JPH04500756A - 熱、酸及び／またはアルカリに高い安定性を有する細菌由来突然変異体α―アミラーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 １４、構造遺伝子から調節配列を物理的に分離することにより大腸菌内でクロー ン化した遺伝子の発現を不可能にし、また枯草菌中でクローン化した遺伝子の発 現を１種の制限酵素による消化及びその後の再環状化により回復することのでき る枯草菌／大腸菌シャトルベクター。

１５、澱粉分解または繊維糊抜きへの応用に際し向上した性質をもつ澱粉分解酵 素を調製する方法であって以下の工程；澱粉分解酵素をコードするクローン化し た遺伝子あるいはその遺伝子断片に突然変異をおこす工程；得られた変異体アミ ラーゼ遺伝子あるいは遺伝子群を単離する工程；該変異体アミラーゼ遺伝子（群 ）を発現する工程；産生に適当な宿主細胞株に導入する工程；及び産生じた変異 体アミラーゼを回収し澱粉分解あるいは繊維糊抜きへの応用において向上した性 質をもつ変異体アミラーゼを同定する工程を含む方法。

１６、変異体α−アミラーゼを産生ずる方法であって、請求の範囲第１１項から 第１３項のうちの１つに記載の宿主細胞を適当な培地中で培養する工程、及び産 生されたα−アミラーゼを回収する工程を含む方法。

１７．澱粉分解及び繊維糊抜きでの請求の範囲第１項から第８項記載のα−アミ ラーゼの利用。

１８、請求の範囲第１項から第８項のうちの１つに記載した変異体α−アミラー ゼの利用を含む澱粉分解の方法。

１９、請求の範囲第１項から第８項のうちの１つに記載した変異体α−アミラー ゼの利用を含む繊維糊抜き方法。

２０、請求の範囲第１項から第８項のうちの１つに記載した変異体α−アミラー ゼを含む澱粉分解用組成物。

２１、請求の範囲第１項から第８項のうちの１つに記載した変異体α−アミラー ゼを含む繊維糊抜き用組成物。

明　細　書 熱、酸及び／またはアルカリに高い安定性を有する細菌由来突然変異体α−アミ ラーゼ導入 技術分野 本発明は遺伝子操作技術分野に関し、α−アミラーゼ活性を持つ酵素をコードす るＤＮＡ配列を含む新しいＤＮＡ分子に関する。

具体的には、澱粉の分解や繊維の糊抜き、他の工業的工程の使用に優れた特長を 有する細菌由来突然変異体α−アミラーゼが開示される。この開示されたα−ア ミラーゼは温度、酸及びアルカリに対し高い安定性を示し、それにより今まで使 われなかった工程においても理想的に適した活性を示すことができる。

背景技術 澱粉はアミロース（１５−３０％重重量型量）と、アミロペクチン（７０−８５ ％重量重量量）の混合物からなる。アミロースは約ｅｏｏｏｏから８０００００ の分子量を持つ直鎖のα−１，４−結合グルコース単位から成る。アミロペクチ ンは、２４−３０グルコ一ス単位ごとにα−１６分岐点をもつ分校状高分子であ り、分子量は１億に達すると思われる。

澱粉由来の糖は、濃縮ブドウ糖シロップの形で、現在、（１１α−アミラーゼを 用い固体澱粉を平均約７−１Ｏの重合度を持つデキストリンへ液化（または稀薄 化（ｔｈｉｎｎｉｎｇ））する工程、及び（２）生じた液化澱粉（すなわち澱粉 氷解物）をアミログルコシダーゼ（グルコアミラーゼまたはＡＧとも呼ぶ）を用 いて糖化する工程を含む酵素触媒方法で生産されている。生じたシロップは高濃 度のブドウ糖を含む。工業的に生産したブドウ糖シロップの多くは次に酵素的に イソシロップというブドウ糖／フルクトースの混合物へと異性化される。

α−アミラーゼ（ＥＣ３，２，１，１）は、澱粉とグリコーゲン、類縁の多糖類 を内部のα−１，４−グルコシド結合を不規則に切断することによって加水分解 する。この酵素は、例えば糖、醸造、アルコール、繊維産業などにおいて多数の 重要な工業的応用が図られている。α−アミラーゼは、種々の細菌、真菌類、植 物、動物から単離される。工業的に最も重要なα−アミラーゼは枯草菌（Ｂａｃ ｉｌｌｉ）から単離されるものである。

澱粉の加水分解過程の第一段階では、澱粉スラリーは比較的高い温度（１１０度 ）まで熱することによりゼラチン化する。ゼラチン化した澱粉は、連続した２段 階の工程で熱に安定なα−アミラーゼにより液化されデキストリン化される。主 要な変動因子は澱粉濃度、α−アミラーゼ量、温度そしてｐＨである。液化−デ キストリン化反応では良い転換比率を得るために変動因子を狭い範囲に保つ必要 がある。さもなくば濾過の際重大な問題を生じるからである。例えば、コツカー （Ｌ、　Ｅ、　Ｃｏｋｅｒ）とフェンカッタズブラマニアン（Ｋ、Ｖｅｎｋａｔ ａｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ）　、バイオテクノロジー、１６５−１７１頁、シエ レミシノフ（Ｐ、　Ｎ、　Ｃｈｅｒｅｍｉｓｉｒ＋ｏｆｆ）　、ケレット（Ｐ、 　Ｂ、　Ｑｕｅｌｌｅｔｔｅ）編、テクニコム出版−ランカスター、１９８５年 ）参照。頻繁に生じる問題の１つは分解過程の初期段階の適当な温度調節である 。すなわち過熱によりα−アミラーゼが変性し最終の稀薄化が不充分になる。こ れを防ぐ１つの方法は、さらに高い熱安定性のα−アミラーゼを用いることであ る。

そのためにカルシウムイオンや両親媒性化合物（例えばＥＰ−Ａ−０１８９８３ ８参照）を加えることが提案されてきた。しかしこの解決法は不満足な結果に終 わったようである。

従ってなおさら本質的に、より高い熱安定性をもったα−アミラーゼを用いるこ とに興味がもたれる。

関連文献 ＥＰ−Ａ−０５７９７６では、熱安定なバチルス（Ｂ）、ステアロチモルフィル スからのα−アミラーゼをコードする遺伝子の単離、そしてその遺伝子は枯草菌 または大腸菌の複製開始部位を含むプラスミドに組み込んであることについて述 べている。α−アミラーゼを産生ずるのにそのようなキメラのプラスミドが用い られる。該α−アミラーゼ遺伝子は、単離後修飾を施さずに使われた。

ＥＰ−Ａ−０１３４０４８では、工業的に用いられる枯草菌株の１つ以上のα− アミラーゼ遺伝子をクローン化し発現することにより、α−アミラーゼをとりわ け工業的に多量に生産する方法について述べている。

ＥＰ−Ａ−２５２６６６では、一般にＱ−Ｒ−Ｌと書かれるキメラのα−アミラ ーゼについて説明している。（式中、Ｑは、Ｂ。

アミロリクエファシェンス由来α−アミラーゼのＮ末３７個のアミノ酸残基と最 低７５％一致するＮ末の５５から６０個のアミノ酸残基を示し、Ｒは付は加えら れたポリペプチドを示し、ＬはＢ、リケニホルミスのα−アミラーゼのＣ末３９ ５個のアミノ酸残基と最低７５％のホモロジーをもつ３９０から４００個からな るＣ末のポリペプチドを示す）。

グレイらは（ジャーナル　オブ　バクテリオロジー、１６６号、６３５頁、１９ ８６年）Ｂ、ステアロチルモルフィルスのα−アミラーゼのアミノ末端部位とＢ 、リケニホルミスのα−アミラーゼのＣ末端部位からなるキメラα−アミラーゼ について報告している。はとんどのハイブリッド酵素は親株の酵素より不安定で あることが示されている。さらにいずれのハイブリッド酵素についても、より高 い安定性を有することは示されていない。

上に利用した関連文献のうち新規なα−アミラーゼを得るために単一アミノ酸置 換を利用したものは全くない。

ＥＰ−Ａ−０２８５１２３は、塩基配列の完全な突然変異の方法を開示している 。Ｂ、ステアロテルモフィルスのα−アミラーゼが突然変異の例として説明され ている。この方法はこれまでより高い安定性をもつＢ、ステアロモルフィルスの α−アミラーゼの変異体を得るのに用いることができると示唆しているが、例は あげられていない。

発明の要約 本発明では、変異体α−アミラーゼ及びその様な異変体の生産方法について述べ る。該変異体α−アミラーゼは野生型α−アミラーゼと少なくともアミノ酸１つ が異なることを特徴とする。さらに、これらの変異体をコードするＤＮＡと、こ れらのＤＮＡを発現可能な形で含むベクター、及び該ベクターを含む宿主細胞に ついて報告する。

本発明の第一の態様として、クローン化されたα−アミラーゼ遺伝子の不規則突 然変異が開示される。該変異遺伝子は、適当なベクター系を用いて適したホスト の細菌中で発現させる。

発明の第２の態様として、変異体α−アミラーゼをスクリーニングする方法を説 明し応用する。該方法は、より熱安定でより酸耐性のα−アミラーゼを産生ずる 。さらに、この方法は、わずかに修正することによりアルカリ耐性のα−アミラ ーゼを得るのにも用いられる。そのように検出されたクローンの発現産物は、単 離、精製される。

本発明の第三の態様として、熱安定性が上昇し、これら変異体α−アミラーゼを 澱粉分解に用いる条件下での濾過の問題を減少させたα−アミラーゼが提供され る。

本発明の第４の態様として、酸耐性が上昇し、マルチユロースなどの好ましくな い副産物の生成を減少させ、それと同時にアミログルコシダーゼとの反応の前に 加える酸の量を減少させたα−アミラーゼが提供される。新しいα−アミラーゼ は、熱安定性と酸耐性の点で、あるいは熱安定とアルカリ耐性の点で好ましくは 両者の優れた性質を有する。

本発明の第５の態様としては、変異蛋白が澱粉の液化に用いる条件下でより良い 効率を示すことである。該アルカリ耐性は特に繊維糊抜きへの応用に有用である 。これらの点は後述する発明の開示と実施例でさらに説明される。

図面の簡単な説明 図１：ｐＭａ５−８のヌクレオチド配列スタンセンら、１９８７年、エンボラボ ラトリーコースマルチンスリード、１９８７年７月。別のプラスミドの説明に関 しては本文参照。

図２＝プラスミドｐＰＲＯＭ　５ＰＯ２インサートのヌクレオチド配列 このベクターの構造はＥＰ−Ａ−０２２４２９４で説明されている。α−アミラ ーゼのアミノ酸配列はトリブレットの下に書かれている。番号付けは成熟蛋白の 最初のアミノ酸から始まっている（ターンら、ジャーナルオブバクテリオロジー 、１９４巻：３７２頁）、５ＰＯ２プロモ一ター挿入配列（１ｎｓｅｒｔ）は６ １番目から３４４番目までに組み込まれている。

図３：ｐＭａＴＬｉａ６のヌクレオチド配列このベクターはｐＭａ５−８と、ｐ ＰＲＯＭ　５ＰＯ２の挿入配列、そしてＴＡＣプロモーターをコードする合成り ＮＡフラグメントから成る。ＴＡＣプロモーターＤＮＡフラグメントは３７５７ 番目から３８５９番目までに組み込まれている。α−アミラーゼのアミノ酸配列 はトリブレットの下に示す。

図４：ｐＭａＴＬｉａ６の制限酵素地図法の各１箇所の制限酵素切断部位がα− アミラーゼ遺伝子中のギャップ形成に利用可能である：ＢａｍＨＩ、５ｐｅＩ、 ５ａｃＩ１．ＫｐｎＩ、ＣＩａＩ、ＮａｒＩ、５ａｌＩ、Ｔｈｔｌｌｌ’Ｉ、Ｘ ｍａｌ［Ｉ、そしてＢｓｔＥＩＩ。変異配列を容易に決定するために可能性のあ る全ての切断部位に対するシーフェンシングプライマーを合成した。プラスミド ｐＭｃＴＬｉａ６はｐＭａＴＬｉａ６とアンピシリン遺伝子中にアンバーコドン が存在すること（ＳｃａＩ部位を除いた）とクロラムフェニコール遺伝子中にア ンバーコドンを含まないこと（Ｐ　ｖ　ｕ　ＩＩ部位の存在に伴い）を除いて同 一である。

図５：枯草菌／大腸菌のシャトルベクターｐＭａ／ｃの概略（左）ｐＭａ／ｃ部 分は大腸菌に簡便に突然変異を起こすのをはα−アミラーゼ遺伝子（または他の 枯草菌遺伝子）とバチルスズブチリスの増殖に最小限のレプリコンを含む。大腸 菌での突然変異が成功した後はバチルスズブチリス遺伝子単位は枯草菌にトラン スフォーメーションする際環状化し、５ＰＯ２プロモーターをα−アミラーゼ遺 伝子の前に動かすことができる。

図６：ｐＢＭａ／ｃｌの制限酵素地図 このベクターは図５に示した突然変異発現ベクターの具体的な例である。（１） 及び（２）：マルチプルクローニングサイト。目的の遺伝子は（２）に組み込ま れている。（１）と（２）で制限酵素位置を変えることにより２本鎖へのギャッ プ形成のために便利な制限酵素部位を構築することができる。ＦＤＴ　：転写終 結位置Ｆ１．ＯＲＩ　：ファージＦｌ由来複製開始領域Ｅ、ｃｏｌｉ　ＯＲＩ： ｐＢＲ３２２の複製開始領域ＢＬＡ：アンピシリン耐性遺伝子 ＣＡＴ：クロラムフェニコール耐性遺伝子ＢＡＣＯＲＩ：ｐＵＢｌｌｏの複製開 始領域ＫＡＮＡＭＡＹＣＩＮ　：　ｐＵＢ　１１０のカナマイシン（メオマイシ ン）耐性遺伝子 ５ＰＯ２：ファージ５ＰＯ２のプロモーター図７　：ｐＢＭａ／ｃ６Ｌｉａ６の 制限酵素地図バチルスリケニホルミスのα−アミラーゼ遺伝子を図６のｐＭａ／ ｃｌのマルチプルクローニングサイト（２）に組み込んだ。この図では５ＰＯ２ のプロモーターは（２）と、大腸菌のＯＲＩは（４）と表されている。

図８　：　ｐＭａ／ｃＴＰＬｉ　ａ　６中のｐｈｏＡのシグナル配列断片の配列 ＴＡＣプロモーターの上流のＥｃｏＲＩ部位から成熟α−アミラーゼの最初のア ミノ酸までを示しである。ｐｈｏＡのアミノ酸配列はＤＮＡ配列の下に示す。

図９＝野生型と２Ｄ５α−アミラーゼのミカエリスメンテンプロット このグラフは基質濃度に対する酵素活性の初速度を野生型α−アミラーゼと２Ｄ ５α−アミラーゼについて表したものである。

アッセイ条件は実施例８に説明する。

図１Ｏ：野生型α−アミラーゼとＤ７α−アミラーゼの熱失活このプロットはｐ Ｈ５，ｓ、９０．５℃において野生型とＤ７α−アミラーゼ両方の半減期をＣａ ”＋濃度の関数として表している。

図１１：野生型及びＤ７α−アミラーゼの熱失活１）Ｈが７．０であるのを除き 図１Ｏと同様。

図１２：野性型及び２Ｄ５α−アミラーゼの熱失活このプロットはｐＨ７，０， ９５℃での親株及び２Ｄ５α−アミラーゼ両方の半減期をＣａ　”濃度の関数と して表している。

図１３＝野生型及びＤ７α−アミラーゼの熱失活のｐＨ依存性図１４：野生型及 び２Ｄ５α−アミラーゼの熱失活のｐＨ依存性図１５：１１０℃での液化後に測 定した最終ｐＨに対するＤＥ発明の詳細な説明 本説明中、「変異体α−アミラーゼ」に関連して「性質が向上した」と呼ぶ場合 、高い酵素活性、または澱粉液化、繊維の糊抜き、または他の工業的生産への応 用での条件下で長い半減期を有するα−アミラーゼを意味する。

「高い熱安定性」を有するとは、変異体酵素が高い温度の工程で活性を保持する 、あるいはその変異体酵素が由来する野生型の酵素より、同じ温度においてより 長時間活性を保持することを意味する。

「高い酸（あるいはアルカリ）安定性」を持つとは、変異体酵素がより低い（あ るいは高い）ｐＨ値でその野生型の酵素より高い活性を示すことを意味する。

向上した性質は１つか２つのアミノ酸の置換により生じたものであることを理解 すべきである。

染色体ＤＮＡはα−アミラーゼを含む微生物から単離できる。

好ましくは枯草菌属に属する細菌、さらに好ましくはバチルスリケニホルミス、 さらにより好ましくはバチルス　リケニホルミス　Ｔ５を用いる（ＥＰ−Ａ−１ ３４０４８参照）。染色体ＤＮＡは適当な制限酵素で消化し、ベクターにクロー ン化した。クローンの選択にはハイブリダイゼイション、免疫学的検出、酵素活 性の検出など多くの方法を用いることができる。制限酵素消化した染色体ＤＮＡ をクローニングするのに用いるベクターの選択は、使用可能なりローン選択の方 法に依存する。もしハイブリダイゼイションを用いるなら何も注意は必要でない 。しかし、もし検出が免疫学的なものまたは酵素活性に基づいたものであるなら ベクターは適当な発現シグナルを含んでいなければならない。α−アミラーゼを 含むクローンの実際の検出は、澱粉を含む寒天プレート上で行った。ヨード蒸気 存在下で増殖、培養した後ポジティブクローンの周りちハロー（ｈａｌｏ）が検 出される。次の段階として遺伝子の配列を決定する。そこから得られたアミノ酸 配列を、重要なアミノ酸についての最初の情報を得るために他の既知のα−アミ ラーゼの配列と比較するのに用いる（例　活性部位、Ｃａ”結合、Ｓ−８結合の 可能性など）。３次元構造を決定するとさらに詳しい情報が得られる。これはし ばしば手間がかかるので他の方法が用いられる。３次元構造がなくとも２次元構 造要素（例。

α−ヘリックス、β−シート）を決定する予測プログラムをうまく用い最終的に ３次元構造要素、例えばベータバレル（β−ｂａｒｒｅｌ）を決定できる。総説 としてジャコンとオダック、プログレス　イン　バイオフィジックス　アンド　 モレキュラーバイオロジー、４２巻、２１−７８頁、１９８３年がある。

重要なアミノ酸の置換を予想することができる。蛋白質の構造の安定性は蛋白質 の折りたたまれた部分と伸びた部分の間の自由エネルギーの合計差により決定さ れる。プロリン残基は他のアミノ酸よりとれる構造が限られているのでアミノ酸 がプロリンに置換されているときには蛋白質を伸ばそうとする空間配置上のエン トロピーは減少する（そしてそれにより安定性は上昇する）。別の有用な置換は グリシンをアラニンに置換することである。分枝したβ−炭素を持つトレオニン 、バリン、イソロイシンなどの残基は分枝していない残基よりも骨格のコンフォ メーションを制限する。

ある種の蛋白の熱安定性は部分的には塩橋によるのでリジンとアルギニン残基を 導入することは有用かもしれない（トモシックとクリバッフ、ジャーナル　オブ 　バイオロジカル　ケミストリー、２６３巻、３０９２−３０９６頁、１９８８ 年）。さらにアルギニンは新たな水素結合を形成することができるのでリジンを アルギニン残基で置換することにより塩橋の安定性を高めるかもしれない。総説 としてウィグビーら、バイオケミカル　アンドバイオフィジカル　リサーチ　コ ミュニケーションズ、１４９巻、９２７−９２９頁、１９８７年　参照。アスパ ラギンとグルタミンの脱アミド化は酵素の構造を大幅に破壊すると言われている ので非アミド残基への置換はこのような破壊を防ぐかもしれない。

アミノ酸の置換はＤＮＡレベルでの突然変異により最もうまくできる。

原則的に突然変異実験は単離したクローンに対しても即座に行うことができる。

しかし、挿入配列は突然変異／発現ベクターにクローン化する方が好ましい。ラ ンダム突然変異は可能であり、また部位限定突然変異（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔ ｅｄ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　）もまた可能である。前者の方法によると突然 変異をおこしたクローンは莫大な数に上ることを考慮し、また部位限定突然変異 について経験に基づき推測することができるα−アミラーゼの３次元構造は知ら れていないので、特定の部位においてランダム突然変異を行うことを決定した。

次に示すのは本発明を実行するための可能な方法である。

始めに遺伝子は「サイレント」制限酵素切断部位の導入を行うことにより修飾す る。非サイレント切断部位の導入も可能である。

このことにより遺伝子の特定の部位を欠損させることができる。

２番目に遺伝子はファスミドにクローニングする。このファージとプラスミドの 結合により１本鎖のＤＮＡを産生ずることが容易になる。１本鎖ＤＮＡを得る他 の方法も可能である。解離した２本鎖のベクター（挿入断片を含む）ＤＮＡを挿 入断片にギャップの入ったベクター／挿入断片の結合体とハイブリダイゼイショ ンすることにより、ギャップの入ったヘテロ２本鎖ＤＮＡが得られた（詳しくは 森永ら、バイオテクノロジー、２巻、６３６頁、１９８４年）。

ギャップは化学的あるいは酵素による突然変異においても用いられる。好ましく は我々の用いた重亜硫酸法（フォークとホフステッター、セル、３３巻、５８５ 頁、１９８３年）と酵素的な偽導入（ｍｉｓｊｎｃｏｒｐｏｒａＨｏｎ）法であ る（レートバアラら、プロティンエンジニアリング、２巻、６３頁、１９８８年 ）である。これらの方法はギャップ中の全ての１つのヌクレオチドを他の３つの ヌクレオチド全てと置換する（飽和突然変異）様に行うことができる。後者の方 法は数種の方法に応用することができる。そのうちの一つは合成プライマーをギ ャップとハイブリダイズする方法である。ついでプライマーから３′側の最初の デオキシヌクレオチドに相補的なデオキシヌクレオチドが欠けている部分におい て伸長反応を行う。原則的に他の３つのデオキシヌクレオチド全てをこのように 導入することができる。このことは３つのデオキシヌクレオチドの混合物を用い ることにより、あるいは１つのヌクレオチドを含む３つの別々の反応を用いるこ とにより達成される。

その方法を応用した別の方法によりランダムクローンが得られる。

つまりそれぞれ１つの限られた量のデオキシヌクレオチドを含む４つの別々の反 応を行う。この方法により各１つのヌクレオチドの前で止まる２番目の鎖を得る ことができる。次の段階は前述したように行うことができる。重亜硫酸法と酵素 的突然変異の方法の両者を変異体を得るのに用いた。

酵素的性質を調べるのに突然変異実験に用いた宿主細胞と同じ宿主細胞中でクロ ーニングした遺伝子を発現させるのが都合がよいかもしれない。原則的に宿主細 胞は適当な突然変異／発現ベクター系がその細胞に対して可能であればどんな細 胞でもかまわない。多くの場合大腸菌、例えば大腸菌ＷＫ６株などがとても便利 である。コロニーをマイクロタイタープレート中で増殖させた後プレートのウェ ルからとったサンプルを異なったｐＨ値にバッファライズした澱粉を含む寒天プ レートにスポットする。陽性クローンはハロー（ｈａｌｏ）形成により検出する ことができる。熱安定性、酸安定性、アルカリ安定性、生理食塩水安定性、スク リーニングできるその他の安定性について選択するのに適当な緩衝液を用いたス クリーニングを用いることができる。

変異体α−アミラーゼの産生に適当な宿主細胞株には、α−アミラーゼの発現が 可能である形質転換可能な細菌がある。特に枯草菌などのα−アミラーゼを得た のと同じ種あるいは属の宿主細胞株が適する。好ましくはα−アミラーゼを含ま ない枯草菌株であり、より好ましくはα−アミラーゼとプロテアーゼを含まない 枯草菌株である。

例えばバチルス　リケニホルミス　Ｔ９を大量の変異体α−アミラーゼを得るの に用いた。

好ましくは産生されるα−アミラーゼが培地中に（ＩＩ酵中に）分泌されること であり、これによりα−アミラーゼの回収が容易になる。分泌させるために、い ずれの適当なシグナル配列も用いることができる。

発現されたα−アミラーゼは宿主細胞から分泌され、ついで適当な方法により精 製することができる。例えばゲル濾過とモノＱクロマトグラフィーを挙げること ができる。単離されたα−アミラーゼは種々のＣａ”＋濃度（０，５−１５ｍＭ ）　、広いｐＨ値範囲（５，５−８，０）での熱失活について検討した。検討は 実際の適用条件下でも行った。特に変異体α−アミラーゼはｐＨ５，５からｐＨ ５，２５での澱粉液化の条件下で試験した。さらに繊維の糊抜きへの応用につい ても検討を行った。

スクリーニングされた変異体のいくつかの性質は期待する適用条件下でより適し ているであろう。

本発明は熱安定性、酸耐性、アルカリ耐性の上昇したα−アミラーゼについて開 示している。一般的に置換するアミノ酸の数は変異体蛋白の活性が野生型の酵素 の活性と同じかそれより良い限り重要でない。変異体α−アミラーゼは野生型酵 素と少なくとも１つのアミノ酸、好ましくは１つから１０個のアミノ酸が異なる 。

向上した性質を持つ具体的変異体として１１１，１３３．１４９番目（番号付け はバチルス　リケニホルミスのα−アミラーゼに従った）のアミノ酸の１つかそ れ以上の置換を含むα−アミラーゼがある。好ましいアミノ酸の置換にはＡｌａ −１１１−Ｔｈｅ。

Ｈｉｓ−１３３−Ｔｙｒ、Ｔｙｒ−１４９−Ｉ　１ｅがある。

このような変異体酵素は６．５以下及び／または、７．５以上のｐＨ値での活性 が向上した。例えば１１０度までの高い温度で半減期が長（なるなどの向上した 活性を示した。

入手可能なα−アミラーゼ製品の多くは細菌を原料として得られている。特に枯 草菌、例えばバチルス、ズブチリス、バチルスリケニホルミス、バチルス　ステ アロテルモフィリス、バチルス　コアギユランス、バチルス　アミ口すクエンフ ７シエンスである。これらの酵素は高いホモロジーと類似性を示す（結城ら、ジ ャーナル　オブ　バイオケミストリー、９８巻、１１４７頁、１９８５年；中島 ら、アプライド　マイクロバイオロジー　アンド　バイオテクノロジー、２３巻 、３５５頁、１９８６年）。従って、これらのα−アミラーゼの１つから得た好 ましい変異に関する情報は他のα−アミラーゼを改良するのに用いることができ る。本発明はそのような情報を得るためのアプローチを提供する。

次に述べるのは用いた実験上の方法と発明を具体的に示すための実施例である。

これらの実施例は単に説明のためであり、従って発明の範囲を限定することを意 図したものでは決してない。

実施例 材料と方法 １、一般的なりローニングの技術 クローニングの技術は以下のハンドブックに説明しであるものを用いた。マニア テイスら、モレキュラー　クローニング、コールド　スプリング　ハーバ−ラボ ラトリ−，１９８２年；アウスベルら、カレントプロトコールズインモレキュラ ーバイオロジー、ニューヨーク　１９８７年；パーパル、プラクティカル　ガイ ド　ツウ　モレキュラー　クローニング、第２版、ジョンウイリーアンドサンズ ■、ニューヨーク、１９８８年。これらのノＸンドブックは組み換え体ＤＮＡの 構築とその増殖、遺伝子ライブラリーを作る手順、ＤＮＡのシーフェンスと突然 変異のためのプロトコール、およびＤＮＡ分子に関する酵素の取扱いのプロトコ ールについて詳しく説明しである。

乙化学的突然変異 クローン化されたＤＮＡはＤＮＡ中に変異を導入するために試験管内（ｉｎｖｉ ｔｒｏ）で化学薬品で処理してよい。もしこれらの変異をアミノ酸をコードする トリプレットコドンに起こすならば、変異を起こしたクローン化ＤＮＡにより変 異体蛋白質が産生される。

重亜硫酸ナトリウムを用いた化学的突然変異の方法はショールとポートシュタイ ンにより説明されている（メリーズ　イン　エンザイモロジー、１００巻、４５ ７頁、１９８３年）。好ましい方法はフォークとホッフシュテッタ−（セル、３ ３巻、５８５頁、１９８３年）により説明されている。突然変異を起こす他の方 法はスミスによりアニュアル　レビュー　オブ　ジエネテイツクス、１９巻、４ ２３頁、１９８５年　に説明されている。特に有用なプロトコールはアウスベー ルらにより同誌に説明されている。

３、ギャップの入った２本鎖ＤＮＡの突然変異ギャップの入った２本鎖ＤＮＡを 用いる方法（クレイマーら、ヌクレイツク　アシッズ　リサーチ、１２巻、９４ ４１頁、１９８４年）とファスミド（プラスミド／ファージの）１イブリツド） を用いた。その方法は本質的に、野生型遺伝子の抗生物質耐性マーカーの入った ギャップの入った鎖（−鎖）と抗生物質耐性を与える遺伝子にアンバー突然変異 の入った鋳型鎖（十鎖）からなるギャップの入った２本鎖ＤＮＡの中間体を用い るものである。アニール後は、変異を起こしたオリゴヌクレオチドを試験管内の ギャップ埋め（ｇａｐ　ｆｉｌｌｉｎｇ）と結合（ｓｅａｌｉｎｇ）反応の間に ギャップの入った鎖に組み込む。その結果生じた分子を、目的とした突然変異と 抗生物質耐性マーカー間の連結を保持しているミスマツチ修復欠損宿主細胞株（ Ｍｕｔ　Ｓ）を形質転換するのに用いた。この株から分離した混合ファスミド群 は、サプレッサーを持たない宿主細胞株中で分離される。形質転換株は抗生物質 を含む培地のブレートにま（ことにより、ギャップの入った鎖から生じた子孫細 胞を選択する。

ツインベクター系ｐＭａ／ｃ５−８は、スタンセンらにより記載されているが（ ヌクレイツク　アシッズ　リサーチ、１７巻、４４４１頁、１９８９年）次の領 域からなっている。

ｐｏｓｌｌ−１０５：バクテリオファージ　ｆｄ、ターミネータ− ｐｏｓ　１２１−２１５　：バクテリオファージ　ｆｄ、ターミネータ− ｐｏｓ２２１−３０７：プラスミツドｐＢＲ３２２（ｐｏｓｐｏｓ３１３−７６ ８　：バクテリオファージ　ｆｌ、複製開始領域（ｐｏｓ５４８２−５９４３） ｐｏｓ７７２−２５７１　ニブラスミツド　ｐＢＲ３２２、複製開始領域及びβ −ラクタマーゼ遺伝 子 ｐｏｓ２５７２−２６８５　：　トランスポゾン　Ｔｎ９０３ｐｏｓ２５１９− ２７７２　：　）リブトフ７ンターミネータ（ダブル） ｐｏｓ２７７３−３２２９　：　トランスポゾン　Ｔｎ９、クロラムフェニコー ルアセチルトランス エラーゼ遺伝子 ｐｏｓ３７３０−３８０３　：マルチプルクローニングサイト配列は図１に示し ている。

ｐＭｃ型ベクターでは２２３８番目のヌクレオチドはＧからＣに変えられている のに対しｐＭａ型ベクターで３４０９番目のヌクレオチドがＧからＡに変えられ ているが、それは、それぞれアセチルトランスフェラーゼ遺伝子とβ−ラクタマ ーゼ遺伝子中にアンバー停止コドンを作り、該遺伝子を不活性化するためである 。

ここであげた全ての配列はシーンバンク（Ｇｅｎｂａｎｋ）　（Ｔ　Ｍ　）、ナ ショナル　ヌクレイツク　アシッド　シーフェンス　データバンクＮＩＨＵＳＡ から入手した。プラスミツドｐＭｃ５−８はＤＳＭ　４５６６として登録されて いる。突然変異を行うために目的のＤＮＡ断片はｐＭａ５−８のマルチプル　ク ローニングサイトに組み入れた。次に目的のＤＮＡを含むｐＭａ５−８とｐＭａ ５−８の間のギャップの入った二本鎖を構築した。

目的のＤＮＡから成る一本鎖のギャップは、突然変異誘発性オリゴヌクレオチド 、長い合成オリゴヌクレオチド、低いレベルで偽導入された（ｍｉｓｉｎｃｏｒ ｐｏｒａｔｅｄ）ヌクレオチド、化学薬品、または不規則突然変異ＰＣＲを適用 できる酵素的なヌクレオチドの偽導入（ｍｉｓｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に より突然変異を起こすことができる。

詳細はアウスベールら、（同上）あるいは、パーパル（同上）参照。試験管内突 然変異の他の方法としては、ＵＶ照射または化学薬品によるもの、あるいは大腸 菌ミューティター株を用いる生体内（ｉｎ　ｖｉｖｏ）突然変異を用いることが できる（ファウラーら、ジャーナル　オブ　バクテリオロジー、　１６７巻、　 １３０頁、１９８６年）。

突然変異誘発性ヌクレオチドはアプライドバイオシステムから入手可能な装置を 用い、合成できる。

４、ヌクレオチドの酵素的偽導入による不規則突然変異ｐＭａ／　ｐＭＣのギャ ップの入った２本鎖に対しプライマー伸長と偽導入突然変異を行うことができる 。これは最初にジョートルら（プロシーディンゲス　オブ　ナショナル　アカデ ミ−オブ　サイエンシズ　オブ　ＴＨＥ　ＵＳＡ　７９巻、１５８８頁、１９８ ２年）、カニングハムとウェルズ（プロティンエンジニアリング、１巻、３１９ 頁、１９８７年）により報告されたもので、この方法の改良法はトレバアラらに より報告されている（プロティン　エンジニアリング、６３巻、２頁、１９８８ 年）。

この方法はポリメラーゼの制限的使用に基づいている。始めにＤＮＡ分子の４種 を、ｐ　Ｍ　ａ　／　ｐ　Ｍ　ｃのギャップの入った２本鎖のプライマー伸長に より、ギャップの中で不規則に、しかしいつも決まった塩基種の前で停止するよ うに（それぞれ、Ａ、Ｃ，Ｇ、またはＴの前で）調製した。次に４つの各グルー プはそれぞれ別々の、今度は正しい塩基を除去することができる偽導入反応にお いて突然変異を起こした。この方法で全ての型の塩基置換型突然変異をギャップ の全ての位置において起こすことができる。クレノウボリメラーゼよりもシーケ ナーゼ（ＴＭ）　（Ｕ、　Ｓ、バイオケミカルコーポレイション）を好んで用い た。さらにレトバアラら（同上）らが用いたＭ　ｏ　Ｍ　ｕ　Ｌ　Ｖ逆転写酵素 をＡ、Ｍ、Ｖ、逆転写酵素の代わりに用いた。

１塩基置換を確認するため、レトバアラら（同上）のプロトコールに次の改良点 を導入した。逆転写酵素緩衝液中に３種でなく１種のみ偽導入ヌクレオチドを入 れる。例えば、Ａ特異的に制限された塩基伸長混合物は２５０μＭｄＣＴＰ、２ ５０μＭ　ｄＧＴＰ、２５０μＭ　ｄＴＴＰとそれぞれ別々の３種の反応液中で インキュベートする。４塩基特異的制限伸長反応混合物の完全な組み合わせに対 し、全部で１２種の偽導入反応を行った。４２℃で１．５時間のインキューベー ション後、４種全てのデオキシヌクレオチドを０．５ｍＭの濃度で加え、反応液 をさらに最低２０分間３７℃でインキュベートした。サンプルはレトバアラらの 方法（同上）により処理し、その中でウラシルを含むＤＮＡ鎖へのカウンターセ レクション（ｃｏｕｎｔｅｒｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）でなく　ｐ　Ｍ　ａ　／　ｃ ベクターに基づくカウンターセレクションを適用するという変更を行った。

５、変異体α−アミラーゼの生産 α−アミラーゼ遺伝子を含む発現ベクターを持つ大腸菌変異株ＷＫ６（ツエル、 フリッブ、エンボジャーナル、６巻、１８０９頁、１９８７年）を３０℃でＴＢ 培地（ＩＯＪ）に接種した。ＴＢ培地は０．０１７Ｍ　ＫＨｔ　ＰＯａ　、０． ０７２Ｍ　Ｋ！　ＨＰＯ４，１２ｇ／Ｉ！バタトトリブトン、２４ｇ／ｌバクト イーストエクストラクト、０．４％グリセロールと抗生物質（ｐＭａにはアンピ シリンまたはｐＭｃにはクロラムフェニコール）を含む。培養液の一部を２１の フラスコ中の２５０ｉのＴＢ培地に植え付いだ。

０Ｄｓｏｏが１０−１２のとき０．１　ｍＭ　Ｉ　ＰＴＧ　（イソプロピル−β −ｄ−チオガラクトピラノシド）を加え、さらに１２−１６時間培養を続けた。

６、変異体α−アミラーゼの精製 菌体は遠心により集菌し、２０％ショ糖を含む緩衝液に０℃で懸濁した。２回目 の遠心の後、菌体は冷水に懸濁した。菌体の残さは３回目の遠心により除き、上 滑を２０ｍＭ、ｌ□リス緩衝液でｐＨ８，０に合わせた。ＣａＣｊ！ｔを最終濃 度５０ｍＭになるよう加えた。サンプルは１５分間７０℃で熱処理し、不溶物を 遠心で除いた。上滑は０．２２μミリボアメンブレンによりろ過し、初期容量の １／１０まで濃縮した。

精製はさらに、ゲルろ過（ＴＳＫ　ＨＷ−５５−メルク社）とモノＱクロマトグ ラフィーにより行った。Ｍ　ｏ　ｎ　ｏ　Ｓクロマトグラフィーの前に酵素活性 を含むフラクションについて、酢酢ナトリウムを用い、ｐＨを４．８に調整した 。α−アミラーゼは２５０ｍＭＮａＣＩで溶出した。失活を防ぐため、ｐＨを速 やかに８．０に調整した。

実施例 実施例１ バチルスリケニホルミスのα−アミラーゼ遺伝子のモレキュラークローニング バチルスリケニホルミスのＴ５　（ＥＰ−Ａ−１３４０４８；ＣＢ８４７０．８ ３）から単離した染色体ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＫＩで消化し、ＰＵＢＩＩＯ（ グリンザンら、ジャーナルオブバクテリオロジー、１３４巻、３１８頁、１９７ ８年）のＥｃｏＲ１部位に組み込んだ。組み換え体はバチルスズブチリス１Ａ４ ０（バチルス　ジェネティック　ストックセンター）にトランスフオームした。

α−アミラーゼ産生について、ネオマイシン耐性コロニーを０．４ｇ／Ｉ！澱粉 （ツルコツスキー澱粉、メルク社）を加えたＨＩ寒天プレートで検定した。ヨー 素蒸気中で増殖、インキュベーション後、大きな透明のハロを作った陽性コロニ ーは次の解析に選択された。この陽性コロニーから単離したプラスミドはバチル スリケニホルミスＴ５から生じた３、　４　ｋ　ｂのＥｃｏＲＩ−Ｅｃ。

ＲＩ断片を含むことが示された。このプラスミドはｐＧＢ３３（ＥＰ−Ａ−１３ ４０４８；ＣＢ８４６６．８３）と命名された。

α−アミラーゼをコードする挿入断片は合成シャインダルガル１７配列とバクテ リオファージ５ｐｏｔプロモーターに組み込み、その結果できたプラスミドをｐ ＲｒｏｍｓＰＯｚとした（ＥＰ−Ａ−０２２４２９４参照。ＣＢ５６９６．８５ ）。サンガー法（プロシーディング　オブ　ナショナル　アカデミ−サイエンス オブ　Ｕ、Ｓ、Ａ、７４巻、６４６３頁、１９７７年）により決定したｐＰｒｏ ｍＳＰＯｚの挿入断片のヌクレオチド配列は図２に示した。配列はα−アミラー ゼをコードする１つの大きなオーブンリーディングフレームを示し、これは、結 城ら（同上）により決定されたバチルスリケニホルミスのα−アミラーゼの配列 と実質的に一致する。初めの２９個のアミノ酸はα−アミラーゼが分泌される際 切り出されるシグナル配列である。この応用を通じて、アミノ酸の番号づけは成 熟蛋白に応じた番号である。

結城の配列は、次の箇所において興なっている。１３４番目、ロイシンの代わり にアルギニンが存在し、３１０番目グリシンの代わりにセリンが存在し、３２０ 番目、セリンの代わりにアラニンが存在する。

実施例２ 突然変異／発現ベクターｐＭａＴＬｉ　ａ６の構築プラスミドｐＰＲＯＭ　５Ｐ ＯｔはＥｃｏＲＩとＢｃｌＩで消化し、１．８　ｋ　ｂのＥｃｏＲＩ−Ｂｃ　Ｉ 　Ｉ断片を精製し、ＥｃｏＲｌ−ＢａｍＨＩ消化したｐＭａ５−８に組み込んだ 。このｐＭａ５−８ベクターは改変したマルチプルクローニングサイトを前もっ て付加しておいた。図１の３７６７番目から３７８６番目のＢａｍＨＩ−Ｈｉｎ ｄＩ［［断片は図３の５６４７番目から５６６０番目に（るように合成りＮＡ配 列と交換した。このことは、α−アミラーゼ遺伝子中の制限酵素部位のいくつか を単一箇所にするために行った。生成したα−アミラーゼを含むｐＭａ５−８誘 導体はＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩとで消化し、ＴＡＣプロモーター（デュボアら、 プロシーディングズ　オブ　ナショナルアカデミーオブ　サイエンシズ　オブＴ ｈｅＵ、Ｓ、Ａ、８０巻、２１頁、１９８３年）のコピーをもつ合成りＮＡ断片 と連結した。この合成りＮＡ断片の配列は３７５７番目から３８５９番目まで、 最終的なα−アミラーゼの突然変異／発現ベクターのｐＭａＴＬｉａ６と共に図 ３に示した。この最終α−アミラーゼ突然変異／発現ベクターは突然変異実験の 際にα−アミラーゼ遺伝子中にギャップを生じるよう数か所サイレント制限酵素 切断部位を導入することにより完成した（図４）。この目的のため次の突然変異 を部位限定オリゴヌクレオチド突然変異を用いて行った。

−８ｐｅＩ部位をサイレント突然変異により導入した。

Ｔ４　９Ｔ　と　ｓｓ　ｏｓ ＡＣＧ　４ＡＣＴ　ＡＧＣ−ＡＧＴ −ＮａｒＩ部位をサイレント突然変異により導入した。

２６９Ａ ＧＣＧ４ＧＣＣ −ＢｓｔＥｎ部位をＴＡＧ終止コドンの下流直後に導入した。

ＴＡＧＡＡＧＡＧＣ−４７ＡＧＧＴＧＡＣにのα−アミラーゼ突然変異ベクター ｐＭａＴＬｉａ６はギャップ入り２本鎖法を用いた突然変異に適している。適当 な制限酵素による消化により調製した二本鎖ｐＭａＴＬｉ　ａ　６ＤＮＡはアニ ールし１本鎖ｐＭｃＴＬｉ　ａ６ＤＮＡとした。

生じた１本鎖ギャップに対し、実験の項に説明した部位限定突然変異、化学的突 然変異、そして不規則酵素的突然変異を行った。

α−アミラーゼ遺伝子の前にＴＡＬプロモーターをつけることによってＩＰＴＧ を加えることにより大腸菌にα−アミラーゼを誘導発現させ得る。

大腸菌ＷＫＳ中のプラスミドｐＭａＴＬ　ｉ　ａ６は１９８９年６月２日にＣＢ ５２５５．８９として寄託した。

実施例３ 突然変異と発現のための枯草菌／大腸菌シャトルベクターの構築このベクターは 大腸菌内での挿入した遺伝子の突然変異、及び枯草菌内での速やかな発現を可能 にする。ベクターの構築のために選んだ方法はｐＵＢ１１０系プラスミド（ブリ クザン、同上）をｐ　Ｍ　ａ　／　ｃツインベクター系と次のような方法で結合 することである。

１、バチルスサチリスの遺伝子単位（ｃａｓｅｔｔｅ）は１回の制限酵素切断及 び再ライゲーション実験により除くことができる。

２、異なるα−アミラーゼ遺伝子と異なるプロモーターを容易にこのベクターに クローン化することができる。

３、再環状化の後、クローン化した遺伝子は適当な枯草菌のプロモーターの制御 下に置くことができる。

４、　大腸菌の突然変異の間、枯草菌のプロモーターと構造α−アミラーゼ遺伝 子は大腸菌内にα−アミラーゼを蓄積させると致死的であるかもしれないのでそ れを避けるために物理的に分離する。

シャトルベクターの図は図５に示した。ベクターｐ　Ｂ　Ｍ　ａ　／　ｃｌの最 終的な構造は図６に示した。ベクターｐＢＭａｌは１９８９年６月２日にＣＢＳ 　２５２．８９として寄託しである。ベクターは次のように構築された。

−ＲＦＰ遺伝子とＮｅｏ”遺伝子を含むｐＵＢ］　ｌ　ＯのＥｃｏＲＩ−Ｓｎａ ＢＩ断片は精製しＥｃｏＲＩ−ＳｍａＩで消化したｐＵＣ８に組み込んだ。

−Ｂ　ａｍＨＩ　−Ｘｂ　ａ　Ｉポリリンカー断片はバクテリオファージＳ　Ｐ 　Ｏｔの５ＰＯｚプロモーターをコードするＤＮＡ　（ウィリアムスら、ジャー ナル　オブ　バクテリオロジー、１４６巻、１１６２頁、１９８１年）及びＳａ Ｃ■、ＡｐａＩ、ＸｈｏＩ、５ｕｃＩ、ＢｇｌＩ、ＭｌｕＩとＸｂａＩの制限酵 素認識部位の合成断片で置換した。

−ｐＭａ５−８０の単一のＥｃｏＲＩ部位は、次の制限認識部位を構成するポリ リンカーＤＮＡ断片を挿入するのに用いた：ＥｃｏＲＩ、ＳｍａＩ、５ａｃＩ、 ＥｅｏＲＶ、５ｐｈＩ、Ｋｐｎ　Ｉ、Ｘｂａ　Ｉ、及びＨｉ　ｎｄ　ＩＩＩ、特 定の目的のために誘導体ｐＢＭａ／ｃ２とｐＢＭａ／ｃ６がｐＢＭａ／ｃｌから 開発された。

−ｐＢＭａ／ｃ２ではｐＢＭａ／Ｃ１のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎａｌＩＩポリリンカ ーはｐＵＣＩ　９の相当するポリリンカーにより置換した。

−ｐＢＭａ／ｃ６ではさらにｐＢＭａ／ｃｌの右のポリリンカー中の５ａｃＩ部 位をクレノー反応により除いた。

バチルスリケニホルミスのα−アミラーゼに対する部位限定突然変異はｐＢＭａ ／ｃ　６　Ｌ　ｉ　ａ　６を構築した後行った。このベクターはｐＭａＴＬｉａ ６から単離したＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄｌｌＩ断片をＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩ［ により開裂させた上述のｐＢＭａ／ｃ６に組み込むことにより構築した。生じた プラスミド（図７）は大腸菌の突然変異でギャップの入った２本鎖を構築するの に用いることができる。

生じた変異体はチャンとローエンの方法に従い（モレキュラーアンド　ジェネラ ル　ジュネティックス、１６８巻、１１１頁、１９７９年）ＳａｃＩによる制限 酵素処理、再ライゲーション、及びトランスフォーメーションによりバチルスズ ブチリス　ＩＡ４０　（ＢＧＳｃ　ＩＡ４０）で発現させた。

実施例４ 完全な成熟蛋白としてのバチルスリケニホルミスのα−アミラーゼの大腸菌にお ける発現 ｐＭａＴＬｉａ６（例２）により産生されたα−アミラーゼの解析によりα−ア ミラーゼの一部は分泌される間に誤って修飾されることがわかった。アミノ末端 シーフェンスにより大腸菌ＷＫ６の産生ずるα−アミラーゼは余分なアラニン残 基があることがわかった。

このことによりアミラーゼが異なる性質を持つか否かわからないが、α−アミラ ーゼのシグナル配列をアルカリホスファターゼＰｈｏＡのシグナル配列と交換し た。この目的のためＦｓｐＩ制限酵素切断部位をｐＭａＴＬｉａ６のシグナルペ プヂドと成熟α−アミラーゼの連結部位に導入するように突然変異実験を行った 。

ＦｓｐＩとＢａｍＨＩ消化の後、ｐｈｏＡシグナル配列（ミカエリスら、ジャー ナルオブバクテリオロジー、ｉ５４巻、３６６頁、１９８３年）をコードする合 成りＮＡ断片を挿入した。このプラスミドの配列は図８に示す。ｐＭａ／ｃＴＬ Ｐ　ｉ　ａ６が産生するα−アミラーゼは正確なアミン末端配列を持つことがわ かった。

実施例５ 安定なα−アミラーゼのスクリーニングＡ、酸耐性α−アミラーゼ突然変異体の スクリーニング野生型α−アミラーゼよりも低いｐＨで良くも悪くも活性を示す α−アミラーゼ突然変異体は、異なるｐＨ値で緩衝化した澱粉プレートにできる ハローをヨウ素液ででんぷんを染色した後に比較することにより選択できる。

方法； １、増　殖 突然変異株の候補はマイクロタイタープレートで増殖させる。

増殖培地はプレインハートインフュージョンブロス２５０μ！（ディフコ社）で ある。補足したものはクロラムフェニコール　５０ｇｇ／ｍｌ！、Ｐ、Ｔ、Ｇ、 （シグマ社）　０．２ｍＭＣａＣｊ７．　２ｍＭ コロニーは滅菌つまようじで寒天プレートから拾いマイクロタイタープレートの 各ウェル（９６）に植菌した。各プレートには４つの野生型コロニーを対照とし て植菌した。

これらのマイクロタイタープレートは振とうせず４０時間３７℃に置いた。

２、プレート試験 α−アミラーゼの産生されたインキュベーション後、各ウェルからサンプル５μ ｌをとり２種の異なった種類の寒天プレート（１４４ＸＩ４０ｎｍ）にスポット した。第一のタイプは栄養分の多いハートインフュージョン寒天プレート（Ｄ　 Ｉ　Ｆ　Ｉ　０社）＋０．４％澱粉（ツルコツスキー澱粉−メルク社）＋クロラ ムフェニコール５０μｇ／ｒｎ！である。３７℃１６時間インキュベーションの 後、このプレートは突然変異体を保存するのに用いられた。

第２のプレートのタイプは実際のスクリーニング用のプレートで、バクトラガ− （Ｄ　Ｉ　Ｆ　Ｉ　０社）ｌ、５％ソルコフスキー澱粉０．２％を含む。寒天と 澱粉は合成生水（ＳｔＷ）に溶解した。これは脱金属水＋ＣａＣ１，２ｍＭ Ｍ　ｇ　Ｃ１２１ｍ　Ｍ Ｎ　ａ　ＨＣＯｓ　２．５　ｍ　Ｍ ＢＳＡ　ｌｌｚｇ／ｍ／！　である。

スクリーングプレートはこの培地中に５Ｍのストック用酢酸カリウム緩衝液を１ ００倍希釈して緩衝化する。測定した寒天プレート中の最終ｐＨ値はストック用 溶液より少し低い。各ウェルから５μｌの培養液を異なったｐＨ値の３種のスク リーニングプレートにスポットする。

ｐＨ値の範囲は最低ｐＨ値のプレートにおいて野生型のα−アミラーゼに対し、 はとんどまたは全（活性が残存しないように選ぶ。

３、染　色 スクリーニングプレートは５５℃で２時間インキュベートする。

この後ヨー葉液をプレートに注ぎかける。１０倍ヨウ素液は１βにつき３０ｇの ヨウ素と７０ｇのＫＩを含む。

スポットの透明な部分の面積はそのｐｌにおいて残存するα−アミラーゼ活性と 相関する。野生型株の対照より高い活性を示した突然変異株は第２次のスクリー ニングに選択する。野生型の）＼ローはこの実験において良好な再現性を示す。

４、第２次スクリーニング 栄養分の高いプレートから陽性コロニーを拾い新たなＨｌプレート＋クロウムフ ェニコール上で精製する。各突然変異株から４つのシングルコロニーを拾い、第 一次スクリーニングの際と同様の方法で再度検定する。さらに、これらの培養液 の希釈系列をＳＴＷで作りそれを中性ｐＨのスクリーニングプレート（ｐＨ＝　 ７．０　）にスポットする。野生型株の培養との比較から低いｐＨで高い活性を 示すのがα−アミラーゼの産生が全般に高かったためか本質的により安定なα− アミラーゼのためであるのかを決定することができる。

第２次スクリーニングに「生き残った」突然変異株は突然変異をおこされた遺伝 子の部分のヌクレオチド配列を決定することにより解析を行う。

Ｂ、アルカリ耐性α−アミラーゼのスクリーニングアルカリ耐性のα−アミラー ゼのスクリーニングは酸耐性α−アミラーゼに用いられた方法と同様の方法で行 われる。マイクロタイタープレートで増殖後サンプル５μｌを各ウェルからとり 保伴用プレートと実際のスクリーニングプレートにスポットする。

後者は バクドアカー（ＤＩＦＣＯ）　１．５％ッルコフスキーでん粉　０．２％　を含 み、脱金属水とＣａＣ１，２ｍＭ Ｍｇ、Ｃ１ｔ　１ｍＭ ＮａＨＣＯｓ　２．５ｍＭ ＢＳＡ　］　０μｇ／−を加え完成する。

スクリーニングプレートは ｐＨ値９．０．９．５．１０．０の５０ｍＭ炭酸／重炭酸緩衝液で緩衝化する。

ｐＨ値の範囲は最も高いｐＨ値において野生型のα−アミラーゼがほとんどまた は全く活性を示さなくなるように選ぶ。５５℃で２時間培養後ヨー葉液をプレー トに注ぐ。野生型酵素よりよいハローを形成した突然変異株はスクリーニング第 ２段階に選択する。この第２次スクリーニングは酸耐性株のスクリーニングの際 と同様の方法で行う。

Ｃ０熱耐性α−アミラーゼ突然変異株のスクリーニング高温で野生型α−アミラ ーゼより高いあるいは低い活性をもつα−アミラーゼ突然変異体は加熱後の培養 液の残存するα−アミラーゼ活性により生じた澱粉プレートのハローの比較によ り選択することができる。

方法； １、　突然変異体はｐＨスクリーニングの際と同じ方法で増殖させる。

２、突然変異体をｐＨスクリーニングの際のようにＨ１寒天プレート上で増殖さ せる。

３、　マイクロタイタープレートの各ウェルを加熱時に培養液が蒸発しないよう 使い捨てキャップ（フロララボラトリーズ）で密閉する。

４、　マイクロタイタープレートを水浴で９５℃１時間加熱する。

加熱後マイクロタイタープレートはサンプル全てをマイクロタイタープレートの 底に集めるため遠心した。

５、　熱耐性突然変異体のスクリーニングは次のように行った。各ウェルから５ μｌの培養液をとり中性のスクリーニングプレー）　（＋）Ｈスクリーニング参 照）にスポットした。このプレートは５５℃１時間培養した。

ヨウ素液で澱粉を染色した後突然変異体と対照はスポットの透明部分（ハロー） を比較することにより残存するα−アミラーゼ活性に対するスクリーニングを行 うことができる。

対照の残存する活性が高すぎる場合、野生型酵素より熱耐性の突然変異体を識別 するため希釈系列を作製しスクリーニングプレートにスポットしなければならな い。

６、興味深い突然変異体である可能性のあるものはｐＨスクリーニング法で行っ たようにさらに試験する。

スクリーニングタイプＡまたはＢとＣの組み合わせは、組み合わせた特長を望む ならば用いることができる。例えばアルカリ耐性のα−アミラーゼのスクリーニ ングの第一次段階の後、熱耐性のスクリーニングの第２段階を行うことができる 。両方の試験で陽性の結果を示した突然変異体は望ましい性質を合わせ持った候 補として選択することができよう。

実施例６ ｐＭａＴＬｉａ６の重亜硫酸突然変異 ４３１５番目から４５６９番目（図３）までのギャップの入ったヘテロ２本鎖を 得るためｐＭａＴＬｉａ６の１本鎖ＤＮＡを５ａｃｌＩ−ＣＩ！ａｌで切断した ｐＭｃＴＬｉａ６と共にアニールした。このヘテロ二本鎖に対し重亜硫酸突然変 異を行った（実施例参照）。

大腸菌ＷＫ６ｍｕｔＳ（ツエルとフリッツ、同上）に導入し、クロウムフェニコ ールを含む寒天プレート（５０Ｉｇ　／ｍ／）で選択後、プラスミドＤＮＡを単 離し大腸菌ＷＫ６に導入した。大腸菌ＷＫ　６　Ｍｕ　ｔ　ＳはＣＢ５４７２． ８８として、大腸菌ＷＫ６はＣＢ５４７３．８８として寄託されている。生じた 形質転換体は２．０ｍＭ　ＣａＣ１ｔ、５０Ｉｇ／ｍｊ？クロラム７　ｘ−：］ −ル及び０．２０ｍＭ　ＩＰＴＧ　（シグマ社）を含むＢＨＩ培地（ＤＩＦＣＯ 社）中３７℃４０時間、マイクロタイタープレートで振とうせず培養する。ｐＨ 耐性突然変異体のスクリーニングは実施例５で述べたようにして行った。約３０ ０個のクロラムフェニコール耐性形質転換株をスクリーニングした。ＤＮＡシー クエンスにより決定した突然変異頻度はギャップ上平均０．４回／分子であった 。１つの酸耐性突然変異体Ｄ７がｐＨスクリーニングの後同定された。

この突然変異体の配列からトリブレットがＣＡＣからＴＡＣに変わったことによ るＨ１３３Ｙの変異であることがわかった。

突然変異体Ｄ７は熱耐性スクリーニングアッセイ（実施例５）においても陽性で あることがわかった。

５ａｃｌＩ−Ｃ１ａＩ断片の直前から始まるよう計画された特定のオリゴヌクレ オチドを用い、１本鎖ＤＮＡのＤＮＡシークエンスが行われた。別々の突然変異 実験において１０００個のクロラムフェニコール耐性形質転換体をスクリーニン グした。他の酸耐性突然変異体である２Ｄ５がｐＨスクリーニングの後同定され た。

この突然変異体は次の変異を持つ。

Ｈ１３３Ｙ　ＣＡＣ−ＴＡＣ Ｔ１４９Ｉ　ＣＡＣ−＋ＡＴＡ 重亜硫酸突然変異を図３の４５６９番目から４９７６番目までのＣ１ａＩ−Ｓａ ｌＩギャップに対してもこれまで述べたのと同様の方法で行った。約３００個の クロラムフェニコール耐性形質転換株をスクリーニングした（突然変異頻度０． ６回／分子）。酸耐性形質転換体は全く見出されなかった。多数の階下安定な変 異体を見出した。この酸に不安定な突然変異体の中にはよりアルカリ耐性の表現 型を生じるｐＨスペクトラムの移行があるものがあるのかもしれない。

実施例７ ｐＭａＴＬｉ　ａ　６の酵素的突然変異４５６９番目から４９７６番目（図３） までに渡るヘテロ２本鎖を得るため、（１！ａＩ−８ａｆＩで切断したｐＭｃＴ Ｌ　ｉ　ａ　６と共に、１本鎖ｐＭａＴＬｉａ６　（図４）をアニールした。ギ ャップの入った２本鎖に対し実施例に述べたように酵素的に偽導入し突然変異を 行った。

ｄＡＴＰ制限プライマー伸長後に得たサンプルは３つに分け、それぞれｄｃＴＰ 、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰと共に逆転写酵素存在下インキュベーションした。３７℃ ｌＯ分間インキュベージジン後４つ全てのｄＮＴＰとクレノウボリメラーゼを加 え反応させ、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼを完全に２本鎖ＤＮＡに伸長させるために加 えた。

このＤＮＡは大腸菌ＷＫ６ＭｕｔＳに導入し、プラスミドＤＮＡを回収した。プ ラスミドＤＮＡは続いて大腸菌ＷＫ６に導入しクロラムフェニコール（５０Ｉｇ 　／　ｄ　）を含む寒天プレート上でコロニーを選択した。得られた突然変異株 は実施例５で述べたようにα−アミラーゼの安定性に関してスクリーニングを行 った。

別の実験で５ｐｅＩ−８ａｃｎギヤツプに対し、それぞれｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、 ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰとの制限プライマー伸長を行った。このプライマ一群に対 し偽導入（実験の項参照）により突然変異を行った。１００個のクロラムフェニ コール耐性形質転換株をｐＨプレート上で試験しく実施例５）突然変異体Ｍ２９ を低いｐＨでより耐性を示すと同定した。この変異は次の配列であると決定した 。ＡＩＩＩＴ　ＧＣＧ−ＴＣＧ実施例８ 耐性突然変異体の性質 重亜硫酸突然変異実験で得られた２つの突然変異体をさらに解析した。前述した ようにＤＮＡシークエンスにより次のアミノ酸の置換が示唆された。

−Ｄ７では１３３番目のヒスチジンの代わりに千ロジンを含み（Ｄ７＝Ｈ１３３ Ｙ）、 一２Ｄ５はＤ７の変異とその他に１４９番目のトレオチンがイソロイシンに置換 されている（２Ｄ５＝Ｈ１３３Ｙ、Ｔ１４９Ｉ）。

ａ）酵素活性の測定 バチルスリケニホルミスのα−アミラーゼの野生型と突然変異体の酵素活性を４ −ニトロフェニル−マルトペンタオシド（４ＮＰ−ＤＰ５）を基質として用い測 定した。反応の結果４ニトロフエノールとマルトペンタオースが生じ０Ｄ４０５ の変化を測定することにより活性を調べることができる。アッセイは５０ｍＭＭ ０ＰＳ、５０ｍＭＮａＣｊ？、２ｍＭＣａＣ１ｔ　（ｐＨ７，１５）及び０−１ ｍＭ４ＮＰ−ＤＰ５存在下３５℃で行った。

初速度を測定し、Ｅ−ニトロフェノールはｉｏ、００ＯＡ／Ｍ１ｃｍと定めた。

図９に野生型酵素と２Ｄ５α−アミラーゼについての結果を示す。ＶｍａｘとＫ ｍを計算し表１に示した。

表１ Ｖｍａ　ｘ　（μｍｏ　１／ｍ　ｉ　ｎ／ｍｇ　Ｋｍ　（ｍＭ）ＷＴ　６６．７ ±０．９　０．１１２±０．００５２Ｄ５６６．３±０．７　０．１１９±０． ００４表１はα−アミラーゼ２Ｄ５の変異が本質的に酵素活性に影響を及ぼさな いことを明らかに示している。

ｂ）熱失活性に刻するＣａ”の効果 種々のカルシウム濃度下での熱失活性実験を野生型酵素、Ｄ７．２Ｄ５に対し行 った。方法は以下の通り。

ｌ）脱金属 酵素（２−３■／−）は２４時間以下の緩衝液に対して透析３ＸＩＬ　２０ｍＭ 　ＭＯＰＳ ５ｍＭ　ＥＤＴＡ ５ｍＭ　ＥＧＴＡ　ｐＨ７，０ ３ＸＩＬ　２０ｍＭ　ＭＯＰＳ　ｐＨ７，０２）再金属付加 −５００ｕｌ緩衝液１００ｍＭＣ例ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＥＤＰＳ）”−１４５μ ｌ脱金属化酵素（例、２．１５■／ｍ／）−１００ｕｌ　ＣａＣ１ｔ　（１００ ，５０，３０，２０，１Ｏ１５：または２．５ｍＭ） Ｘｕ　ｌ　Ｋ！　Ｓ　Ｏａ　（１００ｍＭ）−（２５５−Ｘ）μｌＨ１゜ ＣＣａＣ１ｔ”Ｊ最終濃度　（Ｋ！　ＳＯ４）最終濃度（ｍ　Ｍ　）　（ｍ　Ｍ 　） ＊−ＭＥＳのｐＨ・例、室温で６，７７は９０℃で６゜０となる。

（ｐＫａ６．１５　ｐＫａ／℃＝−０，０１１）。

−ｐＫａ値はメルク社の表（２価イオン緩衝液）から採用した。

３）熱失活 約０．２■／ｄの濃度の、室温でブレインキュベーションした酵素液１ｒｎｌを 密閉したピアスバイアル（テフロンコートしたシール）中で９０．５℃または９ ５℃で熱した。Ｏから６時間後一定時間ごとにシリンジでサンプルＳＯμｌをと り氷上で冷却した。残存する酵素活性を４ＮＰ−ＤＤ５　（０，５ｍＭ）を用い 測定した。

シングル　エフスボネンシャル　デケイ　フイテイング　プログラム（Ｓｉｎｇ ｌｅ　ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ　Ｄｅｃａｙ　Ｆｉｔｔｉｎｇ　Ｐｒｏｇｒａｍ ）、（グラフパッド社　ＧＲＡＰＨＰＡＤ）を用い半減期を計算した。

図１０，１２に野生型酵素とＤ７α−アミラーゼのＩ）Ｈ５，５及びｐ）１７． ０各々での９０．５℃での半減期をＣａ　”’ａ度の関数として示している。２ Ｄ５のＣａ　”依存性は９５℃においてはｐＨ７，０においてめたのみである（ 図１２）。変異体のＣａ”依存性も野生型酵素の場合と変わらないことがわかる 。

Ｃ１異なるｐＨ値での突然変異体α−アミラーゼの熱耐性Ｄ７と２Ｄ５両方の熱 耐性のｐＨ依存性を上述したように１ｍＭＣａ’＋を含む緩衝液中で９０．５℃ 及び９５℃各々においてめた。

Ｄ７と２Ｄ５両方について熱耐性はｐＨの範囲全般において大きく向上した（２ Ｄ５では２倍まで）と結論できる。

実施例９ 枯草菌での突然変異体酵素の産生 バチルスリケニホルミスのα−アミラーゼでの突然変異遺伝子は大腸菌ＷＫ−６ において発現させることにより同定されたが、これを２つの異なった方法で枯草 菌の発現ベクターに挿入した。

ａ）α−アミラーゼ遺伝子の単一の制限酵素切断部位を用い（図４）、突然変異 個所を含むＤＮＡ断片をｐＭａＴＬｉａ６突然変異株から単離しｐＢＭａ６、Ｌ ｉａ６の相固な位置にサブクローンした。後者のプラスミドは大腸菌、枯草菌い ずれにおいても複製できるが、それを次にＳａｃ　Ｉで切断しＴ４ＤＮＡリガー ゼで再環状化した。バチルスサチリスｌＡ４０に導入後、５ＰＯ２プロモーター 制御下でα−アミラーゼの多量の産生が認められた。再環状化したｐＢＭａ６、 Ｌｉａ６はベクターの大腸菌のＤＮＡ断片が除かれたのを示すためにｐＨ６、Ｌ ｉａ６と命名する。

ｂ）ｐＢＭａ６、Ｌｉａ６の１本鎖ＤＮＡを大腸菌から再回収し、α−アミラー ゼ遺伝子上に目的のギャップをもつ２本鎖ＤＮＡを得るために制限酵素で切断し たｐＢＭｃ６、Ｌｉａ６の２本鎖ＤＮＡとアニールした。このギャップに対し望 む突然変異をコードするオリゴヌクレオチドとの部位限定突然変異（実験の項で 述べたように）を行った。ｐＢＭｅ６、Ｌｉａ６ベクターは次に上述したように ｐＨ６、Ｌｉａ６型ベクターに変換する。

ａ）においてはもし突然変異が異なるギャップで選択的におこるならば、異なる 単一部位突然変異（ｓｉｎｇｌｅ　５ｉｔｅ　ｍｕｔａｔｉｏｎ）の組み合わせ を行うことができるが、方法ｂ）を用いる。

突然変異株Ｄ７と２Ｄ５の変異ＤＮＡは、方法ａ）により、５ａｃＩＩ−８ａｆ ＩＤＮＡ断片を交換することによりｐＢＭａ６、Ｌｉａ６に挿入した。そしてα −アミラーゼを形質転換したバチルスズブチリスＩＡ４０の培養上清から回収し た。両方の突然変異株の培養上清に対し実施例のスクリーニング操作を行い、両 方の突然変異株は野生型株のｐＨ６、Ｌｉａ６により産生されたα−アミラーゼ より酸耐性かつ熱耐性であるα−アミラーゼを産生ずることを確かめた。

従って、枯草菌でのα−アミラーゼ突然変異株の表現型は大腸菌での表現型と異 ならない。

最終的にｐＨ６、Ｌｉａ６突然変異体は、バチルスリへニホルミスＴ９に導入さ れた。この菌はバチルスリヘニホルミスＴ５のプロテアーゼ、α−アミラーゼ欠 損類縁株である（ＥＰ−０２５３４５５、ＣＢ５４７０．８３）。宿主のＴ９は 宿主と同一の系でα−アミラーゼの突然変異株を多量に産生ずるために用いられ た。

染色体のα−アミラーゼ遺伝子がないためにこの株は野生型のα−アミラーゼが 全く混合して産生されないので突然変異株α−アミラーゼを産生ずるのに非常に 適している。この菌株から回収した酵素は工業上の応用試験に用いた。突然変異 体ｐＢ６、Ｌｉａ６．２Ｄ５とｐＨ６、Ｌｉａ６、Ｄ７の工業上の利用を示した 。

実施例１Ｏ 澱粉分解の条件下での突然変異株α−アミラーゼの応用試験突然変異株α−アミ ラーゼ２Ｄ５をより実際的状況で試験するため、我々は限外濾過により発酵培養 液（実施例９）を精製し酵素を５０％プロブレンゲリコールで処理した。

３種のサンプルを試験した： ８９３７０１：野生型株　バチルスリへニホルミスＴ５α−アミラーゼ１５３０ Ｔ　Ａ　Ｕ／　ｇ ８９３７０３：　２Ｄ５　野生型と同様に調製した突然変異株２８２０Ｔ　Ａ　 Ｕ／　ｇ Ｍａｘａｍｙｊ７０８１９　工業用サンプル　７０９０ＴＡＵ／ｇＩＴＡＵ（熱 耐性α−アミラーゼ単位）は標準化した条件下で１分間にＩｇの澱粉をヨウ素と 反応後６２０ｎｍで対照の色と同一の吸収を持つ産物に変換する酵素の量として 定義する。標準条件はｐＨ６，６，３０℃、反応時間２０分である。対照の色は １００−蒸留水中２５ｇｃｏｃｊ７ｔ　・６Ｈ！　Ｏ１３，８４ｇ　ＫｔＣｒｔ Ｏｌ及び１ｍｊＨ（１（ＩＭ）である。

１、低いｐＨ（５，５及び５．２５）での液化試験澱粉のスラリーの温度を１１ ０℃±０．５℃にできるだけ急速に上げ６分間この温度に保つ。

液化は連続的流路（５，４ｊ！／ｎ）中で行う。ｌ　３５Ｊ　（液化１．５分） の３種のサンプルを液化４５．６０、及び７５分後取り、９５℃に２時間保つ。

この後、サンプル５０ｒｎｌを１ＮＨｔｓＯａ０．４−でｐＨ３，５に調整し、 Ｄ、Ｅ、決定の前に酵素活性を止めるために１０分間沸騰水に入れる。

サンプルの残りは残存酵素活性を測定するため冷却する。

スラリー組成： ３．３ｋｇとうもろこしでん粉り、８．８８％（２，９０４ｋｇ乾燥澱粉）。

３、４５　ｆ　井戸水（４０Ｔ、Ｈ，）スラリーの乾燥物質は３３％。

ｐＨはＩＮ硫酸または１ＮＮａＯＨにより調整する。

酵素濃度：　４．４ＴＡＵ／ｇｒ乾燥澱粉。

流速は試験の間２．３回確認する。

２、Ｄ、Ｅ、測定 液化澱粉の乾燥物質を屈折率測定計により確認する（約３４％）。

Ｄ、Ｅ、は有名なレインエイノン法により決定する。結果は図１５に示す。

３、残存酵素活性 液化澱粉中の残存アミラーゼ活性は、ブラベンダーアミログラフを用いて測定し た。

４０ｇ　ジャガイモ澱粉 ３９〇−蒸留水５０℃ ５０ｒｎ！　）リス緩衝液　０．０５Ｍ　ｐＨ６，５０５ｍＭ　３０ｇ／ｌ　Ｃ ａＣ１ｔ　・２Ｈｔ　Ｏ粘度が安定したら（１０分）温度を８０℃に上げ（１， ５°／分）希釈した液化澱粉５Ｊ　（７ｇを蒸留水で５０艷にする）を加え、２ ０分後粘度の減少を測定する。この減少は酵素活性と相関している。既知の酵素 濃度を用いた標準曲線によりＴ、Ａ、Ｕ、で表される残存活性を推定することが できる。

変異体２Ｄ５はｐＨ５，５以下及び１１０℃におＬＸで野生型酵素より顧著に高 い活性を示す。変異体２Ｄ５についてｐＨ５，２５ｉこお０て２−３ＤＥ単位の 上昇が得られる。

実施例１１ 変異体α−アミラーゼの繊維糊抜きの条件下での適用試験アルカリ性α−アミラ ーゼ変異株の工業的応用を試験するため次の溶液中で２０℃での安定性に関して 試験を行う。

１、４％　過酸化水素（３５％） １、０−１．５％　苛性ソーダ（１００％）１５−２０１ｎｌ／ｊ’　ケイ酸ナ トリウム（３８Ｂｅ）０、３−０．５％　スルホン酸アルキルベンゼン（Ｌａｎ ａｒｙｌ　Ｎ。

Ａ、−ＩＣＩ） ０、５−１．０％　有機安定剤（Ｔｉｎｏｃｌａｒｉｔｅ　Ｇ）２．５時間イン キュベーション後、望ましい性質を有するために選んだ変異体α−アミラーゼに はいくらかの酵素活性が残存するはずである。

ＡＡＴｒＣＡＣＣＴＣＣＡＡＡα頂ＡＧＣＴＧＡＴＡＡＡＣＣＣＡＴ＾ｃｓＡ貫 ＡＭＧＣロη＝７Ｔｎ和ＣＣＴｎ’１’ｉｇｕ＝ａ　１ ＧＣＴＡ　ＣＡＣＡＩ７ｒＣＴＴＣＡＡ　［Ｉ）’ＡＡＣＴＡＣα；ＣＴＡＣＡ ＣＴＡＧ野αＱＣＡＧＴＡηテ■πＡＴＣＣＡＧＴＣＴＡ’ｒｒＡＡｒｒｃ’ｒ ｒｅｃＣＧＧＧＡＡＧＣＴＡＱＡＧＴＡＡＣｒＡ　σｎ℃ＧＣＣＡＧＴＴＡＡＴ ＡＧｒｌ’ｒＧ３９９０　２ＣＫ）０　２０１０　２０２０　２０３０　２０４ ０ＣＧＣＡＡＣσｒｘホＴＧｃＣＡＴｒＧＣ’１ＴＣＡ　０ＧＣＡＴＣＣｒＣｔ ］刀′ＣＡＣＧＣ’ｒＣ（ｉＴ’ｃＣＴＩＴα汀ＡＴＯＯＣＴＴｃＡＴｒＣＡＧ ＣＴＣＣｆｌ刀ゴ’ＣＩｃＡＡＣＩ：ａＡＴＣＡＡＧＧＣＧＡ　渭ＡＣ＾ＴＣＡ 丁ＣＣＣＣＣＡＴＣｒＴＣ；ＴＣ；ＣＡＡ` Ｐｉｇ、１　（ＣＯｎｔ工ｎｕｅａ　）７〒ｎｍＧＴＡＣＴＣＡＡＣＣＡＡＧｍ ＡＴｒＣＴＣＡＣＡＡＴＡｆｆｌＡＴｃｃＣＧＣＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴｒＡＴ ｒｒｒｒＣ′ＩＴｒＡＣαＴＣＴＴＴんυＩＡＡＧＣＣＣＣＴＡＡＴＡＴＣＣＡ ＣｆｌＡＡＡＣα刀で一χπ３４３０　３＋４４０　３＋Ｊ５０　３１１６０　 ３４７０　３４８０ＴＡＴＡＧＣ’ｒＡＣＡ”１ＴＣ−ＡＧＣＡＡσ■込口１ん μ丁ｃｃｃ’ｒｅλＡＡＡｍＡＣＣＡＴＩ：；ＣＣＡＷＧ３４９０　３５００　 Ｂ５１０　３５２０　３５３０　３５４゜ＡＴＡＴＡＴＣＡＡＣαπ■汀ＡＴＡ ＴＣＣＡ（ｍにコＴ丁−Ｔ口℃ＣＡＴＴｒＴＡＧＣＴｒＣＣＴＴＡＧＣＴＣＣＴ ＧＡＡＡＡＴＣＴＣＣＡＴＡＡＣＴＣＡＡＡＡＡＡＴＡＣＣＣＣＣＧＧＴＡσ■ 漬ＴＣＴＴＡＴＩＴＣＡＴＴＡ−χＴＧＡＡＡ（ｒＣＯＧＴＡＴＣＡＡＣＡＧＧ ＧＡＣＡＣＣＡＧ　ＧＡＴＩＴＡＴｒＴＡＴｍＴＯＣＣＡＡσＴＣＡＴＣＴＴＣ ＣＧＴＣＡＣＡＧＣｒｒＡＴＴＴＡＴＴＣＣＡＡＧＡＣ（、ＩＩＡＡＧＧＧＣＡ π：ＧＣＧＣＣＣＧＧＧＧＡＡＴＴＣＣＣ（ｉＧＧＣｊＡＴＣＣ切℃ＧＡＣＣＴ ＸＩ：` Ｆｉｇ−１（ｃｏｒＸｚｉｎｕｅｄ　）ｃｒｃ’ｒＡＣＡＡＡＣＣＣＣＴｒＡＡ ＭＡＣ（ｉＴＴｎＴＡＭＧＧＣｒＴＴ’ｒＡＡＧＣＣＱＴπ口ＡＣ（ＴＴＣＣ： ’ＷＡＡＧＣＡＡＴｒＣＡＣＡＣｒＣＣＣＣＴ’ｒＧ−ｒ”ＴｒＡＡＧＣＴｒＡ ＡＧＡπｍユＣＧＱＡＡπφｍＡＡＧＴＯＴＡＣｒＡＡＡ１３０　１４０　１５ ０　１６０　ｉ７０　１８゜ＧＴＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣＧＧＣＡＧＣｒｒＡＣＡ π＝：−コπんにＡＴＣＴＴＡτＡＴＡＱＡＡＧＡＡＡＬＪＷ’ｒＧＧ：１９０ 　２００　２１０　２ｉｏ　２３０　２４０ＡＡＡＴＯＧＡＡＡＴＩＴ−ＡＡＡ ＣＡＡＴｒＡＡＣＣＡＯＣＡＴＡＣＡ（ｉＴＡＡＡＡＴｒπＡＴＡππ＝ＡＣＧ ＣＡＧＡＴＡ２５０　２６０　２７０　２＆０　２９０　３００τＴＣＡＡＧＡ ＴＣＧＣＧＣＴＴＴＴｃＡＣＡＧＡＧＡＡＧＡＡＡＴＴｒ口ＣＴＡτＡＡＣＣＧ 丁ＣＡＧごＤＣＡＧτＣＡＡＧＡＡＣ°ｒｒｒｒＣＴＧＧＧＡＡＧＴＣＡＴＧＧ ＡＴＣＡＡ　ｃＴ７ｃＡＴＣＡＡＣＡＡＣＡＧＣＡＡＴＴＣＣＡＧごｒ口ｃｃｃ ｃＧＧＧＧＡ丁Ｆｉｒ＊ｒａ　２ Ｆｉｑ＋２　（ｃｏｎｔｉｎｕａｄ） Ｆｉｇ、２　（ｃｏｎｔｉｎｕａｄ） １０　２０　３０　４０　５０　６Ｏ Ｎα−シＣｃＴｃＣＡＡＡαシ、ＡＧσｒＣＡＴＡＡＡＣαａＴＡｃＡＡπＡＡ ＡＧα：℃σ買Ｔ直ズａｃｃｃ’ＴｒＦｉｇｕｒｅコ ＣＴＣＡ（ＴｒＣＷＡＧσｒ’ＣＯＴ１’ＣＧＣＴＣＣＡＡＧＣＴＧαｃππ口 ℃ＣＡＣＣＡＡＣＣＣＣＣＣσｎ℃ＡＧＦ’ｉｑ、コ（ｃｏｎｔｉｎｕｅｄ） ｍ℃ＴＱＴＧＡ　ｃＴｃＧ’ｔ’ｃＡ　ＣｒＡＣＴＣＡＡＣＣＡＡＣ；了ＣＡ’ ｎＴｒＣｉＡＧＡＡ丁ＡＣ丁ｃｒＡＴＣｃｃｃｅａＡｃｃｃＰ′工ｑ、コｔ：ｃ ｎｔｉｎｕａｄ） ３３７０　３３８０　３３９０　３４００　３４１０　３々２゜ＴＣ’ｒＣＣＴ ｒＡＴｎ’ＴＴＣＴ！ＴＡＣＣｃｒ′ＣｒｒｒＡＡＡＡＡＣＣＣＣσ丁ＡＡ丁Ａ ＴＣＣＡＣ，σ丁ＡＡＡＣ［：ａＴＣτｃｃ■ Ｆｉｇ、コ（ｃｏｎｔｉｎｕｅｄｌ Ｆｉｇ、：　１ｃｏｎ−二ｎｕａｄｌ Ｆｉｇ、３　（ｃｏｎｔｉｎｕａｄ） ｐｉｇｕｒｅ　６ ＥＣ口Ｒ工 ＣＡＡＴＴＣＣＡＧＣＴＣＧＡＧＣＴｒＡＣＴＣＣＣＣＡＴＣＣＣＣＣｒＧ”ｎ ”ＧＡＣＡＡＴｒＡＡＴＣＡＴＣＧＧＣｒＣＧＴＡＴＡＢａｍＨ工 ＰＶＴＫＡ　ＡＮ −−−−−−＞アミラーゼ Ｆｉｇｕｒｅ　８ Ｆｉｇｕｒｅ　１コ Ｆｉｇｕｒｅ　１４ 国際調査報告 ｍ−−ａ＝−−−＋　＾＊−田−−ｓ−，ＰＣＴ／ＥＰ　９０１０１０４２国際 調査報告

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. １．野生型α−アミラーゼと少なくとも１個のアミノ酸が異なるアミノ酸配列を 持ち、さらにでん粉の分解、及び／あるいは繊維の糊抜への応用においてそのア ミノ酸置換により性質が向上したことを特徴とする、α−アミラーゼをコードす るＤＮＡ配列に変異をおこしたＤＮＡの発現産物であ変異体α−アミラーゼ。
2. ２．高い熱安定性を示すことを特徴とする請求の範囲第１項記載のα−アミラー ゼ。
3. ３．ｐＨ６．５以下かつ／あるいは７．５以上で高い安定性を示すことを特徴と する、請求の範囲第一項記載のα−アミラーゼ。
4. ４．高い熱安定性及び酸安定性を示すことを特徴とする、請求の範囲第１２項記 載のα−アミラーゼ。
5. ５．変異体酵素を構築する元にした遺伝子が微生物；好ましくは枯草菌から得ら れる請求の範囲第１項から第４項のいずれか１項に記載のα−アミラーゼ。
6. ６．該遺伝子がバチルスステアロテルモフィルス、バチルスリケニホルミス、バ チラスアミロリクエファシエンスからなる群まから選択した株の野生型遺伝子を 元に構築した該遺伝子による請求の範囲第５項記載のα−アミラーゼ。
7. ７．バチラスリケニホルミスから得られる野生型α−アミラーゼと１１１、１３ ３、１４９番目のうちの１つ以上、あるいは相同のα−アミラーゼの相当する位 置において１個のアミノ酸置換により異なることを特徴とする請求の範囲第６項 記載のα−アミラーゼ。
8. ８．次のアミノ配置換、すなわちＡｌａ−１１１−Ｔｈｒ，Ｈｉｓ−１３３−Ｔ ｙｒ，Ｔｈｒ−１４９−Ｉｌｅの１つ以上を含むことを特徴とする、請求の範囲 第７項記載のα−アミラーゼ。
9. ９．請求の範囲第１項から第８項中の１つに定義されたα−アミラーゼをコード する変異体遺伝子
10. １０．請求の範囲第９項記載の変異体遺伝子を含む発現ベクター。
11. １１．請求の範囲第１０項記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
12. １２．請求の範囲第１０項記載の発現ベクターにより形質転換されることを特徴 とし、形質転換に先立ち、細胞外澱粉分解酵素を産生する能力が実質上ない宿主 細胞。
13. １３．バチルスリケニホルミスＴ９を表した請求の範囲第１２項記載の宿主細胞 。
14. １４．構造遺伝子から調節配列を物理的に分離することにより大腸菌内でクロー ン化した遺伝子の発現を不可能にし、また枯草菌中でクローン化した遺伝子の発 現を１種の制限酵素による消化及びその後の再環状化により回復することのでき る枯草菌／大鵬菌シャトルベクター。
15. １５．澱粉分解または繊維糊抜きへの応用に際し向上した性質をもつ澱粉分解酵 素を調製する方法であって以下の工程；澱粉分解酵素をコードするクローン化し た遺伝子あるいはその遺伝子断片に突然変異をおこす工程；得られた変異体アミ ラーゼ遺伝子あるいは遺伝子群を単離する工程；該変異体アミラーゼ遺伝子（群 ）を発現する工程；産生に適当な宿主細胞株に導入する工程；及び産生した変異 体アミラーゼを回収し澱粉分解あるいは繊維糊抜きへの応用において向上した性 質をもつ変異体アミラーゼを同定する工程を含む方法。
16. １６．変異体α−アミラーゼを産生する方法であって、請求の範囲第１１項から 第１３項のうちの１つに記載の宿主細胞を適当な培地中で培養する工程、及び産 生されたα−アミラーゼを回収する工程を含む方法。
17. １７．澱粉分解及び繊維糊抜きでの請求の範囲第１項から第８項記載のα−アミ ラーゼの利用。
18. １８．請求の範囲第１項から第８項のうちの１つに記載した変異体α−アミラー ゼの利用を含む澱粉分解の方法。
19. １９．請求の範囲第１項から第８項のうちの１つに記載した変異体α−アミラー ゼの利用を含む繊維糊抜き方法。
20. ２０．請求の範囲第１項から第８項のうちの１つに記載した変異体α−アミラー ゼを含む澱粉分解用組成物。
21. ２１．請求の範囲第１項から第８項のうちの１つに記載した変異体α−アミラー ゼを含む繊維糊抜き用組成物。