JPH0424993B2

JPH0424993B2 -

Info

Publication number: JPH0424993B2
Application number: JP60000586A
Authority: JP
Inventors: Yoshuki Takasaki
Original assignee: Agency of Industrial Science and Technology
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 1985-01-07
Filing date: 1985-01-07
Publication date: 1992-04-28
Also published as: JPS61162197A

Description

【発明の詳細な説明】

〔技術分野〕本発明は、新規な澱粉糖酵素剤を用いた澱粉の
糖化法に関するものである。〔従来技術〕プルラナーゼはプルランのα−１，６−グルコ
シド結合を切断し、最終的にマルトトリオースを
生成する酵素であり、種々の細菌、放線菌などに
広く存在することが知られている。プルラナーゼ
はアミロペクチン、あるいはこれを含む澱粉に作
用させたとき、その分岐結合（α−１，６−グル
コシド結合）を切断してアミロース様多糖を生成
することから妖度反応の増加をともなうことが知
られているが、α−１，４−グルコシド結合は切
断することはできない。一方、α−１，４−グル
コシド結合を切断するα−アミラーゼやβ−アミ
ラーゼなどの各種アミラーゼはα−１，６−グル
コシド結合を切断することはできない。極めて、
まれな例外として、グルコアミラーゼは、α−
１，４−グルコシド結合のみでなく、α−１，６
−グルコシド結合も切断することができる。 α−１，６−グルコシド結合を切断する酵素に
はプルラナーゼの他に、イソアミラーゼ、Ｒ−酵
素、アミロー１，６−グルコシダーゼと呼ばれる
種々な酵素があり、総称してα−１，６−グルコ
シダーゼあるいは、一般に、枝切り酵素
（debranching enzyme）と呼ばれている。プルラナーゼなど枝切り酵素は、最近、β−ア
ミラーゼと組み合せて澱粉に同時に作用させるこ
とにより、マルトースを収量よく生産するのに使
用したり、また、グルコアミラーゼの分岐（α−
１，６−グルコシド結合）切断能力をおぎなうた
めに、グルコアミラーゼと併用することにより、
澱粉からグルコースを収量よく製造するために使
用される有用な酵素である。しかし、例えば、プルラナーゼをグルコアミラ
ーゼと併用するためには、グルコアミラーゼがPH
４〜５、温度55〜60℃に最適作用域をもつため
に、少なくとも55〜60℃で長時間使用できる熱安
定性をもち、且つPH４〜５で作用できる酵素であ
ることが要求される。しかるに、従来、知られている多くの枝切り酵
素は、一部の微生物のもの〔バシルス・ステアロ
サ−モフイラス（日本農芸化学会大会昭和47年度
講演要旨、第88頁）、バシルス・アシドプルリテ
イカス（特開昭57−174089号、starch、34、340
（1982））〕を除き、殆んどは最適作用温度が40〜
50℃付近にあつて、熱安定性に劣ることが欠点で
あつた。〔目的〕本発明者らは、前記目的にかなつた枝切り酵素
を開発することを目的として、広く自然界より微
生物の検索を行つてきた結果PH約５〜約7.5の広
いPH範囲に最適PHをもつ耐熱性のプルラナーゼ様
酵素がバシルス・ズブチルス（Bacillus
subtilis）TUと同定した細菌により生産させるこ
とを認めた。前記の細菌は、後述する菌学的性質を有し、微
工研条寄第684号として工業技術院微生物工業技
術研究所に寄託されている。本酵素はプルランに作用させたとき、殆んどマ
ルトトリオースに分解するα−１，６−グルコシ
ダーゼ活性を示すが、同時に、同酵素を澱粉など
に作用させた場合、主としてマルトースとマルト
トリオースに分解する新規なα−アミラーゼ活性
をもつている。そして、本酵素剤を、グルコアミ
ラーゼと併用して澱粉を糖化するとき、グルコア
ミラーゼ単独の場合よりも糖化反応が著しく促進
されるばかりか、最終的なグルコースの収量が
0.5〜３％増加できる極めて有用な酵素である。
そして、また、本発明の酵素剤のもつα−アミラ
ーゼ活性は、アミロース、アミロペクチン、澱
粉、グリコーゲンなどに使用させた場合、マルト
ースとマルトトリオースを約40〜約50％の高収量
で生成する興味ある新規な酵素活性である。これ
は、本酵素剤がα−１，６−グルコジド結合を分
解する酵素活性を併せて保持しているため、アミ
ロペクチンや澱粉のように分岐結合をもつ基質か
らも、マルトースとマルトトリオースが極めて高
い収量で得られるものと考えられる。本発明はこ
のような知見にもとづいてなされたものである。〔構成〕本発明は、澱粉又は液化澱粉に、バシルス属細
菌の生産する新規なα−アミラーゼ活性をもつプ
ルラナーゼ様酵素剤を、単独に使用することから
なる澱粉の糖化方法に関するものである。以下
に、本発明の内容を更に具体的に説明する。本発明において使用されるα−アミラーゼ活性
をもつ新規なプルラナーゼ様酵素剤は、プルラン
を基質とするとき、最終的に主としてマルトトリ
オースを生成するプルラナーゼ活性を示すが、同
時に、アミロース、アミロペクチン、グリコーゲ
ンなどのα−１，４−グルコシド結合分解活性を
もち、マルトースとマルトトリオースをほぼ等量
に、且つ主成分として生成するα−アミラーゼ活
性をもつ、興味ある新規な酵素剤であるが、この
プルラナーゼ活性とα−アミラーゼ活性は、硫安
分画、各種有機溶剤による分画、陰イオン交換体
による吸着クロマドグラフイー、ゲル濾過、無機
担体などへの吸着などのタンパク質精製方法によ
つては分離されず、SephadexG−200
（Phermacia Fine Chemicals製）、Cellulofine
GC700ｍ（チツソ(株)製）やBiogel A0.5ｍ（Bio
−Rad Lad.(株)）などを用いたゲル濾過法により
測定した分子量が45〜55万の高分子量である（通
常のプルラナーゼの分子量は10万前後）であるこ
とから、それぞれの活性をもつ複数個のサブユニ
ツトがかなり強固に結合し、複合酵素を形成して
いることが考えられる（第３図はBiogel A1.5ｍ
によるα−アミラーゼ活性、プルラナーゼ活性及
びタンパク質の溶出曲線を示してるが、これら三
者の溶出パターンは完全に一致している）。本発明により生産される酵素のプルラン分解活
性の酵素的性質を以下に記載する。 (1) 作用；プルランのα−１，６−グルコシド結
合を分解し、主としてマルトトリオースを生成
する。 (2) 作用温度及び最適作用温度；１％プルラン、
0.05Mトリス緩衝液（PH7.0）の下で30分間反
応したとき、約80℃まで作用し、最適作用温徳
は60〜63℃（第２図）。 (3) 作用PH及び最適作用PH；１％プルラン、
0.05M緩衝液で測定したとき、PH約４〜約10の
広い範囲に作用する。第１図に示す通り、PH５
付近とPH７〜7.5にピークが認められ、最適作
用PHは約５〜約7.5の広い範囲にあると考えら
れる（第１図、クエン酸−リン酸ニナトリウム
緩衝液とリン酸緩衝液、２％プルラン、55℃で
30分間反応）。 (4) 熱安定性；0.05Mトリス緩衝液（PH7.0）の
もとで各温度で10分間加熱後、プルランを基質
として残存活性を測定した。その結果、50℃、
10分間の加熱までは殆んど失活が認められず、
55℃、10分間の加熱で約30％失活した。そし
て、60℃、10分間の加熱で約80％失活した。 (5) PH安定性；0.1M緩衝液のもとで30℃で３時
間放置後、プルランを基質として残存活性を測
定した結果、PH約５〜約10で安定であつた。 (6) 阻害剤；１×10^-3MのHgCl₂、AgNO₃で90
％以上阻害された。また同濃度のZnSO₄により
約70％阻害された。 (7) 安定化剤；カルシウムイオンの存在下で熱安
定性が著しく増加する。１×10^-2M塩化カルシ
ウムの存在下では、最適作用温度は約65℃に認
められた（１％プルラン、30分反応）。 (8) 精製方法；本酵素は液体培養物の培養瀘液か
ら、リン酸カルシウムゲルに吸着させ、蒸溜水
で洗浄後、0.5M KClまたはリン酸−カリウム
溶液で抽出し、次いで、DEAE−セフアロース
カラムクロマトグラフイー、Biogel A1.5ｍ
によるカラムクロマトグラフイー、同カラムに
よる再クロマトグラフイー等により、クロマト
的及び電気泳動的に均一までに精製することが
できる。 (9) 分子量；Biogel A0.5ｍで測定した分子量は
約55万であつた。 (10) 活性測定法；プルラナーゼ活性の測定は、
0.1Mリン酸緩衝液に溶解させた１％プルラン
溶液（PH7.0）0.5mlに適量の酵素を加え、水で
全量１mlとし、40℃で反応させる。この条件で
１分間に1μmolのグルコースに相当する還元力
を生成する酵素量を１単位とした。以上から明らかなように、本発明のプルラナー
ゼ活性はPH約５〜約7.5の極めて広い範囲に最適
作用PHが認められ、また、最適作用温度は60〜63
℃にある極めて熱安定性の優れた酵素であり、本
発明以前に知られているバシルス属のプルラナー
ゼ〔例えば、Agric.Biol.Chem.40、1523（1976）
（最適PH６〜6.5、最適温度50℃）、特公昭59−
39630号（最適PH7.0、最適温度45℃）、特開昭57
−174089号（最適PH3.5〜5.5、最適温度約60℃）〕
とは違つた新規なプルラナーゼ様酵素であるとい
うことができる。本発明において例示菌として使用されるバシル
ス、ズブチルスTU株の菌学的性質は下記の通り
であり、本菌は微工研条寄第684号として工業技
術院微生物工業技術研究所に寄託されている。 (1) 形態的性質；桿菌で大きさが0.5〜0.7×0.8〜1.2μ、非運動
性、グラム陽性、胞子は球形〜楕円形。 (2) 培養的性質； (a) 肉汁寒天斜面培養；表面スムースで生育良
好、培養後期は淡黄色を示す。 (b) グルコース肉汁寒天斜面培養；肉汁寒天培
養よりも生育劣る。 (c) 肉汁液体培養；育成はよくないが、混濁を
生じ、沈降する。 (d) クエン酸寒天斜面培養；わずかに生育す
る。 (e) ペプトン−ゼラチン穿刺培養；ゆつくり液
化する。 (f) ミルク液体培養；カゼインを凝固し、次い
でペプトン化する。 (g) ポテト培養；生育はあまりよくない。 (3) 生化学的性質； (a) 硝酸塩の還元；陰極 (b) カタラーゼ；陽性 (c) チロシナーゼ；陰極 (d) インドール；生成しない (e) クエン酸の利用；陽性 (f) 硫化水素の生成；陽性 (g) ウレアーゼ；陰性 (h) 澱粉の加水分解；陽性 (i) 炭水化物の利用；Ｄ−グルコース、Ｄ−フ
ラクトース、Ｄ−マンノース、Ｄ−ガラクトー
ス、シユークロース、マルトース、ラクトー
ス、デンプン、デキストリン、グリコーゲン、
Ｄ−キシロース、Ｄ−アラビノース、Ｌ−アラ
ビノースなどの炭水化物から酸を生成するが、
ガスの発生は認められない。 (4) 生育PH及び生育温度；本菌は、中性付近よりも、弱アルカリ性のPH
7.5〜PH8.5で良好に生育する。生育最適温度は
35〜45℃にあり、最適生育温度は約50℃であ
る。〔効果〕本発明において使用される新規なα−アミラー
ゼ活性をもつプルラナーゼ様酸素剤は、プルラン
をマルトトリオースに分解するα−１，６−グル
コシド結合分解活性の他に、アミロース、アミロ
ペクチンやグリコーゲンなどに存在するα−１，
４−グルコシド結合を分解して、マルトースやマ
ルトトリオースを生成するα−アミラーゼ活性を
もつている。本発明の酵素はアミロース、アミロペクチン、
デンプン、グリコーゲンなどに作用させた場合、
主として、マルトースとマルトトリオースを生成
するが、本酵素がα−１，６−グルコシド結合分
解活性をもつているため、マルトースとマルトト
リオースを極めて高い収量で得ることができる。
例えば、本酵素剤を液化デンプンに作用させたと
き、マルトースとマルトトリオースは、いずれも
約40〜約50％の高収量で得られる。マルトースと
マルトトリオースをこのような糖組成で生成する
アミラーゼは、未だ知られていない。本発明の酵
素剤を使用して得られるこのような糖化物はマル
トースとマルトトリオースの両方の特性をもつも
のであり、甘味料、甘味調整剤、食品増量剤な
ど、種々の食品の添加剤として利用できるもので
ある。また、本発明で使用される酵素は、極めて
熱安定性に優れた酵素であり、グルコアミラーゼ
の作用最適かつ限界温度である60℃においても長
時間の反応をおこなうことができるばかりか、PH
4.5〜5.0のグルコアミラーゼの良好な作用PH範囲
でも好適に利用することができる。このように、本発明において使用される酵素を
用いれば、澱粉の糖化において種々の効果をもた
らすものである。本発明のプルラナーゼ様酵素剤を生産するため
には、窒素源として、ペプトン、肉エキス、酵母
エキス、カゼイン、コーン・ステイープ・リカ
ー、大豆粕、魚粉のような有機窒素源や、塩化ア
ンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニ
ウムのようなアンモニウム塩、硝酸ナトリウム、
硝酸カリウムのような硝酸塩あるいは尿素のよう
な無機窒素源のいずれか、または両方を使用す
る。炭素源としては、通常、澱粉、デキストリン、
マルトース、グルコース等が使用される。そして
これに補足する栄養源として、リン酸塩、マグネ
シウム塩や、微量のマンガンや鉄化合物が添加さ
れる。倍養は、PH約５〜約９、温度25〜55℃で行
なうことができるが、通常、PH７〜９、温度30℃
前後で２〜４日間好気的に行われる。該酵素は殆
んど菌体外に生産されるので、培養後、濾過また
は遠心分離して除菌し、上溶液を回収する。そし
て、必要に応じ濃縮し、硫酸アンモニウムや硫酸
ナトリウムなどにより塩析するか、または、アセ
トン、イソプロパノール、エタノール、メタノー
ル等の有機溶剤を加えて該酵素を沈澱物として回
収し、濃厚溶液として、または乾燥物として保存
する。本酵素を使用し、単独又は、グルコアミラー
ゼ、β−アミラーゼなど、各種アミラーゼと併用
して、澱粉を糖化する反応は、通常、PH４〜９、
温度40℃〜70℃で行われる。以下に、実施例により本発明の詳細を説明す
る。実施例１大豆粕５％、コーン・ステイープ・リカー0.6
％、肉エキス0.4％、リン酸二カリ0.3％、硫酸マ
グネシウム0.1％、可溶性澱粉２％、尿素0.3％、
ソデイウム・ドデシルサルフエート0.1％、硫酸
銅５×10^-5M、塩化マンガン2.5×10^-6M、塩化
カルシウム１×10^-3M、硫酸亜鉛１×10^-4、硫酸
鉄×10^-5Mからなる培地（PH7.2）30mlを200ml容
三角フラスコに入れ、常法により殺菌後、バシル
ス、ズブチルスTU株（FERM BP−684）を接
種し、30℃で３日間振盪培養した。培養後、遠心
分離して得た上澄液中のプルラナーゼ活性は培地
１ml当り9.6単位であつた。またα−アミラーゼ
活性は培地１ml当り45.2単位であつた。ここでα−アミラーゼ活性は以下のようにして
測定した。 0.1Mリン酸緩衝液に溶解させた１％可溶性澱
粉液（PH7.0）0.5mlに、適量の酵素を加え、水で
全量１mlとし、40℃で反応させる。この条件で１
分間に1μmolのグルコースに相当する還元力を生
成する酵素量は１単位とした。実施例２実施例１で使用した培地と同じ組成の培地で培
養した、バシルス、ズブチルスTU株（FERM
BP−684）の培養上澄250mlに、0.4Mリン酸ナト
リウム溶液及び0.4M塩化カルシウム溶液各150ml
を滴下しながら添加してリン酸カルシウムゲルを
形成させるとともに、これに酵素を吸着させた。
次いで、ガラスフイルターで濾過して吸着物を回
収し、蒸溜水で充分洗浄後、0.5Mリン酸一カリ
ウム溶液200mlで酵素を溶出し、透析、濃縮した。次いで、2.5×10^-3Mトリス緩衝液（PH7.0）で
緩衝化したDEAE−セフアロースカラムで処理
し、同緩衝液で流出するプルラナーゼ活性区分を
集め、濃縮、透析後、2.5×10^-3Mトリス緩衝液
（PH7.0）で緩衝化したBiogel Al1.5ｍカラムでゲ
ル濾過を行い、活性区分を集め、同カラムで再ク
ロマトグラフイーを繰返した。第３図はBiogel
A1.5ｍカラム（1.5×87cm）による溶出曲線を示
している。精製された酵素はタンパク質曲線、プ
ルラナーゼ活性曲線及びα−アミラーゼ活性曲線
は完全に一致している。最終的に回収された酵素
標品のプルラナーゼ活性は585単位、そしてα−
アミラーゼ活性は1070単位であつた。実施例３実施例２で調製した酵素（プルラナーゼ活性と
して１単位）を、DE4.2の液化デンプン（固形分
として１ｇ）に加え、含量10mlとし、PH７付近に
維持しながら50℃で２日間反応した。反応終了
後、糖化物の糖組成を、高速液体クラマトグラフ
法により測定した結果は第１表に示す通りであ
る。

【表】表から明らかなように、得られた糖化物の糖組
成はマルトースとマルトトリオースが主成分であ
り、いずれも約40％を占めているものであつた。実施例４可溶性澱粉１ｇに、実施例１で調製したバシル
ス・ズブチルスTU株（FERM BP−684）の培
養液をプルラナーゼ活性として0.5単位加え、水
で生量10mlとし、PH７、温度50℃で２日間反応し
た。反応後、糖化液の糖組成を高速液体クロマト
グラフで分析した結果は第２表に示す通りであつ
た。

【表】実施例５ DE4.2の液化澱粉２ｇに市販の植物製β−アミ
ラーゼ500単位を加え、全量を水で10mlとし、55
℃で20時間反応した。得られた糖化液の糖組成は
グルコース1.1％、マルトース52.5％、マルトト
リオース4.9％、その他の糖41.5％であつた。この糖化液の１部（固形分として１ｇ）に、実
施例１で調製した酵素液を、プルラナーゼ活性と
して１単位加え、50℃で24時間反応した。得られ
た糖化液の糖組成は、グルコース4.6％、マルト
ース60.5％、マルトトリオース30.9％とその他の
糖4.0％であつた。

【図面の簡単な説明】

第１図；プルランを基質としたときの最適PHを
示す。第２図；プルランを基質としたときの最適
温度を示す。第３図；BiogelA1.5ｍカラム（1.5
×87cm）によるプルラナーゼ活性、アミラーゼ活
性及びタンパク質（280nｍにおける吸収）の溶
出曲線を示す。

Claims

【特許請求の範囲】１澱粉又は液化澱粉に、バシルス属細菌が生産
し、澱粉を、マルトースとマルトトリオースに分
解する新規なα−アミラーゼ活性をもつプルラナ
ーゼ様複合酵素剤を作用させることを特徴とする
澱粉の糖化法。２バシルス属細菌が、バシルス・ズブチルス
TU株（微工研条寄第684号）である特許請求の
範囲第１項記載の澱粉の糖化法。