JPH0367078B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は式（） で示されるアンドロスタ−１，４，11（12）−トリ
エン−３，17−ジオンに関する。 本発明により提供されるアンドロスター１，
４，11（12）−トリエン−３，17−ジオンは公知文
献に未記載の新規化合物であり、後程詳述するよ
うに種々の性ホルモン、副腎皮質ホルモンなどの
ステロイド系医薬品の合成中間体として有用であ
る。 アンドロスタ−１，４，11（12）−トリエン−
３，17−ジオンは次に示す方法により12−ヒドロ
キシアンドロスター１，４−ジエン−３，17−ジ
オンから誘導される。 （式中、Ｒはアルキル基を表わし、波線〜はヒド
ロキシル基又はRSO₂O基がα−立体配置又はβ
−立体配置のいずれかにあることを示す。） すなわち、12−ヒドロキシアンドロスタ−１，
４−ジエン−３，17−ジオンをスルホネート化反
応に付することにより一搬式（）で示されるス
ルホネートが得られる。例えば、このスルホネー
ト化反応は、12−ヒドロキシアンドロスタ−１，
４−ジエン−３，17−ジオンをピリジン、ピコリ
ン又はこれらとベンゼン、トルエンなどとの混合
溶媒に溶解し、この溶液に一般式（） RSO₂Cl …（） （式中、Ｒはアルキル基を表わす。）で示される
スルホン酸クロリドを該12−ヒドロキシアンドロ
スタ−１，４−ジエン−３，17−ジオンに対し等
モル〜２倍モル量加え、室温ないしは必要に応じ
て約80℃までの加温下に行なわれる。反応後、反
応混合物を希塩酸水などにあけ、塩化メチレンな
どで抽出し、抽出液を希塩酸水、重曹水、水など
で洗滌し、乾燥したのち、これにより低沸点物を
留去することにより一般式（）で示されるスル
ホネートの粗生成物が得られる。この粗生成物を
例えば酢酸エチルなどから再結晶することにより
高純度の一般式（）で示されるスルホネートを
得ることができる。 次に、前記一般式（）で示されるスルホネー
トを脱スルホン酸反応に付することにより、目的
とするアンドロスタ−１，４，11（12）−トリエン
−３，17−ジオンが得られる。この脱スルホン酸
反応は通常、酢酸カリウム、塩化リチウム、コリ
ジン、カリウムtert.−ブトキシドなどの反応助剤
（スルホン酸を捕捉することができる化合物）の
存在下で行なわれる。反応助剤の使用量は一般式
（）で示されるスルホネートに対して等モル〜
20倍モル量である。この反応はヘキサメチルホス
ホルトリアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
などの溶媒中で行なうのが好ましく、通常約80〜
160℃の温度下に加熱して行なわれる。反応後、
反応混合物を水、希塩酸水などにあけ、塩化メチ
レンなどで抽出し、抽出液を希塩酸水、重曹水、
水などで洗滌し、乾燥したのち、これより低沸点
物を留去することによりアンドロスタ−１，４，
11（12）−トリエン−３，17−ジオンの粗生成物が
得られる。この粗生成物を例えば酢酸エチルなど
から再結晶することにより高純度のアンドロスタ
−１，４，11（12）−トリエン−３，17−ジオンを
得ることができる。 原料化合物である12−ヒドロキシアンドロスタ
−１，４−ジエン−３，17−ジオン（以下、これ
を12−ヒドロキシADDと称す）は公知化合物で
あるが、本発明者らのうちの数人が先に見出した
方法によれば、デオキシコール酸及び／又はその
塩を基質として12−ヒドロキシADDを生産する
シユードモナス・プチダ又はシユードモナス・オ
バリスに属する細菌を、デオキシコール酸及び／
又はその塩を含む培地に培養することにより得る
ことができる。 上記のシユードモナス・プチダに属する細菌と
しては、シユードモナス・プチダD4014−A1099
（Pseudomonas putidaD4014−A1099）菌株（微
工研条寄第207号）がある。この菌株は土壌中よ
り採取したシユードモナス・プチダD4014
（Pseudomonas putida D4014）菌株（微工研条
寄第205号）に突然変異処理を施して得られた変
異株である。またシユードモナス・オバリスに属
する細菌としては、シユードモナス・オバリスＤ
−40（Psedomonas ovalis Ｄ−40）菌株（微工研
菌寄第6147号）がある。 シユードモナス・プチダD4014菌株、シユード
モナス・プチダD4014−A1099菌株及びシユード
モナス・オバリスＤ−40菌株の菌学的性質を列挙
すると第１表及び第２表のとおりである。

【表】

【表】

【表】

【表】

【表】 上記の表に示した菌学的性質に基づき、シユー
ドモナス・プチダD4014菌株、チユードモナス・
プチダD4014−A1099菌株及びシユードモナス・
オバリスＤ−40菌株の同定を行なつた。シユード
モナス・プチダD4014菌株は、桿菌であること、
極鞭毛を有していること、グラム染色が陰性であ
ることなどの顕微鏡的所見並びにオキシダーゼ反
応及びカタラーゼ反応がともに陽性であること、
好気性であること、Ｏ−Ｆテストの結果が酸化的
（Oxidative）であることなどの生理学的性質か
らバージエイズ・マニユアル・オブ・デイターミ
ネイテイブ・バクテリオロジー第７版及び第８版
に基づき、シユードモナス属に属する細菌である
と同定した。さらにシユードモナス・プチダ
D4014菌株は、培養液が螢光色を帯びる点、ゼラ
チンを液化しない点、37℃で生育する点、アルギ
ニン・ジヒドロラーゼを生成する点などからシユ
ードモナス属のプチダ種に属する細菌であると同
定した。一般に突然変異株はその親株と同じ種に
属するものと考えられており、シユードモナス・
プチダD4014−A1099菌株はシユードモナス属の
プチダ種に属する細菌であると判定した。また、
シユードモナス・オバリスＤ−40菌株は、桿菌で
あること、桿鞭毛を有していること、グラム染色
が陰性であることなどの顕微鏡的所見及び好気性
であること、Ｏ−Ｆテストの結果がマイナスであ
ることなどの生理学的性質からバージエイズ・マ
ニユアル・オブ・デイターミネイテイブ・バクテ
リオロジー第７版及び第８版に基づき、シユード
モナス属に属する細菌であると同定した。さらに
シユードモナス・オバリスＤ−40菌株は、両端に
丸みを持つた短桿菌である点、寒天平板上で形成
するコロニーが円形で光沢を有する点、インドー
ルを生成しない点並びに糖類から酸及びガスの生
成が認められない点から、シユードモナス属のオ
バリス種に属する細菌であると同定した。 上記の微生物を利用した12−ヒドロキシADD
の製造方法では、デオキシコール酸及び／又はそ
の塩を基質として用いる。デオキシコール酸の塩
としては具体的にはデオキシコール酸のナトリウ
ム、カリウムなどのアルカリ金属の塩又はカルシ
ウム、マグネシウムなどのアルカリ土類金属の塩
である。デオキシコール酸及び／又はその塩の濃
度は通常約１〜200ｇ／の範囲でよいが、生産
される12−ヒドロキシADDの収量、培養条件及
び操作性などの経済的観点から約２〜50ｇ／の
範囲が好ましい。培養方法は原則的には一般微生
物の好気培養で採用される方法と同じであるが、
通常は液体培地による振盪培養法又は通気撹拌培
養法が用いられる。培地は上記のデオキシコール
酸及び／又はその塩を基質として12−ヒドロキシ
ADDを生産するシユードモナス・プチダ又はシ
ユードモナス・オバリスに属する細菌が資化利用
できる栄養源を含有するものであればよい。炭素
源としてはデオキシコール酸及び／又はその塩を
単一炭素源としてもよいが好ましくはデオキシコ
ール酸及び／又はその塩にグルコース、グリセリ
ン、ペプトン、肉エキス、麦芽エキス、酵母エキ
スなどを併用するのがよい。また窒素源として
は、例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウ
ム、燐酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、硝酸
ナトリウム、硝酸カリウムなどの無機窒素源、又
はポリペプトン、ペプトン、肉エキスなどの有機
窒素源が用いられる。また、この他の燐酸水素２
カリウム、燐酸２水素カリウム、硫酸マグネシウ
ムなどの無機塩類が添加される。培養条件に特徴
はないが、通常25〜35℃で10時間〜７日間振盪培
養又は通気撹拌培養を行なう。 このようにして培養液中に蓄積された12−ヒド
ロキシADDを分離、採取するには、培養液を所
望によりアルカリ性にしたのち、12−ヒドロキシ
ADDを溶解しかつ水と相分離する有機溶媒、例
えば酢酸エチル、クロロホルム、クロロホルムと
メタノールの混合液などを用いて抽出する方法が
採られる。この有機溶媒による抽出は、菌体を含
んだ状態の培養液について行なつてもよいし、予
め培養液中の菌体その他の不溶成分を濾過又は遠
心分離などにより分離除去し、得られた培養瀘液
又は上清について行なつてもよい。後者の抽出方
法を採る場合には、必要に応じて濾過又は遠心分
離などによつて分離除去される不溶成分について
上記の有機溶媒による抽出操作を行なうことによ
り、培養液中に析出又は沈澱している12−ヒドロ
キシADDを回収することができる。このように
して得られた抽出液を集め、これより溶媒を溜去
することによつて12−ヒドロキシADDをはじめ
とするデオキシコール酸の酸化物及び未変換デオ
キシコール酸をほぼ全量回収することができる。
得られた抽出物を例えば酢酸エチル、ジクロルメ
タン／メタノールなどから再結晶するか、又はシ
リカゲルカラムに吸着させ、クロロホルムとエタ
ノールの混合液で溶出させることにより12−ヒド
ロキシADDを取得することができる。 本発明により提供されるアンドロスタ−１，
４，11（12）−トリエン−３，17−ジオンは、（）
これを部分水素添加反応に付することにより、
種々の性ホルモンの重要な合成中間体となるアン
ドロスタ−４−エン−３，17−ジオンに誘導する
ことができ、また（）アンドロスタ−１，４，
11（12）−トリエン−３，17−ジオンの17位のケト
ン部分をエチニル化することにより、プロゲステ
ロン又はプレドニゾロン、ハイドロコーチゾンに
代表されるコルチコイドの合成中間体となる公知
化合物の17α−エチニル−17β−ヒドロキシアン
ドロスタ−１，４，11（12）−トリエン−３−オン
に誘導することができ、同様に（）アンドロス
タ−１，４，11（12）−トリエン−３，17−ジオン
の17位のケトン部分をシアンヒドリン化すること
により、プロゲステロン又はプレドニゾロン、ハ
イドロコーチゾンなどのコルチコイドの重要な合
成中間体となる17−シアノ−17−ヒドロキシアン
ドロスタ−１，４，11（12）−トリエン−３−オン
にも誘導することができる。 以下に、本発明を実施例及び参考例により具体
的に説明する。 参考例 １ シユードモナス・プチダD4014−A1099菌株の
取得方法 培地１（組成：デオキシコール酸0.5％、水酸化
ナトリウム0.05％、ペプトン0.5％、酵母エキス
0.5％、塩化ナトリウム0.5％及び寒天1.5％）のス
ラントに生育させたシユードモナス・プチダ
D4014菌株の一白金耳を、予め試験管内に準備し
た培地２（組成：デオキシコール酸２％、水酸化
ナトリウム0.2％、硝酸アンモニウム0.2％、燐酸
２水素カリウム0.1％、燐酸水素２カリウム0.6
％、硫酸マグネシウム・７水和物0.02％及び酵母
エキス0.02％）の10mlに植菌し、30℃で14〜15時
間振盪培養した。この培養液の0.3mlを予め試験
管に準備した培地３（組成：デオキシコール酸0.5
％、水酸化ナトリウム0.05％、グルコース0.1％、
硝酸アンモニウム0.2％、燐酸２水素カリウム0.1
％、燐酸水素２カリウム0.6％、硫酸マグネシウ
ム・７水和物0.02％及び酵母エキス0.02％）の10
mlに加え、30℃で８〜９時間培養した。ついで、
この対数増殖期にある菌体を0.45μのメンブレン
フイルターで無菌的に濾過集菌し、0.1M燐酸塩
緩衝液（PH：7.0）20mlで洗滌後、同じ緩衝液25
mlに懸濁させた。これに終濃度が50μｇ／mlにな
るようにＮ−メチル−N′−ニトロ−Ｎ−ニトロ
ソグアニジンを添加し、３〜４分放置することに
より突然変異処理を行なつた。突然変異処理を施
した菌体を0.45μのメンブレンフイルターで濾過
集菌し、0.1M燐酸塩緩衝液（PH：7.0）20mlで洗
滌後、同じ緩衝液20mlに懸濁した。得られた菌懸
濁液を減菌生理食塩水で希釈し、それを培地４
（組成：デオキシコール酸0.5％、水酸化ナトリウ
ム0.05％、硝酸アンモニウム0.2％、燐酸２水素
カリウム0.1％、燐酸水素２カリウム0.6％、硫酸
マグネシウム・７水和物0.02％、酵母エキス0.02
％及び寒天1.5％）の寒天平板上に500〜1000個の
コロニーを出現させるように塗布したのち、30℃
で３〜４日間培養した。出現したコロニー中の極
小コロニーを培地１のスラントに単離したのち、
その一白金耳を予め試験管に準備した培地５（組
成：デオキシコール酸0.2％、水酸化ナトリウム
0.02、グルコース0.1％、硝酸アンモニウム0.2％、
燐酸２水素カリウム0.1％、燐酸水素２カリウム
0.6％、硫酸マグネシウム・７水和物0.02％及び
酵母エキス0.02％）の10mlに植菌し、30℃で24時
間振盪培養した。得られたそれぞれの培養液中の
生産物を薄層クロマトグラフイーにより検定し、
目的とする12α−ヒドロキシアンドロスタ−１，
４−ジエン−３，17−ジオン（以下、これを12α
−ヒドロキシADDと称す）を選択的に蓄積して
いる一菌株を見い出し、これをシユードモナス・
プチダD4014−A1099と命名した。 参考例 ２ シユードモナス・プチダD4014−A1099菌株
（微工研菌寄第6327号）を次に示す方法で培養し
た。デオキシコール酸0.5ｇ、グルコース0.1ｇ、
硝酸アンモニウム0.2ｇ、燐酸２水素カリウム0.1
ｇ燐酸水素２カリウム0.6ｇ、硫酸マグネシウ
ム・７水和物0.02ｇ、酵母エキス0.02ｇ及び水酸
化ナトリウム0.05ｇに水道水を加えて容量を100
ml（PH：8.4）に調整し、これを培地とした。こ
の培地を500ml溶坂口フラスコに入れ、120℃で15
分間、蒸気殺菌を行なつた。予め上記の培地と同
じ培地で試験管振盪機にて15時間増殖させた種菌
の10mlを上記の500ml溶坂口フラスコに添加し、
30℃で28時間振盪培養した。培養後、この培養液
を集め、遠心分離機で菌体を除去後、得られた培
養液上清に１規定の水酸化ナトリウム水溶液を加
えることにより、この培養液上清のPHを12附近に
調整した。ついで、培養液上清を酢酸エチル300
mlで抽出し、抽出液から酢酸エチルをロータリ
ー・エバポレーターで溜去することにより12α−
ヒドロキシADDを360mg得た。 得られた12α−ヒドロキシADDの一部を取り、
これにメタノールを加えて２％溶液とし、この溶
液25μをミクロボンダパツクＣ−18カラムを備
えた高速液体クロマトグラフイー（米国ウオータ
ーズ社製、HLC−GPC−244型）に注入した。移
動相としてPH4.0に調整した水／メタノールの
30／70容量比の混合液を流速１ml／分で流し、検
出を屈折率方式で行なつた。得られた液体クロマ
トグラフにおける各ピークの面積比が積分計（島
津製作所製、島津クロマトパツクＣ−R1A）で
求め、この面積比から上記の12α−ヒドロキシ
ADDの純度を求めたところ、99.5％であつた。 また、上記で得られた12α−ヒドロキシADDの
確認を下記の方法で行なつた。 マススペクトルｍ／ｚ： 300〔Ｍ〕⁺ 282〔Ｍ−H₂O〕⁺ またｍ／ｚ＝121及び122より３−ケト−１，４
−ジエンの存在が確認された。 NMRスペクトル（90MHz）δ^DMSO-d6 _HMS： 0.75（3H，ｓ）18−CH₃ 1.13（3H，ｓ）19−CH₃ 3.85（1H，ｄ）12β−Ｈ 4.55（1H，ｄ）12α−OH 5.95（1H）４−Ｈ 6.15（1H，ｄ）２−Ｈ 7.10（1H，ｄ）１−Ｈ 参考例 ３ シユードモナス・オバリスＤ−40菌株（微工研
菌寄第6147号）を次に示す方法で培養した。デオ
キシコール酸50ｇ、硝酸アンモニウム2.0ｇ、燐
酸２水素カリウム1.0ｇ、燐酸水素２カリウム50
ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物0.2ｇ、酵母エ
キス0.2ｇ及び水酸化ナトリウム5.0ｇに水道水を
加えて容量を１に調整し、これを培地とした。
この培地を500ml容坂口フラスコに100ml宛10本に
分注し、120℃で15分間、蒸気殺菌を行なつた。
予め上記の培地と同じ培地で試験管振盪機にて２
日間増殖させた種菌を上記の500ml溶坂口フラス
コあたり10ml宛添加し、30℃で５日間振盪培養し
た。培養後、これらの培養液を集め、遠心分離機
で菌体を除去後、得られた培養液上清をクロロホ
ルム／メタノールの２／１容量比の混合液1.5
で抽出し、ロータリー・エバポレーターでクロロ
ホルム／メタノール混合液を溜去することによ
り、34ｇのデオキシコール酸の酸化生成物及び未
変換のデオキシコール酸の混合物を得た。 上記の混合物20ｇを少量のクロロホルム／エタ
ノールの99.5／0.5容量比の混合液に溶解させ、
600ｇのシリカゲルカラムに吸着させた。このカ
ラムをクロロホルム／エタノールの99.5／0.5容
量比の混合液１で洗滌後、クロロホルム／エタ
ノールの99／１容量比の混合液２をカラムに流
し、得られた溶出液から溶培を溜去することによ
り、12β−ヒドロキシアンドロスタ−１，４−ジ
エン−３，17−ジオン（以下、これを12β−ヒド
ロキシADDと称す）３，４ｇを単離した。 上記で単離された12β−ヒドロキシADDの確認
を下記の方法で行なつた。 融点：213℃ マススペクトルｍ／ｚ：300〔Ｍ〕⁺ 285〔Ｍ−CH₃〕⁺ 252〔Ｍ−H₂O〕⁺ またｍ／ｚ＝122より３−ケト−１，４−ジエ
ンの存在が確認された。 NMRスペクトル（90MHz）δ^CDCl3 _HMS： 0.9（3H，ｓ）18−CH₃ 1.21（3H，ｓ）19−CH₃ 2.30〜2.50（2H，ｍ）16−CH₂ 3.72（1H，dd，Ｊ＝５Hz及び10Hz）12α−Ｈ 6.06（1H，ｓ）４−Ｈ 6.20（1H，ｄ，Ｊ＝10Hz）２−Ｈ 6.98（1H，ｄ，Ｊ＝10Hz）１−Ｈ 実施例 12α−メシルオキシアンドロスタ−１，４−ジ
エン−３，17−ジオンの合成 12α−ヒドロキシADDの1500ｇをピリジン150
mlに溶解した。この溶液にメタンスルホンニルク
ロリダ22.91ｇを滴下し、室温で一夜撹拌した。
次に、反応液を約700ml氷水中に注ぎ、塩化メチ
レンで抽出した。抽出液を希塩酸水、水で順次洗
滌し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。これよ
り減圧下に低沸点物を留去し、得られた残渣を酢
酸エチルで再結晶することにより、赤褐色結晶の
12α−メシルオキシアンドロスタ−１，４−ジエ
ン−３，17−ジオン13.75ｇを得た。このものの
性状は次のとおりであつた。 NMRスペクトル（90MHz）δ^CDCl3 _HMS： 0.97（ｓ，3H）；1.22（ｓ，3H）； 2.99（ｓ，3H）；4.80〜4.90（ｍ，1H）； 6.07（bs，1H）；6.20、6.22（each ｄ，1H）； 6.95（ｄ，1H） 融点：198〜199℃ アンドロスタ−１，４，11（12）−トリエン−
３，17−ジオンの合成 12α−メチルオキシアンドロスタ−１，４−ジ
エン−３，17−ジオン1000ｇをヘキサメチルホス
ホルトリアミド150mlに溶解した。この溶液に酢
酸カリウム12.96ｇを加え、130〜140℃の温度で
４時間撹拌した。次に、反応液を約700mlの氷水
に注ぎ、塩化メチレンで抽出した。抽出液を希塩
酸水、水で順次洗滌し、無水硫酸マグネシウムで
乾燥した。これより減圧下に低沸点物を留去する
ことにより、アンドロスタ−１，４，11（12）−ト
リエン−３，17−ジオンの粗結晶を6.95ｇ得た。
この粗結晶を酢酸エチウで再結晶したものの性状
は次のとおりであつた。 NMRスペクトル（90MHz）δ^CDCl3 _HMS： 0.99（ｓ，3H）；1.18（ｓ，3H）； 5.66、5.67（each ｄ，1H）； 6.07〜6.36（ｍ，3H）；7.10（ｄ，1H）； IRスペクトル（KBr，cm^-1）：1747、1658、1620 融点：193〜195℃ EI−Massスペクトルｍ／ｚ：282〔Ｍ〕⁺ 参考例 ４ 17−エチニル−17−ヒドロキシアンドロスタ−
１，４，11（12）−トリエン−３−オンの合成 テトラヒドロフラン80mlにカリウムtert.−ブト
キシド3.37ｇを溶解させ、この溶液にアセチレン
ガスを30分間吹き込んだ。粘稠な白色のスラリー
状となつた溶液中に、アンドロスタ−１，４，11
（12）−トリエン−３−オン2.82ｇをテトラヒドロ
フラン20mlに溶解した溶液を室温で滴下し、２時
間撹拌した。次いで30〜40℃の温度で１時間撹拌
したのち、反応液を希塩酸水に注ぎ、塩化メチレ
ンで抽出した。抽出液を水洗したのち、無水硫酸
マグネシウムで乾燥し、減圧下に低沸点物を留去
することにより固体残渣を得た。次いで、この残
渣にイソプロピルエーテルを50ml加え、室温で２
時間撹拌し、不溶部を濾別し、瀘液よりイソプロ
ピルエーテルを留去することにより、下記の性状
を有する17−エチニル−17−ヒドロキシアンドロ
スタ−１，４，11（12）−トリエン−３−オン0.88
ｇを得た。 GC−Massスペクトルｍ／ｚ：308〔Ｍ〕⁺ IRスペクトル（KBr，cm^-1）：1678、1665 NMRスペクトル（90MHz）δ^CDCl3 _HMS： 2.40（ｓ，−Ｃ≡CH） 参考例 ５ 17−シアノ−17−ヒドロキシアンドロスタ−
１，４，11（12）−トリエン−３−オンの合成 メタノール20mlにアンドロスタ−１，４，11
（12）−トリエン−３，17−ジオン2.82ｇ及びシア
ン化カリウム３，26ｇを添加し、室温で撹拌し
た。この溶液に氷酢酸３ｇを５時間を要して滴下
したのち、一夜撹拌した。次いで、この反応液に
氷酢酸２ｇを加えたのち、この溶液を200mlの水
に注ぎ、塩化メチレンで抽出した。抽出液を水で
洗滌したのち無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧
下に低沸点物を留去することにより、17−シアノ
−17−ヒドロキシアンドロスタ−１，４，11（12）
−トリエン−３−オンの粗結晶を2.98ｇ得た。エ
タノールから再結晶したもの性状は次のとおりで
あつた。 NMRスペクトル（90MHz） δ^d-DMSO _HMS：0.94（ｓ，3H）、1.10（ｓ，3H）、5.68
〜
6.27（ｍ，5H）、7.31（ｄ，1H） δ^d-DMSO/D2O _HMS：0.94（ｓ，3H）、1.12（ｓ，3H）、5
.70
〜6.28（ｍ，4H）、7.33（ｄ，1H） IRスペクトル（KBr，cm^-1）： 3400、2240、1653、1617、1592

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ アンドロスタ−１，４，11（12）−トリエン−
   ３，17−ジオン。