JPH0346106B2 - - Google Patents
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- JPH0346106B2 JPH0346106B2 JP11499482A JP11499482A JPH0346106B2 JP H0346106 B2 JPH0346106 B2 JP H0346106B2 JP 11499482 A JP11499482 A JP 11499482A JP 11499482 A JP11499482 A JP 11499482A JP H0346106 B2 JPH0346106 B2 JP H0346106B2
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は酵素の固定化方法に関し、さらに詳し
くは特定のスペーサーを導入した担体を用いた酵
素の固定化方法に関する。 これまでに知られている固定化酵素の製造法の
１つとして酵素を水不溶性担体に共有結合させる
方法または多官能性試薬にて酵素を架橋結合させ
る方法があるが、酵素の活性発現を極力妨害しな
いためには担体の幹部と官能基との距離を適当に
離す必要がある。そのためには煩雑な反応処理が
必要で、そのため担体の作成が割高なものになる
場合が多かつた。 かかる現状に鑑み本発明者らは酵素の活性発源
を極力妨害しないようなスペーサーを有する水不
溶性担体を容易にかつ安価に製造すべく、種々研
究を重ねた結果、水酸基および／またはアミノ基
を有する高分子物質に、一般式(I) H2N−Ｗ−SO2−Ｘ (I) 〔式中、Ｗは脂肪族炭化水素基、脂環式炭化水素
基または−（CH2）n−Ｙ−（CH2）o−（式中、ｍ，
ｎはそれぞれ０，１，２，３，４，５をあらわ
し、Ｙはアリール基をあらわす。）を、Ｘはビニ
ル基、−CH2CH2−Ａ−Ｒ（Ａは酸素原子またはイ
オウ原子を、Ｒは多塩基性酸の残基を表わす。）
またはハロゲノエチル基をあらわす。〕 で示される化合物またはそのアミノ基が保護され
た化合物とをアルカリの存在下反応させて得られ
る担体を用いることを特徴とする酵素の固定化方
法を見い出した。 以下に本発明を詳細に説明する。水酸基およ
び／またはアミノ基を有する高分子物質としては
ビニルスルホン型反応性染料と反応しうるもので
あれば何でもよく、たとえばセルロース、アガロ
ース、デンプンなどの多糖類、ポリビニルアルコ
ール、絹、羊毛などがあげられる。 一般式(I)で示される化合物としては、末端にア
ミノ基があり、他端にビニルスルホン型反応性染
料の活性二重結合反応基として通常用いられてい
るビニルスルホニル基、−SO2−CH2CH2−Ａ−
Ｒ（Ａ，Ｒは前述のとおり）またはハロゲノエチ
ルスルホニル基があればよい。Ｗは両端のアミノ
基と−SO2−Ｘとの距離を保つために存在するの
であり、前述のような基であればよい。 さらに具体的に述べるならば、多塩基性酸（そ
の残基がＲを表わす）としては、例えば硫酸、燐
酸またはその酸性塩があげられる。ハロゲノエチ
ル基のハロゲン原子としては塩素、臭素、ヨウ素
があげられるが塩素が好ましい。 脂肪族炭化水素基としては、置換または無置換
のC1−C5低級アルキレン基が、アリール基とし
てはたとえば置換または無置換のフエニレン基、
ナフチレン基が、脂環式炭化水素基としてはC3
−C7の低級シクロアルキレンがあげられるがも
ちろんこれに限定されるものではない。 Ｗとして好ましいものとしては、置換または無
置換のフエニレン基があげられ、そのときの置換
基として低級アルキル基、低級アルコキシル基、
ハロゲン原子等があげられる。 さらに具体的にいうならば、一般式(I)で示され
る化合物として、β−スルフアートエチルスルホ
ニルアニリン、β−スルフアートエチルスルホニ
ルトルイジン、β−スルフアートエチルスルホニ
ルアニシジン、β−スルフアートエチルスルホニ
ルメトキシメチルアニリン、β−スルフアートエ
チルスルホニルハロゲノアニリン、β−チオスル
フアートエチルスルホニルアニリン、β−ホスフ
アートエチルスルホニルアニリン、ビニルスルホ
ニルアニリン、ビニルスルホニルトルイジン、β
−スルフアートエチルスルホニルベンジルアミ
ン、β−スルフアートエチルアニリノメタン、β
−スルフアートエチルスルホニルベンジルアミノ
エタン、β−クロロエチルスルホニルアニリン、
β−クロロエチルスルホニルトルイジン等があげ
られる。 一般式(I)のアミノ基が保護された化合物として
は、高分子物質と反応後、適当な分解反応にてフ
リーのアミノ基になる化合物であればよくたとえ
ばビニルスルホン型の反応性染料（例えばC.I.
Reactive Yellow13〜17、C.I.Reactive Red21〜
23やC.I.Reactive Black5など）またはアミノ基
が低級アルカノイル基で保護された化合物、例え
ばβ−スルフアートエチルスルホニルアセトアミ
ノベンゼン、β−ホスフアートエチルスルホニル
アセトアミノベンゼンなどが挙げられる。 本発明で用いられる酵素固定化用担体を製造す
るには、ビニルスルホン型反応性染料の染着条件
がそのまま適用されるが、特に好ましくは浴比が
１対100以下の適当な溶媒（例えば水）中水酸化
ナトリウム、水酸化カリウム、第三リン酸ナトリ
ウム、炭酸ナトリウム等の通常のアルカリ剤の存
在下、PH８以上、好ましくはPH10〜12、温度20〜
80℃にて、さらに好ましくは電解質物質（例えば
芒硝、食塩など）を適当量（例えば２〜20wt％）
添加し、１〜数十時間撹拌接触させた後、十分に
洗浄を行ない、さらに好ましくは非イオンまたは
弱アニオン洗剤を用いて90〜100℃にて２〜20分
程度のソーピング処理を行ない、未反応分を除去
することにより容易に製造される。 一般式(I)のアミノ基が保護された化合物と高分
子物質を反応させた場合には、アミノ基の保護基
は通常の方法、たとえばジアゾ結合の場合は還
元、低級アルカノイル基の場合は加水分解により
アミノ基に導かれる。 このようにして得られた担体に酵素を固定化す
る。固定化方法の一つとして、架橋結合法がある
が、得られた担体に酵素を架橋結合にて結合させ
るには、酵素のアミノ基と担体のスペーサー末端
部のアミノ基と反応しうる多官能性試薬（例えば
グルタルアルデヒド、グリオキサール、マロンジ
アルデヒド、マレインジアルデヒド等のジアルデ
ヒド化合物やヘキサメチレンジイソシアナートな
ど）を用い、好ましくは緩衝液中、比較的低い温
度で撹拌混合する。 この場合、酵素と担体を先に接触させた後に多
官能性試薬を加えることも、逆に担体と多官能性
試薬を接触反応させた後に酵素を添加すること
も、さらには同一系で三者を混合接触させること
も可能であり、酵素活性が失なわれない限りにお
いては、担体と酵素と多官能性試薬との反応条件
は特に制限されるものではない。 本発明で用いられる酵素固定化用担体に、酵素
を固定化する方法は架橋結合法に限られるもので
はなく、ジアゾ法やこのアミノ基を他の官能基に
変換して用いる方法も適用できる。 本発明において用いられる酵素は、特に限定さ
れるものではない。 以下に実施例で本発明を詳細に説明するが、本
発明はこれによつて限定されるものではない。 例中、部および％は夫々重量部および重量％を
表わす。 実施例 １ （水不溶性担体の調製） 綿２部と硫酸ナトリウム10部を、β−スルフア
ートエチルスルホニル−ｐ−アミノベンゼン７％
水溶液100部に加え、40℃にて20分間撹拌後、28
％水酸化ナトリウム水溶液にてPHを9.0にコント
ロールしつつ、６時間混合撹拌を行ない、反応終
了後、綿を別し、温水200部にて洗浄し、さら
に0.1％モノゲン（花王石鹸(株)製）液100部にて、
95〜100℃で10分間煮沸し、水200部にて洗浄別
し、60℃にて乾燥した。得られた水不溶性担体１
ｇは、ジアゾ分析からアミノ基を0.97ｍ−mole
有していることが判かつた。 （酵素の固定化） 0.01％ラクターゼ液（PH＝5.0の0.05M酢酸緩衝
液）80部に、前記で調製した水不溶性担体１部を
加え、25℃にて４時間ゆるやかに撹拌後、PH＝
5.0の0.3M酢酸緩衝液100部にて洗浄しイオン交
換水40部と３％グルタルアルデヒド水溶液（PH＝
4.5に調節）20部を加え、18℃にて２時間反応さ
せた。反応終了後、残存グルタルアルデヒドを十
分量のイオン交換水にて洗浄し、固定化ラクター
ゼを作成した。 得られた固定化ラクターゼ剤の酵素活性を測定
したところ、632μ−mole／Hr／ｇ（乾重量）の
活性を示した。 ここでラクターゼ活性は、10％ラクトース溶液
を基質とし30℃、PH＝5.0にて反応させた時、１
時間に生成するグルコースのμ−mole数にて表
した。 実施例 ２ （水不溶性担体の調製） β−スルフアートエチルスルホニル−ｐ−アミ
ノベンゼンの代わりに、ビニルスルホニル−ｐ−
アミノベンゼンを用いる以外は実施例１と同様の
処理を行なつたところ、得られた水不溶性担体１
ｇはアミノ基0.63ｍ−mole有していた。 （酵素の固定化） イオン交換水40部に、前記で調製した水不溶性
担体１部を加え、18℃にて３％グリオキサール水
溶液（PH＝4.5に調節）10部を添加し、１時間接
触後、イオン交換水150部と0.05M酢酸緩衝液
（PH＝5.0）100部にて十分洗浄し、0.01％ラクタ
ーゼ液（PH＝5.0：0.05M酢酸緩衝液）80部を加
え25℃にて４時間ゆるやかに撹拌し、その後
0.3M酢酸緩衝液（PH＝5.0）100部とイオン交換
水500部にて十分洗浄した。 かくして得られた固定化ラクターゼ剤の酵素活
性を測定したところ373μ−mole／Hr／ｇ（乾重
量）の活性を示した。 実施例 ３ （水不溶性担体の調製） β−スルフアートエチルスルホニル−ｐ−アミ
ノベンゼンの代わりに、β−スルフアートエチル
スルホニル−ｍ−アミノベンゼンをPH調整剤とし
て28％水酸化ナトリウム水溶液の代わりに、20％
炭酸ナトリウム水溶液を用いる以外は、実施例１
と同様の処理を行なつた。 得られた水不溶性担体１ｇはアミノ基を0.63ｍ
−mole有している。 （酵素の固定化） イオン交換水40部に、前記で調製した水不溶性
担体１部を加え、18℃にて３％グルタルアルデヒ
ド水溶液（PH＝4.5に調節）20部を添加し、２時
間接触後、イオン交換水200部と0.05M酢酸緩衝
液（PH＝5.0）100部にて十分洗浄し、0.01％グル
コアミラーゼ液（PH＝5.0；Ｍ酢酸緩衝液）100部
を加え25℃にて４時間ゆるやかに撹拌し、その後
0.3M酢酸緩衝液（PH＝5.0）200部とイオン交換
水500部にて十分洗浄した。 かくして得られた固定化グルコアミラーゼ剤の
酵素活性を測定したところ、404μ−mole／Hr／
ｇ（乾重量）の活性を示した。 ここで、グルコアミラーゼ活性は、１％可溶性
デンプンを基質とし、40℃、PH＝5.0で反応させ
た時に、１時間に生成するグルコースのμ−
mole数にて表わした。 実施例 ４ （水不溶性担体の調製） セルロースパウダー２部と塩化ナトリウム10部
をβ−スルフアートエチルスルホニル−ｏ−アミ
ノベンゼン10％水溶液に加え、50℃にて１時間撹
拌後20％第三リン酸ナトリウム水溶液にてPHを
9.5にコントロールしつつ10時間撹拌し、反応終
了後、実施例１と同様の方法にて、洗浄、ソーピ
ング処理を行なつた。 得られた水不溶性担体１ｇは、アミノ基を
0.59m−mole有していた。 （酵素の固定化） 実施例１と同様の方法にて、前記で得られた水
不溶性担体にラクターゼを固定化した。 得られた固定化ラクターゼ剤の酵素活性は
221μ−mole／Hr／ｇ（乾重量）であつた。 実施例 ５ （水不溶性担体の調製） ビニロン10部をβ−スルフアートエチルスルホ
ニル−ｐ−アミノベンゼン11％水溶液300部に加
え、40℃にて１時間混合撹拌後、20％炭酸ナトリ
ウム水溶液にてPHを9.0にコントロールして、25
時間撹拌を継続した。反応終了後、実施例１と同
様の方法にて、洗浄、ソーピング処理を行なつ
た。 得られた水不溶性担体１ｇは、アミノ基を0.09
ｍ−mole有していた。 （酵素の固定化） 0.05％セルラーゼ液（PH＝4.5；0.05M酢酸緩衝
液）100部に、前記で得られた水不溶性担体１部
を加え、30℃にて３時間ゆるやかに撹拌した後、
３％グルタルアルデヒド水溶液（PH＝4.5に調節）
20部を加え、18℃にて２時間反応した。反応終了
後、十分量のPH＝4.5；0.3M酢酸緩衝液とイオン
交換水にて洗浄した。 得られた固定化セルラーゼ剤の酵素活性を測定
したところ、19μ−mole／Hr／ｇ（乾重量）の
活性を示した。 ここで、セルラーゼ活性は、１％可溶性デンプ
ンを基質とし、40℃；PH＝4.5で反応させ、１時
間で生成するグルコースのμ−mole数にて表わ
した。 実施例 ６ 反応性染料Sumifix Black B. ｛住友化学工
業KK品 （一部Na塩も存在する）｝20部と綿10部を500
部の水に添加し、20％炭酸ナトリウム水溶液にて
PHを10.0にコントロールしつつ50℃にて20時間反
応させ、十分量の温水で洗浄を行ない、更に0.1
％モノゲン（花王石鹸(株)製）水溶液400部に懸濁
させ、95〜100℃にて10分間ソーピング処理を行
ない、十分に洗浄した後、ハイドロサルフアイト
４部を加え、65〜70℃にて２時間処理を行なうこ
とによりジアゾ結合を還元し、アミノ基とした。 得られた水不溶性担体１ｇは、アミノ基を0.16
ｍ−mole有していた。 （酵素の固定化） 実施例１と同様の方法にて、前記で得られた水
不溶性担体にラクターゼを固定化した。 得られた固定化ラクターゼ剤の酵素活性を測定
したところ、1123μ−mole／Hr／ｇ（乾重量）
の活性を示した。 実施例 ７ β−スルフアートエチルスルホニル−ｐ−アミ
ノベンゼンの代わりに、βスルフアートエチルス
ルホニルｐ−アセトアミノベンゼンを用いる以外
は、実施例１と同様の処理を行ない、更に28％水
酸化ナトリウム水溶液10部と水90部を加え、80〜
85℃にて６時間加水分解処理を行なつた。 得られた水不溶性担体１ｇは、アミノ基を0.06
ｍ−mole有していた。 （酵素の固定化） 実施例１と同様の方法にて、前記で得られた水
不溶性担体にラクターゼを固定化した。 得られた固定化ラクターゼ剤の酵素活性を測定
したところ、2176μ−mole／Hr／ｇ（乾重量）
の活性を示した。 参考例 １ 実施例１にて作成した固定化ラクターゼ剤を、
冷蔵庫中に湿潤状態で保存し、10日後の酵素活性
を測定したところ、119μ−mole／min／ｇ（乾
重量）の活性を示した。 参考例 ２ 実施例１にて作成した固定化ラクターゼ剤を用
いて、２日毎に酵素反応を５回繰り返し使用し
た。 結果を表−１に示す。 ５回の再使用において、本固定化ラクターゼ剤
は、ほとんど酵素活性の低下を示していなかつ
た。 【表】
くは特定のスペーサーを導入した担体を用いた酵
素の固定化方法に関する。 これまでに知られている固定化酵素の製造法の
１つとして酵素を水不溶性担体に共有結合させる
方法または多官能性試薬にて酵素を架橋結合させ
る方法があるが、酵素の活性発現を極力妨害しな
いためには担体の幹部と官能基との距離を適当に
離す必要がある。そのためには煩雑な反応処理が
必要で、そのため担体の作成が割高なものになる
場合が多かつた。 かかる現状に鑑み本発明者らは酵素の活性発源
を極力妨害しないようなスペーサーを有する水不
溶性担体を容易にかつ安価に製造すべく、種々研
究を重ねた結果、水酸基および／またはアミノ基
を有する高分子物質に、一般式(I) H2N−Ｗ−SO2−Ｘ (I) 〔式中、Ｗは脂肪族炭化水素基、脂環式炭化水素
基または−（CH2）n−Ｙ−（CH2）o−（式中、ｍ，
ｎはそれぞれ０，１，２，３，４，５をあらわ
し、Ｙはアリール基をあらわす。）を、Ｘはビニ
ル基、−CH2CH2−Ａ−Ｒ（Ａは酸素原子またはイ
オウ原子を、Ｒは多塩基性酸の残基を表わす。）
またはハロゲノエチル基をあらわす。〕 で示される化合物またはそのアミノ基が保護され
た化合物とをアルカリの存在下反応させて得られ
る担体を用いることを特徴とする酵素の固定化方
法を見い出した。 以下に本発明を詳細に説明する。水酸基およ
び／またはアミノ基を有する高分子物質としては
ビニルスルホン型反応性染料と反応しうるもので
あれば何でもよく、たとえばセルロース、アガロ
ース、デンプンなどの多糖類、ポリビニルアルコ
ール、絹、羊毛などがあげられる。 一般式(I)で示される化合物としては、末端にア
ミノ基があり、他端にビニルスルホン型反応性染
料の活性二重結合反応基として通常用いられてい
るビニルスルホニル基、−SO2−CH2CH2−Ａ−
Ｒ（Ａ，Ｒは前述のとおり）またはハロゲノエチ
ルスルホニル基があればよい。Ｗは両端のアミノ
基と−SO2−Ｘとの距離を保つために存在するの
であり、前述のような基であればよい。 さらに具体的に述べるならば、多塩基性酸（そ
の残基がＲを表わす）としては、例えば硫酸、燐
酸またはその酸性塩があげられる。ハロゲノエチ
ル基のハロゲン原子としては塩素、臭素、ヨウ素
があげられるが塩素が好ましい。 脂肪族炭化水素基としては、置換または無置換
のC1−C5低級アルキレン基が、アリール基とし
てはたとえば置換または無置換のフエニレン基、
ナフチレン基が、脂環式炭化水素基としてはC3
−C7の低級シクロアルキレンがあげられるがも
ちろんこれに限定されるものではない。 Ｗとして好ましいものとしては、置換または無
置換のフエニレン基があげられ、そのときの置換
基として低級アルキル基、低級アルコキシル基、
ハロゲン原子等があげられる。 さらに具体的にいうならば、一般式(I)で示され
る化合物として、β−スルフアートエチルスルホ
ニルアニリン、β−スルフアートエチルスルホニ
ルトルイジン、β−スルフアートエチルスルホニ
ルアニシジン、β−スルフアートエチルスルホニ
ルメトキシメチルアニリン、β−スルフアートエ
チルスルホニルハロゲノアニリン、β−チオスル
フアートエチルスルホニルアニリン、β−ホスフ
アートエチルスルホニルアニリン、ビニルスルホ
ニルアニリン、ビニルスルホニルトルイジン、β
−スルフアートエチルスルホニルベンジルアミ
ン、β−スルフアートエチルアニリノメタン、β
−スルフアートエチルスルホニルベンジルアミノ
エタン、β−クロロエチルスルホニルアニリン、
β−クロロエチルスルホニルトルイジン等があげ
られる。 一般式(I)のアミノ基が保護された化合物として
は、高分子物質と反応後、適当な分解反応にてフ
リーのアミノ基になる化合物であればよくたとえ
ばビニルスルホン型の反応性染料（例えばC.I.
Reactive Yellow13〜17、C.I.Reactive Red21〜
23やC.I.Reactive Black5など）またはアミノ基
が低級アルカノイル基で保護された化合物、例え
ばβ−スルフアートエチルスルホニルアセトアミ
ノベンゼン、β−ホスフアートエチルスルホニル
アセトアミノベンゼンなどが挙げられる。 本発明で用いられる酵素固定化用担体を製造す
るには、ビニルスルホン型反応性染料の染着条件
がそのまま適用されるが、特に好ましくは浴比が
１対100以下の適当な溶媒（例えば水）中水酸化
ナトリウム、水酸化カリウム、第三リン酸ナトリ
ウム、炭酸ナトリウム等の通常のアルカリ剤の存
在下、PH８以上、好ましくはPH10〜12、温度20〜
80℃にて、さらに好ましくは電解質物質（例えば
芒硝、食塩など）を適当量（例えば２〜20wt％）
添加し、１〜数十時間撹拌接触させた後、十分に
洗浄を行ない、さらに好ましくは非イオンまたは
弱アニオン洗剤を用いて90〜100℃にて２〜20分
程度のソーピング処理を行ない、未反応分を除去
することにより容易に製造される。 一般式(I)のアミノ基が保護された化合物と高分
子物質を反応させた場合には、アミノ基の保護基
は通常の方法、たとえばジアゾ結合の場合は還
元、低級アルカノイル基の場合は加水分解により
アミノ基に導かれる。 このようにして得られた担体に酵素を固定化す
る。固定化方法の一つとして、架橋結合法がある
が、得られた担体に酵素を架橋結合にて結合させ
るには、酵素のアミノ基と担体のスペーサー末端
部のアミノ基と反応しうる多官能性試薬（例えば
グルタルアルデヒド、グリオキサール、マロンジ
アルデヒド、マレインジアルデヒド等のジアルデ
ヒド化合物やヘキサメチレンジイソシアナートな
ど）を用い、好ましくは緩衝液中、比較的低い温
度で撹拌混合する。 この場合、酵素と担体を先に接触させた後に多
官能性試薬を加えることも、逆に担体と多官能性
試薬を接触反応させた後に酵素を添加すること
も、さらには同一系で三者を混合接触させること
も可能であり、酵素活性が失なわれない限りにお
いては、担体と酵素と多官能性試薬との反応条件
は特に制限されるものではない。 本発明で用いられる酵素固定化用担体に、酵素
を固定化する方法は架橋結合法に限られるもので
はなく、ジアゾ法やこのアミノ基を他の官能基に
変換して用いる方法も適用できる。 本発明において用いられる酵素は、特に限定さ
れるものではない。 以下に実施例で本発明を詳細に説明するが、本
発明はこれによつて限定されるものではない。 例中、部および％は夫々重量部および重量％を
表わす。 実施例 １ （水不溶性担体の調製） 綿２部と硫酸ナトリウム10部を、β−スルフア
ートエチルスルホニル−ｐ−アミノベンゼン７％
水溶液100部に加え、40℃にて20分間撹拌後、28
％水酸化ナトリウム水溶液にてPHを9.0にコント
ロールしつつ、６時間混合撹拌を行ない、反応終
了後、綿を別し、温水200部にて洗浄し、さら
に0.1％モノゲン（花王石鹸(株)製）液100部にて、
95〜100℃で10分間煮沸し、水200部にて洗浄別
し、60℃にて乾燥した。得られた水不溶性担体１
ｇは、ジアゾ分析からアミノ基を0.97ｍ−mole
有していることが判かつた。 （酵素の固定化） 0.01％ラクターゼ液（PH＝5.0の0.05M酢酸緩衝
液）80部に、前記で調製した水不溶性担体１部を
加え、25℃にて４時間ゆるやかに撹拌後、PH＝
5.0の0.3M酢酸緩衝液100部にて洗浄しイオン交
換水40部と３％グルタルアルデヒド水溶液（PH＝
4.5に調節）20部を加え、18℃にて２時間反応さ
せた。反応終了後、残存グルタルアルデヒドを十
分量のイオン交換水にて洗浄し、固定化ラクター
ゼを作成した。 得られた固定化ラクターゼ剤の酵素活性を測定
したところ、632μ−mole／Hr／ｇ（乾重量）の
活性を示した。 ここでラクターゼ活性は、10％ラクトース溶液
を基質とし30℃、PH＝5.0にて反応させた時、１
時間に生成するグルコースのμ−mole数にて表
した。 実施例 ２ （水不溶性担体の調製） β−スルフアートエチルスルホニル−ｐ−アミ
ノベンゼンの代わりに、ビニルスルホニル−ｐ−
アミノベンゼンを用いる以外は実施例１と同様の
処理を行なつたところ、得られた水不溶性担体１
ｇはアミノ基0.63ｍ−mole有していた。 （酵素の固定化） イオン交換水40部に、前記で調製した水不溶性
担体１部を加え、18℃にて３％グリオキサール水
溶液（PH＝4.5に調節）10部を添加し、１時間接
触後、イオン交換水150部と0.05M酢酸緩衝液
（PH＝5.0）100部にて十分洗浄し、0.01％ラクタ
ーゼ液（PH＝5.0：0.05M酢酸緩衝液）80部を加
え25℃にて４時間ゆるやかに撹拌し、その後
0.3M酢酸緩衝液（PH＝5.0）100部とイオン交換
水500部にて十分洗浄した。 かくして得られた固定化ラクターゼ剤の酵素活
性を測定したところ373μ−mole／Hr／ｇ（乾重
量）の活性を示した。 実施例 ３ （水不溶性担体の調製） β−スルフアートエチルスルホニル−ｐ−アミ
ノベンゼンの代わりに、β−スルフアートエチル
スルホニル−ｍ−アミノベンゼンをPH調整剤とし
て28％水酸化ナトリウム水溶液の代わりに、20％
炭酸ナトリウム水溶液を用いる以外は、実施例１
と同様の処理を行なつた。 得られた水不溶性担体１ｇはアミノ基を0.63ｍ
−mole有している。 （酵素の固定化） イオン交換水40部に、前記で調製した水不溶性
担体１部を加え、18℃にて３％グルタルアルデヒ
ド水溶液（PH＝4.5に調節）20部を添加し、２時
間接触後、イオン交換水200部と0.05M酢酸緩衝
液（PH＝5.0）100部にて十分洗浄し、0.01％グル
コアミラーゼ液（PH＝5.0；Ｍ酢酸緩衝液）100部
を加え25℃にて４時間ゆるやかに撹拌し、その後
0.3M酢酸緩衝液（PH＝5.0）200部とイオン交換
水500部にて十分洗浄した。 かくして得られた固定化グルコアミラーゼ剤の
酵素活性を測定したところ、404μ−mole／Hr／
ｇ（乾重量）の活性を示した。 ここで、グルコアミラーゼ活性は、１％可溶性
デンプンを基質とし、40℃、PH＝5.0で反応させ
た時に、１時間に生成するグルコースのμ−
mole数にて表わした。 実施例 ４ （水不溶性担体の調製） セルロースパウダー２部と塩化ナトリウム10部
をβ−スルフアートエチルスルホニル−ｏ−アミ
ノベンゼン10％水溶液に加え、50℃にて１時間撹
拌後20％第三リン酸ナトリウム水溶液にてPHを
9.5にコントロールしつつ10時間撹拌し、反応終
了後、実施例１と同様の方法にて、洗浄、ソーピ
ング処理を行なつた。 得られた水不溶性担体１ｇは、アミノ基を
0.59m−mole有していた。 （酵素の固定化） 実施例１と同様の方法にて、前記で得られた水
不溶性担体にラクターゼを固定化した。 得られた固定化ラクターゼ剤の酵素活性は
221μ−mole／Hr／ｇ（乾重量）であつた。 実施例 ５ （水不溶性担体の調製） ビニロン10部をβ−スルフアートエチルスルホ
ニル−ｐ−アミノベンゼン11％水溶液300部に加
え、40℃にて１時間混合撹拌後、20％炭酸ナトリ
ウム水溶液にてPHを9.0にコントロールして、25
時間撹拌を継続した。反応終了後、実施例１と同
様の方法にて、洗浄、ソーピング処理を行なつ
た。 得られた水不溶性担体１ｇは、アミノ基を0.09
ｍ−mole有していた。 （酵素の固定化） 0.05％セルラーゼ液（PH＝4.5；0.05M酢酸緩衝
液）100部に、前記で得られた水不溶性担体１部
を加え、30℃にて３時間ゆるやかに撹拌した後、
３％グルタルアルデヒド水溶液（PH＝4.5に調節）
20部を加え、18℃にて２時間反応した。反応終了
後、十分量のPH＝4.5；0.3M酢酸緩衝液とイオン
交換水にて洗浄した。 得られた固定化セルラーゼ剤の酵素活性を測定
したところ、19μ−mole／Hr／ｇ（乾重量）の
活性を示した。 ここで、セルラーゼ活性は、１％可溶性デンプ
ンを基質とし、40℃；PH＝4.5で反応させ、１時
間で生成するグルコースのμ−mole数にて表わ
した。 実施例 ６ 反応性染料Sumifix Black B. ｛住友化学工
業KK品 （一部Na塩も存在する）｝20部と綿10部を500
部の水に添加し、20％炭酸ナトリウム水溶液にて
PHを10.0にコントロールしつつ50℃にて20時間反
応させ、十分量の温水で洗浄を行ない、更に0.1
％モノゲン（花王石鹸(株)製）水溶液400部に懸濁
させ、95〜100℃にて10分間ソーピング処理を行
ない、十分に洗浄した後、ハイドロサルフアイト
４部を加え、65〜70℃にて２時間処理を行なうこ
とによりジアゾ結合を還元し、アミノ基とした。 得られた水不溶性担体１ｇは、アミノ基を0.16
ｍ−mole有していた。 （酵素の固定化） 実施例１と同様の方法にて、前記で得られた水
不溶性担体にラクターゼを固定化した。 得られた固定化ラクターゼ剤の酵素活性を測定
したところ、1123μ−mole／Hr／ｇ（乾重量）
の活性を示した。 実施例 ７ β−スルフアートエチルスルホニル−ｐ−アミ
ノベンゼンの代わりに、βスルフアートエチルス
ルホニルｐ−アセトアミノベンゼンを用いる以外
は、実施例１と同様の処理を行ない、更に28％水
酸化ナトリウム水溶液10部と水90部を加え、80〜
85℃にて６時間加水分解処理を行なつた。 得られた水不溶性担体１ｇは、アミノ基を0.06
ｍ−mole有していた。 （酵素の固定化） 実施例１と同様の方法にて、前記で得られた水
不溶性担体にラクターゼを固定化した。 得られた固定化ラクターゼ剤の酵素活性を測定
したところ、2176μ−mole／Hr／ｇ（乾重量）
の活性を示した。 参考例 １ 実施例１にて作成した固定化ラクターゼ剤を、
冷蔵庫中に湿潤状態で保存し、10日後の酵素活性
を測定したところ、119μ−mole／min／ｇ（乾
重量）の活性を示した。 参考例 ２ 実施例１にて作成した固定化ラクターゼ剤を用
いて、２日毎に酵素反応を５回繰り返し使用し
た。 結果を表−１に示す。 ５回の再使用において、本固定化ラクターゼ剤
は、ほとんど酵素活性の低下を示していなかつ
た。 【表】
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 水酸基および／またはアミノ基を有する高分
子物質と一般式 H2N−Ｗ−SO2−Ｘ 〔式中、Ｗは脂肪族炭化水素基、脂環式炭化水素
基、または−（CH2）n−Ｙ−（CH2）o−（式中ｍ，
ｎはそれぞれ０，１，２，３，４，５をあらわ
し、Ｙはアリール基をあらわす。）をＸはビニル
基、−CH2CH2−Ａ−Ｒ（Ａは酸素原子またはイオ
ウ原子を、Ｒは多塩基性酸の残基を表わす。）ま
たはハロゲノエチル基をあらわす。〕 で示される化合物またはそのアミノ基が保護され
た化合物とをアルカリの存在下反応させて得られ
る担体を用いることを特徴とする酵素の固定化方
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11499482A JPS596887A (ja) | 1982-07-01 | 1982-07-01 | 酵素の固定化方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11499482A JPS596887A (ja) | 1982-07-01 | 1982-07-01 | 酵素の固定化方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS596887A JPS596887A (ja) | 1984-01-13 |
| JPH0346106B2 true JPH0346106B2 (ja) | 1991-07-15 |
Family
ID=14651678
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP11499482A Granted JPS596887A (ja) | 1982-07-01 | 1982-07-01 | 酵素の固定化方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS596887A (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60237993A (ja) * | 1984-05-10 | 1985-11-26 | Toyobo Co Ltd | 水酸基含有繊維への酵素固定化法 |
-
1982
- 1982-07-01 JP JP11499482A patent/JPS596887A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS596887A (ja) | 1984-01-13 |
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