JPH0235B2

JPH0235B2 -

Info

Publication number: JPH0235B2
Application number: JP58125588A
Authority: JP
Inventors: Yoshiaki Sato; Yasutaka Nakajima; Kanehiko Enomoto; Atsushi Fujiwara; Toshiaki Doi
Original assignee: Mitsubishi Rayon Co Ltd
Current assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Priority date: 1983-07-12
Filing date: 1983-07-12
Publication date: 1990-01-05
Also published as: JPS6019496A; IL72370A0; DE3479593D1; SU1530101A3; EP0133927B1; EP0133927A3; BR8403429A; US4908313A; IL72370A; EP0133927A2

Description

【発明の詳細な説明】

発明の背景技術分野本発明は、ニトリラーゼ活性を有する微生物の
作用によりニトリル化合物を水和して対応するア
ミド化合物に転化させる方法に関する。さらに具
体的には、本発明は、使用微生物に光を照射する
ことによつて収率、空時収率および菌体生産性
（単位菌体量当り可能なアミド化合物生産量のこ
とをいう）よくアミド化合物を製造する方法に関
する。近年、微生物またはそれから得られた酵素を用
いて種々の化学反応を実施する技術が開発されつ
つある。一般に、微生物ないし酵素による反応
は、常温常圧下に実施できるのでエネルギー消費
が少なく、しかも目的生成物への選択性が極度に
高いので高純度の製品が得られ易いという特徴が
ある。しかしその反面、この反応は、反応活性お
よび微生物ないし酵素の触媒としての寿命の点で
改善すべき余地がある。特に、目的とする反応の
速度すなわち反応活性が常法通り反応条件特に温
度および（または）PHの至適化を行なつたとして
も低位の場合は、空時収率が低いので反応器の容
量を増大しなければならないばかりでなく、反応
速度が遅いため反応時間が長くなるところから、
これがさらに反応活性の低下につながつて、菌体
生産性が悪化する。従つて、微生物あるいは酵素の反応活性を高位
に発現させることは、基本的に重要なことであ
り、工業生産における経済性を左右するものであ
る。先行技術ニトリル化合物を水和して対応アミド化合物に
転化させる酵素活性、すなわちニトリラーゼ活
性、を有する微生物の作用下にニトリル化合物を
水和して対応アミド化合物を製造する方法は、特
公昭56−17918号、同56−38118号および特開昭51
−86186号各公報に記載されている。この反応で
は微生物が重要な役割を担うところ、これら各公
報には何種類かの微生物が開示されている。問題点これらの微生物のニトリラーゼ活性を利用して
ニトリル化合物の水和を工業的規模で実施すべく
容量の大きな金属製反応装置を使用したところ、
ニトリラーゼ活性の発現が不充分であつた。この
ような現象が微生物自体に起因するのかあるいは
反応装置の材質、構造その他の理由によるのかは
不明であつたが、この点が解決されなければこの
微生物学的なアミド化合物の製造法を工業的に実
施することはできない。発明の概要要旨本発明は上記の点に解決を与えることを目的と
し、使用微生物に光を照射することによつてこの
目的を達成しようとするものである。従つて、本発明による微生物によるアミドの製
造法は、ニトリル化合物をニトリラーゼ活性を有
する微生物の使用によつて水と反応させて対応す
るアミド化合物に転化させる方法において、この
反応を下記の条件下に実施すること、を特徴とす
るものである。 (イ) ニトリラーゼ活性を有する微生物が、グラム
染色性が陽性のものであること。 (ロ) 使用する微生物菌体に、水和反応の終了以前
に少なくとも約１×10^-2μE／ｇ菌体・秒の光
エネルギーを受けさせること。 (ハ) 水和反応を、少なくとも一部が光不透過性材
料からなる容器の中で実施すること。効果このように、本発明ではニトリラーゼ活性を有
する微生物の作用によつてニトリルの水和反応を
実施するに当り、この微生物に光を照射すること
によつて、光不透過性材料で製作した反応容器中
では光が実質的に存在しないので実質的に進行し
ないこの水和反応を進行させることができ、また
一部を光不透過性材料で製作した反応容器中では
光が存在するのである程度は進行するこの水和反
応を光照射によつて著るしく促進することができ
る。この水和反応はニトリラーゼの作用によつて行
なわれるところ、光照射の効果は微生物自身に照
射を行なうことによつて実現されるのであつて、
抽出した酵素に対して照射を行なつても認められ
ないのであり、またニトリラーゼ活性を持たない
微生物についても認めることができない。酵素の利用を含めて微生物学的な方法で有用物
質を生産することは既に多くの事例が知られてい
るのであるが、光のような電磁波を照射して微生
物ないしその酵素の活性を高める例は知られてお
らず、むしろ一般には照射は有害であることが多
いとされていることをも考慮すれば、上記の特定
の場合について認められた光照射の効果は全く思
いがけなかつたことといわなければならない。発明の具体的説明使用微生物ニトリラーゼ活性を有する微生物の作用によつ
てニトリル化合物を対応アミド化合物に転化させ
ることが公知であることは前記した通りである
が、本発明者の見出したところによれば前記特公
昭56−17918号、同56−38118号および特開昭51−
86186号公報に記載されている属の微生物は一般
に光による活性向上がある。これらの属の微生物に共通する特徴は、グラム
染色性が陽性であり、一般にりん脂質を有し、細
胞膜が厚く、そのため物質の透過に抵抗があり、
また細胞内酵素を取り出すに当つての膜破砕も容
易ではない、ということである。本発明による光照射効果は、ニトリラーゼ活性
を有する微生物以外の微生物には検討した限りで
は認められない。そして、興味のあることは、本発明の光照射効
果は、ニトリラーゼ酵素そのものに作用するもの
ではないということである。すなわち、本発明で
使用する微生物の一具体例であるコリネバクテリ
ウム属のＮ−774菌細胞から既知の方法で酵素を
抽出して精製して、そのニトリラーゼ活性を測定
したところ、光照射の有無で酵素活性に差は全く
認められなかつたからである。従つて、１つの理論によれば（たゞし、本発明
はそのような理論によつて拘束されるものではな
い）、光照射によつて基質（ニトリル）および
（または）生成物（アミド）の細胞膜透過速度が
向上することによつて見掛け上のニトリラーゼ活
性が増加するもののようである。よつて、本発明
は、一般に物質の細胞膜透過に抵抗を有するグラ
ム陽性菌について一般に成立するということがで
きる。さて、本発明で使用される微生物は、ニトリラ
ーゼ活性を有するグラム陽性菌である。このよう
な微生物の具体例を挙げれば、下記の群から選ん
だ属に属するものがある。 (イ) コリネバクテリウム属 (ロ) ノカルジア属 (ハ) バチルス属 (ニ) バクテリジウム属 (ホ) ミクロコツカス属 (ヘ) ブレビバクテリウム属これらの属に属する具体的な菌株の例を挙げれ
ば、コリネバクテリウム属のものとしてはＮ−
771株（昭和53年５月30日付微工研菌寄第4445号）
およびＮ−774株（昭和53年５月30日付微工研菌
寄第4446号）、ノカルジア属のものとしてはＮ−
775株（昭和53年５月30日付微工研菌寄第4447号）
があつて特公昭56−17918号および同56−38118号
公報に記載されており、バチルス属以外のものと
しては特開昭51−86186号公報に記載されたもの
があつて、微工研に寄託されていると記載されて
いる。これらの菌株の菌学的性質はこれら諸公報
に記載されていて公知である。ニトリル化合物およびアミド化合物ニトリル化合物は一般に式Ｒ−（CN）_oで表わさ
れ、ｎの値によつてモノニトリル（ｎ＝１）およ
びポリニトリル（ｎ≧２）があるうえ、Ｒは水素
あるいは種々の炭素数の、直鎖状、分岐鎖状また
は環状の飽和または不飽和の炭化水素残基、およ
びアミノ基、ヒドロキシル基、ハロゲン基、カル
ボキシル基、その他の置換基を有する炭化水素残
基であつて、広範囲の化合物が包含される。後記実施例に示されているように、多くのニト
リル化合物について実験した結果ではすべて例外
なく光照射でニトリラーゼ活性向上が認められて
おり、本発明はニトリル化合物に対して一般に成
立つ。水和反応生成物は出発ニトリル化合物のシアノ
基が水和したアミド化合物である。生成物の有用性の観点からは、少なくとも現在
の判断基準からすれば、アクリロニトリルからア
クリルアミドおよびシアノピリジンからニコチン
酸アミドの生産が重要であろう。水和反応ニトリラーゼ活性を有する微生物の作用下にニ
トリル化合物の水和を行なう方法は公知であつ
て、本発明でもその趣旨が損なわれない限り任意
の態様でこの反応を実施することができる（光照
射によつて、水和反応そのものには変化が認めら
れない）。この方法は、一般に微生物菌体と原料ニトリル
化合物とを水性媒体中で所定時間接触させること
からなる。微生物菌体は、培養液の形で、培養液から分離
した生菌体の形で（水洗したものが好ましい）、
生菌体を乾燥させた形で、あるいは生菌体（また
は乾燥菌体）を適当な担体に担持ないし固定化し
た形で、あることができる。好ましい形態は、生
菌体および生菌体を水性重合体ゲル（たとえば架
橋ポリアミドゲルあるいは架橋ポリビニルアルコ
ール）中に固定化したもの、である。水性媒体中の基質（ニトリル）濃度および菌体
濃度も上記のように適当に選択することができる
が、一般的には基質濃度約0.01〜約５％程度、菌
体濃度約0.01〜約２％程度（以上いずれも重量
％）である。反応温度、反応PHその他の反応条件
も使用微生物の種類に応じて適当に定めればよい
が、反応温度は氷点〜20℃程度、PHは７前後であ
る。PH値を所定値に保つため適当なバツフアーを
使用することができることはいうまでもない。なお、水和反応に供すべき菌体の調製は、所与
の微生物をそれに適した条件で培養すればよいこ
とはいうまでもない。培養液から分離されて水和
反応に供される菌体は非増殖条件下にあるという
ことができる。光照射 (1) 光光照射は、水和反応終了以前の菌体に対して
行なう。ここで、水和反応終了以前とは水和反
応の終了（必ずしも転化率100％を意味しない）
以前の任意の時点を意味する。光照射は菌体に
対して行なうのであるから、水和反応終了以前
とは菌体をニトリル化合物と接触させる前の時
点をも意味する。すなわち、光照射は、菌体を
ニトリル化合物に接触させる前および（また
は）接触させた後に行なうことができる。このように、光照射は菌体をニトリル化合物
と接触させる前のみに行なうことができる。し
かし、光照射した菌体を光不存在下にニトリル
化合物と接触させる場合は、光照射による活性
向上効果は認められるけれども、その持続が充
分ではない（たゞし、光照射をすれば回復す
る）。従つて、本発明の好ましい実施態様では、
菌体をニトリル化合物と接触させた後に光照射
を行なう。具体的には、たとえば、ニトリル化
合物と接触させる前にも接触後の水和反応中に
も行なう。本発明で照射する「光」は、その効果が認め
られる限り任意の波長のものでありうる。しか
し、電磁波の一部領域として光を捉えたときに
容易に想像できるように、より低エネルギーの
原子過程から生じるより高波長域では効果が少
なく、一方低波長に過ぎればそのエネルギーが
過大であるところより菌体あるいは酵素の分子
（配列）が破壊されて酵素活性を失なつて、遂
には所謂殺菌へと進むであろう。事実、本発明
者らが広い波長域を検討した結果では、800n
ｍを越える長波長の光は菌体に異常を与えない
が酵素活性向上効果は顕著ではなく、一方
100nｍ未満の短波長では短時間に活性向上効
果を発現することができるが回復しえない活性
低下をもたらす。従つて、本発明で好ましい光
は波長が約100〜約1000nｍのものであり、具
体的には波長200〜300nｍの範囲の殺菌用ライ
ト類、300〜400nｍの範囲のブラツクライト
類、400〜800nｍの範囲の一般照射用ライト類
からの光が例示される。光の照射は、それによつて活性向上効果が実
現される限り任意の強度ないし量で行なえばよ
い。具体的には、菌体が少なくとも約１×
10^-2μE／ｇ菌体・秒、好ましくは少なくとも
約２×10^-2μE／ｇ菌体・秒の光エネルギーを
受けるように照射を行なうべきである。なお、
固定化菌体を使用する場合はこれと同一濃度の
生菌体使用の場合にくらべて反応速度が約1/2
〜1/3に低下することがあるが、その場合は上
記値より約２〜３倍の光エネルギー量が必要で
ある。ここで、「μE」は１モル分子数に等しい
数の光量子のもつエネルギー（Ｅ（アインシユ
タイン））×10^-6で表わした光エネルギー量であ
り、「ｇ菌体」は乾燥菌体の菌体重量をｇで表
わしたものである。秒は照射時間を秒で表わし
たものである。この光エネルギー量は、通常の工業的生産規
模での反応容器その他の反応装置の環境の光
（すなわち、室内の照明および（または）一部
室内への散乱（太陽光）によつて与えられるも
のより大きい。すなわち、本発明者らの実験に
よれば、通常工業的生産現場での照度は100ル
ツクス程度であるが、この明るさでは、仮に菌
体濃度が100ppmと低く、且つ上部が全部光開
放された反応容器を使用したとしても、反応容
器が約250リツトル以上ともなると得られる光
エネルギー量は上記１×10^-2μE／ｇ菌体・秒
の値に満たなくなる。このように、かなり光を受け入れ易い条件に
あつても工業的生産現場においては所要光エネ
ルギー量は満たし難いが、本発明で少なくとも
約１×10^-2μE／ｇ菌体・秒の光エネルギーを
受けさせるというときは光の照射態様（詳細後
記）によつて室内光の寄与があるときはそれを
も含めるものとする。また、本発明で必要とする反応速度を得るた
めには、たとえば本発明の最低の光エネルギー
量すなわち１×10^-2μE／ｇ菌体・秒では約１
時間の照射を行なえばよい。 (2) 照射ニトリル化合物と接触する前の菌体あるいは
ニトリル化合物と接触している菌体が、それを
照射対象とする光源から所定量の光エネルギー
を連続的にあるいは非連続的に受けることがで
きる限り、任意の態様で照射を行なうことがで
きる。ここで、「菌体を照射対象とする光源」とは、
菌体を照射すべく反応装置内または外に設けら
れた光源を意味し、反応装置を取りまく環境が
散乱太陽光および（または）室内照明光として
反応装置内に入射させることあるべき光を包含
するという趣旨である。なお、反応装置の存る
室内を不必要ないし不自然に明るくしてその光
により反応装置内への有意の光エネルギーの入
射が認められるときは、そのような光源は本発
明でいう光源と解すべきものとする。光の照射は、具体的には、たとえば、菌体の
存在する容器の上部空間（すなわち、菌体ある
いはそれが懸濁する水性媒体液面上の空間）に
光源を設置して照射を行なう方法、容器の上
部、側部または底部に窓を設けてそこから外部
光源から照射を行なう方法、および一般に光化
学反応器として多用されるように液中浸漬ラン
プにより照射する方法、その他の方法、によつ
て行なうことができる。また、必要ならば、あ
るいは可能ならば、菌体の存在する容器（特に
反応容器）から反応液を抜出して、それについ
て別の容器で上記のような照射を行なうことも
できる（この場合の「別の容器」は、透明ガラ
ス管の一本または複数本からなるものであつて
もよい）。なお、光照射による本発明の効果は、ふつう
の室内光の入射によつては光エネルギー量が不
足するような工業的生産規模での反応容器を使
用する場合に特に顕著である。このような反応
容器は光不透過性材料、特に金属によつてその
実質的部分が製作されていることがふつうであ
り、このような光不透過性の反応容器では例え
ば視き窓あるいは蓋部から得られる一般照明に
よる光エネルギーでは極めて不充分で積極的な
光の照射が不可欠である。なお、ここで「反応
容器」とは、水和反応の少なくとも大部分が実
施される反応装置部分をいう。実施例実施例１グルコース１％、ペプトン0.5％、酵母エキス
0.3％、麦芽エキス0.3％および硫酸第二鉄・７水
塩0.05％を含む培地（PH7.2）により好気的に培
養して調製したＮ−774株（コリネバクテリウム
属）の洗滌菌体を得た。この菌体を暗所にて
0.05Mリン酸バツフアー（PH7.7）に分散させて、
3.5ｇ乾燥菌体／リツトルの濃度の菌体分散液を
調整した。この菌液を二分し、一方は4W昼光色
蛍光灯（東京芝浦電気(株)製）２基を用いて1.5×
10^-1μE／ｇ菌体・秒の光エネルギー照射下に０
℃で４時間放置し（以後、このサンプルを「明放
置」という）、もう一方は暗所にて０℃で４時間
放置した（以後、このサンプルを「暗放置」とい
う）。この菌液を用いてそれぞれについて、以下
の処方にて、アクリロニトリルからアクリルアミ
ドを生成させ、アクリルアミドの生成量の差によ
り反応速度を比較検討した。すなわち、明放置にては、菌体0.088部（乾燥
菌体量（以後この重量で示す））、アクリロニトリ
ル１部および0.05Mリン酸バツフアー（PH7.7）
98.912部を混合し、ガラス製50ミリリツトル反応
器中で上記と同じ光照射条件で撹拌下に10℃で20
分間反応させた（以後、この反応を「光照射反
応」という）。一方、暗放置は、光を照射しない
こと以外は、同条件で反応（以後、この反応を
「暗反応」という）を行なつた。それぞれの反応
終了液中のアクリルアミドをガスクロマトグラフ
イーにより定量分析した。その結果、単位菌体当
りのアクリルアミド（AA）の生成能で比較する
と、明放置光照射反応では41.1μモルAA／mg菌
体・分であり、暗放置暗反応では0.34μモルAA／
mg菌体・分であつた。また、この生成能を比較す
ると、明放置光照射反応／暗放置暗反応＝121で
あつた。以下の実施例については、本実施例中の明放置
光照射反応の41.1μモルAA／mg菌体・分を100U
とした相対値で示す。従つて、本例での暗放置暗
反応は、換算すると0.83Uとなる。実施例２〜13 実施例１と同様にして得た明放置と暗放置の菌
体それぞれについて、表−１の組成の反応液をつ
くり、実施例１と同様に反応させて、それぞれの
反応終了液を得た。これらの反応終了液中の対応
各アミド化合物をガスクロマトグラフイーにより
定量分析して、表−２の結果を得た。

【表】

【表】オニトリルピオアミド
実施例 14〜18 実施例１と同様にして調製した各種の属の菌
株、すなわち実施例14：バシラス属（CBS−
494）、実施例15：バクテリジウム属（CBS−
496）、実施例16：ミクロコツカス属（CBS−
497）、実施例17：ブレビバクテリウム属（CBS
−717）、および実施例18：ノスカルジア属（Ｎ−
775）、の洗滌菌体を得て、実施例１と同様にして
明放置と暗放置の菌体を得た。この菌体をそれぞ
れ以下の処方にてアクリロニトリルからアクリル
アミドを生成させ、アクリルアミドの生成量の差
により反応速度を比較検討した。すなわち、それぞれの菌株の明放置と暗放置に
ついて菌株0.088部、アクリロニトリル１部、
0.05Mリン酸バツフアー（PH7.7）98.912部を混合
し、撹拌下に10℃で20分間反応（光照射反応）さ
せ、また暗放置では光を照射しないこと以外は同
条件で反応（暗反応）を行なつて、反応終了液を
得た。それぞれの反応終了液中のアクリルアミド
をガスクロマトグラフイーにより定量分析して、
表−３の結果を得た。

【表】実施例19〜21および比較例１〜２グルコース１％、ペプトン0.5％、酵母エキス
0.3％、麦芽エキス0.3％および硫酸第二鉄・７水
塩0.05％を含む培地（PH7.2）により好気的に培
養して調製したＮ−774株の洗滌菌体を得た。こ
の菌体を暗所にて0.05モルリン酸バツフアー（PH
7.7）に分散させて、22.72mg／ｍリツトルの菌液
を調製した。この菌液をそれぞれ鋼製の50ｍリツトル容器に
１ｍリツトル採取し、24ｍリツトルの0.05モルリ
ン酸バツフアー（PH7.7）を加えて、実施例１と
同じ光源を用い、容器上部からの受光量を受光面
積の異なるフイルターを用いることにより、表−
４に示す光エネルギーとなるように調製して、０
℃、撹拌下光照射を１時間および20時間行なつ
た。これらの光照射菌液に、それぞれ同じ光照射条
件下に、５％アクリロニトリル溶液（0.05モルリ
ン酸バツフアー（PH7.7）溶液）を25ml加え20分
間反応を行ない、反応終了液を得た。なお、比較
のため光照射を全く行なわなかつたものおよび１
×10^-2μE／ｇ菌体・秒以下の光エネルギーにつ
いても上記同様に反応を行なつた。これらの反応液中のアクリルアミドの生成量を
ガスクロマトグラフイーにより定量分析し反応速
度を求めた。結果を表−４に示した。

【表】実施例 22 グルコース１％、ペプトン0.5％、酵母エキス
0.3％、麦芽エキス0.3％および硫酸第二鉄・７水
塩0.05％を含む培地（PH7.2）により好気的に培
養して調製したＮ−774菌株の洗滌菌体（含水率
75％）40部、アクリルアミド4.5部、Ｎ，N′−メ
チレンビスアクリルアミド0.5部および0.05Mリ
ン酸バツフアー（PH7.7）40部を混合して、均一
な懸濁液とした。これに、５％ジメチルアミノプ
ロピオニトリル水溶液５部および2.5％過硫酸カ
リウム水溶液10部を加えて10℃に30分間保つて重
合させた。かくして得られた塊状の菌体含有ゲル
を小粒子に破砕し、0.05Mリン酸バツフアー（PH
7.7）にて十分洗滌して、固定化菌体100部を得
た。この固定化菌体を0.05Mリン酸バツフアー
（PH7.7）にて3.5ｇ乾燥菌体／リツトルに調製し
た。この固定化菌体液を２分し、一方は実施例１
と同じ光照射条件で０℃に４時間放置し（明放
置）、もう一方は暗所にて０℃に４時間放置した
（暗放置）。この固定化菌体を用いて、それぞれに
ついて以下の処方にて、アクリロニトリルからア
クリルアミドを生成させ、アクリルアミドの生成
量の差により反応速度の比較検討をした。すなわ
ち、明放置にては、固定化菌体ゲル0.5部とアク
リロニトリル2.5部、0.05Mリン酸バツフアー
（PH7.7）97部を混合し、上記条件で光照射し、撹
拌下に０℃で20分間反応させ（光照射反応）、一
方暗放置については光を照射しないこと以外は同
条件で反応を行なつて（暗反応）、それぞれ反応
終了液を得た。それぞれの反応終了液中のアクリ
ルアミドをガスクロマトグラフイーにより定量分
析した。その結果、明放置光照射反応20.0U、暗
放置暗反応0.4Uであり、明放置光照射反応／暗
放置暗反応＝50.0であつた。実施例 23〜24 実施例22と同様にして得た明放置のＮ−774株
の固定化菌体４部、アクリロニトリル2.5部およ
び0.05Mリン酸バツフアー（PH7.7）93.5部を混合
し、これに2.5リツトル直方体ステンレス鋼製の
上部のみ開放された容器中で上部一面（144cm²）
より(1)実施例１と同じ光源を用い2.48×10^-2μE／
ｇ菌体・秒の光エネルギー、(2)100W（東京芝浦電
気(株)製「クールビーム」）のライトを用い1.86×
10μE／ｇ菌体・秒の光エネルギーをそれぞれ照
射して０℃で撹拌下に20分間反応させて、反応終
了液を得た。反応終了液中のアクリルアミドをガ
スクロマトグラフイーにより定量分析した。その
結果表−５に示した結果を得た。

【表】実施例25および比較例３実施例22と同様にして調製した、Ｎ−774株の
固定化菌体0.4部、0.0025M硫酸ナトリウム水溶
液84.6部およびアクリロニトリル1.8部を一部光
不透過性とした１リツトルのガラス製のセパラブ
ルフラスコに入れ、0.05NカセイソーダでPH8.5に
制御しつつ、０℃で撹拌下に150W（東京芝浦電気
株式会社製「クールライト」）のライトを反応液
から20cmの距離から照射し（光エネルギー量約７
×10²μE／ｇ菌体・秒）、反応系内のアクリロニ
トリル濃度を２％に制御しつつ、アクリロニトリ
ル13.2部を遂次添加して反応させて、反応終了液
100部を得た。この反応終了液は20％のアクリル
アミドを含み、未反応アクリロニトリルは反応時
間25時間目で100ppm以下であつた。比較例として、ライトを照射しないこと以外は
本実施例と同様の条件で反応を行なつた。その結
果、反応時間25時間目でアクリルアミド１％以下
であつた。参考例１実施例１と同様にして培養を行ない、洗滌して
得たＮ−774菌体をさらに低温にてフレンチプレ
ス破砕して得た抽出液を、常法に従つて除核酸お
よび透析して、50％硫酸アンモニウム飽和画分と
して粗酵素液を得た。この液は蛋白濃度3.9mg蛋
白／mlであつた。この液を二分し、一方は実施例
１と同じ光照射条件で10℃に４時間放置した（明
放置）。もう一方は、暗所にて10℃で４時間放置
（暗放置）した。この粗酵素液を用いて、それぞ
れについて以下の処方にてアクリロニトリルから
アクリルアミドを生成させ、アクリルアミドの生
成量の差により反応速度を比較検討した。すなわち、明放置については、粗酵素液2.5部、
アクリロニトリル2.5部および0.05Mリン酸バツ
フアー95.0部を混合し、上記条件で光照射し撹拌
下に10℃で20分間反応させ、一方暗放置について
は光を照射しないこと以外は同条件で反応を行な
つて、反応終了液を得た。それぞれの反応終了液
中のアクリルアミドをガスクロマトグラフイーに
より定量分析した。その結果、明放置光照射反応
では103μモルAA／mg蛋白・分、暗放置暗反応で
は102μモルAA／mg蛋白・分であつた。また、こ
の生成能を比較すると明放置光照射反応／暗放置
暗反応＝1.01であつた。よつて光照射効果はなか
つた。参考例２この実験は、ニトリラーゼ活性以外の酵素活性
を有する細菌については光照射がその酵素活性に
影響を及ぼさないことを示すためのものである。グルコース２％、フマール酸ナトリウム0.5％、
尿素0.2％、リン酸二水素一カリウム塩0.2％、硫
酸マグネシウム７水塩0.05％およびコーンステイ
ープリカー１％、を含む培地（PH7.2）により好
気的に培養して調製したブレビバクテリウム・ア
ンモニアゲネス（IAM1645）の洗滌菌体を得た。
この菌体を、暗所にて0.05Mリン酸バツフアー
（PH7.7）に分散させて菌体濃度30.0OD₆₃₀μｍの菌
体分散液を調整した。この菌液を二分し、一方は
150W「クールビーム」（東京芝浦電気株式会社製）
から20cmの距離に（光エネルギー量７×10²μE／
ｇ菌体・秒）30℃で１時間放置した（明放置）。
もう一方は暗所にて30℃で１時間放置（暗放置）
した。この菌液を用いて以下の処方にてフマール
酸からリンゴ酸を生成させ、リンゴ酸の生成量の
差により反応速度を比較検討した。すなわち、明放置については先に調製した菌液
50部、フマール酸ナトリウム８部および0.05Mリ
ン酸バツフアー（PH7.7）42部を混合し、上記光
照射条件で撹拌下に30℃で１時間反応させ、一方
暗放置については光を照射しないこと以下は同条
件で反応を行なつて、それぞれ反応終了液を得
た。それぞれの反応終了液中のリンゴ酸を、2N
−HClにてフマル酸を沈澱除去後、２，７−ナフ
タレンジオールによる発色法で定量した。その結
果、明放置光照射反応では3.40μモル／O.D.時間、
暗放置暗反応では3.36μモル／O.D.時間であつた。
この生成能を比較すると、明放置光照射反応／暗
放置暗反応＝0.95であつた。よつて光照射効果は
なかつた。本菌は、界面活性剤により処理することより、
著しい活性の向上がみられることがわかつてい
る。よつて、界面活性剤処理を行つた後に光照射
効果があるかどうか検討した。菌体の処理は、
0.02％のセチルピリジニウムクロリドを含む1M
フマール酸ナトリウム溶液（PH7.5）に、上記培
養液で培養した菌体を懸濁させ（71.5OD₆₃₀μｍ）、
37℃にて19時間振とうすることによつて行なつ
た。後に遠心にて菌体を分離し、0.05Mリン酸バ
ツフアー（PH7.7）にて洗滌して、洗滌菌体を得
た。処理菌体を上記と同様にしてそれぞれの反応終
了液を得た。その結果、明放置光照射反応では
13.9μモル／O.D.時間、暗放置暗反応では12.7μモ
ル／O.D.時間であつた。またこの生成能を比較
すると、明放置光照射反応／暗放置暗反応＝1.09
であつた。よつて光照射効果はなかつた。

Claims

【特許請求の範囲】１ニトリル化合物をニトリラーゼ活性を有する
微生物の作用によつて水と反応させて対応するア
ミド化合物に転化させる方法において、この反応
を下記の条件下に実施することを特徴とする、微
生物によるアミドの工業的製造法。 (イ) ニトリラーゼ活性を有する微生物が、グラム
染色性が陽性のものであること。 (ロ) 使用する微生物菌体に、水和反応終了以前に
少なくとも約１×10^-2μE／ｇ菌体・秒の光エ
ネルギーを受けさせること。 (ハ) 水和反応を、少なくとも一部が光不透過性材
料からなる容器の中で実施すること。２光が、約100〜約1000nｍの波長のものであ
る、特許請求の範囲第１項に記載の方法。３光エネルギーが、少なくとも約２×
10^-2μE／ｇ菌体・秒である、特許請求の範囲第
１〜２項のいずれかに記載の方法。４光の照射を、微生物菌体をニトリル化合物に
接触させる前および（または）接触させた後に実
施する、特許請求の範囲第１〜３項のいずれか１
項に記載の方法。５微生物が、コリネバクテリウム属、ノカルジ
ア属、バチルス属、バクテリジウム属、ミクロコ
ツカス属およびブレビバクテリウム属からなる群
から選ばれた属に属するものである、特許請求の
範囲第１〜４項のいずれか１項に記載の方法。６ニトリル化合物が、アセトニトリル、プロピ
オニトリル、ｎ−ブチロニトリル、ｉ−ブチロニ
トリル、ｎ−バレロニトリル、アクリロニトリ
ル、メタクリロニトリル、ベンゾニトリル、シア
ノピリジン、マロノニトリル、サクシノニトリ
ル、フマロニトリル、クロロアセトニトリル、β
−ヒドロキシプロピオニトリル、アミノアセトニ
トリルおよびβ−アミノプロピオニトリルからな
る群から選ばれたものである、特許請求の範囲第
１〜５項のいずれか１項に記載の方法。