RS59199B1 - Metode i jedinjenja za rnk-upravljanu ciljanu dnk modifikaciju i za rnk- upravljanu modulaciju transkripta - Google Patents

Metode i jedinjenja za rnk-upravljanu ciljanu dnk modifikaciju i za rnk- upravljanu modulaciju transkripta

Info

Publication number
RS59199B1
RS59199B1 RSP20190673A RS59199B1 RS 59199 B1 RS59199 B1 RS 59199B1 RS P20190673 A RSP20190673 A RS P20190673A RS 59199 B1 RS59199 B1 RS 59199B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
dna
rna
targeting
cell
polypeptide
Prior art date
Application number
Other languages
English (en)
Inventor
Emmanuelle Charpentier
Martin Jinek
Cate James Harrison Doudna
Wendell Lim
Lei Qi
Krzysztof Chylinski
Jennifer A Doudna
Original Assignee
Univ California
Univ Vienna
Emmanuelle Charpentier
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=49624232&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS59199(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Univ California, Univ Vienna, Emmanuelle Charpentier filed Critical Univ California
Publication of RS59199B1 publication Critical patent/RS59199B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H6/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their botanic taxonomy
    • A01H6/46—Gramineae or Poaceae, e.g. ryegrass, rice, wheat or maize
    • A01H6/4684—Zea mays [maize]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/465—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1), e.g. lipases, ribonucleases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/746—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for lactic acid bacteria (Streptococcus; Lactococcus; Lactobacillus; Pediococcus; Enterococcus; Leuconostoc; Propionibacterium; Bifidobacterium; Sporolactobacillus)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases [RNase]; Deoxyribonucleases [DNase]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases [RNase]; Deoxyribonucleases [DNase]
    • C12N9/222—Clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPR]-associated [CAS] enzymes
    • C12N9/226—Class 2 CAS enzyme complex, e.g. single CAS protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/04—Phosphoric diester hydrolases (3.1.4)
    • H—ELECTRICITY
    • H10—SEMICONDUCTOR DEVICES; ELECTRIC SOLID-STATE DEVICES NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • H10H—INORGANIC LIGHT-EMITTING SEMICONDUCTOR DEVICES HAVING POTENTIAL BARRIERS
    • H10H20/00—Individual inorganic light-emitting semiconductor devices having potential barriers, e.g. light-emitting diodes [LED]
    • H10H20/01—Manufacture or treatment
    • H10H20/011—Manufacture or treatment of bodies, e.g. forming semiconductor layers
    • H10H20/013—Manufacture or treatment of bodies, e.g. forming semiconductor layers having light-emitting regions comprising only Group III-V materials
    • H10H20/0137—Manufacture or treatment of bodies, e.g. forming semiconductor layers having light-emitting regions comprising only Group III-V materials the light-emitting regions comprising nitride materials
    • H—ELECTRICITY
    • H10—SEMICONDUCTOR DEVICES; ELECTRIC SOLID-STATE DEVICES NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • H10P—GENERIC PROCESSES OR APPARATUS FOR THE MANUFACTURE OR TREATMENT OF DEVICES COVERED BY CLASS H10
    • H10P14/00—Formation of materials, e.g. in the shape of layers or pillars
    • H10P14/20—Formation of materials, e.g. in the shape of layers or pillars of semiconductor materials
    • H—ELECTRICITY
    • H10—SEMICONDUCTOR DEVICES; ELECTRIC SOLID-STATE DEVICES NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • H10P—GENERIC PROCESSES OR APPARATUS FOR THE MANUFACTURE OR TREATMENT OF DEVICES COVERED BY CLASS H10
    • H10P14/00—Formation of materials, e.g. in the shape of layers or pillars
    • H10P14/60—Formation of materials, e.g. in the shape of layers or pillars of insulating materials
    • H10P14/65—Formation of materials, e.g. in the shape of layers or pillars of insulating materials characterised by treatments performed before or after the formation of the materials
    • H10P14/6502—Formation of materials, e.g. in the shape of layers or pillars of insulating materials characterised by treatments performed before or after the formation of the materials of treatments performed before formation of the materials
    • H10P14/6512—Formation of materials, e.g. in the shape of layers or pillars of insulating materials characterised by treatments performed before or after the formation of the materials of treatments performed before formation of the materials by exposure to a gas or vapour
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/71—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing domain for transcriptional activaation, e.g. VP16
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/85—Fusion polypeptide containing an RNA binding domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/13—Decoys
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering nucleic acids [NA]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/33—Chemical structure of the base
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C12N2310/3519—Fusion with another nucleic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/50—Physical structure
    • C12N2310/53—Physical structure partially self-complementary or closed
    • C12N2310/531—Stem-loop; Hairpin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/80—Vectors containing sites for inducing double-stranded breaks, e.g. meganuclease restriction sites
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Botany (AREA)

Description

Opis
Stanje tehnike
[0001 Oko 60% bakterija i 90% arhea poseduje CRISPR (klasterisane redovno interspaced kratke palindromske ponavljanja) / CRISPR (Cas) sistemske sisteme da bi se dobila otpornost na strane DNK elemente. CRISPR sistem tipa II iz Streptococcus piogenes uključuje samo jedan gen koji kodira Cas9 protein i dve RNK - zrelu CRISPR RNK (crRNA) i delimično komplementarnu trans-delujuću RNK (tracrRNA) - koje su neophodne i dovoljne za RNA-vođeno utišavanje strane DNK. Deltcheva (Nature 471, 2011) se odnosi na sazrevanje CRISPR RNK preko trans-kodirane male RNK i domaćina faktora RNaze III.
[0002 Poslednjih godina, inzenjerirani enzimi nukleaze dizajnirani da ciljaju specifične sekvence DNK privukli su značajnu pažnju kao moćna sredstva za genetsku manipulaciju ćelija i celih organizama, omogućavajući ciljano brisanje, zamenu i popravku gena, kao i umetanje egzogenih sekvenci (transgeni) u genom. Pojavile su se dve glavne tehnologije za inženjerske DNK nukleaze specifične za gradilište, koje se zasnivaju na konstrukciji enzima himernih endonukleaza u kojima je sekvenca nespecifična DNK endonukleazna domena fuzionisana sa projektovanim DNK vezujućim domenom. Međutim, ciljanje svakog novog genomskog lokusa zahteva dizajn novog enzima nukleaze, čineći ove pristupe i dugotrajnim i skupim. Pored toga, obe tehnologije pate od ograničene preciznosti, što može dovesti do nepredvidivih efekata koji nisu ciljani.
VO 2011/072246 se odnosi na ciljanje gena sa nukleazama sličnim aktivatoru transkripcije.
0003 Sistematsko ispitivanje genoma i genetsko reprogramiranje ćelija uključuje ciljanje skupova gena za ekspresiju ili represiju. Trenutno najčešći pristup za ciljanje proizvoljnih gena za regulaciju je upotreba RNA interferencije (RNAi). Ovaj pristup ima ograničenja. Na primer, RNAi može pokazati značajne efekte i toksičnost van ciljne grupe.
0004] Oko 60% bakterija i 90% arhea posjeduju CRISPR (grupisana pravilno razmaknuta kratka palindromska ponavljanja) sisteme/sisteme vezane za CRISPR (Cas) koji pružaju otpor stranim DNK elementima. Tip II CRISPR sistema iz Streptococcus pyogenes podrazumeva samo jedan gen koji kodira Cas9 protein i dva RNK - zrelu CRISPR RNK (crRNK) i delimično komplementarnu trans-dejstvujuću RNK (tracrRNK) - koji su neophodni i dovoljni za RNK-navođeno smirivanje strane DNK. Deltcheva (Nature 471, 2011) se odnosi na sazrevanje CRISPR RNK putem transenhodiranih malih RNK i domaćinovog faktora RNKaza III.
Sažeti prikaz
[0005] Svaka referenca na genetsku modifikaciju ćelija ne obuhvata germlinija modifikaciju ljudi. Sastavi prema pronalasku ne obuhvataju ljudske germ ćelije, ljudske embrione ili ljudske embrionalne germ ćelije. Postupci prema pronalasku ne obuhvataju upotrebu ljudskih embriona ili ljudskih embrionalnih germ ćelija. Predmetni pronalazak pruža postupak modifikacije ciljane DNK, postupak koji obuhvata dovođenje u dodir ciljane DNK sa kompleksom koji sadrži:
(a) polipeptid Cas9; i
(b) jednomolekulske RNK koja cilja DNK koji sadrži:
(i) segment koji cilja DNK koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja je komplementarna sekvenci u ciljanoj DNK i
(ii) protein-vezujući segment koji interakuje sa navedenim Cas9 polipeptidom, pri čemu protein-vezujući segment sadrži dva komplementarna dela nukleotida koji hibridizuju da bi se formirao dvostruko vezani RNK (dsRNK) dupleks, pri čemu su navedena dva komplementarna dela nukleotida kovalentno povezana intervencijskim nukleotidima, pri čemu je navedeni dodir in vitro ili u ćeliji ex vivo; i gde je pomenuto modifikovanje cepanje ciljane DNK.
Pronalazak pruža sastav koja sadrži:
(a) polipeptid Cas9 ili polinukleotid koji kodira navedeni Cas9 polipeptid, i
(b) jednomolekulske RNK koja cilja DNK, ili DNK polinukleotid koji kodira pomenutu RNK koja cilja DNK, pri čemu pomenuta jednomolekulske RNK koja cilja DNK obuhvata:
(i) segment koji cilja DNK koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja je komplementarna sekvenci u ciljanoj DNK, i
(ii) segment vezivanja proteina koji interakuje sa pomenutim Cas9 polipeptidom, pri čemu segment za vezivanje proteina sadrži dva komplementarna dela nukleotida koji se hibridizuju da bi se formirao dvostruki vezani RNK (dsRNK) dupleks, pri čemu su navedena dva komplementarna dela nukleotida kovalentno povezana intervencijskim nukleotidima.
Pronalazak pruža jednu ili više nukleinskih kiselina koje sadrže:
(a) prvu nukleotidnu sekvencu koja kodira jednomolekulska RNK koja cilja DNK koja sadrži:
(i) segment koji cilja DNK koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja je komplementarna sa ciljanom sekvencom u ciljanoj DNK, i
(ii) (ii) segment vezivanja proteina koji interakuje sa Cas9 polipeptidom, pri čemu segment za vezivanje proteina sadrži dva komplementarna dela nukleotida koji hibridizuju da bi se formirao dvostruko vezani RNK (dsRNK) dupleks,
pri čemu su pomenuta dva komplementarna dela nukleotida kovalentno vezani intervencijskim nukleotidima; gde je prva nukleotidna sekvenca koja kodira pomenutu RNK koja cilja DNK perativno povezana sa promoterom; i, opciono,
(b) druga nukleotidna sekvenca koja kodira polipeptid Cas9, pri čemu je nukleotidna sekvenca koja kodira
pomenuti polipeptid Cas9, operativno je povezana sa promoterom.
Pronalazak pruža komplet koji sadrži:
(a) Cas9 polipeptid ili nukleinsku kiselinu koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira pomenuti polipeptid Cas9; i
(b) jednomolekulska RNK koja cilja DNK ili nukleinsku kiselinu koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira pomenutu jednomolekulska RNK koja cilja DNK, pri čemu jednomolekulska RNK koja cilja DNK sadrži:
(i) segment ciljanja na DNK koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja je komplementarna sekvenci u ciljanoj DNK, i
(ii) (ii) segment za vezivanje proteina koji interakuje sa pomenutim Cas9 polipeptidom, pri čemu segment vezivanja proteina sadrži dva komplementarna dela nukleotida koji se hibridizuju da bi se formirao dvostruko vezani RNK (dsRNK) dupleks, pri čemu su navedena dva komplementarna dela nukleotida kovalentno povezana intervencijskim nukleotidima, a gde su (a) i (b) u istim ili odvojenim kontejnerima, i i gde je cilj DNK prisutan u jedna ćelija eukariotske organizam, ćelija koja životinja ili biljna ćelija.
Pronalazak obezbeđuje genetički modifikovan ćelije domaćina, koja je eukariotske ćelije, obuhvata:
(a) a Cas9 polipeptid, ili polinukleotid kodira navedenog polipeptida Cas9; i / ili
(b) a RNK ciljanu DNK, ili jedan ili više DNK polinukleotid kodira navedeni DNK ciljanu DNK, pri čemu DNA Ciljanje DNA obuhvata:
(i) DNK ciljanje segment koji sadrži sekvencu nukleotida koja je komplementarna sekvenci na meti DNK i
(ii) segment protein vezivanje koje interaguje sa Cas9 navedenog polipeptida, pri čemu segment protein vezivanje sastoji dva komplementarna nizove nukleotida koji hibridizuju formirati dvostruka RNK (dsRNA) double; i gde (A) ćelija domaćin je genetski modifikovan in vitro ili in vivo; i / ili (B) genetski modifikovani ćelija domaćin nije humana ćelija.
[0006] Ovo obelodanjenje pruža RNK koja cilja DNK koja sadrži ciljanu sekvencu i, zajedno sa modifikovanim polipeptidom, pruža modifikaciju specifičnu za lokaciju ciljane DNK i/ili polipeptida povezanog sa ciljanom DNK. Ovo obelodanjenje dalje pruža polipeptide koji modifikuju specifične lokacije. Ovo obelodanjenje dalje pruža postupke modifikacije specifične za lokaciju ciljane DNK i/ili polipeptida povezanog sa ciljanom DNK. Ovo obelodanjenje pruža postupke modulacije transkripcije ciljane nukleinske kiseline u ciljanoj ćeliji, uopšteno uključivši dovođenje u dodir ciljane nukleinske kiseline sa enzimatskim neaktivnim Cas9 polipeptidom i RNK koja cilja DNK. Pruženi su i kompleti i sastavi za otelotvorenje postupaka. Ovo obelodanjenje pruža genetski modifikovane ćelije koje proizvode Cas9; i Cas9 transgene ne-ljudske višećelijske organizme.
[0007] Karakteristike ovog obelodanjenja uključuju RNK koja cilja DNK koja sadrži: (i) prvi segment koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja je komplementarna sekvenci u ciljanoj DNK; i (ii) drugi segment koji interakuje sa usmerenim modifikacionim polipeptidom. U nekim slučajevima, prvi segment sadrži 8 nukleotida koji imaju 100% komplementarnost sekvenci u ciljanoj DNK. U nekim slučajevima, drugi segment sadrži nukleotidnu sekvencu sa najmanje 60% identičnosti na delu od najmanje 8 susednih nukleotida sa bilo kojom od nukleotidnih sekvenci datih u SEQ ID NO: 431-682 (npr.431-562). U nekim slučajevima, drugi segment sadrži nukleotidnu sekvencu sa najmanje 60% identičnosti preko dela od najmanje 8 susednih nukleotida sa bilo kojom od nukleotidnih sekvenci datih u SEQ ID NO: 563-682. U nekim slučajevima, na mesto usmereni usmeren modifikacioni polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje oko 75% identičnosti aminokiseline sa aminokiselinama 7-166 ili 731-1003 od Cas9/Csn1 aminokiselinske sekvence prikazane na Slici 3 ili odgovarajućim delovima u bilo kojoj od sekvenci aminokiselina koji su navedeni kao SEQ ID NO: 1-256 i 795-1346.
[0008] Karakteristike ovog otkrića uključuju DNK polinukleotid koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira RNK-ciljanje na DNK. U nekim slučajevima, rekombinantni ekspresioni vektor sadrži DNK polinukleotid. U nekim slučajevima, nukleotidna sekvenca koja kodira RNK-ciljanje je operativno povezana sa promotorom. U nekim slučajevima, promotor je inducibilni promotor. U nekim slučajevima, nukleotidna sekvenca koja kodira RNK-ciljanje dalje obuhvata mesto za višestruko kloniranje. Karakteristike ovog otkrića uključuju in vitro genetski modifikovanu ćeliju domaćina koja sadrži DNK polinukleotid.
[0009] Karakteristike ovog obelodanjenja uključuju rekombinantni vektor eksprimiranja koji sadrži: (i) nukleotidnu sekvencu koja kodira RNK koja cilja DNK, pri čemu RNK koja cilja DNK sadrži: (a) prvi segment koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja je komplementarna sekvenci u ciljanoj DNK; i (b) drugi segment koji interakuje sa polipeptidom koji je usmeren na mesto; i (ii) nukleotidnu sekvenca koja kodira usmeren modifikacioni polipeptid i sadrži: (a) deo koji se vezuje za RNK koja interakuje sa RNK koja cilja DNK; i (b) deo aktivnosti koji pokazuje usmerenu enzimsku aktivnost, pri čemu se mesto enzimske aktivnosti određuje pomoću RNK koja cilja DNK.
[0010] Karakteristike ovog obelodanjenja uključuju rekombinantni vektor eksprimiranja koji sadrži: (i) nukleotidnu sekvencu koja kodira RNK koja cilja DNK, pri čemu RNK koja cilja DNK sadrži: (a) prvi segment koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja je komplementarna sekvenci u ciljanoj DNK; i (b) drugi segment koji interakuje sa polipeptidom koji je usmeren na mesto; i (ii) nukleotidnu sekvencu koja kodira usmeren modifikacioni polipeptid, gde usmeren modifikacioni polipeptid obuhvata: (a) deo koji se vezuje za RNK, koji interakuje sa RNK koja cilja DNK; i (b) deo aktivnosti koji modulira transkripciju unutar ciljane DNK, pri čemu je mesto modulirane transkripcije unutar ciljane DNK određeno pomoću RNK koja cilja DNK.
[0011] Karakteristike ovog obelodanjenja uključuju RNK koja cilja DNK koja sadrži: (i) prvi segment koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja je komplementarna sekvenci u ciljanoj DNK; i (ii) drugi segment koji interakuje sa usmerenim modifikacionim polipeptidom. U nekim slučajevima, prvi segment sadrži 8 nukleotida koji imaju 100% komplementarnost sekvenci u ciljanoj DNK. U nekim slučajevima, drugi segment sadrži nukleotidnu sekvencu sa najmanje 60% identičnosti na delu od najmanje 8 susednih nukleotida sa bilo kojom od nukleotidnih sekvenci datih u SEQ ID NO: 431-682 (npr.431-562). U nekim slučajevima, drugi segment sadrži nukleotidnu sekvencu sa najmanje 60% identičnosti preko dela od najmanje 8 susednih nukleotida sa bilo kojom od nukleotidnih sekvenci datih u SEQ ID NO: 563-682. U nekim slučajevima, na mesto usmereni usmeren modifikacioni polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje oko 75% identičnosti aminokiseline sa aminokiselinama 7-166 ili 731-1003 od Cas9/Csn1 aminokiselinske sekvence prikazane na Slici 3 ili odgovarajućim delovima u bilo kojoj od sekvenci aminokiselina koji su navedeni kao SEQ ID NO: 1-256 i 795-1346.
[0012] Karakteristike ovog obelodanjenja uključuju himerni usmereni modifikacioni polipeptid, koji sadrži: (i) deo koji se vezuje za RNK koja interakuje sa RNK koja cilja DNK, pri čemu RNK koja cilja DNK sadrži nukleotidnu sekvencu koja je komplementarna sa sekvencom u ciljanoj DNK; i (ii) deo aktivnosti koji pokazuje enzimsku aktivnost usmerenu na mesto, pri čemu se mesto enzimske aktivnosti određuje pomoću RNK koja cilja DNK. U nekim slučajevima, himerni usmereni modifikacioni polipeptid, sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje oko 75% identičnosti aminokiselinske sekvence sa aminokiselinama 7-166 ili 731-1003 od Cas9/Csn1 aminokiselinske sekvence prikazane na Slici 3, ili odgovarajućim delovima u bilo kojoj od aminokiselinskih sekvenci datih kao SEQ ID NOs: 1-256 i 795-1346. U nekim slučajevima, RNK koja cilja DNK dalje sadrži nukleotidnu sekvencu sa najmanje 60% identičnosti sa delom od najmanje 8 susednih nukleotida u bilo kojoj od nukleotidnih sekvenci datih u SEQ ID NO: 431-682 (npr., SEQ ID brojevi: 563-682). U nekim slučajevima, RNK koja cilja DNK dalje sadrži nukleotidnu sekvencu sa najmanje 60% identičnosti sa delom od najmanje 8 susednih nukleotida u bilo koju od nukleotidnih sekvenci datih u SEQ ID NO: 431-562. U nekim slučajevima, enzimska aktivnost himernog usmerenog modifikacionog polipeptida modifikuje ciljanu DNK. U nekim slučajevima, enzimska aktivnost himernog usmerenog modifikacionog polipeptida je aktivnost nukleaze, aktivnost metiltransferaze, aktivnost demetilaze, aktivnost DNK popravke, aktivnost DNK oštećenja, aktivnost deaminacije, aktivnost dismutaze, aktivnost alkilacije, aktivnost depuracije, aktivnost oksidacije, aktivnost formiranja pirimidinskog dimera, aktivnost integraze, aktivnost transposaze, aktivnost rekombinaze, aktivnost polimeraze, aktivnost ligaze, aktivnost helikase, aktivnost fotoliaze ili aktivnost glikozilaze. U nekim slučajevima, enzimska aktivnost himernog usmerenog modifikacionog polipeptida je aktivnost nukleaze. U nekim slučajevima aktivnost nukleaze dovodi do raskida dvostruke veze u ciljanoj DNK. U nekim slučajevima, enzimska aktivnost himernog usmerenog modifikacionog polipeptida modifikuje ciljani polipeptid povezan sa ciljanom DNK. U nekim slučajevima, enzimska aktivnost himernog usmerenog modifikacionog polipeptida je aktivnost metil-transferaze, aktivnost demetilaze, aktivnost acetiltransferaze, aktivnost deacetilaze, aktivnost kinaze, aktivnost fosfataze, aktivnost ubikuitin ligaze, aktivnost deubikuitinacije, aktivnost adenilacije, aktivnost umirenja, aktivnost SUMOilacije, aktivnost deSUMOilacije, aktivnost ribozilacije, aktivnost deribozilacije, aktivnost miristoilacije ili aktivnost demiristoilacije.
[0013] Karakteristike ovog obelodanjenja uključuju DNK polinukleotid koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira RNK koja cilja DNK. U nekim slučajevima, rekombinantni vektor eksprimiranja sadrži DNK polinukleotid. U nekim slučajevima, nukleotidna sekvenca koja kodira RNK koja cilja operativno je povezana sa promoterom. U nekim slučajevima, promoter je inducibilni promoter. U nekim slučajevima, nukleotidna sekvenca koja kodira RNK koja cilja DNK dalje sadrži više mesto za kloniranje. Karakteristike ovog obelodanjenja uključuju in vitro genetski modifikovanu ćeliju domaćina koja sadrži DNK polinukleotid.
[0014] Karakteristike ovog obelodanjenja uključuju himerni usmereni modifikacioni polipeptid: (i) RNK-vezujući deo koji interakuje sa RNK koja cilja DNK, pri čemu RNK koja cilja DNK ciljanjem sadrži nukleotidnu sekvencu koja je komplementarna sa sekvencom u ciljanoj DNK; i (ii) deo aktivnosti koji modulira transkripciju unutar ciljane DNK, pri čemu je mesto modulirane transkripcije unutar ciljane DNK određeno pomoću RNK koja cilja DNK. U nekim slučajevima, deo aktivnosti povećava transkripciju unutar ciljane DNK. U nekim slučajevima, deo aktivnosti smanjuje transkripciju unutar ciljane DNK.
[0015] Karakteristike ovog obelodanjenja uključuju genetski modifikovanu ćeliju koja sadrži rekombinantni usmeren modifikacioni polipeptid koji sadrži RNK-vezujući deo koji interakuje sa RNK koja cilja DNK; i deo aktivnosti koji pokazuje usmerenu enzimsku aktivnost, pri čemu se mesto enzimske aktivnosti određuje pomoću RNK koja cilja DNK. U nekim slučajevima, usmeren modifikacioni polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje oko 75% identičnosti aminokiseline sa aminokiselinama 7-166 ili 731-1003 od Cas9/Csn1 aminokiselinskih sekvenci datih na Slici 3 ili odgovarajućim delovima u bilo kojoj od aminokiselinskih sekvenci koje su navedeni kao SEQ ID NO: 1-256 i 795-1346. U nekim slučajevima, ćelija je izabrana iz grupe koju čine: ćelije arhea, bakterijske ćelije, eukariotske ćelije, eukariotski jednoćelijski organizmi, somatske ćelije, germ ćelije, matične ćelije, biljne ćelije, ćelija ćelija, ćelija životinja, ćelije beskičmenjaka, ćelija kičmenjaka, ćelije riba, žablje ćelije, ptičje ćelije, ćelije sisara, ćelija svinje, kravlje ćelije, ćelije koza, ćelija ovaca, ćelija glodara, ćelije pacova, mišije ćelije, ćelije primata bez čoveka i ćelije čoveka.
[0016] Osobine ovog obelodanjenja uključuju transgeni ne-ljudski organizam čiji genom sadrži transgen koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira rekombinantni usmeren modifikacioni polipeptid, koji obuhvata: (i) deo koji se vezuje za RNK koja interakuje sa RNK koja cilja DNK; i (ii) deo aktivnosti koji pokazuje usmerenu enzimsku aktivnost, pri čemu se mesto enzimske aktivnosti određuje pomoću RNK koja cilja DNK. U nekim slučajevima, usmeren modifikacioni polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje oko 75% identičnosti aminokiseline sa aminokiselinama 7-166 ili 731-1003 od Cas9/Csn1 aminokiselinske sekvence prikazane na Slici 3 ili odgovarajućim delovi u bilo kojoj od aminokiselinskih sekvenci koji su navedeni kao SEQ ID NO: 1-256 i 795-1346. U nekim slučajevima, organizam se bira iz grupe koju čine: arhea, bakterija, eukariotski jednoćelijski organizam, alga, biljka, životinja, beskičmenjak, muva, crv, cnidar, kičmenjak, riba, žaba, ptica, sisar, kopola, glodar, pacov, miš i primat koji nije čovek.
[0017] Karakteristike ovog obelodanjenja obuhvataju postupak specifične modifikacije ciljane DNK, gde postupak obuhvata: dovođenje u dodir ciljane DNK sa: (i) RNK koja cilja DNK, ili DNK polinukleotidom koji kodira isto, pri čemu RNK koja cilja DNK sadrži: (a) prvi segment koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja je komplementarna sekvenci u ciljanoj DNK; i (b) drugi segment koji interakuje sa usmerenim modifikacionim polipeptidom; i (ii) usmeren modifikacioni polipeptid, ili polinukleotid koji kodira isto, gde usmeren modifikacioni polipeptid sadrži: (a) deo koji se vezuje za RNK koja interakuje sa RNK koja cilja DNK; i (b) deo aktivnosti koji pokazuje usmerenu enzimsku aktivnost. U nekim slučajevima, ciljana DNK je ekstrahromozomna. U nekim slučajevima ciljana DNK sadrži PAM sekvencu komplementarne linije koja je 5'-CCY-3' , pri čemu je Y bilo koji nukleotid DNK i Y je odmah 5' ciljane sekvence komplementarne linije ciljane DNK. U nekim slučajevima, ciljana DNK je deo hromozoma in vitro. U nekim slučajevima, ciljana DNK je deo hromozoma in vivo. U nekim slučajevima, ciljana DNK je deo hromozoma u ćeliji. U nekim slučajevima, ćelija je izabrana iz grupe koja se sastoji od: ćelije arhea, bakterijske ćelije, eukariotske ćelije, eukariotski jednoćelijski organizmi, somatske ćelije, germ ćelije, matične ćelije, biljne ćelije, ćelija ćelija, ćelija životinja, ćelije beskičmenjaka, ćelija kičmenjaka, ćelije riba, žablje ćelije, ptičje ćelije, ćelije sisara, ćelija svinje, kravlje ćelije, ćelije koza, ćelija ovaca, ćelija glodara, ćelije pacova, mišije ćelije, ćelije primata bez čoveka i ćelije čoveka. U nekim slučajevima, RNK koja cilja DNK sadrži nukleotidnu sekvencu sa najmanje 60% identičnosti sa delom od najmanje 8 susednih nukleotida sa bilo kojom od nukleotidnih sekvenci datih u SEQ ID NO: 431-682 (npr., SEQ ID NOs: 563-682). U nekim slučajevima, RNK koja cilja DNK sadrži nukleotidnu sekvencu sa najmanje 60% identičnosti sa delom od najmanje 8 susednih nukleotida sa bilo kojom od nukleotidnih sekvenci datih u SEQ ID NO: 431-562. U nekim slučajevima, polipeptid koji modifikuje DNK sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje oko 75% identičnosti aminokiselinske sekvence sa aminokiselinama 7-166 ili 731-1003 od Cas9/Csn1 aminokiselinske sekvence prikazane na Slici 3, ili na odgovarajućim delovima u bilo kojoj od aminokiselinskih sekvenci koje su navedeni kao SEQ ID NO: 1-256 i 795-1346. U nekim slučajevima, enzimska aktivnost modifikuje ciljanu DNK. U nekim slučajevima, enzimska aktivnost je aktivnost nukleaze, aktivnost metiltransferaze, aktivnost demetilaze, aktivnost DNK popravke, aktivnost DNK oštećenja, aktivnost dehidracije, aktivnost dismutaze, aktivnost alkilacije, aktivnost depuracije, aktivnost oksidacije, aktivnost pirimidin dimera, integrazna aktivnost, transpozna aktivnost, aktivnost rekombinaze, aktivnost polimeraze, aktivnost ligaze, aktivnosti helikase, aktivnosti fotolijase ili glikozilaze. U nekim slučajevima, enzimska aktivnost koja modifikuje DNK je aktivnost nukleaze. U nekim slučajevima aktivnost nukleaze dovodi do raskida dvostruke veze u ciljanoj DNK. U nekim slučajevima, dovođenje u dodir se odvija pod uslovima koji su dopušteni za nehomologno spajanje ili popravku homologije. U nekim slučajevima postupak dalje obuhvata dovođenje u dodir ciljane DNK sa donor polinukleotidom, pri čemu se donor polinukleotid, deo donorskog polinukleotida, kopija donorskog polinukleotida ili deo kopije donorskog polinukleotida integrišu u ciljanu DNK. U nekim slučajevima, postupak ne obuhvata dovođenje u dodir ćelije sa donor polinukleotidom, pri čemu se ciljana DNK modifikuje tako da se nukleotidi unutar ciljane DNK brišu. U nekim slučajevima, enzimska aktivnost modifikuje ciljani polipeptid povezan sa ciljanom DNK. U nekim slučajevima, enzimska aktivnost je aktivnost metil-transferaze, aktivnost demetilaze, aktivnost acetil-transferaze, aktivnost deacetilaze, aktivnost kinaze, aktivnost fosfataze, aktivnost ubikuitin ligaze, aktivnost deubikuitinacije, aktivnost adenilacije, aktivnost umirenja, aktivnost SUMOilacije, aktivnost deSUMOilacije, aktivnost ribozilacije, aktivnost deribozilacije, aktivnost miristoilacije ili aktivnost demiristoilacije. U nekim slučajevima, ciljani polipeptid je histon, a enzimska aktivnost je metiltransferazna aktivnost, aktivnost demetilaze, aktivnost acetil-transferaze, aktivnost deacetilaze, aktivnost kinaze, aktivnost fosfataze, aktivnost ubikuitin ligaze ili aktivnost deubikiniziranja. U nekim slučajevima kompleks dodatno sadrži aktivator-RNK. U nekim slučajevima, aktivator-RNK sadrži nukleotidnu sekvencu sa najmanje 60% identičnosti sa delom od najmanje 8 susednih nukleotida sa bilo kojom od nukleotidnih sekvenci datih u SEQ ID NO: 431-682.
[0018] Karakteristike ovog obelodanjenja uključuju sastav koji sadrži: (i) RNK koja cilja DNK ovog obelodanjenja, ili DNK polinukleotid koji kodira isto; i (ii) pufer za stabilizaciju nukleinskih kiselina. Karakteristike ovog obelodanjenja uključuju sastav koji sadrži: (i) usmeren modifikacioni polipeptid ovog obelodanjenja, ili polinukleotid koji kodira isto; i (ii) pufer za stabilizaciju nukleinskih kiselina i/ili proteina. Karakteristike ovog obelodanjenja uključuju sastav koji sadrži: (i) RNK koja cilja DNK ili DNK polinukleotid koji kodira isto, gde RNK koja cilja DNK sadrži: (a) prvi segment koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja je komplementarna sekvenci u ciljanoj DNK; i (b) drugi segment koji interakuje sa usmerenim modifikacionim polipeptidom; i (ii) usmeren modifikacioni polipeptid, ili polinukleotid koji kodira isto, gde usmeren modifikacioni polipeptid sadrži: (a) deo koji se vezuje za RNK koja interakuje sa RNK koja cilja DNK; i (b) deo aktivnosti koji modulira transkripciju unutar ciljane DNK, pri čemu je mesto modulirane transkripcije unutar ciljane DNK određeno pomoću RNK koja cilja DNK. U nekim slučajevima, deo aktivnosti povećava transkripciju unutar ciljane DNK. U nekim slučajevima, deo aktivnosti smanjuje transkripciju unutar ciljane DNK. Karakteristike ovog obelodanjenja uključuju sastav koji sadrži: (i) usmeren modifikacioni polipeptid, ili polinukleotid koji kodira isto; i (ii) pufer za stabilizaciju nukleinskih kiselina i/ili proteina.
[0019] Karakteristike ovog obelodanjenja obuhvataju postupak specifične modifikacije ciljane DNK, gde postupak obuhvata: dovođenje u dodir ciljane DNK sa: (i) RNK koja cilja DNK, ili DNK polinukleotidom koji kodira isto, pri čemu RNK koja cilja DNK sadrži: (a) prvi segment koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja je komplementarna sekvenci u ciljanoj DNK; i (b) drugi segment koji interakuje sa usmerenim modifikacionim polipeptidom; i (ii) usmeren modifikacioni polipeptid, ili polinukleotid koji kodira isto, gde usmeren modifikacioni polipeptid sadrži: (a) deo koji se vezuje za RNK koja interakuje sa RNK koja cilja DNK; i (b) deo aktivnosti koji pokazuje usmerenu enzimsku aktivnost. U nekim slučajevima, ciljana DNK je ekstrahromozomna. U nekim slučajevima ciljana DNK sadrži PAM sekvencu komplementarne linije koja je 5'-CCY-3' , pri čemu je Y bilo koji nukleotid DNK i Y je odmah 5' ciljane sekvence komplementarne linije ciljane DNK. U nekim slučajevima, ciljana DNK je deo hromozoma in vitro. U nekim slučajevima, ciljana DNK je deo hromozoma in vivo. U nekim slučajevima, ciljana DNK je deo hromozoma u ćeliji. U nekim slučajevima, ćelija je izabrana iz grupe koja se sastoji od: ćelije arhea, bakterijske ćelije, eukariotske ćelije, eukariotski jednoćelijski organizmi, somatske ćelije, germ ćelije, matične ćelije, biljne ćelije, ćelija ćelija, ćelija životinja, ćelije beskičmenjaka, ćelija kičmenjaka, ćelije riba, žablje ćelije, ptičje ćelije, ćelije sisara, ćelija svinje, kravlje ćelije, ćelije koza, ćelija ovaca, ćelija glodara, ćelije pacova, mišije ćelije, ćelije primata bez čoveka i ćelije čoveka. U nekim slučajevima, RNK koja cilja DNK sadrži nukleotidnu sekvencu sa najmanje 60% identičnosti sa delom od najmanje 8 susednih nukleotida sa bilo kojom od nukleotidnih sekvenci datih u SEQ ID NO: 431-682 (npr., SEQ ID NOs: 563-682). U nekim slučajevima, RNK koja cilja DNK sadrži nukleotidnu sekvencu sa najmanje 60% identičnosti sa delom od najmanje 8 susednih nukleotida sa bilo kojom od nukleotidnih sekvenci datih u SEQ ID NO: 431-562. U nekim slučajevima, polipeptid koji modifikuje DNK sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje oko 75% identičnosti aminokiselinske sekvence sa aminokiselinama 7-166 ili 731-1003 od Cas9/Csn1 aminokiselinske sekvence prikazane na Slici 3, ili na odgovarajućim delovima u bilo kojoj od aminokiselinskih sekvenci koje su navedeni kao SEQ ID NO: 1-256 i 795-1346. U nekim slučajevima, enzimska aktivnost modifikuje ciljanu DNK. U nekim slučajevima, enzimska aktivnost je aktivnost nukleaze, aktivnost metiltransferaze, aktivnost demetilaze, aktivnost DNK popravke, aktivnost DNK oštećenja, aktivnost dehidracije, aktivnost dismutaze, aktivnost alkilacije, aktivnost depuracije, aktivnost oksidacije, aktivnost pirimidin dimera, integrazna aktivnost, transpozna aktivnost, aktivnost rekombinaze, aktivnost polimeraze, aktivnost ligaze, aktivnosti helikase, aktivnosti fotolijase ili glikozilaze. U nekim slučajevima, enzimska aktivnost koja modifikuje DNK je aktivnost nukleaze. U nekim slučajevima aktivnost nukleaze dovodi do raskida dvostruke veze u ciljanoj DNK. U nekim slučajevima, dovođenje u dodir se odvija pod uslovima koji su dopušteni za nehomologno spajanje ili popravku homologije. U nekim slučajevima postupak dalje obuhvata dovođenje u dodir ciljane DNK sa donor polinukleotidom, pri čemu se donor polinukleotid, deo donorskog polinukleotida, kopija donorskog polinukleotida ili deo kopije donorskog polinukleotida integrišu u ciljanu DNK. U nekim slučajevima, postupak ne obuhvata dovođenje u dodir ćelije sa donor polinukleotidom, pri čemu se ciljana DNK modifikuje tako da se nukleotidi unutar ciljane DNK brišu. U nekim slučajevima, enzimska aktivnost modifikuje ciljani polipeptid povezan sa ciljanom DNK. U nekim slučajevima, enzimska aktivnost je aktivnost metil-transferaze, aktivnost demetilaze, aktivnost acetil-transferaze, aktivnost deacetilaze, aktivnost kinaze, aktivnost fosfataze, aktivnost ubikuitin ligaze, aktivnost deubikuitinacije, aktivnost adenilacije, aktivnost umirenja, aktivnost SUMOilacije, aktivnost deSUMOilacije, aktivnost ribozilacije, aktivnost deribozilacije, aktivnost miristoilacije ili aktivnost demiristoilacije. U nekim slučajevima, ciljani polipeptid je histon, a enzimska aktivnost je metiltransferazna aktivnost, aktivnost demetilaze, aktivnost acetil-transferaze, aktivnost deacetilaze, aktivnost kinaze, aktivnost fosfataze, aktivnost ubikuitin ligaze ili aktivnost deubikiniziranja. U nekim slučajevima kompleks dodatno sadrži aktivator-RNK. U nekim slučajevima, aktivator-RNK sadrži nukleotidnu sekvencu sa najmanje 60% identičnosti sa delom od najmanje 8 susednih nukleotida sa bilo kojom od nukleotidnih sekvenci datih u SEQ ID NO: 431-682.
[0020] Karakteristike ovog obelodanjenja uključuju postupak modulacije specifične transkripcije unutar ciljane DNK, postupak koji obuhvata dovođenje u dodir ciljane DNK sa: (i) RNK koja cilja DNK, ili DNK polinukleotidom koji kodira isto, pri čemu RNK koja cilja DNK sadrži: (a) prvi segment koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja je komplementarna sekvenci u ciljanoj DNK; i (b) drugi segment koji interakuje sa usmerenim modifikacionim polipeptidom; i (ii) usmereni modifikacioni polipeptid, ili polinukleotid koji kodira isto, pri čemu usmereni modifikacioni polipeptid sadrži: (a) deo koji se vezuje za RNK koja interakuje sa RNK koja cilja DNK; i (b) deo aktivnosti koji modulira transkripciju, pri čemu navedeno dovođenje u dodir dovodi do modulacije transkripcije unutar ciljane DNK. U nekim slučajevima, transkripcija unutar ciljane DNK je povećana. U nekim slučajevima, transkripcija unutar ciljane DNK je smanjena.
[0021] Karakteristike ovog obelodanjenja uključuju postupak specifične modifikacije na ciljanoj DNK, a postupak obuhvata: dovođenje u dodir ciljane DNK sa: (i) RNK koja cilja DNK ili DNK polinukleotidom koji kodira isto, pri čemu RNK koja cilja DNK: (a) prvi segment koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja je komplementarna sekvenci u ciljanoj DNK; i (b) drugi segment koji interakuje sa usmerenim modifikacionim polipeptidom; i (ii) usmereni modifikacioni polipeptid, ili polinukleotid koji kodira isto, gde usmereni modifikacioni polipeptid sadrži: (a) deo koji se vezuje za RNK koja se interakuje sa RNK koja cilja DNK; i (b) deo aktivnosti koji modulira transkripciju unutar ciljane DNK. U nekim slučajevima, usmereni modifikacioni polipeptid povećava transkripciju unutar ciljane DNK. U nekim slučajevima, usmereni modifikacioni polipeptid smanjuje transkripciju unutar ciljane DNK.
[0022] Karakteristike ovog obelodanjenja obuhvataju postupak promovisanja specifičnog cepanja i modifikacije ciljane DNK u ćeliji, a postupak sadrži uvođenje u ćeliju: (i) RNK koja cilja DNK ili DNK polinukleotida koji kodira isto, pri čemu RNK koja cilja DNK sadrži: (a) prvi segment koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja je komplementarna sekvenci u ciljanoj DNK; i (b) drugi segment koji interakuje sa usmerenim modifikacionim polipeptidom; i (ii) usmereni modifikacioni polipeptid, ili polinukleotid koji kodira isto, gde usmereni modifikacioni polipeptid sadrži: (a) deo koji se vezuje za RNK koja interakuje sa RNK koja cilja DNK; i (b) deo aktivnosti koji pokazuje aktivnost nukleaze koja stvara prekid dvostruke veze u cilju DNK; pri čemu se mesto prekida dvostruke veze određuje pomoću RNK koja cilja DNK, dodir se javlja pod uslovima koji su dozvoljeni za nehomologno povezivanje ili homologno usmereno popravljanje, a ciljana DNK se odvaja i ponovo spaja kako bi se proizvela modifikovana DNK sekvenca. U nekim slučajevima postupak dalje obuhvata dovođenje u dodir ciljane DNK sa donor polinukleotidom, pri čemu se donor polinukleotid, deo donorskog polinukleotida, kopija donorskog polinukleotida ili deo kopije donorskog polinukleotida integrišu se u ciljanu DNK. U nekim slučajevima, postupak ne obuhvata dovođenje u dodir ćelije sa donor polinukleotidom, pri čemu se ciljana DNK modifikuje tako što se nukleotidi unutar ciljane DNK brišu. U nekim slučajevima, ćelija je izabrana iz grupe koju čine: ćelije arhea, bakterijske ćelije, eukariotske ćelije, eukariotski jednoćelijski organizmi, somatske ćelije, germ ćelije, matične ćelije, biljne ćelije, ćelija ćelija, ćelija životinja, ćelije beskičmenjaka, ćelija kičmenjaka, ćelije riba, žablje ćelije, ptičje ćelije, ćelije sisara, ćelija svinje, kravlje ćelije, ćelije koza, ćelija ovaca, ćelija glodara, ćelije pacova, mišije ćelije, ćelije primata bez čoveka i ćelije čoveka. U nekim slučajevima, ćelija je in vitro. U nekim slučajevima, ćelija je in vivo.
[0023] Karakteristike ovog obelodanjenja uključuju postupak za proizvodnju genetski modifikovane ćelije u pacijentu, gde postupak obuhvata: (I) uvođenje u ćeliju: (i) RNK koja cilja DNK ili DNK polinukleotida koji kodira isti, gde RNK koja cilja NA sadrži: (a) prvi segment koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja je komplementarna sekvenci u ciljanoj DNK; i (b) drugi segment koji interakuje sa usmerenim modifikacionim polipeptidom; i (ii) usmereni modifikacioni polipeptid, ili polinukleotid koji kodira isto, gde usmereni modifikacioni polipeptid sadrži: (a) deo koji se vezuje za RNK koja interakuje sa RNK koja cilja DNK; i (b) deo aktivnosti koji pokazuje aktivnost nukleaze koja stvara prekid dvostruke veze u ciljanoj DNK; pri čemu se mesto prekida dvostruke veze određuje od strane RNK koja cilja DNK, dodir se javlja pod uslovima koji su dozvoljeni za nehomologno spajanje ili popravku homologije, a ciljana DNK se odvaja i ponovo spaja kako bi se proizvela modifikovana DNK sekvenca; Čime se proizvodi genetski modifikovana ćelija; i (ii) presađivanje genetski modifikovane ćelije u pacijenta. U nekim slučajevima postupak dalje obuhvata dovođenje u dodir ćelije sa donor polinukleotidom, gde se donor polinukleotid, deo donorskog polinukleotida, kopija donorskog polinukleotida ili deo kopije donorskog polinukleotida integrišu u ciljanu DNK. U nekim slučajevima, postupak ne obuhvata dovođenje u dodir ćelije sa donorm polinukleotidom, pri čemu se ciljana DNK modifikuje tako da se nukleotidi unutar ciljane DNK brišu. U nekim slučajevima, ćelija je izabrana iz grupe koja se sastoji od: ćelije arhea, bakterijske ćelije, eukariotske ćelije, eukariotski jednoćelijski organizmi, somatske ćelije, germ ćelije, matične ćelije, biljne ćelije, ćelija ćelija, ćelija životinja, ćelije beskičmenjaka, ćelija kičmenjaka, ćelije riba, žablje ćelije, ptičje ćelije, ćelije sisara, ćelija glodara, ćelije primata bez čoveka i ćelije čoveka.
[0024] Karakteristike ovog obelodanjenja obuhvataju postupak modifikacije ciljane DNK u genetski modifikovanoj ćeliji koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira egzogeni usmeren modifikacioni polipeptid, gde postupak obuhvata unošenje u genetski modifikovanu ćeliju RNK koja ciljan DNK, ili DNK polinukleotida koji kodira isto, gde: (i) RNK koja cilja DNK sadrži: (a) prvi segment koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja je komplementarna sekvenci u ciljanoj DNK; i (b) drugi segment koji interakuje sa usmerenim modifikacionim polipeptidom; i (ii) usmereni modifikacioni polipeptid sadrži: (a) deo koji se vezuje za RNK, koji interakuje sa RNK koja cilja DNK; i (b) deo aktivnosti koji pokazuje aktivnost nukleaze. U nekim slučajevima, usmereni modifikacioni polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje oko 75% identičnosti aminokiseline sa aminokiselinama 7-166 ili 731-1003 od Cas9/Csn1 aminokiselinske sekvence prikazane na Slici 3 ili odgovarajućim delovima u bilo kojim aminokiselinskim sekvencama koje su navedene kao SEQ ID NO: 1-256 i 795-1346. U nekim slučajevima, ćelija je izabrana iz grupe koja se sastoji od: ćelije arhea, bakterijske ćelije, eukariotske ćelije, eukariotski jednoćelijski organizmi, somatske ćelije, germ ćelije, matične ćelije, biljne ćelije, ćelija ćelija, ćelija životinja, ćelije beskičmenjaka, ćelija kičmenjaka, ćelije riba, žablje ćelije, ptičje ćelije, ćelije sisara, ćelija glodara, ćelije primata bez čoveka i ćelije čoveka. U nekim slučajevima, ćelija je in vitro. U nekim slučajevima, ćelija je in vivo. U nekim slučajevima, eksprimiranje usmerenog modifikacionog polipeptida je pod kontrolom inducibilnog promotera. U nekim slučajevima, eksprimiranje usmerenog modifikacionog polipeptida je pod kontrolom promotera specifičnog za ćelijski tip.
[0025] Karakteristike ovog obelodanjenja obuhvataju komplet koji sadrži: RNK koja cilja DNK ili DNK polinukleotid koji kodira isto; i reagens za rekonstituciju i/ili razblaživanje. U nekim slučajevima, komplet dodatno sadrži reagens izabran iz grupe koja se sastoji od: pufera za unošenje RNK koja cilja DNK u ćelije, pufer za ispiranje, kontrolni reagens, kontrolni vektor eksprimiranja ili RNK polinukleotid, reagens za transkripciju RNK koja cilja DNK iz DNK, i njihove kombinacije.
[0026] Karakteristike ovog obelodanjenja obuhvataju komplet koji sadrži: usmereni modifikacioni polipeptid ovog obelodanjenja, ili polinukleotid koji kodira isto; i reagens za rekonstituciju i/ili razblaživanje. U nekim slučajevima, komplet dalje sadrži reagens izabran iz grupe koja se sastoji od: pufera za unošenje usmerenog modifikacionog polipeptida u ćeliju, pufer za ispiranje, kontrolni reagens, kontrolni vektor eksprimiranja ili RNK polinukleotid, reagens za in vitro proizvodnju usmerenog modifikacionog polipeptida iz DNK i njihove kombinacije.
[0027] Karakteristike ovog obelodanjenja uključuju komplet koji sadrži: usmereni modifikacioni polipeptid ovog obelodanjenja, ili polinukleotid koji kodira isto; i reagens za rekonstituciju i/ili razblaživanje. Karakteristike ovog obelodanjenja uključuju komplet koji sadrži: RNK koja cilja DNK ili DNK polinukleotid koji kodira isto, RNK koja cilja DNK koja sadrži: (a) prvi segment koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja je komplementarna sekvenci u ciljanoj DNK; i (b) drugi segment koji interakuje sa usmerenim modifikacionim polipeptidom; i (ii) usmereni modifikacioni polipeptid, ili polinukleotid koji kodira isto, gde usmereni modifikacioni polipeptid sadrži: (a) deo koji se vezuje za RNK koja interakuje sa RNK koja cilja DNK; i (b) deo aktivnosti koji pokazuje usmerenu enzimsku aktivnost, pri čemu se mesto enzimske aktivnosti određuje pomoću RNK koja cilja DNK.
[0028] Karakteristike ovog obelodanjenja obuhvataju komplet koji sadrži: (i) RNK koja cilja DNK ili DNK polinukleotid koji kodira isto, koja sadrži: (a) prvi segment koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja je komplementarna sekvenci u ciljanoj DNK; i (b) drugi segment koji interakuje sa usmerenim modifikacionim polipeptidom; i (ii) usmereni modifikacioni polipeptid, ili polinukleotid koji kodira isto, gde usmereni modifikacioni polipeptid sadrži: (a) deo koji se vezuje za RNK koja interakuje sa RNK koja cilja DNK; i (b) deo aktivnosti koji modulira transkripciju unutar ciljane DNK, pri čemu je mesto modulirane transkripcije unutar ciljane DNK određeno pomoću RNK koja cilja DNK.
[0029] Karakteristike ovog obelodanjenja uključuju komplet koji sadrži: (i) bilo koji od rekombinantnih vektora eksprimiranja iznad; i (ii) reagens za rekonstituciju i/ili razblaživanje. Karakteristike ovog obelodanjenja obuhvataju komplet koji sadrži: (i) bilo koji od rekombinantnih vektora eksprimiranja iznad; i (ii) rekombinantni vektor eksprimiranja koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira usmereni modifikacioni polipeptid, pri čemu usmereni modifikacioni polipeptid obuhvata: (a) deo koji se vezuje za RNK koja interakuje sa RNK koja cilja DNK; i (b) deo aktivnosti koji pokazuje usmerenu enzimsku aktivnost, pri čemu se mesto enzimske aktivnosti određuje pomoću RNK koja cilja DNK. Karakteristike ovog obelodanjenja obuhvataju komplet koji sadrži: (i) bilo koji od rekombinantnih vektora eksprimiranja iznad; i (ii) rekombinantni vektor eksprimiranja koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira usmeren modifikacioni polipeptid, pri čemu usmereni modifikacioni polipeptid obuhvata: (a) deo koji se vezuje za RNK koja interakuje sa RNK koja cilja DNK; i (b) deo aktivnosti koji modulira transkripciju unutar ciljane DNK, pri čemu je mesto modulirane transkripcije unutar ciljane DNK određeno pomoću RNK koja cilja DNK.
[0030] Karakteristike ovog obelodanjenja obuhvataju komplet za ciljanje ciljane DNK koji sadrži: dve ili više RNK koje ciljaju DNK ili DNK polinukleotide koji kodiraju isto, pri čemu se prvi segment od najmanje jedne od dve ili više RNK koje ciljaju DNK razlikuje po najmanje jednom nukleotidu iz prvog segmenta barem jednog od drugih dve ili više RNK koje ciljaju DNK.
KRATAK OPIS SLIKA
[0031]
Slike 1A-B pružaju šematsku skicu dva primerna predmetna RNK koja ciljaju DNK, gde je svaki u vezi sa usmerenim modifikacionim polipeptidom i sa ciljanim DNK.
Slika 2 prikazuje ciljanu DNK izmenu kroz prekide dvostrukih veza DNK uvedene pomoću modifikovanog polipeptida Cas9/Csn1 i RNK koja cilja DNK.
Slike 3A-B prikazuju aminokiselinsku sekvencu proteina Cas9/Csn1 od Streptococcus pyogenes (SEQ ID NO: 8). Cas9 ima domene homologne za HNH i RuvC endonukleaze. (A) Motivi 1-4 su prekriveni (B) Domeni 1 i 2 su prekriveni.
Slike 4A-B prikazuju procenat identičnosti između Cas9/Csn1 proteina iz više vrsta. (A) Identičnost sekvence u odnosu na Streptococcus pyogenes. Na primer, Domen 1 su aminokiseline 7-166, a Domen 2 su aminokiseline 731-1003 Cas9/Csn1 iz Streptococcus pyogenes kao što je prikazano na Slici 3B. (B) Identičnost sekvence u odnosu na Neisseria meningitidis. Na primer, Domen 1 su aminokiseline 13-139, a Domen 2 su aminokiseline 475-750 Cas9/Csn1 iz Neisseria meningitidis (SEQ ID NO: 79).
Slika 5 prikazuje višestruko poravnanje sekvenci motiva 1-4od Cas9/Csn1 proteina iz različitih različitih vrsta izabranih iz filogenetske tablice na Slici 32 (pogledati Sliku 32, Sliku 3A i Tabelu 1) (Streptococcus pyogenes (SEQ ID NO:8), Legionella pneumophila (SEQ ID NO:17), Gamma proteobacterium (SEQ ID NO:107), Listeria innocua (SEQ ID NO:3), Lactobacillus gasseri (SEQ ID NO:152), Eubacterium rectale (SEQ ID NO:99), Staphylococcus lugdunensis (SEQ ID NO:185), Mycoplasma synoviae (SEQ ID NO:22), Mycoplasma mobile (SEQ ID NO:16), Wolinella succinogenes (SEQ ID NO:10), Flavobacterium columnare (SEQ ID NO:235), Fibrobacter succinogenes (SEQ ID NO:121), Bacteroides fragilis (SEQ ID NO:21), Acidothermus cellulolyticus (SEQ ID NO:42), i Bifidobacterium dentium (SEQ ID NO:131).
Slika 6A-B pruža poravnanje prirodnih sekvenci tracrRNK („activator-RNK“) iz različitih vrsta (L. innocua (SEQ ID NO:268); s. pyogenes (SEQ ID NO:267); s. mutans (SEQ ID NO:269); s. thermophilus1 (SEQ ID NO:270); m. mobile (SEQ ID NO:274); n. meningitides (SEQ ID NO:272); p. multocida (SEQ ID NO:273); s. thermophilus2 (SEQ ID NO:271); i S. pyogenes (SEQ ID NO:267). (A) višestruko poravnavanje sekvenci odabranih tracrRNK ortologa (AlignX, VectorNTI paket, Invitrogen) povezano sa CRISPR/Cas lokusima slične arhitekture i visoko sličnih Cas9/Csn1 sekvenci. Crne kućice predstavljaju deljene nukleotide (B) višestruko poravnavanje sekvenci odabranih tracrRNK ortologa (AlignX, VectorNTI paket, Invitrogen) koji su povezani sa CRISPR/Cas lokusima različite arhitekture i neblisko povezanih Cas9/Csn1 sekvenci. Primetiti sličnost sekvenci N. meningitidis i P. multocida tracrRNK orthologues. Crne kućice predstavljaju zajedničke nukleotide. Za više primernih aktivator-RNK sekvenci, pogledati SEQ ID NO: 431-562.
Slike 7A-B pruža poravnanja prirodnih dupleks-formirajućih segmenata crRNK sekvenci („RNK koje ciljaju“) iz različitih vrsta (L. innocua (SEQ ID NO://); s. pyogenes (SEQ ID NO://); s. mutans (SEQ ID NO://); s. thermophilus1 (SEQ ID NO://); C. jejuni (SEQ ID NO://); s. pyogenes (SEQ ID NO://); F. novicida (SEQ ID NO://); m. mobile (SEQ ID NO://); n. meningitides (SEQ ID NO://); p. multocida (SEQ ID NO://); i S. thermophilus2 (SEQ ID NO://). (A) višestruko poravnavanje sekvenci primernih dupleks-formirajućih segmenata RNK sekvenci koje ciljaju (AlignX, VectorNTI paket, Invitrogen) koji su povezani sa lokusima slične arhitekture i veoma sličnih Cas9/Csn1 sekvenci. (B) višestruko poravnavanje sekvenci primernih dupleks-formirajućih segmenata RNK sekvenci koje ciljaju (AlignX, VectorNTI paket, Invitrogen) koji su povezani sa lokusima različite arhitekture i raznovrsnim Cas9 sekvencama. Crte kućice predstavljaju zajedničke nukleotide. Za više primernih dupleks-formirajuće segmenate RNK sekvenci koje ciljaju, pogledati SEQ ID brojeve: 563-679.
Slika 8 prikazuje šemu hibridizacije za prirodne dupleks-formirajuće segmenate crRNK sekvenci („targeter-RNK“) sa dupleks-formirajućim segmenatom odgovarajućeg tracrRNK ortologa („aktivator-RNK“). Gornja sekvenca, RNK koja ciljaja; donja sekvenca, dupleks-formirajući segmenat odgovarajućeg aktivator-RNK. Lokusi CRISPR pripadaju sistemu tipa II (Nmeni/CASS4) CRISPR/Cas. Nomenklatura je prema CRISPR bazi podataka (CRISPR DB). S. pyogenes (SEQ ID NO:// and //); s. mutans (SEQ ID NO:// and //); s. thermophilus1 (SEQ ID NO:// and //); s. thermophilus2 (SEQ ID NO:// and //); L. innocua (SEQ ID NO:// and //); t. denticola (SEQ ID NO:// and //); n. meningitides (SEQ ID NO:// and //); s. gordonii (SEQ ID NO:// and //); b. bifidum (SEQ ID NO:// and //); L. salivarius (SEQ ID NO:// and //); F. tularensis (SEQ ID NO:// and //); i L. pneumophila (SEQ ID NO:// and //). Treba imati na umu da neke vrste obadva Tip II CRISPR lokusa. Za više primernih sekvenci aktivator-RNK, pogledati SEQ ID NOs: 431-562. Za više primernih dupleks-formirajućih segmenata sekvenci targeter-RNK, pogledati SEQ ID NOs: 563-679.
Slika 9 prikazuje su primer tracrRNK (aktivator-RNK) i crRNK (targeter-RNK) sekvenci od dve vrste. Postoji stepen zamenjivosti; na primer, S.pyogenes Cas9/Csn1 protein je funkcionalan sa tracrRNK i crRNK izvedenim iz L.innocua. (I) označava kanonski Vatson-Crick bazni par, dok (•) označava bazni par G-U vobble. „Varijabilni 20nt“ ili „20nt“ predstavlja segment ciljanja DNK koji je komplementaran ciljanoj DNK (ova regija može biti do oko 100nt dužine). Takođe je prikazan i dizajn jednomolekulske RNK koja cilja DNK koji sadrži karakteristike targeter-RNK i aktivator-RNK. (Cas9/Csn1 proteinske sekvence iz širokog spektra vrsta su prikazane na Slici 3 i prikazane su kao SEQ ID NO: 1-256 i 795-1346) Streptococcus pyogenes: od vrha prema dnu: (SEQ ID NO://, //, //); Listeria innocua: od vrha prema dnu: (SEQ ID NO://, //, //). Date sekvence su neograničavajući primeri i imaju za cilj da ilustruju kako jednomolekulska RNK koja cilja DNK i dvomolekulska RNK koja cilja DNK mogu biti dizajnirane na osnovu prirodno postojećih sekvenci iz različitih vrsta. Različiti primeri odgovarajućih sekvenci iz različitih vrsta su određeni na sledeći način (Cas9 protein: SEQ ID NO: 1-259; tracrRNK:SEQ ID NOs: 431-562 ili njihovi komplementi; crRNK:SEQ ID NOs: 563 -679, ili njihovi komplementi, i primerni NA koja cilja jednomolekulski DNK: SEQ ID NO: 680-682).
Slike 10A-E pokazuju da je Cas9 DNK endonukleazna navođena od strane dva RNK molekula. Slika E (od vrha ka dnu, SEQ ID NOs: 278-280 i //).
Slike 11A-B pokazuju da Cas9 koristi dva domena nukleaze kako bi se razdvojile dve ćelije u ciljanoj DNK.
Slike 12A-E ilustruju da Cas9-katalizirano cepanje ciljane DNK zahteva aktivacijski domen u tracrRNK i da je regulisano sekvencom semena u crRNK. Slika 12C (od vrha ka dnu, SEQ ID NO: 278-280 i //); slika 12D (od vrha ka dnu, SEQ ID NO: 281-290); i Slika 12E (od vrha ka dnu, SEQ ID NOs: 291-292, 283, 293-298).
Slike 13A-C pokazuju da je potreban PAM da dozvoli cepanje ciljane DNK pomoću Cas9-tracrRNK:crRNK kompleksa.
Slike 14A-C ilustruju da se Cas9 može programirati koristeći jedinstveni RNK molekul koji kombinuje tracrRNK i crRNK karakteristike. Himera A (SEQ ID NO: 299); Himera B (SEQ ID N0: 300).
Slika 15 prikazuje imuni put CRISPR/Casus posredovan RNK-om tipa II.
Slike 16A-B prikazuju prečišćavanje nukleaze Cas9.
Slike 17A-C pokazuju da Cas9 vođeni dvostruki-tracrRNK:crRNK cepa protospacer plazmid i oligonukleotidnu DNK. Slika 17B (od vrha ka dnu, SEQ ID NOs: 301-303 i //); i Slika 17C (od vrha ka dnu, SEQ ID NO: 304-306 i //).
Slike 18A-B pokazuju da je Cas9 Mg2+ zavisna endonukleaza sa aktivnošću 3'-5' egzonukleaze.
Slike 19A-C ilustruju da je dvostruko-tracrRNK:crRNK usmereno Cas9 cepanje ciljane DNK specifično za lokaciju. Slika 19C (od vrha ka dnu, SEQ ID NOs: 307-309, //, 337-339 i //).
Slike 20A-B pokazuju da je dvostruko-tracrRNK:crRNK usmereno Cas9 cepanje ciljane DNK brzo i efikasno.
Slike 21A-B pokazuju da HNH i RuvC-domeni Cas9 direktno cepaju komplementarne i nekomplementarne DNK linije, respektivno.
Slika 22 pokazuje da je tracrRNK potrebna za prepoznavanje ciljane DNK.
Slike 23A-B pokazuju da je minimalna regija tracrRNK sposobna da usmerava dualtracrRNK:crRNK usmereno cepanje ciljane DNK.
Slike 24A-D pokazuju da dvostruko-tracrRNK:crRNK-usmereno cepanje ciljane DNK putem Cas9 može biti specifičano za vrstu.
Slike 25A-C pokazuju da sekvenca u crRNK reguliše dvostruki-tracrRNK:crRNK usmereno cepanje ciljane DNK od Cas9. Slika 25A: ciljana DNK sonda 1 (SEQ ID NO: 310); Spacer 4 crRNK (1-42) (SEQ ID NO: 311); tracrRNK (15-89) (SEQ ID NO: //). Slika 25B leva ploča (SEQ ID NO: 310).
Slike 26A-C pokazuju da je PAM sekvenca od suštinskog značaja za rasprostiranje protospacer plazmidne DNK pomoću Cas9tracrRNK:crRNK i za interferenciju plazmidne DNK posredovane sa Cas9 u bakterijskim ćelijama. Slika 26B (od vrha ka dnu, SEQ ID NO: 312-314); i Slika 26C (od vrha ka dnu, SEQ ID NO: 315-320).
Slike 27A-C pokazuju da je Cas9 vođen jednom himernom RNK koja imitira duplu tracrRNK:crRNK cepa protospacer DNK. Slika 27C (od vrha ka dnu, SEQ ID NO: 321-324). Slike 28A-D prikazuje nov dizajn himernih RNK koje ciljaju gensku sekvencu zelenog fluorescentnog proteina (GFP). Slika 28B (od vrha ka dnu, SEQ ID NOs: 325-326). Slika 28C: ciljana sekvenca GFP1 (SEQ ID NO: 327); gFP2 ciljana sekvenca (SEQ ID NO: 328); gFP3 ciljana sekvenca (SEQ ID NO: 329); gFP4 ciljana sekvenca (SEQ ID NO: 330); gFP5 ciljana sekvenca (SEQ ID NO: 331); gFP1 himerna RNK (SEQ ID NO: 332); gFP2 himerna RNK (SEQ ID NO: 333); gFP3 himerna RNK (SEQ ID NO: 334); gFP4 himerna RNK (SEQ ID NO: 335); gFP5 himerna RNK (SEQ ID NO: 336).
Slike 29A-E pokazuju da ko-eksprimiranje Cas9 i vodič RNK u ljudskim ćelijama generiše predike dvostrukih veza DNK na ciljanom lokusu. Slika 29C (od vrha ka dnu, SEQ ID NO: 425-428).
Slike 30A-B pokazuju da lizati ćelija sadrže aktivnu Cas9:sgRNK i podržavaju lokalno DNK cepanje.
Slike 31A-B pokazuju da 3' proširenje sgRNK konstrukta poboljšava specifičnu mutagenezu posredovanu NHEJ-om. Slika 31A (od vrha ka dnu, SEQ ID NO: 428-430).
Slike 32A-B prikazuju filogenetsko drvo reprezentativnih Cas9 sekvenci iz različitih organizama (A), kao i Cas9 lokus arhitekture za glavne grupe drveta (B).
Slike 33A-E prikazuju arhitekturu tipa II CRISPR-Cas iz odabranih vrsta bakterija.
Slike 34A-B prikazuju tracrRNK i pre-crRNK ko-procesuiranje u odabranim tip II CRISPR Cas sistemima. Slika 34A (od vrha ka dnu, SEQ ID NO://,//,//,//,//,//,//,//); slika 34B (od vrha ka dnu, SEQ ID NO://,//,//,//).
Slika 35 prikazuje poravnavanje sekvence traktronskih ortologa koje pokazuju raznovrsnost tracrRNK sekvenci.
Slike 36A-F prikazuju eksprimiranje bakterijskih tracrRNK ortologa i crRNK otkrivenih dubokim sekvenciranjem RNK.
Slike 37A-O navode sve tracrRNK ortologe i zrele crRNK koje se dobijaju sekvenciranjem za proučavane vrste bakterija, uključujući koordinate (regije od interesa) i odgovarajuće sekvence cDNK (5'do 3').
Slike 38 A-B prikazuju tabelu bakterijskih vrsta koje sadrže CRISPR-Cas lokuse tipa II, koji se karakterišu prisustvom potpisnog gena cas9. Ove sekvence su korišćene za filogenetske analize.
Slike 39 A-B prikazuju dizajn sistema CRISPR interferencije (CRISPRi).
Slike 40 A-E pokazuju da CRISPRi efikasno utiče na izduženje transkripcije i inicijaciju.
Slike 41 A-B pokazuju da CRISPRi funkcioniše tako što blokira izduženje transkripcije.
Slike 42 A-C pokazuju ciljanu specifičnost CRISPRi sistema.
Slike 43 A-F prikazuju karakterizaciju faktora koji utiču na efikasnost pri čišćenju.
Slike 44 A-C prikazuju funkcionalno profiliranje složene regulatorne mreže koristeći CRISPRi gensko obaranje.
Slike 45 A-B pokazuju gensko smirivanje koristeći CRISPRi u ćelijama sisara.
Slika 46 prikazuje mehanizam tip II CRISPR sistema od S. pyogenes.
Slike 47 A-B prikazuju krive rasta kultura ćelija E. coli ko-transformisane sa dCas9 i sgRNK. Slika 48 pokazuje da CRISPRi može zaustaviti eksprimiranje reporter gena na plazmidu sa više kopija.
Slike 49 A-C prikazuju podatke RNK sekvenci od ćelija sa sgRNK koje ciljaju različite gene. Slike 50 A-E prikazuju efekte smirivanja sgRNK susednim dvostrukim neuklapanjima.
Slike 51 A-C prikazuju efekte kombinatornog smirivanja korišćenjem dvea sgRNK za regulisanje jednog gena.
Slika 52 pokazuje da sgRNK represija zavisi od cilja lokusa i relativnog rastojanja od početka transkripcije.
Slike 53 A-C prikazuju rezultate eksperimenta koji pokazuju da varijanta Cas9 usmerenog polipeptida (dCas9) radi za predmetne postupke kada dCas9 ima redukovanu aktivnost samo u RuvC1 domenu (npr. d10A), samo HNH domenu (npr. h840A), ili u oba domena (npr. d10A i H840A).
Slike 54 A-C spisak primera pogodnih fuzionih partnera (ili njihovih fragmenata) za predmetnu varijantu Cas9 usmerenog polipeptida. Primeri uključuju, ali nisu ograničeni na one navedene.
Slike 55 A-D pokazuju da se himerni usmereni polipeptid može koristiti za aktiviranje (povećanje) transkripcije u ljudskim ćelijama.
Slika 56 pokazuje da se himerni usmereni polipeptid može koristiti za ublažavanje (smanjenje) transkripcije u ljudskim ćelijama.
Slike 57A-B pokazuju da veštačke sekvence koje dele približno 50% identičnosti sa prirodnim tracrRNK i crRNK mogu da funkcionišu sa Cas9 kako bi se cepala ciljana DNK sve dok je očuvana struktura proteina vezujućeg domena RNK koja cilja DNK.
DEFINICIJE – DEO I
[0032] Izrazi „polinukleotid“ i „nukleinska kiselina“, koji se ovde koriste međusobno zamenjivo, odnose se na polimerni oblik nukleotida bilo koje dužine, bilo ribonukleotide ili deoksiribonukleotide. Dakle, ovaj izraz uključuje, ali nije ograničen na, jednostruko-, dvostrukoili višestruko-vezane DNK ili RNK, genomske DNK, cDNK, DNK-RNK hibride ili polimer koji sadrži purinske i pirimidinske baze ili druge prirodne, hemijske ili biohemijski modifikovane, ne-prirodne ili derivatizovane nukleotidne baze. „Oligonukleotid“ se uglavnom odnosi na polinukleotide između oko 5 i oko 100 nukleotida jednostrukog ili dvostrukog DNK. Međutim, za svrhe ovog obelodanjenja, nema gornjih granica dužine oligonukleotida. Oligonukleotidi su takođe poznati kao „oligomeri“ ili „oligosi“ i mogu biti izolovani iz gena ili hemijski sintetizovani postupcima poznatim u struci. Treba podrazumevati da pojmovi „polinukleotid“ i „nukleinska kiselina“ obuhvataju, u zavisnosti od opisanih rešenja, jednostruke (kao što su sens ili antisens) i dvostruke polinukleotide.
[0033] „Struktura stem-petlje“ se odnosi na nukleinsku kiselinu koja ima sekundarnu strukturu koja uključuje regiju nukleotida koji su poznati ili predviđeni da formiraju dvostruku vezu (stem deo) koja je sa jedne strane povezana sa regijom pretežno jednostrukih nukleotida (petlja deo). Izrazi „pruge“ i „fold-back“ strukture se takođe ovde koriste da se odnose na strukture stempetlje. Takve strukture su dobro poznate u ovoj oblasti i ti izrazi se koriste dosledno sa svojim poznatim značenjima u struci. Kao što je poznato u struci, struktura stem-petlje ne zahtevaju tačno bazno uparivanje. Stoga, stem može uključivati jednu ili više neusaglašenosti baznih podataka. Alternativno, bazno uparivanje može biti tačno, tj. da ne uključuje bilo kakve neusaglašenosti.
[0034] Pod „hibridizabilno“ ili „komplementarno“ ili „suštinski komplementarno“ podrazumeva se da nukleinska kiselina (npr. RNK) sadrži sekvencu nukleotida koja mu omogućava ne-kovalentno vezivanje, tj. formira bazne parove Vatson-Crick i/ili G/U bazne parove, „kalemi“ ili „hibridizuje“, za drugu nukleinsku kiselinu na sekvencno-specifičan, antiparalelni način (tj. nukleinska kiselina se specifično vezuje za komplementarnu nukleinsku kiselinu) pod odgovarajućim in vitro i/ili in vivo uslovima za temperaturu i jonsku jačinu rastvora. Kao što je poznato u struci, standardna Vatson-Crick bazna uparivanja uključuju: uparivanje adenina (A) sa timidinom (T), uparivanje adenina (A) sa uracilom (U) i uparivanje gvanina (G) sa citozinom (C) [DNK, RNK]. Pored toga, u struci je takođe poznato da za hibridizaciju između dva RNK molekula (npr., dsRNK), gvanin (G) se bazno uparuje sa uracilom (U). Na primer, bazno uparivanje G/U je delimično odgovorno za degeneraciju (tj. redundanciju) genetskog koda u kontekstu baznog uparivanja tRNK antikodona sa kodonima u mRNK. U kontekstu ovog obelodanjenja, gvanin (G) segment vezivanja proteina (dsRNK duplesk) pacijentov molekul RNK koja cilja DNK se smatra komplementarnim uracilu (U) i obrnuto. Kao takav, kada se bazni par G/U može napraviti na datoj nukleotidnoj poziciji segmenta za vezivanje proteina (dsRNK dupleks) pacijentovog molekula RNK koja cilja DNK, pozicija se smatra nekomplementarnom, već se umesto toga se smatra komplementarnom.
[0035] Hibridizacija i uslovi pranja su dobro poznati i prikazani kod Sambrook, J., Fritsch, E. F. And Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (1989), posebno Chapter 11 i Table 11.1 tamo; i Sambrook, J. and Russell, W., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (2001). Uslovi temperature i jonske jačine određuju „strogost“ hibridizacije.
[0036] Hibridizacija zahteva da dve nukleinske kiseline sadrže komplementarne sekvence, iako su neusklađenosti između baza moguće. Uslovi pogodni za hibridizaciju između dve nukleinske kiseline zavise od dužine nukleinskih kiselina i stepena komplementacije, varijable koje su dobro poznate u struci. Što je veći stepen komplementacije između dve nukleotidne sekvence, veća je vrednost temperature topljenja (Tm) za hibride nukleinskih kiselina koje imaju te sekvence. Za hibridizaciju između nukleinskih kiselina sa kratkim podelama komplementarnosti (npr. omplementarnost preko 35 ili manje, 30 ili manje, 25 ili manje, 22 ili manje, 20 ili manje, ili 18 ili manje nukleotida), položaj neusaglašenosti postaje važan (pogledati Sambrook et al., supra, 11.7-11.8). Tipično, dužina hibridizabilne nukleinske kiseline je najmanje oko 10 nukleotida. Ilustrativne minimalne dužine za hibridizabilnu nukleinsku kiselinu su: najmanje oko 15 nukleotida; najmanje oko 20 nukleotida; najmanje oko 22 nukleotida; najmanje oko 25 nukleotida; i najmanje oko 30 nukleotida). Štaviše, stručnjak u oblasti će prepoznati da se temperatura i koncentracija rastvora soli mogu prilagoditi po potrebi u skladu sa faktorima kao što su dužina regiona komplementacije i stepen komplementacije.
[0037] U struci je poznato da sekvenca polinukleotida ne mora biti 100% komplementarna sa svojom ciljanom nukleinskom kiselinom koja je specifično hibridizabilna ili hibridizabilna. Štaviše, polinukleotid može hibridizovati preko jednog ili više segmenata tako da intervenišući ili susedni segmenti nisu uključeni u događaje hibridizacije (npr., struktura petlje ili struktura šupljine). Polinukleotid može da sadrži najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 99% ili 100% komplementarnosti sekvence sa ciljanom regijom u okviru ciljane nukleinske kiseline prema kojoj su ciljane. Na primer, antisens nukleinska kiselina u kojoj su 18 od 20 nukleotida antisensivnog jedinjenja komplementarni ciljanoj regiji, i stoga kad bi se specifično hibridizovali, predstavljali bi 90% komplementarnosti. U ovom primeru, preostali nekomplementarni nukleotidi mogu biti grupisani ili podeljeni sa komplementarnim nukleotidima i ne moraju biti susedni jedni drugima ili komplementarnim nukleotidima. Procenat komplementarnosti između pojedinačnih nizova sekvenci nukleinskih kiselina u okviru nukleinskih kiselina može se odrediti rutinski koristeći BLAST programe (alat za pretraživanje osnovnog lokalnog poravnanja) i PoverBLAST programi poznati u struci (Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403-410; Zhang and Madden, Genome Res., 1997, 7, 649-656) ili korišćenjem Gap programa (PWisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wis.), koristeći podrazumevana podešavanja, koja koristi algoritam Smit i Vaterman (Adv. Appl. Math., 1981, 2, 482-489).
[0038] Izrazi „peptid“, „polipeptid“ i „protein“ su ovde međusobno zamenljivi i odnose se na polimerni oblik aminokiselina bilo koje dužine, što može uključivati kodirane i nekodirane aminokiseline, hemijski ili biohemijski modifikovane ili derivatizovane aminokiseline i polipeptide koji imaju modifikovane peptidne osnove.
[0039] „Vezujući“ kad se ovde koristi (npr. u vezi sa domenom polipeptida koji se vezuje za RNK) odnosi se na nekovalentnu interakciju između makromolekula (npr. između proteina i nukleinske kiseline). Dok su u stanju nekovalentne interakcije, za makromolekule se kaže da su „povezani“ ili „interaktivni“ ili „vezujući“ (npr. kada se za molekul X kaže da interakuje sa molekulom Y, podrazumeva se da se molekul X vezuje za molekul Y na ne-kovalentni način). Nije neophodno da su sve komponente vezujuće interakcije specifične za sekvencu (npr., dodiri sa ostacima fosfata DNK kičmi), ali neki delovi vezujuće interakcije mogu biti specifični za sekvencu. Vezujuće interakcije se generalno karakterišu konstantom disociacije (Kd) manjom od 10<-6>M, manjom od 10<-7>M, manjom od 10<-8>M, manjom od 10<-9>M, manjom od 10<-10>M, manjom od 10<-11>M, manjom od 10<-12>M, manjom od 10<-13>M, manjom od 10<-14>M, ili manjom od 10<-15>M. „Afinitet“ se odnosi na jačinu vezivanja, gde je povećan vezujući afinitet u korelaciji sa nižim Kd.
[0040] Pod „vezujući domen“ podrazumeva se proteinski domen koji je sposoban da se nekovalentno veže na drugi molekul. Vezujući domen se može vezati za, na primer, molekul DNK (protein koji vezuje DNK), molekul RNK (protein koji vezuje RNK) i/ili molekul proteina (proteinvezujući protein). U slučaju proteinskog domen-vezujućeg proteina, može se vezati za sebe (da bi obrazovao homodimere, homotrimere, itd.) i/ili se može vezati za jedan ili više molekula različitih proteina.
[0041 Izraz „konzervativna supstitucija aminokiselina“ odnosi se na zamenjivost u proteinima aminokiselinskih ostataka koji imaju slične bočne lance. Na primer, grupa aminokiselina sa alifatskim bočnim lancima sastoji se od glicina, alanina, valina, leucina i izolevcina; grupa aminokiselina sa alifatskim-hidroksilnim bočnim lancima sastoji se od serina i treonina; grupa aminokiselina koja sadrži amid koji sadrži bočne lance koji se sastoje od asparagina i glutamina; grupa aminokiselina koje imaju aromatične bočne lance sastoji se od fenilalanina, tirozina i triptofana; grupa aminokiselina sa osnovnim bočnim lancima sastoji se od lizina, arginina i histidina; grupa aminokiselina koje imaju kisele bočne lance sastoje se od glutamata i aspartata; i grupa aminokiselina koje imaju bočne lance koji sadrže sumpor sastoji se od cisteina i metionina. Primerne konzervativne aminokiselinske supstitucione grupe su: valin-leucinizolevcin, fenilalaninetrozin, lizin-arginin, alanin-valin i asparagin-glutamin.
[0042] Polinukleotid ili polipeptid ima određeni procenat „identičnosti sekvence“ sa drugim polinukleotidom ili polipeptidom, što znači da kada je poravnat, taj procenat baza ili aminokiselina je isti, i na istom relativnom položaju, kada se uporede dve sekvence . Identitet sekvence može se odrediti na više različitih načina. Da bi se utvrdio identitet sekvenci, sekvence se mogu poravnati različitim postupcima i računarskim programima (npr. bLAST, T-COFFEE, MUSCLE, MAFFT, itd.), dostupnim preko interneta na sajtovima uključujući ncbi.nlm.nili.gov/BLAST, ebi.ac.uk/Tools/msa/tcoffee/, ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/, mafft.cbrc.jp/alignment/software/. See, e.g., Altschul et al. (1990), J. Mol. Bioi.215:403-10.
[0043] DNK sekvenca koja "kodira" određenu RNK je DNK sekvenca nukleinske kiseline koja se transkribuje u RNK. DNK polinukleotid može kodirati RNK (mRNK) koja je translatirana u protein, ili DNK polinukleotid može kodirati RNK koja nije translatirana u protein (npr. tRNK, rRNK ili RNK koja cilja DNK, takođe naziva se „ne-kodirajuća“ RNK ili „ncRNK“).
[0044 „Sekvenca kodiranja proteina" ili sekvenca koja kodira određeni protein ili polipeptid, je sekvenca nukleinske kiseline koja se transkribuje u mRNK (u slučaju DNK) i translatirana je (u slučaju mRNK) u polipeptid in vitro ili in vivo kada se stavlja pod kontrolu odgovarajućih regulatornih sekvenci. Granice kodirajuće sekvence određuje početni kodon na 5' terminusu (N-terminus) i kodonski kod za zaustavljanje translacije na 3' terminusu (C-terminus). Kodiranja sekvenca može uključivati, ali nije ograničena na, cDNK iz prokariotske ili eukariotske mRNK, genomske DNK sekvence iz prokariotske ili eukariotske DNK i sintetičke nukleinske kiseline. Sekvenca završetka transkripcije obično se nalazi 3' u sekvenci kodiranja.
[0045] Kad se ovde koristi, „promoterska sekvenca“ je regulatorna regija DNK sposobna za vezivanje RNK polimeraze i započinjanje transkripcije nizvodne (3' smer) kodiranjuće ili nekodirajuće sekvence. Za potrebe definisanja ovog pronalaska, promoterska sekvenca je ograničena na svom 3' terminusu od strane mesta iniciranja transkripcije i proteže se uzvodno (5' smer) tako da uključuje minimalni broj baza ili elemenata neophodnih za iniciranje transkripcije na nivoima koji se mogu detektovati iznad pozadine. U okviru promoterske sekvence biće pronađeno mesto inicijacije transkripcije, kao i oblasti vezivanja proteina odgovorne za vezivanje RNK polimeraze. Eukariotski promoteri često, ali ne uvek, sadrže „TATA“ kutije i „CAT“ kutije. Razni promoteri, uključujući inducibilne promotere, mogu se koristiti za vođenje različitih vektora iz ovog pronalaska.
[0046] Promoter može biti konstitutivno aktivni promoter (tj. promoter koji je konstitutivno u aktivnom/„uključeno“ stanju), može biti inducibilni promoter (tj. promoter čije se stanje, aktivno/„uključeno“ ili neaktivno/„isključeno“, kontroliše spoljašnjim stimulusom, npr. prisustvom određene temperature, jedinjenja ili proteina), može biti prostorno ograničen promoter (tj. element kontrole transkripcije, pojačivač, itd.) (npr. promoter specifičan za tkivo, promoter specifičan za ćelijski oblik itd.) i može biti promoter koji je vremenski ograničen (tj. promoter je u stanju "uključeno" ili "isključeno" u određenim fazama embrionalnog razvoja ili u određenim fazama biološkog procesa, npr. ciklus folikula kose kod miševa).
[0047] Odgovarajući promoteri mogu biti izvedeni iz virusa i stoga se mogu nazvati virusnim promoterima, ili mogu biti izvedeni iz bilo kog organizma, uključujući prokariotske ili eukariotske organizme. Odgovarajući promoteri mogu se koristiti za eksprimiranje bilo kojom RNK polimerazom (npr., pol I, pol II, pol III). Primeri promotera obuhvataju, ali nisu ograničeni na rani promoter SV40, promoter dugačkog terminalnog ponavljanja (LTR) mišjeg virusa tumora dojke; adenovirus veliki kasni promoter (Ad MLP); herpes simpleks virus (HSV) promoter, promoter citomegalovirusa (CMV) kao što je neposredna rana promotivna regija (CMVIE), promoter virusa rous sarkoma (RSV), ljudski U6 mali nuklearni promoter (U6) ((Miyagishi et al. , Nature Biotechnology 20, 497 - 500 (2002)), poboljšani promoter U6 (npr. Xia et al., Nucleic Acids Res.
2003 Sep 1;31(17)), ljudski H1 promoter (HI) i slično.
[0048] Primeri inducibilnih promotera uključuju, ali se ne ograničavaju na promoter T7 RNK polimeraze, promoter T3 RNK polimeraze, promoter regulisanog izopropil-beta-D-tiogalaktopiranozidoma (IPTG), promoter izazvan laktozom, promoter toplotnog šoka, promoter regulisan tetraciklinom, steroidno regulisani promoter, promoter kog reguliše metal, estrogen receptorski regulator, itd. Inducibilni promoteri mogu stoga biti regulisani molekulima uključujući, ali ne ograničavajući se na, doksiciklin; RNK polimerazu, npr. t7 RNK polimeraza; estrogen receptor; euzija estrogenskih receptora; itd.
[0049] U nekim otelotvorenjima, promoter je prostorno ograničeni promoter (tj. promoter specifičan za ćelijski tip, promoter specifičan za tkivo, itd.), tako da je u multićelijskom organizmu promoter aktivan (npr. „uključen“) u podskupu specifičnih ćelija. Prostorno ograničeni promoteri mogu takođe biti obeleženi kao ojačivači, elementi kontrole transkripcije, kontrolne sekvence itd. Može se koristiti bilo koji pogodan prostorski ograničeni promoter i izbor odgovarajućeg promotera (npr. promoter specifičan za mozak, promoter koji vodi eksprimiranje u podskupu neurona, promotera koji vodi eksprimiranje u germliniji, promoter koji vodi eksprimiranje u plućima, promoter koji vodi eksprimiranje u mišićima, promoter koji vodi eksprimiranje u ćelijama ostrvcima pankreasa itd.) zavisiće od organizma. Na primer, razni prostorno ograničeni promoteri poznati su za biljke, muve, crve, sisare, miševe i sl. Tako se prostorno ograničeni promoter može koristiti za regulisanje eksprimiranja nukleinske kiseline koja kodira usmeren modifikacioni polipeptid kod mnoštva različitih tkiva i vrsta ćelija, u zavisnosti od organizma. Neki prostorno ograničeni promoteri su takođe ograničeni tako da je promoter u stanju „uključeno“ ili „isključeno“" u određenim fazama embrionalnog razvoja ili u određenim fazama biološkog procesa (npr. ciklus folikula kose kod miševa).
[0050] U svrhe ilustracije, primeri prostorno ograničenih promotera uključuju, ali se ne ograničavaju na, neuronske specifične promotere, adipocit-specifične promotere, promotere specifične za kardiomiocit, promotere specifične za glatke mišiće, promotere specifične za fotoreceptore itd. Prostorno ograničeni promoteri specifični za neurone uključuju, ali nisu ograničeni na, promoter specifičan za neonsku enolazu (NSE) (pogledati, npr., eMBL HSENO2, X51956); promoter aromatične aminokiseline dekarboksilaze (AADC); promoter neurofilamenta (pogledati, npr., GenBank HUMNFL, L04147); promoter sinapsina (pogledati, npr., GenBank HUMSINIB, M55301); promoter thi-1 (pogledati, npr., Chen et al. (1987) Cell 51:7-19; i Llewellyn, et al. (2010) Nat. Med. 16(10):1161-1166); promoter serotoninskog receptora (pogledati, npr., GenBank S62283); promoter tirozin hidroksilaze (TH) (pogledati, npr., oh et al. (2009) Gene Ther 16:437; Sasaoka et al. (1992) Mol. Brain Res.16:274; Boundy et al. (1998) J. Neurosci.18:9989; i Kaneda et al. (1991) Neuron 6:583-594); promoter GnRH (pogledati, npr., Radovick et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:3402-3406); L7 promoter (pogledati, npr., Oberdick et al. (1990) Science 248:223-226); a DNMT promoter (pogledati, npr., bartge et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:3648-3652); promoter enkefalina (pogledati, npr. Comb et al. (1988) EMBO J.
17:3793-3805); promoter mijelinskog baznog proteina (MBP); promoter Ca2+kalmodulin-zavisne protein kinaze II-alfa (pogledati npr. Mayford et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:13250; i Casanova et al. (2001) Genesis 31:37); promoter CMV ojačivača/faktora rasta-β koji je dobijen od trombocita (pogledati, npr., Liu et al. (2004) Gene Therapy 11:52-60); i slično.
[0051] Adipocitni specifični prostorno ograničeni promoteri uključuju, ali se ne ograničavaju na promoter/ojačivač aP2 gena, npr. regija od -5,4 kb do 21 bp ljudskog aP2 gene (pogledati, na primer, Tozzo et al. (1997) Endocrinol.138:1604; Ross et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:9590; i Pavjani et al. (2005) Nat. Med. 11:797); promoter glukoza transportera-4 (GLUT4) (pogledati, npr., Knight et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:14725); promoter masnih kiselina (FAT/CD36) (pogledati, na primer, Kuriki et al. (2002) Biol. Pharm. Bull.25:1476; i Sato et al. (2002) J. Biol. Chem.277:15703); promoter stearoil-CoA desaturaze-1 (SCD1) (Tabor et al. (1999) J. Biol. Chem. 274:20603); promoter leptina (pogledati, npr., Mason et al. (1998) Endocrinol.139:1013; i Chen et al. (1999) Biochem. Biophys. Res. Comm.262:187); promoter adiponektina (pogledati, npr., kita et al. (2005) Biochem. Biophys. Res. Comm. 331:484; i Chakrabarti (2010) Endocrinol.151:2408); promoter adipsina (pogledati, npr., Platt et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:7490); promoter resistina (pogledati, npr., Seo et al. (2003) Molec. Endocrinol.17:1522); i slično.
[0052] Kardiomiocitno specifični prostorno ograničeni promoteri uključuju, ali se ne ograničavaju na kontrolne sekvence izvedene iz sledećih gena: miozin lakog lanca-2, α-miozin teškog lanca, AE3, srčani troponin C, kardijalni aktin i slično. Franz et al. (1997) Cardiovasc. Res.35:560-566; robbins et al. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci.752:492-505; Linn et al. (1995) Circ. Res.76:584-591; Parmacek et al. (1994) Mol. Cell. Biol.14:1870-1885; Hunter et al. (1993) Hypertension 22:608-617; i Sartorelli et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4047-4051.
[0053] Prostorno ograničeni promoteri specifični za glatke mišiće uključuju, ali nisu ograničeni na promoter SM22a (pogledati, npr., akyürek et al. (2000) Mol. Med. 6:983; i U.S. Patent No.
7,169,874); promoter smutelina (pogledati, npr., WO 2001/018048); promoter aktina α-glatkog mišića; i slično. Na primer, pokazano je da regija 0,4 kb promotera SM22a u kojoj leže dva CArG elementa, posreduje u ćelijsko-specifičnom eksprimiranju vaskularnih glatkihmišiće (pogledati npr. Kim, et al. (1997) Mol. Cell. Biol.17, 2266-2278; Li, et al., (1996) J. Cell Biol.132, 849-859; i Moessler, et al. (1996) Development 122, 2415-2425).
[0054] Prostorno ograničeni promoteri specifični za fotoreceptor uključuju, ali nisu ograničeni na, promoter rodopsina; promoter rodopsin kinaze (Young et al. (2003) Ophthalmol. Vis. Sci.
44:4076); promoter gena beta fosfodiesteraze (Nicoud et al. (2007) J. Gene Med. 9:1015); promoter gena retinitis pigmentoze (Nicoud et al. (2007) supra); interferotoreceptor retinoidvezujući protein (IRBP) genski pojačivač (Nicoud et al. (2007) supra); promoter IRBP gena (Yokoyama et al. (1992) Exp Eye Res.55:225); i slično.
[0055] Izrazi „DNK regulatorne sekvence“, „kontrolni elementi“ i „regulatorni elementi“, koji se ovde koriste međusobno zamenjivo, odnose se na transkripcijske i translacijske kontrolne sekvence, kao što su promoteri, ojačivači, signali poliadenilacije, terminatori, signali razgradnje proteina i slično, koji omogućavaju i/ili regulišu transkripciju nekodirajuće sekvence (npr., RNK koja cilja DNK) ili kodirajuće sekvence (npr. usmeren modifikacioni polipeptida, ili Cas9/Csn1 polipeptid) i/ili regulišu translaciju kodiranog polipeptida.
[0056] Izraz „prirodan“ ili „ne-modifikovani“ kad se ovde koriste i odnose na nukleinsku kiselinu, polipeptid, ćeliju ili organizam, odnosi se na nukleinsku kiselinu, polipeptid, ćeliju ili organizam koji se pronalazi u prirodi. Na primer, prirodno se javlja polipeptid ili polinukleotidna sekvenca koja je prisutna u organizmu (uključujući i viruse) koja se može izolovati iz izvora u prirodi i koja nije namerno modifikovana od strane čoveka u laboratoriji.
[0057] Izraz „himerni“ kad se ovde koristi i odnosi na nukleinsku kiselina ili polipeptid odnosi se na dve komponente koje su definisane strukturama izvedenim iz različitih izvora. Na primer, kad se „himerni“ koristi u kontekstu himernog polipeptida (npr., himernog Cas9/Csn1 proteina), himerni polipeptid uključuje sekvence aminokiselina koje potiču iz različitih polipeptida. Himerni polipeptid može da sadrži ili modifikovane ili prirodno prisutne polipeptidne sekvence (npr., prvu aminokiselinsku sekvencu modifikovanog ili nemodifikovanog Cas9/Csn1 proteina i drugu aminokiselinsku sekvencu koja nije Cas9/Csn1 protein). Slično tome, „himerni“ u kontekstu polinukleotida koji kodira himerni polipeptid uključuje nukleotidne sekvence izvedene iz različitih regija kodiranja (npr., prva nukleotidna sekvenca koja kodira modifikovani ili nemodifikovani Cas9/Csn1 protein i druga nukleotidna sekvenca koja kodira polipeptid koji nije Cas9/Csn1 protein).
[0058] Izraz „himerni polipeptid“ odnosi se na polipeptid koji se pravi kombinacijom (tj. „fuzijom“) dva inače odvojena segmenta amino-sekvence, obično posredstvom čoveka. Polipeptid koji sadrži himernu aminokiselinsku sekvencu je himerni polipeptid. Neki himerni polipeptidi mogu se nazvati „varijante fuzije“.
[0059] „Heterologno“, kako se ovde koristi, označava nukleotidnu ili polipeptidnu sekvencu koja se ne nalazi u nativnoj nukleinskoj kiselini ili proteinu, respektivno. Na primer, u himernom Cas9/Csn1 proteinu, domen za vezivanje RNK prirodnog bakterijskog Cas9/Csn1 polipeptida (ili njegove varijante) može biti spojen sa heterolognom polipeptidnom sekvencom (tj. polipeptidnom sekvencom iz proteina koji nije Cas9/Csn1 ili polipeptidnom sekvencom iz drugog organizma). Heterologna polipeptidna sekvenca može pokazati aktivnost (npr., enzimsku aktivnost) koja će takođe biti prikazana od strane himernog Cas9/Csn1 proteina (npr. aktivnost metiltransferaze, aktivnost acetil-transferaze, aktivnost kinaze, aktivnost ubikitinacije i sl.). Heterologna sekvenca nukleinske kiseline može biti povezana sa prirodnom sekvencom nukleinske kiseline (ili njegovom varijantom) (npr., genetskim inženjeringom) kako bi se generisala himerna nukleotidna sekvenca koja kodira himerni polipeptid. Kao još jedan primer, u fuzionoj varijanti Cas9-usmerenog polipeptida, varijanta Cas9-usmerenog polipeptida može biti fuzionisana sa heterolognim polipeptidom (tj. polipeptidom, različitim od Cas9), koji pokazuje aktivnost koja će takođe biti prikazana od strane fuzione varijante Cas9 usmerenog polipeptida. Heterologna sekvenca nukleinske kiseline može biti vezana za varijantnu Cas9 usmerenog polipeptida (npr., genetskim inženjeringom) kako bi se generisala nukleotidna sekvenca koja kodira fuzionu varijantu Cas9 usmerenog polipeptida.
[0060] „Rekombinantni“, kad se ovde koristi, znači da je određena nukleinska kiselina (DNK ili RNK) proizvod različitih kombinacija kloniranja, restrikcija, polimerazne lančane reakcije (PCR) i/ili koraka ligiranja što rezultuje konstruktom koji ima strukturne kodirajuće ili ne-kodirajuće sekvence koje se mogu razlikovati od endogenih nukleinskih kiselina pronađenih u prirodnim sistemima. DNK sekvence koje kodiraju polipeptide mogu se sastaviti od cDNK fragmenata ili od serije sintetičkih oligonukleotida, kako bi se obezbedila sintetička nukleinska kiselina koja se može eksprimirati iz rekombinantne transkripcione jedinice koja se nalazi u ćeliji ili u ćelijskom sistemu za transkripciju i translaciju. Genomska DNK koja sadrži relevantne sekvence takođe se može koristiti u formiranju rekombinantne jedinice gena ili transkripcije. Sekvence netranslatirane DNK mogu biti prisutne 5' ili 3' iz otvorenog okvira za čitanje, pri čemu takve sekvence ne ometaju manipulaciju ili eksprimiranje regije kodiranja, i zaista mogu delovati kako bi modulisale proizvodnju željenog proizvoda različitim mehanizmima (pogledati „DNK regulatorne sekvence“, u nastavku). Alternativno, DNK sekvence koje kodiraju RNK (npr. RNK koja cilja DNK) koje nisu translatirane takođe se mogu smatrati rekombinantnim. Tako, na primer, izraz „rekombinantna“ nukleinska kiselina se odnosi na onu koja se ne pojavljuje prirodno, npr., dobija se veštačkom kombinacijom dva inače odvojena segmenta sekvence kroz ljudsku intervenciju. Ova veštačka kombinacija se često ostvaruje bilo hemijskim sinteznim sredstvima ili veštačkim manipulacijama izolovanih segmenata nukleinskih kiselina, na primer, tehnikama genetskog inženjeringa. To se obično vrši kako bi se zamenio kodon sa kodonom koji kodira istu aminokiselinu, konzervativnu aminokiselinu ili nekonzervativnu aminokiselinu. Alternativno, ona se izvodi da udružuje segmente nukleinske kiseline željenih funkcija kako bi se generisala željena kombinacija funkcija. Ova veštačka kombinacija se često ostvaruje bilo hemijskim sinteznim sredstvima ili veštačkim manipulacijama izolovanih segmenata nukleinskih kiselina, na primer, tehnikama genetskog inženjeringa. Kada rekombinantni polinukleotid kodira polipeptid, sekvenca kodiranog polipeptida može se prirodno pojaviti („divlji tip“) ili može biti varijanta (npr., mutant) prirodne sekvence. Prema tome, izraz „rekombinantni“ polipeptid se ne odnosi nužno na polipeptid čija se sekvenca ne javlja prirodno. Umesto toga, „rekombinantni“ polipeptid je kodiran rekombinantnom DNK sekvencom, ali sekvenca polipeptida može biti prirodna („divlji tip“) ili ne-prirodna (npr. varijanta, mutant itd.). Prema tome, „rekombinantni“ polipeptid je rezultat intervencije ljudi, ali može biti prirodna aminokiselinska sekvenca.
[0061] „Vektor“ ili „vektor eksprimiranja“ je replikon, kao što je plazmid, fag, virus ili kosmid, na koji se može priključiti još jedan segment DNK, tj. „umetak“, kako bi došlo do replikacije priključenog segmenta u ćeliji.
[0062] „Kaseta eksprimiranja“ sadrži sekvencu kodiranja DNK koja je operativno vezana za promoter. „Operativno povezana“ odnosi se na jednačinu u kojoj su tako opisane komponente u odnosima koji dozvoljavaju da funkcionišu na svoj način. Na primer, promoter je operativno povezan sa kodirajućom sekvencom ako promoter utiče na njegovu transkripciju ili eksprimiranje.
[0063] Izrazi "rekombinantni vektor eksprimiranja" ili "DNK konstrukt" se ovde koriste međusobno zamenjivo da bi se referirali na molekulu DNK koja sadrži vektor i najmanje jedan insert. Rekombinantni vektori eksprimiranja obično se generišu radi eksprimiranja i/ili razmnožavanja umetka ili za konstrukciju drugih rekombinantnih nukleotidnih sekvenci. Umetak (i) može ili ne sme biti operativno povezan sa promoterskom sekvencom i može ili ne mora biti operativno povezan sa DNK regulatornim sekvencama.
[0064] Ćelija je „genetski modifikovana“ ili „transformisana“ ili „transfektovana“ pomoću egzogene DNK, npr. rekombinantnog vektora eksprimiranja, kada je takva DNK uvedena unutar ćelije. Prisustvo egzogene DNK rezultuje permanentnom ili prolaznom genetskom promenom. Transformirajuća DNK može ili ne mora biti integrisana (kovalentno povezana) u genom ćelije. Kod prokariota, kvasaca i ćelijama sisara, na primer, transformirajuća DNK može se održavati na epizomalnom elementu kao što je plazmid. S obzirom na eukariotske ćelije, stabilno transformisana ćelija je ona u kojoj se transformirajuća DNK integriše u hromozom, tako da je nasledila ćerka ćelijama pomoću replikacije hromozoma. Ova stabilnost dokazuje sposobnost eukariotske ćelije da uspostavi ćelijske linije ili klonove koji sadrže populaciju ćerki ćelija koje sadrže transformirajuću DNK. „Klon“ je populacija ćelija izvedenih iz jedne ćelije ili zajedničkog predaka mitozom. „Ćelijska linija“ je klon primarne ćelije koja je sposobna za stabilan rast in vitro tokom mnogih generacija.
[0065] Pogodni postupci genetske modifikacije (takođe poznate kao „transformacija“) uključuju npr. virusnu ili bakteriofagnu infekciju, transfekciju, konjugaciju, fuziju protoplasta, lipofekciju, elektroporaciju, precipitaciju kalcijum fosfata, transfekciju sa polietileniminom (PEI), DEAE-dektran posredovanu transfekciju, transfekciju posredovanu lipozomima, tehnoloziju pištolja čestica, precipitaciju kalcijum fosfata, direktne mikro injekcije, isporuku nukleinskih kiselina posredovanih nanočesticama (pogledati npr. panyam et., al Adv Drug Deliv Rev.2012 Sep 13. pii: S0169-409X(12)00283-9. doi: 10.1016/j.addr.2012.09.023) i slično.
[0066] Izbor postupka genetske modifikacije generalno zavisi od vrste ćelije koja se transformiše i okolnosti pod kojima se odvija transformacija (npr., in vitro, ex vivo ili in vivo). Opšta diskusija o ovimpostupcima može se naći u Ausubel, et al., Short Protocols in Molecular Biology, 3rd ed., Wiley & Sons, 1995.
[0067] „Ciljana DNK“ kad se ovde koristi je DNK polinukleotid koji sadrži „ciljanu lokaciju“ ili „ciljanu sekvencu“. Izrazi „ciljana mesto“ ili „ciljana sekvenca“ ili „ciljana protospacer DNK“ se ovde koriste međusobno zamenjivo i odnose se na sekvencu nukleinske kiseline prisutnu u ciljanoj DNK na koju će se vezati DNK-ciljajući segment predmetne RNK koja cilja DNK (pogledati Sliku 1 i Sliku 39), pod uslovom da postoje dovoljni uslovi za vezivanje. Na primer, ciljana mesto (ili ciljana sekvenca) 5’-GAGCATATC-3’ (SEQ ID NO://) u okviru ciljane DNKje ciljana (ili je vezana ili hibridizovana sa ili je komplementarna sa) RNK sekvencom 5’-GAUAUGCUC-3’ (SEQ ID NO://). Pogodni uslovi vezivanja DNK/RNK uključuju fiziološke uslove koji su normalno prisutni u ćeliji. Ostali pogodni uslovi vezivanja DNK/RNK (npr., uslovi u sistemu bez ćelija) su poznati u struci; pogledati, npr., Sambrook, supra. Linija ciljane DNK koja je komplementarna i hibridizovana sa RNK koja cilja DNK naziva se „komplementarna linija“ i linija ciljane DNK koja je komplementarna „komplementarnoj liniji“ (i stoga nije komplementarna RNK koja cilja DNK) se naziva „nekomplementarnom linijom“ ili „ne-komplementarnom linijom“ (pogledati Sliku 12).
[0068] Sa „usmeren modifikacioni polipeptid“ ili „RNK vezujući usmeren polipeptid“ ili „RNK vezujući usmeren modifikacioni polipeptid“ ili "usmeren polipeptid“ misli se na polipeptid koji vezuje RNK i ciljan je za određenu sekvencu DNK. Usmeren modifikacioni polipeptid, kako je ovde opisan, je usmeren na specifičnu DNK sekvencu molekula RNK na koji je vezan. Molekul RNK sadrži sekvencu koja je komplementarna sa ciljanoj sekvenci unutar ciljane DNK, čime se vezani polipeptid usmerava na određenu lokaciju unutar ciljane DNK (ciljana sekvenca).
[0069] Pod „cepanjem“ podrazumeva se lomljenje kovalentne kičme molekula DNK. Cepanje može biti inicirano različitim postupcima, uključujući, ali ne ograničavajući se na, enzimsku ili hemijsku hidrolizu fosfodiesterske veze. Moguće je i jednostruko cepanje i dvostruko cepanje, i dvostruko cepanje može nastati kao rezultat dva različita jednostruka događaja cepanja. Cepanje DNK može rezultovati proizvodnjom tupih krajeva ili razmaknutih krajeva. U određenim otelotvorenjima, kompleks koji obuhvata RNK koja cilja DNK i usmereni modifikacioni polipeptid koristi se za ciljano dvostruko DNK cepanje.
[0070] „Nukleaza“ i „endonukleaza“ su ovde međusobno zamenjivo koriste da označe enzim koji poseduje katalitičku aktivnost za cepanje DNK.
[0071] Sa „domenom cepanja“ ili „aktivnim domenom“ ili „domenom nukleaze“ nukleaze, misli se na polipeptidnu sekvencu ili domen unutar nukleaze koji poseduje katalitičku aktivnost za cepanje DNK. Domen cepanja može biti sadržan u jednom polipeptidnom lancu ili aktivnost cepanja može biti rezultat udruživanja dva (ili više) polipeptida. Jedinstveni domen nukleaze može se sastojati od više izolovanih delova aminokiselina u datom polipeptidu.
[0072] Molekul RNK koja se vezuje za usmeren modifikacioni polipeptid i usmerava polipeptid na određenu lokaciju unutar ciljane DNK ovde se ovde naziva kao „RNK koja cilja DNK" ili „RNK polinukleotid koji cilja DNK“ (takođe se pominje ovde kao „vodič RNK“ ili „gRNK“). Predmetni RNK koja cilja DNK sadrži dva segmenta, „segment za ciljanje DNK“ i „protein-vezujući segment“. Pod „segmentom“ se podrazumeva segment/sekcija/regija molekula, na primer, susedni deo nukleotida u RNK. Segment takođe može značiti regiju/sekciju kompleksa tako da segment može obuhvatiti regije sa više od jednog molekula. Na primer, u nekim slučajevima segment vezivanja proteina (opisan ispod) RNK koja cilja DNK je jedan RNK molekul, a segment za vezivanje proteina stoga obuhvata regiju tog molekula RNK. U drugim slučajevima, protein-vezujući segment (opisan ispod) RNK koja cilja DNK sadrži dva odvojena molekula koja su hibridizovana duž regije komplementarnosti. Kao ilustrativan, negraničavajući primer, protein-vezujući segment RNK koja cilja DNK koja sadrži dva odvojena molekula može sadržati (i) bazne parove 40-75 prvog molekula RNK koja je 100 baznih parova dužine; i (ii) bazne parove 10-25 drugog molekula RNK-a koji je 50 baznih parova u dužini. Definicija „segmenta“, ukoliko nije drugačije specifikovano u određenom kontekstu, nije ograničena na određeni broj ukupnih baznih parova, nije ograničena na bilo koji određeni broj baznih parova iz datog molekula RNK, nije ograničena na određeni broj odvojenih molekula unutar kompleksa i može uključivati regije molekula RNK koja su svi pune dužine i mogu ili ne mora obuhvatiti regije sa komplementarnošću sa drugim molekulima.
[0073] Segment koji cilja DNK (ili „sekvenca koja cilja DNK“) sadrži nukleotidnu sekvencu koja je komplementarna specifičnoj sekvenci unutar ciljane DNK (komplementarna ćelija ciljane DNK). Segment koji vezuje protein (ili „sekvenca koja vezuje protein“) interakuje sa usmerenim modifikacionim polipeptidom. Kada je usmereni modifikacioni polipeptid Cas9 ili Cas9 povezan polipeptid (detaljnije opisan ispod), cepanje specifične lokacije na ciljanoj DNK se javlja na mestima određenim (i) komplementarnosti baznog uparivanja između RNK koja cilja DNK i ciljane DNK; i (ii) kratogi motiv (koji se naziva protospacer susedni motiv (PAM)) u ciljanoj DNK.
[0074] Segment vezivanja proteina predmetne RNK koja cilja DNK sadrži dva komplementarna dela nukleotida koji se hibridizuju jedan sa drugim kako bi se formirao dvostruki vezani RNK dupleks (dsRNK dupleks).
[0075] U nekim otelotvorenjima, predmetna nukleinska kiselina (npr. RNK koja cilja DNK, nukleinska kiselina koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira RNK koja cilja DNK, nukleinska kiselina koja kodira usmeren polipeptid, itd.) sadrži modifikaciju ili sekvencu koja pruža dodatnu poželjnu osobinu (npr. modifikovana ili regulisana stabilnost, subćelijsko ciljanje, praćenje, npr. fluorescentno obeležje, mesto vezivanja za protein ili kompleks proteina itd.). Neograničavajući primeri uključuju: 5' kapicu (npr., 7-metilguanilat kapica (m7G)); 3' poliadenilovani rep (tj., 3' poli(A) rep); sekvencu ribosviča (npr., kako bi se omogućila regulisana stabilnost i/ili regulisana dostupnost proteina i/ili proteinskih kompleksa); sekvencu kontrole stabilnosti; sekvencu koja formira dsRNK dupleks (tj., ukosnica)); modifikaciju ili sekvencu koja usmerava RNK na subćelijsku lokaciju (npr., jezgro, mitohondrija, hloroplasti i slično); modifikacija ili sekvenca koja pruža praćenje (npr., direktno konjugovanje fluorescentnog molekula, konjugovanje na deo koji olakšava fluorescentnu detekciju, sekvencu koja omogućava fluorescentno detekciju itd.); modifikaciju ili sekvencu koja pruža vezujuće mesto za proteine (npr. proteine koji deluju na DNK, uključujući transkripcijske aktivatore, transkripcijske represore, DNK metiltransferaze, DNK demetalaze, histone acetiltransferaze, histon deacetilaze i slično); i njihove kombinacije.
[0076] U nekim otelotvorenjima, RNK koja cilja DNK sadrži dodatni segment ili na 5' ili 3' kraju koji pruža bilo koju od karakteristika opisanih gore. Na primer, odgovarajući treći segment može da sadrži 5' kapicu (npr., 7-metilguanilat kapica (m7G)); 3' poliadenilovani rep (tj., 3' poli(A) rep); sekvencu ribosviča (npr., kako bi se omogućila regulisana stabilnost i/ili regulisana dostupnost proteina i proteinskih kompleksa); sekvencu kontrole stabilnosti; sekvencu koja formira dsRNK dupleks (tj., ukosnica)); modifikaciju ili sekvencu koja usmerava RNK na subćelijsku lokaciju (npr., jezgro, mitohondrija, hloroplasti i slično); modifikacija ili sekvenca koja pruža praćenje (npr., direktno konjugovanje fluorescentnog molekula, konjugovanje na deo koji olakšava fluorescentnu detekciju, sekvencu koja omogućava fluorescentno detekciju itd.); modifikaciju ili sekvencu koja pruža vezujuće mesto za proteine (npr. proteine koji deluju na DNK, uključujući transkripcijske aktivatore, transkripcijske represore, DNK metiltransferaze, DNK demetalaze, histone acetiltransferaze, histon deacetilaze i slično); i njihove kombinacije.
[0077] Predmetna RNK koja cilja DNK i predmetni usmereni modifikacioni polipeptid (tj. usmeren polipeptid) formiraju kompleks (tj., vezuju se putem ne-kovalentnih interakcija). RNK koja cilja DNK daje specifičnost ciljanja na kompleks tako što sadrži nukleotidnu sekvencu koja je komplementarna sekvenci ciljane DNK. Polipeptid koji modifikuje polipeptid kompleksa pruža aktivnost specifičnu za lokaciju. Drugim rečima, usmereni modifikacioni polipeptid navodi se na ciljanu DNK sekvencu(npr. ciljana sekvenca u hromozomskoj nukleinskoj kiselini, ciljana sekvenca u ekstrahromozomnoj nukleinskoj kiselini, npr. epizomalna nukleinska kiselina, minikrug, itd. iljna sekvenca u mitohondrijskoj nukleinskoj kiselini, ciljana sekvenca u nukleinskoj kiselini hloroplasta, ciljana sekvenca u plazmidu itd.) zahvaljujući vezi sa segmentom vezivanja proteina RNK koja cilja DNK.
[0078] U nekim otelotvorenjima je opisana RNK koja cilja predmetnu DNK koja sadrži dva odvojena RNK molekula (RNK polinukleotidi: „aktivator-RNK“ i „targeter-RNK“, videti dole) i ovde se ovde naziva „dvostrukomolekulska RNK koja cilja DNK“ ili „dvomolekulska RNK koja cilja DNK“. U drugim otelotvorenjima, predmetna RNK koja cilja DNK je jedinstveni RNK molekul (jedan RNK polinukleotid) i ovde se ovde naziva „jednomolekulska RNK koja cilja DNK“, „jednosmerni RNK“ ili „sgRNK“. Izraz „RNK koja cilja DNK“ ili „gRNK“ je inkluzivan, upućujući i na dvomolekulska RNK koja cilja DNK i jednomolekulska RNK koja cilja DNK (tj. SgRNK).
[0079] Primerni RNK koja cilja dvomolekulski RNK sadrži molekul nalik crRNK („CRISPR RNK“ ili „targeter-RNK“ ili „crRNK“ ili „crRNK ponavljanje“) i odgovarajući molekul nalik tracrRNK („trans-dejstvujući „CRISPR RNK“ ili „akivator RNK“ ili „tracrRNK“). Molekul sličan crRNK-u (tRNK koja cilja) obuhvata i segment ciljanja DNK (jednostruki) od RNK koja cilja DNK i razmak („segment koji formira dupleks“) nukleotida koji formira polovinu dsRNK dupleksa proteinvezujućeg segmenta RNK koja cilja DNK. Odgovarajući molekul sličan tracrRNK (aktivator-RNK) sadrži deo nukleotida (segment koji formira dupleks) koji formira drugu polovinu dsRNK dupleksa protein vezujućeg segmenta RNK koja cilja DNK. Drugim rečima, deo nukleotida molekula sličan crRNK komplementaran je i hibridizuje sa delom nukleotida molekula sličnim tracrRNK, kako bi se formirao dsRNK dupleks protein vezujućeg domena RNK koja cilja DNK. Kao takav, za svaki molekul sličan crRNK može se reći da ima odgovarajući molekul sličan molekulu tracrRNK. Molekul sličan crRNK dodatno pruža jedan segment koji cilja DNK. Tako, molekul nalik crRNK i nalik tracrRNK (kao odgovarajući par) hibridizuju da formiraju RNK koja cilja DNK. Tačna sekvenca datog crRNK ili tracrRNK molekula je karakteristična za vrstu u kojoj se nalaze molekuli RNK. Različiti crRNK i tracrRNK su prikazani u odgovarajućim komplementarnim parovima na Slikama 8. Predmetna dvomolekulska RNK koja cilja DNK može sadržati bilo koji odgovarajući crRNK i tracrRNK par. Predmetna dvomolekulska RNK koja cilja DNK može sadržati bilo koji odgovarajući crRNK i tracrRNK par.
[0080] Izraz „aktivator-RNK“ se ovde koristi da označava molekul sličan tracrRNK od dvomolekulske RNK koja cilja DNK. Izraz „targeter-RNK“ se ovde koristi da označava molekul sličan crRNK od dvomolekulske RNK koja cilja DNK. Izraz „segment koji formira dupleks“ se ovde koristi da označava deo nukleotida aktivator-RNK ili RNK koja cilja koji doprinosi stvaranju dsRNK dupleksa hibridizacijom do dela nukleotida odgovarajuće aktivator-RNK ili RNK koja cilja molekula. Drugim rečima, aktivator-RNK sadrži segment koji formira dupleks koji je komplementaran segmentu koji formira dupleks odgovarajuće targeter-RNK. Kao takva, aktivator-RNK sadrži segment koji formira dupleks, dok RNK koja cilja sadrži i segment koji formira dupleks i segment ciljanja RNK koja cilja DNK. Prema tome, predmetni dvomolekulska RNK koja cilja DNK može se sastojati od bilo kog odgovarajućeg aktivator RNK i targeter-RNK para.
[0081] „Ćelija domaćin“, kako se ovde koristi, označava in vivo ili in vitro eukariotsku ćeliju, prokariotsku ćeliju (npr. bakterijsku ili arhealnu ćeliju) ili ćeliju iz višećelijskog organizma (npr. ćelijske linije) kultivisane kao jednoćelijski entitet, čije eukariotske ili prokariotske ćelije mogu biti ili su bile korišćene kao primalac nukleinske kiseline i uključuju potomstvo originalne ćelije koja je transformisana nukleinskom kiselinom. Podrazumeva se da potomstvo jedne ćelije ne mora biti potpuno identično u morfologiji ili u genomskom ili potpunom DNK komplementu kao izvorni roditelj, zbog prirodne, slučajne ili namerne mutacije. „Rekombinantna ćelija domaćin“ (koja se takođe naziva „genetski modifikovana ćelija domaćin“) je ćelija domaćin u koju je uvedena heterologna nukleinska kiselina, na primer, vektor eksprimiranja. Na primer, predmetna bakterijska ćelija domaćina je genetski modifikovana bakterijska ćelija domaćina, zahvaljujući uvođenju u odgovarajuću bakterijsku ćeliju domaćina egzogene nukleinske kiseline (npr. plazmid ili rekombinantni vektor eksprimiranja), i predmetna eukariotska ćelija domaćina je genetski modifikovana eukariotska ćelije domaćina (npr. germ ćelija sisara), zahvaljujući uvođenju u pogodnu eukariotsku ćeliju domaćina egzogene nukleinske kiseline.
[0082] Izraz „matična ćelija“ se ovde koristi da se odnosi na ćeliju (npr. matične ćelije biljaka, matične ćelije na kičmenjaka) koja ima sposobnost da se samostalno obnovi i generiše diferenciran tip ćelija (pogledati Morrison et al. (1997) Cell 88:287-298). U kontekstu ćelijske ontogenosti, pridev „diferenciran“ ili „diferenciranje“ je relativni izraz. „Diferencirana ćelija“ je ćelija koja je napredovala dalje niz razvojni put nego ćelija sa kojom se poredi. Tako, pluripotentne matične ćelije (opisane u nastavku) mogu da se diferencraju u linijom-ograničene progenitorske ćelije (npr. mezodermalne matične ćelije), koje se mogu dalje diferencirati u ćelije koje su dalje ograničene (npr. neuronski progenitori), koji mogu da se diferenciraju u krajnje ćelije (tj. terminalno diferencirane ćelije, npr. neuroni, kardiomiociti itd.), koji igraju karakterističnu ulogu u određenom tkivnom tipu i mogu ili ne moraju zadržati sposobnost dalje proliferacije. Matične ćelije se mogu karakterisati i prisustvom specifičnih markera (npr. proteina, RNK, itd.) i odsustvom specifičnih markera. Matične ćelije takođe mogu biti identifikovane pomoću funkcionalnih analiza kako in vitro tako i in vivo, posebno testova koji se odnose na sposobnost matičnih ćelija da dovedu do više diferenciranih potomaka.
[0083] Matične ćelije od interesa uključuju pluripotentne matične ćelije (PSC). Izraz „pluripotentna matična ćelija“ ili „PSC“ se ovde koristi da označi matičnu ćeliju sposobnu da proizvodi sve vrste ćelija organizma. Zbog toga, PSC može da dovede do ćelija svih germ slojeva organizma (npr., endoderm, mezoderm i ektoderm kičmenjaka). Pluripotentne ćelije su sposobne da formiraju teratome i doprinose ektodermu, mezodermu ili endodermnim tkivima u živom organizmu. Pluripotentne matične ćelije biljaka mogu dovesti do svih vrsta ćelija biljaka (npr. ćelije korena, stanla, lišća, itd.).
[0084] PSC životinja može se izvesti na više različitih načina. Na primer, embrionalne matične ćelije (ESC) su izvedene iz unutrašnje ćelijske mase embriona, dok se indukovane pluripotentne matične ćelije (iPSC) dobijaju iz somatskih ćelija (Takahashi et. al, Cell.2007 Nov 30;131(5):861-72; Takahashi et. al, Nat Protoc. 2007;2(12):3081-9; Yu et. al, Science. 2007 Dec 21;318(5858):1917-20. Epub 2007 Nov 20). Pošto se izraz PSC odnosi na pluripotentne matične ćelije bez obzira na njihovu derivaciju, izraz PSC obuhvata termine ESC i iPSC. PSC mogu biti u obliku utvrđene ćelijske linije, mogu se dobiti direktno iz primarnog embrionalnog tkiva ili mogu biti izvedene iz somatske ćelije. PSC mogu biti ciljane ćelije postupaka opisanih ovde.
[0085] Pod „embrionalna matična ćelija“ (ESC) podrazumeva se PSC koji je izolovan iz embriona, tipično iz unutrašnje ćelijske mase blastociste. Matične ćelije od interesa takođe uključuju embrionalne matične ćelije iz drugih primata, kao što su matične ćelije rezus majmuna i matične ćelije marmozeta. Matične ćelije mogu se dobiti od bilo koje vrste sisara, npr. čoveka, konj, goveda, svinje, psa, mačke, glodara, npr. miša, pacova, hrčka, primata itd. (Thomson et al. (1998) Science 282:1145; thomson et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci USA 92:7844; thomson et al. (1996) Biol. Reprod.55:254; shamblott et al., proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13726, 1998). Pri kultivisanju, ESC se obično gaje kao ravne kolonije sa velikim nukleocitoplazmskim odnosima, definisanim granicama i istaknutim nukleolima. Osim toga, ESC eksprimiraju SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81 i alkalne fosfataze, ali ne i SSEA-1. Primeri postupaka generisanja i karakterizacije ESC-a mogu se naći u, na primer, US Patent No. 7,029,913, US Patent No.
5,843,780, i US Patent No.6,200,806. Postupci za proliferaciju hESC u nediferenciranom obliku opisani su u WO 99/20741, WO 01/51616, i WO 03/020920. Ljudske embrionalne germ matične ćelije ili ljudske embrionalne germ ćelije nisu deo pronalaska.
[0086] Pod pojmom „embrionalne germ matične ćelije“ (EGSC) ili „embrionalne germ ćelije“ ili „EG ćelije“ podrazumevaju se PSC koje su izvedene iz germ ćelija i/ili progenitora germ ćelija, npr. primordijalne germ ćelije, tj. one koje bi postale sperma i jaja. Smatra se da embrionalne germ ćelije (EG ćelije) imaju osobine slične embrionalnim matičnim ćelijama kao što je gore opisano. Primeri postupaka generisanja i karakterizacije EG ćelija mogu se naći u, na primer, patentu US Patent No. 7,153,684; matsui, Y., et al., (1992) Cell 70:841; shamblott, M., et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 113; shamblott, M., et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:13726; i Koshimizu, U., et al. (1996) Development, 122:1235.`
[0087] Pod „indukovanom pluripotentnom matičnom ćelijom“ ili „iPSC“ podrazumeva se PSC koji je izveden iz ćelije koja nije PSC (tj. iz ćelije koja je diferencirana u odnosu na PSC). iPSCs mogu biti izvedeni iz više različitih tipova ćelija, uključujući terminalno diferencirane ćelije. iPSCs imaju ES-ćelijsku morfoloziju, rastu kao ravne kolonije sa velikim nukleotroskopskim odnosima, definisanim granicama i istaknutim jezgrima. Pored toga, iPSCs eksprimiraju jedan ili više ključnih pluripotentnih markera poznatih stručnjacima u oblasti, uključujući ali bez ograničenja na alkalne fosfataze, SSEA3, SSEA4, Sox2, Oct3/4, Nanog, TRA160, TRA181, TDGF 1, Dnmt3b, FoxD3, GDF3, Cyp26a1, TERT, i zfp42. Primeri postupaka generisanja i karakterizacije iPSC-a mogu se naći u, na primer, UU.S. Patent Publication Nos. US20090047263, US20090068742, US20090191159, US20090227032, US20090246875 i US20090304646. Generalno, kako bi se generisali iPSC, somatske ćelije su opremljene faktorima reprogramiranja (npr., oct4, SOX2, KLF4, MYC, Nanog, Lin28 itd.) za koje je poznato u struci da reprogramiraju somatske ćelije kako bi postale pluripotentne matične ćelije.
[0088] Pod „somatskom ćelijom“ podrazumeva se svaka ćelija u organizmu koja, u odsustvu eksperimentalne manipulacije, obično ne dovodi do pojave svih vrsta ćelija u organizmu. Drugim rečima, somatske ćelije su ćelije koje su dovoljno diferencirane da ne bi prirodno generisale ćelije sva tri germ sloja tela, tj. ektoderm, mezoderm i endoderm. Na primer, somatske ćelije bi uključivale i neurone i neuronske progenitore, od kojih bi drugi mogli prirodno dovesti do svih ili nekih ćelijskih tipova centralnog nervnog sistema, ali ne mogu dovesti do ćelijskih linija mezoderma ili endoderma.
[0089] Pod „mitotskom ćelijom“ se misli na ćeliju koja prolazi kroz mitozu. Mitoza je proces pomoću koga eukariotska ćelija razdvaja hromozome u svom jezgru u dva identična seta u dva odvojena jezgra. Uglavnom ga prati citokineza, koja deli jezgra, citoplazem, organele i ćelijsku membranu u dve ćelije koje sadrže približno jednake delove ovih ćelijskih komponenti.
[0090] Pod „postmitotskom ćelijom“ podrazumeva se ćelija koja je napustila mitozu, tj., ona je „mirna“, tj. ona više ne prolazi kroz podele. Ovo stanje irovanja može biti privremeno, tj. Reverzibilno ili trajno.
[0091] Pod „mejotičkom ćelijom“ podrazumeva se ćelija koja prolazi kroz mejozu. Mejoza je proces kojim ćelija deli materijal jezgra u svrhu stvaranja gameta ili spora. Za razliku od mitoze, u mejozi, hromozomi prolaze korak rekombinacije, koji razmenjuju genetski materijal između hromozoma. Pored toga, ishod mejoze su četiri (genetski jedinstvene) haploidne ćelije, u poređenju sa dve (genetski identične) diploidne ćelije proizvedene iz mitoze.
[0092] Pod „rekombinacijom“ podrazumeva se proces razmene genetskih informacija između dva polinukleotida. Kad se ovde koristi, „homogeno usmereno popravljanje (HDR)“ odnosi se na specijalizovani oblik popravke DNK koja se odvija, na primer, tokom popravke prekida dvostrukih veza u ćelijama. Ovaj proces zahteva homoloziju nukleotidne sekvence, koristi molekul „donora“ za obnavljanje „ciljanog“ molekula (tj. onog koji je doživeo prekid dvostruke veze) i dovodi do prenosa genetskih informacija od donora do cilja. Homologno usmereni popravak može dovesti do promene sekvence ciljanog molekula (npr. umetanje, brisanje, mutacija), ako se donor polinukleotid razlikuje od ciljanog molekula i deo ili celokupan niz donor-polinukleotida se inkorporira u ciljanu DNK. U nekim otelotvorenjima, donor polinukleotid, deo donorskog polinukleotida, kopija donorskog polinukleotida ili deo kopije donorskog polinukleotida integriše se u ciljanu DNK.
[0093] Pod „spajanje nehomogenih krajeva (NHEJ)“ podrazumeva se popravljanje dvostrukih prekida u DNK pomoću direktne ligacije krajeva jednih sa drugima bez potrebe za homolognim šablonom (za razliku od homologno usmerenog popravka, koja zahteva homolognu sekvencu za vođenje popravke). NHEJ često dovodi do gubitka (brisanja) nukleotidne sekvence blizu mesta prekida dvostruke veze.
[0094] Izrazi „tretman“, „tretiranje“ i slično ovde se koriste da bi generalno označili sticanje željenog farmakološkog i/ili fiziološkog efekta. Efekat može biti profilaktičan u smislu potpunog ili delimičnog sprečavanja bolesti ili njegovog simptoma i/ili može biti terapeutski u smislu delimičnog ili potpunog lečenja bolesti i/ili negativnog efekta koji se može pripisati bolesti. „Tretman“ kad se ovde koristi obuhvata bilo koji tretman bolesti ili simptoma kod sisara, i obuhvata: (a) sprečavanje nastanka bolesti ili simptoma kod pacijenta koji može biti predisponiran za sticanje bolesti ili simptoma, ali još uvijek nije dijagnostikovan da ima bolest; (b) inhibiranje bolesti ili simptoma, odnosno, zaustavljanje njegovog razvoja; ili (c) ublažavanje bolesti, tj. uzrokovanje regresije bolesti. Terapeutski agens se može davati pre, tokom ili posle pojave bolesti ili povrede. Od posebnog je interesa tretman tekuće bolesti, gde tretman stabilizuje ili smanjuje neželjene kliničke simptome pacijenta. Takav tretman je poželjno izveden pre potpunog gubitka funkcije u pogođenim tkivima. Predmetna terapija će se poželjno davati tokom simptomatskog stadijuma bolesti, a u nekim slučajevima i posle simptomatske faze bolesti.
[0095] Izrazi „pojedinac“, „predmet“, „domaćin“ i „pacijent“ se koriste međusobno zamenjivo ovde i odnose se na bilo kog pacijenta sisara za koga je poželjna dijagnoza, lečenje ili terapija, posebno ljude.
[0096] Opšti postupci u molekularnoj i ćelijskoj biohemiji mogu se naći u standardnim udžbenicima kao što su Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed. (Sambrook et al., HaRBor Laboratory Press 2001); short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed. (Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons 1999); protein Methods (Bollag et al., John Wiley & Sons 1996); nonviral Vectors for Gene Therapy (Wagner et al. eds., Academic Press 1999); Viral Vectors (Kaplift & Loewy eds., Academic Press 1995); immunology Methods Manual (I. Lefkovits ed., Academic Press 1997); i Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures in Biotechnology (Doyle & Griffiths, John Wiley & Sons 1998).
[0097] Pre nego što se ovaj pronalazak dalje opiše, potrebno je shvatiti da ovaj pronalazak nije ograničen na određena otelotvorenja koja su opisana, i kao takav se, naravno, može razlikovati. Takođe treba shvatiti da terminologija koja se ovde koristi je u svrhu opisivanja određenih otelotvorenja i nije namera da bude ograničavajuća, s obzirom na to da će opseg predmetnog pronalaska biti ograničen samo sa priloženim patentnim zahtevima.
[0098] Kada se pruža niz vrednosti, podrazumeva se da je pronalaskom obuhvaćena svaka pomenuta vrednost, do desetog dela jedinice donjeg limita ukoliko kontekst ne nalaže drugačije, između gornjeg i donjeg limita tog opsega i bilo koja navedena vrednost je u tom navedenom rasponu. Gornja i donja granica ovih manjih raspona može nezavisno biti uključena u manje raspone, i takođe su obuhvaćene pronalaskom, uz mogućnost da je specifično uključeno ograničenje za navedeni raspon. Kada navedeni raspon uključuje jedan ili oba limita, rasponi koji isključuju bilo koji ili oba od tih limita su takođe uključeni u pronalazak.
[0099] Određeni rasponi su ovde predstavljeni sa numeričkim vrednostima kojim prethodi izraz „oko“. Izraz „oko“ se ovde koristi da bi se obezbedila doslovna podrška za tačan broj koji prethodio, kao i broj koji je blizu ili približno broju na koji se izraz odnosi. Pri određivanju da li je broj blizu ili približan specifično navedenom broju, blizak ili aproksimirajući neotpisani broj može biti broj koji, u kontekstu u kom je predstavljen, daje značajan ekvivalent konkretno navedenog broja.
[0100] Osim ako nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni izrazi koji se ovde koriste imaju isto značenje kao što je obično poznato stručnjacima u struci kojoj pripada ovaj pronalazak. Iako svi postupci i materijali slični ili ekvivalentni onima opisanim ovde mogu takođe da se koriste u praksi ili testiranju ovog pronalaska, ovde su opisani poželjni postupci i materijali.
[0101] Navođenje bilo koje publikacije jeste njeno objavljivanje pre datuma podnošenja i ne smije se tumačiti kao priznanje da ovaj pronalazak nema pravo na prethodno objavljivanje na osnovu prethodnog pronalaska. Nadalje, datumi objavljivanja mogu se razlikovati od datuma objavljivanja koji bi možda trebali biti nezavisno potvrđeni.
[0102] Treba napomenuti da, kad se koristi ovde i u priloženim patentnim zahtevima, oblici jednine uključuju oblike množine, ukoliko kontekst jasno ne diktira drugačije. Tako, na primer, upućivanje na „polinukleotid“ obuhvata mnoštvo takvih polinukleotida i upućivanje na „polipeptid“ uključuje upućivanje na jedan ili više polipeptida i ekvivalenata koji su poznati stručnjacima i slično. Dalje je napomenuto da se zahtevi mogu izraditi kako bi se isključio bilo koji neobavezni element. Kao takva, ova izjava ima za cilj da posluži kao predodređena osnova za korištenje takve ekskluzivne terminologije kao „isključivo“, "samo" i slično u vezi sa navođenjem elemenata potraživanja ili korištenjem „negativnog“ ograničenja.
[0103 Prihvatljivo je da određene karakteristike pronalaska, koje su, u smislu jasnoće, opisane u kontekstu odvojenih varijanti, mogu takođe biti obezbeđene u kombinaciji u jednom otelotvorenju. Nasuprot tome, različite osobine pronalaska, koje su, zbog sažetosti, opisane u kontekstu jednog otelotvorenja, takođe mogu biti obezbeđene zasebno ili u bilo kojoj pogodnoj podkombinaciji. Sve kombinacije otelotvorenja koje se odnose na pronalazak posebno su obuhvaćene ovim pronalaskom i ovde su obelodanjene kao da je svaka kombinacija pojedinačno i eksplicitno obelodanjena. Pored toga, sve podkombinacije različitih otelotvorenja i njihovih elemenata takođe su posebno obuhvaćene ovim pronalaskom i ovde su obelodanjene kao da je svaka takva podkombinacija pojedinačno i eksplicitno obelodanjena ovde.
[0104 Publikacije koje se ovde razmatraju pružaju se isključivo za njihovo objavljivanje pre datuma podnošenja ove prijave. Ništa ovde ne treba tumačiti kao priznanje da je ovaj pronalazak ovlašćen da izda takvu publikaciju na osnovu prethodnog pronalaska. Nadalje, datumi objavljivanja mogu se razlikovati od datuma objavljivanja koji bi možda trebali biti nezavisno potvrđeni.
DETALJAN OPIS – I DEO
[0105] Ovo obelodanjenje pruža RNK koja cilja DNK koja sadrži ciljanu sekvencu i zajedno sa modifikovanim polipeptidom pruža specifičnu modifikaciju ciljane DNK i/ili polipeptida povezanog sa ciljanom DNK. Ovo obelodanjenje dalje pruža usmerene modifikacone polipeptide. Ovo obelodanjenje dalje pruža postupke usmerene modifikacije ciljane DNK i/ili polipeptida povezanog sa ciljanom DNK. Ovo obelodanjenje pruža postupke modulacije transkripcije ciljane nukleinske kiseline u ciljanoj ćeliji, uopšteno uključivši dovođenje u dodir ciljane nukleinske kiseline Sa enzimatskim neaktivnim Cas9 polipeptidom i RNK koja cilja DNK. Pruženi su i kompleti za otelotvorenje metoda. Ovo obelodanjenje pruža genetski modifikovane ćelije koje proizvode Cas9; i Cas9 transgenih ne-ljudskih višećelijskih organizama.
NUKLEIDNE KISELINE
RNK koja cilja DNK
[0106] Ovo obelodanjenje pruža RNK koja cilja DNK koja usmerava aktivnosti povezanog polipeptida (na pr., usmeren modifikacioni polipeptid) u specifičnu ciljanu sekvencu unutar ciljane DNK. Predmetna DNK koja cilja RNK sadrži: prvi segment (takođe ovde obeležen kao „segment ciljanja na DNK“ ili „sekvenca koja cilja DNK“) i drugi segment (takođe ovde obeležen kao „protein-vezujući segment“ ili „protein-vezujuća sekvenca“).
DNK ciljajući segment RNK koja cilja DNK
[0107] DNK ciljajući segment predmetne RNK koja cilja DNK sadrži nukleotidnu sekvencu koja je komplementarna sekvenci u ciljanoj DNK. Drugim rečima, segment ciljanja DNK predmetne RNK koja cilja DNK interakuje sa ciljanom DNK na specifičan način na sekvencu putem hibridizacije (tj. bazno uparivanje). Kao takva, nukleotidna sekvenca segmenta ciljanja DNK može varirati i određuje lokaciju unutar ciljane DNK na kojoj će RNK koja cilja DNK i ciljana DNK interakovati. DNK ciljani segment predmetne RNK koja cilja DNK može biti modifikovan (npr., genetskim inženjeringom) da hibridizuje do bilo koje željene sekvence unutar ciljane DNK.
[0108] DNK ciljajući segment može da ima dužinu od oko 12 nukleotida do oko 100 nukleotida. Na primer, DNK ciljajući segment može da ima dužinu od oko 12 nukleotida (nt) do oko 80 nt, od oko 12 nt do oko 50nt, od oko 12 nt do oko 40 nt, od oko 12 nt do oko 30 nt, od oko 12 nt do oko 25 nt, od oko 12 nt do oko 20 nt, ili od oko 12 nt do oko 19 nt. Na primer, DNK ciljajući segment može da ima dužinu od oko 19 nt do oko 20 nt, od oko 19 nt do oko 25 nt, od oko 19 nt do oko 30 nt, od oko 19 nt do oko 35 nt, od oko 19 nt do oko 40 nt, od oko 19 nt do oko 45 nt, od oko 19 nt do oko 50 nt, od oko 19 nt do oko 60 nt, od oko 19 nt do oko 70 nt, od oko 19 nt do oko 80 nt, od oko 19 nt do oko 90 nt, od oko 19 nt do oko 100 nt, od oko 20 nt do oko 25 nt, od oko 20 nt do oko 30 nt, od oko 20 nt do oko 35 nt, od oko 20 nt do oko 40 nt, od oko 20 nt do oko 45 nt, od oko 20 nt do oko 50 nt, od oko 20 nt do oko 60 nt, od oko 20 nt do oko 70 nt, od oko 20 nt do oko 80 nt, od oko 20 nt do oko 90 nt, ili od oko 20 nt do oko 100 nt. Nukleotidna sekvenca (DNK ciljajuća sekvenca) DNK ciljajućeg segmenta koja je komplementarna nukleotidnoj sekvenci (ciljana sekvenca) ciljane DNK može da ima dužinu barem oko 12 nt. Na primer, DNK ciljajuća sekvenca DNK ciljajućeg segmenta koja je komplementarna ciljanoj sekvenci ciljane DNK može da ima dužinu barem oko 12 nt, barem oko 15 nt, barem oko 18 nt, barem oko 19 nt, barem oko 20 nt, barem oko 25 nt, barem oko 30 nt, barem oko 35 nt ili barem oko 40 nt. Na primer, DNK ciljajuća sekvenca DNK ciljajućeg segmenta koja je komplementarna ciljanoj sekvenci ciljane DNK može da ima dužinu od oko 12 nukleotida (nt) do oko 80 nt, od oko 12 nt do oko 50nt, od oko 12 nt do oko 45 nt, od oko 12 nt do oko 40 nt, od oko 12 nt do oko 35 nt, od oko 12 nt do oko 30 nt, od oko 12 nt do oko 25 nt, od oko 12 nt do oko 20 nt, od oko 12 nt do oko 19 nt, od oko 19 nt do oko 20 nt, od oko 19 nt do oko 25 nt, od oko 19 nt do oko 30 nt, od oko 19 nt do oko 35 nt, od oko 19 nt do oko 40 nt, od oko 19 nt do oko 45 nt, od oko 19 nt do oko 50 nt, od oko 19 nt do oko 60 nt, od oko 20 nt do oko 25 nt, od oko 20 nt do oko 30 nt, od oko 20 nt do oko 35 nt, od oko 20 nt do oko 40 nt, od oko 20 nt do oko 45 nt, od oko 20 nt do oko 50 nt, ili od oko 20 nt do oko 60 nt. Nukleotidna sekvenca (DNK ciljajuća sekvenca) DNK ciljajućeg segmenta koja je komplementarna nukleotidnoj sekvenci (ciljana sekvenca) ciljane DNK može da ima dužinu barem oko 12 nt.
[0109] U nekim slučajevima, DNK ciljajuća sekvenca DNK ciljajućeg segmenta koja je komplementarna ciljanoj sekvenci ciljane DNK je 20 nukleotida u dužini. U nekim slučajevima, s DNK ciljajuća sekvenca DNK ciljajućeg segmenta koja je komplementarna ciljanoj sekvenci ciljane DNK je 19 nukleotida u dužini.
[0110] Procenat komplementarnosti između DNK ciljajuće sekvence DNK ciljajućeg segmenta i ciljane sekvence ciljane DNK može biti najmanje 60% (npr. najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75% Najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% ili 100%). U nekim slučajevima, procentualna komplementarnost između DNK ciljajuće sekvence DNK ciljajućeg segmenta i ciljane sekvence ciljane DNK je 100% u odnosu na sedam susednih 5'-najviše nukleotida ciljane sekvence komplementarne linije ciljane DNK. U nekim slučajevima, procentualna komplementarnost između DNK ciljajuće sekvence DNK ciljajućeg segmenta i ciljane sekvence ciljane DNK je najmanje 60% u oko 20 susednih nukleotida. U nekim slučajevima, procentualno komplementarnost između DNK ciljajuće sekvence DNK ciljajućeg segmenta i ciljane sekvence ciljane DNK je 100% u odnosu na četrnaest susednih 5'-većina nukleotida ciljane sekvence komplementarne linije ciljane DNK i niska kao 0% u odnosu na ostatak. U takvom slučaju, DNK ciljajuća sekvenca se može smatrati da ima dužinu od 14 nukleotida (pogledati Sliku 12D-E). U nekim slučajevima, procentualna komplementarnost između DNK ciljajuće sekvence DNK ciljajućeg segmenta i ciljane sekvence ciljane DNK je 100% u odnosu na sedam susednih 5'-najviše nukleotida ciljane sekvence komplementarne linije ciljane DNK i niska kao 0% u odnosu na ostatak. U takvom slučaju, sekvenca ciljanja DNK ciljajuća sekvenca se može smatrati da ima dužinu od 7 nukleotida
Proteinski vezujući segment RNK koja cilja DNK
[0111] Segment vezivanja proteina predmetna RNK koja cilja DNK, interakuje sa usmerenim modifikacionim polipeptidom. Predmetna RNK koja cilja DNK usmerava vezani polipeptid u specifičnu nukleotidnu sekvencu unutar ciljane DNK preko gore pomenutog DNK ciljajućeg segmenta. Segment vezivanja proteina predmetne RNK koja cilja DNK sadrži dva dela nukleotida koji su komplementarni jedan drugom. Komplementarni nukleotidi segmenta vezivanja proteina se hibridizuju kako bi se formirao dvostruki vezani dupleks dnRNK (dsRNK) (pogledati Slike 1A i 1B).
[0112] Predmetna dvomolekulska RNK koja cilja DNK sadrži dva odvojena RNK molekula. Svaki od dva RNK molekula predmetne dvomolekulska RNK koja cilja DNK sadrži deo nukleotida koji su komplementarni jedni s drugima tako da komplementarni nukleotidi dva RNK molekula hibridizuju da bi se formirao dvostruko vezani RNK dupleks od protein vezujućeg segmenta (Slika 1A).
[0113] U nekim otelotvorenjima, segment formiranja dupleksa od aktivator-RNK je najmanje oko 60% identičan jednom od molekula aktivator-RNK (tracrRNK) koji je naveden u SEQ ID NO: 431-562 ili njegovom komplementu, na delu od najmanje 8 susednih nukleotida. Na primer, segment formiranja dupleksa aktivator-RNK (ili DNK koji kodira segment formiranja dupleksa od aktivator-RNK) je najmanje oko 60% identičan, najmanje oko 65% identičan, najmanje oko 70% identičan, najmanje oko 75% identičan, najmanje oko 80% identičan, najmanje oko 85% identičan, najmanje oko 90% identičan, najmanje oko 95% identičan, najmanje oko 98% identičan, najmanje oko 99% identičan, ili 100% identičan jednoj od tracrRNK sekvenci datih u SEQ ID NO: 431-562, ili njegovom komplementu, preko dela od najmanje 8 susednih nukleotida.
[0114] U nekim otelotvorenjima, segment formiranja dupleksa RNK koja cilja je najmanje oko 60% identičan jednoj od sekvenci RNK koja cilja (crRNK) koje su date u SEQ ID NO: 563-679, ili njihovom komplementu, na delu od najmanje 8 susednih nukleotida. Na primer, segment formiranja dupleksa RNK koja cilja (ili DNK koja kodira segment formiranja dupleksa NK koja cilja) je najmanje oko 65% identična, najmanje oko 70% identična, najmanje oko 75% identična, najmanje oko 80% identična, najmanje oko 85% identična, najmanje oko 90% identična, najmanje oko 95% identična, najmanje oko 98% identična, najmanje oko 99% identična ili 100% identična jednoj od crRNK sekvenci datih u SEQ ID NOs: 563-679, ili njegovom komplementu, preko dela od najmanje 8 susednih nukleotida.
[0115] Dvomolekulska RNK koja cilja DNK može se dizajnirati tako da omogući kontrolisano (tj. uslovno) vezivanje RNK koja cilja sa aktivator-RNK. S obzirom na to da dvomolekulska RNK koja cilja DNK nije funkcionalna, osim ako su aktivator-RNK i targeter-RNK vezani u funkcionalnom kompleksu sa dCas9, dvomolekulska RNK koja cilja DNK može biti inducibilna (npr. lekom inducibilna) ako su vezivanje između aktivator-RNK i targeter-RNK inducibilnu. Kao jedan neograničavajući primer, RNK aptameri se mogu koristiti za regulisanje (tj. kontrolu) vezivanje aktivator-RNK sa targeter-RNK. Shodno tome, aktivator-RNK i/ili targeter-RNK mogu da sadrže RNK sekvencu aptamera.
[0116] Aptameri RNK su poznati u struci i uglavnom su sintetička verzija ribosviča. Izrazi „RNK aptamer“ i „ribosvič“ su ovde međusobno zamenjivi kako bi obuhvatili i sintetičke i prirodne nukleinske kiseline koje pružaju inducibilnu regulaciju strukture (a samim tim i dostupnost specifičnih sekvenci) molekula RNK, čiji su deo. RNK aptameri obično sadrže sekvencu koja se preklapa u određenu strukturu (npr., ukosnica), koja specifično vezuje određeni lek (npr., mali molekul). Vezivanje leka izaziva strukturne promene u preklapanju RNK, koja menja karakteristike nukleinske kiseline čiji je aptamer deo. Kao neograničavajući primeri: (i) aktivator-RNK sa aptamerom možda neće biti u stanju da se veže sa srodnim RNK koja cilja osim ako aptamer nije vezan odgovarajućim lekom; (ii) RNK koja cilja sa aptamerom možda neće biti u mogućnosti da se veže sa srodnim aktivator-RNK osim ako aptamer nije vezan odgovarajućim lekovima; i (iii) targeter-RNK i aktivator-RNK, od kojih svaka sadrži drugi aptamer koji vezuje drugačiji lek, možda se ne može povezati jedni sa drugima, osim ako nisu prisutna oba leka. Kao što je ilustrovano ovim primerima, dvomolekulska RNK koja cilja DNK može biti dizajnirana da bude inducibilna.
[0117] Primeri aptamera i ribosvičeva mogu se naći na primer u: Nakamura et al., Genes Cells.
2012 May;17(5):344-64; Vavalle et al., Future Cardiol. 2012 May;8(3):371-82; Citartan et al., Biosens Bioelectron.2012 Apr 15;34(1):1-11; i Liberman et al., Wiley Interdiscip Rev RNK.2012 May-Jun;3(3):369-84.
[0118] Neograničavajući primeri nukleotidnih sekvenci koje mogu biti uključene u dvomolekulska RNK koja cilja DNK ovde uključuju bilo koju sekvencu koja je navedena u SEQ ID NO: 431-562, ili ih komplementira uparivanjem sa bilo kojim sekvencama navedenim u SEQ ID NOs: 563-679, ili njihovim suplementima koji mogu hibridizovati da bi formirali protein vezujući segment.
[0119 Jednomolekulska RNK koja cilja DNK sadrži dva dela nukleotida (targeter-RNK i aktivator-RNK) koji su komplementarni jedan drugom, kovalentno su povezani intervencijom nukleotida („veznici“ ili „veznik nukleotidi") i hibridizuju se da bi se formirao dvostruko vezani RNK dupleks (dsRNK dupleks) segmenta vezivanja proteina, čime se dobija struktura stem-petlje (Slika 1B). Targeter-RNK i aktivator-RNK mogu biti kovalentno povezani preko 3' kraja targeter-RNK i 5' kraja aktivator-RNK. Alternativno, targeter-RNK i aktivator RNK mogu biti kovalentno povezani preko 5' kraja targeter-RNK i 3' kraja aktivator-RNK.
[0120] Veznik jednomolekulska RNK koja cilja DNK može da ima dužinu od oko 3 nukleotida od oko 100 nukleotida. Na primer, veznik može da ima dužinu od oko 3 nukleotida (nt) od oko 90 nt, od oko 3 nukleotida (nt) od oko 80 nt, od oko 3 nukleotida (nt) od oko 70 nt, od oko 3 nukleotida (nt) od oko 60 nt, od oko 3 nukleotida (nt) od oko 50 nt, od oko 3 nukleotida (nt) od oko 40 nt, od oko 3 nukleotida (nt) od oko 30 nt, od oko 3 nukleotida (nt) od oko 20 nt ili od oko 3 nukleotida (nt) od oko 10 nt. Na primer, veznik može da ima dužinu od oko 3 nt od oko 5 nt, od oko 5 nt od oko 10 nt, od oko 10 nt od oko 15 nt, od oko 15 nt od oko 20 nt, od oko 20 nt od oko 25 nt, od oko 25 nt od oko 30 nt, od oko 30 nt od oko 35 nt, od oko 35 nt od oko 40 nt, od oko 40 nt od oko 50 nt, od oko 50 nt od oko 60 nt, od oko 60 nt od oko 70 nt, od oko 70 nt od oko 80 nt, od oko 80 nt od oko 90 nt, ili od oko 90 nt od oko 100 nt. U nekim otelotvorenjima, veznik jednomolekulska RNK koja cilja DNK je 4 nt.
[0121] Primerna jednomolekulska RNK koja cilja DNK sadrži dva komplementarna dela nukleotida koji se hibridizuju da bi formirali dsRNK dupleks. U nekim otelotvorenjima, jedan od dva komplementarna dela nukleotida jednomolekulska RNK koja cilja DNK (ili DNK koja kodira rastezanje) je najmanje oko 60% identična jednom od molekula aktivator-RNK (tracrRNK) koji su navedeni u SEQ ID NOs: 431-562, ili njegom komplementu, preko dela od najmanje 8 susednih nukleotida. Na primer, jedan od dva komplementarna dela nukleotida jednomolekulska RNK koja cilja DNK (ili DNK koja kodira rastezanje) je najmanje oko 65% identičan, najmanje oko 70% identičan, najmanje oko 75% identičan, najmanje Oko 80% identičan, najmanje oko 85% identičan, najmanje oko 90% identičan, najmanje oko 95% identičan, najmanje oko 98% identičan, najmanje oko 99% identičan ili 100% identičan jednom od setova tracrRNK sekvenci datih u SEQ ID NO: 431-562, ili njegom komplementu, preko dela od najmanje 8 susednih nukleotida.
[0122] U nekim otelotvorenjima, jedan od dva komplementarna dela nukleotida jednomolekulska RNK koja cilja DNK (ili DNK koja kodira rastezanje) je najmanje oko 60% identična jednom od onih od RNK koja cilja (crRNK) sekvenci datih u SEQ ID NOs: 563-679, ili njegovom komplementu, preko dela od najmanje 8 susednih nukleotida. Na primer, jedan od dva komplementarna dela nukleotida jednomolekulska RNK koja cilja DNK (ili DNK koja kodira rastezanje) je najmanje oko 65% identičan, najmanje oko 70% identičan, najmanje oko 75% identičan, najmanje oko 80% identičan, najmanje oko 85% identičan, najmanje oko 90% identičan, najmanje oko 95% identičan, najmanje oko 98% identičan, najmanje oko 99% identičan ili 100% identičan jednoj od crRNK Sekvenci navedene u SEQ ID NOs: 563-679, ili njihov komplement, preko dela od najmanje 8 susednih nukleotida.
[0123] Odgovarajući prirodni srodni parovi crRNK i tracrRNK mogu se rutinski odrediti za SEQ ID NO: 431-679 uzimajući u obzir naziv vrsta i bazno uparivanje (za dsRNK dupleks protein vezujućeg domena) kada se određuju odgovarajući srodni parovi (pogledati Sliku 8 kao neograničavajući primer).
[0124] Kada se radi o predmetnoj jednomolekulskoj RNK koja cilja DNK i o predmetnoj dvomolekulskoj RNK koja cilja DNK, Slika 57 pokazuje da veštačke sekvence koje dele veoma malo (približno 50% identičnosti) sa prirodnim tracrRNK i crRNK mogu da funkcionišu sa Cas9 kako bi se razdvojila ciljana DNK sve dok se konzervira struktura proteinsko vezujućeg domena RNK koja cilja DNK. Tako se uzima u obzir struktura RNK preklapanja prirodno očvršćavajućeg proteinsko vezujućeg domena RNK koja cilja DNK radi dizajniranja veštačkih domena vezanih za proteine (bilo dvomolekulski ili jednomolekulski). Kao neograničavajući primer, funkcionalna veštačka RNK koja cilja DNK sa Slike 57 je dizajnirana na osnovu strukture segmenta vezivanja proteina prirodnog DNK ciljanja (npr. Uključujući i isti broj baznih parova duž RNK dupleksa i uključujući i istu „ispupčenu“ regiju koja je prisutna u prirodnoj RNK). Kako te strukture mogu lako proizvesti stručnjaci u oblasti za bilo koji prirodni crRNK:tracrRNK par iz bilo kojih vrsta (pogledati SEQ ID NOs: 431-679 za crRNK i tracrRNK sekvencu iz širokog spektra vrsta), veštačka RNK koja cilja DNK se može dizajnirati da imitira prirodnu strukturu za određenu vrstu kada koristi Cas9 (ili vezani Cas9, pogledati Sliku 32A) od te vrste. (pogledati Sliku 24D i povezane detalje u Primeru 1). Prema tome, pogodna RNK koja cilja DNK može biti veštački dizajnirana RNK (koja se ne prirodno javlja) koja sadrži domen za vezivanje proteina koji je dizajniran da imitira strukturu protein vezujućeg domena prirodne RNK koja cilja DNK. (pogledati SEQ ID NOs: 431-679, uzimajući u obzir naziv vrsta prilikom određivanja odgovarajućih srodnih parova).
[0125] Segment vezujući protein može imati dužinu od oko 10 nukleotida do oko 100 nukleotida. Na primer, protein vezujući segment može imati dužinu od oko 15 nukleotida (nt) do oko 80 nt, od oko 15 nt do oko 50 nt, od oko 15 nt do oko 40 nt, od oko 15 nt do oko 30 nt ili od oko 15 nt do oko 25 nt.
[0126] Takođe, u odnosu na predmetnu jednomolekulsku RNK koja cilja DNK i na predmetnu dvomolekulsku RNK koja cilja DNK, dsRNK dupleks segmenta vezivanja proteina može imati dužinu od oko 6 baznih parova (bp) do oko 50bp. Na primer, dsRNK dupleks segmenta vezivanja proteina može imati dužinu od oko 6 bp do oko 40 bp, od oko 6 bp do oko 30 bp, od oko 6 bp do oko 25 bp, od oko 6 bp do oko 20 bp, od oko 6 bp do oko 15 bp, od oko 8 bp do oko 40 bp, od oko 8 bp do oko 30 bp, od oko 8 bp do oko 25 bp, od oko 8 bp do oko 20 bp ili od oko 8 bp do oko 15 bp. Na primer, dsRNK dupleks segmenta vezivanja proteina može imati dužinu od oko 8 bp do oko 10 bp, od oko 10 bp do oko 15 bp, od oko 15 bp do oko 18 bp, od oko 18 bp do oko 20 bp, od oko 20 bp do oko 25 bp, od oko 25 bp do oko 30 bp, od oko 30 bp do oko 35 bp, od oko 35 bp do oko 40 bp ili od oko 40 bp do oko 50 bp. U nekim otelotvorenjima, dsRNK dupleks segmenta vezivanja proteina ima dužinu od 36 baznih parova. Procenat komplementarnosti između nukleotidnih sekvenci koje hibridizuju da bi se formirao dsRNK dupleks segmenta vezivanja proteina može biti najmanje oko 60%. Na primer, procentualna komplementarnost između nukleotidnih sekvenci koje hibridizuju kako bi se formiralo dsRNK dupleks segmenta vezivanja proteina može biti najmanje oko 65%, najmanje oko 70%, najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 98%, ili bar oko 99%. U nekim slučajevima, procentualna komplementarnost između nukleotidnih sekvenci koje hibridizuju kako bi se formirao dsRNK dupleks segmenta vezivanja proteina je 100%.
Usmereni modifikacioni polipeptid
[0127] Predmetna RNK koja cilja DNK i usmeren modifikacioni polipeptid, formiraju kompleks. RNK koja cilja DNK pruža specifičnost ciljanja na kompleks tako što sadrži nukleotidnu sekvencu koja je komplementarna sekvenci ciljane DNK (kao što je gore navedeno). Usmeren modifikacioni polipeptid, kompleksa pruža aktivnost specifičnu za lokaciju. Drugim rečima, usmeren modifikacioni polipeptid se navodi do sekvence DNK (npr. hromozomska sekvenca ili ekstrahromozomska sekvenca, npr. epizodna sekvenca, minijaskularna sekvenca, mitohondrijalna sekvenca, hloroplastna sekvenca itd.) na osnovu Asocijacija sa barem segmentom vezivanja proteina RNK koja cilja DNK (opisan gore).
[0128] Usmeren modifikacioni polipeptid modifikuje ciljanu DNK (npr., Cepanje ili metilovanje ciljane DNK) i/ili polipeptid povezan sa ciljanom DNK (npr., metilovanje ili acetilovanje histonskog repa). Usmeren modifikacioni polipeptid takođe se ovde naziva kao „usmeren polipeptid“ ili „RNK vezujući usmeren modifikacioni polipeptid“.
[0128] U nekim slučajevima, usmeren modifikacioni polipeptid je prirodno prisutan modifikacioni polipeptid. U drugim slučajevima, usmeren modifikacioni polipeptid nije polipeptid koji se prirodno javlja (npr., himerni polipeptid kao što je obrazloženo dole ili prirodni polipeptid koji je modifikovan, npr., mutacija, brisanje, umetanje).
[0130] Primeri prirodno prisutnih usmerenih modifikacionih polipeptida su navedeni u SEQ ID NO: 1-255 kao neograničavajuća lista prirodnih endonukleaza Cas9/Csn1. Ovi prirodno prisutni polipeptidi, kao što je ovde obelodanjeno, vezuju RNK koja cilja DNK, prema tome usmeravaju se ka specifičnoj sekvenci unutar ciljane DNK i razdvajaju ciljanu DNK da generišu prekid u dvostrukoj vezi. Modifikovani usmeren modifikacioni polipeptid, sadrži dva dela, deo koji se vezuje za RNK i deo aktivnosti. U nekim otelotvorenjima, predmetni usmeren modifikacioni polipeptid obuhvata: (i) deo koji se vezuje za RNK koja interakuje sa RNK koja cilja DNK, pri čemu RNK koja cilja DNK sadrži nukleotidnu sekvencu koja je komplementarna sekvenci u ciljanoj DNK; i (ii) deo aktivnosti koji pokazuje usmerenu enzimsku aktivnost (npr. aktivnost za metilaciju DNK, aktivnost za cepanje DNK, aktivnost za acetonilaciju histona, aktivnost za histil metilaciju itd.), pri čemu je mesto enzimske aktivnosti određeno RNK koja cilja DNK.
[0131] U drugim otelotvorenjima, predmetni usmeren modifikacioni polipeptid: (i) deo koji se vezuje za RNK koja interakuje sa RNK koja cilja DNK, pri čemu RNK koja cilja DNK sadrži nukleotidnu sekvencu koja je komplementarna sekvenci u ciljanoj DNK; i (ii) deo aktivnosti koji modulira transkripciju unutar ciljane DNK (npr., da poveća ili smanji transkripciju), pri čemu je mesto modulirane transkripcije unutar ciljane DNK određeno pomoću RNK koja cilja DNK.
[0132] U nekim slučajevima, predmetni usmeren modifikacioni polipeptid ima enzimsku aktivnost koja modifikuje ciljanu DNK (npr. aktivnost nukleaze, aktivnost metiltransferaze, aktivnost demetilaze, aktivnost DNK popravke, aktivnost DNK oštećenja, aktivnost deaminacije, aktivnost dismutaze, aktivnost alkilacije, Aktivnost depurinacije, aktivnost oksidacije, aktivnost formiranja dimera pirimidina, aktivnost integraze, aktivnost transpozaze, aktivnost rekombinaze, aktivnost polimeraze, aktivnost ligaze, aktivnost helikase, aktivnost fotoliaze ili glikozilazna aktivnost).
[0133] U drugim slučajevima, predmetni usmeren modifikacioni polipeptid ima enzimsku aktivnost koja modifikuje polipeptid (npr. histon) povezan sa ciljanom DNK (npr. aktivnost metiltransferaze, aktivnost demetilaze, aktivnost acetil-transferaze, aktivnost deacetilaze, aktivnost kinaze, aktivnost fosfataze, ubikvitin ligaza, aktivnost deubikuitinacije, aktivnost adenilacije, aktivnost umirenja, aktivnost SUMOilacije, aktivnost deSUMOilacije, aktivnost ribozilacije, aktivnost deribozilacije, aktivnost miristoilacije ili demiristoilacijska aktivnost).
Primeri lokalni usmeren modifikacioni polipeptidi
[0134 U nekim slučajevima, usmeren modifikacioni polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 99% ili 100% identičnosti aminokiselinske sekvence sa aminokiselinama 7-166 ili 731-1003 od as9/Csn1 aminokiselinske sekvence C prikazane na Slici 3, ili odgovarajućim delovima u bilo kojoj od sekvenci aminokiselina datih kao SEQ ID NO: 1-256 i 795-1346.
Modifikacije nukleinske kiseline
[0135] U nekim otelotvorenjima, predmetna nukleinska kiselina (npr. RNK koja cilja DNK) sadrži jednu ili više modifikacija, npr. modifikaciju baze, modifikaciju kičme itd., kako bi nukleinska kiselina dobila novu ili poboljšanu osobinu (npr. poboljšana stabilnost). Kao što je poznato u struci, nukleozid je kombinacija baze i šećera. Osnovni deo nukleozida je obično heterociklična baza. Dve najčešće klase takvih heterocikličnih baza su purini i pirimidini. Nukleotidi su nukleozidi koji dalje uključuju fosfatnu grupu kovalentno vezanu za deo šećera u nukleozidu. Za one nukleozide koji uključuju pentofuranozil šećer, fosfatna grupa može biti povezana sa 2', 3' ili 5' hidroksilnim delom šećera. U formiranju oligonukleotida fosfatne grupe kovalentno povezuju susedne nukleozide jedne sa drugima kako bi se formiralo linearno polimerno jedinjenje. Zauzvrat, odgovarajući krajevi ovog linearnog polimernog jedinjenja mogu se dalje spojiti kako bi se formiralo kružno jedinjenje, međutim, linearna jedinjenja su uglavnom pogodna. Pored toga, linearna jedinjenja mogu imati komplementarnost unutrašnje nukleotidne baze i stoga se mogu preklapati na način kako bi se proizvelo potpuno ili delimično dvostruko jedinjenje. U okviru oligonukleotida, za fosfatne grupe se obično smatra da formiranju međunukleozidne kičme oligonukleotida. Normalna veza ili kičma RNK i DNK je veza između 3' do 5' fosfodiestera.
Modifikovane kičme i modifikovane međunukleozidne veze
[0136] Primeri pogodnih nukleinskih kiselina koji sadrže modifikacije uključuju nukleinske kiseline koje sadrže modifikovane kičme ili neprirodne međunukleozidne veze. Nukleinske kiseline koje imaju modifikovane pozadine uključuju one koji zadržavaju atom fosfora u kičmi i oni koji nemaju atom fosfora u kičmi.
[0137] Pogodne modifikovane oligonukleotidne kičme koje sadrže atom fosfora uključuju, na primer, fosforotioate, kiralne fosforotioate, fosforoditioate, fosfotriestre, aminoalkilfosfotriestre, metil i druge alkil fosfonate uključujući 3'-alkilen fosfonate, 5'-alkilen fosfonate i hiralne fosfonate, fosfinate, fosforamidate, uključujući 3'-aminofosforamidat i aminoalkilfosforamidate, fosforodiamidate, tionofosforamidate, tionoalkilfosfonate, tionoalkilfosfotriestre, selenofosfate i boranofosfate koji imaju normalne 3'-5' veze, 2'-5' vezane analoge od njih, i oni koji imaju obrnuti polaritet u kome su jedna ili više međunukleozidna veza 3' do 3', 5' do 5' ili 2' do 2' veza. Pogodni oligonukleotidi koji imaju inverzni polaritet obuhvataju vezu 3' do 3' na 3'-najviše međunukleozidnih veza, tj. Jedan obrnuti nukleozidni ostatak koji može biti bazni (nukleobaza nedostaje ili ima hidroksilnu grupu na njihovom mestu). Uključene su i razne soli (kao što su, na primer, kalijum ili natrijum), mešane soli i slobodni oblici kiselina.
[0138] U nekim otelotvorenjima, predmetna nukleinska kiselina sadrži jednu ili više međunukleozidnih veza fosforotioata i/ili heteroatoma, naročito -CH2-NH-O-CH2-, -CH2-N(CH3)-O-CH2-(poznat kao metilen (metilimino) ili MMI kičma), -CH2-O-N(CH3)-CH2-, -CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2- i -O-N(CH3)-CH2-CH2- (gde je nukleotidna veza prirodnog fosfodiestera predstavljena kao -O-P(=O)(OH)-O-CH2-). MMI tip međunukleozidne veze su otkrivene u gore navedenom U.S. Pat. No.5,489,677. Odgovarajuće amidne međunukleozidne veze su prikazane u U.S. Pat. No.5,602,240.
[0139] Takođe su pogodne nukleinske kiseline koje imaju strukture morfolinskog kičmi kao što je opisano u, npr., U.S. Pat. No. 5,034,506. Na primer, u nekim otelotvorenjima, predmetna nukleinska kiselina sadrži 6-člani morfolinski prsten umesto riboznog prstena. U nekim od ovih otelotvorenja, fosforodiamidat ili druga ne-fosfodiesterna međunukleozidna veza zamenjuje vezu fosfodiestera.
[0140] Pogodne modifikovane pozadine polinukleotida koje ne sadrže atom fosfora u sebi imaju kičme koje su formirane vezama alkilniog kratkog lanca ili cikloalkilnim međunukleozidnim vezama, mešovitim heteroatomom i alkil ili cikloalkil međunukleozidnim vezama ili jednim ili više heteroatomskih ili heterocikličnih međunukleozidnih veza. To uključuje one koji imaju morfolinove veze (formirane delom od šećernog dela nukleozida); siloksanske kičme; sulfidne, sulfoksidne i sulfonske kičme; formacetil i tioformacetil kičme; metilen formacetil i tioformacetil kičme; riboacetil kičme; kičme koje sadrže alken; sulfamat kičme; metilenimino i metilenhidrazino kičme; sulfonat i sulfonamid kičme; amid kičme; i drugi koji imaju mešovite N, O, S i CH2komponente.
Mimetici
[0141] Predmetna nukleinska kiselina može biti mimetik nukleinske kiseline. Izraz „mimetik“, kako se primenjuje na polinukleotide, ima za cilj da uključi polinukleotide u kojima se samo furanozni prsten ili i furanozni prsten i međunukleozidna veza zamenjuju grupama koje ne sadrže furanoze, gde se zamena samo furanoznog prstena se takođe pominje u struci kao surogat šećera. Heterociklična baza ili modifikovana heterociklična baza ostaju održavani za hibridizaciju sa odgovarajućom ciljanom nukleinskom kiselinom. Jedna takva nukleinska kiselina, polinukleotidni mimetik za koji se pokazalo da ima odlične osobine hibridizacije, naziva se peptidna nukleinska kiselina (PNA). U PNA, šećerna kičma polinukleotida zamenjena je kičmom koja sadrži amid, posebno nosač aminoetilglicina. Nukleotidi se zadržavaju i vezuju direktno ili indirektno na aza azotove atome amidnog dela kičme.
[0142] Jedan polinukleotidni mimetik za koji se zna da ima odlične osobine hibridizacije je peptidna nukleinska kiselina (PNA). Kičma u PNA jedinjenjima su dva ili više povezanih jedinjenja aminoetilglicina, što daje PNA amid koji sadrži kičmu. Ostaci heterociklične baze su vezani direktno ili indirektno na azotne atome amidnog dela kičme. Reprezentativni SAD patenti koji opisuju pripremu PNA jedinjenja obuhvataju, ali nisu ograničeni na: U.S. Pat. Nos. 5,539,082; 5,714,331; i 5,719,262.
[0143] Druga klasa polinukleotidnih mimetika koja je proučavana zasnovana je na vezanim morfolinskim jedinicama (morfolinova nukleinska kiselina) koja imaju heterociklične baze vezane za morfolinski prsten. Prijavljeno je nekoliko grupa povezivanja koje povezuju morfolinske monomerne jedinice u morfolinskoj nukleinskoj kiselini. Jedna klasa grupa povezivanja je odabrana da daje ne-jonsko oligomerno jedinjenje. Nejonska oligomerna jedinjenja na bazi morfolina su manje verovatna da imaju neželjene interakcije sa ćelijskim proteinama. Polinukleotidi zasnovani na morfolinima su nejonski mimici oligonukleotida za koje je manje verovatno da formiraju neželjene interakcije sa ćelijskim proteinima (Dwaine A. Braasch and David R. Corey, Biochemistry, 2002, 41(14), 4503-4510). Polinukleotidi na bazi morfolina opisani su u U.S. Pat. No. 5,034,506. Pripremljeni su različiti sastojci unutar klase morfolina polinukleotida, koji imaju različite grupe povezivanja koje spajaju monomerne podjedinice.
[0144] Sledeća klasa polinukleotidnih mimetika se naziva cikloheksenil nukleinske kiseline (CeNA). Furanozni prsten koji je normalno prisutan u molekulu DNK/RNK zamenjuje se sa cikloheksenilnim prstenom. CeNA DMT zaštićeni monomeri fosforamidita su pripremljeni i korišćeni za sintezu oligomernih jedinjenja prema hemijskoj klasifikaciji fosforamidita. Potpuno modifikovana CeNA oligomerna jedinjenja i oligonukleotidi koji imaju specifične položaje modifikovane sa CeNA su pripremljeni i proučavani (pogledati VWang et al., J. Am. Chem. Soc., 2000, 122, 8595-8602). Generalno, uvođenje monomera CeNA u DNK lanac povećava stabilnost DNK/RNK hibrida. CeNA oligoadenilati su formirali komplekse sa RNK i DNK koji se dopunjuju sa sličnom stabilnošću sa prirodnim kompleksima. Istraživanje ugrađivanja struktura CeNA u strukture prirodnih nukleinskih kiselina su pokazali da NMR i kružni dihroizam nastavljaju sa lakom konformacijskom adaptacijom.
[0145] Sledeća modifikacija uključuje zaključane nukleinske kiseline (LNA) u kojima je 2'-hidroksil grupa vezana za 4' atom ugljenika prstenastog šećera čime se formira veza 2'-C, 4'-C-oksimetilen, čime se formira biciklični šećerni deo. Veza može biti metilen (-CH2-), grupa koja premošćuje atom 2‘ kiseonika i atom 4' ugljenika gde je n 1 ili 2 (Singh et al., Chem. Commun., 1998, 4, 455-456) . LNA i LNA analozi pokazuju veoma visoke dupleks termalne stabilnosti sa komplementarnom DNK i RNK (Tm=+3 to 10°C), stabilnošću prema 3'-eksonukleolitičkoj degradaciji i dobrim osobinama rastvorljivosti. Opisani su potentni i netoksični antisens oligonukleotidi koji sadrže LNA (Wahlestedt et al., proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 2000, 97, 5633-5638).
[0146] Opisana je sinteza i priprema LNA monomera adenina, citozina, gvanina, 5-metil-citozina, timina i uracila zajedno sa njihovom oligomerizacijom i osobinama za prepoznavanje nukleinske kiseline (Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630). LNA i njihova priprema su takođe opisani u WO 98/39352 i WO 99/14226.
Modifikovani šećerni ostaci
[0147] Jedna predmetna nukleinska kiselina može takođe da sadrži jedan ili više zamenjenih šećernih ostataka. Odgovarajući polinukleotidi sadrže grupu supstituenata šećera izabranu od: OH; F; O-, S- ili N-alkil; O-, S- ili N-alkenil; O-, S- ili N-alkinil; ili Oalkil-O-alkil, gde alkil, alkenil i alkinil mogu biti supstituisani ili nesupstituisani C1do C10alkilom ili C2do C10alkenilom i alkinilom. Posebno su pogodni O((CH2)nO)mCH3, O(CH2)nOCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2, i O(CH2)nON((CH2)nCH3)2, gde su n i m od 1 do oko 10. Ostali pogodni polinukleotidi sadrže grupu supstituenata šećera izabranu iz grupe koju čine: C1do C10niži alkil, supstituisan niži alkil, alkenil, alkinil, alkaril, aralkil, O-alkaril ili O-aralkil, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, heterocikloalkil, heterocikloalkaril, aminoalkilamino, polialkilamino, supstituisani silil, grupa za cepanje RNK, reporter grupa, interkalator, grupa za poboljšanje farmakokinetičkih osobina oligonukleotida ili grupa za poboljšanje farmakodinamičkih svojstava oligonukleotida i drugih supstituenata koji imaju slična svojstva. Pogodna modifikacija uključuje 2'-metoksietoksi(2’-O-CH2CH2OCH3, takođe poznat kao 2'-O-(2-metoksietil) ili 2'-MOE) (Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504) tj. alkoksialkoksi grupa. Dodatna pogodna modifikacija obuhvata 2'-dimetilaminooksietoksi, odnosno grupu O(CH2)2ON(CH3)2, takođe poznatu kao 2'-DMAOE, kao što je opisano u primerima ovde ispod, i 2'-dimetilaminoetoksietoksi (takođe poznat u struci kao 2'-O-dimetil-amino-etoksi-etil ili 2'-DMAEOE), tj.2’-O-CH2-O-CH2-N(CH3)2.
[0148] Druge pogodne supstancijalne grupe šećera uključuju metoksi (-O-CH3), aminopropoksi (--O CH2CH2CH2NH2), alil (-CH2-CH=CH2), -O-alil (--O-- CH2-CH=CH2) i fluoro (F). Grupe supstituenata 2'-šećera mogu biti u položaju arabino (gore) ili položaju ribo (dole). Pogodna 2'-arabino modifikacija je 2'-F. Slične modifikacije mogu se vršiti i na drugim položajima na oligomernom jedinjenju, naročito na položaju 3' šećera na 3' terminalu nukleozida ili u 2'-5' povezanim oligonukleotidima i na položaju 5' terminalng nukleotida 5' . Oligomerna jedinjenja mogu takođe imati šećerne mimetike kao što su ciklobutilni ostaci umesto pentofuranozilnog šećera.
Bazne modifikacije i zamene
[0149] Predmetna nukleinska kiselina takođe može uključiti modifikacije ili supstitucije nukleobaze (koja se u struci jednostavno naziva „baza“). Kao što je ovde korišćeno, „nemodifikovane“ ili „prirodne“ nukleobaze uključuju purinske baze adenin (A) i guanin (G), i pirimidinske baze timin (T), citozin (C) i uracil (U). Modifikovane nukleobaze uključuju i druge sintetičke i prirodne nukleobaze kao što su 5-metilcitozin (5-me-C), 5-hidroksimetil citozin, ksantin, hipoksantin, 2aminoadenin, 6-metil i drugi alkilni derivati adenina i gvanina, 2-propila i drugih alkila Derivati adenina i gvanina, 2-tiouracila, 2-tiotimina i 2-tiocitozina, 5-halouracila i citozina, 5-propinil (-C = C-CH3) uracila i citozina i drugih alkinilnih derivata pirimidinskih baza, 6-azo uracil, 8-tioalkil, 8-hidroksil i drugi 8-supstituisani adenini i gvanini, 5-halo, posebno 5-bromo, 5-trifluorometil i drugi 5-supstituisani uracili i citozini, 7-metilgvanin i 7-metilladenin, 2-F-adenin, 2-amino-adenin, 8-azaguanin i 8-azadenin, 7-deazagvanin i 7-deazadenin i 3-deazagvanin i 3-deazadenin. Dalje modifikovane nukleobaze uključuju triciklične pirimidine kao što su fenoksazin citidin (1H-pirimido (5,4-b) (1,4) benzoksazin-2 (3H)-on), fenotiazin citidin (1H-pirimido (5,4-b) 1,4-benzotiazin-2 (3H) -on), G-spone kao što je supstituisan fenoksazin citidin (npr. 9-(2-aminoetoksi)-H-pirimido (5,4-(b) (1,4)benzoksazin-2(3H)-on), karbazol citidin (2H-pirimido (4,5-b)indol-2-on), piridoindol citidin (H-pirido (3' ,2':4,5)3-d)pirimidin-2-on).
[0150] Heterociklični bazni ostaci takođe mogu uključivati one u kojima se baza purina ili pirimidina zamenjuje drugim heterociklima, za pr. 7-deaza-adenin, 7-deazagvanozin, 2-aminopiridin i 2-piridon. Dalje nukleobaze obuhvataju one koje su obelodanjene u U.S. Pat. No.
3,687,808, one koje su objavljene u The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages 858-859, Kroschwitz, J. I., ed. John Wiley & Sons, 1990, those disclosed by Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613,, i one koje su objavljene u SSanghvi, Y. S., Chapter 15, Antisense Research and Applications, pages 289-302, Crooke, S. T. and Lebleu, B., ed., CRC Press, 1993. Određene od ovih nukleobaza su korisne za povećanje vezivnog afiniteta oligomernog jedinjenja. Ovo uključuje 5-supstituisane pirimidine, 6-azapirimidine i supstituisane purine N-2, N-6 i O-6, uključujući 2-aminopropilladin, 5-propinilluracil i 5-propinilcitozin. Zaključci 5-metilcitozina pokazali su da povećavaju stabilnost dupleksa nukleinske kiseline za 0,6-1,2°C (Sanghvi et al., eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278) i su pogodne bazne zamene, npr. kada se kombinuju sa modifikacijama 2'-O-metoksietil šećera.
Konjugati
[051] Druga moguća modifikacija predmetne nukleinske kiseline uključuje hemijsko vezivanje na jedan polinukleotid jednog ili više ostataka ili konjugata koji povećavaju aktivnost, ćelijsku distribuciju ili ćelijsko uzimanje oligonukleotida. Ovi ostaci ili konjugati mogu uključiti konjugatne grupe kovalentno vezane za funkcionalne grupe kao što su primarne ili sekundarne hidroksilne grupe. Konjugatne grupe uključuju, ali se ne ograničavaju na, interkalatere, reporterske molekule, poliamine, poliamide, polietilen glikole, polietre, grupe koje poboljšavaju farmakodinamske osobine oligomera i grupe koje poboljšavaju farmakokinetičke osobine oligomera. Pogodne konjugatne grupe uključuju, ali se ne ograničavaju na, holesterole, lipide, fosfolipide, biotin, fenazin, folat, fenantridin, antrakinon, akridin, fluoresceine, rodamine, kumarine i boje. Grupe koje poboljšavaju farmakodinamička svojstva uključuju grupe koje poboljšavaju uzimanje, povećavaju otpornost na degradaciju i/ili ojačavaju hibridizaciju specifičnom sekvencom sa ciljanom nukleinskom kiselinom. Grupe koje poboljšavaju farmakokinetička svojstva uključuju grupe koje poboljšavaju upijanje, distribuciju, metabolizam ili izlučivanje predmetne nukleinske kiseline.
[0152] Konjugovani ostaci uključuju, ali nisu ograničeni na lipidne ostatke kao što su deo holesterola (Letsinger et al., proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6553-6556, holna kiselina (Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1994, 4, 1053-1060), tioetar, npr. heksil-S-tritiltiool (Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660, 306-309; manoharan et al., Bioorg. Med.
Chem. Let., 1993, 3, 2765-2770), tioholesterol (Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533-538), alifatski lanac, npr. dodecandiol ili undecil ostaci (Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10, 1111-1118; kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259, 327-330; svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75, 49-54), fosfolipid, npr. di-hekadecil-rac-glicerol ili trietilamonijum 1,2-di-O-hekadecil-rac-glicero-3-H-fosfonat (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654; shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777-3783), poliamin ili polietilenglikol lanac (Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969-973) ili adamantan sirćetna kiselina (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654), palmitalni deo (Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229-237), ili oktadecilamin ili heksilamino-karbonil-oksiholesterolni deo (Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277, 923-937).
[0153] Konjugat može uključivati „domen proteina za transdukciju“ ili PTD (takođe poznat kao CPP-penetracioni peptid), koji se može odnositi na polipeptid, polinukleotid, ugljeni hidrat ili organsko ili neorgansko jedinjenje koje olakšava prolaženje lipidnog dvosloja, micelije, ćelijske membrane, membrane organela ili membrane vezikula. PTD prikačen na drugi molekul, koji može da se kreće od malih polarnih molekula do velikog makromolekula i/ili nanopartila, olakšava molekulu koji prolazi kroz membranu, na primer, prelazak iz vanćelijskog prostora u unutarćelijski prostor ili citozola, unutar organele. U nekim otelotvorenjima, PTD je kovalentno povezan sa amino terminusom egzogenog polipeptida (npr., usmeren modifikacioni polipeptid). U nekim otelotvorenjima, PTD je kovalentno povezan sa karboksilnim terminusom egzogenog polipeptida (npr., usmeren modifikacioni polipeptid). U nekim otelotvorenjima, PTD je kovalentno povezan sa nukleinskom kiselinom (npr., RNK koja cilja DNK, polinukleotid koji kodira RNK koja cilja DNK, polinukleotid koji kodira usmeren modifikacioni polipeptid itd.). Primerni PTD obuhvataju ali nisu ograničeni na minimalni undekapeptidni proteinski transdukcioni domen (odgovara ostacima 47-57 HIV-1 TAT koji sadrže YGRKKRRQRRR; SEQ ID NO:264); poliargininsku sekvencu koja sadrži broj arginina koji su dovoljni da direktno ulaze u ćeliju (npr.3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili 10-50 arginina); domen VP22 (Zender et al. (2002) Cancer Gene Ther. 9(6):489-96); drosophila Antennapedia proteinski transdukcioni domen (Noguchi et al. (2003) Diabetes 52(7): 1732-1737); skraćeni ljudski kalcitonin peptid (Trehin et al. (2004) Pharm. Research 21:1248-1256); polilisin (Wender et al. (2000) Proc. Natal. Acad. Sci. USA 97:13003-13008); rRQRRTSKLMKR (SEQ ID NO:265); transportan GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL (SEQ ID NO:266); kALAWEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKCEA (SEQ ID NO:267); i RQIKIWFQNRRMKWKK (SEQ ID NO:268). Primerni PTD uključuju, ali nisu ograničeni na, YGRKKRRQRRR (SEQ ID NO:264), RKKRRQRRR (SEQ ID NO:269); argininski homopolimer od 3 argininska ostatka do 50 argininskih ostataka; primeri aminokiselinske sekvence PTD domena uključuju, ali nisu ograničeni na, bilo šta od sledećeg: YGRKKRRQRRR (SEQ ID NO:264); rKKRRQRR (SEQ ID NO:270); YARAAARQARA (SEQ ID NO:271); tHRLPRRRRRR (SEQ ID NO:272); i GGRRARRRRRR (SEQ ID NO:273). U nekim otelotvorenjima, PTD je aktivni CPP (ACPP) (Aguilera et al. (2009) Integr Biol (Camb) June; 1(5-6): 371-381). ACPPs obuhvataju polikatacionski CPP (npr., arg9 ili "R9") spojen preko razdvojenog veznika sa odgovarajućim polianionom (npr., glu9 ili "E9"), što smanjuje neto napon skoro do nule i time inhibira adheziju i upijanje u ćelije. Nakon cepanja veznika, polianion se oslobađa, lokalno demaskirajući poliarginin i njegovu inherentnu adhezivnost, čime se „aktivira“ ACPP da prođe membranu.
Primeri DNK koji ciljaju RNK
[0154] U nekim otelotvorenjima odgovarajuća RNK koja cilja DNK sadrži dva odvojena molekula polinukleotida RNK. Prvi od dva odvojena RNK polinukleotidna molekula (aktivator-RNK) sadrži nukleotidnu sekvencu koja ima najmanje oko 60%, najmanje oko 65%, najmanje oko 70%, najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 98%, najmanje oko 99%, ili 100% identičnosti nukleotidne sekvence preko dela od najmanje 8 susednih nukleotida sa bilo kojom od nukleotidnih sekvenci datih u SEQ ID NO: 431-562, ili njihovim suplementima. Drugi od dva odvojena RNK polinukleotidna molekula (targeter-RNK) sadrži nukleotidnu sekvencu koja ima najmanje oko 60%, najmanje oko 65%, najmanje oko 70%, najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 98%, najmanje oko 99%, ili 100% identičnosti nukleotidne sekvence preko dela od najmanje 8 susednih nukleotida a bilo kojom od nukleotidnih sekvenci datih u SEQ ID NOs: 563-679, ili njihovim suplementima.
[0155 U nekim otelotvorenjima, pogodna RNK koja cilja DNK je jedan RNK polinukleotid i sadrži prvu nukleotidnu sekvencu koja ima najmanje oko 60%, najmanje oko 65%, najmanje oko 70%, najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 98%, najmanje oko 99%, ili 100% identičnosti nukleotidne sekvence na delu od najmanje 8 susednih nukleotida sa bilo kojom od nukleotidnih sekvenci datih u SEQ ID NO: 431-562 i drugu nukleotidnu sekvencu koja ima najmanje oko 60%, najmanje oko 65%, najmanje oko 70%, najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 98%, najmanje oko 99%, ili 100% identičnosti nukleotidne sekvence preko jednog od najmanje 8 susednih nukleotida sa bilo kojom od nukleotidnih sekvenci datih u SEQ ID NO: 463-679.
[0156] U nekim otelotvorenjima RNK koja ciljaju DNK su dvomolekulske RNK koje ciljaju DNK, i RNK koja cilja sadrži sekvencu 5’GUUUUAGAGCUA-3’ (SEQ ID NO:679) povezanu na svom 5' kraju na deo nukleotida koji je komplementaran ciljanoj DNK. U nekim otelotvorenjima RNK koja ciljaju DNK su dvomolekulske RNK koje ciljaju DNK, i aktivator-RNK sadrži sekvencu 5’ UAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCG-3’ (SEQ ID NO://).
[0157] U nekim otelotvorenjima, RNK koja cilja DNK je jednomolekulska RNK koja cilja DNK i sadrži sekvencu 5’-GUUUUAGAGCUA-veznik-UAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCG-3’ povezanu na svom 5' kraju na deo nukleotida koji su komplementaran ciljanoj DNK (gde „veznik“ označava bilo koju vezujuću nukleotidnu sekvencu koja može da sadrži bilo koju nukleotidnu sekvencu) (SEQ ID NO://). Druge primerne jednomolekulske RNK koje ciljaju DNK uključuju one navedene u SEQ ID NO: 680-682.
Nukleinske kiseline koje kodiraju predmetnu RNK koja cilja DNK i/ili usmeren modifikacioni polipeptid
[0158] Ovo obelodanjenje pruža nukleinsku kiselinu koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira predmetnu RNK koja cilja DNK i/ili usmeren modifikacioni polipeptid. U nekim otelotvorenjima, predmetna RNK koja cilja DNK-kodirajuća nukleinska kiselina je vektor eksprimiranja, na primer, rekombinantni vektor eksprimiranja.
[0159] U nekim otelotvorenjima, predmetni postupak uključuje dovođenje u dodir ciljane DNK ili unošenje u ćeliju (ili populaciju ćelija) jedne ili više nukleinskih kiselina koje sadrže nukleotidne sekvence koje kodiraju RNK koja cilja DNK i/ili usmeren modifikacioni polipeptid. U nekim otelotvorenjima ćelija koja sadrži ciljanu DNK je in vitro. U nekim otelotvorenjima ćelija koja sadrži ciljanu DNK je in vivo. Pogodne nukleinske kiseline koje sadrže nukleotidne sekvence koje kodiraju RNK koja cilja DNK i/ili usmeren modifikacioni polipeptid uključuju vektore eksprimiranja, pri čemu je vektor eksprimiranja koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira RNK koja cilja DNK i/ili usmeren modifikacioni polipeptid „rekombinantni vektor eksprimiranja“.
[0160] U nekim otelotvorenjima, rekombinantni vektor eksprimiranja je virusni konstrukt, npr. rekombinantni adeno-povezani virusni konstrukt (pogledati, npr., U.S. Patent No. 7,078,387), rekombinantni adenovirusni konstrukt, rekombinantni lentivirusni konstrukt, rekombinantni retrovirusni konstrukt, Itd.
[0161] Pogodni vektori eksprimiranja uključuju, ali nisu ograničeni na, virusne vektore (npr. virusne vektore zasnovane na vaccinia virusu, poliovirusu, adenovirusu (pogledati, npr., Li et al., Invest Opthalmol Vis Sci 35:25432549, 1994; borras et al., Gene Ther 6:515524, 1999; Li and Davidson, PNAS 92:77007704, 1995; sakamoto et al., H Gene Ther 5:10881097, 1999; WO 94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 and WO 95/00655), adeno-povezanom virusu (pogledati, na primer, Ali et al., Hum Gene Ther 9:81 86, 1998, Flannery et al., PNAS 94:69166921, 1997; Bennett et al., Invest Opthalmol Vis Sci 38:2857 2863, 1997; Jomary et al., Gene Ther 4:683690, 1997, Rolling et al., Hum Gene Ther 10:641 648, 1999; Ali et al., Hum Mol Genet 5:591594, 1996; Srivastava u WO 93/09239, Samulski et al., J. Vir. (1989) 63:3822-3828; mendelson et al., Virol. (1988) 166:154-165; i Flotte et al., PNAS (1993) 90:10613-10617); sV40; herpes simpleks virusu, virusu ljudske imunodeficijencije (pogledati, npr., Miyoshi et al., PNAS 94:1031923, 1997; Takahashi et al., J Virol 73:78127816, 1999); retrovirusnom vektoru (npr. virus mišje leukemije, virus nekroze slezine i vektori izvedeni iz retrovirusa kao što su Rous Sarcoma virus Harvey Sarcoma virus, virus ptičje leukoze, lentivirus, virus ljudske imunodeficijencije, virus mijeloproliferativnog sarkoma i virus tumora dojke); i slično.
[0162] Brojni pogodni vektori eksprimiranja poznati su stručnjacima u oblasti i mnogi su komercijalno dostupni. Sledeći vektori su dati primerom; Za eukariotske ćelije domaćina: pXT1, pSG5 (Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG i pSVLSV40 (Pharmacia). Međutim, bilo koji drugi vektor može se koristiti sve dok je kompatibilan sa ćelijom domaćina.
[0163] U zavisnosti od korišćenog sistema domaćina/vektora, u vektoru eksprimiranja može se koristiti bilo koji od odgovarajućih elemenata za kontrolu transkripcije i translacije, uključujući konstitutivne i inducibilne promotere, elemente poboljšanja transkripcije, terminatore transkripcije itd. (pogledati npr. Bitter et al. (1987) Methods in Enzymodogy, 153:516-544).
[0164] U nekim otelotvorenjima, nukleotidna sekvenca koja kodira RNK koja cilja DNK i/ili usmeren modifikacioni polipeptid operativno je povezana sa kontrolnim elementom, na primer, kontrolnim elementom transkripcije, kao što je promoter. Element kontrole transkripcije može biti funkcionalan u eukariotskoj ćeliji, npr. ćelije sisara; ili prokariotskoj ćeliji (npr., bakterijske ili arhealne ćelije). U nekim otelotvorenjima, nukleotidna sekvenca koja kodira RNK koja cilja DNK i/ili usmeren modifikacioni polipeptid operativno je povezana sa više kontrolnih elemenata koji omogućavaju eksprimiranje nukleotidne sekvence koja kodira RNK koja cilja DNK i/ili usmeren modifikacioni polipeptid u prokariontskim i eukariotskim ćelijama.
[0165] Neograničavajući primeri pogodnih eukariotskih promotera (promoteri funkcionalni u eukariotskoj ćeliji) uključuju one iz neposrednog ranog citomegalovirusa (CMV), timidin kinaze herpes simpleks virusa (HSV), ranog i kasnog SV40, duga terminalna ponavljanja (LTR) od retrovirusa i mišji metalotionein-I. Odabir odgovarajućeg vektora i promotera je u nivou prosečne veštine u struci. Vektor eksprimiranja može takođe sadržati mesto vezivanja ribozoma za inicijaciju translacije i terminaciju transkripcije. Vektor eksprimiranja može takođe uključiti odgovarajuće sekvence za amplifikaciju eksprimiranja. Vektor eksprimiranja može takođe uključiti nukleotidne sekvence koje kodiraju obeležja proteina (npr., 6xHis obeležje, hemaglutinin obeležje, zeleni fluorescentni protein itd.) koji su spojeni sa usmerenim modifikacionim polipeptidom, čime se dobija himerni polipeptid.
[0166] U nekim otelotvorenjima, nukleotidna sekvenca koja kodira RNK koja cilja DNK i/ili usmeren modifikacioni polipeptid, operativno je povezana sa inducibilnim promoterom. U nekim otelotvorenjima, nukleotidna sekvenca koja kodira RNK koja cilja DNK i/ili usmeren modifikacioni polipeptid, operativno je povezana sa konstitutivnim promoterom.
[0167] Postupci uvođenja nukleinske kiseline u ćeliju domaćina su poznati u struci, i svaki poznata postupak može se koristiti za uvođenje nukleinske kiseline (npr., konstrukt eksprimiranja) u ćeliju. Pogodni postupci uključuju npr. virusnu ili bakteriofagnu infekciju, transfekciju, konjugaciju, protoplastnu fuziju, lipofekciju, elektroporaciju, precipitaciju kalcijum fosfata, transfekciju sa polietileniminom (PEI), transfekciju posredovanu DEAE-dekstranom, transfekciju posredovanu lipozomom, tehnoloziju čestica pištoljem, precipitiaciju kalcijum fosfata, direktnu mikro injekciju, isporuku nukleinskih kiselina posredovanih nanočesticama (pogledati, npr., panyam et., al Adv Drug Deliv Rev. 2012 Sep 13. pii: 50169-409X(12)00283-9. doi: 10.1016/j.addr.2012.09.023) i slično.
HIMERICNI POLIPEPTIDI
[0168] Ovde je opisan himerni usmeren modifikacioni polipeptid. Predmetni himerni usmeren modifikacioni polipeptid interakuje sa (npr., vezuje se za) predmetnu RNK koja cilja DNK (opisana gore). RNK koja cilja DNK usmerava himerni usmeren modifikacioni polipeptid na ciljanu sekvencu unutar ciljane DNK (npr. hromozomska sekvenca ili ekstrahromozomska sekvenca, npr. epizodna sekvenca, minijaskularna sekvenca, mitohondrijalna sekvenca, hloroplastna sekvenca itd.). Himerni usmeren modifikacioni polipeptid modifikuje ciljanu DNK (npr., Cepanje ili metilovanje ciljane DNK) i/ili polipeptid povezan sa ciljanom DNK (npr., metilovanje ili acetilovanje histonskog repa).
[0169] Himerni usmeren modifikacioni polipeptid modifikuje ciljanu DNK (npr., Cepanje ili metilaciju ciljane DNK) i/ili polipeptid povezan sa ciljanom DNK (npr., metilovanje ili acetilovanje histonskog repa). Himerni usmeren modifikacioni polipeptid ovde se ovde naziva kao „himerni usmeren polipeptid“ ili „himerni RNK vezujući usmeren modifikacioni polipeptid“.
[0170] Himerni usmeren modifikacioni polipeptid sadrži dva dela, deo koji se vezuje za RNK i deo aktivnosti. Himerni usmeren modifikacioni polipeptid sadrži aminokiselinske sekvence koje su izvedene iz najmanje dva različita polipeptida. Himerni usmeren modifikacioni polipeptid može da sadrži modifikovane i/ili prirodno prisutne polipeptidne sekvence (npr., prvu aminokiselinsku sekvencu modifikovanog ili nemodifikovanog Cas9/Csn1 proteina i drugu aminokiselinsku sekvencu koja nije Cas9/Csn1 protein).
RNK-vezujući deo
[0171] U nekim slučajevima, RNK-vezujući deo himernog usmerenog modifikacionog polipeptida je prirodni polipeptid. U drugim slučajevima, RNK-vezujući deo himernog usmerenog modifikacionog polipeptida nije prirodno molekul (modifikovan, npr., mutacija, brisanje, umetanje). Prirodno-prisutni RNK-vezujući delovi od interesa su izvedeni iz usmerenih modifikacionih polipeptida poznatih u struci. Na primer, SEQ ID NOs: 1-256 i 795-1346 pružaju neograničavajuću prirodnih Cas9/Csn1 endonukleaza koje mogu biti korišćene kao usmeren modifikacioni polipeptid. U nekim slučajevima, deo za vezivanje RNK himernog usmerenog modifikacionog polipeptida sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 98%, najmanje oko 99% ili 100% identičnosti aminokiseline prema RNK vezujućem delu polipeptida koji ima bilo koju od sekvenci aminokiselina datih kao SEQ ID NOs: 1-256 i 795-1346).
[0172] U nekim slučajevima, usmeren modifikacioni polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, kod Najmanje 99% ili 100% identičnosti aminokiselinske sekvence sa aminokiselinama 7-166 ili 731-1003 aminokiselinske sekvence Cas9/Csn1 prikazane na Slici 3, ili odgovarajućim delovima u bilo kojoj od sekvenci aminokiselina datih u SEQ ID NO: 1-256 i 795-1346.
Deo aktivnosti
[0173] Pored RNK-vezujućeg dela, himerni usmeren modifikacioni polipeptid sadrži „deo aktivnosti“. U nekim otelotvorenjima, deo aktivnosti himernog usmerenog modifikacionog polipeptida sadrži prirodni deo aktivnosti usmerenog modifikacionog polipeptida (npr., Cas9/Csn1 endonukleazu). U drugim otelotvorenjima, deo aktivnosti himernog usmerenog modifikacionog polipeptida obuhvata modifikovanu sekvencu aminokiselina (npr. supstituciju, deleciju, umetanje) prirodnog dela aktivnosti usmerenog modifikacionog polipeptida. Delovi od interesa koji se najčešće javljaju u prirodi potiču iz usmerenih modifikacionih polipeptida poznatih u ovoj oblasti. Na primer, SEQ ID NOs: 1-256 i 795-1346 pružaju neograničavajuću listu prirodnih slučajeva Cas9/Csn1 endonukleaze koje se mogu koristiti kao usmeren modifikacioni polipeptid. Deo aktivnosti himernog usmerenog modifikacionog polipeptida je varijabilan i može sadržati bilo koju heterolognu polipeptidnu sekvencu koja može biti korisna u postupcima koji su ovde obelodanjeni.
[0174] U nekim otelotvorenjima, himerni usmeren modifikacioni polipeptid se sastoji od: (i) RNK-vezujućeg dela koji interakuje sa RNK koja cilja DNK, pri čemu RNK koja cilja DNK sadrži nukleotidnu sekvencu koja je komplementarna sekvenci u ciljanoj DNK; i (ii) deo aktivnosti koji pokazuje usmerenu enzimsku aktivnost (npr. aktivnost za metilaciju DNK, aktivnost za cepanje DNK, aktivnost za acetonilaciju histona, aktivnost za histil metilaciju itd.), pri čemu je mesto enzimske aktivnosti određeno pomoću RNK koja cilja DNK.
[0175] U drugim otelotvorenjima, himerni usmeren modifikacioni polipeptid sadrži: (i) RNK-vezujućeg dela koji interakuje sa RNK koja cilja DNK, pri čemu RNK koja cilja DNK sadrži nukleotidnu sekvencu koja je komplementarna sekvenci u ciljanoj DNK; i (ii) deo aktivnosti koji modulira transkripciju unutar ciljane DNK (npr., povećava ili smanjuje transkripciju), pri čemu je mesto modulirane transkripcije unutar ciljane DNK određeno pomoću RNK koja cilja DNK.
[0176] U nekim slučajevima, deo aktivnosti himernog usmerenog modifikacionog polipeptida ima enzimsku aktivnost koja modifikuje ciljanu DNK (npr. aktivnost nukleaze, aktivnost metiltransferaze, aktivnost demetilaze, aktivnost DNK popravke, aktivnost DNK oštećenja, aktivnost deaminacije, aktivnost dismutaze, aktivnost alkilacije, aktivnost depurinacije, aktivnost oksidacije, formiranje pirimidin dimera, aktivnost integraze, aktivnost transpozaze, aktivnost rekombinaze, aktivnost polimeraze, aktivnost ligaze, aktivnost helikase, aktivnost fotoliaze ili glikozilazna aktivnost).
[0177] U drugim slučajevima, deo aktivnosti himernog usmerenog modifikacionog polipeptida ima enzimsku aktivnost (npr. aktivnost metiltransferaze, aktivnost demetilaze, aktivnost acetiltransferaze, aktivnost deacetilaze, aktivnost kinaze, aktivnost fosfataze, aktivnost ubikuitin ligaze, aktivnost deubikiniziranja, adenilacija Aktivnost, aktivnost umirenja, aktivnost SUMOilacije, aktivnost deSUMOilacije, aktivnost ribozilacije, aktivnost deribozilacije, aktivnost miristoilacije ili demirristoilacijska aktivnost) koja modifikuje polipeptid povezan sa ciljanom DNK (npr. histonom).
[0178] U nekim slučajevima, deo aktivnosti himernog usmerenog modifikacionog polipeptid pokazuje enzimsku aktivnost (opisano gore). U drugim slučajevima, deo aktivnosti predmetnog himernog usmerenog modifikacionog polipeptid modulira transkripciju ciljane DNK (opisano iznad). Deo aktivnosti himernog usmerenog modifikacionog polipeptid je varijabilan i može sadržati bilo koju heterolognu polipeptidnu sekvencu koja može biti korisna u postupcima koji su ovde obelodanjeni.
Primeri himerni usmereni modifikacioni polipeptidi
[0179] U nekim otelotvorenjima, deo aktivnosti himernog usmerenog modifikacionog polipeptida sadrži modifikovan oblik Cas9/Csn1 proteina. U nekim slučajevima modifikovani oblik Cas9/Csn1 proteina sadrži promenu aminokiseline (npr. brisanje, umetanje ili supstituciju) što smanjuje prirodnu pojavu aktivnosti nukleaze Cas9/Csn1 proteina. Na primer, u nekim slučajevima modifikovani oblik Cas9/Csn1 proteina ima manje od 50%, manje od 40%, manje od 30%, manje od 20%, manje od 10%, manje od 5% ili manje od 1% aktivnosti nukleaze odgovarajućeg polipeptida Cas9/Csn1 divljeg tipa. U nekim slučajevima, modifikovani oblik polipeptida Cas9/Csn1 nema značajnu aktivnost nukleaze.
[0180] U nekim otelotvorenjima modifikovan oblik polipeptida Cas9/Csn1 je D10A (aspartat za alanin na poziciji aminokiseline 10 od SEQ ID NO: 8) mutacije (ili odgovarajuća mutacija bilo kog proteina predstavljenog u SEQ ID NO: 1-256 i 795-1346) koji može da razdvoji komplementarnu vezu ciljane DNK, ali ima smanjenu sposobnost da uklanja nekomplementarni deo ciljane DNK (pogledati Sliku 11). U nekim otelotvorenjima modifikovan oblik polipeptida Cas9/Csn1 je mutacija H840A (histidin za alanin na poziciji aminokiseline 840) (ili odgovarajuća mutacija bilo kog proteina koji su navedeni kao SEQ ID NOs: 1-256 i 795- 1346) koji može da razdvoji nekomplementarnu vezu ciljane DNK, ali ima smanjenu sposobnost da se razdvoji komplementarnu vezu ciljane DNK (pogledati Sliku 11). U nekim otelotvorenjima modifikovani oblik polipeptida Cas9/Csn1 ima i D10A i H840A mutacije (ili odgovarajuće mutacije bilo kog proteina koji su navedeni kao SEQ ID NOs: 1-256 i 795-1346), tako da polipeptid ima smanjenu sposobnost uklanjanja i komplementarnih i nekomplementarnih ćelija ciljane DNK. Ostali ostaci mogu biti mutirani kako bi se postigli gornji efekti (tj. inaktivirati jedan ili drugi deo nukleaze). Kao neograničavajući primeri, ostaci D10, G12, G17, E762, H840, N854, N863, H982, H983, A984, D986 i/ili A987 (ili odgovarajuće mutacije bilo kog proteina koji su dati kao SEQ ID NOs: 1-256 i 795-1346) mogu se izmeniti (tj. supstituisati) (pogledati Sliku 3, Sliku 5, Sliku 11A i Tabelu 1 za više informacija o očuvanju ostataka aminokiselina Cas9). Takođe, pogodne su mutacije koje nisu alaninske supstitucije. Za više informacija od značaja videti Tabelu 1. Tabela 1 navodi 4 motiva koji su prisutni u Cas9 sekvencama iz različitih vrsta (pogledati takođe Sliku 3 i Sliku 5). Ovde navedene aminokiseline su iz Cas9 iz S. pyogenes (SEQ ID NO: 8).
Tabela 1. Tabela 1 navodi 4 motiva koji su prisutni u Cas9 sekvencama iz različitih vrsta (vidi takođe Slika 3 i Slika 5). Aminokiseline koje su ovde navedene su od Cas9 iz S. piogenes (SEK ID
NO: 8).
[081] U nekim slučajevima, himerni usmeren modifikacioni polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 99% ili 100% identičnosti aminokiselinske sekvence sa aminokiselinama 7-166 ili 731-1003 iz Cas9/Csn1 aminokiselinske sekvence prikazane na Slici 3, ili odgovarajućim delovima u bilo kojoj od sekvenci aminokiselina datih kao SEQ ID NOs: 1-256 i 795-1346. U nekim slučajevima, himerni usmeren modifikacioni polipeptid sadrži 4 motiva (kako je navedeno u Tabeli 4 i prikazano na Slici 3A i Slici 5), svaki sa sekvencama aminokiselina koje imaju najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 99% ili 100% identičnosti aminokiselinske sekvence prema svakom od 4 motiva navedena u Tabeli 1 (SEQ ID NO: 260-263), ili odgovarajućim delovi u bilo kojoj od sekvenci aminokiselina koji su navedeni kao SEQ ID NO: 1-256 i 795-1346. U nekim slučajevima, himerni usmeren modifikacioni polipeptid sadrži aminokiselinske sekvence sa najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 99% % ili 100% identičnosti aminokiselinske sekvence sa aminokiselinama 7-166 ili 731-1003 aminokiselinskom sekvencom Cas9/Csn1 prikazanom na Slici 3, ili odgovarajućim delovima bilo koje od sekvenci aminokiselina datih kao SEQ ID NOs: 1-256 i 795-1346.
[0182] U nekim otelotvorenjima deo aktivnosti usmerenog modifikacionog polipeptida sadrži heterologni polipeptid koji ima aktivnost aktivacije DNK-a i/ili aktivnost transkripcionog faktora i/ili DNP-povezanu polipeptid-modifikujuću aktivnost. U nekim slučajevima, heterologni polipeptid zamenjuje deo polipeptida Cas9/Csn1 koji pruža aktivnost nukleaze. U drugim otelotvorenjima, usmeren modifikacioni polipeptid sadrži i deo polipeptida Cas9/Csn1 koji normalno pruža aktivnost nukleaze (i taj deo može biti potpuno aktivan ili se može umesto toga modifikovati tako da ima manje od 100% odgovarajuće aktivnost divljeg tipa) i heterologni polipeptid. Drugim rečima, u nekim slučajevima, himerni usmeren modifikacioni polipeptid je fuzioni polipeptid koji sadrži i deo polipeptida Cas9/Csn1 koji normalno pruža aktivnost nukleaze i heterologni polipeptid. U drugim slučajevima, himerni usmeren modifikacioni polipeptid je fuzioni polipeptid koji sadrži modifikovanu varijantu dela aktivnosti polipeptida Cas9/Csn1 (npr. promene aminokiselina, brisanje, umetanje) i heterologni polipeptida. U još nekim slučajevima, himerni usmeren modifikacioni polipeptid je fuzioni polipeptid koji sadrži heterologni polipeptid i deo koji se vezuje za RNK prirodnog ili modifikovanog usmerenog modifikacionog polipeptida.
[0183] Na primer, u himernom Cas9/Csn1 proteinu, prirodni (ili modifikovan, npr mutacija, brisanje, umetanje) bakterijski Cas9/Csn1 polipeptid može se fuzionisati na heterolognu polipeptidnu sekvencu (tj. polipeptidnu sekvencu iz proteina koji nije Cas9/Csn1 ili polipeptidnu sekvencu iz drugog organizma). Heterologna polipeptidna sekvenca može pokazati aktivnost (npr., enzimsku aktivnost) koja će takođe biti iskazana od strane himernog Cas9/Csn1 proteina (npr. aktivnost metiltransferaze, aktivnost acetil-transferaze, aktivnost kinaze, aktivnost ubikitinacije i sl.). Heterologna sekvenca nukleinske kiseline može biti povezana sa drugom sekvencom nukleinske kiseline (npr., genetskim inženjeringom) kako bi se generisala himerna nukleotidna sekvenca koja kodira himerni polipeptid. U nekim otelotvorenjima, himerni Cas9/Csn1 polipeptid generiše se fuzijom CasP/Csn1 polipeptida (npr. divlji tip Cas9 ili varijanta Cas9, npr. Cas9 sa smanjenom ili inaktiviranom aktivacijom nukleaze) sa heterolognom sekvencom koja pruža subćelijsku lokalizaciju (npr. signal nuklearne lokalizacije (NLS) za ciljanje na jezgro, signal mitohondrijske lokalizacije za ciljanje na mitohondrije, signal lokalizacije hloroplasta za ciljanje na hloroplast, ER retencijski signal i slično). U nekim otelotvorenjima heterologna sekvenca može da pruži obeležje za lako praćenje ili prečišćavanje (npr. fluorescentni protein, na primer, zeleni fluorescentni protein (GFP), IFP, RFP, CFP, mCherry, tdTomato i slično; HIS obeležje npr. 6XSHis obeležje, hemaglutinin (HA) obeležje, FLAG obeležje, Myc obeležje i slično). U nekim otelotvorenjima heterologna sekvenca može obezbediti povećanu ili smanjenu stabilnost. U nekim otelotvorenjima heterologna sekvenca može da obezbedi vezujući domen (npr. da bi se obezbedila sposobnost himernog Cas9 polipeptida da se vezuje na drugi protein koji je od interesa, npr. protein koja modifikuje DNK ili histon, faktor transkripcije ili represor transkripcije, regrutujući protein itd.).
[0243] Primeri različitih dodatnih pogodnih fuzionih partnera (ili njihovih fragmenata) za predmetnu varijantu Cas9 usmerenog polipeptida uključuju, ali se ne ograničavaju na one navedene na Slici 54.
Nukleinska kiselina koja kodira himerni usmeren modifikacioni polipeptid
[0185] Ovde je opisana nukleinska kiselina koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira predmetni himerni usmeren modifikacioni polipeptid. U nekim otelotvorenjima, nukleinska kiselina koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira himerni usmeren modifikacioni polipeptid je vektor eksprimiranja, na primer, rekombinantni vektor eksprimiranja.
[0186] U nekim otelotvorenjima, postupak uključuje dovođenje u dodir ciljane DNK ili unošenje u ćeliju (ili populaciju ćelija) jedne ili više nukleinskih kiselina koji sadrže himerni usmeren modifikacioni polipeptid. Pogodne nukleinske kiseline koje sadrže nukleotidne sekvence koje kodiraju himerni usmeren modifikacioni polipeptid uključuju vektore eksprimiranja, pri čemu je vektor eksprimiranja koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira himerni usmeren modifikacioni polipeptid „rekombinantni vektor eksprimiranja“.
[0187] U nekim otelotvorenjima, rekombinantni vektor eksprimiranja je virusni konstrukt, na primer, rekombinantni adeno-povezani virusni konstrukt (pogledati, npr., patent No.7,078,387), rekombinantni adenovirusni konstrukt, rekombinantni lentivirusni konstrukt itd.
[0188] Pogodni vektori eksprimiranja uključuju, ali nisu ograničeni na, virusne vektore (npr. virusne vektore zasnovane na vaccinia virusu, poliovirusu, adenovirusu (pogledati, npr., Li et al., Invest Opthalmol Vis Sci 35:25432549, 1994; borras et al., Gene Ther 6:515524, 1999; Li and Davidson, PNAS 92:77007704, 1995; sakamoto et al., H Gene Ther 5:10881097, 1999; WO 94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 and WO 95/00655), adeno-povezanom virusu (pogledati, na primer, Ali et al., Hum Gene Ther 9:81 86, 1998, Flannery et al., PNAS 94:69166921, 1997; Bennett et al., Invest Opthalmol Vis Sci 38:2857 2863, 1997; Jomary et al., Gene Ther 4:683690, 1997, Rolling et al., Hum Gene Ther 10:641 648, 1999; Ali et al., Hum Mol Genet 5:591594, 1996; srivastava in WO 93/09239, Samulski et al., J. Vir. (1989) 63:3822-3828; mendelson et al., Virol. (1988) 166:154-165; i Flotte et al., PNAS (1993) 90:10613-10617); sV40; herpes simpleks virusu, virusu ljudske imunodeficijencije (pogledati, npr., Miyoshi et al., PNAS 94:1031923, 1997; Takahashi et al., J Virol 73:78127816, 1999); retrovirusnom vektoru (npr. virus mišje leukemije, virus nekroze slezine i vektori izvedeni iz retrovirusa kao što su Rous Sarcoma virus Harvey Sarcoma virus, virus ptičje leukoze, lentivirus, virus ljudske imunodeficijencije, virus mijeloproliferativnog sarkoma i virus tumora dojke); i slično.
[0189] Brojni pogodni vektori eksprimiranja poznati su stručnjacima u oblasti i mnogi su komercijalno dostupni. Sledeći vektori su dati primerom; Za eukariotske ćelije domaćina: pXT1, pSG5 (Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG i pSVLSV40 (Pharmacia). Međutim, bilo koji drugi vektor može se koristiti sve dok je kompatibilan sa ćelijom domaćina.
[0190] U zavisnosti od korišćenog sistema domaćina/vektora, u vektoru eksprimiranja može se koristiti bilo koji od odgovarajućih elemenata za kontrolu transkripcije i translacije, uključujući konstitutivne i inducibilne promotere, elemente poboljšanja transkripcije, terminatore transkripcije itd. (pogledati npr. Bitter et al. (1987) Methods in Enzymodogy, 153:516-544).
[0191] U nekim otelotvorenjima, nukleotidna sekvenca koja kodira RNK koja cilja DNK i/ili usmeren modifikacioni polipeptid operativno je povezana sa kontrolnim elementom, na primer, kontrolnim elementom transkripcije, kao što je promoter. Element kontrole transkripcije može biti funkcionalan u eukariotskoj ćeliji, npr. ćelije sisara; ili prokariotskoj ćeliji (npr., bakterijske ili arhealne ćelije). U nekim otelotvorenjima, nukleotidna sekvenca koja kodira RNK koja cilja DNK i/ili usmeren modifikacioni polipeptid operativno je povezana sa više kontrolnih elemenata koji omogućavaju eksprimiranje nukleotidne sekvence koja kodira RNK koja cilja DNK i/ili usmeren modifikacioni polipeptid u prokariotskim i eukariotskim ćelijama.
[0192] Neograničavajući primeri pogodnih eukariotskih promotera (promoteri funkcionalni u eukariotskoj ćeliji) uključuju one iz neposrednog ranog citomegalovirusa (CMV), timidin kinaze herpes simpleks virusa (HSV), ranog i kasnog SV40, duga terminalna ponavljanja (LTR) od retrovirusa i mišji metalotionein-I. Odabir odgovarajućeg vektora i promotera je u nivou prosečne veštine u struci. Vektor eksprimiranja može takođe sadržati mesto vezivanja ribozoma za inicijaciju translacije i terminaciju transkripcije. Vektor eksprimiranja može takođe uključiti odgovarajuće sekvence za amplifikaciju eksprimiranja. Vektor eksprimiranja može takođe uključiti nukleotidne sekvence koje kodiraju obeležja proteina (npr., 6xHis obeležje, hemaglutinin obeležje, zeleni fluorescentni protein itd.) koji su spojeni sa usmerenim modifikacionim polipeptidom, čime se dobija himerni polipeptid.
[0193] U nekim otelotvorenjima, nukleotidna sekvenca koja kodira RNK koja cilja DNK i/ili usmeren modifikacioni polipeptid, operativno je povezana sa inducibilnim promoterom. U nekim otelotvorenjima, nukleotidna sekvenca koja kodira RNK koja cilja DNK i/ili usmeren modifikacioni polipeptid, operativno je povezana sa konstitutivnim promoterom.
[0194] Postupci uvođenja nukleinske kiseline u ćeliju domaćina su poznati u struci, i svaki poznata postupak može se koristiti za uvođenje nukleinske kiseline (npr., konstrukt eksprimiranja) u ćeliju. Pogodni postupci uključuju npr. virusnu ili bakteriofagnu infekciju, transfekciju, konjugaciju, protoplastnu fuziju, lipofekciju, elektroporaciju, precipitaciju kalcijum fosfata, transfekciju sa polietileniminom (PEI), transfekciju posredovanu DEAE-dekstranom, transfekciju posredovanu lipozomom, tehnoloziju čestica pištoljem, precipitiaciju kalcijum fosfata, direktnu mikro injekciju, isporuku nukleinskih kiselina posredovanih nanočesticama (pogledati, npr., panyam et., al Adv Drug Deliv Rev. 2012 Sep 13. pii: 50169-409X(12)00283-9. doi: 10.1016/j.addr.2012.09.023) i slično.
METODE
[0195] Ovo obelodanjenje pruža postupke za modifikovanje ciljane DNK i/ili polipeptida povezanog sa ciljanom DNK. Uopšteno govoreći, predmetni postupak uključuje dovođenje u dodir ciljane DNK sa kompleksom („kompleks za ciljanje“), gde kompleks sadrži RNK koja cilja DNK i usmeren modifikacioni polipeptid.
[0196] Kao što je prethodno razmatrano, predmetna RNK koja cilja DNK i usmeren modifikacioni polipeptid, formiraju kompleks. RNK koja cilja DNK daje specifičnost ciljanja na kompleks tako što sadrži nukleotidnu sekvencu koja je komplementarna sekvenci ciljane DNK. Usmeren modifikacioni polipeptid kompleksa pruža aktivnost specifičnu za lokaciju. U nekim otelotvorenjima predmetni kompleksa modifikuje ciljanu DNK, što dovodi do, na primer, odvajanja DNK, DNK metilacije, oštećenja DNK, popravke DNK itd. U drugim otelotvorenjima, predmetni kompleksa modifikuje ciljani polipeptid povezan sa ciljanom DNK (npr. histon, DNK vezujući protein, itd.), što dovodi do, na primer, metilizacije histona, acetonizacije histona, ubikitinacije histona i slično. ciljana DNK može biti, na primer, gola DNK in vitro, hromozomna DNK u ćelijama in vitro, hromozomna DNK u ćelijama in vivo itd.
[0197] U nekim slučajevima, usmeren modifikacioni polipeptid, pokazuje aktivnost nukleaze koja razdvaja ciljanu DNK u ciljanoj DNK sekvenci definisanoj regijom komplementarnosti između RNK koja cilja DNK i ciljane DNK. U nekim slučajevima, kada je usmeren modifikacioni polipeptid polipeptid povezan sa CasP ili Cas9, razdvajanje specifične lokacije na ciljanoj DNK se javlja na mestoma određenim sa (i) komplementarnosti baznog uparivanja između RNK koja cilja DNK i ciljane DNK; i (ii) kratkim motivom [nazvan protospacer susedni motiv (PAM)] u ciljanoj DNK. U nekim otelotvorenjima (npr. kada se koristi Cas9 iz S. pyogenes ili usko povezanog Cas9 (pogledati SEQ ID NO: 1-256 i 795-1346)), PAM sekvenca nekomplementarne linije je 5'- XGG-3' , gde je X bilo koji nukleotid DNK i X je odmah 3' ciljane sekvence nekomplementarne linije ciljane DNK (pogledati Sliku 10). Kao takva, PAM sekvenca komplementarne linije je 5'-CCY-3', gde je Y bilo koji nukleotid DNK, i Y je odmah 5' ciljane sekvence komplementarne linije ciljane DNK (pogledati Sliku 10 gde je PAM nekomplementarne linije 5'-GGG-3' , a PAM komplementarne linije je 5'-CCC-3'). U nekim takvim otelotvorenjima, X i Y mogu biti komplementarni, i X-Y bazni par može biti bilo koji bazni par (npr. X = C i Y = G; X = G i Y = C; X = A i Y = T, X = T i Y = A).
[0198] U nekim slučajevima, različiti Cas9 proteini (tj. Cas9 proteini iz različitih vrsta) mogu biti korisni u različitim predloženim postupcima kako bi se kapitalizovalo na različitim enzimskim karakteristikama različitih Cas9 proteina (npr. za različite preferencije PAM sekvence za povećanje ili smanjenje enzimske aktivnosti, za povećanje ili smanjenje nivoa toksičnosti ćelije, promenu ravnoteže između NHEJ, popravke usmerene homologijom, jednostrukim prekidima, dvostrukim prekidima, itd.). Cas9 proteini različitih vrsta (pogledati SEQ ID NOs: 1-256 i 795-1346) mogu zahtevati različite PAM sekvence u ciljanoj DNK. Prema tome, za određeni odabir Cas9 proteina, potreba PAM sekvence može biti različita od sekvence 5'-XGG-3' opisane gore.
[0199] Mnogi Cas9 ortolozi iz širokog spektra vrsta su ovde identifikovani i proteini dele samo nekoliko identičnih aminokiselina. Svi identifikovani Cas9 ortolozi imaju istu arhitekturu domena sa centralnim domenom HNH endonukleaze i podeljenim RuvC/RNKazaH domenom (pogledati Slike 3A, 3B, Sliku 5 i Tabelu 1). Cas9 proteini dele 4 ključna motiva sa očuvanom arhitekturom. Motivi 1, 2 i 4 su motivi RuvC, dok je motiv 3 HNH-motiv. U nekim slučajevima, odgovarajući usmeren modifikacioni polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima 4 motiva, svaki od motiva 1-4 ima najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 99% ili 100% identičnosti aminokiselinske sekvence sa motivom 1-4 aminokiselinske sekvence Cas9/Csn1 prikazane na Slici 3A (SEQ ID NO: 260-263, respektivno opisani u Tabeli 1), ili odgovarajućim delovima bilo koje od aminokiselinskih sekvenca datih u SEQ ID NO: 1-256 i 795-1346 (pogledati Sliku 5 za poravnanje motiva 1-4 iz divergentnih Cas9 sekvenci). U nekim slučajevima, pogodan usmeren modifikacioni polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 99% ili 100% identiteta aminokiselinske sekvence sa aminokiselinama 7-166 ili 731-1003 sekvence aminokiselina Cas9/Csn1 prikazane na Slici 3, ili odgovarajućim delovima u bilo kojoj od aminokiselinskih sekvenci datih kao SEQ ID NOs : 1-256 i 795-1346. Bilo koji Cas9 protein, kao što je prethodno definisano, može se koristiti kao usmeren modifikacioni polipeptid, ili kao deo himernog usmerenog modifikacionog polipeptida za predmetne postupke.
[0200] Aktivnost nukleaze cepa ciljanu DNK da stvori dvostruke prekide. Ove prekide tada popravlja ćelija na jedan od dva načina: ne-homologno spajanje krajeva, i popravka usmerena homologijom (Slika 2). U spajanje nehomogenih krajeva (NHEJ), dvostruki prekidi se popravljaju direktnim ligiranjem krajeva preloma jednih sa drugima. U tom slučaju, na mesto nije umetnut nikakav novi materijal nukleinske kiseline, iako se neki materijali nukleinske kiseline mogu izgubiti, što rezultira brisanjem. U popravci usmerenoj homologijom, donor polinukleotid sa homologijom za određenu ciljanu DNK sekvencu koristi se kao šablon za popravku iscepane ciljane DNK sekvence, što rezultira prenošenjem genetskih informacija od donorskog polinukleotida do ciljane DNK. Kao takav, novi materijal nukleinske kiseline može biti ubačen/kopiran na mesto. U nekim slučajevima, ciljana DNK je dovedena u dodir sa predmetnim donorm polinukleotidom. U nekim slučajevima, predmetni donor polinukleotid se unosi u predmetnu ćeliju. Modifikacije ciljane DNK usled NHEJ i/ili popravke usmerene homologijom dovode do, na primer, korekcije gena, zamene gena, obeležavanja gena, umetanja transgena, brisanja nukleotida, poremećaja gena, mutacije gena itd.
[0201] Shodno tome, odvajanje DNK od strane usmerenog modifikacionog polipeptida može se koristiti za uklanjanje materijala nukleinske kiseline iz ciljane DNK sekvence (npr. za poremećaj gena koji čini ćelije podložne infekciji (npr. CCR5 ili CXCR4 gen, koji Čini T ćelije podložnim HIV infekciji), uklanjanje trinukleotidnih ponavljanja sekvenci u neuronima koje uzrokuju bolesti, stvaranje genskih izbacivanja i mutacija kao modela bolesti u istraživanjima itd.) cepanjem ciljane DNK sekvence i omogućavanjem ćeliji da popravi sekvencu u odsustvu egzogeno datog polinukleotida donora. Prema tome, predmetni postupak se može koristiti za izbacivanje gena (što rezultira potpunim nedostatkom transkripcije ili izmenjene transkripcije) ili za ubacivanje genetskog materijala u lokus koji je odabran u ciljanoj DNK.
[0202] Alternativno, ako se RNK koja cilja DNK i usmeren modifikacioni polipepti zajedno primenjuju na ćelije sa polinukleotidnom sekvencom donora koja uključuje barem segment sa homologijom za ciljanu DNK sekvencu, predmetni postupci se mogu koristiti za dodavanje, tj. ubacivanje ili zamenu, materijala nukleinske kiseline za ciljanu DNK sekvencu (npr. da „ubaci“ nukleinsku kiselinu koja kodira protein, siRNK, miRNK itd.), da doda obeležje (npr. 6xHis, fluorescentni proteina (npr. zeleni fluorescentni protein, žuti fluorescentni protein itd.), hemaglutinin (HA), FLAG itd.), da doda regulatornu sekvencu u gen (npr. promoter, poliadenilacijski signal, unutrašnju početnu sekvencu ribozoma (IRES), 2A peptid, početni kodon, zaustavni kodon, signalni isečak, signal lokalizacije, itd.), da modifikuje sekvencu nukleinske kiseline (npr. Uvede mutaciju) i slično. Kao takav, kompleks koji sadrži RNK koja cilja DNK i usmeren modifikacioni polipeptid je koristan u bilo kojoj in vitro ili in vivo primeni za koju je poželjno da modifikuje DNK na specifičnoj lokaciji, tj. „ciljani“ način, na primer gensko izbacivanje, gensko ubacivanje, uređivanje gena, obeležavanje gena, itd., kako se koristi u, na primer, genskoj terapiji, npr. za lečenje bolesti ili kao antivirusna, antipatogena ili antikancerogena terapija, proizvodnja genetski modifikovanih organizama u poljoprivredi, proizvodnja velike količine proteina u ćelijama za terapijske, dijagnostičke ili istraživačke svrhe, indukcija iPS ćelija, biološka istraživanja, ciljanje gena patogena za brisanje ili zamenu, itd.
[0203] U nekim otelotvorenjima, usmeren modifikacioni polipeptid sadrži modifikovan oblik Cas9/Csn1 proteina. U nekim slučajevima modifikovani oblik Cas9/Csn1 proteina sadrži promenu aminokisline (npr. brisanje, umetanje ili supstituciju) što smanjuje prirodnu pojavu aktivnosti nukleaze Cas9/Csn1 proteina. Na primer, u nekim slučajevima modifikovani oblik Cas9/Csn1 proteina ima manje od 50%, manje od 40%, manje od 30%, manje od 20%, manje od 10%, manje od 5% ili manje od 1% aktivnosti nukleaze odgovarajućeg divljeg tipa Cas9/Csn1 polipeptida. U nekim slučajevima, modifikovani oblik polipeptida Cas9/Csn1 nema značajnu aktivnost nukleaze. Kada je usmeren modifikacioni polipeptid, modifikovan oblik polipeptida Cas9/Csn1 koji nema značajnu aktivnost nukleaze, može se nazvati „dCas9“.
[0204] U nekim otelotvorenjima modifikovan oblik polipeptida Cas9/Csn1 je D10A (aspartat za alanin na poziciji aminokiseline 10 od SEQ ID NO: 8) mutacije (ili odgovarajuća mutacija bilo kog proteina predstavljenog u SEQ ID NO: 1-256 i 795-1346) koji može da razdvoji komplementarnu vezu ciljane DNK, ali ima smanjenu sposobnost da uklanja nekomplementarni deo ciljane DNK (što rezultuje u jednostrukom prekidu (SSB) umesto DSB, pogledati Sliku 11). U nekim otelotvorenjima modifikovan oblik polipeptida Cas9/Csn1 je mutacija H840A (histidin za alanin na poziciji aminokiseline 840) (ili odgovarajuća mutacija bilo kog proteina koji su navedeni kao SEQ ID NOs: 1-256 i 795- 1346) koji može da razdvoji nekomplementarnu vezu ciljane DNK, ali ima smanjenu sposobnost da se razdvoji komplementarnu vezu ciljane DNK (što rezultuje u jednostrukom prekidu (SSB) umesto DSB; slika 11). Upotreba D10A ili H840A varijante Cas9 (ili odgovarajuće mutacije u bilo kojoj od proteina predstavljenih kao SEQ ID NO: 1-256 i 795-1346) može da promeni očekivani biološki ishod jer je spajanje nehomogenih krajeva (NHEJ) mnogo je verovatnije da će se desiti kada su DSB prisutni nasuprot SSB. Tako, u nekim slučajevima kada se želi smanjiti verovatnoća DSB (a time i smanjiti verovatnoća NHEJ), može se koristiti D10A ili H840A varijanta Cas9. Ostali ostaci mogu biti mutirani kako bi se postigao isti efekat (tj. inaktivirati jedan ili drugi deo nukleaze). Kao neograničavajući primeri, ostaci D10, G12, G17, E762, H840, N854, N863, H982, H983, A984, D986 i/ili A987 (ili odgovarajuće mutacije bilo kog proteina koji su dati kao SEQ ID NOs: 1-256 i 795-1346) mogu se izmeniti (tj. supstituisati) (pogledati Sliku 3, Sliku 5, Sliku 11A i Tabelu 1 za više informacija o očuvanju ostataka aminokiselina Cas9). Takođe, pogodne su mutacije koje nisu alaninske supstitucije.
U nekim otelotvorenjima kada usmeren polipeptid (npr., usmeren modifikacioni polipeptid) ima smanjenu katalitičku aktivnost (npr. kada Cas9 protein ima D10, G12, G17, E762, H840, N854, N863, H982, H983, A984 , D986 i/ili mutacije A987, npr. d10A, G12A, G17A, E762A, H840A, N854A, N863A, H982A, H983A, A984A i/ili D986A), polipeptid se i dalje može vezati za ciljanu DNK na način specifičan za mesto (jer se i dalje navodi do ciljane DNK sekvence od strane RNK koja cilja DNK) sve dok zadržava sposobnost interakcije sa RNK koja cilja DNK.
[0205] U nekim otelotvorenjima modifikovani oblik polipeptida Cas9/Csn1 ima i D10A i H840A mutacije (ili odgovarajuće mutacije bilo kog proteina koji su navedeni kao SEQ ID NOs: 1-256 i 795- 1346), kao što su da polipeptid ima smanjenu sposobnost da uklanja komplementarne i nekomplementarne ćelije ciljane DNK (tj. varijanta ne može imati značajnu aktivnost nukleaze). Ostali ostaci mogu biti mutirani kako bi se postigao isti efekat (tj. inaktivirati jedan ili drugi deo nukleaze). Kao neograničavajući primeri, ostaci D10, G12, G17, E762, H840, N854, N863, H982, H983, A984, D986 i/ili A987 (ili odgovarajuće mutacije bilo kog proteina koji su dati kao SEQ ID NOs: 1-256 i 795-1346) mogu se izmeniti (tj. supstituisati) (pogledati Sliku 3, Sliku 5, Sliku 11A i Tabelu 1 za više informacija o očuvanju ostataka aminokiselina Cas9). Takođe, pogodne su mutacije koje nisu alaninske supstitucije.
[0206] U nekim otelotvorenjima, usmeren modifikacioni polipeptid sadrži heterolognu sekvencu (npr., Fuziju). U nekim otelotvorenjima, heterologna sekvenca može da pruži subćelijsku lokalizaciju usmerenog modifikacionog polipeptida, (npr. signal za nuklearnu lokalizaciju (NLS) za ciljanje na jezgro, signal mitohondrijalne lokalizacije za ciljanje na mitohondrije, signal lokalizacije hloroplasta za ciljanje na hloroplast, ER retencijski signal i slično). U nekim otelotvorenjima heterologna sekvenca može da pruži obeležje za lakoću praćenja ili prečišćavanja (npr. fluorescentni protein, npr. zeleni fluorescentni protein (GFP), IFP, RFP, CFP, mCherry, tdTomato i slično; njegova obeležje , Npr. obeležje 6XHis, obeležje hemaglutinina (HA), obeležje FLAG, obeležje Mic i slično). U nekim otelotvorenjima heterologna sekvenca može obezbediti povećanu ili smanjenu stabilnost.
[0207] U nekim otelotvorenjima, usmeren modifikacioni polipeptid može biti kodon-optimizovan. Ovaj tip optimizacije je poznat u struci i podrazumeva mutaciju stranog DNK da imitira preferencije kodona željenog organizma ili ćelije domaćina dok kodira isti protein. Zbog toga se kodoni menjaju, ali kodirani protein ostaje nepromenjen. Na primer, ako je ciljana ćelija bila ljudska ćelija, ljudski kodon-optimizovan Cas9 (ili varijanta, npr., enzimatsko neaktivna varijanta) bi bio odgovarajući usmeren modifikacioni polipeptid, (pogledati SEQ ID NO: 256 za primer). Bilo koji pogodni usmeren modifikacioni polipeptid (npr. bilo koji Cas9, kao što je bilo koja od sekvenci datih u SEQ ID NOs: 1-256 i 795-1346) može biti kodon-optimizovan. Kao još jedan neograničavajući primer, ako je predložena ćelija domaćina mišja ćelija, onda bi mišji kodonoptimizovan Cas9 (ili varijanta, npr., enzimatski neaktivna varijanta) bio odgovarajući usmeren modifikacioni polipeptid. Dok optimizacija kodona nije potrebna, ona je prihvatljiva i može biti poželjna u određenim slučajevima.
[0208] U nekim otelotvorenjima, predmetna RNK koja cilja DNK i usmeren modifikacioni polipeptid koriste se kao inducibilni sistem za isključivanje eksprimiranja gena u bakterijskim ćelijama. U nekim slučajevima, nukleinske kiseline koje kodiraju odgovarajuću RNK koja cilja DNK i/ili odgovarajući usmeren polipeptid, inkorporiraju se u hromozom ciljane ćelije i pod kontrolom inducibilnog promotera. Kada su indukovani RNK koja cilja DNK i/ili usmeren polipeptid, ciljana DNK se odvaja (ili drugačije modifikuje) na mestu od interesa (npr. ciljani gen na odvojenom plazmidu), kada su i RNK koja cilja DNK i usmeren modifikacioni polipeptid prisutni i formiraju kompleks. Kao takvi, u nekim slučajevima, linije bakterijske eksprimiranja su dizajnirane tako da uključuju sekvence nukleinskih kiselina koje kodiraju odgovarajući usmeren modifikacioni polipeptid u bakterijskom genomu i/ili odgovarajući RNK koja cilja DNK na plazmidu (npr., pod kontrolom inducibilnog promotera), što omogućava eksperimente u kojima bi eksprimiranje bilo kog ciljanog gena (eksprimirana iz odvojenog plazmida uvedenog u liniju) mogla biti kontrolisana indukovanjem eksprimiranja RNK koja cilja DNK i usmerenog modifikacionog polipeptida.
[0209] Ovde su takođe opisani usmereni modifikacioni polipeptidi, koji imaju enzimsku aktivnost koja modifikuje ciljanu DNK na druge načine osim uvođenja dvostrukih prekida. Enzimska aktivnost od interesa koja se može koristiti za modifikaciju ciljane DNK (npr., fuzija heterolognog polipeptida sa enzimskom aktivnošću sa usmerenim modifikacionim polipeptidom, čime se generiše himerni usmeren modifikacioni polipeptid) uključuje, ali nije ograničena na, aktivnost metiltransferaze, aktivnost demetilaze, aktivnost DNK popravke, aktivnost DNK oštećenja, aktivnost deaminacije, aktivnost dismutaze, aktivnost alkilacije, aktivnost depuracije, aktivnost oksidacije, aktivnost formiranja pirimidinskog dimera, aktivnost integraze, aktivnost transposaze, aktivnost rekombinaze, aktivnost polimeraze, aktivnost ligaze, aktivnost helikase, aktivnost fotoliaze ili aktivnost glikozilaze. Metilacija i demetilacija su u struci prepoznati kao važan način regulacije epigenetskih gena, dok su aktivnost oštećenje DNK i aktivnost popravke DNK neophodni za preživljavanje ćelija i za pravilno održavanje genoma kao odgovor na stres iz okruženja.
[0210] Kao takvi, ovde opisani postupci pronalaze upotrebu u epigenetskoj modifikaciji ciljane DNK i mogu se koristiti za kontrolu epigenetske modifikacije ciljane DNK na bilo kojoj lokaciji u ciljanoj DNK genetskim inženjeringom željene komplementarne sekvence nukleinske kiseline u DNK-ciljajućem segmentu RNK koja cilja DNK. Ovde se takođe koriste postupci u namernim i kontrolisanim oštećenjima DNK na bilo kojoj željenoj lokaciji unutar ciljane DNK. Postupci ovde se takođe koriste u sekvencno-specifičnoj i kontrolisanoj popravci DNK na bilo kojoj željenoj lokaciji unutar ciljane DNK. Postupci ciljanja enzimskih aktivnosti koje modifikuju DNK na specifične lokacije u ciljanoj DNK koriste se i u istraživačke i u kliničke svrhe.
[0211] U nekim slučajevima opisanim ovde, usmeren modifikacioni polipeptidu ima aktivnost koja modulira transkripciju ciljane DNK (npr., u slučaju himernog usmerenog modifikacionog polipeptida i sl.). U nekim slučajevima, himerni usmeren modifikacioni polipeptid koji sadrži heterologni polipeptid koji pokazuje sposobnost da poveća ili smanji transkripciju (npr. transkripcijski aktivator ili polipeptidi receptori transkripcije) se koristi za povećanje ili smanjenje transkripcije ciljane DNK na određenoj lokaciji u ciljanoj DNK, koja se rukovodi DNK-ciljajućim segmentom RNK koja cilja DNK. Primeri izvornih polipeptida za pružanje himernog usmerenog modifikacionog polipeptida sa modulacijom aktivnosti transkripcije uključuju, ali se ne ograničavaju na svetlom-inducibilne regulatore transkripcije, regulatore transkripcije sa dobrim odgovorima na male molekule/lekove, transkripcioni faktori, represori transkripcije itd. U nekim slučajevima, predmetni postupak se koristi za kontrolu eksprimiranja ciljanog kodirajućeg RNK (protein-kodirajući gen) i/ili ciljanog nekodirajućeg RNK (npr. tRNK, rRNK, snoRNK, siRNK, miRNK, dugački ncRNK itd) .
[0212] U nekim slučajevima opisanim ovde, usmeren modifikacioni polipeptid ima enzimsku aktivnost koja modifikuje polipeptid pridružen DNK (npr., histon). U nekim slučajevima aktivnost metil-transferaze, aktivnost demetilaze, aktivnost acetil-transferaze, aktivnost deacetilaze, aktivnost kinaze, aktivnost fosfataze, aktivnost ubikuitin ligaze, aktivnost deubikuitinacije, aktivnost adenilacije, aktivnost umirenja, aktivnost SUMOilacije, aktivnost deSUMOilacije, aktivnost ribozilacije, aktivnost deribozilacije, aktivnost miristoilacije, aktivnost demiristoilacije, aktivnost glikolizacije (npr. O-GlcNAc transferaza) ili aktivnost deglikozilacije. Enzimske aktivnosti navedene ovde kataliziraju kovalentne modifikacije proteina. Takve modifikacije su poznate u struci da bi se promenila stabilnost ili aktivnost ciljanog proteina (npr., Fosforilacija usled aktivnosti kinaze može stimulisati ili zaustaviti aktivnost proteina u zavisnosti od ciljanog proteina). Od posebnog interesa kao proteinski ciljevi su histoni. Histonski proteini su u struci poznati da se vezuju za DNK i formiraju komplekse poznate kao nukleozomi. Histori se mogu modifikovati (npr., metilacijom, acetilacijom, ubuinacijom, fosforilacijom) kako bi se izazvale strukturne promene u okolnoj DNK, čime se kontroliše pristupačnost potencijalno velikih delova DNK u interakcionim faktorima kao što su transkripcioni faktori, polimeraze i slično. Jedan histon se može modifikovati na mnogo različitih načina i u mnogim različitim kombinacijama (npr. trimetilacija lizina 27 histona 3, H3K27, povezana je sa regionima DNK potisnute transkripcije, dok je trimetilacija lizina 4 histona 3, H3K4, povezana sa DNK regijom aktivne transkripcije). Stoga, usmeren modifikacioni polipeptid sa aktivnošću koja modifikuje histon pronalazi upotrebu u specifičnoj kontroli strukture DNK i može se koristiti za promenu obrasca modifikacije u odabranoj regiji ciljane DNK. Takvi postupci koriste se i u istraživačke i u kliničke svrhe.
[0213] U nekim otelotvorenjima, istovremeno se koristi više RNK koje ciljaju DNK da istovremeno modifikuju različite lokacije na istoj ciljanoj DNK ili na različitim ciljanim DNK. U nekim otelotvorenjima, dve ili više RNK koje ciljaju DNK ciljaju isti gen ili transkript ili lokus. U nekim otelotvorenjima, dve ili više RNK koje ciljaju DNK ciljaju različite nepovezane lokuse. U nekim otelotvorenjima, dve ili više RNK koje ciljaju DNK ciljaju različite, ali povezane lokuse.
[0214] U nekim slučajevima, usmeren modifikacioni polipeptid pruža se direktno kao protein. Kao jedan neograničavajući primer, gljive (npr. kvasac) mogu se transformisati pomoću egzogenog proteina i/ili nukleinske kiseline koristeći transformaciju sferoplasta (pogledati Kawai et al., Bioeng Bugs.2010 Nov-Dec;1(6):395-403 : "Transformation of Saccharomyces cerevisiae and other fungi: methods and possible underlying mechanism"; i Tanka et al., Nature. 2004 Mar 18;428(6980):323-8: "Conformational variations in an infectious protein determine prion strain differences"). Prema tome, usmeren modifikacioni polipeptid (npr., Cas9) može biti inkorporiran u sferoplast (sa ili bez nukleinske kiseline koja kodira RNK koja cilja DNK sa ili bez donorskog polinukleotida), i sferoplast se može koristiti za uvođenje sadržaja u ćelije kvasca. Usmeren modifikacioni polipeptid može se uvesti u ćeliju (dat ćeliji) pomoću bilo kog pogodnog postupka; takvi postupci su poznate stručnjacima u oblasti. Kao još jedan neograničavajući primer, usmeren modifikacioni polipeptid može se direktno ubrizgavati u ćeliju (npr. sa ili bez nukleinske kiseline koja kodira RNK koja cilja DNK i sa ili bez donoskog polinukleotida), npr. ćelija embriona zebrica, pronukleus oplođenih jajnih ćelija miša, itd.
Ciljane ćelije od interesa
[0215] U nekim od gore navedenih primena, predmetni postupci mogu biti primenjeni kako bi se indukovalo odvajanje DNK, modifikacija DNK i/ili transkripciona modulacija u mitotskim ili postmitotskim ćelijama in vivo i/ili ex vivo i/ili in vitro (npr. , Za proizvodnju genetski modifikovanih ćelija koje se mogu ponovo unositi u pojedince). Pošto RNK koja cilja DNK daje specifičnost hibridizacije za ciljanu DNK, mitotska i/ili post-mitotska ćelija koja od u interesa u obelodanjenim postupcima može uključiti ćeliju iz bilo kog organizma (npr. bakterijska ćelija, arhealna ćelija, ćelija jednoćelijskog eukariotskog organizma, biljna ćelija, ćelija algi, npr. botryococcus braunii, Chlamydomonas reinhardtii, Nannochloropsis gaditana, Chlorella pyrenoidosa, Sargassum patens C. Agardh i slično, ćelije gljiva (npr. ćelije kvasca), ćelija životinja, ćelija beskičmenjaka (npr. voćna muva, cnidarijan, ehinoderm, nematod itd.), ćelije kičmenjaka (npr. riba, amfibija, gmizavac, ptica, sisar), ćelija sisara, ćelija od glodara, ćelija od čoveka itd.).
[0216] Svaka vrsta ćelije može biti od interesa (npr. matične ćelije, npr. ćelije embrionalne linije (ES), ćelije indukovane pluripotentne linije (iPS), germ ćelija, pri čemu ljudske germ ćelije nisu deo sastava pronalaska, somatske ćelija, npr. fibroblast, hematopoetska ćelija, neuron, mišićna ćelija, ćelija kosti, hepatocit, ćelija pankreasa, in vitro ili in vivo ne-ljudska embrionalna ćelija neljudskog embriona u bilo kojoj fazi, npr. 1-ćelijski, 2-ćelijski, 4-ćelijski, 8-ćelijski itd., embrion zebrice itd.). Ćelije mogu biti iz utvrđenih ćelijskih linija ili mogu biti primarne ćelije, gde se „primarne ćelije“, „primarne ćelijske linije“ i „primarne kulture“ ovde koriste međusobno zamenjivo da se odnose na ćelije i ćelijske kulture koje su izvedene od pacijenta i kojima je dozvoljeno da rastu in vitro za ograničeni broj prolaza, odnosno razdvajanja, kulture. Na primer, primarne kulture su kulture koje su možda bile puštene 0 puta, 1 put, 2 puta, 4 puta, 5 puta, 10 puta ili 15 puta, ali nedovoljno vremena da prođu kroz fazu krize. Tipično, primarne ćelijske linije prema predmetnom pronalasku održavaju se za manje od 10 prolaza in vitro. ciljane ćelije su u mnogim otelotvorenjima jednoćelijski organizmi ili se gaje u kulturi.
[0217] Ako su ćelije primarne ćelije, mogu se sakupljati od pojedinca bilo kojim pogodnim postupkom. Na primer, leukociti se lako mogu sakupljati aferezom, leukocitafezom, razdvajanjem gradijenta gustine itd. dok su najpogodnije ćelije iz tkiva kao što su koža, mišić, koštana srž, slezina, jetra, pankreas, pluća, creva, želudac itd. sakupljene biopsijom. Odgovarajući rastvor se može koristiti za disperziju ili suspenziju sakupljenih ćelija. Takvo rešenje će uglavnom biti uravnoteženi slani rastvor, npr. uravnotežen fiziološki rastvor, fosfatom puferisan fiziološki rastvor (PBS), Henkov uravnotežen fiziološki rastvor, itd., Pogodno dopunjeni serumom fetusa ili drugim prirodnim faktorima, u kombinaciji sa prihvatljivim puferom u niskoj koncentraciji, uglavnom od 5-25 mM. Prikladni puferi uključuju HEPES, fosfatne pufere, laktatne pufere i sl. Ćelije se mogu odmah koristiti, ili se mogu spremiti, zamrznuti, dugotrajno odleđivati i mogu se ponovo koristiti. U takvim slučajevima ćelije će se obično zamrznuti u 10% DMSO, 50% seruma, 40% puferisanog medijuma ili nekog drugog takvog rastvora koji se u struci obično koristi za očuvanje ćelija na takvim temperaturama zamrzavanja, i odmrzavanje na način poznat u tehnici za odmrzavanje zamrznutih kultivisanih ćelija.
Nukleinske kiseline koje kodiraju predmetnu RNK koja cilja DNK i/ili predmetni usmeren modifikacioni polipeptid
[0218] U nekim otelotvorenjima, predmetni postupak uključuje dovođenje u dodir ciljane DNK ili unošenje u ćeliju (ili populaciju ćelija) jedne ili više nukleinskih kiselina koje sadrže nukleotidne sekvence koje kodiraju RNK koja cilja DNK i/ili usmeren modifikacioni polipeptid i/ili donor polinukleotid. Pogodne nukleinske kiseline koje sadrže nukleotidne sekvence koje kodiraju RNK koja cilja DNK i/ili usmeren modifikacioni polipeptid uključuju vektore eksprimiranja, pri čemu je vektor eksprimiranja koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira RNK koja cilja DNK i/ili usmeren modifikacioni polipeptid „rekombinantni vektor eksprimiranja“.
[0219] U nekim otelotvorenjima, rekombinantni vektor eksprimiranja je virusni konstrukt, npr. rekombinantni adeno-povezani virusni konstrukt (pogledati, npr., U.S. Patent No. 7,078,387), rekombinantni adenovirusni konstrukt, rekombinantni lentivirusni konstrukt, itd.
[0222] Pogodni vektori eksprimiranja uključuju, ali nisu ograničeni na, virusne vektore (npr. virusne vektore zasnovane na vaccinia virusu, poliovirusu, adenovirusu (pogledati, npr., Li et al., Invest Opthalmol Vis Sci 35:25432549, 1994; borras et al., Gene Ther 6:515524, 1999; Li and Davidson, PNAS 92:77007704, 1995; sakamoto et al., H Gene Ther 5:10881097, 1999; WO 94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 and WO 95/00655); adeno-povezanom virusu (pogledati, npr., Ali et al., Hum Gene Ther 9:8186, 1998, Flannery et al., PNAS 94:69166921, 1997; Bennett et al., Invest Opthalmol Vis Sci 38:28572863, 1997; Jomary et al., Gene Ther 4:683690, 1997, Rolling et al., Hum Gene Ther 10:641648, 1999; Ali et al., Hum Mol Genet 5:591594, 1996; Srivastava u WO 93/09239, Samulski et al., J. Vir. (1989) 63:3822-3828; mendelson et al., Virol. (1988) 166:154-165; i Flotte et al., PNAS (1993) 90:10613-10617); sV40; herpes simpleks virusu, virusu ljudske imunodeficijencije (pogledati, npr., Miyoshi et al., PNAS 94:1031923, 1997; Takahashi et al., J Virol 73:78127816, 1999); retrovirusnom vektoru (npr. virus mišje leukemije, virus nekroze slezine i vektori izvedeni iz retrovirusa kao što su Rous Sarcoma virus Harvey Sarcoma virus, virus ptičje leukoze, lentivirus, virus ljudske imunodeficijencije, virus mijeloproliferativnog sarkoma i virus tumora dojke); i slično.
[0221] Brojni pogodni vektori eksprimiranja poznati su stručnjacima u oblasti i mnogi su komercijalno dostupni. Sledeći vektori su dati primerom; Za eukariotske ćelije domaćina: pXT1, pSG5 (Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG i pSVLSV40 (Pharmacia). Međutim, bilo koji drugi vektor može se koristiti sve dok je kompatibilan sa ćelijom domaćina.
[0222] U nekim otelotvorenjima, nukleotidna sekvenca koja kodira RNK koja cilja DNK i/ili usmeren modifikacioni polipeptid operativno je povezana sa kontrolnim elementom, na primer, kontrolnim elementom transkripcije, kao što je promoter. Element kontrole transkripcije može biti funkcionalan u eukariotskoj ćeliji, npr. ćelije sisara; ili prokariotskoj ćeliji (npr., bakterijske ili arhealne ćelije). U nekim otelotvorenjima, nukleotidna sekvenca koja kodira RNK koja cilja DNK i/ili usmeren modifikacioni polipeptid operativno je povezana sa više kontrolnih elemenata koji omogućavaju eksprimiranje nukleotidne sekvence koja kodira RNK koja cilja DNK i/ili usmeren modifikacioni polipeptid u prokariontskim i eukariotskim ćelijama.
[0223] U zavisnosti od korišćenog sistema domaćina/vektora, u vektoru eksprimiranja može se koristiti bilo koji od odgovarajućih elemenata za kontrolu transkripcije i translacije, uključujući konstitutivne i inducibilne promotere, elemente poboljšanja transkripcije, terminatore transkripcije itd. (pogledati npr. Bitter et al. (1987) Methods in Enzymodogy, 153:516-544).
[0224] U nekim otelotvorenjima, RNK koja cilja DNK i/ili usmeren modifikacioni polipeptid mogu se obezbediti kao RNK. U takvim slučajevima, RNK koja cilja DNK i/ili RNK koja kodira usmeren modifikacioni polipeptid može biti proizvedena direktnom hemijskom sintezom ili može biti transkribovana in vitro iz DNK koja kodira RNK koja cilja DNK. Postupci sintetizovanja RNK iz DNK predložaka su dobro poznati u struci. U nekim slučajevima, RNK koja cilja DNK i/ili RNK koja kodira usmeren modifikacioni polipeptid, biće sintetisana in vitro koristeći enzim RNK polimeraze (npr. t7 polimeraza, T3 polimeraza, SP6 polimeraza itd.). Kada se sintetizuje, RNK može direktno da dođe u dodir sa ciljanom DNK ili se može uvesti u ćeliju bilo kojom od poznatih tehnika za uvođenje nukleinskih kiselina u ćelije (npr. mikroinženjering, elektroporacija, transfekcija itd.).
[0225] Nukleotidi koji kodiraju RNK koja cilja DNK (uvedeni ili kao DNK ili RNK) i/ili usmeren modifikacioni polipeptid (uveden kao DNK ili RNK) i/ili donorski polinukleotid mogu se pružiti ćelijama koje koriste dobro razvijene tehnike transfekcije; pogledati, npr. angel and Yanik (2010) PLoS ONE 5(7): e11756 i komercijalno dostupei TransMessenger® reagense od Qiagen, Stemfect™ RNK Transfection komplet od Stemgent, i TransIT®-mRNK Transfection komplet od Mirus Bio LLC. Pogledati takođe Beumer et al. (2008) Efficient gene targeting in Drosophila by direct embryo injection with zinc-finger nucleases. PNAS 105(50):19821-19826. Alternativno, nukleinske kiseline koje kodiraju RNK koja cilja DNK i/ili usmeren modifikacioni polipeptid i/ili himerni usmeren modifikacioni polipeptid i/ili donor polinukleotid, mogu biti pruženi na vektorima DNK. Mnogi vektori korisni za prenos nukleinskih kiselina u ciljane ćelije su dostupni, npr. plazmidi, kosmidi, minikrugovi, fagi, virusi itd. Vektori koji sadrže nukleinsku kiselinu mogu se održavati episomalno, npr. kao što su plazmidi, minikrugovi DNK, virusi poput citomegalovirusa, adenovirusa itd. ili mogu biti integrisani u genom ciljane ćelije, putem homologne rekombinacije ili slučajne integracije, npr. retrovirusni vektori kao što su MMLV, HIV-1, ALV, itd.
[0226] Vektori mogu biti direktno pruženi predmetnim ćelijama. Drugim rečima, ćelije se dovode u dodir sa vektorima koji sadrže nukleinsku kiselinu koja kodira RNK koja cilja DNK i/ili usmeren modifikacioni polipeptid i/ili himerni usmeren modifikacioni polipeptid i/ili donor polinukleotid tako da se vektori uzimaju od strane ćelija. Postupci za dovođenje u dodir ćelija sa vektorima nukleinske kiseline koji su plazmidi, uključujući elektroporaciju, transfekciju kalcijum hlorida, mikroubrizgavanje i lipofekciju, dobro su poznati u struci. Za isporuku virusnog vektora, ćelije se dovode u dodir sa virusnim česticama koje sadrže nukleinsku kiselinu koja kodira RNK koja cilja DNK i/ili usmeren modifikacioni polipeptid i/ili himerni usmeren modifikacioni polipeptid i/ili donor polinukleotid. Retrovirusi, na primer, lentivirusi, posebno su pogodni za postupak pronalaska. Najčešće korišćeni retrovirusni vektori su „defektivni“, tj. Nesposobni da proizvedu virusne proteine potrebne za produktivnu infekciju. Umesto toga, replikacija vektora zahteva rast u ćelijskoj liniji pakovanja. Za stvaranje virusnih čestica koje sadrže nukleinske kiseline od interesa, retrovirusne nukleinske kiseline koje sadrže nukleinsku kiselinu pakuju se u virusne kapside pomoću ćelijske linije pakovanja. Različite ćelijske linije pakovanja pružaju različite koverta proteine (ekotropne, amfotropne ili ksenotropne) koje treba inkorporirati u kapsid, gde taj koverta protein određuje specifičnost virusne čestice za ćelije (ekotropna za mišje i pacovske, amfotropna za većinu tipova ćelija sisara, uključujući čoveka, psa i miša, i ksenotropna za većinu tipova ćelija sisara osim glodarskih ćelija). Odgovarajuća ćelijska linija pakovanja može se koristiti kako bi se osiguralo da su ćelije ciljane od strane spakovanih virusnih čestica. Postupci uvođenja retrovirusnih vektora koje sadrže nukleinsku kiselinu koja kodira faktore reprogramiranja u ćelijske linije pakovanja i sakupljanje virusnih čestica koje generišu ćelijske linije za pakovanje dobro su poznate u struci. Nukleinske kiseline se takođe mogu uvesti direktnim mikro-injekcijama (npr., ubrizgavanje RNK u embrion zebrica).
[0227] Vektori koji se koriste za pružanje nukleinskih kiselina koji kodiraju RNK koja cilja DNK i/ili usmeren modifikacioni polipeptid i/ili himerni usmeren modifikacioni polipeptid i/ili donor polinukleotid u predmetne ćelije obično sadrže pogodne promotere za pokretanje eksprimiranja, odnosno transkripciono aktiviranje nukleinske kiseline od interesa. Drugim rečima, nukleinska kiselina od interesa će biti operativno povezana sa promoterom. Ovo može obuhvatiti sveobuhvatno delujuće promotere, na primer, promoter CMV-β-aktina ili inducibilne promotere, kao što su promoteri koji su aktivni u određenim ćelijskim populacijama ili koji reaguju na prisustvo lekova kao što je tetraciklin. Aktivacijom transkripcije predviđeno je da se transkripcija poveća iznad bazalnih nivoa u ciljanoj ćeliji najmanje oko 10 puta, za najmanje oko 100 puta, obično za najmanje oko 1000 puta. Osim toga, vektori koji se koriste za dobijanje RNK koja cilja DNK i/ili usmerenog modifikacionog polipeptida i/ili himernog usmerenog modifikacionog polipeptida i/ili donorskog polinukleotida na predmetnim ćelijama mogu uključiti sekvence nukleinskih kiselina koje kodiraju za selektabilne markere u ciljanim ćelijama, kako bi se identifikovale ćelije koje su uzimale RNK koja cilja DNK i/ili usmeren modifikacioni polipeptid i/ili himerni usmeren modifikacioni polipeptid i/ili donor polinukleotid.
[0228] Predmetna RNK koja cilja DNK i/ili usmeren modifikacioni polipeptid i/ili himerni usmeren modifikacioni polipeptid mogu se umesto toga koristiti za dovođenje u dodir sa DNK ili uvoditi u ćelije kao RNK. Postupci uvođenja RNK u ćelije su poznati u struci i mogu uključivati, na primer, direktno ubrizgavanje, transfekciju ili bilo koji drugi postupak koji se koristi za uvođenje DNK.
[0229] Predmetni usmeren modifikacioni polipeptid, umesto toga, može biti pružen ćelijama kao polipeptid. Takav polipeptid može opciono biti spojen sa polipeptidnim domenom koji povećava rastvorljivost proizvoda. Domen može biti povezan sa polipeptidom preko definisane lokacije za cepanje proteaza, npr. TEV sekvence, koja se cepa TEV proteazom. Veznik može takođe uključiti jednu ili više fleksibilnih sekvenci, npr. od 1 do 10 ostataka glicina. U nekim otelotvorenjima, odvajanje fuzionog proteina se izvodi u puferu koji održava rastvorljivost proizvoda, npr. u prisustvu od 0,5 do 2 M uree, u prisustvu polipeptida i/ili polinukleotida koji povećavaju rastvorljivost i slično. Domeni od interesa uključuju endosomolitičke domene, npr. HA domen gripa; i druge polipeptidi koji pomažu u proizvodnji, npr. IF2 domena, GST domena, GRPE domena i slično. Polipeptid se može formulisati za poboljšanu stabilnost. Na primer, peptidi mogu biti PEGilirani, gde polietilenoksi grupa pruža poboljšani vek trajanja u krvi.
[0230] Dodatno ili alternativno, usmeren modifikacioni polipeptid može biti spojen sa polipeptidnim permeantnim domenom radi promovisanja uzimanja od strane ćelije. Brojni permeantni domeni su poznati u struci i mogu se koristiti u neintegrisanim polipeptidima iz ovog pronalaska, uključujući peptide, peptidomimetike i nepeptidne nosače. Na primer, permeantni peptid može se dobiti iz trećeg alfa heliksa od Drosophila melanogaster transkripcionog faktora Antennapaedije, nazvan kao penetratin, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu RQIKIWFQNRRMKWKK (SEQ ID NO://). Kao još jedan primer, permeantni peptid sadrži HIV-1 tat baznu regiju aminokiselinske sekvence, koja može uključivati, na primer, aminokiseline 49-57 prirodnog proteina tat. Ostali permeantni domeni obuhvataju poliargininske motive, na primer region aminokiselina 34-56 HIV-1 rev proteina, nona-arginin, okta-arginin i slično. (pogledati, na primer, Futaki et al. (2003) Curr Protein Pept Sci.2003 Apr; 4(2): 87-9 and 446; i Wender et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 2000 Nov. 21; 97(24):13003-8; objavljene U.S. Patent applications 20030220334; 20030083256; 20030032593; i 20030022831). Nona-arginin (R9) sekvenca je jedan od efikasnijih PTD-ova koji su opisani (Wender et al. 2000; Uemura et al.
2002). Mesto na kome se pravi fuzija može se odabrati kako bi se optimizovala biološka aktivnost, sekrecija ili karakteristike vezivanja polipeptida. Optimalna mesto će se odrediti rutinskim eksperimentisanjem.
[0231] Usmeren modifikacioni polipeptid može se proizvesti in vitro ili putem eukariotskih ćelija ili prokariotskih ćelija, a može se dalje obraditi razvijanjem, npr. denaturacijom toplote, redukcijom DTT-a itd. i može se dalje presavijati, koristeći postupke poznate u struci.
[0232] Modifikacije od interesa koje ne menjaju primarnu sekvencu uključuju hemijsku derivatizaciju polipeptida, npr., acilaciju, acetilaciju, karboksilaciju, amidaciju itd. Takođe su obuhvaćene modifikacije glikozilacije, npr. One učinjene modifikovanjem glikozilacionih obrazaca polipeptida tokom sinteze i obrade ili u narednim koracima obrade; na primer. Izlaganjem polipeptida enzimima koji utiču na glikozilaciju, kao što su enzimi glikozilacije ili deglikozilaze sisara. Takođe su obuhvaćene sekvence koje imaju fosforilisane aminokiselinske ostatke, npr. fosfotirozin, fosfoserin ili fosfotreonin.
[0233] Takođe su predmetnim pronalaskom obuhvaćene RNK koje ciljaju DNK i usmereni modifikacioni polipeptidi, koji su modifikovani korišćenjem običnih molekularnih bioloških tehnika i sintetičke hemije, kako bi se poboljšala njihova otpornost na proteolitičku degradaciju, kako bi se promenila specifičnost ciljane sekvence, optimizovale osobine rastvorljivosti, menjale aktivnost proteina (npr. modulacijska aktivnost transkripcije, enzimska aktivnost itd.) ili se učinili pogodnijim kao terapeutski agens. Analozi takvih polipeptida uključuju one koji sadrže druge ostatke osim prirodnih L-aminokiselina, npr. d-aminokiselina ili ne-prirodne sintetičke aminokiseline. D-aminokiseline mogu biti zamenjene za neke ili sve aminokiseline ostatke.
[0234] Usmereni modifikacioni polipeptidi mogu se pripremiti sintezom in vitro, koristeći konvencionalne postupke koje su poznate u struci. Na raspolaganju su različiti komercijalni sintetički aparati, na primer, automatizovani sintetizatori od Applied Biosystems, Inc., Beckman, itd. Koristeći sintetizere, prirodne aminokiseline mogu biti zamenjene neprirodnim aminokiselinama. Poseban redosled i način pripreme će biti određeni pomoću pogodnosti, ekonomije, potrebne čistoće i slično.
[0235] Ako se tako želi, različite grupe mogu biti unete u peptid tokom sinteze ili tokom eksprimiranja, što omogućava povezivanje sa drugim molekulima ili površinom. Tako se cisteini mogu koristiti za proizvodnju tioetara, histidini za povezivanje sa kompleksom metalnih jona, karboksilne grupe za formiranje amida ili estara, amino grupe za formiranje amida i slično.
[0236] Usmereni modifikacioni polipeptidi takođe mogu biti izolovani i prečišćeni u skladu sa konvencionalnim postupcima rekombinantne sinteze. Lizat može biti pripremljen od domaćina eksprimiranja i lizat je prečišćen pomoću HPLC, hromatografije isključivanja, elektroforeze gela, afinitetne hromatografije ili druge tehnike prečišćavanja. U većini slučajeva, sastavi koje se koriste će sadržati najmanje 20% po težini željenog proizvoda, obično najmanje oko 75% po težini, poželjno najmanje oko 95% po težini, i u terapeutske svrhe, obično najmanje oko 99,5% po težini, u odnosu na zagađivače vezane za postupak pripreme proizvoda i njegovo prečišćavanje. Obično se procenti zasnivaju na ukupnom proteinu.
[0237] Za indukovanje cepanja i rekombinacije DNK ili bilo koje željene modifikacije ciljane DNK ili bilo koje željene modifikacije polipeptida povezanom sa ciljanom DNK, RNK koja cilja DNK i/ili usmerenog modifikacionog polipeptida i/ili donorskog polinukleotida, bilo da se uvode kao nukleinske kiseline ili polipeptidi, pružaju se ćelijama tokom oko 30 minuta do oko 24 sata, npr.
1 sat, 1,5 sat, 2 sata, 2,5 sata, 3 sata, 3,5 sata 4 sata, 5 sati , 6 sati, 7 sati, 8 sati, 12 sati, 16 sati, 18 sati, 20 sati ili bilo koji drugi period od oko 30 minuta do oko 24 časa, što se može ponoviti sa učestalošću od oko svakog dana do oko 4 dana, npr. svakih 1,5 dana, svaka 2 dana, svaka 3 dana ili bilo koje druge frekvencije od oko svakog dana do otprilike svaka 4 dana. Agensi mogu biti obezbeđeni predmetnim ćelijama jednom ili više puta, npr. Jednokratno, dvaput, tri puta ili više od tri puta, a ćelijama je dozvoljeno da se inkubiraju sa agensima tokom određenog vremenskog perioda nakon svakog događaja dovođenja u dodir, npr.16-24 sata, nakon čega se medijum zamenjuje novim medijumom i ćelije se dalje kultivišu.
[0238] U slučajevima u kojima se ćeliji daju dva ili više različitih kompleksa ciljanja (npr. dve različite RNK koje ciljaju DNK koje su komplementarne različitim sekvencama unutar iste ili različite ciljane DNK), kompleksi mogu biti obezbeđeni istovremeno (npr. kao dva Polipeptida i/ili nukleinske kiseline) ili se istovremeno isporučuju. Alternativno, mogu se obezbediti uzastopno, npr. prvo je obezbeđen kompleks za ciljanje, zatim drugi kompleks za ciljanje itd. ili obrnuto.
[0239] Uobičajeno, efikasna količina RNK i/ili usmerenog modifikacionog polipeptida pruženi su ciljanoj DNK ili ćelijama da indukuju cepanje. Efektivna količina RNK koja cilja DNK i/ili usmerenog modifikacionog polipeptida i/ili donorskog polinukleotida je količina koja indukuje dvostruko povećanje ili više u količini ciljane modifikacije koja je primećena između dve homologne sekvence u odnosu na negativnu kontrolu, npr. ćelija u dodiru sa praznim vektorom ili irelevantnim polipeptidom. To znači da efektivna količina ili doza RNK koja cilja DNK i/ili usmeren modifikacioni polipeptid i/ili donor polinukleotida dovode do dvostrukog povećanja, povećanja od 3 puta, povećanja od 4 puta ili više u količini ciljane modifikacije koja je primećena u ciljanoj DNK regiji, u nekim slučajevima povećanje od 5 puta, povećanje od 6 puta ili više, ponekad povećanje od 7 puta ili 8 puta ili više u količini posmatrane rekombinacije, npr. povećanje od 10 puta, 50 puta ili 100 puta ili više, u nekim slučajevima povećanje od 200 puta, 500 puta, 700 puta ili 1000 puta ili više, npr. 5000-puta ili 10.000-puta povećanje u količini rekombinacije koja je primećena. Količina ciljane modifikacije može se meriti bilo kojim pogodnim postupkom. Na primer, tihi reporter konstrukt koji sadrži komplementarnu sekvencu segmenta ciljanja (ciljana sekvenca) RNK koja cilja DNK koja je obeležena ponovljenim sekvencama koje će, kada se rekombinuje, rekonstruisati nukleinsku kiselinu koja kodira aktivnog reportera, može biti transfektovana u ćelije i količina reporter proteina je procenjena posle dodira sa RNK koja cilja DNK i/ili usmerenim modifikacionim polipeptidom i/ili donorm polinukleotidom, npr.2 sata, 4 sata, 8 sati, 12 sati, 24 sata, 36 sati, 48 sati, 72 sata ili više nakon dodira sa RNK i/ili usmerenim modifikacionim polipeptidom. Kao još jedan, senzitivniji test, na primer, stepen rekombinacije u regiji genomske DNK od interesa koja sadrži ciljane DNK sekvence može se proceniti pomoću PCR ili Southern hibridizacije regije nakon dodira sa RNKRNK koja cilja DNK i/ili usmerenim modifikacionim polipeptidom i/ili donorm polinukleotidom, npr 2 sata, 4 sata, 8 sati, 12 sati, 24 sata, 36 sati, 48 sati, 72 sata ili više nakon dodira sa RNK i/ili usmerenim modifikacionim polipeptidom.
[0240] Dovođenje u dodir ćelija sa RNK koja cilja DNK i/ili usmerenim modifikacionim polipeptidom i/ili donorm polinukleotidom može se dogoditi u bilo kom medijumu za kulturu i pod bilo kojim uslovima kulture koji promovišu opstanak ćelija. Na primer, ćelije mogu biti suspendovane u bilo kom odgovarajućem hranljivom medijumu koji je pogodan, kao što je Iskov modifikovan DMEM ili RPMI 1640, dopunjavan fetalnim serumom teleta ili inaktiviranim serumom koza (oko 5-10%), L-glutaminom, tiolom, posebno 2-merkaptoetanolom i antibioticima, npr. penicilin i streptomicin. Kultura može sadržati faktore rasta na koje ćelije odgovaraju. Faktori rasta, kako su ovde definisani, su molekuli sposobni da promovišu preživljavanje, rast i/ili diferencijaciju ćelija, bilo u kulturi ili u netaknutom tkivu, kroz specifične efekte na transmembranski receptor. Faktori rasta uključuju polipeptide i nepolipeptidne faktore. Uslovi koji promovišu opstanak ćelija su tipično dozvoljeno ne-homologno spajanje krajeva i homologno usmerena popravka.
[0241] U primenama u kojima je poželjno umetnuti polinukleotidnu sekvencu u ciljanu DNK sekvencu, polinukleotid koji sadrži donorsku sekvencu koja se ubacuje takođe se daje ćeliji. Pod „donorskom sekvencom“ ili „donorm polinukleotidom“ podrazumeva se sekvenca nukleinske kiseline koja se ubaci na mesto cepanja indukovanog usmerenim modifikacionim polipeptidom. donor olinukleotid će sadržati dovoljnu homoloziju genomske sekvence na mestu cepanja, npr.
70%, 80%, 85%, 90%, 95% ili 100% homologije sa nukleotidnim sekvencama na obodu mesta cepanja, npr. unutar oko 50 baza ili manje mesta od cepanja, npr. unutar oko 30 baza, unutar oko 15 baza, unutar oko 10 baza, unutar oko 5 baza, ili odmah do mesta cepanja, da podrži homologno usmerenu popravku između nje i genomski redosled za koji snosi homoloziju. Približno 25, 50, 100 ili 200 nukleotida ili više od 200 nukleotida, homologije sekvence između donora i genomske sekvence (ili bilo koje integralne vrednosti između 10 i 200 nukleotida ili više) će podržati homologno usmerenu popravku. Donorske sekvence mogu biti bilo koje dužine, npr.
10 nukleotida ili više, 50 nukleotida ili više, 100 nukleotida ili više, 250 nukleotida ili više, 500 nukleotida ili više, 1000 nukleotida ili više, 5000 nukleotida ili više, itd.
[0242] Donorska sekvenca tipično nije identična genomskoj sekvenci koju zamenjuje. Umesto toga, donorska sekvenca može sadržati najmanje jednu ili više pojedinačnih izmena, umetanja, brisanja, inverzije ili preuređenja u odnosu na genomsku sekvencu, sve dok postoji dovoljna homologija da bi se podržala popravka usmerena homologijom. U nekim otelotvorenjima donorska sekvenca obuhvata ne-homolognu sekvencu na kojoj se nalaze dva regiona homologije, tako da popravka homologa između regiona ciljane DNK i dve okružujuće sekvence dovodi do umetanja ne-homologne sekvence u ciljanu regiju. Donorske sekvence mogu takođe sadržati vektorske opsege koje sadrže sekvence koje nisu homologne DNK regiji od interesa i koji nisu namijenjeni za ubacivanje u DNK regiju od interesa. Generalno, homologne regije donorske sekvence imaće najmanje 50% identičnosti sekvence u genomskoj sekvenci sa kojom se želi rekombinacija. U određenim otelotvorenjima je prisutno 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% ili 99,9% identičnosti sekvence. Bilo koja vrednost između 1% i 100% identičnosti sekvence može biti prisutna, u zavisnosti od dužine donorskog polinukleotida.
[0243] Donorska sekvenca može sadržati određene razlike u sekvenci u odnosu na genomsku sekvencu, npr. mesta restrikcije, nukleotidne polimorfizme, selektivne markere (npr. geni otpornosti na lekove, fluorescentni proteini, enzimi itd.) itd., koji se mogu koristiti za procenu uspešnog ubacivanja donorske sekvence na mesto cepanja ili u nekim slučajevima za druge svrhe (npr. da bi se označilo eksprimiranje na ciljanom genomskom lokusu). U nekim slučajevima, ako se nalaze u regionu kodiranja, takve razlike u nukleotidnoj sekvenci neće promeniti aminokiselinsku sekvencu, ili će učiniti tihe promene aminokiselina (tj. promene koje ne utiču na strukturu ili funkciju proteina). Alternativno, ove razlike sekvenci mogu uključivati bočne rekombinacione sekvence kao što su FLP, loxP sekvence ili slično, koje se mogu kasnije aktivirati za uklanjanje markerske sekvence.
[0244] Donorska sekvenca može se obezbediti ćeliji kao jednostruka DNK, jednostruka RNK, dvostruka DNK ili dvostruka RNK. Može se uvesti u ćeliju u linearnom ili kružnom obliku. Ako se uvede u linearnom obliku, krajevi donorske sekvence mogu biti zaštićeni (npr., od egzonukleolitičke degradacije) postupcima poznatim stručnjacima u oblasti. Na primer, jedan ili više dideokinukleotidnih ostataka se dodaju na 3' terminus linearnog molekula i/ili se samokomplementarni oligonukleotidi ligiraju na jedan ili oba kraja. Vidi, na primer, Chang et al. (1987) Proc. Natl. Acad Sci USA 84:4959-4963; nehls et al. (1996) Science 272:886-889. Dodatni postupci za zaštitu egzogenih polinukleotida od razgradnje uključuju, ali nisu ograničeni na, dodavanje terminalne amino grupe i upotrebe modifikovanih internukotidnih veza kao što su, na primer, fosforotioati, fosforamidati i O-metil-riboze ili ostaci oksibrioza. Kao alternativa zaštiti terminala linearne donorske sekvence, dodatne dužine sekvence mogu biti uključene van područja homologije koje se mogu degradirati bez utiecaja na rekombinaciju. Donorska sekvenca se može uneti u ćeliju kao deo vektorskog molekula koji ima dodatne sekvence, kao što su, na primer, poreklo replikacije, promoteri i geni koji kodiraju otpornost na antibiotike. Štaviše, donorske sekvence mogu se predstaviti kao gola nukleinska kiselina, kao nukleinska kiselina koja je složena sa agensom kao što je liposom ili poloksamer, ili se može isporučiti virusima (npr. adenovirusom, AAV), kako je opisano gore za nukleinske kiseline koje kodiraju RNK koja cilja DNK i/ili usmeren modifikacioni polipeptid i/ili donor polinukleotid.
[0245] Nakon gore opisanih postupaka, regija od interesa može se odvojiti i modifikovati, tj. „genetski modifikovti“, ex vivo. U nekim otelotvorenjima, kao kada je selektivni marker ubačen u DNK regiju od interesa, populacija ćelija može biti obogaćena onima koji sadrže genetsku modifikaciju izdvajanjem genetski modifikovanih ćelija od preostale populacije. Pre obogaćivanja, „genetski modifikovane“ ćelije mogu činiti samo oko 1% ili više (npr.2% ili više, 3% ili više, 4% ili više, 5% ili više, 6% ili više, 7% ili više, 8% ili više, 9% ili više, 10% ili više, 15% ili više, ili 20% ili više) populacije ćelija. Odvajanje „genetski modifikovanih“ ćelija može biti postignuto bilo kojom pogodnom tehnikom odvajanja odgovarajućom za odabrani marker koji se koristi. Na primer, ako je umetnut fluoroscentni marker, ćelije se mogu razdvojiti sortiranjem aktiviranih ćelija fluorescencije, dok je ukoliko je umetnut marker za površinu ćelije, ćelije mogu biti odvojene od heterogene populacije pomoću tehnika separacije afiniteta, npr. magnetno odvajanje, afinitetna hromatografija, „paniranje“ sa afinitetnim reagensom vezanim za čvrstu matricu ili drugom pogodnom tehnikom. Tehnike pružanja tačnog odvajanja uključuju fluorescentne aktivne sortere ćelija, koje mogu imati različite stepene sofisticiranosti, kao što su višestruki kolor kanali, kanali za detektovanje niskog ugla i tupe svetlosti, impedancijski kanali itd. Ćelije mogu biti izabrane prema mrtvim ćelijama upotrebom boja povezanih sa mrtvim ćelijama (npr. propidijum jodid). Bilo koja tehnika može biti upotrebljena koja nije nepotrebno štetna za održivost genetski modifikovanih ćelija. Sastavi ćelija koje su visoko obogaćene ćelijama koje sadrže modifikovanu DNK se postižu na ovaj način. Pod „visoko obogaćeni“ podrazumeva se da će genetski modifikovane ćelije biti 70% ili više, 75% ili više, 80% ili više, 85% ili više, 90% ili više sastava ćelija, na primer, oko 95 % ili više, ili 98% ili više sastava ćelija. Drugim rečima, sastav može biti suštinski čist sastav genetski modifikovanih ćelija.
[0246] Genetski modifikovane ćelije proizvedene opisanim ovde postupcima mogu se odmah koristiti. Alternativno, ćelije mogu biti zamrznute na temperaturi tečnog azota i čuvati se u dužem vremenskom periodu, mogu se odlediti, i ponovo koristiti. U takvim slučajevima, ćelije će se obično zamrznuti u 10% dimetilsulfoksida (DMSO), 50% seruma, 40% puferisanog medijuma ili nekom drugom takvom rastvoru koji se uobičajeno koristi u struci za očuvanje ćelija na takvim temperaturama zamrzavanja i otapanje na način koji je u struci poznat za odmrzavanje zamrznutih kultivisanih ćelija.
[0247] Genetski modifikovane ćelije mogu se kultivisati in vitro pod različitim uslovima kulture. Ćelije se mogu proširiti u kulturu, tj. uzgajati pod uslovima koji promovišu njihovu proliferaciju. Medijum kulture može biti tečni ili polučvrst, npr. populacija ćelija može se suspendovati u odgovarajućem hranljivom medijumu, kao što je Iskov modifikovan DMEM ili RPMI 1640, dopunjavan fetalnim serumom teleta ili inaktiviranim serumom koza (oko 5-10%), L-glutaminom, tiolom, posebno 2-merkaptoetanolom i antibioticima, npr. penicilin i streptomicin. Kultura može sadržati faktore rasta na koje ćelije odgovaraju. Faktori rasta, kako su ovde definisani, su molekuli sposobni da promovišu preživljavanje, rast i/ili diferencijaciju ćelija, bilo u kulturi ili u netaknutom tkivu, kroz specifične efekte na transmembranski receptor. Faktori rasta uključuju polipeptide i nepolipeptidne faktore.
[0248] Ćelije koje su na ovaj način genetski modifikovane mogu biti transplantirane pacijentu u svrhe kao što je genska terapija, npr. da leče bolest ili kao antivirusni, antipatogeni ili antikancerogeni terapeutik, za proizvodnju genetski modifikovanih organizama u poljoprivredi ili za biološka istraživanja. Pacijent može biti novorođenče, mlada ili odrasla osoba. Od posebnog interesa su pacijenti sisari. Vrste sisara koje se mogu tretirati ovim postupcima uključuju pse i mačke; konje; goveda; ovce; itd. i primate, posebno ljude. Životinjski modeli, naročito mali sisari (npr. miš, pacov, zamorac, hrčak, lagomorfi (npr., Zec) i sl.) mogu se koristiti za eksperimentalna istraživanja.
[0249] Ćelije mogu biti pružene pacijentu same ili sa odgovarajućim supstratom ili matricom, npr. da podrži njihov rast i/ili organizaciju u tkivu na koje se transplantiraju. Obično će se primenjivati najmanje 1x103 ćelija, na primer 5x103 ćelija, 1x104 ćelija, 5x104 ćelija, 1x105 ćelija, 1x106 ćelija ili više. Ćelije mogu biti uvedene pacijentu putem bilo kog od sledećih pravaca: parenteralno, subkutano, intravenozno, intrakranijalno, intraspinalno, intraokularno, ili u spinalnu tečnost. Ćelije se mogu uvesti injekcijom, katetrom ili slično. Primeri postupaka za lokalnu isporuku, odnosno dostavljanje na mesto povrede uključuju, npr. preko Omaja rezervoara, npr. za intratekalnu isporuku (pogledati npr. US Patent Nos.5,222,982 and 5385582); Ubrizgavanjem bolusa, npr. špricem, npr. u zglob; kontinualnom infuzijom, npr. putem kanulacije, npr. sa konvekcijom (pogledati npr. US Application No. 20070254842); ili implantiranjem uređaja na kome su ćelije rekuperno pričvršćene (pogledati npr. US Application Nos. 20080081064 and 20090196903). Ne-ljudske ćelije takođe mogu biti unete u ne-ljudski embrion (npr., blastocist) u svrhu stvaranja transgene životinje koja nije čovek (npr., transgeni miš).
[0250] Broj primena tretmana na pacijentu može se razlikovati. Uvođenje genetski modifikovanih ćelija u pacijenta može biti jednokratni događaj; ali u određenim situacijama takav tretman može izazvati poboljšanje u ograničenom vremenskom periodu i da zahteva stalnu seriju ponovljenih tretmana. U drugim situacijama može se zahtevati višestruka primena genetski modifikovanih ćelija pre nego što se primeti efekat. Tačni protokoli zavise od bolesti ili stanja, stadijuma bolesti i parametara pojedinačnog pacijenta koji se leči.
[0251] U drugim aspektima pronalaska, RNK koja cilja DNK i/ili usmeren modifikacioni polipeptid, koriste se za modifikovanje ćelijskog DNK in vivo, opet u svrhe kao što je genska terapija, npr. da leče bolest ili kao antivirusni, antipatogeni ili antikancerogeni terapeutik, za proizvodnju genetski modifikovanih organizama u poljoprivredi ili za biološka istraživanja. U ovim in vivo otelotvorenjima, RNK koja cilja DNK i/ili usmeren modifikacioni polipeptid daju se direktno pojedincu. RNK koja cilja DNK i/ili usmeren modifikacioni polipeptid i/ili donor polinukleotid mogu se primeniti bilo kojim od već poznatih postupaka u oblasti za administriranje peptida, malih molekula i nukleinskih kiselina pacijentu. RNK koja cilja DNK i/ili usmeren modifikacioni polipeptid i/ili donor polinukleotid mogu se inkorporirati u različite formulacije. Preciznije, RNK koja cilja DNK i/ili usmeren modifikacioni polipeptid i/ili donor polinukleotid mogu biti formulisan u farmaceutske sastave u kombinaciji sa odgovarajućim farmaceutski prihvatljivim nosačima ili razblaživačima.
[0252] Farmaceutski preparati su sastojci koji uključuju jednu ili više RNK koja cilja DNK i/ili usmeren modifikacioni polipeptid i/ili donor polinukleotida prisutne u farmaceutski prihvatljivom nosaču. „Farmaceutski prihvatljivi nosači“ mogu biti nosači odobrena od strane regulatorne agencije federalne ili državne vlade ili navedeni u U.S. Pharmacopeia ili drugoj opšte priznatoj farmakopeji za upotrebu kod sisara, kao što su ljudi. Izraz „nosač“ se odnosi na razblaživač, adjuvans ili ekscipijens sa kojim je jedinjenje prema pronalasku formulisano za primenu kod sisara. Takvi farmaceutski nosači mogu biti lipidi, npr. lipozomi, npr. lipozomski dendrimi; tečnosti, kao što su voda i ulja, uključujući one od nafte, životinjskog, biljnog ili sintetičkog porekla, kao što su ulje od kikirikija, soje, mineralno ulje, susamovo ulje i slično; gumna akacija, želatin, pasta skroba, talk, keratin, koloidni silicijum, urea i slično. Pored toga, mogu se koristiti pomoćni, stabilizujući, ageni za zgušnjavanje, maziva i agensi zano bojenje. Farmaceutski sastavi mogu se formulisati u preparate u čvrstim, polučvrstim, tečnim ili gasovitim oblicima, kao što su tablete, kapsule, praškovi, granule, masti, rastvori, supozitorijumi, injekcije, inhalanti, gelovi, mikrosfere i aerosoli. Kao takvih, primena RNK koja vezuje DNK i/ili usmerenog modifikacionog polipeptida i/ili donorskog polinukleotida može se postići na različite načine, uključujući oralnu, bukalnu, rektalnu, parenteralnu, intraperitonealno, intradermalnu, transdermalnu, intratrahealnu, intraokularnu, itd. primenu. Aktivni agens može biti sistemski nakon primene ili može biti lokalizovan upotrebom regionalne primene, intramuralne primene ili upotrebe implantata koji deluje da zadrži aktivnu dozu na mestu implantacije. Aktivni agens može biti formulisan za neposrednu aktivnost ili može biti formulisan za produženo oslobađanje.
[0253] Za neke uslove, posebno uslove centralnog nervnog sistema, možda će biti neophodno formulisati agense za prelazak krvno-moždane barijere (BBB). Jedna strategija za isporuku lekova preko krvno-moždane barijere (BBB) podrazumeva ometanje BBB, bilo osmotskim sredstvima kao što su manitol ili leukotrieni, ili biohemijski korišćenjem vazoaktivnih supstanci kao što je bradikinin. Mogućnost korišćenja BBB otvaranja za ciljanje specifičnih agenasa na tumore mozga takođe je opcija. Agens za ometanje BBB može se davati zajedno sa terapeutskim sastavima pronalaska kada se satavi daju intravaskularnom injekcijom. Druge strategije za prolaz kroz BBB mogu dovesti do korišćenja endogenih transportnih sistema, uključujući tranzitozu posredovanu na Caveolin-1, nosačem-posredovane transporteri kao što su nosači glukoze i aminokiselina, transcitoza posredovana receptorom za insulin ili transferin i aktivni efluks transporteri kao što je p-glikoprotein. Aktivni transportni ostaci takođe mogu biti konjugovani sa terapeutskim jedinjenjima za upotrebu u pronalasku kako bi se olakšao transport preko endotelnog zida krvnog suda. Alternativno, isporuka lekova terapeutskih agenasa iza BBB može biti lokalna isporuka, na primer putem intratekalne isporuke, npr. preko Omaja rezervoara (pogledati npr. US Patent Nos. 5,222,982 i 5385582); bolusa injekciom, npr. špricem, npr.
Intravitrealno ili intrakranijalno; kontinualnom infuzijom, npr. putem kanulacije, npr. sa konvekcijom (pogledati npr. US Application No.20070254842); ili implantiranjem uređaja na koji je agens reverzibilno postavljen (pogledati npr. US Application Nos. 20080081064 i 20090196903).
[0254] Uobičajeno, obezbeđena je efikasna količina RNK koja cilja DNK i/ili usmerenog modifikacionog polipeptida i/ili donorskog polinukleotida. Kao što je prethodno razmatrano u pogledu ex vivo postupaka, efikasna količina ili efikasna doza RNK koja cilja DNK i/ili usmerenog modifikacionog polipeptida i/ili donorskog polinukleotida in vivo je količina koja indukuje dvostruko povećanje ili više u količini rekombinacije koja se primećuje između dve homologne sekvence u odnosu na negativnu kontrolu, npr. ćelija u dodiru sa praznim vektorom ili irelevantnim polipeptidom. Količina rekombinacije se može meriti bilo kojim pogodnim postupkom, npr. kao što je gore opisano i poznato u struci. Izračunavanje efektivne količine ili efektivne doze RNK koja cilja DNK i/ili usmerenog modifikacionog polipeptida i/ili donorskog polinukleotida koja treba da se primeni, spada u veštinu prosečnog stručnjaka u oblasti i biće rutina stručnjacima u oblasti. Konačna količina koja treba da se primeni zavisiće od načina primene, i od prirode poremećaja ili stanja koji se trebaju lečiti.
[0255] Efikasna količina koja se daje određenom pacijentu zavisiće od različitih faktora, od kojih će se nekoliko razlikovati od pacijenta do pacijenta. Sposobni kliničar će moći da odredi efikasnu količinu terapeutskog agensa koji će pacijentu dati radi zaustavljanja ili obrtanja progresije bolesti ako je potrebno. Koristeći LD50 podatke o životinjama i druge informacije dostupne za agens, lekar može odrediti maksimalnu bezbednu dozu za pojedinca, zavisno od načina primene. Na primer, intravenski primenjena doza može biti viša od intratekalno primenjene doze, s obzirom na veću telesnu tečnost u koju se primenjuje terapeutski sastav. Slično tome, preparati koji se brzo uklanjaju iz tela mogu se primenjivati u većim dozama ili u ponovljenim dozama, kako bi se održala terapeutska koncentracija. Koristeći uobičajene veštine, sposobni lekar može biti u stanju da optimizuje dozu određene terapije u toku rutinskih kliničkih ispitivanja.
[0256] Za uključivanje u leka, RNK koja cilja DNK i/ili usmeren modifikacioni polipeptid i/ili donor polinukleotid mogu se dobiti iz odgovarajućeg komercijalnog izvora. Kao opšta pretpostavka, ukupna farmaceutski efikasna količina RNK koja cilja DNK i/ili usmerenog modifikacionog polipeptida i/ili donorskog polinukleotida koja je primenjena parenteralno po dozi će biti u opsegu koji se može izmeriti krivom odgovora na dozu.
[0257] Terapije zasnovane na RNK koja cilja DNK i/ili usmerenom modifikacionom polipeptidu i/ili donorskom polinukleotidu, tj. preparati RNK koja cilja DNK i/ili usmerenog modifikacionog polipeptida i/ili donorskog polinukleotida koje se koristi za terapijsku primenu, moraju biti sterilne. Sterilnost se lako postiže filtracijom kroz sterilne filtracione membrane (npr., membrane od 0,2 mm). Terapeutski preparati se generalno stavljaju u kontejner koji ima sterilni pristupni otvor, na primer, intravenoznu vreću za rastvor ili bočicu koja ima zatvarač koji može da se probije pomoću hipodermične injekcijske igle. Terapije zasnovane na RNK koja cilja DNK i/ili usmerenom modifikacionom polipeptidu i/ili donorskom polinukleotidu mogu se čuvati u kontejnerima za jedinične ili višestruke doze, na primer, zatvorenim ampulama ili bočicama, kao vodeni rastvor ili kao liofilizovana formulacija za rekonstituciju. Kao primer liofilizirane formulacije, 10-ml bočice se napune sa 5 ml sterilno filtriranog 1% (v/v) vodenog rastvora jedinjenja, i dobijena smeša se liofilizuje. Infuzioni rastvor se priprema rekonstituisanjem liofilizovanog jedinjenja korišćenjem bakteriostatske vode za injekcije.
[0258] Farmaceutski sastavi mogu, u zavisnosti od željene formulacije, da uključuju farmaceutski prihvatljive, netoksične nosače razblaživača, koje su definisane kao nosači koja se obično koriste za formulisanje farmaceutskih sastava za primenu na životinjama ili ljudima. Razređivač se bira tako da ne utiče na biološku aktivnost kombinacije. Primeri takvih razblaživača su destilovana voda, puferirana voda, fiziološki rastvor, PBS, Ringerov rastvor, rastvor dekstroze i Hankov rastvor. Pored toga, farmaceutski sastav ili formulacija može uključivati i druge nosače, aduvance ili netoksične, neaterapeutske, neimunogene stabilizatore, pomoćne supstance i slično. Sastavi mogu takođe uključiti dodatne supstance za približavanje fizioloških uslova, kao što su podešavanje pH i sredstva za puferovanje, sredstva za prilagođavanje toksičnosti, sredstva za vlaženje i deterdžente.
[0259] Sastav može takođe uključiti bilo koji od različitih stabilizujućih agenasa, kao što je na primer antioksidant. Kada farmaceutski sastav uključuje polipeptid, polipeptid se može složiti sa različitim poznatim jedinjenjima koja poboljšavaju in vivo stabilnost polipeptida ili na drugi način poboljšavaju njegove farmakološke osobine (npr. povećavaju polu-život polipeptida, smanjuju njegovu toksičnost, poboljšaavaju rastvorljivost ili upijanje). Primeri takvih modifikacija ili kompleksirajućih agenasa uključuju sulfat, glukonat, citrat i fosfat. Nukleinske kiseline ili polipeptidi sastava takođe mogu biti složeni sa molekulima koji poboljšavaju njihove in vivo atribute. Takvi molekuli uključuju, na primer, ugljene hidrate, poliamine, aminokiseline, druge peptide, jone (npr. natrijum, kalijum, kalcijum, magnezijum, mangan) i lipide.
[0260] Dalje smernice u vezi sa formulacijama koje su pogodne za različite vrste primene mogu se naći u Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mace Publishing Company, Philadelphia, Pa., 17th ed. (1985). Za kratak pregled postupaka za isporuku lekova, pogledajte Langer, Science 249:1527-1533 (1990).
[0261] Farmaceutski sastavi se mogu primenjivati za profilaktičke i/ili terapeutske tretmane. Toksičnost i terapeutska efikasnost aktivnog sastojka mogu se odrediti prema standardnim farmaceutskim postupcima u ćelijskim kulturama i/ili eksperimentalnim životinjama, uključujući, na primer, određivanje LD50 (doza smrtonosna za 50% populacije) i ED50 (doza terapeutski efikasna kod 50% populacije). Odnos doza između toksičnih i terapijskih efekata je terapeutski indeks i može se izraziti kao odnos LD50/ED50. Poželjne su terapije koje pokazuju velike terapeutske indekse.
[0262] Podaci dobijeni iz ćelijske kulture i/ili ispitivanja na životinjama mogu se koristiti u formulisanju opsega doza za ljude. Doziranje aktivnog sastojka tipično se pojavljuje u opsegu koncentracija cirkulacije koje uključuju ED50 sa niskom toksičnošću. Doziranje se može razlikovati unutar ovoga opsega u zavisnosti od korišćenog doznog oblika i korišćenog načina primene.
[0267] Komponente koje se koriste za formulaciju farmaceutskih sastava su poželjno visoke čistoće i suštinski bez potencijalno štetnih zagađujućih materija (npr. najmanje National Food (NF) kvaliteta, generalno najmanje analitičkog kvaliteta, a najčešće barem farmaceutskog kvaliteta). Štaviše, sastavi namenjeni za in vivo primenu su obično sterilni. U meri u kojoj se dato jedinjenje mora sintetisati pre upotrebe, dobijeni proizvod je obično u značajnoj meri bez potencijalno toksičnih agenasa, naročito svih endotoksina, koji mogu biti prisutni tokom procesa sinteze ili prečišćavanja. Sastavi za roditeljsku primenu su takođe sterilne, u suštini izotonične i izrađene pod GMP uslovima.
[0264] Efikasna količina terapeutskog sastava koja treba da se daje određenom pacijentu zavisiće od različitih faktora, od kojih će se nekoliko razlikovati od pacijenta do pacijenta. Sposobni kliničar će moći da odredi efikasnu količinu terapeutskog agensa koji će pacijentu dati radi zaustavljanja ili obrtanja progresije bolesti ako je potrebno. Koristeći LD50 podatke o životinjama i druge informacije dostupne za agens, lekar može odrediti maksimalnu bezbednu dozu za pojedinca, zavisno od načina primene. Na primer, intravenski primenjena doza može biti viša od intratekalno primenjene doze, s obzirom na veću telesnu tečnost u koju se primenjuje terapeutski sastav. Slično tome, preparati koji se brzo uklanjaju iz tela mogu se primenjivati u većim dozama ili u ponovljenim dozama, kako bi se održala terapeutska koncentracija. Koristeći uobičajene veštine, sposobni lekar može biti u stanju da optimizuje dozu određene terapije u toku rutinskih kliničkih ispitivanja.
Genetski modifikovane matične ćelije
[0265] Ovo obelodanjenje pruža genetski modifikovane ćelije domaćine, uključujući izolovane genetski modifikovane ćelije domaćine, gde genetski modifikovana ćelija domaćina obuhvata (genetski je modifikovana sa: 1) egzogenom RNK koja cilja DNK; 2) egzogenom nukleinskom kiselinom koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira RNK koja cilja DNK; 3) egzogenim usmerenim modifikacionim polipeptiom (npr., Cas9 koji se prirodno pojavljuje, modifikovan, tj. mutiran ili varijantu, Cas9, himerni Cas9 itd.); 4) egzogenom nukleinskom kiselinom koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira usmeren modifikacioni polipeptid; ili 5) bilo koju kombinacija gore navedenog. Predmetna genetski modifikovana ćelija generiše se genetskim modifikovanjem ćelije domaćina sa, na primer: 1) egzogenom RNK koja cilja na DNK; 2) egzogenom nukleinskom kiselinom koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira RNK koja cilja DNK; 3) egzogenim usmerenim modifikacionim polipeptiom; 4) egzogenom nukleinskom kiselinom koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira usmeren modifikacioni polipeptid; ili 5) bilo kojom kombinacijom gore navedenog.).
[0266] Sve ćelije pogodne da budu ciljane ćelije takođe su pogodne da budu genetski modifikovana ćelija domaćin. Na primer, genetski modifikovane ćelije domaćini koji su od interesa mogu biti ćelija iz bilo kog organizma (npr. bakterijska ćelija, arhealna ćelija, ćelija jednoćelijskog eukariotskog organizma, biljna ćelija, ćelija algi, npr. botryococcus braunii, Chlamydomonas reinhardtii, Nannochloropsis gaditana, Chlorella pyrenoidosa, Sargassum patens C. Agardh i slično, glivične ćelije (npr. ćelije kvasca), ćelije životinja, ćelije beskičmenjaka (npr. voćna muva, cnidarijan, ehinoderm, nematode , Itd.), ćelije kičmenjaka (npr. riba, vodozemaca, gmizavaca, ptica, sisara), ćelija sisara (npr. svinja, krava, koza, ovca, glodavar, pacov, Miš, primati bez ljudi, čovek, itd.) itd.
[0267] U nekim otelotvorenjima, genetski modifikovana ćelija domaćina je genetski modifikovana sa egzogenom nukleinskom kiselinom koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira usmeren modifikacioni polipeptid, (npr., Cas9 koji se prirodno pojavljuje, modifikovan, tj. mutiran ili varijantu, Cas9, himerni Cas9 itd.). DNK genetski modifikovane ćelije domaćina može biti ciljana za modifikaciju uvođenjem u ćeliju RNK koja cilja DNK (ili DNK koja kodira RNK koja cilja DNK, koja određuje genomsku lokaciju/sekvencu koja treba da se modifikuje) i opciono donorsku nukleinsku kiselinu. U nekim otelotvorenjima, nukleotidna sekvenca koja kodira usmeren modifikacioni polipeptid operativno je povezana sa inducibilnim promoterom (npr. promoterom toplotnog šoka, promoterom regulisanim tetraciklinom, promoterom regulisanim steroidom, promoterom regulisanim metalom, promoterom regulisanim receptorom estrogena itd.). U nekim otelotvorenjima, nukleotidna sekvenca koja kodira usmeren modifikacioni polipeptid funkcionalno je povezana sa prostorno ograničenim i/ili ograničenim promoterom (npr. promoter specifičan za tkivo, promoter specifičnog tipa ćelije, itd.). U nekim otelotvorenjima, nukleotidna sekvenca koja kodira usmeren modifikacioni polipeptid, operativno je povezana sa konstitutivnim promoterom.
[0268] U nekim otelotvorenjima, predmetna genetski modifikovana ćelija domaćin je in vitro. U nekim otelotvorenjima, predmetna genetski modifikovana ćelija domaćina je in vivo. U nekim otelotvorenjima, predmetna genetski modifikovana ćelija domaćina je prokariotska ćelija ili je izvedena iz prokariotske ćelije. U nekim otelotvorenjima, predmetna genetski modifikovana ćelija domaćina je bakterijska ćelija ili je izvedena iz bakterijske ćelije. U nekim otelotvorenjima, predmetna genetski modifikovana ćelija domaćina je arhealna ćelija ili je izvedena iz arhealne ćelije. U nekim otelotvorenjima, predmetna genetski modifikovana ćelija domaćina je eukariotska ćelija ili je izvedena iz eukariotske ćelije. U nekim otelotvorenjima, predmetna genetski modifikovana ćelija domaćina je biljna ćelija ili je izvedena iz biljne ćelije. U nekim otelotvorenjima, predmetna genetski modifikovana ćelija domaćina je životinjska ćelija ili je izvedena iz životinjske ćelije. U nekim otelotvorenjima, predmetna genetski modifikovana ćelija domaćina je ćelija beskičmenjaka ili je izvedena iz ćelije beskičmenjaka. U nekim otelotvorenjima, predmetna genetski modifikovana ćelija domaćin je ćelija kičmenjaka ili je izvedena iz ćelije kičmenjaka. U nekim otelotvorenjima, predmetna genetski modifikovana ćelija domaćina je ćelija sisara ili je izvedena iz ćelije sisara. U nekim otelotvorenjima, predmetna genetski modifikovana ćelija domaćina je ćelija glodara ili je izvedena iz ćelije glodara. U nekim otelotvorenjima, predmetna genetski modifikovana ćelija domaćina je ćelija čoveka ili je izvedena iz ćelije čoveka.
[0269] Ovo obelodanjenje dalje daje potomstvo predmetne genetski modifikovane ćelije, gde potomstvo može sadržati istu egzogenu nukleinsku kiselinu ili polipeptid kao predmetna genetski modifikovanu ćelija iz koje je izvedeno. Ovo obelodanjenje dalje daje sastav koji sadrži predmetnu genetski modifikovanu ćeliju domaćina.
Genetski modifikovane matične ćelije i genetski modifikovane progenitorska ćelije
[0270] U nekim otelotvorenjima, genetski modifikovana ćelija domaćina je genetski modifikovana matična ćelija ili progenitorska ćelija. Odgovarajuće ćelije domaćina uključuju, na primer, matične ćelije (odrasle matične ćelije, embrionalne matične ćelije, iPS ćelije itd.) i progenitorske ćelije (npr., kardijalne progenitorske ćelije, ćelije neuralnih progenita itd.). Odgovarajuće ćelije domaćina uključuju matične ćelije sisara i progenitorske ćelije, uključujući, na primer, matične ćelije glodara, progenitorske ćelije glodara, ljudske matične ćelije, ljudske progenitorske ćelije itd. Pogodne ćelije domaćina uključuju ćelije domaćine in vitro, na primer, izolovane ćelije domaćina.
[0271] U nekim otelotvorenjima, predmetna genetski modifikovana ćelija domaćina sadrži egzogenu RNK koja cilja DNK nukleinsku kiselinu. U nekim otelotvorenjima, predmetna genetski modifikovana ćelija domaćina sadrži egzogenu nukleinsku kiselinu koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira RNK koja cilja DNK. U nekim otelotvorenjima predmetna genetski modifikovana ćelija domaćina sadrži egzogeni usmeren modifikacioni polipeptid, (npr., Cas9 koji se prirodno pojavljuje, modifikovan, tj. mutiran ili varijantu, Cas9, himerni Cas9 itd.). U nekim otelotvorenjima, predmetna genetski modifikovana ćelija domaćina sadrži egzogenu nukleinsku kiselinu koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira usmeren modifikacioni polipeptid. U nekim otelotvorenjima predmetna genetski modifikovana ćelija domaćina sadrži egzogenu nukleinsku kiselinu koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira 1) RNK koja cilja DNK i 2) usmeren modifikacioni polipeptid.
[0272] U nekim slučajevima, usmeren modifikacioni polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 99% ili 100% identičnosti aminokiselinske sekvence sa aminokiselinama 7-166 ili 731-1003 od Cas9/Csn1 aminokiselinske sekvence prikazane na Slici 3, ili sa odgovarajućim delovima bilo koje od aminokiselinskih sekvenca datih SEQ ID NO: 1-256 i 795-1346.
SASTAVI
[0273] Ovaj pronalazak pruža sastav koji sadrži predmetnu RNK koja cilja DNK i/ili usmeren modifikacioni polipeptid. U nekim slučajevima, usmeren modifikacioni polipeptid je predmetni himerni polipeptid. Predmetni sastav je koristan za sprovođenje postupka ovog obelodanjenja, na primer, postupak za specifičnu modifikaciju ciljane DNK; postupak za specifičnu modifikaciju polipeptida vezanog za ciljanu DNK; itd.
Sastavi koje sadrže RNK koja cilja DNK
[0274] Ovaj pronalazak pruža sastav koji sadrži predmetnu RNK koja cilja DNK. Sastav može da sadrži, pored RNK koja cilja DNK, jedno ili više od: so, npr., naCl, MgCl2, KCl, MgSO4itd.; n-(2-hidroksietil)piperazin-N'-(2-etansulfonska kiselina) (HEPES), 2-(N-morfolino)etansulfonska kiselina (MES), MES natrijumova so, 3-(N-morfolino)propan-sulfonska kiselina (MOPS), N-tris[hidroksimetil]metil-3-aminopropansulfonska kiselina (TAPS) itd.; agens za rastvaranje; deterdžent, npr., nejonski deterdžent kao što je Tween20 itd.; inhibitor nukleaze; i slično. Na primer, u nekim slučajevima, predmetni sastav sadrži predmetnu RNK koja cilja DNK i pufer za stabilizaciju nukleinskih kiselina.
[0275] U nekim otelotvorenjima, RNK koja cilja DNK, prisutna u predmetnom sastavu, je čista, npr. najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95% %, najmanje oko 98%, najmanje oko 99% ili više od 99% čista, gde „% čistoće“ znači da RNK koja cilja DNK u navedenom procentu bez drugih makromolekula ili zagađivača koji mogu biti prisutni tokom proizvodnje RNK koja cilja DNK.
Sastavi koje sadrže predmetni himerni polipeptid
[0276] Ovde je opisan sastav koji sadrži himerni polipeptid kao što je opisano gore. Sastav može da sadrži, pored RNK koja cilja DNK, jedno ili više od: so, npr., naCl, MgCl2, KCl, MgSO4itd.; puferni agens, npr. tris pufer, HEPES, MES, MES natrijumova so, MOPS, TAPS itd.; agens za rastvaranje; deterdžent, npr., nejonski deterdžent kao što je Tween-20 itd.; inhibitor proteaze; redukcioni agens (npr., ditiotreitol); i slično.
[0277] U nekim otelotvorenjima, himerni polipeptid koji je prisutan u sastavu je čist, npr. najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, kod najmanje oko 98%, najmanje oko 99% ili više od 99% čiste, gde „% čistoće“ znači da je usmeren modifikacioni polipeptid u navedenom procentu bez drugih makromolekula ili zagađivača koji mogu biti prisutni tokom proizvodnje RNK koja cilja DNK.
Sastavi koje sadrže RNK koja cilja DNK i usmeren modifikacioni polipeptid
[0278] Ovaj pronalazak pruža sastav koja sadrži: (i) RNK koja cilja DNK ili DNK polinukleotid koji kodira isto; i ii) usmeren modifikacioni polipeptid, ili polinukleotid koji kodira isto. U nekim slučajevima, usmeren modifikacioni polipeptid je predmetni himerni usmeren modifikacioni polipeptid. U drugim slučajevima, usmeren modifikacioni polipeptid je prirodno prisutan usmeren modifikacioni polipeptid. U nekim slučajevima, usmeren modifikacioni polipeptid pokazuje enzimsku aktivnost koja modifikuje ciljanu DNK. U drugim slučajevima, usmeren modifikacioni polipeptid, pokazuje enzimsku aktivnost koja modifikuje polipeptid koji je povezan sa ciljanom DNK. U još nekim slučajevima, usmeren modifikacioni polipeptid modulira transkripciju ciljane DNK.
[0279] Ovaj pronalazak pruža sastav koji sadrži: (i) RNK koja cilja DNK, kao što je prethodno opisano, ili DNK polinukleotid koji kodira isto, gde RNK koja cilja DNK koja sadrži: (a) prvi segment koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja je komplementarna sekvenci u ciljanoj DNK; i (b) drugi segment koji interakuje sa usmerenim modifikacionim polipeptidom; i (ii) usmeren modifikacioni polipeptid, ili polinukleotid koji kodira isto, gde usmeren modifikacioni polipeptid sadrži: (a) deo koji se vezuje za RNK koja interakuje sa RNK koja cilja DNK; i (b) deo aktivnosti koji pokazuje usmerenu enzimsku aktivnost, pri čemu se mesto enzimske aktivnosti određuje pomoću RNK koja cilja DNK.
[0280] U nekim slučajevima, predmetni sastav sadrži: sastav koji sadrži: (i) predmetnu RNK koja cilja DNK, gde RNK koja cilja DNK sadrži: (a) prvi segment koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja je komplementarna sekvenci u ciljanoj DNK; i (b) drugi segment koji interakuje sa usmerenim modifikacionim polipeptidom; i (ii) usmeren modifikacioni polipeptid, gde usmeren modifikacioni polipeptid sadrži: (a) deo koji se vezuje za RNK, koji interakuje sa RNK koja cilja DNK; i (b) deo aktivnosti koji pokazuje usmerenu enzimsku aktivnost, pri čemu se mesto enzimske aktivnosti određuje pomoću RNK koja cilja DNK.
[0281] U drugim otelotvorenjima, predmetni sastav sadrži: (i) polinukleotid koji kodira predmetnu RNK koja cilja DNK, gde RNK koja cilja DNK sadrži: (a) prvi segment koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja je komplementarna sekvenci u ciljanoj DNK; i (b) drugi segment koji interakuje sa usmerenim modifikacionim polipeptidom; i (ii) polinukleotid koji kodira usmeren modifikacioni polipeptid, gde usmeren modifikacioni polipeptid sadrži: (a) deo koji se vezuje za RNK, koji interakuje sa RNK koja cilja DNK; i (b) deo aktivnosti koji pokazuje usmerenu enzimsku aktivnost, pri čemu se mesto enzimske aktivnosti određuje pomoću RNK koja cilja DNK.
[0282] U nekim otelotvorenjima predmetni sastav uključuje oba RNK molekula od dvomolekulske RNK koja cilja DNK. Takav sastav, u nekim otelotvorenjima predmetni sastav može uključivati aktivator-RNK koja obuhvata segment koji formira dupleks koji je komplementaran segmentu koji formira dupleks RNK koja cilja (pogledati Sliku 1A). Segmenti koji formiraju dupleks aktivator RNK i targeter-RNK hibridizuju se tako da formiraju dsRNK dupleks segmenta vezivanja proteina ciljane RNK koja cilja DNK. Targeter-RNK dalje pruža segment ciljanja DNK (jednostruki) od RNK koja cilja DNK i stoga navodi RNK koja cilja DNK na specifičnu sekvencu unutar ciljane DNK. Kao jedan neograničavajući primer, segment segment koji formira dupleks od aktivator-RNK sadrži nukleotidnu sekvencu koja ima najmanje oko 70%, najmanje oko 80%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 98% , ili 100% identičnosti sa sekvencom 5'-UAGCAAGUUAAAAU-3' (SEQ ID NO: 562). Kao još jedan neograničavajući primer, segment segment koji formira dupleks od RNK koja cilja sadrži nukleotidnu sekvencu koja ima najmanje oko 70%, najmanje oko 80%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 98% ili 100% identičnosti sa sekvencom 5’-GUUUUAGAGCUA-3’ (SEQ ID NO:679).
[0283] Ovo obelodanjenje pruža sastav koja sadrži: (i) RNK koja cilja DNK ili DNK polinukleotid koji kodira isto, gde RNK koja cilja DNK sadrži: (a) prvi segment koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja je komplementarna sekvenci u ciljanoj DNK; i (b) drugi segment koji interakuje sa usmerenim modifikacionim polipeptidom; i (ii) usmeren modifikacioni polipeptid, ili polinukleotid koji kodira isto, gde usmeren modifikacioni polipeptid sadrži: (a) deo koji se vezuje za RNK, koji interakuje sa RNK koja cilja DNK; i (b) deo aktivnosti koji modulira transkripciju unutar ciljane DNK, pri čemu se mesto modulirane transkripcije unutar ciljane DNK određuje pomoću RNK koja cilja DNK.
[0284] Na primer, u nekim slučajevima, predmetni sastav sadrži: (i) RNK koja cilja DNK, gde RNK koja cilja DNK koja sadrži: (a) prvi segment koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja je komplementarna sekvenci u ciljanoj DNK; i (b) drugi segment koji interakuje sa usmerenim modifikacionim polipeptidom; i (ii) usmeren modifikacioni polipeptid, gde usmeren modifikacioni polipeptid sadrži: (a) deo koji se vezuje za RNK, koji interakuje sa RNK koja cilja DNK; i (b) deo aktivnosti koji modulira transkripciju unutar ciljane DNK, pri čemu se mesto modulirane transkripcije unutar ciljane DNK određuje pomoću RNK koja cilja DNK.
[0285] Kao još jedan primer, u nekim slučajevima, predmetni sastav sadrži: (i) DNK polinukleotid koji kodira RNK koja cilja DNK, gde RNK koja cilja DNK koja sadrži: (a) prvi segment koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja je komplementarna sekvenci u ciljanoj DNK; i (b) drugi segment koji interakuje sa usmerenim modifikacionim polipeptidom; i (ii) polinukleotid koji kodira usmeren modifikacioni polipeptid, gde usmeren modifikacioni polipeptid sadrži: (a) deo koji se vezuje za RNK, koji interakuje sa RNK koja cilja DNK; i (b) deo aktivnosti koji modulira transkripciju unutar ciljane DNK, pri čemu se mesto modulirane transkripcije unutar ciljane DNK određuje pomoću RNK koja cilja DNK.
[0286] Predmetni sastav može sadržati, pored i) predmetnu RNK koja cilja DNK, ili DNK polinukleotid koji kodira isto; i ii) usmeren modifikacioni polipeptid, ili polinukleotid koji kodira isto, jedno ili više od: so, npr., naCl, MgCl2, KCl, MgSO4itd.; puferni agens, npr. tris pufer, HEPES, MES, MES natrijumova so, MOPS, TAPS itd .; agens za rastvaranje; deterdžent, npr., nejonski deterdžent kao što je Tween-20 itd.; inhibitor proteaze; redukcioni agens (npr., ditiotreitol); i slično.
[0287] U nekim slučajevima komponente sastava su pojedinačno čiste, npr. svaka od komponenti je najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 98%, najmanje oko 99%, ili najmanje 99%, čista. U nekim slučajevima pojedinačne komponente predmetnog sastava su čiste pre dodavanja u sastav.
[0288] Na primer, u nekim otelotvorenjima, usmeren modifikacioni polipeptid prisutan u predmetnom sastavu je čist, npr. najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 98%, najmanje oko 99% ili više od 99% čist, gde „% čistoće“ znači da je usmeren modifikacioni polipeptid naveden u procentu u kom je bez drugih proteina (npr. proteini osim usmerenog modifikacionog polipeptida), drugih makromolekula ili zagađivača koji mogu biti prisutni u toku proizvodnje usmerenog modifikacionog polipeptida.
OPREMA
[0289] Ovo obelodanjenje nudi komplete za otelotvorenje predmetnog postupka. Predmetni komplet može uključivati jedno ili više od: usmeren modifikacioni polipeptid; nukleinska kiselina koja sadrži nukleotid koji kodira usmeren modifikacioni polipeptid; RNK koja cilja DNK; nukleinska kiselina koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira RNK koja cilja DNK; aktivator-RNK; nukleinska kiselina koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira aktivator-RNK; targeter-RNK; i nukleinska kiselina koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira targeter-RNK. Usmeren modifikacioni polipeptid; nukleinska kiselina koja sadrži nukleotid koji kodira usmeren modifikacioni polipeptid; RNK koja cilja DNK; nukleinska kiselina koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira RNK koja cilja DNK; aktivator-RNK; nukleinska kiselina koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira aktivator-RNK; targeter-RNK; i nukleinska kiselina koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira RNK koja cilja, su detaljno opisani iznad. Komplet može obuhvatiti kompleks koji sadrži dva ili više od: usmeren modifikacioni polipeptid; nukleinska kiselina koja sadrži nukleotid koji kodira usmeren modifikacioni polipeptid; RNK koja cilja DNK; nukleinska kiselina koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira RNK koja cilja DNK; aktivator-RNK; nukleinska kiselina koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira aktivator-RNK; targeter-RNK; i nukleinska kiselina koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira targeter-RNK.
[0290] U nekim otelotvorenjima, predmetni komplet sadrži usmeren modifikacioni polipeptid, ili polinukleotid koji kodira isti. Neki usmereni modifikacioni polipeptidi opisani ovde obuhvataju: (a) deo koji se vezuje za RNK, koji interakuje sa RNK koja cilja DNK; i (b) deo aktivnosti koji modulira transkripciju unutar ciljane DNK, pri čemu je mesto modulirane transkripcije unutar ciljane DNK određeno pomoću RNK koja cilja DNK . U nekim slučajevima, deo aktivnosti usmerenog modifikacionog polipeptida na položaj pokazuje smanjenu ili inaktiviranu aktivnost nukleaze. U nekim slučajevima, polipeptid koji je usmeren na položaj je himerni usmeren modifikacioni polipeptid opisan ovde.
[0291] U nekim otelotvorenjima, predmetni komplet sadrži: usmeren modifikacioni polipeptid, ili polinukleotid koji kodira isto, i reagens za rekonstituciju i/ili razblaživanje usmerenog modifikacionog polipeptida. U drugim otelotvorenjima, predmetni komplet sadrži nukleinsku kiselinu (npr., DNK, RNK) koja sadrži nukleotid koji kodira usmeren modifikacioni polipeptid. U nekim otelotvorenjima, predmetni komplet sadrži: nukleinsku kiselinu (npr., DNK, RNK) koja sadrži nukleotid koji kodira usmeren modifikacioni polipeptid; i reagens za rekonstituciju i/ili razblaživanje usmerenog modifikacionog polipeptida.
[0292] Predmetni komplet koji sadrži usmeren modifikacioni polipeptid ili polinukleotid koji kodira isto, može dalje da sadrži jedan ili više dodatnih reagensa, gde se takvi dodatni reagensi mogu izabrati iz: pufera za uvođenje usmerenog modifikacionog polipeptida u ćeliju; pufer za pranje; kontrolni reagens; kontrolni vektor eksprimiranja ili RNK polinukleotid; reagens za in vitro proizvodnju usmerenog modifikacionog polipeptida iz DNK, i slično. U nekim slučajevima, usmeren modifikacioni polipeptid koji je uključen u komplet je himerni usmeren modifikacioni polipeptid, kako je gore opisano.
[0293] U nekim otelotvorenjima, predmetni komplet sadrži RNK koja cilja DNK ili DNK polinukleotid koji kodira isto, gde RNK koja cilja DNK sadrži: (a) prvi segment koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja je komplementarna sekvenci u ciljanoj DNK; i (b) drugi segment koji interakuje sa usmerenim modifikacionim polipeptidom. U nekim otelotvorenjima, RNK koja cilja DNK dalje sadrži treći segment (kao što je gore opisano). U nekim otelotvorenjima, predmetni komplet sadrži: (i) RNK koja cilja DNK ili DNK polinukleotid koji kodira isto, gde RNK koja cilja DNK koja sadrži: (a) prvi segment koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja je komplementarna sekvenci u ciljanoj DNK; i (b) drugi segment koji interakuje sa usmerenim modifikacionim polipeptidom; i (ii) usmeren modifikacioni polipeptid, ili polinukleotid koji kodira isto, gde usmeren modifikacioni polipeptid sadrži: (a) deo za vezivanje RNK koja interakuje sa RNK koja cilja DNK; i (b) deo aktivnosti koji pokazuje usmerenu enzimsku aktivnost, pri čemu se mesto enzimske aktivnosti određuje pomoću RNK koja cilja DNK. U nekim otelotvorenjima, deo aktivnosti usmerenog modifikacionog polipeptida ne pokazuje enzimsku aktivnost (sadrži inaktiviranu nukleazu, npr., putem mutacije). U nekim slučajevima, komplet sadrži RNK koja cilja DNK i usmeren modifikacioni polipeptid. U drugim slučajevima, komplet sadrži: (i) nukleinsku kiselinu koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira RNK koja cilja DNK; i (ii) nukleinsku kiselinu koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira usmeren modifikacioni polipeptid.
[0294] Kao još jedan primer, predmetni komplet može uključivati: (i) RNK koja cilja DNK ili DNK polinukleotid koji kodira isto, koji sadrži: (a) prvi segment koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja je komplementarna sekvenci u ciljanoj DNK; i (b) drugi segment koji interakuje sa usmerenim modifikacionim polipeptidom; i (ii) usmeren modifikacioni polipeptid, ili polinukleotid koji kodira isto, koji sadrži: (a) deo koji se vezuje za RNK, koji interakuje sa RNK koja cilja DNK; i (b) deo aktivnosti koji modulira transkripciju unutar ciljane DNK, pri čemu se mesto modulisane transkripcije unutar ciljane DNK određuje pomoću RNK koja cilja DNK . U nekim slučajevima, komplet sadrži: (i) RNK koja cilja DNK; i usmeren modifikacioni polipeptid. U drugim slučajevima, komplet sadrži: (i) nukleinsku kiselinu koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira RNK koja cilja DNK; i (ii) nukleinsku kiselinu koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira usmeren modifikacioni polipeptid.
[0295] Ovo obelodanjenje pruža komplet koji sadrži: (1) rekombinantni vektor eksprimiranja koji sadrži (i) nukleotidnu sekvencu koja kodira RNK koja cilja DNK, gde RNK koja cilja na DNK sadrži: (a) prvi segment koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja je komplementarna sekvenci u ciljanoj DNK; i (b) drugi segment koji interakuje sa usmerenim modifikacionim polipeptidom; i (ii) nukleotidnu sekvencu koja kodira usmeren modifikacioni polipeptid, gde usmeren modifikacioni polipeptid sadrži: (a) deo koji se vezuje za RNK koja interakuje sa RNK koja cilja DNK; i (b) deo aktivnosti koji pokazuje usmerenu enzimsku aktivnost, pri čemu se mesto enzimske aktivnosti određuje pomoću RNK koja cilja DNK; i (2) reagens za rekonstituciju i/ili razblaživanje vektora eksprimiranja.
[0296] Ovo obelodanjenje pruža komplet koji sadrži: (1) rekombinantni vektor eksprimiranja koji sadrži: (i) nukleotidnu sekvencu koja kodira RNK koja cilja DNK, pri čemu RNK koja cilja na DNK sadrži: (a) prvi segment koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja je komplementarna sekvenci u ciljanoj DNK; i (b) drugi segment koji interakuje sa usmerenim modifikacionim polipeptidom; i (ii) nukleotidnu sekvencu koja kodira usmeren modifikacioni polipeptid, gde usmeren modifikacioni polipeptid sadrži: (a) deo koji se vezuje za RNK koja interakuje sa RNK koja cilja DNK; i (b) deo aktivnosti koji modulira transkripciju unutar ciljane DNK, pri čemu se mesto modulirane transkripcije unutar ciljane DNK određuje pomoću RNK koja cilja DNK; i (2) reagens za rekonstituciju i/ili razblaživanje rekombinantnog vektora eksprimiranja.
[0297] Ovo obelodanjenje pruža komplet koji sadrži: (1) rekombinantni vektor eksprimiranja koji sadrži nukleinsku kiselinu koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira RNK koja cilja DNK koja sadrži: (i) prvi segment koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja je komplementarna sekvenci u ciljanoj DNK; i (ii) drugi segment koji interakuje sa usmerenim modifikacionim polipeptidom; i (2) reagens za rekonstituciju i/ili razblaživanje rekombinantnog vektora eksprimiranja. U nekim otelotvorenjima ovog kompleta, komplet sadrži: rekombinantni vektor eksprimiranja koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira usmeren modifikacioni polipeptid, pri čemu usmeren modifikacioni polipeptid obuhvata: (a) deo koji se vezuje za RNK koja interakuje sa RNK koja cilja DNK; i (b) deo aktivnosti koji pokazuje usmerenu enzimsku aktivnost, pri čemu se mesto enzimske aktivnosti određuje pomoću RNK koja cilja DNK. U drugim otelotvorenjima ovog kompleta, komplet sadrži: rekombinantni vektor eksprimiranja koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira usmeren modifikacioni polipeptid, pri čemu usmeren modifikacioni polipeptid obuhvata: (a) deo koji se vezuje za RNK koja interakuje sa RNK koja cilja DNK; i (b) deo aktivnosti koji modulira transkripciju unutar ciljane DNK, pri čemu se mesto modulirane transkripcije unutar ciljane DNK određuje pomoću RNK koja cilja DNK .
[0298] U nekim otelotvorenjima bilo kog od navedenih kompleta, komplet sadrži aktivator-RNK ili targeter-RNK. U nekim otelotvorenjima bilo kog od navedenih kompleta, komplet sadrži jednomolekulsku RNK koja cilja DNK. U nekim otelotvorenjima bilo kog od gore navedenih kompleta, komplet sadrži dve ili više jednomolekulske ili dvomolekulske RNK koja ciljaju DNK. U nekim otelotvorenjima bilo kog od gore navedenih kompleta, RNK koja cilja DNK (npr. uključujući dve ili više RNK koja ciljjua DNK) može biti data kao niz (npr. niz molekula RNK, niz molekula DNK koji kodiraju RNK koja cilja DNK, itd.). Takvi kompleti mogu biti korisni, na primer, za upotrebu u spoju sa gore opisanim genetski modifikovanim ćelijama domaćina koji sadrže predmetni modifikovani polipeptid. U nekim otelotvorenjima bilo kog od gore navedenih kompleta, komplet dalje sadrži donor polinukleotid da bi učinio željenu genetsku modifikaciju. Komponente predmetnog kompleta mogu biti u odvojenim kontejnerima; ili se mogu kombinovati u jednom kontejneru.
[0299] Bilo koji od gore opisanih kompleta može dalje da sadrži jedan ili više dodatnih reagensa, gde takvi dodatni reagensi mogu biti izabrani od: pufera za razblaživanje; rastvora za rekonstituciju; pufera za pranje; kontrolnog reagensa; kontrolnog vektora eksprimiranja ili RNK polinukleotida; reagens za in vitro proizvodnju usmerenog modifikacionog polipeptida iz DNK, i slično.
[300] Pored gore pomenutih komponenti, predmetni komplet može dalje da sadrži uputstva za upotrebu komponenti kompleta za primenu predmetnih postupaka. Uputstva za primenu predmetnih postupaka generalno su zabeležena na odgovarajućem medijumu za snimanje. Na primer, uputstva mogu biti odštampana na podlozi, kao što su papir ili plastika itd. Kao takva, uputstva mogu biti prisutna u kompletu kao umetci u pakovanju, na etiketiranju kontejnera kompleta ili njegovih komponenti (npr. povezana sa pakovanjem ili pod-pakovanjem) itd. U drugim otelotvorenjima, instrukcije su prisutne kao elektronska datoteka podataka za skladištenje prisutna na odgovarajućem kompjuterski čitljivom medijumu za čuvanje, npr. CD-ROM, disketa, fleš disk, itd. U još nekim otelotvorenjima stvarna uputstva nisu prisutna u kompletu, već su načini za dobijanje instrukcija iz udaljenog izvora, npr. preko interneta. Primer ovakvog otelotvorenja je komplet koji sadrži veb adresu na kojoj se mogu videti uputstva i/ili iz kojih se mogu preuzeti uputstva. Kao i uputstva, ovaj način za dobijanje instrukcija se snima na odgovarajućoj podlozi.
NELJUDSKI GENETICKI MODIFIKOVANI ORGANIZMI
[0301] U nekim otelotvorenjima, genetski modifikovana ćelija domaćina je genetski modifikovana sa egzogenom nukleinskom kiselinom koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira usmeren modifikacioni polipeptid, (npr., Cas9 koji se prirodno pojavljuje, modifikovan, tj. mutiran ili varijantu, Cas9, himerni Cas9 itd.). Ako je takva ćelija eukariotski jednoćelijski organizam, onda se modifikovana ćelija može smatrati genetski modifikovanim organizmom. U nekim otelotvorenjima, predmetni genetski modifikovan ne-ljudski organizam je Cas9 transgeni višećelijski organizam.
[0302] U nekim otelotvorenjima, predmetna genetski modifikovana ne-ljudska ćelija domaćin (npr. ćelija koja je genetski modifikovana sa egzogenom nukleinskom kiselinom koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira usmeren modifikacioni polipeptid, npr. Cas9 koji se prirodno pojavljuje, modifikovan, tj. mutiran ili varijantu, Cas9, himerni Cas9 itd.) može generisati predmetni genetski modifikovan ne-ljudski organizam (npr. miš, riba, žaba, muva, crv itd.). Na primer, ako je genetski modifikovana ćelija domaćina pluripotentna matična ćelija (tj. pSC) ili germ ćelija (npr. sperma, oocit, itd.), genetski modifikovani organizam se može izvesti iz genetski modifikovane ćelije domaćina. U nekim otelotvorenjima, genetski modifikovana ćelija domaćina je pluripotentna matična ćelija (npr. eSC, iPSC, pluripotentna matična ćelija biljaka itd.) ili germ ćelija (npr. ćelije sperme, oociti itd.), in vivo ili in vitro, što može dovesti do genetski modifikovanog organizma. U nekim otelotvorenjima genetski modifikovana ćelija domaćin je PSC (npr., ESC, iPSC, itd.) I koristi se za stvaranje genetski modifikovanog organizma (npr. ubrizgavanjem PSC u blastocist da bi se proizvela himerna/mozaička životinja, koja bi mogla zatim da se pari da generiše ne-himerne/ne-mozaičke genetski modifikovane organizme, kaljenje u slučaju biljaka itd.). Bilo koji pogodan postupak/protokol za proizvodnju genetski modifikovanog organizma, uključujući postupke opisane ovde, pogodni su za proizvodnju genetski modifikovane ćelije domaćina koja sadrži egzogenu nukleinsku kiselinu koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira usmeren modifikacioni polipeptid (npr. Cas9 koji se prirodno pojavljuje, modifikovan, tj. mutiran ili varijantu, Cas9, himerni Cas9 itd.). Postupci izrade genetski modifikovanih organizama poznati su u struci. Na primer, pogldati Cho et al., Curr Protoc Cell Biol.2009 Mar;Chapter 19:Unit 19.11: Generation of transgenic mice; gama et al., Brain Struct Funct. 2010 Mar;214(2-3):91-109. Epub 2009 Nov 25: Animal transgenesis: an overview; Husaini et al., GM Crops.2011 Jun-Dec;2(3):150-62. Epub 2011 Jun 1: Approaches for gene targeting and targeted gene expression in plants.
[0303] U nekim otelotvorenjima, genetski modifikovani organizam sadrži ciljanu ćeliju za postupke pronalaska, i stoga se može smatrati izvornim za ciljane ćelije. Na primer, ako genetski modifikovana ćelija sadrži egzogenu nukleinsku kiselinu koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira usmeren modifikacioni polipeptid, (npr., Cas9 koji se prirodno pojavljuje, modifikovan, tj. mutiran ili varijantu, Cas9, himerni Cas9 itd) koristi se za generisanje genetski modifikovanog organizma, tada ćelije genetski modifikovanog organizma sadrže egzogenu nukleinsku kiselinu koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira usmeren modifikacioni polipeptid (npr. Cas9 koji se prirodno pojavljuje, modifikovan, tj. mutiran ili varijantu, Cas9, himerni Cas9 itd.). U nekim takvim otelotvorenjima, DNK ćelije ili ćelije genetski modifikovanog organizma mogu biti ciljani za modifikaciju uvođenjem u ćeliju ili ćelije RNK koja cilja DNK (ili DNK koja kodira DNK koja cilja RNK) i opciono donorske nukleuske kiseline. Na primer, uvođenje RNK koja cilja DNK (ili DNK koja kodira RNK koja cilja DNK) u podskup ćelija (npr. ćelije mozga, ćelije creva, ćelije bubrega, ćelije pluća, ćelije krvi, itd.) Genetski modifikovani organizam može ciljati DNK takvih ćelija za modifikaciju, a genomska mesto će zavisiti od DNK ciljajuće sekvence uvedene u RNK koja cilja DNK.
[0304] U nekim otelotvorenjima, genetski modifikovani organizam je izvor ciljanih ćelija za postupke pronalaska. Na primer, genetski modifikovani organizam koji sadrži ćelije koje su genetski modifikovane sa egzogenom nukleinskom kiselinom koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira usmeren modifikacioni polipeptid (npr. Cas9 koji se prirodno pojavljuje, modifikovan, tj. mutiran ili varijantu, Cas9, himerni Cas9 itd.) Može da obezbedi izvor genetski modifikovanih ćelija, na primer PSC (npr. eSC, iPSC, sperma, oociti, itd.), neuroni, progenitorske ćelije, kardiomiociti itd.
[0305] U nekim otelotvorenjima, genetski modifikovana ćelija je PSC koji sadrži egzogenu nukleinsku kiselinu koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira usmeren modifikacioni polipeptid (npr., Cas9 koji se prirodno pojavljuje, modifikovan, tj. mutiran ili varijantu, Cas9, himerni Cas9 itd.). Kao takva, PSC može biti ciljana ćelija tako da DNK od PSC može biti ciljana za modifikaciju uvođenjem u PSC RNK koja cilja DNK (ili DNK koja kodira DNK koja cilja RNK) i opciono donorske nukleinske kiseline, i genomska mesto modifikacije će zavisiti od DNK ciljajuće sekvence uvedene RNK koja cilja DNK. Prema tome, u nekim otelotvorenjima, ovde opisani postupci mogu da se koriste za modifikovanje DNK (npr., brisanje i/ili zamena bilo koje željene genomske lokacije) PSC izvedenog iz predmetnog genetski modifikovanog organizma. Takvi modifikovani PSC mogu se onda koristiti za generisanje organizama koji imaju i (i) egzogenu nukleinsku kiselinu koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira usmeren modifikacioni polipeptid (npr., Cas9 koji se prirodno pojavljuje, modifikovan, tj. mutiran ili varijantu, Cas9, himerni Cas9 itd.) I (ii) modifikaciju DNK koja je uvedena u PSC.
[0306] Egzogena nukleinska kiselina koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira usmeren modifikacioni polipeptid, (npr. Cas9 koji se prirodno pojavljuje, modifikovan, tj. mutiran ili varijantu, Cas9, himerni Cas9 itd.) može biti pod kontrolom (npr., operativno povezana sa) nepoznatog promotera (npr. kada se nukleinska kiselina nasumice integriše u genom ćelije domaćina) ili može biti pod kontrolom (tj. Operativno povezana sa) poznatog promotera. Pogodni poznati promoteri mogu biti bilo koji poznati promoter i uključuju konstitutivno aktivne promotere (npr. CMV promoter), inducibilne promotere (npr. promoter toplotnog šoka, promoter regulisan tetraciklinom, promoter regulisan steroidom, promoter regulisan metalom, promoter regulisan receptorom estrogena, Itd.), prostorno ograničeni i/ili vremenski ograničeni promoteri (npr. promoter specifičan za tkivo, promoter specifičnog tipa ćelija, itd.) itd.
[0307] Predmetni genetski modifikovan organizam (npr. Organizam čije ćelije sadrže nukleotidnu sekvencu koja kodira usmeren modifikacioni polipeptid, npr. Cas9 koji se prirodno pojavljuje, modifikovan, tj. mutiran ili varijantu, Cas9, himerni Cas9 itd.) može biti bilo koji organizam uključujući, na primer, biljke; alge; beskičmenjake (npr. Cnidarijan, ehinoderm, crv, muva itd.); kičmenjake (npr. riba (npr. zebrica, riba pufer, zlatna ribica, itd.), vodozemce (npr. salamander, žaba, itd.), gmizavce, ptice, sisare itd.); ungulate (npr. koza, svinja, ovca, krava, itd.); glodare (npr. miš, pacov, hrčak, zamorac); lagomorfi (npr. zec); itd.
[0308] U nekim slučajevima, usmeren modifikacioni polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 99% ili 100% identičnosti aminokiselinske sekvence sa aminokiselinama 7-166 ili 731-1003 od Cas9/Csn1 aminokiselinske sekvence prikazane na Slici 3, ili odgovarajućim delovima u bilo kojoj od aminokiselinskih sekvenci Kao SEQ ID NO: 1-256 i 795-1346.
Transgene ne-ljudske životinje
[0309] Kao što je gore opisano, u nekim otelotvorenjima, predmetna nukleinska kiselina (npr., nukleotidna sekvenca koja kodira usmeren modifikacioni polipeptid, npr. Cas9 koji se prirodno pojavljuje, modifikovan, tj. mutiran ili varijantu, Cas9, himerni Cas9, Itd.) ili predmetni rekombinantni vektor eksprimiranja se koriste kao transgen za generisanje transgene životinje koja proizvodi usmeren modifikacioni polipeptid. Prema tome, predmetni pronalazak dalje pruža transgenu ne-ljudsku životinju, gde ta životinja sadrži transgen koji sadrži predmetnu nukleinsku kiselinu koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira usmeren modifikacioni polipeptid, na primer, prirodni Cas9 koji se prirodno pojavljuje, modifikovan, tj. mutiran ili varijantu, Cas9, himerni Cas9; itd., Kako je gore opisano. U nekim otelotvorenjima, genom transgene ne-ljudske životinje sadrži predmetnu nukleotidnu sekvencu koja kodira usmeren modifikacioni polipeptid. U nekim otelotvorenjima transgena ne-ljudska životinja je homozigotna za genetsku modifikaciju. U nekim otelotvorenjima transgena neljudska životinja je heterozigotna za genetsku modifikaciju. U nekim otelotvorenjima transgena ne-ljudska životinja je kičmenjak, na primer, riba (npr. tebrica, zlatna ribica, pufer riba, pećinska riba itd.), vodozemac (žaba, salamander itd.), ptica (npr. kokoška, ćurka, itd.), Gmizavac (npr. zmija, gušter itd.), Sisar (npr. ungulata, npr. svinja, krava, koza, ovca itd.; Lagomorf (npr. zec), glodar (npr. pacov, miš), primat bez čoveka itd.) itd.
[0310] Egzogena nukleinska kiselina koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira usmeren modifikacioni polipeptid, (npr. Cas9 koji se prirodno pojavljuje, modifikovan, tj. mutiran ili varijantu, Cas9, himerni Cas9 itd.) može biti pod kontrolom (npr., operativno povezana sa) nepoznatog promotera (npr. kada se nukleinska kiselina nasumice integriše u genom ćelije domaćina) ili može biti pod kontrolom (tj. Operativno povezana sa) poznatog promotera. Pogodni poznati promoteri mogu biti bilo koji poznati promoter i uključuju konstitutivno aktivne promotere (npr. CMV promoter), inducibilne promotere (npr. promoter toplotnog šoka, promoter regulisan tetraciklinom, promoter regulisan steroidom, promoter regulisan metalom, promoter regulisan receptorom estrogena, Itd.), prostorno ograničeni i/ili vremenski ograničeni promoteri (npr. promoter specifičan za tkivo, promoter specifičnog tipa ćelija, itd.) itd.
[0311] U nekim slučajevima, usmeren modifikacioni polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 99% ili 100% identičnosti aminokiselinske sekvence sa aminokiselinama 7-166 ili 731-1003 od Cas9/Csn1 aminokiselinske sekvence prikazane na Slici 3, ili odgovarajućim delovima u bilo kojoj od aminokiselinskih sekvenci Kao SEQ ID NO: 1-256 i 795-1346.
Transgene biljke
[0312] Kao što je prethodno opisano, u nekim otelotvorenjima, predmetna nukleinska kiselina (npr. nukleotidna sekvenca koja kodira usmeren modifikacioni polipeptid, npr. Cas9 koji se prirodno pojavljuje, modifikovan, tj. mutiran ili varijantu, Cas9, himerni Cas9 itd.) ili predmetni rekombinantni vektora eksprimiranja se koriste kao transgen za generisanje transgene biljke koja proizvodi usmeren modifikacioni polipeptid. Prema tome, predmetni pronalazak dalje pruža transgenu biljku, gde ta biljka sadrži transgen koji sadrži predmetnu nukleinsku kiselinu koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira usmeren modifikacioni polipeptid, na primer, Cas9 koji se prirodno pojavljuje, modifikovan, tj. mutiran ili varijantu, Cas9, himerni Cas9 itd., kako je gore opisano. U nekim otelotvorenjima, genom transgene biljke sadrži predmetnu nukleinsku kiselinu. U nekim otelotvorenjima transgena biljka je homozigotna za genetsku modifikaciju. U nekim otelotvorenjima transgena biljka je heterozigotna za genetsku modifikaciju.
[0313] Postupci uvođenja egzogenih nukleinskih kiselina u biljne ćelije su dobro poznati u struci. Takve biljne ćelije se smatraju „transformisanim“, kao što je prethodno definisano. Pogodni postupci uključuju virusnu infekciju (kao što su virusi sa dvostruko vezanom DNK), transfekciju, konjugaciju, protoplastnu fuziju, elektroporaciju, tehnoloziju pištolja čestica, precipitaciju kalcijum fosfata, direktni mikroinženjering, tehnoloziju silikon karbidnih metala, Agrobacteriumposredovana transformacija i slično. Izbor postupka uglavnom zavisi od vrste ćelije koja se transformiše i okolnosti pod kojima se odvija transformacija (tj. in vitro, ex vivo ili in vivo).
[0314] Postupci transformacije zasnovane na zemnoj bakteriji Agrobacterium tumefacien su posebno korisne za uvođenje molekula egzogene nukleinske kiseline u vaskularnu biljku. Oblik divljeg tipa Agrobacteriuma sadrži plazmid koji indukuje tumor, koji usmerava proizvodnju tumorogničnog krunskog žučnog rasta kod biljke domaćina. Prenošenje T-DNK regiona T-DNK regije Ti plazmida u biljni genom zahteva gene virulencije kodirane sa Ti plazmidom, kao i granice T-DNK, koje su set direktnih DNK ponavljanja koje određuju regiju za prenos. Vektor koji je baziran na Agrobacteriumu je modifikovana forma Ti plazmida, u kojoj se funkcije indukcije tumora zamenjuju sekvencom nukleinske kiseline koja je interesantna za unos u biljku domaćina.
[0315] Transparacija posredovana agrobakterijom uglavnom koristi vektore kointegratora ili binarne vektorske sisteme, u kojima su komponente Ti plazmida podeljene između pomoćnog vektora koji se stalno nastanjuje u Agrobacterium domaćinu i nosi gene virulencije i prevoznik vektor, koji sadrži gen od interesa koji je ograničen T-DNK sekvencama. Različiti binarni vektori su dobro poznati u struci i dostupni su na tržištu, na primer, od Clontech (Palo Alto, Calif.). U struci su, na primer, dobro poznati i postupci kokulture Agrobacteriuma sa kultivisanim biljnim ćelijama ili ranjenim tkivom, kao što su tkivo listova, eksplanti korena, hipokotiledoni, delovi stabljika ili krtole. Pogledati, npr., glick and Thompson, (eds.), Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Boca Raton, Fla.: CRC Press (1993).
[0316] Transformacija posredovana mikroprojektilom takođe se može koristiti za proizvodnju predmetne transgene biljke. Ovaj postupak, koju su prvi opisali Klein et al. (Nature 327:70-73 (1987)), oslanja se na mikroprojekte kao što su zlato ili volfram koji su obloženi željenim molekulom nukleinske kiseline precipitacijom sa kalcijum hloridom, spermidinom ili polietilen glikolom. Čestice mikroprojekala se ubrzavaju pri velikoj brzini u tkivo angiosperma koristeći uređaj kao što je BIOLISTIC PD-1000 (Biorad; Hercules Calif.).
[0317] Nukleinska kiselina pacijenta može biti uvedena u biljku na takav način da je nukleinska kiselina u stanju da ulazi u ćelije biljke, na primer, putem in vivo ili ex vivo protokola. Pod pojmom „in vivo“ misli se na nukleinsku kiselinu koja se primenjuje u živo telo biljke, npr. infiltracijom. Pod „ek vivo“ misli se da su ćelije ili eksplanti modifikovani izvan biljke, a zatim se takve ćelije ili organi regenerišu u biljci. Opisan je veći broj vektora pogodnih za stabilnu transformaciju biljnih ćelija ili za stvaranje transgenih biljaka, uključujući one opisane kod Weissbach and Weissbach, (1989) Methods for Plant Molecular Biology Academic Press, and Gelvin et al., (1990) Plant Molecular Biology Manual, Kluwer Academic Publishers. Specifični primeri uključuju one koji su izvedeni iz Ti plazmida Agrobacterium tumefaciens, kao i one koje su otkrili Herrera-Estrella et al. (1983) Nature 303: 209, Bevan (1984) Nucl Acid Res.12: 8711-8721, Klee (1985) Bio/Technolo 3: 637-642. Alternativno, ne-Ti vektori se mogu koristiti za prenos DNK u biljke i ćelije korišćenjem tehnika isporuke slobodne DNK. Korišćenjem ovih postupaka mogu se proizvoditi transgene biljke kao što su pšenica, pirinač (Christou (1991) Bio/Technology 9:957-9 and 4462) i kukuruz (Gordon-Kamm (1990) Plant Cell 2: 603-618). Nezreli embrion takođe može biti dobro ciljano tkivo za monokote za direktne tehnike isporuke DNK pomoću pištolja čestica (VWeeks et al. (1993) Plant Physiol 102: 1077-1084; Vasil (1993) Bio/Technolo 10: 667-674; Wan and Lemeaux (1994) Plant Physiol 104: 37-48 i za Agrobacterium-posredovan DNK transfer (Ishida et al. (1996) Nature Biotech 14: 745-750). Primeri postupaka za uvođenje DNK u hloroplaste su biolisticko bombardovanje, transformacija polietilen glikola protoplasta i mikroinjekcije (Danieli et al Nat. Biotechnol 16:345-348, 1998; staub et al Nat. Biotechnol 18: 333-338, 2000; O’Neill et al Plant J. 3:729-738, 1993; knoblauch et al Nat. Biotechnol 17: 906-909; U.S. Pat. Nos. 5,451,513, 5,545,817, 5,545,818, and 5,576,198; in Intl. Application No. WO 95/16783; i in Boynton et al., Methods in Enzymology 217: 510-536 (1993), Svab et al., proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 913-917 (1993), and McBride et al., proc. Nati. Acad. Sci. USA 91: 7301-7305 (1994)). Svaki vektor pogodan za postupke biolističkog bombardovanja, transformacije polietilen glikola protoplasta i mikroinjekcije biće pogodna kao vektor ciljanja za transformaciju hloroplasta. Svaki vektor dvostruke DNK može se koristiti kao vektor transformacije, posebno kada postupak uvođenja ne koristi Agrobacterium.
[0318] Biljke koje mogu biti genetski modifikovane obuhvataju žitarice, krmne žitarice, voće, povrće, uljarice, palme, biljke za šumarstvo i vinovu lozu. Slede specifični primeri biljaka koji se mogu modifikovati: kukuruz, banana, kikiriki, terenski grašak, suncokret, paradajz, kanola, duvan, pšenica, ječam, ovas, krompir, soja, pamuk, karanfili, sorgum, lupin i pirinač.
[0319] Takođe, date predmetnim pronalaskom su transformisane biljne ćelije, tkiva, biljke i proizvodi koji sadrže transformisane biljne ćelije. Karakteristika predmetnih transformisanih ćelija, i tkiva i proizvodi koji uključuju iste je prisustvo predmetne nukleinske kiseline integrisane u genom, i proizvodnja od strane biljnih ćelija usmerenog modifikacionog polipeptida, na primer, Cas9 koji se prirodno pojavljuje, modifikovan, tj. mutiran ili varijantu, Cas9, himerni Cas9; itd. Rekombinantne biljne ćelije predmetnog pronalaska su korisne kao populacije rekombinantnih ćelija, ili kao tkivo, seme, cela biljka, stablo, voće, list, koren, cvet, stablo, krtola, zrno, stočna hrana, polje biljaka, i slično.
[0320] Nukleinska kiselina koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira usmeren modifikacioni polipeptid, (npr. Cas9 koji se prirodno pojavljuje, modifikovan, tj. mutiran ili varijantu, Cas9, himerni Cas9 itd.) može biti pod kontrolom (npr., operativno povezana sa) nepoznatog promotera (npr. kada se nukleinska kiselina nasumice integriše u genom ćelije domaćina) ili može biti pod kontrolom (tj. Operativno povezana sa) poznatog promotera. Pogodni poznati promoteri mogu biti bilo koji poznati promoter i uključuju konstitutivno aktivne promotere, inducibilne promotere, prostorno ograničeni i/ili vremenski ograničeni promoteri itd.
[0321] U nekim slučajevima, usmeren modifikacioni polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 99% ili 100% identičnosti aminokiselinske sekvence sa aminokiselinama 7-166 ili 731-1003 od Cas9/Csn1 aminokiselinske sekvence prikazane na Slici 3, ili odgovarajućim delovima u bilo kojoj od aminokiselinskih sekvenci Kao SEQ ID NO: 1-256 i 795-1346.
[0322] Takođe dat predmetnim pronalaskom je reproduktivni materijal predmetne transgene biljke, gde reproduktivni materijal uključuje seme, potomstvo biljaka i klonski materijal.
DEFINICIJE – DEO II
[0323] Izraz „prirodan“ ili „nemodifikovani“ kad se ovde koriste primenjeni na nukleinsku kiselinu, polipeptid, ćeliju ili organizam, odnosi se na nukleinsku kiselinu, polipeptid, ćeliju ili organizam koji se pronalaze u prirodi. Na primer, prirodni polipeptid ili polinukleotidna sekvenca koja je prisutna u organizmu (uključujući i viruse) koja se može izolovati iz izvora u prirodi i koja nije namerno modifikovana od strane čoveka u laboratoriji.
[0324] „Heterologno“, kako se ovde koristi, označava nukleotidnu ili polipeptidnu sekvencu koja se ne nalazi u prirodnoj nukleinskoj kiselini ili proteinu, respektivno. Na primer, u fuzionoj varijanti Cas9-usmerenog polipeptida, varijanta Cas9 usmerenog polipeptida može biti spojena sa heterolognim polipeptidom (tj. polipeptidom koji nije Cas9). Heterologni polipeptid može pokazati aktivnost (npr., enzimsku aktivnost) koja će takođe biti izložena fuzionoj varijanti Cas9 usmerenog polipeptida. Heterologna sekvenca nukleinske kiseline može biti vezana za varijantnu Cas9 usmerenog polipeptida (npr., genetskim inženjeringom) kako bi se generisala nukleotidna sekvenca koja kodira fuzionu varijantu Cas9 usmerenog polipeptida.
[0325] Izraz „himerni polipeptid“ odnosi se na polipeptid koji se ne javlja u prirodi, na primer, pravi se veštačkom kombinacijom dva inače odvojena segmenta amino-sekvence kroz ljudsku intervenciju. Tako je himerni polipeptid takođe rezultat ljudske intervencije. Prema tome, polipeptid koji sadrži himernu aminokiselinsku sekvencu je himerni polipeptid.
[0326] Pod „usmerenim polipeptidom“ ili „RNK-vezujućim usmerenim polipeptidom“ ili „RNK-vezujućim usmerenim polipeptidom“, podrazumeva se polipeptid koji se vezuje za RNK i usmeren je na određenu sekvencu DNK. Usmeren polipeptid, kako je ovde opisan, je usmeren na specifičnu sekvencu DNK molekula RNK na koji je vezan. Molekula RNK sadrži sekvencu koja je komplementarna sa ciljanom sekvencom unutar ciljane DNK, čime se usmerava vezani polipeptid na određenu lokaciju unutar ciljane DNK (ciljana sekvenca).
[0327] U nekim otelotvorenjima, predmetna nukleinska kiselina (npr. RNK koja cilja DNK, nukleinska kiselina koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira RNK koja cilja DNK, nukleinska kiselina koja kodira usmeren polipeptid itd.) sadrži modifikaciju ili sekvencu koja pruža dodatnu poželjnu osobinu (npr. modifikovana ili regulisana stabilnost, subćelijsko ciljanje, praćenje, na primer, fluorescentnim obeležjem, mesto vezivanja za proteina ili kompleks proteina itd.). Neograničavajući primeri uključuju: 5' kapicu (npr., 7-metilguanilat kapica (m<7>G)); 3' poliadenilovani rep (tj., 3' poli (A) rep); sekvencu ribosviča (npr., kako bi se omogućila regulisana stabilnost i/ili regulisana dostupnost proteina i/ili proteinskih kompleksa); modifikaciju ili sekvencu koja usmerava RNK na subćelijsku lokaciju (npr., Jezgro, mitohondrije, hloroplaste i slično); modifikacija ili sekvenca koja pruža praćenje (npr., direktno konjugovanje fluorescentnog molekula, konjugacija na deo koji olakšava fluorescentnu detekciju, sekvenca koja omogućava fluorescentno detekciju itd.); modifikaciju ili sekvencu koja pruža vezujuće mesto za proteine (npr. proteine koji deluju na DNK, uključujući transkripcijske aktivatore, transkripcijske represore, DNK metiltransferaze, DNK demetalaze, histon acetiltransferaze, histon deacetilaze i slično); i njihove kombinacije.
[0328] U nekim otelotvorenjima, RNK koja cilja DNK sadrži dodatni segment ili na 5' ili 3' kraju koji pruža bilo koju od karakteristika opisanih iznad. Na primer, odgovarajući treći segment može da sadrži 5' kapicu (npr.7-metilguanilat kapica (m<7>G)); 3' poliadenilovani rep (tj., 3' poli (A) rep); sekvencu ribosviča (npr., kako bi se omogućila regulisana stabilnost i/ili regulisana dostupnost proteina i/ili proteinskih kompleksa); sekvencu koja usmerava RNK na subćelijsku lokaciju (npr., Jezgro, mitohondrije, hloroplaste i slično); modifikacija ili sekvenca koja pruža praćenje (npr., direktno konjugovanje fluorescentnog molekula, konjugacija na deo koji olakšava fluorescentnu detekciju, sekvenca koja omogućava fluorescentno detekciju itd.); modifikaciju ili sekvencu koja pruža vezujuće mesto za proteine (npr. proteine koji deluju na DNK, uključujući transkripcijske aktivatore, transkripcijske represore, DNK metiltransferaze, DNK demetalaze, histon acetiltransferaze, histon deacetilaze i slično); i njihove kombinacije.
[0329] Predmetna RNK koja cilja DNK i predmetni usmeren polipeptid formiraju kompleks (tj. vezuju se preko ne-kovalentnih interakcija). RNK koja cilja DNK daje specifičnost ciljanja na kompleks tako što sadrži nukleotidnu sekvencu koja je komplementarna sekvenci ciljane DNK. Usmeren polipeptid kompleksa pruža aktivnosti specifične az lokaciju. Drugim rečima, usmeren polipeptid usmerava se na ciljanu sekvencu DNK (npr. ciljana sekvenca u hromozomskoj nukleinskoj kiselini, ciljana sekvenca u ekstrahromozomnoj nukleinskoj kiselini, npr. epizomalna nukleinska kiselina, minikrug, itd., sekvencu u mitohondrijskoj nukleinskoj kiselini, ciljanu sekvencu u nukleinskoj kiselini hloroplasta, ciljanu sekvencu u plazmidu itd.) zahvaljujući povezanosti sa segmentom vezivanja proteina u RNK koja cilja DNK .
[0330] U nekim otelotvorenjima predmetni RNK koja cilja DNK koja sadrži dva odvojena RNK molekula (RNK polinukleotidi) i ovde se naziva kao „dvomolekulska RNK koja cilja DNK“ ili „dvostrukomolekulska RNK koja cilja DNK“. U drugim otelotvorenjima, predmetna RNK koja cilja DNK je jedinstveni RNK molekul (jedan RNK polinukleotid) i ovde se ovde naziva kao „jednomolekulska RNK koja cilja DNK“. Ako nije drugačije naznačeno izraz „RNK koja cilja DNK“ je inkluzivan, i odnosi se na i na RNK koje ciljaju jednomolekulski DNK i na RNK koje ciljaju dvostrukomolekulski DNK.
[0331] Predmetni RNK koja cilja DNK sadrži dva odvojena RNK molekula („targeter-RNK“ i „aktivator-RNK“). Svaki od dva RNK molekula predmetne dvomolekulska RNK koja cilja DNK sadrži deo nukleotida koji su komplementarni jedni s drugima tako da komplementarni nukleotidi dva RNK molekula hibridizuju da bi se formirao dvostruko vezani RNK dupleks segmenta vezivanja proteina.
[0332] Predmetna jednomolekulska RNK koja cilja DNK sadrži dva dela nukleotida (targeter-RNK i aktivator-RNK) koji su komplementarni jedan drugom, kovalentno su vezani intervenišućim nukleotidima („veznici“ ili „veznik nukleotidi“) i hibridizuju se da bi se formirao dvostruko vezani RNK dupleks (dsRNK dupleks) segment vezivanja proteina, čime se dobija struktura stem-petlje. Targeter-RNK i aktivator-RNK mogu biti kovalentno povezani preko 3' kraja targeter-RNK i 5' kraja aktivator-RNK. Alternativno, targeter-RNK i aktivator-RNK mogu biti kovalentno povezani preko 5' kraja targeter-RNK i 3' kraja aktivator-RNK.
[0333] Primerna dvomolekulska RNK koja cilja DNK sadrži molekul sličan crRNK („CRISPR RNK“ ili „targeter-RNK“ ili „crRNK“ ili „crRNK ponavljanje“) i odgovarajući molekul sličan tracrRNK („trans -aktivna CRISPR RNK“ ili „aktivator-RNK“ ili „tracrRNK“). Molekul sličan crRNK-u (targeter-RNK) obuhvata i segment ciljanja DNK (jednostruki) RNK koja cilja DNK i rasteznički segment („segment formiranja dupleksa“) nukleotida koji formira polovinu dsRNK dupleksa segmenta vezivanja proteina RNK koja cilja DNK. Odgovarajući molekul sličan tracrRNK-u (aktivator-RNK) sadrži deo nukleotida (dupleks-formirajućeg segmenta) koji formira drugu polovinu dsRNK dupleksa segmenta vezivanja protein RNK koja cilja DNK. Drugim rečima, predeo nukleotida molekula sličan CrRNK komplementaran je i hibridizuje sa predelom nukleotida molekula sličnog tracrRNK, kako bi se formirao dsRNK dupleks domena vezivanja proteina RNK koja cilja DNK. Kao takav, za svaki molekul sličan crRNK može se reći da ima odgovarajući molekul sličan tracrRNK. Molekul sličan crRNK dodatno daje jedan segment koji cilja na DNK. Tako, molekul sličan crRNK i molekul sličan tracrRNK (kao odgovarajući par) hibridizuju da formiraju RNK koja cilja DNK. Tačna sekvenca datog crRNK ili tracrRNK molekula je karakteristična za vrstu u kojoj se pronalaze molekuli RNK.
[0334] Izraz „aktivator-RNK“ se ovde koristi da označava molekul sličan tracrRNK od dvomolekulske RNK koja cilja DNK. Izraz „targeter-RNK“ se ovde koristi da označava molekul sličan crRNK od dvomolekulske RNK koja cilja DNK. Izraz „segment koji formira dupleks“ se ovde koristi da označava predeo nukleotida aktivator-RNK ili targeter-RNK koja doprinosi stvaranju dsRNK dupleksa hibridizacijom do dela nukleotida odgovarajućeg molekula aktivator-RNK ili targeter-RNK. Drugim rečima, aktivator-RNK sadrži segment koji formira dupleks koji je komplementaran segmentu koji formira dupleks odgovarajućeg targeter-RNK. Kao takav, aktivator-RNK sadrži segment koji formira dupleks, dok targeter-RNK sadrži i segment koji formira dupleks i segment ciljanja RNK koja cilja DNK. Prema tome, predmetna dvomolekulska RNK koja cilja DNK može se sastojati od bilo kog odgovarajućeg para aktivator-RNK i targeter-RNK.
[0335] Dvomolekulska RNK koja cilja DNK može biti dizajnirana da omogući kontrolisano (tj., uslovno) vezivanje targeter-RNK sa aktivator-RNK. S obzirom da dvomolekulska RNK koja cilja DNK nije funkcionalna ukoliko aktivator-RNK i targeter-RNK nisu vezani u funkcionalnom kompleksu sa dCas9, dvomolekulska RNK koja cilja DNK može biti inducibilna (npr. inducibilna lekom) čineći da vezivanje između aktivator-RNK i targeter-RNK bude inducibilno. Kao jedan neograničavajući primer, RNK aptameri se mogu koristiti za regulisanje (tj. kontrolu) vezivanja aktivator-RNK sa targeter-RNK. Shodno tome, aktivator-RNK i/ili targeter-RNK mogu da sadrže sekvencu RNK aptamera.
[0336] Apnameri RNK su poznati u struci i uglavnom su sintetička verzija ribosviča. Izrazi „RNK aptamer“ i „ribosvitč“ su ovde međusobno zamenjivi kako bi obuhvatili i sintetičke i prirodne nukleinske kiseline koje pružaju inducibilnu regulaciju strukture (a samim tim i dostupnost specifičnih sekvenci) molekula RNK, čiji su deo. RNK aptameri obično sadrže sekvencu koja se prekalemi u određenu strukturu (npr., ukosnica), koja specifično vezuje određeni lek (npr., mali molekul). Vezivanje leka izaziva strukturne promene u preklapanju RNK, koja menja karakteristike nukleinske kiseline čiji je aptamer deo. Kao neograničavajući primeri: (i) aktivator-RNK sa aptamerom možda neće biti u stanju da se veže sa srodnim targeter-RNK osim ako aptamer nije vezan odgovarajućim lijekom; (Ii) targeter-RNK sa aptamerom možda neće biti u mogućnosti da se veže sa srodnim aktivator-RNK osim ako aptamer nije vezan odgovarajućim lekovima; i (iii) targeter-RNK i aktivator-RNK, od kojih svaka sadrži drugačiji aptamer koji vezuje drugačiji lek, možda neće moći da se povežu jedni sa drugima, osim ako nisu prisutna oba leka. Kao što je ilustrovano ovim primerima, dvomolekulska RNK koja cilja DNK može biti dizajnirana da bude inducibilna.
[0337] Primeri aptamera i ribosvča mogu se naći, na primer, u: Nakamura et al., Genes Cells.
2012 May;17(5):344-64; Vavalle et al., Future Cardiol. 2012 May;8(3):371-82; Citartan et al., Biosens Bioelectron.2012 Apr 15;34(1):1-11; i Liberman et al., Wiley Interdiscip Rev RNK.2012 May-Jun;3(3):369-84.
[0338] Neograničavajući primeri nukleotidnih sekvenci koje mogu biti uključeni u dvomolekulska RNK koja cilja DNK uključuju targeter-RNK (npr., SEQ ID NO: 566-567) koji se mogu upariti sa dupleksnim formiranjem bilo koje aktivator-RNK date u SEQ ID NO: 671-678.
[0339] Primerna jednomolekulska RNK koja cilja DNK sadrži dva komplementarna dela nukleotida koji se hibridizuju da bi formirali dsRNK dupleks. U nekim otelotvorenjima, jedna od dva komplementarna dela nukleotida jednomolekulska RNK koja cilja DNK (ili DNK koja kodira rastezanje) je najmanje oko 60% identična jednoj od sekvenci aktivator-RNK (tracrRNK) koje su date u SEQ ID NO: 431-562 preko dela od najmanje 8 susednih nukleotida. Na primer, jedan od dva komplementarna dela nukleotida jednomolekulska RNK koja cilja DNK (ili DNK koja kodira rastezanje) je najmanje oko 65% identična, najmanje oko 70% identična, najmanje oko 75% identična, najmanje oko 80% identična, najmanje oko 85% identična, najmanje oko 90% identična, najmanje oko 95% identična, najmanje oko 98% identična, najmanje oko 99% identična ili 100% identična jednoj od tracrRNK sekvenci datih u SEQ ID NOs: 431-562, preko dela od najmanje 8 susednih nukleotida.
[0340] U nekim otelotvorenjima, jedna od dva komplementarna dela jednomolekulska RNK koja cilja DNK (ili DNK koja kodira rastezanje) je najmanje oko 60% identična jednoj od onih od targeter-RNK (crRNK) sekvenci U SEQ ID NOs: 563-679 preko odseka od najmanje 8 susednih nukleotida. Na primer, jedan od dva komplementarna dela nukleotida jednomolekulska RNK koja cilja DNK (ili DNK koja kodira rastezanje) je najmanje oko 65% identična, najmanje oko 70% identična, najmanje oko 75% identična, najmanje oko 80% identično, najmanje oko 85% identična, najmanje oko 90% identična, najmanje oko 95% identična, najmanje oko 98% identična, najmanje oko 99% identična ili 100% identična jednoj od crRNK sekvenci datih u SEQ ID NOs: 563-679 preko proteina od najmanje 8 susednih nukleotida.
[0341] Kao što je gore navedeno, „ćelija domaćina“, kako se ovde koristi, označava in vivo ili in vitro eukariotsku ćeliju, prokariotsku ćeliju (npr. bakterijske ili arhealne ćelije) ili ćeliju iz višećelijskog organizma (npr. ćelijska linija) kultivisanu kao jednoćelijski entitet, čije eukariotske ili prokariotske ćelije mogu biti, ili su bile, korišćene kao primalac nukleinske kiseline i uključuju potomstvo originalne ćelije koja je transformisana nukleinskom kiselinom. Podrazumeva se da potomstvo jedne ćelije ne mora biti potpuno identično u morfologiji ili genomski ili potpuno DNK komplementarna izvornom roditelju, zbog prirodne, slučajne ili namerne mutacije. „Rekombinantna ćelija domaćin“ (koja se takođe naziva „genetski modifikovana ćelija domaćin“) je ćelija domaćin u koju je uvedena heterologna nukleinska kiselina, na primer, vektor eksprimiranja. Na primer, predmetna bakterijska ćelija domaćin je genetski modifikovana bakterijska ćelija domaćin, zahvaljujući uvođenju u odgovarajuću bakterijsku ćeliju domaćina egzogene nukleinske kiseline (npr. plazmid ili rekombinantni vektor eksprimiranja), i predmetna eukariotska ćelija domaćin je genetski modifikovana eukariotske ćelija domaćin (npr. germ ćelije sisara), zahvaljujući uvođenju u pogodnu eukariotsku ćeliju domaćina egzogene nukleinske kiseline.
[0342] Definicije navedene u „Definicije - Deo I“ primenjuju se i na trenutni odeljak; pogledajte "Definicije - Deo I" za dodatno razjašnjenje izraza.
[0343] Pre nego što se ovaj pronalazak dalje opisuje, potrebno je shvatiti da ovaj pronalazak nije ograničen na određena opisana otelotvorenja, jer se ona, naravno, mogu razlikovati. Takođe treba shvatiti da se terminologija ovde koristi u samo svrhu opisivanja određenih otelotvorenja i nije namera da bude ograničavajuća, s obzirom na to da će opseg predmetnog pronalaska biti ograničen samo sa priloženim patentnim zahtevima.
[0344] Kada se obezbedi niz vrednosti, podrazumeva se da je svaka intervenišuća vrednost, do desetine jedinice donje granice, osim ako kontekst jasno ne diktira drugačije, između gornje i donje granice tog opsega i bilo koje druga navedene ili intervenišuća vrednost u navedenom opsegu, obuhvaćena u okviru pronalaska. Gornja i donja granica ovih manjih opsega mogu se nezavisno uključiti u manje opsege, i takođe su obuhvaćene u pronalasku, u zavisnosti od bilo koje izričito isključene granice u navedenom opsegu. Tamo gde naveden opseg uključuje jednu ili obe granice, opsezi koji isključuju bilo koje ili ob od navedenih ograničenja takođe su uključeni u pronalazak.
[0345] Osim ako nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni izrazi koji se ovde koriste imaju isto značenje kao što je obično poznato stručnjacima u struci kojoj pripada ovaj pronalazak. Iako svi postupci i materijali slični ili ekvivalentni onima opisanim ovde mogu takođe da se koriste u praksi ili testiranju ovog pronalaska, ovde su opisani poželjni postupci i materijali.
[0346] Treba napomenuti da, kad se koristi ovde i u priloženim patentnim zahtevima, oblici jednine uključuju oblike množine, ukoliko kontekst jasno ne diktira drugačije. Tako, na primer, upućivanje na „polinukleotid“ obuhvata mnoštvo takvih polinukleotida i upućivanje na „polipeptid“ uključuje upućivanje na jedan ili više polipeptida i ekvivalenata koji su poznati stručnjacima i slično. Dalje je napomenuto da se zahtevi mogu izraditi kako bi se isključio bilo koji neobavezni element. Kao takva, ova izjava ima za cilj da posluži kao predodređena osnova za korištenje takve ekskluzivne terminologije kao „isključivo“, "samo" i slično u vezi sa navođenjem elemenata potraživanja ili korištenjem „negativnog“ ograničenja.
[0347] Prihvatljivo je da određene karakteristike pronalaska, koje su, u smislu jasnoće, opisane u kontekstu odvojenih varijanti, mogu takođe biti obezbeđene u kombinaciji u jednom otelotvorenju. Nasuprot tome, različite osobine pronalaska, koje su, zbog sažetosti, opisane u kontekstu jednog otelotvorenja, takođe mogu biti obezbeđene zasebno ili u bilo kojoj pogodnoj podkombinaciji. Sve kombinacije otelotvorenja koje se odnose na pronalazak posebno su obuhvaćene ovim pronalaskom i ovde su obelodanjene kao da je svaka kombinacija pojedinačno i eksplicitno obelodanjena. Pored toga, sve podkombinacije različitih otelotvorenja i njihovih elemenata takođe su posebno obuhvaćene ovim pronalaskom i ovde su obelodanjene kao da je svaka takva podkombinacija pojedinačno i eksplicitno obelodanjena ovde.
[0348] Publikacije koje se ovde razmatraju pružaju se isključivo za njihovo objavljivanje pre datuma podnošenja ove prijave. Ništa ovde ne treba tumačiti kao priznanje da je ovaj pronalazak ovlašćen da izda takvu publikaciju na osnovu prethodnog pronalaska. Nadalje, datumi objavljivanja mogu se razlikovati od datuma objavljivanja koji bi možda trebali biti nezavisno potvrđeni.
DETALJNI OPIS- DEO II
[0349] Dati u sadašnjem obelodanjenju su postupci modulacije transkripcije ciljane nukleinske kiseline u ćeliji domaćinu. Postupci generalno uključuju dovođenje u dodir ciljane nukleinske kiseline sa enzimatskim neaktivnim Cas9 polipeptidom i jednosmernom RNK. Postupci su korisni u različitim primenama, koje su takođe navedene u ovom opisu.
[0350] Postupak transkripcijske modulacije opisan ovim prikazom prevazilazi neke nedostatke postupaka koji uključuju RNKi. Postupak transkripcije modulacije ovog obelodanjenja nalazi se u širokom spektru primena, uključujući istraživačke primene, obelodanjenje lekova (npr. skrining sa visokim protokom), validaciju cilja, industrijske primene (npr. Inžinjering, mikrobiološki inženjering itd.), dijagnostčke primene, terapeutske primene i tehnike slikanja.
METODI MODULIRANJA TRANSKRIPCIJE
[0351] Ovo obelodanjenje opisuje postupak selektivnog moduliranja transkripcije ciljane DNK u ćeliji domaćinu. Postupak generalno obuhvata: a) uvođenje u ćeliju domaćina: i) RNK koja cilja DNK ili nukleinsku kiselinu koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira RNK koja cilja DNK; i ii) varijantu Cas9 usmerenog polipeptida („varijanta Cas9 polipeptida“) ili nukleinsku kiselinu koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira varijantu Cas9 polipeptida, gde varijanta Cas9 polipeptida pokazuje smanjenu aktivnost endodoksibribonukleaze.
[0352] RNK koja cilja DNK (takođe ovde obeležena kao „crRNK“ ili „vodič RNK“ ili „gRNK“) sadrži: i) prvi segment koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja je komplementarna ciljanoj sekvenci u ciljanoj DNK; ii) drugi segment koji interakuje sa usmerenim polipeptidom; i iii) terminator transkripcijski. Prvi segment, koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja je komplementarna ciljanoj sekvenci u ciljanoj DNK, ovde se ovde naziva kao „ciljajući segment“. Drugi segment, koji interakuje sa usmerenim polipeptidom, takođe se ovde označava kao „protein-vezujuća sekvenca“ ili „dCas9-vezujući ukosnica“ ili „dCas9 drška“. Pod „segmentom“ podrazumeva se segment/sekcija/region molekula, na primer, susedni deo nukleotida u RNK. Definicija „segmenta“, osim ukoliko nije drugačije specifikovano u određenom kontekstu, nije ograničena na određeni broj ukupnih baznih parova, i može uključivati i regione molekula RNK koja su svu pune dužine i mogu ali ne moraju uključivati regije sa komplementarnošću sa drugim molekulima. RNK koja cilja DNK prema sadašnjem obelodanjenju je jedinstveni RNK molekul (pojedinačni RNK polinukleotid), koji se ovde može nazvati „jednomolekulska RNK koja cilja DNK“, „jednosmerna RNK“ ili „SgRNK“. Još jedna RNK koja cilja DNK opisana ovde može sadržati dva RNK molekula. U sadašnjem opisu izraz „RNK koja cilja DNK“ ili „gRNK“ je inkluzivan, upućujući i na dvomolekulska RNK koja cilja DNK i na jednomolekulska RNK koja cilja DNK (tj. SgRNK).
[0353] Ovde pomenuta varijanta Cas9 usmerenog polipeptida sadrži: i) deo koji se vezuje za RNK koja interakuje sa RNK koja cilja DNK; i ii) deo aktivnosti koji pokazuje smanjenu aktivnost endodoksibribonukleaze.
[0354] RNK koja cilja DNK i varijanta Cas9 polipeptida formiraju kompleks u ćeliji domaćinu; kompleks selektivno modulira transkripciju ciljane DNK u ćeliji domaćina.
[0355] U nekim slučajevima, postupak transkripcije modulacije ovog prikaza pruža selektivnu modulaciju (npr. redukciju ili povećanje) ciljane nukleinske kiseline u ćeliji domaćinu. Na primer, „selektivno“ smanjenje transkripcije ciljane nukleinske kiseline smanjuje transkripciju ciljane nukleinske kiseline za najmanje oko 10%, najmanje oko 20%, najmanje oko 30%, najmanje oko 40%, najmanje oko 50% %, najmanje oko 60%, najmanje oko 70%, najmanje oko 80%, najmanje oko 90% ili više od 90%, u poređenju sa nivoom transkripcije ciljane nukleinske kiseline u odsustvu RNK koja cilja DNK/varijanta Cas9 polipeptida kompleksa. Selektivno smanjenje transkripcije ciljane nukleinske kiseline smanjuje transkripciju ciljane nukleinske kiseline, ali ne smanjuje značajno transkripciju neciljane nukleinske kiseline, na primer, transkripcija neciljane nukleinske kiseline je smanjena, uopšte za manje od 10% u poređenju sa nivoom transkripcije neciljane nukleinske kiseline u odsustvu RNK koja cilja DNK/varijanta Cas9 polipeptida kompleksa.
Povećana transkripcija
[0356] „Selektivna“ povećana transkripcija ciljane DNK može da poveća transkripciju ciljane DNK za barem oko 1,1 puta (npr., barem oko 1,2 puta, barem oko 1,3 puta, barem oko 1,4 puta, barem oko 1,5 puta, barem oko 1,6 puta, barem oko 1,7 puta, barem oko 1,8 puta, barem oko 1,9 puta, barem oko 2 puta, barem oko 2,5 puta, barem oko 3 puta, barem oko 3,5 puta, barem oko 4 puta, barem oko 4,5 puta, barem oko 5 puta, barem oko 6 puta, barem oko 7 puta, barem oko 8 puta, barem oko 9 puta, barem oko 10 puta, barem oko 12 puta, barem oko 15 puta, ili barem oko 20-puta) u poređenju sa nivoom transkripcije ciljane DNK u odsustvo RNK koja cilja DNK/varijanta Cas9 polipeptida kompleksa. Selektivno povećanje transkripcije ciljane DNK povećava transkripciju ciljane DNK, ali ne povećava značajno transkripciju neciljane DNK, npr., transkripcija neciljane DNK je povećana, ako je uopšte, za manje od oko 5-puta (npr., manje od oko 4-puta, manje od oko 3-puta, manje od oko 2-puta, manje od oko 1,8-puta, manje od oko 1,6-puta, manje od oko 1,4-puta, manje od oko 1,2-puta, ili manje od oko 1,1-puta) u poređenju sa nivoom transkripcije ciljane DNK u odsustvo RNK koja cilja DNK/varijanta Cas9 polipeptida kompleksa.
[0357] Kao neograničavajući primer, povećanje se može postići spajanjem dCas9 u heterolognu sekvencu. Pogodni fuzioni partneri uključuju, ali nisu ograničeni na, polipeptid koji pruža aktivnost koja indirektno povećava transkripciju tako što deluje direktno na ciljanu DNK ili na polipeptid (npr., histon ili drugi DNK vezujući protein) koji je povezan sa ciljanom DNK. Pogodni fuzioni partneri uključuju, ali se ne ograničavaju samo na, polipeptid koji pruža aktivnost metiltransferaze, aktivnost demetilaze, aktivnost acetil-transferaze, aktivnost deacetilaze, aktivnost kinaze, aktivnost fosfataze, aktivnost ubikuitin ligaze, aktivnost deubikuitinacije, aktivnost adenilacije, aktivnost umirenja, aktivnost SUMOilacije, aktivnost deSUMOilacije, aktivnost ribozilacije, aktivnost deribozilacije, aktivnost miristoilacije ili aktivnost demiristoilacije.
[0358] Dodatni pogodni fuzioni partneri uključuju, ali nisu ograničeni na, polipeptid koji direktno pruža povećanu transkripciju ciljane nukleinske kiseline (npr. aktivator transkripcije ili njegov fragment, njegov protein ili njegov fragment koji regrutuje transkripcijski aktivator, mali molekul/ regulator transkripcije koji je responsovan na lekove, itd.).
[0359] Neograničavajući primer postupka korišćenja dCas9 fuzionog proteina za povećanje transkripcije kod prokariota uključuje modifikaciju bakterijskog jedno-hibridnog (B1H) ili dvohibridnog (B2H) sistema. U B1H sistemu, domen za vezivanje DNK (BD) je spojen sa domenom aktivacije bakterijske transkripcije (AD, npr., alfa podjedinica Escherichia coli RNK polimeraze (RNKPα)). Tako, dCas9 može biti spojen sa heterolognom sekvencom koja sadrži AD. Kada fuzioni protein dCas9 stigne u uzvodni region promotera (ciljanog tamo od strane RNK koja cilja DNK) AD (npr., RNKPα) fuzionog proteina dCas9 regrutuje RNKP holoenzim, što dovodi do aktivacije transkripcije. U sistemu B2H, BD nije direktno spojen sa AD; Umesto toga, njihova interakcija je posredovana protein-protein interakcijom (npr., interakcija GAL11P-GAL4). Da bi se modifikovao takav sistem za upotrebu u postupcima, dCas9 može biti spojen sa prvom proteinskom sekvencom koja pruža protein-protein interakciju (npr. kvasac GAL11P i/ili GAL4 protein) i RNKα može biti spojena sa drugom proteinskom sekvencom koja završava proteinprotein interakciju (npr. GAL4 ako je GAL11P spojen na dCas9, GAL11P ako je GAL4 spojen sa dCas9 itd.). Afinitet vezivanja između GAL11P i GAL4 povećava efikasnost brzine vezivanja i transkripcije.
[0360] Neograničavajući primer postupka korišćenja dCas9 fuzionog proteina za povećanje transkripcije kod eukariota uključuje fuziju dCas9 u domen aktivacije (AD) (npr. GAL4, herpes virus aktivacijski protein VP16 ili VP64, ljudski nuklearni faktor NF-κB p65 podjedinicu, itd.). Da bi sistem postao inducibilan, eksprimiranje dCas9 fuzionog proteina može se kontrolisati inducibilnim promoterom (npr. tet-ON, Tet-OFF, itd.). RNK koja cilja DNK može biti dizajnirana da cilja na poznate elemente reakcije transkripcije (npr. promotere, poboljšače itd.), poznate uzvodne sekvence aktiviranja (UAS), sekvence nepoznate ili poznate funkcije za koje se sumnja da su u mogućnosti da kontrolišu eksprimiranje ciljane DNK itd.
Dodatni fuzioni partneri
[0361] Neograničavajući primeri fuzionih partnera za postizanje povećane ili smanjene transkripcije navedeni su na Slici 54 i uključuju transkripcijski aktivator i domene transkripcionih represora (npr. Krüppel povezana kutija (KRAB ili SKD), Mad mSIN3 domen interakcije (SID), ERF represpor domen (ERD) itd.). U nekim takvim slučajevima, fuzioni protein dCas9 ciljan od strane RNK koja cilja DNK na specifičnu lokaciju (tj. Sekvencu) u ciljanoj DNK i vrši regulaciju specifičnu za lokus, kao što je blokiranje vezivanja RNK polimeraze za promoter (koji selektivno inhibira funkciju aktivatora transkripcije) i/ili modifikovanje statusa lokalnog hromatina (npr. kada se koristi sekvenca fuzije koja modifikuje ciljanu DNK ili modifikuje polipeptid povezan sa ciljanom DNK). U nekim slučajevima promene su prolazne (npr., Represija ili aktivacija transkripcije). U nekim slučajevima promene su nasleđene (npr. kada se epigenetske modifikacije učine ciljanoj DNK ili proteinima povezane sa ciljanom DNK, npr. nukleozomalni histon).
[0362] U nekim otelotvorenjima, heterologna sekvenca može biti spojena sa C-terminusom dCas9 polipeptida. U nekim otelotvorenjima heterologna sekvenca može biti spojena sa N-terminusom dCas9 polipeptida. U nekim otelotvorenjima, heterologna sekvenca se može fuzionisati na unutrašnji deo (tj. Deo koji nije N- ili C-terminus) dCas9 polipeptida.
[0363] Biološki efekti postupka koji koristi predmetni dCas9 fuzioni protein mogu se detektovati bilo kojim pogodnim postupkom (npr., isšitivanje genskog eksprimiranja, analize zasnovane na hromatinu, npr. hromatin imuno-precipitacija (ChiP), hromatin in vivo test (CiA), itd. i slično).
[0364] U nekim slučajevima, postupak koji je ovde opisan podrazumeva upotrebu dve ili više različitih RNK koje ciljaju DNK. Na primer, dve različite RNK koje ciljaju DNK mogu se koristiti u jednoj jedinici domaćina, gde dve različite RNK koje ciljaju DNK ciljaju dve različite ciljane sekvence u istoj ciljanoj nukleinskoj kiselini.
[0365] Tako, na primer, postupak transkripcione modulacije može dalje sadržati uvođenje u ćeliju domaćina druge RNK koja cilja DNK ili nukleinske kiseline koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira drugu RNK koja cilja DNK, gde druga RNK koja cilja na DNK sadrži: i) prvi segment koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja je komplementarna sa drugom ciljanom sekvencom u ciljanoj DNK; ii) drugi segment koji interakuje sa polipeptidom usmerenim na mesto; i iii) transkripcijski terminator. U nekim slučajevima, upotreba dve različite RNK koje ciljaju DNK koje ciljaju dve različite ciljane sekvence u istoj ciljanoj nukleinskoj kiselini pruža povećanu modulaciju (npr. smanjenje ili povećanje) u transkripciji ciljane nukleinske kiseline.
[0366] Kao još jedan primer, dve različite RNK koje ciljaju DNK mogu se koristiti u jednoj ćeliji domaćinu, gde dve različite RNK koje ciljaju DNK ciljaju na dve različite ciljane nukleinske kiseline. Tako, na primer, predmetni postupak transkripcione modulacije može dodatno da sadržati uvođenje druge RNK koja cilja DNK, ili nukleinske kiseline koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira drugu RNK koja cilja DNK, gde druga RNK koja cilja DNK sadrži: I) prvi segment koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja je komplementarna ciljanoj sekvenci u barem drugoj ciljanoj DNK; ii) drugi segment koji interakuje sa usmerenim polipeptidom; i iii) transkripcijski terminator.
[0367] U nekim otelotvorenjima, predmetna nukleinska kiselina (npr. RNK koja cilja DNK, na primer, jednomolekulska RNK koja cilja DNK, aktivator-RNK, targeter-RNK itd., Donor polinukleotid, nukleinska kiselina koja kodira usmeren modifikacioni polipeptid i sl.) sadrži modifikaciju ili sekvencu koja pruža dodatnu poželjnu osobinu (npr. modifikovana ili regulisana stabilnost, subćelijsko ciljanje, praćenje, npr. fluorescentno obeležje, mesto vezivanja za protein ili kompleks proteina itd.). Neograničavajući primeri uključuju: 5' kapicu (npr., 7-metilguanilat kapica (m7G)); 3' poliadenilovani rep (tj., 3' poli(A) rep); sekvencu ribosviča ili aptamer sekvencu (npr., kako bi se omogućila regulisana stabilnost i/ili regulisana dostupnost proteina i/ili proteinskih kompleksa); terminator sekvencu; sekvencu koja formira dsRNK dupleks (tj., ukosnica)); modifikaciju ili sekvencu koja usmerava RNK na subćelijsku lokaciju (npr., jezgro, mitohondrija, hloroplasti i slično); modifikacija ili sekvenca koja pruža praćenje (npr., direktno konjugovanje fluorescentnog molekula, konjugovanje na deo koji olakšava fluorescentnu detekciju, sekvencu koja omogućava fluorescentno detekciju itd.); modifikaciju ili sekvencu koja pruža vezujuće mesto za proteine (npr. proteine koji deluju na DNK, uključujući transkripcijske aktivatore, transkripcijske represore, DNK metiltransferaze, DNK demetalaze, histone acetiltransferaze, histon deacetilaze i slično); i njihove kombinacije.
Segment koji cilja DNK
[0368] Segment koji cilja DNK (ili „sekvenca koja cilja DNK“) RNK koja cilja DNK („crRNK“) sadrži nukleotidnu sekvencu koja je komplementarna specifičnoj sekvenci unutar ciljane DNK (komplementarna linija ciljane DNK).
[0369] Drugim rečima, segment ciljanja DNK predmetne RNK koja cilja DNK interakuje sa ciljanom DNK na specifičan način u sekvenci putem hibridizacije (tj. bazno uparivanje). Kao takva, nukleotidna sekvenca segmenta koji cilja DNK može da varira i određuje lokaciju unutar ciljane DNK na kojoj će RNK koja cilja DNK i ciljana DNK interagovati. Segment koji cilja DNK predmetne RNK koja cilja DNK može biti modifikovan (npr., genetskim inženjeringom) da hibridizuje do bilo koje željene sekvence unutar ciljane DNK.
[0370] DNK ciljajući segment može da ima dužinu od oko 12 nukleotida do oko 100 nukleotida. Na primer, DNK ciljajući segment može da ima dužinu od oko 12 nukleotida (nt) do oko 80 nt, od oko 12 nt do oko 50nt, od oko 12 nt do oko 40 nt, od oko 12 nt do oko 30 nt, od oko 12 nt do oko 25 nt, od oko 12 nt do oko 20 nt, ili od oko 12 nt do oko 19 nt. Na primer, DNK ciljajući segment može da ima dužinu od oko 19 nt do oko 20 nt, od oko 19 nt do oko 25 nt, od oko 19 nt do oko 30 nt, od oko 19 nt do oko 35 nt, od oko 19 nt do oko 40 nt, od oko 19 nt do oko 45 nt, od oko 19 nt do oko 50 nt, od oko 19 nt do oko 60 nt, od oko 19 nt do oko 70 nt, od oko 19 nt do oko 80 nt, od oko 19 nt do oko 90 nt, od oko 19 nt do oko 100 nt, od oko 20 nt do oko 25 nt, od oko 20 nt do oko 30 nt, od oko 20 nt do oko 35 nt, od oko 20 nt do oko 40 nt, od oko 20 nt do oko 45 nt, od oko 20 nt do oko 50 nt, od oko 20 nt do oko 60 nt, od oko 20 nt do oko 70 nt, od oko 20 nt do oko 80 nt, od oko 20 nt do oko 90 nt, ili od oko 20 nt do oko 100 nt.
[0371] Nukleotidna sekvenca (DNK ciljajuća sekvenca) DNK ciljajućeg segmenta koja je komplementarna nukleotidnoj sekvenci (ciljana sekvenca) ciljane DNK može da ima dužinu barem oko 12 nt. Na primer, DNK ciljajuća sekvenca DNK ciljajućeg segmenta koja je komplementarna ciljanoj sekvenci ciljane DNK može da ima dužinu barem oko 12 nt, barem oko 15 nt, barem oko 18 nt, barem oko 19 nt, barem oko 20 nt, barem oko 25 nt, barem oko 30 nt, barem oko 35 nt ili barem oko 40 nt. Na primer, DNK ciljajuća sekvenca DNK ciljajućeg segmenta koja je komplementarna ciljanoj sekvenci ciljane DNK može da ima dužinu od oko 12 nukleotida (nt) do oko 80 nt, od oko 12 nt do oko 50nt, od oko 12 nt do oko 45 nt, od oko 12 nt do oko 40 nt, od oko 12 nt do oko 35 nt, od oko 12 nt do oko 30 nt, od oko 12 nt do oko 25 nt, od oko 12 nt do oko 20 nt, od oko 12 nt do oko 19 nt, od oko 19 nt do oko 20 nt, od oko 19 nt do oko 25 nt, od oko 19 nt do oko 30 nt, od oko 19 nt do oko 35 nt, od oko 19 nt do oko 40 nt, od oko 19 nt do oko 45 nt, od oko 19 nt do oko 50 nt, od oko 19 nt do oko 60 nt, od oko 20 nt do oko 25 nt, od oko 20 nt do oko 30 nt, od oko 20 nt do oko 35 nt, od oko 20 nt do oko 40 nt, od oko 20 nt do oko 45 nt, od oko 20 nt do oko 50 nt, ili od oko 20 nt do oko 60 nt. Nukleotidna sekvenca (DNK ciljajuća sekvenca) DNK ciljajućeg segmenta koja je komplementarna nukleotidnoj sekvenci (ciljana sekvenca) ciljane DNK može da ima dužinu barem oko 12 nt.
[0372] U nekim slučajevima, DNK ciljajuća sekvenca DNK ciljajućeg segmenta koja je komplementarna ciljanoj sekvenci ciljane DNK je 20 nukleotida u dužini. U nekim slučajevima, s DNK ciljajuća sekvenca DNK ciljajućeg segmenta koja je komplementarna ciljanoj sekvenci ciljane DNK je 19 nukleotida u dužini.
[0373] Procenat komplementarnosti između DNK ciljajuće sekvence DNK ciljajućeg segmenta i ciljane sekvence ciljane DNK može biti najmanje 60% (npr. najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75% Najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% ili 100%). U nekim slučajevima, procentualna komplementarnost između DNK ciljajuće sekvence DNK ciljajućeg segmenta i ciljane sekvence ciljane DNK je 100% u odnosu na sedam susednih 5'-najviše nukleotida ciljane sekvence komplementarne linije ciljane DNK. U nekim slučajevima, procentualna komplementarnost između DNK ciljajuće sekvence DNK ciljajućeg segmenta i ciljane sekvence ciljane DNK je najmanje 60% u oko 20 susednih nukleotida. U nekim slučajevima, procentualno komplementarnost između DNK ciljajuće sekvence DNK ciljajućeg segmenta i ciljane sekvence ciljane DNK je 100% u odnosu na četrnaest susednih 5'-većina nukleotida ciljane sekvence komplementarne linije ciljane DNK i niska kao 0% u odnosu na ostatak. U takvom slučaju, DNK ciljajuća sekvenca se može smatrati da ima dužinu od 14 nukleotida. U nekim slučajevima, procentualna komplementarnost između DNK ciljajuće sekvence DNK ciljajućeg segmenta i ciljane sekvence ciljane DNK je 100% u odnosu na sedam susednih 5'-najviše nukleotida ciljane sekvence komplementarne linije ciljane DNK i niska kao 0% u odnosu na ostatak. U takvom slučaju, sekvenca ciljanja DNK ciljajuća sekvenca se može smatrati da ima dužinu od 7 nukleotida.
Segment za vezivanje proteina
[0374] Segment vezivanja proteina (tj., „protein-vezujuća sekvenca“) RNK koja cilja DNK interakuje sa varijantom usmerenog polipeptida. Kada se varijanta Cas9 usmerenog polipeptida, zajedno sa RNK koja cilja DNK, vezuje za ciljanu DNK, transkripcija ciljane DNK je smanjena.
[0375] Segment vezivanja proteina RNK koja cilja DNK sastoji se od dva komplementarna dela nukleotida koji se hibridizuju jedan sa drugim kako bi se formirao dvostruko vezani RNK dupleks (dsRNK dupleks).
[0376] Segment vezivanja proteina RNK koja cilja DNK ovog obelodanjenja obuhvata dva dela nukleotida (targeter-RNK i aktivator-RNK) koji su komplementarni jedan drugom, kovalentno su vezani intervenišućim nukleotidima (npr. u slučaju jednomolekulska RNK koja cilja DNK) („veznici“ ili „veznik nukleotid“) i hibridizovati da bi se formirao dvostruki vezani RNK dupleks (dsRNK dupleks ili „dCas9-vezujući ukosnica“) segmenta vezivanja proteina, što rezultira strukturom stem-petlje. Struktura stem-petlje je šematski prikazana na Slici 39A. Targeter-RNK i aktivator-RNK mogu biti kovalentno povezani preko 3' kraja targeter-RNK i 5' kraja aktivator-RNK. Alternativno, targeter-RNK i aktivator-RNK mogu biti kovalentno povezani preko 5' kraja targeter-RNK i 3' kraja aktivator-RNK.
[0377] Segment vezivanja proteina mogu imati dužinu od oko 10 nukleotida do oko 100 nukleotida, npr. od oko 10 nukleotida (nt) do oko 20 nt, od oko 20 nt do oko 30 nt, od oko 30 nt do oko 40 nt, od oko 40 nt do oko 50 nt, od oko 50 nt do oko 60 nt, od oko 60 nt do oko 70 nt, od oko 70 nt do oko 80 nt, od oko 80 nt do oko 90 nt, ili od oko 90 do 100 nt. Na primer, protein vezujući segment može imati dužinu od oko 15 nukleotida (nt) do oko 80 nt, od oko 15 nt do oko 50 nt, od oko 15 nt do oko 40 nt, od oko 15 nt do oko 30 Nt ili od oko 15 nt do oko 25 nt.
[0378] dsRNK dupleks segmenta vezivanja proteina može imati dužinu od oko 6 baznih parova (bp) do oko 50 bp. Na primer, dsRNK dupleks segmenta vezivanja proteina može imati dužinu od oko 6 bp do oko 40 bp, od oko 6 bp do oko 30 bp, od oko 6 bp do oko 25 bp, od oko 6 bp do oko 20 bp, od oko 6 bp do oko 15 bp, od oko 8 bp do oko 40 bp, od oko 8 bp do oko 30 bp, od oko 8 bp do oko 25 bp, od oko 8 bp do oko 20 bp ili od oko 8 bp do oko 15 bp. Na primer, dsRNK dupleks segmenta vezivanja proteina može imati dužinu od oko 8 bp do oko 10 bp, od oko 10 bp do oko 15 bp, od oko 15 bp do oko 18 bp, od oko 18 bp do oko 20 bp, od oko 20 bp do oko 25 bp, od oko 25 bp do oko 30 bp, od oko 30 bp do oko 35 bp, od oko 35 bp do oko 40 bp ili od oko 40 bp do oko 50 bp. U nekim otelotvorenjima, dsRNK dupleks segmenta vezivanja proteina ima dužinu od 36 baznih parova. Procenat komplementarnosti između nukleotidnih sekvenci koje hibridizuju da bi se formiralo dsRNK dupleks segmenta vezivanja proteina može biti najmanje oko 60%. Na primer, procentualno komplementarnost između nukleotidnih sekvenci koje hibridizuju da bi se formirao dsRNK dupleks segmenta vezivanja proteina može biti najmanje oko 65%, najmanje oko 70%, najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 98%, ili najmanje oko 99%. U nekim slučajevima, procenat komplementarnost između nukleotidnih sekvenci koje hibridizuju kako bi se formirao dsRNK dupleks segmenta vezivanja proteina je 100%.
[0379] Veznik može da ima dužinu od oko 3 nukleotida od oko 100 nukleotida. Na primer, veznik može da ima dužinu od oko 3 nukleotida (nt) od oko 90 nt, od oko 3 nukleotida (nt) od oko 80 nt, od oko 3 nukleotida (nt) od oko 70 nt, od oko 3 nukleotida (nt) od oko 60 nt, od oko 3 nukleotida (nt) od oko 50 nt, od oko 3 nukleotida (nt) od oko 40 nt, od oko 3 nukleotida (nt) od oko 30 nt, od oko 3 nukleotida (nt) od oko 20 nt ili od oko 3 nukleotida (nt) od oko 10 nt. Na primer, veznik može da ima dužinu od oko 3 nt od oko 5 nt, od oko 5 nt od oko 10 nt, od oko 10 nt od oko 15 nt, od oko 15 nt od oko 20 nt, od oko 20 nt od oko 25 nt, od oko 25 nt od oko 30 nt, od oko 30 nt od oko 35 nt, od oko 35 nt od oko 40 nt, od oko 40 nt od oko 50 nt, od oko 50 nt od oko 60 nt, od oko 60 nt od oko 70 nt, od oko 70 nt od oko 80 nt, od oko 80 nt od oko 90 nt, ili od oko 90 nt od oko 100 nt. U nekim otelotvorenjima, veznik jednomolekulska RNK koja cilja DNK je 4 nt.
[0380] Neograničavajući primeri nukleotidnih sekvenci koji mogu biti uključeni u odgovarajući segment vezivanja proteina (tj. dCas9 drške) su navedeni u SEQ ID NO: 563-682 (npr., pogledati Sliku 8 i Sliku 9).
[0381] U nekim slučajevima, odgovarajući segment vezivanja proteina sadrži nukleotidnu sekvencu koja se razlikuje za 1, 2, 3, 4 ili 5 nukleotida od bilo koje gore navedene sekvence.
Sekvenca kontrole stabilnosti (npr. segment transkripcionog terminatora)
[0382] Sekvenca za kontrolu stabilnosti utiče na stabilnost RNK (npr., RNK koja cilja DNK, targeter-RNK, aktivator-RNK itd.). Jedan primer odgovarajuće sekvence kontrole stabilnosti je segment transkripcionog terminatora (tj. Sekvenca završetka transkripcije). Segment transkripcionog terminatora predmetne RNK koja cilja DNK može imati ukupnu dužinu od oko 10 nukleotida do oko 100 nukleotida, npr. od oko 10 nukleotida (nt) do oko 20 nt, od oko 20 nt do oko 30 nt, od od oko 40 nt do oko 50 nt, od oko 50 nt do oko 60 nt, od oko 60 nt do oko 70 nt, od oko 70 nt do oko 80 nt, od oko 80 nt do oko 90 nt ili od oko 90 nt do oko 100 nt. Na primer, segment transkripcionog terminatora može imati dužinu od oko 15 nukleotida (nt) do oko 80 nt, od oko 15 nt do oko 50 nt, od oko 15 nt do oko 40 nt, od oko 15 nt do oko 30 nt ili od oko 15 nt do oko 25 nt.
[0383] U nekim slučajevima, sekvenca završetka transkripcije je ona koja je funkcionalna u eukariotskoj ćeliji. U nekim slučajevima, sekvenca završetka transkripcije je ona koja je funkcionalna u prokariotskoj ćeliji.
[0384] Neograničavajući primeri nukleotidnih sekvenci koji mogu biti uključeni u sekvencu kontrole stabilnosti (npr. segment transkripcionog završetka ili u bilo kom segmentu RNK koja cilja DNK da bi se obezbedila povećana stabilnost) uključuju sekvence navedene u SEQ ID NO: 683-696 i, na primer, 5'-UAAUCCCACAGCCGCCAGUUCCGCUGGCGGCAUUUU-5' (SEQ ID NO: 795) (Ro-nezavisano trp mesto terminacije).
Dodatne sekvence
[0385] U nekim otelotvorenjima, RNK koja cilja DNK sadrži najmanje jedan dodatni segment ili na 5' ili na 3' kraju. Na primer, odgovarajući dodatni segment može da sadrži 5' kapicu (npr., 7-metilguanilat kapica (m7G)); 3' poliadenilovani rep (tj., 3' poli(A) rep); sekvencu ribosviča (npr., kako bi se omogućila regulisana stabilnost i/ili regulisana dostupnost proteina i/ili proteinskih kompleksa); sekvencu kontrole stabilnosti; sekvencu koja formira dsRNK dupleks (tj., ukosnica)); modifikaciju ili sekvencu koja usmerava RNK na subćelijsku lokaciju (npr., jezgro, mitohondrija, hloroplasti i slično); modifikacija ili sekvenca koja pruža praćenje (npr., direktno konjugovanje fluorescentnog molekula, konjugovanje na deo koji olakšava fluorescentnu detekciju, sekvencu koja omogućava fluorescentno detekciju itd.); modifikaciju ili sekvencu koja pruža vezujuće mesto za proteine (npr. proteine koji deluju na DNK, uključujući transkripcijske aktivatore, transkripcijske represore, DNK metiltransferaze, DNK demetalaze, histone acetiltransferaze, histon deacetilaze i slično); modifkaciju sekvenca koja pruža povećanu, smanjenu i/ili kontrolisanu stabilnost; i njihove kombinacije.
Višestruke istovremene RNK koje ciljaju DNK
[0386] U nekim otelotvorenjima, višestruke RNK koje ciljaju DNK se istovremeno koriste u istoj ćeliji za simultano moduliranje transkripcije na različitim mestima na istoj ciljanoj DNK ili na različitim ciljanim DNK. U nekim otelotvorenjima, dve ili više RNK koje ciljaju DNK ciljaju isti gen ili transkript ili lokus. U nekim otelotvorenjima, dve ili više RNK koje ciljaju DNK ciljaju različite nepovezane lokuse. U nekim otelotvorenjima, dve ili više RNK koje ciljaju DNK ciljaju različite, ali povezane lokuse.
[0387] Pošto su RNK koje ciljaju DNK, male i robusne, one mogu biti istovremeno prisutne na istom vektoru eksprimiranja i čak mogu biti pod istom kontrolom transkripcije ako je tako poželjno. U nekim otelotvorenjima dve ili više (npr.3 ili više, 4 ili više, 5 ili više, 10 ili više, 15 ili više, 20 ili više, 25 ili više, 30 ili više, 35 ili više, 40 ili više, 45 ili više, ili 50 ili više) RNK koje ciljaju DNK istovremeno se eksprimiraju u ciljanoj ćeliji (od istih ili različitih vektora). Eksprimirane RNK koje ciljaju DNK mogu se različito prepoznati od strane dCas9 proteina iz različitih bakterija, kao što su S. pyogenes, S. thermophilus, L. innocua, i N. meningitidis.
[0388] Za eksprimiranje višestrukih RNK koje ciljaju DNK može se koristiti veštački sistem za obradu RNK posredovan pomoću Csy4 endoribonukleaze. Višestruke RNK koje ciljaju DNK mogu se spojiti u tandem nizu na transkriptu prekursora (npr., eksprimiran od U6 promotera) i odvojiti pomoću Csy4-specifičnih RNK sekvence. Ko-eksprimiran Csy4 protein razbija transkript prekursora u više RNK koje ciljaju DNK. Prednosti za korišćenje sistema za obradu RNK uključuju: prvo, nema potrebe za korištenjem više promotera; drugo, s obzirom da su sve RNK koje ciljaju DNK obrađene iz transkripta prekursora, njihove koncentracije su normalizovane za slično vezivanje dCas9.
[0389] Csy4 je mali protein endoribonukleaze (RNKaze) izveden iz bakterija Pseudomonas aeruginosa. Csy4 specifično prepoznaje minimalni 17-bp RNK šupljinu i pokazuje brzo (<1 min) i visoko efikasno (> 99,9%) RNK cepanje. Za razliku od većine RNKaza, rascepeni RNK fragment ostaje stabilan i funkcionalno aktivan. RNK cepanje bazirani na Csy4 može se pretvoriti u veštački sistem za obradu RNK. U ovom sistemu, 17-bp RNK ukosnice se ubacuju između više fragmenata RNK koje se transkribuju kao prekursor transkript iz jednog promotera. Koeksprimiranje Csy4 je efikasna u stvaranju pojedinačnih fragmenata RNK.
Usmeren polipeptid
[0390] Kao što je gore navedeno, predmetna RNK koja cilja DNK i varijanta Cas9 usmerenog polipeptida formiraju kompleks. RNK koja cilja DNK daje specifičnost ciljanja na kompleks tako što sadrži nukleotidnu sekvencu koja je komplementarna sekvenci ciljane DNK.
[0391] Varijanta Cas9 usmerenog polipeptida ima smanjenu aktivnost endodoksibribonukleaze. Na primer, varijanta Cas9 usmerenog polipeptida koja je pogodna za upotrebu u postupku transkripcione modulacije ovog prikaza, pokazuje manje od oko 20%, manje od oko 15%, manje od oko 10%, manje od oko 5%, manje od oko 1% ili manje od oko 0,1% aktivnosti endodoksibribonukleaze polipeptida Cas9 divljeg tipa, npr. polipeptida Cas9 divljeg tipa koji sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je prikazano na Slici 3 (SEQ ID NO: 8). U nekim otelotvorenjima, varijanta Cas9 usmerenog polipeptida nema značajnu aktivnost koja se ne može detektovati endodoksibribonukleazijom. U nekim otelotvorenjima kada usmeren polipeptid ima smanjenu katalitičku aktivnost (npr. kada Cas9 protein ima D10, G12, G17, E762, H840, N854, N863, H982, H983, A984, D986 i/ili A987 mutaciju, npr. d10A, G12A, G17A, E762A, H840A, N854A, N863A, H982A, H983A, A984A i/ili D986A), polipeptid se i dalje može vezati za ciljanu DNK na specifičnom mestu (jer se i dalje navodi do ciljane DNK sekvence pomoću DNK koja cilja RNK) sve dok zadržava sposobnost interakcije sa RNK koja cilja DNK.
[0392] U nekim slučajevima, pogodna varijanta Cas9 usmerenog polipeptida sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95% , najmanje oko 99% ili 100% identičnosti aminokiselinske sekvence sa aminokiselinama 7-166 ili 731-1003 aminokiselinske sekvence Cas9/Csn1 prikazane na Slici 3 (SEQ ID NO: 8) ili odgovarajućim delovima u bilo kojoj od aminokiselinskih sekvenci od SEQ ID NOs: 1-256 i 795-1346.
[0393] U nekim slučajevima, varijanta Cas9 usmerenog polipeptida može da razdvoji komplementarnu vezu ciljane DNK, ali ima smanjenu sposobnost da se cepa nekomplementarne veze ciljane DNK. Na primer, varijanta Cas9-usmerenog polipeptida može imati mutaciju (supstitucija aminokiselina) koja smanjuje funkciju domena RuvC (npr., „domen 1“ na Slici 3). Kao neograničavajući primer, u nekim slučajevima, varijanta Cas9 usmerenog polipeptida je mutacija D10A (aspartat alanin) aminokiselinske sekvence prikazane na Slici 3 (ili odgovarajuća mutacija bilo koje od sekvenci aminokiselina datih u SEQ ID NO: 1-256 i 795-1346).
[0394] U nekim slučajevima, varijanta Cas9 usmerenog polipeptida može ukloniti nekomplementarnu vezu ciljane DNK, ali ima smanjenu sposobnost da cepa komplementarne veze ciljane DNK. Na primer, varijanta Cas9 usmerenog polipeptida može imati mutaciju (supstitucija aminokiselina) koja smanjuje funkciju HNH domena (motivi RuvC/HNH/RuvC domena, „domen 2“ na Slici 3). Kao neograničavajući primer, u nekim slučajevima, varijanta Cas9 usmerenog polipeptida je H840A (histidin u alanin na poziciji aminokiseline 840 od SEQ ID NO: 8) ili odgovarajuća mutacija bilo koje od aminokiselinskih sekvenca datih SEQ ID NO: 1-256 i 795-1346).
[0395] U nekim slučajevima, varijanta Cas9 usmerenog polipeptida ima smanjenu sposobnost da uklanja i komplementarne i nekomplementarne veze ciljane DNK. Kao neograničavajući primer, u nekim slučajevima, varijanta Cas9 usmerenog polipeptida ima i D10A i H840A mutacije aminokiselinske sekvence prikazane na Slici 3 (ili odgovarajuće mutacije bilo koje od aminokiselinskih sekvenci datih u SEQ ID NOs: 1-256 i 795-1346).
[0396] Ostali ostaci mogu biti mutirani da bi se postigao isti efekat (tj. inaktivirati jedan ili drugi deo nukleaze). Kao neograničavajući primeri, ostaci D10, G12, G17, E762, H840, N854, N863, H982, H983, A984, D986 i/ili A987 (ili odgovarajuće mutacije bilo kog proteina koji su navedeni kao SEQ ID NOs: 1-256 i 795-1346) mogu se izmeniti (tj. supstituisati) (pogledati Sliku 3, Sliku 5, Sliku 11A i Tabelu 1 za više informacija o očuvanju ostataka Cas9 aminokiselina). Takođe, pogodne su mutacije koje nisu alaninske supstitucije.
[0397] U nekim slučajevima, varijanta Cas9 usmerenog polipeptida je fuzioni polipeptid („varijanta Cas9 fuzionog polipeptida“), tj. fuzioni polipeptid koji sadrži: i) varijantu Cas9 usmerenog polipeptida; i b) kovalentno povezani heterologni polipeptid (koji se takođe naziva „fuzioni partner“).
[0398] Heterologni polipeptid može pokazati aktivnost (npr., enzimsku aktivnost) koja će takođe biti izložena varijanti Cas9 fuzionog polipeptida (npr. aktivnost metiltransferaze, aktivnost acetiltransferaze, aktivnost kinaze, aktivnost ubikitinacije i sl.). Heterologna sekvenca nukleinske kiseline može biti povezana sa drugom sekvencom nukleinske kiseline (npr., genetskim inženjeringom) kako bi se generisala himerna nukleotidna sekvenca koja kodira himerni polipeptid. U nekim otelotvorenjima varijanta Cas9 fuzionog polipeptida generiše se fuzijom varijante Cas9 polipeptida sa heterolognom sekvencom koja pruža subćelijsku lokalizaciju (tj. heterologna sekvenca je subćelijska lokacijska sekvenca, npr. signal nuklearne lokalizacije (NLS) za ciljanje na nukleus, signal mitohondrijske lokalizacije za ciljanje na mitohondrije, signal lokalizacije hloroplasta za ciljanje na hloroplast, ER retencijski signal i slično). U nekim otelotvorenjima heterologna sekvenca može da obezbedi obeležje (npr., heterologna sekvenca je detektabilno obeležje) za lakoću praćenja i/ili prečišćavanja (npr. fluorescentni protein, npr. zeleni fluorescentni protein (GFP), IFP, RFP, CFP, mCherry, tdTomato i slično; histidin obeležje, npr. obeležje 6XHis, obeležje hemaglutinina (HA), obeležje FLAG, obeležje Mic i slično). U nekim otelotvorenjima heterologna sekvenca može obezbediti povećanu ili smanjenu stabilnost (tj. heterologna sekvenca je peptid koji kontroliše stabilnost, npr. degron, koji se u nekim slučajevima može kontrolisati (npr. temperaturno osetljiva degron sekvenca ili degron sekvenca koja se može kontrolisati lekom, pogledati u nastavku). U nekim otelotvorenjima heterologna sekvenca može da obezbedi povećanu ili smanjenu transkripciju iz ciljane DNK (tj. heterologna sekvenca je transkripciona modulacijska sekvenca, npr. transkripcioni faktor/aktivator ili njegov fragment, protein ili njegov fragment koji regrutuje faktor transkripcije/aktivator, transkripcioni represor ili njegov fragment, protein ili njegov fragment koji regrutuje receptor transkripcije, mali regulator transkripcije koji odgovara molekulima/lekovima, itd.) U nekim otelotvorenjima heterologna sekvenca može da obezbedi vezujući domen (tj. heterologna sekvenca je sekvenca vezivanja proteina, npr., da bi se obezbedila sposobnost himernog dCas9 polipeptida da se veže na drugi protein koji je od interesu, npr. proteina koja modifikuje DNK ili histon, transkripcijski faktor ili represor transkripcije, protein za regrutaciju itd.).
[0399] Pogodni fuzioni partneri koji pružaju povećanu ili smanjenu stabilnost uključuju, ali se ne ograničavaju na degronske sekvence. Degrone se lako razumeju od strane stručnjaka u oblasti da su sekvence aminokiselina koje kontrolišu stabilnost proteina čiji su deo. Na primer, stabilnost proteina koji sadrži degronsku sekvencu se kontroliše bar delimično degronskom sekvencom. U nekim slučajevima, pogodan degron je konstitutivan tako da degron vrši svoj uticaj na stabilnost proteina nezavisno od eksperimentalne kontrole (tj. degron nije inducibilan za lek, inducibilan za temperaturu, itd.). U nekim slučajevima, degron pruža varijantu Cas9 polipeptida sa kontrolisanom stabilnošću tako da se varijanta Cas9 polipeptida može podesiti na „uključeno“ (tj. Stabilno) ili „isključeno“ (tj. Nestabilno, degradirano) u zavisnosti od željenih uslova. Na primer, ako je degron osetljiv na temperaturu, varijanta Cas9 polipeptida može biti funkcionalna (npr. „uključena“, „stabilna“) ispod praga temperature (npr. 442°C, 41°C, 40°C, 39°C, 38°C, 37°C, 36°C, 35°C, 34°C, 33°C, 32°C, 31°C, 30°C, itd.), ali nefunkcionalna (tj. „isključena“, „degradirana“) iznad praga temperature. Kao još jedan primer, ako je degron inducibilni degron, lek ili prisustvo leka mogu prebacivati protein iz „isključenog“ (tj. Nestabilnog) stanja u „uključeno“ (tj. Stabilno) stanje ili obrnuto. Primerna degron za indukovanje leka je izveden iz FKBP12 proteina. Stabilnost degrona kontroliše prisustvo ili odsustvo malog molekula koji se vezuje za degron.
[0400] Primeri pogodnih degrona uključuju, ali se ne ograničavaju na one koji su pod kontrolom Shield-1, DHFR, auksina. Neograničavajući primeri pogodnih degrona su poznati u struci (npr. dohmen et al., Science, 1994. 263(5151): p. 1273-1276: Heat-inducible degron: a method for constructing temperature-sensitive mutants; schoeber et al., Am J Physiol Renal Physiol.2009 Jan;296(1):F204-11 : Conditional fast expression and function of multimeric TRPV5 channels using Shield-1 ; Chu et al., Bioorg Med Chem Lett.2008 Nov 15;18(22):5941-4: Recent progress with FKBP-derived destabilizing domains ; kanemaki, Pflugers Arch.2012 Dec 28: Frontiers of protein expression control with conditional degrons; Yang et al., Mol Cell.2012 Nov 30;48(4):487-8: Titivated for destruction: the methyl degron; barbour et al., Biosci Rep. 2013 Jan 18;33(1).: Characterization of the bipartite degron that regulates ubiquitin-independent degradation of thymidylate synthase; i Greussing et al., J Vis Exp. 2012 Nov 10;(69): Monitoring of ubiquitinproteasome activity in living cells using a Degron (dgn)-destabilized green fluorescent protein (GFP)-based reporter protein).
[0401] Primerne degronske sekvence su dobro obeležene i testirane u ćelijama i životinjama. Tako, fiksiranje dCas9 u degronsku sekvencu proizvodi „podesivi“ i „inducibilni“ dCas9 polipeptid. Svaki od ovde opisanih fuzionih partnera može se koristiti u bilo kojoj poželjnoj kombinaciji. Kao jedan neograničavajući primer koji ilustruje ovu tačku, dCas9 fuzioni protein može sadržati IFP sekvencu za detekciju, degronsku sekvencu za stabilnost i sekvencu transkripcionog aktivatora za povećanje transkripcije ciljane DNK. Pored toga, broj fuzionih partnera koji se mogu koristiti u dCas9 fuzionom proteinu je neograničen. U nekim slučajevima dCas9 fuzioni protein sadrži jednu ili više (npr. dva ili više, tri ili više, četiri ili više, ili pet ili više) heterolognu sekvencu.
[0402] Pogodni fuzioni partneri uključuju, ali nisu ograničeni na, polipeptid koji pruža aktivnost metil-transferaze, aktivnost demetilaze, aktivnost acetil-transferaze, aktivnost deacetilaze, aktivnost kinaze, aktivnost fosfataze, aktivnost ubikuitin ligaze, aktivnost deubikuitinacije, aktivnost adenilacije, aktivnost umirenja, aktivnost SUMOilacije, aktivnost deSUMOilacije, aktivnost ribozilacije, aktivnost deribozilacije, aktivnost miristoilacije ili aktivnost demiristoilacije, od kojih bilo koja može biti usmeren na direktno modifikovanje DNK (npr. metilovanje DNK) ili na modifikovanje polipeptida povezanog sa DNK (npr. histon ili DNK vezujući protein). Dodatni pogodni fuzioni partneri uključuju, ali se ne ograničavaju na granične elemente (npr. CTCF), proteine i njihove fragmente koji pružaju regeneraciju periferije (npr. lamin A, Lamin B, itd.) i elemente za povezivanje proteina (npr. fKBP/FRB , Pil1/Aby1 itd.).
[0403] Primeri različitih dodatnih pogodnih fuzionih partnera (ili njihovih fragmenata) za predmetnu varijantu Cas9 usmerenog polipeptida uključuju, ali se ne ograničavaju na one navedene na Slici 54.
[0404] U nekim otelotvorenjima, usmeren modifikacioni polipeptid može biti kodon-optimizovan. Ovaj tip optimizacije je poznat u struci i podrazumeva mutaciju stranog DNK da imitira preferencije kodona namenjenog organizma ili ćelije domaćina dok kodira isti protein. Zbog toga se kodoni menjaju, ali kodirani protein ostaje nepromenjen. Na primer, ako je ciljana ćelija bila ljudska ćelija, ljudski kodon-optimizovan dCas9 (ili dCas9 varijanta) bi bio odgovarajući usmeren modifikacioni polipeptid. Kao još jedan neograničavajući primer, ako je predložena ćelija domaćina bila mišja ćelija, onda bi mišji kodon-optimizovan Cas9 (ili varijanta, npr., enzimatski neaktivna varijanta) bio odgovarajući Cas9 usmeren modifikacioni polipeptid. Iako optimizacija kodona nije potrebna, ona je prihvatljiva i može biti poželjna u određenim slučajevima.
Ćelije domaćini
[0405] Ovde je opisan postupak za modulaciju transkripcije koja se može primeniti da indukuje transkripcionu modulaciju u mitotskim ili postmitoticnim ćelijama in vivo i/ili ex vivo i/ili in vitro. Pošto RNK koja cilja DNK pruža specifičnost hibridizacijom za ciljanu DNK, mitotska i/ili postmitotska ćelija može biti bilo koja od različitih ćelija domaćina, gde odgovarajuće ćelije domaćini uključuju, ali nisu ograničene na, bakterijsku ćeliju; arhealnu ćeliju; jednoćelijski eukariotski organizam; biljnu ćeliju; ćeliju algi, npr. botryococcus braunii, Chlamydomonas reinhardtii, Nannochloropsis gaditana, Chlorella pyrenoidosa, Sargassum patens, C. agardh i slično; ćeliju gljiva; Životinjsku ćeliju; ćeliju beskičmenjaka (npr. Insekt, cnidarijan, ehinoderm, nematod, itd.); eukariotski parazit (npr., malarijski parazit, npr. plasmodium falciparum, helminth, itd.); ćeliju od kičmenjaka (npr. riba, vodozemaca, gmizavaca, ptica, sisara); ćeliju sisara, npr., ćeliju glodara, ćeliju čoveka, ćeliju primata bez čoveka, itd. Pogodne ćelije domaćini uključuju ćelije koje prirodno okružuju; genetski modifikovane ćelije (npr., ćelije genetski modifikovane u laboratoriji, npr., „rukom čoveka“); i ćelije manipulisane in vitro na bilo koji način. U nekim slučajevima, ćelija domaćin je izolovana.
[0406] Svaka vrsta ćelije može biti od interesa (npr. matične ćelije, npr. ćelije embrionog stabla (ES), indukovane ćelije pluripotentnog stabla (iPS), germ ćelije gde ljudske germ ćelije nisu deo sastava pronalaska, somatska ćelija, npr. fibroblast, hematopoetska ćelija, neuron, mišićna ćelija, koštana ćelija, hepatocit, ćelija pankreasa, in vitro ili in vivo ne-ljudska embrionska ćelija ne-ljudskog embriona u bilo kojoj fazi, npr. 1-ćelijski, 2-ćelijski, 4-ćelijski, 8-ćelijski itd. embrion zebrice itd.). Ćelije mogu biti iz utvrđenih ćelijskih linija ili mogu biti primarne ćelije, gde se „primarne ćelije“, „primarne ćelijske linije“ i „primarne kulture“ ovde koriste međusobno zamenjivo i odnose se na ćelije i ćelijske kulture koje su izvedene od pacijenta i dozvoljeno im je da rastu in vitro tokom ograničenog broj prolaza, odnosno razdvajanja, kulture. Na primer, primarne kulture uključuju kulturu koja je možda bila prošla 0 puta, 1 put, 2 puta, 4 puta, 5 puta, 10 puta ili 15 puta, ali nije dovoljno puta prošla kroz fazu krize. Primarne ćelijske linije se mogu održavati za manje od 10 prolaza in vitro. ciljane ćelije su u mnogim otelotvorenjima jednoćelijski organizmi ili se gaje u kulturi.
[0407] Ako su ćelije primarne ćelije, takve ćelije mogu se sakupljati od pojedinca bilo kojim pogodnim postupkom. Na primer, leukociti se lako mogu sakupljati aferezom, leukocitafezom, separacijom gradijenta gustine itd., dok su najpogodnije ćelije iz tkiva kao što su koža, mišić, koštana srž, slezina, jetra, pankreas, pluća, creva, želudac itd. sakupljena biopsijom. Odgovarajući rastvor se može koristiti za disperziju ili suspenziju sakupljenih ćelija. Takvo rešenje će uglavnom biti uravnoteženi slani rastvor, npr. fiziološki rastvor soli, fosfatno puferisan fiziološki rastvor (PBS), Hankov balansirani rastvor soli, itd., Pogodno dopunjeni goveđim serumom fetusa ili drugim prirodnim faktorima, u kombinaciji sa prihvatljivim puferom pri niskoj koncentraciji, npr., od 5-25 mM. Prikladni baferi uključuju HEPES, puferove fosfate, laktatne bafere itd. Ćelije se mogu odmah koristiti, ili se mogu spremiti, zamrznuti, dugotrajno, odleđivati i ponovo se koristiti. U takvim slučajevima ćelije će obično biti zamrznute u 10% dimetil sulfoksida (DMSO), 50% seruma, 40% puferisanog medijuma ili nekom drugog takvom rastvoru koji se uobičajeno koristi u struci za očuvanje ćelija na takvim temperaturama zamrzavanja, i otapanje na način koji je u struci poznat za odmrzavanje zamrznutih kultivisanih ćelija.
Uvođenje nukleinske kiseline u ćeliju domaćina
[0408] RNK koja cilja DNK ili nukleinska kiselina koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira isto, može se uvesti u ćeliju domaćina bilo kojim od različitih poznatih postupaka. Slično tome, tamo gde predmetni postupak uključuje uvođenje u ćeliju domaćina nukleinske kiseline koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira varijantu Cas9 usmerenog polipeptida, takva nukleinska kiselina može se uvesti u ćeliju domaćina bilo kojim od različitih poznatih postupaka.
[0409] Postupci uvođenja nukleinske kiseline u ćeliju domaćina poznati su u struci, i svaka poznat postupak se može koristiti za uvođenje nukleinske kiseline (npr., eksprimirajući konstrukt) u matičnu ćeliju ili progenitorsku ćeliju. Pogodni postupci uključuju npr. virusnu ili bakteriofagnu infekciju, transfekciju, konjugaciju, protoplastnu fuziju, lipofekciju, elektroporaciju, precipitaciju kalcijum fosfata, transfekciju sa polietileniminom (PEI), transfekciju posredovanu DEAE-dekstranom, transfekciju posredovanu lipozomom, precipitaciju kalcijum fosfata, direktno mikro ubrizgavanje, isporuku nukleinskih kiselina posredovanu nanočesticama (pogledati npr. panyam et., al Adv Drug Deliv Rev. 2012 Sep 13. pii: S0169-409X(12)00283-9. doi: 10.1016/j.addr.2012.09.023) i slično.
NUKLEINSKE KISELINE
[0410] Ovo obelodanjenje pruža izolovanu nukleinsku kiselinu koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira predmetnu RNK koja cilja DNK. U nekim slučajevima, predmetna nukleinska kiselina takođe sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira varijantu Cas9 usmerenog polipeptida.
[0411] U nekim otelotvorenjima predmetni postupak uključuje unošenje u ćeliju domaćina (ili populaciju ćelija domaćina) jedne ili više nukleinskih kiselina koje sadrže nukleotidne sekvence koje kodiraju RNK koja cilja DNK i/ili varijantu Cas9 usmerenog polipeptida. U nekim otelotvorenjima ćelija koja sadrži ciljanu DNK je in vitro. U nekim otelotvorenjima ćelija koja sadrži ciljanu DNK je in vivo. Pogodne nukleinske kiseline koje sadrže nukleotidne sekvence koje kodiraju RNK koja cilja DNK i/ili usmeren polipeptid uključuju vektore eksprimiranja, gde je vektor eksprimiranja koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira RNK koja cilja DNK i/ili polipeptid usmeren na lokaciju „rekombinantni vektor eksprimiranja“.
[0412] U nekim otelotvorenjima, rekombinantni vektor eksprimiranja je virusni konstrukt, npr. rekombinantni adeno-povezani virusni konstrukt (pogledati, npr., U.S. Patent No. 7,078,387), rekombinantni adenovirusni konstrukt, rekombinantni lentivirusni konstrukt, rekombinantni retrovirusni konstrukt, Itd.
[0413] Pogodni vektori eksprimiranja uključuju, ali nisu ograničeni na, virusne vektore (npr. virusne vektore zasnovane na vaccinia virusu, poliovirusu, adenovirusu (pogledati, npr., Li et al., Invest Opthalmol Vis Sci 35:25432549, 1994; borras et al., Gene Ther 6:515524, 1999; Li and Davidson, PNAS 92:77007704, 1995; sakamoto et al., H Gene Ther 5:10881097, 1999; WO 94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 and WO 95/00655), adeno-povezanom virusu (pogledati, na primer, Ali et al., Hum Gene Ther 9:81 86, 1998, Flannery et al., PNAS 94:69166921, 1997; Bennett et al., Invest Opthalmol Vis Sci 38:2857 2863, 1997; Jomary et al., Gene Ther 4:683690, 1997, Rolling et al., Hum Gene Ther 10:641 648, 1999; Ali et al., Hum Mol Genet 5:591594, 1996; srivastava in WO 93/09239, Samulski et al., J. Vir. (1989) 63:3822-3828; mendelson et al., Virol. (1988) 166:154-165; i Flotte et al., PNAS (1993) 90:10613-10617); sV40; herpes simpleks virusu, virusu ljudske imunodeficijencije (pogledati, npr., Miyoshi et al., PNAS 94:1031923, 1997; Takahashi et al., J Virol 73:78127816, 1999); retrovirusnom vektoru (npr. virus mišje leukemije, virus nekroze slezine i vektori izvedeni iz retrovirusa kao što su Rous Sarcoma virus Harvey Sarcoma virus, virus ptičje leukoze, lentivirus, virus ljudske imunodeficijencije, virus mijeloproliferativnog sarkoma i virus tumora dojke); i slično.
[0414] Brojni pogodni vektori eksprimiranja poznati su stručnjacima u oblasti i mnogi su komercijalno dostupni. Sledeći vektori su dati primerom; Za eukariotske ćelije domaćina: pXT1, pSG5 (Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG i pSVLSV40 (Pharmacia). Međutim, bilo koji drugi vektor može se koristiti sve dok je kompatibilan sa ćelijom domaćina.
[0415] U zavisnosti od korišćenog sistema domaćina/vektora, u vektoru eksprimiranja može se koristiti bilo koji od odgovarajućih elemenata za kontrolu transkripcije i translacije, uključujući konstitutivne i inducibilne promotere, elemente poboljšanja transkripcije, terminatore transkripcije itd. (pogledati npr. Bitter et al. (1987) Methods in Enzymodogy, 153:516-544).
[0416] U nekim otelotvorenjima, nukleotidna sekvenca koja kodira RNK koja cilja DNK i/ili varijantu Cas9 usmerenog modifikacionog polipeptida operativno je povezana sa kontrolnim elementom, na primer, kontrolnim elementom transkripcije, kao što je promoter. Element kontrole transkripcije može biti funkcionalan u eukariotskoj ćeliji, npr. ćelije sisara; ili prokariotskoj ćeliji (npr., bakterijske ili arhealne ćelije). U nekim otelotvorenjima, nukleotidna sekvenca koja kodira RNK koja cilja DNK i/ili usmeren modifikacioni polipeptid operativno je povezana sa više kontrolnih elemenata koji omogućavaju eksprimiranje nukleotidne sekvence koja kodira RNK koja cilja DNK i/ili usmeren modifikacioni polipeptid u prokariontskim i eukariotskim ćelijama.
[0417] Promoter može biti konstitutivno aktivni promoter (tj. promoter koji je konstitutivno u aktivnom/„uključeno“ stanju), može biti inducibilni promoter (tj. promoter čije se stanje, aktivno/„uključeno“ ili neaktivno/„isključeno“, kontroliše spoljašnjim stimulusom, npr. prisustvom određene temperature, jedinjenja ili proteina), može biti prostorno ograničen promoter (tj. element kontrole transkripcije, pojačivač, itd.) (npr. promoter specifičan za tkivo, promoter specifičan za ćelijski oblik itd.) i može biti promoter koji je vremenski ograničen (tj. promoter je u stanju "uključeno" ili "isključeno" u određenim fazama embrionalnog razvoja ili u određenim fazama biološkog procesa, npr. ciklus folikula kose kod miševa).
[0418] Odgovarajući promoteri mogu biti izvedeni iz virusa i stoga se mogu nazvati virusnim promoterima, ili mogu biti izvedeni iz bilo kog organizma, uključujući prokariotske ili eukariotske organizme. Odgovarajući promoteri mogu se koristiti za eksprimiranje bilo kojom RNK polimerazom (npr., pol I, pol II, pol III). Primeri promotera obuhvataju, ali nisu ograničeni na rani promoter SV40, promoter dugačkog terminalnog ponavljanja (LTR) mišjeg virusa tumora dojke; adenovirus veliki kasni promoter (Ad MLP); herpes simpleks virus (HSV) promoter, promoter citomegalovirusa (CMV) kao što je neposredna rana promotivna regija (CMVIE), promoter virusa rous sarkoma (RSV), ljudski U6 mali nuklearni promoter (U6) ((Miyagishi et al. , Nature Biotechnology 20, 497 - 500 (2002)), poboljšani promoter U6 (npr. Xia et al., Nucleic Acids Res.
2003 Sep 1;31(17)), ljudski H1 promoter (HI) i slično.
[0419] Primeri inducibilnih promotera uključuju, ali se ne ograničavaju na promoter T7 RNK polimeraze, promoter T3 RNK polimeraze, promoter regulisanog izopropil-beta-D-tiogalaktopiranozidoma (IPTG), promoter izazvan laktozom, promoter toplotnog šoka, promoter regulisan tetraciklinom (npr. tet-ON, Tet-OFF itd.), steroidno regulisani promoter, promoter kog reguliše metal, estrogen receptorski regulator, itd. Inducibilni promoteri mogu stoga biti regulisani molekulima uključujući, ali ne ograničavajući se na, doksiciklin; RNK polimerazu, npr. t7 RNK polimeraza; estrogen receptor; euzija estrogenskih receptora; itd.
[0420] U nekim otelotvorenjima, promoter je prostorno ograničeni promoter (tj. promoter specifičan za ćelijski tip, promoter specifičan za tkivo, itd.), tako da je u viešećelijskom organizmu promoter aktivan (npr. „uključen“) u podskupu specifičnih ćelija. Prostorno ograničeni promoteri mogu takođe biti obeleženi kao ojačivači, elementi kontrole transkripcije, kontrolne sekvence itd. Može se koristiti bilo koji pogodan prostorski ograničeni promoter i izbor odgovarajućeg promotera (npr. promoter specifičan za mozak, promoter koji vodi eksprimiranje u podskupu neurona, promotera koji vodi eksprimiranje u germliniji, promoter koji vodi eksprimiranje u plućima, promoter koji vodi eksprimiranje u mišićima, promoter koji vodi eksprimiranje u ćelijama ostrvcima pankreasa itd.) zavisiće od organizma. Na primer, razni prostorno ograničeni promoteri poznati su za biljke, muve, crve, sisare, miševe i sl. Tako se prostorno ograničeni promoter može koristiti za regulisanje eksprimiranja nukleinske kiseline koja kodira usmeren polipeptid kod mnoštva različitih tkiva i vrsta ćelija, u zavisnosti od organizma. Neki prostorno ograničeni promoteri su takođe ograničeni tako da je promoter u stanju „uključeno“ ili „isključeno“" u određenim fazama embrionalnog razvoja ili u određenim fazama biološkog procesa (npr. ciklus folikula kose kod miševa).
[0421] U svrhe ilustracije, primeri prostorno ograničenih promotera uključuju, ali se ne ograničavaju na, neuronske specifične promotere, adipocit-specifične promotere, promotere specifične za kardiomiocit, promotere specifične za glatke mišiće, promotere specifične za fotoreceptore itd. Prostorno ograničeni promoteri specifični za neurone uključuju, ali nisu ograničeni na, promoter specifičan za neonsku enolazu (NSE) (pogledati, npr., eMBL HSENO2, X51956); promoter aromatične aminokiseline dekarboksilaze (AADC); promoter neurofilamenta (pogledati, npr., GenBank HUMNFL, L04147); promoter sinapsina (pogledati, npr., GenBank HUMSINIB, M55301); promoter thi-1 (pogledati, npr., Chen et al. (1987) Cell 51:7-19; i Llewellyn, et al. (2010) Nat. Med. 16(10):1161-1166); promoter serotoninskog receptora (pogledati, npr., GenBank S62283); promoter tirozin hidroksilaze (TH) (pogledati, npr., oh et al. (2009) Gene Ther 16:437; Sasaoka et al. (1992) Mol. Brain Res.16:274; Boundy et al. (1998) J. Neurosci.18:9989; i Kaneda et al. (1991) Neuron 6:583-594); promoter GnRH (pogledati, npr., Radovick et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:3402-3406); L7 promoter (pogledati, npr., Oberdick et al. (1990) Science 248:223-226); a DNMT promoter (pogledati, npr., bartge et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:3648-3652); promoter enkefalina (pogledati, npr. Comb et al. (1988) EMBO J.
17:3793-3805); promoter mijelinskog baznog proteina (MBP); promoter Ca2+kalmodulin-zavisne protein kinaze II-alfa (pogledati npr. Mayford et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:13250; i Casanova et al. (2001) Genesis 31:37); promoter CMV ojačivača/faktora rasta-β koji je dobijen od trombocita (pogledati, npr., Liu et al. (2004) Gene Therapy 11:52-60); i slično.
[0422] Adipocitni specifični prostorno ograničeni promoteri uključuju, ali se ne ograničavaju na promoter/ojačivač aP2 gena, npr. regija od -5,4 kb do 21 bp ljudskog aP2 gene (pogledati, na primer, Tozzo et al. (1997) Endocrinol.138:1604; Ross et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:9590; i Pavjani et al. (2005) Nat. Med. 11:797); promoter glukoza transportera-4 (GLUT4) (pogledati, npr., Knight et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:14725); promoter masnih kiselina (FAT/CD36) (pogledati, na primer, Kuriki et al. (2002) Biol. Pharm. Bull.25:1476; i Sato et al. (2002) J. Biol. Chem.277:15703); promoter stearoil-CoA desaturaze-1 (SCD1) (Tabor et al. (1999) J. Biol. Chem. 274:20603); promoter leptina (pogledati, npr., Mason et al. (1998) Endocrinol.139:1013; i Chen et al. (1999) Biochem. Biophys. Res. Comm.262:187); promoter adiponektina (pogledati, npr., kita et al. (2005) Biochem. Biophys. Res. Comm. 331:484; i Chakrabarti (2010) Endocrinol.151:2408); promoter adipsina (pogledati, npr., Platt et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:7490); promoter resistina (pogledati, npr., Seo et al. (2003) Molec. Endocrinol.17:1522); i slično.
[0423] Kardiomiocitno specifični prostorno ograničeni promoteri uključuju, ali se ne ograničavaju na kontrolne sekvence izvedene iz sledećih gena: miozin lakog lanca-2, α-miozin teškog lanca, AE3, srčani troponin C, kardijalni aktin i slično. Franz et al. (1997) Cardiovasc. Res.35:560-566; robbins et al. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci.752:492-505; Linn et al. (1995) Circ. Res.76:584-591; Parmacek et al. (1994) Mol. Cell. Biol.14:1870-1885; Hunter et al. (1993) Hypertension 22:608-617; i Sartorelli et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4047-4051.
[0424] Prostorno ograničeni promoteri specifični za glatke mišiće uključuju, ali nisu ograničeni na promoter SM22a (pogledati, npr., akyürek et al. (2000) Mol. Med. 6:983; i U.S. Patent No.
7,169,874); promoter smutelina (pogledati, npr., WO 2001/018048); promoter aktina α-glatkog mišića; i slično. Na primer, pokazano je da regija 0,4 kb promotera SM22a u kojoj leže dva CArG elementa, posreduje u ćelijsko-specifičnom eksprimiranju vaskularnih glatkih mišića (pogledati npr. Kim, et al. (1997) Mol. Cell. Biol.17, 2266-2278; Li, et al., (1996) J. Cell Biol.132, 849-859; i Moessler, et al. (1996) Development 122, 2415-2425).
[0425] Prostorno ograničeni promoteri specifični za fotoreceptor uključuju, ali nisu ograničeni na, promoter rodopsina; promoter rodopsin kinaze (Young et al. (2003) Ophthalmol. Vis. Sci.
44:4076); promoter gena beta fosfodiesteraze (Nicoud et al. (2007) J. Gene Med. 9:1015); promoter gena retinitis pigmentoze (Nicoud et al. (2007) supra); interferotoreceptor retinoidvezujući protein (IRBP) genski pojačivač (Nicoud et al. (2007) supra); promoter IRBP gena (Yokoyama et al. (1992) Exp Eye Res.55:225); i slično.
BIBLIOTEKE
[0426] Ovo obelodanjenje pruža biblioteku RNK koje ciljaju DNK. Ovo obelodanjenje pruža biblioteku nukleinskih kiselina koje sadrže nukleotide koji kodiraju RNK koje ciljaju DNK. Predmetna biblioteka nukleinskih kiselina koja sadrži nukleotide koji kodiraju RNK koje ciljaju DNK može da sadrži biblioteku rekombinantne vektore eksprimiranja koji sadrže nukleotide koji kodiraju RNK koje ciljaju DNK.
[0427] Predmetna biblioteka može sadržati od oko 10 pojedinačnih članova do oko 1012 pojedinačnih članova; npr. biblioteka predmeta može sadržati od oko 10 pojedinačnih članova do oko 102 pojedinačna člana, od oko 102 pojedinačna člana do oko 103 pojedinačna člana, od oko 103 pojedinačna člana do oko 105 pojedinačnih članova, od oko 105 pojedinačnih članova do oko 107 pojedinačnih članova , Od oko 107 pojedinačnih članova do oko 109 pojedinačnih članova, ili od oko 109 pojedinačnih članova do oko 1012 pojedinačnih članova.
[0428] „Pojedinačni član“ predmetne biblioteke razlikuje se od drugih članova biblioteke po nukleotidnoj sekvenci DNK-ciljajućeg segmenta RNK koja cilja DNK. Tako, npr., Svaki pojedinačni član predmetne biblioteke može sadržati istu ili u suštini istu nukleotidnu sekvencu segmenta vezivanja proteina kao i svi ostali članovi biblioteke; i može sadržati istu ili suštinski istu nukleotidnu sekvencu segmenta završetka transkripcije kao i svi ostali članovi biblioteke; ali se razlikuje od ostalih članova biblioteke u nukleotidnoj sekvenci DNK-ciljajućeg segmenta RNK koja cilja DNK. Na ovaj način, biblioteka može sadržati članove koji se vezuju za različite ciljane nukleinske kiseline.
KORISNOST
[0429] Postupak za moduliranje transkripcije kao što je prikazano u ovom obelodanjenju nalazi primenu u različitim svrhama koje su takođe obezbeđene. Primene uključuju istraživačke svrhe; dijagnostičke svrhe; industrijske svrhe; i primena za tretman.
[0430] Istraživanja svrhe uključuju, na primer, određivanje efekta smanjenja ili povećanja transkripcije ciljane nukleinske kiseline na, na primer, razvoj, metabolizam, eksprimiranje nizvodnog gena i slično.
[0431] Visoka genomska analiza može se izvršiti korišćenjem postupka modulacije transkripcije predmeta, u kojoj se mora promeniti samo DNK-ciljajući segment RNK koja cilja DNK, dok segment vezivanja proteina i segment za završetak transkripcije mogu (u nekim slučajevima) biti konstantni. Biblioteka (npr. predmetna biblioteka) koja sadrži mnoštvo nukleinskih kiselina koje se koriste u genomskoj analizi bi uključivala: promoter operativno povezan sa DNK nukleotidnom sekvencom koja kodira RNK, gde svaka nukleinska kiselina uključuje drugačiji segment ciljanja na DNK, zajednički protein vezujući segment, i zajednički segment transkripcije. Čip može sadržati više od 5 x 10<4>jedinstvenih RNK koje ciljaju DNK. Primene bi uključivale fenotipizaciju velikih razmera, mapiranje gena prema funkciji i meta-genomičku analizu.
[0432] Predmetni postupci koji su ovde otkriveni koriste se u oblasti metaboličkog inženjeringa. Pošto nivoi transkripcije mogu biti efikasno i predvidivo kontrolisani dizajniranjem odgovarajuće RNK koja cilja DNK, kao što je ovde obelodanjeno, aktivnost metaboličkih puteva (npr. biosintetski putevi) može se precizno kontrolisati i podesiti kontrolisanjem nivoa specifičnih enzima (npr. preko povećane ili smanjene transkripcije) unutar metaboličkog puta od interesa. Metabolički putevi od interesa uključuju one koji se koriste za hemikalije (fini hemijski proizvodi, gorivo, antibiotici, toksini, agonisti, antagonisti itd.) I/ili proizvodnju lekova.
[0433] Biosintetički putevi od interesa uključuju, ali nisu ograničeni na: (1) mevalonatni put (npr HMG-CoA reduktaza put) (pretvara acetil-CoA u dimetilalil pirofosfat (DMAPP) i izopentenil pirofosfat (IPP), koji se koriste za biosintezu širokog spektra biomolekula uključujući terpenoide/izoprenoide), (2) ne-mevalonatni put (tj „2-C-metil-D-eritritol 4-fosfat/1-deoksi-D-ksiluloza 5-fosfat put“ ili „MEP/DOXP put“ ili „DXP put“) (takođe proizvodi DMAPP i IPP, konvertovanjem piruvat i gliceraldehid 3-fosfata u DMAPP i IPP putem alternativnog puta za mevalonatni put), (3) put sinteze poliketida (proizvodi razne poliketide putem različitih enzima sitnteze poliketida. Poliketidi obuhvataju prirodne male molekule koji koriste za hemoterapiju (npr tetraciklin, i makrolidi) i industrijski važni poliketidi uključuju rapamicin (imunosupresant), eritromicin (antibiotik), lovastatin (lek protiv holesterola) i epotilon B (lek protiv kancera)), (4) put sinteze masnih kiselina, (5) put sinteze DAHP (3-deoksi-D-arabino-heptulosonat 7fosfat), (6) putevi koji proizvode potencijalna biogoriva (poput alkoholnih pića sa kratkim lancima i alkana, metil estara masnih kiselina i masnih alkohola, izoprenoida itd.) itd.
Mreže i kaskade
[0434] Postupci objavljeni ovde mogu se koristiti za dizajniranje integrisanih mreža (tj. kaskade ili kaskada) kontrole. Na primer, predmetna RNK koja cilja DNK/varijanta Cas9 usmerenog polipeptida može se koristiti za kontrolu (tj. moduliranje, npr., povećanje, smanjenje) eksprimiranja druge RNK koja cilja DNK ili druge predmetne varijante Cas9 usmerenog polipeptida. Na primer, prva RNK koja cilja DNK može biti dizajnirani za ciljanje modulaciju transkripcije drugog himernog dCas9 polipeptida sa funkcijom koja se razlikuje od prve varijante Cas9 usmerenog polipeptida (npr aktivnost metiltransferaze, aktivnost demetilaze, aktivnost acetiltansferaze, aktivnost deacetilaze itd.). Pored toga, zbog toga što različiti dCas9 proteini (npr., izvedeni iz različitih vrsta) mogu zahtevati drugačiju Cas9 dršku (tj. Segment vezivanja proteina), drugi himerni dCas9 polipeptid može biti izveden iz drugačije vrste od prvog dCas9 polipeptida iznad. Tako, u nekim slučajevima, drugi himerni dCas9 polipeptid može se odabrati tako da ne može interagovati sa prvom RNK koja cilja DNK. U drugim slučajevima, drugi himerni dCas9 polipeptid može se odabrati tako da on interakuje sa prvom RNK koja cilja DNK. U nekim takvim slučajevima, aktivnosti dva (ili više) dCas9 proteina može se nadmetati (npr., ako polipeptidi imaju suprotne aktivnosti) ili mogu sinergizovati (npr. ako polipeptidi imaju slične ili sinergističke aktivnosti). Takođe, kao što je prethodno pomenuto, bilo koji od kompleksa (tj. RNK koja cilja DNK/dCas9 polipeptid) u mreži može biti dizajniran da kontroliše druge RNK koje ciljaju DNK ili dCas9 polipeptide. S obzirom da predmetna RNK koja cilja DNK i predmetna varijanta Cas9 usmerenog polipeptida mogu biti ciljani na bilo koju željenu sekvencu DNK, postupci koji su ovde opisani mogu se koristiti za kontrolu i regulisanje eksprimiranja bilo kog željenog cilja.
Integrisane mreže (tj. kaskade interakcija) koje se mogu projektovati kreću se od vrlo jednostavnih do veoma složenih, i nisu ograničene.
[0435] U mreži u kojoj dve ili više komponenti (npr. RNK koja cilja DNK, aktivator-RNK, targeter-RNK ili dCas9 polipeptidi) su svaka pod regulatornom kontrolom drugog DNK koja cilja RNK/dCas9 polipeptid kompleksa, nivo eksprimiranja jedne komponente mreže može uticati na nivo eksprimiranja (npr. može povećati ili smanjiti eksprimiranje) druge komponente mreže. Kroz ovaj mehanizam, eksprimiranje jedne komponente može uticati na eksprimiranje različite komponente u istoj mreži, a mreža može uključiti mešavinu komponenti koje povećavaju eksprimiranje ostalih komponenti, kao i komponente koje smanjuju eksprimiranje ostalih komponenti Kao što bi stručnjak u stanju tehnike dobro razumeo, gore navedeni primeri u kojima nivo eksprimiranja jedne komponente može uticati na nivo eksprimiranja jedne ili više različitih komponenti su u ilustrativne svrhe i nisu ograničavajući. Dodatni sloj složenosti može se opciono uvesti u mrežu kada se jedna ili više komponenti modifikuju (kako je gore opisano) tako da se mogu manipulisati (tj. pod eksperimentalnom kontrolom, npr. kontrola temperature, kontrola lekova, tj. kontrola inducibilna lekom; kontrola svetlosti; itd.).
[0436] Kao jedan neograničavajući primer, prva RNK ciljana DNK može se vezati za promotera druge RNK koja cilja na DNK, koja kontroliše eksprimiranje ciljanog terapijskog/metaboličkog gena. U takvim slučajevima, uslovna eksprimiranje prve RNK ciljane na DNK indirektno aktivira terapeutski/metabolički gen. RNK kaskade ove vrste su korisne, na primer, za lako pretvaranje represora u aktivator i mogu se koristiti za kontrolu logike ili dinamike eksprimiranja ciljanog gena.
[0437] Postupak transkripcije modulacije pacijenta takođe se može koristiti za obelodanjenje lekova i validaciju cilja.
OPREMA
[0438] Ovo obelodanjenje sadrži komplet za sprovođenje ovde opisanih postupaka. Komplet sadrži: a) RNK koja cilja DNK ovog obelodanjenja ili nukleinsku kiselinu koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira RNK koja cilja DNK, pri čemu RNK koja cilja DNK sadrži: i) prvi segment koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja je komplementarna ciljanoj sekvenci u ciljanoj DNK; ii) drugi segment koji interakuje sa usmerenim polipeptidom; i iii) transkripcijski terminator; i b) pufer. U nekim slučajevima, nukleinska kiselina koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira RNK koja cilja DNK dalje sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira varijantu Cas9 usmerenog polieptida koja pokazuje smanjenu aktivnost endodoksibribonukleaze u odnosu na divljim tipom Cas9.
[0439] U nekim slučajevima, komplet dalje sadrži varijantu Cas9 usmerenog polieptida koji pokazuje smanjenu aktivnost endodoksibribonukleaze u odnosu na divlji tip Cas9.
[0440] U nekim slučajevima, komplet dalje sadrži nukleinsku kiselinu koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira varijantu Cas9 usmerenog polieptida koji pokazuje smanjenu aktivnost endodoksibribonukleaze u odnosu na divlji tip Cas9.
[0441] Komplet može dalje da sadrži jedan ili više dodatnih reagensa, gde takvi dodatni reagensi mogu biti izabrani iz grupe koju čine: pufer; pufer za pranje; kontrolni reagens; kontrolni vektor eksprimiranja ili RNK polinukleotid; reagens za in vitro proizvodnju varijante Cas9 usmerenog polipeptida iz DNK; i slično. U nekim slučajevima, varijanta Cas9 usmerenog polipeptida uključenog u predmetni komplet je fuziona varijanta Cas9 usmerenog polipeptida, kao što je gore opisano.
[0442] Komponente kompleta mogu biti u odvojenim kontejnerima; ili se mogu kombinovati u jednom kontejneru.
[0443] Pored gore pomenutih komponenti, predmetni komplet može dalje da sadrži uputstva za upotrebu komponenti kompleta za primenu predmetnih postupaka. Uputstva za primenu predmetnih postupaka generalno su zabeležena na odgovarajućem medijumu za snimanje. Na primer, uputstva mogu biti odštampana na podlozi, kao što su papir ili plastika itd. Kao takva, uputstva mogu biti prisutna u kompletu kao umetci u pakovanju, na etiketiranju kontejnera kompleta ili njegovih komponenti (npr. povezana sa pakovanjem ili pod-pakovanjem) itd. U drugim otelotvorenjima, instrukcije su prisutne kao elektronska datoteka podataka za skladištenje prisutna na odgovarajućem kompjuterski čitljivom medijumu za čuvanje, npr. CD-ROM, disketa, fleš disk, itd. U još nekim otelotvorenjima stvarna uputstva nisu prisutna u kompletu, već su načini za dobijanje instrukcija iz udaljenog izvora, npr. preko interneta. Primer ovakvog otelotvorenja je komplet koji sadrži veb adresu na kojoj se mogu videti uputstva i/ili iz kojih se mogu preuzeti uputstva. Kao i uputstva, ovaj način za dobijanje instrukcija se snima na odgovarajućoj podlozi.
PRIMERI
[0444] Sledeći primeri su predstavljeni kako bi stručnjacima u oblasti pružili potpuno obelodanjenje i opis kako napraviti i koristiti ovaj pronalazak i nisu namijenjeni da ograniče obim onoga što pronalazači smatraju kao svoj pronalazak, niti su namereni da predstavljaju da su navedeni eksperimenti ispod svi ili jedini eksperimenti. Uloženi su napori kako bi se osigurala tačnost u odnosu na brojeve koji se koriste (npr. količine, temperature, itd.), Ali neke eksperimentalne greške i odstupanja treba uzeti u obzir. Osim ako nije drugačije naznačeno, udeli su težinski udeli, molekulska masa je prosečna molekulska masa, temperatura je u stepenima celzijusa, a pritisak je u atmosferi ili blizu nje. Mogu se koristiti standardne skraćenice, npr. bp, bazni par; kb, kilobaz); pl, picolitar; s, sekunde; min, minuti; h ili hr, sat (i); aa, aminokiselina; kb, kilobaza; bp, bazni par; nt, nukleotid (s); i.m., intramuskularno (li); i.p., intraperitonealno (li); s.c., potkožno (li); i slično.
Primer 1: Primena Cas9 za generisanje modifikacija u ciljanoj DNK.
MATERIJALI I METODE
Bakterijske linije i uslovi kulture
[0445] Streptococcus pyogenes, kultivisan u THY medijumu (Todd Hewitt Broth (THB, Bacto, Becton Dickinson) dopunjen sa 0,2% ekstrakta kvasca (Oxoid)) ili na TSA (triptikaza soja agrar, BBL, Becton Dickinson) dopunjen sa 3% krvi ovce, inkubiran je na 37°C na atmosferi dopunjen sa 5% CO2bez mešanja. Escherichia coli, kultivisan u Luria-Bertani (LB) medijumu i agaru, inkubiran je na 37°C sa mešanjem. Kada je potrebno, odgovarajući antibiotici su dodati u medijum pri narednim konačnim koncentracijama: ampicillin, 100 mg/ml za E. coli; hloramfenicol, 33 mg/ml za Escherichia coli; kanamicin, 25 mg/ml za E. coli i 300 mg/ml za S. pyogenes. Bakterijski rast ćelija je posmatran periodično merenjem optičke gustine alikvota kulture na 620 nm koristeći čitač mikroploča (SLT Spectra Reader).
Transformacija bakterijskih ćelija
[0446] Transformacija plazmidne DNK u E. coli ćelije je objavljena prema uobičajenom protokolu toplotnog šoka. Transformacija S. pyogenes je objavljena kako je prethodno opisano uz neke modifikacije. Test transformacije objavljen za posmatranje in vivo CRISPR/Cas aktivnosti na održavanju plazmida suštinski je sproveden kako je prethodno opisano. Ukratko, elektrokompetentne ćelije S. pyogenes su izjednačene do iste ćelijske gustine i elektroporrane sa 500 ng plazmidne DNK. Svaka transformacija pokrivena dva do tri puta i eksperiment je objavljen tri puta nezavisno sa različitim serijama kompetentnih ćelije za statističku analizu. Efikasnosti transformacija su izračunate za CFU (jedinice formiranja kolonija) po mg DNK. Kontrolne transformacije su objavljen sa sterilnom vodom i kičmenim vektorom pEC85.
DNK manipulacije
[0447] DNK manipulacije uključujući DNK preparemu, amplifikaciju, digestiju, ligiranje, pročišćavane, agaroza gel elektroforezu objavljene su prema uobičajenim tehnikama sa manjim modifikacijama. Testovi protospacer plazmida za in vitro cepanje i S. pyogenes transformacije su konstruisani kako je opisano gore (4). Dodatni pUC19-zasnovani testovi protospacer plazmida za in vitro cepanje su generisani ligiranjem preklapajućih oligonukleotida između digestovanih EcoRI i BamHI mesta u pUC19. GFP plazmid koji sadrži gen je opisan prethodno (41). Kompleti (Qiagen) su korišćeni za DNK pročišćavanje i pripremu plazmida. Mutageneza plazmida je objavljena koristeći QuikChange® II XL komplet (Stratagene) ili QuikChange usmerena mutageneza komplet (Agilent). VBC-Biotech Services, SigmaAldrich i Integrated DNK Technolozies su dostavili sintetičke oligonukleotide i RNK.
Šabloni oligonukleotida za in vitro transkripciju
Šabloni za in vitro transkribovan CRISPR Type II-A tracrRNK i crRNK od S. pyogenes (za tracrRNK - PCR na chr. DNK SF370; za crRNK – preklapanje dva oligonukleotida)
T7-tracrRNK (75nt)
[0448]
OLEC1521 (F 5’ tracrRNK): SEQ ID NO:340
OLEC1522 (R 3’ tracrRNK): SEQ ID NO:341
T7-crRNK (šablon)
[0449]
OLEC2176 (F crRNK-sp1): SEQ ID NO:342
OLEC2178 (R crRNK-sp1): SEQ ID NO:343
OLEC2177 (F crRNK-sp2): SEQ ID NO:344
OLEC2179 (R crRNK-sp2): SEQ ID NO:345
Šabloni za in vitro transkribovan N. meningitidis tracrRNK i veštački stvoren crRNK-sp2 (za tracrRNK - PCR na chr. DNK Z2491; za crRNK - preklapanje dva oligonukleotida)
T7-tracrRNK
[0450]
OLEC2205 (F predviđen 5’): SEQ ID NO:346
OLEC2206 (R predviđen 3’): SEQ ID NO:347
T7-crRNK (šablon)
[0451]
OLEC2209 (F sp2(speM) N.m. ponavljanje): SEQ ID NO:348
OLEC2214 (R sp2(speM) N.m. ponavljanje): SEQ ID NO:349
Šabloni za in vitro transkribovan L. innocua tracrRNK i veštački stvoren crRNK-sp2 (za tracrRNK - PCR na chr. DNK Clip11262; za crRNK - preklapanje dva oligonukleotida)
T7-tracrRNK
[0452]
OLEC2203 (F predviđen 5’): SEQ ID NO:350
OLEC2204 (R predviđen 3’): SEQ ID NO:351
T7-crRNK (šablon)
[0453]
OLEC2207 (F sp2(speM) L.in. ponavljanje): SEQ ID NO:352
OLEC2212 (R sp2(speM) L.in. ponavljanje): SEQ ID NO:353
In vitro i in vivo ispitivanja oligonukleotida za konstrukciju plazmida sa Protospacerom
Analiza plazmida za speM (Spacer 2 (CRISPR Type II-A, SF370; protospacer profag ø8232,3 od MGAS8232) in vitro i kod S. pyogenes (šablon: chr. DNK MGAS8232 ili plazmida koji sadrže speM fragmente)
pEC287
[0454]
OLEC1555 (F speM): SEQ ID NO:354
OLEC1556 (R speM): SEQ ID NO:355
pEC488
[0455]
OLEC2145 (F speM): SEQ ID NO:356
OLEC2146 (R speM): SEQ ID NO:357
pEC370
[0456]
OLEC1593 (F pEC488 protospacer 2 A22G): SEQ ID NO:358 OLEC1594 (R pEC488 protospacer 2 A22G): SEQ ID NO:359
pEC371
[0457]
OLEC1595 (F pEC488 protospacer 2 T10C): SEQ ID NO:360 OLEC1596 (R pEC488 protospacer 2 T10C): SEQ ID NO:361
pEC372
[0458]
OLEC2185 (F pEC488 protospacer 2 T7A): SEQ ID NO:362 OLEC2186 (R pEC488 protospacer 2 T7A): SEQ ID NO:363
pEC373
[0459]
OLEC2187 (F pEC488 protospacer 2 A6T): SEQ ID NO:364 OLEC2188 (R pEC488 protospacer 2 A6T): SEQ ID NO:365
pEC374
[0460]
OLEC2235 (F pEC488 protospacer 2 A5T): SEQ ID NO:366 OLEC2236 (R pEC488 protospacer 2 A5T): SEQ ID NO:367 pEC375
[0461]
OLEC2233 (F pEC488 protospacer 2 A4T): SEQ ID NO:368
OLEC2234 (R pEC488 protospacer 2 A4T): SEQ ID NO:369
pEC376
[0462]
OLEC2189 (F pEC488 protospacer 2 A3T): SEQ ID NO:370
OLEC2190 (R pEC488 protospacer 2 A3T): SEQ ID NO:371
pEC377
[0463]
OLEC2191 (F pEC488 protospacer 2 PAM G1C): SEQ ID NO:372
OLEC2192 (R pEC488 protospacer 2 PAM G1C): SEQ ID NO:373
pEC378
[0464]
OLEC2237 (F pEC488 protospacer 2 PAM GG1, 2CC): SEQ ID NO:374
OLEC2238 (R pEC488 protospacer 2 PAM GG1, 2CC): SEQ ID NO:375
Analiza plazmida za SPy_0700 (Spacer 1 (CRISPR Type II-A, SF370; protospacer profag ø370,1 od SF370) in vitro i kod S. pyogenes (šablon: chr. DNK SF370 ili plazmidi koji sadrže SPy_0700 fragmente)
pEC489
[0465]
OLEC2106 (F Spy_0700): SEQ ID NO:376
OLEC2107 (R Spy_0700): SEQ ID NO:377
pEC573
[0466]
OLEC2941 (F PAM TG1, 2GG): SEQ ID NO:378
OLEC2942 (R PAM TG1, 2GG): SEQ ID NO:379
Analiza oligonukleotida za verifikaciju konstrukta plazmida i mesta sečenja sekvenciranjem
ColE1 (pEC85)
[0467] oliRN228 (R sekvenciranje): SEQ ID NO:380
speM (pEC287)
[0468]
OLEC1557 (F sekvenciranje): SEQ ID NO:381
OLEC1556 (R sekvenciranje): SEQ ID NO:382
repDEG-pAMbeta1 (pEC85)
[0469] OLEC787 (F sekvenciranje): SEQ ID NO:383
Analiza oligonukleotida za in vitro cepanje
CrRNK
[470]
Spacer 1 crRNK (1-42): SEQ ID NO:384
Spacer 2 crRNK (1-42): SEQ ID NO:385
Spacer 4 crRNK (1-42): SEQ ID NO:386
Spacer 2 crRNK (1-36): SEQ ID NO:387
Spacer 2 crRNK (1-32): SEQ ID NO:388
Spacer 2 crRNK (11-42): SEQ ID NO:389
tracrRNK
[0471]
(4-89): SEQ ID NO:390
(15-89): SEQ ID NO:391
(23-89): SEQ ID NO:392
(15-53): SEQ ID NO:393
(15-44): SEQ ID NO:394
(15-36): SEQ ID NO:395
(23-53): SEQ ID NO:396
(23-48): SEQ ID NO:397
(23-44): SEQ ID NO:398
(1-26): SEQ ID NO:399
Himerni RNK
[0472]
Spacer 1 - himera A: SEQ ID NO:400
Spacer 1 - himera B: SEQ ID NO:401
Spacer 2 - himera A: SEQ ID NO:402
Spacer 2 - himera B: SEQ ID NO:403
Spacer 4 - himera A: SEQ ID NO:404
Spacer 4 - himera B: SEQ ID NO:405
GFP1: SEQ ID NO:406
GFP2: SEQ ID NO:407
GFP3: SEQ ID NO:408
GFP4: SEQ ID NO:409
GFP5: SEQ ID NO:410
Analiza DNK oligonukleotida kao supstrata za cepanje (Protospacer podebljano, PAM podvučen)
Protospacer 1 - komplementaran - WT: SEQ ID NO:411
Protospacer 1 - nekomplementaran - WT: SEQ ID NO:412
Protospacer 2 - komplementaran - WT: SEQ ID NO:413
Protospacer 2 - nekomplementaran - WT: SEQ ID NO:414
Protospacer 4 - komplementaran - WT: SEQ ID NO:415
Protospacer 4 - nekomplementaran - WT: SEQ ID NO:416
Protospacer 2 - komplementaran - PAM1: SEQ ID NO:417
Protospacer 2 - nekomplementaran - PAM1: SEQ ID NO:418
Protospacer 2 - komplementaran - PAM2: SEQ ID NO:419
Protospacer 2 - nekomplementaran - PAM2: SEQ ID NO:420
Protospacer 4 - komplementaran - PAM1: SEQ ID NO:421
Protospacer 4 - nekomplementaran - PAM1: SEQ ID NO:422
Protospacer 4 - komplementaran - PAM2: SEQ ID NO:423
Protospacer 4 - nekomplementaran - PAM2: SEQ ID NO:424
In vitro transkripcija i pročišćavanje od RNK
[0474] RNK je in vitro transkribovan koristeći T7 Flash in vitro transkripcioni komplet (Epicentre, Illumina company) i PCR-generisane DNK šablone koji nose T7 promoter sekvencau. RNK je pročišćena gelom i proverena za kvalitet pre primene. Prajmeri koripćeni za pripremu RNK šablona od S. Pyogenes SF370, Listeria innocua Clip 11262 i Neisseria meningitidis A Z2491 su opisani gore.
Pročišćavanje proteina
[0475] Sekvenca koja kodira Cas9 (ostaci 1-1368) je PCR-amplifikovana od genomskog DNK od S. Pyogenes SF370 i umetnuta u proizvoljni pET-zasnovan vektor eksprimiranja koristeći kloniranje nezavisno od ligiranja (LIC). Rezultujući konstrukt fuzije sadržao je N-terminalni heksahistidin-maltoza vezujući protein (His6- MBP) obeležje, praćeno peptidnom sekvencom koja sadrži tobacco etch virus (TEV) mesto cepanja proteaze. Protein je eksprimiran u E. Coli liniji BL21 Rosetta 2 (DE3) (EMD Biosciences), uzgojenoj u 2xTY medijumu na 18°C tokom 16 sati nakon indukcije sa 0,2 mM IPTG. Protein je pročišćen kombinacijom hromatografskih koraka afiniteta, zamene jona i isključivanja veličine. Ukratko, ćelije su lizirane u 20 mM Tris pH 8,0, 500 mM NaCl, 1 mM TCEP (dopunjen sa koktelom inhibicije proteaze (Roche)) u homogenizeru (Avestin). Pročišćen lizat je vezan u seriji za Ni-NTA agarozu (Qiagen). Smola je oprana intenzivno sa 20 mM Tris pH 8,0, 500 mM NaCl i vezani protein je eluiran u 20 mM Tris pH 8,0, 250 mM NaCl, 10% glicerol. His6-MBP afinitet obeležje je uklonjeno cepanjem sa TEV proteazaom, dok je protein dijalizovan preko noći protiv 20 mM HEPES pH 7,5, 150 mM KCl, 1 mM TCEP, 10% glicerol. Cepan Cas9 protein je razdvojen od fuzionog obeležja pročišćavanjem na 5 ml SP sefaroza HiTrap kolonai (GE Life Sciences), eluiranjem sa linearnim gradijentom od 100 mM - 1 M KCl. Protein je dalje pročišćen hromatografijom isključivanja veličine na Superdex 200 16/60 koloni u 20 mM HEPES pH 7,5, 150 mM KCl i 1 mM TCEP. Eluiran protein je koncentrisan do ~8 mg/ml, brzo zamrznut u tečnom azotu i čuvan na -80°C. Cas9 D10A, H840A i D10A/H840A tačke mutanti su generisane koristeći QuikChange komplet usmerene mutageneze (Agilent) i potvrđeni DNK sekvenciranjem. Proteini su pročišćeni prateći istu proceduru kao za divlji tip Cas9 proteina.
[0476] Cas9 ortolozi od Streptococcus thermophilus (LMD-9,YP_820832,1), L. innocua (Clip11262, NP_472073,1), Campylobacter jejuni (subsp. jejuni NCTC 11168, YP_002344900,1) i N. meningitidis (Z2491, YP_002342100,1) su eksprimirani u BL21 Rosetta (DE3) pLysS ćelije (Novagen) kao His6-MBP (N. meningitidis i C. jejuni), His6-Thioredoxin (L. innocua) i His6-GST (S. thermophilus) fuzioni proteini, i pročišćeni suštinski kao za S. Pyogenes Cas9 sa narednim modifikacijama. Usled velikih kolilčina ko-pročišavajućih nukleinskih kiselina, sva četiri Cas9 proteina su pročišćena dodatnim heparin sefaroza korakom pre gel filtracije, eluiranjem vezani protein sa linearnim gradijentom od 100 mM - 2 M KCl. Ovo je uspešno uklonilo kontaminaciju nukleinske kiseline od C. jejuni, N. meningitidis i L. innocua proteina, ali nije uklonilo kopročišavajuće nukleinske kiseline od S. thermophilus Cas9 pripreme. Svi proteini su koncentrisani do 1-8 mg/ml u 20 mM HEPES pH 7,5, 150 mM KCl i 1 mM TCEP, brzo zamrznuti u tečnom N2 i čuvani na -80°C.
Analiza cepanja plazmidne DNK
[0477] Sintetičke ili in vitro-transkribovane tracrRNK i crRNK su prethodno prekaljene pre reakcije zagrevanjem do 95°C i lagano hlađene do sobne temperature. Prirodna ili restriktivna digest-linearizovana plazmidna DNK (300 ng (~ 8 nM)) se inkubira 60 minuta na 37°C sa prečišćenim Cas9 proteinom (50-500 nM) i tracrRNK:crRNK dupleksom (50-500 nM, 1: 1 ) u puferu cepanja Cas9 plazmida (20 mM HEPES pH 7,5, 150 mM KCl, 0,5 mM DTT, 0,1 mM EDTA) sa ili bez 10 mM MgCl2. Reakcije su zaustavljene sa 5X- DNK puferom za obradu koji sadrži 250 mM EDTA, rastvoreno elektroforezom agaroznog gela 0,8 ili 1% i vizualizovano bojenjem etidijum bromidom. Za test cepanja Cas9 mutanta, reakcije su zaustavljene sa 5X SDS puferom za učvršćivanje (30% glicerol, 1,2% SDS, 250 mM EDTA) pre nego što je psotavljen na agarozni gel.
Analiza metalno zavisnog cepanja
[0478] protospacer 2 plazmidna DNK (5 nM) je inkubirana tokom 1 sata na 37°C sa Cas9 (50 nM) prethodno inkubiranim sa 50 nM tracrRNK:crRNK-sp2 u puferu cepanja (20 mM HEPES pH 7,5, 150 mM KCI , 0,5 mM DTT, 0,1 mM EDTA) dopunjenim sa 1, 5 ili 10 mM MgCl2, 1 ili 10 mM MnCl2, CaCl2, ZnCl2, CoCl2, NiSO4ili CuSO4. Reakcija je zaustavljena dodavanjem 5X SDS pufera za učvršćivanje (30% glicerola, 1,2% SDS, 250 mM EDTA), rastvoreno je sa 1% elektroforezom agaroznog gela i vizualizovano bojenjem etidijum bromidom.
Analiza pojedinačnog obrta
[0479] Cas9 (25 nM) je prethodno inkubiran 15 min na 37°C u puferu cepanja (20 mM HEPES pH 7,5, 150 mM KCI, 10 mM MgCI2, 0,5 mM DTT, 0.1 mM EDTA) sa dupleksovanim tracrRNK:crRNK- Sp2 (25 nM, 1: 1) ili oba RNK (25 nM) nisu prethodno kaljena i reakcija je započeta dodavanjem Protospacera 2 (5 nM) plazmidne DNK. Reakciona smeša je inkubirana na 37°C. U definisanim vremenskim intervalima, uzorci su povučeni iz reakcije, 5X SDS pufera (30% glicerola, 1.2% SDS, 250 mM EDTA) je dodato da se zaustavi reakcija, pa je cepanje praćeno pomoću 1% agaroza gela i etidium bromidom bojenja. Isto je urađeno za kinetike pojedinačnog obrta bez pre-inkubacije Cas9 i RNK, gde je protospacer 2 plazmidna DNK (5 nM) pomešana u puferu cepanja sa dupleks tracrRNK:crRNKp2 (25 nM) ili oba RNK (25 nm) nisu prekaljena, i reakcija je počela dodatkom Cas9 (25 nM). Procenat cepanja analiziran je densitometrijom, i vremenom je prikazan prosek od tri nezavisna eksperimenta. Podaci su uklopljeni nelinearnoj regresionoj analizi i izračuanata je brzina cepanja (kobs[min<-1>]).
Analiza višestrukog obrta
[0480] Cas9 (1 nM) je pre-inkubiran 15 min na 37°C u puferu cepanja (20 mM HEPES pH 7,5, 150 mM KCI, 10 mM MgCl2, 0.5 mM DTT, 0.1 mM EDTA) sa prekaljenim tracrRNK : CrRNK-sp2 (1 nM, 1: 1). Reakcija je počela dodavanjem Protospacera 2 plazmidne DNK (5 nM). U definisanim vremenskim intervalima uzorci su povučeni i reakcija je zaustavljena dodavanjem 5X SDS pufera za učvršćivanje (30% glicerol, 1,2% SDS, 250 mM EDTA). Reakcija cepanja je rastvorena pomoću 1% elektroforeze agaroznog gela, bojenja etidijum bromidom, i procenat cepanja analiziran je denzitometrijom. Rezultati četiri nezavisna eksperimenta su prikazani u odnosu na vreme (min).
Analiza cepanja oligonukleotidne DNK
[0481] DNK oligonukleotidi (10 pmol) su radioobeleženi inkubiranjem sa 5 jedinica T4 polinukleotid kinaze (New England Biolabs) i ~3-6 pmol (~20-40 mCi) [g-32P] -ATP (Promega) u 1X T4 polinukleotid kinaza reakcionog pufera na 37°C tokom 30 min, u reakciji od 50 mL. Nakon inaktivacije toplotom (65°C u toku 20 min), reakcije su prečišćene kolonom Illustra MicroSpin G-25 (GE Healthcare) kako bi se uklonilo neinkorporirano obeležje. dupleks supstrati (100 nM) su generisani kaljenjem obeleženih oligonukleotida sa ekvimolarnim količinama neobeleženih komplementarnih oligonukleotida na 95°C tokom 3 minuta, nakon čega sledi sporo hlađenje do sobne temperature. Za ispitivanja cepanja, tracrRNK i crRNK su zagrejani do 95°C tokom 30 s, nakon čega je sledilo sporo hlađenje do sobne temperature. Cas9 (500 nM krajnja koncentracija) je prethodno inkubirana sa kaljenim tracrRNK:crRNK dupleksom (500 nM) u testiranom puferu cepanja (20 mM HEPES pH 7,5, 100 mM KCI, 5mM MgCl2, 1 mM DTT, 5% glicerol) pri ukupnoj zapremini od 9 ml. Reakcije su pokrenute dodatkom 1 ml ciljane DNK (10 nM) i inkubirane 1 h na 37°C. Reakcije su ugašene dodatkom 20 ml natrijumske boje (5 mM EDTA, 0,025% SDS, 5% glicerola u formamidu) i zagrejane na 95°C tokom 5 min. Proizvodi za razblaženje su rastvoreni na 12% denaturisanom poliakrilamidnom gelu koji sadrži 7 M uree i vizualizovani fosforimimovanjem (Storm, GE Life Sciences). Analiza cepanje testirajući PAM zahteve (Slika 13B) je izvedena korišćenjem DNK dupleks supstrata koji su prethodno prekaljeni i prečišćen na 8% prirodnom akrilamid gelu, a zatim obeleženi na oba 5' kraja. Reakcije su postavljene i analizirane kako je gore navedeno.
Analiza elektroforetskog pomeranja mobilnosti
[0482] Ciljani DNK dupleksi su formirani mešanjem svake linije (10 nmol) u dejonizovanoj vodi, zagrevanjem na 95°C tokom 3 min i sporim hlađenjem do sobne temperature. Sve DNK su prečišćene na 8% prirodnim gelovima koje sadrže 1X TBE. DNK linije su vizualizovane UV senčećenjem, uzbuđenje, elurane potopljenim komadima gela u H2O tretiranom sa DEPC. Elutirana DNK je precipitovana etanolom i rastvorena u H2O tretiranom sa DEPC. DNK uzorci su obeleženi sa 5 [γ-32P]-ATP koristeći T4 polinukleotid kinazu (New England Biolabs) tokom 30 min na 37°C. PNK je toplotno denaturisan na 65°C u trajanju od 20 minuta, a neinkorporirano radio-obeležje je uklonjeno pomoću kolone Illustra MicroSpin G-25 (GE Healthcare). Testovi vezivanja su izvedeni u puferu koji sadrži 20 mM HEPES pH 7.5, 100 mM KCI, 5mM MgCl2, 1 mM DTT i 10% glicerola u ukupnoj zapremini od 10 ml. Cas9 D10A/H840A dvostruki mutant je programiran sa ekvimolarnim količinama predkaljenog tracrRNK:crRNK dupleksa i titriran od 100 pM do 1 mM. Radioobeleženi DNK je dodat u konačnu koncentraciju od 20 pM. Uzorci su inkubirani tokom 1 h na 37°C i razređeni na 4°C na 8% prirodnom poliakrilamidnom gelu koji sadrži 1X TBE i 5 mM MgCl2. Gelovi su osušeni, a DNK je vizualizovan fosforom.
In silico analiza sekvenci DNK i proteina
[0483] Vektorski NTI paket (Invitrogen) korišćen je za analizu DNK sekvence (Vector NTI) i uporednu sekvencijalnu analizu proteina (AlignX).
In silico modeliranje strukture RNK i ko-savijanja
[0484] U silikonskim predviđanjima izvršeni su algoritme Vienna RNK za paketa (42, 43). Sekundarne strukture RNK i ko-sklopivi modeli su predviđeni sa RNKfold i RNKcofold, respektivno i vizualizovani sa VARNK (44).
REZULTATI
[0485] Bakterije i arhee su evoluirale RNK posredovane adaptivne odbrambene sisteme nazvane grupisana pravilno razmaknuta kratka palindromska ponavljanja (CRISPR)/CRISPR-povezana (Cas) koja štite organizam od invazije virusa i plazmida (1-3). Pokazujemo da u podskupu ovih sistema, zrelo crRNK koja je bazno uparen za trans-aktivirajući crRNK (tracrRNK) formira dvvostruko-RNK strukturu koja usmerava CRISPR-povezan protein Cas9 da uvodi dvostruke (DSds) prekide u ciljanu DNK. Na mestima komplementarnim sekvenci crRNK-vodiča, Cas9 HNH domen nukleaze cepa komplementarnu liniju, dok Cas9 RuvC domen cepa nekomplementarnu liniju. Dvosruki-tracrRNK:crRNK, kada je konstruisan kao pojedinačna himera RNK, takođe usmerava cepanje Cas9 dsDNK specifično za sekvencu. Ove studije otkrivaju porodicu endonukleaza koje koriste dvostruki-RNK za usmereno razdvajanje DNK i naglašavaju sposobnost eksploatacije sistema za uređivanje genoma koji se programira sa RNK.
[0486] Sistemi odbrane CRISPR/Cas se oslanjaju na male RNK za određivanje specifičnosti sekvenci i smirivanje stranih nukleinskih kiselina. CRISPR/Cas sistemi se sastoje od cas gena organizovanih u operone i CRISPR nizove koji se sastoje od sekvenci za ciljanje genoma (koje se zovu Spaceri), koje su podeljeni sa identičnim ponavljanjima (1-3). CRISPR/Cas-posredovan imunitet se javlja u tri koraka. U adaptivnoj fazi, bakterije i arhee skrivaju jedna ili više CRISPR lokus odgovoran za virusni ili plazmidni izazov integrisanjem kratkih fragmenata spoljne sekvence (protospaceri) u hromozu domaćina na bližem kraju CRISPR niza (1-3). U fazama eksprimiranja i smetnje, transkripcija ponavljanja Spacer elementa u prekursor CRISPR RNK (pre-crRNK) molekulima praćena enzimskim cepanjem daje kratke crRNK koje se mogu upariti sa komplementarnim protospacer sekvencama invazijom na viralne ili plazmidne ciljeve (4-11). Prepoznavanje ciljeva pomoću crRNK usmerava umanjenje stranih sekvenci pomoću proteina Cas koji funkcionišu u kompleksu sa crRNK (10, 12-20).
[0487] Postoje tri vrste CRISPR/Cas sistema (21-23). Sistemi tipa I i III dele neke od najvažnijih karakteristika: specijalizovane Cas endonukleaze procesiraju pre-crRNK i kada sazre, svaka crRNK se sastavlja u veliki multi-Cas protein kompleks koji može prepoznati i cepiti nukleinske kiseline komplementarne crRNK. Nasuprot tome, tip II sistemi procesuira precrRNK po različitom mehanizmu u kome trans-aktivirajući crRNK (tracrRNK) komplementaran sa ponavljajućem sekvencom u prethodnom crRNK izaziva obradu dvostruke (ds) RNK-specifične ribonukleaza RNKza III u prisustvu Cas9 (ranije Csn1) proteina (Slika 15) (4, 24). Smatra se da je Cas9 jedini protein odgovoran za crRNK-navođeno smirivanje stranih DNK (25-27).
[0488] Pokazujemo da u sistemima tipa II, Cas9 proteini čine familiju enzima koji zahtevaju bazno uparenu strukturu formiranu između aktivirajuće tracrRNK i ciljane crRNK za cepanje ciljane dsDNK. Usmereno cepanje javlja se na mestima utvrđenim od obe komplementarnosti baznog uparivanja između crRNK i ciljanog protospacer DNK i kratkog motiva [nazivaju se protospacer susedni motiv (PAM)] suprotstavljeno postavljeni komplementarnoj regiji u ciljanom DNK. Naša studija dalje pokazuje da se porodica Cas9 endonukleaze može programirati sa pojedinačnim RNK molekulima kako bi se razdvojile specifične DNK lokacije, čime se olakšava razvoj jednostavnog i svestranog sistema usmerenog na RNK za generisanje dsDNK prekida za ciljanje i uređivanje genoma.
Cas9 je DNK endonukleazna navođena sa dva RNK
[0489] Cas9, najprepoznatljiviji protein sistema tipa II, je pretpostavljen da je bude uključen u sazrevanje crRNK i interferenciju uzrokovanu crRNK (Slika 15) (4, 25-27). Cas9 je uključen u sazrevanje crRNK (4), ali njegovo direktno učešće u uništavanju ciljanih DNK nije istraženo. Da bi se testiralo da li i kako bi Cas9 mogao biti sposoban da cilja na DNK, koristili smo sistem za prekomerno eksprimiranje za pročišćavanje Cas9 proteina koji je dobijen od patogena Streptococcus pyogenes (Slika 16, videti dodatne materijale i postupke) i testirali njegovu sposobnost da uklanja plazmidnu DNK ili oligonukleotidni dupleks koji nosi protospacer sekvencu komplementarnu zreloj crRNK i bona fide PAM. Utvrdili smo da samo zrela crRNK nije bila sposobna da usmeri cepanje katalizovane sa Cas9 katalizacijom (Slika 10A i Slika 17A). Međutim, dodavanje tracrRNK, koje se može upariti sa ponovljenom sekvencom crRNK i od suštinskog je značaja za sazrevanje crRNK u ovom sistemu, pokrenulo je Cas9 da cepa plazmidni DNK (Slika 10A i Slika 17A). Reakcija cepanja zahteva i magnezijum i prisustvo crRNK sekvence komplementarne sa DNK; CrRNK sposobna za uparivanje tracrRNK baze, ali koja sadrži nesrodnu ciljanu DNK vezujuću sekvencu, nije podržala cepanje sa katalizovanim Cas9 (Slika 10A, Slika 17A, uporediti crRNK-sp2 sa crRNK-sp1; i Slika 18A). Dobili smo slične rezultate sa kratkim linearnim dsDNK supstratom (Slika 10B i Slika 17, B i C). Prema tome, transaktivirajuća tracrRNK je mala nekodirajuća RNK sa dve kritične funkcije: pokretanje pre-crRNK obrade od strane enzima RNKaze III (4) i zatim aktiviranje crRNK-navođeneog DNK cepanja od strane Cas9.
[0490] Cepanje i plazmida i kratkog linearnog dsDNK pomoću crRNK-navođenim Cas9 su specifični za lokacije (Slika 10, C do E i Slika 19, A i B). Cepanje plazmidne DNK dovelo je do tupih krajeva na poziciji tri bazna para uzvodno od PAM sekvence (Slika 10, C i E i Slika 19, A i C) (26). Slično tome, u okviru kratkih dsDNK dupleka, DNK linija koja je komplementarna sekvenci koja se vezuje za ciljanje u crRNK (komplementarna linija) se odvaja na mestu tri bazna para uzvodno od PAM (Slika 10, D i E i Slika 19 , B i C). Nekompatibilna DNK linija se cepa na jednoj ili više mesto unutar tri do osam baznih parova uzvodno od PAM. Daljnja istraživanja su otkrila da se nekomplementarna vezu prvo cepa endonukleolitički, a potom i skraćuje sa 3'-5' eksonukleaznom aktivnošću (Slika 18B). Stopa cepanja od strane Cas9 u uslovima pojedinačnoj obrta kretala se od 0,3 do 1 min-1, uporedivo sa ograničenjima endonukleaze (Slika 20A), dok je inkubacija divljeg tipa (WT) Cas9 tracrRNK:crRNK kompleksa sa petostrukim molarnim viškom DNK supstrata dokaz da je Cas9 navođen sa dualnim RNK enzim sa višestrukim obrtom (Slika 20B). Za razliku od CRISPR tipa I kaskada kompleksa (18), Cas9 raskida i linearizovane i superzglobne plazmide (Slike 10A i 11A). Stoga, invazioni plazmid može, u principu, biti razdvojen više puta od Cas9 proteina programiranih sa različitim crRNK.
[0491] Slika 10 (A) Cas9 je programiran sa 42-nukleotidnim crRNK-sp2 (crRNK koja sadrži Spacer 2 sekvencu) u prisustvu ili odsustvu 75-nukleotidne tracrRNK. Kompleks je dodat u kružnu ili XhoI-linearizovanu plazmidnu DNK koja ima sekvencu komplementarnu Spaceru 2 i funkcionalnom PAM. crRNK-sp1, kontrola specifičnosti; m, DNK marker; kbp, kilo-bazni par. Pogledajte sSiku 17A. (B) Cas9 je programiran sa crRNK-sp2 i tracrRNK (nukleotidi 4 do 89). Kompleks je inkubiran sa dvostrukim ili jednostrukim DNK sa sekvencom komplementarnom Spaceru 2 i funkcionalnom PAM (4). Komplementarne ili nekomplementarne ćelije DNK su bile obeležene sa 5'-radioobeležjem i kaljene sa neobeleženim partnerskim nizom. Nt, nukleotidi. Pogledati Sliku 17, B i C. (C) Analiza sekvenciranja proizvoda cepanja sa Slike 10A. Prekid ekstrakcije prajmera u reakciji sekvenciranja ukazuje na poziciju mesta cepanja. 3' terminal A prekid (zvezdica) je artefakt reakcije sekvenciranja. Videti Sliku 19, A i C. (D) Proizvodi razdvajanja sa Slike 10B su analizirani zajedno sa 5' markerima sa krajnjim obeležjema izvedenim iz komplementarnih i nekomplementarnih ćelija ciljanog DNK dupleksa. M, marker; p, proizvod cepanja. Pogledati Sliku 19, B i C. (E) Šematski prikaz tracrRNK, crRNK-sp2 i protospacer 2 DNK sekvence. Predstavljene su regije crRNK komplementarnosti tracrRNK (nadvučeno) i protospacer DNK (podvučeno). PAM sekvenca je obeležena; mesta cepanja mapirana u (C) i (D) prikazana su strelicama koje su ispunjene belim bojama (C), crnom strelicom ((D), komplementarna linija) i crnim stubom [(D), nekomplementarna linija).
[0492] Slika 15 prikazuje tip II imunog puta CRISPR/Cas sa posredstvom RNK. Koraci eksprimiranja i smetnji su predstavljeni na crtežu. Tip II CRISPR/Cas lokusi su sastavljeni od operona od četiri gena koji kodiraju proteine Cas9, CAS1, CAS2 i Csn2, CRISPR niz koji sastoji od lider sekvence praćene identičnim ponavljanjima (crni pravougaonici) rasutih sa jedinstvenim genom-ciljajućim Spacerima (dijamanti) i sekvencom koja kodira transaktivirajući tracrRNK. Predstavljen ovde je tip II CRISPR/Cas lokus od S. pyogenes SF370 (pristupni broj NC_002737) (4). Prikazani su eksperimentalni promoteri i transkripcijski terminator u ovom lokusu (4). CRISPR niz se transkribuje kao prekursorski molekul CRISPR RNK (pre-crRNK) koji prolazi kroz proces sazrevanja specifičnih za sisteme tipa II (4). Kod S. pyogenes SF370, tracrRNK se transkribuje kao dva primarna transkripta od 171 i 89 nt dužine koja imaju komplementarnost sa svakim ponavljanjem pre-crRNK. Prvi događaj procesuiranja uključuje sparivanje tracrRNK sa pre-crRNK, formirajući dupleks RNK koja je prepoznata i isečena od strane endoribonucleaze RNKze III u prisustvu Cas9 proteina. RNKaza III-posredovano cepanje dupleksa RNK generiše 75-nt procesuiran tracrRNK i 66-nt međuproizvod crRNK koja se sastoji od centralne regije koja sadrži sekvencu jednog Spacera, okruženu delovima ponovljene sekvence. Drugi događaj procesuiranja, posredovan nepoznatom ribonukleazom, koji dovodi do formiranja zrelog crRNK od 39 do 42 nt u dužini, se sastoji od 5'-terminalne Spacer-izvedene vodič sekvence i ponavljanje-izvedene 3'-terminalne sekvence. Nakon prvog i drugog događaja procesuiranja, zrela tracrRNK ostaje uparena sa zrelim crRNK i vezana za Cas9 protein. U ovom trodelnom kompleksu, dualna tracrRNK:crRNK struktura deluje kao vodič RNK koja usmerava endonukleazu Cas9 u srodnu ciljanu DNK. Prepoznavanje cilja od strane Cas9-tracrRNK:crRNK kompleksa pokreće se skeniranjem invazivnog DNK molekula za homologije između protospacer sekvence u ciljanom DNK i Spacer-izvedenu sekvencu u crRNK. Pored DNK Protospacer-crRNK Spacer komplementarnosti, DNK ciljanje zahteva prisustvo kratkog motiva (NGG, gde N može biti bilo koji nukleotid) susednog Protospaceru (Protospacer susedni motiv - PAM). Sledeći uparivanje između dualne-RNK i protospacer sekvence, formira se R-petlja, i Cas9 kasnije uvedi dvostruku vezu (DSB) u DNK. Cepanje ciljane DNK od strane Cas9 zahteva dva katalitička domena u proteinu. Na određenom mestu u odnosu na PAM, HNH domena razdvaja komplementarnu liniju DNK dok domen RuvC-nalik domen čisti nekomplementaran niz.
[0493] Slika 16 (A) S. pyogenes Cas9 je eksprimiran u E. coli kao fuzioni protein koji sadrži N-terminalno His6MBP obeležje i počišćen kombinacijom koraka hromatografije afiniteta, razmene jona i isključivanja veličine. obeležje afiniteta uklonjena je cepanjem TEV proteaze nakon koraka prečišćavanja afiniteta. Prikazan je hromatogram finalni korak hromatografije isključenja veličine na koloni Superdex 200 (16/60). Cas9 se eluira kao monomerni vrh koji je lišen kontaminiranih nukleinskih kiselina, prema proceni odnosa apsorbancije na 280 i 260 nm. Inset; eluirane frakcije su rastvorene sa SDS-PAGE na 10% poliakrilamidnom gelu i obojene sa SimpliBlue Safe Stain (Invitrogen). (B) SDSPAGE analiza prečišćenih Cas9 ortologa. Cas9 ortolozi su prečišćeni kao što je opisano u dodatnim materijalima i postupcima.2,5 mg svake prečišćene Cas9 analizirano je na gradijentu poliakrilamidnom gelu od 4-20% i obojano sa SimpliBlue Safe Stain.
[0494] Slika 17 (takođe pogledati Sliku 10). protospacer 1 sekvenca potiče od S. pyogenes SF370 (M1) SPi_0700, cilj od S. pyogenes SF370 crRNKp1 (4). Ovde, protospacer 1 sekvenca je manipulisana promenom PAM iz nefunkcionalne sekvence (TTG) do funkcionalne (TGG). protospacer 4 sekvenca potiče od S. pyogenes MGAS10750 (M4) MGAS10750_Spi1285, cilj od S. pyogenes SF370 crRNK-sp4 (4). (A) Cepanje protospacer 1 plazmidne DNK vođeno je srodnim tracrRNK:crRNK dupleksima. Proizvodi razdvajanja su rastvoreni pomoću elektroforeze agaroznog gela i vizualizovani su bojenjem etidijum bromidom. M, DNK marker; naznačene su veličine fragmenata u baznim parovima. (B) Cepanje protospacer 1 oligonukleotidne DNK uz pomoć srodnih tracrRNK:crRNK-sp1 dupleksa. Proizvodi razdvajanja su rešeni denaturisajući elektroforezu poliakrilamidnog gela i vizualizovano fosforno slikanje. Prikazane su veličine fragmenta u nukleotidima. (C) Cepanje protospacer 4 oligonukleotidne DNK vođeno je srodnim tracrRNK:crRNK-sp4 dupleksom. Proizvodi razdvajanja su rastvoreni denaturisajući elektroforezu poliakrilamidnog gela i vizualizovani fosfornim slikanjem. Prikazane su veličine fragmenta u nukleotidima. (A, B, C) Eksperimenti u (A) su izvedeni kao na Slici 10A; U (B) i (C) kao na Slici 10B. (B, C) Šema tracrRNK:crRNKtarget DNK interakcije je prikazana u nastavku. Regije crRNK komplementarnosti sa tracrRNK i protospacer DNK su nadvučene i podvučeni, respektivno. PAM sekvenca je obeležena.
[0495] Slika 18 (takođe pogledati Sliku 10). (A) protospacer 2 plazmidna DNK je inkubiran sa Cas9 kompleksovanim sa tracrRNK:crRNK-sp2 u prisustvu različitih koncentracija Mg2+, Mn2+, Ca2+, Zn2+, Co2+, Ni2+ ili Cu2+. Proizvodi razdvajanja su rastvoreni pomoću elektroforeze agaroznog gela i vizualizovani su bojenjem sa etidijum bromidom. Indikatori plazmida su naznačeni. (B) protospacer 4 oligonukleotidni DNK dupleks koji sadrži PAM motiv je kaljen i pročišćen gelom pre radioobeležavanja na oba 5' kraja. dupleks (konačna koncentracija od 10 nM) je inkubirana sa Cas9 programiranim sa tracrRNK (nukleotidi 23-89) i crRNKp4 (koncna koncentracija od 500 nM, 1:1). U naznačenim vremenskim tačkama (min), 10 ml alikvota reakcije cepanja je ugašeno sa formamid puferom koji sadrži 0,025% SDS i 5 mM EDTA, i analizirano pomoću denaturisanja poliakrilamid gel elektroforezom na Slici 10B. Prikazane su veličine u nukleotidima.
[0496] Slika 19 (A) Mapiranje cepanja protapacer 1 plazmidne DNK. Proizvodi cepanja sa Slike 17A su analizirani sekveciranjem kao što je prikazano na Slici 10C. Treba imati na umu da je 3' terminal A prekid (zvezdica) je artefakt reakcije sekvenciranja. (B) Mapiranje razdvajanja DNK protospacer 4 oligonukleotida. Proizvodi cepanja sa Slike 17C su analizirani denaturisanjem poliakrilamid gel elektroforezom zajedno 5' kraj obeleženim markerima veličine oligonukleotida izvedenim iz komplementarnih i nekomplementarnih linija protospacer 4 dupleks DNK. M, marker; p, proizvod cepanja. Trake 1-2: komplementarne linije. Trake 3-4: nekomplementarne linije. Prikazane su veličine fragmenta u nukleotidima. (C) Šematski prikazi tracrRNK, crRNK-sp1 i protospacer 1 DNK sekvenci (vrh) i tracrRNK, crRNKp4 i protospacer 4 DNK sekvenci (dno).
tracrRNK:crRNK formiraju dualnu-RNK strukturu usmerenu na komplementarni protospacer DNK pomoću crRNK-Protospacer DNK uparivanja. Regije crRNK komplementarnih tracrRNK i protospacer DNK su nadvučene i podvučeni, respektivno. Mesta cepanja u komplementarnim i nekomplementarnim DNK linijama mapirna u (A) (vrh) i (B) (dno) su prikazane sa strelicama (A i B, komplementarne linije) i crnim stubom (B nekomplementarna linija) iznad sekvenci, respektivno.
[0497] Slika 20 (A) Jedinstvena kinetika obrtanja Cas9 pod različitim uslovima RNK predkaljenja i pre-inkubacije proteina-RNK. protospacer 2 plazmidna DNK je inkubirana sa Cas9 preinkubiranim sa pred-kaljenim tracrRNK:crRNK-sp2 (s), Cas9 koji nije prethodno inkubiran sa pred-kaljenim tracrRNK:crRNK-sp2 (d), Cas9 prethodno inkubiran sa ne pred-kaljenim tracrRNK i crRNK-sp2 (h) ili Cas9 koji nije prethodno inkubira sa pred-kaljenim RNK (j). Aktivacija cepanja se posmatrana na vremenski zavisan način i analizirana pomoću elektroforeze agaroznog gela, praćene bojenjem etidijum bromidom. Prosečan procenat cepanja od tri nezavisna eksperimenta je iscrtan u odnosu na vreme (min) i opremljen sa nelinearnom regresijom. Izračunane stope cepanja (kobs) prikazane su u tabeli. Rezultati pokazuju da vezivanje Cas9 na RNK nije ograničeno na stopu u uslovima koji su testirani. Indikatori plazmida su naznačeni. Dobijene vrednosti kobsa su uporedive sa vrednostima restonzivnih endonukleaza koje su tipično reda od 1-10 po minzuu (-47). (B) Cas9 je endonukleaza sa više obrtanja. Cas9, napunjen sa dupleksovanom tracrRNK:crRNK-sp2 (1 nM, 1:1:1 - obeležen sivom linijom na grafikonu) je inkubiran sa 5-ostrukim viškom matične protospacer 2 plazmidne DNK. Cepanje se prati uzimanjem uzoraka iz reakcije u definisanim vremenskim intervalima (0 do 120 min), praćeno analizom elektroforeze agaroznog gela (vrh) i određivanjem količine produkta cepanja (nM) (dno). Navedene su standardne devijacije tri nezavisna eksperimenta. U ispitivanom vremenskom intervalu, 1 nM Cas9 je uspeo da cepa ~ 2,5 nM plazmidne DNK.
Svaki Cas9 domen nukleaze cepa jednu DNK liniju
[0498] Cas9 sadrži domene homologne za HNH i RuvC endonukleaze (Slika 11A i Slika 3) (21-23, 27, 28). Dizajnirali smo i prečišćavali Cas9 varijante koji sadrže inaktivirajuće tačke mutacije u katalitičkim ostacima ili HNH ili RuvC-domenima (Slika 11A i Slika 3) (23, 27). Inkubacija ovih varijanti Cas9 proteina sa matičnom plazmidnom DNK pokazala je da su dualnom-RNK-navođeni mutantni Cas9 proteini dali otvorene kružne plazmide, dok je WT Cas9 protein-tracrRNK:crRNK kompleks proizvodio linearni DNK proizvod (Slike 10A i 11A i Slike 17A i 25A). Ovaj rezultat ukazuje na to da Cas9 HNH i RuvC-slični domeni svaki cepaju jednu plazmidnu DNK vezu. Da bi se utvrdilo koja linija ciljane DNK se odvaja od svakog Cas9 katalitičkog domena, inkubirali smo mutante Cas9-tracrRNK:crRNK komplekse sa kratkim dsDNK supstratima u kojima je ili komplementarna ili nekomplementarna linija bila radioobeležena na svom 5' kraju. Dobijeni produkti cepanja pokazali su da Cas9 HNH domen cepia komplementarnu DNK liniju, dok Cas9 RuvC domen cepa nekomplementarnu DNK liniju (Slika 11B i Slika 21B).
[0499] Slika 11 (A) (vrh) Šematski prikaz Cas9 strukture domena koji pokazuje položaje mutacija domena. D10A, Asp10→Ala10; H840A; His840→Ala840. Kompleks WT ili nukleaza mutant Cas9 proteini sa tracrRNK:crRNK-sp2 su analizirani za aktivnost endonukleaze kao na Slici 10A.
(B) Kompleksi WT Cas9 ili mutanata domena nukleaze sa tracrRNK i crRNK-sp2 su testirani na aktivnost kao na Slici 10B.
[0500] Slika 3 Prikazana je aminokiselinska sekvenca Cas9 iz S. pyogenes (SEQ ID NO: 8). Cas9/Csn1 proteini iz različitih različitih vrsta imaju 2 domena koja uključuju motive homologe za HNH i RuvC endonukleaze. (A) Motivi 1-4 (brojevi motiva su obeleženi sa leve strane sekvence) prikazani su za S. pyogenes Cas9/Csn1. Predviđeni motivi nalik RuvC (1, 2, 4) i predviđeni HNH motivi (3) su nadvučeni. Ostaci Asp10 i His840, koji su zamenili Ala u ovoj studiji, obeleženi su zvezdicom iznad sekvence. Podvučeni ostaci su visoko konzervirani među Cas9 proteinima iz različitih vrsta. Mutacije u podvučenim ostacima verovatno imaju funkcionalne posledice na aktivnost Cas9. Treba imati na umu da je u ovoj studiji eksperimentalno prikazano povezivanje dve aktivnosti nukleaze (Slika 11 i Slika 21). (B) Domeni 1 (aminokiseline 7-166) i 2 (aminokiseline 731-1003), koji uključuju motive 1-4, prikazani su za S. pyogenes Cas9/Csn1. Pogledajte Tabelu 1 i Sliku 5 za dodatne informacije.
[0501] Slika 21 Cepanje protospacer DNK pomoću srodnih tracrRNK:crRNK-usmerenih Cas9 mutanta koji sadrže mutacije u domenu HNH ili RuvC. (A) Cepanje protospacer 1 plazmidne DNK. Eksperiment je izveden kao na Slici 11A. Prikazane su plazmidne DNK konformacije i veličine u baznim parovima. (B) Cepanje protospacer 4 oligonukleotidne DNK. Eksperiment je izvršen kao na Slici 11B. Prikazane su veličine u nukleotidima.
Dual-RNK zahtevi za vezivanje i cepanje ciljane DNK
[0502] TracrRNK bi mogla biti potrebna za ciljanje DNK vezivanja i/ili stimulisanje aktivnosti nukleaze od Cas9 nizvodno od prepoznavanja cilja. Da bismo napravili razliku između ove ve mogućnosti, koristili smo analizu pomeranja elektroforetskog pokreta za nadgledanje vezivanja ciljane DNK pomoću katalitički neaktivnog Cas9 u prisustvu ili odsustvu crRNK i/ili tracrRNK. Dodavanje tracrRNK značajno je povećalo vezivanje ciljane DNK od strane Cas9, dok smo posmatrali malo specifično vezivanje DNK samo sa Cas9 samim ili Cas9-crRNK (Slika 22). Ovo ukazuje na to da je tracrRNK potrebna za prepoznavanje ciljane DNK, verovatno pravilnim orijentisanjem crRNK za interakciju sa komplementarnom mrežom ciljane DNK. Predviđena tracrRNK:crRNK sekundarna struktura obuhvata bazno uparivanje između 22 nukleotida na 3' terminusu crRNK i segmenta u blizini 5' kraja zrelog tracrRNK (Slika 10E). Ova interakcija stvara strukturu u kojoj su 5' terminal 20 nukleotidi crRNK, koji se razlikuju u sekvencama po različitim crRNK, dostupni za vezivanje ciljane DNK. Najveći deo tracrRNK nizvodno od crRNK regije baznih parova je slobodan da formira dodatne RNK strukture i/ili da interakuju sa Cas9 ili mestom ciljane DNK. Da bi se odredilo da li je puna dužina tracrRNK neophodna za usmereno Cas9-katalizovano DNK cepanje, testirali smo Cas9-tracrRNK:crRNK komplekse rekonstituisane korišćenjem zrelih crRNK pune dužine (42-nukleotida) i različite skraćene forme tracrRNK kojima nedostaju sekvence na njihovim 5' ili 3' krajevima. Ovi kompleksi su testirani na cepanje pomoću kratkog ciljanog dsDNK. Suštinski skraćena verzija tracrRNK koja zadržava nukleotide 23 do 48 nativne sekvence je sposobna da podrži robusno dual-RNK-navođeno Cas9-katalitičku cepanje DNK (Slika 12, A i C, i Slika 23, A i B). Skraćivanje crRNK na oba kraja pokazalo je da Cas9-katalizovano cepanje u prisustvu tracrRNK može da se aktivira sa crRNK kojima nedostaju 3'-terminalni 10 nukleotidi (Slika 12, B i C). Nasuprot tome, 10-nukleotidna brisanje iz 5' kraja crRNK ukinula je CNK cepanje kod Cas9 (Slika 12B). Takođe smo analizirali Cas9 ortologe iz različitih vrsta bakterija zbog njihove sposobnosti da podrže S. pyogenes tracrRNK:crNNA-navođeno DNK cepanje. Za razliku od tesno povezanih ortologa S. pyogenes Cas9, dalje povezani ortolozi nisu bile funkcionalni u reakciji cepanja (Slika 24). Slično, S. pyogenes Cas9-navođeni tracrRNK:crRNK dupleksi koji potiču iz više udaljenih sistema nisu bili u mogućnosti da efikasno cepaju DNK (Slika 24). Specifičnost vrste dualnog-RNK-navođenog cepanja DNK ukazuje na koevoluciju Cas9, tracrRNK i crRNK ponavljanja, kao i postojanje još uvek nepoznate strukture i/ili sekvence u dualnoj RNK koja je kritična za formiranje trostrukog kompleksa sa specifičnim Cas9 ortolozima.
[0503] Da bi se ispitali zahtevi protospacer sekvenci za imunost tipa II CRISPR/Casus u bakterijskim ćelijama, analizirali smo niz plazmidnih DNK koje sadrže protospacer i koje imaju nukleotidne mutacije za svoje održavanje nakon transformacije u S. pyogenes i svoju sposobnost za cepanje putem Cas9 in vitro. Za razliku od tačkstih mutacija uvedenih na 5' kraj Protospacera, mutacije u regionu blizu PAM i mesta cepanja Cas nisu bile tolerisane in vivo i rezultovale su smanjenom efikasnošću cepanja plazmida in vitro (Slika 12D). Naši rezultati su u saglasnosti sa prethodnim izveštajem o mutantima Protospacera u tipu II CRISPR sistema od S. thermophilus in vivo (27, 29). Osim toga, rezultati održavanja i cepanja plazmida ukazuju na postojanje regije „semena“ koja se nalazi na 3' kraju protospacer sekvence koji je ključan za interakciju sa crRNK i naknadno cepanje od Cas9. Kao podrška ovom pojmu, Cas9 je poboljšao komplementarnu hibridizaciju DNK linija za crRNK; Ovo poboljšanje je bilo najjače u 3'-terminalnoj regiji crRNK ciljajuće sekvence (Slika 25A-C). Utvrdivši ovaj nalaz, za efikasno cepanje cilja potreban je susedni deo od najmanje 13 baznih parova između crRNE i ciljane DNK lokacije proksimalan za PAM, dok se do šest susednih neusaglašenosti u 5'-termialnoj regiji Protospacera toleriše (Slika 12E). Ovi nalazi podsjećaju na ranije zapažene zahteve o sekvenci semena za prepoznavanje ciljane nukleinske kiseline kod Argonaute proteina (30, 31) i Cascade i Csy CRISPR kompleksa (13, 14).
[0504] Slika 12 (A) Cas9-tracrRNK:crRNK kompleksi su rekonstituisani koristeći 42-nukleotidne crRNK-sp2 i skraćene tracrRNK konstrukte i analizirani su za aktivnost cepanja kao što je prikazano na Slici 10B. (B) Cas9, programiran tracrNNK pune dužine i crRNK-sp2 skraćenjima, analiziran je za aktivnost kao u (A). (C) Minimalne regije tracrRNK i crRNK sposobne da vode Cas9-posredovano cepanje DNK (osenčena regija). (D) Plazmidi koji sadrže WT ili mutant protospacer 2 sekvence sa naznačenim tačkama mutacija su cepane in vitro programiranim Cas9 kao što je prikazano na Slici 10A i korišćeni za testove transformacije WT ili pre-crRNK-deficientnog S. pyogenes. Efikasnost transformacije izračunata je kao jedinica za formiranje kolonija (CFU) po mikrogramu plazmidne DNK. Stubovi sa greškama predstavljaju SD za tri biološke replikacije. (E) Plazmidi koji sadrže WT i mutant protospacer 2 umetke sa različitim stepenom crRNK-cilj DNK neusaglašenosti (dno) su cepani in vitro programiranim Cas9 (vrh). Reakcije cepanja su dalje digestovane pomoću XmnI. 1880- i 800-bp fragmenti su Cas9-generisani proizvodi cepanja. M, DNK marker.
[0505] Slika 22 Ispitivanja pomeranja elektroforetske mobilnosti su izvedena koristeći protospacer 4 ciljana NDK dupleks i DNK Cas9 (koji sadrže mutacije D10A i H840 koji inaktiviraju domen nukleaze) ili u prisustvu crRNK-sp4, tracrRNK (75nt) ili oboje. ciljani DNK dupleks je radioobeležen na oba 5' kraja. Cas9 (D10/H840A) i kompleksi su titrirani od 1 nM do 1 mM. Vezivanje je analizirano pomoću 8% prirodne elektroforeze sa poliakrilamidnim gelom i vizualizovano fosfornim slikanjem. Treba imati na umu da samo Cas9 vezuje ciljanu DNK sa umerenim afinitetom. Ovo vezivanje ne utiče na dodavanje crRNK, što ukazuje na to da to predstavlja sekvencno nespecifičnu interakciju sa dsDNK. Osim toga, ova interakcija može biti isključena samo pomoću tracrRNK u odsustvu crRNK. U prisustvu crRNK i tracrRNK, ciljano vezivanje DNK je značajno poboljšano i daje vrstu sa posebnom elektroforetičkom pokretnošću, što ukazuje na specifično prepoznavanje ciljane DNK.
[0506] Slika 23 Fragment tracrRNK koja obuhvata crRNK uparene regije i deo nizvodne regije je dovoljan da direktno cepa protospacer oligonukleotidnu DNK pomoću Cas9. (A) Cepanje protospacer 1 oligonukleotidne DNK i (B) cepanje protospacer 4 oligonukleotidne DNK od strane Cas9, vođeno sa zrelom srodnom crRNK i različitim fragmentima tracrRNK. (A, B) Prikazane su veličine u nukleotidima.
[0507] Slika 24 Kao Cas9 iz S. pyogenes, tesno povezani Cas9 ortolozi iz Gram-pozitivnih bakterija L. innocua i S. thermophilus cepaju protospacer DNK kada su ciljani od tracrRNK:crRNK iz S. pyogenes. Međutim, pod istim uslovima, DNK cepanje od strane manje tesno povezanih Cas9 ortologa iz Gram-negativnih bakterija C. jejuni i N. meningitidis nije primećeno. Spy, S. pyogenes SF370 (pristupni broj NC_002737); sth, S. thermophilus LMD-9 (STER_1477 Cas9 ortolog; pristupni broj NC_008532); Lin, L. innocua Clip11262 (pristupni broj NC_003212); Cje, C. jejuni NCTC 11168 (pristupni broj NC_002163); nme, N. meningitidis A Z2491 (pristupni broj NC_003116). (A) Cepanje protospacer plazmidne DNK. protospacer 2 plazmidna DNK (300 ng) je podvrgnuta cepanju od strane različitih Cas9 ortologa (500 nM), vođenih hibridnim tracrRNK:crRNK-sp2 dupleksima (500 nM, 1: 1) iz različitih vrsta. Kako bi se dizajnirali RNK dupleksi, predvideli smo tracrRNK sekvencu od L. innocua i N. meningitidis na osnovu prethodno objavljenih Northern blot podataka (4). Dvostruki hibridni RNK dupleksi se sastoje od tracrRNK specifične za vrste i heterologne crRNK. Heterologna crRNK sekvenca je konstruisana tako da sadrži S. pyogenes DNK ciljajuću sekvencu sp2 na 5' kraju spojenom sa L. innocua ili N. meningitidis tracrRNK-vezujućom sekvencom ponavljanja na kraju 3'. Cas9 ortolozi od S. thermophilus i L. innocua, ali ne od N. meningitidis ili C. jejuni, mogu biti vođeni od strane S. pyogenes tracrRNK:crRNK-sp2 za cepanje protospacer 2 plazmidne DNK, mada uz blago smanjenu efikasnost. Slično, hibridni L. innocua tracrRNK:crRNK-sp2 može navoditi S. pyogenes Cas9 za cepanje ciljane DNK sa visokom efikasnošću, dok hibridni N. meningitidis tracrRNK:crRNK-sp2 aktivira samo neznatnu DNK aktivnost cepanja S. pyogenes Cas9. Kao kontrolne grupe, N. meningitidis i L. innocua Cas9 ortholozi razdvajaju protospacer 2 plazmidnu DNK, kada su vođeni srodnim hibridnim tracrRNK:crRNK-sp2. Treba imati na umu da, kao što je već pomenuto, tracrRNK sekvenca od N. meningitidis je samo predviđena i još uvek nije potvrđena RNK sekveciranjem. Stoga, niska efikasnost cepanja može biti rezultat niske aktivnosti Cas9 orthologa ili upotrebe neoptimizovane tracrRNK sekvence. (B) Cepanje protospacer oligonukleotidne DNK.5'-kraj radioobeležena komplementarna linija oligonukleotida (10 nM) prethodno kaljena neoobeleženom nekomplementarnom linijom oligonukleotida (Protospacer 1) (10 nM) (levo) ili 5'-kraj radioobeležena nekomplementarna linija oligonukleotida (10 nM) prethodno kaljena neoobeleženom komplementarnom linijom oligonukleotida (Protospacer 1) (10 nM) (desno) (Protospacer 1) je podvrgnuta cepanju od strane različitih Cas9 ortologa (500 nm) vođenih tracrRNK:crRNK-SP1 dupleksom od S. pyogenes (500 nM, 1: 1). Cas9 ortolozi iz S. thermophilus i L. innocua, ali ne iz N. meningitidis ili C. jejuni mogu biti vođeni S. pyogenes srodnim dualnim-RNK za cepanje protospacer oligonukleotidne DNK, mada sa smanjenim efikasnošću. Treba imati na umu da je mesto cepanja na komplementarnoj DNK jednako za sva tri ortologa. Cepanje nekomplementarne linije se javlja na različitim položajima.
(C) Identičnost aminokiselinske sekvence Cas9 ortologa. S. pyogenes, S. thermophidus i L. innocua ortolozi Cas9 dele visok procenat identičnosti aminokiselina. Nasuprot tome, proteini C. jejuni i N. meningitidis Cas9 se razlikuju po sekvenci i dužini (~300-400 aminokiselina kraći). (D) Ko-savijanje veštački stvorenih heterolognih crRNK sekvenci specifičnih za mesto sa odgovarajućim tracrRNK ortolozima iz S. pyogenes (eksperimentalno potvrđeni, (4)), L. innocua (predviđena) ili N. meningitidis (predviđena). TracrRNK; crRNK Spacer 2 fragmenti; i crRNK ponavljajući fragmenti se prate i obeležavaju. L. innocua i S. pyogenes hibridni tracrRNK:crRNK-sp2 dupleksi dele veoma slične strukturne karakteristike, iako su različiti od N. meningitidis hibrida tracrRNK:crRNK. Zajedno sa podacima cepanja prethodno opisanim u (A) i (B), predviđanje ko-savijanja ukazuje da je cepanje specifično za vrste ciljane DNK pomoću Cas9tracrRNK:crRNK vođeno još uvek nepoznatim svojstvima strukture u tracrRNK:CrRNK dupleksu koji je posebno prepoznat od strane srodnog Cas9 ortologa. Predviđeno je da se specifičnost cepanja za vrste primećena u (A) i (B) javlja na nivou vezivanja Cas9 na dualni-tracrRNK:crRNK. Dualnom-RNK navođeno Cas9 cepanje ciljane DNK može biti specifično za vrstu. U zavisnosti od stepena različitosti/evolucije između Cas9 proteina i tracrRNK:crRNK dupleka, Cas9 i dual-RNK ortolozi su delimično međusobno zamenjivi.
[0508] Slika 25 Serija 8-nukleotidnih DNK sondi komplementarnih regijama u crRNK koje obuhvataju regiju za ciljanje DNK i regiju za vezivanje tracrRNK su analizirane zbog svoje sposobnosti da hibridizuju sa crRNK u kontekstu tracrRNK:crRNK dupleksa i Cas9-tracrRNK:crRNK trostrukog kompleksa. (A) Šematski prikaz sekvenci DNK sondi koje se koriste u testu i njihova mesta vezivanja u crRNK-sp4. (B-C) Analiza promene elektroforetske mobilnosti ciljanih DNK sondi sa tracrRNK:crRNK-sp4 ili Cas9-tracrRNK:crRNK-sp4. U eksperimentu je korišćen tracrRNK (15-89) konstrukt. Vezivanje dupleksa ili kompleksa na ciljane oligonukleotidne DNK analizirano je na 16% prirodnom poliakrilamidnom gelu i vizualizovano fosfornim slikanjem.
Motiv kratke sekvence diktira formiranje R-petlje
[0509] U višestrukim sistemima CRISPR/Cas, prepoznavanje samog sebe u poređenju sa prepoznavanjem ne-sebe pokazalo je da uključuje motiv kratke sekvence koji je sačuvan u stranom genomu, koji se naziva PAM (27, 29, 32-34). PAM motivi su dugački samo nekoliko baznih parova, a njihova precizna sekvenca i položaj variraju u zavisnosti od vrste sistema CRISPR/Cas (32). U sistemu S. pyogenes tipa II, PAM je u skladu sa NGG konsenzusn sekvencom, koja sadrži dva G:C bazna para koji se javljaju jedan bazni par nizvodno od sekvence vezivanja crRNK, unutar ciljane DNK (4). Transformacioni testovi pokazali su da je GG motiv od suštinskog značaja za eliminaciju protospacer plazmidne DNK od strane CRISPR/Cas u bakterijskim ćelijama (Slika 26A), u skladu sa prethodnim zapažanjima kod S. thermophilus (27). Motiv je takođe od suštinskog značaja za in vitro protospacer plazmidno cepanje od strane tracrRNK:crRNK-navođenog Cas9 (Slika 26B). Da bi se utvrdila uloga PAM u cepanju ciljane DNK pomoću Cas9-tracrRNK:crRNK kompleksa, testirali smo niz dsDNK dupleksa koji sadrže mutacije u PAM sekvenci na komplementarnim ili nekomplementarnim linijama, ili oboje (Slika 13A). Analiza cepanja pomoću ovih supstrata pokazala je da je Cas9-katalizovano cepanje DNK posebno osetljivo na mutacije u PAM sekvenci na nekomplementarnoj liniji DNK, za razliku od komplementarnog PAM prepoznavanja od strane tipa I CRISPR/Cas sistema (18, 34). Mutacije motiva PAM nisu uticale na cepanje ciljanih jednostrukih DNK. Ovo zapažanje sugeriše da je motiv PAM potreban samo u kontekstu ciljanih dsDNK i zbog toga može biti potreban za omogući odmotavaje dupleksa, invaziju linija i formiranja strukture R-petlje. Kada smo koristili drugi crRNK-ciljani DNK par (crRNK-sp4 i protospacer 4 DNK), izabrani zbog prisustva kanonskog PAM koji nije prisutan u protospacer 2 ciljanom DNK, utvrdili smo da su oba G nukleotida od PAM potrebna za efikasnog Cas9-katalizovano DNK cepanje (Slika 13B i Slika 26C). Kako bi se utvrdilo da li PAM igra direktnu ulogu u regrutovanju Cas9tracrRNK:crRNK kompleksa na tačnu ciljanu DNK lokaciju, analizirali smo afinitet vezivanja kompleksa za ciljane DNK sekvence pomoću analiza promene gel mobilnosti (Slika 13C). Mutacija bilo kog G u PAM sekvenci značajno je smanjila afinitet Cas9-tracrRNK:crRNK za ciljanu DNK. Ovaj nalaz ilustruje ulogu PAM sekvence vezivanju ciljane DNK od strane Cas9.
[0510] Slika 13 (A) Dualnom-RNK-programiran Cas9 testiran je na aktivnost kao na Slici 10B. WT i mutantne PAM sekvence u ciljanim DNK su obeležene linijama. (B) protospacer 4 ciljani DNK dupleksi (obeleženi na oba 5' kraja) koji sadrže WT i mutirane PAM motive su inkubirani sa Cas9 programiranim sa tracrRNK:crRNK-sp4 (nukleotidi 23 do 89). U navedenim vremenskim tačkama (u minutima), alikvoti reakcije cepanja su uzeti i analizirani kao na Slici 10B. (C) Analiza promene elektroforetske mobilnosti izvršena je pomoću RNK-programiranih Cas9 (D10A/H840A) i protospacer 4 ciljanih DNK dupleksa [isto kao u (B)] koji sadrže WT i mutirane PAM motive. Kompleks Cas9 (D10A/H840A)-RNK je titriran od 100 pM do 1 mM
[0511] Slika 26 (A) Mutacije PAM sekvence u protospacer 2 plazmidnoj DNK ukidaju interferenciju održavanja plazmida od strane tipa II CRISPR/Cas sistema u bakterijskim ćelijama. protospacer 2 plazmidi divljeg tipa sa funkcionalnim ili mutiranim PAM transformisani su u divlji tip (linija SF370, takođe nazvana EC904) i pre-crRNK-deficijentni mutant (EC1479) S. pyogenes kao na Slici 12D. PAM mutacije se ne tolerišu od strane tip II CRISPR/Cas sistema in vivo. Prikazane su srednje vrednosti i standardne devijacije tri biološke replikacije. (B) Mutacije PAM sekvence u protospacer plazmidnoj DNK ukidaju cepanje pomoću Cas9-tracrRNK:crRNK. protospacer 2 plazmid divljeg tipa sa funkcionalnim ili mutiranim PAM podvrgnut je razdvajanju Cas9 kao na Slici 10A. PAM mutantni plazmidi se ne cepaju sa Cas9-tracrRNK:crRNK kompleksom. (C) Mutacije kanonske PAM sekvence ukidaju interferenciju održavanja plazmida pomoću tipa II CRISPR/Cas sistema u bakterijskim ćelijama. protospacer 4 plazmidi divljeg tipa sa funkcionalnim ili mutiranim PAM cepani su pomoću Cas9 programiranog sa tracrRNK i crRNK-sp2. Reakcije cepanja su sprovedene u prisustvu endonukleaze za restrikciju XmnI kako bi se vizuelizovali proizvodi cepanja Cas9 kao dva fragmenta (~1880 i ~800 bp). Prikazane su veličine fragmenta u baznim parovima.
Cas9 se može programirati sa pojedinačnom himernom RNK
[0512] Ispitivanje verovatne sekundarne strukture tracrRNK:crRNK dupleksa (Slike 10E i 12C) sugeriše mogućnost da karakteristike koje se zahtevaju za usmereno Cas9-katalizovano cepanje DNK mogu biti uhvaćene od strane pojedinačne himerne RNK. Iako mehanizam tracrRNK:crRNK izbora cilja efikasno funkcioniše u prirodi, mogućnost pojedinačnog RNK-usmerenog Cas9 je privlačna zahvaljujući svojoj potencijalnoj upotrebi za programirano uklanjanje DNK i uređivanje genoma (Slika 1A-B). Dizajnirali smo dve verzije himerne RNK koja sadrži ciljanu sekvencu za prepoznavanje na 5' kraju, praćeno ukosnica strukturom koja zadržava interakcije bazne uparivanja koje se javljaju između tracrRNK i crRNK (Slika 14A). Ovaj pojedinačni transkript efektivno fuzioniše 3' kraj crRNK na 5' kraj tracrRNK, čime se imitira struktura dvostruke RNK koja je potrebna za navođenje DNK pomoću Cas9. U ispitivanjima cepanja korišćenjem plazmidne DNK, primećeno je da je duži himerni RNK sposoban da vodi Cas9-katalizovano DNK cepanje na način sličan onom koji se primećuje za skraćeni tracrRNK:crRNK dupleks (Slika 14A i Slika 27, A i C). Kraća himerna RNK nije efikasna u ovom testu, potvrđujući da su nukleotidi koji su 5 do 12 pozicija izvan tracrRNK:crRNK interakcija baznog uparivanja važni za efikasnu vezivanje Cas9 i/ili prepoznavanje cilja. Dobijeni su slični rezultati u analizi cepanja korišćenjem kratkog dsDNK kao supstrata, dalje pokazujući da je položaj mesta cepanja u ciljanoj DNK identičan onom koji je primećen pomoću dual tracrRNK:crRNK kao vodiča (Slika 14B i Slika 27, B i C ). Konačno, da bi se utvrdilo da li je dizajn himerne RNK univerzalno primenljiv, napravili smo pet različitih himernih vodiča RNK za ciljanje dela gena koji kodira zeleni fluorescentni protein (GFP) (Slika 28, od A do C) i testiranje njihove efikasnosti protiv plazmida koji nosi GFP kodiranu sekvencu in vitro. U svih pet slučajeva, Cas9 programiran sa ovim himernim RNK efikasno je razdvojio plazmid na tačnoj ciljanoj lokaciji (Slika 14C i Slika 28D), što ukazuje na to da je racionalni dizajn himernih RNK robustan i mogao bi, u principu, omogućiti ciljanje bilo koje DNK sekvence od interesa sa nekoliko ograničenja izvan prisustva GG dinukleotida u blizini ciljane sekvence.
[0513] Slika 1 RNK-ciljajući DNK sadrži jedinostruki „segment za ciljanje DNK“ i „protein-vezujući segment“ koji obuhvata deo dvostruke veze RNK. (A) RNK koja cilja DNK može da sadrži dva odvojena RNK molekula (naziva se „dvostrukomolekulska“ ili „dvomolekulska“ RNK koja cilja DNK). Dvomolekulska RNK koja cilja DNK sadrži „targeter-RNK“ i „aktivator-RNK“. (B) RNK koja cilja DNK može da sadrži jedan jedinstveni RNK molekul (koji se naziva jednomolekulska RNK koja cilja DNK). Jednomolekulska RNK koja cilja DNK sadrži „veznik nukleotide“.
[0514] Slika 14 (A) Plazmid koji se nalazi u protospacer 4 ciljanoj sekvenci i WT PAM je podvrgnut rasklapanju pomoću Cas9 programiranog sa tracrRNK (4-89): crRNK-sp4 dupleksa ili in vitro transkribovanih himernih RNK konstruisanih pridruživanjem 3' kraja crRNK za 5' kraj tracrRNK sa GAAA tetrapetljom. Reakcije cepanja analizirane su mapiranjem ograničenja sa XmnI. Sekvence himernih RNK A i B su prikazane pomoću DNK ciljanja (podvučeno), crRNK ponavljajućih sekvenci (nadvučeno) i sekvenci izvedenih iz tracrRNK. (B) Reakcije cepanja protospacer 4 DNK dupleksa su izvedene kao na Slici 10B. (C) Pet himimernih RNK dizajniranih za ciljanje GFP gena korišćeni su za programiranje Cas9 kako bi se razdvojio plazmid koji sadrži GFP gen. Reakcije cepanja plazmida su izvedene kao na Slici 12E, izuzev što je plazmidna DNK restrikciono mapirana sa AvrII nakon Cas9 cepanja.
[0515] Slika 27 (A) Pojedinačna himerna RNK vodi Cas9-katalizovano cepanje srodne protospacer plazmidne DNK (Protospacer 1 i protospacer 2). Reakcije cepanja su sprovedene u prisustvu endonukleaze za restrikciju XmnI kako bi se vizuelizovali proizvodi Cas9 cepanja kao dva fragmenta (~ 1880 i ~ 800 bp). Prikazane su veličine fragmenta u baznim parovima. (B) Pojedinačna himerna RNK navodi Cas9-katalizovano cepanje srodne protospacer oligonukleotidne DNK (Protospacer 1 i protospacer 2). Prikazane su veličine fragmenta u nukleotidima. (C) Šematski prikazi himernih RNK koje se koriste u eksperimentu. Sekvence himernih RNK A i B prikazane su sa 5' protospacer DNK ciljajućim sekvencama crRNK (podvučeno), tracrRNK-vezujuća sekvenca crRNK (nadvučeno) i od tracrRNK izvedena sekvenca (isprekidano je podvučeno).
[0516] Slika 28 (A) Šematski prikaz GFP plazmida eksprimiranja pCFJ127. Ciljani deo GFP otvorenog okvira čitanja je obeležen crnom strelicom. (B) Zatvaranje sekvence ciljane regije. Sekvence koje su ciljane himernim RNK prikazane su sivim stubovima. PAM dinukleotidi su u kutiji. Jedinstveno mesto restrikcije SalI nalazi se 60 bp uzvodno od ciljanog lokusa. (C) Levo: ciljane DNK sekvence su prikazane zajedno sa svojim susednim PAM motivima. Desno: sekvence himernih vodiča RNK. (D) pCFJ127 je cepan sa Cas9 programiranim sa himernim RNK GFP1-5, kako je navedeno. Plazmid je dodatno digestovan sa SalI i reakcije su analizirane elektroforezom na 3% agaroznom gelu i vizuelizovane bojenjem sa SYBR Safe.
Zakljucak
[0517] Identifikovan je mehanizam interferencije DNK, koji uključuje dualna-RNK strukturu koja usmerava Cas9 endonukleazu za uvođenje usmerenih dvostrukih prekida u ciljanoj DNK. tracrRNK:crRNK-navođeni Cas9 protein koristi različite domene endonukleaze (HNH i RuvC-domeni) kako bi se cepale dve linije u ciljanoj DNK. Prepoznavanje ciljeva od strane Cas9 zahteva i sekvencu semena u crRNK i GG dukleotid koji sadrži PAM sekvencu koja je susedna sa regijom koji vezuje crRNK u DNK cilju. Dalje pokazujemo da se Cas9 endonukleaza može programirati sa vodičem RNK veštački napravljenim kao pojedinačan transkript koji cilja i uklanja bilo koju dsDNK sekvencu od interesa. Sistem je efikasan, prilagodljiv i programabilan izmenom DNK ciljane sekvence u himernom RNK vodiču. Cinkfinger nukleaze i efektorske nukleaze poput epitopa-aktivatora privukle su značajan interes kao veštački enzimi koji su projektovani da manipulišu genome (35-38). Ovo predstavlja alternativnu metodoloziju baziranu na RNK-programiranoj Cas9 koja olakšava primene ciljanje gena i uređivanja genoma.
Navedene reference
1. B. Wiedenheft, S. H. Sternberg, J. A. Doudna, Nature 482, 331 (2012).
2. D. Bhaya, M. Davison, R. Barrangou, Annu. Rev. Genet.45, 273 (2011).
3. M. P. Terns, R. M. Terns, Curr. Opin. Microbiol.14, 321 (2011).
4. E. Deltcheva et al., Nature 471, 602 (2011).
5. J. Carte, R. Wang, H. Li, R. M. Terns, M. P. Terns, Genes Dev.22, 3489 (2008).
6. R. E. Haurwitz, M. Jinek, B. Wiedenheft, K. Zhou, J. A. Doudna, Science 329, 1355 (2010).
7. R. Wang, G. Preamplume, M. P. Terns, R. M. Terns, H. Li, Structure 19, 257 (2011).
8. E. M. Gesner, M. J. Schellenberg, E. L. Garside, M. M. George, A. M. Macmillan, Nat. Struct. Mol. Biol.18, 688 (2011).
9. A. Hatoum-Aslan, I. Maniv, L. A. Marraffini, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.108, 21218 (2011).
10. S. J. J. Brouns et al., Science 321, 960 (2008).
11. D. G. Sashital, M. Jinek, J. A. Doudna, Nat. Struct. Mol. Biol.18, 680 (2011).
12. N. G. Lintner et al., J. Biol. Chem.286, 21643 (2011).
13. E. Semenova et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.108, 10098 (2011).
14. B. Wiedenheft et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.108, 10092 (2011).
15. B. Wiedenheft et al., Nature 477, 486 (2011).
16. C. R. Hale et al., Cell 139, 945 (2009).
17. J. A. L. Howard, S. Delmas, I. Ivancic-Bace, E. L. Bolt, Biochem. J. ˇ ́ ́ 439, 85 (2011). 18. E. R. Westra et al., Mol. Cell 46, 595 (2012).
19. C. R. Hale et al., Mol. Cell 45, 292 (2012).
20. J. Zhang et al., Mol. Cell 45, 303 (2012).
21. K. S. Makarova et al., Nat. Rev. Microbiol.9, 467 (2011).
22. K. S. Makarova, N. V. Grishin, S. A. Shabalina, Y. I. Wolf, E. V. Koonin, Biol. Direct 1, 7 (2006).
23. K. S. Makarova, L. Aravind, Y. I. Wolf, E. V. Koonin, Biol. Direct 6, 38 (2011).
24. S. Gottesman, Nature 471, 588 (2011).
25. R. Barrangou et al., Science 315, 1709 (2007).
26. J. E. Garneau et al., Nature 468, 67 (2010).
27. R. Sapranauskas et al., Nucleic Acids Res.39, 9275 (2011).
28. G. K. Taylor, D. F. Heiter, S. Pietrokovski, B. L. Stoddard, Nucleic Acids Res.39, 9705 (2011).
29. H. Deveau et al., J. Bacteriol.190, 1390 (2008).
30. B. P. Lewis, C. B. Burge, D. P. Bartel, Cell 120, 15 (2005).
31. G. Hutvagner, M. J. Simard, Nat. Rev. Mol. Cell Biol.9, 22 (2008).
32. F. J. M. Mojica, C. Díez-Villaseñor, J. García-Martínez, C. Almendros, Microbiology 155, 733 (2009).
33. L. A. Marraffini, E. J. Sontheimer, Nature 463, 568 (2010).
34. D. G. Sashital, B. Wiedenheft, J. A. Doudna, Mol. Cell 46, 606 (2012).
35. M. Christian et al., Genetics 186, 757 (2010).
36. J. C. Miller et al., Nat. Biotechnol.29, 143 (2011).
37. F. D. Urnov, E. J. Rebar, M. C. Holmes, H. S. Zhang, P. D. Gregory, Nat. Rev. Genet.11, 636 (2010).
38. D. Carroll, Gene Ther.15, 1463 (2008).
39. J. Sambrook, E. F. Fritsch, T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor LaboratoryPress, Cold Spring Harbor, NY, ed.2, 1989).
40. M. G. Caparon, J. R. Scott, Genetic manipulation of pathogenic streptococci. Methods Enzymol.204, 556 (1991). doi:10.1016/0076-6879(91)04028-M Medline
41. C. Frøkjær-Jensen et al., Single-copy insertion of transgenes in Caenorhabditis elegans. Nat. Genet.40, 1375 (2008). doi:10.1038/ng.248 Medline
42. R. B. Denman, Using RNKFOLD to predict the activity of small catalytic RNK. Biotechniques 15, 1090 (1993). Medline
43. I. L. Hofacker, P. F. Stadler, Memory efficient folding algorithms for circular RNK secondary structures. Bioinformatics 22, 1172 (2006). doi:10.1093/bioinformatics/bt1023 Medline
44. K. Darty, A. Denise, Y. Ponty, VARNK: Interactive drawing and editing of the RNK secondary structure. Bioinformatics 25, 1974 (2009). doi:10.1093/bioinformatics/btp250 Medline Primer 2: RNK-programirano uređivanje genoma u ljudskim ćelijama
[0519] Podaci dati u nastavku pokazuju da Cas9 može biti eksprimiran i lokalizovan u jezgru ljudskih ćelija i da se sastavlja sa pojedinačnim vodičem RNK („sgRNK“, koja obuhvata karakteristike potrebne za vezivanje Cas9 i prepoznavanje ciljanih mesta DNK) u ljudskoj ćeliji. Ovi kompleksi mogu da generišu prekide dvostruke veze i stimulišu popravku spajanje nehomogenih krajeva (NHEJ) u genomskoj DNK na mestu komplementarnom za sRNK sekvencu, aktivnost koja zahteva i Cas9 i sgRNK. Produženje RNK sekvence na njenom 3' kraju povećava aktivnost ciljanja DNK u živim ćelijama. Dalje, eksperimenti korišćenjem ekstrakta transfektovanih ćelija pokazuju da je sgRNK sklop u Cas9 ograničavajući faktor za Cs9-posredovano cepanje DNK. Ovi rezultati pokazuju da RNK-programirano uređivanje genoma radi u živim ćelijama i in vivo.
MATERIJALI I POSTUPCI
Dizajn i konstrukcija plazmida
[0520] Sekvenca koja kodira Streptococcus pyogenes Cas9 (ostaci 1-1368) fuzionisana je sa HA epitopom (aminokiselinska sekvenca DAYPYDVPDYASL (SEQ ID NO: 274)), signal nuklearne lokalizacije (aminokiselinska sekvenca PKKKRKVEDPKKKRKVD (SEQ ID NO: 275) ) bio je kodon optimizovan za ljudsko eksprimiranje i sintetisan od strane GeneArt. DNK sekvenca je SEQ ID NO: 276 i proteinska sekvenca je SEQ ID NO: 277. Kloniranje nezavisno od ligacije (LIC) korišćeno je za ubacivanje ove sekvence u pcDNK3.1-izvedene GFP i mCherry LIC vektore (vektori 6D i 6B, respektivno, dobijeni od UC Berkeley MacroLab), što rezultira sa Cas9-HA-NLS-GFP i Cas9-HA-NLS-mCherry fuzijama eksrpimiranim pod kontrolom CMV promotera. Vodič sgRNK su eksrpimirani korišćenjem vektora eksprimiranja pSilencer 2.1-U6 puro (Life Technolozies) i pSuper (Oligoengine). Konstrukti eksrpimiranja RNK su generisana putem kaljenja komplementarnim oligonukleotidima kako bi se formirala DNK sekvenca koja kodira RNK i ligiranjem kaljenog DNK fragmenta između mesto BamHI i HindIII na pSilencer 2.1-U6 puro i BglII i HindIII mestima u pSuper.
Uslovi ćelijske kulture i DNK transfekcije
[0521] HEK293T ćelije su održavane u Dulbekovom modifikovanom orlovskom medijumu (DMEM), dopunjenom sa 10% fetalnog goveđeg seruma (FBS) u humidifikovanom inkubatoru na 37°C sa 5% CO2. Ćelije su transientno transfektovane sa plazmidnom DNK pomoću X-tremeGENE DNK Transfection Reagent (Roche) ili Turbofect Transfection Reagent (Thermo Scientific) sa preporučenim protokolima. Ukratko, HEK293T ćelije su transfektovane u 60-80% konfluentnosti u pločama sa 6 komorica koristeći 0,5 mg plazmida eksprimiranja Cas9 i 2,0 mg plazmida eksprimiranja RNK. Efikasnosti transfekcije procenjene su na 30-50% za Tubofect (Slike 29E i 37A-B) i 80-90% za X-tremegen (Slika 31B), na osnovu dela GFP-pozitivnih ćelija posmatranih fluorescentnom mikroskopijom.48 sati nakon transfekcije, ćelije su isprane fosfatno puferisanim fiziološkim rastvorom (PBS) i lizirane primenom 250 ml lizinskog pufera (20 mM Hepes pH 7.5, 100 mM kalijum hlorid (KCl), 5 mM magnezijum hlorid (MgCl2), 1 mM ditiotreitol DTT), 5% glicerola, 0.1% Triton X-100, dopunjen sa koktelom inhibitora Roche proteaze), i potom mešano 10 minuta na 4°C. Dobijeni ćelijski lizat je podeljen na alikvote za dalju analizu. Genomska DNK je izolovana od 200 ml ćelijskog lizata koristeći DNeasy komplet za krv i tkiva (Qiagen) prema protokolu proizvođača.
Vestern blot analiza eksprimiranja Cas9
[0522] HEK293T, transfektovan sa plazmidom eksprimiranja Cas9-HA-NLS-GFP, sakupljen je i liziran 48 časova posle transfekcije kao što je gore navedeno.5 ul lizata je elektroforezovano na 10% SDS poliakrilamid gelu, bloteru na PVDF membranu i ispitivano sa HRP-konjugovanim anti-HA antitelom (Sigma, 1: 1000 razblaženje u 1x PBS).
Surveyor analiza
[0523] Analiza istraživanja je izvršena kao što je ranije opisano [10,12,13]. Ukratko, lokus ljudskog klatrin lakog lanca A (CLTA) je PCR amplifikovan iz 200 ng genomske DNK korišćenjem polimeraze visoke plodnosti, Herculase II Fusion DNK Polimerase (Agilent Technolozies) i prednji prajmer 5'-GCAGCAGAAGAAGCCTTTGT-3' (SEQ ID NO://) i obrnuti prajmer 5'-TTCCTCCTCTCCCTCCTCTC-3' (SEQ ID NO://). 300 ng 360 bp amplikona je zatim denaturisano zagrevanjem na 95°C i polako ponovo kaljeno korišćenjem toplotnog bloka da nasumice rehribridizuje divlje i mutantne DNK linije. Uzorci su zatim inkubirani sa Cel-1 nukleazom (Surveyor Kit, Transgenomic) tokom 1 sata na 42°C. Cel-1 prepoznaje i cepa DNK helikse koji sadrže neusklađenost (divlji tip: mutantna hibridizacija). Proizvodi za digestiju Cel-1 razdvojeni su na 10% akrilamidnom gelu i vizuelizovani bojom sa SYBR Safe (Life Technolozies). Kvantifikovanje pojaseva cepanja je izvršeno pomoću softvera ImageLab (Bio-Rad). Procenat cepanja određen je deljenjem prosječnog intenziteta proizvoda cepanja (160-200 bps) sumom intenziteta nečistoće PCR proizvoda (360 bp) i produkata cepanja.
In vitro transkripcija
[0524] Vodič RNK je in vitro transkribovana korišćenjem rekombinantne T7 RNK polimeraze i DNK šablona generisanog kaljenjem komplementarnih sintetičkih oligonukleotida kao što je prethodno opisano [14]. RNK su prečišćene elektroforezom na 7M akrilamidnom gelu koji je denaturaiše ureu, precipitirane etanolom i rastvorene u DEPC tretiranom sa vodom.
Northern blot analiza
[0525] RNK je prečišćena iz HEK293T ćelija upotrebom izolacionog kompleta mirVana male-RNK (Ambion). Za svaki uzorak, 800 ng RNK je razdvojeno na 10% urea-PAGE gelu nakon denaturacije tokom 10 min na 70°C u RNK puferu (0,5X TBE (pH 7.5), 0,5 mg/ml bromofenolom plava, 0,5 mg ksilen cijanol i 47% formamid). Posle elektroforeze na 10V u 0,5X TBE puferu dok bromofenola plava boja nije dostigla dno gela, uzorci su elektroblotovani na Nytran membrani na 20 volti tokom 1.5 sati u 0,5X TBE. Prenesene RNK su unakrsno povezane na Nitran membrani u UV-Crossveznik (Strategene) i prethodno su hibridizovane na 45°C tokom 3 časa u puferu koji sadrži 40% formamid, 5X SSC, 3X Dernhardt (0,1% fikol, polivinilpirolidon, i BSA) i 200 mg/ml DNK sperme lososa. Pre-hibridizovane membrane su inkubirane preko noći u puferu za prehribridizaciju uz dodatak 5'-32P obeležene antisense DNK oligo sonde na 1 milion cpm/ml. Posle nekoliko pranja u SSC puferu (konačno ispiranje u 0,2X SCC), membrane su fosforno slikane.
In vitro analiza cepanja
[0526] Ćelijski lizati su pripremljeni kao što je gore opisano i inkubirani sa donor plazmidom CLTA-RFP [10]. Reakcije cepanja su izvedene u ukupnoj zapremini od 20 ml i sadržale su 10 ml lizata, 2 ml 5x pufera cepanja (100 mM HEPES pH 7,5, 500 mM KCI, 25 mM MgCl2, 5 mM DTT, 25% glicerol) i 300 ng plazmida. Gde je navedeno, reakcije su dopunjene sa 10 pmol in vitro transkrbiovane CLTA1 sgRNK. Reakcije su inkubirane na 37°C tokom jednog sata i zatim digestovane sa 10 U Xhol (NEB) tokom dodatnih 30 min na 37°C. Reakcije su zaustavljene dodatkom Proteinase K (Thermo Scientific) i inkubirane na 37°C tokom 15 minuta. Proizvodi za razblaženje su analizirani elektroforezom na 1% agarozna gelu i obojeni sa SYBR Safe. Prisustvo fragmenata ~ 2230 i ~ 3100 bp je indikativno za Cas9-posredovano cepanje.
REZULTATI
[0527] Da testiramo da li bi se Cas9 mogao programirati da cepa genomsku DNK u živim ćelijama, Cas9 je ko-eksprimiran zajedno sa sgRNK dizajniranom da cilja na ljudski gen klatrin lakog lanca (CLTA). CLTA genomski lokus je prethodno bio ciljan i uređen pomoću ZFN [10]. Prvo smo testirali eksprimiranje ljudskim-kodonom-optimizovane verzije Streptococcus pyogenes Cas9 proteina i sgRNK u ljudskim HEK293T ćelijama. 160 kDa Cas9 protein je eksprimiran kao fuzioni protein koji nosi HA epitop, signal nuklearnog lokalizovanja (NLS) i zeleni fluorescentni protein (GFP) prikačen na C-terminus od Cas9 (Slika 29A). Analiza ćelija transfektovanih sa vektorom koji kodira GFP-fuzionisan Cas9 otkrila je obimno eksprimiranje Cas9 i nuklearnu lokalizaciju (Slika 29B). Western blot potvrdilo je da je Cas9 protein eksrpimiran u velikoj meri netaknut u ekstraktima ovih ćelija (Slika 29A). Da bi programirali Cas9, eksprimirali smo sgRNK sa 5-terminalnom 20-nukleotidnom sekvencom komplementarnom ciljanoj DNK sekvenci, i 42-nukleotidnom 3'-terminalnom stem-petlja strukturom potrebnom za vezivanje Cas9 (Slika 29C). Ova 3'-terminalna sekvenca odgovara minimalnoj strukturi stem-petlje koja je prethodno korišćena za programiranje Cas9 in vitro [8]. Eksprimirane ove sgRNK bilo je vođeno ljudskim U6 (RNK polimeraza III) promoterom [11]. Northern blot analiza RNK ekstraktovane iz ćelija transfektovanih sa U6 promoterom-navođenim sgRNK plazmidnim vektorom eksprimiranja pokazala je da je sgRNK zaista eksprimirana i da je njihova stabilnost poboljšana prisustvom Cas9 (Slika 29D).
[0528] Slika 29 pokazuje da ko-eksprimiranje Cas9 i vodič RNK u ljudskim ćelijama generiše prekidedvostruke DNK na ciljanom lokusu. (A) Vrh; šematski dijagram konstrukcije eksprimiranja Cas9-HA-NLS-GFP. Dno; lizat iz HEK293T ćelija transfektovanih sa Cas9 plazmidom eksprimiranja analiziran je pomoću Western blot koristeći anti-HA antitela. (B) Fluorescencijska mikroskopija HEK293T ćelija koje eksprimiraju Cas9-HA-NLS-GFP. (C) Dizajn pojedinačno navođene RNK (sgRNK, tj., jednomolekulska RNK koja cilja DNK) koja cilja na CLTA lokus. Vrh; šematski dijagram sgRNK ciljanog mesta u eksonu 7 ljudskog CLTA gena. ciljana sekvenca koja hibridizuje na vodič segmentu CLTA1 sgRNK obeležena je kao „CLTA1 sgRNK“. GG dinukleotidni protospacer susedni motiv (PAM) obeležen je strelicom. Crne linije označavaju regije vezivanja DNK kontrolnog ZFN proteina. Kodon zaustavljanja translacije CLTA otvorenog okvira čitanja obeležen je tačkastom linijom kao referenca. Sredina; šematski dijagram konstrukcije eksprimiranja sgRNK. RNK se eksprimira pod kontrolom U6 Pol III promotera i poli(T) trakta koji služi kao transkripcijski terminatorni signal Pol III. Dno; sgRNK-navođeno cepanje ciljane DNK od strane Cas9. SgRNK se sastoji od 20-nt 5‘-terminalnog vodičnog segmenta praćenog 42-nt strukturom stem-petlje potrebne za Cas9 vezivanje. Cas9-posredovano cepanje dve linije ciljane DNK se javlja nakon otpuštanja ciljane DNK i formiranja dupleksa između vodič segmenta sgRNK i ciljane DNK. Ovo zavisi od prisustva PAM motiva (pogodno za upotrebu Cas9, npr. GG dinukleotida, pogledati Primer 1 gore) nizvodno od ciljane sekvence u ciljanoj DNK. Treba imati na umu da je ciljana sekvenca obrnuta u odnosu na gornji dijagram. (D) Northern blot analiza eksprimiranja sgRNK u HEK239T ćelijama. (E) Ispitivanje nukleaze genomske DNK izolovane iz HEK293T ćelija koje eksprimiraju Cas9 i/ili CLTA sgRNK. Konstrukt ZFN koji se ranije koristio za ciljanje CLTA lokusa [10] korišćen je kao pozitivna kontrola za detekciju popravke DNK izazvane DSB putem nehomolognog spajanja krajeva.
[0529] Zatim smo ispitali da li su usmereni DSB napravljeni u HEK293T ćelijama transfektovanim sa Cas9-HANLS-mCherry i CLTA1 sgRNK. Da bismo to uradili, ispitali smo manja umetanja i brisanja u lokusu koja su nastala usled nepravilnog popravljanja pomoću DSB-indukovane NHEJ pomoću Surveyor testa nuklease [12]. Regija genomske DNK ciljane od strane Cas9:sgRNK se pojačava pomoću PCR i dobijeni proizvodi su denaturisani i ponovljeni. Rehribizovani PCR proizvodi su inkubirani sa endonuklaznom Cel-1 za prepoznavanje neusaglašenosti i rastvoreni na akrilamidnom gelu da bi se identifikovali pojasevi cepanja Cel-1. Kako je popravljanje DNK pomoću NHEJ tipično indukovano sa DSB, pozitivni signal u Surveyor testu pokazuje da je došlo do cepanja genomske DNK. Koristeći ovaj test, otkrili smo cepanje CLTA lokusa na poziciji koja je ciljala CLTA1 sgRNK (Slika 29E). Par ZFN koji ciljaju susedno mesto u CLTA lokusu dali su pozitivnu kontrolu u ovim eksperimentima [10].
[0530] Kako bi se utvrdilo da li je eksprimiranje Cas9 ili sgRNK ograničavajući faktor u posmatranim reakcijama za uređivanje genoma, lizati dobijeni iz transfektovanih ćelija su inkubirani sa plazmidnom DNK koja sadrži fragment CLTA gena ciljanog sa CLTA1 sgRNK.
Cepanje plazmidne DNK nije primećeno nakon inkubacije sa lizatom, pripremljenim od ćelija transfektovanih samo sa vektorom eksprimiranja Cas9-HA-NLS-GFP, u skladu sa rezultatima Surveyor testa. Međutim, robusno cepanje plazmida je otkriveno kada je lizat dopunjen sa in vitro transkribovanom CLTA1 sgRNK (Slika 30A). Pored toga, lizat koji je pripremljen od ćelija transfektovanih sa vektorima eksprimiranja Cas9 i sgRNK, podržava plazmidno cepanje, dok lizati iz ćelija transfektovanih sa samim sgRNK-kodirajućim vektorom ne podržavaju (Slika 30A). Ovi rezultati ukazuju na to da ograničavajući faktor za Cas9 funkciju u ljudskim ćelijama može biti veza sa sgRNK. Ovu mogućnost smo testirali direktno analizom cepanja plazmida u lizatima od ćelija transfektovanih kao i ranije u prisustvu i odsustvu dodate egzogene sgRNK. Naime, kada je egzogena sgRNK dodata lizatu iz ćelija transfektovanih sa vektorima eksprimiranja Cas9 i sgRNK, primećeno je znatno povećanje aktivnosti cepanja DNK (Slika 30B). Ovaj rezultat ukazuje da je ograničavajući faktor za Cas9 funkciju u HEK293T ćelijama eksrpimiranje sgRNK ili njegovo postavljanje na Cas9.
[0531] Slika 30 pokazuje da ćelijski lizati sadrže aktivnu Cas9:sgRNK i usmereno DNK cepanje.
(A) Lizati iz ćelija transfektovanih sa plazmidima obeleženim levo su inkubirani sa plazmidnom DNK koja sadrži PAM i ciljanu sekvencu komplementarnu sa CLTA1 sgRNK; gde je naznačeno, reakcija je dopunjena sa 10 pmol in vitro transkribovane CLTA1 sgRNK; sekundarno cepanje sa Xhol generisanim fragmentima od ~2230 i ~3100 bp fragmenata koji ukazuju na Cas9-posredovano cepanje. Kontrolna reakcija pomoću lizata iz ćelija transfektovanih sa ZFN konstruktom eksprimiranja pokazuje fragmente neznatno drugačije veličine koji odražavaju razmak ZFN ciljanog mesta u odnosu na CLTA1 ciljano mesto. (B) Lizati iz ćelija transfektovanih sa Cas9-GFP plazmidom eksprimiranja i, gde je naznačeno, plazmidom eksprimiranja CLTA1 sgRNK, inkubirani su sa ciljanom plazmidnom DNK kao u (A) u odsustvu ili prisustvu in vitro transkripcije CLTA1 sgRNK.
[0532] Kao način za poboljšanje skupljanja Cas9:sgRNK u živim ćelijama, zatim smo testirali efekat proširenja pretpostavljene Cas9-vezujuće regije vodič RNK. Dve nove verzije CLTA1 sgRNK su dizajnirane tako da uključuju dodatnih šest ili dvanaest osnovnih parova u heliksu koji imitira interakciju baznog uparivanja između crRNK i tracrRNK (Slika 31A). Pored toga, 3'-kraj vodiča RNK proširen je sa pet nukleotida zasnovanih na prirodnoj sekvenci S. pyogenes tracrRNK [9]. Vektori koji kodiraju ove 3' proširene sgRNK pod kontrolom ili promotera U6 ili H1 Pol III transfektovani su u ćelije zajedno sa Cas9-HA-NLS-GFP vektorom eksprimiranja i usmereno cepanje genom testirano je koristeći Surveyor analizu(Slika 31B ). Rezultati su potvrdili da je cepanje potrebno za Cas9 i CLTA1 sgRNK, ali se nije desilo kada su Cas9 ili sgRNK eksprimirani sami. Osim toga, primećene su značajno povećane frekvencije NHEJ, koje su detektovane pomoću cepanja nukleaze Cel-1, dok je frekvencija NHEJ mutageneza dobijena kontrolnim ZFN parom u velikoj meri nepromenjena.
[0533] Slika 31 pokazuje da 3' proširenje sgRNK konstrukata poboljšava usmerenu NHEJ-posredovanu mutagenezu. (A) Konstrukt za CLTA1 sgRNK eksprimiranje (vrh) dizajniran je da generiše transkripte koji sadrže prvobitnu sekvencu vezivanja Cas9 (v1.0) ili dsRNK duplekse proširene sa 4 bazna parova (v2.1) ili 10 baznih parova (v2.2). (B) Surveyor test nukleaze genomske DNK izolirane iz HEK293T ćelija koje eksprimiraju Cas9 i/ili CLTA sgRNK v1.0, v2.1 ili v2.2. Konstrukt ZFN koji se ranije koristio za ciljanje CLTA lokusa [10] korišćen je kao pozitivna kontrola za detekciju popravke DNK izazvane DSB putem nehomolognog spajanja krajeva.
[0534] Rezultati tako pružaju okvir za primenu Cas9 kao lakog molekularnog alata za različite primene za uređivanje genoma. Moćna karakteristika ovog sistema je potencijal za programiranje Cas9 sa više sgRNK u istoj ćeliji, kako bi se povećala efikasnost ciljanja na jednom lokusu ili kao sredstvo za ciljanje nekoliko lokusa istovremeno. Takve strategije bi pronašle široku primenu u eksperimentima na nivou genoma i velikim istraživačkim naporima kao što je razvoj multigeničnih modela bolesti.
Primer 3: tracrRNK i Cas9 porodice tipa II CRISPR-Casus sistema imuniteta
[0535] Pretražili smo sve značajne tip II CRISPR-Cas lokuse postoje u javno dostupnim bakterijskim genomima pomoću skrininga za sekvence homologne Cas9, najznačajnijeg proteina tip II sistema. Izradili smo filogenetsko drvo od višestrukog poravnanja sekvenci identifikovanih Cas9 ortologa. CRISPR dužina ponavljanja i genska organizacija cas operona pridruženih tip II sistema analizirana je u različitim Cas9 subklasterima. Podklasifikacija tip II lokusa je predložena i dalje podijeljena na podgrupe zasnovane na selekciji 75 reprezentativnih Cas9 ortologa. Zatim smo predvideli tracrRNK sekvence uglavnom uzimanjem CRISPR ponovljenih sekvenci i skrininga za anti-ponavljanje unutar ili u blizini cas gena i CRISPR nizova odabranih tip II lokusa. Izvršena je komparativna analiza sekvenci i predviđenih struktura odabranih tracrRNK ortologa. Konačno, odredili smo profile eksprimiranja i procesuiranja tracrRNK i crRNK od pet vrsta bakterija.
MATERIJALI I POSTUPCI
Bakterijske vrste i uslovi kultivisanja
[0536] Sledeći medijumi su korišćeni za rastu bakterija na pločama: TSA (triptikaza soja agar, Trypticase™ Soy Agar (TSA II) BD BBL, Becton Dickinson) uz dodatak 3% ovčije krvi za S. mutans (UA159) i BHI (Infuzija mozga i srca, BD Bacto™ infuzija mozga i srca, Becton Dickinson) agar za L. innocua (Clip11262). Kada se uzgaja u tečnim kulturama, THI medijum (Todd Hewitt Broth (THB, Bacto, Becton Dickinson) sa dodatkom 0,2% ekstrakta kvasca (Servabacter®) je korišćen za S. mutans, BHI brot za L. innocua, BHI tečni medijum koji sadrži 1% vitaminski miks VX (Difco, Becton Dickinson) za N. meningitidis (a Z2491), MH (Mueller Hinton Broth, Okoid) brot uključujući 1% vitaminski miks VX za C. jejuni (NCTC 11168; aTCC 700819) i TSB (Triptic Soy Broth, BD BBL ™ Trypticase ™ Soy Broth) za F. novicida (U112) S. mutans je inkubiran na 37°C, 5% CO2 bez mešanja. Linije L. innocua, N. meningitidis and F. Novicida su uzgajane aAerobno na 37°C uz mešanje. C. jejuni je uzgajan na 37°C u mikroaerofilnim uslovima korišćenjem atmosfere kampigena (Oyoid). Rast bakterijskih ćelija praćen je merenjem optičke gustine kultura na 620 nm (OD620 nm) u redovnim vremenskim intervalima koristeći čitač mikroploča (BioTek PowerWave™).
Sekvenciranje bakterija malih RNK biblioteka.
[0537] C. jejuni NCTC 11168 (ATCC 700819), F. novicida U112, L. innocua Clips 1262, N. meningitidis Z2491 i S. mutans UA159 su kultivisane do sredine logaritamske faze rasta i ukupna RNK je ekstraktovana sa TRIzol (SigmaAldrich).10 mg ukupne RNK od svake vrste tretirano je sa TURBO™ DNKazom (Ambion) kako bi se uklonila bilo koja rezidualna genomska DNK. Ribosomalne RNK su uklonjene pomoću Ribo-Zero™ Removal Kits® za Gram-pozitivne ili Gram-negativne bakterije (Epicenter) prema uputstvima proizvođača. Nakon prečišćavanja sa RNK Clean & Concentrator™-5 kompletom (Zimo Research), biblioteke su pripremljene koristeći ScriptMiner™ Small RNK-Seq pripremu za kompletnu biblioteku (Multiplex, Illumina® kompatibilno) prema uputstvima proizvođača. RNK su tretirani sa Tobacco Acid Pyrophosphatase (TAP) (Epicenter). Kolone iz RNK Clean & Concentrator™-5 (Zimo Research) su korišćene za naknadno prečišćavanje RNK, i za PCR amplifikaciju korišćena je Phusion® High-Fidelity DNK polimeraza (New England Biolabs). U svakoj biblioteci (RNK-Seq Barcode Primers (Illumina®-kompatibilan) Epicenter) dodati su specifični korisnički definisani barkodovi, i uzorci su sekvencirani na Next Generation Sequencing (CSF NGS jedinica, na internetu na „csf." praćeno sa „ac.at“) uslugom od Vienna Biocenter, Vienna, Austria (Illumina sekvenciranje pojedinačnog kraja).
Analiza tracrRNK i crRNK podataka sekvenciranja
[0538] Čitanja za sekvenciranje RNK su podeljena korišćenjem alata illumina2bam i skraćena pomoću (i) uklanjanja sekvenci adaptera Illumina (cutadapt 1.0) i (ii) uklanjanja 15 nt na kraju 3' kako bi se poboljšao kvalitet čitanja. Posle uklanjanja čitanja kraćih od 15 nt, cDNK čitanja su poravnata sa svojim odgovarajućim genom korišćenjem Bowtie dozvoljavajući 2 neusklađenosti: C. jejuni (GenBank: NC_002163), F. novicida (GenBank: NC_008601), N. meningitidis (GenBank: NC_003116 ), L. innocua (GenBank: NC_003212) i S. mutans (GenBank: NC_004350). Pokrivenost čitanja izračunava se na svakom položaju nukleotida posebno za obe DNK linije koristeći BEDTools-Version-2.15.0. Normalizovana datoteka koja sadrži pokrivanje čitanja po milionu (rpm) stvorena je i vizualizovana korišćenjem alata Integrative Genomics Viewer (IGV) („www.“ praćeno sa „broadinstitute.org/igv/“) (Slika 36). Korišćenjem SAMTools flagstat80, proporcije mapiranih čitanja su izračunate na ukupno matiranih 9914184 čitanja C. jejuni, 48205 čitanja F. novicida, 13110087 čitanja, N. meningitidis, 161865 čitanja L. innocua i 1542239 čitanja S. mutans. Fajl koji sadrži broj čitanja koja počinje (5' ) i završava se (3') na svakom pojedinačnom položaju nukleotida stvoren je i vizualizovana u IGV. Za svaki tracrRNK ortolog i crRNK, ukupan broj čitanja izračunava se koristeći SAMtools.
Cas9 analiza sekvence, višestruko poravnavanje sekvence i konstrukcija stabla vodiča
[0539] Position-Specific Iterated (PSI)-BLAST program je korišćen za dobijanje homologa porodice Cas9 u ne-redundantnoj bazi podataka NCBI. Sekvence kraće od 800 aminokiselina su odbačene. Program BLASTClust podešen sa prekidom dužine pokrivenosti od 0,8 i pragom pokrivenosti rezultata (bitni rezultat podeljen sa dužinom poravnanja) od 0,8 koristi se za grupisanje preostalih sekvenci (Slika 38). Ovim postupkom proizvedeno je 78 klastera (od kojih je 48 predstavljeno samo jednom sekvencom). Jedan (ili retko nekoliko predstavnika) izabrani su iz svakog klastera, i višestruko poravnanje za ove sekvence konstruisano je korišćenjem MUSCLE programa sa podrazumevanim parametrima, praćeno manuelnom korekcijom na osnovu lokalnih poravnanja dobijenih pomoću programa PSI-BLAST i HHpred. Još nekoliko sekvenci nisu bile poravnate i takođe su isključene iz konačnih poravnanja. Pozdano poravnati blokovi sa 272 informativna položaja korišćeni su za rekonstrukciju stabla maksimalne verovatnoće upotrebom programa FastTree sa podrazumevanim parametrima: JTT evolucijski model, diskretni gama model sa 20 kategorija. Isti program korišćen je za izračunavanje vrednosti bootstrapa.
[0540] Slika 38 prikazuje sekvence koje su grupisane u skladu sa BLASTclust programom klasteriranja. Za analizu BLASTclusta izabrane su samo sekvence duže od 800 aminokiselina (pogledate materijale i postupke). Korišćeni su reprezentativne linije koje pokrivaju gene Cas9 ortologua. Neke sekvence nisu grupisane, već su verifikovane kao Cas9 sekvence zbog prisustva konzerviranih motiva i/ili drugih cas gena u svojoj neposrednoj blizini.
Analiza CRISPR-Cas lokusa
[0541] CRISPR ponovljene sekvence su preuzete iz CRISPRdb baze podataka ili su predviđene pomoću alata CRISPRFinder (Grissa I et al., BMC Bioinformatics 2007; 8:172; grissa I et al., Nucleic Acids Res 2007). Geni cas su identifikovani korišćenjem BLASTp algoritma i/ili verifikovani pomoću KEGG baze podataka (na Internetu „www“ praćeno sa „kegg.jp/“).
In silico predviđanja i analiza tracrRNK ortologa
[0542] Predložena anti-ponavljanja su identifikovana pomoću softvera Vector NTI® (Invitrogen) tako što su ispitivana za dodatne, degenerisane ponavljajuće sekvence koje nisu pripadale ponavljajućem rasporedu na oba pramena odgovarajućih genoma, što omogućava do 15 neusklađenosti. Promoteri transkripcije i ro-nezavisni terminatori su predviđeni pomoću programa BDGP Neural Network Promoter Prediction („www.“ praćeno „fruitfly.org/seq_tools/promoter.html“) i softvera TransTermHP, respektivno. Poravnanja višestrukih sekvenci izvršena su pomoću programa MUSCLE sa podrazumevanim parametrima. Poravnavanja su analizirano za prisustvo konzerviranih struktura motiva koristeći RNKalifold algoritam iz paketa Vienna RNK package 2.0.
REZULTATI
Tip II CRISPR-Cas sistemi su rasprostranjeni u bakterijama.
[0543] Pored DNK koja kodira tracrRNK i ponovnog Spacer niza, tip II CRISPR-Cas lokusi tipično se sastoje od tri do četiri cas gena organizovana u operonu (Slika 32A-B). Cas9 je značajan protein karakterističan za tip II i uključen je u korake eksprimiranja i interferencije. Cas1 i Cas2 su osnovni proteini koji dele sve CRISPR-Cas sisteme i uključeni su u Spacer akviziciju. Csn2 i Cas4 su prisutni samo u podskupu tip II sistema i predloženi su da igraju ulogu u adaptaciji. Da bi se preuzeo maksimalan broj tipa II CRISPR-Cas lokusa, koji sadrže tracrRNK, prvo smo pregledali javno dostupne genome za sekvence homologne već obeleženim Cas9 proteinima.
235 Cas9 ortolozi su identifikovani kod 203 bakterijske vrste. Za dalju analizu odabran je set od 75 različitih sekvenci koje su predstavljali sve izvučene Cas9 ortologe (Slika 32, Slika 38, i Materijali i Postupci).
[0544] Slika 32 prikazuje (A) filogenetsko stablo reprezentativnih Cas9 sekvenci iz različitih organizama, kao i (B) reprezentativnu Cas9 lokus arhitekturu. Navedene su izračunate vrednosti za svaki čvor. Iste grane boja predstavljaju izabrane subklastere sličnih Cas9 ortologa. CRISPR ponavljaju dužinu u nukleotidima, prosečna veličina Cas9 proteina u aminokiselinama (aa) i konsenzusna lokusna arhitektura prikazani su za svaki subklaster. *- gi|116628213 *-gi|116627542 †- gi|34557790
-gi|34557932. Tip II-A karakterišu cas9- Csx12, cas1, cas2, cas4. Tip II-B karakterišu cas9, cas1, cas2 praćeni csn2 varijantom. Tip II-C karakterišu konzervirani cas9, cas1, cas2 operoni (pogledati takođe Sliku 38).
[0545] Zatim smo izvršili višestruko poravnanje sekvence odabranih ortologa Cas9. Komparativna analiza pokazala je visoke razlike u sastavu aminokiseline i veličini proteina. Ortolozi Cas9 dele samo nekoliko identičnih aminokiselina, i sve preuzete sekvence imaju istu arhitekturu domena sa centralnim domenom HNH endonukleaze i podeljenim RuvC/RNKazaH domenom. Dužina Cas9 proteina kreće se od 984 (Campylobacter jejuni) do 1629 (Francisella novicida) aminokiselina sa tipičnim veličinama od ~1100 ili ~1400 aminokiselina. Zbog velike raznovrsnosti Cas9 sekvenci, posebno u dužini interdomenskih regija, odabrali smo samo dobro usklađene, informativne položaje pripremljenog poravnanja za rekonstrukciju filogenetskog stabla analiziranih sekvenci (Slika 32 i Materijali i Postupci). Cas9 orgolozi grupisani u tri glavna, monofiletna klastera sa nekim okvirnim sekvencama. Zapažena topologija Cas9 stabla je u saglasnosti sa trenutnom klasifikacijom tip II lokusa, sa prethodno definisanim tipom II-A i tipom II-B koji formiraju odvojene, monofiletne klastere. Da bismo dalje opisali klastere, detaljno smo pregledali sastav cas operona i CRISPR ponovljene sekvence svih navedenih vrsta.
Podgrupa Cas9 odražava raznolikost arhitekture tip II CRISPR-Cas lokusa
[0546] Dublja analiza odabranih tip II lokusa otkrila je da je grupisanje sekvenci Cas9 ortologa u korelaciji sa raznolikošću u dužni ponavljanja CRISPR. Za većinu tip II CRISPR-Cas sistema, dužina ponavljanja je 36 nukleotida (nt) sa nekim varijacijama za dva subklastera Cas9 stabla. U klasteru tipa II-A (Slika 32) koji sadrži lokuse koji kodiraju dugi Cas9 ortolog, ranije nazvan Csx12, CRISPR ponavljanja su 37 nt duga. Mali subklaster sastavljen od sekvenci od bakterija koje pripadaju Bacteroidetes phylumu (Slika 32) karakterišu neobično duga CRISPR ponavljanja, do 48 nt u dužini. Pored toga, primetili smo da subklasterovanje Cas9 sekvenci korelira sa različitim cas operonskim arhitekturama, kao što je prikazano na Slici 32. Treći glavni klaster (Slika 32) i izlazni lokusi (Slika 32) sastoje se uglavnom od minimalnog operona sastavljenih od cas9, cas1 i cas2 gena, sa izuzetkom nekih nepotpunih lokusa o kojima se govori kasnije. Svi drugi lokusi dva prva velika klastera su povezani sa četvrtim genom, uglavnom cas4, specifičnim za tip II-A ili csn2-, specifičan za tip II-B (Slika 32). Identifikovali smo gene koji kodiraju kraće varijante Csn2 proteina, Csn2a, unutar lokusa sličnih tipu II-B S. pyogenes CRISPR01 i S. thermophilus CRISPR3 (Slika 32). Duža varijanta Csn2, Csn2b pronađena je povezana sa lokusima sličnim tipu II-B S. thermophilus CRISPR1 (Slika 32). Interesantno je da smo identifikovali dodatne značajne cas gene koji kodiraju proteine bez očigledne sličnosti sličnosti sa ranije opisanim varijantama Csn2. Jedan od tih neharakterisanih proteina je isključivo povezan sa tipa II-B lokusom vrste Mycoplasma (Slika 32 i Slika 33). Dva druga su pronađena kodirana u tipa II-B lokusu vrste Staphilococcus (Slika 33). U svim slučajevima raznolikost arhitekture cas operona je u skladu sa subklasterisanjem Cas9 sekvencami. Ove karakteristike, zajedno sa opštom topologijom Cas9 stabla podeljene u tri glavna, različita, monofiletna klastera, doveli su nas da predložimo novu, dalju podelu tip II CRISPR-Cas sistema na tri podtipa. Tip II-A je povezan sa Csx12- poput Cas9 i Cas4, tip II-B je povezan sa Csn2 i tip II-C sadrži samo minimalni skup cas9, cas1 i cas2 gena, kao što je prikazano na Slici 32.
[0547] Slika 33 prikazuje arhitekturu tipa II CRISPR-Cas iz odabranih vrsta bakterija. Vertikalni stubovi grupišu lokuse tog koda za ortologe Cas9 koji pripadaju istom subklasteru stabla (uporediti sa Slikom 32). Horizontalni crni stub, liderska sekvenca; crni pravougaonici i dijamanti, niz Spacer ponavljanja. Predviđena anti-ponavljanja su predstavljena strelicama koje ukazuju na pravac predložene transcriptije tracrRNK. Treba imati na umu da se za lokuse koji nisu eksperimentalno verifikovani, CRISPR niz Spacer ponavljanja se ovde smatra transkribovanim iz istog niza kao operon. U skladu s tim je upućen pravac transkripcije značajnoj tracrRNK ortologa.
In silico predviđanja novih tracrRNK ortologa
[0548] Tip II lokusi izabrani ranije na osnovu 75 reprezentativnih Cas9 ortologa su ispitivani za prisustvo značajnih tracrRNK ortologa. Naša prehodna analiza objavljena na ograničenom broju tracrRNK sekvenci otkrila je da ni sekvence tracrRNK ni njihove lokalizacije unutar CRISPR-Cas lokusa izgleda nisu očuvane. Međutim, kako je navedeno gore, tracrRNK su takođe karakterisane anti-ponavljaje sekvencama sposobnim za bazno uparivanje sa svakim od precrRNK ponavljanja kako bi formirali tracrRNK:precrRNK duplekse ponavljanja koji su cepani od strane RNKaze III u prisustvu Cas9. Kako bi predvideli nove tracrRNK, iskoristili smo ovu karakteristiku i koristili sledeći tok rada: (i) ispitivanje za potencijalna anti-ponavljanja (bazno uparivanje sekvenci sa CRISPR ponavljanjima) unutar CRISP-Cas lokusa, (ii) odabir antiponavljanja lociranih u intergenskim regijama, (iii) validacija CRISPR antiponavljanje:ponavljanje baznih parova, i (iv) predviđenje promotera i Ro-nezavisnih transkripcionih terminatora povezanih sa identifikovanim tracrRNK.
[0549] Kako bi tražili značajna anti-ponavljanja, dobili smo sekvence ponavljanja od CRISPRdb baze podataka, ili, kada informacije nisu bile dostupne, predvideli smo sekvence ponavljanja koristeći CRISPRfinder softver. U našem prethodnom ispitivanju, pokazali smo eksperimentalno da smer transkripcije niza ponavljanje Spacer u poređenju sa onim od cas operona varira među lokusima. Ovde je analiza RNK sekvenciranja potvrdila to zapažanje. U nekim analiziranim lokusima, naime u F. novicida, N. meningitidis i C. jejuni, niz ponavljanja Spacera se transkribuje u suprotnom smeru cas operona (pogledati paragraf „Duboko RNK sekvenciranje validira eksprimiranje novih tracrRNK ortologa“ i Slike 33 i 34) dok su kod S. pyogenes, S. mutans, S. thermophilus i L. innocua, niz i cas operon transkribovani u istom pravcu. Ovo su jedini dostupni podaci o eksprimiranju tipa II ponavljanja Spacer nizova. Da bi predvideli pravac transkripcije drugih nizova ponavljanja Spacera, razmotrili smo prethodno posmatranje prema kome se poslednja ponavljanja nizova obično mutiraju. Ova primedba je u saglasnosti sa trenutnim modelom Spacer dobijanja, u kom se tipično prvi niz ponavljanja duplicira prilikom ubacivanja Spacer sekvence tokom faze adaptacije. Za 37 ponovljenih Spacer nizova, mogli smo identifikovati mutirano ponavljanje na predloženom kraju nizova. Uočili smo da će predviđena orijentacija transkripcije za N. meningitidis i C. jejuni ponavljanje Spacer niza biti suprotna eksperimentalnoj orijentaciji (RNK sekvenciranje i Northern blot analiza). Kako predviđena orijentacija nije konzistentna unutar klastera, i kako smo u većini slučajeva mogli da otkrijemo potencijalne promotere na oba kraja nizova, smatrali smo da je transkripcija nizova ponavljanja Spacera u istom pravcu kao i transkripcija cas operona, ako nije drugačije validirano.
[0550] Slika 34 prikazuje ko-procesuiranje tracrRNK i pre-crRNK u odabranim tip II CRISPR Cas sistemima. Prikazane su CRISPR lokus arhitekture sa potvrđenim položajima i pravcima tracrRNK i pre-crRNK transkripcije. Gornje sekvence, pre-crRNK ponavljanje; donje sekvence, tracrRNK bazno uparivanje sekvenci sa crRNK ponavljanjem. Lokacije za obradu značajne RNK kao što je otkriveno RNK sekveciranjem obeležene su strelicama. Za svaki lokus, veličine strelica predstavljaju relativne količine izvučenih 5' i 3' krajeva (pogledati i Sliku 37).
[0551] Slika 37 prikazuje sve ortologe tracrRNK i zrele crRNK koja se dobijaju sekvenciranjem za proučavane vrste bakterija, uključujući koordinate (regije od interesa) i odgovarajuće sekvence cDNK (5' do 3'). Strelice predstavljaju transkripcioni pravac (linija). Broj cDNK čitanja (izračunat pomoću SAMtools), brojevi pokrivenosti (procenat mapiranih čitaoca) i pretežni krajevi povezani sa svakim transkriptom su naznačeni. Prikazani su brojevi čitanja koji počinju ili se zaustavljaju na svakoj poziciji nukleotida oko 5' i 3' krajeva svakog transkripta. Prikazane su veličine svakog crnog zrelog oblika. Broj koji je dodeljen za svaku vrstu crRNK odgovara poziciji sekvence Spacera u pre-crRNK, prema CRISPRdb. Broj koji je dodijeljen za svaku vrstu tracrRNK odgovara različitim oblicima istog transkripta.
[0552] Zatim smo pregledali izabrane CRISPR-Cas lokuse uključujući sekvence koje se nalaze na 1 bg uzvodno i nizvodno na obe linije za moguće ponovljene sekvence koje nisu pripadale ponavljanje Spacer nizu, dozvoljavajući do 15 neusklađenosti. U proseku smo pronašli jednu do tri degenerisane ponavljajuće sekvence po lokusu koje bi odgovarale anti-ponavljanjima tracrRNK ortologa i odabrali sekvence locirane unutar intergenskih regiona. Predložena antiponavljanja bila su pronađena u četiri tipičea lokalizacije: uzvodno od cas9 gena, u regiji između Cas9 i Cas1, i uzvodno ili nizvodno od ponavljanje Spacer niza (Slika 33). Za svaku pronađenu sekvencu, validirali smo stepen baznog uparivanja formiranog između ponavljanja i antiponavljanja (Slika 44) predviđanjem moguće interakcije RNK: RNK i fokusiranjem posebno na kandidate sa dužim i savršenim regionom komplementarnosti koji formiraju optimalnu dvostruki struktura za obradu RNKaze III. Da bi predvideli promotere i transkripcijske terminatore na kojima se pojavljuje anti-ponavljanje, podesili smo početne i završne stranice za transkripciju da se uključe u regiju koja se nalazi maksimalno 200 nt uzvodno i 100 nt nizvodno od anti-ponavljajuće sekvence, respektivno, na osnovu naših prethodnih opservacija<26>. Kao što je već pomenuto, nedostaju eksperimentalne informacije o pravcu transkripcije većine ponavljanje Spacer niz sistema tipa II. Algoritmi predviđanja promotera in silico često daju lažne pozitivne rezultate i ukazuju na značajne promotere koji bi doveli do transkripcije nizova ponovljenih razmaka sa obe strane. U nekim slučajevima nismo mogli predvideti transkripcijske terminatore, iako bi eksprimiranje tracrRNK ortologa moglo da se validira eksperimentalno, kao što je to slučaj sa C. jejuni (pogledati paragraf „Duboko RNK sekvenciranje validira eksprimiranje novih tracrRNK ortologa“). Predlažemo da razmotrimo programe i transkripcijska terminatorska predviđanja samo kao podršku, ali ne i suštinski, korak smernica opisanih gore.
[0553] Slika 44 prikazuje predviđeno ponavljanje cr-RNK:tracrRNK anti- ponavljanje bazno uparivanje u odabranim vrstama bakterija. CRISPR lokusi pripadaju tip II (Nmeni/CASS4) CRISPR-Cas sistemu. Nomenklatura je prema CRISPR bazi podataka (CRISPRdb). Treba imati na umu da S. thermophilus LMD-9 i W. succinogenes sadrže dva tipa lokusa. Gornja sekvenca, pre-crRNK sistemu konsenzus sekvenca (5' do 3'); donja sekvenci, tracrRNK homologna sekvenca kaljena za ponavljanje (anti-ponavljanje, 3' do 5'). Treba imati na umu da je ponuđeni ponovljeni niz zasnovan na pretpostavci da je CRISPR ponavljanje Spacer niz transkribovan iz istog pojasa kao cas operon. Za sekvence koje su eksperimentalno validirane u ovoj studiji, uzeti su u obzir podaci za sekvenciranje RNK da bi se utvrdilo bazno uparivanje. Pogledati Sliku 33.<d>Dva moguća anti-ponavljanja su identifikovana u F. tularensis subsp. novicida, W. succinogenes i gamma proteobacterium HTCC5015 tip II-A lokusima. Uparivanje gornje sekvence, antiponavljanje unutar značajne lider sekvence; uparivanje nižih sekvenci, anti-ponavljanje nizvodno od ponavljanje Spacer niza. Pogledati Sliku 33.<e>Dva moguća anti-ponavljanja su identifikovani u S. wadsworthensis tip II-A lokusu. Uparivanje gornje sekvence, anti-ponavljanje; uparivanje donje sekv sekvence encea, anti-ponavljanje u značajnoj lider sekvenci. Pogledati Sliku 33.<f>Dva moguća anti-ponavljanja su identifikovana u L. gasseri tip II-B lokusu. Uparivanje gornje sekvence, anti-ponavljanje uzvodno od cas9; uparivanje donje sekvence, anti-ponavljanje između cas9 i cas1 gena. Pogledati Sliku 33.<g>Dva moguća anti-ponavljanja su identifikovana u C. jejuni tip II-C lokusu. Uparivanje gornje sekvence, anti-ponavljanje uzvodno od cas9; Uparivanje donjih sekvenci, anti-ponavljanje nizvodno od ponavljanje Spacer niza. Pogledati Sliku 33.<h>Dva moguća anti-ponavljanja su identifikovana u R. rubrum tip II-C lokusu. Uparivanje gornje sekvence, anti-ponavljanje nizvodno od ponavljanje Spacer niza; uparivanje niže sekvence, anti-ponavljanje uzvodno od cas1. Pogledati Sliku 33.
Veliki broj ortologa tracrRNK
[0554] Predvideli smo značajne tracrRNK ortologe za 56 od 75 lokusa izabranih ranije. Rezultati predviđanja su prikazani na Slici 33. Kao što je već pomenuto, pravac transkripcije tracrRNK naznačen na ovoj Slici je hipotetički i zasnovan je na naznačenom pravcu transkripcije ponavljanje Spacer niza. Kao što je ranije navedeno, sekvence koje kodiraju značajne tracrRNK ortologe su identifikovane uzvodno, unutar i nizvodno od Cas operona, kao i nizvodno od ponavljanje Spacer nizova, uključujući pretpostavljene lider sekvence, koje se obično nalaze u tip II-A lokusima (Slika 33). Međutim, primetili smo da anti-ponavljanja slične lokalizacije unutar CRISPR-Cas lokusa mogu da se transkribuju u različitim pravcima (posmatrano prilikom poređenja npr Lactobacillus rhamnosus i Eubacterium rectale ili Mycoplasma mobilne i S. pyogenes ili N. meningitidis) (Slika 33). Značajno, lokusi grupisani u okviru istog subklastera stabla vodiča Cas9 dele zajedničku arhitekturu u odnosu na poziciju gena za kodiranje tracrRNK. Utvrdili smo anti-ponavljanja oko ponavljanje Spacer niza u tip II-A lokusu, a najviše uzvodno od cas9 gena u tipovima II-B i II-C sa nekoliko značajnih izuzetaka za značajne tracrRNK koje se nalaze između cas9 i cas1 u tri različita subklastera tipa II-B.
Neki tip II CRISPR-Cas lokusi imaju defektne ponavljanje Spacer nizove i/ili tracrRNK ortologe
[0555] Za šest tip II lokusa (Fusobacterium nucleatum, Aminomonas paucivorans, Helicobacter mustelae, Azospirillum sp., Prevotella ruminicola i Akkermansia muciniphila) identifikovali smo potencijalna anti-ponavljanja sa slabim uparivanjem baza sa ponovljenim sekvencama ili se nalazi unutar otvorenih okvira čitanja. Značajno, u ovim lokusima, slabo anti-ponavljanje u okviru otvorenog okvira čitanja gena kodiranog ATPazom u A. paucivoransu, snažno anti-ponavljanje unutar prvih 100 nt cas9 gena u Azospirillum sp. B510 i snažno preklapanje anti-ponavljanja sa cas9 i cas1 u A. muciniphilu su identifikovani (Slika 33). Za dvanaest dodatnih lokusa (Peptoniphilus duerdenii, Coprococcus catus, Acidaminococcus intestini, Catenibacterium mitsuokai, Staphylococcus pseudintermedius, Ilyobacter polytropus, Elusimicrobium minutum, Bacteroides fragilis, Acidothermus cellulolyticus, Corynebacterium diphteriae, Bifidobacterium longum i Bifidobacterium dentium), nismo mogli da otkrijemo nikakvo pretpostavljeno antiponavljanje. Ne postoje dostupne informacije o eksprimiranju i obradi pre-crRNK u ovim CRISPR-Cas lokusima. Stoga, funkcionalnost tip II sistema u odsustvu jasno definisanog ortologa tracrRNK ostaje da se reši. Za sedam analiziranih lokusa nismo mogli da identifikujemo nijedan ponavljanje Spacer niz (Parasutterella excrementihominis, Bacillus cereus, Ruminococcus albus, Rhodopseudomonas palustris, Nitrobacter hamburgensis, Bradyrhizobium sp. i Prevotella micans) (Slika 33), a kod tri (Bradyrhizobium sp. BTAi1, N. hamburgensis i B. cereus) otkrili smo cas9 kao jedinstveni gen bez drugih cas gena u blizini. Za ova tri lokusa, nismo uspeli da predvidimo bilo kakvu malu RNK sekvencu uzvodno ili nizvodno od cas9 gena. U slučaju R. albus i P. excrementihominis, genomski kontigent koji sadrži cas9 je prekratak da bi se omogućilo predviđanje ponavljanje Spacer niza.
Duboko RNK sekvenciranje validira eksprimiranje novih tracrRNK ortologa
[0556] Kako bi proverili in silico tracrRNK predviđanja i odredili tracrRNK:pre-crRNK obrasce koprocesuiranja, RNK iz izabranih Gram-pozitivnih (S. mutans i L. innocua) i gram-negativnih (N. meningitidis, C. jejuni i F. novicida) bakterija analizirane su dubokim sekveciranjem. Dobijene su sekvence tracrRNK ortologa i procesuiranih crRNK (Slika 36 i Slika 37). U skladu sa prethodno objavljenim diferencijalnim podacima o sekvenciranju tracrRNK u S. pyogenes<26>, tracrRNK ortolozi su bili visoko zastupljeni u bibliotekama, u rasponu od 0,08 do 6,2% od ukupnih mapiranih čitanja. Obrađene tracrRNK su takođe bile uvećem izobilju od primarnih transkripata, u rasponu od 66% do više od 95% ukupne količine čitanja tracrRNK (Slika 36 i Slika 37).
[0557] Slika 36 prikazuje eksprimiranje bakterijskih tracrRNK ortologa i crRNK otkrivenih dubokim sekvenciranjem RNK. Profili eksprimiranja tracrRNK ortologa i crRNK odabranih bakterijskih vrsta su predstavljeni duž odgovarajućih genoma pomoću stubova na grafikonu (Slike snimljene saIntegrative Genomics Viewer (IGV) tool). Campylobacter jejuni (GenBank: NC_002163), Francisella novicida (GenBank: NC_008601), Neisseria meningitidis (GenBank: NC_003116), Listeria innocua (GenBank: NC_003212) i Streptococcus mutans (GenBank: NC_004350). Genomske koordinate su date.<a>Pokrivenost sekvenci izračunata pomoću BEDTools-Version-2.15.0 (skala data u broju čitanja).<B>Distribucija citanja počinje (5') i završava se (3') na svakom položaju nukleotida (skala data u broju čitanja). Gornji paneli odgovaraju sa transkriptima iz pozitivnih linija i donji paneli odgovaraju transkriptima iz negativnih linija. Negativne vrednosti pokrivanja i vrhovi prikazani ispod osa ukazuju na transkripciju iz negativne linije genoma. Predominantni 5'- i 3'-krajevi čitanja su prikazani za sve RNK. Imajte na umu da s obzirom na nizak kvalitet L. innocua cDNK biblioteke, čitanja su skraćena za crRNK, i akumulacija čitanja na 3' kraju tracrRNK se posmatra, verovatno zbog degradacije RNK.
[0558] Za procenu 5' krajeva tracrRNK primarnih transkripta, analizirali smo obilje svih 5' kraj čitanja od tracrRNK i preuzeli najistaknutija čita uzvodno ili u blizini 5' kraja predviđenih sekvenci anti-ponavljanja. 5' krajeva tracrRNK ortologa su dalje potvrđeni korišćenjem algoritma za predviđanje promotera. Identifikovani 5' krajevi tracrRNK iz S. mutans, L. innocua i N. meningitidis u korelaciji su i sa in silico predviđanjem i sa Northern blot analizom tracrRNK eksprimiranja<26>. Najistaknutiji 5' kraj C. jejuni tracrRNK je identifikovan u sredini sekvence antiponavljanja. Pet nukleotida uzvodno, detektovan je dodatni značajni 5' kraj koji je u korelaciji sa in silico predviđanjem i pruža duži niz interakcije sa CRISPR ponovljenom sekvencom. Izvukli smo relativno nisku količinu čitanja iz biblioteke F. novicida koja se skoro isključivo odnosila na obrađene transkripte. Analiza veoma male količine čitanja primarnih transkripta dala je 5' kraj koji odgovara snažnom in silico predviđanju promotera. Northern blot sondiranje F. novicida tracrRNK dalje potvrđuje validnost predviđanja koja pokazuju nizak broj transkripta dužine oko 90 nt. Rezultati su navedeni u Tabeli 2. Za sve ispitivane vrste, osim N. meningitidis, primarni tracrRNK transkripti su identifikovani kao pojedinačne male vrste RNK od 75 do 100 nt u dužini. U slučaju N. meningitidis, našli smo dominantni primarni tracrRNK oblik ~110 nt i pretpostavljeni duži transkript ~170 nt predstavljen veoma niskom količinom čitanja i ranije otkrivena kao slab pojasa Northern blot analizom.
Tabela 2. Odabrani tracrRNA ortolozi
<a>tracrRNK ortolozi od S. Thermophilus, P. Multocida i M. mobile su predviđeni in silico.
<B>RNK-sekvenca otkrivena RNK sekvenciranjem (Tabela S3); prvo čitanje, prvi 5'-kraj položaj dobijen sekvenciranjem; najčešći, višak 5'-kraj prema podacima RNK sekvence; predviđen, in silico predviđanjem početnog mesta transkripcije; podvučeno, 5'-kraj izabran za primarni tracrRNK da bude poravnat.
<c>Procenjen 3'-kraj prema podacima RNK sekvence i predviđanju transkripcionog terminatora.
[0559] Ispitali smo procesuirane transkripte tracrRNK analizom obilnih trakrRNK 5' krajeva u okviru predviđene anti-ponavljajuće sekvence i obilje zrelih crRNK 3' krajeva (Slike 34 i 45). U svim vrstama smo identifikovali istaknute 5' krajeve tracrRNK ortologa koji bi mogli biti rezultat ko-procesuiranja tracrRNK:pre-crRNK ponovljenih dupleka od strane RNKaze III. Takođe smo identifikovali obrađene 5'-krajeve crRNK koje su najverovatnije posledica drugog događaja sazrevanja, uz pretpostavljeno skraćivanje, dosledno sa prethodnim opservacijama. Značajno, u tesno povezanim RNK parovima S. pyogenes, S. mutans i L. innocua, posmatrali smo istu mesto obrade oko G: C baznog para u sredini anti-ponavljajuće sekvence. I kod S. mutans i kod L. innocua, otkrili smo dodatne istaknute tracrRNK 5' krajeve i crRNK 3' krajeve koji mogu da ukazuju na dalja skraćivanja tracrRNK:crRNK dupleksa, gde je 3'-kraj crRNK skraćen dodatno do već pomenutog skraćivanja 5' -kraja, prateći RNKaza III katalizovan prvu događaj procesuiranja. Slično tome, u C. jejuni smo našli samo malu količinu crRNK 3' krajeva koji bi se uklapali u RNKaza III obrasce procesuiranja i izvukli odgovarajuće 5' krajeve procesuiranje tracrRNK. Dakle, značajno skraćivanje tracrRNK:crRNK dupleksa posle početnog cepanja pomoću RNKaze III će rezultovati kraćim ponavljanjem izvedenim delom u zrelom crRNK, proizvodeći kraći tracrRNK:crRNK dupleksa stabilizovane trostrukim G:C uparivanjem baza za interakciju sa endonukleazom Cas9 i kasnije cepanje ciljanih DNK. N. meningitidis RNK dupleks izgleda da je procesuiranna dva primarna mesta dalje do 3' kraja CRISPR ponavljanje, što dovodi do dužeg ponavljanjem izvedenog dela u zreloj crRNK i stabilnim RNK: RNK interakcijama uprkos centralnoj izbočini u okviru dupleksa. Zanimljivo je da se tracrRNK:pre-crRNK dupleks od F. novicida izgleda cepa u regiji niske komplementarnosti i neki od u izobilju dobijenih 5' krajeva tracrRNK sugerišu njeno dalje skraćivanje bez pridruženog skraćvanja crRNK. Razlike u veličinama primarnog transkripta i na lokaciji mesta za procesuiranje rezultiraju različitim dužinama procesuiranih tracrRNK u rasponu od ~65 do 85 nt. Koordinate i veličine istaknutih procesuiranih transkripta tracrRNK prikazani su u Tabeli 2 i na Slici 37. Primećeni obrasci procesuiranja tracrRNK i crRNK su u saglasnosti sa prethodno predloženim modelom dva događaja sazrevanja. Predloženo dalje smanjenje nekih tracrRNK 5'-krajeva i crRNK 3'-krajeva moglo bi proizići iz drugog događaja sazrevanja ili alternativno, biti artefakat za pripremu biblioteke cDNK ili sekvenciranje RNK. Priroda ovih procesa ostaje da se istraži.
Sekvence tracrRNK ortologa su veoma različite
[560] Takođe su određene sličnosti sekvence odabranih tracrRNK ortologa. Izvršili smo više poravnavanja sekvenci primarnih tracrRNK transkripata S. pyogenes (89 nt oblik samo), S. mutans, L. innocua i N. meningitidis (110 nt oblik samo), S. thermophilus, P.multocida and M. mobile (Tabela 2, Slika 35). Uočili smo visoku raznovrsnost u tracrRNK sekvencama, ali značajno očuvanje sekvenci iz tesno povezanih CRISPR-Cas lokusa. TracrRNK od L. innocua, S. pyogenes, S. mutans i S. thermophiles dele u proseku 77% idenntičnosti i tracrRNK od N. meningitidis i P. multocida dele 82% idenntičnosti prema parnom poravnanju. Prosječan identitet analiziranih tracrRNK sekvenci je 56%, uporediv sa identitetom slučajnih RNK sekvenci. Ovo zapažanje dodatno potvrđuje da se predviđanje traktronskih ortologa zasnovanih na sličnosti sekvence može izvršiti samo u slučaju blisko povezanih lokusa. Takođe smo tražili mogućnost očuvanja tracrRNK strukture, ali nismo našli nikakvu značajnu sličnost osim jedne ko-varijacije i očuvane transkripcijske terminatorske strukture (Slika 35).
[0561] Slika 35 prikazuje sekvencijalnu raznolikost tracrRNK ortologa. Višestruko poravnjanje tracrRNK sekvence. S. thermophilus i S. thermophilus2, tracrRNK povezana sa SEQ ID NO: 41 i SEQ ID NO: 40 Cas9 ortolozi, u skladu sa tim. Crno, visoko očuvano; tamno sivo, očuvano; svetlosivo, slabo očuvano. Predviđena konsenzusna struktura je prikazana na vrhu poravnanja. Strelice ukazuju na nukleotidne kovarijacije. S. pyogenes SF370, S. mutans UA159, L. innocua Clip11262, C. jejuni NCTC 11168, F. novicida U112 i N. meningitidis Z2491 tracrRNK su potvrđene od strane RNK sekveciranja i Northern blot analize. S. thermophiles LMD-9 tracrRNK je validiran analizom Northern blot. P. multocida Pm70 tracrRNK je predviđena od velike sličnosti CRISPR-Cas lokusa sa onim od N. meningitidis A Z2491. M. mobile 163K tracrRNK je predviđena in silico od jakih predviđanja transkripcionog promotera i terminatora.
Primer 4: Druga svrha CRISPR kao RNK-navođena platforma za sekvenciono-specifičnu kontrolu eksprimiranja gena
[0562] Regulacija ciljanih gena široke razmere je moćna strategija za ispitivanje, uznemiravanje i inženjering ćelijskih sistema. Pronalazači su razvili nov postupak za kontrolu eksprimiranja gena, zasnovan na Cas9, RNK-navođenoj DNK endonukleazi od tip II CRISPR sistema. Ovaj primer pokazuje da katalitički mrtav Cas9, koji nema aktivnost endonukleaze, kada je koeksprimiran sa vodičem RNK, generiše kompleks za prepoznavanje DNK koji može posebno ometati transkripciono izduženje, vezivanje RNK polimeraze ili vezivanje transkripcionog faktora. Ovaj sistem, koji se zove CRISPR interferencija (CRISPRi), može efikasno umanjiti eksprimiranje ciljanih gena kod Escherichia coli bez ikakvih otkrivenih efekata van cilja. CRISPRi se može koristiti za suzbijanje više ciljanih gena istovremeno, i njegovi efekti su reverzibilni. Pored toga, sistem se može prilagoditi za represiju gena u ćelijama sisara. Ova RNK-navođena platforma za prepoznavanje DNK pruža jednostavan pristup selektivno uznemiravajućem eksprimiranje gena na skali genoma.
MATERIJALI I POSTUPCI
Linije i medijum
[563] Escherichia coli K-12 linija MG1655 je korišćen kao linija domaćin za merenja fluorescencije in vivo. Za sve eksperimente sekvenciranja korišćena je linija izvedena od E. coli MG1655 koja endogeno eksprimira varijantu RNKP-a sa obeležjem epitopa 3x-FLAG vezan za C-terminalni kraj podjedinice RpoC. EZ bogato definisani medijum (EZ-RDM, Teknoka) korišćen je kao medijum rasta za in vivo fluorescencijske analize. Genetska transformacija i verifikacija transformacije izvršeni su standardnim protokolima, koristeći AmpR, CmR ili KanR gene kao selektivne markere.
Konstrukcija plazmida i kloniranje genoma E. Coli
[0564] Cas9 i dCas9 geni su klonirali iz prethodno opisanih vektora pm806 i pm841, respektivno. Geni su PCR pojačani i ubačeni u vektor koji sadrži promoter anhidrotetraciklina (aTc), PLtetO-1, marker koji se može odabrati od hloramfenikola i poreklo p15A replikacije. Šablon sgRNK je kloniran u vektor koji sadrži minimalni sintetički promoter (J23119) sa anotiranim početnim mestom transkripcije, ampicilin markerom koji se može izabrati i poreklom replikacije ColE1. Inverzni PCR je korišćen za generisanje sgRNK kaseta sa novim komplementarnim regijama od 20 bp. Da bi se geni fluorescentnih reportera ubacili u genome E. coli, gen fluorescencije je prvo kloniran na ulazni vektor, koji je tada PCR amplifikovan da generiše linearizovane fragmente DNK koji sadrže nsfA 5' / 3' UTR sekvence, fluorescentni gen i KanR selektabilan marker. E. coli MG1655 linija transformisana je temperaturno osetljivim plazmidom pKD46 koji sadrži λ-Red rekombinacione proteine (Ekso, Beta i Gama). Ćelijske kulture su gajene na 30°C do OD (600 nm) od 0,5, i 0,2% arabinoze je dodato da indukuje eksprimiranje λ-Red rekombinacionih proteina tokom 1 sata. Ćelije se sakupljaju na 4°C i koriste se za transformaciju linearizovanih DNK fragmenata elektroporacijom. Ćelije koje sadrže ispravne umetke genoma odabrane su pomoću 50 mg/mL kanamicina.
Protočna citometrija i analiza
[0565] Linije su kultivisane u EZ-RDM koji sadrži 100 mg/mL karbenicilina i 34 mg/mL hloramfenikola u 2mL 96-komoričnim dubokim pločama (Kostar 3960) tokom noći na 37°C i 1200r.p.m. Jedan ml ove kulture u toku noći je dodat u 249 mL svežeg EZ-RDM sa istim koncentracijama antibiotika sa 2 mM aTc dopunjenim da indukuje proizvodnju dCas9 proteina. Kada su ćelije porasle u srednju fazu (~4 sata), nivoi fluorescentnog proteina su određeni pomoću LSRII protočnog citometra (BD Biosciences) opremljenog sa samplerom sa visokim protokom. Ćelije su uzorkovane sa niskim protokom dok se ne prikupi najmanje 20.000 ćelija. Podaci su analizirani pomoću FCS Ekpress (De Novo Software) skupljanjem na poligonalnoj regiji koja sadrži 60% populacije ćelija na prednjoj strani razbacivanja. Za svaki eksperiment izmerene su tri kulture, i njihova standardna devijacija je obeležena kao granica greške.
Analiza β-galaktozidaze
[0566] Za objavljanje analize β-glaktozidaze, 1 ml kulture tokom noći, pripremljene kako je gore navedeno, dodato je u 249 mL svežeg EZ-RDM sa istim koncentracijama antibiotika sa 2 mM aTc, sa ili bez 1 mM izopropil β-D-1-tiogalaktopiranozida (IPTG). Ćelije su gajene do srednje faze. LacZ aktivnost od 100 uL ove kulture izmerena je pomoću kompleta za test β-galaktozidaze (Pierce) prema uputstvima.
Ekstrakcija i prečišćavanje ukupne RNK
[0567] Za svaki uzorak, monoklonska kultura E. coli je uzgajana na 37°C od OD (600 nm) 0,1 u 500 ml EZ-RDM do rane faze (OD 0,45 ± 0,05), pri čemu Ćelije su sakupljene filtriranjem preko 0,22 mm nitroceluloznog filtera (GE) i zamrznute u tečnom azotu, kako bi se istovremeno zaustavili svi transkripcijski napretci. Zamrznute ćelije (100 mg) su pulverizovane na mešavini Qiagen TissueLyser II 6 puta na 15 Hz tokom 3 min u prisustvu 500 ml zamrznutog pufera za lizu (20 mM Tris pH 8, 0,4% Triton X-100, 0,1% NP- 40, 100 mM NH4Cl, 50 U/mL SUPERaze•In (Ambion) i 1x koktela inhibitora proteaze (Complete, EDTA-free, Roche), dopunjavano sa 10 mM MnCl2i 15 mM Tagetin transkripcionim inhibitorom (Epicenter).
[0568] Lizat je resuspendovan na ledu pipetiranjem. RQ1 DNaze I (ukupno 110 U, Promega) dodato je i inkubirano 20 min na ledu. Reakcija je ugašena sa EDTA (25 mM final), i lizat je razblažen na 4°C centrifugiranjem na 20,000 g tokom 10 min. Lizat je natovaren na kolonu PD MiniTrap G-25 (GE Healthcare) i eluiran je puferom za lizu, dopunjenim sa 1 mM EDTA.
Ukupno mRNK prečišćavanje
[0569] Ukupna RNK je prečišćena iz pročišćenog lizata pomoću kompleta miRNeasy (Qiagen).
1 mg RNK u 20 mL 10 mM Tris pH 7 je pomešano sa jednakim zapreminom 2x alkalnog fragmentacionog rastvora (2 mM EDTA, 10 mM Na2C03, 90 mM NaHC03, pH 9.3) i inkubirano tokom ~ 25 minuta na 95°C kako bi se generisali fragmenti u rasponu od 30-100 nt. Reakcija fragmentacije je zaustavljena dodavanjem 0,56 mL rastvora za precipitaciju leda (300 mM NaOAc pH 5,5 plus GlicoBlue (Ambion)), i RNK je prečišćena standardnom izopropanolnom precipitacijom. Fragmentovana mRNK je zatim defosforilizovana u reakciji od 50 mL sa 25 U T4 PNK (NEB) u 1x PNK puferu (bez ATP) plus 0,5 U SUPERaze•In i precipitirana sa GlicoBlue pomoću standardnih postupaka precipitacije izopropanola.
Nascentno RNK prečišćavanje
[0570] Za nascentno RNK pročišćavanje, pročišćeni lizat je dodat u 0,5 mL anti-FLAG M2 afinitetnog gela (Sigma Aldrich) kao što je prethodno opisano. Afinitetni gel je dva puta ispran puferom za lizu, dopunjenim sa 1 mM EDTA, pre inkubacije sa razblaženim lizatom na 4°C tokom 2,5 sata sa nutacijom. Imunoprecipitacija je isprana 4 x 10 ml sa puferom za lizu dopunjenim sa 300 mM KCI, i vezani NAPR je eluiran dva puta sa puferom za lizu sa dodatkom 1 mM EDTA i 2 mg/mL 3x-FLAG peptida (Sigma Aldrich). Nascentna RNK je prečišćena iz eluata pomoću miRNeasy kompleta (Qiagen) i pretvorena u DNK pomoću prethodno uspostavljenog protokola za generisanje biblioteke.
Priprema DNK biblioteke i DNK sekvenciranje
[0571] Biblioteka DNK je sekvencirana na Illumina HiSeq 2000. Čitanja su obrađena pomoću paketa HTSeq Python i drugog prilagođenog softvera napisanog u Pythonu. 3'-kraj sekvenciranog transkripta je usklađen sa referentnim genomom koristeći Bowtie („bowtie-bio“ pre „.sourceforge.net“) i RNKP profile generisane u MochiView („johnsonlab.ucsf“ pre „.edu/mochi .html“).
Dizajn plazmida i konstrukcija CRISPRi u ljudskim ćelijama
[0572] Sekvenca koja kodira sisarskim kodonom optimizovan Streptococcus pyogenes Cas9 (DNK 2.0) je duzionisana sa tri C-terminalne SV40 nuklearne lokalizacijske sekvence (NLS) ili za tagBFP koju okružuju dva NLS. Koristeći standardno kloniranje bez ligacije, klonirali smo ova dva fuziona proteina u MSCV-Puro (Clontech). Vodič sgRNK su eksprimirani korišćenjem lentiviralnog U6 baziranog vektora eksprimiranja izvedenog iz pSico koji ko-eksprimira mCherry iz CMV promotera. Plazmidi eksprimiranja sgRNK su klonirani stavljanjem kaljenih prajmera u vektor eksprimiranja zasnovan na lentiviralnom U6 koji je digestovan od strane BstXI i Xhol.
Kultura ćelija, DNK transfekcije i merenja fluorescencije za CRISPRi u ljudskim ćelijama
[0573] HEK293 ćelije su održavane u Dulbeckovom modifikovanom orlovskom medijumu (DMEM) u 10% FBS, 2 mM glutamina, 100 jedinica/mL streptomicina i 100mg/ml penicilina. HEK293 su zaraženi sa GFP koji eksprimira MSCV retrovirusa korišćenjem standardnih protokola i sortirani protočnom citometrijom koristeći BD FACS Aria2 za stabilno GFP eksprimiranje. GFP koji eksprimiraju HEK293 ćelije su privremeno transfektovani upotrebom Transit-LT1 reagensa za transfekciju (Mirus) sa protokolom preporučenim od proizvođača u 24-komorčnim pločama korišćenjem 0,5 mg dCas9 plazmida eksprimiranja i 0,5 mg RNK plazmida eksprimiranja (0,25 mg GFP reporter plazmida za Sliku 45B). 72 sata posle transfekcije, ćelije su tripsinizovane do suspenzije pojedinačne ćelije. U6 vektor sadrži konstitutivni CMV promoter koji pokreće mCherry gen. GFP eksprimiranje je analizirana korišćenjem BD LSRII FACS mašine skupljanjem na mCherry pozitivnih populacija (> 10 puta svetliji mCherry u odnosu na negativne ćelije za kontrolu).
Dizajnirane RNK
[0754] sgRNK dizajni korišćeni na slikama: samo regije sa 20 odgovarajućih nukleotida (segment ciljanja DNK) su navedene (ako nije naznačeno drugačije):
mRFP-ciljajuće sgRNK korišćene na Slici 40C (SEQ ID NOs:741-746);
Promoter-ciljajuće sgRNK korišćene na Slici 40D (SEQ ID NOs:747-751);
Ciljana promoter sekvenca na Slici 40D (SEQ ID NO:752);
mRFP-ciljajuće sgRNK korišćene na Slici 43B (SEQ ID NOs:753-760);
sfGFP-ciljajuće sgRNK (gfp) korišćene na Slici 42B (SEQ ID NO:761);
sfGFP-ciljajuće sgRNK korišćene na Slici 43B (SEQ ID NOs:762-769);
Dvostruki-sgRNK eksperimenti ciljanja na Slici 43F i Slici 51 (SEQ ID NOs:770-778);
lac operon-ciljajuće sgRNK korišćene na Slici 44B (SEQ ID NOs:779-787); i
EGFP-ciljajuće sgRNK korišćene na Slici 45 (SEQ ID NOs:788-794).
Tabela 3. Sekvence korišćene na slikama Primera 4 (navedene gore)
REZULTATI
[0575] Sistem CRISPR (grupisana pravilno razmaknuta kratka palindromska ponavljanja) pruža novu potencijalnu platformu za regulaciju ciljanih gena. Oko 40% bakterija i 90% arhea poseduju CRISPR/CRISPR-pridružene (Cas) sisteme za pružanje otpora stranim DNK elementima. CRISPR sistemi koriste male RNK bazne parove kako bi ciljali i cepali strane elemente DNK na sekvencno-specifičan način. Postoje različiti CRISPR sistemi u različitim organizmima, a jedan od najjednostavijih je tip II CRISPR sistem od Streptococcus pyogenes: samo jedan gen koji kodira Cas9 protein i dve RNK, zrela CRISPR RNK (crRNK) i delimično komplementarni transdejstvujući RNK (tracrRNK), su neophodni i dovoljni za RNK-navođeno smirivanje stranih DNK (Slika 46). Sazrevanje crRNK zahteva tracrRNK i RNKazu III. Međutim, ovaj zahtev može se zaobići korišćenjem veštački stvorenog malog vodič RNK (sgRNK) koji sadrži dizajniran haprin koja imitira kompleks tracrRNK-crRNK. Bazno uparivanje između sgRNK i ciljane DNK uzrokuje dvostruke prekide (DSB) zbog endonukleazne aktivnosti Cas9. Vezivna specifičnost je određena od strane sgRNK-DNK baznog uparivanja i kratkog DNK motiva (Protospacer susedni motiv ili PAM, sekvenca: NGG) uporedo sa DNK komplementarnom regijom. Prema tome, CRISPR sistem zahteva samo minimalni skup dva molekula - Cas9 protein i sgRNK, te stoga ima potencijal da se koristi kao platforma za ciljanje gena nezavisna od domaćina. Pokazano je da se Cas9/CRISPR može koristiti za usmereno RNK-navođeno uređivanje gena (Slika 39A).
[0576] Slika 46 prikazuje mehanizam tipa II CRISPR sistema od S. pyogenes-a. Sistem se sastoji od skupa proteina povezanih sa CRISPR (Cas) i CRISPR lokusa koji sadrži niz ponavljajućih Spacer sekvenci. Sva ponavljanja su ista i svi Spaceri su različiti i komplementarni ciljanim DNK sekvencama. Kada ćelija bude zaražena stranim elementima DNK, CRISPR lokus će transkribovati u dugački transkript prekursor, koji će se razdvojiti na manje fragmente. Cepanje je posredovano transakcionom antisensnom RNK (tracrRNK) i domaćin RNKazom III. Posle cepanja, jedan pojedinačni protein, Cas9, prepoznaje i vezuje se za cepani oblik crRNK. Cas9 vodi crRNK u DNK i skenira molekul DNK. Kompleks se stabilizuje baznim uparivanjem između crRNK i ciljane DNK. U ovom slučaju, Cas9 uzrokuje dvostruke prekide DNK zbog aktivnosti nukleaze. Ovo obično uklanja srodne molekule DNK, a ćelije pružaju imunitet određenim populacijama DNK.
[0577] Slika 39 prikazuje dizajn CRISPR sistema interferencije (CRISPRi). (A) Minimalni sistem interferencije sastoji se od pojedinačnog proteina i dizajnirane sgRNK himere. sgRNK himera se sastoji od tri domena (upakovana regija): 20-nukleotidna (nt) komplementarna regija za specifično vezivanje DNK, ukosnica od 42 nt za vezivanje Cas9 (Cas9 drška) i 40-nt terminator transkripcije izveden iz S. pyogenes. Divlji tip Cas9 proteina sadrži aktivnost nukleaze. dCas9 protein je defektan u aktivnosti nukleaze. (B) Divlji tip Cas9 proteina se vezuje za sgRNK i formira protein-RNK kompleks. Kompleks se vezuje za specifične DNK ciljeve Votson-Krik baznim uparivanjem između sgRNK i DNK cilja. U slučaju divljeg tipa Cas9, DNK će se razdvojiti zbog nukleazne aktivnosti Cas9 proteina. U slučaju nuklearno defektnog Cas9, kompleks ometa odgovarajuću transkripciju.
Minimalni CRISPRi sistem se sastoji od pojedinačnog proteina i RNK i može efikasno da smiri inicijaciju transkripcije i izduženje
[0578] Da bi se primenila takva CRISPRi platforma u E. coli, divlji tip S. pyogenes Cas9 gena i sgRNK su eksprimirani od bakterijskih vektora da bi se odredilo da li bi sistem mogao perturbirati eksprimiranje gena u ciljanom lokusu (Slika 40A). S. pyogenes CRISPR sistem je ortogonalan za matični E. coli sistem. Cas9 protein se eksprimira iz anhidrotetraciklin (aTc)-inducibilnog promotera na plazmidu koji sadrži p15A replikaciono poreklo, a sgRNK se eksprimira iz minimalnog konstitutivnog promotera na plazmidu koji sadrži ColE1 replikaciono poreklo. Kao alternativna strategija, korišćen je katalitički mrtav Cas9 mutant (dCas9), koji je defektan u rastvoru DNK i pokazalo se da ovaj oblik Cas9 i dalje deluje kao jednostavni vezujući DNK kompleks sa RNK.
[0579] Slika 40 pokazuje da CRISPRi efikasno umanjuje transkripciono izduživanje i inicijaciju. (A) CRISPRi sistem se sastoji od inducibilnog Cas9 proteina i dizajniranog sgRNK himera. dCas9 sadrži mutacije RuvC1 i HNH domena nukleaze. Himera sgRNK sadrži tri funkcionalna domena kako je opisano na Slici 1. (B) Sekvenca dizajnirane sgRNK (NT1) i ciljane DNK. NT1 cilja nematričnu DNK vezu mRFP regije kodiranja. Prikazana je samo regija koja okružuje motiv baznog uparivanja (20-nt). Nukleotidi baznog uparivanja su numerisani i dCas9-vezujući ukosnica je obložen. PAM sekvenca je podvučena. (C) CRISPRi blokira izduženje transkripcije na specifičan način. Reporter sistem zasnovan na sintetičkom fluorescentnom sistemu koji sadrži mRFP-kodirajući gen je umetnut u E. coli MG1655 genom (nsfA lokus). Šest sgRNK koje se vezuju za bilo koje šablonske DNK ili ne-šablonske DNK linije su ko-eksprimirane sa dCas9 proteinom, sa efektima na ciljanu mRFP merenim in vivo fluorescencijskim testom. Samo sgRNK koje se vezuju za ne-šablonski DNK pokazale su smirivanje (10~300 puta). Kontrola pokazuje fluorescenciju ćelija sa dCas9 proteinom, ali bez sgRNK. (D) CRISPRi blokirana inicijaciju transkripcije. Pet sgRNK su dizajnirane da se vezuju za različite regione oko promotera E. coli (J23119). Mesto za početak transkripcije je obeleženo kao 1. Tačkasti oval prikazuje početni RNKP kompleks koji pokriva 7- bp regiju od -55 do 20. Samo sgRNK koje su ciljale regije unutar početnog kompleksa RNKP pokazali su represiju (P1P4). Za razliku od bloka produžavanja transkripcije, smirivanje je bilo nezavisno od ciljane DNK linije. (E) CRISPRi regulacija je bila reverzibilna. I dCas9 i sgRNK (NT1) su bili pod kontrolom aTc-inducibilnog promotera. Kultura ćelija je održavana tokom eksponencijalne faze. U vremenu T = 0, 1 mM aTc je dopunjeno ćelijama sa OD = 0,001. Represija ciljane mRFP je počela u roku od 10 min. Signal fluorescencije raspadnut je na način koji je u skladu sa rastom ćelija, što ukazuje na to da je raspad bio zbog deljenja ćelija. Za 240 min, fluorescencija je dostigla potpuno potisnut nivo. Na T = 370 min, aTc se ispere iz medijuma za rast i ćelije su razređene nazad na OD = 0,001. Fluorescencija je počela da se povećava posle 50 minuta, a trebalo je oko 300 minuta da se poveća na isti nivo kao i pozitivna kontrola. Pozitivna kontrola: uvek bez induktora; negativna kontrola: uvek sa 1 mM aTc induktorom. Rezultati fluorescencije u 2C, 2D i 2E predstavljaju prosek i SEM od najmanje tri biološke replikacije. Pogledati takođe Sliku 47 i Sliku 48.
[0580] SgRNK molekuli ko-eksprimirani sa Cas9 se svaki se sastoji od tri segmenta: 20-nukleotidna (nt) ciljano-specifična komplementarna regija, 42-nt Cas9 vezujući ukosnica (Cas9 drška) i 40-nt terminator transkripcije izveden iz S. pyogenes (Slika 40B). Reporter sistem zasnovan na crvenom fluorescentnom proteinu (mRFP), ubačen je u E. coli MG1655 genom.
[0581] Ko-eksprimiranje proteina divljeg tipa Cas9 i sgRNK (NT1) ciljana na mRFP kodirajuću sekvencu dramatično je smanjila efikasnost transformacije, verovatno zbog Cas9-indukovanih dvostrukih prekida na genomu (Slika 47A). Sekvenciranje nekoliko preživelih kolonija pokazalo je da su svi imali preuređivanje sekvence oko ciljane mRFP lokacije na genomu, što ukazuje na to da je bila jaka selekcija protiv eksprimiranja divljeg tipa Cas9 i sgRNK ciljanog na sekvencu domaćina. dCas9 mutantni gen (ne-cepanje), koji je sadržao dve mutacije mutiranja RuvC1 i HNH domena nukleaze(D10A i H841A), ublažili su ovu smrtnost, što je potvrđeno efikasnošću transformacije i stopama rasta E. coli (Slike 47A&B).
[0582] Slika 47 je vezana za Sliku 40 i pokazuje krive rasta kultura ćelija E. coli kotransformisane sa dCas9 i sgRNK. (A) Transformacijska efikasnost za transformaciju ćelija E. coli sa dva plazmida. Jedan plazmid sadrži sgRNK koja je ciljana na genomsku kopiju mRFP, a drugi plazmid sadrži divlji tip Cas9 ili dCas9. Kotransformacija divljeg tipa Cas9 i sgRNK je veoma toksična, što se može ublažiti korišćenjem dCas9. (B) sgRNK (NT1) je dizajniran da cilja na sekvencu kodiranja mRFP. Ko-eksprimiranje dCas9 i sgRNK nema skoro nikakvih efekata na stopu rasta ćelija, što ukazuje da je interakcija dCas9-sgRNK sa DNK dovoljno jaka da blokira RNK polimerazu, ali ne i DNK-polimerazu ili replikaciju ćelija. Rezultati predstavljaju prosek i SEM najmanje tri nezavisna eksperimenta.
[0583] Da bi se testiralo da li kompleks dCas9:sgRNK može dati visoko efikasnu represiju eksprimiranja gena, projektovani su sgRNK koja su komplementarni različitim regionima mRFP kodirajuće sekvence, bilo da su vezani za šablonsku DNK liniju ili ne-šablonsku DNK liniju. Rezultati su pokazali da su se sgRNK koje ciljaju ne-šablonsku DNK liniju pokazali efikasni za smirivanje gena (10 do 300 puta više od represije), dok su oni koji su ciljali šablonsku liniju pokazali malo efekta (Slika 40C). Sistem je pokazao slične efekte represije za gene koji su bili unutar gena E. coli ili na plazmidu sa visokom kopijom (Slika 48). Osim toga, ciljanje na regiju promotera takođe je dovelo do efektivnog smirivanja gena (Slika 40D). Ciljanje sgRNK na -35 kutiju značajno je oborilo eksprimiranje gena (P1, ~100 puta u odnosu na represiju), dok je ciljanje na druge susedne regije pokazalo umanjen efekat (P2-P4). Ciljane sekvence oko 100-bp uzvodno od promotera nisu pokazale efekte (P5). Za razliku od ciljanja na sekvencu kodiranja, kada se cilja promotera, efikasnost čišćenja je nezavisna od DNK veze; Ciljanje šablonskih ili nešablonskih linija je jednako efikasno (P2 i P3).
[0584] Slika 48 je vezana za Sliku 40C i pokazuje da CRISPRi može da smiri eksprimiranje reporter gena na plazmidu sa više kopija. MRFP gen je kloniran na p15A plazmid. Prisustvo dCas9 i mRFP-specifične sgRNK (NT1) snažno potiskuju mRFP (~300 puta). Efekat represije je sličan onom koji se primenjuje korišćenjem mRFP u genomu (Slika 40C). Smirivanje je jedino efikasno kada sgRNK deluje na ne-šablonsku DNK liniju, ali ne kod šablonske DNK linije (T1). Takođe, čišćenje je vrlo specifično, jer GFP-specifična 3 sgRNK (gfp) ne pokazuje nikakav efekat na eksprimiranje mRFP. Rezultati fluorescencije predstavljaju prosek i SEM od najmanje tri biološke replikacije.
Obaranje CRISPRi gena je inducibilno i reverzibilno
[0585] Za razliku od postupaka obaranja dena, jedna prednost korišćenja CRISPRi-zasnovanog obaranja eksprimiranja gena je činjenica da bi ova perturbacija trebalo da bude reverzibilna. Da bi testirali da li CRISPRi regulacija može biti indukovana i kasnije promenjena, i dCas9 i MRFP-specifični sgRNK (NT1) su stavljeni pod kontrolu ATC-inducibilnog promotera i objavljeno merenja toka vremena CRISPRi-posredovane regulacijom MRFP kao odgovor na induktore (Slika 40E). U nultoj vremenskoj tački, ćelijska kultura koja je porasla u ranu eksponencijalnu fazu bez induktora dopunjena je sa 1 mM aTc. Podaci pokazuju da sistem može brzo reagovati na prisustvo induktoja - signal fluorescentnog reporter proteina je počeo da se smanjuje u roku od 10 min od dodavanja induktivnog molekula. Zato što je MRFP protein stabilan, stopa pada fluorescentnog signala je ograničena razblaživanjem proteina usled rasta ćelija, kao što se vidi po sličnom vremenu udvostručavanja ćelija i gubitkom poluživota fluorescencije (oba ~36 min). Na 240 min, sve ćelije su bile ravnomerno potisnute na isti nivo kao i negativna kontrola. Na 420 min, induktor je ispran sa medijuma za rast i ćelije su razređene nazad na niži OD. Nakon kašnjenja od 50 min, mRFP fluorescencija je počela da se povećava. Potrebno je ukupno 300 minuta za jednoćelijsku fluorescenciju da se poveća na isti nivo kao i pozitivna kontrola. Zakašnjenje od 50 minuta najverovatnije je određeno brzinom obrtanja dCas9/sgRNK umanjeno za razblaženjem ćelisjkim rasta i podelom. Ukratko, ovi rezultati pokazuju da se efekti smirivanja dCas9-sgRNK mogu indukovati i obrnuti.
Sekvenciranje prirodno produžavajućeg transkripta (NET-Seq) potvrđuje da CRISPRi funkcioniše blokiranjem transkripcije
[0586] Izgleda da dCas9 funkcioniše kao RNK-navođen DNK vezivajući kompleks, koji bi mogao blokirati vezivanje RNK polimeraze (RNKP) tokom produžavanja transkripcije. Pošto nešablonska DNK linija deli isti identitet sekvence kao transkribovane mRNK, i samo sgRNK koja se vezuju za ne-šablonsku DNK liniju eksprimiraju smirivanje, ostalo je moguće da dCas9:sgRNK kompleks interakuje sa iRNK i menja njegovu translaciju ili stabilnost. Kako bi se razlikovale ove mogućnosti, nedavno opisan pristup sekvenciranja prirodno produžavajućeg transkripta (NET-Seq) je primenjen na E. coli, koji bi mogao da se koristi da globalno profiliše položaje produžavajućih RNK polimeraza i prati efekat dCas9:sgRNK kompleksa na transkripciju. U ovom NET-Seq postupku, CRISPRi sistem se transformisao u E. coli MG1655-izvedenu vrstu koja je sadržavala RNKP obeležen sa FLAG. CRISPRi je sadržao sgRNK (NT1) koja se vezuje za mRFP kodirajuće područje. In vitro imunopročišćavanje obeleženog NAPR praćeno sekvenciranjem nascentnih transkripata povezanih sa produžavajućim RNKP omogućilo je razlikovanje mesta pauza na NAPR.
[0587] Ovi eksperimenti su pokazali da sgRNK indukuje snažnu transkripciju pauzirajući uzvodno od sgRNK ciljanog lokusa (Slika 41A). Razdaljina između mesta pauze i ciljanog mesta je 19-bp, što je u savršenoj saglasnosti sa ranije objavljenom ~18-bp razdaljinom između inkorporacije nukleotida RNKP i njegove prednje ivice. Ovaj nalaz je u skladu sa mehanizmom CRISPRi gde je transkripcioni blok je usled fizičke kolizije između produžavajućeg NAPR i dCas9:sgRNK kompleksa (Slika 41B). Vezivanje dCas9:sgRNK kompleksa na šablonsku liniju imalo je mali represivni efekat, što ukazuje na to da je RNKP mogao čitati kompleks u ovoj određenoj orijentaciji. U ovom slučaju, sgRNK se suočava sa RNKP, koji bi mogao biti otkačen pomoću aktivnosti helikaze od RNKP. Ovi eksperimenti su pokazali da CRISPRi koristi RNK da direktno blokira transkripciju. Ovaj mehanizam se razlikuje od onog kod RNKi, za koji obaranje eksprimiranja gena zahteva uništavanje već transkribovanih mesindžer RNK pre njihove translacije.
[0588] Slika 41 pokazuje da CRISPRi funkcioniše blokiranjem transkripcionog produžavanja. (A) RNKP molekuli sa FLAG obeležjem su imunoprecipitirani i povezani nascentni mRNK transkripti su sekvencirani. Na gornjem panelu su prikazani sekvencionirani rezultati transkripta mRFP u ćelijama bez sgRNK, a donji panel pokazuje rezultate ćelija sa sgRNK. U prisustvu sgRNK, snažna transkripcijska pauza je primećena 19-bp uzvodno od ciljanog mesta, nakon čega se broj sekvencionih čitanja naglo pada. (B) Predloženi CRISPRi mehanizam zasnovan na fizičkom sudaranju između RNKP i dCas9-sgRNK. Udaljenost od centra RNKP do prednje ivice je ~19 bp, što dobro odgovara našem izmerenom rastojanju između mesta za pauzu transkripciju i 3' regije baznog uparivanja sgRNK. Pauzirani RNKP prekida transkripciono produžavanje nakon susreta sa dCas9-sgRNK blokadom puta.
CRISPRi sgRNK-navođenje smirivanja gena je visoko specifično
[0589] Da bi se procenila specifičnost CRISPRina u razmeri genoma, izvršeno je raspršeno sekvenciranje celokupnog transkriptoma (RNK-seq) dCas9-transformisanih ćelija sa i bez sgRNK ko-eksprimiranja (Slika 42A). U prisustvu sgRNK ciljane na mRFP (NT1), transkript mRFP je bio jedini gen koji pokazuje smanjenje obilja. Nijedan drugi gen nije pokazali značajne promene u eksprimiranju nakon dodavanja sgRNK, unutar grešaka u sekvenciranju. Takođe smo izvodili RNK-seq na ćelijama sa različitim sgRNK koja ciljaju različite gene. Nijedan od ovih eksperimenata nije pokazao značajne promene drugih gena osim ciljanog gena (Slika 49). Tako su sgRNK-navođeni ciljanje i regulacija gen visoko specifični i nema značajne efekte van ciljeva.
[0590] Slika 42 prikazuje ciljanu specifičnost CRISPRi sistema. (A) mRNK sekvenciranje (RNK-seq) genomskih razmera potvrdilo je da ciljanje na CRISPRi nema efekte van cilja. Korišćen je sgRNK NT1 koji se vezuje za mRFP kodirajuću regiju. obeleženi su dCas9, mRFP i sfGFP geni.
(B) Višestruki sgRNK može nezavisno da smiri dva fluorescentna protein reportera u istoj ćeliji. Svaka sgRNK specifično je potiskivala svoj srodni gen, ali ne i drugi gen. Kada su obe sgRNK bile prisutne, oba gena su bila smirena. Stubovi za greške predstavljaju SEM iz najmanje tri biološke replikacije. (C) Mikroskopske slike za korišćenje dve sgRNK za kontrolu dva fluorescentna proteina. Na gornjem panelu su prikazane slike sjajnog polja ćelija E. coli, srednji panel pokazuje RFP kanal, a donji deo prikazuje GFP panel. Ko-eksprimiranje jedne sgRNK i dCas9 isključuje srodne fluorescentne proteine, ali ne i druge. Uticaj obaranja je bio jak, pošto skoro da nije bilo fluorescencije od ćelija sa određenim fluorescentnim proteinom. Stub skale, 10 mm. Kontrola pokazuje ćelije bez bilo kog fluorescentnog protein reportera. Rezultati fluorescencije predstavljaju prosek i SEM od najmanje tri biološke replikacije. Pogledati takođe Sliku 49.
[0591] Slika 49 je vezana za Sliku 42A i prikazuje RNK-seq podatke ćelija sa sgRNK koja ciljaju različite gene. (A) (+/-) sgRNK koja cilja promotera endogenog lacI gena u E. coli. Ista lacI-ciljajuća sgRNK je korišćena kao na Slici 44A. (B) (+/-) 1 mM IPTG za ćelije bez auto-inhibiranog sgRNK (sgRNK je potisnuo sopstveni promoter). (C) (+/-) sgRNK koja cilja endogen LacZ gen u E. coli. Ista lacZ-ciljajuća sgRNK je korišćena kao na Slici 44A.1 mM IPTG je takođe dopunjeno za ćelije sa lacZ-ciljanjućom sgRNK.
CRISPRi se može koristiti za simultano regulisanje višestrukih gena
[0592] Sistem CRISPRi može omogućiti kontrolu više gena nezavisno bez međusobne komunikacije. Osmišljen je dvobojni fluorescentni-reporter sistem zasnovan na mRFP i sfGFP. Dizajnirane su dve sgRNK sa različitim komplementarnim regijama za svaki gen. eksprimiranje svakog sgRNK samo je smirilo srodnog gen i nije imalo efekta na druge. Ko-eksprimiranje dva sgRNK je obarila oba gena (Slika 42B&C). Ovi rezultati ukazuju na to da je ciljanje sgRNK usmereno specifično, sa specifičnošću koja je diktirana njenim identitetom sekvence, a ne utiče na prisustvo drugih sgRNK. Ovo ponašanje bi trebalo da omogući Multiplex kontrolu više gena istovremeno od strane CRISPRi.
Faktori koji određuju efikasnost smirivanja CRISPRi
[0593] Da bi se utvrdile determinante efikasnosti ciljanja CRISPRi, istražena je uloga dužine, komplementarnosti sekvence i položaja na efikasnosti smirivanja (Slika 43A). Kao što je predloženo na Slici 40C, mesto sgRNK ciljane sekvence duž gena bila je važna za efikasnost. SgRNK su dalje dizajnirane da pokriju punu dužinu regije kodiranja za mRFP i sfGFP (Supplemental Data za sgRNK sekvence). U svim slučajevima, represija je bila obrnutoj korelaciji sa ciljanim rastojanjem od mesta početka transkripcije (Slika 43B). Za mRFP je primećena snažna linearna korelacija. Slična, ali blago slabija korelacija je primećena kada je sfGFP korišćen kao cilj, možda ukazujući na različitu kinetiku RNK polimeraze tokom različitih tačaka u produžavanju ovog gena.
[0594] SgRNK sadrži 20-bp regiju komplementarnu cilju. Da bi se utvrdio značaj ove regije baznog uparivanja, promenjena je dužina sgRNK NT1 (Slika 43C). Iako proširenje regije od 5' kraja nije uticalo na smirivanje, skraćivanje regije značajno je smanjilo represiju. Minimalna dužina regije baznog uparivanja potrebna za smirivanje gena je 12bp, gde dalje skraćivanje dovodi do potpunog gubitka funkcije. Jedinstvene mutacije su uvedene u regiju baznog uparivanja sgRNK NT1 i testiran je ukupni efekat na smirivanje. Iz rezultata, tri subregije mogu se prepoznati, od kojih svaka ima poseban doprinos ukupnom vezivanju i smirivanja (Slika 43D). Svaka pojedinačna mutacija prvih 7 nukleotida dramatično je smanjila represiju, što ukazuje na to da ovaj niz predstavlja „semensku regiju“ za vezivanje, kao što je ranije navedeno za tip I i tip II CRISPR sisteme. Susedni nukleotidi su takođe mutirani u parovima (Slika 43E i Slika 50). U većini slučajeva, aktivnost relativne represije usled dvostruke mutacije bila je multiplikativna, u odnosu na efekte pojedinačnih mutanata, što ukazuje na nezavisnu vezu između neusaglašenosti. Pored toga, u saglasnosti sa prethodnim rezultatima o važnosti PAM sekvence, netačan PAM je potpuno ukinuo čišćenje čak i sa 20-bp perfektnom vezujućom regijom (Slika 43E). Stoga, specifičnost CRISPRi sistema određuje se zajednički od strane PAM (2-bp) i najmanje 12-bp sgRNK-DNK rastojanjem, čiji prostor je dovoljno veliki da pokrije većinu bakterijskih genoma za jedinstvena ciljana mesta.
[0595] Testirane su dve sgRNK, gde obe ciljaju isti gen (Slika 43F i Slika 51). U zavisnosti od relativnog pozicioniranja višestrukih sgRNK, primećeni su različiti kombinatorni efekti. Kombinovanjem dve sgRNK, svaka sa oko 300-ostrukom represijom, omogućeno je povećanje ukupnog smirivanja do hiljadu puta. Kombinovanje dve slabije sgRNK (~5-ostruko) pokazalo je multiplikativne efekte kada se koriste zajedno. Supresivni kombinatorni efekti su primećeni kada se koriste dve sgRNK, čiji su se ciljevi preklapali. Ovo je verovatno posledica konkurencije obe sgRNK za vezivanje za istu regiju.
[0596] Slika 43 prikazuje karakterizaciju faktora koji utiču na efikasnost pri smirivanju. (A) Efekti smirivanja su mereni od sgRNK sa različitim ciljanim lokusima na istom genu (udaljenost od početnog kodona translacije) i sgRNK sa različitim dužinama regije baznog uparivanja do istog ciljanog lokusa (na osnovu NT1). (B) Efikasnost smirivanja je u obrnutoj korelaciji sa ciljanim rastojanjem od početnog kodona translacije (narandžasti - mRFP i zeleni sfGFP). Aktivna relativna represija izračunava se normalizacijom represije svake sgRNK na onu sgRNK sa najvećom promenom represije. Stubovi greške predstavljaju SEM iz tri biološke replikacije. (C) Dužina Votson-Krik regije baznog uparivanja između sgRNK i ciljane DNK utiče na efikasnost represije. Ekstenzije regije baznog uparivanja pokazale su snažan uticaj na smirivanje, a skraćivanje je dramatično smanjilo represiju. Minimalna dužina regije baznog uparivanja za primetnu represiju je 12-bp. Stubovi greške predstavljaju SEM iz tri biološke replikacije. (D) Pojedinačne neusaglašenosti su uvedene u svaki nukleotid na sgRNK (NT1, Slika 40B) i mereno je kako su ove pojedinačne neusaglašenosti uticale na efikasnost represije. Mogu se prepoznati tri podregije sa posebnim značajem za ukupno smirivanje. Oni pokazuju funkciju koraka. Prva 7-nuleotidna region bika je kritičan za smirivanje, i verovatno predstavlja „semenu“ regiju za ispitivanje sgRNK koja se vezuju za DNK cilj. PAM sekvenca (NGG) bila je neophodna za smirivanje. Stubovi greške predstavljaju SEM iz tri biološke replikacije. (E) Efekti smirivanja sgRNK sa susednim dvostrukim neusaglašenostima. Relativna represivna aktivnost pojedinačno-neusaglašenih sgRNK je prikazana sa položajem neusaglašenosti obeleženim na dnu. Prikazana je eksperimentalna izmerena aktivnost sgRNK sa dvostrukim neusaglašenostima. Izračunata aktivnost množenjem efekata dvostruko neusaglašenih sgRNK je prikazana u beloj boji i obeležena sa „Com“. U većini slučajeva, aktivnost smirivanja dvostruko neusaglašene sgRNK bila je jednostavno množenje aktivnosti pojedinačno-neusaglašenih sgRNK (izuzev Slike 50B), što ukazuje na nezavisnu vezu između pojedinačnih neusaglašenosti. Stubovi greške predstavljaju SEM iz tri biološke replikacije. (F) Kombinatorni efekti smirivanja korišćenja duplih sgRNK za ciljanje jednog mRFP gena. Koristeći dve sgRNK koje ciljaju isti gen, ukupni efekat obaranja može se poboljšati na skoro 1,000 puta. Kada se dve sgRNK vezuju za nepreklapajuće sekvence istog gena, povećana je represija. Kada dve sgRNK ciljaju preklapajuće regione, represija je potisnuta. Stubovi greške predstavljaju SEM iz tri biološke replikacije.
[0597] Slika 50 je vezana za Sliku 43E i prikazuje efekte smirivanja sgRNK sa susednim dvostrukim neusaglašenostima. Relativna represivna aktivnost pojedinačno-neusaglašenih sgRNK je prikazana sa položajem neusaglašenosti obeleženim na dnu. Takođe je prikazana eksperimentalno izmerena aktivnost sgRNK sa dvostrukim neusaglašenostima. Aktivnost izračunata množenjem efekata dvostruko neusaglašenih sgRNK je prikazana u beloj boji i oznacena sa „Com“. Rezultati fluorescencije predstavljaju prosek i SEM od tri biološke replikacije.
[0598] Slika 51 je vezana za Sliku 43F i prikazuje kombinatorne efekte smirivanja korišćenja dve sgRNK za regulisanje jednog gena. U svim slučajevima, ne-preklapajući sgRNK pokazali su augmentivne efekte smirivanja, a preklapajući sgRNK su pokazali supresivne efekte. Kombinatorni efekat je bio nezavisan od toga da li je sgRNK ciljala šablonske ili ne-šablonske DNK linije. Rezultati fluorescencije predstavljaju prosek i SEM od tri biološke replikacije.
Ispitivanje endogene regulatorne mreže koristeći CRISPRi obaranje gena
[0599] CRISPRi sistem je zatim korišćen kao platforma obaranja gena za ispitivanje endogenih genskih mreža. Prethodni postupci ispitivanja mikrobioloških genskih mreža uglavnom su se oslanjali na naporne i skupe procedure genomskog inžinjeringa i obaranja. Za razliku od toga, obaranje gene sa CRISPRi zahteva samo dizajn i sintezu male sgRNK koja nosi komplementarnu regiju od 20 bp do željenih gena. Da bi se ovo pokazalo, CRISPRi je korišćen za stvaranje E. coli linija obaranja dizajniranjem sgRNK da se sistematski perturbiraju geni koji su deo dobro regulisanog regulacionog puta E. coli laktoze (Slika 44A). Ispitivanja βgalaktozidaze izvršene su da bi se izmerilo LacZ eksprimiranje iz oborenih linija sa i bez Isopropil β-D-1-tiogalaktopiranozida (IPTG), hemikalije koja inhibira lac represor (LacI). Kod ćelija divljeg tipa dodatak IPTG indukovao je LacZ eksprimiranje. Rezultati su pokazali da lacZ-specifična sgRNK može snažno potisnuti LacZ eksprimiranje (Slika 44B). Nasuprot tome, sgRNK koja je ciljala na lacI gen dovela je do aktivacije LacZ eksprimiranja, čak i u odsustvu IPTG, kao što bi se i očekivalo da bi se smirio direktni represor LacZ eksprimiranja.
[0600] Poznato je da je cAMP-CRP osnovni aktivator LacZ eksprimiranja vezivanjem na cis regulatorni položaj uzvodno od promotera (A mesto). Uporedo, sgRNK koja je bila usmerena na crp gene ili na mesto A u LacZ promoteru dovela je do represije, pokazujući način za povezivanje regulatora sa svojim cis-regulatornim nizom korišćenjem CRISPRi eksperimenata. Ciljanje gena adenilat cilaze (cya), koje je neophodno da se proizvede cAMP, čineći CRP efikasnijim u LacZ promoteru, samo je dovelo do parcijalne represije. Dodavanje 1mM cAMP-a u medijum za rast dopunilo je efekte za cya obaranje, ali ne i za crp obaranje, što ukazuje da je cya indirektni regulator LacZ. Pored toga, ciljanje LacI cis-regulatornog mesta (O mesto) sa sgRNK dovelo je do inhibicije, verovatno zato što vezivanje Cas9 kompleksa na ovoj lokaciji sterično blokira RNK polimerazu, simulirajući ponašanje LacI transkripcijskog represora. Ciljanje poznatog RNKP mesta za vezivanje (P mesto) takođe je blokiralo eksprimiranje. Ukratko, ove studije pokazuju da postupak CRISPRi-zasnovanog obaranja gena daje brz i efikasan pristup za ispitivanje regulatornih funkcija (aktiviranje ili potiskivanje) gena i cis elemenata u kompleksnoj regulatornoj mreži (Slika 44C).
[0601] Slika 44 pokazuje funkcionalno profilisanje složene regulatorne mreže koristeći CRISPRi obaranje gena. (A) sgRNK su dizajnirani i korišćeni da obaraju gene (cya, crp, lacI, lacZ, lacI, lacA) u regulacioni put lac ili blokove transkripcijskih operatora (A/P/O). LacI je represor lacZIA operona vezivanjem na mesto transkripcionog operatora (O mesto). LacZ gen kodira enzim koji katalizuje laktozu u glukozu. Nekoliko transaktorskih gena domaćina kao što su cya i crp uključeni su u aktivaciju sistema lacZIA. CAMP-CRP kompleks se vezuje za lokaciju transkripcionog operatera (A mesto) i regrutuje vezivanje RNK polimeraze na lokaciju P, koja pokreće transkripciju lacZIA. IPTG, hemikalija koja inhibira LacI funkciju, indukuje LacZ eksprimiranje. (B) β-glaktozidazni test sa linjama obaranja bez (bele) i sa (sive) IPTG. Kontrola pokazuje da ćelije divlje vrste bez perturbacije CRISPRi mogu biti indukovane dodatkom IPTG-a. SgRNK koja cilja LacZ snažno potiskuje LacZ eksprimiranje, čak iu prisustvu IPTG. Kada je LacI bio ciljan, LacZ eksprimiranje je bilo visoko, čak i bez IPTG. Ciljanje genoma cya i crp dovelo je do smanjenja nivoa eksprimiranja LacZ u prisustvu IPTG. Prisustvo 1mM cAMP spaslo je cya obaranje, ali ne i crp obaranje. Blokiranje mesta operatora transkripcije rezultiralo je u reakciji sa LacZ, što ukazuje na to da su ovo važna mesta regulacije za LacZ. Nakon perturbacije, ukazuje se smanjenje (strelice nadole) i povećanje (strelica nagore) LacZ. Stubovi greške predstavljaju SEM iz tri biološke replikacije. (C) Eksperimenti sa obaranjem su nam omogućili profilisanje uloga regulatora u regulacionom krugu lac. Podaci su prikazani na 2-D grafiku, gde x-osa koja prikazuje LacZ aktivnost bez IPTG, a y-osa pokazuje njegovu aktivnost sa IPTG. Širenje ovala duž svake ose pokazuje standardna odstupanja. Rezultati testa β-glaktozidaze predstavljaju prosek i SEM od tri biološke replikacije. Za RNK-seq podatke o ciljanju LacI i LacZ, pogledajti i Sliku 49.
CRISPRi može uništiti ciljano eksprimiranje gena u ljudskim ćelijama
[0602] Za testiranje opštosti CRISPRi pristupa za korišćenje kompleksa dCas9-sgRNK za represiju transkripcije, sistem je testiran u HEK293 sisarskim ćelijama. dCas9 protein je optimizovan kodonom, spojen sa tri kopije nuklearne sekvence lokalizacije (NLS), i izražen iz retroviralnog vektora virusa mišjih matičnih ćelija (MSCV). Isti sgRNK dizajn prikazan na Slici 40B korišćen je za eksprimiranje iz promotera RNK polimeraze III U6. Reporter HEK293 ćelijska linija koja eksprimira EGFP pod promoterom SV40 stvorena je virusnom infekcijom. Korišćenjem sgRNK (eNT2) koja je usmeravala ne-predloženi DNK niz u regiju kodiranja EGFP, primećeno je umereno, ali ponovljivo obaranje eksprimiranja gena (46% represija, Slika 45A). Ova represija zavisila je od proteina dCas9 i sgRNK, što ukazuje na to da je represija bila posledica dCas9-sgRNK kompleksa i RNK-navođenog ciljanja. Ista sgRNK je pokazala bolju represiju na istom genu kada je tranzitivno eksprimirana iz plazmida (63% represija, Slika 52). U skladu sa bakterijskim sistemom, samo sgRNK koja su bili usmereni na ne-šablonske linije pokazuju represiju. Faktori kao što su rastojanje od početka transkripcije i lokalno stanje hromatina mogu biti kritični parametri koji određuju efikasnost represije (Slika 52). Optimizacija dCas9 i sgRNK eksprimiranja, stabilnost, nuklearna lokalizacija i interakcija omogućiće dalje poboljšanje efikasnosti CRISPRi u ćelijama sisara.
[0603] Slika 45 pokazuje da CRISPRi može potisnuti eksprimiranje gena u ljudskim ćelijama.
(A) CRISPRi sistem u HEK293 ćelijama. Kaseta za eksprimiranje SV40-EGFP je umetnuta u genom preko retrovirusne infekcije. Protein dCas9 je optimizovan kodonom i spojen sa tri kopije NLS sekvence. SgRNK je eksprimirana iz vektora RNK polimeraze III U6. Ko-transfekcija dCas9 i sgRNK (eNT2) koja cilja ne-šablonsku liniju EGFP smanjuje fluorescenciju (~46%) dok eksprimiranje samo dCas9 ili samo sgRNK ne pokazuje nikakav efekat. (B) DCas9:sgRNK-posredovana represija zavisila je od ciljanog lokusa. Sedam sgRNK su dizajnirani da ciljaju različite regione sekvence kodiranja EGFP na šablonskim ili ne-šablonskim linijama. Samo eNT2 i eNT5 su pokazali umerenu represiju. Rezultati fluorescencije iz 7A i 7B predstavljaju prosek i grešku dve biološke replikacije.
[0604] Slika 52 je vezana za Sliku 45 i pokazuje da sgRNK represija zavisi od ciljanih lokusa i relativne udaljenost od početka transkripcije. Ista sgRNK je korišćena za suzbijanje istog EGFP gena sa različitim promoterima. Cas9/sgRNK kompleksi vrše represiju transkripcije iz transientno transficirane plazmidne DNK. Nivo transkripcijske represije bio je nešto bolji (63%) od onog koji se primećuje za genomske gene, a procenat GFP-negativnih ćelija povećan je u prisustvu sgRNK. ciljani lokus ima različitu udaljenost od početka transkripcije. Dok je SV40EGFP pokazao represiju, LTR-EGFP nije imao efekta. Rezultati fluorescencije predstavljaju prosek i grešku dve biološke replikacije.
CRISPRi efikasno i selektivno vrši represiju transkripcije ciljanih gena
[0605] CRISPRi sistem je relativno jednostavna platforma za ciljanu regulaciju gena. CRISPRi se ne oslanja na prisustvo složenih faktora domaćina, već samo zahteva dCas9 protein i vodič RNK, i stoga je fleksibilan i lako ga je dizajnirati. Sistem može efikasno smiriti gene u bakterijama. Smirivanje je veoma efikasno, jer nisu otkriveni nikakvi efekti van cilja. Štaviše, efikasnost obaranja se može podesiti promenom ciljanog lokusa i stepenom baznog uparivanja između sgRNK i ciljanog gena. Ovo će omogućiti stvaranje alelične serije hipomorfa - osobina koja je naročito korisna za proučavanje esencijalnih gena. Sistem funkcioniše direktnim blokiranjem transkripcije, na način koji se lako može programirati dizajniranjem sgRNK. Mehanički, to se razlikuje od RNKi-zasnovanog smirivanja, koje zahteva uništavanje već transkribovanih mRNK.
[0606] Pored toga, ovi dCas9:sgRNK kompleksi takođe mogu modulirati transkripciju tako što ciljaju ključne motive cis-dejstva unutar bilo kog promotera, sterično blokirajući asocijaciju njihovih srodnih trans-delujućih faktora transkripcije. Stoga, pored svoje upotrebe kao alata za obaranje gena, CRISPRi se može koristiti za funkcionalno mapiranje promotera i drugih genomskih regulatornih modula.
CRISPRi je podložan analizi i regulaciji genomskih razmera
[0607] CRISPRi postupak se zasniva na korišćenju RNK koje ciljaju DNK, i samo segment ciljanja DNK mora biti dizajniran za specifične genske ciljeve. Sa napretkom tehnologije sintezovanja DNK oligonukleotida u velikoj razmeri, stvaranje velikih skupova oligonukleotida koji sadrže jedinstvene 20-bp regije za ciljanje genoma je brz i jeftin. Ove biblioteke oligonukleotida mogle bi nam omogućiti da ciljamo veliki broj individualnih gena da utičemo na gensku funkciju ili da ciljamo genske parove za mapiranje genetskih interakcija. Osim toga, CRISPRi se može koristiti za istovremeno moduliranje eksprimiranje velikih skupova gena, s obzirom na to da mala veličina sgRNK dozvoljava da se spoji više elemenata u isti vektor eksprimiranja.
CRISPRi pruža nove alate za manipulaciju mikrobnim genomima
[0608] Zbog toga što je platforma CRISPRi kompaktna i samostalna, može se prilagoditi različitim organizmima. CRISPRi je moćno sredstvo za proučavanje ne-modelnih organizama za koje postupci genetskog inženjeringa nisu dobro razvijeni, uključujući patogene ili industrijski korisne organizme. Za razliku od većine eukariota, većina bakterija nema RNKi mašineriju. Kao posledica toga, regulacija endogenih gena koji koriste dizajnirane sintetičke RNK je trenutno ograničena. CRISPRi može da obezbedi RNKi-sličan metod za perturbaciju gena u mikrobima.
CRISPRi kao platforma za inženjering transkripcijske regulatorne mreže
[0609] CRISPRi se može koristiti kao fleksibilan okvir za inženjering transkripcijske regulatorne mreže. CRISPRi platforma, zato što je u suštini RNK-navođen DNK-vezujući kompleks, takođe pruža fleksibilnu skelu za usmeravanje različitih regulatornih mašina na određene lokacije u genomu. Pored jednostavnog blokiranja transkripcije ciljanih gena, moguće je povezati dCas9 protein sa brojnim regulatornim domenima za modulaciju različitih bioloških procesa i generisati različite funkcionalne ishode (npr. transkripciona aktivacija, modifikacije hromatina).
[0610] U CRISPRi sistemu moguće je povezati više sgRNK u transkripciona kola u kojima jedna uzvodna sgRNK kontroliše eksprimiranje različite nizvodne sgRN. Pošto su molekuli RNK u mikroorganizmima kratkotrajni, sumnjamo da bi genetski programi regulisani sgRNK mogli pokazati brzu kinetiku različitu od kola koja uključuju spore procese kao što su eksprimiranje proteina i degradacija. Ukratko, CRISPRi sistem je opšta genetska programska platforma pogodna za različita biomedicinska istraživanja i kliničke primene uključujući funkcionalno profilisanje genoma, metabolički mikrobiološki inženjering i reprogramiranje ćelija.
Primer 5: Himerni polipeptid usmeren na mesto može se koristiti za modulaciju (aktiviranje ili potiskivanje) transkripcije u ljudskim ćelijama.
[0611] Pokazali smo da u ljudskim ćelijama fuzioni protein koji sadrži katalitički neaktivan Cas9 i domen aktivator ili domen represor može povećati ili smanjiti transkripciju iz ciljane DNK, respektivno.
[0612] Slika 55. Fuzionisali smo humanizovani katalitički neaktivni Cas9 sa domenom VP64 transkripcionog aktivatora. (A) Da bismo testirali efikasnost za aktivaciju gena koristeći ovaj sistem, ubacili smo GAL4 UAS inducibilni promoter koji kontroliše GFP u genom HEK293 (ljudske ćelije kulture tkiva). (B) GAL4 UAS promoter može biti indukovan u prisustvu proteina GAL4 koji je izveden iz kvasca. Fuzija dCas9-VP64 može efikasno aktivirati GAL4 UAS 20-ostruko u prisustvu srodne vodič RNK koja se vezuje za regiju GAL4 UAS. (C) Mikroskopske slike za aktivaciju dCas9-VP64. (D) Podaci o protočnoj citometriji za dCas9-VP64 aktivaciju.
[0613] Slika 56 Fuzionisali smo humanizovani katalitički neaktivni Cas9 sa transkripcionim aktivator domenom KRAB. (Vrh) Dizajnirali smo 10 vodič RNK koje su usmerene na dobro karakterisan promoter SV40 ranog promotera i jednu vodič RNK koja cilja na EGFP kodirajuću regiju. (Dno) Koristeći nehimerni dCas9, posmatrali smo 2~3-ostruku represiju gRNK od P9 i NT2. Ova efikasnost je značajno poboljšana korišćenjem dCas9-KRAB fuzije. Na primer, sa dCas9-KRAB fuzijom, P9 i NT2 su pokazali 20-ostruku i 15- ostruku represiju, respektivno. Pored toga, P1-P6 je pokazao značajno smanjenje eksprimiranja kada se koristi fuzioni protein, ali je ograničena represija kada je korišćen ne-himerni dCas9.
Primer 6: Cas9 može koristiti veštačke vodič RNK, koje ne postoje u prirodi, da bi se izvršilo ciljano cepanje DNK
[0614] Veštačka crRNK i veštačka tracrRNK su dizajnirane na osnovu segmenta za protein vezivanje prirodnih transkripta S. pyogenes crRNK i tracrRNK, modifikovani da oponašaju asimetrično ispupčenje unutar prirodnog S. pyogenes crRNK:tracrRNK dupleksa (pogledati ispupčenje u domenu vezivanja proteina veštačkih (top) i prirodnih (dno) RNK molekula prikazanih na Slici 57A). Veštačka tracrRNK sekvenca deli manje od 50% identičnosti sa prirodnom tracrRNK. Predviđena sekundarna struktura crRNK:tracrRNK protein-vezujućeg dupleksa je ista za oba RNK para, ali predviđena struktura ostatka RNK je mnogo drugačija.
[0615] Slika 57 pokazuje da veštačke sekvence koje dele vrlo malo (oko 50% identičnosti) sa prirodnim tracrRNK i crRNK mogu da funkcioniše sa Cas9 da cepaju ciljanu DNK sve dok je očuvana struktura domena vezivanja proteina od RNK koja cilja DNK. (A) Ko-savijanje S. pyogenes tracrRNK i crRNK i veštačkih tracrRNK i crRNK. (B) Kombinacije S. pyogenes Cas9 i tracrRNK:crRNK ortologa su korišćene za otelotvorenje testova cepanja plazmidne DNK. Spy -S. pyogenes, Lin - L. innocua, Nme - N. meningitidis, Pmu - P. multocida. S. pyogenes Cas9 može biti vođen od strane nekih, ali ne i svih tracrRNK:crRNK ortologa koji se prirodno javljaju u odabranim vrstama bakterija. Naročito, S. pyogenes Cas9 može biti navođen veštačkim tracrRNK:crRNK parom, koji je dizajniran na osnovu strukture segmenta vezivanja protein prirode RNK koja cilja DNK korišćenjem sekvence potpuno nepovezane sa CRISPR sistemom.
[0616] Korišćena veštačka „tracrRNK“ (aktivator RNK) bila je 5’-GUUUUCCCUUUUCAAAGAAAUCUCCUGGGCACCUAUCUUCUUAGGUGCCCUCCCU UGUUUAAACCUGACCAGUUAACCGGCUGGUUAGGUUUUU-3’ (SEQ ID NO: 1347). Korišćema veštačka „crRNK“ (targeter RNK) bila je: 5’- GAGAUUUAUGAAAAGGGAAAAC-3’ (SEQ ID NO:1348).
Primer 7: Generisanje transgenih organizama koji nisu ljudski
[0617] Transgeni miš koji eksprimira Cas9 (bilo neimodifikovan, modifikovan da ima smanjenu enzimsku aktivnost, modifikovan kao fuzioni protein, za svrhe bilo kog od gore opisanih ciljeva) generiše se pomoću pogodnog postupka poznatog prosečnom stručnjaku u oblasti (npr. (i) obaranje gena na ciljanom lokusu (npr ROSA 26) mišje embrionalne matične ćelije (ES ćelija), a zatim ubrizgavanje blastocista i stvaranje himernih miševa, (ii) ubrizgavanje nasumično integrišućih transgena u pronukleus oplođenog oocita miša, praćeno implantacijom jajašca u pseudotrudnu ženku, itd.). Protein Cas9 je pod kontrolom promotera koji se eksprimira barem u embrionalnim matičnim ćelijama i može biti dodatno pod vremenskom ili specifičnom kontrolom tkiva (npr. indukuje se lekom, kontroliše se Cre-Lox sistemom na bazi promotera itd.). Kada se generiše linija transgenih miševa koji eksprimiraju Cas9, embrionalne matične ćelije su izolovane i kultivisane, a u nekim slučajevima ES ćelije su zamrznute za buduću upotrebu. Zbog toga što izolovane ES ćelije eksprimiraju Cas9 (a u nekim slučajevima i eksprimiraje je pod vremenskom kontrolom (npr. indkukuje se lekovima)), nove ćelije obaranja ili podizanja (a samim tim i miševi) se brzo generišu na bilo kom željenom lokusu u genomu uvođenjem adekvatno dizajnirane RNK koja cilja DNK koja cilja Cas9 na određeni izabrani lokus. Takav sistem i mnoštvo njegovih varijacija se koriste za generiranje novih genetski modifikovanih organizama u bilo kom izabranom lokusu. Kada se modifikovani Cas9 koristi za modulaciju transkripcije i/ili da modifikuje DNK i/ili da modifikuje polipeptide koji su povezani sa DNK, same ES ćelije (ili bilo koja diferencirana ćelija izvedena iz ES ćelija (npr. čitav miš, diferencirana ćelijska linija itd.)) koriste se za ispitivanje osobina bilo kog izabranog gena (ili bilo kog izabranog proizvoda eksprimiranja ili bilo kog izabranog genomskog lokusa) jednostavno uvođenjem odgovarajuće RNK koja cilja DNK u željenu ćeliju koja eksprimira Cas9.

Claims (1)

  1. Patentni zahtevi
    1. Postupak modifikovanja ciljne DNK, naznačen time, da se postupak sastoji u kontaktiranju ciljne DNK sa kompleksom koji sadrži:
    (a) Cas9 polipeptid; i
    (b) RNK-ciljanu RNK koja sadrži:
    (i) segment ciljanja DNK koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja je komplementarna sekvenci u ciljne DNK, i
    (ii) segment vezivanja proteina koji stupa u interakciju sa polipeptidom Cas9, gde je segment vezivanja proteina Sadrži dva komplementarna niza nukleotida koji hibridizuju tako da formiraju dvolančanu RNK (dsRNA) dupleks,
    gde je ciljna DNK prisutna u jednom ćelijskom eukariotskom organizmu, životinjskoj ćeliji, ili biljnoj ćeliji,
    gde je pomenuta modifikacija cepanje ciljne DNK,
    u čemu:
    (A) navedeno kontaktiranje je in vitro ili u ćeliji ek vivo; i / ili
    (B) navedeni postupak nije postupak za lečenje ljudskog ili životinjskog tela terapijom.
    2. Postupak prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što RNK-ciljanje DNK sadrži jednu ili više modifikovanih nukleobaza, modifikovanih okosnicu ili ne-prirodnu internukleozidnu vezu, modifikovanu šećernu grupu, zaključanu nukleinsku kiselinu ili peptid nukleinske kiseline.
    2. Postupak prema zahtevu 1 ili patentnom zahtevu 2, naznačen time što navedeni dsRNA duplek ima:
    (i) dužinu od 8 parova baza (bp) do 15 bp;
    (ii) dužinu od 8 parova baza (bp) do 30 bp; ili
    (iii) dužina od 15 parova baza (bp) do 18 bp.
    4. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1-3, naznačen time što je procenat komplementarnosti između nukleotida koji hibridizuju da bi se formirao dsRNA dupleks segmenta vezivanja proteina veći je od 70%.
    5. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1-4, naznačen time što kontaktiranje obuhvata uvođenje u ćeliju (a) Cas9 polipeptida,
    ili polinukleotid koji kodira Cas9 polipeptid, i (b) DNA-ciljanje RNA, ili jedan ili više DNK polinu-Kleotide koji kodiraju RNK-ciljanje DNK; opciono gde postupak dalje obuhvata uvođenje ćelija donor polinukleotida.
    6. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1-5, naznačen time što je nukleotidna sekvenca koja je komplementarna sekvenci u ciljna DNK je duga od 15 do 18 nukleotida (nt), od 18 do 20 nt, ili od 20 do 25 nt.
    7. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1-6, naznačen time što je domen transdukcije proteina kovalentno vezan za amino terminus polipeptida Cas9, pri čemu domen transdukcije proteina olakšava prolaz Cas9 polipeptida od citosola do unutar organela ćelije.
    8. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1-6, naznačen time što je domen transdukcije proteina kovalentno vezan za karboksil terminus polipeptida Cas9, pri čemu domen transdukcije proteina olakšava prolaz Cas9 polipeptida od citosola do unutar organela ćelije.
    9. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1-8, naznačen time što RNK-ciljanje DNK je dvo-molekulska RNK-ciljanje DNK I sadrži dva odvojena RNA molekula, od kojih svaki sadrži jedan od dva komplementarna isteka nukleotida koji hibridizuju da formiraju dsRNA dupleks.
    10. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1-9, naznačen time što je ciljna DNK hromozomska DNK.
    11. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 10, naznačen time što je ciljna DNK prisutna u ćeliji životinje beskičmenjaka, ćelija kičmene životinje, ćelija sisara, ćelija glodara, ili ćelija čoveka.
    12. Jedinjenje koje sadrži:
    (a) Cas9 polipeptid, ili polinukleotid koji kodira pomenuti Cas9 polipeptid, i
    (b) RNK koja cilja DNK, ili jedan ili više DNK polinukleotida koji kodiraju pomenutu RNK-ciljanje DNK, pri čemuRNA koja cilja na DNK sadrži:
    (i) segment ciljanja DNK koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja je komplementarna sekvenci u a
    ciljne DNK, i
    (ii) segment vezivanja proteina koji stupa u interakciju sa navedenim Cas9 polipeptidom, pri čemu je segment vezivanja proteina Sadrži dva komplementarna niza nukleotida koji hibridizuju tako da formiraju dvolančanu RNK (dsRNA) dupleks;
    gde je ciljna DNK prisutna u jednom ćelijskom eukariotskom organizmu, životinjskoj ćeliji ili biljnoj ćeliji.
    13. Jedna ili više nukleinskih kiselina koje sadrže:
    (a) prva nukleotidna sekvenca koja kodira RNK-ciljanje koja sadrži:
    (i) segment ciljanja DNK koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja je komplementarna sa ciljnom sekvencomu ciljnoj DNA, i
    (ii) segment vezivanja proteina koji stupa u interakciju sa Cas9 polipeptidom, gde je segment vezivanja proteina sadrži dva komplementarna niza nukleotida koji hibridizuju tako da formiraju dvolančanu RNK (dsRNA) dupleks;
    pri čemu je prva nukleotidna sekvenca koja kodira pomenutu RNK-ciljanu DNK operabilno vezana za promotor; i,po potrebi,
    (b) drugu nukleotidnu sekvencu koja kodira Cas9 polipeptid, pri čemu kodiranje nukleotidne sekvencenavedeni Cas9 polipeptid je operativno vezan za promotor;
    gde je ciljna DNK prisutna u jednom ćelijskom eukariotskom organizmu, životinjskoj ćeliji ili biljnoj ćeliji.
    14. Jedna ili više nukleinskih kiselina iz zahteva 13, naznačene time, što su navedene nukleinske kiseline jedna ili više rekombinantnih ekspresija
    vektora, opciono gde je jedan ili više rekombinantnih ekspresionih vektora jedan ili više virusnih vektora.
    15. Jedna ili više nukleinskih kiselina prema zahtevu 13 ili zahtevu 14, pri čemu nukleotidna sekvenca koja kodira navedeno ciljanje DNK
    RNK je operativno vezana za promotor koji je funkcionalan u eukariotskoj ćeliji, i / ili kodiranje nukleotidne sekvence Cas9 polipeptid je operativno vezan za promotor koji je funkcionalan u eukariotskoj ćeliji.
    16. Komplet koji sadrži
    (a) Cas9 polipeptid, ili polinukleotid koji kodira pomenuti Cas9 polipeptid; i
    (b) RNK koja cilja DNK, ili jedan ili više DNK polinukleotida koji kodiraju pomenutu RNK-ciljanje DNK, pri čemu RNA koja cilja na DNK sadrži:
    (i) segment ciljanja DNK koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja je komplementarna sekvenci u a ciljne DNK, i
    (ii) segment vezivanja proteina koji stupa u interakciju sa navedenim Cas9 polipeptidom, pri čemu je segment vezivanja proteina sadrži dva komplementarna niza nukleotida koji hibridizuju tako da formiraju dvolančanu RNK (dsRNA) duplek,
    pri čemu (a) i (b) su u istim ili odvojenim posudama, i
    gde je ciljna DNK prisutna u jednom ćelijskom eukariotskom organizmu, životinjskoj ćeliji ili biljnoj ćeliji.
    17. Genetski modifikovana ćelija domaćina, koja je eukariotska ćelija, koja sadrži:
    (a) Cas9 polipeptid, ili polinukleotid koji kodira pomenuti Cas9 polipeptid; i / ili
    (b) RNK koja cilja DNK, ili jedan ili više DNK polinukleotida koji kodiraju pomenutu RNK-ciljanje DNK, pri čemu RNA koja cilja na DNK sadrži:
    (i) segment ciljanja DNK koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja je komplementarna sekvenci u ciljne DNK, i
    (ii) segment vezivanja proteina koji stupa u interakciju sa navedenim Cas9 polipeptidom, pri čemu je segment vezivanja proteina sadrži dva komplementarna niza nukleotida koji hibridizuju tako da formiraju dvolančanu RNK (dsRNA) dupleks;
    i gde
    (A) genetski modifikovana ćelija domaćina je in vitro ili ek vivo; i / ili
    (B) genetski modifikovana ćelija domaćina nije ljudska ćelija.
    18. Jedinjenje prema zahtevu 12, jedna ili više nukleinskih kiselina prema bilo kom od patentnih zahteva 13-15, ili komplet iz patentnog zahteva 16, ili genetski modifikovana ćelija domaćina prema zahtevu 17, pri čemu RNK koja cilja DNK sadrži jedan ili više modifikovanih
    nukleobaza, modifikovana kičma ili ne-prirodna internukleozidna veza, modifikovana šećerna grupa, zaključana nukleinska k iselina, ili peptid nukleinske kiseline.
    19. Kompozicija prema zahtevu 12, ili 18, jedna ili više nukleinskih kiselina prema bilo kom od zahteva 13-15 i 18, ili komplet od patentnog zahteva 16 ili 18, ili genetski modifikovana ćelija domaćina prema zahtevu 17 ili zahtevu 18, naznačena time što:
    (i) navedeni dsRNA dupleks ima dužinu od 8 parova baza (bp) do 15 bp;
    (ii) pomenuti dsRNA dupleks ima dužinu od 8 parova baza (bp) do 30 bp; ili
    (iii) pomenuti dsRNA dupleks ima dužinu od 15 parova baza (bp) do 18 bp.
    20. Jedinjenje prema bilo kom od patentnih zahteva 12 i 18-19, jedna ili više nukleinskih kiselina prema bilo kom od patentnih zahteva 13-15 I 18. – 19, ili komplet prema bilo kom od patentnih zahteva 16 i 18-19, ili genetski modifikovana ćelija domaćina prema bilo kom od patentnih zahteva 17-19, u čemu:
    (i) procentualnu komplementarnost između nukleotida koji hibridizuju da formiraju dsRNA dupleks proteina-segment vezivanja je veći od 70%; i / ili
    (ii) ciljna DNK je hromozomska DNK.
    21. Jedinjenje prema bilo kom od patentnih zahteva 12 i 18-20, jedna ili više nukleinskih kiselina prema bilo kom od patentnih zahteva 13-15 I 18- 20, ili komplet iz bilo kojeg od patentnih zahteva 16 i 18-20, ili genetski modifikovane ćelije domaćina prema bilo kom od patentnih zahteva 17-20, gde je domen transdukcije proteina kovalentno vezan za amino kraj Cas9 polipeptida, gde je domen transdukcije proteina olakšava prelazak Cas9 polipeptida iz citosola u organele ćelije.
    22. Jedinjenje prema bilo kom od patentnih zahteva 12 i 18-20, jedna ili više nukleinskih kiselina prema bilo kom od patentnih zahteva 13-15 I 18 - 20, ili komplet iz bilo kojeg od patentnih zahteva 16 i 18-20, ili genetski modifikovane ćelije domaćina prema bilo kom od patentnih zahteva 17-20, gde je domen transdukcije proteina kovalentno vezan za karboksilni kraj polipeptida Cas9, pri čemu domen transdukcije proteina olakšava prelazak Cas9 polipeptida iz citosola u organele ćelije.
    23. Jedinjenje prema bilo kom od patentnih zahteva 12 i 18-22, jedna ili više nukleinskih kiselina prema bilo kom od patentnih zahteva 13-15, 22. kombinacija prema bilo kom od patentnih zahteva 16 i 18-22, ili genetski modifikovane ćelije domaćina prema bilo kom od zahteva 17-22, pri čemu je RNK-ciljanje DNK dvo-molekulska DNA-ciljna RNK i sadrži dva odvojena RNA molekula, od kojih svaki sadrži jedan od dva komplementarna proteza nukleotida koji hibridizuju da formiraju dsRNK duplek.
    24. Jedinjenje prema bilo kom od patentnih zahteva 12 i 18-23, jedna ili više nukleinskih kiselina prema bilo kom od patentnih zahteva 13-15 I 18-23, ili komplet iz bilo kojeg od zahteva 16 i 18-23, za upotrebu u postupku terapeutskog lečenja pacijenta.
    25.Jedinjenje prema bilo kom od patentnih zahteva 12 i 18-23, jedna ili više nukleinskih kiselina prema bilo kom od patentnih zahteva 13-15 I 18-23, ili komplet iz bilo kog od patentnih zahteva 16 i 18-23, gde je ciljna DNK prisutna u ćeliji iz beskičmenjaka , ćelija kičmenjaka, ćelija sisara, ćelija glodara, ili ćelija čoveka.
RSP20190673 2012-05-25 2013-03-15 Metode i jedinjenja za rnk-upravljanu ciljanu dnk modifikaciju i za rnk- upravljanu modulaciju transkripta RS59199B1 (sr)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261652086P 2012-05-25 2012-05-25
US201261716256P 2012-10-19 2012-10-19
US201361757640P 2013-01-28 2013-01-28
US201361765576P 2013-02-15 2013-02-15
EP18152360.6A EP3401400B1 (en) 2012-05-25 2013-03-15 Methods and compositions for rna-directed target dna modification and for rna-directed modulation of transcription

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS59199B1 true RS59199B1 (sr) 2019-10-31

Family

ID=49624232

Family Applications (5)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20230851A RS64622B1 (sr) 2012-05-25 2013-03-15 Metode i sastavi za modifikaciju ciljane dnk upravljenu pomoću rnk i za modulaciju transkripcije upravljanu rnk
RSP20190673 RS59199B1 (sr) 2012-05-25 2013-03-15 Metode i jedinjenja za rnk-upravljanu ciljanu dnk modifikaciju i za rnk- upravljanu modulaciju transkripta
RS20180482A RS57287B1 (sr) 2012-05-25 2013-03-15 Postupci i sastavi za rnk-usmerenu modifikaciju ciljane dnk i za rnk-usmerenu modulaciju transkripcije
RS20170783A RS56119B1 (sr) 2012-05-25 2013-03-15 Postupci i sastavi za rnk-usmerenu modifikaciju ciljane dnk i za rnk-usmerenu modulaciju transkripcije
RS20250443A RS66774B1 (sr) 2012-05-25 2013-03-15 Postupci i kompozicije za modifikaciju ciljane dnk upravljenu pomoću rnk i za modulaciju transkripcije upravljanu rnk

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20230851A RS64622B1 (sr) 2012-05-25 2013-03-15 Metode i sastavi za modifikaciju ciljane dnk upravljenu pomoću rnk i za modulaciju transkripcije upravljanu rnk

Family Applications After (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20180482A RS57287B1 (sr) 2012-05-25 2013-03-15 Postupci i sastavi za rnk-usmerenu modifikaciju ciljane dnk i za rnk-usmerenu modulaciju transkripcije
RS20170783A RS56119B1 (sr) 2012-05-25 2013-03-15 Postupci i sastavi za rnk-usmerenu modifikaciju ciljane dnk i za rnk-usmerenu modulaciju transkripcije
RS20250443A RS66774B1 (sr) 2012-05-25 2013-03-15 Postupci i kompozicije za modifikaciju ciljane dnk upravljenu pomoću rnk i za modulaciju transkripcije upravljanu rnk

Country Status (41)

Country Link
US (107) US20160046961A1 (sr)
EP (7) EP3401400B1 (sr)
JP (6) JP6343605B2 (sr)
KR (2) KR20150016588A (sr)
CN (2) CN104854241B (sr)
AU (5) AU2013266968B2 (sr)
BR (1) BR112014029441B1 (sr)
CA (1) CA2872241C (sr)
CL (1) CL2014003208A1 (sr)
CO (1) CO7151523A2 (sr)
CR (1) CR20140538A (sr)
CY (3) CY1119282T1 (sr)
DE (3) DE202013012241U1 (sr)
DK (5) DK3597749T5 (sr)
EA (1) EA038924B1 (sr)
EC (1) ECSP14028704A (sr)
ES (5) ES2728782T3 (sr)
FI (2) FI3597749T3 (sr)
GB (3) GB2537000C (sr)
GE (1) GEP20217251B (sr)
HK (1) HK1204003A1 (sr)
HR (5) HRP20171163T1 (sr)
HU (3) HUE043861T2 (sr)
IL (8) IL235461B (sr)
LT (5) LT3401400T (sr)
MA (1) MA37663B1 (sr)
ME (2) ME03530B (sr)
MX (4) MX369077B (sr)
MY (2) MY184753A (sr)
NZ (2) NZ714353A (sr)
PE (4) PE20150336A1 (sr)
PH (1) PH12014502574B1 (sr)
PL (5) PL3597749T3 (sr)
PT (5) PT3241902T (sr)
RS (5) RS64622B1 (sr)
SG (3) SG10201809817UA (sr)
SI (5) SI3597749T1 (sr)
TN (1) TN2014000493A1 (sr)
TR (1) TR201806812T4 (sr)
UA (1) UA118014C2 (sr)
WO (1) WO2013176772A1 (sr)

Families Citing this family (1639)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8399643B2 (en) 2009-02-26 2013-03-19 Transposagen Biopharmaceuticals, Inc. Nucleic acids encoding hyperactive PiggyBac transposases
DK3622815T3 (da) 2009-07-08 2023-06-26 Kymab Ltd Gnavermodeller og terapeutiske molekyler
US9445581B2 (en) 2012-03-28 2016-09-20 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
US9585920B2 (en) 2011-02-04 2017-03-07 Katherine Rose Kovarik Method and system for treating cancer cachexia
US9457077B2 (en) 2009-11-18 2016-10-04 Katherine Rose Kovarik Method and system for targeting the microbiome to promote health and treat allergic and inflammatory diseases
US9719068B2 (en) 2010-05-06 2017-08-01 Children's Hospital Medical Center Methods and systems for converting precursor cells into intestinal tissues through directed differentiation
US12257272B2 (en) 2015-12-24 2025-03-25 Seed Health, Inc. Method and system for reducing the likelihood of developing depression in an individual
US10086018B2 (en) 2011-02-04 2018-10-02 Joseph E. Kovarik Method and system for reducing the likelihood of colorectal cancer in a human being
US10010568B2 (en) 2011-02-04 2018-07-03 Katherine Rose Kovarik Method and system for reducing the likelihood of a spirochetes infection in a human being
US10085938B2 (en) 2011-02-04 2018-10-02 Joseph E. Kovarik Method and system for preventing sore throat in humans
US10842834B2 (en) 2016-01-06 2020-11-24 Joseph E. Kovarik Method and system for reducing the likelihood of developing liver cancer in an individual diagnosed with non-alcoholic fatty liver disease
US12533312B2 (en) 2011-02-04 2026-01-27 Seed Health, Inc. Method and system for preventing sore throat in humans
US10111913B2 (en) 2011-02-04 2018-10-30 Joseph E. Kovarik Method of reducing the likelihood of skin cancer in an individual human being
US10548761B2 (en) 2011-02-04 2020-02-04 Joseph E. Kovarik Method and system for reducing the likelihood of colorectal cancer in a human being
US10245288B2 (en) 2011-02-04 2019-04-02 Joseph E. Kovarik Method and system for reducing the likelihood of developing NASH in an individual diagnosed with non-alcoholic fatty liver disease
US10940169B2 (en) 2015-11-30 2021-03-09 Joseph E. Kovarik Method for reducing the likelihood of developing cancer in an individual human being
US10687975B2 (en) 2011-02-04 2020-06-23 Joseph E. Kovarik Method and system to facilitate the growth of desired bacteria in a human's mouth
US12279989B2 (en) 2011-02-04 2025-04-22 Seed Health, Inc. Method and system for increasing beneficial bacteria and decreasing pathogenic bacteria in the oral cavity
US11951140B2 (en) 2011-02-04 2024-04-09 Seed Health, Inc. Modulation of an individual's gut microbiome to address osteoporosis and bone disease
US10314865B2 (en) 2011-02-04 2019-06-11 Katherine Rose Kovarik Method and system for treating cancer and other age-related diseases by extending the healthspan of a human
US9730967B2 (en) 2011-02-04 2017-08-15 Katherine Rose Kovarik Method and system for treating cancer cachexia
US11357722B2 (en) 2011-02-04 2022-06-14 Seed Health, Inc. Method and system for preventing sore throat in humans
US11998479B2 (en) 2011-02-04 2024-06-04 Seed Health, Inc. Method and system for addressing adverse effects on the oral microbiome and restoring gingival health caused by sodium lauryl sulphate exposure
US9987224B2 (en) 2011-02-04 2018-06-05 Joseph E. Kovarik Method and system for preventing migraine headaches, cluster headaches and dizziness
US10583033B2 (en) 2011-02-04 2020-03-10 Katherine Rose Kovarik Method and system for reducing the likelihood of a porphyromonas gingivalis infection in a human being
US10512661B2 (en) 2011-02-04 2019-12-24 Joseph E. Kovarik Method and system for reducing the likelihood of developing liver cancer in an individual diagnosed with non-alcoholic fatty liver disease
US11523934B2 (en) 2011-02-04 2022-12-13 Seed Health, Inc. Method and system to facilitate the growth of desired bacteria in a human's mouth
US11191665B2 (en) 2011-02-04 2021-12-07 Joseph E. Kovarik Method and system for reducing the likelihood of a porphyromonas gingivalis infection in a human being
US11273187B2 (en) 2015-11-30 2022-03-15 Joseph E. Kovarik Method and system for reducing the likelihood of developing depression in an individual
US11844720B2 (en) 2011-02-04 2023-12-19 Seed Health, Inc. Method and system to reduce the likelihood of dental caries and halitosis
US11951139B2 (en) 2015-11-30 2024-04-09 Seed Health, Inc. Method and system for reducing the likelihood of osteoporosis
US11419903B2 (en) 2015-11-30 2022-08-23 Seed Health, Inc. Method and system for reducing the likelihood of osteoporosis
US10835560B2 (en) 2013-12-20 2020-11-17 Joseph E. Kovarik Reducing the likelihood of skin cancer in an individual human being
CA2831144A1 (en) 2011-03-23 2012-09-27 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods for producing a complex transgenic trait locus
EA024762B9 (ru) 2011-06-30 2017-04-28 Эрроухэд Рисерч Корпорейшн Композиции и способы ингибирования экспрессии генов вируса гепатита в
US10323236B2 (en) 2011-07-22 2019-06-18 President And Fellows Of Harvard College Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity
BR112014006394A2 (pt) 2011-09-19 2017-03-28 Kymab Ltd manipulação de diversidade genética de imunoglobulina e terapêuticos multi-anticorpos
WO2013045916A1 (en) 2011-09-26 2013-04-04 Kymab Limited Chimaeric surrogate light chains (slc) comprising human vpreb
EP3604555B1 (en) 2011-10-14 2024-12-25 President and Fellows of Harvard College Sequencing by structure assembly
US9253965B2 (en) 2012-03-28 2016-02-09 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
US10465042B2 (en) 2011-12-02 2019-11-05 Yale University Poly(amine-co-ester) nanoparticles and methods of use thereof
UA115772C2 (uk) 2011-12-16 2017-12-26 Таргітджин Байотекнолоджиз Лтд Композиція програмованого нуклеопротеїнового молекулярного комплексу і спосіб модифікування заданої послідовності нуклеїнової кислоти-мішені
ES2991004T3 (es) 2011-12-22 2024-12-02 Harvard College Métodos para la detección de analitos
GB201122458D0 (en) 2011-12-30 2012-02-08 Univ Wageningen Modified cascade ribonucleoproteins and uses thereof
US9637739B2 (en) * 2012-03-20 2017-05-02 Vilnius University RNA-directed DNA cleavage by the Cas9-crRNA complex
GB2502127A (en) 2012-05-17 2013-11-20 Kymab Ltd Multivalent antibodies and in vivo methods for their production
US10251377B2 (en) 2012-03-28 2019-04-09 Kymab Limited Transgenic non-human vertebrate for the expression of class-switched, fully human, antibodies
SG11201406547YA (en) 2012-04-25 2014-11-27 Regeneron Pharma Nuclease-mediated targeting with large targeting vectors
WO2013163628A2 (en) 2012-04-27 2013-10-31 Duke University Genetic correction of mutated genes
WO2013177560A1 (en) 2012-05-25 2013-11-28 The Regents Of The University Of California Microfluidic systems for particle trapping and separation
AU2013266968B2 (en) 2012-05-25 2017-06-29 Emmanuelle CHARPENTIER Methods and compositions for RNA-directed target DNA modification and for RNA-directed modulation of transcription
CN104540382A (zh) * 2012-06-12 2015-04-22 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 用于产生条件性敲除等位基因的方法和组合物
US20150225734A1 (en) 2012-06-19 2015-08-13 Regents Of The University Of Minnesota Gene targeting in plants using dna viruses
AU2013293270B2 (en) * 2012-07-25 2018-08-16 Massachusetts Institute Of Technology Inducible DNA binding proteins and genome perturbation tools and applications thereof
KR102909884B1 (ko) * 2012-10-23 2026-01-09 주식회사 툴젠 표적 DNA에 특이적인 가이드 RNA 및 Cas 단백질을 암호화하는 핵산 또는 Cas 단백질을 포함하는, 표적 DNA를 절단하기 위한 조성물 및 이의 용도
AU2013335451C1 (en) * 2012-10-23 2024-07-04 Toolgen Incorporated Composition for cleaving a target DNA comprising a guide RNA specific for the target DNA and Cas protein-encoding nucleic acid or Cas protein, and use thereof
CA2891510C (en) 2012-11-16 2022-10-18 Transposagen Biopharmaceuticals, Inc. Site-specific enzymes and methods of use
CN109554350B (zh) 2012-11-27 2022-09-23 儿童医疗中心有限公司 用于胎儿血红蛋白再诱导的靶向bcl11a远端调控元件
PL3360964T3 (pl) 2012-12-06 2020-03-31 Sigma-Aldrich Co. Llc Modyfikacja i regulacja genomu oparta na crispr
EP3031921B1 (en) 2012-12-12 2025-03-12 The Broad Institute, Inc. Delivery, engineering and optimization of systems, methods and compositions for sequence manipulation and therapeutic applications
IL239344B2 (en) * 2012-12-12 2024-06-01 Broad Inst Inc Systems engineering, methods and optimal guiding components for sequence manipulation
WO2014093655A2 (en) 2012-12-12 2014-06-19 The Broad Institute, Inc. Engineering and optimization of systems, methods and compositions for sequence manipulation with functional domains
US20140186843A1 (en) 2012-12-12 2014-07-03 Massachusetts Institute Of Technology Methods, systems, and apparatus for identifying target sequences for cas enzymes or crispr-cas systems for target sequences and conveying results thereof
EP2931899A1 (en) * 2012-12-12 2015-10-21 The Broad Institute, Inc. Functional genomics using crispr-cas systems, compositions, methods, knock out libraries and applications thereof
US20140310830A1 (en) 2012-12-12 2014-10-16 Feng Zhang CRISPR-Cas Nickase Systems, Methods And Compositions For Sequence Manipulation in Eukaryotes
WO2014093709A1 (en) 2012-12-12 2014-06-19 The Broad Institute, Inc. Methods, models, systems, and apparatus for identifying target sequences for cas enzymes or crispr-cas systems for target sequences and conveying results thereof
CN113355357B (zh) * 2012-12-12 2024-12-03 布罗德研究所有限公司 对用于序列操纵的改进的系统、方法和酶组合物进行的工程化和优化
EP2840140B2 (en) * 2012-12-12 2023-02-22 The Broad Institute, Inc. Crispr-Cas based method for mutation of prokaryotic cells
US8697359B1 (en) * 2012-12-12 2014-04-15 The Broad Institute, Inc. CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products
DK2931891T3 (da) * 2012-12-17 2019-08-19 Harvard College Rna-styret modificering af menneskelige genomer
CA2898184A1 (en) 2013-01-16 2014-07-24 Emory University Cas9-nucleic acid complexes and uses related thereto
US10660943B2 (en) 2013-02-07 2020-05-26 The Rockefeller University Sequence specific antimicrobials
US11135273B2 (en) 2013-02-07 2021-10-05 The Rockefeller University Sequence specific antimicrobials
CN103981147B (zh) 2013-02-08 2017-11-10 中国科学院上海生命科学研究院 一种新的制备肝实质细胞的方法
PT2963113T (pt) * 2013-02-14 2020-02-14 Univ Osaka Método para isolar região genómica específica utilizando molécula que se liga especificamente a sequência de adn endógena
MX384291B (es) 2013-02-20 2025-03-14 Regeneron Pharma Modificación genética de ratas.
EP2922393B2 (en) 2013-02-27 2022-12-28 Helmholtz Zentrum München - Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit und Umwelt (GmbH) Gene editing in the oocyte by cas9 nucleases
EP2971184B1 (en) 2013-03-12 2019-04-17 President and Fellows of Harvard College Method of generating a three-dimensional nucleic acid containing matrix
RU2662932C2 (ru) 2013-03-14 2018-07-31 Карибо Биосайенсиз, Инк. Композиции и способы с участием нуклеиновых кислот, нацеленных на нуклеиновые кислоты
US9957515B2 (en) 2013-03-15 2018-05-01 Cibus Us Llc Methods and compositions for targeted gene modification
EP4136963B1 (en) * 2013-03-15 2026-01-21 Cibus US LLC Methods and compositions for increasing efficiency of targeted gene modification using oligonucleotide-mediated gene repair
US10760064B2 (en) 2013-03-15 2020-09-01 The General Hospital Corporation RNA-guided targeting of genetic and epigenomic regulatory proteins to specific genomic loci
US20140349400A1 (en) * 2013-03-15 2014-11-27 Massachusetts Institute Of Technology Programmable Modification of DNA
US20140273230A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 Sigma-Aldrich Co., Llc Crispr-based genome modification and regulation
CA2905135C (en) * 2013-03-15 2022-10-25 Cibus Us Llc Targeted gene modification using oligonucleotide-mediated gene repair
US9234213B2 (en) * 2013-03-15 2016-01-12 System Biosciences, Llc Compositions and methods directed to CRISPR/Cas genomic engineering systems
CN112301024A (zh) * 2013-03-15 2021-02-02 通用医疗公司 使用RNA引导的FokI核酸酶(RFN)提高RNA引导的基因组编辑的特异性
US12331303B2 (en) 2013-03-15 2025-06-17 Cibus Us Llc Methods and compositions for increasing efficiency of targeted gene modification using oligonucleotide-mediated gene repair
WO2014144155A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 Regents Of The University Of Minnesota Engineering plant genomes using crispr/cas systems
WO2014204578A1 (en) 2013-06-21 2014-12-24 The General Hospital Corporation Using rna-guided foki nucleases (rfns) to increase specificity for rna-guided genome editing
US9788534B2 (en) 2013-03-18 2017-10-17 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
US9828582B2 (en) 2013-03-19 2017-11-28 Duke University Compositions and methods for the induction and tuning of gene expression
DK3456831T3 (da) 2013-04-16 2021-09-06 Regeneron Pharma Målrettet modifikation af rottegenom
US20160186208A1 (en) * 2013-04-16 2016-06-30 Whitehead Institute For Biomedical Research Methods of Mutating, Modifying or Modulating Nucleic Acid in a Cell or Nonhuman Mammal
US9783618B2 (en) 2013-05-01 2017-10-10 Kymab Limited Manipulation of immunoglobulin gene diversity and multi-antibody therapeutics
US9783593B2 (en) 2013-05-02 2017-10-10 Kymab Limited Antibodies, variable domains and chains tailored for human use
US11707056B2 (en) 2013-05-02 2023-07-25 Kymab Limited Animals, repertoires and methods
EP2994531B1 (en) 2013-05-10 2018-03-28 Sangamo Therapeutics, Inc. Delivery methods and compositions for nuclease-mediated genome engineering
WO2014186435A2 (en) 2013-05-14 2014-11-20 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Compositions and methods for reducing neointima formation
CN105683376A (zh) * 2013-05-15 2016-06-15 桑格摩生物科学股份有限公司 用于治疗遗传病状的方法和组合物
WO2014186686A2 (en) * 2013-05-17 2014-11-20 Two Blades Foundation Targeted mutagenesis and genome engineering in plants using rna-guided cas nucleases
CA2913234A1 (en) * 2013-05-22 2014-11-27 Northwestern University Rna-directed dna cleavage and gene editing by cas9 enzyme from neisseria meningitidis
US9873907B2 (en) 2013-05-29 2018-01-23 Agilent Technologies, Inc. Method for fragmenting genomic DNA using CAS9
EP3004339B1 (en) * 2013-05-29 2021-07-07 Cellectis New compact scaffold of cas9 in the type ii crispr system
AU2014273082B2 (en) * 2013-05-29 2018-11-08 Cellectis A method for producing precise DNA cleavage using Cas9 nickase activity
US9267135B2 (en) 2013-06-04 2016-02-23 President And Fellows Of Harvard College RNA-guided transcriptional regulation
SG10201913068PA (en) * 2013-06-04 2020-02-27 Harvard College Rna-guided transcriptional regulation
WO2014197748A2 (en) * 2013-06-05 2014-12-11 Duke University Rna-guided gene editing and gene regulation
US9982277B2 (en) 2013-06-11 2018-05-29 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for target DNA modification
JP2016521561A (ja) 2013-06-14 2016-07-25 セレクティス 植物における非トランスジェニックのゲノム編集のための方法
WO2014204724A1 (en) * 2013-06-17 2014-12-24 The Broad Institute Inc. Delivery, engineering and optimization of tandem guide systems, methods and compositions for sequence manipulation
RU2716420C2 (ru) 2013-06-17 2020-03-11 Те Брод Инститьют Инк. Доставка и применение систем crispr-cas, векторов и композиций для целенаправленного воздействия и терапии в печени
MX374532B (es) 2013-06-17 2025-03-06 Broad Inst Inc Suministro, uso y aplicaciones terapéuticas de los sistemas y composiciones crispr-cas, para actuar sobre trastornos y enfermedades utilizando componentes víricos.
CN105683379A (zh) * 2013-06-17 2016-06-15 布罗德研究所有限公司 用于对有丝分裂后细胞的疾病和障碍进行靶向和建模的系统、方法和组合物的递送、工程化和优化
EP3725885A1 (en) 2013-06-17 2020-10-21 The Broad Institute, Inc. Functional genomics using crispr-cas systems, compositions methods, screens and applications thereof
CN105492611A (zh) 2013-06-17 2016-04-13 布罗德研究所有限公司 用于序列操纵的优化的crispr-cas双切口酶系统、方法以及组合物
ES2929143T3 (es) * 2013-07-09 2022-11-25 Harvard College Ingeniería genómica guiada por ARN múltiplex
EP3666892A1 (en) * 2013-07-10 2020-06-17 President and Fellows of Harvard College Orthogonal cas9 proteins for rna-guided gene regulation and editing
JP6482546B2 (ja) * 2013-07-19 2019-03-13 ラリクス・バイオサイエンス・リミテッド・ライアビリティ・カンパニーＬａｒｉｘ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ， Ｌｌｃ 二重対立遺伝子ノックアウトを生成するための方法および組成物
US11306328B2 (en) 2013-07-26 2022-04-19 President And Fellows Of Harvard College Genome engineering
US10421957B2 (en) 2013-07-29 2019-09-24 Agilent Technologies, Inc. DNA assembly using an RNA-programmable nickase
US9944925B2 (en) 2013-08-02 2018-04-17 Enevolv, Inc. Processes and host cells for genome, pathway, and biomolecular engineering
US9163284B2 (en) 2013-08-09 2015-10-20 President And Fellows Of Harvard College Methods for identifying a target site of a Cas9 nuclease
WO2015021426A1 (en) * 2013-08-09 2015-02-12 Sage Labs, Inc. A crispr/cas system-based novel fusion protein and its application in genome editing
CN120574876A (zh) 2013-08-22 2025-09-02 纳幕尔杜邦公司 使用向导rna/cas内切核酸酶系统的植物基因组修饰及其使用方法
US9359599B2 (en) 2013-08-22 2016-06-07 President And Fellows Of Harvard College Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof
EP4074330A1 (en) * 2013-09-05 2022-10-19 Massachusetts Institute of Technology Tuning microbial populations with programmable nucleases
US9322037B2 (en) 2013-09-06 2016-04-26 President And Fellows Of Harvard College Cas9-FokI fusion proteins and uses thereof
US9228207B2 (en) * 2013-09-06 2016-01-05 President And Fellows Of Harvard College Switchable gRNAs comprising aptamers
US9526784B2 (en) 2013-09-06 2016-12-27 President And Fellows Of Harvard College Delivery system for functional nucleases
IL312865B2 (en) 2013-09-11 2025-06-01 Eagle Biologics Inc Liquid protein formulations containing viscosity-lowering agents
EP3988649B1 (en) 2013-09-18 2024-11-27 Kymab Limited Methods, cells and organisms
AU2014330922A1 (en) 2013-10-01 2016-03-03 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
WO2015065964A1 (en) 2013-10-28 2015-05-07 The Broad Institute Inc. Functional genomics using crispr-cas systems, compositions, methods, screens and applications thereof
WO2015066119A1 (en) 2013-10-30 2015-05-07 North Carolina State University Compositions and methods related to a type-ii crispr-cas system in lactobacillus buchneri
NZ746567A (en) * 2013-11-04 2019-09-27 Dow Agrosciences Llc Optimal soybean loci
US10752906B2 (en) * 2013-11-05 2020-08-25 President And Fellows Of Harvard College Precise microbiota engineering at the cellular level
CN106459995B (zh) 2013-11-07 2020-02-21 爱迪塔斯医药有限公司 使用统治型gRNA的CRISPR相关方法和组合物
US11326209B2 (en) * 2013-11-07 2022-05-10 Massachusetts Institute Of Technology Cell-based genomic recorded accumulative memory
CA2930877A1 (en) * 2013-11-18 2015-05-21 Crispr Therapeutics Ag Crispr-cas system materials and methods
US9074199B1 (en) 2013-11-19 2015-07-07 President And Fellows Of Harvard College Mutant Cas9 proteins
US10787684B2 (en) * 2013-11-19 2020-09-29 President And Fellows Of Harvard College Large gene excision and insertion
EP3080279B1 (en) 2013-12-11 2018-09-26 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for the targeted modification of a genome
KR102170502B1 (ko) 2013-12-11 2020-10-28 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 게놈의 표적화된 변형을 위한 방법 및 조성물
SG10201804975PA (en) 2013-12-12 2018-07-30 Broad Inst Inc Delivery, Use and Therapeutic Applications of the Crispr-Cas Systems and Compositions for HBV and Viral Diseases and Disorders
WO2015089427A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 The Broad Institute Inc. Crispr-cas systems and methods for altering expression of gene products, structural information and inducible modular cas enzymes
EP3470089A1 (en) * 2013-12-12 2019-04-17 The Broad Institute Inc. Delivery, use and therapeutic applications of the crispr-cas systems and compositions for targeting disorders and diseases using particle delivery components
WO2015089364A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 The Broad Institute Inc. Crystal structure of a crispr-cas system, and uses thereof
JP7103750B2 (ja) * 2013-12-12 2022-07-20 ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッド ゲノム編集のためのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系及び組成物の送達、使用及び治療適用
JP6712948B2 (ja) * 2013-12-12 2020-06-24 ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッド 組成物、及びヌクレオチドリピート障害におけるｃｒｉｓｐｒ−ｃａｓ系の使用方法
EP3835419A1 (en) * 2013-12-12 2021-06-16 The Regents of The University of California Methods and compositions for modifying a single stranded target nucleic acid
EP3080259B1 (en) 2013-12-12 2023-02-01 The Broad Institute, Inc. Engineering of systems, methods and optimized guide compositions with new architectures for sequence manipulation
US20150165054A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 President And Fellows Of Harvard College Methods for correcting caspase-9 point mutations
JP6793547B2 (ja) 2013-12-12 2020-12-02 ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッド 最適化機能ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系による配列操作のための系、方法および組成物
US20160304893A1 (en) * 2013-12-13 2016-10-20 Cellectis Cas9 nuclease platform for microalgae genome engineering
WO2015089375A1 (en) 2013-12-13 2015-06-18 The General Hospital Corporation Soluble high molecular weight (hmw) tau species and applications thereof
US20150191744A1 (en) * 2013-12-17 2015-07-09 University Of Massachusetts Cas9 effector-mediated regulation of transcription, differentiation and gene editing/labeling
EP3083958B1 (en) 2013-12-19 2019-04-17 Amyris, Inc. Methods for genomic integration
ES2918501T3 (es) 2013-12-19 2022-07-18 Novartis Ag Receptores de antígenos quiméricos de mesotelina humana y usos de los mismos
US12318377B2 (en) 2013-12-20 2025-06-03 Seed Health, Inc. Method and system for reducing the likelihood of a porphyromonas gingivalis infection in a human being
US11826388B2 (en) 2013-12-20 2023-11-28 Seed Health, Inc. Topical application of Lactobacillus crispatus to ameliorate barrier damage and inflammation
EP3087101B1 (en) 2013-12-20 2024-06-05 Novartis AG Regulatable chimeric antigen receptor
US11672835B2 (en) 2013-12-20 2023-06-13 Seed Health, Inc. Method for treating individuals having cancer and who are receiving cancer immunotherapy
US11026982B2 (en) 2015-11-30 2021-06-08 Joseph E. Kovarik Method for reducing the likelihood of developing bladder or colorectal cancer in an individual human being
US11969445B2 (en) 2013-12-20 2024-04-30 Seed Health, Inc. Probiotic composition and method for controlling excess weight, obesity, NAFLD and NASH
US11642382B2 (en) 2013-12-20 2023-05-09 Seed Health, Inc. Method for treating an individual suffering from bladder cancer
US12329783B2 (en) 2013-12-20 2025-06-17 Seed Health, Inc. Method and system to improve the health of a person's skin microbiome
US11980643B2 (en) 2013-12-20 2024-05-14 Seed Health, Inc. Method and system to modify an individual's gut-brain axis to provide neurocognitive protection
US11213552B2 (en) 2015-11-30 2022-01-04 Joseph E. Kovarik Method for treating an individual suffering from a chronic infectious disease and cancer
US11833177B2 (en) 2013-12-20 2023-12-05 Seed Health, Inc. Probiotic to enhance an individual's skin microbiome
NZ759969A (en) 2013-12-20 2022-12-23 Fred Hutchinson Cancer Center Tagged chimeric effector molecules and receptors thereof
US11529379B2 (en) 2013-12-20 2022-12-20 Seed Health, Inc. Method and system for reducing the likelihood of developing colorectal cancer in an individual human being
US11998574B2 (en) 2013-12-20 2024-06-04 Seed Health, Inc. Method and system for modulating an individual's skin microbiome
US12246043B2 (en) 2013-12-20 2025-03-11 Seed Health, Inc. Topical application to treat acne vulgaris
US12005085B2 (en) 2013-12-20 2024-06-11 Seed Health, Inc. Probiotic method and composition for maintaining a healthy vaginal microbiome
US11839632B2 (en) 2013-12-20 2023-12-12 Seed Health, Inc. Topical application of CRISPR-modified bacteria to treat acne vulgaris
CA2935032C (en) * 2013-12-26 2024-01-23 The General Hospital Corporation Multiplex guide rnas
EP3089989B1 (en) * 2013-12-31 2020-06-24 The Regents of The University of California Cas9 crystals and methods of use thereof
WO2015105928A1 (en) * 2014-01-08 2015-07-16 President And Fellows Of Harvard College Rna-guided gene drives
KR20160128306A (ko) 2014-01-14 2016-11-07 램 테라퓨틱스, 인코포레이티드 돌연변이유발 방법
US10787654B2 (en) 2014-01-24 2020-09-29 North Carolina State University Methods and compositions for sequence guiding Cas9 targeting
JP2017503514A (ja) * 2014-01-24 2017-02-02 ノースカロライナ ステート ユニバーシティーＮｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃａｓ９ターゲッティングをガイドする配列に関する方法および組成物
US11315659B2 (en) * 2014-01-27 2022-04-26 Georgia Tech Research Corporation Methods and systems for identifying nucleotide-guided nuclease off-target sites
WO2015113063A1 (en) 2014-01-27 2015-07-30 Georgia Tech Research Corporation Methods and systems for identifying crispr/cas off-target sites
US9850525B2 (en) * 2014-01-29 2017-12-26 Agilent Technologies, Inc. CAS9-based isothermal method of detection of specific DNA sequence
ES2833299T3 (es) * 2014-02-04 2021-06-14 Jumpcode Genomics Inc Fraccionamiento del genoma
US20180142307A1 (en) * 2014-02-11 2018-05-24 California Institute Of Technology Recording and mapping lineage information and molecular events in individual cells
EP3690044B1 (en) 2014-02-11 2024-01-10 The Regents of the University of Colorado, a body corporate Crispr enabled multiplexed genome engineering
US10287590B2 (en) * 2014-02-12 2019-05-14 Dna2.0, Inc. Methods for generating libraries with co-varying regions of polynuleotides for genome modification
EP3105325B2 (en) * 2014-02-13 2024-10-23 Takara Bio USA, Inc. Methods of depleting a target molecule from an initial collection of nucleic acids, and compositions and kits for practicing the same
US10286084B2 (en) * 2014-02-18 2019-05-14 Duke University Compositions for the inactivation of virus replication and methods of making and using the same
WO2015127439A1 (en) * 2014-02-24 2015-08-27 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for nuclease-mediated targeted integration
ES2898460T3 (es) 2014-02-27 2022-03-07 Monsanto Technology Llc Composiciones y procedimientos para la modificación genómica dirigida al sitio
CN103820454B (zh) * 2014-03-04 2016-03-30 上海金卫生物技术有限公司 CRISPR-Cas9特异性敲除人PD1基因的方法以及用于特异性靶向PD1基因的sgRNA
EP3115457B1 (en) * 2014-03-05 2019-10-02 National University Corporation Kobe University Genomic sequence modification method for specifically converting nucleic acid bases of targeted dna sequence, and molecular complex for use in same
US11028388B2 (en) 2014-03-05 2021-06-08 Editas Medicine, Inc. CRISPR/Cas-related methods and compositions for treating Usher syndrome and retinitis pigmentosa
ES2745769T3 (es) 2014-03-10 2020-03-03 Editas Medicine Inc Procedimientos y composiciones relacionados con CRISPR/CAS para tratar la amaurosis congénita de Leber 10 (LCA10)
US11141493B2 (en) 2014-03-10 2021-10-12 Editas Medicine, Inc. Compositions and methods for treating CEP290-associated disease
US11339437B2 (en) 2014-03-10 2022-05-24 Editas Medicine, Inc. Compositions and methods for treating CEP290-associated disease
KR102450868B1 (ko) 2014-03-14 2022-10-06 시버스 유에스 엘엘씨 올리고뉴클레오타이드 매개 유전자 보수를 사용한 표적화된 유전자 변형의 효율을 증가시키기 위한 방법 및 조성물
US20170335281A1 (en) 2014-03-15 2017-11-23 Novartis Ag Treatment of cancer using chimeric antigen receptor
ES2857226T3 (es) 2014-03-15 2021-09-28 Novartis Ag Receptor de antígeno quimérico regulable
PL3628334T3 (pl) * 2014-03-21 2023-12-18 Genzyme Corporation Terapia genowa w retinopatii barwnikowej
HUE054419T2 (hu) 2014-03-24 2021-09-28 Immco Diagnostics Inc Javított antinukleárisellenanyag-kimutatás és diagnosztika szisztémás és nem szisztémás autoimmun betegségekhez
WO2015148680A1 (en) * 2014-03-25 2015-10-01 Ginkgo Bioworks, Inc. Methods and genetic systems for cell engineering
EP3122880B1 (en) 2014-03-26 2021-05-05 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating sickle cell disease
CA2944141C (en) * 2014-03-28 2023-03-28 Aposense Ltd. Compounds and methods for trans-membrane delivery of molecules
US11318206B2 (en) 2014-03-28 2022-05-03 Aposense Ltd Compounds and methods for trans-membrane delivery of molecules
WO2015153791A1 (en) * 2014-04-01 2015-10-08 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating herpes simplex virus type 2 (hsv-2)
EP3540061A1 (en) 2014-04-02 2019-09-18 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating primary open angle glaucoma
CN106170550A (zh) * 2014-04-03 2016-11-30 麻省理工学院 用于产生导引rna的方法和组合物
AU2015244039B2 (en) 2014-04-07 2021-10-21 Novartis Ag Treatment of cancer using anti-CD19 chimeric antigen receptor
JP2017512481A (ja) 2014-04-08 2017-05-25 ノースカロライナ ステート ユニバーシティーＮｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｒｉｓｐｒ関連遺伝子を用いた、ｒｎａ依存性の転写抑制のための方法および組成物
WO2015161276A2 (en) * 2014-04-18 2015-10-22 Editas Medicine, Inc. Crispr-cas-related methods, compositions and components for cancer immunotherapy
MX375592B (es) 2014-04-25 2025-03-06 The Children´S Medical Center Corp Composiciones y su uso para tratar hemoglobinopatias.
BR112016024945A2 (pt) 2014-04-28 2017-10-24 Recombinetics Inc edição de gene multiplex em suínos
WO2015168404A1 (en) * 2014-04-30 2015-11-05 Massachusetts Institute Of Technology Toehold-gated guide rna for programmable cas9 circuitry with rna input
US11918695B2 (en) 2014-05-09 2024-03-05 Yale University Topical formulation of hyperbranched polymer-coated particles
ES2966886T3 (es) 2014-05-09 2024-04-24 Univ Yale Partículas recubiertas con poliglicerol hiperramificado y métodos de elaboración y uso de las mismas
WO2015175642A2 (en) * 2014-05-13 2015-11-19 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for prevention or treatment of a disease
PL3145934T3 (pl) 2014-05-19 2021-08-16 Pfizer Inc. Podstawione związki 6,8-dioksabicyklo[3.2.1]oktano-2,3-diolu jako środki kierujące do ASGPR
US20170175143A1 (en) * 2014-05-20 2017-06-22 Regents Of The University Of Minnesota Method for editing a genetic sequence
SG10201801654RA (en) 2014-05-28 2018-04-27 Childrens Hospital Med Ct Methods and systems for converting precursor cells into gastric tissues through directed differentiation
WO2015184259A1 (en) 2014-05-30 2015-12-03 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Compositions and methods to treat latent viral infections
WO2015188056A1 (en) * 2014-06-05 2015-12-10 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for nuclease design
HRP20200529T1 (hr) 2014-06-06 2020-09-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Postupci i pripravci za modificiranje ciljnog lokusa
US11274302B2 (en) * 2016-08-17 2022-03-15 Diacarta Ltd Specific synthetic chimeric Xenonucleic acid guide RNA; s(XNA-gRNA) for enhancing CRISPR mediated genome editing efficiency
EP3155116A4 (en) * 2014-06-10 2017-12-27 Massachusetts Institute Of Technology Method for gene editing
AU2015324564B2 (en) 2014-06-11 2021-07-01 Duke University Compositions and methods for rapid and dynamic flux control using synthetic metabolic valves
CN106536056B (zh) 2014-06-13 2021-07-16 儿童医学中心公司 分离线粒体的产品和方法
US20170107541A1 (en) * 2014-06-17 2017-04-20 Poseida Therapeutics, Inc. A method for directing proteins to specific loci in the genome and uses thereof
CN106604994B (zh) 2014-06-23 2021-12-14 通用医疗公司 通过测序评估的DSBs的全基因组无偏鉴定(GUIDE-Seq)
ES2781323T3 (es) 2014-06-23 2020-09-01 Regeneron Pharma Montaje de ADN mediado por nucleasas
SI3161128T1 (sl) 2014-06-26 2019-02-28 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Postopki in sestavki za ciljano genetsko spremembo in postopki uporabe
US10676754B2 (en) 2014-07-11 2020-06-09 E I Du Pont De Nemours And Company Compositions and methods for producing plants resistant to glyphosate herbicide
WO2016007839A1 (en) 2014-07-11 2016-01-14 President And Fellows Of Harvard College Methods for high-throughput labelling and detection of biological features in situ using microscopy
CA2954791C (en) * 2014-07-14 2025-11-18 The Regents Of The University Of California CRISPR/CAS TRANSCRIPTIONAL MODULATION
US20170219596A1 (en) * 2014-07-14 2017-08-03 The Regents Of The University Of California A protein tagging system for in vivo single molecule imaging and control of gene transcription
KR20170032406A (ko) 2014-07-15 2017-03-22 주노 쎄러퓨티크스 인코퍼레이티드 입양 세포 치료를 위한 조작된 세포
US20160053272A1 (en) * 2014-07-18 2016-02-25 Whitehead Institute For Biomedical Research Methods Of Modifying A Sequence Using CRISPR
US20160053304A1 (en) * 2014-07-18 2016-02-25 Whitehead Institute For Biomedical Research Methods Of Depleting Target Sequences Using CRISPR
BR112017001183A2 (pt) 2014-07-21 2017-11-28 Novartis Ag tratamento de câncer usando receptor de antígeno quimérico anti-bcma humanizado
US11542488B2 (en) 2014-07-21 2023-01-03 Novartis Ag Sortase synthesized chimeric antigen receptors
JP2017528433A (ja) 2014-07-21 2017-09-28 ノバルティス アーゲー 低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤とＣＡＲの組み合わせ
CA2955382C (en) * 2014-07-21 2023-07-18 Illumina, Inc. Polynucleotide enrichment using crispr-cas systems
TWI719942B (zh) 2014-07-21 2021-03-01 瑞士商諾華公司 使用ｃｄ３３嵌合抗原受體治療癌症
US10077453B2 (en) 2014-07-30 2018-09-18 President And Fellows Of Harvard College CAS9 proteins including ligand-dependent inteins
EP4205749A1 (en) 2014-07-31 2023-07-05 Novartis AG Subset-optimized chimeric antigen receptor-containing cells
US20160076093A1 (en) * 2014-08-04 2016-03-17 University Of Washington Multiplex homology-directed repair
EP4194557A1 (en) 2014-08-06 2023-06-14 Institute for Basic Science Genome editing using campylobacter jejuni crispr/cas system-derived rgen
WO2016022866A1 (en) * 2014-08-07 2016-02-11 Agilent Technologies, Inc. Cis-blocked guide rna
US10513711B2 (en) 2014-08-13 2019-12-24 Dupont Us Holding, Llc Genetic targeting in non-conventional yeast using an RNA-guided endonuclease
WO2016025759A1 (en) 2014-08-14 2016-02-18 Shen Yuelei Dna knock-in system
AU2015301460B2 (en) 2014-08-14 2021-04-08 Novartis Ag Treatment of cancer using GFR alpha-4 chimeric antigen receptor
US9879270B2 (en) * 2014-08-15 2018-01-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Constructs and methods for genome editing and genetic engineering of fungi and protists
EP3633047B1 (en) 2014-08-19 2022-12-28 Pacific Biosciences of California, Inc. Method of sequencing nucleic acids based on an enrichment of nucleic acids
EP3183358B1 (en) 2014-08-19 2020-10-07 President and Fellows of Harvard College Rna-guided systems for probing and mapping of nucleic acids
MX2017002205A (es) 2014-08-19 2017-08-21 Novartis Ag Receptor quimerico de antigeno (car) anti-cd123 para uso en el tratamiento de cancer.
US10435685B2 (en) 2014-08-19 2019-10-08 Pacific Biosciences Of California, Inc. Compositions and methods for enrichment of nucleic acids
SG11201701245QA (en) 2014-08-27 2017-03-30 Caribou Biosciences Inc Methods for increasing cas9-mediated engineering efficiency
EP3186375A4 (en) * 2014-08-28 2019-03-13 North Carolina State University Novel CAS9 PROTEINS AND CHARACTERISTICS FOR DNA TARGETING AND GENOME EDITING
EP3188763B1 (en) 2014-09-02 2020-05-13 The Regents of The University of California Methods and compositions for rna-directed target dna modification
MX2017002930A (es) 2014-09-12 2017-06-06 Du Pont Generacion de sitios de integracion especifica de sitio para loci de rasgos complejos en maiz y soja, y metodos de uso.
JP6839074B2 (ja) 2014-09-17 2021-03-03 ノバルティス アーゲー 養子免疫療法のためのキメラ受容体での細胞毒性細胞のターゲティング
WO2016049024A2 (en) * 2014-09-24 2016-03-31 The Broad Institute Inc. Delivery, use and therapeutic applications of the crispr-cas systems and compositions for modeling competition of multiple cancer mutations in vivo
WO2016049531A1 (en) 2014-09-26 2016-03-31 Purecircle Usa Inc. Single nucleotide polymorphism (snp) markers for stevia
JP2017534295A (ja) 2014-09-29 2017-11-24 ザ ジャクソン ラボラトリー エレクトロポレーションによる遺伝子改変哺乳動物の高効率ハイスループット生成
US20170233762A1 (en) * 2014-09-29 2017-08-17 The Regents Of The University Of California Scaffold rnas
AU2015325055B2 (en) 2014-10-01 2021-02-25 Eagle Biologics, Inc. Polysaccharide and nucleic acid formulations containing viscosity-lowering agents
WO2016050512A1 (en) 2014-10-03 2016-04-07 Bayer Cropscience Nv Methods and means for increasing stress tolerance and biomass in plants
AU2015330699B2 (en) 2014-10-10 2021-12-02 Editas Medicine, Inc. Compositions and methods for promoting homology directed repair
BR112017007770A2 (pt) 2014-10-15 2018-01-16 Regeneron Pharma cultura in vitro, população de hipscs, método para modificar um locus-alvo genômico, e, hipsc.
WO2016061523A1 (en) * 2014-10-17 2016-04-21 Howard Hughes Medical Institute Genomic probes
WO2016065364A1 (en) * 2014-10-24 2016-04-28 Life Technologies Corporation Compositions and methods for enhancing homologous recombination
GB201418965D0 (sr) 2014-10-24 2014-12-10 Ospedale San Raffaele And Fond Telethon
US20170335331A1 (en) 2014-10-31 2017-11-23 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Altering Gene Expression in CART Cells and Uses Thereof
TWI716367B (zh) * 2014-10-31 2021-01-21 麻省理工學院 用於常間回文重複序列叢集（ｃｒｉｓｐｒ）之大量平行組合性基因學
WO2016073559A1 (en) * 2014-11-05 2016-05-12 The Regents Of The University Of California Methods for autocatalytic genome editing and neutralizing autocatalytic genome editing
JP6823593B2 (ja) 2014-11-06 2021-02-03 イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニーＥ．Ｉ．Ｄｕ Ｐｏｎｔ Ｄｅ Ｎｅｍｏｕｒｓ Ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｒｎａ誘導型エンドヌクレアーゼの細胞へのペプチド媒介輸送
EP4464338A3 (en) 2014-11-07 2025-02-12 Editas Medicine, Inc. Systems for improving crispr/cas-mediated genome-editing
WO2016080097A1 (ja) * 2014-11-17 2016-05-26 国立大学法人東京医科歯科大学 簡便で高効率の遺伝子改変非ヒト哺乳動物の作製方法
CN104531632A (zh) * 2014-11-18 2015-04-22 李云英 快速降解的Cas9-ODC422-461融合蛋白及其应用
KR102531016B1 (ko) 2014-11-21 2023-05-10 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 쌍 형성된 가이드 rna를 사용하는 표적화된 유전자 변형을 위한 방법 및 조성물
CN107208070B (zh) * 2014-11-26 2021-09-07 技术创新动力基金（以色列）有限合伙公司 细菌基因的靶向消除
GB201421096D0 (en) 2014-11-27 2015-01-14 Imp Innovations Ltd Genome editing methods
WO2016089883A1 (en) * 2014-12-01 2016-06-09 Novartis Ag Compositions and methods for diagnosis and treatment of prostate cancer
CA2969619A1 (en) 2014-12-03 2016-06-09 Agilent Technologies, Inc. Guide rna with chemical modifications
CN116059378A (zh) 2014-12-10 2023-05-05 明尼苏达大学董事会 用于治疗疾病的遗传修饰的细胞、组织和器官
US12359197B2 (en) 2014-12-12 2025-07-15 Etagen Pharma, Inc. Compositions and methods for editing nucleic acids in cells utilizing oligonucleotides
EP3889260A1 (en) 2014-12-12 2021-10-06 The Broad Institute, Inc. Protected guide rnas (pgrnas)
WO2016094874A1 (en) * 2014-12-12 2016-06-16 The Broad Institute Inc. Escorted and functionalized guides for crispr-cas systems
WO2016093668A2 (ko) * 2014-12-12 2016-06-16 한국한의학연구원 일체형 유전자 치료 유도만능줄기세포 제작방법
CN113215115B (zh) 2014-12-16 2024-07-02 C3J治疗公司 用于体外病毒基因组工程的组合物和方法
KR102424626B1 (ko) * 2014-12-17 2022-07-25 이 아이 듀폰 디 네모아 앤드 캄파니 원형 폴리뉴클레오티드 변형 주형과 함께 가이드 RNA/Cas 엔도뉴클레아제 시스템을 이용하여 대장균에서 효율적으로 유전자 편집을 하기 위한 조성물 및 방법
CA2970683A1 (en) 2014-12-18 2016-06-23 Integrated Dna Technologies, Inc. Crispr-based compositions and methods of use
WO2016097751A1 (en) * 2014-12-18 2016-06-23 The University Of Bath Method of cas9 mediated genome engineering
US10196613B2 (en) 2014-12-19 2019-02-05 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Stem cells for modeling type 2 diabetes
WO2016098078A2 (en) 2014-12-19 2016-06-23 Novartis Ag Dimerization switches and uses thereof
ES2947714T3 (es) 2014-12-19 2023-08-17 Regeneron Pharma Métodos y composiciones para la modificación genética dirigida a través de múltiples direccionamientos en un solo paso
WO2016100955A2 (en) 2014-12-20 2016-06-23 Identifygenomics, Llc Compositions and methods for targeted depletion, enrichment, and partitioning of nucleic acids using crispr/cas system proteins
WO2016106121A1 (en) 2014-12-23 2016-06-30 Syngenta Participations Ag Methods and compositions for identifying and enriching for cells comprising site specific genomic modifications
CA2970370A1 (en) 2014-12-24 2016-06-30 Massachusetts Institute Of Technology Crispr having or associated with destabilization domains
JP2018500037A (ja) 2014-12-31 2018-01-11 シンセティック ジェノミクス インコーポレーテッド 高効率なインビボゲノム編集のための組成物及び方法
WO2016110453A1 (en) * 2015-01-06 2016-07-14 Dsm Ip Assets B.V. A crispr-cas system for a filamentous fungal host cell
EP3245232B1 (en) 2015-01-12 2021-04-21 The Regents of The University of California Heterodimeric cas9 and methods of use thereof
MA41349A (fr) * 2015-01-14 2017-11-21 Univ Temple Éradication de l'herpès simplex de type i et d'autres virus de l'herpès associés guidée par arn
US10059940B2 (en) * 2015-01-27 2018-08-28 Minghong Zhong Chemically ligated RNAs for CRISPR/Cas9-lgRNA complexes as antiviral therapeutic agents
JP2018503392A (ja) 2015-01-27 2018-02-08 中国科学院遺▲伝▼与▲発▼育生物学研究所Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ 遺伝子一過性発現により完全な植物において部位特異的改変を行うための方法
EP3250689B1 (en) 2015-01-28 2020-11-04 The Regents of The University of California Methods and compositions for labeling a single-stranded target nucleic acid
US9650617B2 (en) 2015-01-28 2017-05-16 Pioneer Hi-Bred International. Inc. CRISPR hybrid DNA/RNA polynucleotides and methods of use
WO2016123578A1 (en) * 2015-01-30 2016-08-04 The Regents Of The University Of California Protein delivery in primary hematopoietic cells
KR102699584B1 (ko) 2015-02-02 2024-08-28 메이라지티엑스 유케이 Ii 리미티드 대안적 스플라이싱의 압타머 매개 조절에 의한 유전자 발현 제어
KR102763121B1 (ko) 2015-02-06 2025-02-04 내셔널 유니버시티 오브 싱가포르 치료적 면역 세포의 효능의 향상 방법
WO2016130600A2 (en) 2015-02-09 2016-08-18 Duke University Compositions and methods for epigenome editing
JP6354100B2 (ja) * 2015-02-19 2018-07-11 国立大学法人徳島大学 Ｃａｓ９ ｍＲＮＡを哺乳動物の受精卵にエレクトロポレーションにより導入する方法
WO2016135559A2 (en) 2015-02-23 2016-09-01 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for treatment of human genetic diseases including hemoglobinopathies
WO2016137949A1 (en) * 2015-02-23 2016-09-01 Voyager Therapeutics, Inc. Regulatable expression using adeno-associated virus (aav)
BR112017017812A2 (en) 2015-02-23 2018-04-10 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for treatment of hemoglobinopathies
US10968536B2 (en) 2015-02-25 2021-04-06 Jumpcode Genomics, Inc. Methods and compositions for sequencing
KR20230156800A (ko) 2015-03-03 2023-11-14 더 제너럴 하스피탈 코포레이션 변경된 PAM 특이성을 갖는 조작된 CRISPR-Cas9 뉴클레아제
WO2016142427A1 (en) 2015-03-10 2016-09-15 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Method ank kit for reprogramming somatic cells
EP3858992A1 (en) 2015-03-13 2021-08-04 The Jackson Laboratory A three-component crispr/cas complex system and uses thereof
JP2018508221A (ja) 2015-03-16 2018-03-29 中国科学院遺▲伝▼与▲発▼育生物学研究所Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ 植物ゲノムの部位特異的改変の実施に非遺伝物質を適用する方法
WO2016149422A1 (en) * 2015-03-16 2016-09-22 The Broad Institute, Inc. Encoding of dna vector identity via iterative hybridization detection of a barcode transcript
EP3929291A1 (en) 2015-03-17 2021-12-29 Bio-Rad Laboratories, Inc. Detection of genome editing
JP6836999B2 (ja) 2015-03-24 2021-03-03 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニアＴｈｅ Ｒｅｇｅｎｔｓ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ アデノ随伴ウイルス変異体及びその使用方法
EP3274454B1 (en) * 2015-03-25 2021-08-25 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods, compositions and components
BR112017017260A2 (pt) 2015-03-27 2018-04-17 Du Pont construções de dna, vetor, célula, plantas, semente, método de expressão de rna e método de modificação de local alvo
JP2018513681A (ja) 2015-03-31 2018-05-31 エクセリゲン サイエンティフィック, インコーポレイテッドExeligen Scientific, Inc. 細胞または生物のゲノムへのＤＮＡ配列の標的化組み込みのためのＣａｓ９レトロウイルスインテグラーゼおよびＣａｓ９レコンビナーゼ系
KR102888521B1 (ko) 2015-04-06 2025-11-19 더 보드 어브 트러스티스 어브 더 리랜드 스탠포드 주니어 유니버시티 Crispr/cas-매개 유전자 조절을 위한 화학적으로 변형된 가이드 rna
EP3284749B1 (en) * 2015-04-13 2024-08-14 The University of Tokyo Set of polypeptides exhibiting nuclease activity or nickase activity with dependence on light or in presence of drug or suppressing or activating expression of target gene
EP3283090B1 (en) 2015-04-15 2023-06-07 Synthetic Genomics, Inc. Algal chloroplastic srp54 mutants
US11674144B2 (en) * 2015-04-16 2023-06-13 California Institute Of Technology Fractional regulation of transcription
EP3286211A1 (en) 2015-04-23 2018-02-28 Novartis AG Treatment of cancer using chimeric antigen receptor and protein kinase a blocker
JP2018522249A (ja) * 2015-04-24 2018-08-09 エディタス・メディシン、インコーポレイテッド Ｃａｓ９分子／ガイドｒｎａ分子複合体の評価
EP3288570A4 (en) 2015-04-29 2018-11-21 Fred Hutchinson Cancer Research Center Modified stem cells and uses thereof
WO2016178207A1 (en) * 2015-05-04 2016-11-10 Ramot At Tel-Aviv University Ltd. Methods and kits for fragmenting dna
EP3711488A1 (en) 2015-05-06 2020-09-23 Snipr Technologies Limited Altering microbial populations & modifying microbiota
US11572543B2 (en) 2015-05-08 2023-02-07 The Children's Medical Center. Corporation Targeting BCL11A enhancer functional regions for fetal hemoglobin reinduction
US11253616B2 (en) 2017-09-06 2022-02-22 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Small molecules for dual function positron emission tomography (PET) and cell suicide switches
CA2986310A1 (en) 2015-05-11 2016-11-17 Editas Medicine, Inc. Optimized crispr/cas9 systems and methods for gene editing in stem cells
WO2016183402A2 (en) * 2015-05-13 2016-11-17 President And Fellows Of Harvard College Methods of making and using guide rna for use with cas9 systems
CN107614680A (zh) * 2015-05-14 2018-01-19 南加利福尼亚大学 利用重组核酸内切酶系统的最佳化基因编辑
JP2018515142A (ja) * 2015-05-15 2018-06-14 ダーマコン，インコーポレイテッド． Ｃａｓ９介在遺伝子編集用の合成シングルガイドｒｎａ
AU2016263026A1 (en) 2015-05-15 2017-11-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Guide RNA/Cas endonuclease systems
EP3095870A1 (en) 2015-05-19 2016-11-23 Kws Saat Se Methods for the in planta transformation of plants and manufacturing processes and products based and obtainable therefrom
US10966414B2 (en) 2015-05-26 2021-04-06 California Institute Of Technology Population control using engineered translocations
US10117911B2 (en) 2015-05-29 2018-11-06 Agenovir Corporation Compositions and methods to treat herpes simplex virus infections
EA201792663A1 (ru) 2015-05-29 2018-04-30 Норт Каролина Стейт Юниверсити Способы скрининга бактерий, архей, водорослей и дрожжей с использованием нуклеиновых кислот crispr
US10883103B2 (en) 2015-06-02 2021-01-05 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for delivery of a polynucleotide into a plant
WO2016196655A1 (en) 2015-06-03 2016-12-08 The Regents Of The University Of California Cas9 variants and methods of use thereof
EP3303585A4 (en) * 2015-06-03 2018-10-31 Board of Regents of the University of Nebraska Dna editing using single-stranded dna
EP3302525A2 (en) 2015-06-05 2018-04-11 Novartis AG Methods and compositions for diagnosing, treating, and monitoring treatment of shank3 deficiency associated disorders
CN108026526B (zh) 2015-06-09 2023-05-12 爱迪塔斯医药公司 用于改善移植的crispr/cas相关方法和组合物
US20160362667A1 (en) 2015-06-10 2016-12-15 Caribou Biosciences, Inc. CRISPR-Cas Compositions and Methods
US20160362705A1 (en) 2015-06-12 2016-12-15 Lonza Walkersville, Inc. Methods for Nuclear Reprogramming Using Synthetic Transcription Factors
GB201510296D0 (en) * 2015-06-12 2015-07-29 Univ Wageningen Thermostable CAS9 nucleases
WO2016205276A1 (en) 2015-06-15 2016-12-22 North Carolina State University Methods and compositions for efficient delivery of nucleic acids and rna-based antimicrobials
IL316159A (en) 2015-06-15 2024-12-01 Mpeg La Llc Defined Oligonucleotide Multimers and Methods for Manufacture Thereof
JP2018518182A (ja) 2015-06-17 2018-07-12 ザ ユーエービー リサーチ ファンデーション ゲノム編集のためのｃｒｉｓｐｒ／ｃａｓ９複合体
US11473082B2 (en) * 2015-06-17 2022-10-18 Poseida Therapeutics, Inc. Compositions and methods for directing proteins to specific loci in the genome
JP2018518181A (ja) 2015-06-17 2018-07-12 ザ ユーエービー リサーチ ファンデーション 血液細胞系列の細胞に機能的ポリペプチドを導入するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体
WO2016205759A1 (en) 2015-06-18 2016-12-22 The Broad Institute Inc. Engineering and optimization of systems, methods, enzymes and guide scaffolds of cas9 orthologs and variants for sequence manipulation
WO2016205749A1 (en) * 2015-06-18 2016-12-22 The Broad Institute Inc. Novel crispr enzymes and systems
TWI906646B (zh) 2015-06-18 2025-12-01 美商博得學院股份有限公司 降低脫靶效應的ｃｒｉｓｐｒ酶突變
US9790490B2 (en) 2015-06-18 2017-10-17 The Broad Institute Inc. CRISPR enzymes and systems
WO2017004261A1 (en) 2015-06-29 2017-01-05 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modified crispr rna and modified single crispr rna and uses thereof
US11279928B2 (en) 2015-06-29 2022-03-22 Massachusetts Institute Of Technology Compositions comprising nucleic acids and methods of using the same
JP6765665B2 (ja) * 2015-07-13 2020-10-07 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 不稔化植物、不稔化植物の作出方法、及びベクター
JP7044373B2 (ja) 2015-07-15 2022-03-30 ラトガース，ザ ステート ユニバーシティ オブ ニュージャージー ヌクレアーゼ非依存的な標的化遺伝子編集プラットフォームおよびその用途
HK1255161A1 (zh) 2015-07-15 2019-08-09 Juno Therapeutics, Inc. 用於过继性细胞治疗的工程细胞
WO2017015101A1 (en) * 2015-07-17 2017-01-26 University Of Washington Methods for maximizing the efficiency of targeted gene correction
US10676735B2 (en) 2015-07-22 2020-06-09 Duke University High-throughput screening of regulatory element function with epigenome editing technologies
GB2592821B (en) 2015-07-31 2022-01-12 Univ Minnesota Modified cells and methods of therapy
WO2017024047A1 (en) * 2015-08-03 2017-02-09 Emendobio Inc. Compositions and methods for increasing nuclease induced recombination rate in cells
WO2017024318A1 (en) 2015-08-06 2017-02-09 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Targeted protein degradation to attenuate adoptive t-cell therapy associated adverse inflammatory responses
US9580727B1 (en) 2015-08-07 2017-02-28 Caribou Biosciences, Inc. Compositions and methods of engineered CRISPR-Cas9 systems using split-nexus Cas9-associated polynucleotides
AU2016306275A1 (en) 2015-08-07 2018-02-08 Arrowhead Pharmaceuticals, Inc. RNAi therapy for Hepatitis B virus infection
US11667691B2 (en) 2015-08-07 2023-06-06 Novartis Ag Treatment of cancer using chimeric CD3 receptor proteins
AU2016309392A1 (en) * 2015-08-14 2018-02-22 Institute Of Genetics And Developmental Biology, Chinese Academy Of Sciences Method for obtaining glyphosate-resistant rice by site-directed nucleotide substitution
CA3033909A1 (en) 2015-08-14 2017-02-23 The University Of Sydney Connexin 45 inhibition for therapy
US10538758B2 (en) 2015-08-19 2020-01-21 Arc Bio, Llc Capture of nucleic acids using a nucleic acid-guided nuclease-based system
US10898522B2 (en) 2015-08-19 2021-01-26 Children's Research Institute, Children's National Medical Center Compositions and methods for treating graft versus host disease
WO2017035416A2 (en) * 2015-08-25 2017-03-02 Duke University Compositions and methods of improving specificity in genomic engineering using rna-guided endonucleases
US9512446B1 (en) 2015-08-28 2016-12-06 The General Hospital Corporation Engineered CRISPR-Cas9 nucleases
DK3341483T3 (da) 2015-08-28 2020-03-16 Pioneer Hi Bred Int Ochrobactrum-medieret transformation af planter
JP6799586B2 (ja) 2015-08-28 2020-12-16 ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション 遺伝子操作ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ヌクレアーゼ
US9926546B2 (en) 2015-08-28 2018-03-27 The General Hospital Corporation Engineered CRISPR-Cas9 nucleases
WO2017040511A1 (en) 2015-08-31 2017-03-09 Agilent Technologies, Inc. Compounds and methods for crispr/cas-based genome editing by homologous recombination
WO2017040709A1 (en) 2015-08-31 2017-03-09 Caribou Biosciences, Inc. Directed nucleic acid repair
CA3036409C (en) * 2015-09-08 2023-07-11 Erik J. Sontheimer Dnase h activity of neisseria meningitidis cas9
US11773455B2 (en) * 2015-09-09 2023-10-03 Psomagen, Inc. Method and system for microbiome-derived diagnostics and therapeutics infectious disease and other health conditions associated with antibiotic usage
WO2017044885A1 (en) * 2015-09-09 2017-03-16 uBiome, Inc. Method and system for microbiome-derived diagnostics and therapeutics for conditions associated with cerebro-craniofacial health
ES2938623T3 (es) * 2015-09-09 2023-04-13 Univ Kobe Nat Univ Corp Método para convertir una secuencia del genoma de una bacteria gram-positiva mediante una conversión específica de una base de ácido nucleico de una secuencia de ADN seleccionada como diana y el complejo molecular utilizado en el mismo
WO2017044776A1 (en) * 2015-09-10 2017-03-16 Texas Tech University System Single-guide rna (sgrna) with improved knockout efficiency
WO2017044843A1 (en) 2015-09-11 2017-03-16 The General Hospital Corporation Full interrogation of nuclease dsbs and sequencing (find-seq)
WO2017048789A1 (en) 2015-09-14 2017-03-23 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Lipocationic dendrimers and uses thereof
US20180237800A1 (en) * 2015-09-21 2018-08-23 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for target nucleic acid modification
EP3353296B1 (en) 2015-09-24 2020-11-04 Editas Medicine, Inc. Use of exonucleases to improve crispr/cas-mediated genome editing
WO2017053729A1 (en) 2015-09-25 2017-03-30 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Nuclease-mediated genome editing of primary cells and enrichment thereof
EP3356533A1 (en) 2015-09-28 2018-08-08 North Carolina State University Methods and compositions for sequence specific antimicrobials
US20170088828A1 (en) * 2015-09-29 2017-03-30 Agenovir Corporation Compositions and methods for treatment of latent viral infections
JP2018529353A (ja) 2015-09-30 2018-10-11 ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション 配列決定法による切断事象の包括的生体外報告（ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑ）
EP3356520B1 (en) 2015-10-02 2022-03-23 The U.S.A. as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Lentiviral protein delivery system for rna-guided genome editing
CN116555254A (zh) * 2015-10-09 2023-08-08 孟山都技术公司 新颖的rna导向性核酸酶及其用途
EP4144844B1 (en) 2015-10-12 2025-09-10 DuPont US Holding, LLC Protected dna templates for gene modification and increased homologous recombination in cells and methods of use
EP4089175A1 (en) 2015-10-13 2022-11-16 Duke University Genome engineering with type i crispr systems in eukaryotic cells
US9862941B2 (en) 2015-10-14 2018-01-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Single cell microfluidic device
AU2016337525B2 (en) 2015-10-16 2022-01-20 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Compositions and methods for inhibition of lineage specific antigens
FR3042506B1 (fr) * 2015-10-16 2018-11-30 IFP Energies Nouvelles Outil genetique de transformation de bacteries clostridium
BR112018008134A2 (pt) 2015-10-20 2018-11-06 Pioneer Hi Bred Int método para restaurar a função de um produto gênico não funcional no genoma de uma célula, método para editar uma sequência nucleotídica no genoma de uma célula, planta ou planta de progênie, método para editar uma sequência nucleotídica no genoma de uma célula sem o uso de um molde polinucleotídico de modificação e método para entregar um complexo de rna guia/endonuclease cas numa célula
WO2017068077A1 (en) 2015-10-20 2017-04-27 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Methods and products for genetic engineering
EP3365461B1 (en) 2015-10-22 2020-10-14 Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale (INSERM) Endonuclease-barcoding
CN116814590A (zh) 2015-10-22 2023-09-29 布罗德研究所有限公司 Vi-b型crispr酶和系统
IL310721B2 (en) 2015-10-23 2025-11-01 Harvard College Nucleobase editors and uses thereof
WO2017070598A1 (en) 2015-10-23 2017-04-27 Caribou Biosciences, Inc. Engineered crispr class 2 cross-type nucleic-acid targeting nucleic acids
AU2016344609B2 (en) 2015-10-28 2022-05-12 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Materials and methods for treatment of duchenne muscular dystrophy
AU2016349288A1 (en) 2015-11-03 2018-05-31 President And Fellows Of Harvard College Method and apparatus for volumetric imaging of a three-dimensional nucleic acid containing matrix
US12043843B2 (en) 2015-11-04 2024-07-23 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Materials and methods for treatment of hemoglobinopathies
WO2017079026A1 (en) 2015-11-06 2017-05-11 E. I. Du Pont De Nemours And Company Generation of complex trait loci in soybean and methods of use
BR112018008971A2 (pt) 2015-11-06 2018-11-27 Crispr Therapeutics Ag materiais e métodos para tratamento de doença de armazenamento de glicogênio tipo 1a
CN108471731A (zh) 2015-11-06 2018-08-31 杰克逊实验室 大型基因组dna敲入及其用途
EP3374501B1 (en) 2015-11-11 2023-07-12 Lonza Ltd Crispr-associated (cas) proteins with reduced immunogenicity
CA2947904A1 (en) * 2015-11-12 2017-05-12 Pfizer Inc. Tissue-specific genome engineering using crispr-cas9
WO2017083766A1 (en) * 2015-11-13 2017-05-18 Massachusetts Institute Of Technology High-throughput crispr-based library screening
KR102877920B1 (ko) 2015-11-16 2025-10-30 더 리서치 인스티튜트 앳 네이션와이드 칠드런스 하스피탈 티틴-기반 근증 및 다른 티틴성병증의 치료를 위한 물질 및 방법
US10669320B2 (en) 2015-11-18 2020-06-02 The Regents Of The University Of Michigan Mps1 and KNL1 phosphorylation system
JP6923205B2 (ja) 2015-11-27 2021-08-18 国立大学法人神戸大学 標的化したｄｎａ配列の核酸塩基を特異的に変換する、単子葉植物のゲノム配列の変換方法、及びそれに用いる分子複合体
US11903974B2 (en) 2015-11-30 2024-02-20 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Methods and compositions relating to chondrisomes from cultured cells
US12239706B2 (en) 2015-11-30 2025-03-04 Seed Health, Inc. Method and system for protecting monarch butterflies from pesticides
US11529412B2 (en) 2015-11-30 2022-12-20 Seed Health, Inc. Method and system for protecting honey bees from pesticides
US10933128B2 (en) 2015-11-30 2021-03-02 Joseph E. Kovarik Method and system for protecting honey bees from pesticides
US10675347B2 (en) 2015-11-30 2020-06-09 Joseph E. Kovarik Method and system for protecting honey bees from fipronil pesticides
US10086024B2 (en) 2015-11-30 2018-10-02 Joseph E. Kovarik Method and system for protecting honey bees, bats and butterflies from neonicotinoid pesticides
US10568916B2 (en) 2015-11-30 2020-02-25 Joseph E. Kovarik Method and system for protecting honey bees, bats and butterflies from neonicotinoid pesticides
KR102787119B1 (ko) 2015-11-30 2025-03-27 듀크 유니버시티 유전자 편집에 의한 인간 디스트로핀 유전자의 교정을 위한 치료용 표적 및 사용 방법
US10946042B2 (en) 2015-12-01 2021-03-16 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for selective phagocytosis of human cancer cells
CN109715801B (zh) 2015-12-01 2022-11-01 克里斯普治疗股份公司 用于治疗α1抗胰蛋白酶缺乏的材料和方法
CN108473981B (zh) 2015-12-04 2022-04-12 卡里布生物科学公司 工程化靶向核酸的核酸
US11208649B2 (en) 2015-12-07 2021-12-28 Zymergen Inc. HTP genomic engineering platform
BR112018011503A2 (pt) 2015-12-07 2018-12-04 Zymergen Inc promotores da corynebacterium glutamicum
AU2016365720B2 (en) 2015-12-07 2020-11-26 Arc Bio, Llc Methods and compositions for the making and using of guide nucleic acids
US9988624B2 (en) 2015-12-07 2018-06-05 Zymergen Inc. Microbial strain improvement by a HTP genomic engineering platform
DK3387134T3 (da) 2015-12-11 2020-12-21 Danisco Us Inc Fremgangsmåder og sammensætninger til øget nukleasemedieret genommodifikation og reducerede virkninger uden for målstedet
WO2017106767A1 (en) * 2015-12-18 2017-06-22 The Scripps Research Institute Production of unnatural nucleotides using a crispr/cas9 system
EP3390643B8 (en) 2015-12-18 2023-08-02 OncoSec Medical Incorporated Plasmid constructs for heterologous protein expression and methods of use
US20190075770A1 (en) * 2015-12-18 2019-03-14 Japan Science And Technology Agency Genetic modification non-human organism, egg cells, fertilized eggs, and method for modifying target genes
EP3390624A4 (en) 2015-12-18 2019-07-10 The Regents of The University of California Modified site-directed modifying polypeptides and methods of use thereof
WO2017106414A1 (en) * 2015-12-18 2017-06-22 Danisco Us Inc. Methods and compositions for polymerase ii (pol-ii) based guide rna expression
EP3390631B1 (en) 2015-12-18 2020-04-08 Danisco US Inc. Methods and compositions for t-rna based guide rna expression
US11542466B2 (en) 2015-12-22 2023-01-03 North Carolina State University Methods and compositions for delivery of CRISPR based antimicrobials
WO2017112944A1 (en) 2015-12-23 2017-06-29 Fred Hutchinson Cancer Research Center High affinity t cell receptors and uses thereof
KR20180118111A (ko) 2015-12-23 2018-10-30 크리스퍼 테라퓨틱스 아게 근위축성 측색 경화증 및/또는 전두측두엽 퇴행의 치료 물질 및 방법
RU2018127657A (ru) 2015-12-30 2020-01-31 Новартис Аг Виды терапии на основе иммуноэффекторных клеток с улучшенной эффективностью
US11441146B2 (en) 2016-01-11 2022-09-13 Christiana Care Health Services, Inc. Compositions and methods for improving homogeneity of DNA generated using a CRISPR/Cas9 cleavage system
MX2018008345A (es) 2016-01-11 2018-12-06 Univ Leland Stanford Junior Proteínas quiméricas y métodos de inmunoterapia.
IL260532B2 (en) 2016-01-11 2023-12-01 Univ Leland Stanford Junior Chimeric proteins- containing systems and uses thereof in regulating gene expression
US11427837B2 (en) * 2016-01-12 2022-08-30 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for enhanced genome editing
CN109414001A (zh) 2016-01-15 2019-03-01 杰克逊实验室 通过cas9蛋白的多循环电穿孔产生的遗传修饰的非人哺乳动物
WO2017124037A1 (en) 2016-01-15 2017-07-20 The Children's Medical Center Corporation Therapeutic use of mitochondria and combined mitochondrial agents
WO2017132239A1 (en) 2016-01-26 2017-08-03 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Waxy corn
EP3199632A1 (en) 2016-01-26 2017-08-02 ACIB GmbH Temperature-inducible crispr/cas system
CN109072224B (zh) * 2016-01-30 2022-07-15 株式会社博纳克 人工单导rna及其用途
US20190038771A1 (en) 2016-02-02 2019-02-07 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for treatment of severe combined immunodeficiency (scid) or omenn syndrome
WO2017136794A1 (en) 2016-02-03 2017-08-10 Massachusetts Institute Of Technology Structure-guided chemical modification of guide rna and its applications
CN109072248A (zh) 2016-02-09 2018-12-21 希博斯美国有限公司 采用寡核苷酸介导的基因修复提高靶向基因修饰的效率的方法和组合物
EP4155397B1 (en) * 2016-02-10 2024-06-26 The Regents of The University of Michigan Detection of nucleic acids
US10876129B2 (en) 2016-02-12 2020-12-29 Ceres, Inc. Methods and materials for high throughput testing of mutagenized allele combinations
US11339427B2 (en) 2016-02-12 2022-05-24 Jumpcode Genomics, Inc. Method for target specific RNA transcription of DNA sequences
US9896696B2 (en) 2016-02-15 2018-02-20 Benson Hill Biosystems, Inc. Compositions and methods for modifying genomes
JP2019508037A (ja) 2016-02-16 2019-03-28 イェール ユニバーシティーＹａｌｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔ 標的化遺伝子編集を増強するための組成物およびその使用方法
US20200308590A1 (en) 2016-02-16 2020-10-01 Yale University Compositions and methods for treatment of cystic fibrosis
US20190249172A1 (en) 2016-02-18 2019-08-15 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for gene editing in stem cells
EP3416689B1 (en) 2016-02-18 2023-01-18 CRISPR Therapeutics AG Materials and methods for treatment of severe combined immunodeficiency (scid) or omenn syndrome
ES2847252T3 (es) 2016-02-22 2021-08-02 Caribou Biosciences Inc Procedimientos de modulación de resultados de reparación de ADN
CN105646719B (zh) * 2016-02-24 2019-12-20 无锡市妇幼保健院 一种高效定点转基因的工具及其应用
WO2017147278A1 (en) 2016-02-25 2017-08-31 The Children's Medical Center Corporation Customized class switch of immunoglobulin genes in lymphoma and hybridoma by crispr/cas9 technology
EP3420089B1 (en) * 2016-02-26 2021-12-29 LanzaTech NZ, Inc. Crispr/cas systems for c-1 fixing bacteria
WO2017151444A1 (en) 2016-02-29 2017-09-08 Agilent Technologies, Inc. Methods and compositions for blocking off-target nucleic acids from cleavage by crispr proteins
JP2019507610A (ja) 2016-03-04 2019-03-22 インドア バイオテクノロジーズ インコーポレイテッド ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓゲノム編集に基づく、Ｆｅｌ ｄ１ノックアウト並びに関連組成物及び方法
EP3426778A1 (en) 2016-03-11 2019-01-16 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Novel cas9 systems and methods of use
WO2017155715A1 (en) 2016-03-11 2017-09-14 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Novel cas9 systems and methods of use
EP3426780A1 (en) 2016-03-11 2019-01-16 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Novel cas9 systems and methods of use
CN109152848B (zh) * 2016-03-15 2022-12-09 马萨诸塞大学 抗-crispr化合物以及使用方法
CN109414414A (zh) 2016-03-16 2019-03-01 戴维·格拉德斯通研究所 用于治疗肥胖症和/或糖尿病以及用于鉴定候选治疗剂的方法和组合物
EP3429632B1 (en) 2016-03-16 2023-01-04 CRISPR Therapeutics AG Materials and methods for treatment of hereditary haemochromatosis
EP3219799A1 (en) 2016-03-17 2017-09-20 IMBA-Institut für Molekulare Biotechnologie GmbH Conditional crispr sgrna expression
US11597924B2 (en) 2016-03-25 2023-03-07 Editas Medicine, Inc. Genome editing systems comprising repair-modulating enzyme molecules and methods of their use
US11512311B2 (en) 2016-03-25 2022-11-29 Editas Medicine, Inc. Systems and methods for treating alpha 1-antitrypsin (A1AT) deficiency
GB2565461B (en) * 2016-03-31 2022-04-13 Harvard College Methods and compositions for the single tube preparation of sequencing libraries using Cas9
US20190117799A1 (en) 2016-04-01 2019-04-25 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Stimuli-responsive nanoparticles for biomedical applications
US11236313B2 (en) 2016-04-13 2022-02-01 Editas Medicine, Inc. Cas9 fusion molecules, gene editing systems, and methods of use thereof
US20190127713A1 (en) 2016-04-13 2019-05-02 Duke University Crispr/cas9-based repressors for silencing gene targets in vivo and methods of use
AU2017250683A1 (en) * 2016-04-14 2018-11-01 Boco Silicon Valley, Inc. Genome editing of human neural stem cells using nucleases
CN109715808A (zh) 2016-04-15 2019-05-03 诺华股份有限公司 用于选择性蛋白质表达的组合物和方法
EP4628587A3 (en) 2016-04-15 2026-02-25 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Transgenic t cell and chimeric antigen receptor t cell compositions and related methods
WO2017181107A2 (en) * 2016-04-16 2017-10-19 Ohio State Innovation Foundation Modified cpf1 mrna, modified guide rna, and uses thereof
AU2017252023B2 (en) 2016-04-18 2024-05-02 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Materials and methods for treatment of hemoglobinopathies
KR20180134412A (ko) * 2016-04-22 2018-12-18 인텔리아 테라퓨틱스, 인크. 전사 인자 4에서 트라이뉴클레오타이드 반복부와 연관된 질환의 치료를 위한 조성물 및 방법
EP4613756A3 (en) 2016-04-25 2025-11-12 President And Fellows Of Harvard College Hybridization chain reaction methods for in situ molecular detection
JP2019514377A (ja) 2016-04-26 2019-06-06 マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー 拡張可能なリコンビナーゼカスケード
WO2017189870A1 (en) 2016-04-27 2017-11-02 Massachusetts Institute Of Technology Stable nanoscale nucleic acid assemblies and methods thereof
WO2017189914A1 (en) 2016-04-27 2017-11-02 Massachusetts Institute Of Technology Sequence-controlled polymer random access memory storage
WO2017191503A1 (en) 2016-05-05 2017-11-09 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for treatment of hemoglobinopathies
EP3452094B1 (en) 2016-05-06 2021-11-17 The Brigham and Women's Hospital, Inc. Binary self assembled gels for controlled delivery of encapsulated agents to cartilage
CA3022319A1 (en) * 2016-05-06 2017-11-09 Tod M. Woolf Improved methods for genome editing with and without programmable nucleases
WO2017197128A1 (en) 2016-05-11 2017-11-16 Yale University Poly(amine-co-ester) nanoparticles and methods of use thereof
CN109152343A (zh) 2016-05-13 2019-01-04 株式会社钟化 转化植物的制备方法
EP3456825A4 (en) * 2016-05-13 2020-03-18 Kaneka Corporation Plant genome editing method
US11499158B2 (en) 2016-05-13 2022-11-15 Kaneka Corporation Method for modifying plant
CN113831407B (zh) 2016-05-20 2024-06-11 瑞泽恩制药公司 用于使用多个引导rna来破坏免疫耐受性的方法
CA3025523A1 (en) * 2016-05-27 2017-11-30 Aadigen, Llc Peptides and nanoparticles for intracellular delivery of genome-editing molecules
EP3463484B1 (en) 2016-05-27 2026-01-07 The Regents of the University of California Methods and compositions for targeting rna polymerases and non-coding rna biogenesis to specific loci
CA3209273A1 (en) 2016-06-02 2017-12-07 Sigma-Aldrich Co. Llc Using programmable dna binding proteins to enhance targeted genome modification
GB201609811D0 (en) 2016-06-05 2016-07-20 Snipr Technologies Ltd Methods, cells, systems, arrays, RNA and kits
US10767175B2 (en) * 2016-06-08 2020-09-08 Agilent Technologies, Inc. High specificity genome editing using chemically modified guide RNAs
WO2017222834A1 (en) * 2016-06-10 2017-12-28 City Of Hope Compositions and methods for mitochondrial genome editing
MX2018014993A (es) 2016-06-14 2019-09-06 Pioneer Hi Bred Int Uso de endonucleasa cpf1 para modificaciones de genoma de planta.
WO2017217768A1 (ko) * 2016-06-15 2017-12-21 주식회사 툴젠 온타겟 및 오프타겟의 다중 타겟 시스템을 이용하는, 표적 특이적 유전자 가위 스크리닝 방법 및 이의 용도
US10337051B2 (en) 2016-06-16 2019-07-02 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for detecting a target RNA
CN109642231A (zh) * 2016-06-17 2019-04-16 博德研究所 Vi型crispr直向同源物和系统
WO2017222773A1 (en) 2016-06-20 2017-12-28 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Novel cas systems and methods of use
US11293021B1 (en) 2016-06-23 2022-04-05 Inscripta, Inc. Automated cell processing methods, modules, instruments, and systems
AU2017280353B2 (en) 2016-06-24 2021-11-11 Inscripta, Inc. Methods for generating barcoded combinatorial libraries
WO2018005445A1 (en) 2016-06-27 2018-01-04 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods for detecting and treating diabetes
WO2018005589A1 (en) 2016-06-28 2018-01-04 Cellectis Altering expression of gene products in plants through targeted insertion of nucleic acid sequences
US11174469B2 (en) 2016-06-29 2021-11-16 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for treatment of Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) and other related disorders
EP4484443A3 (en) 2016-06-29 2025-03-26 CRISPR Therapeutics AG Materials and methods for treatment of friedreich ataxia and other related disorders
US11427838B2 (en) 2016-06-29 2022-08-30 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Materials and methods for treatment of myotonic dystrophy type 1 (DM1) and other related disorders
US12595478B2 (en) * 2016-06-29 2026-04-07 The Broad Institute, Inc. Crispr-Cas systems having destabilization domain
US10544390B2 (en) 2016-06-30 2020-01-28 Zymergen Inc. Methods for generating a bacterial hemoglobin library and uses thereof
EP3478845A4 (en) 2016-06-30 2019-07-31 Zymergen, Inc. METHOD OF GENERATING A GLUCOSE PERMEASE LIBRARY AND USES THEREOF
JP7305534B2 (ja) 2016-07-06 2023-07-10 バーテックス ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド 疼痛関連障害を処置するための物質及び方法
CN109843914B (zh) 2016-07-06 2024-03-15 沃泰克斯药物股份有限公司 用于治疗疼痛相关病症的材料和方法
WO2018007871A1 (en) 2016-07-08 2018-01-11 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for treatment of transthyretin amyloidosis
EP4321623A3 (en) 2016-07-15 2024-05-15 Salk Institute for Biological Studies Methods and compositions for genome editing in non-dividing cells
SG11201900344YA (en) 2016-07-15 2019-02-27 Novartis Ag Treatment and prevention of cytokine release syndrome using a chimeric antigen receptor in combination with a kinase inhibitor
JP7490211B2 (ja) 2016-07-19 2024-05-27 デューク ユニバーシティ Ｃｐｆ１に基づくゲノム編集の治療適用
WO2018015444A1 (en) 2016-07-22 2018-01-25 Novozymes A/S Crispr-cas9 genome editing with multiple guide rnas in filamentous fungi
WO2018020323A2 (en) 2016-07-25 2018-02-01 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for treatment of fatty acid disorders
CN109790527A (zh) 2016-07-26 2019-05-21 通用医疗公司 普氏菌属和弗朗西斯氏菌属的CRISPR1(Cpf1)的变体
CN106191043B (zh) * 2016-07-26 2019-07-02 吉林大学 一种基因片段、载体pPlasmid-Clearance及应用
EP3491014B1 (en) 2016-07-28 2023-04-05 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Allele-specific primer or probe hybridized to a nucleic acid molecule encoding a gpr156 variant
JP2019523009A (ja) 2016-07-29 2019-08-22 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドＲｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． Ｃ末端切断型フィブリリン−１の発現をもたらす変異を有するマウス
BR112019001887A2 (pt) 2016-08-02 2019-07-09 Editas Medicine Inc composições e métodos para o tratamento de doença associada a cep290
CN110214183A (zh) 2016-08-03 2019-09-06 哈佛大学的校长及成员们 腺苷核碱基编辑器及其用途
US11078481B1 (en) 2016-08-03 2021-08-03 KSQ Therapeutics, Inc. Methods for screening for cancer targets
JOP20190015A1 (ar) 2016-08-04 2019-02-04 Arrowhead Pharmaceuticals Inc عوامل (ار ان ايه آي) لعدوى فيروس الالتهاب الكبدي الوبائي ب
WO2018031683A1 (en) 2016-08-09 2018-02-15 President And Fellows Of Harvard College Programmable cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof
KR101710026B1 (ko) 2016-08-10 2017-02-27 주식회사 무진메디 Cas9 단백질 및 가이드 RNA의 혼성체를 함유하는 나노 리포좀 전달체 조성물
BR112019002779A2 (pt) 2016-08-12 2019-05-14 Toolgen Incorporated elemento imunorregulador manipulado e imunidade alterada por este
WO2018031950A1 (en) 2016-08-12 2018-02-15 Caribou Biosciences, Inc. Protein engineering methods
US11046995B2 (en) * 2016-08-16 2021-06-29 The Regents Of The University Of California Method for finding low abundance sequences by hybridization (FLASH)
AU2017312132A1 (en) * 2016-08-19 2019-03-21 Bluebird Bio, Inc. Genome editing enhancers
CA3034369A1 (en) 2016-08-19 2018-02-22 Whitehead Institute For Biomedical Research Methods of editing dna methylation
JP2019524149A (ja) * 2016-08-20 2019-09-05 アベリノ ラボ ユーエスエー インコーポレイテッドＡｖｅｌｌｉｎｏ Ｌａｂ ＵＳＡ， Ｉｎｃ． 一本鎖ガイドＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム、及びそれらの使用方法
US11542509B2 (en) 2016-08-24 2023-01-03 President And Fellows Of Harvard College Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing
JP7179354B2 (ja) 2016-08-29 2022-11-29 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 皮膚処置のためのイオン種に基づく局所処方物
CN118853848A (zh) 2016-08-31 2024-10-29 哈佛学院董事及会员团体 将生物分子的检测组合到使用荧光原位测序的单个试验的方法
US11078483B1 (en) 2016-09-02 2021-08-03 KSQ Therapeutics, Inc. Methods for measuring and improving CRISPR reagent function
CN106399311A (zh) * 2016-09-07 2017-02-15 同济大学 用于Chip‑seq全基因组结合谱的内源蛋白标记的方法
JP2019533139A (ja) 2016-09-08 2019-11-14 アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル ネフローゼ症候群を診断及び処置するための方法
ES2985812T3 (es) 2016-09-09 2024-11-07 The Board Of Trustees Of The Leland Stanfordjunior Univ Edición genómica de precisión de alto rendimiento
WO2018053035A1 (en) 2016-09-13 2018-03-22 The Jackson Laboratory Targeted dna demethylation and methylation
WO2018057837A1 (en) * 2016-09-23 2018-03-29 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Gene therapy and targeted delivery of conjugated compounds
CN109996868A (zh) 2016-09-23 2019-07-09 弗雷德哈钦森癌症研究中心 特异性用于次要组织相容性(h)抗原ha-1的tcr及其用途
US20190225974A1 (en) 2016-09-23 2019-07-25 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Targeted genome optimization in plants
CN109844126A (zh) 2016-09-28 2019-06-04 诺华股份有限公司 基于多孔膜的大分子递送系统
EP3519570B1 (en) * 2016-09-29 2022-06-08 F. Hoffmann-La Roche AG Method to analyze and optimize gene editing modules and delivery approaches
GB201616590D0 (en) * 2016-09-29 2016-11-16 Oxford Nanopore Technologies Limited Method
BR112019006388A2 (pt) * 2016-09-30 2019-06-25 Univ California enzimas modificadoras de ácido nucleico guiadas por rna e métodos de uso das mesmas
MX2019003674A (es) * 2016-09-30 2021-01-08 Univ California Enzimas modificadoras de ácido nucleico guiadas por arn y métodos de uso de estas.
US10669539B2 (en) 2016-10-06 2020-06-02 Pioneer Biolabs, Llc Methods and compositions for generating CRISPR guide RNA libraries
BR112019006781A2 (pt) 2016-10-07 2019-07-30 Novartis Ag receptores de antígeno quiméricos para o tratamento de câncer
WO2018069232A1 (en) 2016-10-10 2018-04-19 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for predicting the risk of having cardiac hypertrophy
US11090653B2 (en) 2016-10-11 2021-08-17 The Regents Of The University Of California Systems and methods to encapsulate and preserve organic matter for analysis
US12012605B2 (en) 2016-10-13 2024-06-18 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Generating northern leaf blight resistant maize
KR102622411B1 (ko) 2016-10-14 2024-01-10 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 핵염기 에디터의 aav 전달
KR20190067209A (ko) 2016-10-14 2019-06-14 더 제너럴 하스피탈 코포레이션 후성적으로 조절되는 부위-특이적 뉴클레아제
GB201617559D0 (en) 2016-10-17 2016-11-30 University Court Of The University Of Edinburgh The Swine comprising modified cd163 and associated methods
CN110520530A (zh) 2016-10-18 2019-11-29 明尼苏达大学董事会 肿瘤浸润性淋巴细胞和治疗方法
WO2018081138A1 (en) 2016-10-24 2018-05-03 Yale University Biodegradable contraceptive implants
WO2018081531A2 (en) 2016-10-28 2018-05-03 Ariad Pharmaceuticals, Inc. Methods for human t-cell activation
US20180119141A1 (en) 2016-10-28 2018-05-03 Massachusetts Institute Of Technology Crispr/cas global regulator screening platform
EP3535396A1 (en) 2016-11-01 2019-09-11 Novartis AG Methods and compositions for enhancing gene editing
US11732258B2 (en) * 2016-11-02 2023-08-22 President And Fellows Of Harvard College Engineered guide RNA sequences for in situ detection and sequencing
CN109689693B (zh) * 2016-11-03 2022-06-28 深圳华大生命科学研究院 提高基因编辑效率的方法和系统
CN109906030B (zh) 2016-11-04 2022-03-18 安健基因公司 用于产生仅重链抗体的经基因修饰的非人动物和方法
US20190264218A1 (en) 2016-11-04 2019-08-29 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Novel Plant Cells, Plants, and Seeds
EP4553082A3 (en) 2016-11-04 2025-08-20 Children's Hospital Medical Center Liver organoid compositions and methods of making and using same
US20190345500A1 (en) 2016-11-14 2019-11-14 |Nserm (Institut National De La Santé Et De La Recherche Médicale) Methods and pharmaceutical compositions for modulating stem cells proliferation or differentiation
WO2018094356A2 (en) * 2016-11-18 2018-05-24 Genedit Inc. Compositions and methods for target nucleic acid modification
NZ752984A (en) 2016-11-22 2026-03-27 Nat Univ Singapore Blockade of cd7 expression and chimeric antigen receptors for immunotherapy of t-cell malignancies
AU2017364106A1 (en) 2016-11-28 2019-06-20 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Prevention of muscular dystrophy by CRISPR/Cpfl-mediated gene editing
US20200081010A1 (en) 2016-12-02 2020-03-12 Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) Methods and compositions for diagnosing renal cell carcinoma
US9816093B1 (en) 2016-12-06 2017-11-14 Caribou Biosciences, Inc. Engineered nucleic acid-targeting nucleic acids
WO2018107003A1 (en) 2016-12-08 2018-06-14 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Dmd reporter models containing humanized duschene muscular dystrophy mutations
US20200149039A1 (en) 2016-12-12 2020-05-14 Whitehead Institute For Biomedical Research Regulation of transcription through ctcf loop anchors
CN110191955B (zh) 2016-12-13 2024-05-31 西雅图儿童医院（Dba西雅图儿童研究所） 在体外和体内对工程化的细胞中表达的化学物质诱导的信号传导复合物进行外源性药物激活的方法
AU2017378427A1 (en) 2016-12-14 2019-06-20 Ligandal, Inc. Methods and compositions for nucleic acid and protein payload delivery
BR112019012155A2 (pt) * 2016-12-14 2019-11-12 Wageningen Universiteit uso de pelo menos uma molécula-guia de rna e uma proteína cas, método de ligação, clivagem, marcação ou modificação de um polinucleotídeo alvo de fita dupla, célula transformada, e, complexo de nucleoproteína
WO2018112470A1 (en) 2016-12-16 2018-06-21 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Co-delivery of nucleic acids for simultaneous suppression and expression of target genes
EP3555297A1 (en) 2016-12-19 2019-10-23 Editas Medicine, Inc. Assessing nuclease cleavage
CN110213961A (zh) 2016-12-22 2019-09-06 孟山都技术公司 基于基因组编辑的作物工程化和生产矮秆植物
WO2018118585A1 (en) * 2016-12-22 2018-06-28 Agenovir Corporation Antiviral compositions
KR20230125856A (ko) * 2016-12-23 2023-08-29 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 Pcsk9의 유전자 편집
WO2018119359A1 (en) 2016-12-23 2018-06-28 President And Fellows Of Harvard College Editing of ccr5 receptor gene to protect against hiv infection
US11597947B2 (en) 2016-12-29 2023-03-07 Asc Therapeutics Inc. Gene editing method using virus
EP3342868B1 (en) 2016-12-30 2019-12-25 Systasy Bioscience GmbH Constructs and screening methods
US11859219B1 (en) 2016-12-30 2024-01-02 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Methods of altering a target nucleotide sequence with an RNA-guided nuclease and a single guide RNA
EP3565608A4 (en) 2017-01-05 2020-12-16 Rutgers, The State University of New Jersey TARGETED GENE EDITING PLATFORM INDEPENDENT OF BICATENARY DNA BREAKAGE AND ITS USES
JOP20190166A1 (ar) 2017-01-05 2019-07-02 Univ Texas استراتيجية مثلى من أجل تعديلات تخطي إكسون باستخدام crispr/cas9 مع متواليات توجيه ثلاثي
JP7229923B2 (ja) 2017-01-06 2023-02-28 エディタス・メディシン、インコーポレイテッド ヌクレアーゼ切断を評価する方法
EP3346001A1 (en) 2017-01-06 2018-07-11 TXCell Monospecific regulatory t cell population with cytotoxicity for b cells
WO2018127585A1 (en) 2017-01-06 2018-07-12 Txcell Monospecific regulatory t cell population with cytotoxicity for b cells
WO2018127927A1 (en) 2017-01-09 2018-07-12 Aposense Ltd. Compounds and methods for trans-membrane delivery of molecules
DK3565891T3 (da) 2017-01-09 2023-07-24 Whitehead Inst Biomedical Res Fremgangsmåder til ændring af genekspression ved forstyrrelse af transkriptionsfaktor-multimere, der strukturerer regulatoriske sløjfer
ES2928176T3 (es) 2017-01-10 2022-11-16 Christiana Care Gene Editing Inst Llc Métodos para mutagénesis dirigida al sitio in vitro mediante el uso de tecnologías de edición de genes
JP7215716B2 (ja) * 2017-01-13 2023-01-31 学校法人自治医科大学 肝臓ゲノム上の凝固関連因子遺伝子を破壊するためのａａｖベクター
CA3047416A1 (en) 2017-01-20 2018-07-26 The Regents Of The University Of California Targeted gene activation in plants
RU2019126483A (ru) 2017-01-23 2021-02-24 Ридженерон Фармасьютикалз, Инк. Варианты 17-бета-гидроксистероиддегидрогеназы 13 (hsd17b13) и их применение
ES2912408T3 (es) 2017-01-26 2022-05-25 Novartis Ag Composiciones de CD28 y métodos para terapia con receptores quiméricos para antígenos
AU2018213044B2 (en) 2017-01-26 2024-08-01 The Regents Of The University Of California Targeted gene demethylation in plants
WO2018140899A1 (en) 2017-01-28 2018-08-02 Inari Agriculture, Inc. Novel plant cells, plants, and seeds
CN110582509A (zh) 2017-01-31 2019-12-17 诺华股份有限公司 使用具有多特异性的嵌合t细胞受体蛋白治疗癌症
US11345938B2 (en) 2017-02-02 2022-05-31 Cargill, Incorporated Genetically modified cells that produce C6-C10 fatty acid derivatives
EP3577220A2 (en) 2017-02-06 2019-12-11 Zymergen, Inc. Engineered biosynthetic pathways for production of tyramine by fermentation
TW201839136A (zh) 2017-02-06 2018-11-01 瑞士商諾華公司 治療血色素異常症之組合物及方法
US10995333B2 (en) * 2017-02-06 2021-05-04 10X Genomics, Inc. Systems and methods for nucleic acid preparation
JP7227912B2 (ja) 2017-02-08 2023-02-24 ダナ－ファーバー キャンサー インスティテュート，インコーポレイテッド キメラ抗原受容体の調節
WO2018146253A1 (en) 2017-02-10 2018-08-16 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and pharmaceutical compositions for the treatment of cancers associated with activation of the mapk pathway
JP2020507312A (ja) 2017-02-10 2020-03-12 ザイマージェン インコーポレイテッド 複数の宿主用の複数のｄｎａコンストラクトのアセンブリ及び編集のためのモジュラーユニバーサルプラスミド設計戦略
MY193581A (en) 2017-02-21 2022-10-19 Univ Duke Compositions and methods for robust dynamic metabolic control
EP3585900B1 (en) 2017-02-22 2022-12-21 CRISPR Therapeutics AG Materials and methods for treatment of spinocerebellar ataxia type 2 (sca2) and other spinocerebellar ataxia type 2 protein (atxn2) gene related conditions or disorders
WO2018154459A1 (en) 2017-02-22 2018-08-30 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for treatment of primary hyperoxaluria type 1 (ph1) and other alanine-glyoxylate aminotransferase (agxt) gene related conditions or disorders
EP3585898A1 (en) 2017-02-22 2020-01-01 CRISPR Therapeutics AG Materials and methods for treatment of spinocerebellar ataxia type 1 (sca1) and other spinocerebellar ataxia type 1 protein (atxn1) gene related conditions or disorders
EP3585895A1 (en) 2017-02-22 2020-01-01 CRISPR Therapeutics AG Compositions and methods for gene editing
EP3585807A1 (en) 2017-02-22 2020-01-01 CRISPR Therapeutics AG Materials and methods for treatment of early onset parkinson's disease (park1) and other synuclein, alpha (snca) gene related conditions or disorders
RU2019130504A (ru) 2017-02-28 2021-03-30 Вор Байофарма, Инк. Композиции и способы ингибирования линиеспецифических белков
WO2018160731A1 (en) 2017-02-28 2018-09-07 Novartis Ag Shp inhibitor compositions and uses for chimeric antigen receptor therapy
WO2018165309A1 (en) 2017-03-08 2018-09-13 The Regents Of The University Of Michigan Analyte detection
EP3592853A1 (en) 2017-03-09 2020-01-15 President and Fellows of Harvard College Suppression of pain by gene editing
US12390514B2 (en) 2017-03-09 2025-08-19 President And Fellows Of Harvard College Cancer vaccine
US11542496B2 (en) 2017-03-10 2023-01-03 President And Fellows Of Harvard College Cytosine to guanine base editor
WO2018170184A1 (en) 2017-03-14 2018-09-20 Editas Medicine, Inc. Systems and methods for the treatment of hemoglobinopathies
WO2018170015A1 (en) * 2017-03-14 2018-09-20 The Regents Of The University Of California Engineering crispr cas9 immune stealth
US20200087403A1 (en) 2017-03-15 2020-03-19 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Pharmaceutical compositions for the treatment of thrombosis in patients suffering from a myeloproliferative neoplasm
JP7037577B2 (ja) 2017-03-15 2022-03-16 フレッド ハッチンソン キャンサー リサーチ センター 高親和性ｍａｇｅ－ａ１特異的ｔｃｒ及びその使用
KR20240116572A (ko) 2017-03-23 2024-07-29 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 핵산 프로그램가능한 dna 결합 단백질을 포함하는 핵염기 편집제
WO2018172570A1 (en) 2017-03-24 2018-09-27 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Gfi1 inhibitors for the treatment of hyperglycemia
SG11201906297QA (en) * 2017-03-24 2019-10-30 Curevac Ag Nucleic acids encoding crispr-associated proteins and uses thereof
US20210186982A1 (en) 2017-03-24 2021-06-24 Universite Nice Sophia Antipolis Methods and compositions for treating melanoma
US10876101B2 (en) 2017-03-28 2020-12-29 Locanabio, Inc. CRISPR-associated (Cas) protein
EP3600308A1 (en) 2017-03-30 2020-02-05 INSERM - Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Methods for the treatment of mitochondrial genetic diseases
EP3601610A1 (en) 2017-03-30 2020-02-05 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods of identifying and characterizing gene editing variations in nucleic acids
WO2018187493A1 (en) 2017-04-04 2018-10-11 Yale University Compositions and methods for in utero delivery
KR20190139869A (ko) 2017-04-11 2019-12-18 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 하이드록시스테로이드 (17-베타) 탈수소효소(hsd17b) 패밀리의 구성원의 조절인자의 활성도를 스크리닝하기 위한 검정
JP7248586B2 (ja) 2017-04-14 2023-03-29 チルドレンズ ホスピタル メディカル センター 複数ドナー幹細胞組成物およびそれを作製する方法
WO2018195129A1 (en) 2017-04-17 2018-10-25 University Of Maryland, College Park Embryonic cell cultures and methods of using the same
US11834670B2 (en) * 2017-04-19 2023-12-05 Global Life Sciences Solutions Usa Llc Site-specific DNA modification using a donor DNA repair template having tandem repeat sequences
KR102746223B1 (ko) 2017-04-20 2024-12-27 이제네시스, 인크. 유전자 변형 동물의 생성 방법
WO2018195540A1 (en) 2017-04-21 2018-10-25 The General Hospital Corporation Inducible, tunable, and multiplex human gene regulation using crispr-cpf1
US11591589B2 (en) 2017-04-21 2023-02-28 The General Hospital Corporation Variants of Cpf1 (Cas12a) with altered PAM specificity
WO2018193075A1 (en) 2017-04-21 2018-10-25 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and pharmaceutical compositions for the treatment of diseases associated with reduced cftr function
WO2018197520A1 (en) 2017-04-24 2018-11-01 Dupont Nutrition Biosciences Aps Methods and compositions of anti-crispr proteins for use in plants
US11499151B2 (en) 2017-04-28 2022-11-15 Editas Medicine, Inc. Methods and systems for analyzing guide RNA molecules
EP3615055A1 (en) 2017-04-28 2020-03-04 Novartis AG Cells expressing a bcma-targeting chimeric antigen receptor, and combination therapy with a gamma secretase inhibitor
US20200179511A1 (en) 2017-04-28 2020-06-11 Novartis Ag Bcma-targeting agent, and combination therapy with a gamma secretase inhibitor
CN110997705B (zh) 2017-05-05 2026-04-10 巴塞罗那自治大学 纳米结构蛋白及其用途
WO2018204722A1 (en) * 2017-05-05 2018-11-08 Califorinia Institute Of Technology Dna sequence modification-based gene drive
JP7235391B2 (ja) 2017-05-08 2023-03-08 ツールゲン インコーポレイテッド 人工的に操作された免疫細胞
EP3622070A2 (en) 2017-05-10 2020-03-18 Editas Medicine, Inc. Crispr/rna-guided nuclease systems and methods
US11560566B2 (en) 2017-05-12 2023-01-24 President And Fellows Of Harvard College Aptazyme-embedded guide RNAs for use with CRISPR-Cas9 in genome editing and transcriptional activation
MX2019013514A (es) 2017-05-12 2020-01-20 Crispr Therapeutics Ag Materiales y metodos para modificar celulas por ingenieria genetica y usos de los mismos en inmunooncologia.
US11692184B2 (en) 2017-05-16 2023-07-04 The Regents Of The University Of California Thermostable RNA-guided endonucleases and methods of use thereof
JP2020519665A (ja) 2017-05-17 2020-07-02 アンセルム（アンスティテュト ナショナル ド ラ サンテ エ ド ラ ルシェルシュ メディカル） オピオイドによる痛みの処置を改善する為のｆｌｔ３阻害剤
US11439692B2 (en) 2017-05-17 2022-09-13 Modalis Therapeutics Corporation Method of treating diseases associated with MYD88 pathways using CRISPR-GNDM system
CA3064000A1 (en) 2017-05-24 2018-11-29 Effector Therapeutics, Inc. Methods and compositions for cellular immunotherapy
US11788087B2 (en) 2017-05-25 2023-10-17 The Children's Medical Center Corporation BCL11A guide delivery
EP3630849A4 (en) 2017-05-25 2021-01-13 The General Hospital Corporation BIPARTITE BASIC EDITOR (BBE) AND TYPE II-C-CAS9 ZINC FINGER EDITOR ARCHITECTURES
CN108977442B (zh) * 2017-06-05 2023-01-06 广州市锐博生物科技有限公司 用于dna编辑的系统及其应用
US10738284B2 (en) 2017-06-05 2020-08-11 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. B4GALT1 cDNA variants and compositions comprising the same
WO2018226900A2 (en) 2017-06-06 2018-12-13 Zymergen Inc. A htp genomic engineering platform for improving fungal strains
WO2018226880A1 (en) 2017-06-06 2018-12-13 Zymergen Inc. A htp genomic engineering platform for improving escherichia coli
US20210079100A1 (en) 2017-06-08 2021-03-18 Inserm (Institute National De La Sante Et De La Recherche Medicale) Methods and compositions for treating hyperpigmentation disorders
MX2019014640A (es) 2017-06-09 2020-10-05 Editas Medicine Inc Nucleasas de repeticiones palíndromicas agrupadas y regularmente interespaciadas de proteina asociada 9 (cas9) genomanipuladas.
WO2018227210A1 (en) 2017-06-09 2018-12-13 The Regents Of The University Of California High-efficiency encapsulation in droplets based on hydrodynamic vortices control
US11517901B2 (en) 2017-06-09 2022-12-06 The Regents Of The University Of California High-efficiency particle encapsulation in droplets with particle spacing and downstream droplet sorting
EP3638789A4 (en) * 2017-06-12 2021-03-10 California Institute of Technology CONDITIONAL GUIDE RNAS
IL271275B1 (en) 2017-06-13 2026-04-01 Flagship Pioneering Innovations V Inc Preparations containing croons and their uses
WO2018232356A1 (en) 2017-06-15 2018-12-20 The Regents Of The University Of California Targeted non-viral dna insertions
US9982279B1 (en) 2017-06-23 2018-05-29 Inscripta, Inc. Nucleic acid-guided nucleases
EP3916086A1 (en) 2017-06-23 2021-12-01 Inscripta, Inc. Nucleic acid-guided nucleases
US10011849B1 (en) 2017-06-23 2018-07-03 Inscripta, Inc. Nucleic acid-guided nucleases
JP2020525049A (ja) 2017-06-25 2020-08-27 エスエヌアイピーアール・テクノロジーズ・リミテッドＳｎｉｐｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ 微生物集団の変更及び細菌叢の改変
ES2996886T3 (en) 2017-06-27 2025-02-13 Regeneron Pharma Rodents comprising a humanized asgr1 locus
US20200140896A1 (en) 2017-06-30 2020-05-07 Novartis Ag Methods for the treatment of disease with gene editing systems
EP3645021A4 (en) 2017-06-30 2021-04-21 Intima Bioscience, Inc. ADENO-ASSOCIATED VIRAL VECTORS FOR GENE THERAPY
US10392616B2 (en) 2017-06-30 2019-08-27 Arbor Biotechnologies, Inc. CRISPR RNA targeting enzymes and systems and uses thereof
EP3645712A4 (en) 2017-06-30 2021-07-07 Codexis, Inc. T7 RNA POLYMERASE VARIANTS
JP2020530979A (ja) 2017-06-30 2020-11-05 インスクリプタ， インコーポレイテッド 自動細胞処理方法、モジュール、機器及びシステム
KR20250028535A (ko) 2017-06-30 2025-02-28 코덱시스, 인코포레이티드 T7 rna 폴리머라제 변이체
JP7325341B2 (ja) 2017-07-11 2023-08-14 シンソークス，インク． 非天然ヌクレオチドの組み込み及びその方法
EP3427756A1 (en) 2017-07-14 2019-01-16 Universidad Autónoma De Barcelona (UAB) Therapeutic nanoconjugates and uses thereof
US11866726B2 (en) 2017-07-14 2024-01-09 Editas Medicine, Inc. Systems and methods for targeted integration and genome editing and detection thereof using integrated priming sites
WO2019036140A1 (en) 2017-07-17 2019-02-21 Zymergen Inc. METALLO-ORGANIC STRESS MATERIALS
US20190316101A1 (en) 2017-07-18 2019-10-17 Howard Hughes Medical Institute Methods and compositions for genetically manipulating genes and cells
WO2019016310A1 (en) 2017-07-20 2019-01-24 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) METHODS AND COMPOSITIONS FOR TREATING CANCERS
WO2019020593A1 (en) 2017-07-25 2019-01-31 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) METHODS AND PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS FOR MODULATION OF MONOCYTOPOISIS
CN109295054B (zh) * 2017-07-25 2024-02-06 广州普世利华科技有限公司 用于靶向病原体基因RNA的gRNA及基于C2c2的病原体基因的检测方法及试剂盒
CN111801345A (zh) 2017-07-28 2020-10-20 哈佛大学的校长及成员们 使用噬菌体辅助连续进化(pace)的进化碱基编辑器的方法和组合物
CN110891420B (zh) 2017-07-31 2022-06-03 瑞泽恩制药公司 Cas转基因小鼠胚胎干细胞和小鼠及其应用
SG11202000840YA (en) 2017-07-31 2020-02-27 Reflection Biotechnologies Ltd Cellular models of and therapies for ocular diseases
KR20200033259A (ko) 2017-07-31 2020-03-27 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 생체내에서 CRISPR/Cas-매개된 파괴 또는 삭제 및 외인성 도너 핵산과의 CRISPR/Cas-유도된 재조합을 평가하기 위한 방법 및 조성물
EP3585161A1 (en) 2017-07-31 2020-01-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Assessment of crispr/cas-induced recombination with an exogenous donor nucleic acid in vivo
EP3663310A4 (en) 2017-08-04 2021-08-11 Peking University TALE RVD SPECIFICALLY RECOGNIZING A DNA BASE MODIFIED BY METHYLATION AND CORRESPONDING APPLICATION
EP3625356B1 (en) 2017-08-08 2021-05-19 Depixus In vitro isolation and enrichment of nucleic acids using site-specific nucleases
WO2019028686A1 (zh) 2017-08-08 2019-02-14 北京大学 基因敲除方法
EP3665279B1 (en) 2017-08-09 2023-07-19 Benson Hill, Inc. Compositions and methods for modifying genomes
US12398191B2 (en) 2017-08-11 2025-08-26 Fred Hutchinson Cancer Center BRAF-specific TCRs and uses thereof
US20200260698A1 (en) 2017-08-18 2020-08-20 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Exon deletion correction of duchenne muscular dystrophy mutations in the dystrophin actin binding domain 1 using crispr genome editing
US20210054404A1 (en) * 2017-08-22 2021-02-25 Napigen, Inc. Organelle genome modification using polynucleotide guided endonuclease
CA3073448A1 (en) 2017-08-23 2019-02-28 The General Hospital Corporation Engineered crispr-cas9 nucleases with altered pam specificity
US10738327B2 (en) 2017-08-28 2020-08-11 Inscripta, Inc. Electroporation cuvettes for automation
EP3676376B1 (en) 2017-08-30 2025-01-15 President and Fellows of Harvard College High efficiency base editors comprising gam
EP3678680A4 (en) * 2017-09-05 2021-12-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. ADMINISTRATION OF A GENE EDITING SYSTEM CONTAINING A SINGLE RETROVIRAL PARTICLE AND METHODS OF GENERATION AND USE
MX2020002643A (es) 2017-09-06 2020-09-25 Regeneron Pharma Variantes relacionadas con el receptor de inmunoglobulina interleucina 1 simple (sigirr) y usos de estas.
US12350312B2 (en) 2017-09-06 2025-07-08 Fred Hutchinson Cancer Center Methods for improving adoptive cell therapy
CN111051349A (zh) 2017-09-06 2020-04-21 弗雷德哈钦森癌症研究中心 Strep-tag特异性嵌合受体及其用途
CN111278851A (zh) 2017-09-07 2020-06-12 雷杰纳荣制药公司 溶质运载体家族14成员1(slc14a1)变体及其用途
US11649442B2 (en) 2017-09-08 2023-05-16 The Regents Of The University Of California RNA-guided endonuclease fusion polypeptides and methods of use thereof
EP3679143A1 (en) 2017-09-08 2020-07-15 Life Technologies Corporation Methods for improved homologous recombination and compositions thereof
US20190076814A1 (en) * 2017-09-11 2019-03-14 Synthego Corporation Biopolymer synthesis system and method
WO2019051428A1 (en) * 2017-09-11 2019-03-14 The Regents Of The University Of California CAS9 ANTIBODY MEDIA ADMINISTRATION TO MAMMALIAN CELLS
CN110168093B (zh) * 2017-09-12 2023-08-15 中科蓝华(广州)生物医药技术有限公司 一种转染细胞内寄生虫的试剂盒及其应用
WO2019055862A1 (en) 2017-09-14 2019-03-21 Fred Hutchinson Cancer Research Center HIGH AFFINITY T CELL RECEPTORS AND USES THEREOF
EP3686275A4 (en) 2017-09-18 2021-09-29 Edigene Inc. GENE EDITING LYMPHOCYTE T AND RELATED USE
IL272713B2 (en) 2017-09-18 2024-10-01 Futuragene Israel Ltd Tissue-specific expression control of della polypeptides
AU2018336988B2 (en) 2017-09-19 2023-06-22 Advaxis, Inc. Compositions and methods for lyophilization of bacteria or Listeria strains
SG11202002520UA (en) 2017-09-19 2020-04-29 Univ British Columbia Anti-hla-a2 antibodies and methods of using the same
US11453865B2 (en) * 2017-09-19 2022-09-27 Massachusetts Institute Of Technology Applications of engineered Streptococcus canis Cas9 variants on single-base PAM targets
WO2019057649A1 (en) 2017-09-19 2019-03-28 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) METHODS AND PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT OF ACUTE MYELOID LEUKEMIA
WO2019060469A2 (en) * 2017-09-19 2019-03-28 Massachusetts Institute Of Technology CAS9 STREPTOCOCCUS CANIS AS A GENOMIC ENGINEERING PLATFORM WITH NEW PAM SPECIFICITY
CN111655340A (zh) 2017-09-20 2020-09-11 国家医疗保健研究所 用于调节自噬的方法和药物组合物
EP3684822A4 (en) 2017-09-20 2021-06-16 The University of British Columbia NEW ANTI-HLA-A2 ANTIBODIES AND USES THEREOF
IT201700105372A1 (it) * 2017-09-20 2019-03-20 Fondazione St Italiano Tecnologia Molecola di acido nucleico funzionale e relativo uso
CA3073449A1 (en) 2017-09-25 2019-03-28 Agrospheres, Inc. Compositions and methods for scalable production and delivery of biologicals
US11572574B2 (en) * 2017-09-28 2023-02-07 Toolgen Incorporated Artificial genome manipulation for gene expression regulation
WO2019067910A1 (en) * 2017-09-29 2019-04-04 Intellia Therapeutics, Inc. POLYNUCLEOTIDES, COMPOSITIONS AND METHODS FOR GENOMIC EDITION
US20190098879A1 (en) 2017-09-29 2019-04-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-Human Animals Comprising A Humanized TTR Locus And Methods Of Use
US11845951B2 (en) * 2017-09-29 2023-12-19 Toolgen Incorporated Gene manipulation for treatment of retinal dysfunction disorder
JP6985508B2 (ja) 2017-09-30 2021-12-22 インスクリプタ， インコーポレイテッド フロースルーエレクトロポレーション機器編成
BR112020006601A2 (pt) 2017-10-02 2020-12-08 Genedit Inc. Rna guia de cpf1 modificado
US12441841B2 (en) 2017-10-05 2025-10-14 Akron Polymer Systems, Inc. Optically transparent polyimides
EP3691656A1 (en) 2017-10-06 2020-08-12 Camp4 Therapeutics Corporation Methods and compositions for treating urea cycle disorders, in particular otc deficiency
EP3694603B1 (en) 2017-10-10 2026-04-08 Children's Hospital Medical Center Esophageal tissue and/or organoid compositions and methods of making same
WO2019075197A1 (en) 2017-10-11 2019-04-18 The General Hospital Corporation METHODS OF DETECTION OF INDIVIDUAL SITE-SPECIFIC PARASITE GENOMIC DEAMINATION BY BASE EDITING TECHNOLOGIES
AU2018348195B2 (en) 2017-10-11 2025-05-15 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Inhibition of HSD17B13 in the treatment of liver disease in patients expressing the PNPLA3 I148M variation
WO2019075409A1 (en) 2017-10-12 2019-04-18 The Regents Of The University Of California ISOLATION AND IDENTIFICATION WITHOUT MICROFLUIDIC LABEL OF CELLS USING FLUORESCENCE LIFE IMAGING (FLIM)
KR20250107288A (ko) 2017-10-16 2025-07-11 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 아데노신 염기 편집제의 용도
AU2018352234A1 (en) 2017-10-16 2020-04-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Cornulin (CRNN) variants and uses thereof
MA50833A (fr) 2017-10-17 2020-08-26 Bayer Healthcare Llc Compositions et méthodes pour l'édition génique pour l'hémophilie a
US11499127B2 (en) 2017-10-20 2022-11-15 The Regents Of The University Of California Multi-layered microfluidic systems for in vitro large-scale perfused capillary networks
WO2019079787A1 (en) * 2017-10-20 2019-04-25 The Regents Of The University Of California MICROFLUIDIC SYSTEMS AND METHODS FOR CELL TRANSFECTION VIA LIPOFLEX
US20210069241A1 (en) 2017-10-20 2021-03-11 Fred Hutchinson Cancer Research Center Compositions and methods of immunotherapy targeting tigit and/or cd112r or comprising cd226 overexpression
WO2019135816A2 (en) * 2017-10-23 2019-07-11 The Broad Institute, Inc. Novel nucleic acid modifiers
US11690856B2 (en) 2017-10-23 2023-07-04 Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) Compounds for treating CMV related diseases
KR102013798B1 (ko) 2017-10-25 2019-08-23 성균관대학교산학협력단 노화 모델 제조 방법 및 이에 의해 제조된 세포 또는 동물 노화 모델
MA50849A (fr) 2017-10-26 2020-09-02 Vertex Pharma Substances et procédés pour le traitement d'hémoglobinopathies
CN109722414A (zh) 2017-10-27 2019-05-07 博雅辑因（北京）生物科技有限公司 一种高效制备成熟红细胞的方法以及用于制备成熟红细胞的培养基
JP7101419B2 (ja) 2017-10-27 2022-07-15 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 内因性ｔ細胞受容体の標的置換
US20210179709A1 (en) 2017-10-31 2021-06-17 Novartis Ag Anti-car compositions and methods
WO2019089804A1 (en) 2017-11-01 2019-05-09 The Regents Of The University Of California Casy compositions and methods of use
AU2018358051B2 (en) 2017-11-01 2025-01-09 The Regents Of The University Of California CasZ compositions and methods of use
EP3704245A1 (en) 2017-11-01 2020-09-09 Novartis AG Synthetic rnas and methods of use
US11970719B2 (en) 2017-11-01 2024-04-30 The Regents Of The University Of California Class 2 CRISPR/Cas compositions and methods of use
WO2019090175A1 (en) * 2017-11-02 2019-05-09 Arbor Biotechnologies, Inc. Novel crispr-associated transposon systems and components
EP3707155A2 (en) 2017-11-09 2020-09-16 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Crispr/cas systems for treatment of dmd
US10940171B2 (en) 2017-11-10 2021-03-09 Massachusetts Institute Of Technology Microbial production of pure single stranded nucleic acids
JP7097440B2 (ja) 2017-11-10 2022-07-07 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド Ｓｌｃ３０ａ８変異を含む非ヒト動物および使用方法
IL317505A (en) * 2017-11-10 2025-02-01 Univ Massachusetts CRISPR-directed delivery platforms
EP3707252A1 (en) 2017-11-10 2020-09-16 Novozymes A/S Temperature-sensitive cas9 protein
CN120310773A (zh) 2017-11-16 2025-07-15 阿斯利康(瑞典)有限公司 用于改善基于Cas9的敲入策略的有效性的组合物和方法
EP3713644B1 (en) 2017-11-20 2024-08-07 University of Georgia Research Foundation, Inc. Compositions and methods for modulating hif-2a to improve muscle generation and repair
WO2019101995A1 (en) 2017-11-27 2019-05-31 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and pharmaceutical compositions for cardiac regeneration
US20190160120A1 (en) * 2017-11-29 2019-05-30 Snipr Biome Aps Dna, methods etc
JP7361031B2 (ja) 2017-11-30 2023-10-13 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド ヒト化ｔｒｋｂ遺伝子座を含む非ヒト動物
US20220267403A1 (en) 2017-12-01 2022-08-25 Fred Hutchinson Cancer Research Center Binding proteins specific for 5t4 and uses thereof
US20210002609A1 (en) 2017-12-05 2021-01-07 Caribou Biosciences, Inc. Modified lymphocytes
AU2018379996A1 (en) * 2017-12-05 2020-06-25 BioPlx, Inc. Methods and compositions to prevent microbial infection
AU2018378479B2 (en) 2017-12-05 2025-03-13 Vertex Pharmaceuticals Incorporated CRISPR-Cas9 modified CD34+ human hematopoietic stem and progenitor cells and uses thereof
CA3084263A1 (en) 2017-12-07 2019-06-13 Zymergen Inc. Engineered biosynthetic pathways for production of (6e)-8-hydroxygeraniol by fermentation
CA3082956A1 (en) 2017-12-08 2019-06-13 Synthetic Genomics, Inc. Improving algal lipid productivity via genetic modification of a tpr domain containing protein
JP2021506251A (ja) * 2017-12-14 2021-02-22 クリスパー セラピューティクス アーゲー 新規ｒｎａプログラム可能エンドヌクレアーゼ系、ならびにゲノム編集および他の適用におけるその使用
US11661599B1 (en) 2017-12-14 2023-05-30 National Technology & Engineering Solutions Of Sandia, Llc CRISPR-Cas based system for targeting single-stranded sequences
EP3724327A4 (en) 2017-12-14 2022-01-12 EZY Biotech LLC SUBJECT-SPECIFIC TUMOR-INHIBITING CELLS AND THEIR USE
BR112020011011A2 (pt) 2017-12-15 2020-11-17 Danisco Us Inc. variantes de cas9 e métodos de uso
CN111819185A (zh) 2017-12-15 2020-10-23 旗舰创业创新第六有限责任公司 包含环状多核糖核苷酸的组合物及其用途
US12406749B2 (en) 2017-12-15 2025-09-02 The Broad Institute, Inc. Systems and methods for predicting repair outcomes in genetic engineering
AU2018393050A1 (en) 2017-12-21 2020-06-18 Bayer Healthcare Llc Materials and methods for treatment of Usher Syndrome Type 2A
EP3727394A4 (en) 2017-12-21 2021-09-08 Children's Hospital Medical Center DIGITALIZED HUMAN ORGANOIDS AND METHOD OF USING THEREOF
SG11202006101WA (en) * 2017-12-29 2020-07-29 Scripps Research Inst Unnatural base pair compositions and methods of use
JP7295864B2 (ja) 2017-12-29 2023-06-21 シンセティック ジェノミクス インコーポレーテッド 成長を改善するための光合成生物の遺伝子調節方法
WO2019133881A1 (en) 2017-12-29 2019-07-04 Rubius Therapeutics, Inc. Gene editing and targeted transcriptional modulation for enginerering erythroid cells
WO2019130319A1 (en) 2018-01-01 2019-07-04 Aposense Ltd. Compounds and methods for trans-membrane delivery of molecules
EP3735590A1 (en) 2018-01-04 2020-11-11 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for treating melanoma resistant
EP3735462A1 (en) 2018-01-05 2020-11-11 The Board of Regents of The University of Texas System Therapeutic crispr/cas9 compositions and methods of use
CN118830491A (zh) 2018-01-09 2024-10-25 希博斯美国有限公司 防碎基因和突变
WO2019140278A1 (en) 2018-01-11 2019-07-18 Fred Hutchinson Cancer Research Center Immunotherapy targeting core binding factor antigens
CA3088180A1 (en) 2018-01-12 2019-07-18 Crispr Therapeutics Ag Compositions and methods for gene editing by targeting transferrin
US11268092B2 (en) 2018-01-12 2022-03-08 GenEdit, Inc. Structure-engineered guide RNA
AU2019207409B2 (en) 2018-01-12 2023-02-23 Basf Se Gene underlying the number of spikelets per spike qtl in wheat on chromosome 7a
JP7466448B2 (ja) * 2018-01-17 2024-04-12 バーテックス ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド Ｄｎａ－ｐｋ阻害剤
BR112020013626A2 (pt) 2018-01-17 2020-12-01 Vertex Pharmaceuticals Incorporated compostos de quinoxalinona, composições, métodos e kits para aumentar a eficiência de edição de genoma
EP3740580A4 (en) 2018-01-19 2021-10-20 Duke University GENOME ENGINEERING WITH CRISPR-CAS SYSTEMS IN EUKARYONTS
WO2019145413A1 (en) 2018-01-25 2019-08-01 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Antagonists of il-33 for use in methods for preventing ischemia reperfusion injury in an organ
WO2019147275A1 (en) * 2018-01-26 2019-08-01 Integrated Dna Technologies, Inc. Crispr-based compositions and methods of use
WO2019147302A1 (en) * 2018-01-26 2019-08-01 Bauer Daniel E Targeting bcl11a distal regulatory elements with a cas9-cas9 fusion for fetal hemoglobin reinduction
US11926835B1 (en) 2018-01-29 2024-03-12 Inari Agriculture Technology, Inc. Methods for efficient tomato genome editing
US11497752B2 (en) 2018-01-30 2022-11-15 Foghorn Therapeutics Inc. Compounds and uses thereof
AR114350A1 (es) 2018-01-31 2020-08-26 Res Institute At Nationwide Children’S Hospital Terapia genética para la distrofia muscular de cinturas del tipo 2c
AU2019216321A1 (en) 2018-01-31 2020-07-30 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Compositions and methods for correcting dystrophin mutations in human cardiomyocytes
WO2019150309A1 (en) 2018-02-02 2019-08-08 Hammack Scott Modulators of gpr68 and uses thereof for treating and preventing diseases
US11268077B2 (en) 2018-02-05 2022-03-08 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Materials and methods for treatment of hemoglobinopathies
WO2019152941A1 (en) 2018-02-05 2019-08-08 Caribou Biosciences, Inc. Engineered gut microbes for reduction of reactivation of detoxified drugs
US11566236B2 (en) 2018-02-05 2023-01-31 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Materials and methods for treatment of hemoglobinopathies
CN111699254A (zh) 2018-02-08 2020-09-22 齐默尔根公司 使用crispr在棒状杆菌属中进行基因组编辑
KR102465067B1 (ko) 2018-02-15 2022-11-10 시그마-알드리치 컴퍼니., 엘엘씨 진핵 게놈 변형을 위한 조작된 cas9 시스템
MA51869A (fr) 2018-02-16 2020-12-23 Bayer Healthcare Llc Compositions et méthodes pour l'édition génique par ciblage du fibrinogène-alpha
JP7384811B2 (ja) 2018-02-16 2023-11-21 アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル 白斑を処置するための方法及び組成物
US11718849B2 (en) 2018-02-19 2023-08-08 Agilent Technologies, Inc. Phosphopeptide-encoding oligonucleotide libraries and methods for detecting phosphorylation-dependent molecular interactions
WO2019165168A1 (en) 2018-02-23 2019-08-29 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Novel cas9 orthologs
AU2019224051A1 (en) 2018-02-26 2020-09-03 Fred Hutchinson Cancer Center Compositions and methods for cellular immunotherapy
US11713472B2 (en) 2018-03-06 2023-08-01 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Genome editing in Archaea
AU2019231783B2 (en) 2018-03-09 2023-11-16 Advaxis, Inc. Compositions and methods for evaluating attenuation and infectivity of Listeria strains
US11332752B2 (en) * 2018-03-12 2022-05-17 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Use of morphogenic factors for the improvement of gene editing
KR102907245B1 (ko) 2018-03-14 2026-01-05 에디타스 메디신, 인코포레이티드 혈색소병증 치료를 위한 시스템 및 방법
US20190284553A1 (en) 2018-03-15 2019-09-19 KSQ Therapeutics, Inc. Gene-regulating compositions and methods for improved immunotherapy
MA52074A (fr) * 2018-03-19 2021-01-27 Bayer Healthcare Llc Nouveaux systèmes d'endonucléase à arn programmable et leurs utilisations
EP3592140A1 (en) * 2018-03-19 2020-01-15 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Transcription modulation in animals using crispr/cas systems
US20210037798A1 (en) 2018-03-20 2021-02-11 Tsinghua University Alzheimers disease animal model and use thereof
AU2019239971B2 (en) 2018-03-21 2025-09-11 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. 17beta-hydroxysteroid dehydrogenase type 13 (HSD17b13) iRNA compositions and methods of use thereof
US10760075B2 (en) 2018-04-30 2020-09-01 Snipr Biome Aps Treating and preventing microbial infections
KR102287880B1 (ko) * 2018-03-26 2021-08-09 고쿠리츠다이가쿠호진 고베다이가쿠 세포에서 이중 가닥 dna의 표적 부위를 변형시키기 위한 방법
US11447769B2 (en) 2018-03-27 2022-09-20 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Modified immune cells having enhanced function and methods for screening for same
CN112533627A (zh) * 2018-03-27 2021-03-19 G+Flas 生命科学公司 序列特异性体内细胞靶向
GB201805287D0 (en) 2018-03-29 2018-05-16 Univ Edinburgh Haematoietic stem cell treatment
US10443031B1 (en) 2018-03-29 2019-10-15 Inscripta, Inc. Methods for controlling the growth of prokaryotic and eukaryotic cells
UA129286C2 (uk) 2018-04-04 2025-03-12 Сайбас Юес Ллс Гени fad2 і мутації
WO2019193375A1 (en) 2018-04-04 2019-10-10 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Use of fzd7 inhibitors for the treatment of retinal neovascularization
JP7522038B2 (ja) 2018-04-06 2024-07-24 ザ チルドレンズ メディカル センター コーポレーション 体細胞リプログラミングおよびインプリンティングのモジュレートのための組成物および方法
AU2019250692A1 (en) 2018-04-13 2020-11-05 Sangamo Therapeutics France Chimeric antigen receptor specific for Interleukin-23 receptor
WO2019200004A1 (en) 2018-04-13 2019-10-17 Inscripta, Inc. Automated cell processing instruments comprising reagent cartridges
US11898203B2 (en) 2018-04-17 2024-02-13 The General Hospital Corporation Highly sensitive in vitro assays to define substrate preferences and sites of nucleic-acid binding, modifying, and cleaving agents
WO2019204668A1 (en) 2018-04-18 2019-10-24 Casebia Therapeutics Limited Liability Partnership Compositions and methods for knockdown of apo(a) by gene editing for treatment of cardiovascular disease
KR102922694B1 (ko) 2018-04-19 2026-02-03 더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아 유전자 편집을 위한 조성물 및 방법
US10557216B2 (en) 2018-04-24 2020-02-11 Inscripta, Inc. Automated instrumentation for production of T-cell receptor peptide libraries
US10858761B2 (en) 2018-04-24 2020-12-08 Inscripta, Inc. Nucleic acid-guided editing of exogenous polynucleotides in heterologous cells
WO2019209926A1 (en) 2018-04-24 2019-10-31 Inscripta, Inc. Automated instrumentation for production of peptide libraries
WO2019210153A1 (en) 2018-04-27 2019-10-31 Novartis Ag Car t cell therapies with enhanced efficacy
US20210239681A1 (en) 2018-04-27 2021-08-05 Advaxis, Inc. Compositions and methods for evaluating potency of listeria-based immunotherapeutics
WO2019210057A1 (en) 2018-04-27 2019-10-31 Seattle Children's Hospital (dba Seattle Children's Research Institute) Rapamycin resistant cells
WO2019213273A1 (en) 2018-05-01 2019-11-07 The Children's Medical Center Corporation Enhanced bcl11a rnp / crispr delivery & editing using a 3xnls-cas9
WO2019213013A1 (en) 2018-05-02 2019-11-07 The Children's Medical Center Corporation Improved bcl11a micrornas for treating hemoglobinopathies
EP3790974A1 (en) 2018-05-10 2021-03-17 Auxolytic Ltd Gene therapy methods and compositions using auxotrophic regulatable cells
WO2019213910A1 (en) * 2018-05-10 2019-11-14 Syngenta Participations Ag Methods and compositions for targeted editing of polynucleotides
AU2019265019B2 (en) 2018-05-11 2025-11-06 Beam Therapeutics Inc. Methods of substituting pathogenic amino acids using programmable base editor systems
CA3100050A1 (en) 2018-05-11 2019-11-14 Lupagen, Inc. Systems and methods for closed loop, real-time modifications of patient cells
KR20210045360A (ko) 2018-05-16 2021-04-26 신테고 코포레이션 가이드 rna 설계 및 사용을 위한 방법 및 시스템
CN112839671A (zh) 2018-05-17 2021-05-25 明尼苏达大学董事会 抗药性免疫细胞及其使用方法
US11946049B2 (en) 2018-05-22 2024-04-02 The Regents Of The University Of California tRNA/pre-miRNA compositions and use in treating cancer
US12157760B2 (en) 2018-05-23 2024-12-03 The Broad Institute, Inc. Base editors and uses thereof
EP3784776A4 (en) 2018-05-23 2022-01-26 National University of Singapore Blockade of cd2 surface expression and expression of chimeric antigen receptors for immunotherapy of t-cell malignancies
EP3572512A1 (en) 2018-05-24 2019-11-27 B.R.A.I.N. Ag A method for engineering a protein
US11866719B1 (en) 2018-06-04 2024-01-09 Inari Agriculture Technology, Inc. Heterologous integration of regulatory elements to alter gene expression in wheat cells and wheat plants
PL3802807T3 (pl) 2018-06-05 2025-03-31 Life Edit Therapeutics, Inc. Nukleazy kierowane rna i ich aktywne fragmenty oraz warianty i sposoby ich zastosowania
WO2019236893A2 (en) * 2018-06-07 2019-12-12 Allen Institute Stem cell lines containing endogenous, differentially-expressed tagged proteins, methods of production, and use thereof
FR3082208A1 (fr) 2018-06-11 2019-12-13 Fondation Mediterranee Infection Methode de modification d'une sequence cible d'acide nucleique d'une cellule hote
TWI890660B (zh) 2018-06-13 2025-07-21 瑞士商諾華公司 Bcma 嵌合抗原受體及其用途
WO2019246488A1 (en) 2018-06-21 2019-12-26 Duke University Compositions and methods for the production of pyruvic acid and related products using dynamic metabolic control
EP3823633A4 (en) 2018-06-29 2023-05-03 Editas Medicine, Inc. SYNTHETIC LEAD MOLECULES, COMPOSITIONS AND METHODS RELATED THERETO
EP3814369A1 (en) 2018-06-29 2021-05-05 Stichting Het Nederlands Kanker Instituut- Antoni van Leeuwenhoek Ziekenhuis Tweak-receptor agonists for use in combination with immunotherapy of a cancer
KR20210028162A (ko) 2018-06-29 2021-03-11 더 리서치 인스티튜트 앳 네이션와이드 칠드런스 하스피탈 지대근 이영양증 2a형을 치료하기 위한 재조합 아데노 연관 바이러스 생성물 및 방법
CA3108767A1 (en) 2018-06-30 2020-01-02 Inscripta, Inc. Instruments, modules, and methods for improved detection of edited sequences in live cells
WO2020014235A1 (en) 2018-07-09 2020-01-16 The Regents Of The University Of California Gene targets for t-cell-based immunotherapy
US12522807B2 (en) 2018-07-09 2026-01-13 The Broad Institute, Inc. RNA programmable epigenetic RNA modifiers and uses thereof
JP2021530212A (ja) 2018-07-13 2021-11-11 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニアThe Regents Of The University Of California レトロトランスポゾンベースの送達媒体及びその使用方法
CN113039276A (zh) 2018-07-16 2021-06-25 密歇根大学董事会 核酸酶介导的核酸修饰
WO2020018918A1 (en) 2018-07-19 2020-01-23 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Methods for exon skipping and gene knockout using base editors
WO2020018964A1 (en) 2018-07-20 2020-01-23 Fred Hutchinson Cancer Research Center Compositions and methods for controlled expression of antigen-specific receptors
WO2020023655A1 (en) * 2018-07-24 2020-01-30 Flagship Pioneering, Inc. Compositions comprising circular polyribonucleotides and uses thereof
EP4678727A3 (en) 2018-07-26 2026-03-11 Children's Hospital Medical Center Hepato-biliary-pancreatic tissues and methods of making same
MX2021001070A (es) * 2018-07-31 2021-05-27 Intellia Therapeutics Inc Composiciones y métodos para editar el gen hidroxiácido oxidasa 1 (hao1) para tratar la hiperoxaluria primaria tipo 1 (ph1).
EP3830301B1 (en) 2018-08-01 2024-05-22 Mammoth Biosciences, Inc. Programmable nuclease compositions and methods of use thereof
US20210290727A1 (en) * 2018-08-01 2021-09-23 University Of Maryland, Baltimore MODULATION OF mTORCI ACTIVITY AND AUTOPHAGY VIA CIB2-RHEB INTERACTION
US11939593B2 (en) 2018-08-01 2024-03-26 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Compositions and methods for improving embryo development
AU2019317066A1 (en) 2018-08-07 2021-02-18 Modalis Therapeutics Corporation Novel transcription activator
KR20210046006A (ko) 2018-08-10 2021-04-27 상가모 테라퓨틱스 프랑스 Tnfr2 도메인을 포함하는 신규한 car 작제물
US10752874B2 (en) 2018-08-14 2020-08-25 Inscripta, Inc. Instruments, modules, and methods for improved detection of edited sequences in live cells
US10532324B1 (en) 2018-08-14 2020-01-14 Inscripta, Inc. Instruments, modules, and methods for improved detection of edited sequences in live cells
US11142740B2 (en) 2018-08-14 2021-10-12 Inscripta, Inc. Detection of nuclease edited sequences in automated modules and instruments
CA3107002A1 (en) 2018-08-15 2020-04-30 Zymergen Inc. Applications of crispri in high throughput metabolic engineering
US12497611B2 (en) 2018-08-17 2025-12-16 Yale University Compositions and methods for high-throughput activation screening to boost T cell effector function
WO2020055547A2 (en) 2018-08-18 2020-03-19 Seed Health, Inc. Methods and compositions for honey bee health
US12421507B2 (en) * 2018-08-20 2025-09-23 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for optochemical control of CRISPR-CAS9
CN112912387A (zh) 2018-08-22 2021-06-04 弗雷德哈钦森癌症研究中心 靶向kras或her2抗原的免疫疗法
US12275964B2 (en) 2018-08-22 2025-04-15 The Regents Of The University Of California Variant type V CRISPR/Cas effector polypeptides and methods of use thereof
AU2019326408A1 (en) 2018-08-23 2021-03-11 Sangamo Therapeutics, Inc. Engineered target specific base editors
CA3110089A1 (en) 2018-08-28 2020-03-05 Fred Hutchinson Cancer Research Center Methods and compositions for adoptive t cell therapy incorporating induced notch signaling
CA3110837A1 (en) 2018-08-28 2020-03-05 Vor Biopharma Inc. Genetically engineered hematopoietic stem cells and uses thereof
MX2021002418A (es) 2018-08-30 2021-04-28 Univ North Carolina Chapel Hill Genes sinteticos activados por retroalimentacion, casetes de coincidencia de semilla objetivo y sus usos.
WO2020081149A2 (en) 2018-08-30 2020-04-23 Inscripta, Inc. Improved detection of nuclease edited sequences in automated modules and instruments
EP3844287B1 (en) 2018-08-31 2024-05-22 Yale University Compositions and methods for enhancing donor oligonucleotide-based gene editing
US12534743B2 (en) 2018-08-31 2026-01-27 Inari Agriculture Technology, Inc. Compositions, systems, and methods for genome editing
US11479762B1 (en) 2018-08-31 2022-10-25 Inari Agriculture Technology, Inc. Compositions, systems, and methods for genome editing
CA3111186A1 (en) 2018-08-31 2020-03-05 Yale University Compositions and methods for enhancing triplex and nuclease-based gene editing
US12545910B2 (en) 2018-08-31 2026-02-10 Inari Agriculture Technology, Inc. Compositions, systems, and methods for genome editing
WO2020048942A1 (en) 2018-09-04 2020-03-12 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and pharmaceutical compositions for enhancing cytotoxic t lymphocyte-dependent immune responses
WO2020049026A1 (en) 2018-09-05 2020-03-12 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for treating asthma and allergic diseases
WO2020051562A2 (en) 2018-09-07 2020-03-12 Beam Therapeutics Inc. Compositions and methods for improving base editing
CN112654702B (zh) 2018-09-07 2025-05-13 阿斯利康(瑞典)有限公司 改进的核酸酶的组合物和方法
EP3847254A4 (en) 2018-09-07 2022-08-10 Beam Therapeutics Inc. COMPOSITIONS AND METHODS FOR DELIVERING A NUCLEOBASE EDITING SYSTEM
US12378572B2 (en) 2018-09-07 2025-08-05 Crispr Therapeutics Ag Universal donor cells
EP3849545A1 (en) 2018-09-10 2021-07-21 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) Methods for the treatment of neurofibromatosis
CA3112026A1 (en) 2018-09-12 2020-03-19 Children's Hospital Medical Center Organoid compositions for the production of hematopoietic stem cells and derivatives thereof
JP7222075B2 (ja) 2018-09-13 2023-02-14 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド Ｃ３糸球体症のモデルとしての補体因子ｈ遺伝子ノックアウトラット
RU2706298C1 (ru) * 2018-09-14 2019-11-15 Закрытое Акционерное Общество "Биокад" НУКЛЕАЗА PaCas9
US12097239B2 (en) 2018-09-21 2024-09-24 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for treating diabetes, and methods for enriching MRNA coding for secreted proteins
US20240165232A1 (en) 2018-09-24 2024-05-23 Fred Hutchinson Cancer Research Center Chimeric receptor proteins and uses thereof
EP3856772A1 (en) 2018-09-25 2021-08-04 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) Use of antagonists of th17 cytokines for the treatment of bronchial remodeling in patients suffering from allergic asthma
GB201815820D0 (en) 2018-09-28 2018-11-14 Univ Wageningen Off-target activity inhibitors for guided endonucleases
WO2020072254A1 (en) 2018-10-01 2020-04-09 North Carolina State University Recombinant type i crispr-cas system and uses thereof for killing target cells
WO2020072250A1 (en) 2018-10-01 2020-04-09 North Carolina State University Recombinant type i crispr-cas system and uses thereof for genome modification and alteration of expression
WO2020070062A1 (en) 2018-10-01 2020-04-09 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Use of tim-3 inhibitors for the treatment of exacerbations in patients suffering from severe asthma
WO2020072248A1 (en) 2018-10-01 2020-04-09 North Carolina State University Recombinant type i crispr-cas system
US12203123B2 (en) 2018-10-01 2025-01-21 North Carolina State University Recombinant type I CRISPR-Cas system and uses thereof for screening for variant cells
EP3862430A4 (en) 2018-10-04 2022-06-15 Kaneka Corporation DNA CONSTRUCT FOR USE IN PLANT GENO EDITING
JP2022512648A (ja) 2018-10-09 2022-02-07 アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル 心筋線維化の処置のためのαＶ－インテグリン（ＣＤ５１）阻害剤の使用
WO2020076976A1 (en) 2018-10-10 2020-04-16 Readcoor, Inc. Three-dimensional spatial molecular indexing
US11851663B2 (en) 2018-10-14 2023-12-26 Snipr Biome Aps Single-vector type I vectors
JP2022505139A (ja) 2018-10-15 2022-01-14 フォンダッツィオーネ・テレソン ゲノム編集の方法及び構築物
WO2020081173A1 (en) 2018-10-16 2020-04-23 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Genome edited fine mapping and causal gene identification
JP7520826B2 (ja) 2018-10-17 2024-07-23 クリスパー・セラピューティクス・アクチェンゲゼルシャフト 導入遺伝子を送達するための組成物および方法
WO2020081588A1 (en) 2018-10-17 2020-04-23 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Swi/snf family chromatin remodeling complexes and uses thereof
WO2020079162A1 (en) 2018-10-18 2020-04-23 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for inducing full ablation of hematopoiesis
CN113272428A (zh) 2018-10-18 2021-08-17 英特利亚治疗股份有限公司 核酸构建体和使用方法
US20200270617A1 (en) 2018-10-18 2020-08-27 Intellia Therapeutics, Inc. Compositions and methods for transgene expression from an albumin locus
AU2019360270B2 (en) 2018-10-18 2025-08-07 Intellia Therapeutics, Inc. Compositions and methods for expressing factor IX.
WO2020082047A1 (en) 2018-10-18 2020-04-23 Intellia Therapeutics, Inc. Compositions and methods for treating alpha-1 antitrypsin deficiencey
US11214781B2 (en) 2018-10-22 2022-01-04 Inscripta, Inc. Engineered enzyme
WO2020086475A1 (en) 2018-10-22 2020-04-30 Inscripta, Inc. Engineered enzymes
US11946047B2 (en) * 2018-10-23 2024-04-02 Texas Tech University System Treatment strategies against anthrax by interfering with critical host factors
UY38427A (es) 2018-10-26 2020-05-29 Novartis Ag Métodos y composiciones para terapia con células oculares
US11407995B1 (en) 2018-10-26 2022-08-09 Inari Agriculture Technology, Inc. RNA-guided nucleases and DNA binding proteins
WO2020092453A1 (en) 2018-10-29 2020-05-07 The Broad Institute, Inc. Nucleobase editors comprising geocas9 and uses thereof
WO2020092057A1 (en) 2018-10-30 2020-05-07 Yale University Compositions and methods for rapid and modular generation of chimeric antigen receptor t cells
SG11202104409YA (en) 2018-10-31 2021-05-28 Zymergen Inc Multiplexed deterministic assembly of dna libraries
EP3874048A1 (en) 2018-11-01 2021-09-08 Keygene N.V. Dual guide rna for crispr/cas genome editing in plants cells
US11434477B1 (en) 2018-11-02 2022-09-06 Inari Agriculture Technology, Inc. RNA-guided nucleases and DNA binding proteins
US11965172B2 (en) 2018-11-05 2024-04-23 California Institute Of Technology DNA sequence modification-based gene drive
WO2020097445A1 (en) 2018-11-09 2020-05-14 Inari Agriculture, Inc. Rna-guided nucleases and dna binding proteins
CA3119188A1 (en) 2018-11-09 2020-05-14 Fred Hutchinson Cancer Research Center T cell receptors specific for mesothelin and their use in immunotherapy
US12194327B2 (en) 2018-11-14 2025-01-14 University Of Florida Research Foundation, Inc. Materials and methods for modifying Wolbachia and paratransformation of arthropods
WO2020101042A1 (en) 2018-11-16 2020-05-22 Astellas Pharma Inc. Method for treating muscular dystrophy by targeting utrophin gene
RU2712497C1 (ru) * 2018-11-26 2020-01-29 Автономная некоммерческая образовательная организация высшего образования Сколковский институт науки и технологий Средство разрезания ДНК на основе Cas9 белка из биотехнологически значимой бактерии Clostridium cellulolyticum
TWI850282B (zh) 2018-11-27 2024-08-01 香港商弘年發展有限公司 用於治療癌症之質體建構體和使用方法
CN113710799B (zh) 2018-11-28 2024-11-12 克里斯珀医疗股份公司 用于在LNP中使用的编码CAS9的优化mRNA
WO2020109412A1 (en) 2018-11-28 2020-06-04 Keygene N.V. Targeted enrichment by endonuclease protection
JP2022513159A (ja) * 2018-11-29 2022-02-07 フラッグシップ パイオニアリング イノベーションズ ブイ， インコーポレイテッド Ｒｎａを調節する方法
WO2020112195A1 (en) 2018-11-30 2020-06-04 Yale University Compositions, technologies and methods of using plerixafor to enhance gene editing
KR20200071198A (ko) 2018-12-10 2020-06-19 네오이뮨텍, 인코퍼레이티드 Nrf2 발현 조절 기반 T 세포 항암면역치료법
US11166996B2 (en) 2018-12-12 2021-11-09 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Anellovirus compositions and methods of use
JP7553100B2 (ja) * 2018-12-12 2024-09-18 国立大学法人九州大学 ゲノム編集された細胞の製造方法
WO2020123887A2 (en) 2018-12-14 2020-06-18 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Novel crispr-cas systems for genome editing
CN113544266A (zh) * 2018-12-17 2021-10-22 博德研究所 Crispr相关转座酶系统和其使用方法
AU2019400930A1 (en) 2018-12-19 2021-07-01 King's College London Immunotherapeutic methods and compositions
KR102925054B1 (ko) 2018-12-20 2026-02-10 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 뉴클레아제-매개 반복부 팽창
WO2020132647A1 (en) 2018-12-21 2020-06-25 Northwestern University Use of annexins in preventing and treating muscle membrane injury
AU2019417720A1 (en) * 2018-12-24 2021-07-08 Visterra, Inc. Methods for identifying epitopes and paratopes
WO2020136216A1 (en) 2018-12-27 2020-07-02 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods of identifying subjects having or at risk of having a coagulation related disorder
KR20210149686A (ko) 2018-12-27 2021-12-09 라이프에디트 테라퓨틱스, 인크. 유전자 편집에 유용한 폴리펩티드 및 사용 방법
EP3906321A1 (en) * 2018-12-31 2021-11-10 HTG Molecular Diagnostics, Inc. Methods of detecting dna and rna in the same sample
CN113574386A (zh) 2019-01-03 2021-10-29 国家医疗保健研究所 用于增强癌症患者的cd8+t细胞依赖性免疫应答的方法和药物组合物
EP3931313A2 (en) 2019-01-04 2022-01-05 Mammoth Biosciences, Inc. Programmable nuclease improvements and compositions and methods for nucleic acid amplification and detection
TWI852977B (zh) * 2019-01-10 2024-08-21 美商健生生物科技公司 前列腺新抗原及其用途
WO2020148206A1 (en) 2019-01-14 2020-07-23 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and kits for generating and selecting a variant of a binding protein with increased binding affinity and/or specificity
AU2020208190B2 (en) 2019-01-15 2022-07-28 Seminis Vegetable Seeds, Inc. Green bean plants with improved disease resistance
JP2022522265A (ja) 2019-01-16 2022-04-15 アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル エリスロフェロンの変異体及びその使用
CN113597318A (zh) 2019-01-17 2021-11-02 巴塞罗那自治大学(Uab) 治疗性纳米缀合物及其用途
US12351837B2 (en) 2019-01-23 2025-07-08 The Broad Institute, Inc. Supernegatively charged proteins and uses thereof
WO2020154595A1 (en) 2019-01-24 2020-07-30 Massachusetts Institute Of Technology Nucleic acid nanostructure platform for antigen presentation and vaccine formulations formed therefrom
US20220249625A1 (en) * 2019-01-29 2022-08-11 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Compositions comprising an endonuclease and methods for purifying an endonuclease
US12384776B2 (en) 2019-01-29 2025-08-12 Foghorn Therapeutics Inc. Compounds and uses thereof
US12509453B2 (en) 2019-01-29 2025-12-30 Foghorn Therapeutics Inc. BRM/BRG1 inhibitors and uses thereof
AU2020215730A1 (en) 2019-01-31 2021-07-29 Beam Therapeutics Inc. Nucleobase editors having reduced non-target deamination and assays for characterizing nucleobase editors
US12600943B2 (en) 2019-02-01 2026-04-14 The University Of Hong Kong Innervated organoid compositions and methods of making same
EP3921031A1 (en) 2019-02-04 2021-12-15 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) Methods and compositions for modulating blood-brain barrier
US11946040B2 (en) 2019-02-04 2024-04-02 The General Hospital Corporation Adenine DNA base editor variants with reduced off-target RNA editing
WO2020163856A1 (en) 2019-02-10 2020-08-13 The J. David Gladstone Institutes, A Testamentary Trust Established Under The Will Of J. David Gladstone Modified mitochondrion and methods of use thereof
CN120174005A (zh) 2019-02-13 2025-06-20 比姆医疗股份有限公司 具有用于修饰靶标序列中核碱基的腺苷脱氨酶碱基编辑器的经修饰的免疫细胞
SG11202108357PA (en) 2019-02-15 2021-08-30 Crispr Therapeutics Ag Gene editing for hemophilia a with improved factor viii expression
US10947517B2 (en) 2019-02-15 2021-03-16 Sigma-Aldrich Co. Llc CRISPR/Cas fusion proteins and systems
WO2020169472A2 (en) 2019-02-18 2020-08-27 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods of inducing phenotypic changes in macrophages
GB201902277D0 (en) 2019-02-19 2019-04-03 King S College London Therapeutic agents
CN114026116A (zh) 2019-02-20 2022-02-08 弗雷德哈钦森癌症研究中心 Ras新抗原特异性结合蛋白及其用途
WO2020176389A1 (en) 2019-02-25 2020-09-03 Caribou Biosciences, Inc. Plasmids for gene editing
AU2020229340A1 (en) 2019-02-26 2021-09-16 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Adeno-associated virus vector delivery of B-sarcoglycan and the treatment of muscular dystrophy
WO2020176564A1 (en) 2019-02-26 2020-09-03 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Method and composition for treating gastrointestinal inflammatory disorders
US20220049273A1 (en) * 2019-03-01 2022-02-17 Arbor Biotechnologies, Inc. Novel crispr dna targeting enzymes and systems
WO2020178759A1 (en) 2019-03-04 2020-09-10 King Abdullah University Of Science And Technology Compositions and methods of targeted nucleic acid enrichment by loop adapter protection and exonuclease digestion
MX2021010559A (es) * 2019-03-07 2021-12-15 Univ California Polipéptidos efectores de crispr-cas y métodos de uso de estos.
US11053515B2 (en) 2019-03-08 2021-07-06 Zymergen Inc. Pooled genome editing in microbes
CN113728106A (zh) 2019-03-08 2021-11-30 齐默尔根公司 微生物中的迭代基因组编辑
CN113825834A (zh) 2019-03-11 2021-12-21 索伦托药业有限公司 使用rna引导的核酸内切酶进行dna构建体整合的改进工艺
WO2020185796A1 (en) 2019-03-11 2020-09-17 Fred Hutchinson Cancer Research Center High avidity wt1 t cell receptors and uses thereof
SG11202109741VA (en) * 2019-03-12 2021-10-28 Crispr Therapeutics Ag Novel high fidelity rna-programmable endonuclease systems and uses thereof
EP3769090B1 (en) 2019-03-18 2023-11-15 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Crispr/cas dropout screening platform to reveal genetic vulnerabilities associated with tau aggregation
CN120648640A (zh) 2019-03-18 2025-09-16 瑞泽恩制药公司 用于鉴定tau接种或聚集的基因修饰因子的CRISPR/Cas筛选平台
WO2020191233A1 (en) 2019-03-19 2020-09-24 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for editing nucleotide sequences
WO2020198403A2 (en) 2019-03-25 2020-10-01 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Compositions comprising modified circular polyribonucleotides and uses thereof
US11001831B2 (en) 2019-03-25 2021-05-11 Inscripta, Inc. Simultaneous multiplex genome editing in yeast
AU2020247900A1 (en) 2019-03-25 2021-11-04 Inscripta, Inc. Simultaneous multiplex genome editing in yeast
EP3947425A1 (en) 2019-03-27 2022-02-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Plant explant transformation
WO2020193740A1 (en) 2019-03-28 2020-10-01 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) New strategy for treating pancreatic cancer
WO2020201073A1 (en) 2019-03-29 2020-10-08 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for the treatment of keloid, hypertrophic scars and/or hyperpigmentation disorders
EP3947737A2 (en) 2019-04-02 2022-02-09 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods of predicting and preventing cancer in patients having premalignant lesions
AU2020256225B9 (en) 2019-04-03 2025-04-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for insertion of antibody coding sequences into a safe harbor locus
KR102661779B1 (ko) 2019-04-04 2024-04-30 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 인간화 응고 인자 12 좌위를 포함하는 비-인간 동물
RU2771374C1 (ru) 2019-04-04 2022-05-04 Редженерон Фармасьютикалс, Инк. Способы для бесшовного внесения целевых модификаций в направленные векторы
CN113646429B (zh) 2019-04-05 2025-07-11 国立大学法人大阪大学 敲入细胞的制作方法
KR102931179B1 (ko) 2019-04-05 2026-02-25 다니스코 유에스 인크. 선형 재조합 dna 작제물 및 이의 조성물을 이용하여 공여 dna 서열을 바실러스 게놈 내에 통합시키기 위한 방법
EP3947656A1 (en) 2019-04-05 2022-02-09 Danisco US Inc. Methods for polynucleotide integration into the genome of bacillus using dual circular recombinant dna constructs and compositions thereof
WO2020208082A1 (en) 2019-04-09 2020-10-15 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Method for treating cmv related diseases
JP7641233B2 (ja) 2019-04-12 2025-03-06 アストラゼネカ・アクチエボラーグ 改善された遺伝子編集のための組成物及び方法
GB201905360D0 (en) 2019-04-16 2019-05-29 Univ Nottingham Fungal strains, production and uses thereof
US12473543B2 (en) 2019-04-17 2025-11-18 The Broad Institute, Inc. Adenine base editors with reduced off-target effects
EP3959320A1 (en) 2019-04-24 2022-03-02 Novartis AG Compositions and methods for selective protein degradation
EP3963109A1 (en) 2019-04-30 2022-03-09 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for treating melanoma
AU2020265060A1 (en) 2019-04-30 2021-12-16 Edigene (Guangzhou) Inc. Method for predicting effectiveness of treatment of hemoglobinopathy
BR112021021912A2 (pt) * 2019-04-30 2022-01-18 Emendobio Inc Nova nuclease omni-50 crispr
US11692197B2 (en) 2019-05-06 2023-07-04 Inari Agriculture Technology, Inc. Delivery of biological molecules to plant cells
US20210047649A1 (en) 2019-05-08 2021-02-18 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Crispr/cas all-in-two vector systems for treatment of dmd
EP3966334A1 (en) 2019-05-10 2022-03-16 Basf Se Regulatory nucleic acid molecules for enhancing gene expression in plants
JP2022533713A (ja) 2019-05-21 2022-07-25 サンガモ セラピューティクス， インコーポレイテッド 調節性ｔ細胞における制御された導入遺伝子発現
AU2020280103A1 (en) 2019-05-23 2021-12-23 Vor Biopharma Inc. Compositions and methods for CD33 modification
WO2020239623A1 (en) 2019-05-24 2020-12-03 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Use of ngal inhibitors for the treating chronic wound
BR112021021149A2 (pt) 2019-05-29 2021-12-14 Monsanto Technology Llc Métodos e composições para a geração de alelos dominantes utilizando a edição de genomas
US12497597B2 (en) 2019-05-31 2025-12-16 Children's Hospital Medical Center Methods of generating and expanding hematopoietic stem cells
AU2020283048A1 (en) 2019-05-31 2021-12-23 Children's Hospital Medical Center Shaped organoid compositions and methods of making same
US11891618B2 (en) 2019-06-04 2024-02-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mouse comprising a humanized TTR locus with a beta-slip mutation and methods of use
WO2020245208A1 (en) 2019-06-04 2020-12-10 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Use of cd9 as a biomarker and as a biotarget in glomerulonephritis or glomerulosclerosis
EP3980012A1 (en) 2019-06-04 2022-04-13 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) A neuropilin antagonist in combination with a p38alpha-kinase inhibitor for the treatment of cancer
AU2020288623A1 (en) 2019-06-06 2022-01-06 Inscripta, Inc. Curing for recursive nucleic acid-guided cell editing
MX2021015122A (es) 2019-06-07 2022-04-06 Regeneron Pharma Animales no humanos que comprenden un locus de albumina humanizado.
EP3980533A1 (en) 2019-06-07 2022-04-13 Scribe Therapeutics Inc. Engineered casx systems
CN113906134B (zh) 2019-06-14 2025-06-24 瑞泽恩制药公司 Tau蛋白病模型
WO2020249769A1 (en) 2019-06-14 2020-12-17 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for treating ocular diseases related to mitochondrial dna maintenance
US10907125B2 (en) 2019-06-20 2021-02-02 Inscripta, Inc. Flow through electroporation modules and instrumentation
WO2020257395A1 (en) 2019-06-21 2020-12-24 Inscripta, Inc. Genome-wide rationally-designed mutations leading to enhanced lysine production in e. coli
IL267614A (en) 2019-06-24 2019-09-26 Lotem Michal Nucleic acids to modulate SLAMF6 isoforms
CN114630910A (zh) 2019-06-25 2022-06-14 伊纳瑞农业技术有限公司 改善的同源依赖修复基因组编辑
US10927385B2 (en) 2019-06-25 2021-02-23 Inscripta, Inc. Increased nucleic-acid guided cell editing in yeast
US11905532B2 (en) 2019-06-25 2024-02-20 Massachusetts Institute Of Technology Compositions and methods for molecular memory storage and retrieval
EP3990475A1 (en) 2019-06-27 2022-05-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Modeling tdp-43 proteinopathy
WO2021001427A1 (en) 2019-07-02 2021-01-07 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for the prophylactic treatment of cancer in patients suffering from pancreatitis
WO2021001431A1 (en) 2019-07-02 2021-01-07 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Use of pi3ka-selective inhibitors for treating metastatic disease in patients suffering from pancreatic cancer
GB201909597D0 (en) 2019-07-03 2019-08-14 Univ Wageningen Crispr type v-u1 system from mycobacterium mucogenicum and uses thereof
AU2020313004A1 (en) 2019-07-12 2022-03-10 Riken Therapeutic agent for disease caused by dominant mutant gene
US10653731B1 (en) 2019-07-15 2020-05-19 Vigene Biosciences Inc. Recombinantly-modified adeno-associated virus (rAAV) having improved packaging efficiency
WO2021009692A1 (en) 2019-07-15 2021-01-21 Medimmune Limited Tripartite systems for protein dimerization and methods of use
US10557149B1 (en) 2019-07-15 2020-02-11 Vigene Biosciences, Inc. Recombinantly-modified adeno-associated virus helper vectors and their use to improve the packaging efficiency of recombinantly-modified adeno-associated virus
US10801042B1 (en) 2019-07-15 2020-10-13 Vigene Biosciences, Inc. Use of ion concentrations to increase the packaging efficiency of recombinant adeno-associated virus
WO2021009299A1 (en) 2019-07-17 2021-01-21 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Bcl-xl:fkbp12 fusion proteins suitable for screening agents capable of slowing down the aging process
EP3999103A4 (en) 2019-07-19 2023-11-22 Inari Agriculture Technology, Inc. GENOMIC EDITING FOR ENHANCED HOMOLOGY-DIRECTED REPAIR
EP4003325A1 (en) 2019-07-24 2022-06-01 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Inhibitors of the sting pathway for the treatment of hidradenitis suppurativa
US20220275105A1 (en) 2019-08-02 2022-09-01 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Neutralizing granzyme b for providing cardioprotection in a subject who experienced a myocardial infarction
US12179199B2 (en) 2019-08-09 2024-12-31 The Regents Of The University Of California Microfluidic single-cell pairing array for studying cell-cell interactions in isolated compartments
WO2021028359A1 (en) 2019-08-09 2021-02-18 Sangamo Therapeutics France Controlled expression of chimeric antigen receptors in t cells
WO2021030344A1 (en) * 2019-08-12 2021-02-18 Lifeedit, Inc. Rna-guided nucleases and active fragments and variants thereof and methods of use
US12612657B2 (en) 2019-08-16 2026-04-28 The Jackson Laboratory Extrachromosomal DNA labeling
JP7737978B2 (ja) 2019-08-20 2025-09-11 フレッド ハッチンソン キャンサー センター Ｗｔ－１に特異的なｔ細胞免疫療法
RS65421B1 (sr) 2019-08-21 2024-05-31 Res Inst Nationwide Childrens Hospital Isporuka adeno-asociranog virusnog vektora alfa-sarkoglikana i lečenje mišićne distrofije
US20220288176A1 (en) * 2019-08-28 2022-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Circular rna modification and methods of use
AU2020338011A1 (en) 2019-08-28 2022-03-10 Vor Biopharma Inc. Compositions and methods for CLL1 modification
WO2021041977A1 (en) 2019-08-28 2021-03-04 Vor Biopharma, Inc. Compositions and methods for cd123 modification
WO2021042060A1 (en) 2019-08-30 2021-03-04 Yale University Compositions and methods for delivery of nucleic acids to cells
WO2021046155A1 (en) 2019-09-03 2021-03-11 Voyager Therapeutics, Inc. Vectorized editing of nucleic acids to correct overt mutations
JP2022547105A (ja) 2019-09-04 2022-11-10 博雅▲輯▼因（北京）生物科技有限公司 オフターゲット評価に基づく遺伝子編集治療の評価方法
PH12022550542A1 (en) 2019-09-05 2023-03-20 Crispr Therapeutics Ag Universal donor cells
CA3150235A1 (en) 2019-09-05 2021-03-11 Alireza Rezania Universal donor cells
EP4025712A1 (en) 2019-09-05 2022-07-13 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) Method of treatment and pronostic of acute myeloid leukemia
MX2022002642A (es) 2019-09-05 2022-06-14 Benson Hill Inc Composiciones y metodos para modificar genomas.
MX2022002919A (es) * 2019-09-10 2022-09-09 Science Solutions Llc Nuevas endonucleasas guiadas por rna crispr-cas tipo ii y tipo v de clase 2.
WO2021047775A1 (en) 2019-09-12 2021-03-18 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Use of inhibitors of tgfb/activinb signaling pathway for the treatment of patients suffering from medulloblastoma group 3
CN114729382A (zh) 2019-09-12 2022-07-08 巴斯夫欧洲公司 增强植物中基因表达的调节性核酸分子
EP4028063A1 (en) 2019-09-13 2022-07-20 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Transcription modulation in animals using crispr/cas systems delivered by lipid nanoparticles
EP4048807A1 (en) 2019-09-23 2022-08-31 Omega Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating apolipoprotein b (apob) gene expression
CN114729376A (zh) 2019-09-23 2022-07-08 欧米茄治疗公司 用于调节肝细胞核因子4α(HNF4α)基因表达的组合物和方法
SG10202008262UA (en) 2019-09-26 2021-04-29 Seminis Vegetable Seeds Inc Lettuce plants having resistance to nasonovia ribisnigri biotype nr:1
EP4034138A4 (en) 2019-09-27 2024-07-31 Beam Therapeutics, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS FOR THE TREATMENT OF LIQUID CANCERS
US20210095273A1 (en) * 2019-09-30 2021-04-01 Sigma-Aldrich Co. Llc Modulation of microbiota compositions using targeted nucleases
WO2021063968A1 (en) 2019-09-30 2021-04-08 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Method and composition for diagnosing chronic obstructive pulmonary disease
WO2021064180A1 (en) 2019-10-03 2021-04-08 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for modulating macrophages polarization
JP7689949B2 (ja) 2019-10-03 2025-06-09 アーティサン ディベロップメント ラブズ インコーポレイテッド 操作されたデュアルガイド核酸を有するｃｒｉｓｐｒシステム
WO2021069387A1 (en) 2019-10-07 2021-04-15 Basf Se Regulatory nucleic acid molecules for enhancing gene expression in plants
US12435330B2 (en) 2019-10-10 2025-10-07 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for prime editing RNA
JP7640461B2 (ja) 2019-10-11 2025-03-05 住友化学株式会社 核酸オリゴマーの製造方法
JP7680440B2 (ja) * 2019-10-15 2025-05-20 エージェンシー フォー サイエンス， テクノロジー アンド リサーチ 核酸修飾酵素活性を測定するためのアッセイ法
EP3808766A1 (en) 2019-10-15 2021-04-21 Sangamo Therapeutics France Chimeric antigen receptor specific for interleukin-23 receptor
WO2021078359A1 (en) 2019-10-21 2021-04-29 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Use of inhibitors of cubilin for the treatment of chronic kidney diseases
WO2021081264A1 (en) 2019-10-24 2021-04-29 Pairwise Plants Services, Inc. Optimized crispr-cas nucleases and base editors and methods of use thereof
EP4051286A1 (en) 2019-10-29 2022-09-07 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) Methods and compositions for treating uveal melanoma
US12521451B2 (en) 2019-11-08 2026-01-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. CRISPR and AAV strategies for x-linked juvenile retinoschisis therapy
CN114929862A (zh) * 2019-11-13 2022-08-19 克里斯珀医疗股份公司 用于制备表达嵌合抗原受体的t细胞的生产方法
KR20220097985A (ko) * 2019-11-13 2022-07-08 크리스퍼 테라퓨틱스 아게 Car-t 세포의 제조 방법
US12612649B2 (en) 2019-11-19 2026-04-28 Danisco Us Inc. Selection marker free methods for modifying the genome of bacillus and compositions thereof
US11203762B2 (en) 2019-11-19 2021-12-21 Inscripta, Inc. Methods for increasing observed editing in bacteria
WO2021102139A1 (en) 2019-11-20 2021-05-27 Corbion Biotech, Inc. Sucrose invertase variants
CN110938659B (zh) * 2019-11-22 2022-05-10 广东省微生物研究所（广东省微生物分析检测中心） 一种提高纤维堆囊菌埃博霉素产量的dCas9载体及其构建方法
WO2021099600A1 (en) 2019-11-22 2021-05-27 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Inhibitors of adrenomedullin for the treatment of acute myeloid leukemia by eradicating leukemic stem cells
WO2021108363A1 (en) 2019-11-25 2021-06-03 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Crispr/cas-mediated upregulation of humanized ttr allele
EP4065157A1 (en) 2019-11-26 2022-10-05 Novartis AG Cd19 and cd22 chimeric antigen receptors and uses thereof
KR20220121816A (ko) 2019-11-27 2022-09-01 프로메가 코포레이션 다분할 루시퍼라제 펩타이드 및 폴리펩타이드
EP4065701A4 (en) 2019-11-27 2023-11-29 Danmarks Tekniske Universitet CONSTRUCTS, COMPOSITIONS AND METHODS THEREOF WITH IMPROVED GENOMEDITING EFFICIENCY AND SPECIFICITY
WO2021105368A1 (en) 2019-11-27 2021-06-03 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Use of neuropilin antagonists for the treatment of endometriosis
CN114945273B (zh) 2019-11-29 2025-08-12 巴斯夫欧洲公司 增加植物对抗真菌感染的抗性
US20230055682A1 (en) 2019-12-03 2023-02-23 Beam Therapeutics lnc. Synthetic guide rna, compositions, methods, and uses thereof
CA3159805A1 (en) 2019-12-03 2021-06-10 Frank Meulewaeter Regulatory nucleic acid molecules for enhancing gene expression in plants
CA3157131A1 (en) 2019-12-10 2021-06-17 Inscripta, Inc. Novel mad nucleases
US10704033B1 (en) 2019-12-13 2020-07-07 Inscripta, Inc. Nucleic acid-guided nucleases
GB201918586D0 (en) 2019-12-17 2020-01-29 Patterson James Engineered platelets for targeted delivery of a therapeutic agent
AU2020407048A1 (en) 2019-12-18 2022-06-09 Inscripta, Inc. Cascade/dCas3 complementation assays for in vivo detection of nucleic acid-guided nuclease edited cells
EP4058032A4 (en) 2019-12-19 2024-01-10 Entrada Therapeutics, Inc. Compositions for delivery of antisense compounds
EP4077699A1 (en) 2019-12-19 2022-10-26 Basf Se Increasing space-time-yield, carbon-conversion-efficiency and carbon substrate flexibility in the production of fine chemicals
US20230041211A1 (en) 2019-12-20 2023-02-09 Basf Se Decreasing toxicity of terpenes and increasing the production potential in micro-organisms
IL271656A (en) 2019-12-22 2021-06-30 Yeda Res & Dev System and methods for identifying cells that have undergone genome editing
EP3842452A1 (en) 2019-12-26 2021-06-30 Universitat Autònoma de Barcelona Scaffold proteins and therapeutic nanoconjugates based on nidogen
EP4086341A1 (en) 2019-12-30 2022-11-09 Edigene Biotechnology Inc. Method for purifying ucart cell and use thereof
CN114901813A (zh) 2019-12-30 2022-08-12 博雅缉因（北京）生物科技有限公司 一种靶向t细胞淋巴瘤细胞的通用型car-t及其制备方法和应用
US11859172B2 (en) 2020-01-02 2024-01-02 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Programmable and portable CRISPR-Cas transcriptional activation in bacteria
CN110982820A (zh) * 2020-01-03 2020-04-10 云南中烟工业有限责任公司 一种烟草单倍体的基因编辑方法
US10689669B1 (en) 2020-01-11 2020-06-23 Inscripta, Inc. Automated multi-module cell processing methods, instruments, and systems
US20230076415A1 (en) 2020-01-17 2023-03-09 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for treating melanoma
EP4093187A1 (en) 2020-01-21 2022-11-30 Limagrain Europe Wheat haploid inducer plant and uses
WO2021151085A2 (en) 2020-01-24 2021-07-29 The General Hospital Corporation Crispr-cas enzymes with enhanced on-target activity
WO2021151073A2 (en) * 2020-01-24 2021-07-29 The General Hospital Corporation Unconstrained genome targeting with near-pamless engineered crispr-cas9 variants
US11225674B2 (en) 2020-01-27 2022-01-18 Inscripta, Inc. Electroporation modules and instrumentation
WO2021154791A1 (en) 2020-01-28 2021-08-05 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a humanized pnpla3 locus and methods of use
AU2021213811A1 (en) 2020-01-29 2022-07-28 Foghorn Therapeutics Inc. Compounds and uses thereof
EP4097251A1 (en) 2020-01-29 2022-12-07 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for analyte detection
JP7667788B2 (ja) 2020-01-29 2025-04-23 住友化学株式会社 核酸オリゴマーの製造方法
WO2021152402A1 (en) * 2020-01-29 2021-08-05 Jenthera Therapeutics Inc. Nuclease-scaffold composition delivery platform
EP4098655A4 (en) 2020-01-29 2024-02-28 Sumitomo Chemical Company, Limited METHOD FOR PRODUCING NUCLEIC ACID OLIGOMERS
EP4099821A1 (en) 2020-02-07 2022-12-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. <smallcaps/>? ? ?klkb1? ? ? ? ?non-human animals comprising a humanizedlocus and methods of use
WO2021165508A1 (en) 2020-02-21 2021-08-26 Biogemma Prime editing technology for plant genome engineering
CA3168986A1 (en) 2020-02-26 2021-09-02 Sorrento Therapeutics, Inc. Activatable antigen binding proteins with universal masking moieties
KR20230004456A (ko) 2020-03-04 2023-01-06 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. 면역 요법에 대한 종양 세포의 감작화를 위한 방법 및 조성물
EP4114952A4 (en) * 2020-03-05 2024-05-08 Board of Regents of the University of Nebraska Crispr/cas9 system for multistrain hiv-1 treatment
CA3173528A1 (en) 2020-03-11 2021-09-16 Omega Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating forkhead box p3 (foxp3) gene expression
US20230058352A1 (en) * 2020-03-11 2023-02-23 Sigma-Aldrich Co. Llc High Fidelity SpCas9 Nucleases for Genome Modification
KR20210116324A (ko) 2020-03-12 2021-09-27 기초과학연구원 게놈 서열 변이를 가지는 세포 사멸 유도용 조성물 및 상기 조성물을 이용한 세포 사멸 유도 방법
JP2023518395A (ja) 2020-03-19 2023-05-01 インテリア セラピューティクス，インコーポレイテッド 指向性ゲノム編集のための方法及び組成物
WO2021186056A1 (en) 2020-03-20 2021-09-23 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Chimeric antigen receptor specific for human cd45rc and uses thereof
US20230102342A1 (en) 2020-03-23 2023-03-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a humanized ttr locus comprising a v30m mutation and methods of use
EP4129050A4 (en) 2020-03-26 2024-05-08 National Agriculture And Food Research Organization METHOD FOR PRODUCING A TEMPERATURE SENSITIVE MALE STERILE PLANT
EP4130018A4 (en) 2020-03-27 2024-04-17 Sumitomo Chemical Company, Limited METHOD FOR PRODUCING A NUCLEIC ACID OLIGOMER
US12057197B2 (en) 2020-04-03 2024-08-06 Creyon Bio, Inc. Oligonucleotide-based machine learning
EP4133069A2 (en) 2020-04-08 2023-02-15 Astrazeneca AB Compositions and methods for improved site-specific modification
EP4132954A1 (en) 2020-04-08 2023-02-15 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) Use of cdon inhibitors for the treatment of endothelial dysfunction
EP4139345A1 (en) 2020-04-24 2023-03-01 Sorrento Therapeutics, Inc. Memory dimeric antigen receptors
US20210332388A1 (en) 2020-04-24 2021-10-28 Inscripta, Inc. Compositions, methods, modules and instruments for automated nucleic acid-guided nuclease editing in mammalian cells
TW202208626A (zh) * 2020-04-24 2022-03-01 美商生命編輯公司 Rna引導核酸酶及其活性片段與變體，以及使用方法
JP2023522784A (ja) 2020-04-27 2023-05-31 ノバルティス アーゲー 眼細胞療法のための方法及び組成物
WO2021222328A1 (en) * 2020-04-27 2021-11-04 Duke University Targeted genomic integration to restore neurofibromin coding sequence in neurofibromatosis type 1 (nf1)
EP4146798A4 (en) 2020-05-04 2025-02-12 Saliogen Therapeutics, Inc. TRANSPOSITION-BASED THERAPIES
JP2023524976A (ja) * 2020-05-04 2023-06-14 エディタス・メディシン、インコーポレイテッド 必須遺伝子ノックインによる選択
CA3179710A1 (en) 2020-05-05 2021-11-11 Andrew Mark CIGAN Methods for improving the health of porcine species by targeted inactivation of cd163
EP4146797A1 (en) 2020-05-06 2023-03-15 Orchard Therapeutics (Europe) Limited Treatment for neurodegenerative diseases
WO2021224401A1 (en) 2020-05-07 2021-11-11 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for determining a reference range of β-galactose exposure platelet
IL297761A (en) 2020-05-08 2022-12-01 Broad Inst Inc Methods and compositions for simultaneously editing two helices of a designated double-helix nucleotide sequence
US20230279438A1 (en) 2020-05-13 2023-09-07 Inserm (Institut National De La Santé Et La Recherche Médicale) Base editing approaches for the treatment of betahemoglobinopathies
WO2021230385A1 (en) 2020-05-15 2021-11-18 Astellas Pharma Inc. Method for treating muscular dystrophy by targeting utrophin gene
US11787841B2 (en) 2020-05-19 2023-10-17 Inscripta, Inc. Rationally-designed mutations to the thrA gene for enhanced lysine production in E. coli
US12383555B2 (en) 2020-05-20 2025-08-12 Foghorn Therapeutics Inc. Methods of treating cancers
US11263022B2 (en) * 2020-05-21 2022-03-01 Microsoft Technology Licensing, Llc Mechanism to turn on/off post-processing features in the device media foundation transform
WO2021245224A1 (en) 2020-06-05 2021-12-09 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and pharmaceutical compositions for treating ocular diseases
JP2023530234A (ja) 2020-06-05 2023-07-14 ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッド 新生物を治療するための組成物および方法
JP2023529211A (ja) 2020-06-11 2023-07-07 ノバルティス アーゲー Ｚｂｔｂ３２阻害剤及びその使用
CN111748539B (zh) * 2020-06-11 2021-10-22 中国农业科学院农产品加工研究所 CRISPR/LpCas9基因编辑系统及其应用
WO2021255204A1 (en) 2020-06-18 2021-12-23 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) New strategy for treating pancreatic cancer
EP4168593A4 (en) 2020-06-23 2024-11-27 The Regents of the University of Colorado, a body corporate METHODS FOR DIAGNOSIS OF RESPIRATORY PATHOGENS AND PREDICTION OF EVOLUTIONS ASSOCIATED WITH COVID-19
WO2021263146A2 (en) 2020-06-26 2021-12-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a humanized ace2 locus
EP4175664A2 (en) 2020-07-06 2023-05-10 Janssen Biotech, Inc. Prostate neoantigens and their uses
KR20230037043A (ko) * 2020-07-08 2023-03-15 더 잭슨 래보라토리 인간 선천적 면역 기능을 지원하는 트랜스제닉 마우스 모델
WO2022008597A1 (en) 2020-07-08 2022-01-13 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and pharmaceutical composition for the treatment of infectious diseases
CA3182390A1 (en) 2020-07-09 2022-01-13 Iain Robert THOMPSON Method for treating alzheimer's disease by targeting mapt gene
WO2022008935A1 (en) 2020-07-10 2022-01-13 Horizon Discovery Limited Method for producing genetically modified cells
AU2021204717A1 (en) 2020-07-15 2022-02-03 Seminis Vegetable Seeds, Inc. Green Bean Plants with Improved Disease Resistance
US20240247242A1 (en) 2020-07-15 2024-07-25 LifeEDIT Therapeutics, Inc. Uracil stabilizing proteins and active fragments and variants thereof and methods of use
EP4189071A1 (en) 2020-08-03 2023-06-07 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) Population of treg cells functionally committed to exert a regulatory activity and their use for adoptive therapy
US20230295615A1 (en) 2020-08-07 2023-09-21 The Jackson Laboratory Targeted Sequence Insertion Compositions and Methods
AU2021325947A1 (en) 2020-08-13 2023-03-02 Yale University Compositions and methods for engineering and selection of CAR T cells with desired phenotypes
US20220049303A1 (en) 2020-08-17 2022-02-17 Readcoor, Llc Methods and systems for spatial mapping of genetic variants
BR112023002885A2 (pt) 2020-08-18 2023-03-21 Pioneer Hi Bred Int Genes de resistência a múltiplas doenças e seus empilhamentos genômicos
CA3188867A1 (en) 2020-08-20 2022-02-24 Xueyin Wang Compositions and methods for treating ceacam positive cancers
WO2022040444A1 (en) 2020-08-20 2022-02-24 A2 Biotherapeutics, Inc. Compositions and methods for treating egfr positive cancers
IL300500A (en) 2020-08-20 2023-04-01 A2 Biotherapeutics Inc Preparations and methods for the treatment of mesothelin positive cancer
CN116438302A (zh) * 2020-08-24 2023-07-14 宏基因组学公司 用于对货物核苷酸序列转位的系统和方法
US20240238344A1 (en) 2020-08-28 2024-07-18 Vor Biopharma Inc. Compositions and methods for cd123 modification
WO2022047168A1 (en) 2020-08-28 2022-03-03 Vor Biopharma Inc. Compositions and methods for cll1 modification
CN116529266A (zh) 2020-08-31 2023-08-01 耶鲁大学 用于将核酸递送到细胞的组合物和方法
CN116134141A (zh) 2020-09-04 2023-05-16 国立大学法人神户大学 包含小型化胞苷脱氨酶的双链dna修饰用复合体
MX2023002848A (es) 2020-09-11 2023-03-22 Lifeedit Therapeutics Inc Enzimas modificadoras del acido desoxirribonucleico (adn) y fragmentos activos y sus variantes y metodos de uso.
JP2023541457A (ja) 2020-09-14 2023-10-02 ブイオーアール バイオファーマ インコーポレーテッド Ｃｄ３８修飾のための化合物および方法
WO2022056459A1 (en) 2020-09-14 2022-03-17 Vor Biopharma, Inc. Compositions and methods for cd5 modification
US11299731B1 (en) 2020-09-15 2022-04-12 Inscripta, Inc. CRISPR editing to embed nucleic acid landing pads into genomes of live cells
CA3193089A1 (en) 2020-09-18 2022-03-24 Jamie KERSHNER Constructs and uses thereof for efficient and specific genome editing
WO2022061115A1 (en) 2020-09-18 2022-03-24 Vor Biopharma Inc. Compositions and methods for cd7 modification
WO2022066973A1 (en) 2020-09-24 2022-03-31 Fred Hutchinson Cancer Research Center Immunotherapy targeting pbk or oip5 antigens
KR20230074205A (ko) 2020-09-24 2023-05-26 스미또모 가가꾸 가부시끼가이샤 핵산 올리고머의 제조 방법
CN116724053A (zh) 2020-09-24 2023-09-08 弗雷德哈钦森癌症中心 靶向sox2抗原的免疫治疗
AU2021350024A1 (en) * 2020-09-24 2023-05-04 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Compositions and methods for inhibiting gene expression
CA3196831A1 (en) 2020-09-25 2022-03-31 Beam Therapeutics Inc. Fratricide resistant modified immune cells and methods of using the same
US20230364233A1 (en) 2020-09-28 2023-11-16 Vor Biopharma Inc. Compositions and methods for cd6 modification
US10947552B1 (en) 2020-09-30 2021-03-16 Alpine Roads, Inc. Recombinant fusion proteins for producing milk proteins in plants
AU2021353004A1 (en) 2020-09-30 2023-04-13 Nobell Foods, Inc. Recombinant milk proteins and food compositions comprising the same
WO2022072643A1 (en) 2020-09-30 2022-04-07 Vor Biopharma Inc. Compositions and methods for cd30 gene modification
US10894812B1 (en) 2020-09-30 2021-01-19 Alpine Roads, Inc. Recombinant milk proteins
EP4222264A1 (en) 2020-09-30 2023-08-09 CRISPR Therapeutics AG Materials and methods for treatment of amyotrophic lateral sclerosis
WO2022069756A1 (en) 2020-10-02 2022-04-07 Limagrain Europe Crispr-mediated directed codon re-write
WO2022073915A1 (en) 2020-10-05 2022-04-14 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Gdf3 as biomarker and biotarget in post-ischemic cardiac remodeling
WO2022076353A1 (en) 2020-10-06 2022-04-14 Fred Hutchinson Cancer Research Center Compositions and methods for treating mage-a1-expressing disease
WO2022074058A1 (en) 2020-10-06 2022-04-14 Keygene N.V. Targeted sequence addition
US20240016855A1 (en) 2020-10-13 2024-01-18 Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) Targeted-antibacterial-plasmids combining conjugation and crispr/cas systems and uses thereof
EP4232583A1 (en) 2020-10-21 2023-08-30 Massachusetts Institute of Technology Systems, methods, and compositions for site-specific genetic engineering using programmable addition via site-specific targeting elements (paste)
WO2022084531A1 (en) 2020-10-23 2022-04-28 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for treating glioma
WO2022093983A1 (en) 2020-10-27 2022-05-05 Vor Biopharma, Inc. Compositions and methods for treating hematopoietic malignancy
WO2022094245A1 (en) 2020-10-30 2022-05-05 Vor Biopharma, Inc. Compositions and methods for bcma modification
CN116670271A (zh) * 2020-11-04 2023-08-29 埃门多生物公司 新型omni-50 crispr核酸酶-rna复合物
CN112553195B (zh) * 2020-11-05 2022-04-05 南方医科大学 一种用于CRISPR-Cas9定点突变编辑DNMT1基因的试剂及其应用
WO2022097663A1 (ja) 2020-11-06 2022-05-12 エディットフォース株式会社 ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインの変異体
US11512297B2 (en) 2020-11-09 2022-11-29 Inscripta, Inc. Affinity tag for recombination protein recruitment
KR102875461B1 (ko) 2020-11-09 2025-10-24 삼성전자주식회사 전자 장치 및 그의 연락처를 관리하는 방법
EP4243858A1 (en) 2020-11-13 2023-09-20 Vor Biopharma Inc. Methods and compositions relating to genetically engineered cells expressing chimeric antigen receptors
CA3198447A1 (en) 2020-11-13 2022-05-19 Novartis Ag Combination therapies with chimeric antigen receptor (car)-expressing cells
US20230416830A1 (en) 2020-11-16 2023-12-28 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for predicting and treating uveal melanoma
WO2022115506A2 (en) 2020-11-24 2022-06-02 University Of Houston System Salicylic acid-inducible gene expression compositions and systems for cells
WO2022112316A1 (en) 2020-11-24 2022-06-02 Keygene N.V. Targeted enrichment using nanopore selective sequencing
US11459372B2 (en) 2020-11-30 2022-10-04 Crispr Therapeutics Ag Gene-edited natural killer cells
WO2022120022A1 (en) 2020-12-02 2022-06-09 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Crispr sam biosensor cell lines and methods of use thereof
KR20230128289A (ko) 2020-12-03 2023-09-04 스크라이브 테라퓨틱스 인크. 조작된 클래스 2 유형 v crispr 시스템
WO2022132836A2 (en) 2020-12-14 2022-06-23 Fred Hutchinson Cancer Research Center Compositions and methods for cellular immunotherapy
TW202235622A (zh) 2020-12-23 2022-09-16 美商旗艦先鋒創新公司 包裹rna之指環病毒(anellovirus)蛋白殼之活體外組裝
WO2022144632A1 (en) 2020-12-30 2022-07-07 Crispr Therapeutics Ag Compositions and methods for differentiating stem cells into nk cells
CN116848235A (zh) 2020-12-30 2023-10-03 因特利亚治疗公司 工程化t细胞
WO2022144855A1 (en) 2020-12-31 2022-07-07 Crispr Therapeutics Ag Universal donor cells
JP2024502820A (ja) 2020-12-31 2024-01-23 ブイオーアール バイオファーマ インコーポレーテッド Ｃｄ３４遺伝子改変のための組成物及び方法
AU2021415461A1 (en) * 2021-01-04 2023-08-17 Inscripta, Inc. Mad nucleases
CA3207144A1 (en) 2021-01-05 2022-07-14 Horizon Discovery Limited Method for producing genetically modified cells
EP4274890A4 (en) 2021-01-07 2024-11-27 Inscripta, Inc. MAD-NUCLEASES
JP2024502630A (ja) 2021-01-12 2024-01-22 マーチ セラピューティクス， インコーポレイテッド コンテキスト依存性二本鎖ｄｎａ特異的デアミナーゼ及びその使用
WO2022158898A1 (ko) * 2021-01-21 2022-07-28 한국생명공학연구원 Francisella novicida cas9 모듈 기반의 역전사 효소를 사용한 유전체 치환 및 삽입 기술
WO2022164796A1 (en) 2021-01-26 2022-08-04 California Institute Of Technology Allosteric conditional guide rnas for cell-selective regulation of crispr/cas
US12171813B2 (en) 2021-02-05 2024-12-24 Christiana Care Gene Editing Institute, Inc. Methods of and compositions for reducing gene expression and/or activity
US20240425885A1 (en) * 2021-02-08 2024-12-26 Emendobio Inc. OMNI 90-99, 101, 104-110, 114, 116, 118-123, 125, 126, 128, 129, and 131-138 CRISPR NUCLEASE
JP2024506608A (ja) 2021-02-08 2024-02-14 エメンドバイオ・インコーポレイテッド Ｏｍｎｉ－１０３ ｃｒｉｓｐｒヌクレアーゼ
WO2022177979A1 (en) 2021-02-16 2022-08-25 A2 Biotherapeutics, Inc. Compositions and methods for treating her2 positive cancers
US11884924B2 (en) 2021-02-16 2024-01-30 Inscripta, Inc. Dual strand nucleic acid-guided nickase editing
AU2022227650A1 (en) 2021-02-25 2023-10-12 Celyntra Therapeutics Sa Compositions and methods for targeting, editing, or modifying genes
WO2022180153A1 (en) 2021-02-25 2022-09-01 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Allele-specific genome editing of the nr2e3 mutation g56r
WO2022187125A1 (en) * 2021-03-01 2022-09-09 The Regents Of The University Of California Methods for generating a crispr array
GB202103131D0 (en) 2021-03-05 2021-04-21 Biosystems Tech Limited Method for preparation of research organisms
US12606553B2 (en) 2021-03-09 2026-04-21 Foghorn Therapeutics Inc. Crystalline forms, compositions containing same, and methods of their use
US20240165094A1 (en) 2021-03-17 2024-05-23 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Methods and compositions for treating melanoma
US20240301385A1 (en) 2021-03-22 2024-09-12 LifeEDIT Therapeutics, Inc. Dna modifying enzymes and active fragments and variants thereof and methods of use
WO2022214522A2 (en) 2021-04-07 2022-10-13 Astrazeneca Ab Compositions and methods for site-specific modification
WO2022214632A1 (en) 2021-04-07 2022-10-13 Neoplants Sas Compositions and methods for indoor air remediation
US20240200059A1 (en) 2021-04-09 2024-06-20 Vor Biopharma Inc. Photocleavable guide rnas and methods of use thereof
EP4320153A1 (en) 2021-04-09 2024-02-14 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for the treatment of anaplastic large cell lymphoma
WO2022219175A1 (en) 2021-04-15 2022-10-20 Keygene N.V. Mobile endonucleases for heritable mutations
AU2022256793A1 (en) 2021-04-15 2023-09-28 Keygene N.V. Co-regeneration recalcitrant plants
KR20240007651A (ko) 2021-04-16 2024-01-16 빔 테라퓨틱스, 인크. 간세포의 유전적 변형
JP2024516168A (ja) 2021-04-22 2024-04-12 デイナ ファーバー キャンサー インスティチュート，インコーポレイテッド がんを治療するための組成物および方法
EP4326903A1 (en) 2021-04-23 2024-02-28 Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) Methods and compositions for treating cell senescence accumulation related disease
CA3218511A1 (en) 2021-05-10 2022-11-17 Sqz Biotechnologies Company Methods for delivering genome editing molecules to the nucleus or cytosol of a cell and uses thereof
US20240384246A1 (en) 2021-05-27 2024-11-21 Astrazeneca Ab Ca s9 effector proteins with enhanced stability
WO2022251644A1 (en) 2021-05-28 2022-12-01 Lyell Immunopharma, Inc. Nr4a3-deficient immune cells and uses thereof
EP4419672A2 (en) 2021-06-01 2024-08-28 Artisan Development Labs, Inc. Compositions and methods for targeting, editing, or modifying genes
TW202307210A (zh) 2021-06-01 2023-02-16 瑞士商諾華公司 Ｃｄ１９和ｃｄ２２嵌合抗原受體及其用途
EP4347818A2 (en) 2021-06-01 2024-04-10 Arbor Biotechnologies, Inc. Gene editing systems comprising a crispr nuclease and uses thereof
EP4347826A1 (en) 2021-06-02 2024-04-10 Lyell Immunopharma, Inc. Nr4a3-deficient immune cells and uses thereof
AU2022285744A1 (en) 2021-06-02 2023-12-14 Beam Therapeutics Inc. Circular guide rnas for crispr/cas editing systems
US20240279687A1 (en) 2021-06-07 2024-08-22 Yale University Peptide nucleic acids for spatiotemporal control of crispr-cas binding
EP4352215A1 (en) 2021-06-11 2024-04-17 LifeEDIT Therapeutics, Inc. Rna polymerase iii promoters and methods of use
GB202108585D0 (en) 2021-06-16 2021-07-28 Rockend Ltd Methods and compositions
EP4370676A2 (en) 2021-06-18 2024-05-22 Artisan Development Labs, Inc. Compositions and methods for targeting, editing or modifying human genes
WO2022272293A1 (en) * 2021-06-23 2022-12-29 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Compositions and methods for efficient retron production and genetic editing
WO2022269393A1 (en) 2021-06-23 2022-12-29 Crispr Therapeutics Ag Engineered cells with improved protection from natural killer cell killing
WO2023283585A2 (en) 2021-07-06 2023-01-12 Vor Biopharma Inc. Inhibitor oligonucleotides and methods of use thereof
EP4367242A2 (en) 2021-07-07 2024-05-15 Omega Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating secreted frizzled receptor protein 1 (sfrp1) gene expression
WO2023283495A1 (en) * 2021-07-09 2023-01-12 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Crispr-based protein barcoding and surface assembly
TW202317602A (zh) 2021-07-15 2023-05-01 福瑞德哈金森腫瘤中心 嵌合多肽
KR20240037299A (ko) 2021-07-23 2024-03-21 빔 테라퓨틱스, 인크. Crispr/cas 편집 시스템용 가이드 rna
CA3227103A1 (en) 2021-07-30 2023-02-02 Matthew P. GEMBERLING Compositions and methods for modulating expression of frataxin (fxn)
US20240252684A1 (en) 2021-07-30 2024-08-01 Tune Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating expression of methyl-cpg binding protein 2 (mecp2)
AU2022324093A1 (en) 2021-08-02 2024-02-08 Vor Biopharma Inc. Compositions and methods for gene modification
KR102574819B1 (ko) 2021-08-09 2023-09-04 경상국립대학교산학협력단 P34와 이의 상동체 동시 타겟 유전자교정 시스템 및 이의 용도
KR102584891B1 (ko) 2021-08-09 2023-10-04 경상국립대학교산학협력단 GmIPK1 유전자교정 시스템 및 이의 용도
KR102573952B1 (ko) 2021-08-09 2023-09-01 경상국립대학교산학협력단 E2와 이의 상동체 동시 타겟 유전자교정 시스템 및 이의 용도
KR102573947B1 (ko) 2021-08-09 2023-09-01 경상국립대학교산학협력단 콩 유전자교정 효율 증대를 위한 유전자교정 시스템 및 이의 용도
KR102573948B1 (ko) 2021-08-09 2023-09-01 경상국립대학교산학협력단 Mips1과 이의 상동체 동시 타겟 유전자교정 시스템 및 이의 용도
EP4144841A1 (en) * 2021-09-07 2023-03-08 Bayer AG Novel small rna programmable endonuclease systems with impoved pam specificity and uses thereof
AU2022344256A1 (en) 2021-09-08 2024-02-29 Arbor Biotechnologies, Inc. Compositions comprising a crispr nuclease and uses thereof
JP2024534945A (ja) 2021-09-10 2024-09-26 アジレント・テクノロジーズ・インク 化学修飾を有するプライム編集のためのガイドｒｎａ
GB2625500B (en) * 2021-09-21 2026-04-01 Scribe Therapeutics Inc Engineered CasX repressor systems
AR127144A1 (es) 2021-09-27 2023-12-20 Monsanto Technology Llc Composiciones y métodos para la transformación de explantes de embriones extirpados de semillas de monocotiledóneas
US20240417755A1 (en) 2021-09-27 2024-12-19 Vor Biopharma Inc. Fusion polypeptides for genetic editing and methods of use thereof
EP4409000A1 (en) 2021-09-28 2024-08-07 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Base editing approaches for the treatment of beta-hemoglobinopathies
CN117980285A (zh) 2021-09-28 2024-05-03 住友化学株式会社 纯化二氯乙酸的制造方法
EP4596696A3 (en) 2021-09-28 2025-08-27 Acrigen Biosciences Compositions and methods for nucleic acid modifications
JP2024537775A (ja) 2021-09-30 2024-10-16 アコーオス インコーポレイテッド Ｋｃｎｑ４関連難聴を治療するための組成物及び方法
WO2023052508A2 (en) 2021-09-30 2023-04-06 Astrazeneca Ab Use of inhibitors to increase efficiency of crispr/cas insertions
WO2023059115A1 (ko) 2021-10-06 2023-04-13 주식회사 진코어 유전자 편집을 위한 target 시스템 및 이의 용도
WO2023064813A2 (en) * 2021-10-13 2023-04-20 University Of Massachusetts Modified guide rnas for neisseria meningitidis cas9
IL311962A (en) 2021-10-14 2024-06-01 Lonza Sales Ag Modified producer cells for extracellular vesicle production
JP2024537991A (ja) 2021-10-14 2024-10-18 アーセナル バイオサイエンシズ インコーポレイテッド 共発現されるｓｈＲＮＡと論理ゲートシステムとを有する免疫細胞
EP4219726A1 (en) 2021-10-15 2023-08-02 Research Institute at Nationwide Children's Hospital Self-complementary adeno-associated virus vector and its use in treatment of muscular dystrophy
US20250241999A1 (en) 2021-10-15 2025-07-31 Georgia State University Research Foundation, Inc. Delivery of therapeutic recombinant uricase using nanoparticles
CA3234809A1 (en) 2021-10-20 2023-04-27 Steven Goldman Isolated glial progenitor cells for use in the competition treatment of age-related white matter loss
WO2023070043A1 (en) 2021-10-20 2023-04-27 Yale University Compositions and methods for targeted editing and evolution of repetitive genetic elements
US20240407344A1 (en) 2021-10-22 2024-12-12 Tokyo Metropolitan Institute Of Medical Science Neurodegenerative and amyotrophic model animal
WO2023076944A1 (en) 2021-10-26 2023-05-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Overexpression of lemd2, lemd3, or chmp7 as a therapeutic modality for tauopathy
US20230149563A1 (en) 2021-10-27 2023-05-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for expressing factor ix for hemophilia b therapy
US20240415980A1 (en) 2021-10-28 2024-12-19 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for knocking out c5
EP4426828A1 (en) 2021-11-01 2024-09-11 Tome Biosciences, Inc. Single construct platform for simultaneous delivery of gene editing machinery and nucleic acid cargo
US20240426823A1 (en) 2021-11-03 2024-12-26 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Methods and compositions for treating triple negative breast cancer (tnbc)
CA3237482A1 (en) 2021-11-03 2023-05-11 The J. David Gladstone Institutes, A Testamentary Trust Established Under The Will Of J. David Gladstone Precise genome editing using retrons
IL312505A (en) 2021-11-04 2024-07-01 Regeneron Pharma Non-human animals comprising a modified cacng1 locus
JP2024543369A (ja) 2021-11-09 2024-11-21 ブイオーアール バイオファーマ インコーポレーテッド Ｅｍｒ２修飾のための化合物及び方法
EP4433512A4 (en) 2021-11-19 2025-12-31 Univ Pennsylvania Genetically modified pan-leukocyte-specific CD45 antigen to facilitate T-lymphocyte therapy
GB202117314D0 (en) 2021-11-30 2022-01-12 Clarke David John Cyclic nucleic acid fragmentation
WO2023099591A1 (en) 2021-12-01 2023-06-08 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for increasing fetal hemoglobin content by editing the +55-kb region of the erythroid-specific bcl11a enhancer
KR20240117571A (ko) 2021-12-08 2024-08-01 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 돌연변이 마이오실린 질환 모델 및 이의 용도
EP4444874A1 (en) 2021-12-09 2024-10-16 Zygosity Limited Vector
US20230193310A1 (en) 2021-12-10 2023-06-22 Seminis Vegetabe Seeds, Inc. Lettuce plants having resistance to downy mildew
US20250064032A1 (en) 2021-12-10 2025-02-27 Pig Improvement Company Uk Limited Editing tmprss2/4 for disease resistance in livestock
GB202118058D0 (en) 2021-12-14 2022-01-26 Univ Warwick Methods to increase yields in crops
US20230279442A1 (en) 2021-12-15 2023-09-07 Versitech Limited Engineered cas9-nucleases and method of use thereof
WO2023111173A1 (en) 2021-12-16 2023-06-22 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) An ezh2 degrader or inhibitor for use in the treatment of resistant acute myeloid leukemia
EP4447649A1 (en) 2021-12-17 2024-10-23 Keygene N.V. Double decapitation of plants
US20250049006A1 (en) 2021-12-20 2025-02-13 C/O Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising humanized ace2 and tmprss loci
CA3243006A1 (en) 2021-12-21 2025-02-27 Alia Therapeutics Srl TYPE II CAS PROTEINS AND THEIR APPLICATIONS
EP4452257A1 (en) 2021-12-21 2024-10-30 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for treating melanoma
EP4453199A1 (en) 2021-12-21 2024-10-30 Benson Hill, Inc. Compositions and methods for modifying genomes
AU2022420615A1 (en) 2021-12-22 2024-07-04 Tome Biosciences, Inc. Co-delivery of a gene editor construct and a donor template
JP2025501755A (ja) 2021-12-23 2025-01-23 ユニバーシティー オブ マサチューセッツ 脆弱ｘ関連障害に対する治療的処置
AU2022424002A1 (en) 2021-12-29 2024-06-13 Bristol-Myers Squibb Company Generation of landing pad cell lines
US20250134999A1 (en) 2022-01-14 2025-05-01 Tune Therapeutics, Inc. Compositions, systems, and methods for programming t cell phenotypes through targeted gene activation
US20250154503A1 (en) 2022-01-14 2025-05-15 Tune Therapeutics, Inc. Compositions, systems, and methods for programming t cell phenotypes through targeted gene repression
WO2023141602A2 (en) 2022-01-21 2023-07-27 Renagade Therapeutics Management Inc. Engineered retrons and methods of use
CA3243220A1 (en) 2022-01-24 2023-07-27 LifeEDIT Therapeutics, Inc. RNA-GUIDED NUCLEASE AND ACTIVE FRAGMENTS, ASSOCIATED VARIANTS AND METHODS OF USE
WO2023144104A1 (en) 2022-01-25 2023-08-03 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Base editing approaches for the treatment of βeta-thalassemia
WO2023144235A1 (en) 2022-01-27 2023-08-03 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for monitoring and treating warburg effect in patients with pi3k-related disorders
US20250230412A1 (en) 2022-02-01 2025-07-17 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for treating cancer
CA3242731A1 (en) 2022-02-02 2023-08-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-tfr:gaa and anti-cd63:gaa insertions for treatment of pompe disease
WO2023150798A1 (en) 2022-02-07 2023-08-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for defining optimal treatment timeframes in lysosomal disease
EP4223877A1 (en) * 2022-02-08 2023-08-09 Eberhard Karls Universität Tübingen Medizinische Fakultät System and method for editing genomic dna to modulate splicing
AU2023218391A1 (en) 2022-02-11 2024-07-11 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for screening 4r tau targeting agents
US20250152677A1 (en) 2022-02-14 2025-05-15 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Treatment of liver cancers by disrupting the beta-catenin/tcf-4 binding site located upstreatm of meg3 in the dlk1/dio3 locus
WO2023159103A1 (en) 2022-02-17 2023-08-24 The Board Of Regents Of The University Of Texas System CRISPR/SpCas9 VARIANT AND METHODS FOR ENHANCED CORRECTON OF DUCHENNE MUSCULAR DYSTROPHY MUTATIONS
EP4479143A1 (en) 2022-02-18 2024-12-25 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) Use of tcr-deficient car-tregs in combination with anti-tcr complex monoclonal antibodies for inducing durable tolerance
AU2022201166B2 (en) * 2022-02-21 2024-02-22 Zhuhai Shu Tong Medical Technology Co., Ltd. Type ii crispr/cas9 genome editing system and the application thereof
US12157886B2 (en) * 2022-02-21 2024-12-03 Zhuhai Shu Tong Medical Technology Co., Ltd. Type II CRISPR/Cas9 genome editing system and the application thereof
EP4482955A2 (en) * 2022-02-25 2025-01-01 Duke University Crispr-cas9 compositions and methods with a novel cas9 protein for genome editing and gene regulation
US20250179531A1 (en) 2022-02-25 2025-06-05 Vor Biopharma Inc. Compositions and methods for homology-directed repair gene modification
EP4486881A1 (en) 2022-03-01 2025-01-08 Celyntra Therapeutics SA Composition and methods for transgene insertion
WO2023166425A1 (en) 2022-03-01 2023-09-07 Crispr Therapeutics Ag Methods and compositions for treating angiopoietin-like 3 (angptl3) related conditions
US12509485B2 (en) 2022-03-23 2025-12-30 Sumitomo Chemical Company, Limited Method for producing nucleic acid oligomer
US20230302423A1 (en) 2022-03-28 2023-09-28 Massachusetts Institute Of Technology Rna scaffolded wireframe origami and methods thereof
WO2023194359A1 (en) 2022-04-04 2023-10-12 Alia Therapeutics Srl Compositions and methods for treatment of usher syndrome type 2a
AU2023251040A1 (en) 2022-04-04 2024-10-17 Vor Biopharma Inc. Compositions and methods for mediating epitope engineering
WO2023205744A1 (en) 2022-04-20 2023-10-26 Tome Biosciences, Inc. Programmable gene insertion compositions
CN114864002B (zh) * 2022-04-28 2023-03-10 广西科学院 一种基于深度学习的转录因子结合位点识别方法
WO2023212677A2 (en) 2022-04-29 2023-11-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Identification of tissue-specific extragenic safe harbors for gene therapy approaches
WO2023215725A1 (en) 2022-05-02 2023-11-09 Fred Hutchinson Cancer Center Compositions and methods for cellular immunotherapy
EP4518907A1 (en) 2022-05-02 2025-03-12 Fondazione Telethon ETS Homology independent targeted integration for gene editing
WO2023215831A1 (en) 2022-05-04 2023-11-09 Tome Biosciences, Inc. Guide rna compositions for programmable gene insertion
US20250302998A1 (en) 2022-05-09 2025-10-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Vectors and methods for in vivo antibody production
US20250241956A1 (en) 2022-05-10 2025-07-31 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Base editing approaches for correcting the cd39 (cag>tag) mutation in patients suffering from beta-thalassemia
JP2025516462A (ja) * 2022-05-13 2025-05-30 エスアールアイ インターナショナル 内因性遺伝子への転写因子のプログラム可能なリクルートメント
JP2025516823A (ja) 2022-05-19 2025-05-30 ライエル・イミュノファーマ・インコーポレイテッド Ｎｒ４ａ３を標的とするポリヌクレオチド及びその使用
WO2023225670A2 (en) 2022-05-20 2023-11-23 Tome Biosciences, Inc. Ex vivo programmable gene insertion
US20250308637A1 (en) 2022-05-20 2025-10-02 Celyntra Therapeutics Sa Systems and methods for assessing risk of genome editing events
WO2023230570A2 (en) 2022-05-25 2023-11-30 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Compositions and methods for modulating genetic drivers
US20250319115A1 (en) 2022-05-25 2025-10-16 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Compositions and Methods for Modulating Cytokines
AU2023276757A1 (en) 2022-05-25 2024-11-21 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Compositions and methods for modulation of tumor suppressors and oncogenes
CA3254388A1 (en) 2022-05-25 2023-11-30 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc COMPOSITIONS AND METHODS OF MODULATING TRAFFIC FACTORS
CN119563038A (zh) 2022-05-25 2025-03-04 旗舰创业创新七公司 用于调节免疫应答的组合物和方法
JP2025521154A (ja) 2022-05-31 2025-07-08 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド Ｃ９ｏｒｆ７２反復伸長疾患のためのｃｒｉｓｐｒ干渉療法
US20250344681A1 (en) 2022-05-31 2025-11-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Animal model of tdp-43 proteinopathy
WO2023235725A2 (en) 2022-05-31 2023-12-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Crispr-based therapeutics for c9orf72 repeat expansion disease
WO2023233342A2 (en) 2022-06-01 2023-12-07 Crispr Therapeutics Ag Gene-edited natural killer cells
WO2023233339A1 (en) 2022-06-01 2023-12-07 Crispr Therapeutics Ag Compositions and methods for differentiating stem cells into nk cells
GB2634837A (en) 2022-06-07 2025-04-23 Scribe Therapeutics Inc Compositions and methods for the targeting of PCSK9
WO2023250288A2 (en) 2022-06-21 2023-12-28 Seminis Vegetable Seeds, Inc. Novel qtls conferring resistance to cucumber mosaic virus
IL317874A (en) 2022-06-24 2025-02-01 Tune Therapeutics Inc Compounds, systems and methods for reducing low density lipoproteins through targeted gene suppression
WO2024006955A1 (en) 2022-06-29 2024-01-04 Intellia Therapeutics, Inc. Engineered t cells
GB202209518D0 (en) 2022-06-29 2022-08-10 Snipr Biome Aps Treating & preventing E coli infections
WO2024005863A1 (en) 2022-06-30 2024-01-04 Inari Agriculture Technology, Inc. Compositions, systems, and methods for genome editing
WO2024005864A1 (en) 2022-06-30 2024-01-04 Inari Agriculture Technology, Inc. Compositions, systems, and methods for genome editing
JP7152094B1 (ja) 2022-06-30 2022-10-12 リージョナルフィッシュ株式会社 ｔｒａｃｒＲＮＡユニット、及びゲノム編集方法
EP4299733A1 (en) 2022-06-30 2024-01-03 Inari Agriculture Technology, Inc. Compositions, systems, and methods for genome editing
EP4548351A1 (en) 2022-06-30 2025-05-07 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Artificial intelligence-mediated methods and systems for genome editing
GB2621813A (en) 2022-06-30 2024-02-28 Univ Newcastle Preventing disease recurrence in Mitochondrial replacement therapy
EP4299739A1 (en) 2022-06-30 2024-01-03 Inari Agriculture Technology, Inc. Compositions, systems, and methods for genome editing
US20260000658A1 (en) 2022-07-06 2026-01-01 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Methods for the treatment of proliferative glomerulonephritis
CA3261865A1 (en) 2022-07-12 2024-01-18 Tune Therapeutics, Inc. TARGETED TRANSCRIPTIONAL ACTIVATION COMPOSITIONS, SYSTEMS AND METHODS
WO2024015925A2 (en) 2022-07-13 2024-01-18 Vor Biopharma Inc. Compositions and methods for artificial protospacer adjacent motif (pam) generation
WO2024013514A2 (en) 2022-07-15 2024-01-18 Pig Improvement Company Uk Limited Gene edited livestock animals having coronavirus resistance
JP2025525569A (ja) 2022-07-18 2025-08-05 レナゲード セラピューティクス マネージメント インコーポレイテッド 遺伝子編集成分、システム、及び使用方法
CA3262625A1 (en) 2022-07-22 2024-01-25 The Johns Hopkins University ADMINISTRATION OF TARGETED INTRACELLULAR CRISPR/CAS SYSTEM ACTIVATED BY DENDRIMER AND GENE EDITING
WO2024018056A1 (en) 2022-07-22 2024-01-25 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Base editing approaches for correcting the ivs2-1 (g>a) mutation in patients suffering from βeta-thalassemia
WO2024020587A2 (en) 2022-07-22 2024-01-25 Tome Biosciences, Inc. Pleiopluripotent stem cell programmable gene insertion
US20260015580A1 (en) 2022-07-25 2026-01-15 The Regents Of The University Of California Methods of Producing and Using Avian Embryonic Stem Cells and Avian Telencephalic Organoids
WO2024023734A1 (en) 2022-07-26 2024-02-01 Bit Bio Limited MULTI-gRNA GENOME EDITING
JPWO2024024873A1 (sr) 2022-07-28 2024-02-01
CN120659627A (zh) 2022-07-29 2025-09-16 瑞泽恩制药公司 用于转铁蛋白受体（tfr）介导的脑和肌肉递送的组合物和方法
IL317261A (en) 2022-07-29 2025-01-01 Regeneron Pharma Non-human animals containing a modified transferrin receptor locus
EP4565217A1 (en) 2022-08-04 2025-06-11 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Methods for the treatment of lymphoproliferative disorders
JP2025525745A (ja) 2022-08-05 2025-08-07 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド Ｔｄｐ－４３の凝集耐性バリアント
WO2024036190A2 (en) 2022-08-09 2024-02-15 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Guide polynucleotide multiplexing
EP4569093A1 (en) 2022-08-12 2025-06-18 Life Edit Therapeutics, Inc. Rna-guided nucleases and active fragments and variants thereof and methods of use
KR20250077608A (ko) 2022-08-19 2025-05-30 튠 쎄라퓨틱스, 인코포레이티드 표적 유전자 억제를 통한 b형 간염 바이러스 조절용 조성물, 시스템 및 방법
WO2024044723A1 (en) 2022-08-25 2024-02-29 Renagade Therapeutics Management Inc. Engineered retrons and methods of use
CA3265664A1 (en) 2022-08-25 2024-02-29 Life Edit Therapeutics, Inc. CHEMICAL MODIFICATION OF GUIDE RNA WITH A LOCKED NUCLEIC ACID FOR RNA-GUIDED NUCLEASE-MEDIATED GENE EDITING
WO2024042165A2 (en) 2022-08-26 2024-02-29 UCB Biopharma SRL Novel rna-guided nucleases and nucleic acid targeting systems comprising such rna-guided nucleases
WO2024042168A1 (en) 2022-08-26 2024-02-29 UCB Biopharma SRL Novel rna-guided nucleases and nucleic acid targeting systems comprising such rna-guided nucleases
EP4580658A1 (en) 2022-08-31 2025-07-09 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Method to generate more efficient car-t cells
WO2024047247A1 (en) 2022-09-02 2024-03-07 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Base editing approaches for the treatment of amyotrophic lateral sclerosis
EP4583905A1 (en) 2022-09-06 2025-07-16 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Novel dual split car-t cells for the treatment of cd38-positive hematological malignancies
WO2024056659A1 (en) 2022-09-13 2024-03-21 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Method for treating prostate cancer and other epithelial cancers
CA3267752A1 (en) 2022-09-16 2024-03-21 Alia Therapeutics Srl ENQP TYPE II CAS PROTEINS AND THEIR APPLICATIONS
WO2024064642A2 (en) 2022-09-19 2024-03-28 Tune Therapeutics, Inc. Compositions, systems, and methods for modulating t cell function
US20260097121A1 (en) * 2022-09-19 2026-04-09 Emendobio Inc. Biallelic Knockout of CISH
WO2024064824A2 (en) 2022-09-21 2024-03-28 Yale University Compositions and methods for identification of membrane targets for enhancement of nk cell therapy
WO2024064958A1 (en) 2022-09-23 2024-03-28 Lyell Immunopharma, Inc. Methods for culturing nr4a-deficient cells
WO2024064952A1 (en) 2022-09-23 2024-03-28 Lyell Immunopharma, Inc. Methods for culturing nr4a-deficient cells overexpressing c-jun
KR20250075694A (ko) 2022-09-28 2025-05-28 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 세포 기반 요법을 강화하기 위한 항체 저항성 변형 수용체
WO2024073751A1 (en) 2022-09-29 2024-04-04 Vor Biopharma Inc. Methods and compositions for gene modification and enrichment
EP4593590A1 (en) 2022-09-29 2025-08-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Correction of hepatosteatosis in humanized liver animals through restoration of il6/il6r/gp130 signaling in human hepatocytes
WO2024077174A1 (en) 2022-10-05 2024-04-11 Lyell Immunopharma, Inc. Methods for culturing nr4a-deficient cells
EP4602078A2 (en) 2022-10-11 2025-08-20 Yale University Compositions and methods of using cell-penetrating antibodies
JP7353602B1 (ja) 2022-10-14 2023-10-02 株式会社インプランタイノベーションズ ゲノム編集方法およびゲノム編集用組成物
EP4605524A1 (en) 2022-10-20 2025-08-27 Basf Se Regulatory nucleic acid molecules for enhancing gene expression in plants
AU2023364547A1 (en) 2022-10-21 2025-04-10 Watchmaker Genomics, Inc. Methods and compositions for sequencing library normalization
EP4605000A1 (en) 2022-10-21 2025-08-27 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Methods and pharmaceutical compositions for the treatment of osteoarthritis
WO2024089953A1 (ja) 2022-10-27 2024-05-02 住友化学株式会社 オリゴヌクレオチドの製造方法
CN115678903B (zh) * 2022-11-03 2024-04-02 贵州大学 一种白背飞虱Ago1基因、合成dsRNA的方法及其应用
KR20250126155A (ko) 2022-11-04 2025-08-22 라이프 에디트 테라퓨틱스, 인크. 내부 삽입 부위를 갖는 진화된 아데닌 데아미나제 및 rna-가이드 뉴클레아제 융합 단백질 및 사용 방법
EP4612184A1 (en) 2022-11-04 2025-09-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Calcium voltage-gated channel auxiliary subunit gamma 1 (cacng1) binding proteins and cacng1-mediated delivery to skeletal muscle
WO2024102434A1 (en) 2022-11-10 2024-05-16 Senda Biosciences, Inc. Rna compositions comprising lipid nanoparticles or lipid reconstructed natural messenger packs
KR20250116795A (ko) 2022-11-14 2025-08-01 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 별아교세포로의 섬유아세포 성장 인자 수용체 3-매개된 전달을 위한 조성물 및 방법
WO2024105162A1 (en) 2022-11-16 2024-05-23 Alia Therapeutics Srl Type ii cas proteins and applications thereof
CN120112547A (zh) 2022-11-16 2025-06-06 瑞泽恩制药公司 包含膜结合il-12和蛋白酶可裂解接头的嵌合蛋白
AU2023380182A1 (en) 2022-11-18 2025-07-03 Kyoto Prefectural Public University Corporation Compositions for mitophagy induction and uses thereof
EP4627077A1 (en) 2022-12-01 2025-10-08 Danisco US Inc. Iterative multiplex genome engineering in microbial cells using a selection marker swapping system
EP4627078A1 (en) 2022-12-01 2025-10-08 Danisco US Inc. Iterative muliplex genome engineering in microbial cells using a bidirectional selection marker system
EP4627076A1 (en) 2022-12-01 2025-10-08 Danisco Us Inc Iterative multiplex genome engineering in microbial cells using a recombinant self-excisable selection marker system
JP2025540052A (ja) 2022-12-01 2025-12-11 イェール ユニバーシティー 細胞内ペイロード送達用刺激応答性トレースレス操作プラットフォーム
WO2024123786A1 (en) 2022-12-06 2024-06-13 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods and compositions for co-delivery of t-dnas expressing multiple guide polynucleotides into plants
CN120457489A (zh) 2022-12-07 2025-08-08 赛诺菲 预测插入缺失频率
EP4634383A1 (en) 2022-12-16 2025-10-22 Life Edit Therapeutics, Inc. Guide rnas that target foxp3 gene and methods of use
WO2024127370A1 (en) 2022-12-16 2024-06-20 LifeEDIT Therapeutics, Inc. Guide rnas that target trac gene and methods of use
WO2024133723A1 (en) 2022-12-22 2024-06-27 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Methods for decreasing therapeutic acquired resistance to chemotherapy and/or radiotherapy
EP4638783A2 (en) 2022-12-22 2025-10-29 Intellia Therapeutics, Inc. Methods for analyzing nucleic acid cargos of lipid nucleic acid assemblies
WO2024138194A1 (en) 2022-12-22 2024-06-27 Tome Biosciences, Inc. Platforms, compositions, and methods for in vivo programmable gene insertion
CA3275398A1 (en) 2022-12-22 2024-06-27 Keygene N.V. REGENERATION BY PROTOPLASTIC CALL GRAFTING
JPWO2024143276A1 (sr) 2022-12-26 2024-07-04
CN120882867A (zh) 2023-01-11 2025-10-31 阿利亚治疗有限公司 Ii型cas蛋白及其应用
JP2026502532A (ja) 2023-01-12 2026-01-23 ナショナル ユニバーシティ オブ シンガポール Ｔ細胞及びｎｋ細胞悪性腫瘍の免疫療法のためのｃｄ８発現及びキメラ抗原受容体の遮断
WO2024159071A1 (en) 2023-01-27 2024-08-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Modified rhabdovirus glycoproteins and uses thereof
WO2024163683A2 (en) 2023-02-01 2024-08-08 Tune Therapeutics, Inc. Systems, compositions, and methods for modulating expression of methyl-cpg binding protein 2 (mecp2) and x-inactive specific transcript (xist)
AU2024214456A1 (en) 2023-02-01 2025-07-03 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Animals comprising a modified klhdc7b locus
WO2024163678A2 (en) 2023-02-01 2024-08-08 Tune Therapeutics, Inc. Fusion proteins and systems for targeted activation of frataxin (fxn) and related methods
WO2024163615A1 (en) 2023-02-02 2024-08-08 University Of Florida Research Foundation, Incorporated Brain-derived neurotrophic factor-nano luciferase transgenic rodents and methods of use thereof
JP2026506554A (ja) 2023-02-06 2026-02-25 アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル 多重塩基編集による遺伝子改変造血幹細胞の濃縮
WO2024168097A2 (en) * 2023-02-07 2024-08-15 Applied Stemcell, Inc. Integrase variants for gene insertion in human cell
WO2024168312A1 (en) 2023-02-09 2024-08-15 Vor Biopharma Inc. Methods for treating hematopoietic malignancy
WO2024168348A1 (en) * 2023-02-10 2024-08-15 Tryptagenix, Inc. Production of monoterpene indole alkaloid compounds in a heterologous host
KR20250151430A (ko) 2023-02-15 2025-10-21 아버 바이오테크놀로지스, 인크. 스타스민 2(stmn2) 전사체에서 비정상적인 스플라이싱을 억제하는 유전자 편집 방법
IT202300004443A1 (it) 2023-03-09 2024-09-09 Int Centre For Genetic Engineering And Biotechnology Icgeb Sequenza codificante per alfa galattosidasi a umana per il trattamento della malattia di fabry
AU2024239266A1 (en) 2023-03-20 2025-09-25 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Cas polypeptides with altered pam recognition
US12383615B2 (en) 2023-03-23 2025-08-12 Carbon Biosciences, Inc. Protoparvovirus compositions comprising a protoparvovirus variant VP1 capsid polypeptide and related methods
WO2024196965A1 (en) 2023-03-23 2024-09-26 Carbon Biosciences, Inc. Parvovirus compositions and related methods for gene therapy
EP4689155A1 (en) 2023-03-29 2026-02-11 Astrazeneca AB Use of inhibitors to increase efficiency of crispr/cas insertions
WO2024206911A2 (en) 2023-03-30 2024-10-03 Children's Hospital Medical Center Clinical-grade organoids
WO2024206714A1 (en) * 2023-03-31 2024-10-03 Mammoth Biosciences, Inc. Engineered effector proteins, compositions, systems and methods of use thereof
WO2024211287A1 (en) 2023-04-03 2024-10-10 Seagen Inc. Production cell lines with targeted integration sites
CN121241136A (zh) * 2023-04-07 2025-12-30 基因泰克公司 经修饰的指导rna
AU2024202284B2 (en) 2023-04-14 2025-08-14 Seminis Vegetable Seeds, Inc. Methods and compositions for Peronospora resistance in spinach
WO2024220135A1 (en) 2023-04-17 2024-10-24 University Of Massachusetts Prime editing systems having pegrna with reduced auto-inhibitory interaction
IT202300007968A1 (it) 2023-04-21 2024-10-21 Fond Telethon Ets Metodi di editing genomico e costrutti
EP4697940A1 (en) 2023-04-21 2026-02-25 Vib Vzw Allelic combinations in crops for yield increase
WO2024226499A1 (en) 2023-04-24 2024-10-31 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods for modifying fertility
EP4703472A1 (en) 2023-04-26 2026-03-04 Eurus Therapeutics Inc. Non-natural polynucleotides for modification of target nucleotide sequence
CN121712899A (zh) * 2023-04-27 2026-03-20 伦斯勒理工学院 用于在真核细胞中准确插入dna序列的重组酶
EP4688814A1 (en) 2023-04-27 2026-02-11 University of Massachusetts Cas-embedded cytidine deaminase ribonucleoprotein complexes having improved base editing specificity and efficiency
WO2024233328A1 (en) * 2023-05-05 2024-11-14 Insmed Incorporated Nannochloropsis-producing viruses and methods and compositions for making the same
WO2024234006A1 (en) 2023-05-11 2024-11-14 Tome Biosciences, Inc. Systems, compositions, and methods for targeting liver sinusodial endothelial cells (lsecs)
EP4709860A1 (en) * 2023-05-11 2026-03-18 University of Massachusetts Compositions and methods for improved genome editing with nme2cas9 and nme2-smucas9 variants
AU2024270764A1 (en) 2023-05-15 2025-12-04 Nchroma Bio, Inc. Compositions and methods for epigenetic regulation of hbv gene expression
WO2024235991A1 (en) 2023-05-15 2024-11-21 UCB Biopharma SRL Rna-guided nucleases and nucleic acid targeting systems comprising such rna-guided nucleases
EP4713003A1 (en) 2023-05-17 2026-03-25 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Lipc variant in the treatment of hypercholesterolemia and atherosclerotic cardiovascular disease
WO2024238977A2 (en) 2023-05-18 2024-11-21 Children's Hospital Medical Center Liver organoids with intrahepatic sympathetic nerves, and methods of use thereof
EP4716741A2 (en) 2023-05-23 2026-04-01 Flagship Labs 114, Inc. Compositions and methods for reducing cxcl9, cxcl10, and cxcl11 gene expression
WO2024245951A1 (en) 2023-05-26 2024-12-05 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Combination of slc8a1 inhibitor and mitochondria-targeted antioxidant for treating melanoma
CN121773211A (zh) 2023-05-30 2026-03-31 哈皮西兹研发有限公司 通过抑制aip10/abap1调控网络基因改善农艺性状的植物
EP4719423A1 (en) 2023-05-30 2026-04-08 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Method and pharmaceutical composition for use in the treatment of focal cortical dysplasia
WO2024254376A1 (en) 2023-06-08 2024-12-12 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Animal model with rapid onset of alzheimer's amyloid beta plaque pathology
WO2024259135A1 (en) 2023-06-13 2024-12-19 Intellia Therapeutics, Inc. Assays for analysis of ribonucleic acid (rna) molecules
KR20260026049A (ko) 2023-06-15 2026-02-25 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. 청력 장애에 대한 유전자 치료
WO2024256635A1 (en) 2023-06-15 2024-12-19 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Dpm1 inhibitor for treating cancer
CN118475621A (zh) 2023-06-19 2024-08-09 杭州恩和生物科技有限公司 生产7-脱氢胆固醇的融合多肽及其使用方法
WO2024261302A1 (en) 2023-06-22 2024-12-26 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Nlrp3 inhibitors, pak1/2 inhibitors and/or caspase 1 inhibitors for use in the treatment of rac2 monogenic disorders
EP4731750A2 (en) 2023-06-23 2026-04-29 Children's Hospital Medical Center Methods of matrix-free suspension culture
WO2024261323A1 (en) 2023-06-23 2024-12-26 Astrazeneca Ab Molecular switches
WO2025003344A1 (en) 2023-06-28 2025-01-02 Alia Therapeutics Srl Type ii cas proteins and applications thereof
KR20260032927A (ko) 2023-06-30 2026-03-10 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 상동성 지향 복구를 증가시키는 방법 및 조성물
WO2025012316A2 (en) 2023-07-10 2025-01-16 Universiteit Gent Method of genome-editing
WO2025017030A1 (en) 2023-07-17 2025-01-23 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Prime editing of the -200 region in the hbg1 and/or hbg2 promoter for increasing fetal hemoglobin content in a eukaryotic cell
WO2025017033A1 (en) 2023-07-17 2025-01-23 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Prime editing of the -115 region in the hbg1 and/or hbg2 promoter for increasing fetal hemoglobin content in a eukaryotic cell
WO2025021839A1 (en) 2023-07-25 2025-01-30 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Method to treat metabolic disorders
WO2025022367A2 (en) 2023-07-27 2025-01-30 Life Edit Therapeutics, Inc. Rna-guided nucleases and active fragments and variants thereof and methods of use
IL326018A (en) 2023-07-28 2026-03-01 Regeneron Pharma Introduction of anti-TFR:GAA and anti-CD63:GAA for the treatment of Pompe disease
US20250049896A1 (en) 2023-07-28 2025-02-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-tfr:acid sphingomyelinase for treatment of acid sphingomyelinase deficiency
CN121693566A (zh) 2023-07-28 2026-03-17 瑞泽恩制药公司 使用bGH-SV40L串联PolyA在单向基因插入期间增强转基因表达
WO2025029840A1 (en) 2023-07-31 2025-02-06 Tune Therapeutics, Inc. Compositions and methods for multiplexed activation and repression of t cell gene expression
CN121909284A (zh) 2023-07-31 2026-04-21 图恩疗法股份有限公司 用于调节il-2基因表达的组合物和方法
WO2025027165A1 (en) 2023-08-01 2025-02-06 Basf Plant Science Company Gmbh Increased resistance by expression of an ics protein
CN121605117A (zh) 2023-08-01 2026-03-03 巴斯夫植物科学有限公司 通过表达msbp1蛋白增加抗性
WO2025030010A1 (en) 2023-08-01 2025-02-06 Vor Biopharma Inc. Compositions comprising genetically engineered hematopoietic stem cells and methods of use thereof
WO2025032112A1 (en) 2023-08-08 2025-02-13 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Methods for the treatment of type 2-mediated diseases
WO2025038494A1 (en) 2023-08-11 2025-02-20 Tune Therapeutics, Inc. Compositions, systems, and methods for lymphoid cell differentiation using targeted gene activation
WO2025038750A2 (en) 2023-08-14 2025-02-20 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for treating cancer
WO2025038948A2 (en) * 2023-08-16 2025-02-20 The Regents Of The University Of California Alpha-crystalline domain proteins and their use in genome modification
EP4512403A1 (en) 2023-08-22 2025-02-26 Friedrich-Schiller-Universität Jena Neuropeptide b and w-receptor as a target for treating mood disorders and/or chronic stress
WO2025049524A1 (en) 2023-08-28 2025-03-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Cxcr4 antibody-resistant modified receptors
AU2024335327A1 (en) 2023-09-01 2026-03-26 Renagade Therapeutics Management Inc. Gene editing systems, compositions, and methods for treatment of vexas syndrome
WO2025050069A1 (en) 2023-09-01 2025-03-06 Tome Biosciences, Inc. Programmable gene insertion using engineered integration enzymes
WO2025059073A1 (en) 2023-09-11 2025-03-20 Tune Therapeutics, Inc. Epigenetic editing methods and systems for differentiating stem cells
WO2025059215A1 (en) 2023-09-12 2025-03-20 Aadigen, Llc Methods and compositions for treating or preventing cancer
WO2025059184A1 (en) 2023-09-12 2025-03-20 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods and compositions for generating genome-edited paternal doubled haploids
WO2025064408A1 (en) 2023-09-18 2025-03-27 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods for treating cardiovascular disease
GB202314578D0 (en) 2023-09-22 2023-11-08 Univ Manchester Methods of producing homoplasmic modified plants or parts thereof
WO2025072803A1 (en) 2023-09-29 2025-04-03 Children's Hospital Medical Center Ntrk2 signaling-mediated alveolar capillary injury and repair
WO2025076141A1 (en) 2023-10-03 2025-04-10 Inari Agriculture Technology, Inc. Viral delivery of grna to the scion
WO2025076306A1 (en) 2023-10-06 2025-04-10 University Of Massachusetts Prime editors having improved prime editing efficiency
WO2025078851A1 (en) 2023-10-11 2025-04-17 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Methods of treating cognitive deficit
AU2024357861A1 (en) 2023-10-12 2026-04-23 Renagade Therapeutics Management Inc. Nickase-retron template-based precision editing system and methods of use
WO2025081123A1 (en) 2023-10-12 2025-04-17 Fred Hutchinson Cancer Center Methods and compositions for improving t cell immunotherapy
WO2025078632A1 (en) 2023-10-12 2025-04-17 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Methods of prognosis and treatment of patients suffering from cancer
WO2025083169A1 (en) 2023-10-17 2025-04-24 Tenpoint Therapeutics Limited Combination of a vegf inhibitor and a complement pathway inhibitor for treating ocular disorders
WO2025090427A1 (en) 2023-10-23 2025-05-01 University Of Rochester Glial-targeted relief of hyperexcitability in neurodegenerative diseases
WO2025096638A2 (en) 2023-10-30 2025-05-08 Turnstone Biologics Corp. Genetically modified tumor infilitrating lymphocytes and methods of producing and using the same
WO2025101820A1 (en) 2023-11-08 2025-05-15 Fred Hutchinson Cancer Center Compositions and methods for cellular immunotherapy
US20250161347A1 (en) 2023-11-22 2025-05-22 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Methods and compositions for treating non-alcoholic fatty liver disease
WO2025122754A1 (en) 2023-12-07 2025-06-12 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Gaa knockout non-human animals
WO2025132479A1 (en) 2023-12-18 2025-06-26 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Flt3 inhibitor for modulating macrophages polarization
WO2025137439A2 (en) 2023-12-20 2025-06-26 Intellia Therapeutics, Inc. Engineered t cells
WO2025155753A2 (en) 2024-01-17 2025-07-24 Renagade Therapeutics Management Inc. Improved gene editing system, guides, and methods
WO2025153608A1 (en) 2024-01-18 2025-07-24 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Wip1 inhibitor for the treatment of glomerular disease
WO2025158400A1 (en) 2024-01-24 2025-07-31 Yale University Compositions and methods of natural killer cell hyperboosts for enhancement of nk cell therapy
WO2025160324A2 (en) 2024-01-26 2025-07-31 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for using plasma cell depleting agents and/or b cell depleting agents to suppress host anti-aav antibody response and enable aav transduction and re-dosing
US20250242018A1 (en) 2024-01-26 2025-07-31 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Combination immunosuppression for inhibiting an immune response and enabling immunogen administration and re-administration
WO2025162980A1 (en) 2024-01-30 2025-08-07 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Methods for the treatment of breast cancer using a jnk-1 inhibitor
WO2025162985A1 (en) 2024-01-30 2025-08-07 Basf Plant Science Company Gmbh Increased plant disease resistance by expression of a glycine-rich protein
WO2025168705A1 (en) 2024-02-08 2025-08-14 Vib Vzw Means and methods for the production of saponins with endosomal escape-enhancing properties
WO2025171210A1 (en) 2024-02-09 2025-08-14 Arbor Biotechnologies, Inc. Compositions and methods for gene editing via homology-mediated end joining
WO2025174908A1 (en) 2024-02-12 2025-08-21 Life Edit Therapeutics, Inc. Novel rna-guided nucleases and proteins for polymerase editing
WO2025174765A1 (en) 2024-02-12 2025-08-21 Renagade Therapeutics Management Inc. Lipid nanoparticles comprising coding rna molecules for use in gene editing and as vaccines and therapeutic agents
WO2025184603A2 (en) 2024-03-01 2025-09-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. The use of cd40 inhibitors for inhibiting an immune response and enabling immunogen administration and re-administration
US20250276092A1 (en) 2024-03-01 2025-09-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for re-dosing aav using anti-cd40 antagonistic antibody to suppress host anti-aav antibody response
WO2025184759A1 (en) 2024-03-04 2025-09-12 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Maize plants comprising resistance to gray leaf spot and compositions and methods for selecting and producing the same
WO2025191018A1 (en) 2024-03-13 2025-09-18 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Mrgpre binding agent for use in the treatment of inflammatory and pain disorders
WO2025194019A1 (en) 2024-03-14 2025-09-18 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Methods for treating liver fibrosis and non-alcoholic fatty liver disease
WO2025202874A1 (en) 2024-03-25 2025-10-02 Crispr Therapeutics Ag Genetically modified cells expressing glp-1 receptor agonist
WO2025202473A1 (en) 2024-03-28 2025-10-02 Revvity Discovery Limited A nucleic acid deaminase, a base editor and uses thereof
WO2025210123A1 (en) 2024-04-03 2025-10-09 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Methods and pharmaceutical composition for treating cancers
WO2025212920A1 (en) 2024-04-03 2025-10-09 Children's Hospital Medical Center Multi-zonal liver organoids
WO2025217202A1 (en) 2024-04-08 2025-10-16 Children's Hospital Medical Center Bile duct organoid
WO2025217398A1 (en) 2024-04-10 2025-10-16 Lyell Immunopharma, Inc. Methods for culturing cells with improved culture medium
WO2025217503A1 (en) * 2024-04-12 2025-10-16 Georgetown University Assay for in-vivo characterization of genotoxicity
EP4677108A1 (en) 2024-04-22 2026-01-14 Basecamp Research Ltd Method and compositions for detecting off-target editing
WO2025224182A2 (en) 2024-04-23 2025-10-30 Basecamp Research Ltd Single construct platform for simultaneous delivery of gene editing machinery and nucleic acid cargo
WO2025226912A1 (en) * 2024-04-26 2025-10-30 Sri International Cell-type specific delivery of gene editors and methods of use thereof
WO2025224297A1 (en) 2024-04-26 2025-10-30 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Antibodies having specificity to tgfbi and uses thereof
WO2025224715A1 (en) 2024-04-26 2025-10-30 King Abdullah Univeristy Of Science And Technology Methods for improving precise genome modification and reducing unwanted mutations by crispr-cas editing
EP4643858A1 (en) 2024-04-29 2025-11-05 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Methods and pharmaceutical composition for the treatment of uterine disease
WO2025228998A1 (en) 2024-04-30 2025-11-06 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Use of hdac4 inhibitors for the treatment of melanoma
CN118127022B (zh) * 2024-04-30 2024-07-12 四川大学 变异链球菌环状RNA circcsbD及应用、其过表达菌株及构建方法和应用
WO2025235388A1 (en) 2024-05-06 2025-11-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Transgene genomic identification by nuclease-mediated long read sequencing
WO2025240947A1 (en) 2024-05-17 2025-11-20 University Of Massachusetts Therapeutic treatment for fragile x-associated disorder
WO2025245169A1 (en) 2024-05-21 2025-11-27 Fred Hutchinson Cancer Center Immunotherapy cells equipped with a collagen-targeting payload
WO2025245188A2 (en) 2024-05-21 2025-11-27 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Methods of treating liver steatosis and non-alcoholic fatty liver disease
WO2025247829A1 (en) 2024-05-27 2025-12-04 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Methods and pharmaceutical composition for treating prostate cancer
WO2025250454A1 (en) 2024-05-28 2025-12-04 University Of Rochester Adeno-associated viruses evolved to specifically target human glial progenitor cells in vivo
WO2025250495A1 (en) 2024-05-28 2025-12-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Acceleration of human hepatocyte engraftment in humanized liver animals by supplementing paracrine ligands or agonists that activate human liver regeneration signals
WO2025248102A1 (en) 2024-05-31 2025-12-04 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Tbk1 inhibitor for use in the treatment of vitiligo
WO2025257151A1 (en) 2024-06-10 2025-12-18 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Methods and pharmaceutical composition for treating ciliopathies
WO2025259669A1 (en) 2024-06-10 2025-12-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and systems for characterizing modified oligonucleotides
WO2025257212A1 (en) 2024-06-11 2025-12-18 Keygene N.V. Screening and regeneration of protoplast callus
WO2025260068A1 (en) 2024-06-14 2025-12-18 Tune Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle formulation for delivery of nucleic acids to cells
CN121160664B (zh) * 2024-06-17 2026-04-24 南京诺唯赞生物科技股份有限公司 Rna聚合酶变体
WO2025261741A1 (en) 2024-06-19 2025-12-26 Albert-Ludwigs-Universitaet Freiburg Koerperschaft Des Oeffentlichen Rechts Synthetic lethality to treat autosomal dominant polycystic kidney disease (adpkd)
EP4667628A1 (en) 2024-06-19 2025-12-24 Albert-Ludwigs-Universität Freiburg Körperschaft des öffentlichen Rechts Synthetic lethality to treat autosomal dominant polycystic kidney disease (adpkd)
WO2025265017A1 (en) 2024-06-20 2025-12-26 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Ass1 gene insertion for the treatment of citrullinemia type i
WO2026002934A1 (en) 2024-06-25 2026-01-02 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Combination of a slc16a1 inhibitor and a smad3 inhibitor for treating cancer
WO2026003754A1 (en) 2024-06-25 2026-01-02 Life Edit Therapeutics, Inc. Novel reverse transcriptases and uses thereof
WO2026006542A2 (en) 2024-06-26 2026-01-02 Yale University Compositions and methods for crispr/cas9 based reactivation of human angelman syndrome
WO2026006832A1 (en) 2024-06-28 2026-01-02 University Of Connecticut Gene modulation for treating cancer
WO2026012976A1 (en) 2024-07-08 2026-01-15 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Use of inhibitor of gasdermind for treatment of rac2 monogenic disorders
WO2026013071A1 (en) 2024-07-09 2026-01-15 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Setdb1 inhibitor for use in the treatment of uveal melanoma
WO2026015647A1 (en) 2024-07-09 2026-01-15 Tune Therapeutics, Inc. Compositions, systems, and methods for cell differentiation using targeted gene activation of dll4 and/or vcam1
WO2026015829A2 (en) 2024-07-12 2026-01-15 Arbor Biotechnologies, Inc. Small reverse transcriptases and gene editing systems comprising such
WO2026015832A2 (en) 2024-07-12 2026-01-15 Arbor Biotechnologies, Inc. Reverse transcriptases and gene editing systems comprising such
WO2026020120A1 (en) 2024-07-19 2026-01-22 University Of Massachusetts Increasing cas9 genome editing fidelity through attenuation of guide rna watson-crick base pairing potential
WO2026036000A1 (en) 2024-08-08 2026-02-12 Invaio Sciences, Inc. Nature-derived lipid particles for use in agriculture
US20260071285A1 (en) 2024-09-11 2026-03-12 Seminis Vegetable Seeds, Inc. Novel qtls conferring resistance to cucurbit aphid-borne yellow virus
WO2026057679A1 (en) 2024-09-11 2026-03-19 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Inhibitor of rab30 for use in a method of treatment of metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease (masld)
WO2026077659A1 (en) 2024-09-17 2026-04-16 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Enrichment of genetically modified hematopoietic stem cells through epigenome editing
WO2026064425A2 (en) 2024-09-17 2026-03-26 Dxome Co., Ltd. Mirror image crispr-cas compositions
WO2026064736A1 (en) 2024-09-23 2026-03-26 Carbon Biosciences, Inc. Parvovirus compositions and related methods for gene therapy
WO2026064753A1 (en) 2024-09-23 2026-03-26 Tune Therapeutics, Inc. Dna methyltransferase-like protein (dnmt3l) or dna methyltransferase 3a (dnmt3a) repressor systems for epigenetic editing
WO2026064739A1 (en) 2024-09-23 2026-03-26 Carbon Biosciences, Inc. Parvovirus compositions and related methods for gene therapy
WO2026072529A1 (en) 2024-09-24 2026-04-02 University Of Florida Research Foundation, Incorporated Mettl7a for improved embryo competence
WO2026069163A1 (en) 2024-09-25 2026-04-02 Crispr Therapeutics Ag Differentiation method for producing immature beta cells
WO2026080515A2 (en) 2024-10-08 2026-04-16 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Crispr sam biosensor cells and cell lines and methods of use thereof
WO2026083309A1 (en) 2024-10-17 2026-04-23 Astrazeneca Ab Use of inhibitors or modulators of artemis in gene editing
CN119867017B (zh) * 2025-01-13 2025-11-18 西南医科大学 一种同时检测果蝇采食量和排泄物面积的方法

Family Cites Families (212)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US106048A (en) 1870-08-02 Materials of different
DE1133825B (de) 1960-06-15 1962-07-26 Danfoss Ved Ing M Clausen Elektromagnetisches Relais
US3687808A (en) 1969-08-14 1972-08-29 Univ Leland Stanford Junior Synthetic polynucleotides
US4952496A (en) 1984-03-30 1990-08-28 Associated Universities, Inc. Cloning and expression of the gene for bacteriophage T7 RNA polymerase
US5034506A (en) 1985-03-15 1991-07-23 Anti-Gene Development Group Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages
WO1988008450A1 (en) 1987-05-01 1988-11-03 Birdwell Finlayson Gene therapy for metabolite disorders
US5350689A (en) 1987-05-20 1994-09-27 Ciba-Geigy Corporation Zea mays plants and transgenic Zea mays plants regenerated from protoplasts or protoplast-derived cells
US5585362A (en) 1989-08-22 1996-12-17 The Regents Of The University Of Michigan Adenovirus vectors for gene therapy
US5451513A (en) 1990-05-01 1995-09-19 The State University of New Jersey Rutgers Method for stably transforming plastids of multicellular plants
US5767367A (en) 1990-06-23 1998-06-16 Hoechst Aktiengesellschaft Zea mays (L.) with capability of long term, highly efficient plant regeneration including fertile transgenic maize plants having a heterologous gene, and their preparation
US5489677A (en) 1990-07-27 1996-02-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleoside linkages containing adjacent oxygen and nitrogen atoms
US5602240A (en) 1990-07-27 1997-02-11 Ciba Geigy Ag. Backbone modified oligonucleotide analogs
US5222982A (en) 1991-02-11 1993-06-29 Ommaya Ayub K Spinal fluid driven artificial organ
JPH06505186A (ja) 1991-02-11 1994-06-16 オマーヤ，アユブ　ケー． 脊髄液駆動式人工器官
US5539082A (en) 1993-04-26 1996-07-23 Nielsen; Peter E. Peptide nucleic acids
US5719262A (en) 1993-11-22 1998-02-17 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having amino acid side chains
US5714331A (en) 1991-05-24 1998-02-03 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having enhanced binding affinity, sequence specificity and solubility
DE69233013T2 (de) 1991-08-20 2004-03-04 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of National Institute Of Health, Office Of Technology Transfer Adenovirus vermittelter gentransfer in den gastrointestinaltrakt
US7150982B2 (en) 1991-09-09 2006-12-19 Third Wave Technologies, Inc. RNA detection assays
US5252479A (en) 1991-11-08 1993-10-12 Research Corporation Technologies, Inc. Safe vector for gene therapy
FR2688514A1 (fr) 1992-03-16 1993-09-17 Centre Nat Rech Scient Adenovirus recombinants defectifs exprimant des cytokines et medicaments antitumoraux les contenant.
US7153684B1 (en) 1992-10-08 2006-12-26 Vanderbilt University Pluripotential embryonic stem cells and methods of making same
EP1024198A3 (en) 1992-12-03 2002-05-29 Genzyme Corporation Pseudo-adenoviral vectors for the gene therapy of haemophiliae
EP0705344B8 (en) 1993-06-24 2006-05-10 Advec Inc. Adenovirus vectors for gene therapy
AU687117B2 (en) 1993-10-25 1998-02-19 Canji, Inc. Recombinant adenoviral vector and methods of use
US5576198A (en) 1993-12-14 1996-11-19 Calgene, Inc. Controlled expression of transgenic constructs in plant plastids
US5545817A (en) 1994-03-11 1996-08-13 Calgene, Inc. Enhanced expression in a plant plastid
US5545818A (en) 1994-03-11 1996-08-13 Calgene Inc. Expression of Bacillus thuringiensis cry proteins in plant plastids
US5843780A (en) 1995-01-20 1998-12-01 Wisconsin Alumni Research Foundation Primate embryonic stem cells
US6583336B1 (en) 1995-08-30 2003-06-24 Basf Plant Science Gmbh Stimulation of homologous recombination in eukaryotic organisms or cells by recombination promoting enzymes
DE69728793T2 (de) 1996-08-29 2004-09-23 Bausch & Lomb Surgical, Inc. Frequenz- und leistungsregelunganordnung mit doppelkreis
JP3756313B2 (ja) 1997-03-07 2006-03-15 武 今西 新規ビシクロヌクレオシド及びオリゴヌクレオチド類縁体
JP4236812B2 (ja) 1997-09-12 2009-03-11 エクシコン エ／エス オリゴヌクレオチド類似体
CA2307807C (en) 1997-10-23 2008-09-02 Andrea G. Bodnar Methods and materials for the growth of primate-derived primordial stem cells in feeder-free culture
US20040186071A1 (en) 1998-04-13 2004-09-23 Bennett C. Frank Antisense modulation of CD40 expression
US20020182673A1 (en) 1998-05-15 2002-12-05 Genentech, Inc. IL-17 homologous polypedies and therapeutic uses thereof
US6667176B1 (en) 2000-01-11 2003-12-23 Geron Corporation cDNA libraries reflecting gene expression during growth and differentiation of human pluripotent stem cells
US7410798B2 (en) 2001-01-10 2008-08-12 Geron Corporation Culture system for rapid expansion of human embryonic stem cells
US7078387B1 (en) 1998-12-28 2006-07-18 Arch Development Corp. Efficient and stable in vivo gene transfer to cardiomyocytes using recombinant adeno-associated virus vectors
CA2361191A1 (en) 1999-02-03 2000-08-10 The Children's Medical Center Corporation Gene repair involving the induction of double-stranded dna cleavage at a chromosomal target site
US7229961B2 (en) 1999-08-24 2007-06-12 Cellgate, Inc. Compositions and methods for enhancing drug delivery across and into ocular tissues
US6593292B1 (en) 1999-08-24 2003-07-15 Cellgate, Inc. Compositions and methods for enhancing drug delivery across and into epithelial tissues
EP1083231A1 (en) 1999-09-09 2001-03-14 Introgene B.V. Smooth muscle cell promoter and uses thereof
US7256286B2 (en) 1999-11-30 2007-08-14 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Bryostatin analogues, synthetic methods and uses
US20020119570A1 (en) 2000-09-25 2002-08-29 Kyonggeun Yoon Targeted gene correction by single-stranded oligodeoxynucleotides
CA2881568C (en) 2000-10-27 2019-09-24 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Nucleic acids and proteins from streptococcus groups a & b
DE60233137D1 (de) 2001-02-16 2009-09-10 Univ R Transporter mit beabstandeten arginin-teilchen
IL159756A0 (en) 2001-07-12 2004-06-20 Univ Massachusetts IN VIVO PRODUCTION OF SMALL INTERFERING RNAs THAT MEDIATE GENE SILENCING
US7169874B2 (en) 2001-11-02 2007-01-30 Bausch & Lomb Incorporated High refractive index polymeric siloxysilane compositions
US20060253913A1 (en) 2001-12-21 2006-11-09 Yue-Jin Huang Production of hSA-linked butyrylcholinesterases in transgenic mammals
WO2003087341A2 (en) 2002-01-23 2003-10-23 The University Of Utah Research Foundation Targeted chromosomal mutagenesis using zinc finger nucleases
WO2003080809A2 (en) 2002-03-21 2003-10-02 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for using zinc finger endonucleases to enhance homologous recombination
US7539579B2 (en) 2002-04-09 2009-05-26 Beattie Kenneth L Oligonucleotide probes for genosensor chips
EP2806025B1 (en) 2002-09-05 2019-04-03 California Institute of Technology Use of zinc finger nucleases to stimulate gene targeting
US20070134796A1 (en) 2005-07-26 2007-06-14 Sangamo Biosciences, Inc. Targeted integration and expression of exogenous nucleic acid sequences
US8053232B2 (en) 2004-01-23 2011-11-08 Virxsys Corporation Correction of alpha-1-antitrypsin genetic defects using spliceosome mediated RNA trans splicing
US7972854B2 (en) 2004-02-05 2011-07-05 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for targeted cleavage and recombination
US7919277B2 (en) 2004-04-28 2011-04-05 Danisco A/S Detection and typing of bacterial strains
US7892224B2 (en) 2005-06-01 2011-02-22 Brainlab Ag Inverse catheter planning
US7534819B2 (en) 2005-06-10 2009-05-19 University Of Washington Compositions and methods for intracellular delivery of biotinylated cargo
US10022457B2 (en) 2005-08-05 2018-07-17 Gholam A. Peyman Methods to regulate polarization and enhance function of cells
KR20080045141A (ko) 2005-08-24 2008-05-22 톰슨 라이센싱 지상 방송 수신기를 갖는 로우빙 디바이스용 팝 스크린다이얼로그를 위한 방법 및 장치
DK2341149T3 (en) 2005-08-26 2017-02-27 Dupont Nutrition Biosci Aps Use of CRISPR-associated genes (Cas)
US20090227032A1 (en) 2005-12-13 2009-09-10 Kyoto University Nuclear reprogramming factor and induced pluripotent stem cells
US8278104B2 (en) 2005-12-13 2012-10-02 Kyoto University Induced pluripotent stem cells produced with Oct3/4, Klf4 and Sox2
US8048999B2 (en) 2005-12-13 2011-11-01 Kyoto University Nuclear reprogramming factor
US9677123B2 (en) 2006-03-15 2017-06-13 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Degenerate nucleobase analogs
DK2019683T4 (da) 2006-04-25 2022-08-29 Univ California Indgivelse af vækstfaktorer til behandling af CNS-lidelser
WO2007128338A1 (en) 2006-05-10 2007-11-15 Deinove Process for chromosomal engineering using a novel dna repair system
DK2426220T3 (en) 2006-05-19 2016-09-26 Dupont Nutrition Biosci Aps Labeled microorganisms, and methods for labeling
ES2465996T3 (es) 2006-05-25 2014-06-09 Sangamo Biosciences, Inc. Métodos y composiciones para la inactivación genética
WO2007144770A2 (en) 2006-06-16 2007-12-21 Danisco A/S Bacterium
US8481272B2 (en) 2006-08-04 2013-07-09 Georgia State University Research Foundation, Inc. Enzyme sensors, methods for preparing and using such sensors, and methods of detecting protease activity
WO2008060360A2 (en) 2006-09-28 2008-05-22 Surmodics, Inc. Implantable medical device with apertures for delivery of bioactive agents
CN101688241B (zh) 2007-03-02 2015-01-21 杜邦营养生物科学有限公司 具有改善的噬菌体抗性的培养物
WO2008148304A1 (en) 2007-05-31 2008-12-11 Xiamen University Rna interference target for treating aids
JP2008307007A (ja) 2007-06-15 2008-12-25 Bayer Schering Pharma Ag 出生後のヒト組織由来未分化幹細胞から誘導したヒト多能性幹細胞
ES2638977T3 (es) * 2007-12-04 2017-10-24 Biogen Chesapeake Llc Formulaciones y procedimientos mejorados para liofilización y liofilizados obtenidos por los mismos
US9683232B2 (en) 2007-12-10 2017-06-20 Kyoto University Efficient method for nuclear reprogramming
WO2009097468A2 (en) 2008-01-29 2009-08-06 Kliman Gilbert H Drug delivery devices, kits and methods therefor
WO2010011961A2 (en) * 2008-07-25 2010-01-28 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Prokaryotic rnai-like system and methods of use
SG191561A1 (en) * 2008-08-22 2013-07-31 Sangamo Biosciences Inc Methods and compositions for targeted single-stranded cleavage and targeted integration
US8383604B2 (en) 2008-09-15 2013-02-26 Children's Medical Center Corporation Modulation of BCL11A for treatment of hemoglobinopathies
US20100076057A1 (en) * 2008-09-23 2010-03-25 Northwestern University TARGET DNA INTERFERENCE WITH crRNA
US9404098B2 (en) 2008-11-06 2016-08-02 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Method for cleaving a target RNA using a Cas6 polypeptide
US10662227B2 (en) 2008-11-07 2020-05-26 Dupont Nutrition Biosciences Aps Bifidobacteria CRISPR sequences
WO2010066907A1 (en) 2008-12-12 2010-06-17 Danisco A/S Genetic cluster of strains of streptococcus thermophilus having unique rheological properties for dairy fermentation
WO2010075424A2 (en) 2008-12-22 2010-07-01 The Regents Of University Of California Compositions and methods for downregulating prokaryotic genes
GB0823658D0 (en) 2008-12-30 2009-02-04 Angiomed Ag Stent delivery device
EP2206723A1 (en) 2009-01-12 2010-07-14 Bonas, Ulla Modular DNA-binding domains
WO2010117646A1 (en) 2009-04-09 2010-10-14 Motorola, Inc. Retransmission technique for a communication network
EP2419511B1 (en) 2009-04-09 2018-01-17 Sangamo Therapeutics, Inc. Targeted integration into stem cells
PL2424571T3 (pl) 2009-04-30 2020-10-19 Ospedale San Raffaele S.R.L Wektor genowy
EP2456877A4 (en) 2009-07-24 2012-05-30 Sigma Aldrich Co Llc METHOD OF GENOMIC PROCESSING
US20120192298A1 (en) 2009-07-24 2012-07-26 Sigma Aldrich Co. Llc Method for genome editing
CA2769262C (en) 2009-07-28 2019-04-30 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for treating trinucleotide repeat disorders
US8586526B2 (en) 2010-05-17 2013-11-19 Sangamo Biosciences, Inc. DNA-binding proteins and uses thereof
US20110104787A1 (en) 2009-11-05 2011-05-05 President And Fellows Of Harvard College Fusion Peptides That Bind to and Modify Target Nucleic Acid Sequences
US20110294114A1 (en) 2009-12-04 2011-12-01 Cincinnati Children's Hospital Medical Center Optimization of determinants for successful genetic correction of diseases, mediated by hematopoietic stem cells
WO2011072246A2 (en) 2009-12-10 2011-06-16 Regents Of The University Of Minnesota Tal effector-mediated dna modification
EP2660318A1 (en) 2010-02-09 2013-11-06 Sangamo BioSciences, Inc. Targeted genomic modification with partially single-stranded donor molecules
US10087431B2 (en) 2010-03-10 2018-10-02 The Regents Of The University Of California Methods of generating nucleic acid fragments
MX2012013037A (es) 2010-05-10 2013-07-29 Univ California Composiciones de endorribonucleasa y metodos de uso de las mismas.
US20140148361A1 (en) 2010-06-07 2014-05-29 Barry L. Stoddard Generation and Expression of Engineered I-ONUI Endonuclease and Its Homologues and Uses Thereof
US9512444B2 (en) 2010-07-23 2016-12-06 Sigma-Aldrich Co. Llc Genome editing using targeting endonucleases and single-stranded nucleic acids
DK2601611T3 (da) 2010-08-02 2021-02-01 Integrated Dna Tech Inc Fremgangsmåder til forudsigelse af stabilitet og smeltetemperaturer for nukleinsyreduplekser
CN103261213A (zh) 2010-10-20 2013-08-21 杜邦营养生物科学有限公司 乳球菌CRISPR-Cas序列
KR20120096395A (ko) 2011-02-22 2012-08-30 주식회사 툴젠 뉴클레아제에 의해 유전자 변형된 세포를 농축시키는 방법
WO2012164565A1 (en) 2011-06-01 2012-12-06 Yeda Research And Development Co. Ltd. Compositions and methods for downregulating prokaryotic genes
CA2848417C (en) 2011-09-21 2023-05-02 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for regulation of transgene expression
US8450107B1 (en) 2011-11-30 2013-05-28 The Broad Institute Inc. Nucleotide-specific recognition sequences for designer TAL effectors
US9046593B2 (en) 2011-12-15 2015-06-02 The Boeing Company Method and apparatus for detecting and classifying signals
GB201122458D0 (en) 2011-12-30 2012-02-08 Univ Wageningen Modified cascade ribonucleoproteins and uses thereof
US20150166969A1 (en) 2012-02-24 2015-06-18 Fred Hutchinson Cancer Research Center Compositions and methods for the treatment of hemoglobinopathies
WO2013130824A1 (en) 2012-02-29 2013-09-06 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for treating huntington's disease
WO2013141680A1 (en) 2012-03-20 2013-09-26 Vilnius University RNA-DIRECTED DNA CLEAVAGE BY THE Cas9-crRNA COMPLEX
US9637739B2 (en) 2012-03-20 2017-05-02 Vilnius University RNA-directed DNA cleavage by the Cas9-crRNA complex
AU2013204327B2 (en) 2012-04-20 2016-09-01 Aviagen Cell transfection method
CN104245940A (zh) 2012-04-23 2014-12-24 拜尔作物科学公司 植物中的靶向基因组工程
SG11201406547YA (en) 2012-04-25 2014-11-27 Regeneron Pharma Nuclease-mediated targeting with large targeting vectors
MX369788B (es) 2012-05-02 2019-11-21 Dow Agrosciences Llc Modificacion dirigida de deshidrogenasa de malato.
AU2013259647B2 (en) 2012-05-07 2018-11-08 Corteva Agriscience Llc Methods and compositions for nuclease-mediated targeted integration of transgenes
US11120889B2 (en) 2012-05-09 2021-09-14 Georgia Tech Research Corporation Method for synthesizing a nuclease with reduced off-site cleavage
AU2013266968B2 (en) * 2012-05-25 2017-06-29 Emmanuelle CHARPENTIER Methods and compositions for RNA-directed target DNA modification and for RNA-directed modulation of transcription
CA2876860A1 (en) 2012-05-30 2013-12-05 Baylor College Of Medicine Supercoiled minivectors as a tool for dna repair, alteration and replacement
WO2013188037A2 (en) 2012-06-11 2013-12-19 Agilent Technologies, Inc Method of adaptor-dimer subtraction using a crispr cas6 protein
CN104540382A (zh) 2012-06-12 2015-04-22 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 用于产生条件性敲除等位基因的方法和组合物
EP2674501A1 (en) 2012-06-14 2013-12-18 Agence nationale de sécurité sanitaire de l'alimentation,de l'environnement et du travail Method for detecting and identifying enterohemorrhagic Escherichia coli
WO2013188638A2 (en) 2012-06-15 2013-12-19 The Regents Of The University Of California Endoribonucleases and methods of use thereof
US20150225734A1 (en) 2012-06-19 2015-08-13 Regents Of The University Of Minnesota Gene targeting in plants using dna viruses
EP3196301B1 (en) 2012-07-11 2018-10-17 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for the treatment of monogenic diseases
JP6329537B2 (ja) 2012-07-11 2018-05-23 サンガモ セラピューティクス， インコーポレイテッド 生物学的薬剤の送達のための方法および組成物
AU2013293270B2 (en) 2012-07-25 2018-08-16 Massachusetts Institute Of Technology Inducible DNA binding proteins and genome perturbation tools and applications thereof
WO2014022702A2 (en) 2012-08-03 2014-02-06 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for controlling gene expression by rna processing
SG10201701601WA (en) 2012-08-29 2017-04-27 Sangamo Biosciences Inc Methods and compositions for treatment of a genetic condition
UA119135C2 (uk) 2012-09-07 2019-05-10 ДАУ АГРОСАЙЄНСІЗ ЕлЕлСі Спосіб отримання трансгенної рослини
UA118090C2 (uk) 2012-09-07 2018-11-26 ДАУ АГРОСАЙЄНСІЗ ЕлЕлСі Спосіб інтегрування послідовності нуклеїнової кислоти, що представляє інтерес, у ген fad2 у клітині сої та специфічний для локусу fad2 білок, що зв'язується, здатний індукувати спрямований розрив
US9914930B2 (en) 2012-09-07 2018-03-13 Dow Agrosciences Llc FAD3 performance loci and corresponding target site specific binding proteins capable of inducing targeted breaks
EP3789405A1 (en) 2012-10-12 2021-03-10 The General Hospital Corporation Transcription activator-like effector (tale) - lysine-specific demethylase 1 (lsd1) fusion proteins
AU2013335451C1 (en) 2012-10-23 2024-07-04 Toolgen Incorporated Composition for cleaving a target DNA comprising a guide RNA specific for the target DNA and Cas protein-encoding nucleic acid or Cas protein, and use thereof
AP2015008495A0 (en) 2012-10-30 2015-05-31 Ct For Aquaculture Technologies Inc Control of sexual maturation in animals
CA2890160A1 (en) 2012-10-31 2014-05-08 Cellectis Coupling herbicide resistance with targeted insertion of transgenes in plants
US20140127752A1 (en) 2012-11-07 2014-05-08 Zhaohui Zhou Method, composition, and reagent kit for targeted genomic enrichment
PL3360964T3 (pl) 2012-12-06 2020-03-31 Sigma-Aldrich Co. Llc Modyfikacja i regulacja genomu oparta na crispr
WO2014093479A1 (en) 2012-12-11 2014-06-19 Montana State University Crispr (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) rna-guided control of gene regulation
WO2014093655A2 (en) 2012-12-12 2014-06-19 The Broad Institute, Inc. Engineering and optimization of systems, methods and compositions for sequence manipulation with functional domains
US20140310830A1 (en) 2012-12-12 2014-10-16 Feng Zhang CRISPR-Cas Nickase Systems, Methods And Compositions For Sequence Manipulation in Eukaryotes
WO2014093709A1 (en) 2012-12-12 2014-06-19 The Broad Institute, Inc. Methods, models, systems, and apparatus for identifying target sequences for cas enzymes or crispr-cas systems for target sequences and conveying results thereof
US20140186843A1 (en) 2012-12-12 2014-07-03 Massachusetts Institute Of Technology Methods, systems, and apparatus for identifying target sequences for cas enzymes or crispr-cas systems for target sequences and conveying results thereof
EP2931899A1 (en) 2012-12-12 2015-10-21 The Broad Institute, Inc. Functional genomics using crispr-cas systems, compositions, methods, knock out libraries and applications thereof
EP3031921B1 (en) 2012-12-12 2025-03-12 The Broad Institute, Inc. Delivery, engineering and optimization of systems, methods and compositions for sequence manipulation and therapeutic applications
CN113355357B (zh) 2012-12-12 2024-12-03 布罗德研究所有限公司 对用于序列操纵的改进的系统、方法和酶组合物进行的工程化和优化
EP2840140B2 (en) 2012-12-12 2023-02-22 The Broad Institute, Inc. Crispr-Cas based method for mutation of prokaryotic cells
US8697359B1 (en) 2012-12-12 2014-04-15 The Broad Institute, Inc. CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products
IL239344B2 (en) 2012-12-12 2024-06-01 Broad Inst Inc Systems engineering, methods and optimal guiding components for sequence manipulation
AR093946A1 (es) 2012-12-13 2015-07-01 Dow Agrosciences Llc Un proceso mejorado para el aislamiento del acido 4-amino-3-cloro-6-(4-cloro-2-fluor-3-metoxi-fenil)piridina-2-carboxilico
CN105074061B (zh) 2012-12-13 2021-03-09 美国陶氏益农公司 位点特异性核酸酶活性的dna检测方法
US8939652B2 (en) 2012-12-13 2015-01-27 Us Synthetic Corporation Roller bearing apparatuses including compliant rolling elements, and related methods of manufacture
DK2931891T3 (da) 2012-12-17 2019-08-19 Harvard College Rna-styret modificering af menneskelige genomer
NL2010038C2 (en) 2012-12-21 2014-06-24 Koni Bv Shock absorber.
ES2953523T3 (es) 2012-12-27 2023-11-14 Keygene Nv Método para inducir una translocación dirigida en una planta
CA2898184A1 (en) 2013-01-16 2014-07-24 Emory University Cas9-nucleic acid complexes and uses related thereto
CN103233028B (zh) 2013-01-25 2015-05-13 南京徇齐生物技术有限公司 一种无物种限制无生物安全性问题的真核生物基因打靶方法及螺旋结构dna序列
WO2014127287A1 (en) 2013-02-14 2014-08-21 Massachusetts Institute Of Technology Method for in vivo tergated mutagenesis
MX384291B (es) 2013-02-20 2025-03-14 Regeneron Pharma Modificación genética de ratas.
US10227610B2 (en) 2013-02-25 2019-03-12 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for enhancing nuclease-mediated gene disruption
US20140273230A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Sigma-Aldrich Co., Llc Crispr-based genome modification and regulation
WO2014144155A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Regents Of The University Of Minnesota Engineering plant genomes using crispr/cas systems
US20140364333A1 (en) 2013-03-15 2014-12-11 President And Fellows Of Harvard College Methods for Live Imaging of Cells
US9234213B2 (en) 2013-03-15 2016-01-12 System Biosciences, Llc Compositions and methods directed to CRISPR/Cas genomic engineering systems
US10760064B2 (en) 2013-03-15 2020-09-01 The General Hospital Corporation RNA-guided targeting of genetic and epigenomic regulatory proteins to specific genomic loci
US11332719B2 (en) 2013-03-15 2022-05-17 The Broad Institute, Inc. Recombinant virus and preparations thereof
CN112301024A (zh) 2013-03-15 2021-02-02 通用医疗公司 使用RNA引导的FokI核酸酶(RFN)提高RNA引导的基因组编辑的特异性
EP4286517A3 (en) 2013-04-04 2024-03-13 President and Fellows of Harvard College Therapeutic uses of genome editing with crispr/cas systems
CN105263312A (zh) 2013-04-05 2016-01-20 美国陶氏益农公司 用于在植物基因组内整合外源序列的方法和组合物
DK3456831T3 (da) 2013-04-16 2021-09-06 Regeneron Pharma Målrettet modifikation af rottegenom
CN103224947B (zh) 2013-04-28 2015-06-10 陕西师范大学 一种基因打靶系统
EP2994531B1 (en) 2013-05-10 2018-03-28 Sangamo Therapeutics, Inc. Delivery methods and compositions for nuclease-mediated genome engineering
CA2913234A1 (en) 2013-05-22 2014-11-27 Northwestern University Rna-directed dna cleavage and gene editing by cas9 enzyme from neisseria meningitidis
WO2014191021A1 (en) 2013-05-28 2014-12-04 Telefonaktiebolaget L M Ericsson (Publ) Method, apparatus and computer program for updating a prioritization level of a service data flow based on traffic size per time unit of said data flow
US9873907B2 (en) 2013-05-29 2018-01-23 Agilent Technologies, Inc. Method for fragmenting genomic DNA using CAS9
US9267135B2 (en) 2013-06-04 2016-02-23 President And Fellows Of Harvard College RNA-guided transcriptional regulation
WO2014204724A1 (en) 2013-06-17 2014-12-24 The Broad Institute Inc. Delivery, engineering and optimization of tandem guide systems, methods and compositions for sequence manipulation
EP3725885A1 (en) 2013-06-17 2020-10-21 The Broad Institute, Inc. Functional genomics using crispr-cas systems, compositions methods, screens and applications thereof
CN105492611A (zh) 2013-06-17 2016-04-13 布罗德研究所有限公司 用于序列操纵的优化的crispr-cas双切口酶系统、方法以及组合物
CN105683379A (zh) 2013-06-17 2016-06-15 布罗德研究所有限公司 用于对有丝分裂后细胞的疾病和障碍进行靶向和建模的系统、方法和组合物的递送、工程化和优化
NL2010994C2 (en) 2013-06-17 2014-12-18 Fuji Seal Europe Bv Container sleeving method and device.
RU2716420C2 (ru) 2013-06-17 2020-03-11 Те Брод Инститьют Инк. Доставка и применение систем crispr-cas, векторов и композиций для целенаправленного воздействия и терапии в печени
MX374532B (es) 2013-06-17 2025-03-06 Broad Inst Inc Suministro, uso y aplicaciones terapéuticas de los sistemas y composiciones crispr-cas, para actuar sobre trastornos y enfermedades utilizando componentes víricos.
WO2014204723A1 (en) 2013-06-17 2014-12-24 The Broad Institute Inc. Oncogenic models based on delivery and use of the crispr-cas systems, vectors and compositions
CN103343120B (zh) 2013-07-04 2015-03-04 中国科学院遗传与发育生物学研究所 一种小麦基因组定点改造方法
EP3666892A1 (en) 2013-07-10 2020-06-17 President and Fellows of Harvard College Orthogonal cas9 proteins for rna-guided gene regulation and editing
US10421957B2 (en) 2013-07-29 2019-09-24 Agilent Technologies, Inc. DNA assembly using an RNA-programmable nickase
NZ746567A (en) 2013-11-04 2019-09-27 Dow Agrosciences Llc Optimal soybean loci
UY35812A (es) 2013-11-04 2015-05-29 Dow Agrosciences Llc ?loci de maíz óptimos?.
CN105980395A (zh) 2013-11-04 2016-09-28 美国陶氏益农公司 最优大豆座位
CN106459995B (zh) 2013-11-07 2020-02-21 爱迪塔斯医药有限公司 使用统治型gRNA的CRISPR相关方法和组合物
CA2930877A1 (en) 2013-11-18 2015-05-21 Crispr Therapeutics Ag Crispr-cas system materials and methods
US10787684B2 (en) 2013-11-19 2020-09-29 President And Fellows Of Harvard College Large gene excision and insertion
KR102170502B1 (ko) 2013-12-11 2020-10-28 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 게놈의 표적화된 변형을 위한 방법 및 조성물
EP3470089A1 (en) 2013-12-12 2019-04-17 The Broad Institute Inc. Delivery, use and therapeutic applications of the crispr-cas systems and compositions for targeting disorders and diseases using particle delivery components
US20150165054A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 President And Fellows Of Harvard College Methods for correcting caspase-9 point mutations
CA2935032C (en) 2013-12-26 2024-01-23 The General Hospital Corporation Multiplex guide rnas
US9850525B2 (en) 2014-01-29 2017-12-26 Agilent Technologies, Inc. CAS9-based isothermal method of detection of specific DNA sequence
US20150291969A1 (en) 2014-01-30 2015-10-15 Chromatin, Inc. Compositions for reduced lignin content in sorghum and improving cell wall digestibility, and methods of making the same
US20150225801A1 (en) 2014-02-11 2015-08-13 California Institute Of Technology Recording and mapping lineage information and molecular events in individual cells
WO2015127439A1 (en) 2014-02-24 2015-08-27 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for nuclease-mediated targeted integration
CN106459894B (zh) 2014-03-18 2020-02-18 桑格摩生物科学股份有限公司 用于调控锌指蛋白表达的方法和组合物
WO2015153789A1 (en) 2014-04-01 2015-10-08 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating herpes simplex virus type 1 (hsv-1)
DE102015226614A1 (de) 2015-12-23 2017-06-29 Robert Bosch Gmbh Verfahren zum Betreiben eines Kraftfahrzeugs, Steuerungseinheit für ein Antriebssystem und ein Antriebssystem
US10250380B2 (en) 2016-12-12 2019-04-02 Qualcomm Incorporated Techniques for unified synchronization channel design in new radio
US11352698B2 (en) 2019-04-25 2022-06-07 Samsung Electronics Co., Ltd. Atomic layer deposition apparatus and methods of fabricating semiconductor devices using the same

Also Published As

Publication number Publication date
US11473108B2 (en) 2022-10-18
CN107603976A (zh) 2018-01-19
US20220259620A1 (en) 2022-08-18
US10415061B2 (en) 2019-09-17
US20190330662A1 (en) 2019-10-31
US20190106712A1 (en) 2019-04-11
US20220127645A1 (en) 2022-04-28
US11549127B2 (en) 2023-01-10
US20190106715A1 (en) 2019-04-11
US11008590B2 (en) 2021-05-18
EP3401400A1 (en) 2018-11-14
AU2017225060B2 (en) 2019-01-17
US20200299733A1 (en) 2020-09-24
US20210108231A1 (en) 2021-04-15
EA201401319A1 (ru) 2015-05-29
EP3241902B1 (en) 2018-02-28
US10113167B2 (en) 2018-10-30
NZ728024A (en) 2019-05-31
US10900054B2 (en) 2021-01-26
PT3597749T (pt) 2023-10-24
US20190264233A1 (en) 2019-08-29
US20190010520A1 (en) 2019-01-10
CN107603976B (zh) 2021-10-12
US20220073952A1 (en) 2022-03-10
UA118014C2 (uk) 2018-11-12
DK2800811T3 (en) 2017-07-17
PL3241902T3 (pl) 2018-09-28
US20180230496A1 (en) 2018-08-16
US20190169647A1 (en) 2019-06-06
ES2728782T3 (es) 2019-10-28
US20210222205A1 (en) 2021-07-22
US10612045B2 (en) 2020-04-07
US20190093129A1 (en) 2019-03-28
US20210332390A1 (en) 2021-10-28
US10533190B2 (en) 2020-01-14
US20190169644A1 (en) 2019-06-06
DK3401400T3 (da) 2019-06-03
US20190256870A1 (en) 2019-08-22
KR20150016588A (ko) 2015-02-12
US20190002922A1 (en) 2019-01-03
EP3597749A1 (en) 2020-01-22
HUE064300T2 (hu) 2024-03-28
HK1204003A1 (zh) 2015-11-06
HK1207107A1 (zh) 2016-01-22
ES3028090T3 (en) 2025-06-18
JP6887479B2 (ja) 2021-06-16
GEP20217251B (en) 2021-04-26
US20200071728A1 (en) 2020-03-05
SG10201809817UA (en) 2018-12-28
JP2015523856A (ja) 2015-08-20
IL261569A (en) 2018-10-31
IL261569B (en) 2021-09-30
IL261570A (en) 2018-10-31
CY1120291T1 (el) 2019-07-10
US20210062223A1 (en) 2021-03-04
US20200308606A1 (en) 2020-10-01
JP2025148318A (ja) 2025-10-07
EP4289948A3 (en) 2024-04-17
US20220267928A1 (en) 2022-08-25
US20200354747A1 (en) 2020-11-12
HRP20231042T1 (hr) 2024-01-05
AU2013266968B2 (en) 2017-06-29
US20180208931A1 (en) 2018-07-26
TR201806812T4 (tr) 2018-06-21
CA2872241A1 (en) 2013-11-28
GB2518764B (en) 2016-03-02
US20180237801A1 (en) 2018-08-23
US20230212614A1 (en) 2023-07-06
US10513712B2 (en) 2019-12-24
SI3597749T1 (sl) 2023-11-30
US10400253B2 (en) 2019-09-03
US11634730B2 (en) 2023-04-25
US10358658B2 (en) 2019-07-23
LT2800811T (lt) 2017-09-11
EP3241902A1 (en) 2017-11-08
EP3597749B1 (en) 2023-07-26
US20200354749A1 (en) 2020-11-12
US10526619B2 (en) 2020-01-07
US11028412B2 (en) 2021-06-08
US20160130608A1 (en) 2016-05-12
US10385360B2 (en) 2019-08-20
RS64622B1 (sr) 2023-10-31
IL261565A (en) 2018-10-31
US20180312875A1 (en) 2018-11-01
US20200080113A1 (en) 2020-03-12
CA2872241C (en) 2022-12-06
PT2800811T (pt) 2017-08-17
IL261568B (en) 2021-09-30
US12180504B2 (en) 2024-12-31
US11401532B2 (en) 2022-08-02
US20190264234A1 (en) 2019-08-29
US20200308607A1 (en) 2020-10-01
US20180251793A1 (en) 2018-09-06
RS66774B1 (sr) 2025-05-30
ES2960803T3 (es) 2024-03-06
AU2017225060A1 (en) 2017-09-28
ES2670718T3 (es) 2018-05-31
DE202013012241U1 (de) 2016-01-18
US20190106711A1 (en) 2019-04-11
AU2019201850A1 (en) 2019-04-11
US20220112521A1 (en) 2022-04-14
US20180230497A1 (en) 2018-08-16
LT3597749T (lt) 2023-10-10
US20190169649A1 (en) 2019-06-06
PT3401400T (pt) 2019-06-12
US20180273981A1 (en) 2018-09-27
US20160060654A1 (en) 2016-03-03
US10982231B2 (en) 2021-04-20
US10988780B2 (en) 2021-04-27
LT3401400T (lt) 2019-06-10
US12215343B2 (en) 2025-02-04
US20180245100A1 (en) 2018-08-30
US10358659B2 (en) 2019-07-23
HUE038850T2 (hu) 2018-11-28
MX2019012772A (es) 2019-12-16
US20210388394A1 (en) 2021-12-16
US10337029B2 (en) 2019-07-02
US10443076B2 (en) 2019-10-15
US10597680B2 (en) 2020-03-24
MX2014014477A (es) 2015-08-20
JP2020039351A (ja) 2020-03-19
US10487341B2 (en) 2019-11-26
US11186849B2 (en) 2021-11-30
AU2021200952B2 (en) 2023-07-13
JP2018138054A (ja) 2018-09-06
US20200277631A1 (en) 2020-09-03
EP4570908A2 (en) 2025-06-18
CO7151523A2 (es) 2014-12-29
PT3241902T (pt) 2018-05-28
IL261568A (en) 2018-10-31
AU2019201850B2 (en) 2020-11-19
EP4043564A1 (en) 2022-08-17
NZ714353A (en) 2017-05-26
PH12014502574A1 (en) 2015-01-21
US10550407B2 (en) 2020-02-04
HRP20250549T1 (hr) 2025-06-20
US11479794B2 (en) 2022-10-25
DE202013012242U1 (de) 2016-02-02
HRP20180794T1 (hr) 2018-07-13
US20240417756A1 (en) 2024-12-19
GB201601071D0 (en) 2016-03-02
US20190256871A1 (en) 2019-08-22
US11008589B2 (en) 2021-05-18
EP2800811A1 (en) 2014-11-12
US20250146024A1 (en) 2025-05-08
US20180312876A1 (en) 2018-11-01
US10626419B2 (en) 2020-04-21
MY184753A (en) 2021-04-20
PE20150336A1 (es) 2015-03-25
US10570419B2 (en) 2020-02-25
PE20190844A1 (es) 2019-06-17
US10351878B2 (en) 2019-07-16
US20200308605A1 (en) 2020-10-01
US20190169646A1 (en) 2019-06-06
PL2800811T3 (pl) 2017-11-30
US10982230B2 (en) 2021-04-20
IL235461B (en) 2019-01-31
US20210079428A1 (en) 2021-03-18
US20210388395A1 (en) 2021-12-16
US20190264235A1 (en) 2019-08-29
CY1121657T1 (el) 2020-07-31
DE202013012240U1 (de) 2016-02-02
HUE043861T2 (hu) 2019-09-30
IL261565B (en) 2021-09-30
JP2021121205A (ja) 2021-08-26
GB201511669D0 (en) 2015-08-19
EP2800811A4 (en) 2015-09-23
LT4289948T (lt) 2025-05-12
AU2023248113A1 (en) 2023-11-09
US11242543B2 (en) 2022-02-08
CR20140538A (es) 2015-02-18
EP4570908A3 (en) 2025-10-22
US11001863B2 (en) 2021-05-11
EP2800811B1 (en) 2017-05-10
US12123015B2 (en) 2024-10-22
US20210087588A1 (en) 2021-03-25
US20220049276A1 (en) 2022-02-17
GB2518764A8 (en) 2015-07-22
US20200190542A1 (en) 2020-06-18
US20190106714A1 (en) 2019-04-11
US10519467B2 (en) 2019-12-31
RS56119B1 (sr) 2017-10-31
US20220010338A1 (en) 2022-01-13
MA37663A1 (fr) 2017-05-31
US20170051312A1 (en) 2017-02-23
US20170051310A1 (en) 2017-02-23
BR112014029441B1 (pt) 2022-10-18
EA038924B1 (ru) 2021-11-10
WO2013176772A1 (en) 2013-11-28
FI3597749T3 (fi) 2023-10-09
US20180251791A1 (en) 2018-09-06
US20190169643A1 (en) 2019-06-06
US20210310028A1 (en) 2021-10-07
US20190264236A1 (en) 2019-08-29
SG10201701800YA (en) 2017-04-27
CL2014003208A1 (es) 2015-06-19
ME02836B (me) 2018-01-20
HK1211978A1 (zh) 2016-06-03
US20180298406A1 (en) 2018-10-18
US20160138008A1 (en) 2016-05-19
US11293034B2 (en) 2022-04-05
US10640791B2 (en) 2020-05-05
US20160068864A1 (en) 2016-03-10
US20220119847A1 (en) 2022-04-21
JP6343605B2 (ja) 2018-06-13
IL261566B (en) 2022-04-01
EP3401400B1 (en) 2019-04-03
US20140068797A1 (en) 2014-03-06
PH12014502574B1 (en) 2019-08-09
US20180230495A1 (en) 2018-08-16
US10752920B2 (en) 2020-08-25
US10227611B2 (en) 2019-03-12
MX369077B (es) 2019-10-25
KR20170134766A (ko) 2017-12-06
US20190169648A1 (en) 2019-06-06
HRP20171163T1 (hr) 2017-10-06
US10774344B1 (en) 2020-09-15
US10421980B2 (en) 2019-09-24
TN2014000493A1 (en) 2016-03-30
HRP20190965T1 (hr) 2019-10-04
SI4289948T1 (sl) 2025-07-31
US10428352B2 (en) 2019-10-01
US20210062224A1 (en) 2021-03-04
GB2537000A (en) 2016-10-05
SI3401400T1 (sl) 2019-10-30
MX349744B (es) 2017-08-10
SI3241902T1 (en) 2018-07-31
US20190169642A1 (en) 2019-06-06
US11970711B2 (en) 2024-04-30
DK3597749T5 (da) 2024-09-02
US20250122537A1 (en) 2025-04-17
US11674159B2 (en) 2023-06-13
US10000772B2 (en) 2018-06-19
RS57287B1 (sr) 2018-08-31
US20210230639A1 (en) 2021-07-29
US20220267808A1 (en) 2022-08-25
IL261563A (en) 2018-10-31
GB2518764A (en) 2015-04-01
JP6692856B2 (ja) 2020-05-13
GB2518764C (en) 2016-08-24
IL261570B (en) 2021-10-31
IL261567A (en) 2018-10-31
GB2537000C (en) 2019-10-09
US20220119846A1 (en) 2022-04-21
US20210340575A1 (en) 2021-11-04
US20190169641A1 (en) 2019-06-06
US20170166893A1 (en) 2017-06-15
AU2021200952A1 (en) 2021-03-04
US10563227B2 (en) 2020-02-18
LT3241902T (lt) 2018-06-25
AU2013266968A1 (en) 2014-11-20
ES2636902T3 (es) 2017-10-10
PL4289948T3 (pl) 2025-06-02
EP4289948B1 (en) 2025-02-26
US20180251795A1 (en) 2018-09-06
DK3597749T3 (da) 2023-09-25
US20210062225A1 (en) 2021-03-04
PL3401400T3 (pl) 2019-12-31
US20160060653A1 (en) 2016-03-03
US20160130609A1 (en) 2016-05-12
GB2537000B (en) 2017-03-08
US10577631B2 (en) 2020-03-03
US10301651B2 (en) 2019-05-28
US20230227859A1 (en) 2023-07-20
US20220025407A1 (en) 2022-01-27
US20210332391A1 (en) 2021-10-28
US20190002923A1 (en) 2019-01-03
US11814645B2 (en) 2023-11-14
ME03530B (me) 2020-04-20
MX362866B (es) 2019-02-20
FI4289948T3 (fi) 2025-04-29
MA37663B1 (fr) 2019-12-31
DK3241902T3 (en) 2018-05-07
US20180282764A1 (en) 2018-10-04
US10407697B2 (en) 2019-09-10
US20190062790A1 (en) 2019-02-28
GB201420270D0 (en) 2014-12-31
US20220119845A1 (en) 2022-04-21
US20200354748A1 (en) 2020-11-12
US11274318B2 (en) 2022-03-15
US12180503B2 (en) 2024-12-31
ECSP14028704A (es) 2015-09-30
US20210062226A1 (en) 2021-03-04
US10988782B2 (en) 2021-04-27
PE20190843A1 (es) 2019-06-17
CY1119282T1 (el) 2018-02-14
CN104854241A (zh) 2015-08-19
US20190106713A1 (en) 2019-04-11
DK4289948T3 (da) 2025-04-28
MY189533A (en) 2022-02-16
US20180298407A1 (en) 2018-10-18
US20190002921A1 (en) 2019-01-03
US10793878B1 (en) 2020-10-06
US20200362370A1 (en) 2020-11-19
IL261566A (en) 2018-10-31
EP4289948A2 (en) 2023-12-13
CN104854241B (zh) 2017-07-14
US11332761B2 (en) 2022-05-17
US20190256869A1 (en) 2019-08-22
US20220267807A1 (en) 2022-08-25
IL261567B (en) 2020-11-30
US20190284583A1 (en) 2019-09-19
PT4289948T (pt) 2025-05-16
US20200299734A1 (en) 2020-09-24
PL3597749T3 (pl) 2023-11-27
US20190271008A1 (en) 2019-09-05
US20160046961A1 (en) 2016-02-18
US20200325495A1 (en) 2020-10-15
US10266850B2 (en) 2019-04-23
BR112014029441A2 (pt) 2017-06-27
US20180251794A1 (en) 2018-09-06
US10308961B2 (en) 2019-06-04
SI2800811T1 (sl) 2017-10-30
US10669560B2 (en) 2020-06-02
US20220119848A1 (en) 2022-04-21
PE20190842A1 (es) 2019-06-17
JP2023123755A (ja) 2023-09-05
SG11201407702XA (en) 2014-12-30
US20190169645A1 (en) 2019-06-06
US20180312874A1 (en) 2018-11-01
US10676759B2 (en) 2020-06-09
US20180245101A1 (en) 2018-08-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11549127B2 (en) Methods and compositions for RNA-directed target DNA modification and for RNA-directed modulation of transcription
HK40071464A (en) Methods and compositions for rna-directed target dna modification and for rna-directed modulation of transcription
HK1230233A1 (en) Methods and compositions for rna-directed target dna modification and for rna-directed modulation of transcription
HK1230233A (en) Methods and compositions for rna-directed target dna modification and for rna-directed modulation of transcription