JPH04325079A - 酒類の品質改良方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は酒類の品質改良方法に関
する。更に詳細には本発明は微生物を培養してウレタナ
ーゼを得、そのウレタナーゼを利用して酒類の品質を改
良する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】カルバミン酸エチルは従来、日本では麻
酔薬や医薬品の溶解剤等として使用されていたが、その
変異原性、および発癌性が問題となり、その使用が禁止
になった経緯があり、またカルバミン酸エチルが発酵食
品中にも存在することが判明し、その生成経過は例えば
、発酵食品中ではエチルアルコールと尿素が共存する際
、その食品の過酷な加熱殺菌を行ったり、長時間の貯蔵
における条件にて両者がエステル結合してカルバミン酸
エチルが生成する。また、カルバミン酸エチルの生成経
路は未だ判明していないものもある（例えばウイスキー
等の蒸留酒）。

【０００３】このカルバミン酸エチルに関しては、食品
衛生上、上述した如き問題がおきており、カナダ、米国
を中心に世界的な問題にまで発展し、酒類中のカルバミ
ン酸エチルを低減させる為に数多くの研究がなされてい
る。

【０００４】上記発酵食品中のカルバミン酸エチルの除
去の為に、例えば酸性ウレアーゼによる酒類中の尿素を
分解することにより、カルバミン酸エチルの生成を抑制
する方法として、特開昭６３−１９６２８９号、特開昭
６３−１９６２６１号等に記載された方法が実施されて
いる。

【０００５】日本酒の如き、カルバミン酸エチルの生成
が尿素由来と判明しているものには、この方法は最適と
思われるが、蒸留酒の如く尿素ばかりでなく、他の要因
にてカルバミン酸エチルが生成しているものは、直接、
カルバミン酸エチルを分解する方法が望まれている。

【０００６】ところで、数多くの微生物からカルバミン
酸エチルを分解しうるウレタナーゼが発見されたが、ア
ルコール存在下での反応は、非常に大きな阻害を受け、
酒類中のカルバミン酸エチルを分解する上での効率が悪
かった（特開平１−３００８９２号、特開平１−２４０
１７９号参照）。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】上記発酵食品あるいは
、食品中に含まれるウレタンの分解によるカルバミン酸
エチルの消失又は減少により、その作用による悪影響を
防止する為に、ウレタナーゼ、特にアルコール存在下に
てもその酵素活性の発現に対する阻害の少ないウレタナ
ーゼが望まれていた。

【０００８】従来のウレタナーゼはアルコール中ではそ
の阻害作用により、酵素活性の発現が悪く、非効率的で
あった。

【０００９】従って本発明の目的は、アルコールによる
阻害の少ないウレタナーゼを見出し、それを酒類の品質
改良のために利用する方法を提供することにある。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明はＮＨ２ＣＯＯＲ
　（Ｒはアルキル基又はフエニル基を示す）で示される
構造式を持つウレタンを分解する能力を有するウレタナ
ーゼであり、しかもその作用はエタノール存在下にても
阻害が弱く、十分ウレタン分解能を発現する。その作用
は

【００１１】

【化１】

【００１２】（Ｒはアルキル基又はフエニル基を示す）
で示す如く、カルバミン酸エステルを分解してＮＨ３　
とＣＯ２　とアルコールを生成する。

【００１３】本発明においては、エタノールに対して耐
性を示すウレタナーゼを生産する能力を有する微生物お
よびその変異株、細胞融合株も使用することができる。

【００１４】上記ウレタナーゼを生産しうる菌株は何れ
も公知であり、例えばＢＥＲＧＥＹ’Ｓ　ＭＡＮＵＡＬ
　ｏｆ　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏ
ｇｙ、Ｖｏｌ．１，３０５〜３０６頁に記載されており
、公的寄託機関（例えばＡＴＣＣ）より容易に入手しう
るものである。これらの菌株の例には例えばアシネトバ
クター・カルコアセチカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅ
ｒ　ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ　）〔フエノテイピツ
ク・グループ（Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ　Ｇｒｏｕｐｓ　
）Ａ１　，Ａ２，Ａ３　，Ｂ１　，Ｂ２　，Ｂ３　，Ｂ
４　〕等のアシネトバクター属に属する微生物があり、
本発明ウレタナーゼを生産することができる。なお、本
発明は上記菌株に必ずしも限定するものではない。

【００１５】これらの微生物は通常用いられている栄養
物、例えば肉エキス、ペプトン、酵母エキス、麦芽エキ
ス、コーンスチープリカー、カザミノ酸等を窒素源とし
て、グルコース、シュークロース、マルトース、ラクト
ース、澱粉、ウレタン、アセトアミド、ブチルアミド等
を炭素源として、第１リン酸カリウム、第２リン酸カリ
ウム、その他硝酸アンモン、塩化アンモン、硝酸ソーダ
等を無機塩として加え、更には所望により、微量金属と
して、マグネシウム塩、第一鉄塩、マンガン塩、モリブ
デン酸塩、銅塩、亜鉛塩、ホウ酸等を加えた培地にて２
０〜４０℃好ましくは３０〜３７℃にて好気的に良好に
増殖し、培養６〜４８時間でウレタナーゼを生産する。

【００１６】本発明で用いる菌の培養により生産された
ウレタナーゼは、通常菌体内に存在するため、その採取
にあたっては菌体からの抽出を行う。なお、本発明はウ
レタナーゼであれば、菌体内に限定するものではなく、
菌体外酵素でも当然利用できる。

【００１７】抽出は公知の有機溶媒抽出法によることも
できるが、ビーズや超音波を用いた細胞破砕法、界面活
性剤溶液による抽出法等、公知の方法が用いられる。

【００１８】所望によりウレタナーゼは有機溶媒沈殿、
塩析、クロマトグラフィ、膜濃縮、膜除菌等の公知の方
法で精製することができる。なおこのウレタナーゼは上
記の粗酵素液、精製酵素液、それらの乾燥物、固定化物
または細胞懸濁液、細胞の固定化物等任意適当な形で使
用することができる。

【００１９】本発明において、例えばアシネトバクター
・カルコアセチカスのフエノテイピツク・グループＡ１
　の培養により得られるウレタナーゼの酵素化学的およ
び理化学的性質を示す。

【００２０】（１）　作用：カルバミン酸エチルを基質
として反応させた時、カルバミン酸エチルの分解生成物
であるアンモニア、エタノールが確認された。

【００２１】 （２）　基質特異性： 　　　　　　　　　　　　　　基　　　　　　　　質　
　　　　　　　　　　　　　　　　　添加濃度（Ｍ）　
　　相対活性（％）　　　　　　　カルバミン酸メチル
エステル　　　　　　　　　　　　　　０．５　　　　
　　　　　　　　８５　　　　　　カルバミン酸ベンジ
ルエステル　　　　　　　　　　　　０．２５　　　　
　　　　３５９　　　　　　カルバミン酸ｎ−ブチルエ
ステル　　　　　　　　　　０．２５　　　　　　　　
１３８　　　　　　カルバミン酸イソプロピルエステル
　　　　　　　　０．５　　　　　　　　　　　　　　
９　　　　　　カルバミン酸アンモニウム塩　　　　　
　　　　　　　　　０．０５　　　　　　　　　　　　
０　　　　　　カルバミン酸エチルエステル　　　　　
　　　　　　　　　０．５　　　　　　　　　　１００
　　　　　　フエニルカルバミン酸メチルエステル　　
　　　　０．２５　　　　　　　　　　　　０　　　　
　　フエニル尿素　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　０．５　　　　　　　　　　　
　　　０　　　　　　アセトアミド　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．５　　　
　　　　　　　８２２　　　　　　グリシンアミド　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０
．５　　　　　　　　　　　　　　０　　　　　　ベン
ズアミド　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　０．２　　　　　　　　　　９１６　　
　　　　フエニルカルバメート　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　０．５　　　　　　　　　　２２０
　　　　　　ブチルアミド　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　０．５　　　　　　　
　１８３３　　　　　　Ｎ−メチルアセトアミド　　　
　　　　　　　　　　　　　　　０．５　　　　　　　
　　　　　　　０　　　　　　ｎ−バレルアミド　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．５　
　　　　　　　２７０２　　　　　　プロピオンアミド
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０
．５　　　　　　　　２４３２　　　　　　ホルムアミ
ド　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　０．５　　　　　　　　　　　　８９　　　　
　　メチル尿素　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　０．５　　　　　　　　　　
　　　　０　　　　　　グルタミン　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．２５
　　　　　　５１３７　　　　　　カルバミルホスフエ
ート（二ナトリウム塩）０．０５　　　　　　　　　　
　　０

【００２２】（３）　至適ｐＨおよび安定ｐＨ範
囲：ｐＨ５．５〜８付近に至適ｐＨを示す（図１参照）
。 ｐＨ５．５〜９付近にて安定（図２参照）。

【００２３】（４）　至適温度および熱安定性：至適温
度は０．１Ｍリン酸バツフアー（ｐＨ６．５）中で５５
℃付近である（図３参照）。 熱安定性は０．１Ｍリン酸バツフアー（ｐＨ６．５）中
で３７℃付近である（図４参照）。

【００２４】 （５）　阻害および活性化： 　　　　　　　　　　添　　　　加　　　　剤　　　　
　　　　　　　　　　　　濃　　度　　　　　　相対活
性（％）　　　　　　　エチレンジアミンテトラアセテ
ート　　　　１ｍＭ　　　　　　　　　　６１　　　　
　　エタノール　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　１８％　　　　　　　　　　５０　　　　
　　ｏ−フエナンスロリン　　　　　　　　　　　　　
　　　１ｍＭ　　　　　　　　　　６０　　　　　　ト
リトンＸ−１００　　　　　　　　　　　　　　　　　
　１％　　　　　　　　１０１　　　　　　無　　添　
　加　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　−　　　　　　　　　　１００

【００２５】 （６）　安定化（５５℃、１５分処理）：　　　　　　
　　　　添　　　　加　　　　剤　　　　　　　　　　
　　　　　　濃　　度　　　　　　相対活性（％）　　
　　　　　　　　　　　　　　　−　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　０　　　　　　　　　　　
　１００　　　　　　トリトンＸ−１００　　　　　　
　　　　　　　　　　１％　　　　　　　　　　１０３
　　　　　　グリセリン　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　２．５％　　　　　　　　６０　
　　　　　ドデシルベンゼンサルフエート　　　　　　
１％　　　　　　　　　　　　１５　　　　　　Ｎ−ソ
ジウムラウロイルザルコシン　　１％　　　　　　　　
　　　　１５

【００２６】（７）　分子量：ゲル濾過法
により約１０万と測定された。

【００２７】（８）　酵素活性測定法：ウレタンとの反
応により生成したアンモニアを比色定量又はエチルアル
コールを定量する。 （ａ）　反応液の組成 　　　　　　ウレタン（０．５Ｍ水溶液）　　　　　　
　　　　　　　　　　０．０５ｍｌ　　　　　　０．１
Ｍリン酸バツフアー（ｐＨ６．５）　　　　０．６ｍｌ
　　　　　　酵　　素　　液　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．１ｍｌ
（ｂ）　反応条件 ３７℃、１時間〜３時間反応させ、１．０Ｎ硫酸０．２
ｍｌを添加して反応を停止し、反応液の１部をとり、イ
ンドフエノール試液により発色させ６３０ｎｍの吸光度
を測定し、生成したアンモニア量を定量することにより
分解されたウレタン量を測定する。なお、生成したエチ
ルアルコールを定量する時は、反応液の１部をとり、ベ
ーリンガー社製エチルアルコール定量用キツトにより紫
外部吸収（アルコール脱水素酵素−アルデヒド脱水素酵
素系）の増加（ＮＡＤＨ）を測定することにより実施し
た。 （ｃ）　酵素活性 ウレタナーゼ１単位（ＩＵ）は一定ｐＨ、３７℃の条件
で１分間にウレタン１μｍｏｌを分解する酵素量とする
。

【００２８】本発明の対象とする酒類としては、カルバ
ミン酸エチルを含有するものであればよく、清酒、ビー
ル、ぶどう酒、老酒などの醸造酒をはじめ更にはウイス
キー、ブランデー、焼酎などの蒸留酒およびそれらを製
造する中間工程品が本発明の至適ｐＨでよりよい効果が
期待できる。

【００２９】これらの酒類に対して、本発明ウレタナー
ゼにて処理する場合、添加するウレタナーゼの量は、酒
類１ｌ当たり、２ＩＵ乃至１０００００ＩＵ、好ましく
は、５ＩＵ乃至１０００ＩＵ、更に好ましくは５ＩＵ乃
至１００ＩＵが効果的に使用される。

【００３０】

【実施例】以下に本発明を製造例および実施例をあげて
具体的に説明するが、本発明はかかる特定の実施例によ
って限定されるものではない。％は他に特記せぬ限りｗ
／ｖ％である。なお、酒類中に含まれるカルバミン酸エ
チルの定量はキャピラリーガスクロマトグラフイ法にて
測定した。

【００３１】製造例　　１ 酵母エキス（オリエンタル酵母）０．５％、塩化アンモ
ニウム０．１％、ブチルアミド１．０％を含有する培地
（ｐＨ６．０）１０ｍｌを試験管に入れ、１２０℃で２
０分間オートクレーブ殺菌する。アシネトバクター・カ
ルコアセチカスのフエノテイピツク・グループＡ１　の
１白金耳を上記培地に接種し、３０℃で２４時間振とう
培養し、種培養液とする。

【００３２】同条件で殺菌した培地１ｌを含む３ｌ容三
角フラスコへ上記種培養液１０ｍｌを接種し、３０℃で
２４時間培養する。集菌した菌体を超音波破砕機にて氷
冷下５分間処理した。次いで遠心分離にかけ、ウレタナ
ーゼ活性、５０×１０−４ＩＵ／ｍｌ（培養濾液換算）
を得た。

【００３３】製造例　　２ 製造例１と同様に培養し、菌体を集菌し、超音波破砕し
、遠心分離した上澄液５０ｍｌ（０．０９ＩＵ／ｍｌ）
に硫安３０ｇを投入溶解し、沈殿物を遠心分離し、その
ケーキを１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）５ｍｌに
溶解し、その後冷１０ｍＭリン酸緩衝液に対して透析し
、凍結乾燥し、２ＩＵ／２ｇ（８０％収率）酵素粉末を
得た。これをＤＥＡＥセルロース、クロマトグラフイに
て２１ＩＵ／１２０ｍｇ（５０％収率）酵素粉末を得た
。

【００３４】実施例　　１ ウイスキーの一次蒸留酒（ウレタン１２０ｐｐｂ、アル
コール２１％、ｐＨ６．２）１０ｍｌに対して製造例２
の方法により得たウレタナーゼ酵素粉末２．４ｍｇ（０
．４２ＩＵ／ｍｌ）又は１２ｍｇ（２．１ＩＵ／ｍｌ）
を添加し、下表１に示す日数の間１５℃にて反応させた
。ガスマスクロマトグラフイにてウレタンの減少速度を
測定した結果、表１に示す結果が得られた。

【００３５】 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　表　　　　１　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　カルバミン酸エチルの変化　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　経　　　　過　
　　　日　　　　数　　　　　　　　　　ウレタナーゼ
（ＩＵ／ｍｌ）　　　　０日　　　　　　　　２日　　
　　　　４日　　　　　　６日　　　　　　　　　　０
．４２　　　　　　　　　　　　１２０ｐｐｂ　　　５
０ｐｐｂ　　　２５ｐｐｂ　　　１１ｐｐｂ　　　　　
　　　　　　２．１　　　　　　　　　　　　　　１２
０ｐｐｂ　　　１０ｐｐｂ　　　　　０　　　　　　　
　０

【００３６】

【発明の効果】以上詳述したとおり、本発明により、ア
ルコールに対して耐性を有するウレタナーゼの生産が可
能になった。これにより、問題になっている酒類中のカ
ルバミン酸エチルを分解し、無害化することにより、酒
類業界の保健衛生面に寄与することが可能となった。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の方法で得られたウレタナーゼの各ｐＨ
における活性（３７℃）を表わすグラフである。

【図２】各ｐＨにおける３０℃、３０分間処理によるｐ
Ｈ安定性を表わすグラフである。

【図３】各温度における活性を表わすグラフである。

【図４】ｐＨ６．５で各温度における１５分間処理によ
る熱安定性を示すグラフである。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　アシネトバクター・カルコアセチカス
   に属する微生物の産生したウレタナーゼを酒類中のウレ
   タンに作用させることを特徴とする酒類の品質改良方法
   。