JPH0370182B2 - - Google Patents

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JPH0370182B2
JPH0370182B2 JP61090202A JP9020286A JPH0370182B2 JP H0370182 B2 JPH0370182 B2 JP H0370182B2 JP 61090202 A JP61090202 A JP 61090202A JP 9020286 A JP9020286 A JP 9020286A JP H0370182 B2 JPH0370182 B2 JP H0370182B2
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angstrom units
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Ii Ramusuden Hagu
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Description

【発明の詳細な説明】
本発明に従えば、平均粒径約３〜約70ミクロン
及び平均孔寸法約50〜約1000オングストローム単
位を有する微粒シリカゲル又は平均粒径約37〜約
177ミクロン及び平均孔寸法約40〜約1000オング
ストローム単位を有する微粒状の孔の抑制された
ガラス（CPG）と、約400〜約1800の平均分子量
を有するポリエチレンイミノプロピルトリメトキ
シシラン（PEI−Pr−triMeO−シラン）との共
有結合非架橋ポリエチレンイミン反応生成物が、
アシル官能基が末端カルボニルを有していない酸
ハロゲン化物又は酸無水物でＮ−アシル化され、
生じるアシルかされたPEI−PrSi−シリカゲル及
びPEI−PrSi−CPG生成物は夫々蛋白質の精製及
び分離の為の液体クロマトグラフイのカラム充填
剤として適した固相として有用である。 （従来の技術） アルバート及びレグニアーはJ.
Chromatogr.185、375−392（1979）でポリエチレ
ンイミン（PEI）がシリカ表面に吸着出来それに
よつて隣接する吸着されたPEI分子上に十分な第
１級及び第２級イミノ基を与え、これが多官能オ
キシランによつて重合層に架橋されることを示し
ている。最近では、高性能液体クロマトグラフイ
ー（HPLC）を使用し、架橋されたポリエチレン
イミンで被覆された微粒子シリカのカラムで合成
オリゴヌクレオチドを分離することがT.G.ロウ
ソン等、Anal.Biochem.133、85−93 1983に文献
に報告されている。これに対して、本発明は、上
に吸着されるのではなく、非架橋性のポリエチレ
ンイミノプロピルシランが共有結合されている多
孔性のシリカ又はガラス支持体を提供するもので
あり、そのイミノ及びアミノ官能基は末端が非カ
ルボキシル化されたアシル部分でアシル化されて
いる。 （問題を解決する為の手段） 本発明は「ポリエチレンイミン結合クロマトグ
ラフ充填剤」という名称の特開昭60−135761号の
41983年11月25日米国出願番号555368中において
共同発明者の一人であるフグ ラムスデンによつ
て記載され、そして上記米国出願に基づいて優先
権主張をしている本発明者の出願している同じ題
名の1984年11月14日出願の南アフリカ特許出願
84／8886に記載されている）共有結合非架橋PEI
−PrSi−シリカゲル及びPEI−PrSi−CPG生成物
のアシル化された改良を提供するものである。 上記の出願はここで参照する。ラムスデンの
PEI−PrSi−シリカゲル生成物も米国特許
4469630に記載されている。 本発明にしたがつてアシル化されるべき基質を
ラムスデンの非架橋性共有結合去れたPEI−PrSi
−シリカゲル及びPEI−PrSi−CPG製品が構成し
ているので、上記の出願のラムスデンの関連のあ
る抜粋をここに再び記載する。 ［特開昭60−135761の抜粋］ 該発明の非架橋共有結合PEIシリカゲル及びガ
ラス生成物は次の段階によつて都合よく生成され
る。 Ａ 平均粒径約３〜約70ミクロン及び平均孔寸法
約50〜約1000オングストローム単位を有する微
粒シリカゲル又は平均粒径約37〜約177ミクロ
ン及び平均孔寸法約40〜約1000オングストロー
ム単位を有する微粒状の孔の制御されたガラス
のいずれかを、不活性有機溶媒スラリー中で、
約400〜約1800の平均分子量を有するポリエチ
レンイミノプロピルトリメトキシシランの低級
アルカノール性溶液と約２〜約50時間環境温度
〜還流温度で反応させ、 Ｂ 生じる固体フラクシヨンを反応混合物から回
収し、 Ｃ 上記固体フランクシヨンを乾燥し且つシラン
をそれぞれシリカゲル又は孔の制御されたガラ
スに完全に結合するのに十分な温度及び時間で
加熱する。 本明細書で使用する「共有結合」又は「共有結
合された」という用語は、PEI部分がシリカゲル
又は孔の制御されたガラスに化学的相互作用によ
つて共有的に結合されていて、プロピル−シリル
（Pr−Si）の結合を生じていることを意味し、
「非架橋」という用語は隣接する共有結合した
PEI部分上のイミノ及びアミノ基が架橋していな
い又は架橋剤と反応し、重合層を形成していない
ことを意味する。 次に通りになるとは限らないが反応は次のよう
に２段階で終了すると考えられる。 段階１ シラン上のシリカヒドロキシル及びメト
キシ基が反応してSi−Ｏ−Si結合及び遊離メタ
ノールを形成し、幾らかの残留メトキシ基が未
反応のままでいる。 段階２ 残留メトキシ基との反応の完結がａ）及
びｂ）による熱硬化の間に行なわれる。 無定形のシリカからなるシリカゲルは、不規則
及び球状（好ましい）の微粒形で市販されてお
り、また幾つかの商品等級で得られ、メツシユ寸
法が３−325（ASTM）の範囲である。数字的な
メツシユ寸法の表示に頼るよりも、本発明の為の
より正確な指標はシリカゲルの微粒の平均粒径及
び平均孔寸法が夫々約３〜70ミクロン及び約50〜
約1000、好ましくは約250〜500オングストローム
単位のものである。HPLCクロマトグラフカラム
充填に使用する最終製品のためには、約３〜約10
ミクロンのシリカゲル出発物質が好ましく、低圧
クロマトグラフイーカラム充填用には約40〜約70
ミクロンがこのましい。 液体クロマトグラフイーに使用する為に化学的
にシリカに似ているシリケート含有支持物質であ
るところの孔の制御されたガラス（CPG）は市
販されており、例えばピースケミカルカンパニ
ー、ロツクフオード、イリノイから得ることが出
来、平均粒径が30〜177ミクロンそして平均孔寸
法が40〜1000オングストローム、好ましくは40〜
500オングストロームである。 シリカゲル又はCPGスラリーを調製するのに
適した不活性有機溶媒のなかで脂肪族炭化水素例
えば、ヘキサン、ヘプタンなど、芳香族炭化水素
例えば、ベンゼン、トルエン、キシレンなど、低
級アルカノール類例えば、エタノール、イソプロ
パノール、ブタノールなど、塩素化メタン、例え
ば塩化メチレン、クロロホルム、四塩化炭素など
（注意そのようなクロロ溶媒は高温で反応するか
もしれない）、及びテトラヒドロフラン、グライ
ム（グリコールジメチルエーテル）、ジグライム
（ジエチレングリコールジメチルエーテル）など
の他の不活性溶媒が適している。一般に溶媒mlに
対しシリカゲル又はCPGのグラム１：５の比が
適当なスラリーを与える。シリカゲル及びCPG
微粒の細かく不溶性である性質の為に真の溶液で
なくスラリーが得られる。 （Ｎ−トリメトキシシリルプロピル）−ポリエ
チレンイミンとしても知られているポリエチレン
イミノプロピルトリメトキシシランはポリエチレ
ンイミンとアミノプロピルトリメトキシシランと
の反応生成物で次の式によつて記載される。 ここで本発明の目的にはｎは約４〜37の整数又
は平均分子量で表現すると約400〜1800である。 シラン（１）は反応中でシリカゲルまたは
CPGとの反応中に於いてシランを可溶化させる
為の十分なアルカノールを使用して低級C1〜C6
アルカノール溶液の形で使用される。50％（w/
ｗ）のイソプロパノール溶液が好ましい。一般に
約25〜1000ｇのシラン又はこれに代わつて約50〜
200mlの50％（w/w）シランのアルカノール溶液
が各100ｇのシリカゲル又はCPGと反応するのに
使用される。反応は環境温度で実施できるが反応
溶媒系の還流までの高温を反応速度を強めるため
に使用することが出来る。反応は実質的な完了
（段階１）迄に容易に２〜50時間内に進行する。
反応体の混合中に撹はんをするのが有利である
が、その後の反応は更に撹はんすることなしに続
き得る。無水の条件は臨界的でなく、小量の水即
ち約0.1〜1.0ml／スラリー溶媒50mlの存在が反応
に悪影響を与えないことが見いだされている。 生じる固体フラクシヨンは反応混合物から慣用
の物理的手段例えばろ過、遠心分離などによつて
回収される。一般にろ過手段は粒径５ミクロンを
保持するのに十分なものであるのに対し、遠心は
３ミクロンの粒子寸法に適している。 回収された固体フラクシヨンは次に、乾燥、そ
してシランとシリカゲル又はCPGの完全な共有
結合に十分な温度及び時間で熱硬化される。一般
に約40〜120℃に於ける１−４時間が十分である
ことが分かつた。このようにして得られた共有結
合し、非架橋の最終生成物は好ましくは約0.5〜
約3.8％の窒素を含有している。 ［以上で特開昭60−135761の抜粋終り］ 該記載中、シリカゲルとCPGの平均粒径と平
均孔寸法範囲は、単にクロマトグラフイに通常使
用されるという理由で定義されるにすぎないが、
本発明に於いても同じである。 本発明に於てラムスデンの上記の非架橋、共有
結合されたPEI−PrSi−シリカゲルとPEI−PrSi
−CPG生成物のイミノ及びアミノ官能基がアシ
ル化剤として適当な酸ハロゲン化物及び酸無水物
でＮ−アシル化出来、式Ｒ−CO−（式中ＲはC1〜
C8アルキル、フエニル、アラルキル、及びC1〜
C4アルキル、C1〜C4アルコキシ、ハロ及びニト
ロからなる群から選ばれる１又はそれ以上の置換
基で置換されたフエニルからなる群から選ばれる
一員である）を有するアシル官能基を提供できる
ことが分かつた。「ハロ」という用語はブロモ、
クロロ、フルオロ及びヨードを含む。「アラルキ
ル」という用語はベンジル、１−フエネチル、２
−フエネチル、α−ナフチル等を含む。 慣用の元素分析によつて容易に決定することが
できるPEI−PrSi−シリカゲル又はPEI−PrSi−
CPG基質中の窒素％はPEI部分上のイミノ及びア
ミノ官能基の相対的な一緒にした合計を示すもの
である。十分なアシル化剤をPEI部分のイミノ及
びアミノ官能基の実質的な全てと反応させるのに
使用する。一般にＮ−アシル化段階は不活性の中
性有機溶媒中で当量又は僅かに過剰のアシル化剤
で容易に達成できる。典型的なアシル化剤には塩
化アセチル、無水酢酸、塩化プロピオニル、無水
プロピオン酸、塩化ブチリル、塩化ヘキサノイ
ル、塩化オクタノイル、塩化ベンゾイル、ｐ−ニ
トロベンゾイルクロライド、３，５−ジニトロベ
ンゾイルクロライド、ｏ−、ｍ−及びｐ−メトキ
シベンゾイルクロライド、ｏ−、ｍ−及びｐ−ク
ロロベンゾイルクロライド、２，４，６−トリク
ロロベンゾイルクロライド、ｏ−、ｍ−及びｐ−
メチルベンゾイルクロライド、フエニルアセチル
クロライドその他が含まれる。典型的な中性溶媒
には芳香族炭化水素、例えばベンゼン、トルエ
ン、キシレンなど、エーテル、例えばテトラヒド
ロフラン、ジオキサンなど、及び脂肪族炭化水
素、例えばヘキサン、ヘプタンなどが含まれる。
当量又は僅かに過剰の酸スカベンジヤー例えば第
三級アミン、好ましくは第三級アルキルアミンを
使うのが有利で、アシル化反応中に放出された酸
を取上げる。 従つて本発明はシリカゲル又は孔が抑制された
ガラスにプロピルシリル（Pr−Si−）結合によ
つて共有結合された非架橋ポリエチレンイミン
（PEI）官能基を提供し、ここで実質的に全て、
即ち80％を越える、そして好ましくは90％を越え
るPEI部分のイミノ及びアミノ官能基が前に定義
した通りの式Ｒ−CO−を有するアシル官能基で
アシル化されている。 より詳しくは本発明は平均粒径約33〜約70ミク
ロン及び平均孔寸法約50〜約1000オングストロー
ム単位を有する微粒シリカゲル又は平均粒径約37
〜約177ミクロン及び平均孔寸法約40〜約1000オ
ングストローム単位を有する微粒状の孔の抑制さ
れたガラスと、約400〜約1800の平均分子量を有
するポリエチレンイミノプロピルトリメトキシシ
ランとのＮ−アシル化された共有結合、非架橋ポ
リエチレンイミン反応生成物［但し、Ｎ−アシル
官能基が式Ｒ−CO−を有し、ここでＲはC1〜C8
アルキル、フエニル、アラルキル及びC1〜C4ア
ルキル、C1〜C4アルコキシ、ハロ及びニトロか
らなる群から選ばれる１又はそれ以上の置換基で
置換されたフエニルからなる群から選ばれる一員
である］を提供する。 本発明のＮ−アシル化されたPEI−PrSi−シリ
カゲル又はPEI−PrSi−CPG生成物はカラムクロ
マトグラフイによる蛋白質の精製及び分離の為の
新規でかつ有用な結合相を構成し、そして近代的
HPLC装置とともに使用するのに特に適してい
る。充填材は種々のメツシユ寸法のもの、例えば
約50〜約600メツシユのものでよい。 好ましいＮ−アシル化されたPEI−PrSi−シリ
カゲル生成物は平均粒寸法約５〜約40ミクロン及
び平均孔寸法約50〜約330オングストローム単位
を有する微粒状のシリカゲルと、平均分子量約
400〜約600を有するポリエチレンイミノプロピル
トリメトキシシランとの反応生成物から得られる
もの及び、平均及び平均粒寸法約40〜約62μ及び
平均孔寸法約250〜約500オングストローム単位を
有する微粒状のシリカゲルと平均分子量約1000を
有するポリエチレンイミノプロピルトリメトキシ
シランから得られるものである。 本発明のＮ−アシル化されたPEI−PrSi−シリ
カゲル及びPEI−PrSi−CPG生成物は弱い疎水相
互作用に基づいて蛋白質を分離すると信じられ
る。これに基づいて分離する現在入手可能なクロ
マトグラフイーマトリツクは貧弱な選択性を有す
る巾の広いピーク、そして蛋白質の定量的でない
回収を一般に与えるから、本発明の製品で蛋白質
を分離する顕著な利点は驚くべきもの及び普通で
ないものと看される。現在入手可能なものに対し
て、本発明のクロマトグラフイーマトリツクスは
良好な選択性と、蛋白質の量の損失、そして酵素
分離の場合には酵素活性の重大な損失なしに定量
的な回収とをもつて鋭い良く決定できるピークを
与える。 このような高いイオン強度の水性溶液中では、
シリカの固有の溶解特性の為に、疎水相互作用の
クロマトグラフイについて使用される水性の高い
イオン強度移動相中で、ここに記載されるクロマ
トグラフイマトリツクスが加水分解に不安定なこ
とが通常は予想されることに鑑みて、本発明は更
にもつて驚異的なものである。このようにシリカ
に基づくマトリツクスが短いカラム寿命を必然的
に生じることが通常は予想されるが、本発明のＮ
−アシル化されたPEI−PrSi−シリカゲル及び
PEI−PrSi−CPG生成物についてはこの逆とな
る。 実施例17に説明されるように本発明のクロマト
グラフイーマトリツクスを充填したHPLCカラム
はカラムの性能品質における非常に少ない変化し
か生じずに移動緩衝液相で1000時間を越えて使用
可能である。 従つて本発明に従つて、平均粒直径約３〜70ミ
クロン及び平均孔寸法約50〜1000オングストロー
ム単位を有する微粒状のシリカゲル、又は又は平
均粒径約37〜約177ミクロン及び平均孔寸法約40
〜約1000オングストローム単位を有する微粒状の
孔の抑制されたガラスと、約400〜約1800の平均
分子量を有するポリエチレンイミノプロピルトリ
メトキシシランとのＮ−アシル化された共有結
合、非架橋ポリエチレンイミン反応生成物であつ
て、Ｎ−アシル化された部分が上に定義された式
Ｒ−CO−を有するもので充填した液体クロマト
グラフイに適したクロマトグラフイカラムが提供
される。 次の実施例は例示の為に提供され本発明を制限
するものではない。 製造例 １ ジエーテイーベーカーケミカルカンパニー、フ
イリツプスバーク、ニユージヤージーにより、
「シリカゲル＃7024」として不規則形で市販され
ている平均粒径40ミクロン及び平均孔寸法60オン
グストロームを有するシリカゲル10ｇの50mlトル
エン中のスラリーに、撹はんしながら平均分子量
400〜600（推定500）を有しペトラルチシステムイ
ンコーポレーテツド、ブリストル、PA.から“Ｎ
−トリメトキシシリルプロピル）−ポリエチレン
イミンPS076”として市販されているポリオキシ
エチレンイミノプロピルトリメトキシシランの50
％（w/w）イソプロパノール溶液19.71ｇを加え
る。混合物を室温（25℃）で約１時間10分撹はん
し次に一夜（17時間）撹はんなしに放置する。撹
はんを再度更に５時間40分室温で開始し、次に再
度混合物を一夜放置する。混合物を次に中程度に
フリツト化されたガラスフイルター上でろ過す
る。ろ液を50mlのトルエンで２度そして50mlのメ
タノールで２度洗浄しいかなる過剰のシラン反応
体も確実に除去し、次に80〜85℃で約３時間30分
オーブン乾燥し、約12ｇの共有結合したPEI−シ
リカゲル製品約3.9％Ｎを生成する。 B.製造例1Aの手順を繰り返すが但し１mlの水を
シリカゲル／シラン混合物に加える。PEI結合シ
リカゲル製品の収量は約13.3ｇ；約5.5％Ｎ。 製造例 ２ 平均粒径5.25ミクロン及び平均孔寸法330オン
グストロームを有し、カリフオルニア州ヘスペリ
アのザセツプＡ Raタイオンズグループから商
品名“Vydac Ａ”カタログNo.101TPB5の商品名
で球状のシリカとして市販されている20ｇのシリ
カゲルの100mlトルエン及び２mlの水中のスラリ
ーを調製しそして10分間室温で撹はんする。これ
に撹はんしながら39.4ｇの平均分子量500を有す
るポリエチレンイミノプロピルトリメトキシシラ
ンの50％（w/w）イソプロパノール溶液39.4ｇを
加え、混合物をさらに５分間撹はんする。混合物
を次に室温で一夜放置する。混合物を次に1.0ミ
クロンフイルターのろうとを使用しろ過する。ろ
液を50mlのトルエンで２回、50mlのメタノールで
２回洗い次にろうと上で空気乾燥し最後に80〜85
℃で約３時間30オーブン乾燥しPEl結合されたシ
リカゲル製品約2.85％Ｎを生成する。 製造例 ３ 平均粒径40〜63ミクロンと平均孔寸法420オン
グストロームを有しE.メルクリエージエンツ、西
ドイツから商品名“Fractosil500”の名で市販さ
れている230−400メツシユ（ASTM）のシリカ
ゲル20ｇの50mlのメタノールおよび１mlの水中の
スラリーを調製し５分間室温で撹はんする。平均
分子量1800を有するポリエチレンイミノプロピル
トリメトキシシランの50％（w/w）イソプロパ
ノール溶液11.2ｇの100mlメタノール中の別の溶
液も調製する。シラン溶液を次にシリカゲルスラ
リーに５分間かけて撹はんしながら加える。追加
が完了した後撹はんを止め、混合物を室温で50時
間放置する。混合物を次に中程度の寸法の焼結ガ
ラス上でろ過する。ろ液を３×50mlのメタノール
で真空で下で洗浄し次に80〜85℃で約４時間オー
ブン乾燥しPEI−結合のシリカゲル製品約1.1％Ｎ
を生成する。 製造例 ４ 次の反応混合物が前の実施例の教えに従つて製
造された。
【表】 各反応混合物を５分間室温で撹はんし次に撹は
んなしで41時間30分放置した。各混合物をろ過
し、50mlのイソプロパノールで１度そして50mlの
メタノールで２度洗浄した。各ろ液を80〜85℃で
約３時間12分オーブン乾燥しそれぞれのPEl結合
したシリカゲル製品Ａ：1.2％ Ｎ、Ｂ：1.0％
Ｎ、Ｃ：0.9％Ｎを生成した。 製造例 ５ Ａ 平均粒径40ミクロン及び平均孔寸法50オング
ストロームを有する50mlヘキサン中の10ｇのシ
リカゲルのスラリーに平均分子量500を有する
PElPr−triMeO−シランの50％（w/w）
iPrCH溶液19.71ｇを加える。混合物を５分間
室温で撹はんし、次に還流温度に約２時間加熱
した。混合物を室温に放冷し、ろ過し50mlのヘ
キサンで２回そして50mlのメタノールで２回洗
浄した。ろ液を次に80〜85℃で３時間オーブン
乾燥しPEl結合シリカゲル製品を生成した。 Ｂ 製造例5Aの手順を繰り返したが、但し等量
の孔の制御されたガラス125ミクロン、240オン
グストローム）をそこで使用したシリカゲルと
置き換え、対応する共有結合された非架橋PEl
−PrSi−CPG製品を生成した。 実施例 ６ 25mlのトルエン中の製造例２の５ｇのPEl−
PrSi−シリカゲル製品、（約５ミクロン、約330
オングストローム、約３％Ｎ）に２mlのトリエチ
ルアミンを加え、続いて0.6mlの無水酢酸を加え
た。混合物を均一まで振とうし、時々振とうしな
がら一夜放置した（約17.5時間）。Ｎ−アシル化
された生成物をろ去し、連続してトルエン、メタ
ノール、50／50MeOH／HOH、水、そして３回
メタノールで洗浄した。これを次に80〜85℃でオ
ーブン乾燥し、乾固した。生成物収量は５ｇであ
つた。分析8.52％Ｃ、2.0％Ｈ、2.8％Ｎ。 実施例 ７ 実施例６の手順を繰り返したが、但し無水酢酸
の代りにブチリルクロライドの当量を用いた。対
応するＮ−ブタノイル生成物の収量は約5.04ｇで
あつた。分析9.12％Ｃ、2.21％Ｈ、2.62％Ｎ。 実施例 ８ 製造例２の手順を繰り返したが、但し無水酢酸
の代りに0.81mlの塩化ヘキサノイルを用いた。対
応するＮ−ヘキサノイル生成物の収量は約5.05ｇ
であつた。分析9.59％Ｃ、2.26％Ｈ、2.58％Ｎ。 実施例 ９ 20ｇのPEl−PrSi−シリカゲル（約15〜20ミク
ロン約300オングストローム、約1.2％Ｎ）を８ml
のトリエチルアミン及び2.4mlの塩化ブチリルで
実施例２の手順に従つて処理したが、但し生じる
Ｎ−ブタノイル生成物をトルエンで１回、次にメ
タノールで１回洗浄した。生成物収量は19.3ｇで
あつた。分析5.96％Ｃ、1.63％Ｈ、1.17％Ｎであ
つた。 実施例 10 製造例２及び実施例６の手順を繰り返した。但
し実施例６でPEl−PrSi−シリカゲル生成物の代
りに当量の実施例5BのPEl−PrSi−CPG生成物
の置き換え、対応するＮ−アセチル化されたPEl
−PrSi−CPGゲル生成物を生成した。 実施例 11 10ｇのPEl−PrSi−シリカゲルの試料（約５ミ
クロン、約300オングストローム、約1.71％Ｎ）
を150％過剰の塩化ブチリル及び当量のトリエチ
ルアミン（1.38ml、BuOCl、2.54mlEt3N）で実施
例９の手順に従つて処理した。収量10.2ｇ、分析
6.68％Ｃ、1.26％Ｈ、1.65％Ｎ。 実施例 12 20mlのトルエン中の20ｇのPEl−PrSi−シリカ
ゲルの試料（約40ミクロン、約250オングストロ
ーム、約3.5％Ｎ）を10.5ｇの塩化ベンゾイル及
び7.6ｇのトリエチルアミンで約18時間処理した。
生じるベンゾイル化されたPEl−PrSi−シリカゲ
ル生成物を濾過し、次に連続して200mlのトルエ
ン、200mlのメタノール、200mlの水及び３回の
200mlのメタノールで洗浄し、80〜85℃で乾燥し
た。収量22.2ｇ、分析16.78％、1.94％Ｈ、2.87％
Ｎ。 実施例 13 実施例12の手順を繰り返したが、7.0ｇのトリ
エチルアミンの存在下でアシル化剤として11.5ｇ
の３，５ジニトロベンゾイルクロライドを使用
し、対応する３，５−ジニトロベンゾイル化され
たPEl−PrSi−シリカゲル生成物を生成した。 収量23.6ｇ、分析13.33％Ｃ、1.62％Ｈ、3.37％
Ｎ。 実施例 14 実施例12の手順を繰り返したが、但しアシル化
剤として10.5ｇのｐ−アニソイルクロライドを
7.6ｇのトリエチルアミンの存在下で使用し、対
応するｐ−アニソイル化されたPEl−PrSi−シリ
カゲル生成物を生成した。収量22.8ｇ。 実施例 15 実施例12の手順を繰り返したが、但しアシル化
剤として13.1ｇのｐ−クロロベンゾイルクロライ
ドを、当量のトリエチルアミンの存在下で使用
し、対応するｐ−クロロベンゾイル化されたPEl
−PrSi−シリカゲル生成物を生成した。収量26.5
ｇ。 実施例 16 実施例12の手順を繰り返したが、但し、アシル
化剤として、11.6ｇのｐ−トルオイルクロライド
を、10.6ml（7.6ｇ）のトリエチルアミンの存在
下で使用し、対応するｐ−トルオイル化された
PEl−PrSi−シリカゲル生成物を生成した。収量
22.0ｇ。 実施例 17 標準の分析カラム（4.6mm内径×250mm長さ）を
高圧（7000psi）に於て、結合相として、実施例
11から得たブチリル化されたPEl−PrSi−シリカ
ゲル（約５ミクロン、約300オングストローム）
でスラリー充填した。スラリーは25mlのメタノー
ル中の3.6ｇのブチリル化されたPEl−PrSi−シリ
カゲルからなつていた。スラリーをカラムにポン
プで送つたのち、 追加の100mlのメタノールを次に同じ圧力でカ
ラムにポンプで通じた。カラムを高圧液体クロマ
トグラフイに取り付け、25mlのKH2PO4、PH７の
溶液を、安定なベースランが280nmで観測される
まで、1200psiで１ml／分の流速に於てポンプで
送つてカラムに通じた。２モルの（NH4）2SO4、
及び25mlのKH2PO4、PH７の溶液を次に凡そ同じ
流速で安定なベースラインが達成されるまでポン
プで送つてカラムに通じた。２モルの
（NH4）2SO4＋25mMのKH2PO4から構成された
高塩緩衝液Ａに溶解した蛋白質混合物の溶液
（100μl）をカラムに注入し、１ml／分に於て30分
間かけて塩濃度を25mMのKH2PO4（緩衝液Ｂ）
に減少させることによつて蛋白質成分を溶出し
た。 蛋白質の混合物は85μｇのチトクロームＣ、
377μｇのミオグロビン、203ｇのリゾチーム、
850μｇのオバルブミン、及び232μｇのα−キモ
トリプシンＡを含んでいた。濃縮バンドとして各
蛋白質溶離物はお互いに良く分離された。個々の
蛋白質に対する典型的な量の回収は最初の量の90
％より大きかつた。例えばチトクロームＣに対し
95％、ミオグロビンに対し94％、リゾチームに対
し92％であつた。この実施例のカラムは蛋白分離
の為に1000時間のクロマトグラフイ使用の後でさ
えも、クロマトグラフイ性能に於けるどんな有意
義な損失も示さなかつた。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ 平均粒径約３〜約70ミクロン及び平均孔寸法
    約50〜約1000オングストローム単位を有する微粒
    シリカゲル又は平均粒径約37〜約177ミクロン及
    び平均孔寸法約40〜約1000オングストローム単位
    を有する微粒状の孔の抑制されたガラスと、約
    400〜約1800の平均分子量を有するポリエチレン
    イミノプロピルトリメトキシシランとのＮ−アシ
    ル化された共有結合非架橋ポリエチレンイミン反
    応生成物［但し、Ｎ−アシル官能基が式Ｒ−CO
    −を有し、ここでＲはC1〜C8アルキル、フエニ
    ル、アラルキル及びC1〜C4アルキル、C1〜C4ア
    ルコキシ、ハロ及びニトロからなる群から選ばれ
    る１又はそれ以上の置換基で置換されたフエニル
    からなる群から選ばれる一員である］からなるク
    ロマトグラフイー用充填剤。 ２ Ｎ−アシル部分がブチリルである特許請求の
    範囲第１項に記載の充填剤。 ３ Ｎ−アシル部分がブチリルであり、微粒状シ
    リカゲルが平均粒直径が約５〜約40ミクロン及び
    平均孔寸法約50〜約330オングストローム単位を
    有し、ポリエチレンイミノプロピルトリメトキシ
    シランが平均分子量約400から約600を有する特許
    請求の範囲第２項に記載の充填剤。 ４ Ｎ−アシル部分がブチリルであり、微粒状シ
    リカゲルが平均粒直径約40〜約62ミクロン及び平
    均孔寸法約210〜約520オングストローム単位を有
    し、ポリエチレンイミノプロピルトリメトキシシ
    ランが平均分子量約1000を有する特許請求の範囲
    第２項に記載の充填剤。 ５ 平均粒径約３〜約70ミクロン及び平均孔寸法
    約50〜約1000オングストローム単位を有する微粒
    シリカゲル又は平均粒径約37〜約177ミクロン及
    び平均孔寸法約40〜約1000オングストローム単位
    を有する微粒状の孔の抑制されたガラスと、約
    400〜約1800の平均分子量を有するポリエチレン
    イミノプロピルトリメトキシシランとの共有結合
    非架橋ポリエチレンイミン反応生成物をアシル化
    剤としての酸ハロゲン化物又は酸無水物でＮ−ア
    シル化することからなり、但し、上記アシル官能
    基が式Ｒ−CO−を有し、ここでＲはC1〜C8アル
    キル、フエニル、アラルキル及びC1〜C4アルキ
    ル、C1〜C4アルコキシ、ハロ及びニトロからな
    る群から選ばれる１又はそれ以上の置換基で置換
    されたフエニルからなる群から選ばれる一員であ
    る、上記反応生成物のＮ−アシル化生成物からな
    るクロマトグラフイー用充填剤を製造する方法。 ６ 平均粒径約３〜約70ミクロン及び平均孔寸法
    約50〜約1000オングストローム単位を有する微粒
    シリカゲル又は平均粒径約37〜約177ミクロン及
    び平均孔寸法約40〜約1000オングストローム単位
    を有する微粒状の孔の抑制されたガラスと、約
    400〜約1800の平均分子量を有するポリエチレン
    イミノプロピルトリメトキシシランとのＮ−アシ
    ル化された共有結合非架橋ポリエチレンイミン反
    応生成物［但し、Ｎ−アシル官能基が式Ｒ−CO
    −を有し、ここでＲはC1〜C8アルキル、フエニ
    ル、アラルキル及びC1〜C4アルキル、C1〜C4ア
    ルコキシ、ハロ及びニトロからなる群から選ばれ
    る１又はそれ以上の置換基で置換されたフエニル
    からなる群から選ばれる一員である］を充填した
    液体クロマトグラフイに適したクロマトグラフイ
    ーカラム。 ７ Ｎ−アシル部分がブチリルである特許請求の
    範囲第６項に記載のクロマトグラフイーカラム。 ８ Ｎ−アシル部分がブチリルであり、微粒状シ
    リカゲルが平均粒直径が約５〜約40ミクロン及び
    平均孔寸法約50〜約330オングストローム単位を
    有し、ポリエチレンイミノトリメトキシシランが
    平均分子量約400から約600を有する特許請求の範
    囲第７項に記載のクロマトグラフイーカラム。 ９ Ｎ−アシル部分がブチリルであり、微粒状シ
    リカゲルが平均粒直径約40〜約62ミクロン及び平
    均孔寸法約210〜約520オングストローム単位を有
    し、ポリエチレンイミノトリメトキシシランが平
    均分子量約1000を有する特許請求の範囲第７項に
    記載のクロマトグラフイーカラム。
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