JPS647759B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

（産業上の利用分野） 本発明は安定なペルオキシダーゼ組成物に関す
るものであり、特に酵素免疫測定法に使用する標
識酵素、ペルオキシダーゼの製造および貯蔵に関
するものである。 （従来の技術） 遊離のペルオキシダーゼあるいは他の成分（例
えば、免疫活性物質）と結合しているペルオキシ
ダーゼを長時間安定化させるためには、凍結乾燥
といつた手段を用いて安定化が行なわれるが、特
公昭58−5668号公報記載のように８−アニリノ−
１−ナフタレンスルホン酸の有効量を添加する
か、特開昭58−23786号公報記載のように４−ア
ミノ−アンチピリンの有効量を添加する安定化法
が記載されている。 （発明が解決しようとする問題点） しかし、８−アニリノ−１−ナフタレンスルホ
ン酸や４−アミノアンチピリンといつた物質を用
いないと遊離のペルオキシダーゼあるいは他の成
分（例えば免疫活性物質）と結合しているペルオ
キシダーゼを長時間安定化させることは困難で特
に低濃度の水溶液状態においてきわめて不安定で
あり、測定に必要な酵素活性を維持することは酵
素免疫測定法において重要な意義を有する。 本発明者等は上記８−アニリノ−１−ナフタレ
ンスルホン酸や４−アミノアンチピリンによらな
いペルオキシダーゼの安定化法を開発すべく鋭意
研究した結果本発明に到達した。 （問題点を解決するための手段） 本発明は、ペルオキシダーゼ、血清あるいは血
清蛋白質を含む媒質およびハロゲン化アルキルフ
エノールを含み、過酸化水素を含まないことを特
徴とする安定なペルオキシダーゼ組成物である。 本発明に用いるハロゲン化アルキルフエノール
の分子式は、次に示すような構造を有している。 （式中、Ｘはハロゲン原子、Ｒは炭素原子数１〜
10のアルキル基、ｍ＝１〜４、ｎ＝１〜４を示
す。） ハロゲン化アルキルフエノールとしては、例え
ば４−クロロ−ｍ−クレゾール、４−クロロ−ｏ
−クレゾール、、４−ブロム−ｍ−クレゾール、
２−エチル−４−クロロフエノールなどが挙げら
れる。 ハロゲン化アルキルフエノールの添加量として
は全組成物に対して約0.01〜５重量対容量（Ｗ／
Ｖ）％、好ましくは0.02〜３重量対容量（Ｗ／
Ｖ）％である。又、溶解度を越える量を添加して
も水性媒質中に沈殿として発生してくるので使用
できない。 血清としては、家兎血清、人血清、馬血清、牛
胎児血清、牛血清等多種挙げられ、又血清蛋白質
として牛血清アルブミン、家兎血清アルブミン等
これも多数挙げられる。血清又は血清蛋白質の添
加量は、血清として全組成物に対して５〜50容量
％で血清蛋白質の乾燥微粉末なら全組成物に対し
て0.1〜10重量対容量（Ｗ／Ｖ）％を用いること
が好ましい。血清あるいは血清蛋白質を含む媒質
としては、水又は緩衝液などが挙げられる。 本発明の組成物におけるハロゲン化アルキルフ
エノールのペルオキシダーゼへの安定化作用は不
明であるが、血清蛋白質とハロゲン化アルキルフ
エノールがペルオキシダーゼに作用し、その特殊
構造を保持しているものと考えられる。ペルオキ
シダーゼは遊離状態でも免疫活性物質を結合した
状態のものであつてもよい。又遊離状態のものと
結合状態のものとの混合物であつてもよい。 免疫活性物質としては、ハプテン、多価抗原、
抗体等が挙げられる。ハプテンとしては、チロキ
シン、ヒスタミン、ジゴキシン、アドレナリン、
プロスタグランジン、ステロイドホルモン、例え
ばプロゲステロン、エストラジオール、テストス
テロン、エストリオールなど、及び抗生物質、例
えばペニシリンなどが用いられる。多価抗原とし
てはホルモン、例えば成長ホルモンなどタンパク
質、例えばアルブミン、グロブリン、α−フエト
プロテインなど及び種々の細菌、ウイルス、例え
ば連鎖球菌、肝炎ウイルス、風疹ウイルスなどが
用いられる。抗体としては、従来既知の方法で、
ヤギ、ウサギなどの哺乳動物に上記ハプテン又は
抗原を免疫することによつて得られた抗体（例え
ば、抗インスリン抗体、抗α−フエトプロテイン
抗体など）が用いられる。又、ハイブリドーマ法
によつて作成された抗体も同様に使用できる。 また、免疫活性物質とペルオキシダーゼ結合物
の結合形態としては、共有結合があげられ、種々
の公知の方法、例えばグルタルアルデヒドを架橋
剤として免疫活性物質のアミノ基とペルオキシダ
ーゼのアミノ基を共有結合する方法
（Avrameas、S.；Immunochemistry、６：43−
52、〔1969〕）及びペルオキシダーゼに含まれる糖
鎖を過沃素酸で酸化切断し、アルデヒド基を導入
後免疫活性物質のアミノ基とシツフ塩基を作製し
結合させる方法（Nakane、P.K.、＆ Kawaoi、
A.；J.Histochem.Cytochem、22：1084−1091、
〔1974〕などを用いて共有結合を作ることができ
る。 遊離のペルオキシダーゼあるいは免疫活性物質
を共有結合しているペルオキシダーゼの酵素活性
は、過酸化水素と適当な発色剤、例えばｏ−アミ
ノフエノール、４−アミノアンチピリンとフエノ
ール、ｏ−フエニレンジアミンなどを用い比色法
によりその酵素活性を定量することが可能であ
る。 また本発明の組成物は、緩衝作用を有する任意
成分を添加しても良いし、生理食塩水濃度の塩化
ナトリウムを添加しても良い。緩衝剤としてはリ
ン酸緩衝液、トリス緩衝液などが用いられ、水性
溶液のPHが６〜８を示すものが好ましい。水性組
成物を調製する場合、各物質の添加順序はとくに
限定されない。 またペニシリンＧ、アンピシリン、クロラムフ
エニコール、テトラサイクリン、アンホテリシン
Ｂなどの抗生物質を添加して用いることも可能で
ある。 本発明による安定化されたペルオキシダーゼ組
成物を用いた有利な検査薬としては、免疫診断用
試薬、特に酵素免疫測定法があげられる。又、酵
素免疫測定法以外の診断薬として、例えばグルコ
ースを定量するためのグルコースオキシダーゼ法
の試薬としても使用可能である。 （実施例） 以下に実施例を挙げて本発明を説明するが、本
発明はこれら実施例に限定されるものではない。 実施例 １ 西洋ワサビペルオキシダーゼ（東洋紡績株式会
社製、グレード１−Ｃ）を家兎血清10容量％と４
−クロロメタクレゾール0.02重量対容量（Ｗ／
Ｖ）％を含む0.01Mリン酸緩衝生理食塩水（以下
0.01M PBSと略する）PH6.0に溶解した。対照と
して４−クロロメタクレゾールを含まないものお
よび家兎血清を含まないものを用意し、以下の酵
素安定性試験に供した。又、西洋ワサビペルオキ
シダーゼの濃度は各々1.0μｇ／であつた。各溶
液は0.22μｍの滅菌過器で過し、５mlの殺菌
ビンにとり、４℃と40℃で貯蔵した。０、７日、
14日の酵素安定性を調べた。安定性は40℃貯蔵の
酵素活性の４℃貯蔵で示す活性に対するパーセン
トで示した。 酵素活性測定は過酸化水素0.02重量対容量
（Ｗ／Ｖ）％およびｏ−フエニレンジアミン二塩
酸塩（以下OPDと略す。）を３mg／ml含むPH5.0の
シトレート・ホスフエート0.1M緩衝液0.5mlに上
記溶液を50μ加え、室温30分反応させ1N硫酸
2.0mlを加え反応を停止させた後、492nｍの吸光
度を測定することにより求めた。 その結果を第１表に示す。

【表】 実施例 ２ 実施例１における４−クロロメタクレゾールを
第２表に示されるハロゲン化アルキルフエノール
に代替する以外は実施例１と同様にして西洋ワサ
ビペルオキシダーゼの安定化効果をみた。その結
果を第２表に示す。

【表】

【表】 実施例 ３ 過ヨウ素酸塩酸化法〔Nakane、P.K.、＆
Kawaoi.A.；J.Histochem.Cytochem.22、1084−
1091、（1974）〕により家兎イムノグロブリンＧ
（以下家兎IgGと略す）と結合させて西洋ワサビ
ペルオキシダーゼをセフアデツクスＧ−200によ
るゲル過で遊離のペルオキシダーゼを除去した
結合ペルオキシダーゼとゲル過をかけず遊離の
ペルオキシダーゼと結合したペルオキシダーゼと
が共存する場合の各々について、４−クロロ−ｍ
−クレゾール、0.025重量対容量（Ｗ／Ｖ）％及
び家兎血清１容量％、牛血清アルブミン１重量対
容量（Ｗ／Ｖ）％クロラムフエニコール0.1重量
対容量（Ｗ／Ｖ）％を含む0.02Mリン酸緩衝生理
食塩水に加えた場合と対照例として、４−クロロ
−ｍ−クレゾールだけを除いたものについて実施
例１に記載の操作法で溶液中のペルオキシダーゼ
の安定性を調べた。その結果を第２表に示す。

【表】 （発明の効果） 本発明により、ペルオキシダーゼを低濃度で長
期にわたり安定化することができる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ペルオキシダーゼ、血清あるいは血清蛋白質
   を含む媒質およびハロゲン化アルキルフエノール
   を含み、過酸化水素を含まないことを特徴とする
   安定なペルオキシダーゼ組成物。 ２ ペルオキシダーゼが遊離状態のペルオキシダ
   ーゼおよび／あるいは免疫活性物質を共有結合し
   た状態のペルオキシダーゼであることを特徴とす
   る特許請求の範囲第１項記載の安定なペルオキシ
   ダーゼ組成物。