JPH0159543B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、DNA塩基配列決定のために用いら
れるゲル電気泳動用媒体（以下、ゲル媒体という
ことがある。）に関するものであり、特に、ゲル
媒体の加工適性を改良するためのゲル媒体組成に
関するものである。 ポストラベル法に基づくDNAやRNAの塩基配
列決定法においては、ポリアクセルアミドゲル膜
を用いたスラブ電気泳動が必須の操作となつてい
る。この目的に用いられるポリアクリルアミドゲ
ル膜は、アクリルアミドのような単量体約95重量
部とＮ、N'−メチレンビスアクリルアミドのよ
うな二官能性の架橋剤約５重量部の割合の混合
物、および重合開始剤を含む水溶液（以下、ゲル
形成液ということがある。）中で単量体と架橋剤
を架橋重合させることによつて得ている。 特に近年において遺伝子関連の研究が進むにつ
れて、DNA塩基配列決定の操作の迅速化が急務
となつており、上記のようなポリアクセルアミド
を泳動層とする電気泳動方式は分離能が極めて高
いため、ポリアクリルアミドDNAの塩基配列決
定に必須となつている。 しかしながら現在用いられているポリアクリル
アミドゲル膜には、もろくてこわれやすいといつ
た膜物性上の大きな欠点を有している。このため
DNA塩基配列決定のためのポリアクリルアミド
ゲル膜は、２枚のガラス板で形成されたセル（一
定の空間7.3mm〜１mmを有する）の中にゲル形成
液を注入して、そのセル内でゲル膜を形成させる
方法により作成している。ただしゲル膜には
DNA試料（Maxam−Gilbert分解した³²Pラベル
されたDNAなど）を注入するためのサンプル注
入口を設けることが必要であるため、ゲル化の前
に注入口を作成するためのサンプルスロツトホー
マー（Sample slot former）が挿入される。す
なわちゲル膜が非常にもろくて破れやすいため、
ゲル化をさせた膜を後からカミソリ等でサンプル
注入口を切つて作ることが出来ず、あらかじめ前
述のようにサンプルスロツトホーマーをゲル化前
に挿入しゲル化させる工程がとられている。従つ
て、このような工程がポリアクリルアミドゲル膜
の多量製造においての大きな障害の一つとなつて
いる。 次に、以上のようにして作成したポリアクリル
アミドゲル膜をガラス板にはさんだままで垂直に
立て、サンプルホーマーを取り去つたのち、その
サンプルスロツトに試料（Maxam−Gilbert分解
した³²PラベルされたDNAなど）を一定量注入し
て、電気泳動を行なう。一定時間電気泳動を行な
つた後、片面のガラス板を注意深く除去し、この
ゲル膜を用いてオートラジオグラフイー処理を行
なう。そしてこの後DNAの塩基配列の決定操作
が行なわれる。なお、この際においても、現在の
ゲル膜が非常にもろいため、ガラス板をはずす時
に膜が破れてしまうことさえあり、ゲル膜のもろ
さは非常に大きな問題となつている。 本発明はこの大きな問題点であるゲル膜のもろ
さを改良する方法を鋭意検討した結果、本発明に
到達したものである。 本発明はゲル媒体組成に起因するDNA塩基配
列決定用ポリアクリルアミドゲル電気泳動膜の欠
点（もろさ）を改良するためのゲル組成を提する
ものである。 ちなわち、本発明の目的は、分離能、泳動速度
などの電気泳動特性が良好でかつ、ゲル膜が破損
しにくく、取り扱いが良くその上、任意の形体に
ゲル膜を裁断加工でき、また必要によりデイスク
電気泳動用のゲルカラム等にも用いることがで
き、総合的に見て、従来のものよりも著しく優れ
た特性を有するDNA塩基配列用の分子ふるい効
果を有するポリアクリルアミドゲル媒体を提供す
る事である。 本発明の目的は、アクリルアミドゲル形成液
（例えば、アクリルアミドとＮ，N′−メチレンビ
スアクリルアミド等を含む液）中にあらかじめ親
水性の合成ポリマー及びアガロースを含有させた
のち、形成させたゲル媒体により達成される。 本発明は、アクリルアミド系化合物（以下、単
量体ということがある。）と架橋剤が水の存在下
で架橋重合してなるポリアクリルアミドゲル、お
よび変性剤として尿素またはホルムアミドを含む
ゲル電気泳動用媒体において、さらに水溶性ポリ
マーおよびアガロースを含むゲル電気泳動用媒体
にある。 本発明に用いることができるアクリルアミド系
化合物の例としては、アクリルアミド、Ｎ−メチ
ルアクリルアミド、Ｎ、Ｎ−ジメチルアクリルア
ミド、Ｎ−（ヒドロキシメチル）アクリルアミド、
ジアセトンアクリルアミド等のアクリルアミドホ
モログがあげられ、これらの化合物は単独である
いは二種以上を併用して用いることができる。そ
して、これらのアクリルアミド系化合物のうちで
はアクリルアミドが最も好ましく、またアクリル
アミドと他のアクリルアミド系化合物の一種以上
との併用も好ましい。 本発明のポリアクリルアミド系ゲルを得るため
に用いられる架橋剤としては
『Electorophoresis』1989、２、220−228等に記
載の架橋剤を用いることができる。そして、架橋
剤の具体例としては、Ｎ，N′−メチレンビスア
クリルアミド（BIS）；Ｎ，N′−プロピレンビス
アクリルアミド（PBA）；ジアクリルアミドジメ
チルエーテル（DAE）；１、２−ジアクリルアミ
ドエチレングリコール（DEG）；エチレンウレア
ビスアクリルアミド（EUB）；エチレンジアクリ
レート（EDA）；Ｎ，N′−ジアリルタータルジア
ミド（Ｎ，N′−diallyltartar−diamide、
DATD）；Ｎ，N′−ビスアクリリルシスタミン
（Ｎ，N′−bisacrylylcystamine、BAC）等の二
官能性化合物が挙げられる。架橋剤の濃度として
は、単量体と架橋剤の総重量に対して約2wt％か
ら約30wt％が用いられ、特に約3wt％から約
10wt％が好ましく用いられる。 変性剤としては尿素またはホルムアミドが用い
られ、これらのうちで尿素が特に好ましく用いら
れる。変性剤の量は単量体と架橋剤とを含む水性
ゲルの容積100c.c.に対して、約40ｇから約60ｇの
範囲で用いられる。また変性剤として尿素を用い
る場合には、単量体と架橋剤を含む水性ゲル媒体
１に対し約６モル（約360ｇ）から飽和溶解量
まで、好ましくは約７モル（約420ｇ）から飽和
溶解量までの範囲で用いることができる。 水溶性ポリマーとしては、付加重合型または縮
重合型の水溶性ポリマーを用いることができる。
付加重合型ポリマーの具体例としてポリビニルア
ルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル
アミド等の非イオン性水溶性ポリマーがあげられ
る。縮重合型ポリマーの具体例としてポリエチレ
ングリコール、ポリプロピレングリコール等の非
イオン性水溶性ポリアルキレングリコールがあげ
られる。水溶性ポリマーの分子量は約１万から約
100万の範囲のものが好ましい。これらの水溶性
ポリマーのうちではポリアクリルアミドとポリエ
チレングリコールが好ましい。水溶性ポリマーは
単量体と架橋剤の合計重量に対して約2wt％から
約50wt％の範囲、好ましくは約5wt％から約
30wt％の範囲で用いられる。 本発明においては水溶性ポリマーの添加により
ゲル媒体が可塑性を有するようになり、またゲル
媒体は乾燥時にも可塑性を有するようになり、も
ろさが改良され、こわれにくくなる。また、水溶
性ポリマーの分子量および添加量を選択すること
によりゲル媒体の粘度をコントロールすることも
できる。 本発明のゲル媒体に添加されるアガロースは公
知のアガロースであれば特に制限はなく、低電気
浸透性、中電気浸透性、高電気浸透性アガロース
のいずれも用いることができる。用いることがで
きるアガロースの例としては、特開昭55−5730公
報、特開昭55−110946公報、特表昭57−502098公
報等に開示のアガロース等を挙げることができ
る。アガロースの添加量は単量体と架橋剤を含む
水溶ゲルの容積（100c.c.）に対して、約0.2ｇから
約２ｇの範囲、好ましくは、約0.3ｇから約1.2ｇ
の範囲の割合で用いられる。アガロースの添加に
よつて、ゲル形成用溶液温度を変化させることに
より適当な液粘度にコントロールすることが可能
となる。 本発明のゲル媒体にはPH緩衝剤を含有させるこ
とができる。緩衝剤としては、PH8.0から9.0、好
ましくはPH8.2から8.3の範囲内のPH値に緩衝でき
る緩衝剤であれば、いずれをも用いることができ
る。用いうる緩衝剤としては、日本化学会編『化
学便覧 基礎編』（東京、丸善(株) 1966年発行）
1312−1320ページ；『Date for Biochemical
Research』（R.M.C.Dawson et al編 第２版、
Oxford at the Clarendon Press、1969年発行）
476−508ページ；『Biochemistry』、５、467
（1966）；『Analytical Biochemistry』104、300
−310（1980）等の敢行物に記載の緩衝剤があげら
れる。そして、その具体例としてはトリス（ヒド
ロキシメチル）アミノメタン（Tris）、Ｎ，N′−
ビス（２−ヒドロキシメチル）グリシン
（Bicine）、Ｎ−２ヒドロキシエチルピペラジン−
N'−２−ヒドロキシプロパン−３−スルホン酸
のNa塩またはＫ塩等、Ｎ−２−ヒドロキシメチ
ルピペラジン−N′−３−プロパンスルホン酸の
Na塩またはＫ塩等、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメ
チル）メチル］−３−アミノプロパンスルホン酸
のNa塩またはＫ塩および、これらのいずれかと
必要により組合せられる酸、アルカリまたは塩等
をあげることできる。特に好ましい緩衝剤の例と
しては、Tris、ホウ酸およびEDTA・2Na塩の
組合せ（PH8.2）がある。 本発明のゲル媒体を層または膜として用いる場
合には、平滑な親水性表面を有する電気絶縁性支
持体の上にゲル形成液を公知の方法により塗布し
て設けたのちにゲル形成液を架橋重合させること
によりゲル層またはゲル膜に成形することができ
る。支持体としてガラス板、親水性ポリマー、ま
たは公知の表面処理により表面を親水したポリマ
ー（例、ポリエチレンテレフタレート、ビスフエ
ノールＡのポリカルボネート、ポリ塩化ビニル、
塩化ビニリデン・塩化ビニルコポリマー、ポリメ
チルメタアクリレート、ポリエチレン、ポリプロ
ピレン、セルロースアセテート類、セルロースア
セテテートプロピオネート等）の板またはシート
等の成形物をあげることができる。これらのポリ
マー成形物の表面を親水化するための処理として
は、紫外線照射、グロー放電処理、コロナ放電処
理、火焔処理、電子線照射、ケミカルエツチン
グ、電解エツチング等の公知の方法を適用するこ
とができる。 ゲル形成液を支持体の表面で架橋重合させる場
合には、ゲル形成液の上をさらにカバーフイル
ム、シートまたは板などでおおうことができる。
この目的に私用されるカバーフイルム、シート、
または板としては前記支持体と同様な素材からな
るものを用いることができる。 本発明で用いられるゲル媒体は、アクリルアミ
ドの様な単量体と二官能性のアクリル化合物又は
アクリル化合物（架橋剤）とが、水溶性ポリマー
及びアガロースを実質的に均一に溶解させた水溶
液中で、ラジカル架橋重合させて得られるもので
あり、三次元架橋重合体に、水溶性ポリマー及び
アガロースが実質的に均一に分散され、ポリマー
鎖が三次元架橋重合体とからみあつていると推定
される構造に特徴がある。 上記架橋重合反応は過酸化物の存在及び／又は
紫外線照射により起こすことができる。更にこの
反応は熱および紫外線により加速することができ
る。 重合用触媒としては公知の低温ラジカル重合開
始剤を持いることができ、例えば、Ｎ，Ｎ，N′，
N′−テトラメチルエチレンジアミン・過硫酸ア
ンモニウムの混合物及びＮ，Ｎ，N′，N′−テト
ラメチルエチレンジアミン・リボフラビン・過酸
化水素と紫外線の組合せ等がある。 なお、本発明のゲル媒体には、湿潤剤としてグ
リセリン、エチレングリコール等のポリオール化
合物を含ませることができ、その添加量は水性ゲ
ル媒体の容積100c.c.に対して、約５ｇから約40ｇ
の範囲とされる。ポリオール化合物のうちではグ
リセリンが特に好ましい。 以下に本発明の効果を明確にするために実施例
を上げて説明するが、本発明の範囲を限定するも
のではない。 実施例 １ 平面平滑なガラス板２枚と0.5mm厚みのスペー
サー板を用いて0.5mm厚み空間を有するガラス板
セルを作成し、このセルの中に第１表に示すアク
リルアミドゲル組成溶液（ゲル形成液）を注入し
架橋重合させることによりポリアクリルアミド系
ゲル膜を形成した。そして充分にゲル化させたの
ち片面のガラス板をはずし、ポリアクリルアミド
ゲル膜に鋭い刃を用いてサンプル注入用のスロツ
トを作つた。 試料No.１（比較ゲル膜）では、切り口にひびが
生じ、膜がやぶれたりして、鋭い切口のサンプル
スロツトが得られなかつた。しかしながら、試料
No.２〜４（本発明のゲル媒体によるゲル膜）では
いずれも鋭い切口のサンプルスロツトが容易に得
られた。 このようにして得たゲル膜に再度ガラス板でカ
バーをし、常法に従つて電気泳動をを行ない色素
の泳動パターンを観察した。 試料No.１では色素の乱れがひどく、シヤープな
泳動パターワが得られなかつた。これに対して試
料No.２〜４は色素乱れももなく、均一な泳動パタ
ーンが得られた。 以上のように、本発明のゲル媒体によるゲル膜
は、従来公知のゲル膜と比較して、もろさの欠点
が著しく改良されていることが明らかになつた。

【表】 註：トリスヒドロキシアミノメタン、ホウ酸
およびEDTA〓2NaはpH8.2の緩衝剤組成
実施例 ２ 実施例１と同じゲル処方を用いゲル膜をを作成
した。比較のために試料No.１についてはゲル膜作
成時にスロツトホーマを挿入しスロツトをあらか
じめ作成した膜も作つた（これを試料No.１−Ａと
する。比較ゲル膜）。 これらのゲル膜を用いたDNA塩基配列決定の
実験を、³²PラベルされたDNAを用いMaxam−
Gilbert分解した試料を用いて行なつた。 試料No.１−Ａと試料２〜４は正常な電気泳動パ
ターンを示しDNA塩基配列解析が行なえたが、
試料No.１は電気泳動パターンに乱れが生じた。 以上のごとく本発明のゲル媒体によるゲル膜は
電気泳動特性に問題がなく、且つもろさが改良さ
れたゲル膜を提供できることが明らかになつた。 実施例 ３ 実施例１における固形ポリアクリルアミド（水
溶性ポリマー）の代りにポリエチレングリコール
（平均分子量２万）を用いてポリアクリルアミド
系ゲル膜を形成し、このゲル膜を用いて同様の実
験を行なつたところ、電気泳動特性上特に問題が
なく、その上膜物性における欠点であつたもろさ
も著しく改良され、ゲル膜を任意に加工裁断出来
る事が判明し、本発明の効果が明らかになつた。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ アクリルアミド系化合物と架橋剤が水の存在
   下で架橋重合してなるポリアクリルアミド系ゲ
   ル、および変性剤として尿素またはホルムアミド
   を含む電気泳動用媒体において、さらに水溶性ポ
   リマーおよびアガロースを含むことを特徴とする
   電気泳動用媒体。 ２ 前記アクリルアミド系化合物と前記架橋剤と
   の合計重量に対し、前記架橋剤が2wt％から30wt
   ％の範囲、前記水溶性ポリマーが2wt％から50wt
   ％の範囲で含まれ、かつ前記ポリアクリルアミド
   系ゲルの容積100c.c.に対し前記変性剤が40ｇ〜60
   ｇの範囲、アガロースが0.2ｇ〜２ｇの範囲で含
   まれている特許請求の範囲第１項に記載の電気泳
   動用媒体。 ３ 前記電気泳動用媒体が平坦な表面を有する支
   持体の上に設けられた実質的に一様な厚さの膜で
   ある特許請求の範囲第１項に記載の電気泳動用媒
   体。