JPH0160783B2 - - Google Patents
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- JPH0160783B2 JPH0160783B2 JP58201231A JP20123183A JPH0160783B2 JP H0160783 B2 JPH0160783 B2 JP H0160783B2 JP 58201231 A JP58201231 A JP 58201231A JP 20123183 A JP20123183 A JP 20123183A JP H0160783 B2 JPH0160783 B2 JP H0160783B2
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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Description
本発明は、オートラジオグラフイーを利用する
DNAもしくはDNA断片物の塩基配列決定方法に
関するものである。 近年、急激に発展して来た分子生物学において
は、生物体の機能や複製のメカニズムを解明する
ために、生物体のもつ遺伝情報を明らかにするこ
とが必須のこととなつている。とりわけ、特定の
遺伝情報を担うDNA（もしくはDNA断片物、以
下同様）などの核酸の塩基配列を決定することは
必要不可欠なこととなつている。 DNAの塩基配列を決定するための代表的な方
法の一つとして、サンガー・クールソン
（Sanger−Coulson）法が知られている。この方
法は、DNAが二本の鎖状分子からなる二重ラセ
ン構造を有し、かつその二本の鎖状分子は、各々
四種類の塩基、すなわちアデニン(A)、グアニン
（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）なる塩基を
有する構成単位から構成されていること、そして
この二本の鎖状分子の間はこれらの四種類の塩基
間の水素結合によつて架橋されており、しかも各
構成単位間の水素結合はＧ−ＣおよびＡ−Ｔの二
種類の組合わせのみにおいて実現しているという
DNAの特徴的な構造に着目し、DNA合成酵素に
よるDNA断片の合成、ゲル電気泳動およびオー
トラジオグラフイーの手段を巧みに利用して
DNAの塩基配列を決定する方法である。 サンガー・クールソン法において、塩基配列を
決定しようとしているDNAもしくはDNA断片物
（これらを以後、検体DNAという）と相補的な
DNA断片を合成するためには幾つかの方法があ
るが、基本的には一本鎖の検体DNAを鋳型（テ
ンプレート）とし、上記の四種類の塩基を含むモ
ノヌクレオシドトリフオスフエートの存在下で
DNA合成酵素（DNAポリメラーゼ）を作用させ
ることにより、検体DNAと相補的な種々の長さ
のDNA断片を合成する。このとき、一部のモノ
ヌクレオシドトリフオスフエートに放射性標識が
付与されたものを用いることにより、放射性標識
された合成DNA断片（DNA合成物）が得られ
る。 次に、この操作により得られる多数の合成
DNA断片からなる混合物をゲル電気泳動法によ
り支持媒体上に分離展開する。この支持媒体につ
いてオートラジオグラフイー操作を行なうことに
より、合成DNA断片が分離展開されてなる分離
展開列のオートラジオグラフも得る。そして、こ
の可視化されたオートラジオグラフに基づいて、
鎖状分子の末端から順にその塩基配列を決定する
ことができ、このようにして検体DNAのすべて
の塩基の配列を決定することができる。 なお、上記に要約したサンガー・クールソン法
の特徴および操作についての簡単な記述は次の文
献に見られる。 〓遺伝情報を原語で読む・意表を衝いたDNA
の塩基配列解析法〓三浦謹一郎、現代化学、1977
年９月号46〜54頁（(株)東京化学同人刊） 上述のサンガー・クールソン法は、検体DNA
と相補的なDNA断片を合成するに際し、まずテ
ンプレートDNAにプライマーと呼ばれる短い鎖
のDNA断片を対合させ、このプライマー部分か
らDNAを伸長させて合成する。そのため、支持
媒体上に分離展開されたDNA断片のオートラジ
オグラフを解析する際に、プライマー部分の塩基
配列は決定する必要がない。すなわち、比較的短
いDNA断片については解析する必要がなく、分
子量の小さな、従つて泳動速度の大きいDNA断
片が流出してしまうような泳動速度で分離展開を
行なつてもよい。このため、電気泳動による分離
展開速度を速めて分離展開の時間を短縮化できる
という利点がある。 さらに、DNAの合成過程で放射性物質を導入
することができるため、比放射能の高いDNA断
片を得ることができ、オートラジオグラフイーに
おける露光時間を短縮化することができる。また
比放射能の高いDNA断片が得られるために、用
いるテンプレートDNAの量が少量で済むという
利点もある。 このような理由から、サンガー・クールソン法
は、検体DNAの塩基特異的切断分解を利用する
マキサム・ギルバート法とともに、DNAの塩基
配列決定において非常に注目されている方法であ
る。 従来において、上記のDNAの塩基配列決定に
利用されるオートラジオグラフイーは、放射性標
識が付与されたDNA断片が分離展開された支持
媒体と高感度Ｘ線フイルムなどの放射線フイルム
とを一定時間重ね合わせて、該フイルムを感光
（あるいは、露光）させることによつて行なわれ
ている。また、オートラジオグラフイーの検出感
度を高めるために増感紙を用いることも行なわれ
ている。このようなオートラジオグラフイーにつ
いては、たとえば、次に示すような文献に記載さ
れている。 生化学実験講座６ トレーサー実験法（上）
271〜289頁、〓8.オートラジオグラフイー〓末吉
徹、重松昭世（1977年、(株)東京化学同人刊） 上述のように、オートラジオグラフイーは
DNAなどの核酸の塩基配列を決定する上で、支
持媒体上に分離展開されたDNA断片の位置情報
を得るための重要な手段となつている。しかしな
がら、このように有用なオートラジオグラフイー
をDNAの塩基配列決定に適用するにあたつては、
いくつかの問題がある。 その第一は、放射性標識物質を含む支持媒体上
の放射性物質の位置を可視化するために、その支
持媒体と高感度Ｘ線フイルムなどの放射線フイル
ムとを一定時間重ね合わせて、該フイルムを感光
（露光）させることが行なわれているが、この露
光操作が長時間を必要とする点である。すなわち
従来よりDNAの塩基配列決定におけるオートラ
ジオグラフイーの露光操作は通常、数十時間かけ
て実施されている。これは、支持媒体上に展開さ
れたDNA断片などの試料の量が少ないこと、お
よび放射性標識物質が一般に 32P等で部分的に標
識された核酸であるため、高い放射性が付与され
ていないことによる。 第二には、この露光操作は通常、低温（たとえ
ば、０℃〜−80℃）で行なわなければならない点
である。その理由は、室温などの比較的高い温度
では、放射線または蛍光による感光によつて形成
されたフイルム上の銀塩中の潜像が退行して現像
できない像となりやすく、また、上記の試料が分
離展開された支持媒体から、銀塩に対して有害な
成分が移動するなどして化学カブリを形成しやす
いからである。さらに、蛍光増感紙を用いて増感
露光を行なう場合には、増感紙からの発光の輝度
が低いため、室温のような比較的高い温度では潜
像を形成しにくいという銀塩の特性にも依つてい
る。 第三には、化学カブリなどによる画質の低下を
防ぐために、放射性標識物質を含む支持媒体を乾
燥した状態で放射線フイルムと重ね合わせて露光
させなければならない点である。このため、通常
は支持媒体の乾燥もしくは合成樹脂フイルム等に
よる支持媒体の包装が行なわれている。 オートラジオグラフイーによつて得られた画像
にこのようなカブリが発生すると、支持媒体上に
分離展開されたDNA断片の位置情報を高精度で
得ることがむずかしく、決定されるDNAの塩基
配列の精度を著しく低下させることになる。 以上の理由により、オートラジオグラフイーの
操作が煩雑なものとなつており、このことにより
DNAの塩基配列を決定するための操作全体が煩
雑になつている。 また、放射線フイルムの感光成分である銀塩は
物理的な刺激にも影響されやすく、露光操作時に
おける操作担当者の手あるいは機器との接触など
に起因する物理的圧力などによつて物理的カブリ
現象をこ起こす傾向がある。この点も得られる
DNAの塩基配列の精度を低下させる原因となり、
そのような放射線フイルムの物理的カブリの発生
を回避するためには、その取扱い作業において高
度の熟練と注意とを必要とし、塩基配列決定のた
めの操作をさらに複雑にする結果となる。 また、従来のオートラジオグラフイーでは上記
のように長時間の露光操作が行なわれるため、放
射性標識物質以外に支持媒体に混入した不純物に
よる放射能または自然放射能もまた放射線フイル
ムの露光に関与し、得られる放射性標識物質の位
置情報の精度を低下させるとの問題がある。その
ような妨害を排除して適切な露光条件を設定する
ためには、たとえば、対照試料を用いた並行実験
の実施、露光時間の適正化などが図られている
が、並行実験の実施による実験回数の増大、好適
な露光時間の決定を行なうための予備実験の必要
性などにより、その操作全体が煩雑になるとの欠
点がある。 さらに、従来のオートラジオグラフイーによる
DNAの塩基配列決定においては、画像化された
オートラジオグラフから必要な位置情報を得るた
めに、分離展開された放射性標識化されている
DNA断片の泳動距離を目視によつて読み取ると
いう単純な作業を長時間に渡つて行なうことが必
要であつた。 本発明者は、従来のオートラジオグラフイーを
利用するDNAもしくはDNA断片物の塩基配列決
定方法において附随する上記のような問題点の解
決を目的として鋭意研究を行なつた結果、感光材
料として放射線フイルムの代りに、輝尽光蛍光体
を含有する蓄積性蛍光体シートを用いることによ
り、前記の問題点の解決あるいは欠点の低減が実
現することを見出し、本発明に到達した。 すなわち、本発明は、 (1) 塩基配列を決定しようとしているDNAもし
くはDNA断片物と相補的な塩基配列を有し、
かつ放射性標識が付与されているDNA合成物
からなる混合物を調製する工程； (2) 該DNA合成物からなる混合物を支持媒体上
で分離展開させる工程； (3) 該支持媒体と、輝尽性蛍光体を含有する蓄積
性蛍光体シートとを一定時間重ね合わせること
により、該支持媒体上の放射性標識物質から放
出される放射線エネルギーの少なくとも一部を
該蓄積性蛍光体シートに吸収させたのち、該シ
ートを電磁波により励起して該シートに蓄積さ
れている放射線エネルギーを輝尽光として放出
させ、そしてその輝尽光を検出することによ
り、放射性標識が付与されたDNA合成物の位
置情報を得る工程；および、 (4) 得られた位置情報に基づいて、目的のDNA
もしくはDNA断片物の塩基配列を決定する工
程； を含むことを特徴とするオートラジオグラフイー
によるDNAもしくはDNA断片物の塩基配列決定
方法を提供するものである。 なお、本発明において支持媒体上の放射性標識
物質の「位置情報」とは、支持媒体上における放
射性標識物質もしくはその集合体の位置を中心と
する各種の情報、たとえば、支持媒体上に存在す
る放射性物質の集合体の存在位置と形状、その位
置における放射性物質の濃度、分布などからなる
情報の一つもしくは任意の組合わせとして得られ
る各種の情報を意味する。 本発明において使用する蓄積性蛍光体シートは
放射線像変換パネルとも呼ばれるものであり、そ
の例は、たとえば特開昭55−12145号公報などに
記載されており、一般的な構成としては既に公知
である。 すなわち、蓄積性蛍光体シートは輝尽性蛍光体
からなるものであり、被写体を透過した放射線エ
ネルギー、あるいは被検体から発せられた放射線
エネルギーを該シートの輝尽性蛍光体に吸収さ
せ、そののちに該シートを可視乃至赤外領域の電
磁波（励起光）を用いて励起することにより、該
シートの輝尽性蛍光体中に蓄積されている放射線
エネルギーを蛍光として放出させることができる
ものである。従つて、被写体あるいは被検体の放
射線像は、この蛍光を光電的に読み取つて電気信
号に変換し、得られた電気信号を写真フイルムな
どの記録材料、CRTなどの表示装置上に可視画
像として再生するか、あるいは数値化もしくは記
号化した位置情報などとして表わすことができ
る。 本発明の方法によれば、DNAの塩基配列を決
定するためのオートラジオグラフイーにおいて、
従来のオートラジオグラフイーで用いられている
放射線フイルム、あるいはそれと増感紙との組合
わせの代りに、輝尽性蛍光体を含有してなる蓄積
性蛍光体シートを用いることにより、露光時間の
大幅な短縮化が実現されるのみでなく、露光が環
境温度あるいはその付近の温度という温度条件で
行なわれても、得られる位置情報の精度は低下す
ることがない。従つて、従来においては冷却下で
長時間かけて実施されていた露光操作が著しく簡
便なものとなり、オートラジオグラフイー操作が
簡略化されるものである。 また、感光材料として蓄積性蛍光体シートを使
用した場合には、蓄積性蛍光体シートに蓄積記録
された放射性標識物質の位置情報を得るために特
に画像化する必要はなく、蓄積性蛍光体シートを
レーザーなどの電磁波で走査することにより上記
の位置情報を読み出し、その位置情報を画像、記
号および／または数値、あるいはそれらの組合わ
せなどの任意な形態に変えて取り出すことが可能
となる。さらに、上記の位置情報を電気的手段な
どを利用して更に処理することにより、所望の各
種の形態で、すなわち必ずしも画像の形で位置情
報を得るのではなく、その画像情報についてデー
タ処理して得られる他の情報として得ることも可
能である。本発明においては、蓄積性蛍光体シー
トを読み出して得られる放射性標識物質の位置情
報を有する電気信号あるいはデジタル信号を、電
気泳動などにより分離展開された分離パターンと
して画像情報の形で得るのみではなく、それをコ
ンピユータなどを利用して解析し、目的のDNA
の塩基配列情報として得ることも可能である。 さらに、オートラジオグラフイーの感光材料と
して上記の蓄積性蛍光体シートを利用することに
より、従来より放射線フイルムの使用において大
きな問題となつていた化学カブリおよび物理カブ
リが実質的に発生しなくなる点も、DNAの塩基
配列決定の精度の向上および作業性において非常
に有利に作用する。また、支持媒体中に含まれて
いた不純物の放射能または自然放射能などに起因
する精度の低下は、蓄積性蛍光体シートに蓄積記
録されている位置情報を電気的に処理することに
より容易に低減あるいは解消することが可能とな
る。 従つて、支持媒体上に分離展開された放射性標
識物質の位置情報に基づくDNAの塩基配列決定
のための解析操作は著しく容易になり、同時に決
定されるDNAの塩基配列の精度を高めてその解
析効率を向上させることが可能となる。 以下に、本発明のオートラジオグラフイーによ
るDNAもしくはDNA断片物の塩基配列決定方法
について、ジデオキシ法（dideoxy
sequencingmethodまたは、鎖停止法ともいう）
を例にとり、詳細に説明する。この方法は、前述
のサンガー・クールソン法のうち最も簡便かつ精
度の高い方法として汎用されている方法である。 まず、検体DNAを含む一本鎖のDNAを用意す
る。これをテンプレートDNAと呼ぶ。このDNA
の一部に対して相補的な短いDNA断片（プライ
マーと呼ばれる）を用意し、テンプレートDNA
とハイブリダイズさせたのち、テンプレート
DNAと相補的なDNAの合成を行なう。 DNAの合成は、プライマーを有するテンプレ
ートDNAに、四種類の塩基をそれぞれ含むデオ
キシヌクレオシドトリフオスフエート（dNTP）
四種と特定の塩基を含むジデオキシヌクレオシド
トリフオスフエート（ddNTP）一種とを加え、
DNAポリメラーゼを作用させることにより、テ
ンプレートDNAのプライマー部分からDNA鎖を
伸長させて行なわれる。この合成過程において、
テンプレートDNAにジデオキシヌクレオシドト
リフオスフエートが組み込まれるとDNAの合成
反応はそこで停止するため、プライマーから特定
の塩基の位置まで伸長された検体DNAと相補的
なDNA断片が得られる。たとえば、ジデオキシ
アデノシントリフオスフエート（ddATP）を用
いた場合には、末端がアデニン（Ａ）で終わる
種々の長さのDNA断片の混合物が得られる。 上記DNAの合成において、四種のデオキシヌ
クレオシドトリフオスフエートのうちの少なくと
も一種ヌクレオチドとして32Pなどの放射性元素
で標識化されたものを用いることにより、放射性
標識が付与された合成DNA断片を得ることがで
きる。 上記の合成工程を異なる四種のジデオキシヌク
レオシドトリフオスフエートを用いて四回繰り返
えし、四種類の塩基特異的DNA合成物を得る。 なお、以上に記述したジデオキシヌクレオシド
トリフオスフエートを用いるDNA断片の合成法、
および得られたDNA合成物によるDNAの塩基配
列決定法の詳細については、たとえば次の文献に
詳細に記載されている。 Sanger、F.、Nicklen、S.＆ Coulson、A.
R.、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、74、pp.5463−
5467（1977） また、テンプレートDNAを得る方法としては
種々のものが考案されているが、バクテリオフオ
ージM13を用いたクローニング方法が最も簡便で
あり、この方法についてはたとえば、次の文献に
詳細に記載されている。 Scheier、P.H.、＆ Cortese、R.、J.Mol.
Biol.、129、pp.169−172（1979） 次に、得られた四種類の合成DNA断片混合物
についてゲル電気泳動操作を行ない、各々の混合
物が分離展開されてなる支持媒体を得る。 この放射性標識化された合成DNA断片が分離
展開された支持媒体について、オートラジオグラ
フ測定を行なうことにより、検体DNAの塩基配
列を決定する。 本発明の特徴的な要件である支持媒体上に分離
展開されてなる放射性標識物質の位置情報を得る
ためのオートラジオグラフイーは、まず、上記支
持媒体と蓄積性蛍光体シートとを一定時間重ね合
わせて露光操作を行なうことにより、支持媒体上
の放射性標識物質から放出される放射線の少なく
とも一部を該シートに吸収させる。 露光操作において、上記の支持媒体と蓄積性蛍
光体シートとを重ね合わせた状態は、通常は蓄積
性蛍光体シートと密着させることにより実現する
が、必ずしも支持媒体と蓄積性蛍光体シートとを
密着させる必要はなく、それらが近接した状態で
配置されていてもよい。また、支持媒体は必ずし
も乾燥状態とする必要はなく、湿つていてもよい
し、あるいは所望により放射性標識されたDNA
断片からの放射線を妨げない程度の厚みのポリエ
チレンシート等で包まれていてもよい。 また、いわゆる露光時間は、支持媒体に含まれ
る放射性標識物質の放射線強度、該物質の量、蓄
積性蛍光体シートの感度、および支持媒体の蓄積
性蛍光体シートとの位置関係などにより変動する
が、露光操作は一定時間、たとえば数秒程度以上
は必要とする。ただし、本発明に従つて感光材料
として蓄積性蛍光体シートを用いた場合には、従
来の放射線フイルムを使用する場合に必要な露光
時間に比較して、その露光時間は大幅に短縮され
る。また、露光により支持媒体から蓄積性蛍光体
シートに蓄積記録された支持媒体中の放射性標識
物質の位置情報を読み出す操作において、該シー
トに蓄積されているエネルギーの強さ、分布、所
望とする情報などに応じて各種の電気的処理を施
すことにより、たとえば得られる電気信号の増幅
率を任意の値に設定できるなど、得られる位置情
報を好適に処理することが可能となるため、露光
操作時における露光時間の厳密な制御は特に必要
とはしない。 また、露光操作を実施する温度は特に制限はな
いが、本発明における蓄積性蛍光体シートを利用
したオートラジオグラフイーは、約10〜35℃など
の環境温度にて実施することが可能である。ただ
し、従来のオートラジオグラフイーにおいて利用
されている低温（たとえば５℃付近、あるいはそ
れ以下の温度）において露光操作を行なうことも
差しつかえない。 上記オートラジオグラフイーにおいて好適に使
用される蓄積性蛍光体シートは、一般に基本構造
として、支持体と、この支持体上に設けられた輝
尽性蛍光体を分散状態で含有支持する結合剤から
なる蛍光体層とから構成される。ただし、蛍光体
層が自己支持性である場合には、必ずしも支持体
を設ける必要はない。 上記の構成を有する蓄積性蛍光体シートは、た
とえば、次に述べるような方法により製造するこ
とができる。 まず、輝尽性蛍光体粒子と結合剤とを適当な溶
剤（たとえば、低級アルコール、塩素原子含有炭
化水素、ケトン、エステル、エーテル）に加え、
これを充分に混合して、結合剤溶液中に輝尽性蛍
光体が均一に分散した塗布液を調製する。 結合剤の例としては、ゼラチン等の蛋白質、ポ
リ酢酸ビニル、ニトロセルロース、ポリウレタ
ン、ポリビニルアルコール、線状ポリエステルな
どのような合成高分子物質などにより代表される
結合剤を挙げることができる。 塗布液における結合剤と輝尽性蛍光体との混合
比は、通常１：８乃至１：40（重量比）の範囲か
ら選ばれる。 次に、この塗布液を支持体の表面に均一に塗布
することにより塗布液の塗膜を形成する。この塗
膜を徐々に加熱することにより乾燥して、支持体
上への蛍光体層の形成を完了する。蛍光体層の層
厚は、一般に50乃至500μmである。 支持体としては、従来の放射線写真法における
増感紙（または増感スクリーン）の支持体として
用いられている各種の材料から任意に選ぶことが
できる。そのような材料の例としては、セルロー
スアセテート、ポリエチレンテレフタレートなど
のプラスチツク物質のフイルム、アルミニウム箔
などの金属シート、通常の紙、バライタ紙、レジ
ンコート紙などを挙げることができる。 なお、支持体の蛍光体層が設けられる側の表面
には、接着性付与層、光反射層、光吸収層などが
設けられていてもよい。 さらに、蛍光体層の支持体に接する側とは反対
側の表面に、蛍光体層を物理的および化学的に保
護するための透明な保護膜が設けられていてもよ
い。透明保護膜に用いられる材料の例としては、
酢酸セルロース、ポリメチルメタクリレート、ポ
リエチレンテレフタレート、ポリエチレンを挙げ
ることができる。透明保護膜の膜厚は、通常は約
0.1乃至20μmである。 また、蓄積性蛍光体シートの表面は必要に応じ
て、親水化処理などの表面処理が施されていても
よい。 本発明において利用される蓄積性蛍光体シート
に用いられる輝尽性蛍光体は、先に述べたように
放射線を照射した後、励起光を照射すると輝尽発
光を示す蛍光体であるが、実用的な面からは400
〜850nmの波長範囲の励起光によつて300〜
500nmの波長範囲の輝尽発光を示す蛍光体である
ことが望ましい。そのような輝尽性蛍光体の例と
しては、 米国特許第3859527号明細書に記載されている
SrS：Ce、Sm、SrS：Eu、Sm、ThO2：Er、お
よびLa2O2S：Eu、Smなどの組成式で表わされ
る蛍光体、 特開昭55−12142号公報に記載されている
ZnS：Cu、Pb、BaO・xAl2O3：Eu〔ただし、0.8
≦ｘ≦10〕、および、M2+O・xSiO2：Ａ〔ただし、
M2+はMg、Ca、Sr、Zn、Cd、またはBaであり、
ＡはCe、Tb、Eu、Tm、Pb、Tl、Bi、または
Mnであり、ｘは、0.5≦ｘ≦2.5である〕などの
組成式を表わされる蛍光体、 特開昭55−12143号公報に記載されている
（Ba1-x-y、Mgx、Cay）FX：aEu2+〔ただし、Ｘ
はClおよびBrのうちの少なくとも一つであり、
ｘおよびｙは、０＜ｘ＋ｙ≦0.6、かつxy≠０で
あり、ａは、10-6≦ａ≦５×10-2である〕の組成
式で表わされる蛍光体、 特開昭55−12144号公報に記載されている
LnOX：xA〔ただし、LnはLa、Ｙ、Gd、および
Luのうちの少なくとも一つ、ＸはClおよびBrの
うちの少なくとも一つ、ＡはCeおよびTbのうち
の少なくとも一つ、そして、ｘは、０＜ｘ＜0.1
である〕の組成式で表わされる蛍光体、 特開昭55−12145号公報に記載されている
（Ba1-x、M〓ｘ）FX：yA〔ただし、M〓はMg、
Ca、Sr、Zn、およびCdのうちの少なくとも一
つ、ＸはCl、Br、およびＩのうちの少なくとも
一つ、ＡはEu、Tb、Ce、Tm、Dy、Pr、Ho、
Nd、Yb、およびErのうちの少なくとも一つ、そ
してｘは、０≦ｘ≦0.6、ｙは、０≦ｙ≦0.2であ
る〕の組成式で表わされる蛍光体、 特開昭55−160078号公報に記載されているM〓
FX・xA：yLn〔ただし、M〓はBa、Ca、Sr、
Mg、Zn、およびCdのうちの少なくとも一種、Ａ
はBeO、MgO、CaO、SrO、BaO、ZnO、
Al2O3、Y2O3、La2O3、In2O3、SiO2、TlO2、
ZrO2、GeO2、SnO2、Nb2O5、Ta2O5、および
ThO2のうちの少なくとも一種、LnはEu、Tb、
Ce、Tm、Dy、Pr、Ho、Nd、Yb、Er、Sm、
およびGdのうちの少なくとも一種、ＸはCl、
Br、およびＩのうちの少なくとも一種であり、
ｘおよびｙはそれぞれ５×10-5≦ｘ≦0.5、およ
び０＜ｙ≦0.2である〕の組成式で表わされる蛍
光体、 特開昭56−116777号公報に記載されている
（Ba1-x、M〓x）F2・aBaX2：yEu、zA〔ただし、
M〓はベリリウム、マグネシウム、カルシウム、
ストロンチウム、亜鉛、およびカドミウムのうち
の少なくとも一種、Ｘは塩素、臭素、および沃素
のうちの少なくとも一種、Ａはジルコニウムおよ
びスカンジウムのうちの少なくとも一種であり、
ａ、ｘ、ｙ、およびｚはそれぞれ0.5≦ａ≦1.25、
０≦ｘ≦１、10-6≦ｙ≦２×10-1、および０＜ｚ
≦10-2である〕の組成式で表わされる蛍光体、 特開昭57−23673号公報に記載されている
（Ba1-x、M〓x）F2・aBaX2：yEu、zB〔ただし、
M〓はベリリウム、マグネシウム、カルシウム、
ストロンチウム、亜鉛、およびカドミウムのうち
の少なくとも一種、Ｘは塩素、臭素、および沃素
のうちの少なくとも一種であり、ａ、ｘ、ｙ、お
よびｚはそれぞれ0.5≦０≦1.25、０≦ｘ≦１、
10-6≦ｙ≦２×10-1、および０＜ｚ≦２×10-1で
ある〕の組成式で表わされる蛍光体、 特開昭57−23675号公報に記載されている
（Ba1-x、M〓x）F2・aBaX2：yEu、zB〔ただし、
M〓はベリリウム、マグネシウム、カルシウム、
ストロンチウム、亜鉛、およびカドミウムのうち
の少なくとも一種、Ｘは塩素、臭素、および沃素
のうちの少なくとも一種、Ａは砒素および硅素の
うちの少なくとも一種であり、ａ、ｘ、ｙ、およ
びｚはそれぞれ0.5≦ａ≦1.25、０≦ｘ≦１、10-6
≦ｙ≦２×10-1、および０＜ｚ≦５×10-1であ
る〕の組成式で表わされる蛍光体、 本出願人による特開昭56−167498号明細書に記
載されているM〓OX：xCe〔ただしM〓はPr、Nd、
Pm、Sm、Eu、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb、
およびBiからなる群より選ばれる少なくとも一
種の三価金属であり、ＸはClおよびBrのうちの
いずれか一方あるいはその両方であり、ｘは０＜
ｘ＜0.1である〕の組成式で表わされる蛍光体、 本出願人による特開昭57−89875号明細書に記
載されているBa1-xMx/2Lx/2FX：yEu2+〔ただし、
Ｍは、Li、Na、Ｋ、Rb、およびCsからなる群よ
り選ばれる少なくとも一種のアルカリ金属を表わ
し；Ｌは、Sc、Ｙ、La、Ce、Pr、Nd、Pm、
Sm、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb、Lu、
Al、Ga、In、およびTlからなる群より選ばれる
少なくとも一種の三価金属を表わし；Ｘは、Cl、
Br、およびＩからなる群より選ばれる少なくと
も一種のハロゲンを表わし；そして、ｘは10-2≦
ｘ≦0.5、ｙは０＜ｙ≦0.1である〕の組成式で表
わされる蛍光体、 本出願人による特開昭57−137374号明細書に記
載されているBaFX・xA：yEu2+〔ただし、Ｘは、
Cl、Br、およびＩからなる群より選ばれる少な
くとも一種のハロゲンであり；Ａは、テトラフル
オロホウ酸化合物の焼成物であり；そして、ｘは
10-6≦ｘ≦0.1、ｙは０＜ｙ≦0.1である〕の組成
式で表わされる蛍光体、 本出願人による特開昭57−158048号明細書に記
載されているBaFX・xA：yEu2+〔ただし、Ｘは、
Cl、Br、およびＩからなる群より選ばれる少な
くとも一種のハロゲンであり；Ａは、ヘキサフル
オロケイ酸、ヘキサフルオロチタン酸およびヘキ
サフルオロジルコニウム酸の一価もしくは二価金
属の塩からなるヘキサフルオロ化合物群より選ば
れる少なくとも一種の化合物の焼成物であり；そ
して、ｘは10-6≦ｘ≦0.1、ｙは０＜ｙ≦0.1であ
る〕の組成式で表わされる蛍光体、 本出願人による特開昭57−166320号明細書に記
載されているBaFX・xNaX′：aEu2+〔ただし、
ＸおよびX′は、それぞれCl、Br、およびＩのう
ちの少なくとも一種であり、ｘおよびａはそれぞ
れ０＜ｘ≦２、および０＜ａ≦0.2である〕の組
成式で表わされる蛍光体、 本出願人による特開昭57−166696号明細書に記
載されているM〓FX・xNaX′：yEu2+：zA〔ただ
し、M〓は、Ba、Sr、およびCaからなる群より
選ばれる少なくとも一種のアルカリ土類金属であ
り；ＸおよびX′は、それぞれCl、Br、およびＩ
からなる群より選ばれる少なくとも一種のハロゲ
ンであり；Ａは、Ｖ、Cr、Mn、Fe、Co、およ
びNiより選ばれる少なくとも一種の遷移金属で
あり；そして、ｘは０＜ｘ≦２、ｙは０＜ｙ≦
0.2、およびｚは０＜ｚ≦10-2である〕の組成式
で表わされる蛍光体、 本出願人による特開昭57−184455号明細書に記
載されているM〓FX・aMIX′・bM′〓X″2・cM〓
X″′3・xA：yEu2+〔ただし、M〓はBa、Sr、およ
びCaからなる群より選ばれる少なくとも一種の
アルカリ土類金属であり；MIはLi、Na、Ｋ、
Rb、およびCsからなる群より選ばれる少なくと
も一種のアルカリ金属であり；M′〓はBeおよび
Mgからなる群より選ばれる少なくとも一種の二
価金属であり；M〓はAl、Ga、In、およびTlか
らなる群より選ばれる少なくとも一種の三価金属
であり；Ａは金属酸化物であり；ＸはCl、Br、
およびＩからなる群より選ばれる少なくとも一種
のハロゲンであり；X′、X″、およびX″′は、Ｆ、
Cl、Br、およびＩからなる群より選ばれる少な
くとも一種のハロゲンであり；そして、ａは０≦
ａ≦２、ｂは０≦ｂ≦10-2、ｃは０≦ｃ≦10-2、
かつａ＋ｂ＋ｃ≧10-6であり；ｘは０＜ｘ≦0.5、
ｙは０＜ｙ≦0.2である〕の組成式で表わされる
蛍光体、 などを挙げることができる。 ただし、本発明の方法に用いられる蓄積性蛍光
体シートに含まれる輝尽性蛍光体は上述の蛍光体
に限られるものではなく、放射線の照射を受けた
のち励起光の照射を受けた場合に輝尽発光を示す
蛍光体であればいかなるものであつてもよい。 本発明に従うオートラジオグラフイーに利用さ
れる蓄積性蛍光体シートの詳細については、たと
えば本出願人による特開昭57−193418号明細書に
記載されている。 次に、蓄積性蛍光体シートに蓄積記録された支
持媒体上の放射性標識物質の位置情報の読み出し
が行なわれる。この読み出し方法について、添付
図面の第１図に示した読出装置（あるいは読取装
置）の例を参照しながら略述する。 第１図は、蓄積性蛍光体シート（以下において
は、シートと略記することもある）１に蓄積記録
されている放射性標識物質の二次元的な位置情報
を仮に読み出すための先読み用読出部２と、放射
性標識物質の位置情報を出力するためにシート１
に蓄積記録されている放射線画像を読み出す機能
を有する本読み用読出部３から構成される読出装
置の例の概略図を示している。 先読み用読出部２においては次のような先読み
操作が行なわれる。 レーザー光源４から発生したレーザー光５はフ
イルター６を通過することにより、このレーザー
光５による励起に応じて蓄積性蛍光体シート１か
ら発生する輝尽発光の波長領域に該当する波長領
域の部分がカツトされる。次いでレーザー光は、
ガルバノミラー等の光偏向器７により偏向処理さ
れ、平面反射鏡８により反射されたのちシート１
上に一次元的に偏向して入射する。ここで用いる
レーザー光源４は、そのレーザー光５の波長領域
が、シート１から発する輝尽発光の主要波長領域
と重複しないように選択される。 蓄積性蛍光体シート１は、上記の偏向レーザー
光の照射下において矢印９の方向に移送される。
従つて、シート１の全面にわたつて偏向レーザー
光が照射されるようになる。なお、レーザー光源
４の出力、レーザー光５のビーム径、レーザー光
５の走査速度、シート１の移送速度については、
先読み操作のレーザー光５のエネルギーが本読み
操作に用いられるエネルギーよりも小さくなるよ
うに調整される。 蓄積性蛍光体シート１は、上記のようなレーザ
ー光の照射を受けると、蓄積記録されている放射
線エネルギーに比例する光量の輝尽発光を示し、
この光は先読み用導光性シート１０に入射する。
この導光性シート１０はその入射面が直線状で、
蓄積性蛍光体シート１上の走査線に対向するよう
に近接して配置されており、その射出面は円環を
形成し、フオトマルなどの光検出器１１の受光面
に連絡している。この導光性シート１０は、たと
えばアクリル系合成樹脂などの透明な熱可塑性樹
脂シートを加工してつくられたもので、入射面よ
り入射した光がその内部において全反射しながら
射出面へ伝達されるように構成されている。蓄積
性蛍光体シート１からの輝尽発光はこの導光性シ
ート１０内を導かれて射出面に到達し、その射出
面から射出されて光検出器１１に受光される。 光検出器１１の受光面には、輝尽発光の波長領
域の光のみを透過し、励起光（レーザー光）の波
長領域の光をカツトする支持媒体が貼着され、輝
尽発光のみを検出しうるようにされている。光検
出器１１により検出された輝尽発光は電気信号に
変換され、さらに増幅器１２により増幅され出力
される。増幅器１２から出力された蓄積記録情報
は、本読み用読出部３の制御回路１３に入力され
る。制御回路１３は、得られた蓄積記録情報に応
じて、濃度およびコントラストが最も均一でかつ
観察読影性能の優れた画像が得られるように、増
幅率設定値ａ、収録スケールフアクターｂ、およ
び、再生画像処理条件設定値ｃを出力する。 以上のようにして先読み操作が終了した蓄積性
蛍光体シート１は、本読み用読出部３へ移送され
る。本読み用読出部３においては次のような本読
み操作が行なわれる。 本読み用レーザー光源１４から発せられたレー
ザー光１５は、前述のフイルター６と同様な機能
を有するフイルター１６を通過したのちビーム・
エクスパンダー１７によりビーム径の大きさが厳
密に調整される。次いでレーザー光は、ガルバノ
ミラー等の光偏向器１８により偏向処理され、平
面反射鏡１９により反射されたのち蓄積性蛍光体
シート１上に一次元的に偏向して入射する。な
お、光偏向器１８と平面反射鏡１９との間にはfθ
レンズ２０等が配置され、シート１の上を偏向レ
ーザー光が走査した場合に、常に均一なビーム速
度を維持するようにされている。 蓄積性蛍光体シート１は、上記の偏向レーザー
光の照射下において、矢印２１の方向に移送され
る。従つて、先読み操作におけると同様にシート
１の全面にわたつて偏向レーザー光が照射される
ようになる。 蓄積性蛍光体シート１は、上記のようにしてレ
ーザー光の照射を受けると、先読み操作における
と同様に、蓄積記録されている放射線エネルギー
に比例する光量の輝尽発光を発し、この光は本読
み用導光性シート２２に入射する。この本読み用
導光性シート２２は本読み用導光性シート１０と
同様の材質、構造を有しており、本読み用導光性
シート２２の内部を全反射を繰返しつつ導かれた
輝尽発光はその射出面から射出されて、光検出器
２３に受光される。なお、光検出器２３の受光面
には輝尽発光の波長領域のみを選択的に透過する
フイルターが貼着され、光検出器２３が輝尽発光
のみを検出するようにされている。 光検出器２３により検出された輝尽発光は電気
信号に変換され、前記の増幅率設定値ａに従つて
感度設定された増幅器２４において適正レベルの
電気信号に増幅されたのち、Ａ／Ｄ変換器２５に
入力される。Ａ／Ｄ変換器２５は、収録スケール
フアクター設定値ｂに従い信号変動幅に適したス
ケールフアクターでデジタル信号に変換され、信
号処理回路２６に入力される。信号処理回路２６
では、再生画像処理条件設定値ｃに基づいて、濃
度およびコントラストが適正で観察読影性能の優
れた可視画像が得られるように信号処理が行なわ
れ、処理された情報は磁気テープなどの保存手段
に蓄えられる。次いで、必要に応じて所望の記録
装置（図示なし）へ伝送される。 記録装置としては、たとえば、感光材料上をレ
ーザー光等で走査して光学的に記録するもの、
CRT等に電子的に表示するもの、CRT等に表示
された放射線画像をビデオ・プリンター等に記録
するもの、熱線を用いて感熱記録材料上に記録す
るものなど種々の原理に基づいた記録装置を用い
ることができる。 ただし、記録装置は上記のように可視画像化す
るものに限られるものではなく、前述したように
放射性標識物質の二次元的な位置情報を、たとえ
ば数値化もしくは記号化するなどして記録するこ
ともできる。 なお、本発明における蓄積性蛍光体シートに蓄
積記録された支持媒体上の放射性標識物質の位置
情報を読み出すための方法について、上記におい
ては先読み操作と本読み操作とからなる読出し操
作を説明したが、本発明において利用することが
できる読出し操作は、上記の例に限られるもので
はない。たとえば、支持媒体上の放射性物質の放
射線強度および、その支持媒体についての蓄積性
蛍光体シートの露光時間が予めわかつていれば、
上記の例において先読み操作を省略することもで
きる。 また、本発明における蓄積性蛍光体シートに蓄
積記録された放射性標識物質の位置情報を読み出
すための方法は、上記に例示した方法に限られる
ものではない。 このようにして得られた支持媒体上の放射性標
識物質の二次元的な位置情報に基づいて、DNA
の塩基配列を決定することができる。すなわち、
末端がそれぞれＡ、Ｇ、Ｔ、Ｃのうちのいずれか
の特定の塩基のみからなる合成DNA断片混合物
（塩基特異的DNA合成物）の各分離展開列間で放
射性標識物質の位置（泳動距離）を相互に比較す
ることにより、泳動距離の長い順に末端の塩基を
帰属させていくことにより、その塩基配列を決定
することができる。 なお、このようにしてDNA合成物に対して塩
基配列を決定することは、上記の一本鎖のDNA
合成物が目的とする検体DNAの片方のDNA鎖と
相補的であるところから、二本鎖の検体DNAの
うちの一本鎖の塩基配列を決定することに等し
い。そして、この塩基配列の決められた片方の
DNA鎖から、二本鎖の検体DNA全てについてそ
の塩基配列を決定することができる。あるいは、
検体DNAが一本鎖のものである場合には、DNA
合成物に対して塩基配列を決定することによつて
これに相補的なDNAの塩基配列が決定されるこ
とになり、得られた塩基配列から一本鎖の検体
DNAの塩基配列を決定することができる。 本発明において、オートラジオグラフイーを利
用して支持媒体上の放射性標識物質の二次元的な
位置情報を得ることによりDNAの塩基配列を決
定する方法は、上記のような放射線フイルム等に
オートラジオグラフを可視画像化する方法に限ら
れるものではなく、たとえば、その位置情報を数
値化もしくは記号化することにより、得られた数
値・記号等のデジタル値に基づいてDNAの塩基
配列を決定することも可能である。 さらには、得られたデジタル信号にDNAの塩
基配列決定のための好適な信号処理を行なうこと
により、直接に検体DNAの塩基配列を得ること
も可能である。このような信号処理方法について
は、たとえば本出願人による下記の特許出願の明
細書に記載されている。 特願昭58−1326号、特願昭58−1327号、特願昭
58−1328号および特願昭58−1329号。 上記においては、サンガー・クールソン法のう
ちジデオキシ法を利用するDNAの塩基配列決定
方法について説明したが、本発明の方法は、上記
のジデオキシ法に限定されるものではなく、プラ
ス・マイナス法などの別のサンガー・クールソン
法に適用することもできる。さらに、本発明の方
法はサンガー・クールソン法に限られるものでは
なく、オートラジオグラフイーによりDNA合成
物を利用してその塩基配列を決定することができ
る方法であればいかなる方法にも適用することが
可能である。 また、合成DNA断片に放射性標識を付与する
ために、ヌクレオチドに用いられる放射性核種の
例としては、32P、3H、14C、35Sを挙げることができ
る。 次に本発明の実施態様を、前述のジデオキシ法
を利用したサンガー・クールソン法を例にして記
載する。なお、以下の実施例および比較例におい
て用いた検体DNA（プラスミドpBR322）は既に
その塩基配列が解明されており、得られた塩基配
列の結果を、それらの既知データと比較して評価
した。 また、以下の実施例において使用した蓄積性蛍
光体シートは下記の方法により製造されたもので
ある。 輝尽性の二価のユーロピウム賦活弗化臭化バリ
ウム蛍光体（BaFBr：Eu2+）の粒子と線状ポリ
エステル樹脂との混合物にメチルエチルケトンを
添加し、さらに硝化度11.5％のニトロセルロース
を添加して蛍光体粒子を分散状態で含有する分散
液を調製する。次に、この分散液に燐酸トリクレ
ジル、ｎ−ブタノール、そしてメチルエチルケト
ンを添加したのち、プロペラミキサーを用いて充
分に撹拌混合して、蛍光体粒子が均一に分散し、
結合剤と蛍光体との混合比が１：25（重量比）か
つ粘度が25〜35PS（25℃）の塗布液を調製する。 次に、ガラス板上に水平に置いたカーボンブラ
ツク練り込みポリエチレンテレフタレートシート
（支持体、厚み：250μm）の上に塗布液をドクタ
ーブレードを用いて均一に塗布する。そして塗布
後に、塗膜が形成された支持体を乾燥器内に入
れ、この乾燥器内部の温度を25℃から100℃に
徐々に上昇させて、塗膜の乾燥を行なつた。この
ようにして、支持体上に層厚が300μmの蛍光体層
を形成する。 そして、この蛍光体層の上に、透明なポリエチ
レンテレフタレートフイルム（厚み：12μm）の
片面にポリエステル系接着剤を付与したのち、接
着剤層側を下に向けて置いて接着することによ
り、保護膜を形成し、支持体、蛍光体層および保
護膜から構成された蓄積性蛍光体シートを製造す
る。 実施例 １ (1) 検体DNAを含むテンプレートDNAの調製 常法により、大腸菌プラスミドDNA
（pBR322）を制限酵素Hind−により切断し
てDNA断片100ngを得た。これに、バクテリ
オフアージM13mp8株（アマシヤム社製、
N4501）を上記と同じ制限酵素Hind−で処
理したもの20ngをベクターDNAとして加え、
T4DNAリガーゼを用いて常法により接合させ
た。その後、対数成長期にあるE.ColiK12株に
この組換えDNAを感染させて、一夜培養した。 得られた組換えDNA（M13）を含むE.ColiK
培養菌（無色のプラーク）１mlを、２×TY培
地（１当り、バクトトリプトン16g、イース
ト抽出物10g、および塩化ナトリウム5gを含
む）100ml上に木製のカクテルステイツクを用
いて植え付けた。これを培養管に移して37℃の
温度で５時間振とうしたのち、遠心分離を行な
つてその上澄み液を採取することにより、大腸
菌を注意深く除去した。 この上澄み液を20％PEG（ポリエチレングリ
コール6000）と2.5M塩化ナトリウムとを含む
液に加え、よく撹拌したのち、遠心分離により
PEG層を取り除いた。底部に残つたペレツト
状の固形物にTE緩衝液（10mMトリス・塩酸
溶液および1mMのEDTAを含む、PH8.0）100μ
を加え、次いでTE緩衝液で飽和されたフエ
ノール50μを加えて撹拌したのち、室温で15
分間放置した。得られた懸濁液に遠心分離を行
ない、その上澄み液を3M酢酸ナトリウム溶液
10μ中に移し、さらにエタノール250μを加
えて−20℃の温度で一夜放置した。これを遠心
分離にかけて、その沈澱物を冷メタノールで洗
浄し、乾燥したのち、乾燥物をTE緩衝液50μ
に溶解して検体DNAを含むテンプレート
DNA溶液を得た。 (2) テンプレートDNA上へのプライマーのハイ
ブリダイゼーシヨン 蒸留水2.5μに、上記のテンプレート
DNA5μ、M13プライマー（アマシヤム社
製、N4502）1μおよびKlenow反応緩衝液
（10mMトリス、PH8.5および10mM塩化マグネ
シウムを含む）1.5μを加えた後、55〜60℃の
温度で２時間培養して、プライマーがハイブリ
ダイズしたテンプレートDNAを得た。 (3) 合成反応 上記プライマーがハイブリダイズしたテンプ
レートDNAに、〔α−32P〕dATP（比放射能：
800Ci／ｍ mole、アマシヤム社製、
PB10384）2μおよびKlenowフラグメント
（DNAポリメラーゼＩ）1μ（1unit）を加え
た。四本の試験管にこの混合物を2.5μずつ取
り、さらに下記の第１表に示される成分からな
る反応用モノヌクレオチドの混合液（Ａ＃、Ｃ
＃、Ｇ＃またはＴ＃）2μを添加して混合し、
四種類の混合液を得た。これらの混合液を室温
にて15分間反応させた後、それぞれにチエイス
反応溶液（0.5mMの四種のモノデオキシヌク
レオシドトリフオスフエートの混合液）2μ
を加えて、さらに15分間反応させた。次いで、
イオン交換処理したホルムアミド4μを加え
て反応を停止させた。
DNAもしくはDNA断片物の塩基配列決定方法に
関するものである。 近年、急激に発展して来た分子生物学において
は、生物体の機能や複製のメカニズムを解明する
ために、生物体のもつ遺伝情報を明らかにするこ
とが必須のこととなつている。とりわけ、特定の
遺伝情報を担うDNA（もしくはDNA断片物、以
下同様）などの核酸の塩基配列を決定することは
必要不可欠なこととなつている。 DNAの塩基配列を決定するための代表的な方
法の一つとして、サンガー・クールソン
（Sanger−Coulson）法が知られている。この方
法は、DNAが二本の鎖状分子からなる二重ラセ
ン構造を有し、かつその二本の鎖状分子は、各々
四種類の塩基、すなわちアデニン(A)、グアニン
（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）なる塩基を
有する構成単位から構成されていること、そして
この二本の鎖状分子の間はこれらの四種類の塩基
間の水素結合によつて架橋されており、しかも各
構成単位間の水素結合はＧ−ＣおよびＡ−Ｔの二
種類の組合わせのみにおいて実現しているという
DNAの特徴的な構造に着目し、DNA合成酵素に
よるDNA断片の合成、ゲル電気泳動およびオー
トラジオグラフイーの手段を巧みに利用して
DNAの塩基配列を決定する方法である。 サンガー・クールソン法において、塩基配列を
決定しようとしているDNAもしくはDNA断片物
（これらを以後、検体DNAという）と相補的な
DNA断片を合成するためには幾つかの方法があ
るが、基本的には一本鎖の検体DNAを鋳型（テ
ンプレート）とし、上記の四種類の塩基を含むモ
ノヌクレオシドトリフオスフエートの存在下で
DNA合成酵素（DNAポリメラーゼ）を作用させ
ることにより、検体DNAと相補的な種々の長さ
のDNA断片を合成する。このとき、一部のモノ
ヌクレオシドトリフオスフエートに放射性標識が
付与されたものを用いることにより、放射性標識
された合成DNA断片（DNA合成物）が得られ
る。 次に、この操作により得られる多数の合成
DNA断片からなる混合物をゲル電気泳動法によ
り支持媒体上に分離展開する。この支持媒体につ
いてオートラジオグラフイー操作を行なうことに
より、合成DNA断片が分離展開されてなる分離
展開列のオートラジオグラフも得る。そして、こ
の可視化されたオートラジオグラフに基づいて、
鎖状分子の末端から順にその塩基配列を決定する
ことができ、このようにして検体DNAのすべて
の塩基の配列を決定することができる。 なお、上記に要約したサンガー・クールソン法
の特徴および操作についての簡単な記述は次の文
献に見られる。 〓遺伝情報を原語で読む・意表を衝いたDNA
の塩基配列解析法〓三浦謹一郎、現代化学、1977
年９月号46〜54頁（(株)東京化学同人刊） 上述のサンガー・クールソン法は、検体DNA
と相補的なDNA断片を合成するに際し、まずテ
ンプレートDNAにプライマーと呼ばれる短い鎖
のDNA断片を対合させ、このプライマー部分か
らDNAを伸長させて合成する。そのため、支持
媒体上に分離展開されたDNA断片のオートラジ
オグラフを解析する際に、プライマー部分の塩基
配列は決定する必要がない。すなわち、比較的短
いDNA断片については解析する必要がなく、分
子量の小さな、従つて泳動速度の大きいDNA断
片が流出してしまうような泳動速度で分離展開を
行なつてもよい。このため、電気泳動による分離
展開速度を速めて分離展開の時間を短縮化できる
という利点がある。 さらに、DNAの合成過程で放射性物質を導入
することができるため、比放射能の高いDNA断
片を得ることができ、オートラジオグラフイーに
おける露光時間を短縮化することができる。また
比放射能の高いDNA断片が得られるために、用
いるテンプレートDNAの量が少量で済むという
利点もある。 このような理由から、サンガー・クールソン法
は、検体DNAの塩基特異的切断分解を利用する
マキサム・ギルバート法とともに、DNAの塩基
配列決定において非常に注目されている方法であ
る。 従来において、上記のDNAの塩基配列決定に
利用されるオートラジオグラフイーは、放射性標
識が付与されたDNA断片が分離展開された支持
媒体と高感度Ｘ線フイルムなどの放射線フイルム
とを一定時間重ね合わせて、該フイルムを感光
（あるいは、露光）させることによつて行なわれ
ている。また、オートラジオグラフイーの検出感
度を高めるために増感紙を用いることも行なわれ
ている。このようなオートラジオグラフイーにつ
いては、たとえば、次に示すような文献に記載さ
れている。 生化学実験講座６ トレーサー実験法（上）
271〜289頁、〓8.オートラジオグラフイー〓末吉
徹、重松昭世（1977年、(株)東京化学同人刊） 上述のように、オートラジオグラフイーは
DNAなどの核酸の塩基配列を決定する上で、支
持媒体上に分離展開されたDNA断片の位置情報
を得るための重要な手段となつている。しかしな
がら、このように有用なオートラジオグラフイー
をDNAの塩基配列決定に適用するにあたつては、
いくつかの問題がある。 その第一は、放射性標識物質を含む支持媒体上
の放射性物質の位置を可視化するために、その支
持媒体と高感度Ｘ線フイルムなどの放射線フイル
ムとを一定時間重ね合わせて、該フイルムを感光
（露光）させることが行なわれているが、この露
光操作が長時間を必要とする点である。すなわち
従来よりDNAの塩基配列決定におけるオートラ
ジオグラフイーの露光操作は通常、数十時間かけ
て実施されている。これは、支持媒体上に展開さ
れたDNA断片などの試料の量が少ないこと、お
よび放射性標識物質が一般に 32P等で部分的に標
識された核酸であるため、高い放射性が付与され
ていないことによる。 第二には、この露光操作は通常、低温（たとえ
ば、０℃〜−80℃）で行なわなければならない点
である。その理由は、室温などの比較的高い温度
では、放射線または蛍光による感光によつて形成
されたフイルム上の銀塩中の潜像が退行して現像
できない像となりやすく、また、上記の試料が分
離展開された支持媒体から、銀塩に対して有害な
成分が移動するなどして化学カブリを形成しやす
いからである。さらに、蛍光増感紙を用いて増感
露光を行なう場合には、増感紙からの発光の輝度
が低いため、室温のような比較的高い温度では潜
像を形成しにくいという銀塩の特性にも依つてい
る。 第三には、化学カブリなどによる画質の低下を
防ぐために、放射性標識物質を含む支持媒体を乾
燥した状態で放射線フイルムと重ね合わせて露光
させなければならない点である。このため、通常
は支持媒体の乾燥もしくは合成樹脂フイルム等に
よる支持媒体の包装が行なわれている。 オートラジオグラフイーによつて得られた画像
にこのようなカブリが発生すると、支持媒体上に
分離展開されたDNA断片の位置情報を高精度で
得ることがむずかしく、決定されるDNAの塩基
配列の精度を著しく低下させることになる。 以上の理由により、オートラジオグラフイーの
操作が煩雑なものとなつており、このことにより
DNAの塩基配列を決定するための操作全体が煩
雑になつている。 また、放射線フイルムの感光成分である銀塩は
物理的な刺激にも影響されやすく、露光操作時に
おける操作担当者の手あるいは機器との接触など
に起因する物理的圧力などによつて物理的カブリ
現象をこ起こす傾向がある。この点も得られる
DNAの塩基配列の精度を低下させる原因となり、
そのような放射線フイルムの物理的カブリの発生
を回避するためには、その取扱い作業において高
度の熟練と注意とを必要とし、塩基配列決定のた
めの操作をさらに複雑にする結果となる。 また、従来のオートラジオグラフイーでは上記
のように長時間の露光操作が行なわれるため、放
射性標識物質以外に支持媒体に混入した不純物に
よる放射能または自然放射能もまた放射線フイル
ムの露光に関与し、得られる放射性標識物質の位
置情報の精度を低下させるとの問題がある。その
ような妨害を排除して適切な露光条件を設定する
ためには、たとえば、対照試料を用いた並行実験
の実施、露光時間の適正化などが図られている
が、並行実験の実施による実験回数の増大、好適
な露光時間の決定を行なうための予備実験の必要
性などにより、その操作全体が煩雑になるとの欠
点がある。 さらに、従来のオートラジオグラフイーによる
DNAの塩基配列決定においては、画像化された
オートラジオグラフから必要な位置情報を得るた
めに、分離展開された放射性標識化されている
DNA断片の泳動距離を目視によつて読み取ると
いう単純な作業を長時間に渡つて行なうことが必
要であつた。 本発明者は、従来のオートラジオグラフイーを
利用するDNAもしくはDNA断片物の塩基配列決
定方法において附随する上記のような問題点の解
決を目的として鋭意研究を行なつた結果、感光材
料として放射線フイルムの代りに、輝尽光蛍光体
を含有する蓄積性蛍光体シートを用いることによ
り、前記の問題点の解決あるいは欠点の低減が実
現することを見出し、本発明に到達した。 すなわち、本発明は、 (1) 塩基配列を決定しようとしているDNAもし
くはDNA断片物と相補的な塩基配列を有し、
かつ放射性標識が付与されているDNA合成物
からなる混合物を調製する工程； (2) 該DNA合成物からなる混合物を支持媒体上
で分離展開させる工程； (3) 該支持媒体と、輝尽性蛍光体を含有する蓄積
性蛍光体シートとを一定時間重ね合わせること
により、該支持媒体上の放射性標識物質から放
出される放射線エネルギーの少なくとも一部を
該蓄積性蛍光体シートに吸収させたのち、該シ
ートを電磁波により励起して該シートに蓄積さ
れている放射線エネルギーを輝尽光として放出
させ、そしてその輝尽光を検出することによ
り、放射性標識が付与されたDNA合成物の位
置情報を得る工程；および、 (4) 得られた位置情報に基づいて、目的のDNA
もしくはDNA断片物の塩基配列を決定する工
程； を含むことを特徴とするオートラジオグラフイー
によるDNAもしくはDNA断片物の塩基配列決定
方法を提供するものである。 なお、本発明において支持媒体上の放射性標識
物質の「位置情報」とは、支持媒体上における放
射性標識物質もしくはその集合体の位置を中心と
する各種の情報、たとえば、支持媒体上に存在す
る放射性物質の集合体の存在位置と形状、その位
置における放射性物質の濃度、分布などからなる
情報の一つもしくは任意の組合わせとして得られ
る各種の情報を意味する。 本発明において使用する蓄積性蛍光体シートは
放射線像変換パネルとも呼ばれるものであり、そ
の例は、たとえば特開昭55−12145号公報などに
記載されており、一般的な構成としては既に公知
である。 すなわち、蓄積性蛍光体シートは輝尽性蛍光体
からなるものであり、被写体を透過した放射線エ
ネルギー、あるいは被検体から発せられた放射線
エネルギーを該シートの輝尽性蛍光体に吸収さ
せ、そののちに該シートを可視乃至赤外領域の電
磁波（励起光）を用いて励起することにより、該
シートの輝尽性蛍光体中に蓄積されている放射線
エネルギーを蛍光として放出させることができる
ものである。従つて、被写体あるいは被検体の放
射線像は、この蛍光を光電的に読み取つて電気信
号に変換し、得られた電気信号を写真フイルムな
どの記録材料、CRTなどの表示装置上に可視画
像として再生するか、あるいは数値化もしくは記
号化した位置情報などとして表わすことができ
る。 本発明の方法によれば、DNAの塩基配列を決
定するためのオートラジオグラフイーにおいて、
従来のオートラジオグラフイーで用いられている
放射線フイルム、あるいはそれと増感紙との組合
わせの代りに、輝尽性蛍光体を含有してなる蓄積
性蛍光体シートを用いることにより、露光時間の
大幅な短縮化が実現されるのみでなく、露光が環
境温度あるいはその付近の温度という温度条件で
行なわれても、得られる位置情報の精度は低下す
ることがない。従つて、従来においては冷却下で
長時間かけて実施されていた露光操作が著しく簡
便なものとなり、オートラジオグラフイー操作が
簡略化されるものである。 また、感光材料として蓄積性蛍光体シートを使
用した場合には、蓄積性蛍光体シートに蓄積記録
された放射性標識物質の位置情報を得るために特
に画像化する必要はなく、蓄積性蛍光体シートを
レーザーなどの電磁波で走査することにより上記
の位置情報を読み出し、その位置情報を画像、記
号および／または数値、あるいはそれらの組合わ
せなどの任意な形態に変えて取り出すことが可能
となる。さらに、上記の位置情報を電気的手段な
どを利用して更に処理することにより、所望の各
種の形態で、すなわち必ずしも画像の形で位置情
報を得るのではなく、その画像情報についてデー
タ処理して得られる他の情報として得ることも可
能である。本発明においては、蓄積性蛍光体シー
トを読み出して得られる放射性標識物質の位置情
報を有する電気信号あるいはデジタル信号を、電
気泳動などにより分離展開された分離パターンと
して画像情報の形で得るのみではなく、それをコ
ンピユータなどを利用して解析し、目的のDNA
の塩基配列情報として得ることも可能である。 さらに、オートラジオグラフイーの感光材料と
して上記の蓄積性蛍光体シートを利用することに
より、従来より放射線フイルムの使用において大
きな問題となつていた化学カブリおよび物理カブ
リが実質的に発生しなくなる点も、DNAの塩基
配列決定の精度の向上および作業性において非常
に有利に作用する。また、支持媒体中に含まれて
いた不純物の放射能または自然放射能などに起因
する精度の低下は、蓄積性蛍光体シートに蓄積記
録されている位置情報を電気的に処理することに
より容易に低減あるいは解消することが可能とな
る。 従つて、支持媒体上に分離展開された放射性標
識物質の位置情報に基づくDNAの塩基配列決定
のための解析操作は著しく容易になり、同時に決
定されるDNAの塩基配列の精度を高めてその解
析効率を向上させることが可能となる。 以下に、本発明のオートラジオグラフイーによ
るDNAもしくはDNA断片物の塩基配列決定方法
について、ジデオキシ法（dideoxy
sequencingmethodまたは、鎖停止法ともいう）
を例にとり、詳細に説明する。この方法は、前述
のサンガー・クールソン法のうち最も簡便かつ精
度の高い方法として汎用されている方法である。 まず、検体DNAを含む一本鎖のDNAを用意す
る。これをテンプレートDNAと呼ぶ。このDNA
の一部に対して相補的な短いDNA断片（プライ
マーと呼ばれる）を用意し、テンプレートDNA
とハイブリダイズさせたのち、テンプレート
DNAと相補的なDNAの合成を行なう。 DNAの合成は、プライマーを有するテンプレ
ートDNAに、四種類の塩基をそれぞれ含むデオ
キシヌクレオシドトリフオスフエート（dNTP）
四種と特定の塩基を含むジデオキシヌクレオシド
トリフオスフエート（ddNTP）一種とを加え、
DNAポリメラーゼを作用させることにより、テ
ンプレートDNAのプライマー部分からDNA鎖を
伸長させて行なわれる。この合成過程において、
テンプレートDNAにジデオキシヌクレオシドト
リフオスフエートが組み込まれるとDNAの合成
反応はそこで停止するため、プライマーから特定
の塩基の位置まで伸長された検体DNAと相補的
なDNA断片が得られる。たとえば、ジデオキシ
アデノシントリフオスフエート（ddATP）を用
いた場合には、末端がアデニン（Ａ）で終わる
種々の長さのDNA断片の混合物が得られる。 上記DNAの合成において、四種のデオキシヌ
クレオシドトリフオスフエートのうちの少なくと
も一種ヌクレオチドとして32Pなどの放射性元素
で標識化されたものを用いることにより、放射性
標識が付与された合成DNA断片を得ることがで
きる。 上記の合成工程を異なる四種のジデオキシヌク
レオシドトリフオスフエートを用いて四回繰り返
えし、四種類の塩基特異的DNA合成物を得る。 なお、以上に記述したジデオキシヌクレオシド
トリフオスフエートを用いるDNA断片の合成法、
および得られたDNA合成物によるDNAの塩基配
列決定法の詳細については、たとえば次の文献に
詳細に記載されている。 Sanger、F.、Nicklen、S.＆ Coulson、A.
R.、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、74、pp.5463−
5467（1977） また、テンプレートDNAを得る方法としては
種々のものが考案されているが、バクテリオフオ
ージM13を用いたクローニング方法が最も簡便で
あり、この方法についてはたとえば、次の文献に
詳細に記載されている。 Scheier、P.H.、＆ Cortese、R.、J.Mol.
Biol.、129、pp.169−172（1979） 次に、得られた四種類の合成DNA断片混合物
についてゲル電気泳動操作を行ない、各々の混合
物が分離展開されてなる支持媒体を得る。 この放射性標識化された合成DNA断片が分離
展開された支持媒体について、オートラジオグラ
フ測定を行なうことにより、検体DNAの塩基配
列を決定する。 本発明の特徴的な要件である支持媒体上に分離
展開されてなる放射性標識物質の位置情報を得る
ためのオートラジオグラフイーは、まず、上記支
持媒体と蓄積性蛍光体シートとを一定時間重ね合
わせて露光操作を行なうことにより、支持媒体上
の放射性標識物質から放出される放射線の少なく
とも一部を該シートに吸収させる。 露光操作において、上記の支持媒体と蓄積性蛍
光体シートとを重ね合わせた状態は、通常は蓄積
性蛍光体シートと密着させることにより実現する
が、必ずしも支持媒体と蓄積性蛍光体シートとを
密着させる必要はなく、それらが近接した状態で
配置されていてもよい。また、支持媒体は必ずし
も乾燥状態とする必要はなく、湿つていてもよい
し、あるいは所望により放射性標識されたDNA
断片からの放射線を妨げない程度の厚みのポリエ
チレンシート等で包まれていてもよい。 また、いわゆる露光時間は、支持媒体に含まれ
る放射性標識物質の放射線強度、該物質の量、蓄
積性蛍光体シートの感度、および支持媒体の蓄積
性蛍光体シートとの位置関係などにより変動する
が、露光操作は一定時間、たとえば数秒程度以上
は必要とする。ただし、本発明に従つて感光材料
として蓄積性蛍光体シートを用いた場合には、従
来の放射線フイルムを使用する場合に必要な露光
時間に比較して、その露光時間は大幅に短縮され
る。また、露光により支持媒体から蓄積性蛍光体
シートに蓄積記録された支持媒体中の放射性標識
物質の位置情報を読み出す操作において、該シー
トに蓄積されているエネルギーの強さ、分布、所
望とする情報などに応じて各種の電気的処理を施
すことにより、たとえば得られる電気信号の増幅
率を任意の値に設定できるなど、得られる位置情
報を好適に処理することが可能となるため、露光
操作時における露光時間の厳密な制御は特に必要
とはしない。 また、露光操作を実施する温度は特に制限はな
いが、本発明における蓄積性蛍光体シートを利用
したオートラジオグラフイーは、約10〜35℃など
の環境温度にて実施することが可能である。ただ
し、従来のオートラジオグラフイーにおいて利用
されている低温（たとえば５℃付近、あるいはそ
れ以下の温度）において露光操作を行なうことも
差しつかえない。 上記オートラジオグラフイーにおいて好適に使
用される蓄積性蛍光体シートは、一般に基本構造
として、支持体と、この支持体上に設けられた輝
尽性蛍光体を分散状態で含有支持する結合剤から
なる蛍光体層とから構成される。ただし、蛍光体
層が自己支持性である場合には、必ずしも支持体
を設ける必要はない。 上記の構成を有する蓄積性蛍光体シートは、た
とえば、次に述べるような方法により製造するこ
とができる。 まず、輝尽性蛍光体粒子と結合剤とを適当な溶
剤（たとえば、低級アルコール、塩素原子含有炭
化水素、ケトン、エステル、エーテル）に加え、
これを充分に混合して、結合剤溶液中に輝尽性蛍
光体が均一に分散した塗布液を調製する。 結合剤の例としては、ゼラチン等の蛋白質、ポ
リ酢酸ビニル、ニトロセルロース、ポリウレタ
ン、ポリビニルアルコール、線状ポリエステルな
どのような合成高分子物質などにより代表される
結合剤を挙げることができる。 塗布液における結合剤と輝尽性蛍光体との混合
比は、通常１：８乃至１：40（重量比）の範囲か
ら選ばれる。 次に、この塗布液を支持体の表面に均一に塗布
することにより塗布液の塗膜を形成する。この塗
膜を徐々に加熱することにより乾燥して、支持体
上への蛍光体層の形成を完了する。蛍光体層の層
厚は、一般に50乃至500μmである。 支持体としては、従来の放射線写真法における
増感紙（または増感スクリーン）の支持体として
用いられている各種の材料から任意に選ぶことが
できる。そのような材料の例としては、セルロー
スアセテート、ポリエチレンテレフタレートなど
のプラスチツク物質のフイルム、アルミニウム箔
などの金属シート、通常の紙、バライタ紙、レジ
ンコート紙などを挙げることができる。 なお、支持体の蛍光体層が設けられる側の表面
には、接着性付与層、光反射層、光吸収層などが
設けられていてもよい。 さらに、蛍光体層の支持体に接する側とは反対
側の表面に、蛍光体層を物理的および化学的に保
護するための透明な保護膜が設けられていてもよ
い。透明保護膜に用いられる材料の例としては、
酢酸セルロース、ポリメチルメタクリレート、ポ
リエチレンテレフタレート、ポリエチレンを挙げ
ることができる。透明保護膜の膜厚は、通常は約
0.1乃至20μmである。 また、蓄積性蛍光体シートの表面は必要に応じ
て、親水化処理などの表面処理が施されていても
よい。 本発明において利用される蓄積性蛍光体シート
に用いられる輝尽性蛍光体は、先に述べたように
放射線を照射した後、励起光を照射すると輝尽発
光を示す蛍光体であるが、実用的な面からは400
〜850nmの波長範囲の励起光によつて300〜
500nmの波長範囲の輝尽発光を示す蛍光体である
ことが望ましい。そのような輝尽性蛍光体の例と
しては、 米国特許第3859527号明細書に記載されている
SrS：Ce、Sm、SrS：Eu、Sm、ThO2：Er、お
よびLa2O2S：Eu、Smなどの組成式で表わされ
る蛍光体、 特開昭55−12142号公報に記載されている
ZnS：Cu、Pb、BaO・xAl2O3：Eu〔ただし、0.8
≦ｘ≦10〕、および、M2+O・xSiO2：Ａ〔ただし、
M2+はMg、Ca、Sr、Zn、Cd、またはBaであり、
ＡはCe、Tb、Eu、Tm、Pb、Tl、Bi、または
Mnであり、ｘは、0.5≦ｘ≦2.5である〕などの
組成式を表わされる蛍光体、 特開昭55−12143号公報に記載されている
（Ba1-x-y、Mgx、Cay）FX：aEu2+〔ただし、Ｘ
はClおよびBrのうちの少なくとも一つであり、
ｘおよびｙは、０＜ｘ＋ｙ≦0.6、かつxy≠０で
あり、ａは、10-6≦ａ≦５×10-2である〕の組成
式で表わされる蛍光体、 特開昭55−12144号公報に記載されている
LnOX：xA〔ただし、LnはLa、Ｙ、Gd、および
Luのうちの少なくとも一つ、ＸはClおよびBrの
うちの少なくとも一つ、ＡはCeおよびTbのうち
の少なくとも一つ、そして、ｘは、０＜ｘ＜0.1
である〕の組成式で表わされる蛍光体、 特開昭55−12145号公報に記載されている
（Ba1-x、M〓ｘ）FX：yA〔ただし、M〓はMg、
Ca、Sr、Zn、およびCdのうちの少なくとも一
つ、ＸはCl、Br、およびＩのうちの少なくとも
一つ、ＡはEu、Tb、Ce、Tm、Dy、Pr、Ho、
Nd、Yb、およびErのうちの少なくとも一つ、そ
してｘは、０≦ｘ≦0.6、ｙは、０≦ｙ≦0.2であ
る〕の組成式で表わされる蛍光体、 特開昭55−160078号公報に記載されているM〓
FX・xA：yLn〔ただし、M〓はBa、Ca、Sr、
Mg、Zn、およびCdのうちの少なくとも一種、Ａ
はBeO、MgO、CaO、SrO、BaO、ZnO、
Al2O3、Y2O3、La2O3、In2O3、SiO2、TlO2、
ZrO2、GeO2、SnO2、Nb2O5、Ta2O5、および
ThO2のうちの少なくとも一種、LnはEu、Tb、
Ce、Tm、Dy、Pr、Ho、Nd、Yb、Er、Sm、
およびGdのうちの少なくとも一種、ＸはCl、
Br、およびＩのうちの少なくとも一種であり、
ｘおよびｙはそれぞれ５×10-5≦ｘ≦0.5、およ
び０＜ｙ≦0.2である〕の組成式で表わされる蛍
光体、 特開昭56−116777号公報に記載されている
（Ba1-x、M〓x）F2・aBaX2：yEu、zA〔ただし、
M〓はベリリウム、マグネシウム、カルシウム、
ストロンチウム、亜鉛、およびカドミウムのうち
の少なくとも一種、Ｘは塩素、臭素、および沃素
のうちの少なくとも一種、Ａはジルコニウムおよ
びスカンジウムのうちの少なくとも一種であり、
ａ、ｘ、ｙ、およびｚはそれぞれ0.5≦ａ≦1.25、
０≦ｘ≦１、10-6≦ｙ≦２×10-1、および０＜ｚ
≦10-2である〕の組成式で表わされる蛍光体、 特開昭57−23673号公報に記載されている
（Ba1-x、M〓x）F2・aBaX2：yEu、zB〔ただし、
M〓はベリリウム、マグネシウム、カルシウム、
ストロンチウム、亜鉛、およびカドミウムのうち
の少なくとも一種、Ｘは塩素、臭素、および沃素
のうちの少なくとも一種であり、ａ、ｘ、ｙ、お
よびｚはそれぞれ0.5≦０≦1.25、０≦ｘ≦１、
10-6≦ｙ≦２×10-1、および０＜ｚ≦２×10-1で
ある〕の組成式で表わされる蛍光体、 特開昭57−23675号公報に記載されている
（Ba1-x、M〓x）F2・aBaX2：yEu、zB〔ただし、
M〓はベリリウム、マグネシウム、カルシウム、
ストロンチウム、亜鉛、およびカドミウムのうち
の少なくとも一種、Ｘは塩素、臭素、および沃素
のうちの少なくとも一種、Ａは砒素および硅素の
うちの少なくとも一種であり、ａ、ｘ、ｙ、およ
びｚはそれぞれ0.5≦ａ≦1.25、０≦ｘ≦１、10-6
≦ｙ≦２×10-1、および０＜ｚ≦５×10-1であ
る〕の組成式で表わされる蛍光体、 本出願人による特開昭56−167498号明細書に記
載されているM〓OX：xCe〔ただしM〓はPr、Nd、
Pm、Sm、Eu、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb、
およびBiからなる群より選ばれる少なくとも一
種の三価金属であり、ＸはClおよびBrのうちの
いずれか一方あるいはその両方であり、ｘは０＜
ｘ＜0.1である〕の組成式で表わされる蛍光体、 本出願人による特開昭57−89875号明細書に記
載されているBa1-xMx/2Lx/2FX：yEu2+〔ただし、
Ｍは、Li、Na、Ｋ、Rb、およびCsからなる群よ
り選ばれる少なくとも一種のアルカリ金属を表わ
し；Ｌは、Sc、Ｙ、La、Ce、Pr、Nd、Pm、
Sm、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb、Lu、
Al、Ga、In、およびTlからなる群より選ばれる
少なくとも一種の三価金属を表わし；Ｘは、Cl、
Br、およびＩからなる群より選ばれる少なくと
も一種のハロゲンを表わし；そして、ｘは10-2≦
ｘ≦0.5、ｙは０＜ｙ≦0.1である〕の組成式で表
わされる蛍光体、 本出願人による特開昭57−137374号明細書に記
載されているBaFX・xA：yEu2+〔ただし、Ｘは、
Cl、Br、およびＩからなる群より選ばれる少な
くとも一種のハロゲンであり；Ａは、テトラフル
オロホウ酸化合物の焼成物であり；そして、ｘは
10-6≦ｘ≦0.1、ｙは０＜ｙ≦0.1である〕の組成
式で表わされる蛍光体、 本出願人による特開昭57−158048号明細書に記
載されているBaFX・xA：yEu2+〔ただし、Ｘは、
Cl、Br、およびＩからなる群より選ばれる少な
くとも一種のハロゲンであり；Ａは、ヘキサフル
オロケイ酸、ヘキサフルオロチタン酸およびヘキ
サフルオロジルコニウム酸の一価もしくは二価金
属の塩からなるヘキサフルオロ化合物群より選ば
れる少なくとも一種の化合物の焼成物であり；そ
して、ｘは10-6≦ｘ≦0.1、ｙは０＜ｙ≦0.1であ
る〕の組成式で表わされる蛍光体、 本出願人による特開昭57−166320号明細書に記
載されているBaFX・xNaX′：aEu2+〔ただし、
ＸおよびX′は、それぞれCl、Br、およびＩのう
ちの少なくとも一種であり、ｘおよびａはそれぞ
れ０＜ｘ≦２、および０＜ａ≦0.2である〕の組
成式で表わされる蛍光体、 本出願人による特開昭57−166696号明細書に記
載されているM〓FX・xNaX′：yEu2+：zA〔ただ
し、M〓は、Ba、Sr、およびCaからなる群より
選ばれる少なくとも一種のアルカリ土類金属であ
り；ＸおよびX′は、それぞれCl、Br、およびＩ
からなる群より選ばれる少なくとも一種のハロゲ
ンであり；Ａは、Ｖ、Cr、Mn、Fe、Co、およ
びNiより選ばれる少なくとも一種の遷移金属で
あり；そして、ｘは０＜ｘ≦２、ｙは０＜ｙ≦
0.2、およびｚは０＜ｚ≦10-2である〕の組成式
で表わされる蛍光体、 本出願人による特開昭57−184455号明細書に記
載されているM〓FX・aMIX′・bM′〓X″2・cM〓
X″′3・xA：yEu2+〔ただし、M〓はBa、Sr、およ
びCaからなる群より選ばれる少なくとも一種の
アルカリ土類金属であり；MIはLi、Na、Ｋ、
Rb、およびCsからなる群より選ばれる少なくと
も一種のアルカリ金属であり；M′〓はBeおよび
Mgからなる群より選ばれる少なくとも一種の二
価金属であり；M〓はAl、Ga、In、およびTlか
らなる群より選ばれる少なくとも一種の三価金属
であり；Ａは金属酸化物であり；ＸはCl、Br、
およびＩからなる群より選ばれる少なくとも一種
のハロゲンであり；X′、X″、およびX″′は、Ｆ、
Cl、Br、およびＩからなる群より選ばれる少な
くとも一種のハロゲンであり；そして、ａは０≦
ａ≦２、ｂは０≦ｂ≦10-2、ｃは０≦ｃ≦10-2、
かつａ＋ｂ＋ｃ≧10-6であり；ｘは０＜ｘ≦0.5、
ｙは０＜ｙ≦0.2である〕の組成式で表わされる
蛍光体、 などを挙げることができる。 ただし、本発明の方法に用いられる蓄積性蛍光
体シートに含まれる輝尽性蛍光体は上述の蛍光体
に限られるものではなく、放射線の照射を受けた
のち励起光の照射を受けた場合に輝尽発光を示す
蛍光体であればいかなるものであつてもよい。 本発明に従うオートラジオグラフイーに利用さ
れる蓄積性蛍光体シートの詳細については、たと
えば本出願人による特開昭57−193418号明細書に
記載されている。 次に、蓄積性蛍光体シートに蓄積記録された支
持媒体上の放射性標識物質の位置情報の読み出し
が行なわれる。この読み出し方法について、添付
図面の第１図に示した読出装置（あるいは読取装
置）の例を参照しながら略述する。 第１図は、蓄積性蛍光体シート（以下において
は、シートと略記することもある）１に蓄積記録
されている放射性標識物質の二次元的な位置情報
を仮に読み出すための先読み用読出部２と、放射
性標識物質の位置情報を出力するためにシート１
に蓄積記録されている放射線画像を読み出す機能
を有する本読み用読出部３から構成される読出装
置の例の概略図を示している。 先読み用読出部２においては次のような先読み
操作が行なわれる。 レーザー光源４から発生したレーザー光５はフ
イルター６を通過することにより、このレーザー
光５による励起に応じて蓄積性蛍光体シート１か
ら発生する輝尽発光の波長領域に該当する波長領
域の部分がカツトされる。次いでレーザー光は、
ガルバノミラー等の光偏向器７により偏向処理さ
れ、平面反射鏡８により反射されたのちシート１
上に一次元的に偏向して入射する。ここで用いる
レーザー光源４は、そのレーザー光５の波長領域
が、シート１から発する輝尽発光の主要波長領域
と重複しないように選択される。 蓄積性蛍光体シート１は、上記の偏向レーザー
光の照射下において矢印９の方向に移送される。
従つて、シート１の全面にわたつて偏向レーザー
光が照射されるようになる。なお、レーザー光源
４の出力、レーザー光５のビーム径、レーザー光
５の走査速度、シート１の移送速度については、
先読み操作のレーザー光５のエネルギーが本読み
操作に用いられるエネルギーよりも小さくなるよ
うに調整される。 蓄積性蛍光体シート１は、上記のようなレーザ
ー光の照射を受けると、蓄積記録されている放射
線エネルギーに比例する光量の輝尽発光を示し、
この光は先読み用導光性シート１０に入射する。
この導光性シート１０はその入射面が直線状で、
蓄積性蛍光体シート１上の走査線に対向するよう
に近接して配置されており、その射出面は円環を
形成し、フオトマルなどの光検出器１１の受光面
に連絡している。この導光性シート１０は、たと
えばアクリル系合成樹脂などの透明な熱可塑性樹
脂シートを加工してつくられたもので、入射面よ
り入射した光がその内部において全反射しながら
射出面へ伝達されるように構成されている。蓄積
性蛍光体シート１からの輝尽発光はこの導光性シ
ート１０内を導かれて射出面に到達し、その射出
面から射出されて光検出器１１に受光される。 光検出器１１の受光面には、輝尽発光の波長領
域の光のみを透過し、励起光（レーザー光）の波
長領域の光をカツトする支持媒体が貼着され、輝
尽発光のみを検出しうるようにされている。光検
出器１１により検出された輝尽発光は電気信号に
変換され、さらに増幅器１２により増幅され出力
される。増幅器１２から出力された蓄積記録情報
は、本読み用読出部３の制御回路１３に入力され
る。制御回路１３は、得られた蓄積記録情報に応
じて、濃度およびコントラストが最も均一でかつ
観察読影性能の優れた画像が得られるように、増
幅率設定値ａ、収録スケールフアクターｂ、およ
び、再生画像処理条件設定値ｃを出力する。 以上のようにして先読み操作が終了した蓄積性
蛍光体シート１は、本読み用読出部３へ移送され
る。本読み用読出部３においては次のような本読
み操作が行なわれる。 本読み用レーザー光源１４から発せられたレー
ザー光１５は、前述のフイルター６と同様な機能
を有するフイルター１６を通過したのちビーム・
エクスパンダー１７によりビーム径の大きさが厳
密に調整される。次いでレーザー光は、ガルバノ
ミラー等の光偏向器１８により偏向処理され、平
面反射鏡１９により反射されたのち蓄積性蛍光体
シート１上に一次元的に偏向して入射する。な
お、光偏向器１８と平面反射鏡１９との間にはfθ
レンズ２０等が配置され、シート１の上を偏向レ
ーザー光が走査した場合に、常に均一なビーム速
度を維持するようにされている。 蓄積性蛍光体シート１は、上記の偏向レーザー
光の照射下において、矢印２１の方向に移送され
る。従つて、先読み操作におけると同様にシート
１の全面にわたつて偏向レーザー光が照射される
ようになる。 蓄積性蛍光体シート１は、上記のようにしてレ
ーザー光の照射を受けると、先読み操作における
と同様に、蓄積記録されている放射線エネルギー
に比例する光量の輝尽発光を発し、この光は本読
み用導光性シート２２に入射する。この本読み用
導光性シート２２は本読み用導光性シート１０と
同様の材質、構造を有しており、本読み用導光性
シート２２の内部を全反射を繰返しつつ導かれた
輝尽発光はその射出面から射出されて、光検出器
２３に受光される。なお、光検出器２３の受光面
には輝尽発光の波長領域のみを選択的に透過する
フイルターが貼着され、光検出器２３が輝尽発光
のみを検出するようにされている。 光検出器２３により検出された輝尽発光は電気
信号に変換され、前記の増幅率設定値ａに従つて
感度設定された増幅器２４において適正レベルの
電気信号に増幅されたのち、Ａ／Ｄ変換器２５に
入力される。Ａ／Ｄ変換器２５は、収録スケール
フアクター設定値ｂに従い信号変動幅に適したス
ケールフアクターでデジタル信号に変換され、信
号処理回路２６に入力される。信号処理回路２６
では、再生画像処理条件設定値ｃに基づいて、濃
度およびコントラストが適正で観察読影性能の優
れた可視画像が得られるように信号処理が行なわ
れ、処理された情報は磁気テープなどの保存手段
に蓄えられる。次いで、必要に応じて所望の記録
装置（図示なし）へ伝送される。 記録装置としては、たとえば、感光材料上をレ
ーザー光等で走査して光学的に記録するもの、
CRT等に電子的に表示するもの、CRT等に表示
された放射線画像をビデオ・プリンター等に記録
するもの、熱線を用いて感熱記録材料上に記録す
るものなど種々の原理に基づいた記録装置を用い
ることができる。 ただし、記録装置は上記のように可視画像化す
るものに限られるものではなく、前述したように
放射性標識物質の二次元的な位置情報を、たとえ
ば数値化もしくは記号化するなどして記録するこ
ともできる。 なお、本発明における蓄積性蛍光体シートに蓄
積記録された支持媒体上の放射性標識物質の位置
情報を読み出すための方法について、上記におい
ては先読み操作と本読み操作とからなる読出し操
作を説明したが、本発明において利用することが
できる読出し操作は、上記の例に限られるもので
はない。たとえば、支持媒体上の放射性物質の放
射線強度および、その支持媒体についての蓄積性
蛍光体シートの露光時間が予めわかつていれば、
上記の例において先読み操作を省略することもで
きる。 また、本発明における蓄積性蛍光体シートに蓄
積記録された放射性標識物質の位置情報を読み出
すための方法は、上記に例示した方法に限られる
ものではない。 このようにして得られた支持媒体上の放射性標
識物質の二次元的な位置情報に基づいて、DNA
の塩基配列を決定することができる。すなわち、
末端がそれぞれＡ、Ｇ、Ｔ、Ｃのうちのいずれか
の特定の塩基のみからなる合成DNA断片混合物
（塩基特異的DNA合成物）の各分離展開列間で放
射性標識物質の位置（泳動距離）を相互に比較す
ることにより、泳動距離の長い順に末端の塩基を
帰属させていくことにより、その塩基配列を決定
することができる。 なお、このようにしてDNA合成物に対して塩
基配列を決定することは、上記の一本鎖のDNA
合成物が目的とする検体DNAの片方のDNA鎖と
相補的であるところから、二本鎖の検体DNAの
うちの一本鎖の塩基配列を決定することに等し
い。そして、この塩基配列の決められた片方の
DNA鎖から、二本鎖の検体DNA全てについてそ
の塩基配列を決定することができる。あるいは、
検体DNAが一本鎖のものである場合には、DNA
合成物に対して塩基配列を決定することによつて
これに相補的なDNAの塩基配列が決定されるこ
とになり、得られた塩基配列から一本鎖の検体
DNAの塩基配列を決定することができる。 本発明において、オートラジオグラフイーを利
用して支持媒体上の放射性標識物質の二次元的な
位置情報を得ることによりDNAの塩基配列を決
定する方法は、上記のような放射線フイルム等に
オートラジオグラフを可視画像化する方法に限ら
れるものではなく、たとえば、その位置情報を数
値化もしくは記号化することにより、得られた数
値・記号等のデジタル値に基づいてDNAの塩基
配列を決定することも可能である。 さらには、得られたデジタル信号にDNAの塩
基配列決定のための好適な信号処理を行なうこと
により、直接に検体DNAの塩基配列を得ること
も可能である。このような信号処理方法について
は、たとえば本出願人による下記の特許出願の明
細書に記載されている。 特願昭58−1326号、特願昭58−1327号、特願昭
58−1328号および特願昭58−1329号。 上記においては、サンガー・クールソン法のう
ちジデオキシ法を利用するDNAの塩基配列決定
方法について説明したが、本発明の方法は、上記
のジデオキシ法に限定されるものではなく、プラ
ス・マイナス法などの別のサンガー・クールソン
法に適用することもできる。さらに、本発明の方
法はサンガー・クールソン法に限られるものでは
なく、オートラジオグラフイーによりDNA合成
物を利用してその塩基配列を決定することができ
る方法であればいかなる方法にも適用することが
可能である。 また、合成DNA断片に放射性標識を付与する
ために、ヌクレオチドに用いられる放射性核種の
例としては、32P、3H、14C、35Sを挙げることができ
る。 次に本発明の実施態様を、前述のジデオキシ法
を利用したサンガー・クールソン法を例にして記
載する。なお、以下の実施例および比較例におい
て用いた検体DNA（プラスミドpBR322）は既に
その塩基配列が解明されており、得られた塩基配
列の結果を、それらの既知データと比較して評価
した。 また、以下の実施例において使用した蓄積性蛍
光体シートは下記の方法により製造されたもので
ある。 輝尽性の二価のユーロピウム賦活弗化臭化バリ
ウム蛍光体（BaFBr：Eu2+）の粒子と線状ポリ
エステル樹脂との混合物にメチルエチルケトンを
添加し、さらに硝化度11.5％のニトロセルロース
を添加して蛍光体粒子を分散状態で含有する分散
液を調製する。次に、この分散液に燐酸トリクレ
ジル、ｎ−ブタノール、そしてメチルエチルケト
ンを添加したのち、プロペラミキサーを用いて充
分に撹拌混合して、蛍光体粒子が均一に分散し、
結合剤と蛍光体との混合比が１：25（重量比）か
つ粘度が25〜35PS（25℃）の塗布液を調製する。 次に、ガラス板上に水平に置いたカーボンブラ
ツク練り込みポリエチレンテレフタレートシート
（支持体、厚み：250μm）の上に塗布液をドクタ
ーブレードを用いて均一に塗布する。そして塗布
後に、塗膜が形成された支持体を乾燥器内に入
れ、この乾燥器内部の温度を25℃から100℃に
徐々に上昇させて、塗膜の乾燥を行なつた。この
ようにして、支持体上に層厚が300μmの蛍光体層
を形成する。 そして、この蛍光体層の上に、透明なポリエチ
レンテレフタレートフイルム（厚み：12μm）の
片面にポリエステル系接着剤を付与したのち、接
着剤層側を下に向けて置いて接着することによ
り、保護膜を形成し、支持体、蛍光体層および保
護膜から構成された蓄積性蛍光体シートを製造す
る。 実施例 １ (1) 検体DNAを含むテンプレートDNAの調製 常法により、大腸菌プラスミドDNA
（pBR322）を制限酵素Hind−により切断し
てDNA断片100ngを得た。これに、バクテリ
オフアージM13mp8株（アマシヤム社製、
N4501）を上記と同じ制限酵素Hind−で処
理したもの20ngをベクターDNAとして加え、
T4DNAリガーゼを用いて常法により接合させ
た。その後、対数成長期にあるE.ColiK12株に
この組換えDNAを感染させて、一夜培養した。 得られた組換えDNA（M13）を含むE.ColiK
培養菌（無色のプラーク）１mlを、２×TY培
地（１当り、バクトトリプトン16g、イース
ト抽出物10g、および塩化ナトリウム5gを含
む）100ml上に木製のカクテルステイツクを用
いて植え付けた。これを培養管に移して37℃の
温度で５時間振とうしたのち、遠心分離を行な
つてその上澄み液を採取することにより、大腸
菌を注意深く除去した。 この上澄み液を20％PEG（ポリエチレングリ
コール6000）と2.5M塩化ナトリウムとを含む
液に加え、よく撹拌したのち、遠心分離により
PEG層を取り除いた。底部に残つたペレツト
状の固形物にTE緩衝液（10mMトリス・塩酸
溶液および1mMのEDTAを含む、PH8.0）100μ
を加え、次いでTE緩衝液で飽和されたフエ
ノール50μを加えて撹拌したのち、室温で15
分間放置した。得られた懸濁液に遠心分離を行
ない、その上澄み液を3M酢酸ナトリウム溶液
10μ中に移し、さらにエタノール250μを加
えて−20℃の温度で一夜放置した。これを遠心
分離にかけて、その沈澱物を冷メタノールで洗
浄し、乾燥したのち、乾燥物をTE緩衝液50μ
に溶解して検体DNAを含むテンプレート
DNA溶液を得た。 (2) テンプレートDNA上へのプライマーのハイ
ブリダイゼーシヨン 蒸留水2.5μに、上記のテンプレート
DNA5μ、M13プライマー（アマシヤム社
製、N4502）1μおよびKlenow反応緩衝液
（10mMトリス、PH8.5および10mM塩化マグネ
シウムを含む）1.5μを加えた後、55〜60℃の
温度で２時間培養して、プライマーがハイブリ
ダイズしたテンプレートDNAを得た。 (3) 合成反応 上記プライマーがハイブリダイズしたテンプ
レートDNAに、〔α−32P〕dATP（比放射能：
800Ci／ｍ mole、アマシヤム社製、
PB10384）2μおよびKlenowフラグメント
（DNAポリメラーゼＩ）1μ（1unit）を加え
た。四本の試験管にこの混合物を2.5μずつ取
り、さらに下記の第１表に示される成分からな
る反応用モノヌクレオチドの混合液（Ａ＃、Ｃ
＃、Ｇ＃またはＴ＃）2μを添加して混合し、
四種類の混合液を得た。これらの混合液を室温
にて15分間反応させた後、それぞれにチエイス
反応溶液（0.5mMの四種のモノデオキシヌク
レオシドトリフオスフエートの混合液）2μ
を加えて、さらに15分間反応させた。次いで、
イオン交換処理したホルムアミド4μを加え
て反応を停止させた。
【表】
【表】
このようにしてＡ＃〜Ｔ＃の四種類の溶液を
用いて合成することにより、アデニン（Ａ）特
異的DNA合成物、シトシン（Ｃ）特異的DNA
合成物、グアニン（Ｇ）特異的DNA合成物、
およびチミン（Ｔ）特異的DNA合成物を得た。 (4) 電気泳動用ゲルの調製 アクリルアミド5.7g、Ｎ，N′−メチレンビス
アクリルアミド0.3g、尿素42gおよび20mMの
EDTAを含む1.0Mトリス・ホウ酸緩衝液（PH
8.3）10mlを蒸留水に溶解して全量を100mlとし
てゲル液を得た。このゲル液に窒素ガスを吹込
んで酸素を除いた後、これに10％過硫酸アンモ
ニウム水溶液600μと触媒のTEMED（テトラ
メチルエチレンジアミン）100μを加えた。
こようにして処理したゲル液を、充分に洗浄し
た二枚の厚さ３mmのガラス板から形成したモー
ルド（0.5mm×200mm×400mm）の中に注入し、
さらに上記のゲル液の上端部に、四個のスロツ
ト（各、0.5mm×15mm×20mm）形成用のスロツ
トフオーマーを挿入したのち、一夜放置してゲ
ル化させて目的の四個のスロツトを有する電気
泳動用ゲルを調製した。 (5) 電気泳動操作 上述のようにして調製されたゲルを電気泳動
装置に装着したのち、 第１スロツトに（Ａ）特異的DNA合成物、 第２スロツトに（Ｃ）特異的DNA合成物、 第３スロツトに（Ｇ）特異的DNA合成物、 第４スロツトに（Ｔ）特異的DNA合成物、 各々2μを、ミクロピペツトを用いて注入
した。この際に、スロツトに電極液を吹き付け
ることにより、ゲル中から溶出する尿素を除去
してスロツトを洗浄したのち、上記DNA合成
物の注入を行なつた。 このゲルに2000V／40cmの直流電圧を印加し
て試料の電気泳動を行なつた。電気泳動は、
DNA試料中に予め添加しておいたマーカー色
素BPB（ブロムフエノールブルー）がゲルの下
端から約３cmの位置に達するまで継続したのち
電源を切り、ゲルを泳動装置から取り外した。 次いで一方のガラス板を除去したのち、ゲル
を10％酢酸中に15分間ずつ液を換えて数回浸漬
してDNAを固定し、さらにゲルを濾紙上に移
し、減圧下にて加熱乾燥した。 (6) オートラジオグラフ測定操作 上記において得られた乾燥ゲルと蓄積性蛍光
体シートとを重ね合わせてカセツト内に収納
し、室温（約20℃）にて、10分間露光したの
ち、第１図に示した読出装置に装填して、蓄積
性蛍光体シートに転写蓄積されたゲル支持媒体
上の放射性標識物質の位置を示す四列のオート
ラジオグラフを読み出し、次いでその位置情報
をデジタル信号として記憶装置に保存させた。 上記のデジタル情報に基づいてオートラジオ
グラフの可視画像を得たところ、鮮明な画像が
得られた。そして、この可視化されたオートラ
ジオグラフを既知の大腸菌プラスミドDNA
（pBR322）のオートラジオグラフと照合した
ところ、充分な一致が見られた。 (7) DNAの塩基配列の決定 得られたオートラジオグラフ上の各々のスロ
ツトの泳動列において、スロツトの底から各泳
動帯（分子量の相違によつて分離された放射性
標識DNA断片に対応している）までの距離を
測定し、最も泳動距離の大きいものから順に並
べることにより数列｛xy i｝を得た。ここで、ｘ
は泳動距離、ｙは各塩基別のスロツトに対応す
る記号（この場合は、第１スロツトがＡ、第２
スロツトがＣ、第３スロツトがＧ、そして第４
スロツトがＴである）、ｉは上記のようにして
並べたときの順位を意味する。 次に、全てのxy iについてそのスロツトに対応
する記号（ｙ）を順に並べることにより、
DNAの塩基配列を得た。 以上のようにして得られた塩基配列は、調査
対象とした大腸菌プラスミドDNA（pBR322）
の既知の塩基配列に一致した。 上記の結果から、蓄積性蛍光体シートを用い
て室温で短時間のオートラジオグラフイー操作
を行なうことにより、バクテリオフアージM13
を用いてクローニングしたpBR322の塩基配列
をジデオキシ法によつて決定できることが明ら
かである。 比較例 １ 実施例１の(6)オートラジオグラフイー測定操作
において、乾燥ゲルによる蓄積性蛍光体シートの
露光操作を、蓄積性蛍光体シートの代りにＸ線フ
イルム（RXタイプ：富士写真フイルム(株)製）を
使用し、通常のＸ線フイルム用カセツテに収納し
て実施例１と同一の条件（室温）10分間露光）に
て露光操作を行なつた。次いでＸ線フイルムを現
像したが、判読可能なオートラジオグラフを得る
ことができなかつた。 次に上記の露光操作を、通常のジデオキシ法に
準じて−80℃にて1200分間実施したのち、同様に
Ｘ線フイルムを現像したところ、実施例１にて可
視画像として得られたオートラジオグラフと同程
度の鮮明度を有するオートラジオグラフを得るこ
とができた。ここで得られたオートラジオグラフ
は、実施例１において可視画像として得られたオ
ートラジオグラフと一致した。
用いて合成することにより、アデニン（Ａ）特
異的DNA合成物、シトシン（Ｃ）特異的DNA
合成物、グアニン（Ｇ）特異的DNA合成物、
およびチミン（Ｔ）特異的DNA合成物を得た。 (4) 電気泳動用ゲルの調製 アクリルアミド5.7g、Ｎ，N′−メチレンビス
アクリルアミド0.3g、尿素42gおよび20mMの
EDTAを含む1.0Mトリス・ホウ酸緩衝液（PH
8.3）10mlを蒸留水に溶解して全量を100mlとし
てゲル液を得た。このゲル液に窒素ガスを吹込
んで酸素を除いた後、これに10％過硫酸アンモ
ニウム水溶液600μと触媒のTEMED（テトラ
メチルエチレンジアミン）100μを加えた。
こようにして処理したゲル液を、充分に洗浄し
た二枚の厚さ３mmのガラス板から形成したモー
ルド（0.5mm×200mm×400mm）の中に注入し、
さらに上記のゲル液の上端部に、四個のスロツ
ト（各、0.5mm×15mm×20mm）形成用のスロツ
トフオーマーを挿入したのち、一夜放置してゲ
ル化させて目的の四個のスロツトを有する電気
泳動用ゲルを調製した。 (5) 電気泳動操作 上述のようにして調製されたゲルを電気泳動
装置に装着したのち、 第１スロツトに（Ａ）特異的DNA合成物、 第２スロツトに（Ｃ）特異的DNA合成物、 第３スロツトに（Ｇ）特異的DNA合成物、 第４スロツトに（Ｔ）特異的DNA合成物、 各々2μを、ミクロピペツトを用いて注入
した。この際に、スロツトに電極液を吹き付け
ることにより、ゲル中から溶出する尿素を除去
してスロツトを洗浄したのち、上記DNA合成
物の注入を行なつた。 このゲルに2000V／40cmの直流電圧を印加し
て試料の電気泳動を行なつた。電気泳動は、
DNA試料中に予め添加しておいたマーカー色
素BPB（ブロムフエノールブルー）がゲルの下
端から約３cmの位置に達するまで継続したのち
電源を切り、ゲルを泳動装置から取り外した。 次いで一方のガラス板を除去したのち、ゲル
を10％酢酸中に15分間ずつ液を換えて数回浸漬
してDNAを固定し、さらにゲルを濾紙上に移
し、減圧下にて加熱乾燥した。 (6) オートラジオグラフ測定操作 上記において得られた乾燥ゲルと蓄積性蛍光
体シートとを重ね合わせてカセツト内に収納
し、室温（約20℃）にて、10分間露光したの
ち、第１図に示した読出装置に装填して、蓄積
性蛍光体シートに転写蓄積されたゲル支持媒体
上の放射性標識物質の位置を示す四列のオート
ラジオグラフを読み出し、次いでその位置情報
をデジタル信号として記憶装置に保存させた。 上記のデジタル情報に基づいてオートラジオ
グラフの可視画像を得たところ、鮮明な画像が
得られた。そして、この可視化されたオートラ
ジオグラフを既知の大腸菌プラスミドDNA
（pBR322）のオートラジオグラフと照合した
ところ、充分な一致が見られた。 (7) DNAの塩基配列の決定 得られたオートラジオグラフ上の各々のスロ
ツトの泳動列において、スロツトの底から各泳
動帯（分子量の相違によつて分離された放射性
標識DNA断片に対応している）までの距離を
測定し、最も泳動距離の大きいものから順に並
べることにより数列｛xy i｝を得た。ここで、ｘ
は泳動距離、ｙは各塩基別のスロツトに対応す
る記号（この場合は、第１スロツトがＡ、第２
スロツトがＣ、第３スロツトがＧ、そして第４
スロツトがＴである）、ｉは上記のようにして
並べたときの順位を意味する。 次に、全てのxy iについてそのスロツトに対応
する記号（ｙ）を順に並べることにより、
DNAの塩基配列を得た。 以上のようにして得られた塩基配列は、調査
対象とした大腸菌プラスミドDNA（pBR322）
の既知の塩基配列に一致した。 上記の結果から、蓄積性蛍光体シートを用い
て室温で短時間のオートラジオグラフイー操作
を行なうことにより、バクテリオフアージM13
を用いてクローニングしたpBR322の塩基配列
をジデオキシ法によつて決定できることが明ら
かである。 比較例 １ 実施例１の(6)オートラジオグラフイー測定操作
において、乾燥ゲルによる蓄積性蛍光体シートの
露光操作を、蓄積性蛍光体シートの代りにＸ線フ
イルム（RXタイプ：富士写真フイルム(株)製）を
使用し、通常のＸ線フイルム用カセツテに収納し
て実施例１と同一の条件（室温）10分間露光）に
て露光操作を行なつた。次いでＸ線フイルムを現
像したが、判読可能なオートラジオグラフを得る
ことができなかつた。 次に上記の露光操作を、通常のジデオキシ法に
準じて−80℃にて1200分間実施したのち、同様に
Ｘ線フイルムを現像したところ、実施例１にて可
視画像として得られたオートラジオグラフと同程
度の鮮明度を有するオートラジオグラフを得るこ
とができた。ここで得られたオートラジオグラフ
は、実施例１において可視画像として得られたオ
ートラジオグラフと一致した。
第１図は、本発明において蓄積性蛍光体シート
に転写蓄積された試料中の放射性標識物質の位置
情報を読み出すための読出装置（あるいは読取装
置）の例を示すものである。 １：蓄積性蛍光体シート、２：先読み用読出
部、３：本読み用読出部、４：レーザー光源、
５：レーザー光、６：フイルター、７：光偏向
器、８：平面反射鏡、９：移送方向、１０：先読
み用導光性シート、１１：光検出器、１２：増幅
器、１３：制御回路、１４：レーザー光源、１
５：レーザー光、１６：フイルター、１７：ビー
ム・エクスパンダー、１８：光偏向器、１９：平
面反射鏡、２０：fθレンズ、２１：移送方向、２
２：本読み用導光性シート、２３：光検出器、２
４：増幅器、２５：Ａ／Ｄ変換器、２６：信号処
理回路。
に転写蓄積された試料中の放射性標識物質の位置
情報を読み出すための読出装置（あるいは読取装
置）の例を示すものである。 １：蓄積性蛍光体シート、２：先読み用読出
部、３：本読み用読出部、４：レーザー光源、
５：レーザー光、６：フイルター、７：光偏向
器、８：平面反射鏡、９：移送方向、１０：先読
み用導光性シート、１１：光検出器、１２：増幅
器、１３：制御回路、１４：レーザー光源、１
５：レーザー光、１６：フイルター、１７：ビー
ム・エクスパンダー、１８：光偏向器、１９：平
面反射鏡、２０：fθレンズ、２１：移送方向、２
２：本読み用導光性シート、２３：光検出器、２
４：増幅器、２５：Ａ／Ｄ変換器、２６：信号処
理回路。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ (1) 塩基配列を決定しようとしているDNA
もしくはDNA断片物と相補的な塩基配列を有
し、かつ放射性標識が付与されているDNA合
成物からなる混合物を調製する工程； (2) 該DNA合成物からなる混合物を支持媒体上
で分離展開させる工程； (3) 該支持媒体と、輝尽性蛍光体を含有する蓄積
性蛍光体シートとを一定時間重ね合わせること
により、該支持媒体上の放射性標識物質から放
出される放射線エネルギーの少なくとも一部を
該蓄積性蛍光体シートに吸収させたのち、該シ
ートを電磁波により励起して該シートに蓄積さ
れている放射線エネルギーを輝尽光として放出
させ、そしてその輝尽光を検出することによ
り、放射性標識が付与されたDNA合成物の位
置情報を得る工程；および、 (4) 得られた位置情報に基づいて、目的のDNA
もしくはDNA断片物の塩基配列を決定する工
程； を含むことを特徴とするオートラジオグラフイー
によるDNAもしくはDNA断片物の塩基配列決定
方法。 ２ 上記(1)の工程において、DNA合成物をサン
ガー・クールソン法により合成することを特徴と
する特許請求の範囲第１項記載のオートラジオグ
ラフイーによるDNAもしくはDNA断片物の塩基
配列決定方法。 ３ 上記(1)の工程において、DNA合成物をジデ
オキシ法により合成することを特徴とする特許請
求の範囲第２項記載のオートラジオグラフイーに
よるDNAもしくはDNA断片物の塩基配列決定方
法。 ４ 上記(2)の工程において、DNA合成物の混合
物をゲル電気泳動により分離展開させることを特
徴とする特許請求の範囲第１項乃至第３項のいず
れかの項記載のオートラジオグラフイーによる
DNAもしくはDNA断片物の塩基配列決定方法。 ５ 上記(3)）の工程において、蓄積性蛍光体シー
トを電磁波で時系列的に走査することにより励起
することを特徴とする特許請求の範囲第１項乃至
第３項のいずれかの項記載のオートラジオグラフ
イーによるDNAもしくはDNA断片物の塩基配列
決定方法。 ６ 上記(3)の工程において、放射性標識物質の位
置情報を画像として得ることを特徴とする特許請
求の範囲第１項乃至第３項のいずれかの項記載の
オートラジオグラフイーによるDNAもしくは
DNA断片物の塩基配列決定方法。 ７ 上記(3)の工程において、放射性標識物質の位
置情報を記号および／または数値として得ること
を特徴とする特許請求の範囲第１項乃至第３項の
いずれかの項記載のオートラジオグラフイーによ
るDNAもしくはDNA断片物の塩基配列決定方
法。 ８ 上記蓄積性蛍光体シートが、支持体、輝尽性
蛍光体を結合剤中に分散してなる蛍光体層および
保護膜を含むものであることを特徴とする特許請
求の範囲第１項乃至第３項のいずれかの項記載の
オートラジオグラフイーによるDNAもしくは
DNA断片物の塩基配列決定方法。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58201231A JPS6093354A (ja) | 1983-10-26 | 1983-10-26 | オ−トラジオグラフイ−によるｄνａもしくはｄνａ断片物の塩基配列決定方法 |
| DE8484112879T DE3485110D1 (de) | 1983-10-26 | 1984-10-25 | Verfahren zur bestimmung der basensequenz der dns oder der dns-fragmente mittels autoradiographie. |
| EP84112879A EP0141382B1 (en) | 1983-10-26 | 1984-10-25 | Method for determining base sequence of dna or dna fragment utilizing autoradiography |
| CA000466347A CA1257184A (en) | 1983-10-26 | 1984-10-25 | Method for determining base sequence of dna or dna fragment utilizing autoradiography |
| FI844213A FI844213L (fi) | 1983-10-26 | 1984-10-26 | Foerfarande foer bestaemning av bassekvensen foer dna och dna-fragment genom att anvaenda autoradiografi. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58201231A JPS6093354A (ja) | 1983-10-26 | 1983-10-26 | オ−トラジオグラフイ−によるｄνａもしくはｄνａ断片物の塩基配列決定方法 |
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| Publication Number | Publication Date |
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| JPS6093354A JPS6093354A (ja) | 1985-05-25 |
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| JP58201231A Granted JPS6093354A (ja) | 1983-10-26 | 1983-10-26 | オ−トラジオグラフイ−によるｄνａもしくはｄνａ断片物の塩基配列決定方法 |
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-
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- 1984-10-25 CA CA000466347A patent/CA1257184A/en not_active Expired
- 1984-10-26 FI FI844213A patent/FI844213L/fi not_active Application Discontinuation
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