JPH0359915B2 - - Google Patents
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- JPH0359915B2 JPH0359915B2 JP6267983A JP6267983A JPH0359915B2 JP H0359915 B2 JPH0359915 B2 JP H0359915B2 JP 6267983 A JP6267983 A JP 6267983A JP 6267983 A JP6267983 A JP 6267983A JP H0359915 B2 JPH0359915 B2 JP H0359915B2
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- pseudomonas
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- culture
- deoxycholic acid
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
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Description
本発明は式
（式中、波線〜はヒドロキシル基又はシアノ基
がα−立体配置又はβ−立体配置のいずれかにあ
ることを示す。）で示される17−シアノ−12，17
−ジヒドロキシアンドロスタ−１，４−ジエン−
３−オンに関する。 本発明により提供される17−シアノ−12，17−
ジヒドロキシアンドロスタ−１，４−ジエン−３
−オンは公知文献に未記載の新規化合物であり、
プロゲステロン又はブレドニゾン、ブレドニゾロ
ンなどで代表されるコルチコイドの合成中間体と
して有用である。 17−シアノ−12，17−ジヒドロキシアンドロス
タ−１，４−ジエン−３−オンは、12−ヒドロキ
シアンドロスタ−１，４−ジエン−３，17−ジオ
ン（以下、これを12−ヒドロキシADDと称す）
を低級アルコール及びシアノ化合物の存在下にシ
アン化水素と反応させることにより製造される。
溶媒として用いる低級アルコールとしてはメタノ
ール、エタノール、プロパノールなどが挙げられ
る。またシアノ化合物としてはシアン化カリウ
ム、シアン化ナトリウムなどが例示される。シア
ノ化合物の使用量は12−ヒドロキシADDに対し
て約１〜10倍モル量が好ましい。シアン化水素は
反応系内に直接加えてもよいし、系内に存在する
シアノ化合物に酢酸、プロピオン酸などの有機酸
又は塩酸、硫酸などの無機酸を作用させることに
より反応系内で発生させてもよい。シアン化水素
は12−ヒドロキシADDに対して約１〜８モル倍
量用いるのが好ましい。この反応は約０〜30℃の
温度で行なう。 また17−シアノ−12，17−ジヒドロキシアンド
ロスタ−１，４−ジエン−３−オンは、12−ヒド
ロキシADDにアセトンシアンヒドリンを少量の
ピリジンの存在下に反応させるか、又は12−ヒド
ロキシADDに直接シアン化水素を付加反応させ
ることによつても製造される。 反応終了後、反応混合物を水にあけ、塩化メチ
レンなどで抽出し、抽出液を水、重曹水などで洗
滌し、乾燥したのち、これより低沸点物を留去す
ることにより17−シアノ−12，17−ジヒドロキシ
アンドスタ−１，４−ジエン−３−オンの粗生成
物が得られる。この粗生成物を例えばエタノール
などから再結晶することにより高純度の17−シア
ノ−12，17−ジヒドロキシアンドロスタ−１，４
−ジエン−３−オンを得ることができる。 原料化合物である12−ヒドロキシADDは公知
化合物であるが、本発明者らのうちの数人が先に
見出した方法によれば、デオキシコール酸及び／
又はその塩を基質として12−ヒドロキシADDを
生産するシユードモナス・プチダ又はシユードモ
ナス・オバリスに属する細菌を、デオキシコール
酸及び／又はその塩を含む培地に培養することに
より得ることができる。 上記のシユードモナス・プチダに属する細菌と
しては、シユードモナス・プチダD4014−A1099
（Pseudomonas putida D4014−A1099）菌株
（微工研条寄第207号）がある。この菌株は土壤中
より採取したシユードモナス・プチダD4014
（Pseudomonas Putida D4014）菌株（微工研条
寄第205号）に突然変異処理を施して得られた変
異株である。またシユードモナス・オバリスに属
する細菌としては、シユードモナス・オバリスＤ
−40（Pseudomonas ovalis Ｄ−40）菌株（微工
研菌寄第6147号）がある。 シユードモナス・プチダD4014菌株、シユード
モナス・プチダD4014−A1099菌株及びシユード
モナス・オバリスＤ−40菌株の菌学的性質を列挙
すると第１及び第２表のとおりである。
がα−立体配置又はβ−立体配置のいずれかにあ
ることを示す。）で示される17−シアノ−12，17
−ジヒドロキシアンドロスタ−１，４−ジエン−
３−オンに関する。 本発明により提供される17−シアノ−12，17−
ジヒドロキシアンドロスタ−１，４−ジエン−３
−オンは公知文献に未記載の新規化合物であり、
プロゲステロン又はブレドニゾン、ブレドニゾロ
ンなどで代表されるコルチコイドの合成中間体と
して有用である。 17−シアノ−12，17−ジヒドロキシアンドロス
タ−１，４−ジエン−３−オンは、12−ヒドロキ
シアンドロスタ−１，４−ジエン−３，17−ジオ
ン（以下、これを12−ヒドロキシADDと称す）
を低級アルコール及びシアノ化合物の存在下にシ
アン化水素と反応させることにより製造される。
溶媒として用いる低級アルコールとしてはメタノ
ール、エタノール、プロパノールなどが挙げられ
る。またシアノ化合物としてはシアン化カリウ
ム、シアン化ナトリウムなどが例示される。シア
ノ化合物の使用量は12−ヒドロキシADDに対し
て約１〜10倍モル量が好ましい。シアン化水素は
反応系内に直接加えてもよいし、系内に存在する
シアノ化合物に酢酸、プロピオン酸などの有機酸
又は塩酸、硫酸などの無機酸を作用させることに
より反応系内で発生させてもよい。シアン化水素
は12−ヒドロキシADDに対して約１〜８モル倍
量用いるのが好ましい。この反応は約０〜30℃の
温度で行なう。 また17−シアノ−12，17−ジヒドロキシアンド
ロスタ−１，４−ジエン−３−オンは、12−ヒド
ロキシADDにアセトンシアンヒドリンを少量の
ピリジンの存在下に反応させるか、又は12−ヒド
ロキシADDに直接シアン化水素を付加反応させ
ることによつても製造される。 反応終了後、反応混合物を水にあけ、塩化メチ
レンなどで抽出し、抽出液を水、重曹水などで洗
滌し、乾燥したのち、これより低沸点物を留去す
ることにより17−シアノ−12，17−ジヒドロキシ
アンドスタ−１，４−ジエン−３−オンの粗生成
物が得られる。この粗生成物を例えばエタノール
などから再結晶することにより高純度の17−シア
ノ−12，17−ジヒドロキシアンドロスタ−１，４
−ジエン−３−オンを得ることができる。 原料化合物である12−ヒドロキシADDは公知
化合物であるが、本発明者らのうちの数人が先に
見出した方法によれば、デオキシコール酸及び／
又はその塩を基質として12−ヒドロキシADDを
生産するシユードモナス・プチダ又はシユードモ
ナス・オバリスに属する細菌を、デオキシコール
酸及び／又はその塩を含む培地に培養することに
より得ることができる。 上記のシユードモナス・プチダに属する細菌と
しては、シユードモナス・プチダD4014−A1099
（Pseudomonas putida D4014−A1099）菌株
（微工研条寄第207号）がある。この菌株は土壤中
より採取したシユードモナス・プチダD4014
（Pseudomonas Putida D4014）菌株（微工研条
寄第205号）に突然変異処理を施して得られた変
異株である。またシユードモナス・オバリスに属
する細菌としては、シユードモナス・オバリスＤ
−40（Pseudomonas ovalis Ｄ−40）菌株（微工
研菌寄第6147号）がある。 シユードモナス・プチダD4014菌株、シユード
モナス・プチダD4014−A1099菌株及びシユード
モナス・オバリスＤ−40菌株の菌学的性質を列挙
すると第１及び第２表のとおりである。
【表】
【表】
【表】
【表】
【表】
上記の表に示した菌学的性質に基づき、シユー
ドモナス・プチダD4014菌株、シユードモナス・
プチダD4014−A1099菌株及びシユードモナス・
オバリスＤ−40菌株の同定を行なつた。シユード
モナス・プチダD4014菌株は、桿菌であること、
極鞭毛を有していること、グラム染色が陰性であ
ることなどの顕微鏡的所見並びにオキシダーゼ反
応及びカタラーゼ反応がともに陽性であること、
好気性であること、Ｏ−Ｆテストの結果が酸化的
（Oxidative）であることなどの生理学的性質か
らパージエイズ・マニユアル・オブ・デイターミ
ネイテイブ・バクテリオロジー第７版及び第８版
に基づき、シユードモナス属に属する細菌である
と同定した。さらにシユードモナス・プチダ
D4014菌株は、培養液が螢光色を帯びる点、ゼラ
チンを液化しない点、37℃で生育する点、アルギ
ニン・ジヒドロラーゼを生成する点などからシユ
ードモナス属のプチダ種に属する細菌であると同
定した。一般に突然変異株はその親株と同じ種に
属するものと考えられており、シユードモナス・
プチダD4014−A1099菌株はシユードモナス属の
プチダ種に属する細菌であると判定した。また、
シユードモナス・オバリスＤ−40菌株は、桿菌で
あること、極鞭毛を有していること、グラム染色
が陰性であることなどの顕微鏡的所見及び好気性
であること、Ｏ−Ｆテストの結果がマイナスであ
ることなどの生理学的性質からバージエイズ・マ
ニユアル・オブ・デイターミネイテイブ・バクテ
リオロジー第７版及び第８版に基づき、シユード
モナス属に属する細菌であると同定した。さらに
シユードモナス・オバリスＤ−40菌株は、両端に
丸みを持つた短桿菌である点、寒点平板上で形成
するコロニーが円形で光沢を有する点、インドー
ルを生成しない点並びに糖類から酸及びガスの生
成が認められない点から、シユードモナス属のオ
バリス種に属する細菌であると同定した。 上記の微生物を利用した12−ヒドロキシADD
の製造方法では、デオキシコール酸及び／又はそ
の塩を基質として用いる。デオキシコール酸の塩
としては具体的にはデオキシコール酸のナトリウ
ム、カリウムなどのアルカリ金属の塩又はカルシ
ウム、マグネシウムなどのアルカリ土類金属の塩
である。デオキシコール酸及び／又はその塩の濃
度は通常約１〜200ｇ／の範囲でよいが、生産
される12−ヒドロキシADDの収量、培養条件及
び操作性などの経済的観点から約２〜50ｇ／の
範囲が好ましい。培養方法は原則的には一般微生
物の好気培養で採用される方法と同じであるが、
通常は液体培地による振盪培養法又は通気攪伴培
養法が用いられる。培地は上記のデオキシコール
酸及び／又はその塩を基質として12−ヒドロキシ
ADDを生産するシユードモナス・プチダ又はシ
ユードモナス・オバリスに属する細菌が資化剤用
できる栄養源を含有するものであればよい。炭素
源としてはデオキシコール酸及び／又はその塩を
単一炭素源としてもよいが好ましくはデオキシコ
ール酸及び／又はその塩にグルコース、グリセリ
ン、ペプトン、肉エキス、麦芽エキス、酵母エキ
スなどを併用するのがよい。また窒素源として
は、例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウ
ム、燐酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、硝酸
ナトリウム、硝酸カリウムなどの無機窒素源、又
はボリペプトン、ペプトン、肉エキスなどの有機
窒素源が用いられる。また、この他に燐酸水素２
カリウム、燐酸２水素カリウム、硫酸マグネシウ
ムなどの無機塩類が添加される。培養条件に特徴
はないが、通常25〜35℃で10時間〜７日間振盪培
養又は通気撹拌培養を行なう。 このようにして培養液中に蓄積された12−ヒド
ロキシADDを分離、採取するには、培養液を所
望によりアルカリ性にしたのち、12−ヒドロキシ
ADDを溶解しかつ水と相分離する有機溶媒、例
えば酢酸エチル、クロロホルム、クロロホルムと
メタノールの混合液などを用いて抽出する方法が
採られる。この有溶媒による抽出は、菌体を含ん
だ状態の培養液について行なつてもよいし、予め
培養液中の菌体その他の不溶成分を濾過又は遠心
分離などにより分離除去し、得られた培養濾液又
は上清について行なつてもよい。後者の抽出方法
を採る場合には、必要に応じて濾過又は遠心分離
などによつて分離除去される不溶成分について上
記の有機溶媒による抽出操作を行なうことによ
り、培養液中に析出又は沈澱している12−ヒドロ
キシADDを回収することができる。このように
して得られた抽出液を集め、これより溶媒を溜去
することによつて12−ヒドロキシADDをはじめ
とするデオキシコール酸の酸化物及び未変換デオ
キシコール酸をほぼ全量回収することができる。
得られた抽出物を例えば酢酸エチル、ジクロルメ
タン／メタノールなどから再結晶するか、又はシ
リカゲルカラムに吸着させ、クロロホルムとエタ
ノールの混合液で溶出させることにより12−ヒド
ロキシADDを取得することができる。 本発明により提供される17−シアノ−12，17−
ジヒドロキシアンドロスター１，４−ジエン−３
−オンは、(i)これを脱水反応に付したのち部分水
素添加を行ない、得られた生成物の３位のケトン
部分を保護し、これをメチルマグネシウムハライ
ドと反応させ、さらにその生成物を必要に応じて
部分水素添加反応に付することによりプロゲステ
ロンに誘導することができ、また(ii)17−シアノ−
12，17−ジヒドロキシアンドロスタ−１，４−ジ
エン−３−オンの12位の水酸基を常法により11位
のβ−水酸基に転換させ、17位のシアノ基を利用
して側鎖を誘導することによりプレドニゾン、プ
レドニゾロンなどに代表されるコルチコイドに導
くことができる。 以下に、本発明を実施例及び参考例により具体
的に説明する。 参考例 １ シユードモナス・プチダD4014−A1099菌株の
取得方法 培地１（組成：デオキシコール酸0.5％、水酸化
ナトリウム0.05％、ペプトン0.5％、酵母エキス
0.5％、塩化ナトリウム0.5％及び寒天1.5％）のス
ラントに生育させたシユードモナス・プチダ
D4014菌株の一白金耳を、予め試験管内に準備し
た培地２（組成：デオキシコール酸２％、水酸化
ナトリウム0.2％、硝酸アンモニウム0.2％、燐酸
２水素カリウム01％、燐酸水素２カリウム0.6％、
硫酸マグネシウム・７水和物0.02％及び酵母エキ
ス0.02％）の10mlに植菌し、30℃で14〜15時間振
盪培養した。この培養液の0.3mlを予め試験管に
準備した培地３（組成：デオキシコール酸0.5％、
水酸化ナトリウム0.05％、グルコース0.1％、硝
酸アンモニウム0.2％、燐酸２水素カリウム0.1
％、燐酸水素２カリウム0.6％、硫酸マグネシウ
ム・７水和物0.02％及び酵母エキス0.02％）の10
mlに加え、30℃で８〜９時間培養した。ついで、
この対数増殖期にある菌体を0.45μのメンブレン
フイルターで無菌的に濾過集菌し、0.1M燐酸塩
緩衝液（PH：7.0）20mlで洗滌後、同じ緩衝液25
mlに懸濁させた。これに終濃度が50μg／mlにな
るようにＮ−メチル−N′−ニトロ−Ｎ−ニトロ
ソグアニジンを添加し、３〜４分放置することに
より突然変異処理を行なつた。突然変異処理を施
した菌体を0.45μのメンブレンフイルターで濾過
集菌し、0.1M燐酸塩緩衝液（PH：7.0）20mlで洗
滌後、同じ緩衝液20mlに懸濁した。得られた菌懸
濁液を滅菌生理食塩水で希釈し、それを培地４
（組成：デオキシコール酸0.5％、水酸化ナトリウ
ム0.05％、硝酸アンモニウム0.2％、燐酸２水素
カリウム0.1％、燐酸水素２カリウム0.6％、硫酸
マグネシウム・７水和物0.02％、酵母エキス0.02
％及び寒天1.5％）の寒天平板上に500〜1000個の
コロニーを出現させるように塗布したのち、30℃
で３〜４日間培養した。出現したコロニー中の極
小コロニーを培地１のスラントに単離したのち、
その一白金耳を予め試験管に準備した培地５（組
成：デオキシコール酸0.2％、水酸化ナトリウム
0.02％、グルコース0.1％、硝酸アンモニウム0.2
％、燐酸２水素カリウム0.1％、燐酸水素２カリ
ウム0.6％、硫酸マグネシウム・７水和物0.02％
及び酵母エキス0.02％）の10mlに植菌し、30℃で
24時間振盪培養した。得られたそれぞれの培養液
中の生産物を薄層クロマトグラフイーにより検定
し、目的とする12α−ヒドロキシアンドロスター
１，４−ジエン−３，17−ジオン（以下、これを
12α−ヒドロキシADDと称す）を選択的に蓄積し
ている一菌株を見い出し、これをシユードモナ
ス・プチダD4014−A1099と命名した。 参考例 ２ シユードモナス・プチダD4014−A1099菌株
（微工研菌寄第6327号）を次に示す方法で培養し
た。デオキシコール酸0.5ｇ、グルコース0.1ｇ、
硝酸アンモニウム0.2ｇ、燐酸２水素カリウム0.1
ｇ、燐酸水素２カリウム0.6ｇ、硫酸マグネシウ
ム・７水和物0.02ｇ、酵母エキス0.02ｇ及び水酸
化ナトリウム0.05ｇに水道水を加えて容量を100
ml（PH：8.4）に調整し、これを培地とした。こ
の培地を500ml容坂口フラスコに入れ、120℃で15
分間、蒸気殺菌を行なつた。予め上記の培地と同
じ培地で試験管振盪機にて15時間増殖させた種菌
の10mlを上記の500ml容坂口フラスコに添加し、
30℃で28時間振盪培養した。培養後、この培養液
を集め、遠心分離機で菌体を除去後、得られた培
養液上清に１規定の水酸化ナトリウム水溶液を加
えることにより、この培養液上清のPHを12附近に
調整した。ついで、培養液上清を酢酸エチル300
mlで抽出し、抽出液から酢酸エチルをロータリ
ー・エバポレーターで溜去することにより12α−
ヒドロキシADDを360mg得た。 得られた12α−ヒドロキシADDの一部を取り、
これにメタノールを加えて２％溶液とし、この溶
液25μlをミクロボンダパツクＣ−18カラムを備え
た高速液体クロマトグラフイー（米国ウオーター
ズ社製、HLC−GPC−244型）に注入した。移動
相としてPH4.0に調整した水／メタノールの30／
70容量比の混合液を流速１ml／分で流し、検出を
屈折率方式で行なつた。得られた液体クロマトグ
ラフにおける各ピークの面積比を積分計（島津製
作所製、島津クロマトパツクＣ−R1A）で求め、
この面積比から上記の12α−ヒドロキシADDの純
度を求めたところ、99.5％であつた。 また、上記で得られた12μ−ヒドロキシADDの
確認を下記の方法で行なつた。 マススペクトルｍ／ｚ：300〔Ｍ〕+
ドモナス・プチダD4014菌株、シユードモナス・
プチダD4014−A1099菌株及びシユードモナス・
オバリスＤ−40菌株の同定を行なつた。シユード
モナス・プチダD4014菌株は、桿菌であること、
極鞭毛を有していること、グラム染色が陰性であ
ることなどの顕微鏡的所見並びにオキシダーゼ反
応及びカタラーゼ反応がともに陽性であること、
好気性であること、Ｏ−Ｆテストの結果が酸化的
（Oxidative）であることなどの生理学的性質か
らパージエイズ・マニユアル・オブ・デイターミ
ネイテイブ・バクテリオロジー第７版及び第８版
に基づき、シユードモナス属に属する細菌である
と同定した。さらにシユードモナス・プチダ
D4014菌株は、培養液が螢光色を帯びる点、ゼラ
チンを液化しない点、37℃で生育する点、アルギ
ニン・ジヒドロラーゼを生成する点などからシユ
ードモナス属のプチダ種に属する細菌であると同
定した。一般に突然変異株はその親株と同じ種に
属するものと考えられており、シユードモナス・
プチダD4014−A1099菌株はシユードモナス属の
プチダ種に属する細菌であると判定した。また、
シユードモナス・オバリスＤ−40菌株は、桿菌で
あること、極鞭毛を有していること、グラム染色
が陰性であることなどの顕微鏡的所見及び好気性
であること、Ｏ−Ｆテストの結果がマイナスであ
ることなどの生理学的性質からバージエイズ・マ
ニユアル・オブ・デイターミネイテイブ・バクテ
リオロジー第７版及び第８版に基づき、シユード
モナス属に属する細菌であると同定した。さらに
シユードモナス・オバリスＤ−40菌株は、両端に
丸みを持つた短桿菌である点、寒点平板上で形成
するコロニーが円形で光沢を有する点、インドー
ルを生成しない点並びに糖類から酸及びガスの生
成が認められない点から、シユードモナス属のオ
バリス種に属する細菌であると同定した。 上記の微生物を利用した12−ヒドロキシADD
の製造方法では、デオキシコール酸及び／又はそ
の塩を基質として用いる。デオキシコール酸の塩
としては具体的にはデオキシコール酸のナトリウ
ム、カリウムなどのアルカリ金属の塩又はカルシ
ウム、マグネシウムなどのアルカリ土類金属の塩
である。デオキシコール酸及び／又はその塩の濃
度は通常約１〜200ｇ／の範囲でよいが、生産
される12−ヒドロキシADDの収量、培養条件及
び操作性などの経済的観点から約２〜50ｇ／の
範囲が好ましい。培養方法は原則的には一般微生
物の好気培養で採用される方法と同じであるが、
通常は液体培地による振盪培養法又は通気攪伴培
養法が用いられる。培地は上記のデオキシコール
酸及び／又はその塩を基質として12−ヒドロキシ
ADDを生産するシユードモナス・プチダ又はシ
ユードモナス・オバリスに属する細菌が資化剤用
できる栄養源を含有するものであればよい。炭素
源としてはデオキシコール酸及び／又はその塩を
単一炭素源としてもよいが好ましくはデオキシコ
ール酸及び／又はその塩にグルコース、グリセリ
ン、ペプトン、肉エキス、麦芽エキス、酵母エキ
スなどを併用するのがよい。また窒素源として
は、例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウ
ム、燐酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、硝酸
ナトリウム、硝酸カリウムなどの無機窒素源、又
はボリペプトン、ペプトン、肉エキスなどの有機
窒素源が用いられる。また、この他に燐酸水素２
カリウム、燐酸２水素カリウム、硫酸マグネシウ
ムなどの無機塩類が添加される。培養条件に特徴
はないが、通常25〜35℃で10時間〜７日間振盪培
養又は通気撹拌培養を行なう。 このようにして培養液中に蓄積された12−ヒド
ロキシADDを分離、採取するには、培養液を所
望によりアルカリ性にしたのち、12−ヒドロキシ
ADDを溶解しかつ水と相分離する有機溶媒、例
えば酢酸エチル、クロロホルム、クロロホルムと
メタノールの混合液などを用いて抽出する方法が
採られる。この有溶媒による抽出は、菌体を含ん
だ状態の培養液について行なつてもよいし、予め
培養液中の菌体その他の不溶成分を濾過又は遠心
分離などにより分離除去し、得られた培養濾液又
は上清について行なつてもよい。後者の抽出方法
を採る場合には、必要に応じて濾過又は遠心分離
などによつて分離除去される不溶成分について上
記の有機溶媒による抽出操作を行なうことによ
り、培養液中に析出又は沈澱している12−ヒドロ
キシADDを回収することができる。このように
して得られた抽出液を集め、これより溶媒を溜去
することによつて12−ヒドロキシADDをはじめ
とするデオキシコール酸の酸化物及び未変換デオ
キシコール酸をほぼ全量回収することができる。
得られた抽出物を例えば酢酸エチル、ジクロルメ
タン／メタノールなどから再結晶するか、又はシ
リカゲルカラムに吸着させ、クロロホルムとエタ
ノールの混合液で溶出させることにより12−ヒド
ロキシADDを取得することができる。 本発明により提供される17−シアノ−12，17−
ジヒドロキシアンドロスター１，４−ジエン−３
−オンは、(i)これを脱水反応に付したのち部分水
素添加を行ない、得られた生成物の３位のケトン
部分を保護し、これをメチルマグネシウムハライ
ドと反応させ、さらにその生成物を必要に応じて
部分水素添加反応に付することによりプロゲステ
ロンに誘導することができ、また(ii)17−シアノ−
12，17−ジヒドロキシアンドロスタ−１，４−ジ
エン−３−オンの12位の水酸基を常法により11位
のβ−水酸基に転換させ、17位のシアノ基を利用
して側鎖を誘導することによりプレドニゾン、プ
レドニゾロンなどに代表されるコルチコイドに導
くことができる。 以下に、本発明を実施例及び参考例により具体
的に説明する。 参考例 １ シユードモナス・プチダD4014−A1099菌株の
取得方法 培地１（組成：デオキシコール酸0.5％、水酸化
ナトリウム0.05％、ペプトン0.5％、酵母エキス
0.5％、塩化ナトリウム0.5％及び寒天1.5％）のス
ラントに生育させたシユードモナス・プチダ
D4014菌株の一白金耳を、予め試験管内に準備し
た培地２（組成：デオキシコール酸２％、水酸化
ナトリウム0.2％、硝酸アンモニウム0.2％、燐酸
２水素カリウム01％、燐酸水素２カリウム0.6％、
硫酸マグネシウム・７水和物0.02％及び酵母エキ
ス0.02％）の10mlに植菌し、30℃で14〜15時間振
盪培養した。この培養液の0.3mlを予め試験管に
準備した培地３（組成：デオキシコール酸0.5％、
水酸化ナトリウム0.05％、グルコース0.1％、硝
酸アンモニウム0.2％、燐酸２水素カリウム0.1
％、燐酸水素２カリウム0.6％、硫酸マグネシウ
ム・７水和物0.02％及び酵母エキス0.02％）の10
mlに加え、30℃で８〜９時間培養した。ついで、
この対数増殖期にある菌体を0.45μのメンブレン
フイルターで無菌的に濾過集菌し、0.1M燐酸塩
緩衝液（PH：7.0）20mlで洗滌後、同じ緩衝液25
mlに懸濁させた。これに終濃度が50μg／mlにな
るようにＮ−メチル−N′−ニトロ−Ｎ−ニトロ
ソグアニジンを添加し、３〜４分放置することに
より突然変異処理を行なつた。突然変異処理を施
した菌体を0.45μのメンブレンフイルターで濾過
集菌し、0.1M燐酸塩緩衝液（PH：7.0）20mlで洗
滌後、同じ緩衝液20mlに懸濁した。得られた菌懸
濁液を滅菌生理食塩水で希釈し、それを培地４
（組成：デオキシコール酸0.5％、水酸化ナトリウ
ム0.05％、硝酸アンモニウム0.2％、燐酸２水素
カリウム0.1％、燐酸水素２カリウム0.6％、硫酸
マグネシウム・７水和物0.02％、酵母エキス0.02
％及び寒天1.5％）の寒天平板上に500〜1000個の
コロニーを出現させるように塗布したのち、30℃
で３〜４日間培養した。出現したコロニー中の極
小コロニーを培地１のスラントに単離したのち、
その一白金耳を予め試験管に準備した培地５（組
成：デオキシコール酸0.2％、水酸化ナトリウム
0.02％、グルコース0.1％、硝酸アンモニウム0.2
％、燐酸２水素カリウム0.1％、燐酸水素２カリ
ウム0.6％、硫酸マグネシウム・７水和物0.02％
及び酵母エキス0.02％）の10mlに植菌し、30℃で
24時間振盪培養した。得られたそれぞれの培養液
中の生産物を薄層クロマトグラフイーにより検定
し、目的とする12α−ヒドロキシアンドロスター
１，４−ジエン−３，17−ジオン（以下、これを
12α−ヒドロキシADDと称す）を選択的に蓄積し
ている一菌株を見い出し、これをシユードモナ
ス・プチダD4014−A1099と命名した。 参考例 ２ シユードモナス・プチダD4014−A1099菌株
（微工研菌寄第6327号）を次に示す方法で培養し
た。デオキシコール酸0.5ｇ、グルコース0.1ｇ、
硝酸アンモニウム0.2ｇ、燐酸２水素カリウム0.1
ｇ、燐酸水素２カリウム0.6ｇ、硫酸マグネシウ
ム・７水和物0.02ｇ、酵母エキス0.02ｇ及び水酸
化ナトリウム0.05ｇに水道水を加えて容量を100
ml（PH：8.4）に調整し、これを培地とした。こ
の培地を500ml容坂口フラスコに入れ、120℃で15
分間、蒸気殺菌を行なつた。予め上記の培地と同
じ培地で試験管振盪機にて15時間増殖させた種菌
の10mlを上記の500ml容坂口フラスコに添加し、
30℃で28時間振盪培養した。培養後、この培養液
を集め、遠心分離機で菌体を除去後、得られた培
養液上清に１規定の水酸化ナトリウム水溶液を加
えることにより、この培養液上清のPHを12附近に
調整した。ついで、培養液上清を酢酸エチル300
mlで抽出し、抽出液から酢酸エチルをロータリ
ー・エバポレーターで溜去することにより12α−
ヒドロキシADDを360mg得た。 得られた12α−ヒドロキシADDの一部を取り、
これにメタノールを加えて２％溶液とし、この溶
液25μlをミクロボンダパツクＣ−18カラムを備え
た高速液体クロマトグラフイー（米国ウオーター
ズ社製、HLC−GPC−244型）に注入した。移動
相としてPH4.0に調整した水／メタノールの30／
70容量比の混合液を流速１ml／分で流し、検出を
屈折率方式で行なつた。得られた液体クロマトグ
ラフにおける各ピークの面積比を積分計（島津製
作所製、島津クロマトパツクＣ−R1A）で求め、
この面積比から上記の12α−ヒドロキシADDの純
度を求めたところ、99.5％であつた。 また、上記で得られた12μ−ヒドロキシADDの
確認を下記の方法で行なつた。 マススペクトルｍ／ｚ：300〔Ｍ〕+
Claims (1)
- １ 17−シアノ−12，17−ジヒドロキシアンドロ
スタ−１，４−ジエン−３−オン。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6267983A JPS59186998A (ja) | 1983-04-08 | 1983-04-08 | １７−シアノ−１２，１７−ジヒドロキシアンドロスタ−１，４−ジエン−３−オン |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6267983A JPS59186998A (ja) | 1983-04-08 | 1983-04-08 | １７−シアノ−１２，１７−ジヒドロキシアンドロスタ−１，４−ジエン−３−オン |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59186998A JPS59186998A (ja) | 1984-10-23 |
| JPH0359915B2 true JPH0359915B2 (ja) | 1991-09-12 |
Family
ID=13207205
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6267983A Granted JPS59186998A (ja) | 1983-04-08 | 1983-04-08 | １７−シアノ−１２，１７−ジヒドロキシアンドロスタ−１，４−ジエン−３−オン |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS59186998A (ja) |
-
1983
- 1983-04-08 JP JP6267983A patent/JPS59186998A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS59186998A (ja) | 1984-10-23 |
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