JPH01171488A - 組換えプラスミド及びそれにより形質転換された枯草菌 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ■　産業上の利用分野 この発明は、多糖体プルラン及びでん粉のα−１，４お
よびα−１，６グルコシド結合を切断する能力をもつプ
ルラナーゼ類似酵素（以下、ネオプルラナーゼという）
の製造と、かかる酵素を生産するプラスミド並びにその
プラスミドを有する枯草菌に関するものである。

■　従来の技術および本発明が解決しようとする問題点 従来、プルランに作用する酵素としては、プルランの末
端からグルコース単位で作用するグルコアミラーゼ、α
−１，６グルコシド結合だけを切断するプルラナーゼ、
プルラン中のα−１，４グルコ享 シト結合を切断しインパノースをＸえるインプルラナー
ゼ、パノース（６２−ａ　−Ｇｌｕｃｏｓｙｌ　ｍａｌ
ｔｏ−ｓｅ　）　　を生成するサーモアクチノミセス　
ヴルガリカス（Ｔｈ２ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ　：１ｇ
ａｒｉｃａｓ　）　　のアミラーゼ（ＴＶＡ）などが知
られている。

本発明の酵素はプルランに作用してパノースを生成する
点ではＴＶＡと同様であるが、同時に本酵素はグルコー
ス、マルトースを生成する点で全（ＴＶＡと異り、新し
い作用特異性をもつ新規酵素である。また本酵素はでん
粉にも作用しα−７ミラーゼの一種ともいえる。

α−アミラーゼはでん粉糖化産業などにおいて広く用い
られる酵素であるので、本酵素単独嘩至は他の各種酵素
と混合使用することにより色々な用途が開発されるもの
と期待される。

■　問題点を解決するための手段および作用本発明は新
規なプラスミド、それを有する枯草菌及びそれを利用し
て耐熱性のネオプルラナーゼを製造する方法に関するも
のである。

本発明者等は、プルランを分解し主としてパノースを生
成する耐熱性のあるネオプルラナーゼを分泌するバチル
ス　ステアロサーモフィルスＴＲ５４０を大阪市鶴見区
の堆肥より分離したのであるが、本酵素は従来報告され
ているどのプルラナーゼともその活性が異りており、本
発明者等によってネオプルラナーゼと命名された酵素で
ある。

なお、バチルス　ステアロサーモフィルスＴＲ３４０は
次のような菌学的性質を有している。

−１形態学的性質 １）細胞の形及び大きさ・・・・・・（０，６〜１．０
　）　Ｘ　（２〜３．５）μの桿菌。連鎖性なく莢膜は
少い。加糖肉汁寒天培地では肉汁寒天培地と同一の桿菌
の形を示す。

２）運動性・・・・・・あり。

３）胞子−−（０，４〜０．５　）　Ｘ　（０，５〜０
．６　）　ｐの長円形で末端付近に存在し膜壁はうすい
。６０℃・１６時間で形成するものが多い。胞子のうの
ふくらみは認められる。

４）ダラム染色性・・・・・・陽性。

二、生育状態 １）肉汁寒天平板培養・・・・・・生育良好。表面はや
や乾き白色に近い。

２）肉汁寒天斜面培養・・・・・・拡布状となり表面の
光沢な、し。

８）肉汁液体培養・・・・・・Ｐ　Ｈ７，０で生育良好
。液は混濁する。

４）ゼラチン穿刺培養・・・・・・ゼラチンを液化する
。

５）食塩肉汁液体培養・・・・・・７％の食塩水濃度で
は生育しない。

６）グルコース・アスパラギン寒天培地・・・・・・生
育不良。

７）グルコースやナイトレイト寒天培地・・・・・・僅
かに生育。

三、生理学的性質 ｌ）硝酸塩の還元・・・・・・陽性。

２）でん粉の加水分解・・・・・・でん粉を含むシャー
レ上で生育させるときヨード呈色は陰性。

３）クエン酸の醗酵性・・・・・・陽性。

４）カタラーゼの生成・・・・・・陰性。

５）生育の範囲・・・・・・トリプシン、酵母エキス、
食塩を含む培地で６５℃まで生育。最適生育温度は６０
　℃。

６）糖の醗酵性・・・・・・グルコース、ラクトース、
しよ糖から酸を形成。ただし、ガス発生を伴わない。

７）７セチルメチルカルビノールの生成・・・・・・陽
性。

８）ゼラチンの分解・・・・・・陽性。

以上の結果をパージニーのマニアルｅオプ・システマテ
イツク・バクテリオデターミネーションし 第２巻（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｓｙ
ｓｔｅｍａｔｇｃ　Ｂａｃｔｅｒ−赤ｏｄｅｔ＋ｒｍｉ
ｎａｔｉｏｎ　ｖｏｌ　２．　（１９８６）　）と照合
して本国はバチルス　ステアルサーモフィルス（Ｂ−ａ
ｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ
　）　　と同定した０つぎに本菌株の生産する酵素を詳
細に説明する。

−１作用及び基質特異性 本酵素はプルランに作用し、最終的にパノース、グルコ
ース、マルトースを生じる。量的にはパノースが最も多
い。

でん粉に作用させると主としてマルトースとグルコース
を生じるが、反応後期には分枝デキストリンとしてバ０
ノース及びインマルトシルマルトース（ｊｓｏｍａｌｔ
ｏｓｙｌ　ｍａｌｔｏｓｅ　略称ＩＭＭ）を生成する。

還元糖の生成に較べてヨード呈色の減少が速かでα−ア
ミラーゼの一種と考えられる。一般にα−アミラーゼは
比較的でん粉をよく加水分解する糖化型と、でん粉の液
化速度は大きいが糖化度の低い液化型に大別される。そ
して、前者をでん粉に作用させた場合、得られる最小の
低分子ｙ４ットデキストリンはＩＭＭである。本発明の
酵素はでん粉に作用させると最初からグルコースやマル
トースを生成し、糖化型のグループに属するが、最小の
リミットデキストリンはＩＭＭではなくパノースである
。この点において著だ特異なα−７ミラーゼである。更
に、本酵素はプルランとでん粉に同濃度、同条件で作用
させると、プルランに対してでん粉に対すると同等もし
くはそれ以上に作用する。ＴＶＡはでん粉への作用の方
がプルランへの作用より著しく大きい。この意味でＴＶ
Ａはα−アミラーゼの一種と考えられるのに対し、本酵
素はプルラナーゼの一種であり、これを従来のプルラナ
ーゼと区別するため、ネオプルラナーゼと命名した。

また、本酵素をβ−サイクシデキストリンにマルトース
がα−１，６グルフシル結合で結合したマルトシル−β
−サイクロデキストリンに作用させると、まずそのα−
１，６結合を切断し、マルトースとβ−サイクロデキス
トリンを生じる。ついでβ−サイクロデキストリンも再
分解を受け、グルコース、マルトース及びマルトトリオ
ースを与える。

即ち、本酵素は主としてマルトースを認識し、マルトー
スがα−１，４結合で結合していてもα−１，６結合で
結合していても、その結合を切断する新しい作用特異性
をもつ酵素と考えることができる。

二、作用ＰＨ Ｐ　Ｈ５，０〜７．５゜測定は０．０５　Ｍ酢酸ナトリ
ウム−酢酸緩衝液（ＰＨ４〜６）又はリン酸２ナトリウ
ム−リン酸１カリウム緩衝液（ＰＨ６〜８）を用い、０
．５％プルラン中で６０−℃、１５分間反応させる。生
成した還元糖はＤＮＳ法で測定。

三、作用最適ＰＨ。

前記二の条件でおよそＰ　Ｈ６，０゜ 四、作用温度 ０．１Ｍリン酸緩衝液（Ｐ　Ｈ６，０）、０．５％プル
ラン中で各種温度下１６分間反応させたところ、７５℃
まで反応した。

五、作用最適温度 前記の条件下６０〜６５℃であった。

六、熱安定性 ０、２　Ｍ酢酸緩衝液（Ｐ　Ｈ６，０＞中で各種温度で
６０分間加熱し残存活性を測定したところ、６５℃にお
いて６０％の活性が残存していた。更にこの系に１ｍＭ
、ＥＤＴＡを加えると９０％以上活性は残存した。

七、ＰＨ安定性 Ｐ　Ｈ５，５よす９．０の間で安定（各種緩衝液を用い
ＰＨを調整し、６０℃−６０分放置後、Ｐ　Ｈ７゜０に
調整し残存活性を測定した）。

八、精製方法 培養上澄液を硫安分画（８５〜６０％飽和）した後、沈
でん物を少量の水に溶解し透析後、ＰＨ８，０でＤ　Ｅ
　Ａ　Ｅ　−ｃｅｌｌｕｌｏｓｅに吸着させた。ついで
食塩濃度を０．６　Ｍまで漸次上昇させて酵素を溶出し
た。さらにセファデックスＧ−２０００カラムクロマト
グラフイーを２回繰返した後、α−サイクロデキストリ
ンを結合したセファロース６Ｂ（５ｅｐｈａｒｏｓｅ　
６　Ｂ　）カラムでアフイ會ティクロマトグラフィを行
った。

溶出液の蛋白質の吸収は１個のピークを示し、酵素活性
のピークと完全に一致した。この活性区分を５ＤＳ−Ｐ
ＡＧＥにより電気泳動を行うと単一バンドを示した。

九、分子量 ６２０００ｄａｌｔｏｒ％（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法）士、
生産物 プルランからはパノースの他グルコース、マルトースを
与えた。また、でん粉からグルコース、マルトース、パ
ノース、ＩＭＭを与えた。

十−１力価測定方法 １％プルラン（０，２Ｍ酢酸緩衝液（Ｐ　Ｈ６，０）に
溶解）　０．２５　ｍ　ｌに酵素液０．２５　ｍ　／を
加え、６０℃・１５分間反応させ、生ずる還元力の増加
をＤＮＳ法により定量した。上記反応で１分間当’ｌｌ
１ｍｍｏｌの還元糖を生ずる酵素力を１単位とした。

以上の理化学的性質から、本発明酵素はこれまでに報告
されたことのない新規なプルラナーゼであるといえる。

本発明では、かかる耐熱性のあるネオプルラナーゼの遺
伝子をバチルス　ステアロサーモフィルス、殊にバチル
ス　ステアロサーモフィルスＴＲ８４０から調製し、制
限酵素ヒンドＩＩＩを用いて切断する。ヒンドＩＩＩを
使用するのは、酵素の分子量の大きさ、生成蛋白質の細
胞外への分泌に必要なキャリアー蛋白質に相当する遺伝
情報（シグナル配列）などを有効に保持した遺伝子の断
片が得られるためである。切断処理法は常法による。

切断した断片をショットガン方式でベクタープＧｅｎｅ
ｒａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ｓ　　第１８１巻
、第１７５７頁、１９８５年刊行に記載あり）に組換え
、枯草菌を宿主として複製維持できる組換えプラスミド
を作成する。目的とするプラスミドは、分子量約２．２
　Ｍ　ｄで制限酵素Ｅ　ｃｏ　ＲＩに対する切断箇所が
２ケ所であり％ＥＣ０ＲＩで処理したと　きのＤＮＡ断
片′の分子量が０．８．０．４及び１．０（Ｍｄ）で示
されうるＤＮＡ断片を含む組換えプラスミドＰＩＧと命
名された組換えプラスミドは、遺伝子的 工学場一般的な手法により目的物質生産を可能とするた
めの所望性質（コピー数、薬剤耐性の種類、図に示す。

本願の第２発明（本願の特許請求の範囲の第４項に記載
のものをいう。以下おなじ）は、前述の組換えプラスミ
ドで形質転換せしめた新規の微生物である。この場合、
宿主枯草菌はアミラーゼ生産能を失った枯草菌であれば
菌株の如何を問わず利用できる。かかる欠損株は常法に
より容易に取得できる。

本願の第８発明（特許請求の範囲の第６項に記載のもの
をいう。以下おなじ）は、第２発明の枯草菌を使用した
ネオプルラナーゼの製造法に関するものである。即ち、
第２発明になる菌が生育しうる栄養培地として、たとえ
ば炭素源としてでん粉、可溶性でん粉、デキストリン、
酸処理でん粉などの炭水化物を１〜１０％、窒素源とし
て大豆粕、大豆粕抽出物、乾燥酵母、ミルクカゼイン、
ペプトン、肉エキス、コーンステイープリカー、ペプチ
ド含有物、アミノ酸類の単独ないし適宜の混和物を添加
し、その他必要に応じて少量の無機塩類を適量添加した
ものを使い、これに菌体を接種し、Ｐ　Ｈ６，５〜７．
８．３７℃で２４〜７２時間通気攪拌培養することによ
り、ネオプルラナーゼを生成蓄積せしめるのである。こ
の培養物からネオプルラナーゼを回収・精製するには、
培養Ｆ液を硫安により分画・沈でん、アルコール沈でん
、膜濃縮法などの通常の手段によつて行えばよい。

■　実施例 実施例１（組換えプラスミドの生成と形質転換された枯
草菌の培養） まずバチルス　ステアロサーモフィルスＴＲ５４０の染
色体ＤＮＡを以下により調製する。

バチルス　ステアロサーモフィルスＴＲ３４０を１００
　ｍ　ｌ　Ｌ培地を含む５００ｍＡ’容フラスコ中で一
夜、６０℃で培養した。これを遠心集菌し、２０　ｍ　
ｌのＴＥ緩衝液（ＩＬｉｍＭトリス、１ｍＭ−ＥＤＴＡ
、ＰＨ８，５）で洗浄し、ａｍｌの１５％しよ糖−５０
ｍ　Ｍ　）リス（ＰＨ８，５）　−５０Ｍ−ＥＤＴＡ−
１ｍＪ’／ｍ！リゾチームに愁眉し、水中で３０分間静
置した。これにａｍｌの１％ザル−ｘ　シｋ　−５０ｍ
Ｍ　）リス（ＰＨ８，５）　−５０ｍＭ・ＥＤＴＡを添
加し、混合した。ついで５．４ｔＣｓＣ１を加え０．８
　ｍ　／のエチジウムブロマイドダ 液（１０ｍり／ｍりを加え、ＲＰ６ｆｌＴローター（日
立製作新製）で超遠心場で分離した。超遠心終了後、Ｄ
ＮＡ区分を注射針で抜き取＋１）、ｎ−ブタノールで３
回抽出を繰り返してエチジウムブロマイドを除去した。

このＤＮＡ試料を１０ｍＭトリ、ｘ、　（Ｐ　Ｈ７，５
）　−０，１ｍ　Ｍ　＠Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ中で透析し４″
Ｃで保存した。

次いで以下の通りに制限酵素及びリガーゼで処理してベ
クタープラスミドを調製する。即ち、−方では枯草菌を
宿主として複製維持できるペクタ性）を常法により調製
し、ついでバチルス　ステその反応条件は次の通りであ
る。

表中、１０　Ｘ　Ｈｉｎｄ　［［緩衝液とは、１００ｍ
Ｍト　リ　ス　（Ｐ　　Ｈ７，４）　　、　　１　０　
０ｍＭＭｇ　　ＣＩ２　　、５　０　０ｍＭＮａ　ｃｌ
　、　　１０　ｍＭジチオスレイトールを含む。

上記溶液で３７℃・１．５〜２時間反応させる。

上記で得られるＡ％Ｂ、２種類のＤＮＡを混合し、８Ｍ
酢酸カリウム２０μ！加え、その後エタノール０．４５
ｍ１を加えて遠心し、上澄を除いた。沈でんはエタノー
ルで洗浄し、脱水・脱塩し、デシケータ−で乾燥した。

この乾燥物に２×リガーゼ緩衝液（１ｇ２ｍＭ）リス（
Ｐ　Ｈ７，６）　−１８，２Ｍ＠Ｍｇｃ１２）　　１０
０　ｓ　ｉｓ　　１００ｍＭジチオスレイトール２０　
ｐ　ｉｓ　　５ｍＭ　１ＩＡＴＰ　２０　ｐ　ｌ、水６
０μｌを加え混合した後、ＤＮＡ！Ｊガーゼ１μｌを加
え、８℃−１６時間保ち、ＤＮＡ溶液とした。

第８段階としては、上述のベクターを枯草菌に導入して
クローニングする段階である。

バチルス　ズブチリスＮＡＩは、通常の変異処理により
得られるアミラーゼ欠損株の１つであるが（日本農芸化
学会昭和６１年度京都大会にて発表。講演番号２Ａ−２
２）、これをＬ培地で一夜培養した後、その１ｍｌ！を
１００　ｍ　ｌ容フラスコ内のＴＦＩ培地２０　ｍ　ｌ
に植菌する。

これを８７℃で培養し、対数増殖期を外れてから１時間
後、５００ｍ１！容フラスコ内のＴＦ■培地８６ｍｌに
４　ｍ　ｌ植菌し、１．５時間培養してコンピテント　
セルを得る。

ＴＦＩ、ＴＦ■培地は夫々以下の通りである。

このコンピテント　セル１ｍＩ！に前述により得られた
ＤＮＡ溶液を混合し、３７℃・３０分間激しく振盪培養
後、遠心集菌し、Ｌ培地１ｍｊ’を加えて３７℃・１．
５時間振盪培養する。その培養液を１００μｌづつテト
ラサイクリン２５μＪ’　／　ｍｌを含む寒天平板に塗
抹し、３７℃１夜培養し、形質転換体を得た。

この形質変換体をＰＬＬ寒天平板（１％プルラン、０．
２％トリプトン、０．２％イーストエキス、０．２％Ｎ
ａＣ／％１．５％寒天（Ｐ　Ｈ７，８）　）にレプリカ
し、３７℃１夜培養後、平板上にエタノールを注ぎ数時
間放置し、ハローを形成するコーニーバチルス　ズブチ
リスＮＡＩを２．６％可溶性でん粉を含むし培地（２５
μ／　／　ｍＩ！テトラサイクリン含有）にて３７℃・
２４時間培養した。培養液を遠心分離して上澄を採り６
０℃・１５分間加熱処理をした。この段階で培養上澄液
中の蛋白質は殆んど耐熱性のネオプルラナーゼのみであ
ることが、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動により確
認された。

ネオプルラナーゼ活性測定法により関連菌株を測定した
ところ、次のようであった。

ス　ズブチリスＮＡＩより得たネオプルラナーゼは、６
０℃、６５℃で夫々６０分間熱処理したところ、夫々９
０％以上、６０％程度の酵素活性を維持しており、耐熱
性に富むことが確認された。

■　本発明の効果 一般に好熱菌であるバチルス　ステアロサーモフィルス
は、枯草菌に較べ培養時の最終菌体濃度が低く、菌体生
産物を大量に取得するのが比較的困難である。そこで本
発明ではバチルス　ステアロサーモフィルス中の耐熱性
酵素であるネオプルラナーゼの遺伝子を枯草菌に組込む
ことにより、ネオプルラナーゼを大量に取得することを
可能としたものである。就中、バチルス　ステア０サー
込ンタバチルス　ズブチリスＮＡＩは本願発明を効果的
に実現可能とするものである。しかして本発明によると
きは、宿主菌にα−アミラーゼ及びプロテアーゼ欠損の
変異株であるバチルス　ズブチリスＮＡＩを用いるので
、培養Ｆ液に含まれる菌体外分泌酵素は殆んど本菌株に
クローン化された耐熱性のネオプルラナーゼのみとなり
、その遺伝−子が増幅されることにより、当該酵素の生
産性を顕著に向上せしめ得ることや、中温菌に好熱菌の
遺伝子がクローン化されたことにより、たとえば６０℃
・１５分間の加熱処理により培養Ｆ液中の耐熱性のネオ
プルラナーゼ以外の蛋白質は殆んど変性法でんしてしま
うことから、目的酵素の濃縮・精製はバチルス　ステア
ロサーモフィルスＴＲ５４０を培養しこれから本件酵素
を濃縮・精製するよりも遥かに簡便・効率的に行うこと
ができる。

１０の制限酵素地図、図中、太線で示した２、　２　Ｍ
　ｄのヒンドＩＩＩ断片に相当する部分は、バチルス　
ステアロサーモフィルスＴＲ３４０由来の耐熱性ネオプ
ルラナーゼ遺伝子である。ただし、円内の数字は分子サ
イズをＭｄで表わしたもの。

特許出願人　江崎グリコ株式会社

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. （１）バチルス　ステアロサーモフイルス（Ｂａｃｉｌ
   ｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）の染
   色体ＤＮＡを制限酵素ヒンドIII（ＨｉｎｄIII）により
   処理して得られるプルラナーゼ類似酵素生産能をもつＤ
   ＮＡ断片とヒンドIIIで処理して得られたベクター断片
   とを結合させた組換えＤＮＡであって、かつ、枯草菌を
   宿主として複製維持されたことを特徴とする組換えプラ
   スミド。
2. （２）バチルス　ステアロサーモフイルス菌がバチルス
   　ステアロサーモフイルスＴＲＳ４０（微工研菌寄託第
   ９６０９号）であることを特徴とする特許請求の範囲の
   第１項に記載の組換えプラスミド。
3. （３）バチルス　ステアロサーモフイルス又はバチルス
   　ステアロサーモフイルスＴＲＳ４０をヒンドIII処理
   して得られるＤＮＡ断片が分子量約２．２Ｍｄであり、
   かつ、制限酵素エコアール I （ＥｃｏＲ I ）に対して
   ２ケ所の切断個所を示すことを特徴とする特許請求の範
   囲の第１項に記載の組換えプラスミド。
4. （４）バチルス　ステアロサーモフイルスの染色体ＤＮ
   Ａを制限酵素ヒンドIIIにより処理して得られるプルラ
   ナーゼ類似酵素生産能をもつＤＮＡ断片を有するプラス
   ミドを複製維持した宿主であることを特徴とする形質転
   換された枯草菌。
5. （５）バチルス　ステアロサーモフイルス菌がバチルス
   　ステアロサーモフイルスＴＲＳ４０であることを特徴
   とする特許請求の範囲の第４項に記載の形質転換された
   枯草菌。
6. （６）バチルス　ステアロサーモフイルスの染色体ＤＮ
   Ａを制限酵素ヒンドIIIにより処理して得られるプルラ
   ナーゼ類似酵素生産能をもつＤＮＡ断片を有するプラス
   ミドを複製維持した枯草菌を栄養培地で培養し、その培
   養物からプルラナーゼ類似酵素を回収することを特徴と
   する形質転換された枯草菌によるプルラナーゼ類似酵素
   の製造法。
7. （７）バチルス　ステアロサーモフイルス菌がバチルス
   　ステアロサーモフイルスＴＲＳ４０であることを特徴
   とする特許請求の範囲の第６項に記載の形質転換された
   枯草菌によるプルラナーゼ類似酵素の製造法。