JPH0357751B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、安定な酵素組成物に関するものであ
る。さらに詳しくは、ペルオキシダーゼ単独およ
び／あるいはペルオキシダーゼと免疫活性物質と
結合した複合物のペルオキシダーゼ酵素の安定化
に関するものである。 ペルオキシダーゼは、近年種々の目的で使用さ
れるようになつてきており、特に臨床検査部門で
の診断試薬として用いられ、酵素免疫測定法の進
歩により、この測定法のラベル酵素としてのペル
オキシダーゼの重要性は増加してきている。しか
しながら、ペルオキシダーゼは、他の成分（例え
ば免疫活性物質）と結合していても、又、単独遊
離状態でも低濃度の水溶液状態においてきわめて
不安定であり、測定に必要な酵素活性を維持する
ことは非常に困難である。そこで一般には、ペル
オキシダーゼ活性を長期間保持するためには、特
公昭58−5668号公報に示されているような８−ア
ニリノ−１−ナフタレンスルホン酸を添加する
か、凍結乾燥といつた手段を用いて安定化が行な
われているが、この凍結乾燥の場合でも乾燥時に
ペルオキシダーゼの酵素活性が相当低下すること
も明らかにされている。これらの理由よりペルオ
キシダーゼを使用する際、かなり限定された使用
法にならざるをえない。 本発明者等は上記欠点を有しないペルオキシダ
ーゼの安定化法を開発すべく研究した結果、ペル
オキシダーゼに血清蛋白質およびポリアルキレン
グリコールを配合することを見出し、既に提案し
た（特願昭57−136126号）。ところが上記組成物
ではペルオキシダーゼが長期間安定ではあるが、
長期保存中に沈殿が形成される。本発明者等は長
期保存中に沈殿が形成されない安定化剤について
種々鉛意検討した結果、本発明に到達した。即
ち、本発明はペルオキシダーゼ、ハロゲン化炭化
水素で、脂質成分を抽出除去した血清蛋白質およ
びポリアルキレングリコールを含む安定な酵素組
成物である。 本発明の安定化剤は特に溶液中のペルオキシダ
ーゼを著しく安定化させ、長期間保存中に沈殿の
形成がほとんど見られない。 本発明に用いるポリアルキレングリコールとし
ては、ポリエチレングリコール、ポリプロピレン
グリコール、エチレンオキサイド・プロピレンオ
キサイド・コポリマー、ポリテトラメチレングリ
コールなどが挙げられる。本発明において用いる
ポリアルキレングリコールの分子量は約1000〜
20000、好ましくは約4000〜6000のものである。
添加量としては水性組成物に対して約１〜10重量
対容量（Ｗ／Ｖ）％、好ましくは３〜６％重量対
容量（Ｗ／Ｖ）％である。10重量対容量（Ｗ／
Ｖ）％を越える添加は血清蛋白質の沈殿をひきお
こし、好ましいものではない。 又、血清蛋白質として、牛アルブミン、ヒトア
ルブミン、牛血清、ヒト血清、ウマ血清、家兎血
清等多種挙げられる。 本発明に用いるハロゲン化炭化水素としては炭
素原子数２〜５の炭化水素であつて、水素原子の
50％以上がハロゲン原子で置換されているものが
好ましい。ハロゲン原子としては、塩素、臭素、
沃素が挙げられる。好ましいハロゲン化炭化水素
としては、１，１，２−トリクロロ−１，２，２
−トリフルオロエタン、パークレン、トリクレン
等が例示される。 上記血清蛋白質は粉末状では１から10重量／容
量％の水溶液とし、血清蛋白質１容に対し、ハロ
ゲン化炭化水素、例えば１，１，２−トリクロル
１，２，２−トリフルオロエタン１，５〜５容の
割で混合し、よく撹拌し、血清蛋白質中の脂質成
分を抽出する。3000r.p.m.10分間遠心分離し、上
清部分の血清蛋白質を用い、添加量は水性組成物
に対し１〜50容量％であることが好ましい。 ポリエチレングリコールは、ラジオアイソトー
プを用いた免疫測定法、即ちラジオイムノアツセ
イ法で免疫複合体の沈殿剤として使用されている
が酵素の安定化、特にペルオキシダーゼの安定化
に使用された例はない。 本発明の組成物におけるペルオキシダーゼの安
定化作用は、ハロゲン化炭化水素で処理された血
清蛋白質とポリアルキレングリコールがペルオキ
シダーゼに作用し、その特殊構造を保持している
ものと考えられる。 ペルオキシダーゼは、遊離状態でも、免疫活性
物質と結合した結合状態のものであつてもよい。
また遊離状態のものと結合状態のものとの混合物
であつてもよい。 免疫活性物質としては、ハプテン、多価抗原、
抗体等があげられる。ハプテンとしては、チロキ
シン、ヒスタミン、ジゴキシン、アドレナリン、
プロスタグランジン、ステロイドホルモン、例え
ばプロゲステロン、エストラジオール、テストス
テロン、エストリオールなど、及び抗生物質、例
えばペニシリンなどが用いられる。多価抗原とし
てはホルモン、例えば、成長ホルモンなどタンパ
ク質、例えばアルブミン、グロブリン、α−フエ
トプロテインなど及び種々の細菌、ウイルス、例
えば連鎖球菌、肝炎ウイルス、風疹ウイルスなど
が用いられる。抗体としては、従来既知の方法
で、ヤギ、ウサギなどの哺乳動物に上記ハプテン
又は抗原を免疫することによつて得られた抗体
（例えば、抗インスリン抗体、抗α−フエトプロ
テインなど）が用いられる。又、ハイブリドーマ
法によつて作成された抗体も同様に使用できる。 また、免疫活性物質とペルオキシダーゼ結合物
の結合形態としては、共有結合があげられ、種々
の公知の方法、例えばグルタルアルデヒドを架橋
剤として免疫活性物質のアミノ基とペルオキシダ
ーゼのアミノ基を共有結合する方法
（Avrameas，Ｓ，；Imminochemistyry，６：43
−52，〔1969〕）及びペルオキシダーゼに含まれる
糖鎖を過ヨー素酸で酸化切断し、アルデヒド基を
導入後免疫活性物質のアミノ基とシツフ塩基を作
製し結合させる方法（Nakane，P.K，＆
Kawaoi，A.；J.Histochem.cytochem，22：
1084−1091，〔1974〕）などを用いて共有結合を作
ることができる。 遊離のペルオキシダーゼあるいは共有結合して
いるペルオキシダーゼの酵素活性は、過酸化水素
を適当な発色剤、例えばｏ−アミノフエノール、
４−アミノアンチピリン、フエノール、ｏ−フエ
ニレンジアミンなどを用い、比色法によりその酵
素活性を定量することが可能である。 又、本発明の組成物は、緩衝作用を有する任意
成分を添加しても良いし、生理食塩水濃度の塩化
ナトリウムを添加しても良い。緩衝剤としては、
リン酸緩衝液、トリス緩衝液などが用いられ、水
性溶液のpHが６〜８を示すものが好ましい。水
性組成物を調製する場合、各物質の添加順序はと
くに限定されない。 本発明による安定化されたペルオキシダーゼ組
成物を用いた有利な検査薬としては、免疫診断用
試薬、特に酵素免疫測定法があげられる。又、酵
素免疫測定法以外の診断薬として、例えばグルコ
ースを定量するためのグルコースオキシダーゼ法
の試薬としても使用可能である。 以下に実施例例を挙げて本発明を説明するが、
本発明はこれら実施例に限定されるものではな
い。 実施例 １ １，１，２−トリクロロ−１，２，２−トリフ
ロロエタン1.5容に対し、家兎血清１容の割で混
合、撹拌し、3000r.p.mにて遠心分離した上清部
分の家兎血清10容量％と西洋ワサビペルオキシダ
ーゼ（東洋紡績株式会社製、グレード１−Ｃ）と
ポリエチレングリコール＃4000（半井化学社製）
５重量対容量（Ｗ／Ｖ）％を含む0.01Mリン酸緩
衝液（以下0.01MPBと略す）に溶解した。 対照例１として上記家兎血清を含むがポリエチ
レングリコール＃4000を含まないもの、又対称例
２としてポリエチレングリコール＃4000を含むが
何も処理しない家兎血清を含むものを用意し、以
下の酵素安定性試験に供した。又、西洋ワサビペ
ルオキシダーゼの濃度は、各々、1.0μg／であ
つた。各溶液は、0.22μmの滅菌過器で過し、
５mlの殺菌したビンにとり、４℃と40℃で貯蔵し
た。０，７，14，21，28日目の酵素安定性を調べ
た。安定性は、40℃貯蔵の酵素活性の４℃貯蔵で
示す活性に対するパーセントで示した。又、組成
液の安定性は４℃で２ケ月、４ケ月、６ケ月、９
ケ月、12ケ月と保存し、沈殿の形成を目視判定し
た。 尚、酵素活性は過酸化水素0.02％およびｏ−フ
エニレンジアミン二塩酸塩（以下OPDと略す）
を３mg／ml含むpH5.0のシトレート・ホスフエー
ト0.1M緩衝液0.5mlに上記各溶液を50μ加え、
室温、30分放置後、Ｎ硫酸2.0mlを加え、492nm
にて吸光度を測定した。 その結果を第１表、第２表に示す。

【表】

【表】

【表】 判定 −：沈殿の形成無し。
±：沈殿の形成わずかに認められる。
＋： 〃 有る。
実施例 ２ ポリエチレングリコール＃1000（半井化学社製）
について実施例１記載の方法で、安定性を調べ
た。ポリエチレングリコール＃1000の濃度は、８
重量対容量（Ｗ／Ｖ）％とした。その結果を第３
表、第４表に示す。なお対照例１、２は実施例１
における対照例１、２と同様に配合した。

【表】

【表】 判定 −：沈殿の形成無し。
±：沈殿の形成わずかに認められる。
＋： 〃 有る。
実施例 ３ 過ヨウ素酸塩酸化法（NaKane，P.K.＆
Kawaoi，A.：J.Histochem.Cytochem.22，1840
−1091，〔1974〕）により家兎イムノグロブリンＧ
（以下家兎IgGと略す）と結合させた西洋ワサビ
ペルオキシダーゼをセフアデツクスＧ−200によ
るゲル過で遊離のペルオキシダーゼを除去した
結合ペルオキシダーゼとゲル過をかけず、遊離
のペルオキシダーゼと結合したペルオキシダーゼ
とが共存する場合の各々について安定性ならびに
沈殿形成を調べた。すなわち、ポリエチレングリ
コール＃6000（半井化学社製）４重量対容量
（Ｗ／Ｖ）％及び実施例１と同様に処理した家兎
血清10容量％を含む0.05Mリン酸緩衝食塩水（以
下0.05MPBSと略す）に加えた場合と、対照例１
として、上記組成からポリエチレングリコール
＃6000だけを除いたもの、対照例２として上記組
成の家兎血清に代えて未処理の家兎血清を用いた
ものについて、実施例１に記載の操作法で、溶液
中のペルオキシダーゼの安定性と沈殿形成の有無
を調べた。その結果を第５表、第６表に示す。

【表】

【表】

【表】 実施例 ４ 家兎血清と10重量対容量（Ｗ／Ｖ）％の牛血清
アルブミン（フラクシヨンＶ）をそれぞれ、１，
１，２−トリクロル−１，２，２−トリフロロエ
タンを用いて、血清蛋白液１容に対し、１，１，
２−トリクロル−１，２，２−トリフロロエタン
1.5容の割で、混合撹拌し、3000r.p.m.で遠心分離
し、上清の血清蛋白液を回収した。このように回
収した血清蛋白液を用いて、以下のペルオキシダ
ーゼ液を調製した。 実施例３で用いた家兎IgGに結合している西洋
ワサビペルペルオキシダーゼとポリプロピレング
リコール、ジオールタイプ平均分子量2000（和光
純薬工業社製）５重量対容量（Ｗ／Ｖ）％、およ
び１，１，２トリクロロ−１，２，２トリフロロ
エタンで処理した家兎血清２容量％と、牛血清ア
ルブミン１重量対容量（Ｗ／Ｖ）％を含む
0.05MPBSに溶解した。 対照例１として上記家兎血清を含むがポリプロ
ピレングリコールを含まないもの、対照例２とし
て、処理した血清蛋白質液のかわりに未処理の家
兎血清、牛血清アルブミンを用いた場合のペルオ
キシダーゼの安定性と、４℃での沈殿形成の有無
を実施例１の方法で調べた結果を第７表、第８表
に示す。

【表】

【表】 実施例 ５ テトラクロロエチレン２容あるいは、トリクロ
ロエチレン２容に対し、家兎血清１の割で混合、
撹拌し、3000r.p.mにて遠心分離した上清部分の
家兎血清10容量％と西洋ワサビペルオキシダーゼ
（東洋紡績株式会社製、グレード１−Ｃ）と、ポ
リエチレングリコール＃4000（半井化学社製）５
重量対容量（Ｗ／Ｖ）％を含む0.01Mリン酸緩衝
生理食塩水（以下0.01MPBSと略す。）に溶解し
た。対照例１としてポリエチレングリコール
＃4000を含まないもの、又、対照例２として、処
理していない家兎血清を含むもの、対照例３とし
て、ポリエチレングリコール＃4000処理家兎血清
を含まないものを用意し、実施例１と同様な酵素
安定化試験に供した。 結果を第９表、第10表に示す。

【表】

【表】 判定：− 沈殿の形成なし
± 沈殿の形成わずかに認められる
＋ 沈殿の形成が認められる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ペルオキシダーゼ、ハロゲン化炭化水素で抽
   出処理した血清蛋白質およびポリアルキレングリ
   コールを含む安定な酵素組成物。 ２ ペルオキシダーゼが遊離状態のペルオキシダ
   ーゼおよび／あるいは結合状態のペルオキシダー
   ゼであることを特徴とする特許請求の範囲第１項
   記載の安定な酵素組成物。 ３ 結合状態のペルオキシダーゼがペルオキシダ
   ーゼと免疫活性物質との結合体であることを特徴
   とする特許請求の範囲第２項記載の安定な酵素組
   成物。