JPH0369510B2 - - Google Patents
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- JPH0369510B2 JPH0369510B2 JP58785A JP58785A JPH0369510B2 JP H0369510 B2 JPH0369510 B2 JP H0369510B2 JP 58785 A JP58785 A JP 58785A JP 58785 A JP58785 A JP 58785A JP H0369510 B2 JPH0369510 B2 JP H0369510B2
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〔技術分野〕
本発明は、新規な澱粉糖化酵素剤に関するもの
である。 〔従来技術〕 アミラーゼは澱粉中に存在するα−１，４−グ
ルコシド結合あるいはα−１，６−グルコシド結
合を分解する酵素の総称であり、分解する結合や
分解様式により、種々の名称で呼ばれる酵素が知
られている。たとえば、α−１，４−グルコシド
結合を切断するアミラーゼに、α−アミラーゼ、
β−アミラーゼなどがあり、α−１，６−グルコ
シド結合を分解する酵素にイソアミラーゼ、プル
ラナーゼ、アミロ−１，６−グルコシダーゼ、Ｒ
−酵素など、一般に枝切り酵素（debranching
enzyme）と呼ばれる酵素がある。そして、α−
１，４−グルコシド結合とα−１，６−グルコシ
ド結合の両結合を切断する酵素としてはグルコア
ミラーゼがあり、α−１，４−グルコシド結合と
α−１，６−グルコシド結合からなるアミロペク
チンまたはこれを含む澱粉を、その非還元性末端
から、ほぼ完全にグルコースに加水分解する。α
−１，６−グルコシド結合を分解する枝切り酵素
は、最近、β−アミラーゼと組み合わせて澱粉に
同時に作用させることにより、マルトースを収量
よく生産するのに使用したり、また、グルコアミ
ラーゼのα−１，６−グルコシドの分解切断能力
を補うために、グルコアミラーゼと併用すること
により、澱粉からグルコースを収量よく製造する
ために使用される有用な酵素である。 しかし、例えば、プルラナーゼをグルコアミラ
ーゼと併用するためには、グルコアミラーゼがPH
４〜５、温度55〜60℃に最適作用域をもつため
に、少なくとも55〜60℃で長時間使用できる熱安
定性をもち、且つPH４〜５で作用できる酵素であ
ることが要求される。 しかるに、従来、知られている多くの枝切り酵
素は、一部の微生物のもの｛バシルス・ステアロ
サーモフライス〔日本農芸化学会大会昭和47年度
講演要旨集第88頁〕、バシルス・アシドプルリテ
イカス〔特開昭57−174089、starch、34，340
（1982）〕｝を除き、殆んどは最適作用温度が40〜
50℃付近にあつて、熱安定性に劣ることが欠点で
あつた。 〔目的〕 本発明者は、前記目的にかなつた枝切り酵素を
開発することを目的として、広く自然界より微生
物の検索を行つてきた結果、PH約５〜約7.5の広
いPH範囲に最適PHをもつ耐熱性のプルラナーゼ様
酵素が、バシルス・ズブチルス（Bacillus
subtilis）TUと同定した細菌により生産されるこ
とを認めた。 本酵素は、プルランに作用させたとき、殆んど
マルトトリオースに分解するα−１，６−グルコ
シダーゼ活性を示すが、同酵素剤を澱粉に作用さ
せたとき、マルトースとマルトトリオースを特異
的、且つ高収量で生産する新規で興味ある酵素活
性を示し、澱粉からマルトースとマルトトリオー
スをそれぞれ約40〜約50％含む新規な水飴が製造
できることを認めた。本発明はこのような知見に
基づいてなされたものである。 〔構成〕 すなわち、本発明は、澱粉を、主としてマルト
ースとマルトトリオースに分解する新規なα−ア
ミラーゼ酵素活性をもち、且つプルランをマルト
トリオースに分解する酵素活性をもつ新規なプル
ラナーゼ様複合酵素剤に関するものである。 以下に、本発明の内容を更に具体的に説明す
る。 本発明により生産される新規なα−アミラーゼ
活性をもつプルラナーゼ様酵素は、プルランを基
質とするとき、最終的に主としてマルトトリオー
スを生成するプルラナーゼ活性を示すが、同時
に、アミロース、アミロペクチン、グリコーゲン
などのα−１，４−グルコシド結合分解活性をも
ち、マルトースとマルトトリオースを主成分とし
て生成する興味ある新規な酵素剤であるが、この
プルラナーゼ活性とα−アミラーゼ活性は、硫安
分画、各種有機溶剤による分画、陰イオン交換体
による吸着クロマトグラフイー、ゲル濾過、無機
担体などへの吸着、などのタンパク質精製方法に
よつては分離されず、Sephadex Ｇ−200
（Pharmatia Fine Chemicals製）、Cellulofine
GC700ｍ（チツソ(株)製）やBiogel Ａ−0.5ｍ
（Bio−Rad Lab.製）などを用いたゲル濾過法に
より測定した分子量が45〜55万の高分子量である
（通常のプルラナーゼの分子量は10万前後）こと
から、それぞれの活性をもつ複数個のサブユニツ
トがかなり強固に結合し、複合酵素を形成してい
ることが考えられる（第３図はBiogel Ａ−1.5ｍ
によるα−アミラーゼ活性、プルラナーゼ活性及
びタンパク質の溶出曲線を示しているが、これら
三者の溶出パターンは完全に一致している）。 本発明により生産される酵素剤のプルラン分解
活性の酵素的性質を以下に記載する。 (1) 作用；プルランのα−１，６−グルコシド結
合を分解し、主としてマルトトリオースを生成
する。 (2) 作用温度及び最適作用温度；１％プルラン、
0.05Mトリス緩衝液（PH7.0）の下で30分間反
応したとき、約80℃まで作用し、最適作用温度
は60〜63℃（第２図）。 (3) 作用PH及び最適作用PH；１％プルラン、
0.05M緩衝液で測定したとき、PH約４〜約10の
広いPH範囲に作用する。第１図に示す通り、PH
約５とPH７〜7.5のピークが認められ、最適作
用PHは約５〜約7.5の広い範囲にあると考えら
れる（クエン酸−リン酸二ナトリウム緩衝液と
リン酸緩衝液、２％プルラン、55℃で30分間反
応）。 (4) 熱安定性；0.05Mトリス緩衝液（PH7.0）の
もとで各温度で10分間加熱後、プルランを基質
として残存活性を測定した。その結果50℃、10
分間の加熱までは殆んど失活が認められず、55
℃、10分の加熱で約30％失活した。そして、60
℃、10分間の加熱で約80％失活した。 (5) PH安定；0.1M緩衝液のもとで30℃で３時間
放置後、プルランを基質として残存活性を測定
した結果、PH約５〜約10で安定であつた。 (6) 阻害剤；１×10-3MのHgCl2、AgNO3で90
％以上阻害された。また同濃度のZnSO4により
約70％阻害された。 (7) 安定化剤；カルシウムイオンの存在下で熱安
定性が著しく増加する。１×10-2M塩化カルシ
ウムの存在下では、最適作用温度は約65℃に認
められた（１％プルラン、30分反応）。 (8) 精製方法；本酵素は液体培養物の培養濾過か
ら、リン酸カルシウムゲルに吸着させ、蒸溜水
で洗浄後、0.5MKClまたは、リン酸−カリウ
ム溶液で抽出し、次いで、DEAE−セフアロー
スカラムクロマトグラフイー、Biogel A1.5ｍ
によるカラムクロマトグラフイー、同カラムに
よる再クロマトグラフイー等により、クロマト
的及び電気泳動的に均一まで精製することがで
きる。 (9) 分子量；Biogel Ａ 0.5ｍで測定した分子量
は約55万であつた。 (10) 活性測定法；プルラナーゼの測定は0.1Mリ
ン酸緩衝液に溶解させた１％プルラン溶液（PH
7.0）0.5mlに適量の酵素を加え、水で全量１ml
とし、40℃で反応させる。この条件で１分間に
1μmolのグルコースに相当する還元力を生成す
る酵素量を１単位とした。 以上から明らかなように、本発明のプルラナー
ゼ活性はPH約５〜約7.5の極めて広いPH範囲に最
適作用PHが認められ、また、最適作用温度は60〜
63℃にある極めて熱安定性に優れた酵素であり、
本発明以前に知られているバシルス属のプルラナ
ーゼ〔例えば、Agric.Biol.Chem、40，1523
（1976）、（最適PH６〜6.5、最適温度50℃）、特公
昭59−39630（最適PH7.0、最適温度45℃）、特開昭
昭57−174089（最適PH3.5〜5.5、最適温度約60
℃）〕とは異なつた新規なプルラナーゼ様酵素で
あるということができる。 本発明において、例示菌として使用されるバシ
ルス・ズブチルスTU株の菌学的性質は下記の通
りであり、本菌は微工研条寄第684号として工業
技術院微生物工業技術研究所に寄託されている。 (1) 形態的性質； 桿菌で大きさ0.5〜0.7×0.8〜1.2μ、非運動
性、グラム陽性、胞子は球形、楕円形。 (2) 培養的性質； (a) 肉汁寒天斜面培養；表面スムースで生育良
好、培養後期は淡黄色を示す。 (b) グルコース肉汁寒天斜面培養；肉汁寒天培
養よりも生育劣る。 (c) 肉汁液体培養；生育はよくないが混濁を生
じ、沈降する。 (d) クエン酸寒天斜面培養；わずかに生育す
る。 (e) ペプトン−ゼラチン穿刺培養；ゆつくり液
化する。 (f) ミルク液体培養；カゼインを凝固し、次い
でペプトン化する。 (g) ポテト培養；生育はあまりよくない。 (3) 生化学的性質； (a) 硝酸塩の還元；陰性 (b) カタラーゼ；陽性 (c) チロシナーゼ；陰性 (d) インドール；生成しない (e) クエン酸の利用；陽性 (f) 硫化水素の生成；陽性 (g) ウレアーゼ；陰性 (h) 澱粉の加水分解；陽性 (i) 炭水化物の利用；Ｄ−グルコース、Ｄ−フ
ラクトース、Ｄ−マンノース、Ｄ−ガラクト
ース、シユークロース、マルトース、ラクト
ース、デンプン、デキストリン、グリコーゲ
ン、Ｄ−キシロース、Ｄ−アラビノース、Ｌ
−アラビノースなどの炭水化物から酸を生成
するが、ガスの発生は認められない。 (4) 生育PH及び生育温度； 本菌は、中性付近よりも、弱アルカリ性のPH
7.5〜8.5で良好に生育する。生育最適温度は35
〜45℃にあり、最高生育温度は約50℃である。 〔効果〕 本発明により生産される新規なプルラナーゼ様
酵素はプルランをマルトトリオースに分解するα
−１，６−グルコシド結合分解活性の他に、澱粉
などα−１，４−グルカンを主としてマルトース
とマルトトリオースに分解するα−アミラーゼ活
性をもつているため、この活性をもたないプルラ
ナーゼやイソアミラーゼなどに比べ、グルコアミ
ラーゼに併用して澱粉の糖化に使用する場合、澱
粉の糖化反応を促進し、且つ最終的なグルコース
の収量も、通常、0.5〜３％高く収得することが
できる。例えば、グルコアミラーゼ単独で30％濃
度の液化澱粉に作用させた場合、グルコースの収
量は94〜95％である。そして、グルコアミラーゼ
に市販のプルラナーゼを共存させた場合、グルコ
ースの収量は約96.5％であつたが、同一プルラナ
ーゼ活性の本発明の酵素剤を共存させた場合は
97.0〜97.5％の収量でグルコースが得られた、こ
のように、グルコースの収量が高いばかりでな
く、最高の糖化率に到達する時間も、本発明の酵
素剤を使用する場合、著しく短縮することができ
る。すなわち、このことはグルコアミラーゼの使
用量を節減できることを意味している。 また、本発明の酵素剤はアミロース、アミロペ
クチン、デンプン、グリコーゲンなどに作用させ
た場合、主として、マルトースとマルトトリオー
スを生成するが、本酵素がα−１，６−グルコシ
ド結合分解活性をもつているため、マルトースと
マルトトリオースを極めて高い収量で得ることが
できる。例えば、本酵素剤を液化デンプンに作用
させた時、マルトースとマルトトリオースは、い
ずれも約40〜約50％の高収量で得られる。マルト
ースとマルトトリオースをこのような糖組成で生
成するアミラーゼは未だ知られていない。本発明
の酵素剤を使用して得られるこのような糖化物は
マルトースとマルトトリオースの両方の特性をも
つものであり、甘味料、甘味調製剤、食品増量剤
など、種々の食品の添加剤として利用できるので
ある。また、本発明の酵素は、極めて熱安定性に
優れ、グルコアミラーゼの限界温度である60℃に
おいても長時間の反応を行うことができるばかり
か、PH4.5〜5.0のグルコアミラーゼの良好な作用
PH範囲でも好適に利用することができる。このよ
うに、本発明の酵素剤は種々の効果をもつ新規な
酵素剤である。 本発明のα−アミラーゼ活性をもつプルラナー
ゼ様酵素を生産するためには、窒素源として、ペ
プトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン、コー
ン・ステイープ・リカー、大豆類、魚粉のような
有機窒素源や、塩化アンモニウム、硝酸アンモニ
ウム、リン酸アンモニウムのようなアンモニウム
塩、硝酸ナトリウム、硝酸カリウムのような硝酸
塩あるいは尿素のような無機窒素源のいずれか、
または両方を使用する。 炭素源としては、通常、澱粉、デキストリン、
マルトース、グルコース等が使用される。そして
これに補足する栄養源として、リン酸塩、マグネ
シウム塩や、少量のマンガンや鉄化合物が添加さ
れる。 培養は、PH約５〜約９、温度25〜55℃で行なう
ことができるが、通常、PH７〜９、温度30℃前後
で２〜４日間好気的に行われる。該酵素は殆んど
菌体外に生産されるので、培養後、濾過または遠
心分離して除菌し、上澄液を回収する。そして、
必要に応じ濃縮し、硫酸アンモニウムや硝酸ナト
リウムなどにより塩析するか、または、アセト
ン、イソプロパノール、エタノール、メタノール
等の有機溶剤を加えて該酵素を沈澱物として回収
し、濃厚溶液として、または乾燥物として保存す
る。 本酵素を使用し、単独または、グルコアミラー
ゼやβ−アミラーゼなどと併用して、澱粉を糖化
する反応は、通常、PH４〜９、温度40℃〜70℃で
行われる。 以下に、実施例により本発明の詳細を説明す
る。 実施例 １ 大豆粒５％、コーン・ステイープ・リカー0.6
％、肉エキス0.3％、リン酸二カリ0.3％、硫酸マ
グネシウム0.1％、可溶性デンプン２％、尿素0.3
％、ソデイウム・ドデシルサルフエート0.1％、
硫酸銅５×10-5M、塩化マンガン2.5×10-6M、
塩化カルシウム１×10-3M、硫酸亜鉛１×
10-4M、硫酸鉄１×10-5Mからなる倍地（PH7.2）
30mlを200ml容三角フラスコに入れ、常法により
殺菌後、バシルス・ズブチルスTU（FERM BP
−684）を接種し、30℃で３日間振盪培養した。
培養後、遠心分離して得た上澄液中のプルラナー
ゼ活性は倍地１ml当り9.6単位であつた。またα
−アミラーゼ活性は培地１ml当は45.2単位であつ
た。 ここでα−アミラーゼ活性は以下のようにして
測定した。 0.1Mリン酸緩衝液に溶解させた１％可溶性澱
粉液（PH7.0）0.5mlに、適量の酵素を加え、水で
１mlとし、40℃で反応させる。この条件で１分間
に1μmolのグルコースに相当する還元力を生成す
る酵素量を１単位とした。 実施例 ２ 実施例１で使用した培地と同じ組成の培地で培
養した、バシルス、ズブチルスTU株（FERM
BP−684）の培養上澄250mlに、0.4Mリン酸二ナ
トリウム溶液及び0.4M塩化カルシウム溶液各150
mlを滴下しながら添加してリン酸カルシウムゲル
を形成させるとともに、これに酵素を吸着させ
た。次いで、ガラスフイルターで濾過して吸着物
に回収し、蒸溜水で充分洗浄後、0.5Mリン酸−
カリウム溶液200mlで酵素を溶出し、透析、濃縮
した。 次いで、2.5×10-3Mトリス緩衝液で緩衝化し
たDEAE−セフアロースカラムで処理し、同緩衝
液で流出する。プルラナーゼ活性区分を集め、濃
縮、透析後、2.5×10-3Mトリス緩衝液（PH7.0）
で緩衝化したBiogel Ａ 1.5ｍカラムでゲル濾過
を行い、活性区分を集め、同カラムで再クロマト
グラフイーを繰返した。第３図はBiogel Ａ 1.5
ｍカラム（1.5×87cm）による溶出曲線を示して
いる。精製された酵素はタンパク質曲線、プルラ
ナーゼ活性曲線及びα−アミラーゼ活性曲線は完
全に一致している。最終的に回収された酵素標品
のプルラナーゼ活性は585単位、そしてα−アミ
ラーゼ活性は1070単位であつた。 実施例 ３ 実施例２で調製した酵素剤を市販のグルコアミ
ラーゼと併用して澱粉の糖化反応を行つた。 基質としては、ポテト澱粉を市販液化酵素で液
化したDE7.7のものを使用した（グルコアミーゼ
と液化酵素は、天野製薬(株)、ノボ・ジヤパン(株)な
どより入手することができる）。 固形分として、各３ｇの液化澱粉に、グルコア
ミラーゼ（ノボ社製工業用酵素）を液化澱粉固形
分に対して、0.2％量と実施例２で調製した。本
発明の酵素剤または市販のプルラナーゼを加え、
１×10-2M塩化カルシウムの存在下、PH4.8〜5.0
で、57.5℃で糖化反応を行つた（各プルラナーゼ
剤は、前記の活性測定法において、リン酸緩衝液
の代りに、酢酸緩衝液を用い、PH5.0で測定する
以外は同じ条件で行ない、基質１ｇに対し、0.5
単位の酵素量を添加した）。得られた結果は第１
表及び第２表に示す通りであつた。
である。 〔従来技術〕 アミラーゼは澱粉中に存在するα−１，４−グ
ルコシド結合あるいはα−１，６−グルコシド結
合を分解する酵素の総称であり、分解する結合や
分解様式により、種々の名称で呼ばれる酵素が知
られている。たとえば、α−１，４−グルコシド
結合を切断するアミラーゼに、α−アミラーゼ、
β−アミラーゼなどがあり、α−１，６−グルコ
シド結合を分解する酵素にイソアミラーゼ、プル
ラナーゼ、アミロ−１，６−グルコシダーゼ、Ｒ
−酵素など、一般に枝切り酵素（debranching
enzyme）と呼ばれる酵素がある。そして、α−
１，４−グルコシド結合とα−１，６−グルコシ
ド結合の両結合を切断する酵素としてはグルコア
ミラーゼがあり、α−１，４−グルコシド結合と
α−１，６−グルコシド結合からなるアミロペク
チンまたはこれを含む澱粉を、その非還元性末端
から、ほぼ完全にグルコースに加水分解する。α
−１，６−グルコシド結合を分解する枝切り酵素
は、最近、β−アミラーゼと組み合わせて澱粉に
同時に作用させることにより、マルトースを収量
よく生産するのに使用したり、また、グルコアミ
ラーゼのα−１，６−グルコシドの分解切断能力
を補うために、グルコアミラーゼと併用すること
により、澱粉からグルコースを収量よく製造する
ために使用される有用な酵素である。 しかし、例えば、プルラナーゼをグルコアミラ
ーゼと併用するためには、グルコアミラーゼがPH
４〜５、温度55〜60℃に最適作用域をもつため
に、少なくとも55〜60℃で長時間使用できる熱安
定性をもち、且つPH４〜５で作用できる酵素であ
ることが要求される。 しかるに、従来、知られている多くの枝切り酵
素は、一部の微生物のもの｛バシルス・ステアロ
サーモフライス〔日本農芸化学会大会昭和47年度
講演要旨集第88頁〕、バシルス・アシドプルリテ
イカス〔特開昭57−174089、starch、34，340
（1982）〕｝を除き、殆んどは最適作用温度が40〜
50℃付近にあつて、熱安定性に劣ることが欠点で
あつた。 〔目的〕 本発明者は、前記目的にかなつた枝切り酵素を
開発することを目的として、広く自然界より微生
物の検索を行つてきた結果、PH約５〜約7.5の広
いPH範囲に最適PHをもつ耐熱性のプルラナーゼ様
酵素が、バシルス・ズブチルス（Bacillus
subtilis）TUと同定した細菌により生産されるこ
とを認めた。 本酵素は、プルランに作用させたとき、殆んど
マルトトリオースに分解するα−１，６−グルコ
シダーゼ活性を示すが、同酵素剤を澱粉に作用さ
せたとき、マルトースとマルトトリオースを特異
的、且つ高収量で生産する新規で興味ある酵素活
性を示し、澱粉からマルトースとマルトトリオー
スをそれぞれ約40〜約50％含む新規な水飴が製造
できることを認めた。本発明はこのような知見に
基づいてなされたものである。 〔構成〕 すなわち、本発明は、澱粉を、主としてマルト
ースとマルトトリオースに分解する新規なα−ア
ミラーゼ酵素活性をもち、且つプルランをマルト
トリオースに分解する酵素活性をもつ新規なプル
ラナーゼ様複合酵素剤に関するものである。 以下に、本発明の内容を更に具体的に説明す
る。 本発明により生産される新規なα−アミラーゼ
活性をもつプルラナーゼ様酵素は、プルランを基
質とするとき、最終的に主としてマルトトリオー
スを生成するプルラナーゼ活性を示すが、同時
に、アミロース、アミロペクチン、グリコーゲン
などのα−１，４−グルコシド結合分解活性をも
ち、マルトースとマルトトリオースを主成分とし
て生成する興味ある新規な酵素剤であるが、この
プルラナーゼ活性とα−アミラーゼ活性は、硫安
分画、各種有機溶剤による分画、陰イオン交換体
による吸着クロマトグラフイー、ゲル濾過、無機
担体などへの吸着、などのタンパク質精製方法に
よつては分離されず、Sephadex Ｇ−200
（Pharmatia Fine Chemicals製）、Cellulofine
GC700ｍ（チツソ(株)製）やBiogel Ａ−0.5ｍ
（Bio−Rad Lab.製）などを用いたゲル濾過法に
より測定した分子量が45〜55万の高分子量である
（通常のプルラナーゼの分子量は10万前後）こと
から、それぞれの活性をもつ複数個のサブユニツ
トがかなり強固に結合し、複合酵素を形成してい
ることが考えられる（第３図はBiogel Ａ−1.5ｍ
によるα−アミラーゼ活性、プルラナーゼ活性及
びタンパク質の溶出曲線を示しているが、これら
三者の溶出パターンは完全に一致している）。 本発明により生産される酵素剤のプルラン分解
活性の酵素的性質を以下に記載する。 (1) 作用；プルランのα−１，６−グルコシド結
合を分解し、主としてマルトトリオースを生成
する。 (2) 作用温度及び最適作用温度；１％プルラン、
0.05Mトリス緩衝液（PH7.0）の下で30分間反
応したとき、約80℃まで作用し、最適作用温度
は60〜63℃（第２図）。 (3) 作用PH及び最適作用PH；１％プルラン、
0.05M緩衝液で測定したとき、PH約４〜約10の
広いPH範囲に作用する。第１図に示す通り、PH
約５とPH７〜7.5のピークが認められ、最適作
用PHは約５〜約7.5の広い範囲にあると考えら
れる（クエン酸−リン酸二ナトリウム緩衝液と
リン酸緩衝液、２％プルラン、55℃で30分間反
応）。 (4) 熱安定性；0.05Mトリス緩衝液（PH7.0）の
もとで各温度で10分間加熱後、プルランを基質
として残存活性を測定した。その結果50℃、10
分間の加熱までは殆んど失活が認められず、55
℃、10分の加熱で約30％失活した。そして、60
℃、10分間の加熱で約80％失活した。 (5) PH安定；0.1M緩衝液のもとで30℃で３時間
放置後、プルランを基質として残存活性を測定
した結果、PH約５〜約10で安定であつた。 (6) 阻害剤；１×10-3MのHgCl2、AgNO3で90
％以上阻害された。また同濃度のZnSO4により
約70％阻害された。 (7) 安定化剤；カルシウムイオンの存在下で熱安
定性が著しく増加する。１×10-2M塩化カルシ
ウムの存在下では、最適作用温度は約65℃に認
められた（１％プルラン、30分反応）。 (8) 精製方法；本酵素は液体培養物の培養濾過か
ら、リン酸カルシウムゲルに吸着させ、蒸溜水
で洗浄後、0.5MKClまたは、リン酸−カリウ
ム溶液で抽出し、次いで、DEAE−セフアロー
スカラムクロマトグラフイー、Biogel A1.5ｍ
によるカラムクロマトグラフイー、同カラムに
よる再クロマトグラフイー等により、クロマト
的及び電気泳動的に均一まで精製することがで
きる。 (9) 分子量；Biogel Ａ 0.5ｍで測定した分子量
は約55万であつた。 (10) 活性測定法；プルラナーゼの測定は0.1Mリ
ン酸緩衝液に溶解させた１％プルラン溶液（PH
7.0）0.5mlに適量の酵素を加え、水で全量１ml
とし、40℃で反応させる。この条件で１分間に
1μmolのグルコースに相当する還元力を生成す
る酵素量を１単位とした。 以上から明らかなように、本発明のプルラナー
ゼ活性はPH約５〜約7.5の極めて広いPH範囲に最
適作用PHが認められ、また、最適作用温度は60〜
63℃にある極めて熱安定性に優れた酵素であり、
本発明以前に知られているバシルス属のプルラナ
ーゼ〔例えば、Agric.Biol.Chem、40，1523
（1976）、（最適PH６〜6.5、最適温度50℃）、特公
昭59−39630（最適PH7.0、最適温度45℃）、特開昭
昭57−174089（最適PH3.5〜5.5、最適温度約60
℃）〕とは異なつた新規なプルラナーゼ様酵素で
あるということができる。 本発明において、例示菌として使用されるバシ
ルス・ズブチルスTU株の菌学的性質は下記の通
りであり、本菌は微工研条寄第684号として工業
技術院微生物工業技術研究所に寄託されている。 (1) 形態的性質； 桿菌で大きさ0.5〜0.7×0.8〜1.2μ、非運動
性、グラム陽性、胞子は球形、楕円形。 (2) 培養的性質； (a) 肉汁寒天斜面培養；表面スムースで生育良
好、培養後期は淡黄色を示す。 (b) グルコース肉汁寒天斜面培養；肉汁寒天培
養よりも生育劣る。 (c) 肉汁液体培養；生育はよくないが混濁を生
じ、沈降する。 (d) クエン酸寒天斜面培養；わずかに生育す
る。 (e) ペプトン−ゼラチン穿刺培養；ゆつくり液
化する。 (f) ミルク液体培養；カゼインを凝固し、次い
でペプトン化する。 (g) ポテト培養；生育はあまりよくない。 (3) 生化学的性質； (a) 硝酸塩の還元；陰性 (b) カタラーゼ；陽性 (c) チロシナーゼ；陰性 (d) インドール；生成しない (e) クエン酸の利用；陽性 (f) 硫化水素の生成；陽性 (g) ウレアーゼ；陰性 (h) 澱粉の加水分解；陽性 (i) 炭水化物の利用；Ｄ−グルコース、Ｄ−フ
ラクトース、Ｄ−マンノース、Ｄ−ガラクト
ース、シユークロース、マルトース、ラクト
ース、デンプン、デキストリン、グリコーゲ
ン、Ｄ−キシロース、Ｄ−アラビノース、Ｌ
−アラビノースなどの炭水化物から酸を生成
するが、ガスの発生は認められない。 (4) 生育PH及び生育温度； 本菌は、中性付近よりも、弱アルカリ性のPH
7.5〜8.5で良好に生育する。生育最適温度は35
〜45℃にあり、最高生育温度は約50℃である。 〔効果〕 本発明により生産される新規なプルラナーゼ様
酵素はプルランをマルトトリオースに分解するα
−１，６−グルコシド結合分解活性の他に、澱粉
などα−１，４−グルカンを主としてマルトース
とマルトトリオースに分解するα−アミラーゼ活
性をもつているため、この活性をもたないプルラ
ナーゼやイソアミラーゼなどに比べ、グルコアミ
ラーゼに併用して澱粉の糖化に使用する場合、澱
粉の糖化反応を促進し、且つ最終的なグルコース
の収量も、通常、0.5〜３％高く収得することが
できる。例えば、グルコアミラーゼ単独で30％濃
度の液化澱粉に作用させた場合、グルコースの収
量は94〜95％である。そして、グルコアミラーゼ
に市販のプルラナーゼを共存させた場合、グルコ
ースの収量は約96.5％であつたが、同一プルラナ
ーゼ活性の本発明の酵素剤を共存させた場合は
97.0〜97.5％の収量でグルコースが得られた、こ
のように、グルコースの収量が高いばかりでな
く、最高の糖化率に到達する時間も、本発明の酵
素剤を使用する場合、著しく短縮することができ
る。すなわち、このことはグルコアミラーゼの使
用量を節減できることを意味している。 また、本発明の酵素剤はアミロース、アミロペ
クチン、デンプン、グリコーゲンなどに作用させ
た場合、主として、マルトースとマルトトリオー
スを生成するが、本酵素がα−１，６−グルコシ
ド結合分解活性をもつているため、マルトースと
マルトトリオースを極めて高い収量で得ることが
できる。例えば、本酵素剤を液化デンプンに作用
させた時、マルトースとマルトトリオースは、い
ずれも約40〜約50％の高収量で得られる。マルト
ースとマルトトリオースをこのような糖組成で生
成するアミラーゼは未だ知られていない。本発明
の酵素剤を使用して得られるこのような糖化物は
マルトースとマルトトリオースの両方の特性をも
つものであり、甘味料、甘味調製剤、食品増量剤
など、種々の食品の添加剤として利用できるので
ある。また、本発明の酵素は、極めて熱安定性に
優れ、グルコアミラーゼの限界温度である60℃に
おいても長時間の反応を行うことができるばかり
か、PH4.5〜5.0のグルコアミラーゼの良好な作用
PH範囲でも好適に利用することができる。このよ
うに、本発明の酵素剤は種々の効果をもつ新規な
酵素剤である。 本発明のα−アミラーゼ活性をもつプルラナー
ゼ様酵素を生産するためには、窒素源として、ペ
プトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン、コー
ン・ステイープ・リカー、大豆類、魚粉のような
有機窒素源や、塩化アンモニウム、硝酸アンモニ
ウム、リン酸アンモニウムのようなアンモニウム
塩、硝酸ナトリウム、硝酸カリウムのような硝酸
塩あるいは尿素のような無機窒素源のいずれか、
または両方を使用する。 炭素源としては、通常、澱粉、デキストリン、
マルトース、グルコース等が使用される。そして
これに補足する栄養源として、リン酸塩、マグネ
シウム塩や、少量のマンガンや鉄化合物が添加さ
れる。 培養は、PH約５〜約９、温度25〜55℃で行なう
ことができるが、通常、PH７〜９、温度30℃前後
で２〜４日間好気的に行われる。該酵素は殆んど
菌体外に生産されるので、培養後、濾過または遠
心分離して除菌し、上澄液を回収する。そして、
必要に応じ濃縮し、硫酸アンモニウムや硝酸ナト
リウムなどにより塩析するか、または、アセト
ン、イソプロパノール、エタノール、メタノール
等の有機溶剤を加えて該酵素を沈澱物として回収
し、濃厚溶液として、または乾燥物として保存す
る。 本酵素を使用し、単独または、グルコアミラー
ゼやβ−アミラーゼなどと併用して、澱粉を糖化
する反応は、通常、PH４〜９、温度40℃〜70℃で
行われる。 以下に、実施例により本発明の詳細を説明す
る。 実施例 １ 大豆粒５％、コーン・ステイープ・リカー0.6
％、肉エキス0.3％、リン酸二カリ0.3％、硫酸マ
グネシウム0.1％、可溶性デンプン２％、尿素0.3
％、ソデイウム・ドデシルサルフエート0.1％、
硫酸銅５×10-5M、塩化マンガン2.5×10-6M、
塩化カルシウム１×10-3M、硫酸亜鉛１×
10-4M、硫酸鉄１×10-5Mからなる倍地（PH7.2）
30mlを200ml容三角フラスコに入れ、常法により
殺菌後、バシルス・ズブチルスTU（FERM BP
−684）を接種し、30℃で３日間振盪培養した。
培養後、遠心分離して得た上澄液中のプルラナー
ゼ活性は倍地１ml当り9.6単位であつた。またα
−アミラーゼ活性は培地１ml当は45.2単位であつ
た。 ここでα−アミラーゼ活性は以下のようにして
測定した。 0.1Mリン酸緩衝液に溶解させた１％可溶性澱
粉液（PH7.0）0.5mlに、適量の酵素を加え、水で
１mlとし、40℃で反応させる。この条件で１分間
に1μmolのグルコースに相当する還元力を生成す
る酵素量を１単位とした。 実施例 ２ 実施例１で使用した培地と同じ組成の培地で培
養した、バシルス、ズブチルスTU株（FERM
BP−684）の培養上澄250mlに、0.4Mリン酸二ナ
トリウム溶液及び0.4M塩化カルシウム溶液各150
mlを滴下しながら添加してリン酸カルシウムゲル
を形成させるとともに、これに酵素を吸着させ
た。次いで、ガラスフイルターで濾過して吸着物
に回収し、蒸溜水で充分洗浄後、0.5Mリン酸−
カリウム溶液200mlで酵素を溶出し、透析、濃縮
した。 次いで、2.5×10-3Mトリス緩衝液で緩衝化し
たDEAE−セフアロースカラムで処理し、同緩衝
液で流出する。プルラナーゼ活性区分を集め、濃
縮、透析後、2.5×10-3Mトリス緩衝液（PH7.0）
で緩衝化したBiogel Ａ 1.5ｍカラムでゲル濾過
を行い、活性区分を集め、同カラムで再クロマト
グラフイーを繰返した。第３図はBiogel Ａ 1.5
ｍカラム（1.5×87cm）による溶出曲線を示して
いる。精製された酵素はタンパク質曲線、プルラ
ナーゼ活性曲線及びα−アミラーゼ活性曲線は完
全に一致している。最終的に回収された酵素標品
のプルラナーゼ活性は585単位、そしてα−アミ
ラーゼ活性は1070単位であつた。 実施例 ３ 実施例２で調製した酵素剤を市販のグルコアミ
ラーゼと併用して澱粉の糖化反応を行つた。 基質としては、ポテト澱粉を市販液化酵素で液
化したDE7.7のものを使用した（グルコアミーゼ
と液化酵素は、天野製薬(株)、ノボ・ジヤパン(株)な
どより入手することができる）。 固形分として、各３ｇの液化澱粉に、グルコア
ミラーゼ（ノボ社製工業用酵素）を液化澱粉固形
分に対して、0.2％量と実施例２で調製した。本
発明の酵素剤または市販のプルラナーゼを加え、
１×10-2M塩化カルシウムの存在下、PH4.8〜5.0
で、57.5℃で糖化反応を行つた（各プルラナーゼ
剤は、前記の活性測定法において、リン酸緩衝液
の代りに、酢酸緩衝液を用い、PH5.0で測定する
以外は同じ条件で行ない、基質１ｇに対し、0.5
単位の酵素量を添加した）。得られた結果は第１
表及び第２表に示す通りであつた。
【表】
第１表は、糖化開始１、２、３、５と20時間目
におけるDE値（全糖中の還元糖をグルコースと
して表わした値）を示す。全糖はフエノール一硫
酸法で定量し、還元糖はフエリシアン化カリ法に
より定量した。表から明らかなように、本発明の
酵素剤を用いた場合、糖化開始初期における糖化
が促進されていることがわかる。 第２表は、糖化開始後、22時間、25時間と28時
間目の糖化物を高速液体クロマトグラフイーによ
り糖組成を分析した結果を示している。表から明
らかなように、本発明の酵素剤を用いた場合、最
高97.1％の収量でグルコースが得られた。また糖
化22時間目のグルコース収量から明らかなよう
に、糖化反応が著しく促進されていることがわか
る。
におけるDE値（全糖中の還元糖をグルコースと
して表わした値）を示す。全糖はフエノール一硫
酸法で定量し、還元糖はフエリシアン化カリ法に
より定量した。表から明らかなように、本発明の
酵素剤を用いた場合、糖化開始初期における糖化
が促進されていることがわかる。 第２表は、糖化開始後、22時間、25時間と28時
間目の糖化物を高速液体クロマトグラフイーによ
り糖組成を分析した結果を示している。表から明
らかなように、本発明の酵素剤を用いた場合、最
高97.1％の収量でグルコースが得られた。また糖
化22時間目のグルコース収量から明らかなよう
に、糖化反応が著しく促進されていることがわか
る。
【表】
実施例 ４
実施例３と同様にして、本発明の酵素剤を基質
ｇ当り0.5単位添加し、PH4.5〜5.3、温度55℃で糖
化した。糖化開始24時間後、２時間毎に生成した
グルコース収量を高速液体クロマトグラフイーに
より求めた。第３表は各糖化PHにおける最高値を
示したときのグルコース収量を示している。
ｇ当り0.5単位添加し、PH4.5〜5.3、温度55℃で糖
化した。糖化開始24時間後、２時間毎に生成した
グルコース収量を高速液体クロマトグラフイーに
より求めた。第３表は各糖化PHにおける最高値を
示したときのグルコース収量を示している。
【表】
表から明らかなように、本発明の酵素はPH4.5
〜５のグルコアミラーゼの最適作用PH条件下で効
果的に作用し、無添加の場合に比べグルコース収
量を約２％増加することができる。
〜５のグルコアミラーゼの最適作用PH条件下で効
果的に作用し、無添加の場合に比べグルコース収
量を約２％増加することができる。
第１図；プルランを基質としたときの最適PHを
示す。第２図；プルランを基質としたときの最適
温度を示す。第３図；Biogel Ａ 1.5ｍカラム
（1.5×87cm）によるプルラナーゼ活性、アミラー
ゼ活性及びタンパク質（280nｍにおける吸収）
の溶出曲線を示す。
示す。第２図；プルランを基質としたときの最適
温度を示す。第３図；Biogel Ａ 1.5ｍカラム
（1.5×87cm）によるプルラナーゼ活性、アミラー
ゼ活性及びタンパク質（280nｍにおける吸収）
の溶出曲線を示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 下記の理化学的性質を有するプルラナーゼ酵
素。 (1) 作用；プルランのα−１，６−グルコシド結
合を分解し、主としてマルトトリオースを生成
する。また、澱粉のα−１，４−グルコシド結
合を分解し、主としてマルトースとマルトトリ
オースを生成する。 (2) 最適PH；プルランに作用させたとき、PH約５
とPH７〜7.5にヒークが認められる。 (3) 最適温度；１％プルラン下で30分作用させた
とき、60〜63℃に認められる。 (4) 安定化；カルシウムイオンの存在により、熱
安定化される。 (5) 分子量が約55万である。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58785A JPS61162182A (ja) | 1985-01-07 | 1985-01-07 | プルラナ−ゼ様酵素剤 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58785A JPS61162182A (ja) | 1985-01-07 | 1985-01-07 | プルラナ−ゼ様酵素剤 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61162182A JPS61162182A (ja) | 1986-07-22 |
| JPH0369510B2 true JPH0369510B2 (ja) | 1991-11-01 |
Family
ID=11477855
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58785A Granted JPS61162182A (ja) | 1985-01-07 | 1985-01-07 | プルラナ−ゼ様酵素剤 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61162182A (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE69133526T2 (de) * | 1990-04-05 | 2006-09-07 | Kao Corp. | Reinigungsmittelzusammensetzung |
-
1985
- 1985-01-07 JP JP58785A patent/JPS61162182A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS61162182A (ja) | 1986-07-22 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |