escherichia coli; kanamicin, 25 µg/ml za E. coli 300 µg/ml za S. pyogenes. Rast bakterijskih ćelija je periodično praćen merenjem optičke gustine alikvota kulture na 620 nm korišćenjem čitača mikroploče (SLT Spectra Reader).
Transformacija bakterijskih ćelija
Transformacija plazmidne DNK u E. coli ćeliju je izvedena prema standardnom protokolu toplotnog šoka. Transformacija S. pyogenes je izvedena kao što je prethodno opisano sa nekim modifikacijama. Test transformacije izveden za praćenje in vivo CRISPR/Cas aktivnosti na održavanju plazmida je u suštini izveden kao što je prethodno opisano. Ukratko, elektrokompetentne ćelije S. pyogenes su izjednačene na istu ćelijsku gustinu i elektroporisane sa 500 ng plazmidne DNK. Svaka transformacija je postavljena dva do tri puta i eksperiment je izveden tri puta nezavisno sa različitim serijama kompetentnih ćelija za statističku analizu. Efikasnosti transformacije su izračunate kao CFU (jedinice koje formiraju kolonije) po µg DNK. Kontrolne transformacije su izvedene sa sterilnom vodom i vektorom kičme pEC85.
DNK manipulacije
DNK manipulacije uključujući pripremu DNK, amplifikaciju, varenje, ligaciju, prečišćavanje, elektroforezu u agaroznom gelu izvedene su prema standardnim tehnikama sa manjim modifikacijama. Protospacer plazmidi za in vitro brazdanje i testove transformacije S. pyogenes konstruisani su kako je prethodno opisano (4). Dodatni plazmidi protospacera zasnovani na pUC19 za in vitro testove brazdanja su generisani ligiranjem žarenih oligonukleotida između digestiranih EcoRI i BamHI mesta u pUC19. Plazmid koji sadrži GFP gen je prethodno opisan (41). Kompleti (Qiagen) su korišćeni za prečišćavanje DNK i pripremu plazmida. Mutageneza plazmida je izvedena korišćenjem QuikChange<®>II XL kompleta (Stratagene) ili QuikChange kompleta za mutagenezu usmerenu na mesto (Agilent). VBC-Biotech Services, Sigma-Aldrich i Integrated DNK Technologies su isporučile sintetičke oligonukleotide i RNK.
Oligonukleotidi za in vitro šablone za transkripciju
Šabloni za in vitro transkribovanu CRISPR tip II-A tracrRNK i crRNKS. pyogenes(za tracrRNK - PCR na chr. DNK SF370; za crRNK -žarenje dva oligonukleotida)
T7-tracrRNK (75nt)
OLEC1521 (F 5' tracrRNK): SEQ ID NO:340
OLEC1522 (R 3' tracrRNK): SEQ ID NO:341
T7-crRNK (šablon)
OLEC2176 (F crRNK-sp1): SEQ ID NO:342
OLEC2178 (R crRNK-sp1): SEQ ID NO:343
OLEC2177 (F crRNK-sp2): SEQ ID NO:344
OLEC2179 (R crRNK-sp2): SEQ ID NO:345
Šabloni za in vitro transkribovanu tracrRNK N. meningitidis i projektovanu crRNK-sp2 (za tracrRNK - PCR na hr. DNK Z2491; za crRNK -žarenje dva oligonukleotida)
T7-tracrRNK
OLEC2205 (P predviđa 5'): SEQ ID NO:346
OLEC2206 (R predviđeno 3'): SEQ ID NO:347
T7-crRNK (šablon)
OLEC2209 (F sp2(speM) N.m. ponavljanje): SEQ ID NO:348
OLEC2214 (R sp2(speM) N.m. ponavljanje): SEQ ID NO:349
Šabloni za in vitro transkribovanu L. innocua tracrRNK i projektovanu crRNK-sp2 (za tracrRNK - PCR na hr. DNK Clip11262; za crRNK - žarenje dva oligonukleotida)
T7-tracrRNK
OLEC2203 (F predviđeno 5'): SEQ ID NO:350
OLEC2204 (R predviđeno 3'): SEQ ID NO:351
T7-crRNK (šablon)
OLEC2207 (F sp2(speM) L.in. ponavljanje): SEQ ID NO:352
OLEC2212 (R sp2(speM) L.in. ponavljanje): SEQ ID NO:353
Oligonukleotidi za konstruisanje plazmida sa protospacerom za in vitro i in vivo studije
Plazmidi zaspeM(spacer 2 (CRISPR Tip II-A, SF370; protospacer profage ø8232.3 iz MGAS8232) analiza in vitro i u S.pyogenes (šablon: hr. DNK MGAS8232 ili plazmidi koji sadržespeMfragmente)
pEC287
OLEC1555 (F speM): SEQ ID NO:354
OLEC1556 (R speM): SEQ ID NO:355
pEC488
OLEC2145 (F speM): SEQ ID NO:356
OLEC2146 (R speM): SEQ ID NO:357
pEC370
OLEC1593 (F pEC488 protospacer 2 A22G): SEQ ID NO:358 OLEC1594 (R pEC488 protospacer 2 A22G): SEQ ID NO:359 pEC371
OLEC1595 (F pEC488 protospacer 2 T10C): SEQ ID NO:360 OLEC1596 (R pEC488 protospacer 2 T10C): SEQ ID NO:361 pEC372
OLEC2185 (F pEC488 protospacer 2 T7A): SEQ ID NO:362 OLEC2186 (R pEC488 protospacer 2 T7A): SEQ ID NO:363 pEC373
OLEC2187 (F pEC488 protospacer 2 A6T): SEQ ID NO:364 OLEC2188 (R pEC488 protospacer 2 A6T): SEQ ID NO:365 pEC374
OLEC2235 (F pEC488 protospacer 2 A5T): SEQ ID NO:366 OLEC2236 (R pEC488 protospacer 2 A5T): SEQ ID NO:367 pEC375
OLEC2233 (F pEC488 protospacer 2 A4T): SEQ ID NO:368 OLEC2234 (R pEC488 protospacer 2 A4T): SEQ ID NO:369 pEC376
OLEC2189 (F pEC488 protospacer 2 A3T): SEQ ID NO:370 OLEC2190 (R pEC488 protospacer 2 A3T): SEQ ID NO:371 pEC377
OLEC2191 (F pEC488 protospacer 2 PAM G1C): SEQ ID NO:372 OLEC2192 (R pEC488 protospacer 2 PAM G1C): SEQ ID NO:373 pEC378
OLEC2237 (F pEC488 protospacer 2 PAM GG1, 2CC): SEQ ID NO:374 OLEC2238 (R pEC488 protospacer 2 PAM GG1, 2CC): SEQ ID NO:375
Plazmidi za SPy_0700 (spacer 1 (CRISPR tip II-A, SF370; protospacer profag ø370.1 iz SF370) analiza in vitro i kod S.
Pyogenes (šablon: hr. DNK SF370 ili plazmidi koji sadrže SPy_0700 fragmente)
pEC489
OLEC2106 (F Spy_0700): SEQ ID NO:376
OLEC2107 (R Spy_0700): SEQ ID NO:377
pEC573
OLEC2941 (F PAM TG1, 2GG): SEQ ID NO:378
OLEC2942 (R PAM TG1, 2GG): SEQ ID NO:379 Oligonukleotidi za verifikaciju plazmidnih konstrukcija i mesta rezanja analizom sekvenciranja
ColE1 (pEC85)
oliRN228 (R sekvenciranje): SEQ ID NO:380
speM (pEC287)
OLEC1557 (F sekvencioniranje): SEQ ID NO:381
OLEC1556 (R sekvenciranje): SEQ ID NO:382
repDEG-pAMbeta1 (pEC85)
OLEC787 (F sekvenciranje): SEQ ID NO:383
Oligonukleotidi za in vitro testove brazdanja
crRNK
Spacer 1 crRNK (1-42): SEQ ID NO:384
Spacer 2 crRNK (1-42): SEQ ID NO:385
Spacer 4 crRNK (1-42): SEQ ID NO:386
Spacer 2 crRNK (1-36): SEQ ID NO:387
Spacer 2 crRNK (1-32): SEQ ID NO:388
Spacer 2 crRNK (11-42): SEQ ID NO:389
tracrRNK
(4-89): SEQ ID NO:390
(15-89): SEQ ID NO:391
(23-89): SEQ ID NO:392
(15-53): SEQ ID NO:393
(15-44): SEQ ID NO:394
(15-36): SEQ ID NO:395
(23-53): SEQ ID NO:396
(23-48): SEQ ID NO:397
(23-44): SEQ ID NO:398
(1-26): SEQ ID NO:399
himerne RNK
Spacer 1 - himera A: SEQ ID NO:400 Spacer 1 - himera B: SEQ ID NO:401 Spacer 2 - himera A: SEQ ID NO:402 Spacer 2 - himera B: SEQ ID NO:403 Spacer 4 - himera A: SEQ ID NO:404 Spacer 4 - himera B: SEQ ID NO:405 GFP1: SEQ ID NO:406
GFP2: SEQ ID NO:407
GFP3: SEQ ID NO:408
GFP4: SEQ ID NO:409
GFP5: SEQ ID NO:410
DNK oligonukleotidi kao supstrati za testove brazdanja (protospacer podebljan, PAM podvučen)
protospacer 1 - komplementaran - WT: SEQ ID NO:411
protospacer 1 - nekomplementaran - WT: SEQ ID NO:412
protospacer 2 - komplementaran - WT: SEQ ID NO:413
protospacer 2 - nekomplementaran - WT: SEQ ID NO:414
protospacer 4 - komplementaran - WT: SEQ ID NO:415
protospacer 4 - nekomplementaran - WT: SEQ ID NO:416
protospacer 2 - komplementaran - PAM1: SEQ ID NO:417
protospacer 2 - nekomplementaran - PAM1: SEQ ID NO:418
protospacer 2 - komplementaran - PAM2: SEQ ID NO:419
protospacer 2 - nekomplementaran - PAM2: SEQ ID NO:420
protospacer 4 - komplementaran - PAM1: SEQ ID NO:421
protospacer 4 - nekomplementaran - PAM1: SEQ ID NO:422
protospacer 4 - komplementaran - PAM2: SEQ ID NO:423
protospacer 4 - nekomplementaran - PAM2: SEQ ID NO:424
In vitro transkripcija i prečišćavanje RNK
RNK je in vitro transkribovana korišćenjem T7 Flash in vitro kompleta za transkripciju (Epicentar, kompanija Illumina) i PCR generisanih DNK šablona koji nose sekvencu T7 promotera. RNK je pročišćena gelom i proveren je kvalitet pre upotrebe. Prajmeri koji se koriste za pripremu RNK šablona iz S. pyogenes SF370, Listeria innocua Clip 11262 i Neisseria meningitidis A Z2491 su opisani iznad.
Prečišćavanje proteina
Sekvenca koja kodira Cas9 (talozi 1-1368) je amplifikovana pomoću PCR iz genomske DNK S. pyogenes SF370 i ubačena u prilagođeni ekspresioni vektor baziran na pET korišćenjem kloniranja nezavisnog od ligacije (LIC).
Dobijeni fuzioni konstrukt je sadržao oznaku N-terminalnog proteina za vezivanje heksahistidin-maltoze (His6-MBP), praćenog peptidnom sekvencom koja sadrži mesto brazdanja proteaze virusa duvana (TEV). Protein je eksprimiran u E. coli soju BL21 Rosetta 2 (DE3) (EMD Biosciences), uzgajanom u 2xTY medijumu na 18 °C tokom 16 h nakon indukcije sa 0,2 mM IPTG. Protein je prečišćen kombinacijom afiniteta, jonske razmene i hromatografskih koraka isključivanja veličine. Ukratko, ćelije su lizirane u 20 mM Tris pH 8,0, 500 mM NaCl, 1 mM TCEP (dopunjen koktelom inhibitora proteaze (Roche)) u homogenizatoru (Avestin). Prečišćeni lizat je vezan u seriji za Ni-NTA agarozu (Qiagen). Smola je opsežno isprana sa 20 mM Tris pH 8,0, 500 mM NaCl i vezani protein je eluiran u 20 mM Tris pH 8,0, 250 mM NaCl, 10% glicerola. His6-MBP oznaka afiniteta je uklonjena brazdanjem sa TEV proteazom, dok je protein dijalizovan preko noći protiv 20 mM HEPES pH 7,5, 150 mM KCl, 1 mM TCEP, 10% glicerola. Brazdani Cas9 protein je odvojen od fuzione oznake prečišćavanjem na koloni SP Sepharose HiTrap od 5 ml (GE Life Sciences), eluiranjem sa linearnim gradijentom od 100 mM - 1 M KCl. Protein je dalje prečišćen ekskluzionom hromatografijom na Superdex 20016/60 koloni u 20 mM HEPES pH 7,5, 150 mM KCl i 1 mM TCEP. Eluirani protein je koncentrovan do ~8 mg/ml, brzo zamrznut u tečnom azotu i čuvan na -80 °C. Cas9 D10A, H840A i D10A/H840A tačkasti mutanti su generisani korišćenjem kompleta za mutagenezu usmerenu na mesto QuikChange (Agilent) i potvrđeni sekvenciranjem DNK. Proteini su prečišćeni po istoj proceduri kao i za divlji tip Cas9 proteina.
Cas9 ortolozi iz Streptococcus thermophilus (LMD-9,YP_820832.1), L. innocua (Clip11262, NP_472073.1), Campylobacter jejuni (subsp. jejuni NCTC 11168, YP_002344900.1) i N. meningitidis (Z2491, YP_002342100.1) eksprimirani su u BL21 Rosetta (DE3) pLysS ćelijama (Novagen) kao His6-MBP (N. meningitidis i C. jejuni), His6-Thioredoksin (L. innocua) i His6-GST (S.
thermophilus) fuzionih proteina, i prečišćeni u suštini kao za S. pyogenes Cas9 sa sledećim modifikacijama. Zbog velikih količina nukleinskih kiselina za koprečišćavanje, sva četiri proteina Cas9 su prečišćena dodatnim korakom heparin sefaroze pre filtracije gelom, eluiranjem vezanog proteina sa linearnim gradijentom od 100 mM - 2 M KCl. Ovim je uspešno uklonjena kontaminacija nukleinskom kiselinom sa proteina C. jejuni, N. meningitidis i L. innocua, ali nije se uspela ukloniti nukleinska kiselina koja se ko-prečišćava iz preparata S. thermophilus Cas9. Svi proteini su koncentrovani do 1-8 mg/ml u 20 mM HEPES pH 7,5, 150 mM KCl i 1 mM TCEP, brzo zamrznuti u tečnom N2 i čuvani na -80 °C.
Test brazdanja plazmidne DNK
Sintetička ili in vitro transkribovana tracrRNK i crRNK su prethodno žarene pre reakcije zagrevanjem na 95 °C i laganim hlađenjem do sobne temperature. Nativna ili restrikcijsko digest-linearizovana plazmidna DNK (300 ng (~8 nM)) je inkubirana 60 minuta na 37 °C sa prečišćenim Cas9 proteinom (50-500 nM) i tracrRNA:crRNA dupleksom (50-500 nM, 1:1) u Cas9 pHm puferu plazmida(20 mM HEPES pH 7,5, 150 mM KCl, 0,5 mM DTT, 0,1 mM EDTA) sa ili bez 10 mM MgCl2. Reakcije su zaustavljene sa 5X puferom za punjenje DNK koji sadrži 250 mM EDTA, rastvoren elektroforezom u 0,8 ili 1% agaroznom gelu i vizuelizovan bojenjem etidijum bromidom. Za testove brazdanja mutanta Cas9, reakcije su zaustavljene sa 5X SDS puferom za punjenje (30% glicerol, 1,2% SDS, 250 mM EDTA) pre stavljanja na agarozni gel.
Ispitivanje brazdanja zavisno od metala
Protospacer 2 plazmid DNK (5 nM) je inkubiran 1 h na 37 °C sa Cas9 (50 nM) prethodno inkubiran sa 50 nM tracrRNK:crRNK-sp2 u puferu za brazdanje (20 mM HEPES pH 7,5, 150 mM KCl, 0,5 mM DTT, 0,1 mM EDTA) sa dodatkom 1,5 ili 10 mM MgCl2, 1 ili 10 mM MnCl2, CaCl2, ZnCl2, CoCl2, NiSO4 ili CuSO4. Reakcija je zaustavljena dodavanjem 5X SDS pufera za punjenje (30% glicerol, 1,2% SDS, 250 mM EDTA), razdvojenog elektroforezom 1% agaroznog gela i vizualizovanog bojenjem etidijum bromidom.
Test sa pojedinačnim obrtom
Cas9 (25 nM) je prethodno inkubiran 15 minuta na 37 °C u puferu za brazdanje (20 mM HEPES pH 7,5, 150 mM KCl, 10 mM MgCl2, 0,5 mM DTT, 0,1 mM EDTA) sa duplim tracrRNK:crRNK-sp2 (25 nM, 1: 1) ili obe RNK (25 nM) nisu prethodno žarene i reakcija je započeta dodavanjem protospacer 2 plazmidne DNK (5 nM). Reakciona mešavina je inkubirana na 37 °C. U definisanim vremenskim intervalima, uzorci su izvučeni iz reakcije, dodat je 5X SDS pufer za punjenje (30% glicerol, 1,2% SDS, 250 mM EDTA) da bi se zaustavila reakcija, a brazdanje je praćeno elektroforezom 1% agaroznog gela i bojenjem etidijum bromidom. Isto je urađeno za kinetiku pojedinačnog obrta bez predinkubacije Cas9 i RNK, naznačeno time što je DNK plazmida protospacera 2 (5 nM) pomešana u puferu za brazdanje sa dupleks tracrRNK: crRNK-sp2 (25 nM) ili obe RNK (25 nM) nisu prethodno žarene, a reakcija je započeta dodavanjem Cas9 (25 nM). Procenat brazdanja je analiziran denzitometrijom i prosek tri nezavisna eksperimenta je ucrtan u odnosu na vreme. Podaci su prilagođeni analizom nelinearne regresije i izračunate su stope brazdanja (kobs[min<-1>]).
Test sa višestrukim obrtom
Cas9 (1 nM) je prethodno inkubiran 15 minuta na 37 °C u puferu za brazdanje (20 mM HEPES pH 7,5, 150 mM KCl, 10 mM MgCl2, 0,5 mM DTT, 0,1 mM EDTA) sa prethodno žarenom tracrRNK:crRNK-sp2 (1 nM, 1: 1). Reakcija je započeta dodavanjem DNK plazmida protospacer 2 (5 nM). U definisanim vremenskim intervalima, uzorci su povučeni i reakcija je zaustavljena dodavanjem 5X SDS pufera za punjenje (30% glicerol, 1,2% SDS, 250 mM EDTA). Reakcija brazdanja je razdvojena elektroforezom u 1% agaroznom gelu, obojena etidijum bromidom i procenat brazdanja je analiziran denzitometrijom. Rezultati četiri nezavisna eksperimenta su prikazani u zavisnosti od vremena (min).
Test brazdanja oligonukleotidne DNK
DNK oligonukleotidi (10 pmol) su obeleženi inkubacijom sa 5 jedinica T4 polinukleotid kinaze (New England Biolabs) i ~3-6 pmol (20-40 mCi) [γ-32P]ATP (Promega) u 1X T4 reakciji polinukleotidne kinaze pufera na 37 °C tokom 30 min, u reakciji od 50 µl. Nakon toplotne inaktivacije (65 °C tokom 20 min), reakcije su prečišćene preko Illustra MicroSpin G-25 kolone (GE Healthcare) da bi se uklonila neugrađena oznaka. Dupleks supstrati (100 nM) su generisani žarenjem obeleženih oligonukleotida sa ekvimolarnim količinama neobeleženog komplementarnog oligonukleotida na 95 °C tokom 3 minuta, nakon čega je usledilo sporo hlađenje do sobne temperature. Za testove brazdanja, tracrRNK i crRNK su žarene zagrevanjem na 95 °C tokom 30 s, nakon čega je usledilo sporo hlađenje do sobne temperature. Cas9 (konačna koncentracija 500 nM) je prethodno inkubiran sa žarenim tracrRNK:crRNK dupleksom (500 nM) u puferu za ispitivanje brazdanja (20 mM HEPES pH 7,5, 100 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1 mM DTT 5% glicerol) u ukupnoj zapremini od 9 µl. Reakcije su započete dodavanjem 1 µl ciljne DNK (10 nM) i inkubirane 1 h na 37 °C. Reakcije su ugašene dodavanjem 20 µl boje za punjenje (5 mM EDTA, 0,025% SDS, 5% glicerol u formamidu) i zagrevane na 95 °C tokom 5 min. Produkti brazdanja su razdvojeni na 12% denaturišućim poliakrilamidnim gelovima koji sadrže 7 M uree i vizualizovani pomoću fosforoskeniranja (Storm, GE Life Sciences). Testovi brazdanja koji testiraju PAM zahteve (Slika 13B) su sprovedeni korišćenjem DNK dupleks supstrata koji su prethodno žareni i prečišćeni na 8% prirodnom akrilamidnom gelu, a zatim radioaktivno obeleženi na oba 5' kraja. Reakcije su postavljene i analizirane kao iznad.
Testovi promene elektroforetske mobilnosti
Dupleksi ciljne DNK su formirani mešanjem svakog lanca (10 nmol) u dejonizovanoj vodi, zagrevanjem na 95 °C tokom 3 minuta i polaganim hlađenjem do sobne temperature. Sve DNK su prečišćene na 8% nativnih gelova koji sadrže 1X TBE. DNK trake su vizualizovane UV senčenjem, izrezane i eluirane natapanjem delova gela u H2O tretiranom DEPC. Eluirana DNK je istaložena etanolom i rastvorena u DEPC-tretiranoj H2O. Uzorci DNK su obeleženi sa 5' krajeva sa [γ-32P]-ATP korišćenjem T4 polinukleotid kinaze (New England Biolabs) tokom 30 minuta na 37 °C. PNK je toplotno denaturisan na 65 °C tokom 20 minuta, a neugrađena radioaktivna oznaka je uklonjena korišćenjem Illustra MicroSpin G-25 kolone (GE Healthcare). Testovi vezivanja su izvedeni u puferu koji sadrži 20 mM HEPES pH 7,5, 100 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1 mM DTT i 10% glicerol u ukupnoj zapremini od 10 µl. Cas9 D10A/H840A dvostruki mutant je programiran sa ekvimolarnim količinama prethodno žarenog tracrRNK:crRNK dupleksa i titriran od 100 pM do 1 µM. Radioaktivno obeležena DNK je dodata do konačne koncentracije od 20 pM. Uzorci su inkubirani 1 h na 37 °C i rastvoreni na 4 °C na 8% prirodnom poliakrilamidnom gelu koji sadrži 1X TBE i 5 mM MgCl2. Gelovi su osušeni i DNK vizualizovana pomoću fosforoskeniranja.
In silico analiza DNK i proteinskih sekvenci
Vektorski NTI paket (Invitrogen) je korišćen za analizu DNK sekvence (Vector NTI) i uporednu analizu sekvence proteina (AlignX).
In silico modeliranje strukture RNK i ko-preklapanje
In silico predviđanja su izvršena korišćenjem algoritama Vienna RNK paketa (42, 43). Sekundarne strukture RNK i modeli ko-sklapanja su predviđeni sa RNKfold i RNKcofold, respektivno i vizuelizovani sa VARNK (44).
Rezultati
Bakterije i arheje su razvile RNK posredovane adaptivne odbrambene sisteme koji se nazivaju grupisana, redovno raspoređena kratka palindromna ponavljanja (CRISPR)/CRISPR-povezani (Cas) koji štite organizme od invazije virusa i plazmida (1-3). Pokazali smo da u podskupu ovih sistema zrela crRNK koja je uparena bazama sa transaktivirajućom crRNK (tracrRNK) formira strukturu sa dve RNK koja usmerava protein Cas9 povezan sa CRISPR-om da uvede dvolančane (ds) prekide u ciljnoj DNK. Na mestima koja su komplementarna sekvenci crRNK-vodiča, domen Cas9 HNH nukleaze brazda komplementarni lanac, dok domen sličan Cas9 RuvC brazda nekomplementarni lanac. DualtracrRNK:crRNK, kada je projektovana kao jedna RNK himera, takođe usmerava brazdanje Cas9 dsDNK specifično za sekvencu. Ove studije otkrivaju familiju endonukleaza koje koriste dualne RNK za brazdanje DNK specifično za mesto i naglašavaju sposobnost da se sistem iskoristi za uređivanje genoma koji se može programirati pomoću RNK.
CRISPR/Cas odbrambeni sistemi se oslanjaju na male RNK za detekciju specifičnih sekvenci i utišavanje stranih nukleinskih kiselina.
CRISPR/Cas sistemi se sastoje od cas gena organizovanih u operon(e) i CRISPR niz(ove) koji se sastoje od sekvenci ciljanih na genom (zvanih spaceri) ispresecanih identičnim ponavljanjima (1-3). Imunitet posredovan CRISPR/Casom javlja se u tri koraka. U fazi adaptacije, bakterije i arheje koje nose jedan ili više CRISPR lokusa reaguju na virusni ili plazmidni izazov integracijom kratkih fragmenata strane sekvence (protospaceri) u hromozom domaćina na proksimalnom kraju CRISPR niza (1-3). U fazama ekspresije i interferencije, transkripcija ponavljajućeg spacer elementa u molekule prekursora CRISPR RNK (pre-crRNK) praćena enzimskim brazdanjem daje kratke crRNK koje se mogu upariti sa komplementarnim sekvencama protospacera napada virusnih ili plazmidnih ciljeva (4-11). Prepoznavanje cilja od strane crRNK usmerava utišavanje stranih sekvenci pomoću Cas proteina koji funkcionišu u kompleksu sa crRNK (10, 12-20).
Postoje tri tipa CRISPR/Cas sistema (21-23). Sistemi tipa I i III dele neke sveobuhvatne karakteristike: specijalizovane Cas endonukleaze obrađuju pre-crRNK, i kada sazre, svaka crRNK se sastavlja u veliki multi-Cas proteinski kompleks sposoban da prepozna i brazda nukleinske kiseline komplementarne crRNK. Nasuprot tome, sistemi tipa II obrađuju precrRNK različitim mehanizmom u kojem transaktivirajuća crRNK (tracrRNK) komplementarna sekvencama ponavljanja u pre-crRNK pokreće procesiranje dvolančanom (ds) RNK specifičnom ribonukleazom RNase III u prisustvu Cas9 (ranije Csn1) protein (Slika 15) (4, 24). Smatra se da je Cas9 jedini protein odgovoran za utišavanje strane DNK vođeno crRNK (25-27).
Prikazujemo da u sistemima tipa II, Cas9 proteini čine familiju enzima koji zahtevaju strukturu uparenu bazama formiranu između aktivirajuće tracrRNK i ciljane crRNK da bi brazdali ciljnu dsDNK. Brazdanje specifično za mesto se dešava na lokacijama koje su određene komplementarnošću uparivanja baza između crRNK i ciljne DNK protospacera i kratkim motivom [koji se naziva susedni motiv protospacera (PAM)] koji se nalazi pored komplementarnog regiona u ciljnoj DNK. Naša studija dalje pokazuje da se porodica endonukleaza Cas9 može programirati sa pojedinačnim molekulima RNK za brazdanje specifičnih DNK mesta, čime se olakšava razvoj jednostavnog i svestranog sistema usmerenog na RNK za generisanje prekida dsDNK za ciljanje i uređivanje genoma.
Cas9 je DNK endonukleaza vođena dvema RNK
Pretpostavlja se da je Cas9, karakteristični protein sistema tipa II, uključen i u sazrevanje crRNK i u interferenciju DNK vođene crRNK (Slika 15) (4, 25-27). Cas9 je uključen u sazrevanje crRNK (4), ali njegovo direktno učešće u uništavanju ciljne DNK nije istraženo. Da bismo testirali da li i kako Cas9 može biti sposoban za brazdanje ciljne DNK, koristili smo sistem prekomerne ekspresije za prečišćavanje proteina Cas9 koji potiče od patogena Streptococcus pyogenes (Slika 16, vidi dodatne materijale i postupke) i testirali njegovu sposobnost da brazda plazmidnu DNK ili oligonukleotidni dupleks koji nosi sekvencu protospacera komplementarnu zreloj crRNK, i autentični PAM. Otkrili smo da sama zrela crRNK nije sposobna da usmerava brazdanje plazmidne DNK katalizovane Cas9 (Slika 10A i Slika 17A). Međutim, dodavanje tracrRNK, koja se može upariti sa sekvencom ponavljanja crRNK i koja je neophodna za sazrevanje crRNK u ovom sistemu, pokrenula je Cas9 da brazda plazmidnu DNK (Slika 10A i Slika 17A). Reakcija brazdanja zahteva i magnezijum i prisustvo crRNK sekvence komplementarne DNK; crRNK sposobna za uparivanje baza tracrRNK, ali koja sadrži nepovezanu ciljnu DNK vezujuću sekvencu nije podržavala brazdanje plazmida katalizovano sa Cas9 (Slika 10A; Slika 17A, uporedite crRNK-sp2 sa crRNK-sp1; i Slika 18A). Dobili smo slične rezultate sa kratkim linearnim supstratom dsDNK (slika 10B i slika 17, B i C). Dakle, trans-aktivirajuća tracrRNK je mala nekodirajuća RNK sa dve kritične funkcije: pokretanje pre-crRNK procesiranja enzimom RNase III (4) i naknadno aktiviranje brazdanja DNK vođene crRNK pomoću Cas9.
Brazdanje plazmida i kratke linearne dsDNK pomoću tracrRNK:crRNK vođen Cas9 je specifičan za mesto (Slika 10, C do E, i Slika 19, A i B). Brazdanje plazmidne DNK proizvelo je tupe krajeve na poziciji tri para baza uzvodno od PAM sekvence (Slika 10, C i E, i Slika 19, A i C) (26). Slično, unutar kratkih dupleksa dsDNK, DNK lanac koji je komplementaran sekvenci za vezivanje cilja u crRNK (komplementarni lanac) se brazda na mestu tri para baza uzvodno od PAM (Slika 10, D i E i Slika 19, B i C). Nekomplementarni DNK lanac se brazda na jednom ili više mesta unutar tri do osam parova baza uzvodno od PAM-a. Dalje istraživanje je otkrilo da se nekomplementarni lanac prvo brazda endonukleolitičkim putem, a zatim skraćuje aktivnošću 3'-5' egzonukleaze (Slika 18B). Stope brazdanja od strane Cas9 u uslovima pojedinačnog obrta kretale su se od 0,3 do 1 min-1, uporedivo sa onima kod restrikcionih endonukleaza (Slika 20A), dok je inkubacija divljeg tipa (WT) Cas9-tracrRNK:crRNK kompleksa sa petostrukim molarnim viškom supstrata DNK pružila dokaze da je dvostruki Cas9 vođen sa RNK enzim sa višestrukim obrtom (slika 20B). Za razliku od CRISPR tipa I Cascade kompleksa (18), Cas9 brazda i linearizovane i supernamotane plazmide (Slike 10A i 11A). Stoga, invazivni plazmid može, u principu, biti višestruko brazdan od strane Cas9 proteina programiranih sa različitim crRNK.
Slika 10 (A) Cas9 je programiran sa crRNK-sp2 od 42 nukleotida (crRNK koja sadrži spacer 2 sekvencu) u prisustvu ili odsustvu tracrRNK od 75 nukleotida. Kompleks je dodat kružnoj ili XhoI-linearizovanoj plazmidnoj DNK koja nosi sekvencu komplementarnu spaceru 2 i funkcionalnom PAM-u. crRNK-sp1, kontrola specifičnosti; M, DNK marker; kbp, kilo-bazni par. Vidi sliku 17A. (B) Cas9 je programiran sa crRNK-sp2 i tracrRNK (nukleotidi 4 do 89). Kompleks je inkubiran sa dvolančanim ili jednolančanim DNK sa sekvencom komplementarnom sa spacerom 2 i funkcionalnim PAM (4). Komplementarni ili nekomplementarni lanci DNK su 5'-radioaktivno obeleženi i žareni sa neobeleženim partnerskim lancem. nt, nukleotidi. Pogledajte Sliku 17, B i C. (C) Analiza sekvenciranja produkta brazdanja sa slike 10A. Završetak produžetka prajmera u reakciji sekvenciranja ukazuje na položaj mesta brazdanja. 3' terminal A oznaka (zvezdice) je artefakt reakcije sekvenciranja. Pogledajte sliku 19, A i C. (D) Produkti brazdanja sa slike 10B su analizirani zajedno sa 5' krajnjim obeleženim markerima veličine koji su izvedeni iz komplementarnih i nekomplementarnih lanaca ciljnog DNK dupleksa. M, marker; P, produkt brazdanja. Pogledajte Sliku 19, B i C. (E) Šematski prikaz tracrRNK, crRNK-sp2 i protospacera 2 DNK sekvenci. Predstavljeni su regioni komplementarnosti crRNK sa tracrRNK (precrtano) i DNK protospacera (podvučeno). PAM sekvenca je označena; mesta brazdanja mapirana u (C) i (D) su predstavljena belim popunjenim strelicama (C), crnom popunjenom strelicom [(D), komplementarni niz], i crnom trakom [(D), nekomplementarni niz].
Slika 15 prikazuje CRISPR/Cas imuni put posredovan sa RNK tipa II. Koraci ekspresije i interferencije su predstavljeni na crtežu. CRISPR/Cas lokusi tipa II se sastoje od operona od četiri gena koji kodiraju proteine Cas9, Cas1, Cas2 i Csn2, CRISPR niza koji se sastoji od vodeće sekvence praćene identičnim ponavljanjima (crni pravougaonici) ispresecanim jedinstvenim spacerima koji ciljaju genom (dijamanti) i sekvence koja kodira trans-aktivirajuću tracrRNK. Ovde je predstavljen tip II CRISPR/Cas lokus S. pyogenes SF370 (Pristupni broj NC_002737) (4). Indikovani su eksperimentalno potvrđeni promoteri i terminator transkripcije u ovom lokusu (4). CRISPR niz se transkribuje kao prekursor CRISPR RNK (pre-crRNK) molekula koji prolazi kroz proces sazrevanja specifičnog za sisteme tipa II (4). U S. pyogenes SF370, tracrRNK se transkribuje kao dva primarna transkripta dužine 171 i 89 nt koji su komplementarni sa svakim ponavljanjem pre-crRNK. Prvi događaj obrade uključuje uparivanje tracrRNK sa pre-crRNK, formirajući dupleks RNK koju prepoznaje i brazda endoribonukleaza RNase III u domaćinstvu u prisustvu proteina Cas9. Brazdanje dupleksa RNK posredovano RNase III generiše 75-nt obrađenu tracrRNK i 66-nt intermedijernu crRNK koja se sastoji od centralnog regiona koji sadrži sekvencu od jednog spacera, okruženu delovima sekvence ponavljanja. Drugi proces obrade, posredovan nepoznatom(im) ribonukleazom(ama), dovodi do formiranja zrelih crRNK od 39 do 42 nt u dužini koje se sastoje od 5'-terminalne sekvence koja je izvedena iz spacera i 3'-terminalne sekvence izvedene iz ponavljanja. Nakon prvog i drugog događaja obrade, zrela tracrRNK ostaje uparena sa zrelim crRNK i vezana za Cas9 protein. U ovom ternarnom kompleksu, dualna tracrRNK:crRNK struktura deluje kao vodeći RNK koja usmerava endonukleazu Cas9 ka srodnoj ciljnoj DNK. Prepoznavanje cilja od strane Cas9-tracrRNK:crRNK kompleksa inicira se skeniranjem invazivnog molekula DNK radi homologije između protospacer sekvence u ciljnoj DNK i sekvence izvedene iz spacera u crRNK.
Pored komplementarnosti DNK protospacera-crRNK spacera, ciljanje DNK zahteva prisustvo kratkog motiva (NGG, naznačeno time što N može biti bilo koji nukleotid) pored protospacera (protospacer susedni motiv - PAM). Nakon uparivanja između dvostruke RNK i sekvence protospacera, formira se R-petlja i Cas9 zatim uvodi dvolančani prekid (DSB) u DNK. Brazdanje ciljne DNK pomoću Cas9 zahteva dva katalitička domena u proteinu. Na specifičnom mestu u odnosu na PAM, HNH domen brazda komplementarni lanac DNK, dok domen sličan RuvC brazda nekomplementarni lanac.
Slika 16 (A) S.pyogenes Cas9 je izražen u E.coli kao fuzioni protein koji sadrži N-terminalnu His6-MBP oznaku i prečišćen kombinacijom afiniteta, jonske razmene i hromatografskih koraka isključivanja veličine. Oznaka afiniteta je uklonjena brazdanjem TEV proteaze nakon koraka prečišćavanja afiniteta.
Prikazan je hromatogram konačne faze ekskluzione hromatografije na Superdex 200 (16/60) koloni. Cas9 eluira kao pojedinačni monomerni pik bez kontaminirajućih nukleinskih kiselina, kao što se procenjuje odnosom apsorbancija na 280 i 260 nm. Umetak; eluirane frakcije su razdvojene pomoću SDS-PAGE na 10% poliakrilamidnom gelu i obojene sa SimplyBlue Safe Stain (Invitrogen). (B) SDS-PAGE analiza prečišćenih Cas9 ortologa. Cas9 ortolozi su prečišćeni kako je opisano u Dodatnim materijalima i postupcima.2,5 µg svakog prečišćenog Cas9 je analizirano na 4-20% gradijentnom poliakrilamidnom gelu i obojeno sa SimplyBlue Safe Stain.
Slika 17 (takođe videti Sliku 10). Protospacer 1 sekvenca potiče od S.pyogenes SF370 (M1) SPy_0700, cilj S.pyogenes SF370 crRNKsp1 (4). Ovde se manipulisalo sekvencom protospacer 1 promenom PAM-a iz nefunkcionalne sekvence (TTG) u funkcionalnu (TGG). Protospacer 4 sekvenca potiče od S.pyogenes MGAS10750 (M4) MGAS10750_Spy1285, cilj S. pyogenes SF370 crRNK-sp4 (4). (A) Brazdanje plazmida DNK Protospacer 1 vođeno srodnim dupleksima tracrRNK: crRNK. Produkti brazdanja su razdvojeni elektroforezom u agaroznom gelu i vizuelizovani bojenjem etidijum bromidom. M, DNK marker; naznačene su veličine fragmenata u osnovnim parovima. (B) Brazdanje DNK oligonukleotida protospacer 1 vođeno srodnim tracrRNK: crRNK-sp1 dupleksom. Produkti brazdanja su razdvojeni elektroforezom denaturirajućeg poliakrilamidnog gela i vizuelizovani pomoću fosforoskeniranja. Naznačene su veličine fragmenata u nukleotidima. (C) Brazdanje DNK oligonukleotida protospacer 4 vođeno srodnim tracrRNK: crRNK-sp4 dupleksom. Produkti brazdanja su razdvojeni elektroforezom denaturirajućeg poliakrilamidnog gela i vizuelizovani pomoću fosforoskeniranja. Naznačene su veličine fragmenata u nukleotidima. (A, B, C) Eksperimenti u (A) su izvedeni kao na Slici 10A; u (B) i u (C) kao na Slici 10B. (B, C) Šema interakcije tracrRNK:crRNK ciljna DNK je prikazana ispod. Regioni komplementarnosti crRNK sa tracrRNK i DNK protospacera su precrtani, odnosno podvučeni. PAM sekvenca je označena.
Slika 18 (takođe videti Sliku 10). (A) Protospacer 2 plazmidna DNK je inkubirana sa Cas9 u kompleksu sa tracrRNK:crRNK-sp2 u prisustvu različitih koncentracija Mg<2+>, Mn<2+>, Ca<2+>, Zn<2+>, Co<2+>, Ni<2+>ili Cu<2+>. Produkti brazdanja su razdvojeni elektroforezom u agaroznom gelu i vizuelizovani bojenjem etidijum bromidom. Indikovani su oblici plazmida. (B) Dupleks DNK protospacer 4 oligonukleotida koji sadrži PAM motiv je žaren i prečišćen gelom pre radioaktivnog obeležavanja na oba 5' kraja. Dupleks (konačna koncentracija 10 nM) je inkubiran sa Cas9 programiranim sa tracrRNK (nukleotidi 23-89) i crRNKsp4 (500 nM konačna koncentracija, 1:1). U naznačenim vremenskim tačkama (min), alikvoti od 10 µl reakcije brazdanja su ugašeni formamidnim puferom koji sadrži 0,025% SDS i 5 mM EDTA, i analizirani elektroforezom denaturirajućeg poliakrilamidnog gela kao na Slici 10B. Naznačene su veličine u nukleotidima.
Slika 19 (A) Mapiranje brazdanja DNK plazmida protospacer 1.
Produkti brazdanja sa Slike 17A analizirani su sekvenciranjem kao na Slici 10C. Imajte na umu da je 3' terminal A oznaka (zvezdica) artefakt reakcije sekvenciranja. (B) Mapiranje brazdanja DNK oligonukleotida protospacer 4.
Produkti brazdanja sa Slike 17C analizirani su elektroforezom denaturirajućeg poliakrilamidnog gela pored markera veličine oligonukleotida sa 5' obeleženim krajem izvedenim iz komplementarnih i nekomplementarnih lanaca protospacer 4 dupleksa DNK. M, marker; P, produkt brazdanja. Trake 1-2: komplementarni niz.
Trake 3-4: nekomplementarni niz. Naznačene su veličine fragmenata u nukleotidima. (C) Šematski prikazi DNK sekvenci tracrRNK, crRNK-sp1 i protospacer 1 (gore) i tracrRNK, crRNKsp4 i protospacer 4 DNK sekvence (dole). tracrRNK:crRNK formira dvostruku RNK strukturu usmerenu na komplementarnu DNK protospacera kroz uparivanje DNK crRNK-protospacera. Regioni crRNK komplementarni sa tracrRNK i DNK protospacera su podvučeni, odnosno precrtani. Mesta brazdanja u komplementarnim i nekomplementarnim lancima DNK mapirana u (A) (gore) i (B) (dole) su predstavljena strelicama (A i B, komplementarni lanac) i crnom trakom (B, nekomplementarni lanac) iznad sekvenci, redom.
Slika 20 (A) Kinetika pojedinačnog obrta Cas9 pod različitim uslovima prethodno žarenog RNK i pre-inkubacije proteinske RNK. Protospacer 2 plazmidna DNK je inkubirana ili sa Cas9 prethodno inkubiranom sa prethodno žarenom tracrRNK:crRNK-sp2 (∘), Cas9 koja nije prethodno inkubirana sa prethodno žarenom tracrRNK:crRNK-sp2 (•), Cas9 prethodno inkubirana sa ne prethodno žarenom tracrRNK i crRNK-sp2 (□) ili Cas9 koji nije prethodno inkubiran sa ne prethodno žarenim RNK (■). Aktivnost brazdanja je praćena na način zavisan od vremena i analizirana elektroforezom u agaroznom gelu nakon čega je usledilo bojenje etidijum bromidom. Prosečan procenat brazdanja iz tri nezavisna eksperimenta je prikazan u odnosu na vreme (min) i opremljen nelinearnom regresijom. Izračunate stope brazdanja (kobs) su prikazane u tabeli. Rezultati sugerišu da vezivanje Cas9 za RNK ne ograničava brzinu u testiranim uslovima. Indikovani su oblici plazmida. Dobijene kobsvrednosti su uporedive sa onima restrikcionih endonukleaza koje su tipično reda 1-10 u minuti (45-47). (B) Cas9 je endonukleaza sa višestrukim obrtom. Cas9 napunjen dupleksom tracrRNA:crRNA-sp2 (1 nM, 1:1:1 - označeno sivom linijom na grafikonu) je inkubiran sa 5-strukim viškom nativne DNK plazmida protospacera 2. Brazdanje je praćeno povlačenjem uzoraka iz reakcije u definisanim vremenskim intervalima (0 do 120 min), praćeno analizom elektroforeze u agaroznom gelu (gore) i određivanjem količine produkta brazdanja (nM) (dole). Navedene su standardne devijacije tri nezavisna eksperimenta. U ispitivanom vremenskom intervalu, 1 nM Cas9 je bio u stanju da brazda ~2,5 nM plazmid DNK. Svaki domen Cas9 nukleaze brazda jedan lanac DNK
Cas9 sadrži domene homologne i HNH i RuvC endonukleazama (Slika 11A i Slika 3) (21-23, 27, 28). Dizajnirali smo i prečistili Cas9 varijante koje sadrže inaktivirajuće mutacije tačke u katalitičkim talozima bilo HNH ili RuvC domena (Slika 11A i Slika 3) (23, 27). Inkubacija ovih varijanti Cas9 proteina sa nativnom plazmidnom DNK pokazala je da su mutantni Cas9 proteini vođeni dvostrukom RNK dali presečene otvorene kružne plazmide, dok je WT Cas9 proteinska tracrRNK:crRNK kompleks proizveo linearni DNK produkt (Slike 10A i 11A i Slike 17 25A). Ovaj rezultat ukazuje da domeni slični Cas9 HNH i RuvC svaki brazdaju jedan lanac plazmidne DNK. Da bismo utvrdili koji lanac ciljne DNK brazda svaki Cas9 katalitički domen, inkubirali smo mutantne Cas9-tracrRNK:crRNK komplekse sa kratkim supstratima dsDNK u kojima je komplementarni ili nekomplementarni lanac radioaktivno obeležen na svom 5' kraju. Dobijeni produkti brazdanja ukazuju na to da Cas9 HNH domen brazda komplementarni DNK lanac, dok domen sličan Cas9 RuvC brazda nekomplementarni DNK lanac (Slika 11B i Slika 21B).
Slika 11(A) (Vrh) Šematski prikaz strukture domena Cas9 koji pokazuje položaje mutacija domena. D10A, Asp10→Ala10; H840A; His840-Ala840.
Kompleksi WT ili nukleaznih mutantnih Cas9 proteina sa tracrRNK: crRNK-sp2 su analizirani na aktivnost endonukleaze kao na Slici 10A. (B) Kompleksi WT Cas9 ili mutanata domena nukleaze sa tracrRNK i crRNK-sp2 su testirani na aktivnost kao na slici 10B.
Slika 3 Aminokiselinska sekvenca Cas9 iz S.pyogenes (SEQ ID NO:8) je predstavljena. Cas9 / Csn1 proteini iz raznih različitih vrsta imaju 2 domena koji uključuju motive homologne i HNH i RuvC endonukleazama. (A) Motivi 1-4 (brojevi motiva su označeni na levoj strani niza) prikazani su za S.pyogenes Cas9/Csn1. Tri predviđena motiva slična RuvC (1, 2, 4) i predviđeni HNH motiv (3) su precrtani. Talozi Asp10 i His840, koji su zamenjeni sa Ala u ovoj studiji, označeni su zvezdicom iznad sekvence. Podvučeni talozi su visoko konzervirani među Cas9 proteinima različitih vrsta. Mutacije u podvučenim talozima verovatno će imati funkcionalne posledice na aktivnost Cas9. Imajte na umu da je u ovoj studiji eksperimentalno demonstrirano spajanje dve aktivnosti slične nukleazi (Slika 11 i Slika 21). (B) Domeni 1 (amino kiseline 7-166) i 2 (amino kiseline 731-1003), koji uključuju motive 1-4, prikazani su za S.pyogenes Cas9/Csn1. Pogledajte Tabelu 1 i Sliku 5 za dodatne informacije.
Slika 21 Brazdanje DNK protospacera pomoću srodnih tracrRNK:crRNK usmerenih Cas9 mutanata koji sadrže mutacije u domenu sličnom HNH ili RuvC. (A) Brazdanje DNK plazmida Protospacer 1. Eksperiment je izveden kao na Slici 11A. Naznačene su konformacije i veličine plazmidne DNK u parovima baza. (B) Brazdanje DNK oligonukleotida protospacer 4. Eksperiment je izveden kao na Slici 11B. Naznačene su veličine u nukleotidima.
Zahtevi dvostruke RNK za vezivanje i brazdanje ciljne DNK
tracrRNK može biti potrebna za vezivanje ciljne DNK i/ili za stimulisanje nukleazne aktivnosti Cas9 nizvodno od prepoznavanja cilja. Da bismo razlikovali ove mogućnosti, koristili smo elektroforetski test promene pokretljivosti da bismo pratili vezivanje ciljne DNK katalitički neaktivnim Cas9 u prisustvu ili odsustvu crRNK i/ili tracrRNK. Dodavanje tracrRNK je značajno poboljšalo vezivanje ciljne DNK od strane Cas9, dok smo primetili malo specifičnog vezivanja DNK samo sa Cas9 ili Cas9-crRNK (Slika 22). Ovo ukazuje da je tracrRNK potrebna za prepoznavanje ciljne DNK, verovatno pravilnim orijentisanjem crRNK za interakciju sa komplementarnim lancem ciljne DNK. Predviđena sekundarna struktura tracrRNK:crRNK uključuje uparivanje baza između 22 nukleotida na 3' terminusu crRNK i segmenta blizu 5' kraja zrele tracrRNK (Slika 10E). Ova interakcija stvara strukturu u kojoj je 5'-terminalnih 20 nukleotida crRNK, koji variraju u sekvenci u različitim crRNK, dostupno za vezivanje ciljne DNK. Najveći deo tracrRNK nizvodno od regiona uparivanja baznih crRNK je slobodan da formira dodatnu(e) RNK strukturu(e) i/ili da stupi u interakciju sa Cas9 ili ciljnim DNK mestom. Da bismo utvrdili da li je cela dužina tracrRNK neophodna za brazdanje DNK specifičnog za mesto koji je katalizovan sa Cas9, testirali smo Cas9-tracrRNK:crRNK komplekse rekonstituisane korišćenjem zrele (42-nukleotidne) crRNK pune dužine i raznih skraćenih oblika tracrRNK kojima nedostaju sekvence na 5' ili 3' završecima. Ovi kompleksi su testirani na brazdanje korišćenjem kratke ciljne dsDNK. Znatno skraćena verzija nukleotida od 23 do 48 nativne sekvence koji zadržava tracrRNK bila je sposobna da podrži robusno brazdanje DNK vođeno dvostrukom RNK, katalizovano Cas9 (Slika 12, A i C, i Slika 23, A i B). Skraćivanje crRNK sa oba kraja pokazalo je da se brazdanje katalizovano Cas9 u prisustvu tracrRNK može pokrenuti sa crRNK kojima nedostaje 3'-terminalnih 10 nukleotida (Slika 12, B i C). Nasuprot tome, brisanje 10 nukleotida od 5' kraja crRNK ukinulo je brazdanje DNK od strane Cas9 (Slika 12B). Takođe smo analizirali Cas9 ortologe iz različitih bakterijskih vrsta zbog njihove sposobnosti da podrže S.pyogenes tracrRNK:crRNK vođeno brazdanje DNK. Za razliku od blisko povezanih S.pyogenes Cas9 ortologa, udaljeniji ortolozi nisu bili funkcionalni u reakciji brazdanja (Slika 24). Slično, S. pyogenes Cas9 vođen tracrRNK:crRNK dupleksima koji potiču iz udaljenijih sistema nije bio u stanju da efikasno brazda DNK (Slika 24). Specifičnost vrstinog brazdanja DNK vođenog dvostrukom RNK ukazuje na koevoluciju Cas9, tracrRNK i ponavljanja crRNK, kao i na postojanje još nepoznate strukture i/ili sekvence u dvostrukoj RNK koja je kritična za formiranje ternarnog kompleksa sa specifičnim Cas9 ortolozima.
Da bismo istražili zahteve sekvence protospacera za imunitet tipa II CRISPR/Cas u bakterijskim ćelijama, analizirali smo seriju plazmidnih DNK koje sadrže protospacer i koje sadrže pojedinačne nukleotidne mutacije za njihovo održavanje nakon transformacije u S. pyogenes i njihovu sposobnost da ih brazda Cas9 u vitro. Za razliku od mutacija tačke uvedenih na 5' kraju protospacera, mutacije u regionu blizu PAM-a i mesta brazdanja Cas9 nisu tolerisane in vivo i rezultirale su smanjenom efikasnošću brazdanja plazmida in vitro (Slika 12D). Naši rezultati su u saglasnosti sa prethodnim izveštajem o mutantima koji su izbegli protospacer izabranim u sistemu CRISPR tipa II iz S. thermophilus in vivo (27, 29). Štaviše, rezultati održavanja i brazdanja plazmida nagoveštavaju postojanje regiona „semena“ koji se nalazi na 3' kraju sekvence protospacera koji je ključan za interakciju sa crRNK i naknadno brazdanje od strane Cas9. U prilog ovoj ideji, Cas9 je poboljšao hibridizaciju komplementarne DNK lanca sa crRNK; ovo poboljšanje je bilo najjače u 3'-terminalnom regionu sekvence ciljanja crRNK (Slika 25A-C). Potvrđujući ovaj nalaz, za efikasno brazdanje mete potreban je uzastopni niz od najmanje 13 parova baza između crRNK i ciljnog DNK mesta proksimalno od PAM-a, dok se toleriše do šest susednih neslaganja u 5'-terminalnom regionu protospacera. (Slika 12E). Ovi nalazi podsećaju na prethodno primećene zahteve sekvence semena za prepoznavanje ciljne nukleinske kiseline u proteinima Argonauta (30, 31) i Cascade i Csi CRISPR kompleksima (13, 14).
Slika 12 (A) Cas9-tracrRNK: kompleksi crRNK su rekonstituisani korišćenjem 42-nukleotida crRNK-sp2 i skraćenih tracrRNK konstrukata i ispitani su na aktivnost brazdanja kao na Slici 10B. (B) Cas9 programiran sa tracrRNK i crRNK-sp2 skraćenjima pune dužine je analiziran na aktivnost kao u (A). (C) Minimalni regioni tracrRNK i crRNK sposobni da vode brazdanje DNK posredovano Cas9 (osenčeni region). (D) Plazmidi koji sadrže WT ili mutantne protospacer 2 sekvence sa naznačenim mutacijama tačke su brazdani in vitro programiranim Cas9 kao na Slici 10A i korišćeni za testove transformacije S. pyogenes sa nedostatkom WT ili pre-crRNK. Efikasnost transformacije je izračunata kao jedinice koje formiraju kolonije (CFU) po mikrogramu plazmidne DNK. Trake grešaka predstavljaju SD za tri biološke replike. (E) Plazmidi koji sadrže WT i mutantne protospacer 2 umetke sa različitim stepenom nepodudarnosti crRNK-ciljne DNK (dole) su brazdani in vitro programiranim Cas9 (gore). Reakcije brazdanja su dalje digestirane sa XmnI. Fragmenti od 1880 i 800 bp su produkti brazdanja generisani pomoću Cas9. M, DNK marker.
Slika 22. Testovi pomeranja elektroforetske mobilnosti su izvedeni korišćenjem dupleksa ciljne DNK protospacera 4 i Cas9 (koji sadrži mutacije D10A i H840 koje inaktiviraju domen nukleaze) ili u prisustvu crRNK-sp4, tracrRNK (75nt) ili oboje. Ciljni DNK dupleks je radioaktivno obeležen na oba 5' kraja. Cas9 (D10/H840A) i kompleksi su titrirani od 1 nM do 1 µM. Vezivanje je analizirano elektroforezom u 8% nativnom poliakrilamidnom gelu i vizuelizovano pomoću fosforoskeniranja. Imajte na umu da sam Cas9 vezuje ciljnu DNK sa umerenim afinitetom. Na ovo vezivanje ne utiče dodavanje crRNK, što sugeriše da ovo predstavlja nespecifičnu interakciju sekvence sa dsDNK. Štaviše, ovu interakciju može nadmašiti sama tracrRNK u odsustvu crRNK. U prisustvu i crRNK i tracrRNK, vezivanje ciljne DNK je značajno poboljšano i daje vrstu sa izrazitom elektroforetskom pokretljivošću, što ukazuje na specifično prepoznavanje ciljne DNK.
Slika 23 Fragment tracrRNK koji obuhvata deo uparenog regiona crRNK i deo nizvodnog regiona dovoljan je za usmeravanje brazdanja protospacer oligonukleotidne DNK od strane Cas9. (A) Brazdanje DNK oligonukleotida Protospacer 1 i (B) BrazdanjeDNK oligonukleotida Protospacer 4 od strane Cas9 vođeno zrelom srodnom crRNK i različitim fragmentima tracrRNK. (A, B) Naznačene su veličine u nukleotidima.
Slika 24 Kao Cas9 iz S.pyogenes, blisko srodni Cas9 ortolozi iz Grampozitivnih bakterija L. innocua i S.thermophilus brazda DNK protospacera kada ga cilja tracrRNK:crRNK iz S.pyogenes. Međutim, pod istim uslovima, nije primećeno cepanje DNK manje srodnim Cas9 ortolozima iz Gram negativnih bakterija C. jejuni i N. meningitidis. Spy, S. Pyogenes SF370 (Pristupni broj NC_002737); Sth, S. Thermophilus LMD-9 (STER_1477 Cas9 ortolog; Pristupni broj NC_008532); Lin,L. Innocua Clip11262 (Pristupni broj NC_003212); Cje, C. Jejuni NCTC 11168 (Pristupni broj NC_002163); Nme, N. Meningitidis A Z2491 (Pristupni broj NC_003116). (A) Brazdanje DNK plazmida protospacera. DNK plazmida Protospacer 2 (300 ng) je podvrgnuta cepanju različitim Cas9 ortolozima (500 nM) vođenim hibridnim tracrRNA:crRNA-sp2 dupleksima (500 nM, 1: 1) iz različitih vrsta. Da bismo dizajnirali RNK duplekse, predvideli smo tracrRNK sekvence iz L. Innocua i N. Meningitidis na osnovu prethodno objavljenih podataka Nortern blota (4). Dupleksi dvostruke hibridne RNK se sastoje od tracrRNK specifične za vrstu i heterologne crRNK. Heterologna crRNK sekvenca je konstruisana tako da sadrži sp2 sekvencu koja cilja na DNK S. pyogenes na 5' kraju fuzionisan sa sekvencom ponavljanja koja se vezuje za L. innocua ili N. meningitidis tracrRNK na 3' kraju. Cas9 ortolozi iz S. thermophilus i L. innocua, ali ne iz N. meningitidis ili C. jejuni, mogu biti vođeni pomoću S. pyogenes tracrRNK:crRNK-sp2 da brazdaju DNK plazmida protospacera 2, iako sa blago smanjenom efikasnošću. Slično, hibrid L. innocua tracrRNK:crRNK-sp2 može da vodi S. pyogenes Cas9 da brazda ciljnu DNK sa visokom efikasnošću, dok hibrid N. meningitidis tracrRNK:crRNK-sp2 pokreće samo blagu aktivnost brazdanja DNK od strane S. pyogenes Cas9. Kao kontrole, ortolozi N. Meningitidis i L. Innocua Cas9 brazdaju DNK plazmida protospacera 2 kada ih vodi srodni hibrid tracrRNK:crRNK-sp2. Imajte na umu da kao što je gore pomenuto, tracrRNK sekvenca N.meningitidis je samo predviđena i još nije potvrđena sekvenciranjem RNK. Stoga, niska efikasnost brazdanja može biti rezultat ili niske aktivnosti Cas9 ortologa ili upotrebe neoptimalno dizajnirane tracrRNK sekvence. (B) Brazdanje DNK oligonukleotida protospacera.5'-kraj radioaktivno obeležen komplementarni lanac oligonukleotida (10 nM) prethodno žaren sa neobeleženim nekomplementarnim oligonukleotidom lanca (protospacer 1) (10 nM) (levo) ili 5'-kraj radioaktivno obeležen nekomplementarnim lancem oligonukleotida (10 nM) prethodno žaren sa neobeleženim komplementarnim oligonukleotidom (10 nM) (desno) (protospacer 1) podvrgnut je brazdanju raznim Cas9 ortolozima (500 nM) vođenim tracrRNK:crRNK-sp1 dupleksom iz S. pyogenes (500 nM, 1: 1). Cas9 ortolozi iz S.thermophilus i L. innocua, ali ne iz N. meningitidis ili C. jejuni mogu se voditi pomoću S.pyogenes srodnih dvostrukih RNK za brazdanje DNK oligonukleotida protospacera, iako sa smanjenom efikasnošću. Imajte na umu da je mesto brazdanja na komplementarnom lancu DNK identično za sva tri ortologa. Brazdanje nekomplementarnog lanca se dešava na različitim pozicijama. (C) Identitet aminokiselinske sekvence ortologa Cas9. S. pyogenes, S. thermophilus i L. innocua Cas9 ortolozi dele visok procenat identiteta aminokiselina. Nasuprot tome, proteini C. jejuni i N. meningitidis Cas9 se razlikuju po sekvenci i dužini (~300-400 aminokiselina kraće). (D) Ko-preklapanje projektovanih heterolognih crRNK sekvenci specifičnih za vrstu sa odgovarajućim ortolozima tracrRNK iz S. pyogenes (eksperimentalno potvrđeno, (4)), L. innocua (predviđeno) ili N. meningitidis (predviđeno). tracrRNK; crRNK spacer 2 fragmenta; a fragmenti ponavljanja crRNK se prate i obeležavaju. L. innocua i S. pyogenes hibridni tracrRNK:crRNK-sp2 dupleksi dele veoma slične strukturne karakteristike, iako se razlikuju od hibrida tracrRNK:crRNK N. meningitidis.
Zajedno sa podacima o brazdanju opisanim gore u (A) i (B), predviđanja kosklapanja bi ukazivala da brazdanje ciljne DNK specifično za vrstu pomoću Cas9-tracrRNK:crRNK diktira još uvek nepoznata strukturna karakteristika u tracrRNK: crRNK dupleks koji se specifično prepoznaje od strane srodnog ortologa Cas9. Predviđeno je da se specifičnost brazdanja za vrstu primećena u (A) i (B) javlja na nivou vezivanja Cas9 za dvostruku tracrRNK:crRNK. Brazdanje ciljne DNK vođeno dvostrukom RNK Cas9 može biti specifično za vrstu. U zavisnosti od stepena raznovrsnosti/evolucije među Cas9 proteinima i tracrRNK:crRNK dupleksima, Cas9 i dvostruki RNK ortolozi su delimično zamenljivi.
Slika 25 Serija 8-nukleotidnih DNK sondi komplementarnih regionima u crRNK koji obuhvataju region ciljanja DNK i region koji se vezuje za tracrRNK analizirani su zbog njihove sposobnosti hibridizacije sa crRNK u kontekstu dupleksa tracrRNK:crRNK i Cas9- tracrRNK:crRNK ternarni kompleks. (A) Šematski prikaz sekvenci DNK sondi korišćenih u testu i mesta njihovog vezivanja u crRNK-sp4. (BC) Testovi elektroforetskog pomeranja pokretljivosti ciljnih DNK sondi sa tracrRNK:crRNK-sp4 ili Cas9-tracrRNK:crRNK-sp4. U eksperimentu je korišćen konstrukt tracrRNK(15-89). Vezivanje dupleksa ili kompleksa za ciljne oligonukleotidne DNK je analizirano na 16% nativnom poliakrilamidnom gelu i vizuelizovano pomoću fosforoskeniranja.
Motiv kratke sekvence diktira formiranje R-petlje
U višestrukim CRISPR/Cas sistemima, pokazalo se da prepoznavanje self nasuprot nonself uključuje motiv kratke sekvence koji je sačuvan u stranom genomu, nazvanom PAM (27, 29, 32-34). PAM motivi su dužine samo nekoliko parova baza, a njihova precizna sekvenca i pozicija variraju u zavisnosti od tipa CRISPR/Cas sistema (32). U sistemu S. pyogenes tipa II, PAM je u skladu sa konsenzusnom sekvencom NGG, koja sadrži dva G: C bazni parovi koji se javljaju jedan par baza nizvodno od sekvence vezivanja crRNK, unutar ciljne DNK (4). Testovi transformacije su pokazali da je GG motiv neophodan za eliminaciju DNK plazmida protospacera pomoću CRISPR/Cas u bakterijskim ćelijama (Slika 26A), što je u skladu sa prethodnim zapažanjima kod S. thermophilus (27). Motiv je takođe neophodan za in vitro brazdanje plazmida protospacera pomoću Cas9 vođenog tracrRNK:crRNK (Slika 26B). Da bismo odredili ulogu PAM-a u brazdanju ciljne DNK kompleksom Cas9-tracrRNK: crRNK, testirali smo seriju dupleksa dsDNK koji sadrže mutacije u PAM sekvenci na komplementarnim ili nekomplementarnim lancima, ili na oba (Slika 13A). Testovi brazdanja korišćenjem ovih supstrata pokazali su da je brazdanje DNK katalizovano Cas9 posebno osetljivo na mutacije u PAM sekvenci na nekomplementarnom lancu DNK, za razliku od komplementarnog PAM prepoznavanja lanca od strane tipa I CRISPR/Cas sistema (18, 34). Mutacije PAM motiva nisu uticale na brazdanje ciljne jednolančane DNK. Ovo zapažanje sugeriše da je PAM motiv potreban samo u kontekstu ciljne dsDNK i stoga može biti potreban za licenciranje odmotavanja dupleksa, invazije lanaca i formiranja strukture R-petlje. Kada smo koristili drugačiji crRNK-ciljni DNK par (crRNK-sp4 i protospacer 4 DNK), odabran zbog prisustva kanonskog PAM-a koji nije prisutan u ciljnoj DNK protospacer 2, otkrili smo da su oba G nukleotida PAM-a potrebna za efikasno brazdanje DNK katalizovano Cas9 (Slika 13B i Slika 26C). Da bismo utvrdili da li PAM igra direktnu ulogu u regrutovanju kompleksa Cas9-tracrRNK:crRNK na tačno mesto ciljne DNK, analizirali smo afinitete vezivanja kompleksa za ciljne DNK sekvence pomoću testova promene pokretljivosti nativnog gela (Slika 13C). Mutacija bilo kojeg od G u PAM sekvenci značajno je smanjila afinitet Cas9-tracrRNK: crRNK za ciljnu DNK. Ovaj nalaz ilustruje ulogu PAM sekvence u vezivanju ciljne DNK od strane Cas9.
Slika 13 (A) Cas9 programiran dvostrukom RNK je testiran na aktivnost kao na Slici 10B. WT i mutantne PAM sekvence u ciljnoj DNK su označene linijama. (B) Protospacer 4 ciljni DNK dupleks (obeleženi na oba 5' kraja) koji sadrže WT i mutantne PAM motive su inkubirani sa Cas9 programiranim sa tracrRNK:crRNK-sp4 (nukleotidi 23 do 89). U naznačenim vremenskim tačkama (u minutima), alikvoti reakcije brazdanja su uzeti i analizirani kao na Slici 10B. (C) Testovi elektroforetskog pomeranja pokretljivosti izvedeni su korišćenjem RNK programiranih Cas9 (D10A/H840A) i protospacer 4 ciljnih DNK dupleksa [isto kao u (B)] koji sadrže ET i mutirane PAM motive. Cas9 (D10A/H840A)-RNK kompleks je titriran od 100 pM do 1 mM.
Slika 26 (A) Mutacije PAM sekvence u DNK plazmida protospacer 2 ukidaju interferenciju održavanja plazmida pomoću sistema CRISPR/Cas tipa II u bakterijskim ćelijama. Protospacer 2 plazmidi divljeg tipa sa funkcionalnim ili mutiranim PAM su transformisani u divlji tip (soj SF370, takođe nazvan EC904) i mutant sa ptr-crRNK (EC1479) S.pyogenes kao na Slici 12D. PAM mutacije ne tolerišu tip II CRISPR/Cas sistem in vivo. Prikazane su srednje vrednosti i standardne devijacije tri biološke replike. (B) Mutacije PAM sekvence u DNK plazmida protospacera ukidaju brazdanje Cas9-tracrRNK:crRNK. Protospacer 2 plazmid divljeg tipa sa funkcionalnim ili mutiranim PAM-om podvrgnut je brazdanju Cas9 kao na Slici 10A. PAM mutantni plazmidi se ne brazdaju kompleksom Cas9-tracrRNK:crRNK. (C) Mutacije kanonske PAM sekvence ukidaju ometanje održavanja plazmida od strane sistema CRISPR/Cas tipa II u bakterijskim ćelijama. Protospacer 4 plazmidi divljeg tipa sa funkcionalnim ili mutiranim PAM-om su brazdani sa Cas9 programiranim sa tracrRNK i crRNK-sp2. Reakcije brazdanja su sprovedene u prisustvu XmnI restrikcione endonukleaze da bi se vizuelizovali produkti brazdanja Cas9 kao dva fragmenta (~1880 i ~800 bp).
Naznačene su veličine fragmenata u osnovnim parovima.
Cas9 se može programirati sa jednom himernom RNK
Ispitivanje verovatne sekundarne strukture tracrRNK:crRNK dupleksa (Slike 10E i 12C) sugerisalo je mogućnost da se karakteristike potrebne za brazdanje DNK katalizovane Cas9 specifično za lokaciju mogu uhvatiti u jednoj himernoj RNK. Iako mehanizam za odabir cilja tracrRNK:crRNK u prirodi funkcioniše efikasno, mogućnost jednog Cas9 vođenog RNK je privlačna zbog svoje potencijalne korisnosti za programirano brazdanje DNK i uređivanje genoma (Slika 1A-B). Dizajnirali smo dve verzije himerne RNK koja sadrži sekvencu za prepoznavanje cilja na 5' kraju praćenu strukturom ukosnice koja zadržava interakcije uparivanja baza koje se javljaju između tracrRNK i crRNK (Slika 14A). Ovaj pojedinačni transkript efikasno spaja 3' kraj crRNK sa 5' krajem tracrRNK, oponašajući tako dvostruku RNK strukturu potrebnu za vođenje brazdanja DNK specifičnog za mesto od strane Cas9. U testovima brazdanja korišćenjem plazmidne DNK, primetili smo da je duža himerna RNK bila u stanju da vodi brazdanje DNK katalizovano Cas9 na način sličan onom koji je primećen za skraćeni dupleks tracrRNK:crRNK (Slika 14A i Slika 27, A i C). Kraća himerna RNK nije funkcionisala efikasno u ovom testu, potvrđujući da su nukleotidi koji su 5 do 12 pozicija izvan interakcije uparivanja baza tracrRNK:crRNK važni za efikasno vezivanje Cas9 i/ili prepoznavanje cilja. Dobili smo slične rezultate u testovima brazdanja koristeći kratku dsDNK kao supstrat, što dalje ukazuje da je položaj mesta brazdanja u ciljnoj DNK identičan onom koji je primećen korišćenjem dvostruke tracrRNK:crRNK kao vodiča (Slika 14B i Slika 27, B i C). Konačno, da bismo utvrdili da li dizajn himerne RNK može biti univerzalno primenljiv, konstruisali smo pet različitih himeričnih vodičnih RNK da ciljaju deo gena koji kodira zeleno-fluorescentni protein (GFP) (Slika 28, A do C) i testirali njihovu efikasnost protiv plazmida koji nosi sekvencu kodiranja GFP in vitro. U svih pet slučajeva, Cas9 programiran sa ovim himernim RNK efikasno je cepao plazmid na tačnom ciljnom mestu (Slika 14C i Slika 28D), što ukazuje da je racionalan dizajn himernih RNK robustan i da bi, u principu, mogao da omogući ciljanje bilo koje sekvence DNK od interesa sa nekoliko ograničenja izvan prisustva GG dinukleotida pored ciljane sekvence.
Slika 1 RNK koja cilja na DNK se sastoji od jednolančanog „segmenta koji cilja na DNK“ i „segmenta koji se vezuje za proteine“, koji obuhvata deo dvolančane RNK. (A) RNK koja cilja DNK može da sadrži dva odvojena molekula RNK (koji se nazivaju „duplomolekulska“ ili „dvomolekulska“ RNK koja cilja na DNK). RNK koja cilja na DNK sa dvostrukim molekulom obuhvata „ciljnu RNK“ i „aktivatorsku RNK“. (B) RNK koja cilja na DNK može da sadrži jedan molekul RNK (koji se naziva RNK koja cilja DNK „sa jednim molekulom“). Jednomolekulska DNK koju cilja RNK sadrži „nukleotide linkera“.
Slika 14 (A) Plazmid koji sadrži ciljnu sekvencu protospacer 4 i WT PAM je podvrgnut brazdanju od strane Cas9 programiranog sa tracrRNK(4-89):crRNK-sp4 dupleksom ili in vitro transkribovanim himernim RNK konstruisanim spajanjem 3' kraja crRNK do 5' kraja tracrRNK sa GAAA tetrapetljom. Reakcije brazdanja su analizirane restrikcionim mapiranjem sa XmnI. Sekvence himernih RNK A i B su prikazane sa DNK-ciljanim sekvencama (podvučeno), sekvencama koje su izvedene iz ponavljanja crRNK (precrtano) i sekvencama izvedenim iz tracrRNK (podvučeno isprekidano). (B) Reakcije dupleksnog brazdanja DNK Protospacer 4 izvedene su kao na Slici 10B. (C) Pet himernih RNK dizajniranih da ciljaju GFP gen korišćeno je za programiranje Cas9 da brazda plazmid koji sadrži GFP gen. Reakcije brazdanja plazmida su izvedene kao na Slici 12E, osim što je plazmidna DNK restrikciono mapirana sa AvrII nakon brazdanja Cas9.
Slika 27 (A) Jedna himerna RNK vodi brazdanje srodne DNK plazmida protospacera katalizovano Cas9 (protospacer 1 i protospacer 2). Reakcije brazdanja su sprovedene u prisustvu XmnI restrikcione endonukleaze da bi se vizuelizovali produkti brazdanja Cas9 kao dva fragmenta (~1880 i ~800 bp).
Naznačene su veličine fragmenata u osnovnim parovima. (B) Jedna himerna RNK vodi brazdanje srodne DNK oligonukleotida protospacera katalizovano Cas9 (protospacer 1 i protospacer 2). Naznačene su veličine fragmenata u nukleotidima. (C) Šematski prikazi himernih RNK korišćenih u eksperimentu.
Sekvence himernih RNK A i B su prikazane sa 5' protospacer DNK ciljanom sekvencom crRNK (podvučeno), sekvencom crRNK koja se vezuje za tracrRNK (precrtano) i sekvencom izvedenom iz tracrRNK (podvučeno isprekidano).
Slika 28 (A) Šematski prikaz plazmida ekspresije GFP pCFJ127. Ciljani deo GFP otvorenog okvira za čitanje je označen crnom strelicom. (B) Krupni plan sekvence ciljanog regiona. Sekvence na koje ciljaju himerne RNK prikazane su sivim trakama. PAM dinukleotidi su u kutijama. Jedinstveno mesto za ograničavanje Sail-a nalazi se 60 bp uzvodno od ciljnog lokusa. (C) Levo: Ciljane DNK sekvence su prikazane zajedno sa njihovim susednim PAM motivima.
Desno: Sekvence himernih vodećih RNK. (D) pCFJ127 je brazdao Cas9 programiran sa himernim RNK GFP1-5, kao što je naznačeno. Plazmid je dodatno digestiran sa Sailom i reakcije su analizirane elektroforezom na 3% agaroznom gelu i vizualizovane bojenjem sa SYBR Safe.
Zaključci
Identifikovan je mehanizam interferencije DNK, koji uključuje dvostruku RNK strukturu koja usmerava Cas9 endonukleazu da uvede za mesto specifične dvolančane prekide u ciljnoj DNK. Protein Cas9 vođen tracrRNK:crRNK koristi različite domene endonukleaze (domene slične HNH i RuvC) za brazdanje dva lanca u ciljnoj DNK. Prepoznavanje cilja od strane Cas9 zahteva i sekvencu semena u crRNK i PAM sekvencu koja sadrži GG dinukleotid pored regiona koji se vezuje za crRNK u DNK cilju. Dalje pokazujemo da se Cas9 endonukleaza može programirati pomoću RNK vodiča dizajniranog kao jedan transkript da cilja i brazda bilo koju dsDNK sekvencu od interesa. Sistem je efikasan, svestran i programabilan promenom sekvence DNK za vezivanje cilja u vodećim himernim RNK. Nukleaze cinkovih prstiju i efektorske nukleaze slične aktivatoru transkripcije privukle su veliko interesovanje kao veštački enzimi projektovani da manipulišu genomima (35-38). Ovo predstavlja alternativnu metodologiju zasnovanu na RNK programiranom Cas9 koja olakšava aplikacije za ciljanje gena i uređivanje genoma.
Citirani izvori
1. B. Wiedenheft, S. H. Sternberg, J. A. Doudna, Nature 482, 331 (2012).
2. D. Bhaya, M. Davison, R. Barrangou, Annu. Rev. Genet.45, 273 (2011).
3. M. P. Terns, R. M. Terns, Curr. Opin. Microbiol.14, 321 (2011).
4. E. Deltcheva i sar., Nature 471, 602 (2011).
5. J. Carte, R. Wang, H. Li, R. M. Terns, M. P. Terns, Genes Dev.22, 3489 (2008).
6. R. E. Haurwitz, M. Jinek, B. Wiedenheft, K. Zhou, J. A. Doudna, Science 329, 1355 (2010).
7. R. Wang, G. Preamplume, M. P. Terns, R. M. Terns, H. Li, Structure 19, 257 (2011).
8. E. M. Gesner, M. J. Schellenberg, E. L. Garside, M. M. George, A. M. Macmillan, Nat. Struct. Mol. Biol.18, 688 (2011).
9. A. Hatoum-Aslan, I. Maniv, L. A. Marraffini, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 21218 (2011).
10. S. J. J. Brouns i sar., Science 321, 960 (2008).
11. D. G. Sashital, M. Jinek, J. A. Doudna, Nat. Struct. Mol. Biol.18, 680 (2011).
12. N. G. Lintner i sar., J. Biol. Chem.286, 21643 (2011).
13. E. Semenova i sar., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 10098 (2011).
14. B. Wiedenheft i sar., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.108, 10092 (2011).
15. B. Wiedenheft i sar., Nature 477, 486 (2011).
16. C. R. Hale i sar., Cell 139, 945 (2009).
17. J. A. L. Howard, S. Delmas, I. Ivančić-Baće, E. L. Bolt, Biochem. J.
439, 85 (2011).
18. E. R. Westra i sar., Mol. Cell 46, 595 (2012).
19. C. R. Hale i sar., Mol. Cell 45, 292 (2012).
20. J. Zhang i sar., Mol. Cell 45, 303 (2012).
21. K. S. Makarova i sar., Nat. Rev. Microbiol. 9, 467 (2011).
22. K. S. Makarova, N. V. Grishin, S. A. Shabalina, Y. I. Wolf, E. V. Koonin, Biol. Direct 1, 7 (2006).
23. K. S. Makarova, L. Aravind, Y. I. Wolf, E. V. Koonin, Biol. Direct 6, 38 (2011).
24. S. Gottesman, Nature 471, 588 (2011).
25. R. Barrangou i sar., Science 315, 1709 (2007).
26. J. E. Garneau i sar., Nature 468, 67 (2010).
27. R. Sapranauskas i sar., Nucleic Acids Res.39, 9275 (2011).
28. G. K. Taylor, D. F. Heiter, S. Pietrokovski, B. L. Stoddard, Nucleic Acids Res.39, 9705 (2011).
29. H. Deveau i sar., J. Bacteriol.190, 1390 (2008).
30. B. P. Lewis, C. B. Burge, D. P. Bartel, Cell 120, 15 (2005).
31. G. Hutvagner, M. J. Simard, Nat. Rev. Mol. Cell Biol.9, 22 (2008).
32. F. J. M. Mojica, C. Diez-Villaseñor, J. Garcia-Martinez, C. Almendros, Microbiology 155, 733 (2009).
33. L. A. Marraffini, E. J. Sontheimer, Nature 463, 568 (2010).
34. D. G. Sashital, B. Wiedenheft, J. A. Doudna, Mol. Cell 46, 606 (2012).
35. M. Christian i sar., Genetics 186, 757 (2010).
36. J. C. Miller i sar., Nat. Biotechnol.29, 143 (2011).
37. F. D. Umov, E. J. Rebar, M. C. Holmes, H. S. Zhang, P. D. Gregory, Nat. Rev. Genet.11, 636 (2010).
38. D. Carroll, Gene Ther.15, 1463 (2008).
39. J. Sambrook, E. F. Fritsch, T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, izdanje br.2, 1989).
40. M. G. Caparon, J. R. Scott, Genetic manipulation of pathogenic streptococci. Methods Enzymol. 204, 556 (1991). doi:10.1016/0076-6879(91)04028-M Medline
41. C. Frøkjær-Jensen i sar., Single-copy insertion of transgenes in Caenorhabditis elegans. Nat. Genet.40, 1375 (2008). doi:10.1038/ng.248 Medline 42. R. B. Denman, Using RNAFOLD to predict the activity of small catalytic RNAs. Biotechniques 15, 1090 (1993). Medline
43. I. L. Hofacker, P. F. Stadler, Memory efficient folding algorithms for circular RNA secondary structures. Bioinformatics 22, 1172 (2006). doi:10.1093/bioinformatics/btl1023 Medline
44. K. Darty, A. Denise, Y. Ponty, VARNA: Interactive drawing and editing of the RNA secondary structure. Bioinformatics 25, 1974 (2009). doi:10.1093/bioinformatics/btp250 Medline
Primer 2: RNK-programirano uređivanje genoma u ljudskim ćelijama
Podaci dati u nastavku pokazuju da se Cas9 može eksprimirati i lokalizovati u jezgru ljudskih ćelija, i da se sklapa sa RNK sa jednim vodičem („sgRNK“; obuhvatajući karakteristike potrebne i za vezivanje Cas9 i za prepoznavanje ciljnog mesta DNK) u ljudskoj ćeliji. Ovi kompleksi mogu da generišu dvolančane prekide i stimulišu popravku nehomolognog spajanja krajeva (NHEJ) u genomskoj DNK na mestu komplementarnom sekvenci sgRNK, aktivnost koja zahteva i Cas9 i sgRNK. Produženje RNK sekvence na njenom 3' kraju povećava aktivnost ciljanja DNK u živim ćelijama. Dalje, eksperimenti koji koriste ekstrakte iz transfektovanih ćelija pokazuju da je sklapanje sgRNK u Cas9 ograničavajući faktor za brazdanje DNK posredovano Cas9. Ovi rezultati pokazuju da uređivanje genoma programirano RNK funkcioniše u živim ćelijama i in vivo.
Materijali i postupci
Dizajn i konstrukcija plazmida
Sekvenca koja kodira Streptococcus pyogenes Cas9 (talozi 1-1368) fuzionisana sa HA epitopom (sekvenca aminokiselina DAYPYDVPDYASL (SEQ ID NO:274)), signal nuklearne lokalizacije (aminokiselinska sekvenca PKKKRKVEDPKKKRKVD (SEQ ID NO:275)) je bio kodon optimizovan za ljudsko izražavanje i sintetizovan od strane GeneArt-a. DNK sekvenca je SEQ ID NO:276, a sekvenca proteina je SEQ ID NO:277. Kloniranje nezavisno od ligacije (LIC) je korišćeno za umetanje ove sekvence u GFP i mCherry LIC vektore dobijene iz pcDNK3.1 (vektori 6D i 6B, respektivno, dobijeni od UC Berkeley MacroLab), što je rezultiralo Cas9-HA-NLS- GFP i Cas9-HA-NLS-mCherry fuzijama eksprimiranim pod kontrolom CMV promotera. Vodeće sgRNK su eksprimirane korišćenjem ekspresionog vektora pSilencer 2.1-U6 puro (Life Technologies) i pSuper (Oligoengine). RNK ekspresioni konstrukti su generisani žarenjem komplementarnih oligonukleotida da bi se formirala DNK sekvenca koja kodira RNK i ligiranjem žarenog DNK fragmenta između BamHI i HindIII mesta u pSilencer 2.1-U6 puro i BglII i HindIII mesta u pSuper.
Uslovi kulture ćelija i transfekcije DNK
HEK293T ćelije su održavane u Dulbecco-ovom modifikovanom eagle medijumu (DMEM) sa dodatkom 10% fetalnog goveđeg seruma (FBS) u vlažnom inkubatoru na 37 °C sa 5% CO2. Ćelije su prolazno transfektovane plazmidnom DNK korišćenjem ili X-tremeGENE DNK reagensa za transfekciju (Roche) ili Turbofect transfekcionog reagensa (Thermo Scientific) sa preporučenim protokolima. Ukratko, ćelije HEK293T su transfektovane pri 60-80% konfluentnosti u pločama sa 6 jažica korišćenjem 0,5 µg ekspresionog plazmida Cas9 i 2,0 µg plazmida ekspresije RNK. Efikasnost transfekcije je procenjena na 30-50% za Tubofect (Slike 29E i 37A-B) i 80-90% za X-tremegene (Slika 31B), na osnovu frakcije GFP-pozitivnih ćelija posmatranih fluorescentnom mikroskopijom.48 sati nakon transfekcije, ćelije su isprane sa fiziološkim rastvorom sa fosfatnim puferom (PBS) i lizirane primenom 250 µl pufera za liziranje (20 mM Hepes pH 7,5, 100 mM kalijum hlorida (KCl), 5 mM magnezijum hlorida (MgCl2), 1 mM ditiotreitola (DTT), 5% glicerola, 0,1% Triton X-100, dopunjen Roche Protease Inhibitor koktelom), a zatim se mućka 10 minuta na 4 °C. Dobijeni ćelijski lizat je podeljen na alikvote za dalju analizu. Genomska DNK je izolovana iz 200 µl ćelijskog lizata korišćenjem DNeasy kompleta za krv i tkivo (Qiagen) prema protokolu proizvođača.
Vestern blot analiza ekspresije Cas9
HEK293T, transfektovani sa Cas9-HA-NLS-GFP ekspresionim plazmidom, sakupljeni su i lizirani 48 sati nakon transfekcije kao što je gore navedeno. 5 ul lizata je podvrgnuto eletroforezi na 10% SDS poliakrilamidnom gelu, umotano na PVDF membranu i ispitano sa HRP-konjugovanim anti-HA antitelom (Sigma, 1: 1000 razblaživanje u 1x PBS).
Surveyor test
Surveyor test je izveden kao što je prethodno opisano [10,12,13].
Ukratko, lokus ljudskog klatrinskog lakog lanca A (CLTA) je PCR amplifikovan sa 200 ng genomske DNK korišćenjem polimeraze visoke vernosti, Herculase II fuzione DNK polimeraze (Agilent Technologies) i prednjeg prajmera 5'-GCAGCAGAAGAAGCCTSEKGT-3' (://) i reverznog prajmera 5'-TTCCTCCTCTCCCTCCTCTC-3' (SEQ ID NO://).300 ng amplikona od 360 bp je zatim denaturisano zagrevanjem na 95 °C i polako ponovo žareno korišćenjem toplotnog bloka da se nasumično rehibridizuje divlji tip i mutantni DNK lanci. Uzorci su zatim inkubirani sa Cel-1 nukleazom (Surveyor Kit, Transgenomic) tokom 1 sata na 42 °C. Cel-1 prepoznaje i brazda spirale DNK koje sadrže nepodudarnosti (divlji tip: hibridizacija mutanta). Produkti digestije Cel-1 nukleaze su odvojeni na 10% akrilamidnom gelu i vizuelizovani bojenjem sa SYBR Safe (Life Technologies). Kvantifikacija traka brazdanja je izvršena korišćenjem softvera ImageLab (Bio-Rad). Procenat brazdanja je određen deljenjem prosečnog intenziteta produkta brazdanja (160-200 bps) zbirom intenziteta neizbrazdanog PCR produkta (360 bp) i produkta brazdanja.
In vitrotranskripcija
Vodeća RNK je in vitro transkribovana korišćenjem rekombinantne T7 RNK polimeraze i DNK šablona generisanog žarenjem komplementarnih sintetičkih oligonukleotida kao što je prethodno opisano [14]. RNK su prečišćene elektroforezom na 7M akrilamidnom gelu koji denaturira ureu, istaložen je etanol i rastvoren u vodi tretiranoj sa DEPC.
Nortern blot analiza
RNK je prečišćena iz ćelija HEK293T korišćenjem kompleta za izolaciju male RNK mirVana (Ambion). Za svaki uzorak, 800 ng RNK je odvojeno na 10% urea-PAGE gelu nakon denaturacije tokom 10 minuta na 70 °C u puferu za punjenje RNK (0,5X TBE (pH7,5), 0,5 mg/ml bromofenol plavo, 0,5 mg ksilen cijanol i 47% formamid). Posle elektroforeze pri 10W u 0,5X TBE puferu sve dok bromofenol plava boja nije stigla do dna gela, uzorci su elektroblotirani na Nitran membrani na 20 volti tokom 1,5 sata u 0,5X TBE. Prenesene RNK su umrežene na Nytran membrani u UV-Crosslinker-u (Strategene) i prethodno su hibridizovane na 45 °C tokom 3 sata u puferu koji sadrži 40% formamida, 5X SSC, 3X Dernhardt-ove (0,1% ficoll, polipiroll, polivinil i BSA) i 200 µg/ml DNK sperme lososa. Prehibridizovane membrane su inkubirane preko noći u prehibridizacionom puferu sa dodatkom 5'-<32>P-obeležene antisens DNK oligo sonde pri 1 milion cpm/ml. Posle nekoliko ispiranja u SSC puferu (konačno ispiranje u 0,2X SCC), membrane su snimljene fosforom.
In vitrotest brazdanja
Ćelijski lizati su pripremljeni kako je gore opisano i inkubirani sa CLTA-RFP donor plazmidom [10]. Reakcije brazdanja su sprovedene u ukupnoj zapremini od 20 µl i sadržale su 10 µl lizata, 2 µl 5x pufera za brazdanje (100 mM HEPES pH 7,5, 500 mM KCl, 25 mM MgCl2, 5 mM DTT, 25% glicerol) i 300 ng plazmid. Naznačeno time što je naznačeno, reakcije su dopunjene sa 10 pmo l in vitro transkribovane CLTA1 sgRNK. Reakcije su inkubirane na 37 °C tokom jednog sata i zatim digestirane sa 10 U XhoI (NEB) dodatnih 30 minuta na 37 °C. Reakcije su zaustavljene dodatkom Proteinaze K (Thermo Scientific) i inkubirane na 37 °C tokom 15 min. Produkti brazdanja su analizirani elektroforezom na 1% agaroznom gelu i obojeni sa SYBR Safe. Prisustvo fragmenata ~2230 i ~3100 bp ukazuje na brazdanje posredovano Cas9.
Rezultati
Da bi se testiralo da li se Cas9 može programirati da brazda genomsku DNK u živim ćelijama, Cas9 je ko-eksprimiran zajedno sa sgRNK dizajniranom da cilja na gen lakog lanca ljudskog klatrina (CLTA). CLTA genomski lokus je prethodno bio ciljan i uređivan korišćenjem ZFN-a [10]. Prvo smo testirali ekspresiju sa ljudskim kodonima optimizovane verzije Streptococcus pyogenes Cas9 proteina i SGRNK u ljudskim ćelijama HEK293T. Protein Cas9 od 160 kDa je eksprimiran kao fuzioni protein koji nosi HA epitop, signal nuklearne lokalizacije (NLS) i zeleni fluorescentni protein (GFP) vezan za C-terminus Cas9 (Slika 29A). Analiza ćelija transfektovanih vektorom koji kodira Cas9 fuzionisan sa GFP otkrila je obilnu ekspresiju Cas9 i nuklearnu lokalizaciju (Slika 29B). Vestern bloting je potvrdio da se protein Cas9 eksprimira uglavnom netaknut u ekstraktima iz ovih ćelija (Slika 29A). Da bismo programirali Cas9, eksprimirali smo sgRNK koja nosi 5'-terminalnu sekvencu od 20 nukleotida komplementarnu ciljnoj DNK sekvenci, i strukturu matične petlje od 42-nukleotida s 3'-terminala potrebnu za vezivanje Cas9 (Slika 29C). Ova 3'-terminalna sekvenca odgovara minimalnoj strukturi matične petlje koja je ranije korišćena za programiranje Cas9 in vitro [8].
Ekspresiju ove sgRNK pokretao je ljudski U6 (RNK polimeraza III) promotor [11]. Nortern bloting analiza RNK ekstrahovane iz ćelija transfektovanih SGRNK vektorom ekspresije plazmida vođenim promotorom U6 pokazala je da je sgRNK zaista eksprimirana i da je njena stabilnost poboljšana prisustvom Cas9 (Slika 29D).
Slika 29 pokazuje da ko-ekspresija Cas9 i vodeće RNK u ljudskim ćelijama generiše dvolančane prekide DNK na ciljnom lokusu. (A) Vrh; šematski dijagram ekspresione konstrukcije Cas9-HA-NLS-GFP. Dno; lizat iz ćelija HEK293T transfektovanih sa Cas9 ekspresionim plazmidom je analiziran Vestern blotingom korišćenjem anti-HA antitela. (B) Fluorescentna mikroskopija ćelija HEK293T koje eksprimiraju Cas9-HA-NLS-GFP. (C) Dizajn RNK sa jednim vodičem (sgRNK, tj. RNK sa jednim molekulom koji cilja na DNK) koja cilja na ljudski CLTA lokus. Vrh; šematski dijagram ciljnog mesta sgRNK u exonu 7 ljudskog CLTA gena. Ciljna sekvenca koja se hibridizuje sa vodećim segmentom CLTA1 sgRNK je označena sa „CLTA1 sgRNK“. GG di-nukleotidni protospacer susedni motiv (PAM) je označen strelicom. Crne linije označavaju regione koji se vezuju za DNK kontrolnog ZFN proteina. Zaustavni kodon translacije otvorenog okvira za čitanje CLTA je označen isprekidanom linijom za referencu. Sredina; šematski dijagram ekspresionog konstrukta sgRNK. RNK se eksprimira pod kontrolom promotora U6 Pol III i poli(T) trakta koji služi kao signal terminatora transkripcije Pol III. Dno; sgRNK vođeno brazdanje ciljne DNK pomoću Cas9. SgRNK se sastoji od 20-nt 5'-terminalnog segmenta vodiča praćenog strukturom matične petlje od 42-nt potrebne za vezivanje Cas9. Cas9 posredovano brazdanje dva ciljna DNK lanca dešava se nakon odmotavanja ciljne DNK i formiranja dupleksa između segmenta vodiča sgRNK i ciljne DNK. Ovo zavisi od prisustva PAM motiva (prikladnog za Cas9 koji se koristi, npr. GG dinukleotid, vidi Primer 1 iznad) nizvodno od ciljne sekvence u ciljnoj DNK. Imajte na umu da je ciljna sekvenca obrnuta u odnosu na gornji dijagram. (D) Nortern blot analiza ekspresije sgRNK u ćelijama HEK239T. (E) Analiza nukleaze genomske DNK izolovane iz ćelija HEK293T koje eksprimiraju Cas9 i/ili CLTA sgRNK. ZFN konstrukt koji je prethodno korišćen za ciljanje CLTA lokusa [10] korišćen je kao pozitivna kontrola za detekciju DSB-indukovane popravke DNK nehomolognim spajanjem krajeva.
Zatim smo istražili da li se DSB-ovi specifični za lokaciju generišu u ćelijama HEK293T transfektovanim sa Cas9-HA-NLS-mCherry i CLTA1 sgRNK. Da bismo to uradili, ispitali smo manje unoske i brisanja u lokusu koji su rezultat nesavršenog popravka pomoću DSB izazvanog NHEJ-a koristeći Surveyor test nukleaze [12]. Region genomske DNK na koji cilja Cas9:sgRNK je umnožen PCR-om i rezultujući produkti se denaturišu i ponovo žare. Rehibridizovani PCR produkti se inkubiraju sa endonukleazom Cel-1 koja prepoznaje neusklađenost i razdvaja na akrilamidnom gelu da bi se identifikovale Cel-1 trake cepanja. Kako se popravka DNK pomoću NHEJ obično indukuje pomoću DSB-a, pozitivan signal u Surveyor testu ukazuje na to da je došlo do brazdanja genomske DNK. Koristeći ovaj test, otkrili smo brazdanje CLTA lokusa na poziciji na koju cilja CLTA1 sgRNK (Slika 29E). Par ZFN-a koji ciljaju na susedno mesto u CLTA lokusu pružio je pozitivnu kontrolu u ovim eksperimentima [10].
Da bi se utvrdilo da li je ekspresija Cas9 ili sgRNK ograničavajući faktor u uočenim reakcijama uređivanja genoma, lizati pripremljeni iz transfektovanih ćelija su inkubirani sa plazmidnom DNK koja sadrži fragment CLTA gena ciljanog od CLTA1 sgRNK. Brazdanje plazmidne DNK nije primećeno nakon inkubacije sa lizatom pripremljenim iz ćelija transfektovanih samo ekspresionim vektorom Cas9HA-NLS-GFP, što je u skladu sa rezultatima Surveyor testa. Međutim, otkriveno je snažno brazdanje plazmida kada je lizat dopunjen in vitro transkribovanom CLTA1 sgRNK (Slika 30A). Štaviše, lizat pripremljen od ćelija transfektovanih sa Cas9 i sgRNK ekspresionim vektorima podržava brazdanje plazmida, dok lizati iz ćelija transficiranih samo vektorom koji kodira sgRNK ne (Slika 30A). Ovi rezultati sugerišu da bi ograničavajući faktor za funkciju Cas9 u ljudskim ćelijama mogao biti sklapanje sa sgRNK. Ovu mogućnost smo testirali direktno analizom brazdanja plazmida u lizatima iz ćelija transfektovanih kao i ranije u prisustvu i odsustvu dodate egzogene sgRNK. Naročito, kada je egzogena sgRNK dodata u lizat iz ćelija transfektovanih sa vektorima ekspresije Cas9 i sgRNK, primećeno je značajno povećanje aktivnosti brazdanja DNK (Slika 30B). Ovaj rezultat ukazuje da je ograničavajući faktor za funkciju Cas9 u ćelijama HEK293T ekspresija sgRNK ili njeno učitavanje u Cas9.
Slika 30 pokazuje da ćelijski lizati sadrže aktivnu Cas9:sgRNK i podržavaju cepanje DNK specifično za mesto. (A) Lizati iz ćelija transficiranih plazmidom(ima) naznačenim levo su inkubirani sa plazmidnom DNK koja sadrži PAM i ciljnu sekvencu komplementarnu CLTA1 sgRNK; naznačeno time što je naznačeno, reakcija je dopunjena sa 10 pmol in vitro transkribovane CLTA1 sgRNK; sekundarno brazdanje sa XhoI generisanim fragmentima od ~2230 i ~3100 bp fragmentima što ukazuje na brazdanje posredovano Cas9. Kontrolna reakcija korišćenjem lizata iz ćelija transfektovanih konstruktom ekspresije ZFN pokazuje fragmente neznatno različite veličine koji odražavaju pomak ciljnog mesta ZFN u odnosu na ciljno mesto CLTA1. (B) Lizati iz ćelija transficiranih sa Cas9-GFP ekspresionim plazmidom i, naznačeno time što je naznačeno, ekspresijskim plazmidom CLTA1 sgRNK, inkubirani su sa ciljnom plazmidnom DNK kao u (A) u odsustvu ili prisustvu in vitro transkribovane CLTA1 sgRNK.
Kao sredstvo za poboljšanje sklopa Cas9: sgRNK u živim ćelijama, zatim smo testirali efekat proširenja pretpostavljenog regiona koji se vezuje za Cas9 vodeće RNK. Dve nove verzije CLTA1 sgRNK su dizajnirane da uključe dodatnih šest ili dvanaest parova baza u heliksu koji oponaša interakcije uparivanja baza između crRNK i tracrRNA (Slika 31A). Dodatno, 3'-kraj vodeće RNK je produžen za pet nukleotida na osnovu prirodne sekvence S. pyogenes tracrRNK [9]. Vektori koji kodiraju ove 3' proširene sgRNK pod kontrolom ili U6 ili H1 Pol III promotora su transfektovani u ćelije zajedno sa Cas9-HA-NLS-GFP ekspresionim vektorom, a brazdanje genoma specifičnog za lokaciju je testirano korišćenjem Surveyor testa (Slika 31B). Rezultati su potvrdili da je brazdanje zahtevalo i Cas9 i CLTA1 sgRNK, ali se nije desilo kada su Cas9 ili sgRNK eksprimirani sami. Štaviše, primetili smo značajno povećane frekvencije NHEJ, što je detektovano brazdanjem nukleaze Cel-1, dok je učestalost NHEJ mutageneze dobijena sa kontrolnim ZFN parom uglavnom nepromenjena.
Slika 31 pokazuje da 3' ekstenzija sgRNK konstrukata pojačava mutagenezu posredovanu NHEJ-om. (A) Konstrukt za ekspresiju CLTA1 sgRNK(gore) je dizajniran da generiše transkripte koji sadrže originalnu sekvencu vezivanja Cas9 (v1.0), ili duplekse dsRNK proširene za 4 para baza (v2.1) ili 10 parova baza (v2.2). (B) I spitivanje nukleaze genomske DNK izolovane iz ćelija HEK293T koje eksprimiraju Cas9 i/ili CLTA sgRNK v1.0, v2.1 ili v2.2. ZFN konstrukt koji je prethodno korišćen za ciljanje CLTA lokusa [10] korišćen je kao pozitivna kontrola za detekciju DSB-indukovane popravke DNK nehomolognim spajanjem krajeva.
Rezultati stoga pružaju okvir za implementaciju Cas9 kao lakog molekularnog alata za različite aplikacije za uređivanje genoma. Moćna karakteristika ovog sistema je mogućnost programiranja Cas9 sa više sgRNK u istoj ćeliji, bilo da se poveća efikasnost ciljanja na jednom lokusu, ili kao sredstvo ciljanja na nekoliko lokusa istovremeno. Takve strategije bi našle široku primenu u eksperimentima širom genoma i velikim istraživačkim naporima kao što je razvoj modela multigenskih bolesti.
Primer 3: Porodice tracrRNK i Cas9 imunskog sistema tipa II CRISPR-Cas
Tražili smo sve pretpostavljene CRISPR-Cas lokuse tipa II koji trenutno postoje u javno dostupnim bakterijskim genomima skriningom na sekvence homologne Cas9, karakterističnom proteinu sistema tipa II. Konstruisali smo filogenetsko stablo iz višestrukog poravnanja sekvenci identifikovanih Cas9 ortologa. CRISPR dužina ponavljanja i organizacija gena cas operona povezanih sistema tipa II analizirani su u različitim Cas9 podklasterima. Predložena je potklasifikacija lokusa tipa II i dalje podeljena na podgrupe na osnovu izbora 75 reprezentativnih Cas9 ortologa. Zatim smo predvideli sekvence tracrRNK uglavnom tako što smo preuzeli sekvence ponavljanja CRISPR i skriningom za anti-ponavljanje unutar ili u blizini cas gena i CRISPR nizova odabranih lokusa tipa II. Izvršena je komparativna analiza sekvenci i predviđenih struktura izabranih tracrRNK ortologa. Konačno, odredili smo profile ekspresije i obrade tracrRNK i crRNK iz pet vrsta bakterija.
Materijali i postupci
Sojevi bakterija i uslovi kulture
Sledeći mediji su korišćeni za uzgoj bakterija na pločama: TSA (triptikaza soja agar, Trypticase<™>sojin agar (TSA II) BD BBL, Becton Dickinson) sa dodatkom 3% ovčije krvi za S. mutans (UA159) i BHI (infuzija mozak srce, BD Bacto<™>Brain Heart Infusion, Becton Dickinson)) agar za L. innocua (Clip11262). Kada se uzgaja u tečnim kulturama, THY medijum (Todd Hewitt Broth (THB, Bacto, Becton Dickinson) sa dodatkom 0,2% ekstrakta kvasca (Servabacter<®>) je korišćen za S. mutans, BHI tečnost za L. innocua, BHI tečni medijum koji sadrži 1% vitaminski miks VX (Difco, Becton Dickinson) za N. meningitidis (A Z2491), MH (Mueller Hinton Broth, Oxoid) Tečnost uključujući 1% vitaminski mix VX za C. jejuni (NCTC 11168; ATCC 700819) i TSB (Tryptic Soy Broth, BD BBL<™>Trypticase<™>Soy Broth) za F. novicida (U112). S. mutans je inkubiran na 37 °C, 5% CO2 bez mućkanja. Sojevi L. innocua, N. meningitidis i F. novicida uzgajani su aerobno na 37 °C uz mućkanje. C. jejuni je uzgajan na 37 °C u mikroaerofilnim uslovima korišćenjem atmosfere kampigena (Oksoid). Rast bakterijskih ćelija je praćen merenjem optičke gustine kultura na 620 nm (OD620 nm) u redovnim vremenskim intervalima korišćenjem čitača mikroploča (BioTek PowerWave<™>).
Sekvenciranje bakterijskih malih RNK biblioteka.
C. jejuni NCTC 11168 (ATCC 700819), F. novicida U112, L. innocua Clip11262, N. meningitidis A Z2491 i S. mutans UA159 su kultivisane do srednje logaritamske faze rasta i ukupna RNK je ekstrahovana sa TRIzolom (Sigma-Aldrich). 10 µg ukupne RNK iz svakog soja je tretirano sa TURBO<™>DNase (Ambion) da bi se uklonila svaka zaostala genomska DNK. Ribosomalne RNK su uklonjene korišćenjem Ribo-Zero<™>Kompleta za uklanjanje rRNK<®>za Grampozitivne ili Gram-negativne bakterije (Epicentre) prema uputstvima proizvođača. Nakon prečišćavanja sa RNK Clean & Concentrator<™>-5 kompletom (Zymo Research), biblioteke su pripremljene korišćenjem ScriptMiner<™>Mali RNK-Sek Library komplet za pripremu (Multiplex, Illumina<®>kompatibilan) prema uputstvima proizvođača. RNK su tretirane duvanskom kiselom pirofosfatazom (TAP) (Epicentar). Kolone iz RNK Clean & Concentrator<™>-5 (Zymo Research) su korišćene za naknadno prečišćavanje RNK i Phusion<®>High-Fidelity DNK polimeraza (New England Biolabs) je korišćena za PCR amplifikaciju. Specifični korisnički definisani bar kodovi su dodati svakoj biblioteci (RNA-Seq Barcode Primers (Illumina<®>- kompatibilan) Epicentar) i uzorci su sekvencionirani u sekvenciranju sledeće generacije (CSF NGS Jedinica; na vebu na „csf“. zatim „ac.at“) objekat Bečkog biocentra, Beč, Austrija (Illumina single end sequencing).
Analiza podataka o sekvenciranju tracrRNK i crRNK
Očitavanja sekvenciranja RNK su podeljena pomoću alata illumina2bam i isečena (i) uklanjanjem sekvenci Illumina adaptera (cutadapt 1.0) i (ii) uklanjanjem 15 nt na 3' kraju da bi se poboljšao kvalitet očitavanja. Nakon uklanjanja očitavanja kraćih od 15 nt, očitavanja cDNK su poravnata sa odgovarajućim genomom koristeći leptir mašna koncept dozvoljavajući 2 nepodudaranja: C. jejuni (GenBank: NC_002163), F. novicida (GenBank:
NC_008601), N. meningitidis (GenBank: NC_003116), L. innocua (GenBank: NC_003212) i S. mutans (GenBank: NC_004350). Pokrivenost očitavanja je izračunata na svakoj poziciji nukleotida posebno za oba lanca DNK koristeći BEDTools-Version-2.15.0. Normalizovana wiggle datoteka koja sadrži pokrivenost u očitavanju na milion (o/min) je kreirana i vizualizovana pomoću alatke Integrative Genomics Viewer (IGV) („www.“ praćeno „broadinstitute.org/igv/“) (Slika 36).
Koristeći SAMTools flagstat<80>, proporcija mapiranih očitavanja je izračunata na ukupno 9914184 mapiranih očitavanja za C. jejuni, 48205 očitavanja za F. novicida, 13110087 očitavanja za N. meningitidis, 161865 očitavanja za L. innocua i 1542239 očitavanja za S. mutans. Datoteka koja sadrži broj čitanja koja počinje (5') i završava (3') na svakom pojedinačnom položaju nukleotida je kreirana i vizuelizovana u IGV. Za svaki tracrRNK ortolog i crRNK, ukupan broj preuzetih čitanja izračunat je pomoću SAMtools-a.
Analiza Cas9 sekvence, višestruko poravnanje sekvenci i konstrukcija stabla vodiča
Position-Specific Iterated (PSI)-BLAST program je korišćen za pronalaženje homologa porodice Cas9 u bazi podataka NCBI koja nije redundantna. Sekvence kraće od 800 aminokiselina su odbačene. Program BLASTClust podešen sa graničnom pokrivenošću dužine od 0,8 i pragom pokrivenosti rezultatom (rezultat bitova podeljen dužinom poravnanja) od 0.8 korišćen je za grupisanje preostalih sekvenci (Slika 38). Ova procedura je proizvela 78 klastera (od kojih je 48 bilo predstavljeno samo jednom sekvencom). Jedan (ili retko nekoliko predstavnika) je izabran iz svakog klastera i višestruko poravnanje za ove sekvence je konstruisano korišćenjem programa MUSCLE sa podrazumevanim parametrima, nakon čega je usledila ručna korekcija na osnovu lokalnih poravnanja dobijenih korišćenjem PSI-BLAST i HHpred programa. Još nekoliko sekvenci nije bilo poravnato i takođe je isključeno iz konačnog poravnanja. Pouzdano poravnati blokovi sa 272 informativne pozicije korišćeni su za rekonstrukciju stabla maksimalne verovatnoće koristeći FastTree program sa podrazumevanim parametrima: JTT evolucioni model, diskretni gama model sa 20 kategorija brzina. Isti program je korišćen za izračunavanje vrednosti nasumične provere.
Slika 38 prikazuje sekvence koje su grupisane prema programu za klasterisanje BLASTclust. Za analizu BLASTclust izabrane su samo sekvence duže od 800 aminokiselina (videti Materijali i postupci). Korišćeni su reprezentativni sojevi koji sadrže cas9 ortološke gene. Neke sekvence se nisu grupisale, ali su verifikovane kao Cas9 sekvence zbog prisustva konzerviranih motiva i/ili drugih cas gena u njihovoj neposrednoj blizini.
Analiza CRISPR-Cas lokusa
Sekvence ponavljanja CRISPR-a su preuzete iz baze podataka CRISPRdb ili predviđene pomoću alata CRISPRFinder (Grissa I i sar., BMC Bioinformatics 2007; 8:172; Grissa I i sar., Nucleic Acids Res 2007). Cas geni su identifikovani korišćenjem BLASTp algoritma i/ili verifikovani sa KEGG bazom podataka (na vebu na „www.“ praćeno kegg.jp/).
In silico predviđanje i analiza tracrRNK ortologa
Pretpostavljena antiponavljanja su identifikovana korišćenjem softvera Vector NTI<®>(Invitrogen) skriningom za dodatne, degenerisane ponavljajuće sekvence koje ne pripadaju nizu spacer ponavljanja na oba lanca odgovarajućih genoma, dozvoljavajući do 15 nepodudaranja. Promotori transkripcije i terminatori nezavisni od rho su predviđeni korišćenjem BDGP Neural Network Promoter Prediction programa („www.“ praćen fruitfly.org/seq_tools/promoter.html) i TransTennHP softvera, respektivno. Višestruko poravnanje sekvenci je izvedeno korišćenjem programa MUSCLE sa podrazumevanim parametrima. Poravnanja su analizirana na prisustvo motiva konzervirane strukture korišćenjem RNKalifold algoritma Vienna RNK paketa 2.0.
Rezultati
CRISPR-Cas sistemi tipa II su široko rasprostranjeni u bakterijama.
Pored tracrRNK-kodirajuće DNK i niza spacera za ponavljanje, tip II CRISPR-Cas lokusi se obično sastoje od tri do četiri cas gena organizovana u operonu (Slika 32A-B). Cas9 je karakteristični protein za tip II i uključen je u korake ekspresije i interferencije. Cas1 i Cas2 su proteini jezgra koje dele svi CRISPR-Cas sistemi i koji su uključeni u sticanje spacera. Csn2 i Cas4 su prisutni samo u podskupu sistema tipa II i predloženo je da igraju ulogu u adaptaciji. Da bismo dobili maksimalan broj lokusa tipa II CRISPR-Cas, koji sadrže tracrRNK, prvo smo pregledali javno dostupne genome za sekvence homologne sa već označenim proteinima Cas9. 235 Cas9 ortologa je identifikovano u 203 bakterijske vrste. Skup od 75 različitih sekvenci reprezentativnih za sve pronađene Cas9 ortologe je odabran za dalju analizu (Slika 32, Slika 38 i Materijali i postupci).
Slika 32 prikazuje (A) filogenetsko stablo reprezentativnih Cas9 sekvenci iz različitih organizama, kao i (B) reprezentativnu arhitekturu Cas9 lokusa. Vrednosti nasumične provere izračunate za svaki čvor su naznačene. Grane iste boje predstavljaju odabrane podklastere sličnih Cas9 ortologa. Dužina ponavljanja CRISPR-a u nukleotidima, prosečna veličina proteina Cas9 u aminokiselinama (aa) i arhitektura konsenzus lokusa su prikazani za svaki podklaster. *- gi|116628213 *-gi|116627542 †- gi|34557790
- gi|34557932. Tip II-A karakterišu cas9-csx12, cas1, cas2, cas4. Tip II-B karakterišu cas9, cas1, cas2 praćeno csn2 varijantom. Tip II-C karakteriše konzervirani operon cas9, cas1, cas2 (vidi takođe Sliku 38).
Zatim smo izvršili višestruko poravnanje sekvenci odabranih Cas9 ortologa. Komparativna analiza je otkrila veliku raznolikost u kompoziciji aminokiselina i veličini proteina. Cas9 ortolozi dele samo nekoliko identičnih aminokiselina i sve dobijene sekvence imaju istu arhitekturu domena sa centralnim domenom HNH endonukleaze i podeljenim RuvC/RNaseH domenom. Dužina Cas9 proteina se kreće od 984 (Campylobacter jejuni) do 1629 (Francisella novicida) aminokiselina sa tipičnim veličinama od ~1100 ili ~1400 aminokiselina. Zbog velike raznolikosti Cas9 sekvenci, posebno u dužini međudomenskih regiona, odabrali smo samo dobro usklađene, informativne pozicije pripremljenog poravnanja da bismo rekonstruisali filogenetsko stablo analiziranih sekvenci (Slika 32 i Materijali i postupci). Cas9 ortolozi su grupisani u tri glavna, monofiletska klastera sa nekim izvanrednim sekvencama. Uočena topologija stabla Cas9 dobro se slaže sa trenutnom klasifikacijom lokusa tipa II, sa prethodno definisanim tipom II-A i tipom II-B koji formiraju odvojene, monofiletske klastere. Da bismo dalje karakterisali klastere, detaljno smo ispitali kompozicije cas operona i sekvence ponavljanja CRISPR svih navedenih sojeva.
Cas9 podklasterovanje odražava raznolikost u arhitekturi lokusa tipa II CRISPR-Cas
Dublja analiza odabranih lokusa tipa II otkrila je da grupisanje ortoloških sekvenci Cas9 koje korelira sa raznovrsnošću u dužini ponavljanja CRISPR-a. Za većinu CRISPR-Cas sistema tipa II, dužina ponavljanja je 36 nukleotida (nt) sa nekim varijacijama za dva podklastera Cas9 stabla. U klasteru tipa II-A (Slika 32) koji sadrži lokuse koji kodiraju dugački ortolog Cas9, prethodno nazvanom Csx12, CRISPR ponavljanja su dugačka 37 nt. Mali podklaster sastavljen od sekvenci bakterija koje pripadaju tipu Bacteroidetes (Slika 32) karakterišu neobično dugačka ponavljanja CRISPR-a, veličine do 48 nt. Štaviše, primetili smo da podklasterovanje Cas9 sekvenci korelira sa različitim arhitekturama cas operona, kao što je prikazano na Slici 32. Treći glavni klaster (Slika 32) i lokusi van granica (Slika 32) se uglavnom sastoje od minimalnog operona sastavljenog od gena cas9, cas1 i cas2, sa izuzetkom nekih nepotpunih lokusa o kojima će biti reči kasnije. Svi ostali lokusi dva prva glavna klastera su povezani sa četvrtim genom, uglavnom cas4, specifičnim za tip II-A ili sličan csn2, specifičnim za tip II-B (Slika 32). Identifikovali smo gene koji kodiraju kraće varijante Csn2 proteina, Csn2a, unutar lokusa sličnih tipu II-B S. pyogenes CRISPR01 i S. thermophilus CRISPR3 (Slika 32). Duža varijanta Csn2, Csn2b, pronađena je povezana sa lokusima sličnim tipu II-B S. thermophilus CRISPR1 (Slika 32). Zanimljivo je da smo identifikovali dodatne pretpostavljene cas gene koji kodiraju proteine bez očigledne sličnosti sekvence sa prethodno opisanim varijantama Csn2. Jedan od tih nekarakterističnih proteina je isključivo povezan sa lokusima tipa II-B vrste Mycoplasma (Slika 32 i Slika 33). Pronađena su dva druga kodirana u lokusima tipa II-B vrste Staphilococcus (Slika 33). U svim slučajevima, raznolikost arhitekture cas operona je stoga konzistentna sa podklasterizacijom Cas9 sekvenci. Ove karakteristike zajedno sa opštom topologijom stabla Cas9 podeljenog u tri glavna, različita, monofiletska klastera, navele su nas da predložimo novu, dalju podelu CRISPR-Cas sistema tipa II na tri podtipa. Tip II-A je povezan sa Cas9 i Cas4 sličnim Csx12, tip II-B je povezan sa Csn2 sličnim, a tip II-C sadrži samo minimalni skup gena cas9, cas1 i cas2, kao što je prikazano na Slici 32.
Slika 33 prikazuje arhitekturu tipa II CRISPR-Cas odabranih vrsta bakterija. Vertikalne trake grupišu lokuse koji kodiraju za Cas9 ortologe koji pripadaju istom podklasteru stabla (uporedite sa Slikom 32). Horizontalna crna traka, vodeći niz; crni pravougaonici i rombovi, niz spacera za ponavljanje.
Predviđena anti-ponavljanja su predstavljena strelicama koje ukazuju na smer pretpostavljene tracrRNK ortološke transkripcije. Imajte na umu da se za lokuse koji nisu eksperimentalno verifikovani, ovde se smatra da je niz CRISPR ponavljajućih spacera transkribovan iz istog lanca kao i cas operon. Smer transkripcije pretpostavljenog tracrRNK ortologa je naznačen u skladu sa tim.
In silico predviđanja novih tracrRNK ortologa
Lokusi tipa II odabrani ranije na osnovu 75 reprezentativnih Cas9 ortologa su pregledani na prisustvo pretpostavljenih tracrRNK ortologa. Naša prethodna analiza obavljena na ograničenom broju sekvenci tracrRNK otkrila je da ni sekvence tracrRNK ni njihova lokalizacija unutar CRISPR-Cas lokusa nisu izgledale očuvane. Međutim, kao što je gore pomenuto, tracrRNK takođe karakteriše sekvenca protiv ponavljanja koja je sposobna za uparivanje baza sa svakim od pre-crRNK ponavljanja da bi se formirali dupleksi tracrRNK:precrRNK koji se brazdaju pomoću RNase III u prisustvu Cas9. Da bismo predvideli nove tracrRNK, iskoristili smo ovu karakteristiku i koristili sledeći tok rada: (i) skrining za potencijalna anti-ponavljanja (uparivanje baza sekvence sa ponavljanjima CRISPR) unutar CRISPR-Cas lokusa, (ii) odabir anti-ponavljanja lociranih u intergenskim regionima, (iii) validacija CRISPR anti-ponavljanja: ponovljeno uparivanje baza, i (iv) predviđanje promotera i Rho-nezavisnih transkripcionih terminatora povezanih sa identifikovanim tracrRNK.
Da bismo obavili skrining pretpostavljenih anti-ponavljanja, preuzeli smo ponavljajuće sekvence iz baze podataka CRISPRdb ili, kada informacije nisu bile dostupne, predvideli smo ponavljajuće sekvence koristeći softver CRISPRfinder. U našoj prethodnoj studiji, eksperimentalno smo pokazali da je pravac transkripcije niza spacera ponavljanja u poređenju sa onim cas operona varirao među lokusima. Ovde je analiza sekvenciranja RNK potvrdila ovo zapažanje. U nekim od analiziranih lokusa, naime kod F. novicida, N. meningitidis i C. jejuni, niz ponavljajućih spacera se transkribuje u suprotnom smeru od cas operona (pogledajte paragraf „Duboko sekvenciranje RNK potvrđuje ekspresiju novih tracrRNK ortologa“ i Slike 33 i 34) dok su kod S. pyogenes, S. mutans, S. thermophilus i L. innocua niz i cas operon transkribovani u istom pravcu. Ovo su jedini podaci o ekspresiji niza spacera ponavljanja tipa II dostupni do danas. Da bismo predvideli pravac transkripcije drugih nizova spacera ponavljanja, razmotrili smo prethodno zapažanje prema kojem su poslednja ponavljanja nizova obično mutirana. Ova primedba je u saglasnosti sa trenutnim modelom akvizicije spacera, u kome se tipično prvo ponavljanje niza duplira nakon umetanja sekvence spacera tokom faze adaptacije. Za 37 nizova spacera ponavljanja, uspeli smo da identifikujemo mutirano ponavljanje na pretpostavljenom kraju nizova. Primetili smo da bi predviđena orijentacija transkripcije za N. meningitidis i C. jejuni niz spacera ponavljanja bila suprotna orijentaciji utvrđenoj eksperimentalno (sekvencioniranje RNK i Nortern blot analiza). Kako predviđena orijentacija nije konzistentna unutar klastera i kako smo u većini slučajeva mogli da otkrijemo potencijalne promotere na oba kraja nizova, smatrali smo da je transkripcija nizova spacera ponavljanja u istom pravcu kao i transkripcija cas operona, ako nije drugačije potvrđeno.
Slika 34 prikazuje ko-procesiranje tracrRNK i pre-crRNK u odabranim sistemima tipa II CRISPR Cas. Prikazane su arhitekture CRISPR lokusa sa verifikovanim pozicijama i pravcima tracrRNK i pre-crRNK transkripcije. Gornje sekvence, ponavljanja pre-crRNK; donje sekvence, sekvence tracrRNK uparivanje baza sa ponavljanjima crRNK. Pretpostavljena mesta za obradu RNK koja su otkrivena sekvenciranjem RNK označena su strelicama. Za svaki lokus, veličine vrhova strelica predstavljaju relativne količine preuzetih 5' i 3' krajeva (videti takođe Sliku 37).
Slika 37 navodi sve tracrRNK ortologe i zrele crRNK dobijene sekvenciranjem za proučavane bakterijske vrste, uključujući koordinate (region od interesa) i odgovarajuće sekvence cDNK (5' do 3'). Strelice predstavljaju pravac transkripcije (lanac). Naznačeni su broj cDNK očitavanja (izračunato korišćenjem SAMtools), brojevi pokrivenosti (procenat mapiranih čitanja) i dominantni krajevi povezani sa svakim transkriptom. Prikazani su brojevi očitavanja koji počinju ili se zaustavljaju na svakoj poziciji nukleotida oko 5' i 3' kraja svakog transkripta.
Naznačene su veličine svakog zrelog oblika crRNK. Broj dodeljen svakoj vrsti crRNK odgovara poziciji sekvence spacera u pre-crRNK, prema CRISPRdb. Broj dodeljen svakoj tracrRNK vrsti odgovara različitim oblicima istog transkripta.
Zatim smo pregledali odabrane CRISPR-Cas lokuse uključujući sekvence locirane 1 kb uzvodno i nizvodno na oba lanca za moguće ponavljajuće sekvence koje ne pripadaju nizu spacera za ponavljanje, dozvoljavajući do 15 nepodudaranja. U proseku, pronašli smo jednu do tri degenerisane ponavljajuće sekvence po lokusu koje bi odgovarale anti-ponavljanjima tracrRNK ortologa i odabrali sekvence koje se nalaze unutar intergenskih regiona. Pretpostavljena anti-ponavljanja su pronađena u četiri tipične lokalizacije: uzvodno od cas9 gena, u regionu između cas9 i cas1, i uzvodno ili nizvodno od niza spacera za ponavljanje (Slika 33). Za svaku pronađenu sekvencu, potvrdili smo stepen uparivanja baza formiran između ponavljanja i anti-ponavljanja (Slika 44) predviđajući moguću RNK:RNK interakciju i fokusirajući se posebno na kandidate sa dužim i savršenim komplementarnim regionom koji formiraju optimalnu dvolančanu strukturu za obradu RNaze III. Da bismo predvideli promotere i terminatore transkripcije koji prate anti-ponavljanje, postavili smo pretpostavljena mesta početka i završetka transkripcije da budu uključena u region koji se nalazi maksimalno 200 nt uzvodno i 100 nt nizvodno od sekvence protiv ponavljanja, na osnovu naših prethodnih zapažanja<26>. Kao što je gore pomenuto, nedostaju eksperimentalne informacije o pravcu transkripcije većine nizova spacera ponavljanja sistema tipa II. Algoritmi za predviđanje in silico promotera često daju lažno pozitivne rezultate i ukazuju na pretpostavljene promotere koji bi doveli do transkripcije nizova spacera ponavljanja iz oba lanca. U nekim slučajevima nismo mogli da predvidimo terminatore transkripcije, iako se ekspresija ortologa tracrRNK može eksperimentalno potvrditi, kao što je ilustrovano lokusom C. jejuni (pogledajte paragraf „Duboko sekvenciranje RNK potvrđuje ekspresiju novih ortologa tracrRNK“). Predlažemo da se predviđanja promotera i terminatora transkripcije razmatraju samo kao podrška, ali ne i suštinski korak gore opisanog uputstva.
Slika 44 prikazuje predviđeno pre-crRNK ponavljanje:tracrRNK antiponavljanje uparivanje baza u odabranim bakterijskim vrstama.<b>CRISPR lokusi pripadaju sistemu CRISPR-Cas tipa II (Nmeni/CASS4). Nomenklatura je prema bazi podataka CRISPR (CRISPRdb). Imajte na umu da S. thermophilus LMD-9 i V. succinogenes sadrže dva lokusa tipa II.<c>Gornja sekvenca, konsenzusna sekvenca ponavljanja pre-crRNK (5' do 3'); niža sekvenca, tracrRNK homologna sekvenca koja se žari na ponavljanje (anti-ponavljanje; 3' do 5'). Imajte na umu da je data sekvenca ponavljanja zasnovana na pretpostavci da je CRISPR niz spacera ponavljanja transkribovan iz istog lanca kao i cas operon. Za sekvence koje su eksperimentalno potvrđene u ovoj studiji, podaci o sekvenciranju RNK su uzeti u obzir da bi se odredilo uparivanje baza. Vidi Sliku 33.<d>Dva moguća antiponavljanja su identifikovana u F. tularensis subsp. novicida, W. succinogenes i gamma proteobacterium HTCC5015 tip II-A lokusima. Uparivanje gornje sekvence, anti-ponavljanje unutar pretpostavljene vodeće sekvence; uparivanje niže sekvence, anti-ponavljanje nizvodno od niza spacera ponavljanja. Vidi Sliku 33.<e>Identifikovana su dva moguća anti-ponavljanja u lokusu S. wadsworthensis tipa II-A. Uparivanje gornje sekvence, anti-ponavljanje; uparivanje niže sekvence, anti-ponavljanje unutar pretpostavljene vodeće sekvence Videti Sliku 33.<f>Dva moguća anti-ponavljanja su identifikovana u lokusu L. gasseri tipa II-B. Uparivanje gornje sekvence, anti-ponavljanje uzvodno od cas9; uparivanje niže sekvence, anti-ponavljanje između gena cas9 i cas1. Vidi Sliku 33.<g>Dva moguća antiponavljanja su identifikovana u lokusima C. jejuni tipa II-C. Uparivanje gornje sekvence, anti-ponavljanje uzvodno od cas9; uparivanje niže sekvence, antiponavljanje nizvodno od niza spacera za ponavljanje. Vidi Sliku 33.<h>Identifikovana su dva moguća anti-ponavljanja u lokusu R. rubrum tipa II-C. Uparivanje gornje sekvence, anti-ponavljanje nizvodno od niza spacera za ponavljanje; uparivanje niže sekvence, anti-ponavljanje uzvodno od cas1. Vidi Sliku 33.
Mnoštvo tracrRNK ortologa
Predvideli smo pretpostavljene tracrRNK ortologe za 56 od 75 ranije odabranih lokusa. Rezultati predviđanja su prikazani na Slici 33. Kao što je već pomenuto, smer transkripcije tracrRNK prikazan na ovoj slici je hipotetički i zasnovan je na naznačenom smeru transkripcije niza spacera ponavljanja. Kao što je ranije navedeno, sekvence koje kodiraju pretpostavljene tracrRNK ortologe su identifikovane uzvodno, unutar i nizvodno od cas operona, kao i nizvodno od nizova spacera ponavljanja, uključujući pretpostavljene liderske sekvence, koje se obično nalaze u lokusima tipa II-A (Slika 33). Međutim, primetili smo da se antiponavljanja slične lokalizacije unutar CRISPR-Cas lokusa mogu transkribovati u različitim pravcima (kao što je primećeno kada poredimo npr. Lactobacillus rhamnosus i Eubacterium rectale ili Micoplasma mobile i S. pyogenes ili N. meningitidis) (Slika 33). Značajno je da lokusi grupisani unutar istog podklastera stabla vodiča Cas9 dele zajedničku arhitekturu u pogledu položaja gena koji kodira tracrRNK. Identifikovali smo anti-ponavljanja oko niza spacera ponavljanja u lokusima tipa II-A, i uglavnom uzvodno od cas9 gena u tipovima II-B i II-C sa nekoliko značajnih izuzetaka za pretpostavljenu tracrRNK koja se nalazi između cas9 i cas1 u tri različita podklastera tipa II-B.
Neki CRISPR-Cas lokusi tipa II imaju defektne nizove spacera za ponavljanje i/ili tracrRNK ortologe
Za šest lokusa tipa II (Fusobacterium nucleatum, Aminomonas paucivorans, Helicobacter mustelae, Azospirillum sp., Prevotella ruminicola i Akkermansia muciniphila), identifikovali smo potencijalna anti-ponavljanja sa slabim uparivanjem baza sa sekvencom ponavljanja ili lociranih u otvorenim okvirima čitanja. Naročito, u ovim lokusima, slabo anti-ponavljanje unutar otvorenog okvira čitanja gena koji kodira pretpostavljenu ATPazu kod A. paucivorans, jako anti-ponavljanje unutar prvih 100 nt gena cas9 u Azospirillum sp. B510 i identifikovano je snažno preklapanje anti-ponavljanja kod cas9 i cas1 kod A. muciniphila (Slika 33). Za dvanaest dodatnih lokusa (Peptoniphilus duerdenii, Coprococcus catus, Acidaminococcus intestini, Catenibacterium mitsuokai, Staphilococcus pseudintermedius, Ilyobacter polytropus, Elusimicrobium minutum, Bacteroides fragilis, Acidothermus cellulolyticus, Corynebacterium diphteriae, Bifidobacterium longum i Bifidobacterium dentium), nismo mogli da otkrijemo nijedno pretpostavljeno anti-ponavljanje. Nema dostupnih informacija o ekspresiji i obradi pre-crRNK u ovim CRISPR-Cas lokusima. Stoga, funkcionalnost sistema tipa II u odsustvu jasno definisanog tracrRNK ortologa ostaje da se reši. Za sedam analiziranih lokusa nismo mogli da identifikujemo nijedan ponovljeni niz spacera (Parasutterella excrementihominis, Bacillus cereus, Ruminococcus albus, Rhodopseudomonas palustris, Nitrobacter hamburgensis, Bradyrhizobium sp. i Prevotella micans) (Slika 33) i u tri od njih (Bradyrhizobium sp. BTAi1, N. hamburgensis i B. cereus) otkrili smo cas9 kao jedan gen bez drugih cas gena u blizini. Za ova tri lokusa nismo uspeli da predvidimo bilo koju malu sekvencu RNK uzvodno ili nizvodno od cas9 gena. U slučaju R. albus i P. excrementihominis, genomski kontig koji sadrži cas9 je prekratak da bi omogućio predviđanje niza spacera ponavljanja.
Duboko sekvenciranje RNK potvrđuje ekspresiju novih tracrRNK ortologa
Za verifikovanje in silico predviđanja tracrRNK i određivanje tracrRNK:pre-crRNK obrazaca koprocesiranja iz odabranih gram-pozitivnih (S. mutans i L. innocua) i gram-negativnih (N. meningitidis, C. jejuni i F. novicida) bakterija analizirani su dubokim sekvenciranjem. Preuzete su sekvence tracrRNK ortologa i obrađenih crRNK (Slika 36 i Slika 37). U skladu sa prethodno objavljenim diferencijalnim podacima o sekvenciranju tracrRNK u S. pyogenes<26>, ortolozi tracrRNK su bili visoko zastupljeni u bibliotekama, u rasponu od 0,08 do 6,2% ukupnih mapiranih očitavanja. Obrađene tracrRNK su takođe bile zastupljenije od primarnih transkripata, u rasponu od 66% do više od 95% ukupne količine očitavanja tracrRNK (Slika 36 i Slika 37).
Slika 36 prikazuje ekspresiju bakterijskih tracrRNK ortologa i crRNK otkrivene dubokim sekvenciranjem RNK. Profili ekspresije tracrRNK ortologa i crRNK odabranih bakterijskih sojeva su predstavljeni duž odgovarajućih genoma pomoću trakastih dijagrama (slike snimljene iz alatke Integrative Genomics Viewer (IGV)). Campylobacter jejuni (GenBank: NC_002163), Francisella novicida (GenBank: NC_008601), Neisseria meningitidis (GenBank: NC_003116), Listeria innocua (GenBank: NC _003212) and Streptococcus mutans (GenBank:
NC_004350). Date su genomske koordinate.<a>Pokrivenost sekvence izračunata korišćenjem BEDTools-Verzija-2.15.0 (Skala data u očitavanjima na milion).<b>Označena je distribucija početka (5') i kraja (3') na svakom nukleotidnom položaju (skala je data u brojevima očitavanja). Gornji paneli odgovaraju transkriptima iz pozitivnog lanca, a donji paneli odgovaraju transkriptima iz negativnog niza. Negativne vrednosti pokrivenosti i vrhovi prikazani ispod osa ukazuju na transkripciju sa negativnog lanca genoma. Predominantni 5'- i 3'-krajevi očitavanja su ucrtani za sve RNK. Imajte na umu da s obzirom na nizak kvalitet biblioteke cDNK L. innocua, očitavanja se skraćuju za crRNK, a primećuje se akumulacija očitavanja na 3' kraju tracrRNK, verovatno zbog degradacije RNK.
Da bismo procenili 5' krajeve tracrRNK primarnih transkripata, analizirali smo obilje svih 5' krajeva očitavanja tracrRNK i izvukli najistaknutija očitavanja uzvodno ili u blizini 5' kraja predviđene sekvence anti-ponavljanja.5' krajevi tracrRNK ortologa su dalje potvrđeni korišćenjem algoritma za predviđanje promotera. Identifikovani 5' krajevi tracrRNK iz S. mutans, L. innocua i N. meningitidis korelirali su i sa in silico predviđanjima i sa Nortern blot analizom tracrRNK ekspresije<26>. Najistaknutiji 5' kraj C. jejuni tracrRNK identifikovan je u sredini sekvence anti-ponavljanja. Pet nukleotida uzvodno, detektovan je dodatni pretpostavljeni 5' kraj koji korelira sa in silico predviđanjem i obezbeđuje dužu sekvencu interakcije sa sekvencom ponavljanja CRISPR. Iz biblioteke F. novicida smo preuzeli relativno malu količinu očitavanja koja je skoro isključivo odgovarala obrađenim transkriptima. Analiza veoma male količine očitavanja primarnih transkripata dala je 5' kraj koji je odgovarao snažnim predviđanjima in silico promotera. Nortern blot ispitivanje F. novicida tracrRNK dalje je potvrdilo validnost predviđanja koja pokazuju nisko obilje transkripata dužine oko 90 nt. Rezultati su navedeni u Tabeli 2. Za sve ispitivane vrste, osim N. meningitidis, primarni transkripti tracrRNK su identifikovani kao pojedinačne male RNK vrste dužine 75 do 100 nt. U slučaju N. meningitidis, pronašli smo preovlađujući primarni tracrRNK oblik od ~110 nt i pretpostavljeni duži transkript od ~170 nt koji je predstavljen veoma malom količinom očitavanja i prethodno otkriven kao slaba traka Nortern blot analizom.
Tabela 2. Odabrani ortolozi tracrRNK
tracrRNK i pre-crRNK mesta za koprocesiranje leže u antiponavljanje:ponavljanje regionu.
Ispitivali smo obrađene transkripte tracrRNK analizirajući zastupljene krajeve tracrRNK 5' unutar predviđene sekvence anti-ponavljanja i zastupljene zrele crRNK 3' krajeve (Slike 34 i 45). Kod svih vrsta identifikovali smo istaknute 5' krajeve tracrRNK ortologa koji bi mogli da budu rezultat koprocesiranja dupleksa tracrRNK:pre-crRNK ponovljenih dupleksa od strane RNase III. Takođe smo identifikovali obrađene 5'-krajeve crRNK koji su najverovatnije rezultat drugog događaja sazrevanja pretpostavljenim sečenjem, u skladu sa prethodnim zapažanjima. Važno je napomenuti da smo u blisko povezanim RNK parovima S. pyogenes, S. mutans i L. innocua, primetili isto mesto obrade oko baznog para G:C u sredini sekvence anti-ponavljanja. I kod S. mutans i kod L. innocua, otkrili smo dodatne istaknute krajeve tracrRNK 5' i crRNK 3' koji bi mogli da sugerišu dalje sečenje dupleksa tracrRNK:crRNl, pri čemu je 3'-kraj crRNK dodatno skraćen na već pomenuto 5 '-skraćivanje kraja, nakon prvog događaja obrade katalizovanog RNase III. Slično, kod C. jejuni smo pronašli samo malu količinu crRNK 3' krajeva koji bi odgovarali obrascima obrade RNase III i preuzeli odgovarajuće 5' krajeve obrađene tracrRNK. Prema tome, pretpostavljeno odsecanje tracrRNK:crRNK dupleksa nakon početnog brazdanja od strane RNase III bi rezultiralo kraćim ponovljenim delom u zrelim crRNK, proizvodeći kraće duplekse tracrRNK:crRNK stabilizovane trostrukim uparivanjem G:C baza za interakciju sa endonukleazom Cas9 i naknadno brazdanje ciljnih DNK. Čini se da je RNK dupleks N. meningitidis obrađen na dva primarna mesta dalje od 3' kraja CRISPR ponavljanja, što rezultira dugim ponovljenim delom u zreloj crRNK i stabilnom interakcijom RNK:RNK uprkos centralnom ispupčenju unutar dupleksa. Zanimljivo je da je tracrRNK:pre-crRNK dupleks F. novicida brazdan unutar regiona niske komplementarnosti i neki od dobijenih najzastupljenijih 5' krajeva tracrRNK sugerišu njeno dalje odsecanje bez istovremenog odsecanja crRNK. Razlike u veličinama primarnih transkripata i u lokaciji mesta za obradu rezultiraju različitim dužinama obrađenih tracrRNK u rasponu od ~65 do 85 nt. Koordinate i veličine istaknutih obrađenih tracrRNK transkripata prikazane su uTabeli 2 i na Slici 37. Uočeni obrasci obrade tracrRNK i crRNK su u dobrom skladu sa prethodno predloženim modelom dva događaja sazrevanja. Pretpostavljeno dalje odsecanje nekih od tracrRNK 5'-krajeva i crRNK 3'-krajeva može proizaći iz drugog događaja sazrevanja ili alternativno, biti artefakt pripreme biblioteke cDNK ili sekvenciranja RNK. Ostaje da se dalje istraži priroda ovih obrada.
Sekvence tracrRNK ortologa su veoma raznovrsne
Utvrđene su i sličnosti sekvenci odabranih tracrRNK ortologa. Izvršili smo višestruka poravnanja sekvenci primarnih tracrRNK transkripata S. pyogenes (samo oblik 89 nt), S. mutans, L. innocua i N. meningitidis (samo 110 nt form), S. thermophilus, P. multocida i M. mobile (Tabela 2, Slika 35). Primetili smo veliku raznolikost u sekvencama tracrRNK, ali značajnu konzervaciju sekvenci iz blisko povezanih CRISPR-Cas lokusa tracrRNK iz L. innocua, S. pyogenes, S. mutans i S. thermophiles dele u proseku 77% identičnosti, a tracrRNK iz N. meningitidis i P. multocida dele 82% identičnosti prema parovima. Prosečna identičnost analiziranih sekvenci tracrRNK je 56%, uporediva sa identičnosti nasumičnih sekvenci RNK. Ovo zapažanje dalje potvrđuje da se predviđanje tracrRNK ortologa na osnovu sličnosti sekvenci može izvršiti samo u slučaju blisko povezanih lokusa. Takođe smo tražili moguću konzervaciju strukture tracrRNK, ali nismo mogli da pronađemo nikakvu značajnu sličnost osim jedne ko-varijacije i očuvane strukture terminatora transkripcije (Slika 35).
Slika 35 prikazuje raznolikost sekvenci tracrRNK ortologa. višestruko poravnanje tracrRNK sekvence. S. thermophilus i S. thermophilus2, tracrRNK povezana sa SEQ ID NO:41 i SEQ ID NO:40 Cas9 ortolozima, shodno tome.
Crna, veoma očuvana; tamno siva, očuvana; svetlo siva, slabo očuvana.
Predviđena struktura konsenzusa je prikazana na vrhu poravnanja. Strelice pokazuju kovarijacije nukleotida. S. pyogenes SF370, S. mutans UA159, L. innocua Clip11262, C. jejuni NCTC 11168, F. novicida U112 i N. meningitidis A Z2491 tracrRNK su potvrđene sekvenciranjem RNK i Nortern blot analizom. S. thermophiles LMD-9 tracrRNK je potvrđena Nortern blot analizom. P. multocida Pm70 tracrRNK je predviđena na osnovu velike sličnosti lokusa CRISPR-Cas sa lokusom N. meningitidis A Z2491. M. mobile 163K tracrRNK je predviđena in silico na osnovu snažnih predviđanja transkripcionog promotera i terminatora.
Primer 4: Cas9 može da koristi veštačke vodeće RNK, koji ne postoje u prirodi, da izvrši brazdanje ciljne DNK
Veštačka crRNK i veštačka tracrRNK su dizajnirane na osnovu segmenta koji se vezuje za proteine transkripata S. pyogenes crRNK i tracrRNK, modifikovanih da oponašaju asimetrično ispupčenje unutar prirodnog S. pyogenes crRNK:tracrRNK dupleksa (pogledajte ispupčenje u proteinu domenu koji vezuje protein i veštačke (gore) i prirodne (donje) RNK molekule prikazane na Slici 39A). Veštačka tracrRNK sekvenca deli manje od 50% identičnosti sa prirodnom tracrRNK. Predviđena sekundarna struktura crRNK:tracrRNK dupleksa koji vezuje protein je ista za oba para RNK, ali je predviđena struktura ostatka RNK mnogo drugačija.
Slika 39 pokazuje da veštačke sekvence koje dele veoma malo (otprilike 50% identičnosti) sa prirodnim tracrRNK i crRNK mogu da funkcionišu sa Cas9 da brazdaju ciljnu DNK sve dok je struktura domena za vezivanje proteina RNK koji cilja na DNK očuvana. (A) Ko-preklapanje S. pyogenes tracrRNK i crRNK i veštačke tracrRNK i crRNK. (B) Kombinacije S. pyogenes Cas9 i tracrRNK:crRNK ortologa su korišćene za izvođenje testova brazdanja plazmidne DNK. Spy - S. pyogenes, Lin -L. innocua, Nme - N. meningitidis, Pmu- P. multocida. S. Pyogenes Cas9 može biti vođen nekim, ali ne svim tracrRNK:crRNK ortolozima koji se prirodno javljaju u odabranim bakterijskim vrstama. Značajno je da S. pyogenes Cas9 može biti vođen veštačkim parom tracrRNK:crRNK, koji je dizajniran na osnovu strukture segmenta koji se vezuje za proteine prirodne RNK ciljane na DNK koristeći sekvencu koja je potpuno nepovezana sa CRISPR sistemom.
Korišćena veštačka „tracrRNK“ (aktivatorska RNK) je 5'-GUUUUCCCUUUUCAAAGAAAUCUCCUGGGCACCUAUCUUCUUAGGUGCCC UCCCU UGUUUAAACCUGACCAGUUAACCGGCUGGUUAGGUUUUU-3' (SEQ ID NO: 1347). Upotrebljena veštačka „crRNK“ (ciljna RNK) je: 5'-GAGAUUUAUGAAAAGGGAAAAC-3' (SEQ ID NO: 1348).
Primer 5: Generacija neljudskih transgenih organizama
Transgeni miš koji eksprimira Cas9 (bilo nemodifikovan, modifikovan da ima smanjenu enzimsku aktivnost, modifikovan kao fuzioni protein za bilo koju od gore navedenih svrha) se generiše korišćenjem pogodnog postupka poznatog osobi sa uobičajenim znanjem u predmetnoj oblasti (npr. (i) ubacivanje gena na ciljani lokus (npr. ROSA 26) embrionalne matične ćelije miša (ES ćelija) praćeno injekcijom blastociste i stvaranjem himernih miševa; (ii) injekcija nasumično integrisanog transgena u pronukleus oplođenih mišjih oocita nakon čega sledi implantacija jajne ćelije u pseudo-trudnu ženku; itd.). Protein Cas9 je pod kontrolom promotera koji se eksprimira najmanje u embrionalnim matičnim ćelijama, i može biti dodatno pod vremenskom ili tkivno specifičnom kontrolom (npr. inducibilan lekom, kontrolisan sistemom promotora zasnovanom na Cre/Lox, itd.). Jednom kada se generiše linija transgenih miševa koji eksprimiraju Cas9, embrionalne matične ćelije se izoluju i uzgajaju, a u nekim slučajevima ES ćelije se zamrzavaju za buduću upotrebu. Pošto izolovane ES ćelije eksprimiraju Cas9 (a u nekim slučajevima je ekspresija pod vremenskom kontrolom (npr. inducibilna lekom), nove ćelije koje se nokautiraju ili ubacuju (a samim tim i miševi) se brzo stvaraju na bilo kom željenom mestu u genomu pomoću uvođenja odgovarajuće dizajnirane RNK koja cilja na DNK koja cilja Cas9 na određeni lokus po izboru. Takav sistem, i mnoge njegove varijacije, koriste se za generisanje novih genetski modifikovanih organizama na bilo kom mestu po izboru. Kada se modifikovani Cas9 koristi za modulaciju transkripcije i/ili modifikovanje DNK i/ili modifikovanje polipeptida povezanih sa DNK, same ES ćelije (ili bilo koje diferencirane ćelije izvedene iz ES ćelija (npr. ceo miš, diferencirana ćelijska linija, itd.) se koriste za proučavanje svojstava bilo kog gena po izboru (ili bilo kog ekspresionog produkta po izboru, ili bilo kog genomskog lokusa po izboru) jednostavnim uvođenjem odgovarajuće RNK koja cilja na DNK u željenu ćeliju koja ekspresuje Cas9.
_____________________

Claims (25)

PATENTNI ZAHTEVI
1. Jednomolekulska DNK ciljana RNK koja se vezuje za modifikovani polipeptid usmeren na mesto i cilja pomenuti modifikovani polipeptid usmeren na mesto na određenu lokaciju unutar ciljne DNK, pri čemu pomenuta jednomolekulska DNK ciljana RNK sadrži:
(a) segment koji cilja DNK koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja je komplementarna sekvenci u ciljnoj DNK, i
(b) segment za vezivanje proteina koji stupa u interakciju sa navedenim polipeptidom za modifikovanje usmerenim na mesto koji je prirodna Cas9 endonukleaza, pri čemu segment koji se vezuje za protein sadrži dva komplementarna dela nukleotida koji se hibridizuju da bi formirali dupleks RNK (dsRNA) i
pri čemu pomenuta jednomolekulska DNK ciljana RNK, zajedno sa navedenim polipeptidom za modifikovanje usmerenom na mesto, koji je prirodna Cas9 endonukleaza, obezbeđuje mesto-specifično cepanje navedene ciljne DNK da bi se stvorio dvolančani prekid.
2. Jednomolekulska DNK ciljana RNK prema patentnom zahtevu 1, pri čemu je navedena nukleotidna sekvenca navedenog segmenta ciljanog DNK koja je komplementarna sekvenci u navedenoj ciljnoj DNK veća od 15 nukleotida.
3. Jednomolekulska DNK ciljana RNK koja se vezuje za modifikovani polipeptid usmeren na mesto i cilja pomenuti modifikovani polipeptid usmeren na mesto na određenu lokaciju unutar ciljne DNK, pri čemu pomenuta jednomolekulska DNK ciljana RNK sadrži:
(a) segment koji cilja na DNK koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja je komplementarna ciljanoj sekvenci u ciljnoj DNK, i
(b) segment za vezivanje proteina koji stupa u interakciju sa navedenim polipeptidom za modifikovanje usmerenim na mesto koji je prirodna Cas9 endonukleaza, pri čemu segment koji se vezuje za protein sadrži dva komplementarna dela nukleotida koji se hibridizuju da bi formirali dupleks RNK (dsRNA),
pri čemu navedena nukleotidna sekvenca koja je komplementarna sekvenci u navedenoj ciljnoj DNK ima više od 15 nukleotida.
4. Jednomolekulska DNK ciljana RNK prema patentnom zahtevu 3,
pri čemu pomenuta jednomolekulska DNK ciljana RNK, zajedno sa navedenim polipeptidom za modifikovanje usmerenom na mesto, koji je prirodna Cas9 endonukleaza, obezbeđuje mesto-specifično cepanje navedene ciljne DNK da bi se stvorio dvolančani prekid.
5. Jednomolekulska DNK ciljana RNK prema bilo kom od patentnih zahteva 1 i 4, pri čemu je pomenuta jednomolekulska DNK ciljana RNK koja obezbeđuje specifičnost kompleksa formiranog od navedene RNK koja cilja na DNK i navedene endonukleaze Cas9 koja se nalazi u prirodi, za ciljnu DNK sekvencom segmenta ciljanog DNK koji je komplementaran sekvenci u ciljnoj DNK, i pri čemu je pomenuta prirodna Cas9 endonukleaza pomenutog kompleksa koja obezbeđuje nukleaznu aktivnost navedenom kompleksu, čija aktivnost nukleaze cepa ciljnu DNK na ciljnoj DNK sekvenci definisanoj regionom komplementarnosti između RNK koja cilja DNK i ciljne DNK.
6. Jednomolekulska DNK ciljana RNK prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5, pri čemu su pomenuta dva komplementarna dela nukleotida kovalentno povezana interventnim nukleotidima.
7. Jednomolekulska DNK ciljana RNK prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 6, pri čemu prvi od dva komplementarna dela pomenutog segmenta koji se vezuje za protein sadrži ponovljeni deo crRNK i pri čemu drugi od dva komplementarna dela pomenutog segmenta koji se vezuje za protein sadrži deo tracrRNA.
8. Jednomolekulska DNK ciljana RNK prema patentnom zahtevu 7, pri čemu su pomenuti ponovljeni deo crRNA i navedeni deo tracrRNA od S. pyogenes.
9. Jednomolekulska DNK ciljana RNK prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 8, pri čemu je navedena prirodna Cas9 endonukleaza iz S. pyogenes.
10. Jednomolekulska DNK ciljana RNK prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 9, pri čemu jednomolekuska DNK ciljana RNK sadrži modifikacije nukleinske kiseline izabrane iz grupe koju čine modifikovane okosnice i modifikovane internukleozidne veze, mimetike nukleinske kiseline, modifikovane delove šećera, modifikacije i supstitucije baze i konjugati.
11. DNK polinukleotid koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira RNK ciljanu na DNK prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 9.
12. Rekombinantni ekspresioni vektor koji sadrži DNK polinukleotid prema patentnom zahtevu 11.
13. Rekombinantni ekspresioni vektor prema patentnom zahtevu 12, pri čemu je nukleotidna sekvenca koja kodira RNK koja cilja DNK operativno povezana sa promoterom.
14. Rekombinantni ekspresioni vektor prema patentnom zahtevu 13, pri čemu je promoter inducibilni promoter.
15. DNK ciljana RNK koja se vezuje za modifikovani polipeptid usmeren na mesto i cilja pomenuti modifikovani polipeptid usmeren na mesto na određenu lokaciju unutar ciljne DNK, pri čemu pomenuta DNK ciljana RNK sadrži:
(a) segment koji cilja na DNK koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja je komplementarna ciljanoj sekvenci u ciljnoj DNK, i
(b) segment za vezivanje proteina koji stupa u interakciju sa navedenim polipeptidom za modifikovanje usmerenim na mesto koji je prirodna Cas9 endonukleaza, pri čemu segment koji se vezuje za protein sadrži dva komplementarna dela nukleotida koji se hibridizuju da bi formirali dupleks RNK (dsRNA),
pri čemu RNK ciljana na DNK sadrži modifikacije nukleinske kiseline izabrane iz grupe koju čine modifikovane okosnice i modifikovane internukleozidne veze, mimetike nukleinske kiseline, modifikovane delove šećera, modifikacije i supstitucije baze i konjugati.
16. DNK ciljana RNK prema patentnom zahtevu 15, pri čemu je navedena RNK ciljana na DNK RNK koja cilja DNK sa dvostrukim molekulom.
17. DNK ciljana RNK prema patentnom zahtevu 15, pri čemu je navedena RNK ciljana na DNK RNK koja cilja DNK sa jednim molekulom.
18. Jednomolekulska DNK ciljana RNK prema patentnom zahtevu 17, pri čemu su pomenuta dva komplementarna dela nukleotida kovalentno povezana interventnim nukleotidima.
19. DNK ciljana RNK prema bilo kom od patentnih zahteva 15 do 18,
pri čemu pomenuta DNK ciljana RNK, zajedno sa navedenim polipeptidom za modifikovanje usmerenom na mesto, koji je prirodna Cas9 endonukleaza, obezbeđuje mesto-specifično cepanje navedene ciljne DNK da bi se stvorio dvolančani prekid.
20. DNK ciljana RNK prema patentnom zahtevu 18,
pri čemu je pomenuta RNK ciljana na DNK koja obezbeđuje specifičnost kompleksa formiranog od pomenute RNK ciljane DNK i navedene endonukleaze Cas9 koja se javlja u prirodi, za ciljnu DNK sekvencom segmenta ciljanog DNK koji je komplementaran sekvenci u ciljnoj DNK, i
pri čemu je navedena prirodna Cas9 endonukleaza navedenog kompleksa koja obezbeđuje nukleaznu aktivnost navedenom kompleksu čija aktivnost nukleaze cepa ciljnu DNK na ciljnoj DNK sekvenci definisanoj regionom komplementarnosti između RNK ciljane DNK i ciljne DNK.
21. DNK ciljana RNK prema bilo kom od patentnih zahteva 15 do 20, pri čemu prvi od dva komplementarna dela pomenutog segmenta koji se vezuje za protein sadrži ponovljeni deo crRNK i pri čemu drugi od dva komplementarna dela pomenutog segmenta koji se vezuje za protein sadrži deo tracrRNA.
22. DNK ciljana RNK prema patentnom zahtevu 21, pri čemu su pomenuti ponovljeni deo crRNA i navedeni deo tracrRNA od S. pyogenes.
23. DNK ciljana RNK prema bilo kom od patentnih zahteva 15 do 22, pri čemu je navedena prirodna Cas9 endonukleaza iz S. pyogenes.
24. Kompleks koji se formira od
(i) jednomolekulske DNK ciljane RNK prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 10 ili RNK koja cilja DNK prema bilo kom od patentnih zahteva 15 do 23 i
(ii) polipeptida za modifikovanje koji je usmeren na mesto koji je prirodna Cas9 endonukleaza.
25. Kompozicija koja se sastoji od:
(i) jednomolekulske DNK ciljane RNK prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 10 ili RNK koja cilja DNK prema bilo kom od patentnih zahteva 15 do 23 i
(ii) polipeptida za modifikovanje koji je usmeren na mesto koji je prirodna Cas9 endonukleaza.
RS20250443A 2012-05-25 2013-03-15 Postupci i kompozicije za modifikaciju ciljane dnk upravljenu pomoću rnk i za modulaciju transkripcije upravljanu rnk RS66774B1 (sr)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261652086P 2012-05-25 2012-05-25
US201261716256P 2012-10-19 2012-10-19
US201361757640P 2013-01-28 2013-01-28
US201361765576P 2013-02-15 2013-02-15
EP23187511.3A EP4289948B1 (en) 2012-05-25 2013-03-15 Methods and compositions for rna-directed target dna modification and for rna-directed modulation of transcription

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS66774B1 true RS66774B1 (sr) 2025-05-30

Family

ID=49624232

Family Applications (5)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20230851A RS64622B1 (sr) 2012-05-25 2013-03-15 Metode i sastavi za modifikaciju ciljane dnk upravljenu pomoću rnk i za modulaciju transkripcije upravljanu rnk
RSP20190673 RS59199B1 (sr) 2012-05-25 2013-03-15 Metode i jedinjenja za rnk-upravljanu ciljanu dnk modifikaciju i za rnk- upravljanu modulaciju transkripta
RS20170783A RS56119B1 (sr) 2012-05-25 2013-03-15 Postupci i sastavi za rnk-usmerenu modifikaciju ciljane dnk i za rnk-usmerenu modulaciju transkripcije
RS20250443A RS66774B1 (sr) 2012-05-25 2013-03-15 Postupci i kompozicije za modifikaciju ciljane dnk upravljenu pomoću rnk i za modulaciju transkripcije upravljanu rnk
RS20180482A RS57287B1 (sr) 2012-05-25 2013-03-15 Postupci i sastavi za rnk-usmerenu modifikaciju ciljane dnk i za rnk-usmerenu modulaciju transkripcije

Family Applications Before (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20230851A RS64622B1 (sr) 2012-05-25 2013-03-15 Metode i sastavi za modifikaciju ciljane dnk upravljenu pomoću rnk i za modulaciju transkripcije upravljanu rnk
RSP20190673 RS59199B1 (sr) 2012-05-25 2013-03-15 Metode i jedinjenja za rnk-upravljanu ciljanu dnk modifikaciju i za rnk- upravljanu modulaciju transkripta
RS20170783A RS56119B1 (sr) 2012-05-25 2013-03-15 Postupci i sastavi za rnk-usmerenu modifikaciju ciljane dnk i za rnk-usmerenu modulaciju transkripcije

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20180482A RS57287B1 (sr) 2012-05-25 2013-03-15 Postupci i sastavi za rnk-usmerenu modifikaciju ciljane dnk i za rnk-usmerenu modulaciju transkripcije

Country Status (41)

Country Link
US (107) US10266850B2 (sr)
EP (7) EP4043564A1 (sr)
JP (6) JP6343605B2 (sr)
KR (2) KR20170134766A (sr)
CN (2) CN104854241B (sr)
AU (5) AU2013266968B2 (sr)
BR (1) BR112014029441B1 (sr)
CA (1) CA2872241C (sr)
CL (1) CL2014003208A1 (sr)
CO (1) CO7151523A2 (sr)
CR (1) CR20140538A (sr)
CY (3) CY1119282T1 (sr)
DE (3) DE202013012241U1 (sr)
DK (5) DK2800811T3 (sr)
EA (1) EA038924B1 (sr)
EC (1) ECSP14028704A (sr)
ES (5) ES2960803T3 (sr)
FI (2) FI3597749T3 (sr)
GB (3) GB2518764C (sr)
GE (1) GEP20217251B (sr)
HK (1) HK1204003A1 (sr)
HR (5) HRP20231042T1 (sr)
HU (3) HUE043861T2 (sr)
IL (8) IL235461B (sr)
LT (5) LT3401400T (sr)
MA (1) MA37663B1 (sr)
ME (2) ME02836B (sr)
MX (4) MX362866B (sr)
MY (2) MY189533A (sr)
NZ (2) NZ728024A (sr)
PE (4) PE20150336A1 (sr)
PH (1) PH12014502574B1 (sr)
PL (5) PL2800811T3 (sr)
PT (5) PT2800811T (sr)
RS (5) RS64622B1 (sr)
SG (3) SG10201809817UA (sr)
SI (5) SI3401400T1 (sr)
TN (1) TN2014000493A1 (sr)
TR (1) TR201806812T4 (sr)
UA (1) UA118014C2 (sr)
WO (1) WO2013176772A1 (sr)

Families Citing this family (1643)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2401367B1 (en) 2009-02-26 2016-11-30 Transposagen Biopharmaceuticals, Inc. Hyperactive piggybac transposases
CN102638971B (zh) 2009-07-08 2015-10-07 科马布有限公司 动物模型及治疗分子
US9445581B2 (en) 2012-03-28 2016-09-20 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
US9585920B2 (en) 2011-02-04 2017-03-07 Katherine Rose Kovarik Method and system for treating cancer cachexia
US9457077B2 (en) 2009-11-18 2016-10-04 Katherine Rose Kovarik Method and system for targeting the microbiome to promote health and treat allergic and inflammatory diseases
WO2011140441A2 (en) 2010-05-06 2011-11-10 Children's Hospital Medical Center Methods and systems for converting precursor cells into intestinal tissues through directed differentiation
US10085938B2 (en) 2011-02-04 2018-10-02 Joseph E. Kovarik Method and system for preventing sore throat in humans
US10583033B2 (en) 2011-02-04 2020-03-10 Katherine Rose Kovarik Method and system for reducing the likelihood of a porphyromonas gingivalis infection in a human being
US10111913B2 (en) 2011-02-04 2018-10-30 Joseph E. Kovarik Method of reducing the likelihood of skin cancer in an individual human being
US11357722B2 (en) 2011-02-04 2022-06-14 Seed Health, Inc. Method and system for preventing sore throat in humans
US11844720B2 (en) 2011-02-04 2023-12-19 Seed Health, Inc. Method and system to reduce the likelihood of dental caries and halitosis
US10940169B2 (en) 2015-11-30 2021-03-09 Joseph E. Kovarik Method for reducing the likelihood of developing cancer in an individual human being
US11273187B2 (en) 2015-11-30 2022-03-15 Joseph E. Kovarik Method and system for reducing the likelihood of developing depression in an individual
US12279989B2 (en) 2011-02-04 2025-04-22 Seed Health, Inc. Method and system for increasing beneficial bacteria and decreasing pathogenic bacteria in the oral cavity
US10842834B2 (en) 2016-01-06 2020-11-24 Joseph E. Kovarik Method and system for reducing the likelihood of developing liver cancer in an individual diagnosed with non-alcoholic fatty liver disease
US10086018B2 (en) 2011-02-04 2018-10-02 Joseph E. Kovarik Method and system for reducing the likelihood of colorectal cancer in a human being
US12257272B2 (en) 2015-12-24 2025-03-25 Seed Health, Inc. Method and system for reducing the likelihood of developing depression in an individual
US11998479B2 (en) 2011-02-04 2024-06-04 Seed Health, Inc. Method and system for addressing adverse effects on the oral microbiome and restoring gingival health caused by sodium lauryl sulphate exposure
US11951139B2 (en) 2015-11-30 2024-04-09 Seed Health, Inc. Method and system for reducing the likelihood of osteoporosis
US11191665B2 (en) 2011-02-04 2021-12-07 Joseph E. Kovarik Method and system for reducing the likelihood of a porphyromonas gingivalis infection in a human being
US11951140B2 (en) 2011-02-04 2024-04-09 Seed Health, Inc. Modulation of an individual's gut microbiome to address osteoporosis and bone disease
US9730967B2 (en) 2011-02-04 2017-08-15 Katherine Rose Kovarik Method and system for treating cancer cachexia
US11419903B2 (en) 2015-11-30 2022-08-23 Seed Health, Inc. Method and system for reducing the likelihood of osteoporosis
US10010568B2 (en) 2011-02-04 2018-07-03 Katherine Rose Kovarik Method and system for reducing the likelihood of a spirochetes infection in a human being
US10835560B2 (en) 2013-12-20 2020-11-17 Joseph E. Kovarik Reducing the likelihood of skin cancer in an individual human being
US12533312B2 (en) 2011-02-04 2026-01-27 Seed Health, Inc. Method and system for preventing sore throat in humans
US10548761B2 (en) 2011-02-04 2020-02-04 Joseph E. Kovarik Method and system for reducing the likelihood of colorectal cancer in a human being
US10314865B2 (en) 2011-02-04 2019-06-11 Katherine Rose Kovarik Method and system for treating cancer and other age-related diseases by extending the healthspan of a human
US10512661B2 (en) 2011-02-04 2019-12-24 Joseph E. Kovarik Method and system for reducing the likelihood of developing liver cancer in an individual diagnosed with non-alcoholic fatty liver disease
US9987224B2 (en) 2011-02-04 2018-06-05 Joseph E. Kovarik Method and system for preventing migraine headaches, cluster headaches and dizziness
US11523934B2 (en) 2011-02-04 2022-12-13 Seed Health, Inc. Method and system to facilitate the growth of desired bacteria in a human's mouth
US10245288B2 (en) 2011-02-04 2019-04-02 Joseph E. Kovarik Method and system for reducing the likelihood of developing NASH in an individual diagnosed with non-alcoholic fatty liver disease
US10687975B2 (en) 2011-02-04 2020-06-23 Joseph E. Kovarik Method and system to facilitate the growth of desired bacteria in a human's mouth
EP2689019A2 (en) 2011-03-23 2014-01-29 Pioneer Hi-Bred International Inc. Methods for producing a complex transgenic trait locus
JP6165723B2 (ja) 2011-06-30 2017-07-19 アローヘッド ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド Ｂ型肝炎ウイルスの遺伝子発現を阻害するための組成物および方法
WO2013066438A2 (en) 2011-07-22 2013-05-10 President And Fellows Of Harvard College Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity
AU2012311286B2 (en) 2011-09-19 2018-07-26 Kymab Limited Antibodies, variable domains and chains tailored for human use
WO2013045916A1 (en) 2011-09-26 2013-04-04 Kymab Limited Chimaeric surrogate light chains (slc) comprising human vpreb
EP3604555B1 (en) 2011-10-14 2024-12-25 President and Fellows of Harvard College Sequencing by structure assembly
US9253965B2 (en) 2012-03-28 2016-02-09 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
US10465042B2 (en) 2011-12-02 2019-11-05 Yale University Poly(amine-co-ester) nanoparticles and methods of use thereof
EP2790708B1 (en) * 2011-12-16 2024-10-23 Targetgene Biotechnologies Ltd. Compositions and methods for modifying a predetermined target nucleic acid sequence
WO2014163886A1 (en) 2013-03-12 2014-10-09 President And Fellows Of Harvard College Method of generating a three-dimensional nucleic acid containing matrix
ES2991004T3 (es) 2011-12-22 2024-12-02 Harvard College Métodos para la detección de analitos
GB201122458D0 (en) 2011-12-30 2012-02-08 Univ Wageningen Modified cascade ribonucleoproteins and uses thereof
US9637739B2 (en) * 2012-03-20 2017-05-02 Vilnius University RNA-directed DNA cleavage by the Cas9-crRNA complex
US10251377B2 (en) 2012-03-28 2019-04-09 Kymab Limited Transgenic non-human vertebrate for the expression of class-switched, fully human, antibodies
GB2502127A (en) 2012-05-17 2013-11-20 Kymab Ltd Multivalent antibodies and in vivo methods for their production
RU2645475C2 (ru) 2012-04-25 2018-02-21 Регенерон Фармасьютикалз, Инк. Опосредованное нуклеазой нацеливание с большими нацеливающими векторами
WO2013163628A2 (en) 2012-04-27 2013-10-31 Duke University Genetic correction of mutated genes
LT3401400T (lt) 2012-05-25 2019-06-10 The Regents Of The University Of California Būdai ir kompozicijos, skirtos rnr molekulės nukreipiamai tikslinės dnr modifikacijai ir rnr molekulės nukreipiamam transkripcijos moduliavimui
WO2013177560A1 (en) 2012-05-25 2013-11-28 The Regents Of The University Of California Microfluidic systems for particle trapping and separation
MX2014015204A (es) * 2012-06-12 2015-08-07 Genentech Inc Metodos y composiciones para generar alelos con inactivacion condicional.
US20150225734A1 (en) 2012-06-19 2015-08-13 Regents Of The University Of Minnesota Gene targeting in plants using dna viruses
JP2015527889A (ja) * 2012-07-25 2015-09-24 ザ ブロード インスティテュート， インコーポレイテッド 誘導可能なｄｎａ結合タンパク質およびゲノム撹乱ツール、ならびにそれらの適用
PL4397760T3 (pl) * 2012-10-23 2026-03-30 Toolgen Incorporated Kompozycja do rozszczepiania docelowego dna zawierająca prowadzące rna specyficzne dla docelowego dna i kwas nukleinowy kodujący białko cas lub białko cas oraz jej zastosowanie
KR102539173B1 (ko) * 2012-10-23 2023-06-02 주식회사 툴젠 표적 DNA에 특이적인 가이드 RNA 및 Cas 단백질을 암호화하는 핵산 또는 Cas 단백질을 포함하는, 표적 DNA를 절단하기 위한 조성물 및 이의 용도
AU2013344375B2 (en) 2012-11-16 2017-09-14 Transposagen Biopharmaceuticals, Inc. Site-specific enzymes and methods of use
AU2013352156B2 (en) 2012-11-27 2018-12-06 Children's Medical Center Corporation Targeting BCL11A distal regulatory elements for fetal hemoglobin reinduction
EP3135765A1 (en) 2012-12-06 2017-03-01 Sigma-Aldrich Co. LLC Crispr-based genome modification and regulation
EP2896697B1 (en) * 2012-12-12 2015-09-02 The Broad Institute, Inc. Engineering of systems, methods and optimized guide compositions for sequence manipulation
IL239317B (en) * 2012-12-12 2022-07-01 Broad Inst Inc Providing, engineering and optimizing systems, methods and compositions for sequence manipulation and therapeutic applications
WO2014093701A1 (en) * 2012-12-12 2014-06-19 The Broad Institute, Inc. Functional genomics using crispr-cas systems, compositions, methods, knock out libraries and applications thereof
JP2016504026A (ja) * 2012-12-12 2016-02-12 ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッド 配列操作のための系、方法および最適化ガイド組成物のエンジニアリング
EP2931898B1 (en) 2012-12-12 2016-03-09 The Broad Institute, Inc. Engineering and optimization of systems, methods and compositions for sequence manipulation with functional domains
US8697359B1 (en) 2012-12-12 2014-04-15 The Broad Institute, Inc. CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products
US20140310830A1 (en) 2012-12-12 2014-10-16 Feng Zhang CRISPR-Cas Nickase Systems, Methods And Compositions For Sequence Manipulation in Eukaryotes
EP3434776A1 (en) 2012-12-12 2019-01-30 The Broad Institute, Inc. Methods, models, systems, and apparatus for identifying target sequences for cas enzymes or crispr-cas systems for target sequences and conveying results thereof
CN114634950A (zh) 2012-12-12 2022-06-17 布罗德研究所有限公司 用于序列操纵的crispr-cas组分系统、方法以及组合物
ES2576126T3 (es) 2012-12-12 2016-07-05 The Broad Institute, Inc. Modificación por tecnología genética y optimización de sistemas, métodos y composiciones enzimáticas mejorados para la manipulación de secuencias
SG10201912991WA (en) 2012-12-17 2020-03-30 Harvard College Rna-guided human genome engineering
EP3919505B1 (en) 2013-01-16 2023-08-30 Emory University Uses of cas9-nucleic acid complexes
US10660943B2 (en) 2013-02-07 2020-05-26 The Rockefeller University Sequence specific antimicrobials
US11135273B2 (en) 2013-02-07 2021-10-05 The Rockefeller University Sequence specific antimicrobials
CN103981147B (zh) 2013-02-08 2017-11-10 中国科学院上海生命科学研究院 一种新的制备肝实质细胞的方法
WO2014125668A1 (ja) * 2013-02-14 2014-08-21 国立大学法人大阪大学 内在性dna配列特異的結合分子を用いる特定ゲノム領域の単離方法
US20140235933A1 (en) 2013-02-20 2014-08-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Genetic modification of rats
JP2016507244A (ja) 2013-02-27 2016-03-10 ヘルムホルツ・ツェントルム・ミュンヒェン・ドイチェス・フォルシュンクスツェントルム・フューア・ゲズントハイト・ウント・ウムベルト（ゲーエムベーハー）Ｈｅｌｍｈｏｌｔｚ Ｚｅｎｔｒｕｍ ＭｕｅｎｃｈｅｎＤｅｕｔｓｃｈｅｓ Ｆｏｒｓｃｈｕｎｇｓｚｅｎｔｒｕｍ ｆｕｅｒ Ｇｅｓｕｎｄｈｅｉｔ ｕｎｄ Ｕｍｗｅｌｔ （ＧｍｂＨ） Ｃａｓ９ヌクレアーゼによる卵母細胞における遺伝子編集
SG11201507378UA (en) * 2013-03-14 2015-10-29 Caribou Biosciences Inc Compositions and methods of nucleic acid-targeting nucleic acids
PL2966984T3 (pl) 2013-03-15 2022-06-13 Cibus Us Llc Ukierunkowana modyfikacja genu z użyciem naprawy genu, w której pośredniczy oligonukleotyd
US10760064B2 (en) 2013-03-15 2020-09-01 The General Hospital Corporation RNA-guided targeting of genetic and epigenomic regulatory proteins to specific genomic loci
US20140273235A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 Regents Of The University Of Minnesota ENGINEERING PLANT GENOMES USING CRISPR/Cas SYSTEMS
US9957515B2 (en) 2013-03-15 2018-05-01 Cibus Us Llc Methods and compositions for targeted gene modification
US12331303B2 (en) 2013-03-15 2025-06-17 Cibus Us Llc Methods and compositions for increasing efficiency of targeted gene modification using oligonucleotide-mediated gene repair
LT3527068T (lt) * 2013-03-15 2022-08-10 Cibus Us Llc Būdai ir kompozicijos, skirti padidinti tikslinės geno modifikacijos efektyvumą, panaudojant geno reparaciją, kuriai tarpininkauja oligonukleotidas
WO2014204578A1 (en) 2013-06-21 2014-12-24 The General Hospital Corporation Using rna-guided foki nucleases (rfns) to increase specificity for rna-guided genome editing
US9234213B2 (en) * 2013-03-15 2016-01-12 System Biosciences, Llc Compositions and methods directed to CRISPR/Cas genomic engineering systems
US20140273230A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 Sigma-Aldrich Co., Llc Crispr-based genome modification and regulation
US10378027B2 (en) * 2013-03-15 2019-08-13 The General Hospital Corporation RNA-guided targeting of genetic and epigenomic regulatory proteins to specific genomic loci
US20140349400A1 (en) * 2013-03-15 2014-11-27 Massachusetts Institute Of Technology Programmable Modification of DNA
US9788534B2 (en) 2013-03-18 2017-10-17 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
US9828582B2 (en) 2013-03-19 2017-11-28 Duke University Compositions and methods for the induction and tuning of gene expression
WO2014172470A2 (en) * 2013-04-16 2014-10-23 Whitehead Institute For Biomedical Research Methods of mutating, modifying or modulating nucleic acid in a cell or nonhuman mammal
DK2986729T3 (en) 2013-04-16 2018-10-29 Regeneron Pharma TARGETED MODIFICATION OF ROOT THROUGH
US9783618B2 (en) 2013-05-01 2017-10-10 Kymab Limited Manipulation of immunoglobulin gene diversity and multi-antibody therapeutics
US11707056B2 (en) 2013-05-02 2023-07-25 Kymab Limited Animals, repertoires and methods
US9783593B2 (en) 2013-05-02 2017-10-10 Kymab Limited Antibodies, variable domains and chains tailored for human use
CA2910427C (en) * 2013-05-10 2024-02-20 Sangamo Biosciences, Inc. Delivery methods and compositions for nuclease-mediated genome engineering
WO2014186435A2 (en) 2013-05-14 2014-11-20 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Compositions and methods for reducing neointima formation
EP3730615A3 (en) * 2013-05-15 2020-12-09 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for treatment of a genetic condition
WO2014186686A2 (en) * 2013-05-17 2014-11-20 Two Blades Foundation Targeted mutagenesis and genome engineering in plants using rna-guided cas nucleases
WO2014190181A1 (en) * 2013-05-22 2014-11-27 Northwestern University Rna-directed dna cleavage and gene editing by cas9 enzyme from neisseria meningitidis
EP3004339B1 (en) * 2013-05-29 2021-07-07 Cellectis New compact scaffold of cas9 in the type ii crispr system
ES2670531T3 (es) * 2013-05-29 2018-05-30 Cellectis S.A. Un método para producir una escisión de ADN precisa utilizando la actividad nickasa de Cas9
US11414695B2 (en) 2013-05-29 2022-08-16 Agilent Technologies, Inc. Nucleic acid enrichment using Cas9
US20140356956A1 (en) 2013-06-04 2014-12-04 President And Fellows Of Harvard College RNA-Guided Transcriptional Regulation
SG10201710030QA (en) 2013-06-04 2018-01-30 Harvard College Rna-guided transcriptional regulation
ES3029138T3 (en) * 2013-06-05 2025-06-23 Univ Duke Rna-guided gene editing and gene regulation
US9982277B2 (en) 2013-06-11 2018-05-29 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for target DNA modification
JP2016521561A (ja) 2013-06-14 2016-07-25 セレクティス 植物における非トランスジェニックのゲノム編集のための方法
MX2015017312A (es) 2013-06-17 2017-04-10 Broad Inst Inc Suministro y uso de composiciones, vectores y sistemas crispr-cas para la modificación dirigida y terapia hepáticas.
CN105793425B (zh) 2013-06-17 2021-10-26 布罗德研究所有限公司 使用病毒组分靶向障碍和疾病的crispr-cas系统和组合物的递送、用途和治疗应用
JP6665088B2 (ja) 2013-06-17 2020-03-13 ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッド 配列操作のための最適化されたＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ二重ニッカーゼ系、方法および組成物
EP3725885A1 (en) 2013-06-17 2020-10-21 The Broad Institute, Inc. Functional genomics using crispr-cas systems, compositions methods, screens and applications thereof
WO2014204724A1 (en) * 2013-06-17 2014-12-24 The Broad Institute Inc. Delivery, engineering and optimization of tandem guide systems, methods and compositions for sequence manipulation
JP6738729B2 (ja) * 2013-06-17 2020-08-12 ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッド 分裂終了細胞の疾患および障害をターゲティングおよびモデリングするための系、方法および組成物の送達、エンジニアリングおよび最適化
KR20260047646A (ko) * 2013-07-09 2026-04-08 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 멀티플렉스 rna-가이드된 게놈 조작
BR112016000571B1 (pt) 2013-07-10 2023-12-26 President And Fellows Of Harvard College Métodos in vitro para modular a expressão e para alterar um ou mais ácidos nucleicos alvo em uma célula simultaneamente com a regulação da expressão de um ou mais ácidos nucleicos alvo em uma célula, bem como célula de levedura ou bactéria compreendendo ácidos nucleicos
JP6482546B2 (ja) * 2013-07-19 2019-03-13 ラリクス・バイオサイエンス・リミテッド・ライアビリティ・カンパニーＬａｒｉｘ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ， Ｌｌｃ 二重対立遺伝子ノックアウトを生成するための方法および組成物
US10563225B2 (en) 2013-07-26 2020-02-18 President And Fellows Of Harvard College Genome engineering
US10421957B2 (en) 2013-07-29 2019-09-24 Agilent Technologies, Inc. DNA assembly using an RNA-programmable nickase
US9944925B2 (en) 2013-08-02 2018-04-17 Enevolv, Inc. Processes and host cells for genome, pathway, and biomolecular engineering
US20150044192A1 (en) 2013-08-09 2015-02-12 President And Fellows Of Harvard College Methods for identifying a target site of a cas9 nuclease
US20150044772A1 (en) * 2013-08-09 2015-02-12 Sage Labs, Inc. Crispr/cas system-based novel fusion protein and its applications in genome editing
CA3221516A1 (en) 2013-08-22 2015-02-26 E. I. Du Pont De Nemours And Company Plant genome modification using guide rna/cas endonuclease systems and methods of use
US9359599B2 (en) 2013-08-22 2016-06-07 President And Fellows Of Harvard College Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof
US10760065B2 (en) * 2013-09-05 2020-09-01 Massachusetts Institute Of Technology Tuning microbial populations with programmable nucleases
US9388430B2 (en) 2013-09-06 2016-07-12 President And Fellows Of Harvard College Cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof
US9340799B2 (en) * 2013-09-06 2016-05-17 President And Fellows Of Harvard College MRNA-sensing switchable gRNAs
US9526784B2 (en) 2013-09-06 2016-12-27 President And Fellows Of Harvard College Delivery system for functional nucleases
IL312865B2 (en) 2013-09-11 2025-06-01 Eagle Biologics Inc Liquid protein formulations containing viscosity-lowering agents
ES2844174T3 (es) 2013-09-18 2021-07-21 Kymab Ltd Métodos, células y organismos
CA2925723A1 (en) 2013-10-01 2015-04-09 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
WO2015065964A1 (en) 2013-10-28 2015-05-07 The Broad Institute Inc. Functional genomics using crispr-cas systems, compositions, methods, screens and applications thereof
WO2015066119A1 (en) 2013-10-30 2015-05-07 North Carolina State University Compositions and methods related to a type-ii crispr-cas system in lactobacillus buchneri
MX358066B (es) * 2013-11-04 2018-08-03 Dow Agrosciences Llc Óptimos loci de soya.
US10752906B2 (en) * 2013-11-05 2020-08-25 President And Fellows Of Harvard College Precise microbiota engineering at the cellular level
CN106459995B (zh) 2013-11-07 2020-02-21 爱迪塔斯医药有限公司 使用统治型gRNA的CRISPR相关方法和组合物
WO2015070062A1 (en) * 2013-11-07 2015-05-14 Massachusetts Institute Of Technology Cell-based genomic recorded accumulative memory
CA2930877A1 (en) * 2013-11-18 2015-05-21 Crispr Therapeutics Ag Crispr-cas system materials and methods
US10787684B2 (en) * 2013-11-19 2020-09-29 President And Fellows Of Harvard College Large gene excision and insertion
US9074199B1 (en) 2013-11-19 2015-07-07 President And Fellows Of Harvard College Mutant Cas9 proteins
WO2015088643A1 (en) 2013-12-11 2015-06-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for the targeted modification of a genome
PT3080279T (pt) 2013-12-11 2018-12-17 Regeneron Pharma Métodos e composições para a modificação direcionada de um genoma
WO2015089486A2 (en) 2013-12-12 2015-06-18 The Broad Institute Inc. Systems, methods and compositions for sequence manipulation with optimized functional crispr-cas systems
BR112016013547A2 (pt) * 2013-12-12 2017-10-03 Broad Inst Inc Composições e métodos de uso de sistemas crispr-cas em distúrbios de repetições de nucleotídeos
EP3835419A1 (en) * 2013-12-12 2021-06-16 The Regents of The University of California Methods and compositions for modifying a single stranded target nucleic acid
US20150166984A1 (en) * 2013-12-12 2015-06-18 President And Fellows Of Harvard College Methods for correcting alpha-antitrypsin point mutations
CN111206032B (zh) * 2013-12-12 2024-07-19 布罗德研究所有限公司 用于基因组编辑的crispr-cas系统和组合物的递送、用途和治疗应用
WO2015089364A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 The Broad Institute Inc. Crystal structure of a crispr-cas system, and uses thereof
WO2015089473A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 The Broad Institute Inc. Engineering of systems, methods and optimized guide compositions with new architectures for sequence manipulation
RU2016128077A (ru) * 2013-12-12 2018-12-06 Те Брод Инститьют Инк. Доставка, применение и применения в терапии систем и композиций crispr-cas для лечения обусловленных hbv и вирусных заболеваний и нарушений
WO2015089427A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 The Broad Institute Inc. Crispr-cas systems and methods for altering expression of gene products, structural information and inducible modular cas enzymes
BR112016013213A2 (pt) * 2013-12-12 2017-12-05 Massachusetts Inst Technology administração, uso e aplicações terapêuticas dos sistemas crispr-cas e composições para visar distúrbios e doenças usando componentes de administração de partículas
CN106030310B (zh) 2013-12-13 2019-01-04 通用医疗公司 可溶性高分子量(hmw)tau种类及其应用
US20160304893A1 (en) * 2013-12-13 2016-10-20 Cellectis Cas9 nuclease platform for microalgae genome engineering
US20150191744A1 (en) * 2013-12-17 2015-07-09 University Of Massachusetts Cas9 effector-mediated regulation of transcription, differentiation and gene editing/labeling
CA2931684C (en) 2013-12-19 2024-02-20 Novartis Ag Human mesothelin chimeric antigen receptors and uses thereof
AU2014368982B2 (en) 2013-12-19 2021-03-25 Amyris, Inc. Methods for genomic integration
US11672835B2 (en) 2013-12-20 2023-06-13 Seed Health, Inc. Method for treating individuals having cancer and who are receiving cancer immunotherapy
US11826388B2 (en) 2013-12-20 2023-11-28 Seed Health, Inc. Topical application of Lactobacillus crispatus to ameliorate barrier damage and inflammation
US12318377B2 (en) 2013-12-20 2025-06-03 Seed Health, Inc. Method and system for reducing the likelihood of a porphyromonas gingivalis infection in a human being
US12246043B2 (en) 2013-12-20 2025-03-11 Seed Health, Inc. Topical application to treat acne vulgaris
US11998574B2 (en) 2013-12-20 2024-06-04 Seed Health, Inc. Method and system for modulating an individual's skin microbiome
US11839632B2 (en) 2013-12-20 2023-12-12 Seed Health, Inc. Topical application of CRISPR-modified bacteria to treat acne vulgaris
EP3087101B1 (en) 2013-12-20 2024-06-05 Novartis AG Regulatable chimeric antigen receptor
US11969445B2 (en) 2013-12-20 2024-04-30 Seed Health, Inc. Probiotic composition and method for controlling excess weight, obesity, NAFLD and NASH
AU2014368892B2 (en) 2013-12-20 2019-06-13 Fred Hutchinson Cancer Center Tagged chimeric effector molecules and receptors thereof
US12329783B2 (en) 2013-12-20 2025-06-17 Seed Health, Inc. Method and system to improve the health of a person's skin microbiome
US11529379B2 (en) 2013-12-20 2022-12-20 Seed Health, Inc. Method and system for reducing the likelihood of developing colorectal cancer in an individual human being
US11833177B2 (en) 2013-12-20 2023-12-05 Seed Health, Inc. Probiotic to enhance an individual's skin microbiome
US12005085B2 (en) 2013-12-20 2024-06-11 Seed Health, Inc. Probiotic method and composition for maintaining a healthy vaginal microbiome
US11213552B2 (en) 2015-11-30 2022-01-04 Joseph E. Kovarik Method for treating an individual suffering from a chronic infectious disease and cancer
US11642382B2 (en) 2013-12-20 2023-05-09 Seed Health, Inc. Method for treating an individual suffering from bladder cancer
US11980643B2 (en) 2013-12-20 2024-05-14 Seed Health, Inc. Method and system to modify an individual's gut-brain axis to provide neurocognitive protection
US11026982B2 (en) 2015-11-30 2021-06-08 Joseph E. Kovarik Method for reducing the likelihood of developing bladder or colorectal cancer in an individual human being
KR20160102056A (ko) * 2013-12-26 2016-08-26 더 제너럴 하스피탈 코포레이션 멀티플렉스 가이드 ｒｎａ
WO2015103153A1 (en) * 2013-12-31 2015-07-09 The Regents Of The University Of California Cas9 crystals and methods of use thereof
EP3092310B1 (en) * 2014-01-08 2019-12-25 President and Fellows of Harvard College Rna-guided gene drives
RU2016133286A (ru) 2014-01-14 2018-02-20 Лэм Терапьютикс, Инк. Способы мутагенеза
JP2017503514A (ja) * 2014-01-24 2017-02-02 ノースカロライナ ステート ユニバーシティーＮｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃａｓ９ターゲッティングをガイドする配列に関する方法および組成物
US10787654B2 (en) * 2014-01-24 2020-09-29 North Carolina State University Methods and compositions for sequence guiding Cas9 targeting
WO2015113063A1 (en) 2014-01-27 2015-07-30 Georgia Tech Research Corporation Methods and systems for identifying crispr/cas off-target sites
US11315659B2 (en) * 2014-01-27 2022-04-26 Georgia Tech Research Corporation Methods and systems for identifying nucleotide-guided nuclease off-target sites
US9850525B2 (en) * 2014-01-29 2017-12-26 Agilent Technologies, Inc. CAS9-based isothermal method of detection of specific DNA sequence
EP4467654A3 (en) * 2014-02-04 2025-02-19 Jumpcode Genomics, Inc. Genome fractioning
EP4063503A1 (en) * 2014-02-11 2022-09-28 The Regents of the University of Colorado, a body corporate Crispr enabled multiplexed genome engineering
US20180142307A1 (en) * 2014-02-11 2018-05-24 California Institute Of Technology Recording and mapping lineage information and molecular events in individual cells
US10287590B2 (en) * 2014-02-12 2019-05-14 Dna2.0, Inc. Methods for generating libraries with co-varying regions of polynuleotides for genome modification
US10150985B2 (en) 2014-02-13 2018-12-11 Takara Bio Usa, Inc. Methods of depleting a target molecule from an initial collection of nucleic acids, and compositions and kits for practicing the same
EP3107999A4 (en) 2014-02-18 2017-10-04 Duke University Compositions for the inactivation of virus replication and methods of making and using the same
AU2015218576B2 (en) 2014-02-24 2020-02-27 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for nuclease-mediated targeted integration
EP3971283A1 (en) 2014-02-27 2022-03-23 Monsanto Technology LLC Compositions and methods for site directed genomic modification
CN103820454B (zh) * 2014-03-04 2016-03-30 上海金卫生物技术有限公司 CRISPR-Cas9特异性敲除人PD1基因的方法以及用于特异性靶向PD1基因的sgRNA
EP3115457B1 (en) * 2014-03-05 2019-10-02 National University Corporation Kobe University Genomic sequence modification method for specifically converting nucleic acid bases of targeted dna sequence, and molecular complex for use in same
US11028388B2 (en) 2014-03-05 2021-06-08 Editas Medicine, Inc. CRISPR/Cas-related methods and compositions for treating Usher syndrome and retinitis pigmentosa
US11141493B2 (en) 2014-03-10 2021-10-12 Editas Medicine, Inc. Compositions and methods for treating CEP290-associated disease
US11339437B2 (en) 2014-03-10 2022-05-24 Editas Medicine, Inc. Compositions and methods for treating CEP290-associated disease
CA2948728A1 (en) 2014-03-10 2015-09-17 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating leber's congenital amaurosis 10 (lca10)
ES2974625T3 (es) * 2014-03-14 2024-06-28 Cibus Us Llc Procedimientos y composiciones para aumentar la eficacia de la modificación génica dirigida mediante reparación génica mediada por oligonucleótidos
EP3593812A3 (en) 2014-03-15 2020-05-27 Novartis AG Treatment of cancer using chimeric antigen receptor
US20170081411A1 (en) 2014-03-15 2017-03-23 Novartis Ag Regulatable chimeric antigen receptor
DK3628334T5 (da) 2014-03-21 2024-09-02 Genzyme Corp Genterapi til behandling af retinitis pigmentosa
PL3122766T3 (pl) 2014-03-24 2021-09-13 IMMCO Diagnostics, Inc. Ulepszone wykrywanie i diagnostyka przeciwciał przeciwjądrowych dla układowych i nieukładowych zaburzeń autoimmunologicznych
JP2017512500A (ja) * 2014-03-25 2017-05-25 ギンゴー バイオワークス， インコーポレイテッド 細胞工学のための方法および遺伝システム
WO2015148863A2 (en) 2014-03-26 2015-10-01 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating sickle cell disease
US11318206B2 (en) 2014-03-28 2022-05-03 Aposense Ltd Compounds and methods for trans-membrane delivery of molecules
RU2703416C2 (ru) * 2014-03-28 2019-10-16 Эпосенс Лтд. Соединения для транс-мембранной доставки молекул
WO2015153791A1 (en) * 2014-04-01 2015-10-08 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating herpes simplex virus type 2 (hsv-2)
EP3126495A1 (en) 2014-04-02 2017-02-08 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating primary open angle glaucoma
EP3126503A1 (en) * 2014-04-03 2017-02-08 Massachusetts Institute Of Technology Methods and compositions for the production of guide rna
IL322264A (en) 2014-04-07 2025-09-01 Novartis Ag Cancer treatment using chimeric antigen receptor (CAR) against CD19
EP3129490A4 (en) 2014-04-08 2017-10-04 North Carolina State University Methods and compositions for rna-directed repression of transcription using crispr-associated genes
KR102595473B1 (ko) * 2014-04-18 2023-10-30 에디타스 메디신, 인코포레이티드 암 면역요법을 위한 crispr-cas-관련 방법, 조성물 및 구성성분
ES2744186T3 (es) 2014-04-25 2020-02-24 Childrens Medical Center Composiciones y métodos para tratar las hemoglobinopatías
US20160029604A1 (en) 2014-04-28 2016-02-04 Recombinetics, Inc. Multiplex gene editing
WO2015168404A1 (en) * 2014-04-30 2015-11-05 Massachusetts Institute Of Technology Toehold-gated guide rna for programmable cas9 circuitry with rna input
US11918695B2 (en) 2014-05-09 2024-03-05 Yale University Topical formulation of hyperbranched polymer-coated particles
EP3139909B1 (en) 2014-05-09 2025-01-01 Yale University Hyperbranched polyglycerol-coated particles
WO2015175642A2 (en) * 2014-05-13 2015-11-19 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for prevention or treatment of a disease
KR102149572B1 (ko) 2014-05-19 2020-08-28 화이자 인코포레이티드 아시알로당단백질 수용체의 표적화제로서 치환된-6,8-다이옥사바이사이클로[3.2.1]옥탄-2,3-다이올 화합물
EP3152221A4 (en) * 2014-05-20 2018-01-24 Regents of the University of Minnesota Method for editing a genetic sequence
EP3712254A1 (en) 2014-05-28 2020-09-23 Children's Hospital Medical Center Methods and systems for converting precursor cells into gastric tissues through directed differentiation
KR20170005494A (ko) 2014-05-30 2017-01-13 더 보드 어브 트러스티스 어브 더 리랜드 스탠포드 주니어 유니버시티 잠복 바이러스 감염에 대한 치료제를 전달하는 조성물 및 방법
EP3151846A4 (en) * 2014-06-05 2017-12-27 Sangamo BioSciences, Inc. Methods and compositions for nuclease design
RU2704283C9 (ru) 2014-06-06 2020-02-07 Регенерон Фармасьютикалз, Инк. Способы и композиции для модификации целевого локуса
US11274302B2 (en) * 2016-08-17 2022-03-15 Diacarta Ltd Specific synthetic chimeric Xenonucleic acid guide RNA; s(XNA-gRNA) for enhancing CRISPR mediated genome editing efficiency
WO2015191693A2 (en) * 2014-06-10 2015-12-17 Massachusetts Institute Of Technology Method for gene editing
HUE061007T2 (hu) 2014-06-11 2023-05-28 Univ Duke Gyors és dinamikus áramlásszabályozásra szolgáló összetételek és módszerek szintetikus matabolikus szelepek segítségével
EP3154694B1 (en) 2014-06-13 2025-01-29 Children's Medical Center Corporation Products and methods to isolate mitochondria
JP2017518082A (ja) * 2014-06-17 2017-07-06 ポセイダ セラピューティクス， インコーポレイテッド ゲノム中の特異的遺伝子座にタンパク質を指向させるための方法およびその使用
RS60366B1 (sr) 2014-06-23 2020-07-31 Regeneron Pharma Sastavljanje dnk posredovano nukleazom
EP3919621A1 (en) 2014-06-23 2021-12-08 The General Hospital Corporation Genomewide unbiased identification of dsbs evaluated by sequencing (guide-seq)
PT3161128T (pt) 2014-06-26 2018-11-21 Regeneron Pharma Métodos e composições para modificações genéticas alvejadas e métodos de utilização
CN106687594A (zh) 2014-07-11 2017-05-17 纳幕尔杜邦公司 用于产生对草甘膦除草剂具有抗性的植物的组合物和方法
US10179932B2 (en) 2014-07-11 2019-01-15 President And Fellows Of Harvard College Methods for high-throughput labelling and detection of biological features in situ using microscopy
EP3169702A4 (en) * 2014-07-14 2018-04-18 The Regents of The University of California A protein tagging system for in vivo single molecule imaging and control of gene transcription
ES3047792T3 (en) * 2014-07-14 2025-12-04 Univ California Crispr/cas transcriptional modulation
AU2015289644A1 (en) * 2014-07-15 2017-02-02 Juno Therapeutics, Inc. Engineered cells for adoptive cell therapy
US20160053304A1 (en) * 2014-07-18 2016-02-25 Whitehead Institute For Biomedical Research Methods Of Depleting Target Sequences Using CRISPR
US20160053272A1 (en) * 2014-07-18 2016-02-25 Whitehead Institute For Biomedical Research Methods Of Modifying A Sequence Using CRISPR
US9777061B2 (en) 2014-07-21 2017-10-03 Novartis Ag Treatment of cancer using a CD33 chimeric antigen receptor
CN112941065A (zh) * 2014-07-21 2021-06-11 亿明达股份有限公司 使用crispr-cas系统的多核苷酸富集
WO2016014530A1 (en) 2014-07-21 2016-01-28 Novartis Ag Combinations of low, immune enhancing. doses of mtor inhibitors and cars
US11542488B2 (en) 2014-07-21 2023-01-03 Novartis Ag Sortase synthesized chimeric antigen receptors
MY181834A (en) 2014-07-21 2021-01-08 Novartis Ag Treatment of cancer using humanized anti-bcma chimeric antigen receptor
WO2016022363A2 (en) 2014-07-30 2016-02-11 President And Fellows Of Harvard College Cas9 proteins including ligand-dependent inteins
US20170209492A1 (en) 2014-07-31 2017-07-27 Novartis Ag Subset-optimized chimeric antigen receptor-containing t-cells
US20160076093A1 (en) * 2014-08-04 2016-03-17 University Of Washington Multiplex homology-directed repair
WO2016021973A1 (ko) 2014-08-06 2016-02-11 주식회사 툴젠 캄필로박터 제주니 crispr/cas 시스템 유래 rgen을 이용한 유전체 교정
WO2016022866A1 (en) * 2014-08-07 2016-02-11 Agilent Technologies, Inc. Cis-blocked guide rna
US10513711B2 (en) 2014-08-13 2019-12-24 Dupont Us Holding, Llc Genetic targeting in non-conventional yeast using an RNA-guided endonuclease
WO2016025880A1 (en) 2014-08-14 2016-02-18 Novartis Ag Treatment of cancer using gfr alpha-4 chimeric antigen receptor
CN107429241B (zh) 2014-08-14 2025-10-24 百奥赛图(北京)医药科技股份有限公司 Dna敲入系统
US9879270B2 (en) * 2014-08-15 2018-01-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Constructs and methods for genome editing and genetic engineering of fungi and protists
US10435685B2 (en) 2014-08-19 2019-10-08 Pacific Biosciences Of California, Inc. Compositions and methods for enrichment of nucleic acids
WO2016028887A1 (en) 2014-08-19 2016-02-25 Pacific Biosciences Of California, Inc. Compositions and methods for enrichment of nucleic acids
US20180320226A1 (en) * 2014-08-19 2018-11-08 President And Fellows Of Harvard College RNA-Guided Systems For Probing And Mapping Of Nucleic Acids
SG11201700770PA (en) 2014-08-19 2017-03-30 Novartis Ag Anti-cd123 chimeric antigen receptor (car) for use in cancer treatment
CA2959070C (en) 2014-08-27 2020-11-10 Caribou Biosciences, Inc. Methods for increasing cas9-mediated engineering efficiency
US10450584B2 (en) * 2014-08-28 2019-10-22 North Carolina State University Cas9 proteins and guiding features for DNA targeting and genome editing
US10570418B2 (en) 2014-09-02 2020-02-25 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for RNA-directed target DNA modification
BR112017003757A2 (pt) 2014-09-12 2017-12-26 Du Pont ?plantas de milho, partes de planta de milho ou sementes de milho?
ES2891332T3 (es) 2014-09-17 2022-01-27 Novartis Ag Direccionamiento a células citotóxicas con receptores quiméricos para la inmunoterapia adoptiva
WO2016049024A2 (en) * 2014-09-24 2016-03-31 The Broad Institute Inc. Delivery, use and therapeutic applications of the crispr-cas systems and compositions for modeling competition of multiple cancer mutations in vivo
CN113016623A (zh) 2014-09-26 2021-06-25 谱赛科美国股份有限公司 用于甜菊的单核苷酸多态性(snp)标志物
US20170233762A1 (en) * 2014-09-29 2017-08-17 The Regents Of The University Of California Scaffold rnas
SG10201902811TA (en) 2014-09-29 2019-04-29 Jackson Lab High efficiency, high throughput generation of genetically modified mammals by electroporation
SG11201702614SA (en) 2014-10-01 2017-04-27 Eagle Biolog Inc Polysaccharide and nucleic acid formulations containing viscosity-lowering agents
WO2016050512A1 (en) 2014-10-03 2016-04-07 Bayer Cropscience Nv Methods and means for increasing stress tolerance and biomass in plants
AU2015330699B2 (en) 2014-10-10 2021-12-02 Editas Medicine, Inc. Compositions and methods for promoting homology directed repair
SG11201702309RA (en) 2014-10-15 2017-04-27 Regeneron Pharma Methods and compositions for generating or maintaining pluripotent cells
CN107208086A (zh) * 2014-10-17 2017-09-26 霍华德休斯医学研究所 基因组探针
GB201418965D0 (sr) 2014-10-24 2014-12-10 Ospedale San Raffaele And Fond Telethon
WO2016065364A1 (en) * 2014-10-24 2016-04-28 Life Technologies Corporation Compositions and methods for enhancing homologous recombination
JP6788584B2 (ja) * 2014-10-31 2020-11-25 マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー Ｃｒｉｓｐｒについての超並列コンビナトリアル遺伝学
KR20170075013A (ko) 2014-10-31 2017-06-30 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아 Cart 세포에서 유전자 발현의 변경 및 그의 용도
US20180291382A1 (en) * 2014-11-05 2018-10-11 The Regents Of The University Of California Methods for Autocatalytic Genome Editing and Neutralizing Autocatalytic Genome Editing
JP6823593B2 (ja) * 2014-11-06 2021-02-03 イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニーＥ．Ｉ．Ｄｕ Ｐｏｎｔ Ｄｅ Ｎｅｍｏｕｒｓ Ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｒｎａ誘導型エンドヌクレアーゼの細胞へのペプチド媒介輸送
WO2016073990A2 (en) 2014-11-07 2016-05-12 Editas Medicine, Inc. Methods for improving crispr/cas-mediated genome-editing
WO2016080097A1 (ja) * 2014-11-17 2016-05-26 国立大学法人東京医科歯科大学 簡便で高効率の遺伝子改変非ヒト哺乳動物の作製方法
CN104531632A (zh) * 2014-11-18 2015-04-22 李云英 快速降解的Cas9-ODC422-461融合蛋白及其应用
CA2968440A1 (en) 2014-11-21 2016-05-26 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for targeted genetic modification using paired guide rnas
EP3224353B9 (en) * 2014-11-26 2023-08-09 Technology Innovation Momentum Fund (Israel) Limited Partnership Targeted elimination of bacterial genes
GB201421096D0 (en) 2014-11-27 2015-01-14 Imp Innovations Ltd Genome editing methods
WO2016089883A1 (en) 2014-12-01 2016-06-09 Novartis Ag Compositions and methods for diagnosis and treatment of prostate cancer
WO2016089433A1 (en) 2014-12-03 2016-06-09 Agilent Technologies, Inc. Guide rna with chemical modifications
EP3229586B1 (en) 2014-12-10 2025-07-30 Regents of the University of Minnesota Genetically modified cells, tissues, and organs for treating disease
WO2016093668A2 (ko) * 2014-12-12 2016-06-16 한국한의학연구원 일체형 유전자 치료 유도만능줄기세포 제작방법
US12359197B2 (en) 2014-12-12 2025-07-15 Etagen Pharma, Inc. Compositions and methods for editing nucleic acids in cells utilizing oligonucleotides
WO2016094874A1 (en) * 2014-12-12 2016-06-16 The Broad Institute Inc. Escorted and functionalized guides for crispr-cas systems
EP3230451B1 (en) 2014-12-12 2021-04-07 The Broad Institute, Inc. Protected guide rnas (pgrnas)
WO2016100389A1 (en) 2014-12-16 2016-06-23 Synthetic Genomics, Inc. Compositions of and methods for in vitro viral genome engineering
JP6839082B2 (ja) * 2014-12-17 2021-03-03 イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニーＥ．Ｉ．Ｄｕ Ｐｏｎｔ Ｄｅ Ｎｅｍｏｕｒｓ Ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ 環状ポリヌクレオチド修飾鋳型と組み合わせてガイドｒｎａ／ｃａｓエンドヌクレアーゼ系を用いるｅ．コリ（ｅ．ｃｏｌｉ）での効率的な遺伝子編集のための組成物および方法
WO2016100951A2 (en) 2014-12-18 2016-06-23 Integrated Dna Technologies, Inc. Crispr-based compositions and methods of use
WO2016097751A1 (en) * 2014-12-18 2016-06-23 The University Of Bath Method of cas9 mediated genome engineering
BR112017013104A2 (en) 2014-12-19 2018-05-15 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. methods for modifying a target genomic locus in a cell, for enhancing homologous recombination at a target genomic locus in a cell, and for producing an f0 generation from a nonhuman animal.
US20190054117A1 (en) 2014-12-19 2019-02-21 Novartis Ag Dimerization switches and uses thereof
US10196613B2 (en) 2014-12-19 2019-02-05 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Stem cells for modeling type 2 diabetes
EP3957745A1 (en) 2014-12-20 2022-02-23 Arc Bio, LLC Compositions and methods for targeted depletion, enrichment, and partitioning of nucleic acids using crispr/cas system proteins
EP3237624B1 (en) 2014-12-23 2020-01-29 Syngenta Participations AG Methods and compositions for identifying and enriching for cells comprising site specific genomic modifications
CA2970370A1 (en) 2014-12-24 2016-06-30 Massachusetts Institute Of Technology Crispr having or associated with destabilization domains
CA2972454C (en) * 2014-12-31 2024-09-10 Phykion Inc. Compositions and methods for high efficiency in in vivo genome editing
US11396665B2 (en) * 2015-01-06 2022-07-26 Dsm Ip Assets B.V. CRISPR-CAS system for a filamentous fungal host cell
EP3245232B1 (en) 2015-01-12 2021-04-21 The Regents of The University of California Heterodimeric cas9 and methods of use thereof
MA41349A (fr) * 2015-01-14 2017-11-21 Univ Temple Éradication de l'herpès simplex de type i et d'autres virus de l'herpès associés guidée par arn
US10059940B2 (en) * 2015-01-27 2018-08-28 Minghong Zhong Chemically ligated RNAs for CRISPR/Cas9-lgRNA complexes as antiviral therapeutic agents
ES2945315T3 (es) 2015-01-27 2023-06-30 Inst Genetics & Developmental Biology Cas Método para realizar modificaciones específicas de sitio en la planta completa a través de la expresión transitoria de genes
SI3250691T1 (sl) 2015-01-28 2023-10-30 Caribou Biosciences, Inc. Hibridni dna/rna-polinukleotidi crispr in postopki za uporabo
US11180792B2 (en) 2015-01-28 2021-11-23 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for labeling a single-stranded target nucleic acid
ES2880473T5 (es) * 2015-01-30 2024-05-09 Univ California Suministro de proteínas en células hematopoyéticas primarias
EA037120B1 (ru) 2015-02-02 2021-02-09 МЕИРЭДжТиЭкс ЮКей II ЛИМИТЕД Регулирование экспрессии генов посредством аптамер-опосредованного модулирования альтернативного сплайсинга
US10765699B2 (en) 2015-02-06 2020-09-08 National University Of Singapore Methods for enhancing efficacy of therapeutic immune cells
JP6929791B2 (ja) 2015-02-09 2021-09-01 デューク ユニバーシティ エピゲノム編集のための組成物および方法
EP3260539B1 (en) * 2015-02-19 2021-10-06 Tokushima University Method for transferring cas9 mrna into mammalian fertilized egg by electroporation
AU2016225179C1 (en) 2015-02-23 2022-11-03 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for treatment of hemoglobinopathies
EP3262162A4 (en) * 2015-02-23 2018-08-08 Voyager Therapeutics, Inc. Regulatable expression using adeno-associated virus (aav)
EP3262173A2 (en) 2015-02-23 2018-01-03 Crispr Therapeutics AG Materials and methods for treatment of human genetic diseases including hemoglobinopathies
US10968536B2 (en) 2015-02-25 2021-04-06 Jumpcode Genomics, Inc. Methods and compositions for sequencing
JP6817215B2 (ja) 2015-03-03 2021-01-20 ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション 変更ＰＡＭ特異性を有する遺伝子操作ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ヌクレアーゼ
WO2016142427A1 (en) 2015-03-10 2016-09-15 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Method ank kit for reprogramming somatic cells
CN107922942B (zh) 2015-03-13 2021-08-31 杰克逊实验室 三组分crispr/cas复合系统及其用途
WO2016149422A1 (en) * 2015-03-16 2016-09-22 The Broad Institute, Inc. Encoding of dna vector identity via iterative hybridization detection of a barcode transcript
KR102194612B1 (ko) 2015-03-16 2020-12-23 인스티튜트 오브 제네틱스 앤드 디벨롭멘털 바이오롤지, 차이니즈 아카데미 오브 사이언시스 비-유전성 물질을 이용한 식물 게놈의 부위-특이적인 변형 방법
WO2016149547A1 (en) 2015-03-17 2016-09-22 Bio-Rad Laboratories, Inc. Detection of genome editing
ES2860712T3 (es) 2015-03-24 2021-10-05 Univ California Variantes de virus adenoasociados y métodos de uso de las mismas
EP4019635A1 (en) * 2015-03-25 2022-06-29 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods, compositions and components
EP3553178A1 (en) 2015-03-27 2019-10-16 E. I. du Pont de Nemours and Company Soybean u6 small nuclear rna gene promoters and their use in constitutive expression of small rna genes in plants
EP3277805B1 (en) 2015-03-31 2025-05-07 SOHM, Inc. Cas 9 retroviral integrase systems for targeted incorporation of a dna sequence into a genome of a cell
KR102888521B1 (ko) 2015-04-06 2025-11-19 더 보드 어브 트러스티스 어브 더 리랜드 스탠포드 주니어 유니버시티 Crispr/cas-매개 유전자 조절을 위한 화학적으로 변형된 가이드 rna
JP6892642B2 (ja) * 2015-04-13 2021-06-23 国立大学法人 東京大学 光依存的に又は薬物存在下でヌクレアーゼ活性若しくはニッカーゼ活性を示す、又は標的遺伝子の発現を抑制若しくは活性化するポリペプチドのセット
WO2016168756A1 (en) 2015-04-15 2016-10-20 Synthetic Genomics, Inc. Algal chloroplastic srp54 mutants
US11674144B2 (en) * 2015-04-16 2023-06-13 California Institute Of Technology Fractional regulation of transcription
EP3286211A1 (en) 2015-04-23 2018-02-28 Novartis AG Treatment of cancer using chimeric antigen receptor and protein kinase a blocker
EP3286571B1 (en) * 2015-04-24 2021-08-18 Editas Medicine, Inc. Evaluation of cas9 molecule/guide rna molecule complexes
WO2016176652A2 (en) 2015-04-29 2016-11-03 Fred Hutchinson Cancer Research Center Modified stem cells and uses thereof
CN108026566A (zh) * 2015-05-04 2018-05-11 特拉维夫大学拉莫特有限公司 用于使dna片段化的方法和试剂盒
KR20200091499A (ko) 2015-05-06 2020-07-30 스니프르 테크놀로지스 리미티드 미생물 개체군 변경 및 미생물군 변형
ES2835861T5 (en) * 2015-05-08 2025-02-18 Childrens Medical Ct Corp Targeting bcl11a enhancer functional regions for fetal hemoglobin reinduction
US11253616B2 (en) 2017-09-06 2022-02-22 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Small molecules for dual function positron emission tomography (PET) and cell suicide switches
EP3294896A1 (en) 2015-05-11 2018-03-21 Editas Medicine, Inc. Optimized crispr/cas9 systems and methods for gene editing in stem cells
WO2016183402A2 (en) * 2015-05-13 2016-11-17 President And Fellows Of Harvard College Methods of making and using guide rna for use with cas9 systems
CN107614680A (zh) * 2015-05-14 2018-01-19 南加利福尼亚大学 利用重组核酸内切酶系统的最佳化基因编辑
EP3294878A1 (en) 2015-05-15 2018-03-21 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Guide rna/cas endonuclease systems
US20180142236A1 (en) * 2015-05-15 2018-05-24 Ge Healthcare Dharmacon, Inc. Synthetic single guide rna for cas9-mediated gene editing
EP3095870A1 (en) 2015-05-19 2016-11-23 Kws Saat Se Methods for the in planta transformation of plants and manufacturing processes and products based and obtainable therefrom
US10966414B2 (en) 2015-05-26 2021-04-06 California Institute Of Technology Population control using engineered translocations
US10117911B2 (en) 2015-05-29 2018-11-06 Agenovir Corporation Compositions and methods to treat herpes simplex virus infections
WO2016196361A1 (en) 2015-05-29 2016-12-08 North Carolina State University Methods for screening bacteria, archaea, algae, and yeast using crispr nucleic acids
US10883103B2 (en) 2015-06-02 2021-01-05 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for delivery of a polynucleotide into a plant
EP3303585A4 (en) 2015-06-03 2018-10-31 Board of Regents of the University of Nebraska Dna editing using single-stranded dna
EP3303634B1 (en) 2015-06-03 2023-08-30 The Regents of The University of California Cas9 variants and methods of use thereof
EP3302525A2 (en) 2015-06-05 2018-04-11 Novartis AG Methods and compositions for diagnosing, treating, and monitoring treatment of shank3 deficiency associated disorders
KR102796744B1 (ko) 2015-06-09 2025-04-15 에디타스 메디신, 인코포레이티드 이식의 개선을 위한 crispr/cas-관련 방법 및 조성물
US20160362667A1 (en) 2015-06-10 2016-12-15 Caribou Biosciences, Inc. CRISPR-Cas Compositions and Methods
EP3307893A4 (en) 2015-06-12 2019-08-21 Lonza Walkersville, Inc. PROCESS FOR NUCLEAR REPROGRAMMING WITH SYNTHETIC TRANSCRIPTION FACTORS
GB201510296D0 (en) * 2015-06-12 2015-07-29 Univ Wageningen Thermostable CAS9 nucleases
IL316159A (en) 2015-06-15 2024-12-01 Mpeg La Llc Defined Oligonucleotide Multimers and Methods for Manufacture Thereof
JP7051438B2 (ja) 2015-06-15 2022-04-11 ノース カロライナ ステート ユニバーシティ 核酸およびｒｎａに基づく抗菌剤の効率的な送達のための方法および組成物
ES2886599T3 (es) * 2015-06-17 2021-12-20 Poseida Therapeutics Inc Composiciones y métodos para dirigir proteínas a loci específicos en el genoma
JP2018518182A (ja) 2015-06-17 2018-07-12 ザ ユーエービー リサーチ ファンデーション ゲノム編集のためのｃｒｉｓｐｒ／ｃａｓ９複合体
CA2989858A1 (en) 2015-06-17 2016-12-22 The Uab Research Foundation Crispr/cas9 complex for introducing a functional polypeptide into cells of blood cell lineage
EP3436575A1 (en) * 2015-06-18 2019-02-06 The Broad Institute Inc. Novel crispr enzymes and systems
WO2016205759A1 (en) 2015-06-18 2016-12-22 The Broad Institute Inc. Engineering and optimization of systems, methods, enzymes and guide scaffolds of cas9 orthologs and variants for sequence manipulation
IL293323B2 (en) 2015-06-18 2024-01-01 Massachusetts Inst Technology Crispr enzyme mutations reducing off-target effects
US9790490B2 (en) 2015-06-18 2017-10-17 The Broad Institute Inc. CRISPR enzymes and systems
CA2990699A1 (en) 2015-06-29 2017-01-05 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modified crispr rna and modified single crispr rna and uses thereof
WO2017004279A2 (en) * 2015-06-29 2017-01-05 Massachusetts Institute Of Technology Compositions comprising nucleic acids and methods of using the same
JP6765665B2 (ja) * 2015-07-13 2020-10-07 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 不稔化植物、不稔化植物の作出方法、及びベクター
JP7044373B2 (ja) 2015-07-15 2022-03-30 ラトガース，ザ ステート ユニバーシティ オブ ニュージャージー ヌクレアーゼ非依存的な標的化遺伝子編集プラットフォームおよびその用途
MA42895A (fr) 2015-07-15 2018-05-23 Juno Therapeutics Inc Cellules modifiées pour thérapie cellulaire adoptive
WO2017015101A1 (en) * 2015-07-17 2017-01-26 University Of Washington Methods for maximizing the efficiency of targeted gene correction
WO2017015637A1 (en) 2015-07-22 2017-01-26 Duke University High-throughput screening of regulatory element function with epigenome editing technologies
GB2557123B (en) 2015-07-31 2021-11-03 Univ Minnesota Modified cells and methods of therapy
WO2017024047A1 (en) * 2015-08-03 2017-02-09 Emendobio Inc. Compositions and methods for increasing nuclease induced recombination rate in cells
AU2016301196B2 (en) 2015-08-06 2022-09-08 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Tunable endogenous protein degradation
US9580727B1 (en) 2015-08-07 2017-02-28 Caribou Biosciences, Inc. Compositions and methods of engineered CRISPR-Cas9 systems using split-nexus Cas9-associated polynucleotides
US11667691B2 (en) 2015-08-07 2023-06-06 Novartis Ag Treatment of cancer using chimeric CD3 receptor proteins
KR20180038465A (ko) 2015-08-07 2018-04-16 애로우헤드 파마슈티컬스 인코포레이티드 Ｂ형 간염 바이러스 감염에 대한 ｒｎａｉ 치료법
JP2018527920A (ja) * 2015-08-14 2018-09-27 インスティテュート・オブ・ジェネティクス・アンド・ディヴェロプメンタル・バイオロジー、チャイニーズ・アカデミー・オブ・サイエンシズＩｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ 部位特異的ヌクレオチド置換によりグリホサート耐性イネを取得するための方法
AU2016309948B2 (en) 2015-08-14 2021-05-20 The University Of Sydney Connexin 45 inhibition for therapy
WO2017031341A1 (en) 2015-08-19 2017-02-23 Children's Research Institute, Children's National Medical Center Compositions and methods for treating graft versus host disease
US10538758B2 (en) 2015-08-19 2020-01-21 Arc Bio, Llc Capture of nucleic acids using a nucleic acid-guided nuclease-based system
WO2017035416A2 (en) 2015-08-25 2017-03-02 Duke University Compositions and methods of improving specificity in genomic engineering using rna-guided endonucleases
US9512446B1 (en) 2015-08-28 2016-12-06 The General Hospital Corporation Engineered CRISPR-Cas9 nucleases
DK3341483T3 (da) 2015-08-28 2020-03-16 Pioneer Hi Bred Int Ochrobactrum-medieret transformation af planter
US9926546B2 (en) 2015-08-28 2018-03-27 The General Hospital Corporation Engineered CRISPR-Cas9 nucleases
AU2016316845B2 (en) * 2015-08-28 2022-03-10 The General Hospital Corporation Engineered CRISPR-Cas9 nucleases
CN107922949A (zh) 2015-08-31 2018-04-17 安捷伦科技有限公司 用于通过同源重组的基于crispr/cas的基因组编辑的化合物和方法
WO2017040709A1 (en) 2015-08-31 2017-03-09 Caribou Biosciences, Inc. Directed nucleic acid repair
EP3347464B1 (en) * 2015-09-08 2024-01-24 University of Massachusetts Dnase h activity of neisseria meningitidis cas9
CN108348166B (zh) * 2015-09-09 2022-06-03 普梭梅根公司 用于与抗生素使用相关的感染性疾病及其它健康状况的源自微生物群系的诊断及治疗方法和系统
WO2017044885A1 (en) * 2015-09-09 2017-03-16 uBiome, Inc. Method and system for microbiome-derived diagnostics and therapeutics for conditions associated with cerebro-craniofacial health
DK3348638T3 (da) * 2015-09-09 2023-02-13 Univ Kobe Nat Univ Corp Fremgangsmåde til at konvertere genomsekvens fra gram-positiv bakterie ved specifikt at konvertere nukleinsyrebase i tilsigtet dna-sekvens, og molekylkompleks anvendt dertil
WO2017044776A1 (en) * 2015-09-10 2017-03-16 Texas Tech University System Single-guide rna (sgrna) with improved knockout efficiency
CN108350453A (zh) 2015-09-11 2018-07-31 通用医疗公司 核酸酶dsb的完全查询和测序(find-seq)
CN108271360B (zh) 2015-09-14 2023-01-24 得克萨斯州大学系统董事会 亲脂阳离子树枝状聚合物及其用途
US20180237800A1 (en) * 2015-09-21 2018-08-23 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for target nucleic acid modification
EP3353296B1 (en) 2015-09-24 2020-11-04 Editas Medicine, Inc. Use of exonucleases to improve crispr/cas-mediated genome editing
WO2017053729A1 (en) 2015-09-25 2017-03-30 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Nuclease-mediated genome editing of primary cells and enrichment thereof
WO2017058751A1 (en) * 2015-09-28 2017-04-06 North Carolina State University Methods and compositions for sequence specific antimicrobials
WO2017058791A1 (en) * 2015-09-29 2017-04-06 Agenovir Corporation Compositions and methods for treatment of latent viral infections
JP2018529353A (ja) 2015-09-30 2018-10-11 ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション 配列決定法による切断事象の包括的生体外報告（ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑ）
WO2017059241A1 (en) 2015-10-02 2017-04-06 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Lentiviral protein delivery system for rna-guided genome editing
US11692182B2 (en) 2015-10-09 2023-07-04 Monsanto Technology Llc RNA-guided DNA nucleases and uses thereof
FI4144844T3 (fi) 2015-10-12 2025-11-24 Dupont Us Holding Llc Suojatut dna-templaatit geenimuokkaukseen ja homologisen rekombinaation lisäämiseen soluissa ja niiden käyttömenetelmät
EP4089175A1 (en) 2015-10-13 2022-11-16 Duke University Genome engineering with type i crispr systems in eukaryotic cells
US9862941B2 (en) 2015-10-14 2018-01-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Single cell microfluidic device
AU2016337525B2 (en) 2015-10-16 2022-01-20 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Compositions and methods for inhibition of lineage specific antigens
FR3042506B1 (fr) * 2015-10-16 2018-11-30 IFP Energies Nouvelles Outil genetique de transformation de bacteries clostridium
CN108138155A (zh) 2015-10-20 2018-06-08 先锋国际良种公司 经由指导cas系统恢复非功能性基因产物的功能及使用方法
WO2017068077A1 (en) 2015-10-20 2017-04-27 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Methods and products for genetic engineering
CN109153980B (zh) * 2015-10-22 2023-04-14 布罗德研究所有限公司 Vi-b型crispr酶和系统
US11371040B2 (en) 2015-10-22 2022-06-28 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medical (Inserm) Endonuclease-barcoding
EP3350327B1 (en) 2015-10-23 2018-09-26 Caribou Biosciences, Inc. Engineered crispr class 2 cross-type nucleic-acid targeting nucleic acids
SG10202104041PA (en) 2015-10-23 2021-06-29 Harvard College Nucleobase editors and uses thereof
AU2016344609B2 (en) 2015-10-28 2022-05-12 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Materials and methods for treatment of duchenne muscular dystrophy
WO2017079406A1 (en) 2015-11-03 2017-05-11 President And Fellows Of Harvard College Method and apparatus for volumetric imaging of a three-dimensional nucleic acid containing matrix
US12043843B2 (en) 2015-11-04 2024-07-23 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Materials and methods for treatment of hemoglobinopathies
JP2018532415A (ja) 2015-11-06 2018-11-08 ザ ジャクソン ラボラトリー 大きなゲノムｄｎａノックインおよびその使用
EP3371305A1 (en) 2015-11-06 2018-09-12 Crispr Therapeutics AG Materials and methods for treatment of glycogen storage disease type 1a
US20180258438A1 (en) 2015-11-06 2018-09-13 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Generation of complex trait loci in soybean and methods of use
EP3374501B1 (en) 2015-11-11 2023-07-12 Lonza Ltd Crispr-associated (cas) proteins with reduced immunogenicity
WO2017083368A1 (en) * 2015-11-12 2017-05-18 Pfizer Inc. Tissue-specific genome engineering using crispr-cas9
US11306308B2 (en) * 2015-11-13 2022-04-19 Massachusetts Institute Of Technology High-throughput CRISPR-based library screening
EP3377042A4 (en) 2015-11-16 2019-05-29 The Research Institute at Nationwide Children's Hospital MATERIALS AND METHOD FOR THE TREATMENT OF TITIN-BASED MYOPATHIES AND OTHER TITINOPATHIES
US10669320B2 (en) 2015-11-18 2020-06-02 The Regents Of The University Of Michigan Mps1 and KNL1 phosphorylation system
WO2017090761A1 (ja) 2015-11-27 2017-06-01 国立大学法人神戸大学 標的化したｄｎａ配列の核酸塩基を特異的に変換する、単子葉植物のゲノム配列の変換方法、及びそれに用いる分子複合体
US10675347B2 (en) 2015-11-30 2020-06-09 Joseph E. Kovarik Method and system for protecting honey bees from fipronil pesticides
EP3383411B1 (en) 2015-11-30 2025-07-09 Sana Biotechnology, Inc. Sub-mitochondrial particles for use in treating metabolic conditions
US10086024B2 (en) 2015-11-30 2018-10-02 Joseph E. Kovarik Method and system for protecting honey bees, bats and butterflies from neonicotinoid pesticides
US10568916B2 (en) 2015-11-30 2020-02-25 Joseph E. Kovarik Method and system for protecting honey bees, bats and butterflies from neonicotinoid pesticides
WO2017095967A2 (en) 2015-11-30 2017-06-08 Duke University Therapeutic targets for the correction of the human dystrophin gene by gene editing and methods of use
US12239706B2 (en) 2015-11-30 2025-03-04 Seed Health, Inc. Method and system for protecting monarch butterflies from pesticides
US10933128B2 (en) 2015-11-30 2021-03-02 Joseph E. Kovarik Method and system for protecting honey bees from pesticides
US11529412B2 (en) 2015-11-30 2022-12-20 Seed Health, Inc. Method and system for protecting honey bees from pesticides
AU2016364667A1 (en) 2015-12-01 2018-06-21 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for treatment of Alpha-1 antitrypsin deficiency
US10946042B2 (en) 2015-12-01 2021-03-16 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for selective phagocytosis of human cancer cells
DK3371310T3 (da) * 2015-12-04 2019-08-05 Caribou Biosciences Inc Nucleinsyrekonstruerede targetnucleinsyrer
WO2017100343A1 (en) 2015-12-07 2017-06-15 Arc Bio, Llc Methods and compositions for the making and using of guide nucleic acids
US11208649B2 (en) 2015-12-07 2021-12-28 Zymergen Inc. HTP genomic engineering platform
US9988624B2 (en) 2015-12-07 2018-06-05 Zymergen Inc. Microbial strain improvement by a HTP genomic engineering platform
CA3007635A1 (en) 2015-12-07 2017-06-15 Zymergen Inc. Promoters from corynebacterium glutamicum
DK3387134T3 (da) 2015-12-11 2020-12-21 Danisco Us Inc Fremgangsmåder og sammensætninger til øget nukleasemedieret genommodifikation og reducerede virkninger uden for målstedet
DK3390631T3 (da) 2015-12-18 2020-07-13 Danisco Us Inc Fremgangsmåder og sammensætninger til t-rna-baseret guide-rna-ekspression
WO2017106767A1 (en) * 2015-12-18 2017-06-22 The Scripps Research Institute Production of unnatural nucleotides using a crispr/cas9 system
SG11201805162VA (en) 2015-12-18 2018-07-30 Oncosec Medical Inc Plasmid constructs for heterologous protein expression and methods of use
WO2017106414A1 (en) 2015-12-18 2017-06-22 Danisco Us Inc. Methods and compositions for polymerase ii (pol-ii) based guide rna expression
EP3392337B1 (en) * 2015-12-18 2024-03-06 Japan Science and Technology Agency Genetic modification non-human organism, egg cells, fertilized eggs, and method for modifying target genes
WO2017106569A1 (en) 2015-12-18 2017-06-22 The Regents Of The University Of California Modified site-directed modifying polypeptides and methods of use thereof
WO2017112620A1 (en) 2015-12-22 2017-06-29 North Carolina State University Methods and compositions for delivery of crispr based antimicrobials
MX2018007840A (es) 2015-12-23 2019-05-02 Crispr Therapeutics Ag Materiales y metodos para el tratamiento de la esclerosis lateral amiotrofica y/o la degeneracion lobar frontotemporal.
EP3394092A1 (en) 2015-12-23 2018-10-31 Fred Hutchinson Cancer Research Center High affinity t cell receptors and uses thereof
BR112018013074A2 (en) 2015-12-30 2018-12-11 Novartis Ag immune effector cell therapies with enhanced efficacy
IL304088A (en) 2016-01-11 2023-08-01 Univ Leland Stanford Junior Systems containing chimeric proteins and their uses for controlling gene expression
MX2018008345A (es) 2016-01-11 2018-12-06 Univ Leland Stanford Junior Proteínas quiméricas y métodos de inmunoterapia.
US11441146B2 (en) 2016-01-11 2022-09-13 Christiana Care Health Services, Inc. Compositions and methods for improving homogeneity of DNA generated using a CRISPR/Cas9 cleavage system
WO2017123609A1 (en) * 2016-01-12 2017-07-20 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for enhanced genome editing
ES3057779T3 (en) 2016-01-15 2026-03-04 Childrens Medical Ct Corp Therapeutic use of mitochondria and combined mitochondrial agents
AU2017208086A1 (en) 2016-01-15 2018-08-09 The Jackson Laboratory Genetically modified non-human mammals by multi-cycle electroporation of Cas9 protein
EP3199632A1 (en) 2016-01-26 2017-08-02 ACIB GmbH Temperature-inducible crispr/cas system
BR112018015348A2 (pt) 2016-01-26 2018-12-18 Pioneer Hi Bred Int método para obter uma planta de milho ceroso, planta, semente, polinucleotídeo-guia e método para produzir uma planta híbrida de milho ceroso
CN109072224B (zh) * 2016-01-30 2022-07-15 株式会社博纳克 人工单导rna及其用途
WO2017134529A1 (en) 2016-02-02 2017-08-10 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for treatment of severe combined immunodeficiency (scid) or omenn syndrome
US11845933B2 (en) 2016-02-03 2023-12-19 Massachusetts Institute Of Technology Structure-guided chemical modification of guide RNA and its applications
KR102841205B1 (ko) 2016-02-09 2025-08-01 시버스 유에스 엘엘씨 올리고뉴클레오타이드 매개 유전자 보수를 사용한 표적화된 유전자 변형의 효율을 증가시키기 위한 방법 및 조성물
JP2019513345A (ja) * 2016-02-10 2019-05-30 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミシガン 核酸の検知
US11339427B2 (en) 2016-02-12 2022-05-24 Jumpcode Genomics, Inc. Method for target specific RNA transcription of DNA sequences
WO2017139309A1 (en) 2016-02-12 2017-08-17 Ceres, Inc. Methods and materials for high throughput testing of mutagenized allele combinations
US9896696B2 (en) 2016-02-15 2018-02-20 Benson Hill Biosystems, Inc. Compositions and methods for modifying genomes
EP3416976A2 (en) 2016-02-16 2018-12-26 Yale University Compositions for enhancing targeted gene editing and methods of use thereof
CA3014795A1 (en) 2016-02-16 2017-08-24 Yale University Compositions and methods for treatment of cystic fibrosis
EP3417061B1 (en) 2016-02-18 2022-10-26 The Regents of the University of California Methods and compositions for gene editing in stem cells
WO2017141109A1 (en) 2016-02-18 2017-08-24 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for treatment of severe combined immunodeficiency (scid) or omenn syndrome
EP3420080B1 (en) 2016-02-22 2019-08-21 Caribou Biosciences, Inc. Methods for modulating dna repair outcomes
CN105646719B (zh) * 2016-02-24 2019-12-20 无锡市妇幼保健院 一种高效定点转基因的工具及其应用
WO2017147278A1 (en) 2016-02-25 2017-08-31 The Children's Medical Center Corporation Customized class switch of immunoglobulin genes in lymphoma and hybridoma by crispr/cas9 technology
CA3015665C (en) * 2016-02-26 2020-09-22 Lanzatech New Zealand Limited Crispr/cas systems for c1-fixing bacteria
WO2017151444A1 (en) 2016-02-29 2017-09-08 Agilent Technologies, Inc. Methods and compositions for blocking off-target nucleic acids from cleavage by crispr proteins
WO2017152023A1 (en) 2016-03-04 2017-09-08 Indoor Biotechnologies Inc. Fel d 1 knockouts and associated compositions and methods based on crispr-cas9 genomic editing
CA3010628A1 (en) 2016-03-11 2017-09-14 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Novel cas9 systems and methods of use
EP3426780A1 (en) 2016-03-11 2019-01-16 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Novel cas9 systems and methods of use
WO2017155715A1 (en) 2016-03-11 2017-09-14 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Novel cas9 systems and methods of use
WO2017160689A1 (en) * 2016-03-15 2017-09-21 University Of Massachusetts Anti-crispr compounds and methods of use
WO2017161043A1 (en) 2016-03-16 2017-09-21 The J. David Gladstone Institutes Methods and compositions for treating obesity and/or diabetes and for identifying candidate treatment agents
WO2017158422A1 (en) 2016-03-16 2017-09-21 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for treatment of hereditary haemochromatosis
EP3219799A1 (en) 2016-03-17 2017-09-20 IMBA-Institut für Molekulare Biotechnologie GmbH Conditional crispr sgrna expression
US11597924B2 (en) 2016-03-25 2023-03-07 Editas Medicine, Inc. Genome editing systems comprising repair-modulating enzyme molecules and methods of their use
WO2017165862A1 (en) 2016-03-25 2017-09-28 Editas Medicine, Inc. Systems and methods for treating alpha 1-antitrypsin (a1at) deficiency
US20190112599A1 (en) * 2016-03-31 2019-04-18 President And Fellows Of Harvard College Methods and Compositions for the Single Tube Preparation of Sequencing Libraries Using Cas9
WO2017173453A1 (en) 2016-04-01 2017-10-05 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Stimuli-responsive nanoparticles for biomedical applications
WO2017180694A1 (en) 2016-04-13 2017-10-19 Editas Medicine, Inc. Cas9 fusion molecules gene editing systems, and methods of use thereof
EP3443081A4 (en) * 2016-04-13 2019-10-30 Duke University CRISPR / CAS9-BASED REPRESSORS FOR IN VIVO SHUT-OFF OF GEN-TARGETS AND METHOD OF USE
US20170298348A1 (en) * 2016-04-14 2017-10-19 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Genome editing of human neural stem cells using nucleases
ES3039670T3 (en) 2016-04-15 2025-10-23 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Transgenic t cell and chimeric antigen receptor t cell compositions and related methods
EP3443096B1 (en) 2016-04-15 2023-03-01 Novartis AG Compositions and methods for selective expression of chimeric antigen receptors
WO2017181107A2 (en) * 2016-04-16 2017-10-19 Ohio State Innovation Foundation Modified cpf1 mrna, modified guide rna, and uses thereof
JP6974349B2 (ja) 2016-04-18 2021-12-01 クリスパー セラピューティクス アクチェンゲゼルシャフト ヘモグロビン異常症の処置のための材料及び方法
JP2019515914A (ja) * 2016-04-22 2019-06-13 インテリア セラピューティクス，インコーポレイテッド 転写因子４内のトリヌクレオチドリピートと関連する疾患の治療のための組成物および方法
AU2017257624B2 (en) 2016-04-25 2023-05-25 President And Fellows Of Harvard College Hybridization chain reaction methods for in situ molecular detection
JP2019514377A (ja) 2016-04-26 2019-06-06 マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー 拡張可能なリコンビナーゼカスケード
US11410746B2 (en) 2016-04-27 2022-08-09 Massachusetts Institute Of Technology Stable nanoscale nucleic acid assemblies and methods thereof
US11514331B2 (en) 2016-04-27 2022-11-29 Massachusetts Institute Of Technology Sequence-controlled polymer random access memory storage
WO2017191503A1 (en) 2016-05-05 2017-11-09 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for treatment of hemoglobinopathies
EP3452055A4 (en) * 2016-05-06 2019-11-06 Tod M. Woolf IMPROVED METHODS FOR GENERIC MODIFICATION WITH AND WITHOUT PROGRAMMABLE NUCLEASES
US10568840B2 (en) 2016-05-06 2020-02-25 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Self assembled gels for controlled delivery of encapsulated agents to cartilage
WO2017197128A1 (en) 2016-05-11 2017-11-16 Yale University Poly(amine-co-ester) nanoparticles and methods of use thereof
CN109153988B (zh) * 2016-05-13 2023-04-18 株式会社钟化 植物的基因组编辑方法
JP6967217B2 (ja) 2016-05-13 2021-11-17 株式会社カネカ 形質転換植物の作製方法
US11499158B2 (en) 2016-05-13 2022-11-15 Kaneka Corporation Method for modifying plant
US20170332610A1 (en) 2016-05-20 2017-11-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for breaking immunological tolerance using multiple guide rnas
EP3463484B1 (en) 2016-05-27 2026-01-07 The Regents of the University of California Methods and compositions for targeting rna polymerases and non-coding rna biogenesis to specific loci
EP3464323B1 (en) * 2016-05-27 2021-09-22 Aadigen, LLC Peptides and nanoparticles for intracellular delivery of genome-editing molecules
LT3604527T (lt) 2016-06-02 2021-06-25 Sigma-Aldrich Co., Llc Programuojamų, dnr surišančių baltymų panaudojimas tiksliniam genomo modifikavimui pagerinti
GB201609811D0 (en) 2016-06-05 2016-07-20 Snipr Technologies Ltd Methods, cells, systems, arrays, RNA and kits
US10767175B2 (en) * 2016-06-08 2020-09-08 Agilent Technologies, Inc. High specificity genome editing using chemically modified guide RNAs
WO2017222834A1 (en) * 2016-06-10 2017-12-28 City Of Hope Compositions and methods for mitochondrial genome editing
MX2018014993A (es) 2016-06-14 2019-09-06 Pioneer Hi Bred Int Uso de endonucleasa cpf1 para modificaciones de genoma de planta.
CN109312386B (zh) * 2016-06-15 2022-10-25 株式会社图尔金 使用中靶靶标和脱靶靶标的多重靶标系统筛选靶特异性核酸酶的方法及其用途
US10337051B2 (en) 2016-06-16 2019-07-02 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for detecting a target RNA
US11788083B2 (en) * 2016-06-17 2023-10-17 The Broad Institute, Inc. Type VI CRISPR orthologs and systems
WO2017222773A1 (en) 2016-06-20 2017-12-28 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Novel cas systems and methods of use
US11293021B1 (en) 2016-06-23 2022-04-05 Inscripta, Inc. Automated cell processing methods, modules, instruments, and systems
ES2915562T3 (es) 2016-06-24 2022-06-23 Univ Colorado Regents Métodos para generar bibliotecas combinatorias con código de barras
WO2018005445A1 (en) 2016-06-27 2018-01-04 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods for detecting and treating diabetes
WO2018005589A1 (en) 2016-06-28 2018-01-04 Cellectis Altering expression of gene products in plants through targeted insertion of nucleic acid sequences
US11174469B2 (en) 2016-06-29 2021-11-16 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for treatment of Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) and other related disorders
US11564997B2 (en) 2016-06-29 2023-01-31 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for treatment of friedreich ataxia and other related disorders
US12595478B2 (en) * 2016-06-29 2026-04-07 The Broad Institute, Inc. Crispr-Cas systems having destabilization domain
WO2018002812A1 (en) 2016-06-29 2018-01-04 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for treatment of myotonic dystrophy type 1 (dm1) and other related disorders
JP2019519242A (ja) 2016-06-30 2019-07-11 ザイマージェン インコーポレイテッド 細菌ヘモグロビンライブラリーを生成するための方法およびその使用
WO2018005793A1 (en) 2016-06-30 2018-01-04 Zymergen Inc. Methods for generating a glucose permease library and uses thereof
US11459587B2 (en) 2016-07-06 2022-10-04 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Materials and methods for treatment of pain related disorders
CA3029132A1 (en) 2016-07-06 2018-01-11 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Materials and methods for treatment of pain related disorders
WO2018007871A1 (en) 2016-07-08 2018-01-11 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for treatment of transthyretin amyloidosis
EP3485023B1 (en) 2016-07-15 2023-11-15 Salk Institute for Biological Studies Methods and compositions for genome editing in non-dividing cells
SG11201900344YA (en) 2016-07-15 2019-02-27 Novartis Ag Treatment and prevention of cytokine release syndrome using a chimeric antigen receptor in combination with a kinase inhibitor
EP4275747A3 (en) 2016-07-19 2024-01-24 Duke University Therapeutic applications of cpf1-based genome editing
WO2018015444A1 (en) 2016-07-22 2018-01-25 Novozymes A/S Crispr-cas9 genome editing with multiple guide rnas in filamentous fungi
WO2018020323A2 (en) 2016-07-25 2018-02-01 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for treatment of fatty acid disorders
US11168313B2 (en) 2016-07-26 2021-11-09 The General Hospital Corporation Variants of CRISPR from Prevotella and Francisella 1 (Cpf1)
CN106191043B (zh) * 2016-07-26 2019-07-02 吉林大学 一种基因片段、载体pPlasmid-Clearance及应用
KR20240027874A (ko) 2016-07-28 2024-03-04 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 Gpr156 변이체 및 이들의 용도
KR20190041476A (ko) 2016-07-29 2019-04-22 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 C-절단된 피브릴린-1의 발현을 유도하는 돌연변이를 포함하는 마우스
CA3032822A1 (en) 2016-08-02 2018-02-08 Editas Medicine, Inc. Compositions and methods for treating cep290 associated disease
US11078481B1 (en) 2016-08-03 2021-08-03 KSQ Therapeutics, Inc. Methods for screening for cancer targets
KR20250103795A (ko) 2016-08-03 2025-07-07 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 아데노신 핵염기 편집제 및 그의 용도
JOP20190015A1 (ar) 2016-08-04 2019-02-04 Arrowhead Pharmaceuticals Inc عوامل (ار ان ايه آي) لعدوى فيروس الالتهاب الكبدي الوبائي ب
US11661590B2 (en) 2016-08-09 2023-05-30 President And Fellows Of Harvard College Programmable CAS9-recombinase fusion proteins and uses thereof
KR101710026B1 (ko) 2016-08-10 2017-02-27 주식회사 무진메디 Cas9 단백질 및 가이드 RNA의 혼성체를 함유하는 나노 리포좀 전달체 조성물
WO2018031950A1 (en) 2016-08-12 2018-02-15 Caribou Biosciences, Inc. Protein engineering methods
JP7215808B2 (ja) 2016-08-12 2023-01-31 ツールゲン インコーポレイテッド 操作された免疫調節エレメントおよび変更された免疫
US11046995B2 (en) * 2016-08-16 2021-06-29 The Regents Of The University Of California Method for finding low abundance sequences by hybridization (FLASH)
CA3034101A1 (en) * 2016-08-19 2018-02-22 Bluebird Bio, Inc. Genome editing enhancers
CN109863246A (zh) * 2016-08-19 2019-06-07 怀特黑德生物医学研究所 编辑dna甲基化的方法
EP3500677A4 (en) * 2016-08-20 2020-04-01 Avellino Lab USA, Inc. Single guide rna, crispr/cas9 systems, and methods of use thereof
WO2018039438A1 (en) 2016-08-24 2018-03-01 President And Fellows Of Harvard College Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing
CA3035414C (en) 2016-08-29 2022-02-22 The Regents Of The University Of California Topical formulations based on ionic species for skin treatment
GB2569252A (en) 2016-08-31 2019-06-12 Harvard College Methods of combining the detection of biomolecules into a single assay using fluorescent in situ sequencing
US11078483B1 (en) 2016-09-02 2021-08-03 KSQ Therapeutics, Inc. Methods for measuring and improving CRISPR reagent function
CN106399311A (zh) * 2016-09-07 2017-02-15 同济大学 用于Chip‑seq全基因组结合谱的内源蛋白标记的方法
US20190242908A1 (en) 2016-09-08 2019-08-08 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for diagnosing and treating nephrotic syndrome
WO2018049168A1 (en) 2016-09-09 2018-03-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University High-throughput precision genome editing
US20190218261A1 (en) 2016-09-13 2019-07-18 The Jackson Laboratory Targeted enhanced dna demethylation
WO2018057837A1 (en) * 2016-09-23 2018-03-29 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Gene therapy and targeted delivery of conjugated compounds
US20190225974A1 (en) 2016-09-23 2019-07-25 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Targeted genome optimization in plants
MX2019003176A (es) 2016-09-23 2019-07-04 Hutchinson Fred Cancer Res Receptores de linfocitos t (tcr) especificos del antigeno menor de histocompatibilidad (h) ah-1 y sus usos.
WO2018064387A1 (en) 2016-09-28 2018-04-05 Novartis Ag Porous membrane-based macromolecule delivery system
GB201616590D0 (en) 2016-09-29 2016-11-16 Oxford Nanopore Technologies Limited Method
EP3519570B1 (en) * 2016-09-29 2022-06-08 F. Hoffmann-La Roche AG Method to analyze and optimize gene editing modules and delivery approaches
WO2018064352A1 (en) * 2016-09-30 2018-04-05 The Regents Of The University Of California Rna-guided nucleic acid modifying enzymes and methods of use thereof
JP2019532644A (ja) 2016-09-30 2019-11-14 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア Ｒｎａ誘導型核酸修飾酵素及びその使用方法
US10669539B2 (en) 2016-10-06 2020-06-02 Pioneer Biolabs, Llc Methods and compositions for generating CRISPR guide RNA libraries
WO2018067992A1 (en) 2016-10-07 2018-04-12 Novartis Ag Chimeric antigen receptors for the treatment of cancer
WO2018069232A1 (en) 2016-10-10 2018-04-19 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for predicting the risk of having cardiac hypertrophy
EP3525933B1 (en) 2016-10-11 2024-07-03 The Regents of the University of California Systems and methods to encapsulate and preserve organic matter for analysis
CA3037560A1 (en) 2016-10-13 2018-04-19 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Generating northern leaf blight resistant maize
EP3525832A4 (en) 2016-10-14 2020-04-29 The General Hospital Corp. Epigenetically regulated site-specific nucleases
SG11201903089RA (en) 2016-10-14 2019-05-30 Harvard College Aav delivery of nucleobase editors
GB201617559D0 (en) 2016-10-17 2016-11-30 University Court Of The University Of Edinburgh The Swine comprising modified cd163 and associated methods
GB2573406B (en) 2016-10-18 2021-11-10 Univ Minnesota Tumor infiltrating lymphocytes and methods of therapy
US11766400B2 (en) 2016-10-24 2023-09-26 Yale University Biodegradable contraceptive implants
WO2018081531A2 (en) 2016-10-28 2018-05-03 Ariad Pharmaceuticals, Inc. Methods for human t-cell activation
WO2018080573A1 (en) 2016-10-28 2018-05-03 Massachusetts Institute Of Technology Crispr/cas global regulator screening platform
US20180245065A1 (en) 2016-11-01 2018-08-30 Novartis Ag Methods and compositions for enhancing gene editing
WO2018085414A1 (en) * 2016-11-02 2018-05-11 President And Fellows Of Harvard College Engineered guide rna sequences for in situ detection and sequencing
CN109689693B (zh) * 2016-11-03 2022-06-28 深圳华大生命科学研究院 提高基因编辑效率的方法和系统
CA3042259A1 (en) 2016-11-04 2018-05-11 Flagship Pioneering Innovations V. Inc. Novel plant cells, plants, and seeds
SG11201903697WA (en) 2016-11-04 2019-05-30 Childrens Hospital Med Ct Liver organoid compositions and methods of making and using same
WO2018144097A1 (en) 2016-11-04 2018-08-09 Akeagen Llc Genetically modified non-human animals and methods for producing heavy chain-only antibodies
WO2018087391A1 (en) 2016-11-14 2018-05-17 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and pharmaceutical compositions for modulating stem cells proliferation or differentiation
EP3541945A4 (en) * 2016-11-18 2020-12-09 Genedit Inc. COMPOSITIONS AND METHODS OF MODIFICATION OF TARGET NUCLEIC ACIDS
US11440958B2 (en) 2016-11-22 2022-09-13 National University Of Singapore Blockade of CD7 expression and chimeric antigen receptors for immunotherapy of T-cell malignancies
CN110382695A (zh) 2016-11-28 2019-10-25 得克萨斯州大学系统董事会 通过crispr/cpf1介导的基因编辑来预防肌营养不良
EP3548894B1 (en) 2016-12-02 2021-10-20 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for diagnosing renal cell carcinoma
US9816093B1 (en) 2016-12-06 2017-11-14 Caribou Biosciences, Inc. Engineered nucleic acid-targeting nucleic acids
WO2018107003A1 (en) 2016-12-08 2018-06-14 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Dmd reporter models containing humanized duschene muscular dystrophy mutations
WO2018111944A1 (en) 2016-12-12 2018-06-21 Whitehead Institute For Biomedical Research Regulation of transcription through ctcf loop anchors
CN118546256A (zh) 2016-12-13 2024-08-27 西雅图儿童医院（Dba西雅图儿童研究所） 在体外和体内对工程化的细胞中表达的化学物质诱导的信号传导复合物进行外源性药物激活的方法
US20180179553A1 (en) 2016-12-14 2018-06-28 Ligandal, Inc. Compositions and methods for nucleic acid and/or protein payload delivery
EA201991443A1 (ru) * 2016-12-14 2020-01-14 Вагенинген Университейт ТЕРМОСТАБИЛЬНЫЕ НУКЛЕАЗЫ Cas9
WO2018112470A1 (en) 2016-12-16 2018-06-21 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Co-delivery of nucleic acids for simultaneous suppression and expression of target genes
WO2018119010A1 (en) 2016-12-19 2018-06-28 Editas Medicine, Inc. Assessing nuclease cleavage
WO2018118585A1 (en) * 2016-12-22 2018-06-28 Agenovir Corporation Antiviral compositions
CA3047163A1 (en) 2016-12-22 2018-06-28 Monsanto Technology Llc Genome editing-based crop engineering and production of brachytic plants
CA3048479A1 (en) * 2016-12-23 2018-06-28 President And Fellows Of Harvard College Gene editing of pcsk9
WO2018119359A1 (en) 2016-12-23 2018-06-28 President And Fellows Of Harvard College Editing of ccr5 receptor gene to protect against hiv infection
US11597947B2 (en) 2016-12-29 2023-03-07 Asc Therapeutics Inc. Gene editing method using virus
EP3342868B1 (en) 2016-12-30 2019-12-25 Systasy Bioscience GmbH Constructs and screening methods
US11859219B1 (en) 2016-12-30 2024-01-02 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Methods of altering a target nucleotide sequence with an RNA-guided nuclease and a single guide RNA
JOP20190166A1 (ar) 2017-01-05 2019-07-02 Univ Texas استراتيجية مثلى من أجل تعديلات تخطي إكسون باستخدام crispr/cas9 مع متواليات توجيه ثلاثي
JP7219972B2 (ja) 2017-01-05 2023-02-09 ラトガース，ザ ステート ユニバーシティ オブ ニュー ジャージー Ｄｎａ二本鎖切断に非依存的な標的化遺伝子編集プラットフォームおよびその用途
EP3565907B1 (en) 2017-01-06 2022-05-04 Editas Medicine, Inc. Methods of assessing nuclease cleavage
WO2018127585A1 (en) 2017-01-06 2018-07-12 Txcell Monospecific regulatory t cell population with cytotoxicity for b cells
EP3346001A1 (en) 2017-01-06 2018-07-11 TXCell Monospecific regulatory t cell population with cytotoxicity for b cells
EA201991661A1 (ru) 2017-01-09 2019-12-30 Апосенс Лтд. Соединения и способы трансмембранной доставки молекул
FI3565891T3 (fi) 2017-01-09 2023-07-04 Whitehead Inst Biomedical Res Menetelmiä geeniekspression muuttamiseksi häiritsemällä säätelysilmukoita muodostavia transkriptiotekijämultimeerejä
EP3568470B1 (en) 2017-01-10 2022-07-06 Christiana Care Health Services, Inc. Methods for in vitro site-directed mutagenesis using gene editing technologies
US20230190958A1 (en) * 2017-01-13 2023-06-22 Jichi Medical University AAV Vector for Disrupting Coagulation Factor-Related Gene on Liver Genome
CA3047416A1 (en) 2017-01-20 2018-07-26 The Regents Of The University Of California Targeted gene activation in plants
SG11201906735RA (en) 2017-01-23 2019-08-27 Regeneron Pharma Hydroxysteroid 17-beta dehydrogenase 13 (hsd17b13) variants and uses thereof
CA3047011A1 (en) 2017-01-26 2018-08-02 The Regents Of The University Of California Targeted gene demethylation in plants
EP3574005B1 (en) 2017-01-26 2021-12-15 Novartis AG Cd28 compositions and methods for chimeric antigen receptor therapy
SG11201906795SA (en) 2017-01-28 2019-08-27 Inari Agriculture Inc Novel plant cells, plants, and seeds
JP2020506700A (ja) 2017-01-31 2020-03-05 ノバルティス アーゲー 多重特異性を有するキメラｔ細胞受容体タンパク質を用いた癌の治療
WO2018144701A2 (en) 2017-02-02 2018-08-09 Cargill Incorporated Genetically modified cells that produce c6-c10 fatty acid derivatives
US10995333B2 (en) * 2017-02-06 2021-05-04 10X Genomics, Inc. Systems and methods for nucleic acid preparation
TW201839136A (zh) 2017-02-06 2018-11-01 瑞士商諾華公司 治療血色素異常症之組合物及方法
EP3577220A2 (en) 2017-02-06 2019-12-11 Zymergen, Inc. Engineered biosynthetic pathways for production of tyramine by fermentation
EP3580212A4 (en) 2017-02-08 2021-03-17 Dana Farber Cancer Institute, Inc. REGULATION OF CHEMERIC ANTIGEN RECEPTORS
US11471538B2 (en) 2017-02-10 2022-10-18 INSERM (Institut National de la Santéet de la Recherche Medicale) Methods and pharmaceutical compositions for the treatment of cancers associated with activation of the MAPK pathway
CA3049989A1 (en) 2017-02-10 2018-08-16 Zymergen Inc. A modular universal plasmid design strategy for the assembly and editing of multiple dna constructs for multiple hosts
CN118256413A (zh) 2017-02-21 2024-06-28 杜克大学 用于稳健动态代谢控制的组合物和方法
US20200216857A1 (en) 2017-02-22 2020-07-09 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for treatment of spinocerebellar ataxia type 2 (sca2) and other spinocerebellar ataxia type 2 protein (atxn2) gene related conditions or disorders
EP3585898A1 (en) 2017-02-22 2020-01-01 CRISPR Therapeutics AG Materials and methods for treatment of spinocerebellar ataxia type 1 (sca1) and other spinocerebellar ataxia type 1 protein (atxn1) gene related conditions or disorders
CN119351474A (zh) 2017-02-22 2025-01-24 克里斯珀医疗股份公司 用于基因编辑的组合物和方法
EP3585807A1 (en) 2017-02-22 2020-01-01 CRISPR Therapeutics AG Materials and methods for treatment of early onset parkinson's disease (park1) and other synuclein, alpha (snca) gene related conditions or disorders
EP3585899A1 (en) 2017-02-22 2020-01-01 CRISPR Therapeutics AG Materials and methods for treatment of primary hyperoxaluria type 1 (ph1) and other alanine-glyoxylate aminotransferase (agxt) gene related conditions or disorders
IL268895B2 (en) 2017-02-28 2025-05-01 Vor Biopharma Inc Compositions and methods for inhibition of lineage specific proteins
US20200048359A1 (en) 2017-02-28 2020-02-13 Novartis Ag Shp inhibitor compositions and uses for chimeric antigen receptor therapy
EP3592768B1 (en) 2017-03-08 2024-12-25 The Regents of The University of Michigan Analyte detection
EP3592381A1 (en) 2017-03-09 2020-01-15 President and Fellows of Harvard College Cancer vaccine
US11898179B2 (en) 2017-03-09 2024-02-13 President And Fellows Of Harvard College Suppression of pain by gene editing
WO2018165629A1 (en) 2017-03-10 2018-09-13 President And Fellows Of Harvard College Cytosine to guanine base editor
US11332727B2 (en) * 2017-03-14 2022-05-17 The Regents Of The University Of California Method for reducing an immune response by administering an immune evading adeno-associated AAV8 or AAVDJ viral vector
EP3596217A1 (en) 2017-03-14 2020-01-22 Editas Medicine, Inc. Systems and methods for the treatment of hemoglobinopathies
EP3595645A1 (en) 2017-03-15 2020-01-22 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Pharmaceutical compositions for the treatment of thrombosis in patients suffering from a myeloproliferative neoplasm
EP3595708A4 (en) 2017-03-15 2020-12-16 Fred Hutchinson Cancer Research Center HIGH AFFINITY MAGE-A1 SPECIFIC TCRS AND THEIR USES
WO2018176009A1 (en) 2017-03-23 2018-09-27 President And Fellows Of Harvard College Nucleobase editors comprising nucleic acid programmable dna binding proteins
EP3600427A1 (en) 2017-03-24 2020-02-05 INSERM - Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Methods and compositions for treating melanoma
EP3600269A1 (en) 2017-03-24 2020-02-05 INSERM - Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Gfi1 inhibitors for the treatment of hyperglycemia
CN110914433A (zh) 2017-03-24 2020-03-24 库尔维科公司 编码crispr相关蛋白质的核酸及其用途
PT3526324T (pt) 2017-03-28 2021-10-20 Locanabio Inc Proteína associada a crispr (cas)
US11661624B2 (en) 2017-03-30 2023-05-30 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods of identifying and characterizing gene editing variations in nucleic acids
WO2018178237A1 (en) 2017-03-30 2018-10-04 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for the treatment of mitochondrial genetic diseases
US20200113821A1 (en) 2017-04-04 2020-04-16 Yale University Compositions and methods for in utero delivery
JP2020516283A (ja) 2017-04-11 2020-06-11 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドＲｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． ヒドロキシステロイド（１７−ベータ）デヒドロゲナーゼ（ｈｓｄ１７ｂ）ファミリーのメンバーのモジュレーターの活性をスクリーニングするためのアッセイ
EP3609997A4 (en) 2017-04-14 2021-03-03 Children's Hospital Medical Center COMPOSITIONS OF STEM CELLS FROM MULTIPLE DONOR CELLS AND THEIR PREPARATION PROCEDURES
WO2018195129A1 (en) 2017-04-17 2018-10-25 University Of Maryland, College Park Embryonic cell cultures and methods of using the same
US11834670B2 (en) * 2017-04-19 2023-12-05 Global Life Sciences Solutions Usa Llc Site-specific DNA modification using a donor DNA repair template having tandem repeat sequences
EP3612023A4 (en) 2017-04-20 2021-05-12 Egenesis, Inc. METHOD FOR PRODUCING GENETICALLY MODIFIED ANIMALS
CN110799205A (zh) 2017-04-21 2020-02-14 通用医疗公司 利用CRISPR-Cpf1的可诱导、可调和多重的人类基因调节
US11458118B2 (en) 2017-04-21 2022-10-04 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and pharmaceutical compositions for the treatment of diseases associated with reduced CFTR function
ES2992912T3 (en) 2017-04-21 2024-12-19 Massachusetts Gen Hospital Variants of cpf1 (cas12a) with altered pam specificity
WO2018197520A1 (en) 2017-04-24 2018-11-01 Dupont Nutrition Biosciences Aps Methods and compositions of anti-crispr proteins for use in plants
US11499151B2 (en) 2017-04-28 2022-11-15 Editas Medicine, Inc. Methods and systems for analyzing guide RNA molecules
US20200179511A1 (en) 2017-04-28 2020-06-11 Novartis Ag Bcma-targeting agent, and combination therapy with a gamma secretase inhibitor
US20200055948A1 (en) 2017-04-28 2020-02-20 Novartis Ag Cells expressing a bcma-targeting chimeric antigen receptor, and combination therapy with a gamma secretase inhibitor
WO2018204722A1 (en) * 2017-05-05 2018-11-08 Califorinia Institute Of Technology Dna sequence modification-based gene drive
CN110997705B (zh) 2017-05-05 2026-04-10 巴塞罗那自治大学 纳米结构蛋白及其用途
CN110914431B (zh) 2017-05-08 2024-04-19 株式会社图尔金 经人工操纵的免疫细胞
EP3622070A2 (en) 2017-05-10 2020-03-18 Editas Medicine, Inc. Crispr/rna-guided nuclease systems and methods
WO2018209320A1 (en) 2017-05-12 2018-11-15 President And Fellows Of Harvard College Aptazyme-embedded guide rnas for use with crispr-cas9 in genome editing and transcriptional activation
BR112019023608A2 (pt) 2017-05-12 2020-05-26 Crispr Therapeutics Ag Materiais e métodos para células manipuladas e seus usos em imuno-oncologia
WO2018213351A1 (en) * 2017-05-16 2018-11-22 The Regents Of The University Of California Thermostable rna-guided endonucleases and methods of use thereof
JP2020519665A (ja) 2017-05-17 2020-07-02 アンセルム（アンスティテュト ナショナル ド ラ サンテ エ ド ラ ルシェルシュ メディカル） オピオイドによる痛みの処置を改善する為のｆｌｔ３阻害剤
WO2018212361A1 (en) * 2017-05-17 2018-11-22 Edigene Corporation Method of treating diseases associated with myd88 pathways using crispr-gndm system
CA3064000A1 (en) 2017-05-24 2018-11-29 Effector Therapeutics, Inc. Methods and compositions for cellular immunotherapy
AU2018273986A1 (en) 2017-05-25 2019-12-12 The General Hospital Corporation Bipartite base editor (BBE) architectures and type-II-C-Cas9 zinc finger editing
US11788087B2 (en) 2017-05-25 2023-10-17 The Children's Medical Center Corporation BCL11A guide delivery
WO2018226560A1 (en) 2017-06-05 2018-12-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. B4galt1 variants and uses thereof
CN108977442B (zh) * 2017-06-05 2023-01-06 广州市锐博生物科技有限公司 用于dna编辑的系统及其应用
KR20200026874A (ko) 2017-06-06 2020-03-11 지머젠 인코포레이티드 대장균 개량을 위한 htp 게놈 공학 플랫폼
KR20200026878A (ko) 2017-06-06 2020-03-11 지머젠 인코포레이티드 균류 균주를 개량하기 위한 htp 게놈 공학 플랫폼
US20210079100A1 (en) 2017-06-08 2021-03-18 Inserm (Institute National De La Sante Et De La Recherche Medicale) Methods and compositions for treating hyperpigmentation disorders
US11517901B2 (en) 2017-06-09 2022-12-06 The Regents Of The University Of California High-efficiency particle encapsulation in droplets with particle spacing and downstream droplet sorting
US10780438B2 (en) 2017-06-09 2020-09-22 The Regents Of The University Of California High-efficiency encapsulation in droplets based on hydrodynamic vortices control
JP7518620B2 (ja) 2017-06-09 2024-07-18 エディタス・メディシン，インコーポレイテッド 操作されたｃａｓ９ヌクレアーゼ
EP3638789A4 (en) * 2017-06-12 2021-03-10 California Institute of Technology CONDITIONAL GUIDE RNAS
IL271275B1 (en) 2017-06-13 2026-04-01 Flagship Pioneering Innovations V Inc Preparations containing croons and their uses
SG11201912179SA (en) 2017-06-15 2020-01-30 Univ California Targeted non-viral dna insertions
AU2018289077B2 (en) 2017-06-23 2022-03-10 Inscripta, Inc. Nucleic acid-guided nucleases
US9982279B1 (en) 2017-06-23 2018-05-29 Inscripta, Inc. Nucleic acid-guided nucleases
US10011849B1 (en) 2017-06-23 2018-07-03 Inscripta, Inc. Nucleic acid-guided nucleases
US20230193241A1 (en) 2017-06-25 2023-06-22 Snipr Technologies Limited Altering microbial populations & modifying microbiota
EP4484562A3 (en) 2017-06-27 2025-03-26 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a humanized asgr1 locus
HUE058668T2 (hu) 2017-06-30 2022-09-28 Inscripta Inc Automatizált sejtkezelési eljárások, modulok, berendezések és rendszerek
CN111417724A (zh) 2017-06-30 2020-07-14 科德克希思公司 T7 rna聚合酶变体
US10392616B2 (en) 2017-06-30 2019-08-27 Arbor Biotechnologies, Inc. CRISPR RNA targeting enzymes and systems and uses thereof
WO2019005540A1 (en) 2017-06-30 2019-01-03 Codexis, Inc. T7 POLYMERASE RNA VARIANTS
EP3645721A1 (en) 2017-06-30 2020-05-06 Novartis AG Methods for the treatment of disease with gene editing systems
JP2020530307A (ja) 2017-06-30 2020-10-22 インティマ・バイオサイエンス，インコーポレーテッド 遺伝子治療のためのアデノ随伴ウイルスベクター
SG11202000167SA (en) 2017-07-11 2020-02-27 Synthorx Inc Incorporation of unnatural nucleotides and methods thereof
EP3427756A1 (en) 2017-07-14 2019-01-16 Universidad Autónoma De Barcelona (UAB) Therapeutic nanoconjugates and uses thereof
WO2019014564A1 (en) 2017-07-14 2019-01-17 Editas Medicine, Inc. SYSTEMS AND METHODS OF TARGETED INTEGRATION AND GENOME EDITING AND DETECTION THEREOF WITH INTEGRATED PRIMING SITES
WO2019036140A1 (en) 2017-07-17 2019-02-21 Zymergen Inc. METALLO-ORGANIC STRESS MATERIALS
US20190316101A1 (en) 2017-07-18 2019-10-17 Howard Hughes Medical Institute Methods and compositions for genetically manipulating genes and cells
WO2019016310A1 (en) 2017-07-20 2019-01-24 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) METHODS AND COMPOSITIONS FOR TREATING CANCERS
CN109295054B (zh) * 2017-07-25 2024-02-06 广州普世利华科技有限公司 用于靶向病原体基因RNA的gRNA及基于C2c2的病原体基因的检测方法及试剂盒
WO2019020593A1 (en) 2017-07-25 2019-01-31 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) METHODS AND PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS FOR MODULATION OF MONOCYTOPOISIS
CN111801345A (zh) 2017-07-28 2020-10-20 哈佛大学的校长及成员们 使用噬菌体辅助连续进化(pace)的进化碱基编辑器的方法和组合物
CN120989074A (zh) 2017-07-31 2025-11-21 映像生物有限公司 眼部疾病的细胞模型及用于眼部疾病的疗法
CA3068072A1 (en) 2017-07-31 2019-02-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for assessing crispr/cas-mediated disruption or excision and crispr/cas-induced recombination with an exogenous donor nucleic acid in vivo
CN110891420B (zh) 2017-07-31 2022-06-03 瑞泽恩制药公司 Cas转基因小鼠胚胎干细胞和小鼠及其应用
JP2020530990A (ja) 2017-07-31 2020-11-05 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドＲｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． ｉｎ ｖｉｖｏでの外因性ドナー核酸とのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ誘導性組換えの評価
US11897920B2 (en) 2017-08-04 2024-02-13 Peking University Tale RVD specifically recognizing DNA base modified by methylation and application thereof
WO2019030306A1 (en) 2017-08-08 2019-02-14 Depixus ISOLATION AND IN VITRO ENRICHMENT OF NUCLEIC ACIDS USING SITE-SPECIFIC NUCLEASES
WO2019028686A1 (zh) 2017-08-08 2019-02-14 北京大学 基因敲除方法
CN111373040B (zh) 2017-08-09 2024-07-12 本森希尔股份有限公司 修饰基因组的组合物和方法
US12398191B2 (en) 2017-08-11 2025-08-26 Fred Hutchinson Cancer Center BRAF-specific TCRs and uses thereof
US20200260698A1 (en) 2017-08-18 2020-08-20 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Exon deletion correction of duchenne muscular dystrophy mutations in the dystrophin actin binding domain 1 using crispr genome editing
CN111263810A (zh) * 2017-08-22 2020-06-09 纳匹基因公司 使用多核苷酸指导的核酸内切酶的细胞器基因组修饰
CA3073448A1 (en) 2017-08-23 2019-02-28 The General Hospital Corporation Engineered crispr-cas9 nucleases with altered pam specificity
US10738327B2 (en) 2017-08-28 2020-08-11 Inscripta, Inc. Electroporation cuvettes for automation
EP3676376B1 (en) 2017-08-30 2025-01-15 President and Fellows of Harvard College High efficiency base editors comprising gam
WO2019050948A1 (en) * 2017-09-05 2019-03-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. ADMINISTRATION OF A GENE EDITION SYSTEM HAVING ONLY ONE RETROVIRAL PARTICLE AND METHODS OF GENERATING AND USING
CA3071661A1 (en) 2017-09-06 2019-03-14 Fred Hutchinson Cancer Research Center Strep-tag specific chimeric receptors and uses thereof
WO2019051135A1 (en) 2017-09-06 2019-03-14 Fred Hutchinson Cancer Research Center METHODS FOR IMPROVING ADOPTIVE CELL THERAPY
DK3679158T3 (da) 2017-09-06 2025-06-23 Regeneron Pharma Enkelt immunoglobulin interleukin-1-receptor-relaterede (sigirr) varianter og anvendelser deraf
EP3679060A1 (en) 2017-09-07 2020-07-15 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Solute carrier family 14 member 1 (slc14a1) variants and uses thereof
CN111315889A (zh) 2017-09-08 2020-06-19 生命技术公司 提高同源重组的方法和其组合物
US11649442B2 (en) 2017-09-08 2023-05-16 The Regents Of The University Of California RNA-guided endonuclease fusion polypeptides and methods of use thereof
CN118389609A (zh) * 2017-09-11 2024-07-26 加利福尼亚大学董事会 抗体介导的cas9向哺乳动物细胞的递送
US20190076814A1 (en) * 2017-09-11 2019-03-14 Synthego Corporation Biopolymer synthesis system and method
WO2019051642A1 (zh) * 2017-09-12 2019-03-21 广州中科蓝华生物科技有限公司 一种转染细胞内寄生虫的试剂盒及其应用
WO2019055862A1 (en) 2017-09-14 2019-03-21 Fred Hutchinson Cancer Research Center HIGH AFFINITY T CELL RECEPTORS AND USES THEREOF
CN109517796A (zh) 2017-09-18 2019-03-26 博雅辑因（北京）生物科技有限公司 一种基因编辑t细胞及其用途
ES2983336T3 (es) 2017-09-18 2024-10-22 Futuragene Israel Ltd Control de la expresión de polipéptidos DELLA en tejidos específicos
WO2019056099A1 (en) 2017-09-19 2019-03-28 The University Of British Columbia ANTI-HLA-A2 ANTIBODIES AND METHODS OF USE
CN111356760A (zh) 2017-09-19 2020-06-30 阿德瓦希斯公司 细菌或李斯特菌菌株的冻干组合物和方法
WO2019060469A2 (en) * 2017-09-19 2019-03-28 Massachusetts Institute Of Technology CAS9 STREPTOCOCCUS CANIS AS A GENOMIC ENGINEERING PLATFORM WITH NEW PAM SPECIFICITY
US11453865B2 (en) * 2017-09-19 2022-09-27 Massachusetts Institute Of Technology Applications of engineered Streptococcus canis Cas9 variants on single-base PAM targets
WO2019057649A1 (en) 2017-09-19 2019-03-28 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) METHODS AND PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT OF ACUTE MYELOID LEUKEMIA
JP7330174B2 (ja) 2017-09-20 2023-08-21 アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル オートファジーをモジュレーションするための方法及び医薬組成物
JP7317023B2 (ja) 2017-09-20 2023-07-28 ザ・ユニバーシティ・オブ・ブリティッシュ・コロンビア 新規抗ｈｌａ－ａ２抗体、およびその使用
IT201700105372A1 (it) * 2017-09-20 2019-03-20 Fondazione St Italiano Tecnologia Molecola di acido nucleico funzionale e relativo uso
BR112020005803A2 (pt) 2017-09-25 2020-12-01 Agrospheres, Inc. composições e métodos para produção e administração moduláveis de produtos biológicos
US11572574B2 (en) * 2017-09-28 2023-02-07 Toolgen Incorporated Artificial genome manipulation for gene expression regulation
JP7139419B2 (ja) 2017-09-29 2022-09-20 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド ヒト化ｔｔｒ遺伝子座を含む非ヒト動物および使用方法
EP3687581A1 (en) * 2017-09-29 2020-08-05 Intellia Therapeutics, Inc. Polynucleotides, compositions, and methods for genome editing
KR102662879B1 (ko) * 2017-09-29 2024-05-02 주식회사 툴젠 망막 기능장애 질환 치료를 위한 유전자 조작
WO2019068022A1 (en) 2017-09-30 2019-04-04 Inscripta, Inc. CONTINUOUS FLOW ELECTROPORATION INSTRUMENTATION
KR20260011199A (ko) 2017-10-02 2026-01-22 진에딧 인코포레이티드 변형된 cpf1 가이드 rna
CN111479853A (zh) 2017-10-05 2020-07-31 齐默尔根公司 光学透明的聚酰亚胺
WO2019071276A1 (en) 2017-10-06 2019-04-11 Camp4 Therapeutics Corporation METHODS AND COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT OF UREA CYCLE DISORDERS, IN PARTICULAR OF OTC DEFICIENCY
US12297457B2 (en) 2017-10-10 2025-05-13 Children's Hospital Medical Center Esophageal tissue and/or organoid compositions and methods of making same
WO2019075197A1 (en) 2017-10-11 2019-04-18 The General Hospital Corporation METHODS OF DETECTION OF INDIVIDUAL SITE-SPECIFIC PARASITE GENOMIC DEAMINATION BY BASE EDITING TECHNOLOGIES
KR20240125690A (ko) 2017-10-11 2024-08-19 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 Pnpla3 i148m 변이를 발현하는 환자의 간 질환의 치료에서의 hsd17b13의 저해
WO2019075409A1 (en) 2017-10-12 2019-04-18 The Regents Of The University Of California ISOLATION AND IDENTIFICATION WITHOUT MICROFLUIDIC LABEL OF CELLS USING FLUORESCENCE LIFE IMAGING (FLIM)
AU2018352234A1 (en) 2017-10-16 2020-04-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Cornulin (CRNN) variants and uses thereof
US11795443B2 (en) 2017-10-16 2023-10-24 The Broad Institute, Inc. Uses of adenosine base editors
WO2019079527A1 (en) 2017-10-17 2019-04-25 Casebia Therapeutics Limited Liability Partnership COMPOSITIONS AND METHODS FOR GENETIC EDITION FOR HEMOPHILIA A
EP3697435A1 (en) 2017-10-20 2020-08-26 Fred Hutchinson Cancer Research Center Compositions and methods of immunotherapy targeting tigit and/or cd112r or comprising cd226 overexpression
WO2019079787A1 (en) * 2017-10-20 2019-04-25 The Regents Of The University Of California MICROFLUIDIC SYSTEMS AND METHODS FOR CELL TRANSFECTION VIA LIPOFLEX
US11499127B2 (en) 2017-10-20 2022-11-15 The Regents Of The University Of California Multi-layered microfluidic systems for in vitro large-scale perfused capillary networks
WO2019081428A1 (en) 2017-10-23 2019-05-02 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) COMPOUNDS FOR THE TREATMENT OF CMV RELATED DISEASES
WO2019135816A2 (en) * 2017-10-23 2019-07-11 The Broad Institute, Inc. Novel nucleic acid modifiers
KR102013798B1 (ko) 2017-10-25 2019-08-23 성균관대학교산학협력단 노화 모델 제조 방법 및 이에 의해 제조된 세포 또는 동물 노화 모델
EP3701029A1 (en) 2017-10-26 2020-09-02 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Materials and methods for treatment of hemoglobinopathies
CN109722414A (zh) 2017-10-27 2019-05-07 博雅辑因（北京）生物科技有限公司 一种高效制备成熟红细胞的方法以及用于制备成熟红细胞的培养基
WO2019084552A1 (en) 2017-10-27 2019-05-02 The Regents Of The University Of California TARGETED REPLACEMENT OF ENDOGENIC T CELL RECEPTORS
WO2019089798A1 (en) 2017-10-31 2019-05-09 Novartis Ag Anti-car compositions and methods
AU2018358051B2 (en) 2017-11-01 2025-01-09 The Regents Of The University Of California CasZ compositions and methods of use
US12227753B2 (en) 2017-11-01 2025-02-18 The Regents Of The University Of California CasY compositions and methods of use
US20210180053A1 (en) 2017-11-01 2021-06-17 Novartis Ag Synthetic rnas and methods of use
US11970719B2 (en) 2017-11-01 2024-04-30 The Regents Of The University Of California Class 2 CRISPR/Cas compositions and methods of use
WO2019090173A1 (en) * 2017-11-02 2019-05-09 Arbor Biotechnologies, Inc. Novel crispr-associated transposon systems and components
US20210032622A1 (en) 2017-11-09 2021-02-04 Crispr Therapeutics Ag Self-inactivating (sin) crispr/cas or crispr/cpf1 systems and uses thereof
ES2911249T3 (es) 2017-11-10 2022-05-18 Regeneron Pharma Animales no humanos que comprenden una mutación de slc30a8 y métodos de uso
WO2019094928A1 (en) 2017-11-10 2019-05-16 Massachusetts Institute Of Technology Microbial production of pure single stranded nucleic acids
EP3707252A1 (en) * 2017-11-10 2020-09-16 Novozymes A/S Temperature-sensitive cas9 protein
MX2020004777A (es) * 2017-11-10 2020-10-08 Univ Massachusetts Plataformas de suministro dirigido por crispr.
WO2019099943A1 (en) 2017-11-16 2019-05-23 Astrazeneca Ab Compositions and methods for improving the efficacy of cas9-based knock-in strategies
WO2019100053A1 (en) 2017-11-20 2019-05-23 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Compositions and methods for modulating hif-2α to improve muscle generation and repair
WO2019101995A1 (en) 2017-11-27 2019-05-31 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and pharmaceutical compositions for cardiac regeneration
US20190160120A1 (en) * 2017-11-29 2019-05-30 Snipr Biome Aps Dna, methods etc
IL274740B2 (en) 2017-11-30 2024-06-01 Regeneron Pharma Non-human animals comprising a humanized trkb locus
WO2019109047A1 (en) 2017-12-01 2019-06-06 Fred Hutchinson Cancer Research Center Binding proteins specific for 5t4 and uses thereof
SG11202005147WA (en) 2017-12-05 2020-06-29 Vertex Pharma Crispr-cas9 modified cd34+ human hematopoietic stem and progenitor cells and uses thereof
CA3084954A1 (en) * 2017-12-05 2019-06-13 BioPlx, Inc. Methods and compositions to prevent microbial infection
US20210002609A1 (en) 2017-12-05 2021-01-07 Caribou Biosciences, Inc. Modified lymphocytes
KR20200095534A (ko) 2017-12-07 2020-08-10 지머젠 인코포레이티드 발효에 의한 (6e)-8-히드록시제라니올의 제조를 위해 조작된 생합성 경로
CA3082956A1 (en) 2017-12-08 2019-06-13 Synthetic Genomics, Inc. Improving algal lipid productivity via genetic modification of a tpr domain containing protein
CN111801417B (zh) * 2017-12-14 2024-10-29 克里斯珀医疗股份公司 新的rna-可编程的内切核酸酶系统及其在基因组编辑和其他应用中的用途
US11661599B1 (en) 2017-12-14 2023-05-30 National Technology & Engineering Solutions Of Sandia, Llc CRISPR-Cas based system for targeting single-stranded sequences
CN111344402A (zh) 2017-12-14 2020-06-26 Ezy生物科技有限公司 受试者特异性肿瘤抑制细胞及其用途
WO2019118949A1 (en) 2017-12-15 2019-06-20 The Broad Institute, Inc. Systems and methods for predicting repair outcomes in genetic engineering
CA3084824A1 (en) 2017-12-15 2019-06-20 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Compositions comprising circular polyribonucleotides and uses thereof
WO2019118463A1 (en) 2017-12-15 2019-06-20 Danisco Us Inc Cas9 variants and methods of use
EP3728594A1 (en) 2017-12-21 2020-10-28 CRISPR Therapeutics AG Materials and methods for treatment of usher syndrome type 2a
EP3727394A4 (en) 2017-12-21 2021-09-08 Children's Hospital Medical Center DIGITALIZED HUMAN ORGANOIDS AND METHOD OF USING THEREOF
WO2019133881A1 (en) 2017-12-29 2019-07-04 Rubius Therapeutics, Inc. Gene editing and targeted transcriptional modulation for enginerering erythroid cells
IL275694B2 (en) * 2017-12-29 2025-08-01 Scripps Research Inst Unnatural base pair compositions and methods of use
EP3732189A4 (en) 2017-12-29 2022-01-19 Synthetic Genomics, Inc. GENETIC MODULATION OF PHOTOSYNTHETIC ORGANISMS FOR IMPROVED GROWTH
US12337036B2 (en) 2018-01-01 2025-06-24 Aposense Ltd Compounds and methods for trans-membrane delivery of molecules
EP3735590A1 (en) 2018-01-04 2020-11-11 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for treating melanoma resistant
EP3735462A1 (en) 2018-01-05 2020-11-11 The Board of Regents of The University of Texas System Therapeutic crispr/cas9 compositions and methods of use
CN111819285B (zh) 2018-01-09 2024-08-09 希博斯美国有限公司 防碎基因和突变
WO2019140278A1 (en) 2018-01-11 2019-07-18 Fred Hutchinson Cancer Research Center Immunotherapy targeting core binding factor antigens
US20200362366A1 (en) 2018-01-12 2020-11-19 Basf Se Gene underlying the number of spikelets per spike qtl in wheat on chromosome 7a
WO2019140330A1 (en) 2018-01-12 2019-07-18 Casebia Therapeutics Limited Liability Partnership Compositions and methods for gene editing by targeting transferrin
US11268092B2 (en) 2018-01-12 2022-03-08 GenEdit, Inc. Structure-engineered guide RNA
BR112020014140A2 (pt) * 2018-01-17 2020-12-01 Vertex Pharmaceuticals Incorporated inibidores de dna-pk
AU2019209292B2 (en) 2018-01-17 2023-10-05 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Quinoxalinone compounds, compositions, methods, and kits for increasing genome editing efficiency
US12509492B2 (en) 2018-01-19 2025-12-30 Duke University Genome engineering with CRISPR-Cas systems in eukaryotes
EP3743096A1 (en) 2018-01-25 2020-12-02 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Antagonists of il-33 for use in methods for preventing ischemia reperfusion injury in an organ
WO2019147275A1 (en) * 2018-01-26 2019-08-01 Integrated Dna Technologies, Inc. Crispr-based compositions and methods of use
WO2019147302A1 (en) * 2018-01-26 2019-08-01 Bauer Daniel E Targeting bcl11a distal regulatory elements with a cas9-cas9 fusion for fetal hemoglobin reinduction
US11926835B1 (en) 2018-01-29 2024-03-12 Inari Agriculture Technology, Inc. Methods for efficient tomato genome editing
US11497752B2 (en) 2018-01-30 2022-11-15 Foghorn Therapeutics Inc. Compounds and uses thereof
KR20200116933A (ko) 2018-01-31 2020-10-13 더 보드 오브 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템 인간 심근세포에서 디스트로핀 돌연변이를 교정하기 위한 조성물 및 방법
AR114350A1 (es) 2018-01-31 2020-08-26 Res Institute At Nationwide Children’S Hospital Terapia genética para la distrofia muscular de cinturas del tipo 2c
WO2019150309A1 (en) 2018-02-02 2019-08-08 Hammack Scott Modulators of gpr68 and uses thereof for treating and preventing diseases
US11268077B2 (en) 2018-02-05 2022-03-08 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Materials and methods for treatment of hemoglobinopathies
WO2019150196A1 (en) 2018-02-05 2019-08-08 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for treatment of hemoglobinopathies
WO2019152941A1 (en) 2018-02-05 2019-08-08 Caribou Biosciences, Inc. Engineered gut microbes for reduction of reactivation of detoxified drugs
WO2019157326A1 (en) 2018-02-08 2019-08-15 Zymergen Inc. Genome editing using crispr in corynebacterium
JP7109547B2 (ja) * 2018-02-15 2022-07-29 シグマ－アルドリッチ・カンパニー・リミテッド・ライアビリティ・カンパニー 真核ゲノム修飾のための操作されたＣａｓ９システム
EP3752134B1 (en) 2018-02-16 2024-12-04 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for treating vitiligo
WO2019161310A1 (en) 2018-02-16 2019-08-22 Casebia Therapeutics Limited Liability Partnership Compositions and methods for gene editing by targeting fibrinogen-alpha
US11718849B2 (en) 2018-02-19 2023-08-08 Agilent Technologies, Inc. Phosphopeptide-encoding oligonucleotide libraries and methods for detecting phosphorylation-dependent molecular interactions
EP3755792A4 (en) * 2018-02-23 2021-12-08 Pioneer Hi-Bred International, Inc. NEW CAS9 ORTHOLOGIST
EP3759130A1 (en) 2018-02-26 2021-01-06 Fred Hutchinson Cancer Research Center Compositions and methods for cellular immunotherapy
US11713472B2 (en) 2018-03-06 2023-08-01 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Genome editing in Archaea
EP3762719A1 (en) 2018-03-09 2021-01-13 Advaxis, Inc. Compositions and methods for evaluating attenuation and infectivity of listeria strains
ES3036459T3 (en) * 2018-03-12 2025-09-19 Pioneer Hi Bred Int Methods for plant transformation
KR102907245B1 (ko) 2018-03-14 2026-01-05 에디타스 메디신, 인코포레이티드 혈색소병증 치료를 위한 시스템 및 방법
US20190284553A1 (en) 2018-03-15 2019-09-19 KSQ Therapeutics, Inc. Gene-regulating compositions and methods for improved immunotherapy
KR20240038811A (ko) 2018-03-19 2024-03-25 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 CRISPR/Cas 시스템을 사용한 동물에서의 전사 조절
JP7550648B2 (ja) * 2018-03-19 2024-09-13 クリスパー セラピューティクス アーゲー 新規ｒｎａプログラム可能エンドヌクレアーゼ系およびその使用
WO2019179445A1 (en) 2018-03-20 2019-09-26 Tsinghua University Alzheimer's disease animal model and use thereof
CN112020556A (zh) 2018-03-21 2020-12-01 瑞泽恩制药公司 第13型17β羟基类固醇脱氢酶(HSD17B13)iRNA组成物及其使用方法
US10760075B2 (en) 2018-04-30 2020-09-01 Snipr Biome Aps Treating and preventing microbial infections
CN111148833B (zh) 2018-03-26 2021-04-02 国立大学法人神户大学 改变细胞具有的双链dna的目标部位的方法
WO2019186275A1 (en) * 2018-03-27 2019-10-03 G+Flas Life Sciences Sequence-specific in vivo cell targeting
WO2019191114A1 (en) 2018-03-27 2019-10-03 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Modified immune cells having enhanced function and methods for screening for same
GB201805287D0 (en) 2018-03-29 2018-05-16 Univ Edinburgh Haematoietic stem cell treatment
WO2019190874A1 (en) 2018-03-29 2019-10-03 Inscripta, Inc. Automated control of cell growth rates for induction and transformation
WO2019193375A1 (en) 2018-04-04 2019-10-10 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Use of fzd7 inhibitors for the treatment of retinal neovascularization
AU2019247403B2 (en) 2018-04-04 2025-04-10 Cibus Europe, B.V. FAD2 genes and mutations
CN116536272A (zh) 2018-04-06 2023-08-04 儿童医疗中心有限公司 用于体细胞重新编程和调整印记的组合物和方法
SG11202010116PA (en) 2018-04-13 2020-11-27 Sangamo Therapeutics France Chimeric antigen receptor specific for interleukin-23 receptor
WO2019200004A1 (en) 2018-04-13 2019-10-17 Inscripta, Inc. Automated cell processing instruments comprising reagent cartridges
EP3781585A4 (en) 2018-04-17 2022-01-26 The General Hospital Corporation SENSITIVE IN VITRO TESTS FOR SUBSTRATE PREFERENCES AND SITE FOR NUCLEIC ACID BINDERS, MODIFIERS AND CLEAVAGE AGENTS
WO2019204668A1 (en) 2018-04-18 2019-10-24 Casebia Therapeutics Limited Liability Partnership Compositions and methods for knockdown of apo(a) by gene editing for treatment of cardiovascular disease
GB2587970B (en) 2018-04-19 2023-02-08 Univ California Compositions and methods for gene editing
US10858761B2 (en) 2018-04-24 2020-12-08 Inscripta, Inc. Nucleic acid-guided editing of exogenous polynucleotides in heterologous cells
US10526598B2 (en) 2018-04-24 2020-01-07 Inscripta, Inc. Methods for identifying T-cell receptor antigens
US10508273B2 (en) 2018-04-24 2019-12-17 Inscripta, Inc. Methods for identifying selective binding pairs
US20210239681A1 (en) 2018-04-27 2021-08-05 Advaxis, Inc. Compositions and methods for evaluating potency of listeria-based immunotherapeutics
CA3091490A1 (en) 2018-04-27 2019-10-31 Seattle Children's Hospital (dba Seattle Children's Research Institute) Rapamycin resistant cells
EP3784351A1 (en) 2018-04-27 2021-03-03 Novartis AG Car t cell therapies with enhanced efficacy
US12522811B2 (en) 2018-05-01 2026-01-13 The Children's Medical Center Corporation Enhanced BCL11A RNP / CRISPR delivery and editing using a 3XNLS-CAS9
WO2019213013A1 (en) 2018-05-02 2019-11-07 The Children's Medical Center Corporation Improved bcl11a micrornas for treating hemoglobinopathies
SG11202010837XA (en) 2018-05-10 2020-11-27 Auxolytic Ltd Gene therapy methods and compositions using auxotrophic regulatable cells
CN112105732A (zh) * 2018-05-10 2020-12-18 先正达参股股份有限公司 用于多核苷酸的靶向编辑的方法和组合物
US11904081B2 (en) 2018-05-11 2024-02-20 Lupagen, Inc. Systems and methods for closed loop, real-time modifications of patient cells
AU2019265019B2 (en) 2018-05-11 2025-11-06 Beam Therapeutics Inc. Methods of substituting pathogenic amino acids using programmable base editor systems
EP3794130A4 (en) 2018-05-16 2022-07-27 Synthego Corporation METHODS AND SYSTEMS FOR DESIGNING AND USING GUIDE RNA
US12343397B2 (en) 2018-05-17 2025-07-01 Regents Of The University Of Minnesota Drug-resistant immune cells and methods of use thereof
EP3796920A4 (en) * 2018-05-22 2023-03-01 The Regents Of The University Of California TRNA/PRE-MIRNA COMPOSITIONS AND USE IN THE TREATMENT OF CANCER
EP3784776A4 (en) 2018-05-23 2022-01-26 National University of Singapore Blockade of cd2 surface expression and expression of chimeric antigen receptors for immunotherapy of t-cell malignancies
US12157760B2 (en) 2018-05-23 2024-12-03 The Broad Institute, Inc. Base editors and uses thereof
EP3572512A1 (en) 2018-05-24 2019-11-27 B.R.A.I.N. Ag A method for engineering a protein
US11866719B1 (en) 2018-06-04 2024-01-09 Inari Agriculture Technology, Inc. Heterologous integration of regulatory elements to alter gene expression in wheat cells and wheat plants
EP3802807B1 (en) * 2018-06-05 2024-11-20 LifeEDIT Therapeutics, Inc. Rna-guided nucleases and active fragments and variants thereof and methods of use
WO2019236893A2 (en) * 2018-06-07 2019-12-12 Allen Institute Stem cell lines containing endogenous, differentially-expressed tagged proteins, methods of production, and use thereof
FR3082208A1 (fr) 2018-06-11 2019-12-13 Fondation Mediterranee Infection Methode de modification d'une sequence cible d'acide nucleique d'une cellule hote
AU2019284911B2 (en) 2018-06-13 2026-04-09 Novartis Ag BCMA chimeric antigen receptors and uses thereof
WO2019246488A1 (en) 2018-06-21 2019-12-26 Duke University Compositions and methods for the production of pyruvic acid and related products using dynamic metabolic control
WO2020006458A1 (en) 2018-06-29 2020-01-02 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Recombinant adeno-associated virus products and methods for treating limb girdle muscular dystrophy 2a
AU2019291918B2 (en) 2018-06-29 2025-06-12 Editas Medicine, Inc. Synthetic guide molecules, compositions and methods relating thereto
WO2020002579A1 (en) 2018-06-29 2020-01-02 Stichting Het Nederlands Kanker Instituut - Antoni Van Leeuwenhoek Ziekenhuis Tweak-receptor agonists for use in combination with immunotherapy of a cancer
AU2019292919A1 (en) 2018-06-30 2021-03-11 Inscripta, Inc. Instruments, modules, and methods for improved detection of edited sequences in live cells
EP3820495A4 (en) 2018-07-09 2022-07-20 The Broad Institute Inc. RNA-PROGRAMMABLE EPIGENETIC RNA MODIFIERS AND THEIR USES
CN112823011B (zh) 2018-07-09 2026-05-08 加利福尼亚大学董事会 基于t细胞的免疫疗法的基因靶标
JP2021530212A (ja) 2018-07-13 2021-11-11 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニアThe Regents Of The University Of California レトロトランスポゾンベースの送達媒体及びその使用方法
US12018297B2 (en) 2018-07-16 2024-06-25 The Regents Of The University Of Michigan Nuclease-mediated nucleic acid modification
WO2020018918A1 (en) 2018-07-19 2020-01-23 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Methods for exon skipping and gene knockout using base editors
WO2020018964A1 (en) 2018-07-20 2020-01-23 Fred Hutchinson Cancer Research Center Compositions and methods for controlled expression of antigen-specific receptors
CN112567038A (zh) * 2018-07-24 2021-03-26 旗舰创业创新第六有限责任公司 包含环状多核糖核苷酸的组合物及其用途
US12421500B2 (en) 2018-07-26 2025-09-23 Children's Hospital Medical Center Hepato-biliary-pancreatic tissues and methods of making same
EP3830267A1 (en) * 2018-07-31 2021-06-09 Intellia Therapeutics, Inc. Compositions and methods for hydroxyacid oxidase 1 (hao1) gene editing for treating primary hyperoxaluria type 1 (ph1)
WO2020028617A1 (en) 2018-08-01 2020-02-06 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Compositions and methods for improving embryo development
WO2020028729A1 (en) 2018-08-01 2020-02-06 Mammoth Biosciences, Inc. Programmable nuclease compositions and methods of use thereof
EP3829652A4 (en) * 2018-08-01 2022-05-11 University of Maryland, Baltimore MODULATION OF MTORC1 ACTIVITY AND AUTOPHAGY BY CIB2-RHEB INTERACTION
AU2019317066A1 (en) 2018-08-07 2021-02-18 Modalis Therapeutics Corporation Novel transcription activator
US20210292389A1 (en) 2018-08-10 2021-09-23 Sangamo Therapeutics France New car constructs comprising tnfr2 domains
US10752874B2 (en) 2018-08-14 2020-08-25 Inscripta, Inc. Instruments, modules, and methods for improved detection of edited sequences in live cells
US11142740B2 (en) 2018-08-14 2021-10-12 Inscripta, Inc. Detection of nuclease edited sequences in automated modules and instruments
US10532324B1 (en) 2018-08-14 2020-01-14 Inscripta, Inc. Instruments, modules, and methods for improved detection of edited sequences in live cells
EP3821020A4 (en) 2018-08-15 2022-05-04 Zymergen Inc. APPLICATIONS OF CRISPRI IN HIGH-PERFORMANCE METABOLIC ENGINEERING
US12497611B2 (en) 2018-08-17 2025-12-16 Yale University Compositions and methods for high-throughput activation screening to boost T cell effector function
US12150967B2 (en) 2018-08-18 2024-11-26 Seed Health, Inc. Methods and compositions for honey bee health
US12421507B2 (en) * 2018-08-20 2025-09-23 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for optochemical control of CRISPR-CAS9
KR20210049119A (ko) 2018-08-22 2021-05-04 프레드 헛친슨 켄서 리서치 센터 Kras 또는 her2 항원을 표적으로 하는 면역요법
EP3841205A4 (en) 2018-08-22 2022-08-17 The Regents of The University of California Variant type v crispr/cas effector polypeptides and methods of use thereof
EP3841204A4 (en) 2018-08-23 2022-05-18 Sangamo Therapeutics, Inc. CHANGED TARGET SPECIFIC BASE EDITORS
WO2020047164A1 (en) 2018-08-28 2020-03-05 Vor Biopharma, Inc Genetically engineered hematopoietic stem cells and uses thereof
BR112021003830A2 (pt) 2018-08-28 2021-07-20 Fred Hutchinson Cancer Research Center métodos e composições para terapia celular t adotiva incorporando sinalização notch induzida
KR102913044B1 (ko) 2018-08-30 2026-01-16 더 유니버시티 오브 노쓰 캐롤라이나 엣 채플 힐 피드백이 가능한 합성 유전자, 표적 시드 매치 카세트, 및 그 용도
US11965154B2 (en) 2018-08-30 2024-04-23 Inscripta, Inc. Detection of nuclease edited sequences in automated modules and instruments
EP3844287B1 (en) 2018-08-31 2024-05-22 Yale University Compositions and methods for enhancing donor oligonucleotide-based gene editing
WO2020047353A1 (en) 2018-08-31 2020-03-05 Yale University Compositions and methods for enhancing triplex and nuclease-based gene editing
US12534743B2 (en) 2018-08-31 2026-01-27 Inari Agriculture Technology, Inc. Compositions, systems, and methods for genome editing
US12545910B2 (en) 2018-08-31 2026-02-10 Inari Agriculture Technology, Inc. Compositions, systems, and methods for genome editing
US11459551B1 (en) 2018-08-31 2022-10-04 Inari Agriculture Technology, Inc. Compositions, systems, and methods for genome editing
WO2020048942A1 (en) 2018-09-04 2020-03-12 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and pharmaceutical compositions for enhancing cytotoxic t lymphocyte-dependent immune responses
JP7444858B2 (ja) 2018-09-05 2024-03-06 アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル 喘息及びアレルギー性疾患を処置するための方法及び組成物
EP3850088A4 (en) 2018-09-07 2023-07-19 Beam Therapeutics, Inc. Compositions and methods for improving base editing
AU2019336245B2 (en) 2018-09-07 2026-02-26 Beam Therapeutics Inc. Compositions and methods for delivering a nucleobase editing system
US10724052B2 (en) 2018-09-07 2020-07-28 Crispr Therapeutics Ag Universal donor cells
EP3847251A1 (en) 2018-09-07 2021-07-14 Astrazeneca AB Compositions and methods for improved nucleases
EP3849545A1 (en) 2018-09-10 2021-07-21 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) Methods for the treatment of neurofibromatosis
JP2021535753A (ja) 2018-09-12 2021-12-23 チルドレンズ ホスピタル メディカル センター 造血幹細胞およびその派生体の生成のためのオルガノイド組成物
WO2020056122A1 (en) 2018-09-13 2020-03-19 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Complement factor h gene knockout rat as a model of c3 glomerulopathy
RU2706298C1 (ru) * 2018-09-14 2019-11-15 Закрытое Акционерное Общество "Биокад" НУКЛЕАЗА PaCas9
CA3113676A1 (en) 2018-09-21 2020-03-26 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for treating diabetes, and methods for enriching mrna coding for secreted proteins
US20240165232A1 (en) 2018-09-24 2024-05-23 Fred Hutchinson Cancer Research Center Chimeric receptor proteins and uses thereof
WO2020064702A1 (en) 2018-09-25 2020-04-02 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Use of antagonists of th17 cytokines for the treatment of bronchial remodeling in patients suffering from allergic asthma
GB201815820D0 (en) 2018-09-28 2018-11-14 Univ Wageningen Off-target activity inhibitors for guided endonucleases
WO2020072253A1 (en) 2018-10-01 2020-04-09 North Carolina State University Recombinant type i crispr-cas system and uses thereof for screening for variant cells
WO2020072250A1 (en) 2018-10-01 2020-04-09 North Carolina State University Recombinant type i crispr-cas system and uses thereof for genome modification and alteration of expression
WO2020070062A1 (en) 2018-10-01 2020-04-09 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Use of tim-3 inhibitors for the treatment of exacerbations in patients suffering from severe asthma
US10711267B2 (en) 2018-10-01 2020-07-14 North Carolina State University Recombinant type I CRISPR-Cas system
US12264330B2 (en) 2018-10-01 2025-04-01 North Carolina State University Recombinant type I CRISPR-Cas system and uses thereof for killing target cells
JP7288915B2 (ja) 2018-10-04 2023-06-08 株式会社カネカ 植物のゲノム編集に用いられるｄｎａ構築物
WO2020074937A1 (en) 2018-10-09 2020-04-16 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Use of alpha-v-integrin (cd51) inhibitors for the treatment of cardiac fibrosis
WO2020076976A1 (en) 2018-10-10 2020-04-16 Readcoor, Inc. Three-dimensional spatial molecular indexing
US11851663B2 (en) 2018-10-14 2023-12-26 Snipr Biome Aps Single-vector type I vectors
EP3867375A1 (en) 2018-10-15 2021-08-25 Fondazione Telethon Genome editing methods and constructs
CA3109984A1 (en) 2018-10-16 2020-04-23 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Genome edited fine mapping and causal gene identification
CA3116885A1 (en) 2018-10-17 2020-04-23 Crispr Therapeutics Ag Compositions and methods for delivering transgenes
WO2020081588A1 (en) 2018-10-17 2020-04-23 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Swi/snf family chromatin remodeling complexes and uses thereof
WO2020079162A1 (en) 2018-10-18 2020-04-23 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for inducing full ablation of hematopoiesis
EP3867376A1 (en) 2018-10-18 2021-08-25 Intellia Therapeutics, Inc. Nucleic acid constructs and methods of use
SG11202103733SA (en) 2018-10-18 2021-05-28 Intellia Therapeutics Inc Compositions and methods for transgene expression from an albumin locus
JP2022505381A (ja) 2018-10-18 2022-01-14 インテリア セラピューティクス，インコーポレーテッド アルファ１アンチトリプシン欠乏症を治療するための組成物及び方法
BR112021007301A2 (pt) 2018-10-18 2021-07-27 Intellia Therapeutics, Inc. composições e métodos para expressar fator ix
US11214781B2 (en) 2018-10-22 2022-01-04 Inscripta, Inc. Engineered enzyme
EP3870697A4 (en) 2018-10-22 2022-11-09 Inscripta, Inc. GMO ENZYMES
US11946047B2 (en) * 2018-10-23 2024-04-02 Texas Tech University System Treatment strategies against anthrax by interfering with critical host factors
UY38427A (es) 2018-10-26 2020-05-29 Novartis Ag Métodos y composiciones para terapia con células oculares
US11407995B1 (en) 2018-10-26 2022-08-09 Inari Agriculture Technology, Inc. RNA-guided nucleases and DNA binding proteins
WO2020092453A1 (en) 2018-10-29 2020-05-07 The Broad Institute, Inc. Nucleobase editors comprising geocas9 and uses thereof
US20210388389A1 (en) 2018-10-30 2021-12-16 Yale University Compositions and methods for rapid and modular generation of chimeric antigen receptor t cells
SG11202104409YA (en) 2018-10-31 2021-05-28 Zymergen Inc Multiplexed deterministic assembly of dna libraries
US20220010321A1 (en) 2018-11-01 2022-01-13 Keygene N.V. Dual guide rna for crispr/cas genome editing in plants cells
US11434477B1 (en) 2018-11-02 2022-09-06 Inari Agriculture Technology, Inc. RNA-guided nucleases and DNA binding proteins
US11965172B2 (en) 2018-11-05 2024-04-23 California Institute Of Technology DNA sequence modification-based gene drive
EP3877517A4 (en) 2018-11-09 2022-09-07 Inari Agriculture, Inc. RNA-DRIVEN NUCLEASES AND DNA-BINDING PROTEINS
KR20210102231A (ko) 2018-11-09 2021-08-19 프레드 헛친슨 켄서 리서치 센터 메소텔린에 특이적인 t 세포 수용체 및 면역요법에서의 그의 용도
US12194327B2 (en) 2018-11-14 2025-01-14 University Of Florida Research Foundation, Inc. Materials and methods for modifying Wolbachia and paratransformation of arthropods
CA3119618A1 (en) 2018-11-16 2020-05-22 Astellas Pharma Inc. Method for treating muscular dystrophy by targeting utrophin gene
RU2712497C1 (ru) * 2018-11-26 2020-01-29 Автономная некоммерческая образовательная организация высшего образования Сколковский институт науки и технологий Средство разрезания ДНК на основе Cas9 белка из биотехнологически значимой бактерии Clostridium cellulolyticum
TWI850282B (zh) 2018-11-27 2024-08-01 香港商弘年發展有限公司 用於治療癌症之質體建構體和使用方法
CN113166798B (zh) 2018-11-28 2025-05-02 主基因有限公司 通过核酸内切酶保护的靶向富集
CA3121191A1 (en) 2018-11-28 2020-06-04 Crispr Therapeutics Ag Optimized mrna encoding cas9 for use in lnps
JP2022513159A (ja) * 2018-11-29 2022-02-07 フラッグシップ パイオニアリング イノベーションズ ブイ， インコーポレイテッド Ｒｎａを調節する方法
WO2020112195A1 (en) 2018-11-30 2020-06-04 Yale University Compositions, technologies and methods of using plerixafor to enhance gene editing
KR20200071198A (ko) 2018-12-10 2020-06-19 네오이뮨텍, 인코퍼레이티드 Nrf2 발현 조절 기반 T 세포 항암면역치료법
US12612648B2 (en) 2018-12-12 2026-04-28 Kyushu University, National University Corporation Production method for genome-edited cells
US11166996B2 (en) 2018-12-12 2021-11-09 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Anellovirus compositions and methods of use
CN113166744B (zh) 2018-12-14 2025-02-07 先锋国际良种公司 用于基因组编辑的新颖crispr-cas系统
AU2019406778A1 (en) * 2018-12-17 2021-07-22 Massachusetts Institute Of Technology Crispr-associated transposase systems and methods of use thereof
AU2019400930A1 (en) 2018-12-19 2021-07-01 King's College London Immunotherapeutic methods and compositions
US11690362B2 (en) 2018-12-20 2023-07-04 Regeneran Pharmaceuticals, Inc. Nuclease-mediated repeat expansion
WO2020132647A1 (en) 2018-12-21 2020-06-25 Northwestern University Use of annexins in preventing and treating muscle membrane injury
AU2019417720A1 (en) * 2018-12-24 2021-07-08 Visterra, Inc. Methods for identifying epitopes and paratopes
SG11202106977PA (en) * 2018-12-27 2021-07-29 Lifeedit Therapeutics Inc Polypeptides useful for gene editing and methods of use
WO2020136216A1 (en) 2018-12-27 2020-07-02 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods of identifying subjects having or at risk of having a coagulation related disorder
US20220106640A1 (en) * 2018-12-31 2022-04-07 Htg Molecular Diagnostics, Inc. Methods of detecting dna and rna in the same sample
WO2020141199A1 (en) 2019-01-03 2020-07-09 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and pharmaceutical compositions for enhancing cd8+ t cell-dependent immune responses in subjects suffering from cancer
EP3931313A2 (en) 2019-01-04 2022-01-05 Mammoth Biosciences, Inc. Programmable nuclease improvements and compositions and methods for nucleic acid amplification and detection
TWI852977B (zh) * 2019-01-10 2024-08-21 美商健生生物科技公司 前列腺新抗原及其用途
EP3911746A1 (en) 2019-01-14 2021-11-24 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) Methods and kits for generating and selecting a variant of a binding protein with increased binding affinity and/or specificity
AU2020208190B2 (en) 2019-01-15 2022-07-28 Seminis Vegetable Seeds, Inc. Green bean plants with improved disease resistance
JP2022522265A (ja) 2019-01-16 2022-04-15 アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル エリスロフェロンの変異体及びその使用
US12540172B2 (en) 2019-01-17 2026-02-03 Universitat Autonoma De Barcelona (Uab) Therapeutic nanoconjugates comprising Stefin A and uses thereof
US12351837B2 (en) 2019-01-23 2025-07-08 The Broad Institute, Inc. Supernegatively charged proteins and uses thereof
WO2020154595A1 (en) 2019-01-24 2020-07-30 Massachusetts Institute Of Technology Nucleic acid nanostructure platform for antigen presentation and vaccine formulations formed therefrom
WO2020160100A1 (en) 2019-01-29 2020-08-06 Foghorn Therapeutics Inc. Compounds and uses thereof
WO2020160125A1 (en) * 2019-01-29 2020-08-06 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Compositions comprising an endonuclease and methods for purifying an endonuclease
WO2020160196A1 (en) 2019-01-29 2020-08-06 Foghorn Therapeutics Inc. Compounds and uses thereof
CN114040977B (zh) 2019-01-31 2024-09-03 比姆医疗股份有限公司 非靶脱氨反应减低的核碱基编辑器和用于定性核碱基编辑器的测定
WO2020160371A1 (en) 2019-02-01 2020-08-06 The University Of Hong Kong Innervated organoid compositions and methods of making same
US20220117911A1 (en) 2019-02-04 2022-04-21 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for modulating blood-brain barrier
EP3921417A4 (en) 2019-02-04 2022-11-09 The General Hospital Corporation VARIANTS OF ADENINE DNA BASES WITH REDUCED OFF-TARGET RNA EDIT
WO2020163856A1 (en) 2019-02-10 2020-08-13 The J. David Gladstone Institutes, A Testamentary Trust Established Under The Will Of J. David Gladstone Modified mitochondrion and methods of use thereof
SG11202108346WA (en) 2019-02-13 2021-08-30 Beam Therapeutics Inc Modified immune cells having adenosine deaminase base editors for modifying a nucleobase in a target sequence
AU2020223314A1 (en) 2019-02-13 2021-08-12 Beam Therapeutics Inc. Compositions and methods for treating alpha-1 antitrypsin deficiency
EP3923992A1 (en) 2019-02-15 2021-12-22 CRISPR Therapeutics AG Gene editing for hemophilia a with improved factor viii expression
WO2020168102A1 (en) 2019-02-15 2020-08-20 Sigma-Aldrich Co. Llc Crispr/cas fusion proteins and systems
WO2020169472A2 (en) 2019-02-18 2020-08-27 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods of inducing phenotypic changes in macrophages
GB201902277D0 (en) 2019-02-19 2019-04-03 King S College London Therapeutic agents
GB2596461B (en) 2019-02-20 2023-09-27 Fred Hutchinson Cancer Center Binding proteins specific for RAS neoantigens and uses thereof
WO2020176389A1 (en) 2019-02-25 2020-09-03 Caribou Biosciences, Inc. Plasmids for gene editing
CA3131390A1 (en) 2019-02-26 2020-09-03 Research Institute Of Nationwide Children's Hospital Adeno-associated virus vector delivery of b-sarcoglycan and the treatment of muscular dystrophy
EP3930735A1 (en) 2019-02-26 2022-01-05 The Regents of the University of Colorado, a body corporate Method and composition for treating gastrointestinal inflammatory disorders
WO2020180699A1 (en) * 2019-03-01 2020-09-10 Arbor Biotechnologies, Inc. Novel crispr dna targeting enzymes and systems
EP3935184B1 (en) 2019-03-04 2024-09-11 King Abdullah University Of Science And Technology Compositions and methods of targeted nucleic acid enrichment by loop adapter protection and exonuclease digestion
EP4219700A1 (en) * 2019-03-07 2023-08-02 The Regents of the University of California Crispr-cas effector polypeptides and methods of use thereof
CA3129871A1 (en) 2019-03-08 2020-09-17 Zymergen Inc. Iterative genome editing in microbes
US11053515B2 (en) 2019-03-08 2021-07-06 Zymergen Inc. Pooled genome editing in microbes
WO2020185796A1 (en) 2019-03-11 2020-09-17 Fred Hutchinson Cancer Research Center High avidity wt1 t cell receptors and uses thereof
US20220145333A1 (en) 2019-03-11 2022-05-12 Sorrento Therapeutics, Inc. Improved process for integration of dna constructs using rna-guided endonucleases
US20220145274A1 (en) * 2019-03-12 2022-05-12 Crispr Therapeutics Ag Novel high fidelity rna-programmable endonuclease systems and uses thereof
US11845931B2 (en) 2019-03-18 2023-12-19 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. CRISPR/Cas screening platform to identify genetic modifiers of tau seeding or aggregation
CA3127814C (en) 2019-03-18 2024-05-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Crispr/cas dropout screening platform to reveal genetic vulnerabilities associated with tau aggregation
EP3942043A2 (en) 2019-03-19 2022-01-26 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for editing nucleotide sequences
EP3946466A2 (en) 2019-03-25 2022-02-09 Flagship Pioneering Innovations VI, LLC Compositions comprising modified circular polyribonucleotides and uses thereof
CN113631713A (zh) 2019-03-25 2021-11-09 因思科瑞普特公司 酵母中的同时多重基因组编辑
US11001831B2 (en) 2019-03-25 2021-05-11 Inscripta, Inc. Simultaneous multiplex genome editing in yeast
EP3947425A1 (en) 2019-03-27 2022-02-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Plant explant transformation
WO2020193740A1 (en) 2019-03-28 2020-10-01 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) New strategy for treating pancreatic cancer
WO2020201073A1 (en) 2019-03-29 2020-10-08 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for the treatment of keloid, hypertrophic scars and/or hyperpigmentation disorders
US20220177978A1 (en) 2019-04-02 2022-06-09 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods of predicting and preventing cancer in patients having premalignant lesions
JP7524214B2 (ja) 2019-04-03 2024-07-29 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 抗体コード配列をセーフハーバー遺伝子座に挿入するための方法および組成物
ES2966625T3 (es) 2019-04-04 2024-04-23 Regeneron Pharma Roedores que comprenden un locus del factor de coagulación 12 humanizado
AU2020253531C1 (en) 2019-04-04 2022-06-16 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for scarless introduction of targeted modifications into targeting vectors
CA3136113A1 (en) 2019-04-05 2020-10-08 Danisco Us Inc. Methods for polynucleotide integration into the genome of bacillus using dual circular recombinant dna constructs and compositions thereof
JP2022526982A (ja) 2019-04-05 2022-05-27 ダニスコ・ユーエス・インク 線状組換えＤＮＡコンストラクトを使用してバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）のゲノムにドナーＤＮＡ配列を組み込むための方法及びその組成物
CA3136061A1 (en) 2019-04-05 2020-10-08 Osaka University Method for producing knock-in cell
WO2020208082A1 (en) 2019-04-09 2020-10-15 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Method for treating cmv related diseases
WO2020208185A1 (en) 2019-04-12 2020-10-15 Astrazeneca Ab Compositions and methods for improved gene editing
GB201905360D0 (en) 2019-04-16 2019-05-29 Univ Nottingham Fungal strains, production and uses thereof
WO2020214842A1 (en) 2019-04-17 2020-10-22 The Broad Institute, Inc. Adenine base editors with reduced off-target effects
EP3959320A1 (en) 2019-04-24 2022-03-02 Novartis AG Compositions and methods for selective protein degradation
WO2020223514A2 (en) * 2019-04-30 2020-11-05 Emendobio Inc. Novel omni-50 crispr nuclease
PE20220003A1 (es) 2019-04-30 2022-01-05 Edigene Inc Metodo para la prediccion de eficacia del tratamiento de hemoglobinopatia
WO2020221796A1 (en) 2019-04-30 2020-11-05 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for treating melanoma
US11692197B2 (en) 2019-05-06 2023-07-04 Inari Agriculture Technology, Inc. Delivery of biological molecules to plant cells
WO2020225606A1 (en) 2019-05-08 2020-11-12 Crispr Therapeutics Ag Crispr/cas all-in-two vector systems for treatment of dmd
US12297440B2 (en) 2019-05-10 2025-05-13 Basf Se Regulatory nucleic acid molecules for enhancing gene expression in plants
JP2022533713A (ja) 2019-05-21 2022-07-25 サンガモ セラピューティクス， インコーポレイテッド 調節性ｔ細胞における制御された導入遺伝子発現
US20220228153A1 (en) 2019-05-23 2022-07-21 Vor Biopharma Inc. Compositions and methods for cd33 modification
WO2020239623A1 (en) 2019-05-24 2020-12-03 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Use of ngal inhibitors for the treating chronic wound
MX2021014528A (es) 2019-05-29 2022-01-06 Monsanto Technology Llc Metodos y composiciones para generar alelos dominantes usando edicion del genoma.
CN114174494A (zh) 2019-05-31 2022-03-11 儿童医院医学中心 产生和扩增造血干细胞的方法
CA3141814A1 (en) 2019-05-31 2020-12-03 Children's Hospital Medical Center Shaped organoid compositions and methods of making same
WO2020245210A1 (en) 2019-06-04 2020-12-10 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) A neuropilin antagonist in combination with a p38alpha-kinase inhibitor for the treatment of cancer
US11891618B2 (en) 2019-06-04 2024-02-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mouse comprising a humanized TTR locus with a beta-slip mutation and methods of use
US12523663B2 (en) 2019-06-04 2026-01-13 Inserm (Institut National De La Santé Et De La Rescherche Médicale) Use of CD9 as a biomarker and as a biotarget in glomerulonephritis or glomerulosclerosis
US10837021B1 (en) 2019-06-06 2020-11-17 Inscripta, Inc. Curing for recursive nucleic acid-guided cell editing
KR20220032050A (ko) 2019-06-07 2022-03-15 스크라이브 테라퓨틱스 인크. 조작된 casx 시스템
CA3137764A1 (en) 2019-06-07 2020-12-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a humanized albumin locus
WO2020249769A1 (en) 2019-06-14 2020-12-17 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for treating ocular diseases related to mitochondrial dna maintenance
KR20220024053A (ko) 2019-06-14 2022-03-03 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 타우병증의 모델
US10907125B2 (en) 2019-06-20 2021-02-02 Inscripta, Inc. Flow through electroporation modules and instrumentation
WO2020257395A1 (en) 2019-06-21 2020-12-24 Inscripta, Inc. Genome-wide rationally-designed mutations leading to enhanced lysine production in e. coli
IL267614A (en) 2019-06-24 2019-09-26 Lotem Michal Nucleic acids to modulate SLAMF6 isoforms
US11905532B2 (en) 2019-06-25 2024-02-20 Massachusetts Institute Of Technology Compositions and methods for molecular memory storage and retrieval
US10927385B2 (en) 2019-06-25 2021-02-23 Inscripta, Inc. Increased nucleic-acid guided cell editing in yeast
CN120665955A (zh) 2019-06-25 2025-09-19 伊纳瑞农业技术有限公司 改善的同源依赖修复基因组编辑
JP7706380B2 (ja) 2019-06-27 2025-07-11 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド Ｔｄｐ－４３タンパク症のモデル化
WO2021001431A1 (en) 2019-07-02 2021-01-07 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Use of pi3ka-selective inhibitors for treating metastatic disease in patients suffering from pancreatic cancer
EP3993786A1 (en) 2019-07-02 2022-05-11 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for the prophylactic treatment of cancer in patients suffering from pancreatitis
GB201909597D0 (en) 2019-07-03 2019-08-14 Univ Wageningen Crispr type v-u1 system from mycobacterium mucogenicum and uses thereof
JP7609436B2 (ja) 2019-07-12 2025-01-07 国立研究開発法人理化学研究所 顕性型変異遺伝子に由来する疾患の治療剤
US10653731B1 (en) 2019-07-15 2020-05-19 Vigene Biosciences Inc. Recombinantly-modified adeno-associated virus (rAAV) having improved packaging efficiency
US10801042B1 (en) 2019-07-15 2020-10-13 Vigene Biosciences, Inc. Use of ion concentrations to increase the packaging efficiency of recombinant adeno-associated virus
US10557149B1 (en) 2019-07-15 2020-02-11 Vigene Biosciences, Inc. Recombinantly-modified adeno-associated virus helper vectors and their use to improve the packaging efficiency of recombinantly-modified adeno-associated virus
WO2021009692A1 (en) 2019-07-15 2021-01-21 Medimmune Limited Tripartite systems for protein dimerization and methods of use
WO2021009299A1 (en) 2019-07-17 2021-01-21 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Bcl-xl:fkbp12 fusion proteins suitable for screening agents capable of slowing down the aging process
US11746354B2 (en) 2019-07-19 2023-09-05 Inari Agriculture Technology, Inc. Homology dependent repair genome editing
US20220249426A1 (en) 2019-07-24 2022-08-11 Inserm (Institut National De La Santé Et De La Recherch Médicale) Inhibitors of the sting pathway for the treatment of hidradenitis suppurativa
EP4007584A1 (en) 2019-08-02 2022-06-08 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) Neutralizing granzyme b for providing cardioprotection in a subject who experienced a myocardial infarction
WO2021028359A1 (en) 2019-08-09 2021-02-18 Sangamo Therapeutics France Controlled expression of chimeric antigen receptors in t cells
US12179199B2 (en) 2019-08-09 2024-12-31 The Regents Of The University Of California Microfluidic single-cell pairing array for studying cell-cell interactions in isolated compartments
WO2021030344A1 (en) * 2019-08-12 2021-02-18 Lifeedit, Inc. Rna-guided nucleases and active fragments and variants thereof and methods of use
US12612657B2 (en) 2019-08-16 2026-04-28 The Jackson Laboratory Extrachromosomal DNA labeling
AU2020334064A1 (en) 2019-08-20 2022-03-03 Fred Hutchinson Cancer Center T-cell immunotherapy specific for WT-1
EP4488287A3 (en) 2019-08-21 2025-03-05 Research Institute at Nationwide Children's Hospital Adeno-associated virus vector delivery of alpha-sarcoglycan and the treatment of muscular dystrophy
WO2021041971A1 (en) 2019-08-28 2021-03-04 Vor Biopharma, Inc. Compositions and methods for cll1 modification
EP4022069A4 (en) * 2019-08-28 2023-12-20 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University MODIFIED CIRCULAR RNAS AND METHOD OF USE THEREOF
US20220333116A1 (en) 2019-08-28 2022-10-20 Vor Biopharma Inc. Compositions and methods for cd123 modification
US12485180B2 (en) 2019-08-30 2025-12-02 Yale University Compositions and methods for delivery of nucleic acids to cells
WO2021046155A1 (en) 2019-09-03 2021-03-11 Voyager Therapeutics, Inc. Vectorized editing of nucleic acids to correct overt mutations
WO2021043278A1 (zh) 2019-09-04 2021-03-11 博雅辑因（北京）生物科技有限公司 基于脱靶评估评价基因编辑治疗的方法
US11118195B2 (en) 2019-09-05 2021-09-14 Crispr Therapeutics Ag Universal donor cells
CN114729381A (zh) 2019-09-05 2022-07-08 本森希尔股份有限公司 修饰基因组的组合物和方法
US20220340975A1 (en) 2019-09-05 2022-10-27 INSERM (Institute National de la Santé et de la Recherche Médicale) Method of treatment and pronostic of acute myeloid leukemia
AU2020340622A1 (en) 2019-09-05 2022-03-03 Crispr Therapeutics Ag Universal donor cells
CN114729343B (zh) * 2019-09-10 2026-02-13 科学方案有限责任公司 新的2类ii型和v型crispr-cas rna指导的内切核酸酶
CN114729382A (zh) 2019-09-12 2022-07-08 巴斯夫欧洲公司 增强植物中基因表达的调节性核酸分子
WO2021047775A1 (en) 2019-09-12 2021-03-18 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Use of inhibitors of tgfb/activinb signaling pathway for the treatment of patients suffering from medulloblastoma group 3
US20210079394A1 (en) 2019-09-13 2021-03-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Transcription modulation in animals using crispr/cas systems delivered by lipid nanoparticles
AU2020352552A1 (en) 2019-09-23 2022-03-17 Omega Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating hepatocyte nuclear factor 4-alpha (HNF4α) gene expression
CN114391040A (zh) 2019-09-23 2022-04-22 欧米茄治疗公司 用于调节载脂蛋白b(apob)基因表达的组合物和方法
US11542513B2 (en) 2019-09-26 2023-01-03 Seminis Vegetable Seeds, Inc. Lettuce plants having resistance to Nasonovia ribisnigri biotype Nr:1
CN115279398B (zh) 2019-09-27 2025-07-04 比姆医疗股份有限公司 治疗液态癌症的组合物和方法
JP2022549519A (ja) * 2019-09-30 2022-11-25 シグマ－アルドリッチ・カンパニー・リミテッド・ライアビリティ・カンパニー 標的化ヌクレアーゼを用いたマイクロバイオータ組成の調節
WO2021063968A1 (en) 2019-09-30 2021-04-08 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Method and composition for diagnosing chronic obstructive pulmonary disease
WO2021064180A1 (en) 2019-10-03 2021-04-08 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for modulating macrophages polarization
CN115103910A (zh) 2019-10-03 2022-09-23 工匠开发实验室公司 具有工程化的双引导核酸的crispr系统
WO2021069387A1 (en) 2019-10-07 2021-04-15 Basf Se Regulatory nucleic acid molecules for enhancing gene expression in plants
US12435330B2 (en) 2019-10-10 2025-10-07 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for prime editing RNA
KR20220079832A (ko) 2019-10-11 2022-06-14 스미또모 가가꾸 가부시끼가이샤 핵산 올리고머의 제조 방법
CN114651067B (zh) * 2019-10-15 2025-08-22 新加坡科技研究局 测量核酸修饰酶活性的测定
EP3808766A1 (en) 2019-10-15 2021-04-21 Sangamo Therapeutics France Chimeric antigen receptor specific for interleukin-23 receptor
WO2021078359A1 (en) 2019-10-21 2021-04-29 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Use of inhibitors of cubilin for the treatment of chronic kidney diseases
US11591607B2 (en) * 2019-10-24 2023-02-28 Pairwise Plants Services, Inc. Optimized CRISPR-Cas nucleases and base editors and methods of use thereof
US20240122938A1 (en) 2019-10-29 2024-04-18 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for treating uveal melanoma
JP7756639B2 (ja) 2019-11-08 2025-10-20 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド Ｘ連鎖性若年網膜分離療法のためのｃｒｉｓｐｒおよびａａｖ戦略
AU2020382219A1 (en) * 2019-11-13 2022-05-12 Crispr Therapeutics Ag Manufacturing process for making T cells expressing chimeric antigen receptors
AR120470A1 (es) * 2019-11-13 2022-02-16 Crispr Therapeutics Ag Métodos para fabricar células t car
WO2021102059A1 (en) 2019-11-19 2021-05-27 Inscripta, Inc. Methods for increasing observed editing in bacteria
WO2021101950A1 (en) 2019-11-19 2021-05-27 Danisco Us Inc Selection marker free methods for modifying the genome of bacillus and compositions thereof
US12338468B2 (en) 2019-11-20 2025-06-24 Corbion Biotech, Inc. Sucrose invertase variants
WO2021099600A1 (en) 2019-11-22 2021-05-27 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Inhibitors of adrenomedullin for the treatment of acute myeloid leukemia by eradicating leukemic stem cells
CN110938659B (zh) * 2019-11-22 2022-05-10 广东省微生物研究所（广东省微生物分析检测中心） 一种提高纤维堆囊菌埃博霉素产量的dCas9载体及其构建方法
WO2021108363A1 (en) 2019-11-25 2021-06-03 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Crispr/cas-mediated upregulation of humanized ttr allele
KR20220104217A (ko) 2019-11-26 2022-07-26 노파르티스 아게 Cd19 및 cd22 키메라 항원 수용체 및 이의 용도
US20230357796A1 (en) 2019-11-27 2023-11-09 Danmarks Tekniske Universitet Constructs, compositions and methods thereof having improved genome editing efficiency and specificity
US12241839B2 (en) 2019-11-27 2025-03-04 Promega Corporation Multipartite luciferase peptides and polypeptides
WO2021105368A1 (en) 2019-11-27 2021-06-03 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Use of neuropilin antagonists for the treatment of endometriosis
CN114945273B (zh) 2019-11-29 2025-08-12 巴斯夫欧洲公司 增加植物对抗真菌感染的抗性
CN121759549A (zh) 2019-12-03 2026-03-31 比姆医疗股份有限公司 合成向导rna、其组合物、方法和用途
AU2020396138A1 (en) 2019-12-03 2022-06-16 Basf Se Regulatory nucleic acid molecules for enhancing gene expression in plants
KR20250033331A (ko) 2019-12-10 2025-03-07 인스크립타 인코포레이티드 신규 mad 뉴클레아제
US10704033B1 (en) 2019-12-13 2020-07-07 Inscripta, Inc. Nucleic acid-guided nucleases
GB201918586D0 (en) 2019-12-17 2020-01-29 Patterson James Engineered platelets for targeted delivery of a therapeutic agent
CA3157127A1 (en) 2019-12-18 2021-06-24 Aamir MIR Cascade/dcas3 complementation assays for in vivo detection of nucleic acid-guided nuclease edited cells
EP4706689A2 (en) 2019-12-19 2026-03-11 Entrada Therapeutics, Inc. Compositions for delivery of antisense compounds
WO2021122687A1 (en) 2019-12-19 2021-06-24 Basf Se Increasing space-time-yield, carbon-conversion-efficiency and carbon substrate flexibility in the production of fine chemicals
CN115135762A (zh) 2019-12-20 2022-09-30 巴斯夫欧洲公司 降低萜烯的毒性和增加微生物的生产潜力
IL271656A (en) 2019-12-22 2021-06-30 Yeda Res & Dev System and methods for identifying cells that have undergone genome editing
EP3842452A1 (en) 2019-12-26 2021-06-30 Universitat Autònoma de Barcelona Scaffold proteins and therapeutic nanoconjugates based on nidogen
CN114867850A (zh) 2019-12-30 2022-08-05 博雅缉因（北京）生物科技有限公司 一种纯化ucart细胞的方法与应用
US20230059884A1 (en) 2019-12-30 2023-02-23 Edigene Biotechnology Inc. Universal car-t targeting t-cell lymphoma cell and preparation method therefor and use thereof
US11859172B2 (en) 2020-01-02 2024-01-02 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Programmable and portable CRISPR-Cas transcriptional activation in bacteria
CN110982820A (zh) * 2020-01-03 2020-04-10 云南中烟工业有限责任公司 一种烟草单倍体的基因编辑方法
US10689669B1 (en) 2020-01-11 2020-06-23 Inscripta, Inc. Automated multi-module cell processing methods, instruments, and systems
EP4090770A1 (en) 2020-01-17 2022-11-23 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for treating melanoma
WO2021148447A1 (en) 2020-01-21 2021-07-29 Limagrain Europe Wheat haploid inducer plant and uses
WO2021151073A2 (en) * 2020-01-24 2021-07-29 The General Hospital Corporation Unconstrained genome targeting with near-pamless engineered crispr-cas9 variants
WO2021151085A2 (en) 2020-01-24 2021-07-29 The General Hospital Corporation Crispr-cas enzymes with enhanced on-target activity
KR20220133257A (ko) 2020-01-27 2022-10-04 인스크립타 인코포레이티드 전기천공 모듈 및 기구
CN115175559A (zh) 2020-01-28 2022-10-11 瑞泽恩制药公司 包含人源化pnpla3基因座的非人动物及其使用方法
KR20220133878A (ko) 2020-01-29 2022-10-05 스미또모 가가꾸 가부시끼가이샤 핵산 올리고머의 제조 방법
CN115362264A (zh) 2020-01-29 2022-11-18 10X基因组学有限公司 用于分析物检测的组合物和方法
BR112022015004A2 (pt) 2020-01-29 2022-09-20 Foghorn Therapeutics Inc Composto, composição farmacêutica, métodos para diminuir a atividade de um complexo baf, induzir apoptose, reduzir o crescimento tumoral, suprimir a progressão e a colonização metastática do câncer e reduzir o nível e/ou a atividade de brg1 e/ou brm em um câncer e métodos de tratamento e de inibição de brm e brg1
CN115003680B (zh) 2020-01-29 2025-01-28 住友化学株式会社 制备核酸寡聚物的方法
WO2021152402A1 (en) * 2020-01-29 2021-08-05 Jenthera Therapeutics Inc. Nuclease-scaffold composition delivery platform
WO2021158883A1 (en) 2020-02-07 2021-08-12 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a humanized klkb1 locus and methods of use
WO2021165508A1 (en) 2020-02-21 2021-08-26 Biogemma Prime editing technology for plant genome engineering
CN115485300A (zh) 2020-02-26 2022-12-16 索伦托药业有限公司 具有通用掩蔽部分的可活化的抗原结合蛋白
CA3167369A1 (en) 2020-03-04 2021-09-10 Tara YOUNG Methods and compositions for sensitization of tumor cells to immune therapy
EP4114952A4 (en) * 2020-03-05 2024-05-08 Board of Regents of the University of Nebraska Crispr/cas9 system for multistrain hiv-1 treatment
US20230058352A1 (en) * 2020-03-11 2023-02-23 Sigma-Aldrich Co. Llc High Fidelity SpCas9 Nucleases for Genome Modification
WO2021183720A1 (en) 2020-03-11 2021-09-16 Omega Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating forkhead box p3 (foxp3) gene expression
JP2023517992A (ja) 2020-03-12 2023-04-27 インスティチュート フォー ベーシック サイエンス ゲノム配列変異を有する細胞死滅誘導用組成物及び該組成物を用いた細胞死滅誘導方法
AU2021236683A1 (en) 2020-03-19 2022-11-17 Intellia Therapeutics, Inc. Methods and compositions for directed genome editing
AU2021237790A1 (en) 2020-03-20 2022-10-13 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Chimeric antigen receptor specific for human CD45RC and uses thereof
EP4125348A1 (en) 2020-03-23 2023-02-08 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a humanized ttr locus comprising a v30m mutation and methods of use
US20240099210A1 (en) 2020-03-26 2024-03-28 National Agriculture And Food Research Organization Method for producing temperature-sensitive male sterile plant
CN115335387A (zh) 2020-03-27 2022-11-11 住友化学株式会社 核酸寡聚物的制造方法
US12057197B2 (en) 2020-04-03 2024-08-06 Creyon Bio, Inc. Oligonucleotide-based machine learning
WO2021204877A2 (en) 2020-04-08 2021-10-14 Astrazeneca Ab Compositions and methods for improved site-specific modification
WO2021204878A1 (en) 2020-04-08 2021-10-14 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Use of cdon inhibitors for the treatment of endothelial dysfunction
WO2021217083A1 (en) 2020-04-24 2021-10-28 Sorrento Therapeutics, Inc. Memory dimeric antigen receptors
US20210332388A1 (en) 2020-04-24 2021-10-28 Inscripta, Inc. Compositions, methods, modules and instruments for automated nucleic acid-guided nuclease editing in mammalian cells
TW202208626A (zh) 2020-04-24 2022-03-01 美商生命編輯公司 Rna引導核酸酶及其活性片段與變體，以及使用方法
US20230201375A1 (en) * 2020-04-27 2023-06-29 Duke University Targeted genomic integration to restore neurofibromin coding sequence in neurofibromatosis type 1 (nf1)
US20230348852A1 (en) 2020-04-27 2023-11-02 Novartis Ag Methods and compositions for ocular cell therapy
CN115698268A (zh) 2020-05-04 2023-02-03 萨利欧基因治疗公司 基于转座的疗法
MX2022013879A (es) * 2020-05-04 2023-02-01 Editas Medicine Inc Selección por inserción génica en genes esenciales.
JP2023525263A (ja) 2020-05-05 2023-06-15 ジーナス ピーエルシー Ｃｄ１６３不活化のターゲティングにより、ブタ種の健康状態を改善するための方法
EP4146797A1 (en) 2020-05-06 2023-03-15 Orchard Therapeutics (Europe) Limited Treatment for neurodegenerative diseases
WO2021224401A1 (en) 2020-05-07 2021-11-11 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for determining a reference range of β-galactose exposure platelet
BR112022022603A2 (pt) 2020-05-08 2023-01-17 Broad Inst Inc Métodos e composições para edição simultânea de ambas as fitas de sequência alvo de nucleotídeos de fita dupla
JP7856581B2 (ja) 2020-05-13 2026-05-11 アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル β－ヘモグロビン異常症の処置のための塩基編集アプローチ
WO2021230385A1 (en) 2020-05-15 2021-11-18 Astellas Pharma Inc. Method for treating muscular dystrophy by targeting utrophin gene
US11787841B2 (en) 2020-05-19 2023-10-17 Inscripta, Inc. Rationally-designed mutations to the thrA gene for enhanced lysine production in E. coli
US12383555B2 (en) 2020-05-20 2025-08-12 Foghorn Therapeutics Inc. Methods of treating cancers
US11263022B2 (en) * 2020-05-21 2022-03-01 Microsoft Technology Licensing, Llc Mechanism to turn on/off post-processing features in the device media foundation transform
EP4161552A1 (en) 2020-06-05 2023-04-12 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods for treating neoplasia
WO2021245224A1 (en) 2020-06-05 2021-12-09 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and pharmaceutical compositions for treating ocular diseases
CN111748539B (zh) * 2020-06-11 2021-10-22 中国农业科学院农产品加工研究所 CRISPR/LpCas9基因编辑系统及其应用
CN116096862A (zh) 2020-06-11 2023-05-09 诺华股份有限公司 Zbtb32抑制剂及其用途
US20230218608A1 (en) 2020-06-18 2023-07-13 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) New strategy for treating pancreatic cancer
CA3184128A1 (en) 2020-06-23 2021-12-30 Kathleen Barnes Methods for diagnosing respiratory pathogens and predicting covid-19 related outcomes
US20230232796A1 (en) 2020-06-26 2023-07-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a humanized ace2 locus
WO2022009052A2 (en) 2020-07-06 2022-01-13 Janssen Biotech, Inc. Prostate neoantigens and their uses
WO2022008597A1 (en) 2020-07-08 2022-01-13 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and pharmaceutical composition for the treatment of infectious diseases
US20230340524A1 (en) * 2020-07-08 2023-10-26 The Jackson Laboratory Transgenic mouse models supporting human innate immune function
KR20230037586A (ko) 2020-07-09 2023-03-16 가부시키가이샤 모달리스 Mapt 유전자를 표적으로 하는 알츠하이머병의 치료 방법
WO2022008935A1 (en) 2020-07-10 2022-01-13 Horizon Discovery Limited Method for producing genetically modified cells
CA3173949A1 (en) 2020-07-15 2022-01-20 LifeEDIT Therapeutics, Inc. Uracil stabilizing proteins and active fragments and variants thereof and methods of use
AU2021204717A1 (en) 2020-07-15 2022-02-03 Seminis Vegetable Seeds, Inc. Green Bean Plants with Improved Disease Resistance
EP4189071A1 (en) 2020-08-03 2023-06-07 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) Population of treg cells functionally committed to exert a regulatory activity and their use for adoptive therapy
WO2022032085A1 (en) 2020-08-07 2022-02-10 The Jackson Laboratory Targeted sequence insertion compositions and methods
CN116583607A (zh) 2020-08-13 2023-08-11 耶鲁大学 用于工程改造和选择具有期望表型的car t细胞的组合物和方法
US20220049303A1 (en) 2020-08-17 2022-02-17 Readcoor, Llc Methods and systems for spatial mapping of genetic variants
US20220056470A1 (en) 2020-08-18 2022-02-24 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Multiple disease resistance genes and genomic stacks thereof
EP4097486A4 (en) 2020-08-20 2023-09-06 A2 Biotherapeutics, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS OF TREATMENT OF POSITIVE CANCERS AT CEACAM
EP4058474B1 (en) 2020-08-20 2024-05-08 A2 Biotherapeutics, Inc. Compositions and methods for treating egfr positive cancers
WO2022040454A1 (en) 2020-08-20 2022-02-24 A2 Biotherapeutics, Inc. Compositions and methods for treating mesothelin positive cancers
MX2023002281A (es) * 2020-08-24 2023-05-16 Metagenomi Inc Sistemas y metodos para transposicion de secuencias de nucleotidos de carga.
WO2022047165A1 (en) 2020-08-28 2022-03-03 Vor Biopharma Inc. Compositions and methods for cd123 modification
WO2022047168A1 (en) 2020-08-28 2022-03-03 Vor Biopharma Inc. Compositions and methods for cll1 modification
IL301014A (en) 2020-08-31 2023-05-01 Univ Yale Compositions and methods for delivery of nucleic acids to cells
CN116134141A (zh) 2020-09-04 2023-05-16 国立大学法人神户大学 包含小型化胞苷脱氨酶的双链dna修饰用复合体
EP4211235A2 (en) 2020-09-11 2023-07-19 Lifeedit Therapeutics, Inc. Dna modifying enzymes and active fragments and variants thereof and methods of use
US20240041932A1 (en) 2020-09-14 2024-02-08 Vor Biopharma Inc. Compositions and methods for cd5 modification
US20230398219A1 (en) 2020-09-14 2023-12-14 Vor Biopharma Inc. Compositions and methods for cd38 modification
WO2022060749A1 (en) 2020-09-15 2022-03-24 Inscripta, Inc. Crispr editing to embed nucleic acid landing pads into genomes of live cells
US20240033290A1 (en) 2020-09-18 2024-02-01 Vor Biopharma Inc. Compositions and methods for cd7 modification
EP4214311A2 (en) 2020-09-18 2023-07-26 Artisan Development Labs, Inc. Constructs and uses thereof for efficient and specific genome editing
CN116724053A (zh) 2020-09-24 2023-09-08 弗雷德哈钦森癌症中心 靶向sox2抗原的免疫治疗
WO2022066973A1 (en) 2020-09-24 2022-03-31 Fred Hutchinson Cancer Research Center Immunotherapy targeting pbk or oip5 antigens
KR20230074525A (ko) * 2020-09-24 2023-05-30 플래그쉽 파이어니어링 이노베이션스 브이, 인크. 유전자 발현을 억제하기 위한 조성물 및 방법
CN116209668A (zh) 2020-09-24 2023-06-02 住友化学株式会社 核酸寡聚物的制造方法
US12576151B2 (en) 2020-09-25 2026-03-17 Beam Therapeutics Inc. Fratricide resistant modified immune cells and methods of using the same
WO2022067240A1 (en) 2020-09-28 2022-03-31 Vor Biopharma, Inc. Compositions and methods for cd6 modification
US10894812B1 (en) 2020-09-30 2021-01-19 Alpine Roads, Inc. Recombinant milk proteins
US10947552B1 (en) 2020-09-30 2021-03-16 Alpine Roads, Inc. Recombinant fusion proteins for producing milk proteins in plants
US20230364146A1 (en) 2020-09-30 2023-11-16 Vor Biopharma Inc. Compositions and methods for cd30 gene modification
EP4222264A1 (en) 2020-09-30 2023-08-09 CRISPR Therapeutics AG Materials and methods for treatment of amyotrophic lateral sclerosis
IL301396A (en) 2020-09-30 2023-05-01 Nobell Foods Inc Recombinant milk proteins and food compositions comprising the same
JP2023545403A (ja) 2020-10-02 2023-10-30 リマグレン、ヨーロッパ Ｃｒｉｓｐｒを介した指令コドン書換え
EP4226160A1 (en) 2020-10-05 2023-08-16 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) Gdf3 as biomarker and biotarget in post-ischemic cardiac remodeling
TW202222841A (zh) 2020-10-06 2022-06-16 福瑞德哈金森腫瘤研究中心 用於治療表現mage-a1之疾病的組成物及方法
US20230407366A1 (en) 2020-10-06 2023-12-21 Keygene N.V. Targeted sequence addition
US20240016855A1 (en) 2020-10-13 2024-01-18 Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) Targeted-antibacterial-plasmids combining conjugation and crispr/cas systems and uses thereof
AU2021364781B2 (en) 2020-10-21 2025-10-09 Massachusetts Institute Of Technology Systems, methods, and compositions for site-specific genetic engineering using programmable addition via site-specific targeting elements (paste)
WO2022084531A1 (en) 2020-10-23 2022-04-28 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for treating glioma
EP4236970A1 (en) 2020-10-27 2023-09-06 Vor Biopharma Inc. Compositions and methods for treating hematopoietic malignancy
WO2022094245A1 (en) 2020-10-30 2022-05-05 Vor Biopharma, Inc. Compositions and methods for bcma modification
JP2023549139A (ja) * 2020-11-04 2023-11-22 エメンドバイオ・インコーポレイテッド 新規ｏｍｎｉ－５０ ｃｒｉｓｐｒヌクレアーゼ－ｒｎａ複合体
CN112553195B (zh) * 2020-11-05 2022-04-05 南方医科大学 一种用于CRISPR-Cas9定点突变编辑DNMT1基因的试剂及其应用
EP4242237A4 (en) 2020-11-06 2025-01-01 Editforce, Inc. FOKI NUCLEASE DOMAIN VARIANT
KR102875461B1 (ko) 2020-11-09 2025-10-24 삼성전자주식회사 전자 장치 및 그의 연락처를 관리하는 방법
US11512297B2 (en) 2020-11-09 2022-11-29 Inscripta, Inc. Affinity tag for recombination protein recruitment
CA3201003A1 (en) 2020-11-13 2022-05-19 Vor Biopharma Inc. Methods and compositions relating to genetically engineered cells expressing chimeric antigen receptors
MX2023005609A (es) 2020-11-13 2023-05-29 Novartis Ag Terapias de combinacion con celulas que expresan receptores quimericos para el antigeno (car).
EP4244391A1 (en) 2020-11-16 2023-09-20 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for predicting and treating uveal melanoma
WO2022115506A2 (en) 2020-11-24 2022-06-02 University Of Houston System Salicylic acid-inducible gene expression compositions and systems for cells
EP4251761A1 (en) 2020-11-24 2023-10-04 Keygene N.V. Targeted enrichment using nanopore selective sequencing
US11459372B2 (en) 2020-11-30 2022-10-04 Crispr Therapeutics Ag Gene-edited natural killer cells
EP4256052A1 (en) 2020-12-02 2023-10-11 Decibel Therapeutics, Inc. Crispr sam biosensor cell lines and methods of use thereof
PE20231178A1 (es) 2020-12-03 2023-08-01 Scribe Therapeutics Inc Sistemas crispr tipo v clase 2 disenados por ingenieria
WO2022132836A2 (en) 2020-12-14 2022-06-23 Fred Hutchinson Cancer Research Center Compositions and methods for cellular immunotherapy
KR20230124682A (ko) 2020-12-23 2023-08-25 플래그쉽 파이어니어링 이노베이션스 브이, 인크. Rna를 봉입하는 아넬로바이러스 캡시드의 시험관 내어셈블리
CN116848235A (zh) 2020-12-30 2023-10-03 因特利亚治疗公司 工程化t细胞
US11473060B2 (en) 2020-12-30 2022-10-18 Crispr Therapeutics Ag Compositions and methods for differentiating stem cells into NK cells
AU2021413252A1 (en) 2020-12-31 2023-06-08 Vor Biopharma Inc. Compositions and methods for cd34 gene modification
KR20230146007A (ko) 2020-12-31 2023-10-18 크리스퍼 테라퓨틱스 아게 범용 공여자 세포
CA3204158A1 (en) 2021-01-04 2022-07-07 Juhan Kim Mad nucleases
CA3207144A1 (en) 2021-01-05 2022-07-14 Horizon Discovery Limited Method for producing genetically modified cells
US11332742B1 (en) 2021-01-07 2022-05-17 Inscripta, Inc. Mad nucleases
EP4277989A2 (en) 2021-01-12 2023-11-22 March Therapeutics, Inc. Context-dependent, double-stranded dna-specific deaminases and uses thereof
US20240110175A1 (en) * 2021-01-19 2024-04-04 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Composition and method for high-multiplexed genome engineering using synthetic crispr arrays
WO2022158898A1 (ko) * 2021-01-21 2022-07-28 한국생명공학연구원 Francisella novicida cas9 모듈 기반의 역전사 효소를 사용한 유전체 치환 및 삽입 기술
US11873485B2 (en) 2021-01-26 2024-01-16 California Institute Of Technology Allosteric conditional guide RNAs for cell-selective regulation of CRISPR/Cas
US12171813B2 (en) 2021-02-05 2024-12-24 Christiana Care Gene Editing Institute, Inc. Methods of and compositions for reducing gene expression and/or activity
KR20230142740A (ko) * 2021-02-08 2023-10-11 에멘도바이오 인코포레이티드 Omni-103 crispr 뉴클레아제
US20240425885A1 (en) * 2021-02-08 2024-12-26 Emendobio Inc. OMNI 90-99, 101, 104-110, 114, 116, 118-123, 125, 126, 128, 129, and 131-138 CRISPR NUCLEASE
US11884924B2 (en) 2021-02-16 2024-01-30 Inscripta, Inc. Dual strand nucleic acid-guided nickase editing
WO2022177979A1 (en) 2021-02-16 2022-08-25 A2 Biotherapeutics, Inc. Compositions and methods for treating her2 positive cancers
WO2022180153A1 (en) 2021-02-25 2022-09-01 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Allele-specific genome editing of the nr2e3 mutation g56r
EP4298212A4 (en) 2021-02-25 2026-04-15 Celyntra Therapeutics Sa Compositions and methods for targeting, editing, or modifying genes
WO2022187125A1 (en) * 2021-03-01 2022-09-09 The Regents Of The University Of California Methods for generating a crispr array
GB202103131D0 (en) 2021-03-05 2021-04-21 Biosystems Tech Limited Method for preparation of research organisms
JP2024509268A (ja) 2021-03-09 2024-02-29 フォグホーン セラピューティクス インコーポレイテッド 結晶形、それらを含有する組成物、及びそれらの使用方法
WO2022194908A1 (en) 2021-03-17 2022-09-22 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for treating melanoma
CN117295817A (zh) 2021-03-22 2023-12-26 生命编辑制药股份有限公司 Dna修饰酶及其活性片段和变体以及使用方法
US20250270575A1 (en) 2021-04-07 2025-08-28 Neoplants Sas Compositions and methods for indoor air remediation
JP2024513087A (ja) 2021-04-07 2024-03-21 アストラゼネカ・アクチエボラーグ 部位特異的改変のための組成物及び方法
WO2022217086A1 (en) 2021-04-09 2022-10-13 Vor Biopharma Inc. Photocleavable guide rnas and methods of use thereof
WO2022214681A1 (en) 2021-04-09 2022-10-13 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for the treatment of anaplastic large cell lymphoma
WO2022219181A1 (en) 2021-04-15 2022-10-20 Keygene N.V. Co-regeneration recalcitrant plants
WO2022219175A1 (en) 2021-04-15 2022-10-20 Keygene N.V. Mobile endonucleases for heritable mutations
WO2022221699A1 (en) 2021-04-16 2022-10-20 Beam Therapeutics, Inc. Genetic modification of hepatocytes
CA3214540A1 (en) 2021-04-22 2022-10-27 Pasi A. Janne Compositions and methods for treating cancer
EP4326903A1 (en) 2021-04-23 2024-02-28 Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) Methods and compositions for treating cell senescence accumulation related disease
WO2022240846A1 (en) 2021-05-10 2022-11-17 Sqz Biotechnologies Company Methods for delivering genome editing molecules to the nucleus or cytosol of a cell and uses thereof
WO2022248645A1 (en) 2021-05-27 2022-12-01 Astrazeneca Ab Cas9 effector proteins with enhanced stability
WO2022251644A1 (en) 2021-05-28 2022-12-01 Lyell Immunopharma, Inc. Nr4a3-deficient immune cells and uses thereof
EP4419672A2 (en) 2021-06-01 2024-08-28 Artisan Development Labs, Inc. Compositions and methods for targeting, editing, or modifying genes
TW202307210A (zh) 2021-06-01 2023-02-16 瑞士商諾華公司 Ｃｄ１９和ｃｄ２２嵌合抗原受體及其用途
WO2022256440A2 (en) 2021-06-01 2022-12-08 Arbor Biotechnologies, Inc. Gene editing systems comprising a crispr nuclease and uses thereof
WO2022256578A2 (en) 2021-06-02 2022-12-08 Beam Therapeutics Inc. Circular guide rnas for crispr/cas editing systems
JP2024520676A (ja) 2021-06-02 2024-05-24 ライエル・イミュノファーマ・インコーポレイテッド Ｎｒ４ａ３欠損免疫細胞及びその使用
WO2022261115A1 (en) 2021-06-07 2022-12-15 Yale University Peptide nucleic acids for spatiotemporal control of crispr-cas binding
AU2022290278A1 (en) 2021-06-11 2024-01-04 LifeEDIT Therapeutics, Inc. Rna polymerase iii promoters and methods of use
GB202108585D0 (en) 2021-06-16 2021-07-28 Rockend Ltd Methods and compositions
EP4370676A2 (en) 2021-06-18 2024-05-22 Artisan Development Labs, Inc. Compositions and methods for targeting, editing or modifying human genes
WO2022269393A1 (en) 2021-06-23 2022-12-29 Crispr Therapeutics Ag Engineered cells with improved protection from natural killer cell killing
WO2022272293A1 (en) * 2021-06-23 2022-12-29 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Compositions and methods for efficient retron production and genetic editing
WO2023283585A2 (en) 2021-07-06 2023-01-12 Vor Biopharma Inc. Inhibitor oligonucleotides and methods of use thereof
WO2023283359A2 (en) 2021-07-07 2023-01-12 Omega Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating secreted frizzled receptor protein 1 (sfrp1) gene expression
WO2023283495A1 (en) * 2021-07-09 2023-01-12 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Crispr-based protein barcoding and surface assembly
US20250250319A1 (en) 2021-07-15 2025-08-07 Fred Hutchinson Cancer Center Chimeric transmembrane polypeptides comprising a tgf beta receptor extracellular domain, a transmembrane domain and an interleukin receptor 2 intracellular signalling domain and its use in therapy
EP4373931A1 (en) 2021-07-23 2024-05-29 Beam Therapeutics Inc. Guide rnas for crispr/cas editing systems
WO2023010135A1 (en) 2021-07-30 2023-02-02 Tune Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating expression of methyl-cpg binding protein 2 (mecp2)
EP4377459A2 (en) 2021-07-30 2024-06-05 Tune Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating expression of frataxin (fxn)
EP4381062A1 (en) 2021-08-02 2024-06-12 Vor Biopharma Inc. Compositions and methods for gene modification
KR102574819B1 (ko) 2021-08-09 2023-09-04 경상국립대학교산학협력단 P34와 이의 상동체 동시 타겟 유전자교정 시스템 및 이의 용도
KR102573948B1 (ko) 2021-08-09 2023-09-01 경상국립대학교산학협력단 Mips1과 이의 상동체 동시 타겟 유전자교정 시스템 및 이의 용도
KR102573947B1 (ko) 2021-08-09 2023-09-01 경상국립대학교산학협력단 콩 유전자교정 효율 증대를 위한 유전자교정 시스템 및 이의 용도
KR102584891B1 (ko) 2021-08-09 2023-10-04 경상국립대학교산학협력단 GmIPK1 유전자교정 시스템 및 이의 용도
KR102573952B1 (ko) 2021-08-09 2023-09-01 경상국립대학교산학협력단 E2와 이의 상동체 동시 타겟 유전자교정 시스템 및 이의 용도
EP4144841A1 (en) * 2021-09-07 2023-03-08 Bayer AG Novel small rna programmable endonuclease systems with impoved pam specificity and uses thereof
CA3230609A1 (en) 2021-09-08 2023-03-16 Shaorong Chong Compositions comprising a crispr nuclease and uses thereof
WO2023039586A1 (en) 2021-09-10 2023-03-16 Agilent Technologies, Inc. Guide rnas with chemical modification for prime editing
KR20240095525A (ko) 2021-09-21 2024-06-25 스크라이브 테라퓨틱스 인크. 조작된 casx 억제 시스템
JP2024535920A (ja) 2021-09-27 2024-10-02 ブイオーアール バイオファーマ インコーポレーテッド 遺伝子編集のための融合ポリペプチド及びその使用方法
JP2024536851A (ja) 2021-09-27 2024-10-08 モンサント テクノロジー エルエルシー 単子葉植物種子から切除された胚外植片を形質転換するための組成物及び方法
WO2023052366A1 (en) 2021-09-28 2023-04-06 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Base editing approaches for the treatment of beta-hemoglobinopathies
EP4596697A3 (en) 2021-09-28 2025-08-27 Acrigen Biosciences Compositions and methods for nucleic acid modifications
KR20240082343A (ko) 2021-09-28 2024-06-10 스미또모 가가꾸 가부시끼가이샤 정제 디클로로아세트산의 제조 방법
AU2022356427A1 (en) 2021-09-30 2024-05-09 Akouos, Inc. Compositions and methods for treating kcnq4-associated hearing loss
EP4408996A2 (en) 2021-09-30 2024-08-07 Astrazeneca AB Use of inhibitors to increase efficiency of crispr/cas insertions
KR102703683B1 (ko) 2021-10-06 2024-09-09 주식회사 진코어 유전자 편집을 위한 TaRGET 시스템 및 이의 용도
US20230183687A1 (en) * 2021-10-13 2023-06-15 University Of Massachusetts Modified guide rnas for neisseria meningitidis cas9
IL311570A (en) 2021-10-14 2024-05-01 Arsenal Biosciences Inc Immune cells with common expression chain and logic gate systems
IL311962A (en) 2021-10-14 2024-06-01 Lonza Sales Ag Modified producer cells for extracellular vesicle production
US12285497B2 (en) 2021-10-15 2025-04-29 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Self-complementary adeno-associated virus vector and its use in treatment of muscular dystrophy
US20250241999A1 (en) 2021-10-15 2025-07-31 Georgia State University Research Foundation, Inc. Delivery of therapeutic recombinant uricase using nanoparticles
WO2023070043A1 (en) 2021-10-20 2023-04-27 Yale University Compositions and methods for targeted editing and evolution of repetitive genetic elements
AU2022368907A1 (en) 2021-10-20 2024-05-02 University Of Copenhagen Rejuvenation treatment of age-related white matter loss
WO2023068212A1 (ja) 2021-10-22 2023-04-27 公益財団法人東京都医学総合研究所 神経変性及び筋萎縮モデル動物
EP4422661A1 (en) 2021-10-26 2024-09-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Overexpression of lemd2, lemd3, or chmp7 as a therapeutic modality for tauopathy
EP4423119A1 (en) 2021-10-27 2024-09-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for expressing factor ix for hemophilia b therapy
JP2024540086A (ja) 2021-10-28 2024-10-31 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド Ｃ５をノックアウトするためのｃｒｉｓｐｒ／ｃａｓ関連方法及び組成物
WO2023077148A1 (en) 2021-11-01 2023-05-04 Tome Biosciences, Inc. Single construct platform for simultaneous delivery of gene editing machinery and nucleic acid cargo
US20240426823A1 (en) 2021-11-03 2024-12-26 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Methods and compositions for treating triple negative breast cancer (tnbc)
EP4426832A1 (en) 2021-11-03 2024-09-11 The J. David Gladstone Institutes, A Testamentary Trust Established under The Will of J. David Gladstone Precise genome editing using retrons
US20250017183A1 (en) 2021-11-04 2025-01-16 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a modified cacng1 locus
CA3236152A1 (en) 2021-11-09 2023-05-19 Vor Biopharma Inc. Compositions and methods for erm2 modification
EP4433512A4 (en) 2021-11-19 2025-12-31 Univ Pennsylvania Genetically modified pan-leukocyte-specific CD45 antigen to facilitate T-lymphocyte therapy
GB202117314D0 (en) 2021-11-30 2022-01-12 Clarke David John Cyclic nucleic acid fragmentation
WO2023099591A1 (en) 2021-12-01 2023-06-08 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for increasing fetal hemoglobin content by editing the +55-kb region of the erythroid-specific bcl11a enhancer
US12582104B2 (en) 2021-12-08 2026-03-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mutant myocilin disease model and uses thereof
WO2023105000A1 (en) 2021-12-09 2023-06-15 Zygosity Limited Vector
US20230193310A1 (en) 2021-12-10 2023-06-22 Seminis Vegetabe Seeds, Inc. Lettuce plants having resistance to downy mildew
WO2023105244A1 (en) 2021-12-10 2023-06-15 Pig Improvement Company Uk Limited Editing tmprss2/4 for disease resistance in livestock
GB202118058D0 (en) 2021-12-14 2022-01-26 Univ Warwick Methods to increase yields in crops
US20230279442A1 (en) 2021-12-15 2023-09-07 Versitech Limited Engineered cas9-nucleases and method of use thereof
WO2023111173A1 (en) 2021-12-16 2023-06-22 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) An ezh2 degrader or inhibitor for use in the treatment of resistant acute myeloid leukemia
EP4447649A1 (en) 2021-12-17 2024-10-23 Keygene N.V. Double decapitation of plants
EP4451863A1 (en) 2021-12-20 2024-10-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising humanized ace2 and tmprss loci
WO2023119135A1 (en) 2021-12-21 2023-06-29 Benson Hill, Inc. Compositions and methods for modifying genomes
CA3243006A1 (en) 2021-12-21 2025-02-27 Alia Therapeutics Srl TYPE II CAS PROTEINS AND THEIR APPLICATIONS
WO2023118165A1 (en) 2021-12-21 2023-06-29 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for treating melanoma
EP4452335A1 (en) 2021-12-22 2024-10-30 Tome Biosciences, Inc. Co-delivery of a gene editor construct and a donor template
KR20240133725A (ko) 2021-12-23 2024-09-04 유니버시티 오브 매사추세츠 취약 x 관련 장애의 치료용 치료제
EP4457342A1 (en) 2021-12-29 2024-11-06 Bristol-Myers Squibb Company Generation of landing pad cell lines
CA3247927A1 (en) 2022-01-14 2023-07-20 Tune Therapeutics, Inc. Compositions, systems and methods for programming T-lymphocyte phenotypes by targeted gene repression
US20250134999A1 (en) 2022-01-14 2025-05-01 Tune Therapeutics, Inc. Compositions, systems, and methods for programming t cell phenotypes through targeted gene activation
WO2023141602A2 (en) 2022-01-21 2023-07-27 Renagade Therapeutics Management Inc. Engineered retrons and methods of use
CN119317713A (zh) 2022-01-24 2025-01-14 生命编辑制药股份有限公司 Rna引导核酸酶、其活性片段与变体，及使用方法
WO2023144104A1 (en) 2022-01-25 2023-08-03 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Base editing approaches for the treatment of βeta-thalassemia
WO2023144235A1 (en) 2022-01-27 2023-08-03 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for monitoring and treating warburg effect in patients with pi3k-related disorders
WO2023150181A1 (en) 2022-02-01 2023-08-10 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for treating cancer
CA3242731A1 (en) 2022-02-02 2023-08-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-tfr:gaa and anti-cd63:gaa insertions for treatment of pompe disease
EP4475671A1 (en) 2022-02-07 2024-12-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for defining optimal treatment timeframes in lysosomal disease
EP4223877A1 (en) * 2022-02-08 2023-08-09 Eberhard Karls Universität Tübingen Medizinische Fakultät System and method for editing genomic dna to modulate splicing
CA3242729A1 (en) 2022-02-11 2023-08-17 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for screening 4r tau targeting agents
EP4479534A1 (en) 2022-02-14 2024-12-25 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) Treatment of liver cancers by disrupting the beta-catenin/tcf-4 binding site located upstream of meg3 in the dlk1/dio3 locus
WO2023159103A1 (en) 2022-02-17 2023-08-24 The Board Of Regents Of The University Of Texas System CRISPR/SpCas9 VARIANT AND METHODS FOR ENHANCED CORRECTON OF DUCHENNE MUSCULAR DYSTROPHY MUTATIONS
EP4479143A1 (en) 2022-02-18 2024-12-25 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) Use of tcr-deficient car-tregs in combination with anti-tcr complex monoclonal antibodies for inducing durable tolerance
AU2022201166B2 (en) * 2022-02-21 2024-02-22 Zhuhai Shu Tong Medical Technology Co., Ltd. Type ii crispr/cas9 genome editing system and the application thereof
US12157886B2 (en) * 2022-02-21 2024-12-03 Zhuhai Shu Tong Medical Technology Co., Ltd. Type II CRISPR/Cas9 genome editing system and the application thereof
WO2023164636A1 (en) 2022-02-25 2023-08-31 Vor Biopharma Inc. Compositions and methods for homology-directed repair gene modification
EP4482955A2 (en) * 2022-02-25 2025-01-01 Duke University Crispr-cas9 compositions and methods with a novel cas9 protein for genome editing and gene regulation
US12037616B2 (en) 2022-03-01 2024-07-16 Crispr Therapeutics Ag Methods and compositions for treating angiopoietin-like 3 (ANGPTL3) related conditions
EP4486881A1 (en) 2022-03-01 2025-01-08 Celyntra Therapeutics SA Composition and methods for transgene insertion
KR20240162536A (ko) 2022-03-23 2024-11-15 스미또모 가가꾸 가부시끼가이샤 핵산 올리고머의 제조 방법
US20230302423A1 (en) 2022-03-28 2023-09-28 Massachusetts Institute Of Technology Rna scaffolded wireframe origami and methods thereof
JP2025511728A (ja) 2022-04-04 2025-04-16 ブイオーアール バイオファーマ インコーポレーテッド エピトープを操作することを媒介するための組成物及び方法
WO2023194359A1 (en) 2022-04-04 2023-10-12 Alia Therapeutics Srl Compositions and methods for treatment of usher syndrome type 2a
WO2023205744A1 (en) 2022-04-20 2023-10-26 Tome Biosciences, Inc. Programmable gene insertion compositions
CN114864002B (zh) * 2022-04-28 2023-03-10 广西科学院 一种基于深度学习的转录因子结合位点识别方法
EP4514981A2 (en) 2022-04-29 2025-03-05 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Identification of tissue-specific extragenic safe harbors for gene therapy approaches
CN119136844A (zh) 2022-05-02 2024-12-13 泰莱托恩基金会第三部门组织 用于基因编辑的同源非依赖性靶向整合
WO2023215725A1 (en) 2022-05-02 2023-11-09 Fred Hutchinson Cancer Center Compositions and methods for cellular immunotherapy
WO2023215831A1 (en) 2022-05-04 2023-11-09 Tome Biosciences, Inc. Guide rna compositions for programmable gene insertion
EP4522726A1 (en) 2022-05-09 2025-03-19 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Vectors and methods for in vivo antibody production
EP4522647A1 (en) 2022-05-10 2025-03-19 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Base editing approaches for correcting the cd39 (cag>tag) mutation in patients suffering from beta-thalassemia
US20250304959A1 (en) * 2022-05-13 2025-10-02 Sri International Programmable recruitment of transcription factors to endogenous genes
KR20250027283A (ko) 2022-05-19 2025-02-25 라이엘 이뮤노파마, 인크. nr4a3을 표적하는 폴리뉴클레오타이드 및 이의 용도
WO2023225670A2 (en) 2022-05-20 2023-11-23 Tome Biosciences, Inc. Ex vivo programmable gene insertion
US20250308637A1 (en) 2022-05-20 2025-10-02 Celyntra Therapeutics Sa Systems and methods for assessing risk of genome editing events
EP4532768A2 (en) 2022-05-25 2025-04-09 Flagship Pioneering Innovations VII, LLC Compositions and methods for modulating circulating factors
WO2023230570A2 (en) 2022-05-25 2023-11-30 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Compositions and methods for modulating genetic drivers
CA3254044A1 (en) 2022-05-25 2023-11-30 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc COMPOSITIONS AND MODULATION METHODS OF TUMOR SUPPRESSANTS AND ONCOGENS
CN119563038A (zh) 2022-05-25 2025-03-04 旗舰创业创新七公司 用于调节免疫应答的组合物和方法
JP2025517967A (ja) 2022-05-25 2025-06-12 フラッグシップ パイオニアリング イノベーションズ セブン，エルエルシー サイトカインを調節するための組成物及び方法
US20250344681A1 (en) 2022-05-31 2025-11-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Animal model of tdp-43 proteinopathy
WO2023235725A2 (en) 2022-05-31 2023-12-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Crispr-based therapeutics for c9orf72 repeat expansion disease
JP2025521154A (ja) 2022-05-31 2025-07-08 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド Ｃ９ｏｒｆ７２反復伸長疾患のためのｃｒｉｓｐｒ干渉療法
WO2023233342A2 (en) 2022-06-01 2023-12-07 Crispr Therapeutics Ag Gene-edited natural killer cells
WO2023233339A1 (en) 2022-06-01 2023-12-07 Crispr Therapeutics Ag Compositions and methods for differentiating stem cells into nk cells
GB2634837A (en) 2022-06-07 2025-04-23 Scribe Therapeutics Inc Compositions and methods for the targeting of PCSK9
US20230404003A1 (en) 2022-06-21 2023-12-21 Seminis Vegetable Seeds, Inc. Novel qtls conferring resistance to cucumber mosaic virus
KR20250044484A (ko) 2022-06-24 2025-03-31 튠 쎄라퓨틱스, 인코포레이티드 표적 유전자 억제를 통해 저밀도 지단백질을 감소시키기 위한 조성물, 시스템, 및 방법
JP2025525437A (ja) 2022-06-29 2025-08-05 インテリア セラピューティクス，インコーポレイテッド 操作されたｔ細胞
GB202209518D0 (en) 2022-06-29 2022-08-10 Snipr Biome Aps Treating & preventing E coli infections
EP4299739A1 (en) 2022-06-30 2024-01-03 Inari Agriculture Technology, Inc. Compositions, systems, and methods for genome editing
WO2024005864A1 (en) 2022-06-30 2024-01-04 Inari Agriculture Technology, Inc. Compositions, systems, and methods for genome editing
EP4299733A1 (en) 2022-06-30 2024-01-03 Inari Agriculture Technology, Inc. Compositions, systems, and methods for genome editing
WO2024005863A1 (en) 2022-06-30 2024-01-04 Inari Agriculture Technology, Inc. Compositions, systems, and methods for genome editing
EP4548351A1 (en) 2022-06-30 2025-05-07 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Artificial intelligence-mediated methods and systems for genome editing
GB2621813A (en) 2022-06-30 2024-02-28 Univ Newcastle Preventing disease recurrence in Mitochondrial replacement therapy
JP7152094B1 (ja) 2022-06-30 2022-10-12 リージョナルフィッシュ株式会社 ｔｒａｃｒＲＮＡユニット、及びゲノム編集方法
JP2025521677A (ja) 2022-07-06 2025-07-10 アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル 増殖性糸球体腎炎を処置するための方法
EP4554967A2 (en) 2022-07-12 2025-05-21 Tune Therapeutics, Inc. Compositions, systems, and methods for targeted transcriptional activation
WO2024015925A2 (en) 2022-07-13 2024-01-18 Vor Biopharma Inc. Compositions and methods for artificial protospacer adjacent motif (pam) generation
WO2024013514A2 (en) 2022-07-15 2024-01-18 Pig Improvement Company Uk Limited Gene edited livestock animals having coronavirus resistance
CN120344660A (zh) 2022-07-18 2025-07-18 雷纳嘉德医疗管理公司 基因编辑组分、系统和使用方法
WO2024018056A1 (en) 2022-07-22 2024-01-25 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Base editing approaches for correcting the ivs2-1 (g>a) mutation in patients suffering from βeta-thalassemia
WO2024020587A2 (en) 2022-07-22 2024-01-25 Tome Biosciences, Inc. Pleiopluripotent stem cell programmable gene insertion
AU2023311477A1 (en) 2022-07-22 2025-01-30 The Johns Hopkins University Dendrimer-enabled targeted intracellular crispr/cas system delivery and gene editing
US20260015580A1 (en) 2022-07-25 2026-01-15 The Regents Of The University Of California Methods of Producing and Using Avian Embryonic Stem Cells and Avian Telencephalic Organoids
WO2024023734A1 (en) 2022-07-26 2024-02-01 Bit Bio Limited MULTI-gRNA GENOME EDITING
JPWO2024024873A1 (sr) 2022-07-28 2024-02-01
IL317261A (en) 2022-07-29 2025-01-01 Regeneron Pharma Non-human animals containing a modified transferrin receptor locus
KR20250054842A (ko) 2022-07-29 2025-04-23 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 뇌 및 근육으로의 트랜스페린 수용체(tfr)-매개 전달을 위한 조성물 및 방법
US20260060969A1 (en) 2022-08-04 2026-03-05 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Methods for the treatment of lymphoproliferative disorders
KR20250044256A (ko) 2022-08-05 2025-03-31 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 Tdp-43의 응집 저항성 변이체
WO2024036190A2 (en) 2022-08-09 2024-02-15 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Guide polynucleotide multiplexing
MA71732A (fr) 2022-08-12 2025-05-30 Life Edit Therapeutics, Inc. Nucléases guidées par arn et fragments actifs, variants associés et procédés d'utilisation
CN120435557A (zh) 2022-08-19 2025-08-05 图恩疗法股份有限公司 通过靶向基因阻遏调节乙型肝炎病毒的组合物、系统和方法
WO2024044723A1 (en) 2022-08-25 2024-02-29 Renagade Therapeutics Management Inc. Engineered retrons and methods of use
EP4577650A1 (en) 2022-08-25 2025-07-02 Life Edit Therapeutics, Inc. Chemical modification of guide rnas with locked nucleic acid for rna guided nuclease-mediated gene editing
WO2024042165A2 (en) 2022-08-26 2024-02-29 UCB Biopharma SRL Novel rna-guided nucleases and nucleic acid targeting systems comprising such rna-guided nucleases
WO2024042168A1 (en) 2022-08-26 2024-02-29 UCB Biopharma SRL Novel rna-guided nucleases and nucleic acid targeting systems comprising such rna-guided nucleases
EP4580658A1 (en) 2022-08-31 2025-07-09 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Method to generate more efficient car-t cells
WO2024047247A1 (en) 2022-09-02 2024-03-07 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Base editing approaches for the treatment of amyotrophic lateral sclerosis
EP4583905A1 (en) 2022-09-06 2025-07-16 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Novel dual split car-t cells for the treatment of cd38-positive hematological malignancies
WO2024056659A1 (en) 2022-09-13 2024-03-21 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Method for treating prostate cancer and other epithelial cancers
CA3267752A1 (en) 2022-09-16 2024-03-21 Alia Therapeutics Srl ENQP TYPE II CAS PROTEINS AND THEIR APPLICATIONS
AU2023347831A1 (en) * 2022-09-19 2025-04-10 Emendobio Inc. Biallelic knockout of cish
WO2024064642A2 (en) 2022-09-19 2024-03-28 Tune Therapeutics, Inc. Compositions, systems, and methods for modulating t cell function
WO2024064824A2 (en) 2022-09-21 2024-03-28 Yale University Compositions and methods for identification of membrane targets for enhancement of nk cell therapy
WO2024064958A1 (en) 2022-09-23 2024-03-28 Lyell Immunopharma, Inc. Methods for culturing nr4a-deficient cells
WO2024064952A1 (en) 2022-09-23 2024-03-28 Lyell Immunopharma, Inc. Methods for culturing nr4a-deficient cells overexpressing c-jun
CA3265590A1 (en) 2022-09-28 2024-04-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. MODIFIED ANTIBODY-RESISTANT RECEPTORS TO IMPROVE CELL-BASED THERAPIES
WO2024073751A1 (en) 2022-09-29 2024-04-04 Vor Biopharma Inc. Methods and compositions for gene modification and enrichment
EP4593590A1 (en) 2022-09-29 2025-08-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Correction of hepatosteatosis in humanized liver animals through restoration of il6/il6r/gp130 signaling in human hepatocytes
WO2024077174A1 (en) 2022-10-05 2024-04-11 Lyell Immunopharma, Inc. Methods for culturing nr4a-deficient cells
JP2025536260A (ja) 2022-10-11 2025-11-05 イェール ユニバーシティー 細胞透過性抗体の組成物および使用方法
JP7353602B1 (ja) 2022-10-14 2023-10-02 株式会社インプランタイノベーションズ ゲノム編集方法およびゲノム編集用組成物
US20260125694A1 (en) 2022-10-20 2026-05-07 Base Se Regulatory nucleic acid molecules for enhancing gene expression in plants
WO2024084034A1 (en) 2022-10-21 2024-04-25 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Methods and pharmaceutical compositions for the treatment of osteoarthritis
JP2025535369A (ja) 2022-10-21 2025-10-24 ウォッチメイカー ジェノミクス， インコーポレイテッド シーケンシングライブラリー正規化のための方法および組成物
WO2024089953A1 (ja) 2022-10-27 2024-05-02 住友化学株式会社 オリゴヌクレオチドの製造方法
CN115678903B (zh) * 2022-11-03 2024-04-02 贵州大学 一种白背飞虱Ago1基因、合成dsRNA的方法及其应用
CN120693347A (zh) 2022-11-04 2025-09-23 瑞泽恩制药公司 钙电压门控通道辅助亚基γ1(CACNG1)结合蛋白和CACNG1介导的向骨骼肌的递送
AU2023374241A1 (en) 2022-11-04 2025-06-12 Life Edit Therapeutics, Inc. Evolved adenine deaminases and rna-guided nuclease fusion proteins with internal insertion sites and methods of use
WO2024102434A1 (en) 2022-11-10 2024-05-16 Senda Biosciences, Inc. Rna compositions comprising lipid nanoparticles or lipid reconstructed natural messenger packs
WO2024107765A2 (en) 2022-11-14 2024-05-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for fibroblast growth factor receptor 3-mediated delivery to astrocytes
WO2024107670A1 (en) 2022-11-16 2024-05-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Chimeric proteins comprising membrane bound il-12 with protease cleavable linkers
WO2024105162A1 (en) 2022-11-16 2024-05-23 Alia Therapeutics Srl Type ii cas proteins and applications thereof
KR20250126156A (ko) 2022-11-18 2025-08-22 교토후고리츠다이가쿠호진 미토파지 유도를 위한 조성물 및 그의 용도
AU2023406926A1 (en) 2022-12-01 2025-06-26 Yale University Stimuli-responsive traceless engineering platform for intracellular payload delivery
WO2024118881A1 (en) 2022-12-01 2024-06-06 Genencor International Bv Iterative muliplex genome engineering in microbial cells using a bidirectional selection marker system
EP4627076A1 (en) 2022-12-01 2025-10-08 Danisco Us Inc Iterative multiplex genome engineering in microbial cells using a recombinant self-excisable selection marker system
WO2024118882A1 (en) 2022-12-01 2024-06-06 Genencor International Bv Iterative multiplex genome engineering in microbial cells using a selection marker swapping system
WO2024123786A1 (en) 2022-12-06 2024-06-13 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods and compositions for co-delivery of t-dnas expressing multiple guide polynucleotides into plants
EP4631048A1 (en) 2022-12-07 2025-10-15 Sanofi Predicting indel frequencies
JP2026504733A (ja) 2022-12-16 2026-02-09 ライフ エディット セラピューティクス，インコーポレイティド Ｔｒａｃ遺伝子を標的とするガイドｒｎａおよび使用方法
WO2024127369A1 (en) 2022-12-16 2024-06-20 LifeEDIT Therapeutics, Inc. Guide rnas that target foxp3 gene and methods of use
WO2024138194A1 (en) 2022-12-22 2024-06-27 Tome Biosciences, Inc. Platforms, compositions, and methods for in vivo programmable gene insertion
AU2023408647A1 (en) 2022-12-22 2025-06-12 Keygene N.V. Regeneration by protoplast callus grafting
EP4638783A2 (en) 2022-12-22 2025-10-29 Intellia Therapeutics, Inc. Methods for analyzing nucleic acid cargos of lipid nucleic acid assemblies
WO2024133723A1 (en) 2022-12-22 2024-06-27 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Methods for decreasing therapeutic acquired resistance to chemotherapy and/or radiotherapy
EP4644404A1 (en) 2022-12-26 2025-11-05 Sumitomo Chemical Company, Limited Oligonucleotide production method
JP2026502531A (ja) 2023-01-11 2026-01-23 アリア セラピューティクス エスアールエル Ｉｉ型ｃａｓタンパク質およびその適用
CN120936625A (zh) 2023-01-12 2025-11-11 新加坡国立大学 用于t细胞和nk细胞恶性肿瘤的免疫疗法的cd8表达阻断和嵌合抗原受体
WO2024159071A1 (en) 2023-01-27 2024-08-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Modified rhabdovirus glycoproteins and uses thereof
WO2024163678A2 (en) 2023-02-01 2024-08-08 Tune Therapeutics, Inc. Fusion proteins and systems for targeted activation of frataxin (fxn) and related methods
WO2024163683A2 (en) 2023-02-01 2024-08-08 Tune Therapeutics, Inc. Systems, compositions, and methods for modulating expression of methyl-cpg binding protein 2 (mecp2) and x-inactive specific transcript (xist)
WO2024163650A1 (en) 2023-02-01 2024-08-08 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Animals comprising a modified klhdc7b locus
WO2024163615A1 (en) 2023-02-02 2024-08-08 University Of Florida Research Foundation, Incorporated Brain-derived neurotrophic factor-nano luciferase transgenic rodents and methods of use thereof
JP2026506554A (ja) 2023-02-06 2026-02-25 アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル 多重塩基編集による遺伝子改変造血幹細胞の濃縮
EP4662324A2 (en) * 2023-02-07 2025-12-17 Applied StemCell, Inc. Integrase variants for gene insertion in human cell
WO2024168312A1 (en) 2023-02-09 2024-08-15 Vor Biopharma Inc. Methods for treating hematopoietic malignancy
WO2024168348A1 (en) * 2023-02-10 2024-08-15 Tryptagenix, Inc. Production of monoterpene indole alkaloid compounds in a heterologous host
CN120712355A (zh) 2023-02-15 2025-09-26 阿伯生物技术公司 用于抑制抑微管装配蛋白2（stmn2）转录物中的异常剪接的基因编辑方法
IT202300004443A1 (it) 2023-03-09 2024-09-09 Int Centre For Genetic Engineering And Biotechnology Icgeb Sequenza codificante per alfa galattosidasi a umana per il trattamento della malattia di fabry
JP2026510998A (ja) 2023-03-20 2026-04-10 パイオニア ハイ－ブレッド インターナショナル， インコーポレイテッド 変更されたＰＡＭ認識を有するＣａｓポリペプチド
US12383615B2 (en) 2023-03-23 2025-08-12 Carbon Biosciences, Inc. Protoparvovirus compositions comprising a protoparvovirus variant VP1 capsid polypeptide and related methods
WO2024196965A1 (en) 2023-03-23 2024-09-26 Carbon Biosciences, Inc. Parvovirus compositions and related methods for gene therapy
EP4689155A1 (en) 2023-03-29 2026-02-11 Astrazeneca AB Use of inhibitors to increase efficiency of crispr/cas insertions
US12624071B2 (en) 2023-03-30 2026-05-12 Triad National Security, Llc Bright and stable red fluorescent protein
WO2024206911A2 (en) 2023-03-30 2024-10-03 Children's Hospital Medical Center Clinical-grade organoids
EP4689092A1 (en) * 2023-03-31 2026-02-11 Mammoth Biosciences, Inc. Engineered effector proteins, compositions, systems and methods of use thereof
WO2024211287A1 (en) 2023-04-03 2024-10-10 Seagen Inc. Production cell lines with targeted integration sites
KR20250168601A (ko) * 2023-04-07 2025-12-02 제넨테크, 인크. 변형된 가이드 rna
MX2024004405A (es) 2023-04-14 2024-11-08 Seminis Vegetable Seeds Inc Métodos y composiciones de resistencia a peronospora en la espinaca
WO2024220135A1 (en) 2023-04-17 2024-10-24 University Of Massachusetts Prime editing systems having pegrna with reduced auto-inhibitory interaction
CN121443140A (zh) 2023-04-21 2026-01-30 非营利性组织佛兰芒综合大学生物技术研究所 用于作物产量提升的等位基因组合
IT202300007968A1 (it) 2023-04-21 2024-10-21 Fond Telethon Ets Metodi di editing genomico e costrutti
WO2024226499A1 (en) 2023-04-24 2024-10-31 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods for modifying fertility
CN121443735A (zh) 2023-04-26 2026-01-30 优乐斯治疗株式会社 用于改变靶核苷酸序列的非天然型多核苷酸
EP4688814A1 (en) 2023-04-27 2026-02-11 University of Massachusetts Cas-embedded cytidine deaminase ribonucleoprotein complexes having improved base editing specificity and efficiency
CN121712899A (zh) * 2023-04-27 2026-03-20 伦斯勒理工学院 用于在真核细胞中准确插入dna序列的重组酶
CN121443748A (zh) * 2023-05-05 2026-01-30 英斯梅德股份有限公司 微拟球藻源病毒以及用于制备其的方法和组合物
WO2024234006A1 (en) 2023-05-11 2024-11-14 Tome Biosciences, Inc. Systems, compositions, and methods for targeting liver sinusodial endothelial cells (lsecs)
WO2024233894A1 (en) * 2023-05-11 2024-11-14 University Of Massachusetts Compositions and methods for improved genome editing with nme2cas9 and nme2-smucas9 variants
IL324634A (en) 2023-05-15 2026-01-01 Nchroma Bio Inc Compositions and methods for epigenetic regulation of hbv gene expression
WO2024235991A1 (en) 2023-05-15 2024-11-21 UCB Biopharma SRL Rna-guided nucleases and nucleic acid targeting systems comprising such rna-guided nucleases
WO2024236336A1 (en) 2023-05-17 2024-11-21 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Lipc variant in the treatment of hypercholesterolemia and atherosclerotic cardiovascular disease
EP4713433A2 (en) 2023-05-18 2026-03-25 Children's Hospital Medical Center Liver organoids with intrahepatic sympathetic nerves, and methods of use thereof
WO2024243438A2 (en) 2023-05-23 2024-11-28 Omega Therapeutics, Inc. Compositions and methods for reducing cxcl9, cxcl10, and cxcl11 gene expression
WO2024245951A1 (en) 2023-05-26 2024-12-05 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Combination of slc8a1 inhibitor and mitochondria-targeted antioxidant for treating melanoma
EP4722372A2 (en) 2023-05-30 2026-04-08 Hapiseeds Pesquisa e Desenvolvimento Ltda. Plants with agronomic characteristics improved by suppression of aip10/abap1 regulatory network genes
EP4719423A1 (en) 2023-05-30 2026-04-08 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Method and pharmaceutical composition for use in the treatment of focal cortical dysplasia
AU2024285988A1 (en) 2023-06-08 2025-11-20 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Animal model with rapid onset of alzheimer's amyloid beta plaque pathology
EP4728093A1 (en) 2023-06-13 2026-04-22 Intellia Therapeutics, Inc. Assays for analysis of ribonucleic acid (rna) molecules
CN121568725A (zh) 2023-06-15 2026-02-24 里珍纳龙药品有限公司 用于听力病症的基因疗法
WO2024256635A1 (en) 2023-06-15 2024-12-19 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Dpm1 inhibitor for treating cancer
WO2024259559A1 (en) 2023-06-19 2024-12-26 Hangzhou Enhe Biotechnology Co., Ltd. Fusion polypeptides for production of 7-dehydrocholesterol and methods of use thereof
WO2024261302A1 (en) 2023-06-22 2024-12-26 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Nlrp3 inhibitors, pak1/2 inhibitors and/or caspase 1 inhibitors for use in the treatment of rac2 monogenic disorders
EP4731750A2 (en) 2023-06-23 2026-04-29 Children's Hospital Medical Center Methods of matrix-free suspension culture
WO2024261323A1 (en) 2023-06-23 2024-12-26 Astrazeneca Ab Molecular switches
WO2025003344A1 (en) 2023-06-28 2025-01-02 Alia Therapeutics Srl Type ii cas proteins and applications thereof
KR20260032927A (ko) 2023-06-30 2026-03-10 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 상동성 지향 복구를 증가시키는 방법 및 조성물
WO2025012316A2 (en) 2023-07-10 2025-01-16 Universiteit Gent Method of genome-editing
WO2025017033A1 (en) 2023-07-17 2025-01-23 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Prime editing of the -115 region in the hbg1 and/or hbg2 promoter for increasing fetal hemoglobin content in a eukaryotic cell
WO2025017030A1 (en) 2023-07-17 2025-01-23 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Prime editing of the -200 region in the hbg1 and/or hbg2 promoter for increasing fetal hemoglobin content in a eukaryotic cell
WO2025021839A1 (en) 2023-07-25 2025-01-30 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Method to treat metabolic disorders
WO2025022367A2 (en) 2023-07-27 2025-01-30 Life Edit Therapeutics, Inc. Rna-guided nucleases and active fragments and variants thereof and methods of use
TW202513801A (zh) 2023-07-28 2025-04-01 美商雷傑納榮製藥公司 用於治療龐貝氏症之抗ＴｆＲ：ＧＡＡ及抗ＣＤ６３：ＧＡＡ插入
KR20260046119A (ko) 2023-07-28 2026-04-06 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 단방향 유전자 삽입 동안 도입유전자 발현을 증진시키는 bGH-SV40L 직렬 PolyA의 용도
US20250049896A1 (en) 2023-07-28 2025-02-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-tfr:acid sphingomyelinase for treatment of acid sphingomyelinase deficiency
WO2025029835A1 (en) 2023-07-31 2025-02-06 Tune Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating il-2 gene expression
WO2025029840A1 (en) 2023-07-31 2025-02-06 Tune Therapeutics, Inc. Compositions and methods for multiplexed activation and repression of t cell gene expression
CN121605117A (zh) 2023-08-01 2026-03-03 巴斯夫植物科学有限公司 通过表达msbp1蛋白增加抗性
WO2025027165A1 (en) 2023-08-01 2025-02-06 Basf Plant Science Company Gmbh Increased resistance by expression of an ics protein
WO2025030010A1 (en) 2023-08-01 2025-02-06 Vor Biopharma Inc. Compositions comprising genetically engineered hematopoietic stem cells and methods of use thereof
WO2025032112A1 (en) 2023-08-08 2025-02-13 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Methods for the treatment of type 2-mediated diseases
WO2025038494A1 (en) 2023-08-11 2025-02-20 Tune Therapeutics, Inc. Compositions, systems, and methods for lymphoid cell differentiation using targeted gene activation
WO2025038750A2 (en) 2023-08-14 2025-02-20 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for treating cancer
WO2025038948A2 (en) * 2023-08-16 2025-02-20 The Regents Of The University Of California Alpha-crystalline domain proteins and their use in genome modification
EP4512403A1 (en) 2023-08-22 2025-02-26 Friedrich-Schiller-Universität Jena Neuropeptide b and w-receptor as a target for treating mood disorders and/or chronic stress
WO2025049524A1 (en) 2023-08-28 2025-03-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Cxcr4 antibody-resistant modified receptors
WO2025050069A1 (en) 2023-09-01 2025-03-06 Tome Biosciences, Inc. Programmable gene insertion using engineered integration enzymes
WO2025049959A2 (en) 2023-09-01 2025-03-06 Renagade Therapeutics Management Inc. Gene editing systems, compositions, and methods for treatment of vexas syndrome
WO2025059073A1 (en) 2023-09-11 2025-03-20 Tune Therapeutics, Inc. Epigenetic editing methods and systems for differentiating stem cells
WO2025059215A1 (en) 2023-09-12 2025-03-20 Aadigen, Llc Methods and compositions for treating or preventing cancer
WO2025059184A1 (en) 2023-09-12 2025-03-20 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods and compositions for generating genome-edited paternal doubled haploids
WO2025064408A1 (en) 2023-09-18 2025-03-27 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods for treating cardiovascular disease
GB202314578D0 (en) 2023-09-22 2023-11-08 Univ Manchester Methods of producing homoplasmic modified plants or parts thereof
WO2025072803A1 (en) 2023-09-29 2025-04-03 Children's Hospital Medical Center Ntrk2 signaling-mediated alveolar capillary injury and repair
EP4554371A4 (en) 2023-10-03 2026-04-22 Inari Agriculture Tech Inc GRNA VIRAL ADMINISTRATION IN GRAFTS
WO2025076306A1 (en) 2023-10-06 2025-04-10 University Of Massachusetts Prime editors having improved prime editing efficiency
WO2025078851A1 (en) 2023-10-11 2025-04-17 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Methods of treating cognitive deficit
WO2025081123A1 (en) 2023-10-12 2025-04-17 Fred Hutchinson Cancer Center Methods and compositions for improving t cell immunotherapy
AU2024357861A1 (en) 2023-10-12 2026-04-23 Renagade Therapeutics Management Inc. Nickase-retron template-based precision editing system and methods of use
WO2025078632A1 (en) 2023-10-12 2025-04-17 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Methods of prognosis and treatment of patients suffering from cancer
WO2025083169A1 (en) 2023-10-17 2025-04-24 Tenpoint Therapeutics Limited Combination of a vegf inhibitor and a complement pathway inhibitor for treating ocular disorders
WO2025090427A1 (en) 2023-10-23 2025-05-01 University Of Rochester Glial-targeted relief of hyperexcitability in neurodegenerative diseases
WO2025096638A2 (en) 2023-10-30 2025-05-08 Turnstone Biologics Corp. Genetically modified tumor infilitrating lymphocytes and methods of producing and using the same
WO2025101820A1 (en) 2023-11-08 2025-05-15 Fred Hutchinson Cancer Center Compositions and methods for cellular immunotherapy
TW202523695A (zh) 2023-11-22 2025-06-16 美商旗艦先鋒創新有限責任（Ｖｉｉ）公司 用於治療非酒精性脂肪性肝病之方法及組成物
WO2025122754A1 (en) 2023-12-07 2025-06-12 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Gaa knockout non-human animals
WO2025132479A1 (en) 2023-12-18 2025-06-26 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Flt3 inhibitor for modulating macrophages polarization
TW202542303A (zh) 2023-12-20 2025-11-01 美商英特利亞醫療公司 經工程改造之ｔ細胞
WO2025155753A2 (en) 2024-01-17 2025-07-24 Renagade Therapeutics Management Inc. Improved gene editing system, guides, and methods
WO2025153608A1 (en) 2024-01-18 2025-07-24 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Wip1 inhibitor for the treatment of glomerular disease
WO2025158400A1 (en) 2024-01-24 2025-07-31 Yale University Compositions and methods of natural killer cell hyperboosts for enhancement of nk cell therapy
US20250242056A1 (en) 2024-01-26 2025-07-31 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for using plasma cell depleting agents and/or b cell depleting agents to suppress host anti-aav antibody response and enable aav transduction and re-dosing
US20250242018A1 (en) 2024-01-26 2025-07-31 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Combination immunosuppression for inhibiting an immune response and enabling immunogen administration and re-administration
WO2025162980A1 (en) 2024-01-30 2025-08-07 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Methods for the treatment of breast cancer using a jnk-1 inhibitor
WO2025162985A1 (en) 2024-01-30 2025-08-07 Basf Plant Science Company Gmbh Increased plant disease resistance by expression of a glycine-rich protein
WO2025168705A1 (en) 2024-02-08 2025-08-14 Vib Vzw Means and methods for the production of saponins with endosomal escape-enhancing properties
WO2025171210A1 (en) 2024-02-09 2025-08-14 Arbor Biotechnologies, Inc. Compositions and methods for gene editing via homology-mediated end joining
WO2025174765A1 (en) 2024-02-12 2025-08-21 Renagade Therapeutics Management Inc. Lipid nanoparticles comprising coding rna molecules for use in gene editing and as vaccines and therapeutic agents
TW202546224A (zh) 2024-02-12 2025-12-01 美商生命編輯治療學公司 新穎的ｒｎａ引導之核酸酶及用於聚合酶編輯之蛋白質
WO2025184567A1 (en) 2024-03-01 2025-09-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for re-dosing aav using anti-cd40 antagonistic antibody to suppress host anti-aav antibody response
US20250277048A1 (en) 2024-03-01 2025-09-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. The use of cd40 inhibitors for inhibiting an immune response and enabling immunogen administration and re-administration
WO2025184759A1 (en) 2024-03-04 2025-09-12 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Maize plants comprising resistance to gray leaf spot and compositions and methods for selecting and producing the same
WO2025191018A1 (en) 2024-03-13 2025-09-18 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Mrgpre binding agent for use in the treatment of inflammatory and pain disorders
WO2025194019A1 (en) 2024-03-14 2025-09-18 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Methods for treating liver fibrosis and non-alcoholic fatty liver disease
WO2025202874A1 (en) 2024-03-25 2025-10-02 Crispr Therapeutics Ag Genetically modified cells expressing glp-1 receptor agonist
WO2025202473A1 (en) 2024-03-28 2025-10-02 Revvity Discovery Limited A nucleic acid deaminase, a base editor and uses thereof
WO2025210123A1 (en) 2024-04-03 2025-10-09 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Methods and pharmaceutical composition for treating cancers
WO2025212920A1 (en) 2024-04-03 2025-10-09 Children's Hospital Medical Center Multi-zonal liver organoids
WO2025217202A1 (en) 2024-04-08 2025-10-16 Children's Hospital Medical Center Bile duct organoid
WO2025217398A1 (en) 2024-04-10 2025-10-16 Lyell Immunopharma, Inc. Methods for culturing cells with improved culture medium
WO2025217503A1 (en) * 2024-04-12 2025-10-16 Georgetown University Assay for in-vivo characterization of genotoxicity
EP4677108A1 (en) 2024-04-22 2026-01-14 Basecamp Research Ltd Method and compositions for detecting off-target editing
WO2025224182A2 (en) 2024-04-23 2025-10-30 Basecamp Research Ltd Single construct platform for simultaneous delivery of gene editing machinery and nucleic acid cargo
WO2025224715A1 (en) 2024-04-26 2025-10-30 King Abdullah Univeristy Of Science And Technology Methods for improving precise genome modification and reducing unwanted mutations by crispr-cas editing
WO2025224297A1 (en) 2024-04-26 2025-10-30 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Antibodies having specificity to tgfbi and uses thereof
WO2025226912A1 (en) * 2024-04-26 2025-10-30 Sri International Cell-type specific delivery of gene editors and methods of use thereof
EP4643858A1 (en) 2024-04-29 2025-11-05 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Methods and pharmaceutical composition for the treatment of uterine disease
WO2025228998A1 (en) 2024-04-30 2025-11-06 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Use of hdac4 inhibitors for the treatment of melanoma
CN118127022B (zh) * 2024-04-30 2024-07-12 四川大学 变异链球菌环状RNA circcsbD及应用、其过表达菌株及构建方法和应用
WO2025235388A1 (en) 2024-05-06 2025-11-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Transgene genomic identification by nuclease-mediated long read sequencing
WO2025240947A1 (en) 2024-05-17 2025-11-20 University Of Massachusetts Therapeutic treatment for fragile x-associated disorder
WO2025245188A2 (en) 2024-05-21 2025-11-27 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Methods of treating liver steatosis and non-alcoholic fatty liver disease
WO2025245169A1 (en) 2024-05-21 2025-11-27 Fred Hutchinson Cancer Center Immunotherapy cells equipped with a collagen-targeting payload
WO2025247829A1 (en) 2024-05-27 2025-12-04 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Methods and pharmaceutical composition for treating prostate cancer
WO2025250454A1 (en) 2024-05-28 2025-12-04 University Of Rochester Adeno-associated viruses evolved to specifically target human glial progenitor cells in vivo
WO2025250495A1 (en) 2024-05-28 2025-12-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Acceleration of human hepatocyte engraftment in humanized liver animals by supplementing paracrine ligands or agonists that activate human liver regeneration signals
WO2025248102A1 (en) 2024-05-31 2025-12-04 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Tbk1 inhibitor for use in the treatment of vitiligo
WO2025259669A1 (en) 2024-06-10 2025-12-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and systems for characterizing modified oligonucleotides
WO2025257151A1 (en) 2024-06-10 2025-12-18 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Methods and pharmaceutical composition for treating ciliopathies
WO2025257212A1 (en) 2024-06-11 2025-12-18 Keygene N.V. Screening and regeneration of protoplast callus
WO2025260068A1 (en) 2024-06-14 2025-12-18 Tune Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle formulation for delivery of nucleic acids to cells
CN121160664B (zh) * 2024-06-17 2026-04-24 南京诺唯赞生物科技股份有限公司 Rna聚合酶变体
WO2025261741A1 (en) 2024-06-19 2025-12-26 Albert-Ludwigs-Universitaet Freiburg Koerperschaft Des Oeffentlichen Rechts Synthetic lethality to treat autosomal dominant polycystic kidney disease (adpkd)
EP4667628A1 (en) 2024-06-19 2025-12-24 Albert-Ludwigs-Universität Freiburg Körperschaft des öffentlichen Rechts Synthetic lethality to treat autosomal dominant polycystic kidney disease (adpkd)
WO2025265017A1 (en) 2024-06-20 2025-12-26 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Ass1 gene insertion for the treatment of citrullinemia type i
WO2026002934A1 (en) 2024-06-25 2026-01-02 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Combination of a slc16a1 inhibitor and a smad3 inhibitor for treating cancer
WO2026003754A1 (en) 2024-06-25 2026-01-02 Life Edit Therapeutics, Inc. Novel reverse transcriptases and uses thereof
WO2026006542A2 (en) 2024-06-26 2026-01-02 Yale University Compositions and methods for crispr/cas9 based reactivation of human angelman syndrome
WO2026006832A1 (en) 2024-06-28 2026-01-02 University Of Connecticut Gene modulation for treating cancer
WO2026012976A1 (en) 2024-07-08 2026-01-15 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Use of inhibitor of gasdermind for treatment of rac2 monogenic disorders
WO2026015647A1 (en) 2024-07-09 2026-01-15 Tune Therapeutics, Inc. Compositions, systems, and methods for cell differentiation using targeted gene activation of dll4 and/or vcam1
WO2026013071A1 (en) 2024-07-09 2026-01-15 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Setdb1 inhibitor for use in the treatment of uveal melanoma
WO2026015829A2 (en) 2024-07-12 2026-01-15 Arbor Biotechnologies, Inc. Small reverse transcriptases and gene editing systems comprising such
WO2026015832A2 (en) 2024-07-12 2026-01-15 Arbor Biotechnologies, Inc. Reverse transcriptases and gene editing systems comprising such
WO2026020120A1 (en) 2024-07-19 2026-01-22 University Of Massachusetts Increasing cas9 genome editing fidelity through attenuation of guide rna watson-crick base pairing potential
WO2026036000A1 (en) 2024-08-08 2026-02-12 Invaio Sciences, Inc. Nature-derived lipid particles for use in agriculture
US20260071285A1 (en) 2024-09-11 2026-03-12 Seminis Vegetable Seeds, Inc. Novel qtls conferring resistance to cucurbit aphid-borne yellow virus
WO2026057679A1 (en) 2024-09-11 2026-03-19 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Inhibitor of rab30 for use in a method of treatment of metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease (masld)
WO2026077659A1 (en) 2024-09-17 2026-04-16 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Enrichment of genetically modified hematopoietic stem cells through epigenome editing
WO2026064425A2 (en) 2024-09-17 2026-03-26 Dxome Co., Ltd. Mirror image crispr-cas compositions
WO2026064739A1 (en) 2024-09-23 2026-03-26 Carbon Biosciences, Inc. Parvovirus compositions and related methods for gene therapy
WO2026064753A1 (en) 2024-09-23 2026-03-26 Tune Therapeutics, Inc. Dna methyltransferase-like protein (dnmt3l) or dna methyltransferase 3a (dnmt3a) repressor systems for epigenetic editing
WO2026064736A1 (en) 2024-09-23 2026-03-26 Carbon Biosciences, Inc. Parvovirus compositions and related methods for gene therapy
WO2026072529A1 (en) 2024-09-24 2026-04-02 University Of Florida Research Foundation, Incorporated Mettl7a for improved embryo competence
WO2026069163A1 (en) 2024-09-25 2026-04-02 Crispr Therapeutics Ag Differentiation method for producing immature beta cells
WO2026080515A2 (en) 2024-10-08 2026-04-16 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Crispr sam biosensor cells and cell lines and methods of use thereof
WO2026083309A1 (en) 2024-10-17 2026-04-23 Astrazeneca Ab Use of inhibitors or modulators of artemis in gene editing
WO2026096383A1 (en) 2024-10-28 2026-05-07 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods for inducing phagocytosis
CN119867017B (zh) * 2025-01-13 2025-11-18 西南医科大学 一种同时检测果蝇采食量和排泄物面积的方法

Family Cites Families (212)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US106048A (en) 1870-08-02 Materials of different
DE1133825B (de) 1960-06-15 1962-07-26 Danfoss Ved Ing M Clausen Elektromagnetisches Relais
US3687808A (en) 1969-08-14 1972-08-29 Univ Leland Stanford Junior Synthetic polynucleotides
US4952496A (en) 1984-03-30 1990-08-28 Associated Universities, Inc. Cloning and expression of the gene for bacteriophage T7 RNA polymerase
US5034506A (en) 1985-03-15 1991-07-23 Anti-Gene Development Group Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages
WO1988008450A1 (en) 1987-05-01 1988-11-03 Birdwell Finlayson Gene therapy for metabolite disorders
US5350689A (en) 1987-05-20 1994-09-27 Ciba-Geigy Corporation Zea mays plants and transgenic Zea mays plants regenerated from protoplasts or protoplast-derived cells
US5585362A (en) 1989-08-22 1996-12-17 The Regents Of The University Of Michigan Adenovirus vectors for gene therapy
US5451513A (en) 1990-05-01 1995-09-19 The State University of New Jersey Rutgers Method for stably transforming plastids of multicellular plants
US5767367A (en) 1990-06-23 1998-06-16 Hoechst Aktiengesellschaft Zea mays (L.) with capability of long term, highly efficient plant regeneration including fertile transgenic maize plants having a heterologous gene, and their preparation
US5489677A (en) 1990-07-27 1996-02-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleoside linkages containing adjacent oxygen and nitrogen atoms
US5602240A (en) 1990-07-27 1997-02-11 Ciba Geigy Ag. Backbone modified oligonucleotide analogs
US5222982A (en) 1991-02-11 1993-06-29 Ommaya Ayub K Spinal fluid driven artificial organ
CA2103705C (en) 1991-02-11 1996-01-30 Ayub K. Ommaya Spinal fluid driven artificial organ
US5539082A (en) 1993-04-26 1996-07-23 Nielsen; Peter E. Peptide nucleic acids
US5719262A (en) 1993-11-22 1998-02-17 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having amino acid side chains
US5714331A (en) 1991-05-24 1998-02-03 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having enhanced binding affinity, sequence specificity and solubility
WO1993003769A1 (en) 1991-08-20 1993-03-04 THE UNITED STATES OF AMERICA, represented by THE SECRETARY, DEPARTEMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES Adenovirus mediated transfer of genes to the gastrointestinal tract
US7150982B2 (en) 1991-09-09 2006-12-19 Third Wave Technologies, Inc. RNA detection assays
US5252479A (en) 1991-11-08 1993-10-12 Research Corporation Technologies, Inc. Safe vector for gene therapy
FR2688514A1 (fr) 1992-03-16 1993-09-17 Centre Nat Rech Scient Adenovirus recombinants defectifs exprimant des cytokines et medicaments antitumoraux les contenant.
US7153684B1 (en) 1992-10-08 2006-12-26 Vanderbilt University Pluripotential embryonic stem cells and methods of making same
JPH08503855A (ja) 1992-12-03 1996-04-30 ジェンザイム・コーポレイション 嚢胞性線維症に対する遺伝子治療
ATE304604T1 (de) 1993-06-24 2005-09-15 Frank L Graham Adenovirus vektoren für gentherapie
DE69434594T2 (de) 1993-10-25 2006-09-21 Canji, Inc., San Diego Rekombinante adenoviren-vektor und verfahren zur verwendung
US5576198A (en) 1993-12-14 1996-11-19 Calgene, Inc. Controlled expression of transgenic constructs in plant plastids
US5545817A (en) 1994-03-11 1996-08-13 Calgene, Inc. Enhanced expression in a plant plastid
US5545818A (en) 1994-03-11 1996-08-13 Calgene Inc. Expression of Bacillus thuringiensis cry proteins in plant plastids
US5843780A (en) 1995-01-20 1998-12-01 Wisconsin Alumni Research Foundation Primate embryonic stem cells
ATE329047T1 (de) 1995-08-30 2006-06-15 Basf Plant Science Gmbh Stimulierung der homologen rekombination in pflanzlichen organismen mittels rekombinations fördernder enzyme
AU724661B2 (en) 1996-08-29 2000-09-28 Bausch & Lomb Surgical, Inc. Dual loop frequency and power control
JP3756313B2 (ja) 1997-03-07 2006-03-15 武 今西 新規ビシクロヌクレオシド及びオリゴヌクレオチド類縁体
CA2303299C (en) 1997-09-12 2016-02-23 Exiqon A/S Oligonucleotide analogues
JP3880795B2 (ja) 1997-10-23 2007-02-14 ジェロン・コーポレーション フィーダー細胞を含まない培養物中で、霊長類由来始原幹細胞を増殖させるための方法
US20040186071A1 (en) 1998-04-13 2004-09-23 Bennett C. Frank Antisense modulation of CD40 expression
US20020182673A1 (en) 1998-05-15 2002-12-05 Genentech, Inc. IL-17 homologous polypedies and therapeutic uses thereof
US6667176B1 (en) 2000-01-11 2003-12-23 Geron Corporation cDNA libraries reflecting gene expression during growth and differentiation of human pluripotent stem cells
US7410798B2 (en) 2001-01-10 2008-08-12 Geron Corporation Culture system for rapid expansion of human embryonic stem cells
US7078387B1 (en) 1998-12-28 2006-07-18 Arch Development Corp. Efficient and stable in vivo gene transfer to cardiomyocytes using recombinant adeno-associated virus vectors
JP2002535995A (ja) 1999-02-03 2002-10-29 ザ チルドレンズ メディカル センター コーポレイション 染色体標的部位での二本鎖ｄｎａ切断の誘導を含む遺伝子修復
MXPA02001857A (es) 1999-08-24 2003-07-14 Cellgate Inc Composiciones y metodos para incrementar la entrega de drogas a traves y dentro de tejidos epiteliales.
US7229961B2 (en) 1999-08-24 2007-06-12 Cellgate, Inc. Compositions and methods for enhancing drug delivery across and into ocular tissues
EP1083231A1 (en) 1999-09-09 2001-03-14 Introgene B.V. Smooth muscle cell promoter and uses thereof
US7256286B2 (en) 1999-11-30 2007-08-14 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Bryostatin analogues, synthetic methods and uses
WO2002026967A2 (en) 2000-09-25 2002-04-04 Thomas Jefferson University Targeted gene correction by single-stranded oligodeoxynucleotides
ATE439372T1 (de) 2000-10-27 2009-08-15 Novartis Vaccines & Diagnostic Nukleinsäuren und proteine von gruppen a und b- streptokokken
MXPA03007358A (es) 2001-02-16 2004-12-13 Cellgate Inc Transportadores que contienen porciones de arginina separadas.
ES2609014T3 (es) 2001-07-12 2017-04-18 University Of Massachusetts Producción in vivo de ARN de interferencia pequeños que median el silenciamiento génico
US7169874B2 (en) 2001-11-02 2007-01-30 Bausch & Lomb Incorporated High refractive index polymeric siloxysilane compositions
US20060253913A1 (en) 2001-12-21 2006-11-09 Yue-Jin Huang Production of hSA-linked butyrylcholinesterases in transgenic mammals
AU2003251286B2 (en) 2002-01-23 2007-08-16 The University Of Utah Research Foundation Targeted chromosomal mutagenesis using zinc finger nucleases
US20030232410A1 (en) 2002-03-21 2003-12-18 Monika Liljedahl Methods and compositions for using zinc finger endonucleases to enhance homologous recombination
AU2003224897A1 (en) 2002-04-09 2003-10-27 Kenneth L. Beattie Oligonucleotide probes for genosensor chips
JP2006502748A (ja) 2002-09-05 2006-01-26 カリフォルニア インスティテュート オブ テクノロジー 遺伝子ターゲッティングを誘発するキメラヌクレアーゼの使用方法
WO2005070948A1 (en) 2004-01-23 2005-08-04 Intronn, Inc. Correction of alpha-1-antitrypsin genetic defects using spliceosome mediated rna trans splicing
US7972854B2 (en) 2004-02-05 2011-07-05 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for targeted cleavage and recombination
US7919277B2 (en) 2004-04-28 2011-04-05 Danisco A/S Detection and typing of bacterial strains
US7892224B2 (en) 2005-06-01 2011-02-22 Brainlab Ag Inverse catheter planning
US7534819B2 (en) 2005-06-10 2009-05-19 University Of Washington Compositions and methods for intracellular delivery of biotinylated cargo
WO2007014275A2 (en) 2005-07-26 2007-02-01 Sangamo Biosciences, Inc. Targeted integration and expression of exogenous nucleic acid sequences
US10022457B2 (en) 2005-08-05 2018-07-17 Gholam A. Peyman Methods to regulate polarization and enhance function of cells
JP2009506670A (ja) 2005-08-24 2009-02-12 トムソン ライセンシング 地上波放送受信機を用いてロービング装置のポップ画面ダイアログを生成する方法および装置
NZ597299A (en) * 2005-08-26 2013-03-28 Dupont Nutrition Biosci Aps Use of a cas gene in combination with CRISPR repeats for modulating resistance in a cell
CN101864392B (zh) 2005-12-13 2016-03-23 国立大学法人京都大学 核重新编程因子
US20090227032A1 (en) 2005-12-13 2009-09-10 Kyoto University Nuclear reprogramming factor and induced pluripotent stem cells
US8278104B2 (en) 2005-12-13 2012-10-02 Kyoto University Induced pluripotent stem cells produced with Oct3/4, Klf4 and Sox2
US9677123B2 (en) 2006-03-15 2017-06-13 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Degenerate nucleobase analogs
PL2019683T5 (pl) 2006-04-25 2022-12-05 The Regents Of The University Of California Podawanie czynników wzrostu do leczenia zaburzeń OUN
EP2016183B1 (en) 2006-05-10 2011-06-15 Deinove Process for chromosomal engineering using a novel dna repair system
US9399801B2 (en) 2006-05-19 2016-07-26 Dupont Nutrition Biosciences Aps Tagged microorganisms and methods of tagging
ES2465996T3 (es) 2006-05-25 2014-06-09 Sangamo Biosciences, Inc. Métodos y composiciones para la inactivación genética
EP2034848B1 (en) 2006-06-16 2016-10-19 DuPont Nutrition Biosciences ApS Streptococcus thermophilus bacterium
WO2008019123A2 (en) 2006-08-04 2008-02-14 Georgia State University Research Foundation, Inc. Enzyme sensors, methods for preparing and using such sensors, and methods of detecting protease activity
US20080081064A1 (en) 2006-09-28 2008-04-03 Surmodics, Inc. Implantable Medical Device with Apertures for Delivery of Bioactive Agents
PT2126130E (pt) 2007-03-02 2015-08-03 Dupont Nutrition Biosci Aps Culturas com resistência melhorada a fagos
WO2008148304A1 (en) 2007-05-31 2008-12-11 Xiamen University Rna interference target for treating aids
JP2008307007A (ja) 2007-06-15 2008-12-25 Bayer Schering Pharma Ag 出生後のヒト組織由来未分化幹細胞から誘導したヒト多能性幹細胞
JP5812318B2 (ja) * 2007-12-04 2015-11-11 レメディー ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 凍結乾燥のための改良された処方物および方法ならびにそれによって提供される凍結乾燥物
US9683232B2 (en) 2007-12-10 2017-06-20 Kyoto University Efficient method for nuclear reprogramming
WO2009097468A2 (en) 2008-01-29 2009-08-06 Kliman Gilbert H Drug delivery devices, kits and methods therefor
WO2010011961A2 (en) 2008-07-25 2010-01-28 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Prokaryotic rnai-like system and methods of use
AU2009283194B2 (en) 2008-08-22 2014-10-16 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for targeted single-stranded cleavage and targeted integration
MX345116B (es) 2008-09-15 2017-01-17 Children's Medical Center Corp Modulacion de bcl11a para tratamiento de hemoglobinopatias.
US20100076057A1 (en) * 2008-09-23 2010-03-25 Northwestern University TARGET DNA INTERFERENCE WITH crRNA
US9404098B2 (en) 2008-11-06 2016-08-02 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Method for cleaving a target RNA using a Cas6 polypeptide
WO2010054154A2 (en) 2008-11-07 2010-05-14 Danisco A/S Bifidobacteria crispr sequences
EP2367938B1 (en) 2008-12-12 2014-06-11 DuPont Nutrition Biosciences ApS Genetic cluster of strains of streptococcus thermophilus having unique rheological properties for dairy fermentation
WO2010075424A2 (en) 2008-12-22 2010-07-01 The Regents Of University Of California Compositions and methods for downregulating prokaryotic genes
GB0823658D0 (en) 2008-12-30 2009-02-04 Angiomed Ag Stent delivery device
EP2206723A1 (en) 2009-01-12 2010-07-14 Bonas, Ulla Modular DNA-binding domains
CA2756833C (en) 2009-04-09 2019-11-19 Sangamo Therapeutics, Inc. Targeted integration into stem cells
WO2010117646A1 (en) 2009-04-09 2010-10-14 Motorola, Inc. Retransmission technique for a communication network
ES2786039T3 (es) 2009-04-30 2020-10-08 Ospedale San Raffaele Srl Vector génico
US20120192298A1 (en) 2009-07-24 2012-07-26 Sigma Aldrich Co. Llc Method for genome editing
CA2767377A1 (en) 2009-07-24 2011-01-27 Sigma-Aldrich Co. Llc Method for genome editing
CA2769262C (en) 2009-07-28 2019-04-30 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for treating trinucleotide repeat disorders
US20110104787A1 (en) 2009-11-05 2011-05-05 President And Fellows Of Harvard College Fusion Peptides That Bind to and Modify Target Nucleic Acid Sequences
US20110294114A1 (en) 2009-12-04 2011-12-01 Cincinnati Children's Hospital Medical Center Optimization of determinants for successful genetic correction of diseases, mediated by hematopoietic stem cells
NO2510096T3 (sr) * 2009-12-10 2015-03-21
JP2013518602A (ja) 2010-02-09 2013-05-23 サンガモ バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド 部分的に一本鎖のドナー分子による標的化ゲノム改変
US10087431B2 (en) 2010-03-10 2018-10-02 The Regents Of The University Of California Methods of generating nucleic acid fragments
EA024121B9 (ru) 2010-05-10 2017-01-30 Дзе Реджентс Ов Дзе Юниверсити Ов Калифорния Композиции эндорибонуклеаз и способы их использования
EP3156062A1 (en) 2010-05-17 2017-04-19 Sangamo BioSciences, Inc. Novel dna-binding proteins and uses thereof
US20140148361A1 (en) 2010-06-07 2014-05-29 Barry L. Stoddard Generation and Expression of Engineered I-ONUI Endonuclease and Its Homologues and Uses Thereof
BR112013001685B1 (pt) 2010-07-23 2021-10-13 Sigma-Aldrich Co. Llc Método para editar pelo menos uma sequência cromossômica endógena em uma célula pela inserção de uma sequência na sequência cromossômica
US9081737B2 (en) 2010-08-02 2015-07-14 Integrated Dna Technologies, Inc. Methods for predicting stability and melting temperatures of nucleic acid duplexes
DK2630156T3 (en) 2010-10-20 2018-12-17 Dupont Nutrition Biosci Aps CRISPR-CAS SEQUENCES OF LACTOCOCCUS
KR20120096395A (ko) 2011-02-22 2012-08-30 주식회사 툴젠 뉴클레아제에 의해 유전자 변형된 세포를 농축시키는 방법
WO2012164565A1 (en) 2011-06-01 2012-12-06 Yeda Research And Development Co. Ltd. Compositions and methods for downregulating prokaryotic genes
US9150847B2 (en) 2011-09-21 2015-10-06 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for regulation of transgene expression
US8450107B1 (en) 2011-11-30 2013-05-28 The Broad Institute Inc. Nucleotide-specific recognition sequences for designer TAL effectors
US9046593B2 (en) 2011-12-15 2015-06-02 The Boeing Company Method and apparatus for detecting and classifying signals
GB201122458D0 (en) 2011-12-30 2012-02-08 Univ Wageningen Modified cascade ribonucleoproteins and uses thereof
DK2836226T3 (en) 2012-02-24 2017-09-18 Hutchinson Fred Cancer Res COMPOSITIONS AND PROCEDURES FOR TREATING HEMOGLOBINOPATHY
NZ629427A (en) 2012-02-29 2016-04-29 Sangamo Biosciences Inc Methods and compositions for treating huntington’s disease
US9637739B2 (en) 2012-03-20 2017-05-02 Vilnius University RNA-directed DNA cleavage by the Cas9-crRNA complex
WO2013141680A1 (en) 2012-03-20 2013-09-26 Vilnius University RNA-DIRECTED DNA CLEAVAGE BY THE Cas9-crRNA COMPLEX
AU2013204327B2 (en) 2012-04-20 2016-09-01 Aviagen Cell transfection method
CA2871008C (en) 2012-04-23 2022-11-22 Bayer Cropscience Nv Targeted genome engineering in plants
RU2645475C2 (ru) 2012-04-25 2018-02-21 Регенерон Фармасьютикалз, Инк. Опосредованное нуклеазой нацеливание с большими нацеливающими векторами
JP6352250B2 (ja) 2012-05-02 2018-07-04 ダウ アグロサイエンシィズ エルエルシー リンゴ酸デヒドロゲナーゼの標的改変
JP6559063B2 (ja) 2012-05-07 2019-08-14 サンガモ セラピューティクス， インコーポレイテッド 導入遺伝子のヌクレアーゼ媒介標的化組み込みのための方法および組成物
US11120889B2 (en) 2012-05-09 2021-09-14 Georgia Tech Research Corporation Method for synthesizing a nuclease with reduced off-site cleavage
LT3401400T (lt) * 2012-05-25 2019-06-10 The Regents Of The University Of California Būdai ir kompozicijos, skirtos rnr molekulės nukreipiamai tikslinės dnr modifikacijai ir rnr molekulės nukreipiamam transkripcijos moduliavimui
EP2854866A4 (en) 2012-05-30 2015-12-23 Baylor College Medicine SUPERHELIC MINI-SECTORS AS A TOOL FOR DNS REPAIR, CHANGE AND REPLACEMENT
US9102936B2 (en) 2012-06-11 2015-08-11 Agilent Technologies, Inc. Method of adaptor-dimer subtraction using a CRISPR CAS6 protein
MX2014015204A (es) 2012-06-12 2015-08-07 Genentech Inc Metodos y composiciones para generar alelos con inactivacion condicional.
EP2674501A1 (en) 2012-06-14 2013-12-18 Agence nationale de sécurité sanitaire de l'alimentation,de l'environnement et du travail Method for detecting and identifying enterohemorrhagic Escherichia coli
WO2013188638A2 (en) 2012-06-15 2013-12-19 The Regents Of The University Of California Endoribonucleases and methods of use thereof
US20150225734A1 (en) 2012-06-19 2015-08-13 Regents Of The University Of Minnesota Gene targeting in plants using dna viruses
CA2875618C (en) 2012-07-11 2021-04-27 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for the treatment of lysosomal storage diseases
EP2872154B1 (en) 2012-07-11 2017-05-31 Sangamo BioSciences, Inc. Methods and compositions for delivery of biologics
JP2015527889A (ja) 2012-07-25 2015-09-24 ザ ブロード インスティテュート， インコーポレイテッド 誘導可能なｄｎａ結合タンパク質およびゲノム撹乱ツール、ならびにそれらの適用
WO2014022702A2 (en) 2012-08-03 2014-02-06 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for controlling gene expression by rna processing
DK2890780T3 (da) 2012-08-29 2020-09-21 Sangamo Therapeutics Inc Fremgangsmåder og sammensætninger til behandling af en genetisk tilstand
UA119135C2 (uk) 2012-09-07 2019-05-10 ДАУ АГРОСАЙЄНСІЗ ЕлЕлСі Спосіб отримання трансгенної рослини
UA118090C2 (uk) 2012-09-07 2018-11-26 ДАУ АГРОСАЙЄНСІЗ ЕлЕлСі Спосіб інтегрування послідовності нуклеїнової кислоти, що представляє інтерес, у ген fad2 у клітині сої та специфічний для локусу fad2 білок, що зв'язується, здатний індукувати спрямований розрив
HK1217732A1 (zh) 2012-09-07 2017-01-20 美国陶氏益农公司 Fad3性能基因座及相應的能夠誘導靶向斷裂的靶位點特異性結合蛋白
EP2906602B1 (en) 2012-10-12 2019-01-16 The General Hospital Corporation Transcription activator-like effector (tale) - lysine-specific demethylase 1 (lsd1) fusion proteins
PL4397760T3 (pl) 2012-10-23 2026-03-30 Toolgen Incorporated Kompozycja do rozszczepiania docelowego dna zawierająca prowadzące rna specyficzne dla docelowego dna i kwas nukleinowy kodujący białko cas lub białko cas oraz jej zastosowanie
AP2015008495A0 (en) 2012-10-30 2015-05-31 Ct For Aquaculture Technologies Inc Control of sexual maturation in animals
US20150291967A1 (en) 2012-10-31 2015-10-15 Luc Mathis Coupling herbicide resistance with targeted insertion of transgenes in plants
US20140127752A1 (en) 2012-11-07 2014-05-08 Zhaohui Zhou Method, composition, and reagent kit for targeted genomic enrichment
EP3135765A1 (en) 2012-12-06 2017-03-01 Sigma-Aldrich Co. LLC Crispr-based genome modification and regulation
WO2014093479A1 (en) 2012-12-11 2014-06-19 Montana State University Crispr (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) rna-guided control of gene regulation
EP2896697B1 (en) 2012-12-12 2015-09-02 The Broad Institute, Inc. Engineering of systems, methods and optimized guide compositions for sequence manipulation
US20140310830A1 (en) 2012-12-12 2014-10-16 Feng Zhang CRISPR-Cas Nickase Systems, Methods And Compositions For Sequence Manipulation in Eukaryotes
EP3434776A1 (en) 2012-12-12 2019-01-30 The Broad Institute, Inc. Methods, models, systems, and apparatus for identifying target sequences for cas enzymes or crispr-cas systems for target sequences and conveying results thereof
US8697359B1 (en) 2012-12-12 2014-04-15 The Broad Institute, Inc. CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products
ES2576126T3 (es) 2012-12-12 2016-07-05 The Broad Institute, Inc. Modificación por tecnología genética y optimización de sistemas, métodos y composiciones enzimáticas mejorados para la manipulación de secuencias
WO2014093701A1 (en) 2012-12-12 2014-06-19 The Broad Institute, Inc. Functional genomics using crispr-cas systems, compositions, methods, knock out libraries and applications thereof
JP2016504026A (ja) 2012-12-12 2016-02-12 ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッド 配列操作のための系、方法および最適化ガイド組成物のエンジニアリング
IL239317B (en) 2012-12-12 2022-07-01 Broad Inst Inc Providing, engineering and optimizing systems, methods and compositions for sequence manipulation and therapeutic applications
CN114634950A (zh) 2012-12-12 2022-06-17 布罗德研究所有限公司 用于序列操纵的crispr-cas组分系统、方法以及组合物
EP2931898B1 (en) 2012-12-12 2016-03-09 The Broad Institute, Inc. Engineering and optimization of systems, methods and compositions for sequence manipulation with functional domains
US8939652B2 (en) 2012-12-13 2015-01-27 Us Synthetic Corporation Roller bearing apparatuses including compliant rolling elements, and related methods of manufacture
WO2014093565A1 (en) 2012-12-13 2014-06-19 Dow Agrosciences Llc Improved processes for the isolation of 4-amino-3-chloro-6-(4-chloro-2-fluoro-3-methoxyphenyl)pyridine-2-carboxylic acid
AU2013359146B2 (en) 2012-12-13 2017-12-07 Corteva Agriscience Llc DNA detection methods for site specific nuclease activity
SG10201912991WA (en) 2012-12-17 2020-03-30 Harvard College Rna-guided human genome engineering
NL2010038C2 (en) 2012-12-21 2014-06-24 Koni Bv Shock absorber.
WO2014104878A1 (en) 2012-12-27 2014-07-03 Keygene N.V. Method for removing genetic linkage in a plant
EP3919505B1 (en) 2013-01-16 2023-08-30 Emory University Uses of cas9-nucleic acid complexes
CN103233028B (zh) 2013-01-25 2015-05-13 南京徇齐生物技术有限公司 一种无物种限制无生物安全性问题的真核生物基因打靶方法及螺旋结构dna序列
WO2014127287A1 (en) 2013-02-14 2014-08-21 Massachusetts Institute Of Technology Method for in vivo tergated mutagenesis
US20140235933A1 (en) 2013-02-20 2014-08-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Genetic modification of rats
EP2958996B1 (en) 2013-02-25 2019-10-16 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for enhancing nuclease-mediated gene disruption
US9234213B2 (en) 2013-03-15 2016-01-12 System Biosciences, Llc Compositions and methods directed to CRISPR/Cas genomic engineering systems
US10760064B2 (en) 2013-03-15 2020-09-01 The General Hospital Corporation RNA-guided targeting of genetic and epigenomic regulatory proteins to specific genomic loci
US20140364333A1 (en) 2013-03-15 2014-12-11 President And Fellows Of Harvard College Methods for Live Imaging of Cells
US11332719B2 (en) 2013-03-15 2022-05-17 The Broad Institute, Inc. Recombinant virus and preparations thereof
US20140273230A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Sigma-Aldrich Co., Llc Crispr-based genome modification and regulation
US20140273235A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Regents Of The University Of Minnesota ENGINEERING PLANT GENOMES USING CRISPR/Cas SYSTEMS
US10378027B2 (en) 2013-03-15 2019-08-13 The General Hospital Corporation RNA-guided targeting of genetic and epigenomic regulatory proteins to specific genomic loci
JP2016522679A (ja) 2013-04-04 2016-08-04 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を用いたゲノム編集の治療的使用
RU2723130C2 (ru) 2013-04-05 2020-06-08 ДАУ АГРОСАЙЕНСИЗ ЭлЭлСи Способы и композиции для встраивания экзогенной последовательности в геном растений
DK2986729T3 (en) 2013-04-16 2018-10-29 Regeneron Pharma TARGETED MODIFICATION OF ROOT THROUGH
CN103224947B (zh) 2013-04-28 2015-06-10 陕西师范大学 一种基因打靶系统
CA2910427C (en) 2013-05-10 2024-02-20 Sangamo Biosciences, Inc. Delivery methods and compositions for nuclease-mediated genome engineering
WO2014190181A1 (en) 2013-05-22 2014-11-27 Northwestern University Rna-directed dna cleavage and gene editing by cas9 enzyme from neisseria meningitidis
US10117124B2 (en) 2013-05-28 2018-10-30 Telefonaktiebolaget L M Ericsson (Publ) Method, apparatus and computer program for updating a prioritization level of a service data flow based on traffic size per time unit of said data flow
US11414695B2 (en) 2013-05-29 2022-08-16 Agilent Technologies, Inc. Nucleic acid enrichment using Cas9
US20140356956A1 (en) 2013-06-04 2014-12-04 President And Fellows Of Harvard College RNA-Guided Transcriptional Regulation
EP3725885A1 (en) 2013-06-17 2020-10-21 The Broad Institute, Inc. Functional genomics using crispr-cas systems, compositions methods, screens and applications thereof
CN105793425B (zh) 2013-06-17 2021-10-26 布罗德研究所有限公司 使用病毒组分靶向障碍和疾病的crispr-cas系统和组合物的递送、用途和治疗应用
WO2014204723A1 (en) 2013-06-17 2014-12-24 The Broad Institute Inc. Oncogenic models based on delivery and use of the crispr-cas systems, vectors and compositions
NL2010994C2 (en) 2013-06-17 2014-12-18 Fuji Seal Europe Bv Container sleeving method and device.
WO2014204724A1 (en) 2013-06-17 2014-12-24 The Broad Institute Inc. Delivery, engineering and optimization of tandem guide systems, methods and compositions for sequence manipulation
JP6738729B2 (ja) 2013-06-17 2020-08-12 ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッド 分裂終了細胞の疾患および障害をターゲティングおよびモデリングするための系、方法および組成物の送達、エンジニアリングおよび最適化
MX2015017312A (es) 2013-06-17 2017-04-10 Broad Inst Inc Suministro y uso de composiciones, vectores y sistemas crispr-cas para la modificación dirigida y terapia hepáticas.
JP6665088B2 (ja) 2013-06-17 2020-03-13 ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッド 配列操作のための最適化されたＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ二重ニッカーゼ系、方法および組成物
CN103343120B (zh) 2013-07-04 2015-03-04 中国科学院遗传与发育生物学研究所 一种小麦基因组定点改造方法
BR112016000571B1 (pt) 2013-07-10 2023-12-26 President And Fellows Of Harvard College Métodos in vitro para modular a expressão e para alterar um ou mais ácidos nucleicos alvo em uma célula simultaneamente com a regulação da expressão de um ou mais ácidos nucleicos alvo em uma célula, bem como célula de levedura ou bactéria compreendendo ácidos nucleicos
US10421957B2 (en) 2013-07-29 2019-09-24 Agilent Technologies, Inc. DNA assembly using an RNA-programmable nickase
MX358066B (es) 2013-11-04 2018-08-03 Dow Agrosciences Llc Óptimos loci de soya.
UY35814A (es) 2013-11-04 2015-05-29 Dow Agrosciences Llc ?lugares óptimos para la soja?.
KR102269769B1 (ko) 2013-11-04 2021-06-28 코르테바 애그리사이언스 엘엘씨 최적 메이즈 유전자좌
CN106459995B (zh) 2013-11-07 2020-02-21 爱迪塔斯医药有限公司 使用统治型gRNA的CRISPR相关方法和组合物
CA2930877A1 (en) 2013-11-18 2015-05-21 Crispr Therapeutics Ag Crispr-cas system materials and methods
US10787684B2 (en) 2013-11-19 2020-09-29 President And Fellows Of Harvard College Large gene excision and insertion
WO2015088643A1 (en) 2013-12-11 2015-06-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for the targeted modification of a genome
US20150166984A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 President And Fellows Of Harvard College Methods for correcting alpha-antitrypsin point mutations
BR112016013213A2 (pt) 2013-12-12 2017-12-05 Massachusetts Inst Technology administração, uso e aplicações terapêuticas dos sistemas crispr-cas e composições para visar distúrbios e doenças usando componentes de administração de partículas
KR20160102056A (ko) 2013-12-26 2016-08-26 더 제너럴 하스피탈 코포레이션 멀티플렉스 가이드 ｒｎａ
US9850525B2 (en) 2014-01-29 2017-12-26 Agilent Technologies, Inc. CAS9-based isothermal method of detection of specific DNA sequence
US20150291969A1 (en) 2014-01-30 2015-10-15 Chromatin, Inc. Compositions for reduced lignin content in sorghum and improving cell wall digestibility, and methods of making the same
US20150225801A1 (en) 2014-02-11 2015-08-13 California Institute Of Technology Recording and mapping lineage information and molecular events in individual cells
AU2015218576B2 (en) 2014-02-24 2020-02-27 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for nuclease-mediated targeted integration
JP6594891B2 (ja) 2014-03-18 2019-10-23 サンガモ セラピューティクス， インコーポレイテッド ジンクフィンガータンパク質発現を調節するための方法および組成物
EP3498845B1 (en) 2014-04-01 2022-06-22 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating herpes simplex virus type 1 (hsv-1)
DE102015226614A1 (de) 2015-12-23 2017-06-29 Robert Bosch Gmbh Verfahren zum Betreiben eines Kraftfahrzeugs, Steuerungseinheit für ein Antriebssystem und ein Antriebssystem
US10250380B2 (en) 2016-12-12 2019-04-02 Qualcomm Incorporated Techniques for unified synchronization channel design in new radio
US11352698B2 (en) 2019-04-25 2022-06-07 Samsung Electronics Co., Ltd. Atomic layer deposition apparatus and methods of fabricating semiconductor devices using the same

Also Published As

Publication number Publication date
US20160130608A1 (en) 2016-05-12
US10774344B1 (en) 2020-09-15
US20200299733A1 (en) 2020-09-24
US20210108231A1 (en) 2021-04-15
AU2021200952B2 (en) 2023-07-13
ES3028090T3 (en) 2025-06-18
US10266850B2 (en) 2019-04-23
AU2017225060B2 (en) 2019-01-17
US20180273981A1 (en) 2018-09-27
MX2019012772A (es) 2019-12-16
US11001863B2 (en) 2021-05-11
US20220112521A1 (en) 2022-04-14
US20220119847A1 (en) 2022-04-21
CN107603976B (zh) 2021-10-12
EP4289948A2 (en) 2023-12-13
IL261570B (en) 2021-10-31
US20200354749A1 (en) 2020-11-12
US20160060653A1 (en) 2016-03-03
US20160130609A1 (en) 2016-05-12
GB201420270D0 (en) 2014-12-31
US20210222205A1 (en) 2021-07-22
US20160046961A1 (en) 2016-02-18
US20190169647A1 (en) 2019-06-06
LT3597749T (lt) 2023-10-10
CY1121657T1 (el) 2020-07-31
US20210079428A1 (en) 2021-03-18
US20210388395A1 (en) 2021-12-16
US11293034B2 (en) 2022-04-05
US20250146024A1 (en) 2025-05-08
PE20190843A1 (es) 2019-06-17
US20180251791A1 (en) 2018-09-06
GB2518764B (en) 2016-03-02
IL261570A (en) 2018-10-31
US20220259620A1 (en) 2022-08-18
EP4570908A3 (en) 2025-10-22
EP3401400B1 (en) 2019-04-03
US11401532B2 (en) 2022-08-02
US20190010520A1 (en) 2019-01-10
US12180503B2 (en) 2024-12-31
PH12014502574A1 (en) 2015-01-21
US20190169643A1 (en) 2019-06-06
US20210310028A1 (en) 2021-10-07
HUE043861T2 (hu) 2019-09-30
DK3597749T3 (da) 2023-09-25
US10113167B2 (en) 2018-10-30
US10358659B2 (en) 2019-07-23
RS59199B1 (sr) 2019-10-31
US10550407B2 (en) 2020-02-04
US20190106711A1 (en) 2019-04-11
JP6692856B2 (ja) 2020-05-13
KR20170134766A (ko) 2017-12-06
US20190169648A1 (en) 2019-06-06
US20190106714A1 (en) 2019-04-11
US20210062226A1 (en) 2021-03-04
EP2800811A1 (en) 2014-11-12
HUE038850T2 (hu) 2018-11-28
JP2015523856A (ja) 2015-08-20
SG11201407702XA (en) 2014-12-30
EP4289948B1 (en) 2025-02-26
US20170051310A1 (en) 2017-02-23
DK2800811T3 (en) 2017-07-17
IL261565B (en) 2021-09-30
US20220267807A1 (en) 2022-08-25
EP4289948A3 (en) 2024-04-17
US20190002923A1 (en) 2019-01-03
GB2537000C (en) 2019-10-09
DK4289948T3 (da) 2025-04-28
EP3597749B1 (en) 2023-07-26
CN104854241A (zh) 2015-08-19
US20200308607A1 (en) 2020-10-01
ME03530B (me) 2020-04-20
US12215343B2 (en) 2025-02-04
US10900054B2 (en) 2021-01-26
GB201601071D0 (en) 2016-03-02
US20180312875A1 (en) 2018-11-01
IL235461B (en) 2019-01-31
US20200277631A1 (en) 2020-09-03
NZ728024A (en) 2019-05-31
MX349744B (es) 2017-08-10
US20190169641A1 (en) 2019-06-06
LT4289948T (lt) 2025-05-12
HK1204003A1 (zh) 2015-11-06
CN104854241B (zh) 2017-07-14
US20210230639A1 (en) 2021-07-29
SI3597749T1 (sl) 2023-11-30
EA038924B1 (ru) 2021-11-10
US20180230496A1 (en) 2018-08-16
US10407697B2 (en) 2019-09-10
MY184753A (en) 2021-04-20
FI4289948T3 (fi) 2025-04-29
US20210388394A1 (en) 2021-12-16
SI2800811T1 (sl) 2017-10-30
US20140068797A1 (en) 2014-03-06
US20220119846A1 (en) 2022-04-21
US20190062790A1 (en) 2019-02-28
HUE064300T2 (hu) 2024-03-28
CA2872241C (en) 2022-12-06
US20210062225A1 (en) 2021-03-04
US11479794B2 (en) 2022-10-25
MX2014014477A (es) 2015-08-20
SI3401400T1 (sl) 2019-10-30
GB2518764C (en) 2016-08-24
MA37663A1 (fr) 2017-05-31
US20170051312A1 (en) 2017-02-23
US10988782B2 (en) 2021-04-27
PL3401400T3 (pl) 2019-12-31
US20250122537A1 (en) 2025-04-17
US20210062224A1 (en) 2021-03-04
BR112014029441A2 (pt) 2017-06-27
LT3241902T (lt) 2018-06-25
US20220073952A1 (en) 2022-03-10
US20220025407A1 (en) 2022-01-27
US20220119845A1 (en) 2022-04-21
GEP20217251B (en) 2021-04-26
US20210332391A1 (en) 2021-10-28
US20180251794A1 (en) 2018-09-06
BR112014029441B1 (pt) 2022-10-18
US20180298407A1 (en) 2018-10-18
US11473108B2 (en) 2022-10-18
US10519467B2 (en) 2019-12-31
HRP20180794T1 (hr) 2018-07-13
RS64622B1 (sr) 2023-10-31
US20190093129A1 (en) 2019-03-28
US20210332390A1 (en) 2021-10-28
US20190284583A1 (en) 2019-09-19
US20200308606A1 (en) 2020-10-01
EP4570908A2 (en) 2025-06-18
US20200325495A1 (en) 2020-10-15
HRP20231042T1 (hr) 2024-01-05
IL261566A (en) 2018-10-31
US20190264236A1 (en) 2019-08-29
US10533190B2 (en) 2020-01-14
IL261563A (en) 2018-10-31
US20180208931A1 (en) 2018-07-26
RS56119B1 (sr) 2017-10-31
CY1119282T1 (el) 2018-02-14
US20180245100A1 (en) 2018-08-30
AU2019201850A1 (en) 2019-04-11
US10752920B2 (en) 2020-08-25
CO7151523A2 (es) 2014-12-29
US11242543B2 (en) 2022-02-08
US11332761B2 (en) 2022-05-17
US20220127645A1 (en) 2022-04-28
US20200354747A1 (en) 2020-11-12
SG10201809817UA (en) 2018-12-28
PL3241902T3 (pl) 2018-09-28
US20190169644A1 (en) 2019-06-06
US10415061B2 (en) 2019-09-17
US20190330662A1 (en) 2019-10-31
US20210340575A1 (en) 2021-11-04
MX362866B (es) 2019-02-20
DK3241902T3 (en) 2018-05-07
US20180230497A1 (en) 2018-08-16
US20190264233A1 (en) 2019-08-29
US12180504B2 (en) 2024-12-31
US10000772B2 (en) 2018-06-19
SI4289948T1 (sl) 2025-07-31
EP3241902A1 (en) 2017-11-08
ES2960803T3 (es) 2024-03-06
EA201401319A1 (ru) 2015-05-29
AU2023248113A1 (en) 2023-11-09
MY189533A (en) 2022-02-16
IL261569A (en) 2018-10-31
HRP20190965T1 (hr) 2019-10-04
TN2014000493A1 (en) 2016-03-30
US20210062223A1 (en) 2021-03-04
US20200299734A1 (en) 2020-09-24
MX369077B (es) 2019-10-25
US20200354748A1 (en) 2020-11-12
PE20190842A1 (es) 2019-06-17
US10385360B2 (en) 2019-08-20
US10308961B2 (en) 2019-06-04
US20190256869A1 (en) 2019-08-22
US20190106713A1 (en) 2019-04-11
US10577631B2 (en) 2020-03-03
CY1120291T1 (el) 2019-07-10
PL4289948T3 (pl) 2025-06-02
US10669560B2 (en) 2020-06-02
US20220119848A1 (en) 2022-04-21
US10570419B2 (en) 2020-02-25
PT3401400T (pt) 2019-06-12
US10982231B2 (en) 2021-04-20
US20180251795A1 (en) 2018-09-06
US20180312876A1 (en) 2018-11-01
US20190264234A1 (en) 2019-08-29
IL261566B (en) 2022-04-01
US20190169642A1 (en) 2019-06-06
US20190256870A1 (en) 2019-08-22
EP2800811A4 (en) 2015-09-23
US20220267928A1 (en) 2022-08-25
US20180282764A1 (en) 2018-10-04
US20240417756A1 (en) 2024-12-19
NZ714353A (en) 2017-05-26
US10227611B2 (en) 2019-03-12
US12123015B2 (en) 2024-10-22
US20210087588A1 (en) 2021-03-25
US20220049276A1 (en) 2022-02-17
HK1207107A1 (zh) 2016-01-22
US20190169649A1 (en) 2019-06-06
US20190256871A1 (en) 2019-08-22
US20220267808A1 (en) 2022-08-25
US11674159B2 (en) 2023-06-13
EP3597749A1 (en) 2020-01-22
CL2014003208A1 (es) 2015-06-19
US20230227859A1 (en) 2023-07-20
FI3597749T3 (fi) 2023-10-09
EP2800811B1 (en) 2017-05-10
US20180245101A1 (en) 2018-08-30
GB2518764A (en) 2015-04-01
SI3241902T1 (en) 2018-07-31
IL261567A (en) 2018-10-31
HRP20171163T1 (hr) 2017-10-06
UA118014C2 (uk) 2018-11-12
US10337029B2 (en) 2019-07-02
DK3597749T5 (da) 2024-09-02
US10301651B2 (en) 2019-05-28
EP4043564A1 (en) 2022-08-17
PE20190844A1 (es) 2019-06-17
US10513712B2 (en) 2019-12-24
CN107603976A (zh) 2018-01-19
US20190271008A1 (en) 2019-09-05
JP6343605B2 (ja) 2018-06-13
US11274318B2 (en) 2022-03-15
EP3241902B1 (en) 2018-02-28
ME02836B (me) 2018-01-20
ES2636902T3 (es) 2017-10-10
HRP20250549T1 (hr) 2025-06-20
US20200308605A1 (en) 2020-10-01
GB2537000B (en) 2017-03-08
US20200362370A1 (en) 2020-11-19
US20200190542A1 (en) 2020-06-18
DE202013012242U1 (de) 2016-02-02
PL2800811T3 (pl) 2017-11-30
US11634730B2 (en) 2023-04-25
US10526619B2 (en) 2020-01-07
US11028412B2 (en) 2021-06-08
TR201806812T4 (tr) 2018-06-21
US11186849B2 (en) 2021-11-30
PT3241902T (pt) 2018-05-28
AU2013266968A1 (en) 2014-11-20
US20180230495A1 (en) 2018-08-16
US10421980B2 (en) 2019-09-24
PH12014502574B1 (en) 2019-08-09
US20200071728A1 (en) 2020-03-05
MA37663B1 (fr) 2019-12-31
JP2020039351A (ja) 2020-03-19
DK3401400T3 (da) 2019-06-03
AU2013266968B2 (en) 2017-06-29
WO2013176772A1 (en) 2013-11-28
IL261565A (en) 2018-10-31
IL261568A (en) 2018-10-31
GB201511669D0 (en) 2015-08-19
ECSP14028704A (es) 2015-09-30
LT2800811T (lt) 2017-09-11
US20160060654A1 (en) 2016-03-03
CR20140538A (es) 2015-02-18
US20180237801A1 (en) 2018-08-23
JP2018138054A (ja) 2018-09-06
PT2800811T (pt) 2017-08-17
US10612045B2 (en) 2020-04-07
US10351878B2 (en) 2019-07-16
IL261567B (en) 2020-11-30
US20190002922A1 (en) 2019-01-03
JP6887479B2 (ja) 2021-06-16
US10358658B2 (en) 2019-07-23
DE202013012240U1 (de) 2016-02-02
US10988780B2 (en) 2021-04-27
US10400253B2 (en) 2019-09-03
SG10201701800YA (en) 2017-04-27
US10982230B2 (en) 2021-04-20
US20190106712A1 (en) 2019-04-11
GB2518764A8 (en) 2015-07-22
AU2019201850B2 (en) 2020-11-19
US11970711B2 (en) 2024-04-30
US20160138008A1 (en) 2016-05-19
US20230212614A1 (en) 2023-07-06
PE20150336A1 (es) 2015-03-25
RS57287B1 (sr) 2018-08-31
IL261568B (en) 2021-09-30
HK1211978A1 (zh) 2016-06-03
JP2025148318A (ja) 2025-10-07
EP3401400A1 (en) 2018-11-14
PT3597749T (pt) 2023-10-24
ES2728782T3 (es) 2019-10-28
DE202013012241U1 (de) 2016-01-18
US10640791B2 (en) 2020-05-05
US20190169645A1 (en) 2019-06-06
JP2021121205A (ja) 2021-08-26
US10676759B2 (en) 2020-06-09
US20180251793A1 (en) 2018-09-06
US11814645B2 (en) 2023-11-14
GB2537000A (en) 2016-10-05
US10487341B2 (en) 2019-11-26
US20160068864A1 (en) 2016-03-10
PT4289948T (pt) 2025-05-16
KR20150016588A (ko) 2015-02-12
AU2017225060A1 (en) 2017-09-28
ES2670718T3 (es) 2018-05-31
LT3401400T (lt) 2019-06-10
PL3597749T3 (pl) 2023-11-27
US11008590B2 (en) 2021-05-18
JP2023123755A (ja) 2023-09-05
US11549127B2 (en) 2023-01-10
US20190106715A1 (en) 2019-04-11
US20190002921A1 (en) 2019-01-03
IL261569B (en) 2021-09-30
US20180312874A1 (en) 2018-11-01
US10428352B2 (en) 2019-10-01
US10443076B2 (en) 2019-10-15
US10597680B2 (en) 2020-03-24
US10793878B1 (en) 2020-10-06
CA2872241A1 (en) 2013-11-28
US10563227B2 (en) 2020-02-18
US20190169646A1 (en) 2019-06-06
US20220010338A1 (en) 2022-01-13
US20190264235A1 (en) 2019-08-29
US11008589B2 (en) 2021-05-18
US10626419B2 (en) 2020-04-21
US20170166893A1 (en) 2017-06-15
AU2021200952A1 (en) 2021-03-04
US20180298406A1 (en) 2018-10-18
US20200080113A1 (en) 2020-03-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11008590B2 (en) Methods and compositions for RNA-directed target DNA modification and for RNA-directed modulation of transcription
HK40099448A (en) Methods and compositions for rna-directed target dna modification and for rna-directed modulation of transcription
HK40099448B (en) Methods and compositions for rna-directed target dna modification and for rna-directed modulation of transcription
HK1230233A1 (en) Methods and compositions for rna-directed target dna modification and for rna-directed modulation of transcription
HK1230233A (en) Methods and compositions for rna-directed target dna modification and for rna-directed modulation of transcription