JPH022371A - ＨｈａＩ制限エンドヌクレアーゼおよびメチラーゼの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明のバックグラウンド 本発明は、制限エンドヌクレアーゼＨｈａＩおよびその
修飾メチラーゼのクローンならびに該クローンからこれ
らの酵素を製造する方法に係る。

制限エンドヌクレアーゼは天然のｍ菌中にみられる酵素
の一群である。制限エンドヌクレアーゼは、夾雑する伯
の細菌成分から精製すると、実験室でＤＮＡ分子を切断
して各々相応する正確な断片を形成するのに使用するこ
とができる。この性質の故に、ＤＮＡ分子はひとつずつ
独自に同定することができ、またその構成遺伝子別に分
画することができる。制限エンドヌクレアーゼは現代の
遺伝子研究における不可欠の手段であることが立証され
ている。これらの酵素は、遺伝子の工学および解析を達
成するのに使用される生化学的な「ハサミ」である。

制限エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ分子上の特定のヌク
レオチド配列（いわゆる「認識配列」）を認識してこれ
に結合することによって作用する。

これらの酵素はＤＮＡ分子に結合すると、認識配列の内
部または一端でその分子を開裂する。異なる制限エンド
ヌクレアーゼはそれぞれ異なる認識配列に対して親和力
をもっている。今日までに調べられた幾百種もの細菌で
百を越える数の異なる制限エンドヌクレアーげが同定さ
れている。

通常細菌は、その種石に、小数の制限Ｔンドヌクレアー
げをもつのみである。これらのエンドヌクレアーゼはそ
れの由来となった細菌に因んで命名される。たとえば、
ｌ！ａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　　ａｅｇｙｐｔｉｕｓはＨ
ａｅ■、ＨａｅＩＩおよびＨａｅ■とよばれる３つの異
なる制限エンドヌクレアーゼを合成する。これらの酵素
は、それぞれ（ＡＴ）−ＧＧＣＣ（八Ｔ）、ＰｕＧＣＧ
ＣＰｙおよびＧＧＣＣという配列を認識して開裂する。

一方、大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＲＹ
１３は唯１種類の酵素ＥｃｏＲＩを合成するだけであり
、この酵素はＧＡＡＴＴＣという配列を認識する。

理論にとられれるつもりはないが、制限エンドヌクレア
ーゼは自然界で細菌細胞の繁殖に関して防衛的な役割を
果たしていると考えられる。これらの酵素のおかげで、
細菌は、もしこれらの酵素がなければこれらの細菌を殺
したりまたはこれらに寄生したりするウィルスやプラス
ミドのような外来ＤＮＡ分子による感染に対して抵抗す
ることが可能になる。制限エンドヌクレアーゼは、浸入
して来るＤＮＡ分子に結合し、それぞれの認識配列に出
会う度毎にそれらのＤＮＡ分子を開裂することによって
、細菌に抵抗性を付与する。こうしで生起する破壊作用
の結果、侵入する感染性の遺伝子の多くは不活化され、
そのＤＮＡはエキソヌクレアーゼによってさらに細かく
分解されることになる。

細菌の防御系の第二の要素は修飾メチラーゼである。こ
れらの酵素は制限エンドヌクレアーゼと相補的であり、
これらが提供する手段によって、細菌は外来の感染性Ｄ
ＮＡから自身のＤＮＡを区別し防御できるようになる。

修飾メチラーゼは対応する制限エンドヌクレアーゼと同
じヌクレオチドｕ　ｆｌ配列を認識してそれに結合する
が、このＤＮＡを破断する代わりに、メチル基を付加す
ることによってその認識配列内のヌクレオチドのいずれ
かを化学的に修飾する。このメチル化が起こると、制限
エンドヌクレアーゼがその認識配列に結合することはな
くなり、また、その配列が制限エンドヌクレアーゼによ
って開裂されることもなくなる。細菌細胞のＤＮＡはそ
の修飾メチラーゼの活性のおかげでいつも充分に！！飾
されており、したがって内因性の制限エンドヌクレアー
ゼの存在に対する感受性を全くもたない。制限エンドヌ
クレアーげの認識と攻撃に対して感受性のあるのは未躇
飾のＤＮＡ、したがって外来のものであることが確認で
きるＤＮＡだけである。

遺伝子工学技術の出現によって、今では、遺伝子をクロ
ーニングし、その遺伝子がコードしているタンパク質や
酵素を従来の精さツ技術で取１９可能な吊より大間に生
産することが可能である。制限エンドヌクレアーゼ遺伝
子のクローンを単離する際の鍵は、そのようなりローン
の出現頻度が１０−３〜１０−４程度に低い場合、複雑
な「ライブラリー」、すなわち「ショットガン」法で得
られるクローンの集団の中で目的とするクローンを同定
するための簡単で信頼のおける方法を開発することであ
る。

この方法は、目的としない大多数のクローンは死滅する
が珍にある望ましいクローンは生き残れるように選択的
なものであると好ましい。

■型の制限−修飾系はクローニングされつつあり、その
数は次第に増加している。最初にクローニングされた系
では、制限エンドヌクレアーゼクローンを同定または選
択する手段としてバクテリオファージによる感染が使用
された［ＨｈａＩ：Ｈａｎｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｇｅｎｅ
、　３：９７−［２（１９７８）：　Ｅ　ｃｏＲＩＩ　
：Ｋｏｓｙｋｈ　ｅｔ　ａｌ、、Ｈｏ１ｅｃ、　ｇｅｎ
、　　Ｇｅｎｅｔ、、　１７８　：　７）７−７）９（
１９８０）；　ＰｓｔＩ　：　Ｗａｌｄｅｒ　ｅｔ　ａ
ｔ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳ
Ａ、　７８．１５０３−１５０７　（１９８１）］　、
細菌中に制限−修飾系が存在すると細菌はバクテリオフ
ァージによる感染に対して抵抗できるので、クローニン
グされた制限−修飾遺伝子を担持する細胞は、原則とし
て、ファージに暴露されたライブラリーから生えて来る
（生き残る）株として選択的に単離することができる。

しかしこの方法は限られた価値しかないことが判明した
。すなわち、クローニングされた制限−修飾遺伝子は、
選択的な生き残りを可能にする程に充分なファージ耐性
を常に発現するとは限らないことが判明したのである。

もうひとつ別のクローニング法では、最初プラスミド由
来とされていた系をＥ、ｃｏｌｉクローニングプラスミ
ド中に組み込んでいる［ＥｃｏＲＶ：Ｂｏｕｇｕｅｌｅ
ｒｅｔ　ａｔ　ａｔ、、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ
　Ｒｅｓ、、　１２３６５９−３６７６（１９８４）：
ＰａｅＲ７：Ｇｉｎｇｅｒａｓ　ａｎｄ　Ｂｒｏｏｋｓ
Ｐｒｏｃ　　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳ
＾　８０：４０２−４０６（１９８３）　：Ｔｈｅｒｉ
ａｕｌｊ　ａｎｄ　　Ｒｏｙ、　Ｇｅｎｅ、　１９：３
５５−３５９　（１９８２）ＰｖｕＩＩ　：　Ｂｌｕｍ
ｅｎｔｈａｌ　ｅｔ　ａｔ、、　　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒ
＋。

１６４：　５０１−５０９　（１９８５）］。

第三の方法としてますます多くの系のクローニングに使
用されている方法では、本発明者らの特許出願第７０７
０７９号に関連する活性なメチラーゼ遺伝子について選
択する［ＢｓｕＲＩ：にｉｓｓ　ｅｔ　ａＮｕｃｌｃｉ
ｃ　　八ｃｉｄｓ　　　Ｉｔｅｓ、、　　１３：　　６
４０３−６４２１　　（１９８５）］。

制限遺伝子と修飾遺伝子とは近接して存在する傾向があ
るので、両者の遺伝子を含有するクローンは一方の遺伝
子について選択するだけで単離できることが多い。しか
し、メチル化活性による選択では常に完全な制限−修飾
系が得られるわけではなく、逆に、メチラーゼ遺伝子の
みが得られることもある［　Ｂ　ｓｐＲＩ　：　Ｓｚｏ
ｍｏｌａｎｙｉ　ｅｔ　ａｌ、、Ｇｅｎｅｌｏ：２１９
−２２５　（１９８０）：ＢｃｎＩ　：　Ｊａｎ、ｕｌ
ａｉｔｉｓ　ｅｔ　ａＧｅｎｅ　　２０：１９７−２０
４　（１９８２）　　；　ＢｓｕＲＩ　：にｉｓｓ　ａ
ｎｄＢａｌｄａｕｆ　Ｇｅｎｅ　　２１：１１１−１１
９　（１９８３）；およびＭＳＩ）Ｉ：Ｗａｌｄｅｒ　
ｅｔ　ａｔ、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　　Ｃｈｅｍ、、　２
５８：１２３５−１２４１（１９８３）　］。

制限−修飾遺伝子のクローニングに対する基本的な障害
は、修飾によって保護されていない宿主中にエンドヌク
レアーゼ遺伝子を導入しようとすることにある。メチラ
ーゼ遺伝子とエンドヌクレアーゼ遺伝子とを一緒に単一
のクローンとして導入すると、エンドヌクレアーゼが宿
主ＤＮＡを開裂する機会を得る前にメチラーゼがそのＤ
ＮＡを修飾して保護するはずである。したがって、場合
によっては、これらの遺伝子は順番（すなわち、最初に
メチラーゼ、次にエンドヌクレアーゼの順）にのみクロ
ーニングが可能となるかもしれない。

［、ｃｏ＋ｒ中で制限−修飾系をクローニングする際の
別の障害がさまざまなメチラーゼ遺伝子をクローニング
する過程で発見された。すなわち、（クローニングに通
常使用されているものを含めて）多くのＥ、（１０）１
ｉ株は、メチル化シトシンを含有するＤＮＡの導入に対
して抵抗する系をもっているのである［Ｒａｌｅｉｇｈ
　ａｎｄ　Ｗｉｌｓｏｎ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

シン特異的メチラーゼ遺伝子を、単独でも、あるいはそ
の対応するエンドヌクレアーゼ遺伝子と共にでも、これ
らのＥ、ｃｏｌｉ株中でクローニングすることは極めて
難しい。したがって、これらの遺伝子をクローニングす
るには、これらの系を欠損している旦、　ｃｏｌｉ−変
異株を使用する必要がある。

精製した制限エンドヌクレアーゼ、および重要性はそれ
より落ちるが修飾メチラーゼは、実験室でＤＮＡの特性
決定と再配列をするのに有用な道具であるから、これら
の酵素を大樋に合成する細菌株を組換えＤＮＡ技術によ
って得ることは商業的に魅力がある。そのような株が得
られれば、商業的に有用な量で生産するための手段が提
供されるばかりでなく精製の作業も簡単になると思われ
るので、これらの株は極めて有用なものとなろう。

発明の概要 ＡＴＣＣ１００１４に由来するＨｈａＩ制限エンドヌク
レアーゼおよび修飾メチラーゼの遺伝子を含有するクロ
ーン、ならびにこれらの酵素の生産方法が提供される。

より特定すると、本発明は、ＧＣＧＣというＤＮＡ配列
を認識して３′のＣ残塁とＣ残塁の間で開裂する酵素で
ある制限エンドヌクレアーゼ１」ｈａＴを発現するクロ
ーンに係る。ＲＯｂｅｒｔＳＨｙｅｒｓ、　Ｈｏｒｒｉ
ｓｏｎ　ａｎｄ　Ｈｕｒｒａｙ、　Ｊ　、　Ｈｏ１．　
　Ｂｉ。

１０３：１９９−２０８　（１９７６）参照（その開示
内容は、ここで引用したことによって本明細書中に含ま
れるものとする）。本発明に従って生産されるｌ−１ｈ
ａＩ制限エンドヌクレアーゼは実質的に純粋であって、
Ｒｏｂｅｒｔｓ　ｅｔ　ａｌ、、　５ｕｐｒａに開示さ
れているような従来の技術によって製造されたＨｈａＩ
調製物中に通常みられる夾雑物を含んでいない。

この酵素をクローニングする好ましい方法は、有するラ
イブラリーを形成し、ＨｈａＩｌ飾メチラーゼをコード
しているＤＮＡを含有するクローンを単離し、これらを
スクリーニングして、ＨｈａＩ制限エンドヌクレアーゼ
遺伝子も共に含有しているクローンを同定することから
なる。

発明の詳細な説明 本発明は、ｌ−１ｈａ工制限および修飾遺伝子のクロー
ン、ならびにそのようなりローンによって生産される制
限エンドヌクレアーゼＨｈａ工に係る。これらのｚｈａ
Ｉａ伝子は、ＨｈａＩ修飾メチラーゼ遺伝子を含有し発
現することに基づいて選択したある種のクローンが同時
にＨｈａＩ制限遺伝子も含有しているという事実を利用
する方法によってクローニングされる。そのようなりロ
ーンのＤＮＡはＨｈａＩ制限エンドヌクレアーゼによる
ｉｎ　ｖｉｔｒ。

消化に対して耐性を示す。この消化に対する耐性によっ
て、ＨｈａＩメヂラーゼおよび制限エンドヌクレアーゼ
をコードしているクローンを選択的に単離するための手
段が得られる。

１−１ｈａ工制限遺伝子およびメチラーゼ遺伝子をクロ
ーニングして発現させるための本発明の好ましい方法を
第１図に示すが、これには以下のステップが含まれる。

ａｌ。５ｕｐｒａを始めとしていくつかの刊行物に記載
されており、この細菌のサンプルはｔｈｅ　Ａｍｅｒｉ
ＣａｎＴｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏ
ｎからカタログＮｏ、　ＡＴＣＣ１００１４として入手
可能である。

（２）　　このＤＮＡをＰＳｔ工のような制限エンドヌ
クレアーゼで消化する。

（３）　　消化したＤＮＡを、１個以上の１−（ｈａＪ
部位を含有するｐＢ　Ｒ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）
のようなりローニングベクターに連結する。連結したＤ
ＮＡをＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　　ＲＲ１株
（ＡＴＣＣ，３１３４３）のような適当な宿主に形質転
換する。

（４）　　このＤＮＡ／細胞混合物を、形質転換細胞を
選択するためのテトラサイクリンのような抗生物質を含
有する培地に接種する。培養少形質転換細胞コロニーを
ひとつに集めてセルライブラリーとする。

（５）　　このセルライブラリーから組換えプラスミド
全部をそっくり精製してプラスミドライブラリーを作成
する。

（６）　　このプラスミドライブラリーをＨｈａＩｉＬ
１限エンドヌクレアーゼで完全に消化する。このエンド
ヌクレアーゼは、Ｒｏｂｅｒｔｓ　ｅｔ　ａｌ、、　５
ｕｐｒａに記載されている方法と類似の方法によって１
１ａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓか
ら調製することができる。ＨｈａＩ消化により、メチラ
ーゼを含有しない未修飾クローンが特異的に破壊され、
Ｈｈａ■メチラーゼ担持クローンの相対頻度が増大する
。

（７）　　消化したプラスミドライブラリーのＤＮＡを
旦、　ｃｏｌｉ　ＲＲ７株のような適当な宿主に形質転
換し、抗生物質プレートに接種して形質転換コロニーを
再度取得する。これらのコロニーを採取し、そのＤＮＡ
をＨｈａ１１飾遺伝子の存在について以下のようにして
分析する。ずなわら、コロニーが担持するプラスミドＤ
ＮＡを精製し、Ｈｈａｉ制限エンドヌクレアーゼと共に
ｉｎ　ｖｉｔｒＯでインキュベートしてＨｈａＩ消化に
対して抵抗性か否かを決定する。また、このクローンの
全細胞ＤＮＡ（染色体およびプラスミド）も精製してＨ
ｈａ　Ｉ　Ｗｉ１１限エンドヌクレアーゼと共にインキ
ュベートする。

ＨｈａＩメチラーゼ遺伝子を担持するクローンの１）　
Ｎ△は充分に修飾されているはずであり、プラスミドＤ
ＮＡと全ＤＮＡは両方とも消化に対して実質的または完
全に抵抗性であるはずである。

（８）　　ステップ（７）でＨｈａＴメチラーゼ遺伝子
を担持していることが確認されたクローンの粗抽出物を
調製し、この抽出物のＨｈａＩｉｔＩ’Ｊ限エンドヌク
レアーぜ活性を検定することによって、ＨｈａＩ制限エ
ンドヌクレアーゼを担持するクローンを同定する。

（９Ｊ　　Ｈｈａ　Ｉ制限および修飾遺伝子を担持して
いるクローンを醗酵槽内のテトラサイクリン含有富化培
地中で増殖させることによって、ｌ−１ｈａＩ制限エン
ドヌクレアーゼを生産することができる。その後、細胞
を遠心して採集し、音波処理で破砕すると、ＨｈａＩ制
限エンドヌクレアーゼ活性を含有する粗細的抽出物が生
成する。

（１０）　　ＨｈａＩ制限エンドヌクレアーゼ活性を含
有する粗細的抽出物を、アフィニティークロマ１〜グラ
フイーやイオン交換クロマｌ−グラフィーのように標準
的なタンパク質精製技術によって精製する。

上に概略を記載した手順は本発明の好ましい実施態様で
あるが、上記の手順を業界で公知の技術によって変える
ことができるということは当業者には明らかであろう。

以下に現状で好ましい具体例を挙げて本発明を例示する
が、これらの実施例は単なる例示であって特許請求の範
囲で指摘されない限り本発明がこれらの実施例に限定さ
れることはないものと考えられたい。

実施例 １−Ｉ　Ｌ＋　１制限エンドヌクレアーゼ遺伝子のクロ
ー臣≦ニク （１）　　ＤＮＡの精製： Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ　
（ＡＴＣＣ１００１４）の凍結した細胞１０９を氷上で
１時間解凍した後２０威の２５％スクロース、　５０ｍ
ＨＴｒｉｓ　ｐＨ８，０中に再懸濁させた。１０７の０
．２５ＨＥＤＴ八Ｄへ＋８．０および６威の１０ｍｇ／
戒リゾチーム（０，２５ＨＴｒｉｓ　ｐＨ８，０中）を
加えた。この懸濁液を２時間氷上に保った後、２４ｄＬ
ｌ）１％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００，５０ｍＨＴｒｉ
ｓ　　ｐＨ８，０，６７ｍＨ［：Ｄ丁Ａおよび５−の１
０％ＳＤＳを加えて溶菌させた。

得られた溶液を、（前もって０．５８　Ｔｒｉｓ、　Ｄ
ｔｌ　８．０で平衡化した）フェノール７０ｄおよびク
ロロホルム６０ｄで抽出した。得られた乳濁液を１０Ｋ
ｒｐｍで３０分遠心し、粘稠な上層を取り出し、１０ｍ
ＨＴｒｉｓ　ＤＨ８，０，１ｍＨＥＤＴＡに対しこの液
を四回交換して透析した。次に、透析した溶液を最終濃
度＋００ｉ　／　ｒｄ。

（７）　ＲＮａＳｅにより３７℃で１時間消化した。次
に、ＤＮＡを沈澱させるために、ＮａＣρを最終１度０
．４Ｈまで加え、０．５５倍容最のイソプロピルアルコ
ールを重層し、相を一緒に混合することによってＤＮＡ
をガラス棒に巻き付けて取り出した。このＤＮＡを１０
ｍＨＴｒｉｓ　ｐＨ８，０，１ｍＨＥＤＴＡに再懸濁さ
せて４℃で貯蔵した。

（２）　　ＤＮＡの消化： 精製したＤＮＡを以下のようにしてＰＳｔＩで開裂した
。すなわち、１ｄの１０ｍＨＴｒｉｓ　ｐＨ７，５，１
０ｍＨＨｇＣ１！２．５０ｍＨＮａＣ１２，１０ｍＨメ
ルメルトカプトエタノール中たＨ、　　ｈａｅｍｏｌｙ
ｔｉｃｕｓＤ　Ｎ　Ａ　　１００Ｎを１０００　ｕｎｉ
ｔのＰｓｔＩ制限エンドヌクレアーゼで消化した。この
チューブを１時間３７℃にインキュベートした後、１５
分間７２℃に加熱して反応を停止した。ＨｈａＩｉ飾メ
チラーぜをコードするＬ　４ｋｂ１」＋ｎｄＩ［ｌ断片
を担持するクローンのハイブリダイぜ〜ジョンを含めた
初期の実験［Ｃａ５ｅｒｔａ　ｅｔ　ａｔ、。

Ｊ、　Ｂ＋ｏ１．　　Ｃｈｅｍ、、　２６２：　４７７
０−４７７７　（１９８７）］で、本発明者らがクロー
ニングしようとした同様なＰＳｔＩ断片は約９　ｋｂの
長さであったことが判明した。この断片のクローニング
を！ｔ！純化するために、ＰｓｔＩで消化したＨ、ｈａ
（！ｍｏｌｌ／１ｉｃＵｓのＤＮＡを連結する前にサイ
ズ分画し、８〜Ｔ２ｋｂの範囲のサイズの断片を含有す
る両分を精製した。分画はゲル電気泳動と抽出によって
以下のようにして行なった。

すなわち、バルクなりＮＡ制限エンドヌクレアーゼ消化
物充填用のトラフを含有する１、０％のｔｒｉｓ−ａｃ
ｅｔａｔｅアガロースゲルを流し込んだ。このゲルを２
０＋ｎ＾で一晩泳動させて８〜１２ｋｂの範囲のバンド
を分離した。ゲル中のバンドを長波長Ｕｖ光で可視化し
、８〜１２ｋｂの範囲のバンドをゲルから切り出して注
射器に移した。１８ゲージのニードルにゲルを通して押
し出して、１ｄのＴＡＥを含有する５０ｍ１遠心管に入
れた。得られたスラリーをＢｃｃｋｍａｎ　Ｊ２−２１
遠心機で１５０００　ｒｌ）Ｉｌｌ　、　４℃として３
０分間遠心した。得られた上清中のＤＮＡを２倍容量の
イソプロパツールで沈澱させ、ｉ　００ｄのＤＮＡ緩衝
液に再懸濁させた。

（３）　　連結および形質転換： サイズ分画したＤＮＡ　１ｊ１９（１０ｍ）を、ｐｓｔ
工で開裂し脱リン酸化したｐＢ　Ｒ３２２（Ａ丁ＣＣ３
７０１７）２１Ｊ３（２０成）と混合した。１０成の５
００ｍＨＴｒｉｓ　ｐＨ７，５，１００ｍＨＨｇＣ１！
２，１００ｍＨＤＴＴ、　５ｍＨＡＴＰ　１および５６
．６ｐ１の試菌蒸溜水を加えて容積を１００ｐｉとした
。Ｔ４　ＤＮＡリガーゼを３．４成加え、得られた溶液
を４時間１６℃にインキュベートした後、クロロボルム
２０１Ｊ１で抽出して滅菌した。連結した混合物８０成
を、１，０成の５０ｍＨＮａＣ１！、　５ｍＨクエン酸
Ｎａ３．６７ｍＨＣａＣｊ！、、と混合し、氷冷したＥ
、ｃｏｌｉＲＲｌ　（Ａ１ＣＣ３１３４３）コンピテン
ト細胞を２．Ｏｍｌカロえた。１７られた溶液を５分間
４２℃にインキュベートした後、８ｄのＩｕｒｉａ−ブ
ロス（Ｌ−ｂｒｏｔｈ）を添加して３７℃で４時間イン
キュベーションを続行した。

（４）　　セルライブラリー： 形質転換した細胞培養液を簡単に遠心した後、上清を捨
て、細胞を１０−のＬ　−ｂｒｏｔｈに再懸濁させた。

そのうちの２００ｇを、テトラサイクリンを３Ｏｎ　／
　ｍＲ金含有るＬｕｒｉａ−寒天（Ｌ−ａｇａｒ）プレ
ート上に接種した。−晩３７℃にインキュベートした後
、各プレートに２．５ｄの１０ｍＨＴｒｉｓ　ｐＨ７，
５１０ｍＨＮａＣ１２を満たし、形質転換コロニーを全
部掻き集めてプールした。

（５）　　プラスミドライブラリー： ２、５ｍｌのセルライブラリーを、テトラサイクリンを
３０ｐ９／　ｒａｆ！含有するＬ−ｂｒｏｔｈ　５００
ｄ中に接種した。３７℃で一晩撮援培養した後、４００
０　ｒｐｍで５分遠心した。上清を捨て、細胞ベレット
を１０戒の２５％スクロース、　５０ｍＨＴｒｉｓ　ｐ
Ｈ８，０に室温で再懸濁ｇせた。０．２５ＨＥＤＴＡ、
　ｐＨ８，０を５戒、およヒ１０ｍｇ／ｉリゾチーム（
０，２５ＨＴｒｉｓ、　ｐｔｌ　８．０中）を３戒加え
た。得られた溶液を氷上に１時間放置した後、１２ｍの
１％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００，５０ｍＨＴｒｉｓ　
ｐＨ８，０，６７ｍＨＥＤＴＡをピペツ１−で激しく添
加し、得られた懸濁液を穏やかにかぎ回して溶菌を起こ
させた。

溶菌した混合物を５０ｄのチューブに移して１７０００
　ｒｌ）ｍ　、　４℃で４５分間遠心した。ピペットで
上清を取り出した。固体のＣｓＣｆ！を２０，０９秤吊
して５０ｄのプラスチック製ネジブタ付きチューブに入
れ、このチューブ中に上清２２．０９をピペットで入れ
て混合した。５ｍｇ／ｄのエチジウムプロミド（１０ｍ
ＨＴｒｉｓ　ｐＨ８，０，１００ｍＭ　ＮａｃＪ！、　
　１ｍＨＥＤＴＡ中）を１．Ｏｄ加えた。この溶液を、
５／８１ｎｘ３　＋ｎの遠心管２木に移し、Ｂｅｃｌｖ
ａｎ　Ｔ　ｉ　７０ｏ−ター中４４００Ｏｒｐｍ　、　
１７℃で４２時間回転させた。プラスミドを集めるため
に、これらのチューブを間き、紫外光を照射して２本の
ケイ光バンドの下側の方を注射器で集めた。各チューブ
から（ｑた下側のバンドを合わせ、等容量の、水で飽和
した氷冷ｎ−ブタノールで四回抽出することによってエ
チジウムプロミドを除去した。

抽出された溶液を、１ｏｍ＋　Ｔｒｉｓ　Ｄｌ＋　７．
５．１＋ｕ＋ＥＤＴＡを四回交換しながらこの液に対し
て透析した後、２倍容量のイソプロパツールと最終濃度
が０、４８となるのに充分な５８　Ｎａａ！を添加して
核酸を沈澱させた。１すられた溶液を一晩−２０°Ｃで
保存した後１５０００　ｒＤｍ、　ＯｏＣで１５分遠心
した。上清を捨て、ベレットを１５分間風乾した後、５
００／ｊｊ２の１０ｍＨＴｒｉｓ　ｐＨ７，５，１ｍＨ
ＥＤＴＡに溶かしチー２０°Ｃで貯蔵した。プラスミド
ＤＮＡの濃度は約　１５０埒／戒であった。

（６）　　プラスミドライブラリーの消化：最初のプラ
スミドライブラリーを、プラスミドＤＮＡ１ｐ３に付き
ＨｈａＩエンドヌクＬ／７−セ５．２．５．１．３；Ｂ
よび０．６　ｔｌｎｉｔの濃度として４種の希釈液で消
化した。これらのチューブを１時間３７°Ｃにインキュ
ベートした。１０分間７２℃に加熱して反応を停止させ
た。

（７）　　形質転換： １０成の消化物をＥ、　ｃｏｌｉ　１１１株に形質転換
し、テトラサイクリンを３０ｉ／−含有するし−ａｇａ
ｒプレートに接種して一晩３７℃にインキュベートした
。

ＤＮＡＩＩＪ３に付き２．５　ｕｎｉｔのＨｈａＩｒ選
択サレタプす−ト上には全部で１３２個のコロニーが生
えて来た。これらを採り、スクリーニングして、ｌ−１
ｈａエメチラーげ遺伝子を担持している９　ｋｂ断片が
導入されているものを同定した。

（８）　　生き残った個体の解析： １３２個のコロニーを、アンピシリンを含有するプレー
トとテトラサイクリンを含有するプレートに画線した。

１３２個のうち２８個のコロニーがアンピシリンに対し
て感受性であり、ＤＮＡ断片をもっていることを示した
。これらのクローンが担持するプラスミドを、Ｂｉｒｎ
ｂｏｉｎ　ａｎｄ　Ｄｏｌｙ、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ
ｓ　　Ｒｅｓ、　　７　：　１４１３　（１９７９）の
プラスミドｍ１ｎｉｐｒｅｐ法によって精製した。

ｍ１ｎｉｐｒｅｐ法： 各培養物を８０００　ｒｐｍで５分間遠心し、上清を捨
でて得られた細胞ベレットを、１ｍｙ／ｍリゾチームを
含有する１、（７の２５ｍＨＴｒｉｓ、　１０ｍＨＥＤ
ＴＡ　　５０ｍＭグルコース、　ｐＨ８，０中に再懸濁
させた。室温に１０分間装いた後、各チューブに２．Ｏ
ｎｅの０．２８ＮａＯ１ｌ、　１χＳＤＳを加え、チュ
ーブを振盪して細胞を溶解し、次いで氷上に置いた。溶
液が透明になってから各々３Ｍ酢酸ナトリウム（１）Ｉ
＋　４．８）を１．５ｄずつ加えて振盪した。生じた沈
澱を１５００Ｏｒｐｍ　。

４℃で１０分間遠心して沈ませた。得られた上清を各々
、イソプロパツールを３ｄ含有する遠心管に流し入れて
混合した。室温で１０分経った後遠心管を１５０００　
ｒｐｍで１０分間遠心して沈澱した核酸をベレット化し
た。上清を捨て、ベレットを室温で３０分風乾した。乾
燥した後ペレットを８５０成の１０ｍＨ丁ｒｉｓ　　１
ｍＨＥＤＴＡ、　ｐＨ８，０に再懸濁させた。

５ＨＮａＣｊを７５成ずつ加え、得られた溶液を、５７
５成のイソプロパツールを含有するＥｐｐｅｎｄｏｒｆ
チューブに移し、室温で１０分かけて再度沈澱させた。

次に、デユープをｍｉｃｒｏｆｕｇｅ中で４５秒間回転
し、上清を（舎でてペレットを風乾した。このペレット
を、次いで、ＲＮａｓｅを１００埒／ｄ含有する５００
１Ｊｉの１０ｍＨＴｒｉｓ　１ｍＨ［ＤＴＡ、　ｐＨ８
，０に溶解し、１時間３７°ＣにインキュベートしてＲ
ＮＡを消化した。５０１Ｊ１の５８　Ｎａｐ！、次いで
３５０成のイソプロパツールを添加してＤＮＡをもう一
度沈澱させた。室温で１０分後、４５秒間遠心してＤＮ
Ａを沈ませ、上清を捨て、１ｑられたペレッを　１５０
成の１０ｍＨＴｒｉｓ、　１ｍＨＥＤＴＡ、　Ｉ）Ｈ８
，０に再溶解した。次いで、プラスミドｍ１ｎｉｐｒｃ
ｐ　（小調製物）をｌ−１ｈａＩとｐｓｔＪで消化して
解析した。

（９）　　Ｈｈａ　Ｉメチラーゼ遺伝子クローン：解析
した２８個のうち１個のクローン１ｌＪＢ１３９ｎＨ４
−２が９　ｋｂ断片を含有しており、ＨｈａＩ消化に対
して耐性であり、ＨｈａＩメチラーゼ遺伝子を担持して
いる１、４ｋｂ　Ｈｉｎｄ　ｍ断片とハイブリダイズし
た。その後、このプラスミドは、ＨｈａＩメチラーゼ遺
伝子を担持しているばかりでなく、ＨｈａＩエンドヌク
レアーゼ遺伝子も担持していることが示されたく第２図
）。

（１０１ＨｈａＩ制限遺伝子クローン：上記第９項でＨ
ｈａＩｔ！飾メチラーゼ遺伝子を担持していることが確
認されたクローンは、また、Ｈｈａ工制限エンドヌクレ
アーゼ遺伝子も担持していることが判明した。これは、
以下のように実施するｉｎ　ｖｉｔｒｏ制限エンドヌク
レアーゼアッセイによって確かめた。

エンドヌクレアーゼアッセイ： １−１ｈａＩエンドヌクレアーゼ活性について検定する
ために２種の溶液を調製した。

（ｉ）　　ＩＯＸ制限エンドヌクレアーゼ緩衝液：１０
０ｍＨＴｒｉｓ　ｐｌ＋　７．５．１００ｍＨＨｇｃＩ
！２．６０ｍＨメルカプトエ タノール、　２００ｍＨＫＣＩ。

（１１）消化反応用ｍｉＸ：１８／ＩｔλＤ　Ｎ　Ａ　
（６３０ｉ／ｄ　）　。

５６成の１０Ｘ制限エンドヌク レアーぜ緩衝液、４８６成蒸 溜水。

以下のようにして細胞抽出物を調製した。

培養物５０ｍを、３０Ｉｉ！ｌ／ｌｌ１ｉ！テトラサイ
クリンを含有するＬ　−ｂｒｏｔｈ中３７℃で一晩増殖
さゼた。この細胞を４００Ｏｒｐｍで５分間遠心してペ
レット化した後、３ｍｆ！の１０ｍＨ丁ｒｉＳ　ｐＨａ
、ｏ、　　１０＋ｎＨメルカプトエタノール、　０．１
ｍＨＥＤＴＡ中に再懸濁させた。同じ緩衝液中に１０η
／ｍ１．のりゾチームを含有する液を０．５ｄ加え、得
られた懸濁液を３時間氷上に放置した。この懸濁液を一
晩−２０℃にしておいた後氷上で解凍した。１成のサン
プルをＥｐｐＯｎｄＯｒｆチューブに移し、ｏ、　ｏｏ
ｓ％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００とし、混合し、４℃のｅ
ｌ）ｌ）ｅｎｄｏｒｒ遠心機で１０分間遠心した。

得られた上清を細胞抽出物として使用した。この抽出物
を検定するために、消化反応用ｍｉｘを４本のチューブ
に、最初の１本には１５０ＩＪｉ、残りの３本には１０
２．５屑ずつ分注した。最初のチューブに抽出物７．５
ｐｉを入れて混合した。最初のチューブから４７．５７
Ｊを取り出して第二のチューブに移して混合した。この
ようにして、最初のチューブはＤＮＡ１７）１１ｇ当た
り抽出物１成、第２のチューブは０．３成／埒、第３の
チューブは０１成／埒、等とした。各々　１００成ずつ
含有するこれらのチューブを１時間３７℃にインキュベ
ートした後、各チューブのサンプル２０成をゲル電気泳
動によって分析した。この抽出物の力価は、１ｄに付き
約１×１０４ｕｎｉｔであることが判明した。これは、
湿った細胞ペースト１ｇ当たり約５ｘｌＯ’ｕｎ目のＨ
ｈａ工制限酵素に相当する。

（１１）　　１）ＪＢ１３９ＲＨ２−４のＥ（１０）Ｒ
Ｉ消化およびサブクローニング： 精製したｐＪＢ１３９ＲＨ２−４のＤ　Ｎ　Ａ　２０埒
を、　１００成の１０ｍＨＴｒｉｓ　ｐＨ７，５，１０
ｍＨＨ（ＩＱ！２．１０ｍＨメルカプトエタノール、　
１００ｍＨＮａＣ１！中で、１時間３７℃にして２０　
ｕｎｉｔのＥ　ＣＯＲＩ　Ｌ’ｌ限エンドヌクレアーゼ
で消化した。消化物を１％７ガロースゲル電気泳動にか
け、９　ｋｂのｐｓｔ■断片内にある６　ｋｂのＥ（１
０）ＲＩ断片を切り出して精製したく上記第２項）。

この６　ｋｂのＥ（１０）ＲＩ断片１埒を、Ｅ（１０）
ＲＩで開裂し脱リン酸化したＩ）ＢＲ３２２（上記第３
項）２埒と連結し、コンピテントなＥ、　ｃｏｌｉ　Ｒ
Ｒｌに形質転換し、アンピシリンを１００ｐ！ｇ／　ｄ
含有するＬ−ａｇａｒプレート上に接種した。１４個の
コロニーを採取し、スクリーニング（上記第８項）して
、ｅ　ｋｂ断ハをもっているプラスミドを同定した。解
析した１４個のうち１個が６　ｋｂ断片を含有している
ように思われたのでこれをｐＪＢ１３９ＲＨ１−１と命
名した。

１）ＪＢ１３９ＲＨ１−１はＨｈａＩＦ完全に修飾され
ていることが判明した。これは、このプラスミドが親の
ｐＪＢ１３９１Ｅ　４−２と同様にｌ−１ｈａＩメチラ
ーぜ遺伝子を含有しており発現したことを示している。

ｐＪＢ１３９ＲＨ１−１を担持しているＥ、　ｃｏｌｉ
　ＲＲｌの抽出物は、ｐＪＢ１３９１１Ｈ４−２を担持
する細胞の抽出物の約５倍のレベルのＨｈａＩエンドヌ
クレアーゼ活性、すなわち抽出物１ｄ当たり約５　Ｘ　
１０４ｕｎｉｔを含有していることが判明した（第３図
）。Ｉ）ＪＢ１３９ＲＨ１１を担持しているＦ　、　ｃ
ｏｌｉ　ＲＲｌは、ＨｈａＩエンドヌクレアーゼを精製
する際に使用することができる好ましい株である。。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ｌ−１ｈａ工制限エンドヌクレアーゼをクロ
ーニングおよび生産する方法の概略を示す。 第２図は、ＨｈａＩ制限エンドヌクレアーゼおよび修飾
メチラーゼをコードしているＨ、　ｈａｅｍｏｌｙｔ−
ｉｃｕｓのＤＮＡの９にｂＰｓｔＩ断片の制限地図であ
り、この断片をｐＢ　Ｒ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）
のＰＳｔＩ部位に連結してｐＪＢ１３９ＲＨ４−２を創
作した。 第３図は、１）ＪＢ１３９ＲＨ４−２を担持するＥ、ｃ
ｏｌｉＲＲｌ（ＡＴＣＣ３１３４３）の粗細胞抽出物中
の）（ｈａ■制限エンドヌクレアーゼ活性を示すアガロ
ースゲルの写真である。 代理人弁理士　月ａ　　山　　　　武 ＦＩＧ、２ ｐＪＢ１３９ＲＭ１−４ ’　Ｐｕｒｅ　Ｈｈａ！ ＦＩＧ、３

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. （１）Ｈｈａ I 制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を含む
   クローニングベクター。
2. （２）請求項１に記載のクローニングベクターを含有す
   る形質転換された宿主。
3. （３）Ｈｈａ I 遺伝子が、￥Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ
   　ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ￥ＡＴＣＣ　１００１４か
   ら切り出されたものである、請求項１に記載のクローニ
   ングベクター。
4. （４）（ａ）￥Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｈａｅｍｏｌ
   ｙｔｉｃｕｓ￥に由来するＤＮＡからライブラリーを形
   成し、 （ｂ）Ｈｈａ I 修飾遺伝子を含有するクローンを単離
   し、 （ｃ）修飾遺伝子を含有するクローンをスクリーニング
   し、 （ｄ）Ｈｈａ I 制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を同時
   に含有しているクローンを単離する ことからなる、Ｈｈａ I 制限エンドヌクレアーゼ遺伝
   子のクローニング方法。
5. （５）前記ライブラリ−を、 （ａ）￥Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｈａｅｍｏｌｙｔｉ
   ｃｕｓ　ＡＴＣＣ　１００１４に由来するＤＮＡを精製
   するステップ、 （ｂ）精製したＤＮＡを消化してＤＮＡ断片を形成する
   ステップ、 （ｃ）この断片をクローニングベクターに連結するステ
   ップ、 （ｄ）ステップ（ｃ）のクローニングベクターで宿主細
   胞を形質転換してセルライブラリーを形成するステップ
   、 （ｅ）このセルライブラリーから組換えベクターを精製
   してプラスミドライブラリーを形成するステップ によって形成する、請求項４に記載の方法。
6. （６）クローニングベクターがｐＢＲ３２２である、請
   求項５に記載の方法。
7. （７）宿主細胞が￥Ｅ．ｃｏｌｉ￥のｍｃｒＢ＾−およ
   びｈｓｄＲ＾−株である、請求項５に記載の方法。
8. （８）プラスミドライブラリーをＨｈａ I で消化して
   消化プールを形成し、この消化プールを宿主細胞中に形
   質転換し、修飾遺伝子を含有するクローンを選択するこ
   とによって、Ｈｈａ I 修飾遺伝子を含有するクローン
   を単離する、請求項５に記載の方法。
9. （９）（ａ）￥Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｈａｅｍｏｌ
   ｙｔｉｃｕｓ￥に由来するＤＮＡを精製し、 （ｂ）精製したＤＮＡを適当な制限エンドヌクレアーゼ
   で消化してＤＮＡ断片を形成し、（ｃ）この断片をクロ
   ーニングベクターに連結してＤＮＡ混合物を形成し、 （ｄ）ステップ（ｃ）のＤＮＡ混合物で宿主細胞を形質
   転換してライブラリーを形成し、（ｅ）Ｈｈａ I 修飾
   メチラーゼ遺伝子を含有するクローンを単離し、 （ｆ）Ｈｈａ I 修飾メチラーゼ遺伝子を含有するクロ
   ーンをスクリーニングし、Ｈｈａ I 制限エンドヌクレ
   アーゼ遺伝子を同時に含有しているクローンを単離し、 （ｇ）ステップ（ｆ）のクローンを含有する宿主細胞を
   培養し、 （ｈ）この培養物からＨｈａ I 制限エンドヌクレアー
   ゼを回収する ことからなる、Ｈｈａ I 制限エンドヌクレアーゼの製
   造方法。
10. （１０）クローニングベクターがプラスミドまたはウィ
    ルスのＤＮＡ分子である、請求項９に記載の方法。
11. （１１）プラスミドがｐＢＲ３２２である、請求項１０
    に記載の方法。