JPH04503157A - 核酸の入手および検出のためのポリアクリルアミド固形支持体に対するオリゴヌクレオチドの末端の付着 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 核酸の入手および検出のためのポリアクリルアミド固形支持体に対するオリゴヌ クレオチドの末端の付着 発明の分野 本発明は、一般にオリゴヌクレオチドの接着のための固形支持体の化学における ある開発に関する。

より特定すれば、本発明は一本鎖および二本鎖のＤＮＡおよびＲＮＡ目標物を含 む、核酸の入手（（ａｐｔｕｒｅ）および検出のための、末端で付着したオリゴ ヌクレオチドを含む固形支持体に関する。

本発明はさらに実質的にはオリゴヌクレオチドの５゛末端において固形支持体に オリゴヌクレオチドを共有結合させる方法および手段に関する。本発明に従って 、チオール−オリゴヌクレオチドをブロモアセチル由来のポリアクリルアミド支 持体に付着させるか、あるいは逆に、ブロモアセチル−オリゴヌクレオチドをチ オール−ポリアクリルアミド上に固定化する。

さらなる局面において、本発明はチオール−ポリアクリルアミド固形支持体上に 固定化されたブロモアセチル−オリゴヌクレオチド、ブロモアセチル由来のポリ アクリルアミド支持体上に固定化されたチオール−オリゴヌクレオチド、ならび に直接入手することによるかあるいはサンドウィッチ　ハイブリダイゼーション 　フォーマットにおいて、ポリアクリルアミド固形支持体に付着させたオリゴヌ クレオチドにより核酸を入手する方法に関する。

発明の背景 例えば生物的試料中の、たいへんに微量の、抽出されたかあるいはイン　ビトロ で増幅された核酸の検出がしばしば要求される。もっとも一般的な方法に従って 、目標物の核酸をオリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせる。目標物の量に適 応した、検出できるシグナルを得るために、目標物の核酸あるいはオリゴヌクレ オチドのどちらかを放射活性原子あるいは色素産生分子のような、シグナルを生 じる伝達要素、あるいはアルカリホスファターゼのような酵素と会合させる必要 がある。前もってハイブリダイズされた核酸により生じたシグナルはその分野に おいて知られた方法により検出および測定されつる。分子生物学において一般的 に使用される技術の多くは、特定の配列を分画および同定できるようにするため に、固形の支持体の上に目標物の核酸を固定化することを必要とする。目標物の 核酸を、固形支持体上に固定化されたオリゴヌクレオチドにより入手し、あるい はより頻繁には、溶液中に形成された検出オリゴヌクレオチド−目標物の核酸の 付加生成物の入手のために固形支持体に共有結合された、入手オリゴヌクレオチ ドを使用して、いわゆる”サンドウィッチ“ハイブリダイゼーション系が用いら れる。典型的な固形支持体は、例えば、ニトロセルロースあるいはナイロン膜、 活性化されたアガロース支持体あるいはジアゾ化されたセルロース支持体である 。

しかしながら、これらの支持体とオリゴヌクレオチドとの間の結合は、それによ って支持体からオリゴヌクレオチドを確実に解放させるような非共有結合である か、または支持体が他の欠点をもつかである。例えば、Ｎ−サクシニミドあるい は臭化シアンで活性化されたポリサツカロイド親和性支持体は、リガンドの漏れ において重大な欠点をもつ。このことは結果の誤解につながるだけでなく、組換 え体ＤＮＡ合成により生産されて免疫親和性により精製された産物がマウスモノ クローナル抗体と複合体を作るときに健康上の危険を伴うことの方がより重要で すらある［ウイルケック（Ｗｉｌｃｈｅｋ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｊｓｔｒｙ２６ ，２１５５　（１９８７）およびウイルケック（Ｗｉｌｃｈｅｋ）ら、ＰＮＡＳ 　’γ２．１０５５　（１９７５）を参照せよ］。固形支持体からの漏れは明ら かに親和性精製を邪魔する：もしも支持体から漏れた遊離のりガントが不溶化さ れたリガンドよりも効果的な結合剤であるならば、遊離のリガンドは目標物の高 分子と本質的に不可逆的に結合し、モしてカラムへの親和性吸着を阻止する。さ らに、ポリサツカロイド支持体の臭化シアンによる活性化はマトリックス表面上 のＮ−置換イソ尿素の形成に通じる。これらは、分析物（核酸のような）が大変 低い濃度で存在するとき、親和性クロマトグラフィーにおいて問題となるような 、不所望なイオン交換の特性を支持体に与える。

５′末端においてアルデヒド基あるいはカルボン酸基を含むオリゴヌクレオチド の、穴のないポリスチレンラテックスの固形の極小体に対する付着がクレムスキ ー（Ｋｒｅｍｓｋｙ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ付着 の結果を提供するが、カップリング反応の最後において非共有結合されたオリゴ ヌクレオチドを退屈なゲル電気泳動の工程により除去することが必要な点におい て不利である。

よって、オリゴヌクレオチドを入手でき、オリゴヌクレオチドに共有結合できる 、クロスリンクした、穴のある重合マトリックス構造を持った固形支持体が好ま しい。例えばセファクリル　ビーズはその優秀なハイブリダイゼーション特性か ら広く使用されている。

いわゆる”ビーズを基にしたサンドウィッチ　ハイブリダイゼーション系″　（ ＢＢＳＨ８）は、例えば以下の公告において記述されている：欧州特許第２７６ ゜３０２号。

この方法に従って、最初の工程として目標物の核酸と、その検出に使用される、 目標物の少なくともある領域と相補的なオリゴヌクレオチドプローブとをハイブ リダイズさせる。そして得られる生成物を、目標物の別の領域と相補的な、固形 支持体と末端で付着した２番目のオリゴヌクレオチドにより入手する。固形支持 体に付着した検出用のオリゴヌクレオチドの量は、入手される目標物の量と直接 関連する。この経路において、ＢＢＳＨ８は試料中の一本鎖核酸の量の決定に使 用されつる。このアッセイおよび同様のアッセイにおいて、最も一般的に放射性 （例えば、３２Ｐ）標識された、クローン化されたＤＮＡあるいは合成オリゴヌ クレオチドが使用される。ＢＢＳＨ８実験においてセファクリル　ビーズととも に使用される３２Ｐで標識されたオリゴヌクレオチド　プローブは、約１０：１ あるいはそれ以上の、ノイズ比に対するシグナルを、約０．５　ｆｍｏｌｅの量 で存在する目標物の配列で与える。

実際、根本的には放射性標識物の取り扱い、貯蔵および処分に関連した不便さの ために、非放射性標識物による伝達系がしばしば好まれる。非放射性標識物の伝 達系をうま（使用するには、与えられた固形支持体上で伝達系とともに使用され るとき、高い感度と低いバックグラウンドの特性を表す検出系を必要とする。

セファクリル　ビーズ支持体は、非放射性標識物、例えば発色による検出系と共 に使用されるとき、重大な制限を露呈する。例えば、サンドウィッチ　フォーマ ットにおける酵素−オリゴヌクレオチド配合体からの発色シグナルおよびセフ７ りリル　ビーズ上での直接的な入手の実験は、不所望のバックグラウンド、すな わちそれによりノイズ比に対して低いシグナルを与えることにより危険にさらさ れた。目標物の存在において、非特異的なバックグラウンドは：ｌ）目標物の核 酸の厳密でない配列に対する検出および入手オリゴヌクレオチドのハイブリダイ ゼーション： ２）入手オリゴヌクレオチドに対する検出オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼ ーション； ３）ビーズ支持体あるいは反応容器の壁に対する検出オリゴヌクレオチドの非特 異的な付着 の結果でありうる。

これらの可能な原因の最初の２つは、十分に厳しい溶液のハイブリダイゼーショ ン、入手および洗浄の条件により最小限にされつるが、非特異的結合の特性の理 由はほとんど理解されていない。

より良い結合特性、例えば目標物の核酸の検出に使用されるオリゴヌクレオチド の非特異的な付着が低く、特に非放射性標識検出系とともに使用されるとき、固 定化されたプローブを入手する、より大きな能力を示すような特性をもつ固形支 持体をみつけることが望まれる。

核酸の検出に使用される固形支持体において最も要求される特性はニー親水性 一遠心分離技術に匹敵するような取り扱いの容易性−適切で機能的なグループの 存在 一検出するオリゴヌクレオチドの弱い非特異的結合である。

新しい固形支持体を探すことにおいて、ポリアクリルアミドを基にしたマトリッ クスに注意が集まった。これらの支持体は広範囲の穴の大きさで市販されており 、そして日常、例えば親和性クロマトグラフィーにおいて使用される。それらの 親和性、それらの表面に電荷をもった残基がないこと、および誘導化の容易さが 、オリゴヌクレオチドを付着させる支持体としてそのマトリックスを潜在的に引 き付ける物にしている幾つかの特性である。親和性クロマトグラフィーにおける 使用のための、これらのクロスリンクされたポリアクリルアミド　ビーズの化学 的な誘導化は、さまざまな高分子との特異的な結合に都合の良い順序で、特異的 なリガンドを付着するための一定の間隔を置いた機能的なグループであり、それ らによって高分子、例えば蛋白質の選択的な保持を可能にする［インマン（Ｉｎ ｍａｎ）、　Ｊ、に、、Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍｏｌ、　３４：３０　（１９７４ ）］。インマン（Ｉｎｍａｎ）は、それらの第一アミド基をヒドラジドと反応さ せることにより、クロスリンクされたポリアクリルアミドのヒドラジド誘導体の 調製のための便利な方法を記述した。反応条件に依存して、さまざまなレベルの ヒドラジドをもつヒドラジド誘導体が得られた。ヒドラジド誘導体は他の誘導体 の調製のための適切な出発材料である。例えば、ブロモアセチル由来のポリアク リルアミド　マトリックスはベルナトピッチ（Ｂｅｒｎａｔｏｗｉｃｚ）ら、Ａ ｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１５５．　９５　（１９８６）により記述された 反応から類推して、臭化酢酸のＮ−ヒドロキシサクシニミド　エステルとヒドラ ジド誘導体を反応させることにより得られつる。

我々の最終的な到達点は、核酸がそれらの５′末端において支持体とつながれる ことにより、オリゴヌクレオチドを固形支持体に付着させるための方法論の開発 であった。慣用的に使用される固形支持体、例えばセファクリル　ビーズの場い の末端の付着は、固定化されたオリゴヌクレオチド　プローブのより大きな入手 能力において証明される。

本発明の対象として、適切に誘導化されたオリゴヌクレオチドのチオール基ある いはブロモアセチル基とポリアクリルアミド固形支持体が、道理にかなった収率 およびそれらの反応で反応することが見いだされ、驚くことにほとんど１００％ のオリゴヌクレオチドの末端の付着を生じる。したがって、チオール由来のオリ ゴヌクレオチドが、ブロモアセチルで誘導化されたポリアクリルアミド固形支持 体と共に使用された。チオール−オリゴヌクレオチドは、例えばペン　リー（Ｐ ｅｎｇ　Ｌｉ）ら、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１旦　５２７５　（１９ ８７）あるいはオーゲル（Ｏｒｇｅｌ）ら、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ。

あるいは、ブロモアセチル−オリゴヌクレオチドを、チオールで誘導化されたポ リアクリルアミドに付着させた。ブロモアセチルで誘導化されたポリアクリルア ミド支持体はその分野において知られており、そして、例えばＭｅｔｈ、　Ｅｎ ｚｙｍｏｌ、旦４：３０　（１９７４）において開示されている。知られている チオール−親和性支持体はカルボキシル基をシスタミンとカップリングさせて、 本発明の工程のように過剰量のＤＴＴでヒドラジド誘導体を経由しないで還元す ることにより調製された。

発明の概要 本発明は固形支持体上に固定化されたオリゴヌクレオチド、および固形支持体に 対するオリゴヌクレオチドの付着方法に関する。

より特定すれば、ポリアクリルアミド固形支持体上に固定化されたオリゴヌクレ オチド、および上記ポリアクリルアミド支持体と上記オリゴヌクレオチドとのカ ップリングの工程に関する。ポリアクリルアミド　マトリックス上のオリゴヌク レオチドの固定化のための新しい方法論を開発することにより、我々の最終的な 到達点は固定化されたオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション特性に対す る穴の大きさの影響を調査せねばならず、そしてカップリングの効率、特に５゛ 末端において固形支持体と付着しているオリゴヌクレオチドのパーセンテージを 上昇させなければならない。ここで上述されたように、２つの本質的な系におい て実験がおこなわれた。チオールで誘導化された固形支持体を、ブロモアセチル で誘導化された固形支持体と付着させたか、あるいはブロモアセチル　オリゴヌ クレオチドをチオールで誘導化されたポリアクリルアミド固形支持体でカップリ ングさせた。カップリングの効率は実際に使用されたフォーマットに依存してか なり変化したが、どちらのフォーマットにおいても実質的にすべての（９５％以 上）オリゴヌクレオチドがポリアクリルアミド固形支持体に末端で付着したとい うことを、驚きをもって発見した。このことは、相補的なオリゴヌクレオチドお よび二本鎖ＤＮＡのための本発明に従って、固定化されたオリゴヌクレオチドの 優れた、直接の入手の能力に反映された。大変に高い（約２Ｘ１０’ドルトン） 排除の限界をもつポリアクリルアミド支持体が、特に良くはたらいた。

本発明の他の局面において、負電荷の核酸の非特異的な吸着は、固形支持体の残 基の官能性（カップリング反応に参加していない）をアニオンの特性、例えばカ ルボン酸基あるいはトリニトロフェニル基をもった官能性に変換することにより かなり減少されうる。混合された官能性をもつ、得られた支持体は本発明の実施 のために特に好ましい。

したがって、本発明は、実質的に５°末端で共有結合したオリゴヌクレオチドを もつポリアクリルアミド固形支持体に関する。他の局面において、本発明はチオ ールで誘導化されたオリゴヌクレオチドとポリアクリルアミド支持体とを実質的 に５“末端において付着させる工程を指示し、上記支持体の第一アミド基は末端 の付着の前に少な（とも一部がブロモアセチル基に変換される。

他の局面に従って、本発明はブロモアセチルで誘導化されたオリゴヌクレオチド とポリアクリルアミド支持体とを実質的に５°末端において付着させる工程に関 し、上記支持体の第一アミド基は末端の付着の前に少な（とも一部が千オール基 に変換される。

いずれかのカップリングの手段、方法にしたがって、本発明はより良い非特異的 な吸着結果を得るための、カップリングに関与しない官能基をアニオン官能基に 変換することによる、ポリアクリルアミド支持体のさらなる誘導化を含む。

さらなる局面に従って、その５゛末端においてブロモアセチル基で誘導化された オリゴヌクレオチドが提供される。

なお、さらなる局面において、本発明はブロモアセチルで誘導化され、チオール で誘導化されたポリアクリルアミド固形支持体上に固定化されたオリゴヌクレオ チド、あるいは逆に、チオールで誘導化され、ブロモアセチルで誘導化されたポ リアクリルアミド固形支持体上に固定化されたオリゴヌクレオチドに関する。

本発明は、上記の局面およびすべての関連した方法およびそのようにして成し遂 げるための手段に関する。例えば、 ＃Ｊｌ！２！分割およびそれに引き続く精製を経由した天然源からの合成および 単離を含んだ、検出および入手オリゴヌクレオチドの調製および精製の方法：目 標物の核酸とのハイブリダイゼーションに使用する、オリゴヌクレオチド−シグ ナル因子（例えば、放射活性原子、酵素、蛍光あるいは化学的な発光プローブ、 水銀を基にした検出体、等々）の付加生成物：オリゴヌクレオチドの検出（およ び入手）のために目標物の核酸をハイブリダイズするハイブリダイゼーシタン技 術：等が本発明の目的である。

図面の簡単な説明 第１図は、ブロモセチルを含む（反応Ａ）およびスルフィドリルを含む（反応Ｂ ）バイオゲル　ポリアクリルアミド支持体の合成を示す。

第２図は、チオール　オリゴヌクレオチドの合成ルートおよびブロモアセチルで 誘導化されたバイオゲル　ポリアクリルアミド支持体へのそれらのカップリング を示す。（残余のヒドラジド基は低い非特異的結合のためにカルボキシル基に変 換される。） 第３図は、ブロモアセチル　オリゴヌクレオチドの合成の反応図である。

第４図は、チオールで誘導化されたバイオゲル　ポリアクリルアミド支持体のア シル化、およびブロモアセチル　オリゴヌクレオチドとカップリングして混合さ れた官能基を用いたポリアクリルアミド　マトリックスの使用を示す。

第５図は、トリスアクリル−８Ｈ支持体の調製のための合成図を示す。

第６図は、チオールで誘導化されたトリスアクリル支持体のアシル化およびブロ モアセチル　オリゴヌクレオチドの入手において混合された官能基を用いた生産 物の使用を示す。

明細書および請求の範囲を通じて使用された”オリゴヌクレオチド”という言葉 は、天然源から単離され、制限分解により合成されあるいは生産された、−開鎖 および二本鎖のＲＮＡおよびＤＮＡを含む核酸のことである。

”検出オリゴヌクレオチド”あるいはそれらを文法的に変化させた言葉は、目標 物の核酸と十分に相同性のある、核酸（ＲＮＡあるいはＤＮＡ）の配列（天然源 から単離されるか、合成的に生産されるかあるいは伝達体の標識物を運ぶ制限分 解物）、すなわち適切な条件において上記目標物の配列とハイブリダイズできる ようなものである。

”入手オリゴヌクレオチド”という言葉は特に、固形支持体、好ましくは実質的 に５゛末端において付着し、そして目標物の核酸の配列（検出するオリゴヌクレ オチドとハイブリダイズする配列とは違う）と十分な相同性をもつ核酸（ＲＮＡ あるいはＤＮＡ）の配列（天然源から単離されるか、合成的に生産されるかある いは伝達体の標識物を運ぶ制限分解物）、すなわち適切な条件において上記目標 物の配列とハイブリダイズできるようなものである。

典型的な検出および入手オリゴヌクレオチドは、約１２から２００ヌクレオチド 、好ましくは約１５から４０ヌクレオチドの長さであり、通常は目標物の核酸と 相補的な少なくとも約１２ｂｐ、好ましくは約２５ｂｐである。

”ポリアクリルアミド　マトリックス”は、広範囲の穴の大きさで市販されてい る、クロスリンクしたポリアクリルアミド　マトリックスである。そのようなマ トリックスの典型的な代表は、それらが排除する体積にしたがってさらに分類さ れたバイオ　ラッド社（米国）で製造されている、′バイオゲル２ビーズである 。バイオゲルＰ−２，バイオゲルＰ−１０，バイオゲルＰ−６０およびバイオゲ ルＰ−２００の排除する分子量の限界は、それぞれ２０００．　１００００゜６ ００００、および２０００００ドルトンである。我々の実験は主にバイオゲルビ ーズで行われたが、ある種類、例えばアミド基が交換されたようなものを含む、 他のポリアクリルアミド支持体も本発明の実施のために使用される。そのような 支持体の典型的な代表は、Ｎ−アクリクリル−２−アミノ−２−ヒドロキシメチ ル−１，３−プロパン　ジオールを共重合させることにより生産され、そして２ ×１０７ドルトンの排除の限界をもつトリス　アクリルＧＦ−２００（ＩＢＦバ イオテクニクス、米国）である。この樹脂において、第ニアミドは、３つのヒド ロキシル基および１つの第ニアミド基を含む、それぞれのその繰り返しユニット である、２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパン　ジオール置換基を含む。結 果として、この重合体は、その特徴のとおりバイオゲル樹脂よりもより親水性で ある。

本発明に従って使用されたポリアクリルアミド支持体の第一アミド基は、オリゴ ヌクレオチドと付着して少なくとも一部がブロモアセチル基あるいはチオール基 に変換されている。ブロモアセチルおよびチオール誘導体はヒドラジドで誘導化 された支持体から生じた。それぞれの工程のさらなる詳細は、好ましい態様の説 明および実施例において見いだされるであろう。

ヒドラジド支持体のブロモアセチルあるいはチオールへの変換は定量されないの で、変換されないヒドラジドの官能基はさらなる誘導化に利用される。そして、 望まれれば、それらはさらに他の基、例えばカルボキシル、トリニトロフェノー ル、等々の基に変換され得る。そのような誘導体のすべては、本発明の目的に含 まれる。ブロモアセチルおよびチオールで誘導化されたポリアクリルアミド支持 体はそれぞれのヒドラジド組成物から調製されたが、他の合成ルートも利用され 、そしてそれらが、少なくとも部分的にブロモアセチルあるいはチオール基に変 換されるようなポリアクリルアミド支持体の第一アミド基の生産に有用であるこ とを提供する発明により包含される（例えば、インマン（Ｔｎｍａｎ）　、Ｍｅ 　ｔｈＥｎｚｙｍｏＬ　３４．　３０　（１９７４）を参照せよ）。

オリゴヌクレオチドはその分野において知られているどのような方法、例えば固 相シアノエチル　ホスホアミダイト法およびＨＰＬＣの精製を使用して合成され 、そして精製され得るＣボッシュ（Ｇｈｏｓｈ）ら、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓＲｅ ｓ、　１５．　５３５３　（１９８７）］。一方、それらは、天然源カラ単離さ れあるいは合成的にあるいは制限酵素の分割により生産されそして、望まれれば 、意図された使用に有用になるようにあつらえられつる。

チオールおよびブロモアセチルで誘導化されたオリゴヌクレオチドは、ここで以 前に述べられたように、文献で知られた工程により調製されつる。それらの調製 のさらなる詳細は、本発明の好ましい態様の説明および実施例の中で与えられる 。

オリゴヌクレオチドと固形支持体の間のハイブリダイゼ−７シンの工程を記述す るとき、明細書および請求の範囲の中で、”付着”、”カップリング、″つなぎ “、′結合“および”固定化“という言葉は、相互に交換できるように使用され 、そしてオリゴヌクレオチドの固形支持体への共有結合を意味する。

”ＴＡＳ”という言葉は、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ３８／１０３１５号において開 示されている転写の増幅系を意味する。この方法は、目標物のＤＮＡあるいはＲ ＮＡ配列の二本鎖のＤＮＡコピー（ｃＤＮＡ）の合成を開始させるためにオリゴ ヌクレオチドを使用することを含む。ＴＡＳの態様において、その配列すなわち Ｔ７のＲＮＡポリメラーゼ　プロモーター結合配列（ＰＢＳ）の中に、プライマ ーΔが含む、オリゴヌクレオチドのうちの一つが、目標物の配列（Ｔｅ３）に相 補的な配列に付着した。逆転写酵素によるこのプライマーからの伸長合成により 、その５゛末端にＴ７のプロモーターを含む一本鎖のｃＤＮＡを生じる。二番目 のプライマー　オリゴヌクレオチド、すなわちプライマーＢはプライマーＡの下 流の少し離れたところ（１００−３００ｂｐ）において最初のｃＤＮＡ鎖と相補 的である。プライマーＢは二本目のｃＤＮＡ鎖の合成の開始に使用され、Ｔ７Ｒ ＮＡポリメラーゼのプロモーターに付着して二本鎖ｃＤＮＡを生産する。Ｔ７Ｒ ＮＡポリメラーゼおよびリボヌクレオチドを二本鎖ｃＤＮＡとインキュベートし た結果、ｃＤＮＡからＲＮＡ転写物が合成される。新しく合成されたＲＮＡ上で ＴＡＳを繰り返すことにより、さらに増幅がおこなわれる。

オリゴヌクレオチドの調製および精製を含む、本発明の他の局面に関して、オリ ゴヌクレオチド−目標物の核酸の生成付加物の調製、オリゴヌクレオチドの固形 支持体に対する付着の方法、ハイブリダイゼーシヨンの方法論、まえもってハイ ブリダイズされた核酸により生じたシグナルの検出および測定、等々、引例は分 子生物学の標準的な教科書に整理されている。

例えば、マニアティス（Ｍａｎｉａｔｆｓ）ら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１゜ｎ ｉｎｇ＋　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａ］、　Ｃｏ１ｄ　５ｐｒｉｎ 、ｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　１９８２、 およびここに引用されたさまざまな引例：デービス（Ｄａｖｉｓ）ら、Ｂａ５ｉ ｃ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、　Ｅｌｓｅ ｖｉｅｒ　５ｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、　Ｉｎｃ、、Ｎｅｗ　Ｙｏ ｒｋ　（１９８６）およびヘイムズ（Ｈａｍｅｓ）ら、−Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ １ｃｉ　Ｈｙｂｒｉｄｊｚａｔｉｏｎ”、　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、　（１９８５ ）を参照せよ。

２、好ましい態様の説明 さらに誘導化する前に、ポリアクリルアミド　マトリックス、例えばバイオゲル 　ビーズをヒドラジドで処理し、本質的には上記インマン（ｉｎｍ、ａｎ）の方 法に従う（引用実施例２を参照せよ）。ヒドラジドの濃度、反応温度および反応 時間に依存して、ヒドラジドの官能基のさまざまな置換レベルをもつヒドラジド 支持体が得られる反応は、室温あるいはより高い温度でおこなわれうる（上記イ ンマン（Ｉｎｍａｎ）を参照せよ）。ヒドラジド基の密度は上で引用されている インマン（Ｉｎｍａｎ）の引例の分析法の一節あるいは引用実施例１ｄに与えら れている。これらの実験においては、さまざまな排除の限界をもつポリアクリル アミド樹脂が使用でき、高い排除限界をもつものが好まれる。特定の好ましい態 様に従って、大きな穴の大きさをもつポリアクリルアミド支持体、特に４０００ ００ドルトン以上の排除限界の物、最も好ましくは約２Ｘ１０’ドルトン、例え ばトリスアクリル　ＧＦ　２０００　（ＩＢＦバイオテクニクス、米国）、が使 用される。

［！！２ｐ］で標識されたオリゴヌクレオチドの非特異的な結合は低いことがわ かりそしてヒドラジドで誘導化されたバイオゲル樹脂上のヒドラジドの官能基の 置換のレベルに依存していないが、ヒドラジドで誘導化された支持体は、第一に 増加した非特異的結合のために、主に配合体の酵素の組成物のために、酵素−オ リゴヌクレオチドの配合体を用いた結合実験においてうまく実行されない。この 問題は支持体をさらに誘導化することにより排除されると考えられた。

本発明の態様に従って、チオール−オリゴヌクレオチドを、ブロモアセチルで誘 導化されたポリアクリルアミド支持体にカップリングする。

ポリアクリルアミド支持体のブロモアセチル誘導体は、過剰の臭化酢酸−Ｎ−ヒ ドロキシサクシニミド　エステルによりヒドラジドで官能基化された支持体を処 理することにより好ましく得られ、本質的にはベルナトピッチ（上記Ｂｅ　ｒｎ ａｔｏｗｉｃｚ）ら、により記述された方法に従う。誘導化の範囲は２段階の工 程により決定されうる。最初の段階において、ブロモアセチルからチオールへの 、量で表しうる官能基の変換をもたらすために、大過剰のジチオスレイトール（ ＤＴＴ）に支持体を暴露する。そしてチオール基をエルマンの試薬［５，５’　 −ジチオ−ビス（２−ニトロ安息香酸）コを用いて定量する。したがって、標準 的な反応条件、すなわち一般に１６−５６％の間の範囲の変換の下で、残余のヒ ドラジド基はさらなる誘導化のためにまだ利用される。カルボキシル誘導体はヒ ドラジドからカルボキシルへの転換をもたらすために、過剰量の無水グルタル酸 によりブロモアセチルで誘導化された支持体を処理することにより得られつる。

オリゴヌクレオチド−アルカリ　ホスファターゼ配合体を用いた非特異的な実験 において、ブロモアセチルで誘導化された支持体はヒドラジド誘導体よりもかな り良好に実行される。非特異的な結合はヒドラジドからカルボキシルへの転換に よりさらに減らされる。エッペンドルフ　チューブをシラン化することおよびチ ューブの壁にオリゴヌクレオチド−酵素の配合体が付着するのを阻害するために ハイブリダイゼーション溶液中に１％ＢＳＡを含むことは有益であることが分か った。

カップリングをもたらすために、オリゴヌクレオチドもまた誘導化される。アミ ンを通しての強い核性のために、チオール化合物はアルファーハロ　カルボニル で置換された化合物に対する反応性が高められたことを示すので、本発明にした がって、ブロモアセチルで誘導化されたポリアクリルアミド支持体をチオールオ リゴヌクレオチドにカップリングさせる。好ましくは、チオールで誘導化された オリゴヌクレオチドを、［３２ｐ］で標識され、５゛がリン酸化されたオリゴヌ クレオチドを使用して、２段階で調製される：　（１）ジイミド存在下における リン酸基とイミダゾールの反応、およびイミダゾールが残した基のシスタミンに よる置換を１段階で行い；そしてシスタミン　リンカ−のジスルフィド結合をＤ ＴＴで還元する。同様の工程は上記オーゲル（Ｏｒｇｅｌ）ら、により記述され ている。５′がリン酸化された、最初のオリゴヌクレオチドは上記マニアナイス （Ｍａｎ　ｉ　ａ　ｔ　ｉ　ｓ）ら、ｐ、１２２により記述されたように調製さ れる。それらのチオール誘導体の合成の詳細は実施例１ｃに出てくる。この工程 により得られた、すべてのリン酸からチオールへの転換は、［３１ｐ］で標識さ れた生産物のポリアクリルアミド　ゲル分析、および実施例１ｄにおいて記述さ れたように、アルカリ　ホスファターゼ処理による、未反応のリン酸化されたオ リゴヌクレオチドの５°＋　３　！　ｐ　Ｑ　４標識物の排除の率により６０− ７５％であることが推定された。

チオールで誘導化されたオリゴヌクレオチドを窒素の空気の下で、ブロモアセチ ルで誘導化されたポリアクリルアミド固形支持体でカップリングする（実施例１ ｅも参照せよ）。チオール−オリゴヌクレオチドの支持体に対する付着は放射性 標識核酸を使用して監視されつる。チオールで誘導化されたオリゴヌクレオチド の、ブロモアセチルで誘導化された固形支持体へのカップリングの効率は反応の ｐＨ１好ましくは約９０のｐＨに依存している。おそらく反応性チオール基の貯 蔵および反応の過程の間の空気の酸化作用に対する感受性のために、この実験に おける付着の効率がかなり変動することを、我々は見いだしてきた。すべての付 着効率は約３．５％から４８％の間であることが見いだされた。しかしながら、 カップリング実験の収量は、５°がリン酸化されたオリゴヌクレオチドのチオー ル誘導体への不完全な変換のために、この系において導入された総放射活性のｃ ｐｍのパーセンテージとして計算されるので、実際の収量はさらに高い。さらに 、この方法に従い、９９％以上のオリゴヌクレオチドがそれらの５′末端を通じ て固形支持体に付着する。これは、その分野で知られている他の系、例えば単に 約５０−５５％のオリゴヌクレオチドが末端で付着するセファクリル　ビーズよ りはるかに顕著な有利さである。

この研究の過程の間、我々は＝　（１）カップリング反応に新鮮なチオール　オ リゴヌクレオチドを使用すること；　（２）使用の前にすべての反応溶液を脱気 すること：および（３）不活性の空気下でカップリングを行うこと、が有益であ ることを見いだした。

ブロモアセチル　ポリアクリルアミド支持体上に固定化されたチオール−オリゴ ヌクレオチドのハイブリダイゼーションの能力は、直接の入手実験において３２ Ｐで標識されたオリゴヌクレオチド、あるいはサンドウィッチ　フォーマットに おいて一本鎖の７ＫｂのプラスミドＤＮＡ目標物のどちらかを使用して評価され た。この構成において目標物のオリゴヌクレオチドを直接入手するために、本発 明にしたがって固定化されたオリゴヌクレオチドは通常、セファクリル　ビーズ よりも良好な結果を与える。長い目標物ＤＮＡのサンドウィッチの入手の場合は 、結果が多少悪かった。

逆のフォーマットを使用して、ブロモアセチルで誘導化されたオリゴヌクレオチ ドを、チオールで誘導化されたポリアクリルアミド固形支持体にカップリングさ せる。ポリアクリルアミド　マトリックス上へのチオール基の導入は、本質的に はここで後に実施例２ａにより記述されているように、ヒドラジド−ポリアクリ ルアミド支持体にＮ−アセチルホモシスティン　チオラクトンを反応させること により達成されつる。誘導化の範囲は、ここで以前に記述されているように、エ ルマンの試薬でチオール基を定量することにより決定されつる。変換は通常的４ ％から約１５％の間で、固形支持体：好ましくはより高いヒドラジドの置換レベ ルをもつ支持体中のヒドラジド基の量に強く依存している。ヒドラジド基からチ オール基への変換は少ないので、さらに誘導化するのに有用な未反応のヒドラジ ド基がいつも残される。残されたヒドラジドを、チオール基を修飾しないで例え ばカルボキシル基あるいはトリニトロフェニル基に変換するように、混成の官能 基をもつマトリックスは、文献で知られる方法により調製され、そしてカルボキ シル基アルいはトリニトロフェニル基のアニオンの特性のために、負電荷をもつ 核酸の非特異的な吸収を減らすことにより特定のハイブリダイゼーション反応に おいて有利性をもつ。無水グルタル酸および／あるいはヨード酢酸によるポリア クリルアミド支持体の処理は、ヒドラジドあるいはスルフィドリル基をカルボキ シル基に変換する。これらの支持体はより良好な非特異的吸収の結果を提供する ことが見いだされた、したがって直接の入手実験における使用に好まれる。

それらの５′末端においてブロモアセチルで誘導化されたオリゴヌクレオチドは 、例えば臭化酢酸−Ｎ−ヒドロキシサクシニミド　エステルを５′−アミノヘキ シル−ホスホアミデート　オリゴヌクレオチドに反応させることにより調製され つる。反応の実行は実施例中にさらに説明されている。リン酸からブロモアセト アミドへの転換は［３２ｐ］で標識された生産物のポリアクリルアミド　ゲル分 析、およびアルカリ　ホスファターゼ処理に対する未反応のリン酸化されたオリ ゴヌクレオチドの分割率により約７０％と決定される。

ブロモアセチル−オリゴヌクレオチドの、チオールで誘導化されたポリアクリル アミド固形支持体への共有結合は実施例に説明されている。カップリングの効率 は用いられた固形支持体の穴の大きさく排除する分子量の限界）に依存して、約 ３％と約３０％の間である。前に注意したとうり、実際のカップリングの効率は 高い、なぜならばそれらの数字は５′がリン酸化されたオリゴヌクレオチドのブ ロモアセチル誘導体への不完全な変換を反映していないからである。驚いたこと に、高い排除の限界をもつ、より穴のあるマトリックスは、高率にクロスリンり された変体よりも実質的に良好なカップリングの結果を提供する。

チオールで誘導化された固形支持体に固定化されたブロモアセチル　オリゴヌク レオチドのハイブリダイゼーションの能力は、ＴＡＳ　ＲＮＡ転写物を使用して 、サンドウィッチ　フォーマットにおいてオリゴヌクレオチド目標物の直接の入 手により試験された。結果は、逆のフォーマントで得られたものと同様であった 。チオール−ポリアクリルアミド支持体に固定化されたオリゴヌクレオチドはセ ファクリル　ビーズよりもオリゴヌクレオチドの直接の入手において明らかに良 好であるが、それらの入手の能力は、特に長い目標物が同定されるかもしれない とき、サンドウィッチの実験において低く示された。

チオール−ポリアクリルアミド固形支持体上に固定化されたブロモアセチルエス テルで誘導化されたオリゴヌクレオチドの直接の入手及びバックグラウンド特性 はまたオリゴヌクレオチド−アルカリ　ホスファターゼ配合体で試験された。

非特異的結合からのバックグラウンドは低いことが見いだされたが、ポリアクリ ルアミド支持体をより大量に入手する能力は、オリゴヌクレオチド−酵素の配合 体の場合に失われた。

本発明の特定の好ましい態様に従って、約２Ｘ１０’ドルトンの排除限界をもつ ポリアクリルアミド支持体が用いられる。このグループからの典型的な支持体は トリスアクリル　ＧＦ−２０００（バイオテクニクス、米国）である。ここで上 述されたように、このポリアクリルアミドの樹脂のアミドの水素を２−ヒドロキ シメチル−１，３−プロパン　ジオール基で置換し、さらに誘導化する前に、反 応性アミノ基は、例えばエチレン　ジアミンを用いたアミノ基転移により導入さ れる必要がある。この反応はわずかに温度を、好ましくは約９０℃に上昇させる ことにより行われる。これらの支持体のチオール−誘導物はチオールで誘導化さ れたバイオゲル生産物の調製と類似の様式により調製される。正電荷をもつアミ ノ基と負電荷をもつオリゴヌクレオチドのバックボーンとの間の静電気的な相互 作用を減らすため、トリスアクリル支持体上の残りの未反応のアミノ基は無水グ ルタル酸あるいは無水琥珀酸のどちらかで望ましくアシル化される。トリスアク リル−３Ｈ支持体上のスルフィドリル基の置換レベルはスルフィドリル基をＤＴ ＮＢで定量することにより決定され、約１０から約１６μｍｏｌｅｓ／ｇｒの範 囲内である。これらの支持体を用いた、ブロモアセチル化されたオリゴヌクレオ チドへのカップリングの効率は約２０％であり、末端の付着のレベルは極端に高 い（約９７％）。これらの支持体のオリゴヌクレオチドの置換のレベルは約６０ ｐｍｏ　１　ｅ　ｓ　オリゴヌクＩノオチド／グラム支持体である。

放射標識されたオリゴヌクレオチドの直接の入手を含むハイブリダイゼーション の研究において、固定化されたオリゴヌクレオチドを含むトリスアクリル−８Ｈ 支持体、特に未反応のスルフィドリル基をヨード酢酸でアルキル化した支持体は 特によく実行された。トリスアクリル−３Ｈ支持体上に固定化されたオリゴヌク レオチドは、ここで上述されたようにサンドウィッチ　ハイブリダイゼーション 実験においても優秀なハイブリダイゼーションの能力を示した。ノイズに対する シグナルの比はセファクリル　ビーズ上よりもトリスアクリル支持体で実行され たサンドウィッチ　ハイブリダイゼーション実験において約４倍高かった。

論理にかなった収量、および反応の再現性で、チオールで誘導化されたポリアク リルアミド支持体とカップリングされた。ブロモアセチル化されたオリゴヌクレ オチドは大変に良好である。逆のフォーマットの場合、チオール−オリゴヌクレ オチドおよびブロモアセチルで誘導化された支持体の使用により、おそらくチオ ール−オリゴヌクレオチドの酸化に対する高い率のために、カップリング効率は より高い変動性を示す。しかしながら、両方のアプローチは極端に良好な末端の 付着の結果を提供する。実質的にすべてのオリゴヌクレオチド（９５％あるいは それ以上）が、本発明のどちらかの方法論を使用することにより、それらの５′ 末端で固形支持体に付着する。

本発明に開示された方法のどれかにしたがった、ポリアクリルアミド支持体上に 固定化されたオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションの能力は、第一に末 端で付着したオリゴヌクレオチドの、優れた直接の入手の能力のために、直接の 入手の実験において大変良好である。ＴＡＳ　ＲＮＡ生産物あるいは長い一本鎖 ＤＮＡ断片を用いたサンドウィッチ　ハイブリダイゼーションにおいて、大きな 穴の大きさをもつポリアクリルアミド支持体は、それらの高率にクロスリンクさ れた類似物とは対照的に本質的にうまくゆく。結果はこれらの穴のある支持体、 例えばカルボキシル基の誘導化によりさらに改良されつる。最高の結果は約２Ｘ １０７ドルトンの排除の限界をもつポリアクリルアミド支持体（トリスアクリル ＧＦ　２０００）を用いて明瞭に得られる。

テキストの方法 ａ、オリゴヌクレオチドで誘導化された支持体上の３２９で標識された目標物の 直接の入手 ビーズの試料（５０ｍｇ）を１　ｍｌのエッペンドルフ　チューブに分配し、モ して上清を遠心分離後除去した。上清を捨てた後、２５０μｌの５ＸＳＳＰＥ［ ０，７５Ｍ塩化ナトリウム、５０　ｍＭ　ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７，４，および ５　ｍＭエチレン　ジアミン４酢酸・４Ｎａ　（ＥＤＴＡ）　コ、１０％デキス トラン硫酸塩、０．１％ソデイウム　ドデシル硫酸塩（ＳＤＳ）中のブリノλイ ブリダイゼーシジンを３７℃において３０分間行った。相補的及び非相補的な！ ２ｐで標識されたオリゴヌクレオチド（約３０塩基）の試料を６５℃において５ 分間ブリインキユベートシ、そしてビーズの試料に加えた（一般に３．７５　ｆ ｍｏｌｅｓオリゴヌクレオチド／１００μｍ　ハイブリダイゼーション緩衝液） 。ビーズを時折撹拌しながら３７℃において１時間インキュベートした。５ｘｌ ｍｌの２ＸＳＳＣ（０，３Ｍ塩化ナトリウム、０．０３Ｍクエン酸ナトリウム、 ｐＨ７，０）で３７℃においてビーズをインキュベートした後、支持体に結合し た標識の量をチェレンコフ　カウンティングにより決定した。

ｂ、支持体上のＴＡＳで生じたＲＮＡ転写物のサンドウィッチ　ハイブリダイゼ ーノヨン バイオゲル（バイオラッド、米国）あるいはトリスアクリル（ＩＢＦバイオテク ニクス、米国）（５０ｍｇ）を上で略述したようにブリ１１イブリダイズした。

目標物、すなわちＤＮＡあるいはＲＮ　Ａ　、をハイブリダイゼーション直前に 、６５℃において５分間変成させた。目標物のＲＮＡ（０，５ｆｍｏｌｅｓ）と 相補的な、３２Ｐで標識された検出オリゴヌクレオチド（５ｆｍｏｌｅｓ）との 溶液のハイブリダイゼーションを、総体積２０μｍの５ｘＳＳＰＥ、１０％　デ キストラン硫酸塩、０．１％ＳＤＳ中で４２℃において２時間行った。そして試 料をハイブリダイゼーション緩衝液で１００μｌに希釈しそして固形支持体に加 えた。サンドウィッチ　ハイブリダイゼーションを、時折撹拌しながら３７℃に おいて１時間行った。最後に、ビーズを５ｘｌ　ｍｌの２ＸＳＳＣで３７℃にお いて洗浄した。非相補的なＲＮＡ目標物は、アッセイ中の非特異的な結合のレベ ルの決定の対照として使用された。

Ｃ１固形支持体上のアルカリ　ホスファターゼ−オリゴヌクレオチド配合体の直 接の入手 オリゴヌクレオチドを含むバイオゲルあるいはトリスアクリル支持体（５０ｍｇ ）を２５０μｌの５ｘＳＳＣ，１０％　デキストラン硫酸塩、０．１％ＳＤＳ、 １％　ウシ血清の画分Ｖ（ＢＳＡ）と共に１　ｍｌのエツペンドルフ　チューブ 中で３７℃において３０分間プリハイブリダイズさせた。相補的あるいは非相補 的なオリゴヌクレオチド−アルカリ　ホスファターゼ配合体を０．１　ＭＴｒｉ ｓ、０．１　Ｍ塩化ナトリウム、１％　ＢＳＡ、ｐＨ７，５で希釈し、そして５ ５℃に置いて５分間ブリインキュベートした。１００μｍのハイブリダイゼーシ ヨン緩衝液中の配合体（３７，５ｆｍｏｌｅｓ）の添加の後、配合体及びビーズ の混合物を、時折撹拌しながら４２℃において１時間インキュベートした。支持 体を４Ｘ１ｍｌの２ＸＳＳＣで３７℃において洗浄した。ビーズの試料及び洗浄 物を０．　１　Ｍ　Ｔｒｉｓ、０．　１　Ｍ塩化ナトリウム、０．０１ＭＭｇＣ ＋２、ｐＨ９，５中のｐ−ニトロフェニルリン酸で処理した。室温において発色 させた後、ｐ−ニトロフェルレートの形成を４１０ｎｍの吸光度を読むことによ り測定した。

ｄ、ヒドラジドおよびアミノのＴＮＢＳ試験ヒドラジドあるいはアミノで誘導化 された支持体の濾過を、遊離のヒドラジドあるいはエチレンジアミンで以下のよ うに試験した。２ｍｌの濾過物を１ｍｌの飽和ＮａＪ４０７および３滴の２％水 性トリニトロベンゼンスルフォン酸塩（ＴＮＢＳ）で徹底的に撹拌しながら処理 した。１分後の紫あるいはオレンジ色の出現は、それぞれヒドラジドあるいはア ミノの存在を示した。

ｅ、スルフィドリルおよびブロモアセチルの置換の決定のためのＤＴＮＢ試験 上清を除去した後、誘導化された支持体の試料（１−２０ｍｇ乾燥重量）を０． ０５　Ｍ　ＫｚＨＰＯ４，１ｍＭ　ＥＤＴＡ、ｐＨ８，０中の５００μｍの２０ ｍＭジチオスレイトールで３０分間、１　ｍｌのエツベンドルフ　チューブ中で 還元し、モして３ｘｌ　ｍｌの０．０５　Ｍ　Ｋ２ＨＰＯ４，ｐＨ８，Ｏｒ洗浄 した。そしてビーズを０．０５　Ｍ　Ｋ２ＨＰＯ４，ｐＨ８，０中のｌ　ｍｌの １　ｍＭ　５．５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）で処理し た。上清の吸光度を１５分後、４１２ｎｍで監視した（放出されたトリフエルレ ートのε＝１３，６００）。

引用実施例２ バイオゲル　ビーズのヒドラジド誘導体の調製バイオゲル　ビーズ（パイオーラ ッド、米国）のヒドラジド誘導体はインマン（Ｉｎｍａｎ）（Ｍｅｔｈ、　Ｅｎ ｚｙｍｏｌ、　３４（Ｂ）：３０，１９７４）の方法を使用して調製された。実 際は、５０℃の６　Ｍヒドラジドの２０　ｍｌの溶液を１グラムの乾燥樹脂に加 えた。４０分後、濾過物が２．　４．　６−ドリニトロベンゼンスルフオン酸（ ＴＮＢＳ）による試験で陰性になるまで、ビーズを０．２　Ｍ塩化ナトリウムで 洗浄することにより、過剰の試薬を除去した。誘導化されたビーズを１５分間吸 い尽くし、重量を量り、そして１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ、１　ｍＭ　ＥＤＴＡ　（ ＴＥ）、ｐＨｇ、ｏ、あるいは０．１　Ｍ　Ｋ２ＨＰＯａ、ｐＨ８，０に再懸濁 した。

［１１ｐ］で標識されたオリゴヌクレオチド、アルカリ　ホスファターゼ−オリ ゴヌクレオチドの配合体、ＢＳＡとアルカリホスファターゼ、およびＢＳＡとリ ンカ−で誘導化されたアルカリホスファターゼの非特異的な結合を上記支持体で 決定し、そして結果は表■に示された。

表■ バイオゲルＰ−６０ヒドラジド　ビーズ上の非特異的な結合ビーズに対する％結 合 バイオゲル−［３！ｐ］　配合体配合体アルカリホスファアルカリホスファタヒ ドラジド　オリゴ　＋ＢＳ＾　ターゼとＢＳＡ　−ゼーリンカーとＢＳ＾モルモ ルｌグラム０．２６　１１Ｊ　５．２　１．９５　５．９０６２マイクロ モル／グラム　０．２３　９．８　−−　−−　−−１２５マイクロ モル／グラム　０．３２　１３．７　４．１　−−　−−５００マイクロ モルｌグラム　０．４１　１３．５　ｇ、６　１．２　４．４９［３！ｐ］で標 識されたオリゴヌクレオチドの非特異的な結合は低く、バイオゲル上のヒドラジ ド残基の置換のレベルに依存していなかった。しかしながら、酵素−オリゴヌク レオチド配合体からのバックグラウンドは、ハイブリダイゼーション溶液中にＢ ＳＡを使用しないとき、より高かった（９．８−１３．７％）。このことは、配 合体の酵素の組成物は、この相互作用に大いに必要であることを示唆した。ハイ ブリダイゼーション混合物に対するＢＳＡの添加は、酵素−オリゴヌクレオチド 配合体の非特異的結合を排除するのに部分的に効果的であることが見いだされた 。アルカリホスファターゼおよびアルカリホスファターゼ−リンカ−を使用した 平行実験が示したことは、リンカ−を用いた酵素の誘導化は第一に非特異的な結 合に必要であるということである。

実施例１ ブロモアセチル　バイオゲル　ビーズへのチオール−オリゴヌクレオチドの付着 ａ、サクシニミジル臭化酢酸を用いたバイオゲル　ヒドラジド　ビーズのＮ−サ クシニミジル臭化酢酸の白い固形物を得るために、ベルナトピッチ（Ｂｅｒｎａ ｔｏｗｉｃｚ）とＧ、　Ｒ，ｖツエダ（Ｍａｔｓｕｅｄａ）（Ａｎａｌ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、１５５：９５，１９８６）の方法に従い、臭化酢酸（２０ｍｍ ｏ　Ｉ　ｅ　ｓ）を３Ｑ　ｍｌのＣＨＩＣＩ　！中のジシクロヘキシル（２２ｍ ｍｏｌｅｓ、１．１当量）およびヒドロキシサクシニミド（２２ｍｍｏｌｅｓ） で４℃において処理した。

アシル化 バイオゲル　ヒドラジド　ビーズ（５０μｍｏ　ｌ　ｅ　ｓ／乾燥グラム）の試 料１グラム（乾燥重量）を２Ｘ５０　ｍｌの０．１　Ｍ　ＫｔＨＰＯ４、ｐＨ７ ，０で洗浄し、そして５　ｍｌの緩衝液に再懸濁した。懸濁液を水浴中で０℃に おいて冷やし、そして２５０　μｍのＮ、　Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ ）中のＮ−サクシニミジル臭化酢酸（ヒドラジド基に関して１０モル当量）を撹 拌しながら滴下して加えた。反応混合物を３０分以上かけて室温までもどした。

再び０℃に冷やした後、Ｎ−サクシニミジル臭化酢酸の他方のアリコートを加え 、そして反応混合物を室温において３０分間撹拌した。ビーズを半融ガラスファ ンネル（多孔度Ｃ）で濾過し、そして５０　ｍｌの０．１　Ｍ　Ｋ＊ＨＰＯ４， ｐＨ７゜０で洗浄した。アシル化されたビーズを４℃において０．１　Ｍ　Ｋｚ ＨＰＯ４中に保存した。

置換のレベルを決定するために、ブロモアセチルからチオール基への官能基の量 的な変換を果たすように、支持体を大過剰のＤＴＴに暴露した。そしてチオール 基をエルマン試薬［５，５−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）〕で定量した 。表ＩＩから、Ｐ−２支持体を用いた反応は効率が低いが、ヒドラジド基のブロ モアセチル基への変換はそれぞれＰ−１０、Ｐ−６０，およびＰ−２００につい て５６％、４３％、および４０％の効率で続いたことが認められつる。

表ＩＩ 臭化酢酸ＮＨＳエステル　ポリアクリルアミド支持体を用いたヒドラジドの反応 支持体の　μモル　過剰モルの　μモル　変換された種類　ＮＨＮＨ，／ｇ　Ｎ ＨＳＢｒＡｃ　ＣＨＪｒ／ｇ　％ＮＨＮＨ。

Ｐ−２−ＣＨ２Ｂｒ（分子量　５０　２０　８．０　１６．０２、０００を排除 ） Ｐ−１０−ＣＨ，Ｂｒ（分子量　５０　２０　２７．９　５５．８１０、０００ を排除） Ｐ’６Ｏ−ＣＩＩｔＢｒ（分子量　５０　２０　２１．６　４３．２ａｏ、　ｏ ｏｏを排除） Ｐ−２００−ＣＨＪｒ（分子量　５０　２０　２０．３　４０．５２００、００ ０を排除） オリゴヌクレオチド−アルカリホスファターゼ配合体を用いた非特異的な結合（ 引用実施例ＩＣを参照せよ）を３つのタイプのＰ−２およびＰ−６０支持体を用 いて行った（表ＩＩＩ）。

表ｌｌｌ ５Ｑ　ｆｍｏｌｅｓの配合体を用いた非特異的な結合（％結合）支持体の種類　 −Ｎ　ＨＮ　Ｈ！　−ＣＨ！　Ｂ　ｒ　−Ｎ　ＨＮ　Ｈ！　−ＣＨｔ　Ｂ　ｒ　 −Ｃ００ＨＰ−２１，５７１，０１０，７Ｉ Ｐ−６０７，３３，５１，４ 非特異的な結合の減少は、ヒドラジド基をブロモアセチル基でカップリングした ときに、どちらの支持体でも観察された。ヒドラジド支持体の臭化酢酸Ｎ−ヒド ロキシサクシニミド　エステルとの反応が量で表しつる変換をもたらさないので （表ＩＩの最後の列を参照せよ）、残りのヒドラジド基はまだ誘導化に有用であ る。

ｂ、ブロモアセチル　バイオゲル　ビーズのグルタル化ブロモアセチル　バイオ ゲル　ビーズ（５０μＭ　ヒドラジド／乾燥グラム）の１．０グラム（乾燥重量 ）の試料を０．１Ｍ塩化ナトリウムで洗浄し、そしてガラスのビーカー中の２０ 　ｍｌのこの溶液に再懸濁した。撹拌された懸濁液に１００　ｍｇの無水グルタ ル酸を加えた。反応混合物を１５分間撹拌している間、懸濁液のｐＨは３　Ｍ水 酸化ナトリウムにより４．　０−４．　２に保持された。

そして、さらに１００　ｍｇの無水グルタル酸を加え、そして反応混合物をさら １＝１５分間撹拌した。そしてビーズをコニカル　チューブ中で静置して、上清 をデカントすることにより、ビーズを３Ｘ４０　ｍｌの０．１　Ｍ　Ｋ２ＨＰＯ ４゜ｐＨ７，０で洗浄した。

ブロモアセチル支持体を上述のようにして過剰の無水グルタル酸で処理するとき 、ヒドラジドからカルボキシルへの転換かえられた。これらの二官能性支持体中 のカルボキシル基は酵素−オリゴヌクレオチドの配合体の非特異的な結合におけ る付加的な還元を提供したく表ＩＩＩ、３列目）。

Ｃ，オリゴヌクレオチドの５′−ンスタミニル　ホスホアミデート誘導物の一段 階の調製 シラン化されたエッペンドルフ　チューブ中の５゛がリン酸化されたオリゴヌク レオチド［上記マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、］を３００μｍの０゜１ 　Ｍ　１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド・［ Ｍ（ＥＤＣ）、０．２５　Ｍシスタミン　ジヒドロクロライド、ｐＨ６，０で処 理し、そして室温において一晩静置した。修飾されたオリゴヌクレオチドをエタ ノール／塩化リチウムで沈殿させ、３００μｌの水で洗浄して、再び沈殿させた 。この方法を使用して、８６％の収率がえらねた。反応は第２図に図解されてい る。

ｄ、５゛　がり〉・酸化されたオリゴヌクレオチドへのシスタミンの付着のレベ ルの決定 １２ｐで標識されたシスタミンで誘導化されたオリゴヌクレオチドの５０　ｐｍ ｏｌｅの試料を１　μｍの持ち合わせのウシの腸のアルカリホスファターゼ（ベ ーリンガー　マンハイム、ＥＩＡグレード）で処理し、そして０．１　ＭＴｒｉ ｓ、０．　１　Ｍ塩化ナトリウム、０．０１　Ｍ　ＭｇＣｌ２、ｐＨ９，５で１ ００μｍに体積を合わせた。引き続いて反応を２時間行った。そして試料を５　 ｍｌのセファデクス　Ｇ−５０カラムにのせて、ＴＥ、ｐＨ８，０で溶出した。

それぞれ、シスタミンで誘導化されたオリゴヌクレオチドおよび遊離の無機リン 酸（５°がリン酸化されたオリゴヌクレオチドから分割された）に相当する、一 番目および二番目のピークを集めた。シスタミンの付着の収量を測定するために 、そのピークをチェレンコフ　カウンティングによりカウントした。

ｅ、ブロモアセチル−バイオゲル　ビーズに対する、５°がシスタミンで誘導化 されたオリゴヌクレオチドの共有結合シスタミンを含むオリゴヌクレオチドを３ ００　μｍのＱ、ｌ　Ｍ　ＤＴＴ。

０．２　Ｍ　ＨＥＰＥＳ、０．００１　Ｍ　ＥＤＴＡ、ｐＨ７，７で室温におい て１時間還元した。生産物をエタノール／塩化リチウムで沈殿させ、そして０゜ ２　Ｍ　ＨＥＰＥＳ、０．００１　Ｍ　ＥＤＴＡで２回洗浄した。実際は、５０ ｒｎｇのビーズを１５０　、ｃｚｌの０．１　Ｍ　Ｋ２ＨＰＯ４、ｐＨ９，０中 の２５ｐｍｏ　ｌ　ｅ　ｓの還元されたオリゴヌクレオチドで処理し、そして− 晩回転して混合しなからＮ２下で撹拌した。非特異的な結合を決定する対照とし て、５′がリン酸化されたオリゴヌクレオチドを同じ条件下でビーズの試料に加 えた。ビーズを（ａ）３Ｘ１　ｍｌの０．１　Ｍ　Ｎａ、Ｐ２Ｏ丁、ｐＨ７，５ 、および（ｂ）３Ｘ１　ｍｌの０．０１５Ｍ水酸化ナトリウム、ｐＨ１２で洗浄 した。３２ｐで標識されたオリゴヌクレオチドを、末端の付着の効率の評価の対 照として使用した。

ブロモアセチル−バイオゲル支持体への、チオールで誘導化されたオリゴヌクレ オチドの付着は放射標識された核酸を使用して監視され、そして結果は表ＩＶに 集約されている。

表ＩＶ チオール−オリゴヌクレオチドを用いたブロモアセチル支持体のカップリングの 収量１ 支持体の　％８６−３ｌ−８ｔ１％８６−３ｌ−Ｐ０４％末端の％２８７−４１ ６−８１１１％８７−４１６−ＰＯ４％末端の種類　結合　結合　付着　結合　 結合　付着Ｉ　Ｐ−２−ＣＨ２Ｂｒ　３゜４６　０．０８　９８２　Ｐ−１０− ＣＨ２Ｂｒ　９．５１　０．４４　９５３Ｐ−６０−Ｃ１＋Ｊｒ　１５．８２　 ０．２８　９８４　Ｐ−６０−Ｃ！Ｔ２８ｒ　３６．７　０．８４　９８５　Ｐ −６０−ＣＨ２Ｂｒ　４８．４　０．１５　１００６　Ｐ−２００−Ｃ１１２Ｂ ｒ　１７．００　０．３５　９ｇ７　Ｐ−６０−ＣＨＪｒ　１６．１　０．７　 ９６８　Ｐ−６０−ＣＨ２Ｂｒ −Ｃｏ２１１　１１．９　０．３　９８１ノン酸カルシウムｐｌＴ８．０中で１ ６時間反応を行い、そして非特異的に結合したオリゴヌクレオチドをピロリン酸 ナトリウムで３回、その後水酸化ナトリウム、ｐＨ１２，００で３回洗浄するこ とにより除去した。

２末端の付着（％）＝［（オリゴ−３Ｒ）　−（オリゴ−ＰＯ４）］］＋オリゴ ー３ｌｌカップリング実における収率は反応で取り込まれた総放射活性のｃｐｍ のパーセンテージであるから、５′がリン酸化されたオリゴヌクレオチドのそれ らのチオールの誘導体への不完全な変換のために、事実、実際の収率は高い。本 質的にすべてのオリゴヌクレオチドは、このカップリングの手段、方法に従って 、チオエーテル結合により末端で付着することが、容易に見られつる。付着の効 率における変動性は（表ＩＶの３−６の証人事項を参照せよ）、貯蔵におけるか または反応の過程の間の空気による酸化に対する反応性のチオール基の感受性の ためであった。オリゴヌクレオチドのポリアクリルアミド支持体に対するすべて の付着効率（３−４８％）は、セファクリル（７０％）よりも低いが、この力・ ンブリングの手段、方法は末端で付着したオリゴヌクレオチドをえるための優秀 な方法を提供する。

Ｐ−６０支持体（６０，０００の分子量を排除する）上に固定化されたオリゴヌ クレオチドのハイブリダイゼーションの能力は、サンドウィッチ　フォーマット で［３２ｐ］で標識されたオリゴヌクレオチドの長さの目標物および７　ｋｂの ＤＮＡの一開鎖ブラスミドを使用して評価された。このマトリックスは、チオー ル−オリゴヌクレオチド誘導体を用いたカップリング反応において最良の付着の 効率を表したので、Ｐ−６０支持体がこの研究のために選択された。入手の実験 の結果は、表Ｖに集約されている。

表Ｖ ブロモアセチルで誘導化したポリアクリルアミド支持体を用いたハイブリダイゼ ーション実験 オリゴヌクレオチド目標物　７ｋｂの目標物を用いたサンドウィッチ８６−３１ 固定化　ｆｍｏｌｅｓ　８６−３２　８６−３１　ｆｍｏｌｅｓ　ＰＨＩＶ−Ｉ 　ＰｉＩＶ−２された支持体　目標物　（相補的）（非相補的）目標物　（相補 的）（非相補的）ＣＨ２Ｂｒ Ｐ−６０−０，５８９０，２０，５８，３０，８５−ＮＨ聞２ ＣＨ２Ｂｒ Ｐ−６０−０，５７４０，１５ ｃｏｏｎ 表に見られるように、どちらの種類のＰ−６０オリゴヌクレオチド支持体も、オ リゴヌクレオチドの直接の入手にはセファクリル　ビーズよりも良好であること が証明された。表面上にカルボキシル基をもつ支持体は、セファクリルの対照と 同一の非特異的な結合を示し、そしてＰ−６０ヒドラジド　マトリックスよりも わずかに良好であった。ポリアクリルアミドを基にした支持体は、サンドウィッ チ　ハイブリダイゼーションにおいてセファクリル　ビーズよりも長い目標物の ＤＮＡを検出する能力が劣っていることを表し、そしてより高いバックグラウン ドを示した。この結果から、おそらく固定化されたオリゴヌクレオチドの実質的 な部分が支持体の内部にあり、そしてそのためにハイブリダイゼ・−ジョンのた めに長い目標物のＤＮＡに近づけないことを示唆している。その結果として、固 定化されたオリゴヌクレオチドのわずかな部分だけが二本鎖の形成率の点で、表 面上で利用できるのであろう。この段階で、カップリング反応において官能基を 転換するのに有益であろうということが推定された。より良いカップリングの効 率、およびそれによるより高い置換レベルをえるための障害物は、酸化に対する チオール−オリゴヌクレオチドの感受性であった。以下の実施例２および３は逆 のフォーマットを用いた結果を論じている。

実施例２ バイオゲル−５Ｈに対するブロモアセチル−オリゴヌクレオチドの共有結合 ａ、バイオゲル支持体のスルフィドリル誘導体の調製１グラム（乾燥賃量）のバ イオゲル　ヒドラジド　ビーズ（５００μｍｏｌｅｓ−ＮＨＮＨｇ／乾燥グラム ）を０．５　Ｍ　ＮａＨＣＯ３，ｐＨ９，７で平衡化した。５　ｍｌ中の懸濁液 にＮ−アセチルホモシスティン　チオラクトンの３０　ｍｏｌｅ等量（ＮＨＮＨ ２基に関して）を加え、そして混合物を室温において一晩撹拌した。ビーズを３ ００　ｍｌの０．Ｉ　Ｍ塩化ナトリウムで洗浄し、モしてＴＥ、ｐＨ８，０、あ るいは０．１　Ｍ　Ｋ２ＨＰ○４＋　ｐＨｇ、０中で保存した。反応は第１図の 反応Ｂに図解されている。スルフィドリルの置換のレベルは５，５°−ジチオビ ス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）で定量し、モして４１２　ｎｍにおいて ３−カロポキシラトー４−ニトロチオフエル−トの放出を監視することにより決 定した。変換は、表ＶＩに示されていおるとうり、固形支持体中のヒドラジド基 の置換レベルに依存していることが見いだされた。

表ＶＩ Ｎ−アセチルホモシスティン　ラクトンを用いたヒドラジド支持体の反応支持体 の　μモル　過剰モルの　％ＮＨＮＨ，μモル種ｇｉ　ＮＨＮＨｔ／ｇ＋ａ　チ オールラクトン　変換　ＳＨ／ｇｍＩ　Ｐ−２−３Ｈ５０１００３，８１，９２ Ｐ−２−８Ｈ５００３０９，９４９，４３Ｐ−１０−８Ｈ５０１００７，１３， ６４Ｐ−６０−８Ｈ５０１００７，６３，６５Ｐ−２００−８Ｈ５０１００４， ３２，２６Ｐ−２００−ＳＨ５００３０１４，２７０，３−８Ｈ’ ７　Ｐ−２００−８Ｈ５００３０１５，３７６，３−Ｃｏ、Ｈ ８Ｐ−３００−５Ｈ５００２０１０，４５２，２−ＳＨ！ ９　Ｐ−３００−８Ｈ５００２０１０，０５０，２ＴＮＰＨ −５Ｒ’ １０Ｐ−３００５００２０９，２４５，９−Ｃｏ！Ｈ １、無水グルタル酸を用いたＰ−２００−３Ｈ支持体中のヒドラジド基の変換。

２、トリニトロフェニルスルフォネートを用いたＰ−３００−３Ｒ支持体中のヒ ドラジド基の変換。

３、　無水グルタル酸を用いたＰ−３００−ＳＨ支持体中のヒドラジド基の変換 。

ｂ、スルフィドリル−バイオゲル　ビーズのグルタル化スルフィドリル　バイオ ゲルの１グラムの試料を２０　ｍｌの０．１　Ｍ塩化ナトリウムに懸濁し、そし て無水グルタル酸の２つの１００−ｍｇのアリコートを１５分の間隔で加えた。

ｐＨは３　Ｍ水酸化ナトリウムを用いて４．０付近に保持した。３０分間のすべ ての反応時間の後、ビーズを０．１　Ｍ塩化ナトリウムで洗浄した。モしてチオ エステルの加水分解を、１０　ｍｌの０．　１　Ｍ　Ｔｒｉｓ・塩酸、ｐＨ８， ５を用いて室温において１時間行った。

チオール支持体中の残りのヒドラジド基の、無水グルタル酸あるいはトリニトロ ベンンゼン　スルフォネートを用いたさらなる変換は、混合された官能基（それ ぞれ−ＳＨおよび＃Ｃ０ＯＨ，あるいは−ＳＨおよび＃ＴＮＰＨ）をもつマトリ ックスを提供した。この反応においてチオール基の修飾は観察されなかった（表 ＶＬ　６および７．８−１０を比較せよ）。これらの混合された支持体の合成の 背後にある論理的根拠は、ハイブリダイゼーション反応における負電荷の核酸の 非特異的な吸着を減少させることにおいてカルボキシルあるいはＴＮＰＨ基のア ニオンあるいは両性の特性を利用するものであった。排除の体積を広範囲に広げ るような、チオールで誘導化されたポリアクリルアミド支持体のファミリーはこ のように、材料のダラムあたりさまざまな２−７６μｍｏｌｅｓのチオールの置 換のレベルをもって調製された。

Ｃ，オリゴヌクレオチドのブロモアセチル誘導体の調製７ラン化されたエツペン ドルフ　チューブ中の５′がリン酸化されたオリゴヌクレオチドを３００　μｍ の０．２５Ｍヘキサンジアミン、０．　１５　Ｍ　ＥＤＣ，ｐＨ６，０７で室温 において２０時間処理した。アミノ誘導体をエタノール／塩化リチウムで２回沈 殿させ、そして２８５　μｍの０．２　Ｍ　ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７，７に再溶解し た。ＤＭＦ中のＮ−サクシニミジル臭化酢酸のｌｏ−ｍｇ／ｍｌ溶液の１５−μ ｌのアリコートを加えた。１時間の反応時間後、オリゴヌクレオチドをエタノー ル／塩化リチウムで２回沈殿させた。反応は第３図に図解されている。すべての リン酸からブロモアセトアミドへの転換は　［１！ｐ］で標識された生産物のポ リアクリルアミド　ゲル分析、およびアルカリホスファターゼ処理による５’　 ”ＰＯ４（未反応のリン酸化されたオリゴヌクレオチド）の分割の率により６０ −７０％であると評価された。

ｄ、５′がブロモアセチルで誘導化されたオリゴヌクレオチドのスルフィドリル バイオゲル　ビーズに対する共有結合スルフィドリル−バイオゲル支持体（１グ ラム乾燥重量）を０．０５　Ｍ　Ｋ！ＨＰＯ４、ｐＨ８，０中の２０　ｍＭ　Ｄ ＴＴ　５　ｍｌ、モして２　×　４０ｍ１の０．１Ｍトリエチルアンモニウム　 リン酸、１　ｍＭ　ＥＤＴＡ、ｐＨ９，０で還元した。５００　ｐｍｏｌｅｓの ブロモアセチルで誘導化されたオリゴヌクレオチドを１　ｍ１ＴＥＡＰ、ＥＤＴ Ａ、ｐＨ９，０に溶解し、モして５−ｍｌのポリプロピレン　チューブ中の樹脂 に加えた。Ｎ、でチューブを清浄し、そしてパラフィルムで密封した後、ビーズ の試料を回転ミキサーで一晩撹拌した。

ビーズを（ａ）３　Ｘ　１０　ｍｌのＮａ１ＰｚＯｔ、ｐＨ７，５、および（ｂ ）２　ｘ　１０　ｍｌ　ＴＥ、ｐＨ８，０で洗浄した。未反応のスルフィドリル 基は、３　ｍｌの０．０５　Ｍ　Ｋ！ＨＰＯ４、ｐＨ８，０中の２０　ｍＭ　Ｄ ＴＴを用いて３０分間支持体を還元することによりおおわれた。過剰のＤＴＴの 除去および０．１　Ｍ　ＴＥＡＰ、１　ｍＭ　ＥＤＴＡ、ｐＨ９，０中における 平衡化の後、３　ｍｌの同じ緩衝液中の５　ｍＭヨード酢酸を加え、そして１時 間反応をさせた。半融ガラス　ファンネル（多孔度　Ｃ）を通した未反応の試薬 の濾過後、ビーズの試料をＴＥ、ｐＨ８，０中で４℃において貯蔵した。

排除の体積が大きく異なるので、固定化の研究はＰ−２，Ｐ−２００，およびＰ −３００マトリツクスの点に集中した。高度にクロス　リンクされたＰ−２支持 体は、すべて表面上に付着したオリゴヌクレオチドをもっていると思えるので入 手に有用である。小さな穴の大きさはハイブリダイゼーションの間の核酸の包含 も阻害し、それにより非特異的な結合を減らすのに有益である。反対に、Ｐ−２ ００およびＰ−３００支持体（２００，０００および３００．０００の分子量を 排除する）はマトリックス中に大きな穴をもつことにおいてセファクリル（２ｏ 、ｏｏｏ、ｏｏｏの分子量を排除する）と構造的な特性かにている。これらのチ オール−ポリアクリルアミド支持体を用いたこれらの誘導体のカップリング反応 （第４図を参照せよ）の結果は、表ＶＩＩに示されている。

表ＶＩＩ ブロモアセチル　オリゴヌクレオチドを用いた支持体（５００ｔｔモルＮＨＮＨ ｘ　８６−３ｌ−ＣＢ２Ｂｒ　８６−３ｌ−ＰＯ４％　末端）最初の置換時間） 　％　付着　％　付着　付着Ｉ　Ｐ−２−３Ｈ３，５０，２９４ ２Ｐ−２００−３Ｈ２８，６０，５９８ＳＨ ３Ｐ−２００２９，３０，５９８ ＴＮＰＨ ４Ｐ−３００−８Ｈ２９，９１，７９４５Ｈ ５Ｐ−３００２２０，５９８ Ｃ０２Ｈ マトリックス上のチオールの濃度が反応中のオリゴヌクレオチド濃度を大きく越 えていてさえも、Ｐ−２支持体を用いたカップリングは低い収量であった。Ｐ− ２００およびＰ−３００支持体は満足な収量を提供し、そして反対のフォーマッ トに比較して、堅実に再生できた。前に注意したとうり、５゛でリン酸化された オリゴヌクレオチド　ブロモアセチル誘導体への不完全な変換のために、実際の 収量は記録された値よりも高い。注意すべき他の因子は　（１）ＣＯＯＨあるい はＴＮＰＨを用いたチオール支持体の付加的な誘導化は、付着の効率に対する顕 著な効果をもたない（死人事項２および３．４および５）：　（２）リン酸化さ れたオリゴヌクレオチドの対照の最小の結合により明らかにされたように、ブロ モアセチル　オリゴヌクレオチドを用いた反応は、核酸の、支持体に対する末端 の付着をもたらす：　（３）Ｐ−２００チオ一ル支持体を用いたブロモアセチル 　オリゴヌクレオチドの反応性の比較から、支持体上の千オール基による臭素の ！換は、５°がマレイミドで誘導化されたオリゴヌクレオチドに対する付加より も３０％以上効果的であることを示唆した；　（４）カップリングのための最適 なｐＨはｐＨ９，０であると決定されニトリエチルアンモニウムリン酸をカップ リング緩衝液として使用すると、リン酸カリウムに比較してより高いカップリン グの効率が得られる。

チオール支持体のハイブリダイゼーションの特性ポリアクリルアミド　チオール 支持体上のオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを、オリゴヌクレオチ ドの直接の入手により、およびＴＡＳで生じたＲＮＡ転写物を用いたサンドウィ ッチ　フォーマットにおいて試験した。２つのセットの実験は、セファクリル　 ビーズを用いたＰ−２およびＰ−２００と比較した、表ＶＩＩＬＡ、に集約され ている。

どちらのタイプのポリアクリルアミド支持体も、目標物のオリゴヌクレオチドの 入手および低い非特異的な結合を示すことにおいて良い印象でセファクリルビー ズと比較される。しかしながら、ＴＡＳを用いたサンドウィッチ　ハイブリダイ ゼーションにおいては、Ｐ−２支持体は高いバックグラウンドと共に目標物の入 手の能力が低下していることを示した。Ｐ−２０００支持体はサンドウィッチ　 ハイブリダイゼーシヨンにおいてＰ−２より良好であったが、非特異的な結合が 約２倍高いために、セファクリル　ビーズとの比較において劣っていた。この特 性は、７　ｋｂの目標物の断片に対するサンドウィッチ　ハイブリダイゼーショ ンにおいてＰ−２００支持体とセファクリル　ビーズを比較した一組の実験にお いて再度見られた（表ＶＩＩ１．Ｂ）。ポリアクリルアミド支持体は明らかにオ リゴヌクレオチドの入手においてセファクリル　ビーズよりも優秀であったが、 それは長い目標物のサンドウィッチの入手における低い効率のみでなく非特異的 な結合の期待されない増加を示した。

表ＶＩＩＩ チオール支持体を用いたノシブリダイゼーノヨン実験オリゴヌクレオチド　ＴＡ Ｓ　７ｋｂ目標物（直接入手）　仁ヱ旦久ざｙ＋）　（ｆンドウＬパ１−目標物 ８６−３２８６−３１　目標物　目標物（ｆｍｏｌｅｓ）（相補）（非１１ｍＸ ｆｍｏｌｅｓ）桓遡−非相補（ｆｍｏｌｅｓ）　ｍｍ　ｎｍｍＡ、　８６−３１ 固定化された支持体 １、Ｐ−２−３１１３，７５７０，９０，１３０，５２，９１，４ＮＨＮＨ２ ２Ｐ−２００−３ＣＨ２ＣＯＯ１＋ −間ＮＨ。

３．７５　９１．９　０，３５　０．５　８．６　１．９３セフアクリルビーズ ３．７５　７７．７　０，２５　０，５　１２．０　０．８５ＩＰ−２００−３ Ｈ０，５８２０，６０，５１３１，９ＮＨＮＨ２ ２セフアクリルビーズ ０．５　６１　０．２　０．５　３５　０．３Ｃ０ ＩＰ−３００３，７５８８，４０，５６０，５２４７−３ＣＢ２ＣＯ□Ｂ −ＮＨＮＨ。

２　Ｐ−２００−５Ｒ３，７５８７，８０，５５０，５１７４−ＮＩ３ＭＨｚＣ Ｏ□Ｈ ３Ｐ−３００３，７５７４，５０，５８０，５１５２−３Ｃ１１２ＣＯ，Ｉｔ −ＮＨＮＨ２Ｃ０２Ｂ ４セフアクリルビーズ ３．７５　６６．５　０，１８　０．５　１３　０．６非特異的な吸着の問題を 扱うために、ポリアクリルアミド支持体（Ｐ−２００およびＰ−３００）を、ヒ ドラジドおよびスルフィドリル官能基をカルボキシル基に変換させるように無水 グルタル酸および／あるいはヨード酢酸で処理した。

これらの修飾された支持体を用いたハイブリダイゼーションの結果は表ＶＩＩＩ 。

Ｃに示されている。我々の以前の実験と一致して、どのポリアクリルアミド支持 体による直接の入手も印象的でセファクリル　ビーズより優秀であった。ＴＡＳ 転写物のサンドウィッチの入手のレベルはポリアクリルアミドおよびセファクリ ル支持体のどちら−も同様であることが示されたが、非特異的な吸着の問題がチ オールを基にした支持体において再び表面に現れた。支持体上のヒドラジドおよ びチオール基を覆うことはバックグラウンドを３から５倍低下させる手助けとな っり（表ＶＩ　Ｉ　１．Ｃ，死人事項２および３）。

３．７５　ｆｍｏｌｅｓの目標物のオリゴヌクレオチドを用いた直接の入手実験 において、非特異的な結合が、全部の３種類のポリアクリルアミド支持体に関し てｓｏ、５５％であることが観察された（表ＶＩＩＩ、Ｃ，記人事項１．２、お よび３）。しかルながら、５　ｆｍｏｌｅｓの検出オリゴヌクレオチドを利用す るサンドウィッチ　ハイブリダイゼーションにおける、５−から１４−倍の増加 は注意に値した。

長い目標物は効率よく入手されず、そしておそらく非特異的な結合の増加におい て役割を担っているという推論の根拠を試すために、ポリアクリルアミドおよび セファクリル　ビーズによる、標識されたＰＣＲ生産物の直接の入手を調査した 。表ＩＸはその実験の結果を集約している。

表に示されているように、バックグラウンドはセファクリル　ビーズよりも２− から３−倍高いが、ポリアクリルアミド支持体の両方のカルボキシル化された形 はセファクリル　ビーズより、長い鎖のＤＮＡ目標物の入手に良好な効率を示し た。長い目標物ＤＮＡを用いたこれらの結果はオリゴヌクレオチド目標物を用い たわれわれの発見と一致していた（表ＶＩＩＴ、Ｃ，）。したがって、ポリアク リルアミド支持体はセファクリル　ビーズ（もしもそれ以上でないならば）と同 様の効率で長い目標物を入手できるが、現在知られていない、他の幾つかの因子 は、非特異的な結合の増加に寄与するサンドウィッチ　ハイプリダイゼーション に含まれるということがあきらかになる。

表ＩＸ ＰＣＲで増幅された、二本鎖生産物の直接の入手８６−３１固定化　目標物　相 補的　非相補的　シグナル／された支持体　（ｆ＋＊ｏｌｅｓ）　（％入手）　 （％入手）　ノイズＰ−３００−８Ｈ１１１１，１１０ Ｐ−３００−ＳＨ１１９，５０，７５２６Ｃ０ＩＨ Ｐ−２００−８Ｈ１２３１，７１３，５−Ｃｏ！Ｈ セファクリル　ビーズ　１　１３．５　０．４　３３．８１７．５　０．６５　 ２６．９ オリゴヌクレオチド−酵素の配合体を用いた支持体のハイブリダイゼーションポ リアクリルアミド支持体の直接の入手及びバックグラウンド特性も、オリゴヌク レオチド−酵素の配合体を用いて試験された。支持体を相補的なオリゴヌクレオ チド−酵素の配合体と１時間インキュベートし、そして未結合の配合体を除去す るために標準的な洗浄に供した。旦−二トロフェニルリン酸を基質として使用し て１時間発色させ、且−ニトロフェルレートの放出を分光分析的に決定した。

非相補的なオリゴヌクレオチド−酵素の配合体を対照として使用した。この研究 からのデータは表Ｘに集約されている。

表Ｘ ポリアクリルアミド支持体によるオリゴヌクレオチド−酵素の配合体の直接の入 手 ８６−３１固定化’　８６−３２−ＡＰ　８６−３ｌ−ＡＰ　シグナル／　平均 された支持体　ｆ＋ａｏｌｅｓ　（相補的）（非相補的）ノイズ（Ｓ／Ｎ）　Ｓ ／ＮＩＰ−２００−３Ｈ３５，２４２，０３０８，５８，５−Ｃｏ！Ｈ ２Ｐ−２００−ＳＣＨＩＣＯ，Ｈ３５，１４３，００６２１，８１４，６〜Ｃ０ ＩＨ３５，２３９，０３１？、４３１０％Ｐ−２００−ＳＣＨＩＣｏ□Ｈ”　３ ５　．１３５　．００２　６１．８　３６．４７＜ＯＪ　３５　、１７２　、０ １５　１１．０４　Ｐ−３００−ＳＣＴｏＣＯＪ　３５　、２１６　、０１９　 １２〜Ｃｏ！Ｈ３５，１７３，０１０１５，８３５，２２２，０２５ｇ、５　１ ２．１５１０％Ｐ−３００−３ＣＨＩＣＯ！Ｈ３５，１４１，００９１４，３＜ ０２Ｈ３５，１９０，０２６７，０１０，７６セフアクリルビーズ　３５　．２ ９４　．０１３　２３．９　１９．６３５　．２３８　．０１５　１５．３ １支持体に結合した配合体による且−ニトロフェニルリン酸の加水分解により放 出された旦−ニトロフェルレートの４１０　ｎｍにおける吸光度を記録する。

記録された値は一対の実験の平均である。それぞれの列は一対のセットの固形支 持体（５０ｍｇ）を用いて実行された別々の実験を表す。

２オリゴヌクレオチドを固定化した支持体を、カルボキシル基のみをプロセシン グしたポリアクリルアミド支持体と混合した。

以下の観察がこの結果から理解されつる。支持体に結合した配合体による基質の 加水分解により生じたシグナルの平均は、ポリアクリルアミド支持体と比較した ときのセファクリル　ビーズの場合、−４０％高かった。両方の支持体のバック グラウンドの平均はほとんど同一であった。したがってこれは、ポリアクリルア ミドと比較したセファクリル　ビーズのノイズに対するシグナルの率が優秀であ ることの説明となる。ポリアクリルアミド支持体がオリゴヌクレオチドの直接の 入手においてセファクリル　ビーズより効果的であることを記憶しているので、 配合体の入手が不利である事が証明されたことは驚くべきことであった。

支持体上に固定化されたオリゴヌクレオチドの存在が幾つかの非特異的な結合に 対する方法に寄与するかどうかを決定するために、オリゴヌクレオチドを結合し た支持体をオリゴヌクレオチドを結合していない支持体と１：９の割合で混合し た。表Ｘ１記人事項３および５に見られるように、ノイズに対するシグナルの比 率からは意義のある結果を得ることができなかった。

実施例　３ ブロモアセチル　オリゴヌクレオチドのトリスアクリル−８Ｈに対する共有結合 ａ、トリスアクリルのアミノ誘導体の調製トリスアクリル　ＧＦ−２０００（Ｉ ＢＦ、バイオテクニクス、米国）の２０−ｍｌの懸濁液を半融ガラス　ファンネ ルにピペットでうつし、２０ｍ１の水で洗浄し、１０分間吸引乾燥した。乾燥し た試料（＃１１　グラム）を、油浴中で平衡化された２０　ｍｌの蒸留されたエ チレン　ジアミンにゆっくりと加えた。１時間後、砕いた氷３０　ｍｌを加える ことにより反応混合物を冷やした。

過剰のエチレン　ジアミンは、４００　ｍｌの０．２Ｍ塩化ナトリウム、０゜０ ０１　Ｍ塩酸により樹脂を洗浄し、さらにファンネル中で５００　ｍｌの０゜１ 　Ｍ塩化ナト・リウムで洗浄することにより除去した。濾過物がＴＮＢＳ試薬（ 引用実施例　１ｄ）の試験で陰性になるまで、洗浄を続けた。

ｂ、トリスアクリルのスルフィドリル誘導体の調製トリスアクリル−アミノ支持 体を０．５　Ｍ　ＮａＨＣＯｓ−ｐＨ９，７で平衡化し、モして５Ｑ−ｍｌのザ ルステッド（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）　コニカル　ビーカー中で体積を３０　ｍｌに 合わせた。固体のＮ−アセチル　ホモシスティンラクトン（１グラム）を加え、 そしてチューブを室温において２時間振盪した。

そしてさらに１　グラムの試薬を加え、試料を一晩振盪した。ビーズを５００ｍ １）０．　１　Ｍ塩化ナトリウムで洗浄し、スルフィドリル基をエルマンの試薬 （ＤＴＮＢ）で定量することにより見積もった（引用実施例１ｅ）。反応は第５ 図に図解されている。

トリスアクリル−８Ｈ支持体上のスルフィドリル基の定量が、樹脂の乾燥グラム あたり１２．３　μｍｏｌｅｓ−３Ｈの置換レベルであることを示した。

Ｃ，スルフィドリル−トリスアクリルのサクシニル化２−グラムのトリスアクリ ル−３Ｈの試料を２０　ｍｌの０．　１　Ｍ　Ｎａ０Ａｃ、ｐＨ６，０で平衡化 し、モしてＺｏｏ　ｍｇの固体の無水琥珀酸で処理した。３０分間の振盪後、さ らに３０　ｍｇの無水物を懸濁液に加えそしてさらに３０分間振盪した。そして ビーズを４０　ｍｌのＯ，ｌ　Ｍ　Ｔｒｉｓ、ｐＨ８゜５で平衡化した。１時間 後、支持体をＴＥ、ｐＨ８，Ｑで洗浄し、そして４℃において貯蔵した。

ｄ、５′　がブロモアセチルで誘導化されたオリゴヌクレオチドのスルフィドリ ル−トリスアクリルに対する共有結合バイオゲル　ビーズに使用した方法（実施 例　２ｄ）にしたがって、支持体（１グラム）をＤＴＴで還元し、そして０．１ 　Ｍ　ＴＥＡＰ、１　ｍＭ　ＥＤＴＡ。

ｐＨ９，０で平衡化した。１　ｍｌのＴＥＡＰ／ＥＤＴＡ中に溶解した、５００ ｐｍｏ　ｌ　ｅ　ｓの、ブロモアセチルで誘導化されたオリゴヌクレオチドを支 持体に加え、そしてチューブをＮ２で清浄してシールした。回転ミキサーで一晩 撹拌した後、１００　μｍｏｌｅｓのヨード酢酸を加え、そして混合物を室温に １時間放置した。ビーズを４．　Ｘ　２０　ｍｌの０．Ｉ　Ｍ　ＮａｚＰｚＯｔ 、ｐＨ７゜５、そしてさらに２　Ｘ　２０　ｍｌのＴＥ、ｐＨ８，Ｏｒ洗浄した 。

反応は第６図に図解されている。［！！ｐ］で標識され、ブロモアセチル化され たオリゴヌクレオチドを用いたカップリング反応により、１２％の標識がスルフ ィドリル支持体に対して付着し、そして末端の付着のレベルは９７％であると決 定された。この反応の実際のカップリングの収量は、６０−７０％のブロモアセ チル　オリゴヌクレオチドの精製度に基づいて、約２０％であると見積もられた 。

カップリングの収量はバイオゲル　ポリアクリルアミド支持体で得られた収量（ ４０−４５％）よりも低かったが、トリスアクリル−樹脂は、ハイブリダイゼー ション実験において使用された目標物の量（０，５−５ｆｍｏｌｅｓ）と比較し て大過剰のオリゴヌクレオチド分子をまだ含んでいた。

スルフィドリル−トリスアクリル支持体のハイブリダイゼーションの特性トリス アクリル−５Ｈ（オリゴ８６−３１）を用いて３．７５　ｆｍｏｌｅｓの［３２ ｐ］で標識された目標物を直接入手することを含む、最初のハイブリダイゼーシ ョンの研究（表ＸＬＡ）は、非相補的な目標物の非特異的な結合がセファクリル −ビーズ支持体よりも約３倍高いことを示唆した（０．４２％対０．１４％）。

表ＸＩ トリスアクリル−８Ｈを用いたハイブリダイゼーション実験Ａ、直接の入手（％ 　オリゴの結合） ８６−３１　目標物　８６−３２　８６−３１　シグナル／支持体　（ｆｍｏｌ ｅｓ）　（相補的）　（非相補的）　ノイズトリスアクリル−５Ｈ３７５６６， ５０，４２１５８，３トリスアクリル−３Ｈ３７５６９，８０，１５４６５，３ （ＩＣＵ２００Ｈで処理された） セファクリル　ビーズ　３７５　５４．６　０．１４　３９０．ＯＢ、　ＴＡＳ 　ＨＩＶ　ＲＮＡ　（サンＦつ１’ツチ）　入手８６−３１　目標物　８６−３ ２　８６−３１　シグナル／支持体　（ｆｍｏｌｅｓ）　（相補的）　（非相補 的）　ノイズトリスアクリル−６ＨＯ，５１７，００，１１７０，０（ＩＣＵ２ ００Ｈで処理された） セファクリル　ビーズ　０．５　１２．５　０，９　１３．９Ｃ６オリゴヌクレ オチド−酵素の配合体の直接の入手８６−３１　目標物　８６−３２　８６−３ １　シグナル／支持体　（ｆｍｏｌｅｓ）　（相補的）　（非相補的）　ノイズ トリスアクリル−８Ｈ５０，１７９０，００３６１，７（ＩＣＩＩＩ、０ＯＩｌ で処理された）セファクリル　ビーズ　５　０．３１９　０．０２３　１４．４ ヨード酢酸を用いた、トリスアクリル支持体上の未反応のスルフィドリル基のア ルキル化は、マトリックスの負電荷密度を増加させることにより非特異的な結合 を減らすであろうということが予測された。事実、アルキル化されたトリスアク リル支持体を直接の入手実験においてアッセイしたとき、非特異的な結合が、セ ファクリル　ビーズで得られたのと等しい０．１５％にかなり落ちた。

より重要なことは、０．５　ｆｍｏｌｅｓの目標物のＲＮＡを使用したＴＡＳサ ンドウィッチ実験（表Ｘ１．Ｂ）からの結果が、相補的な目標物を高いパーセン トで入手したことにより証明されたように、セファクリル　ビーズ以上のトリス アクリルの優秀性を強調した。もっとも満足したことは、この穴の大きいポリア クリルアミド支持体によりもたらされた極端に低い非特異的なバックグラウンド である。このことは、ＴＡＳサンドウィッチ　フォーマットにおける低いシグナ ル／ノイズ比の第一の原因であるとされて来た、バイオゲルの支持体のより高い バックグラウンドと対照的であった。

最後に、直接の入手のレベルおよびバックグラウンドの特性を決定するために、 トリスアクリル支持体をオリゴヌクレオチド−アルカリホスファターゼ配合体を 用いて試験した（表Ｘ１．　Ｃ，）。標準的な洗浄方法に従った、トリスアクリ ルおよびセファクリル　ビーズを用いた相補的な配合体および非相補的な配合体 のインキュベーションおよびｐ−ニトロフェニル　リン酸を使用した発色アッセ イを、５　ｆｍｏｌｅｓの配合体を用いて行った。相補的な目標物の入手はセフ ァクリル　ビーズの場合多かったが、トリスアクリルの非特異的な結合はかなり 低（、セファクリル　ビーズに比較して、ノイズに対するシグナル比において４ 倍の改良をもたらした。

ＨＥＰＥ５　ｐＨ７，７ 、↓　↓ 第１区 ＤＮＡ−５’−ＯＨ 牢２　口 ＤＮＡ−５’−０Ｈ ｚ、　０．１Ｍ　ｒ＋ｕｓ　ｐＨ８，５％５０ ！、ＴＦＩｔｓ　ｐＨ８，５ ２、丁りご　−―ｒ 寥６色 国際ｖ４萱報告

Claims (36)

【特許請求の範囲】
1. １．実質的にそれらの５′末端において共有結合したオリゴヌクレオチドを持つ ポリアクリルアミド支持体。
2. ２．上記オリゴヌクレオチドの少なくとも約９５％がそれらの５′末端において 上記支持体に付着している、請求項１に記載のポリアクリルアミド支持体。
3. ３．約２，０００から約４００，０００の分子量の排除限界を持つ請求項１に記 載のポリアクリルアミド支持体。
4. ４．少なくとも約２×１０７ドルトンの分子量の排除限界を持つ請求項１に記載 のポリアクリルアミド支持体。
5. ５．それぞれ３つのヒドロキシメチル基および１つの第二級アミノ基を含む繰り 返しユニットを持つ、請求項４に記載のポリアクリルアミド支持体。
6. ６．チオール基に誘導化されたオリゴヌクレオチドをポリアクリルアミド支持体 にカップリングし、末端の付着前に上記ポリアクリルアミド支持体のアミド基の 少なくとも一部がブロモアセチル基に変換されることからなる、実質的に５′末 端においてオリゴヌクレオチドを固形支持体に付着させる方法。
7. ７．上記チオールに誘導化されたオリゴヌクレオチドが５′−アルキルチオール オリゴヌクレオチドである、請求項６に記載の方法。
8. ８．上記ポリアクリルアミド支持体のアミド基を最初にヒドラジンで修飾し、そ して得られたヒドラジド官能基の少なくとも一部をブロモアセチル基に変換する 、請求項６に記載の方法。
9. ９．ブロモアセチル基への上記変換をＮ−ヒドロキシサクシンイミド臭化酢酸エ ステルを用いて行う、請求項７に記載の方法。
10. １０．上記ヒドラジド官能基の少なくとも約１５％が上記ブロモアセチル基に変 換されている、請求項８に記載の方法。
11. １１．上記ヒドラジド官能基の少なくとも約４０％が上記ブロモアセチル基に変 換されている、請求項８に記載の方法。
12. １２．残りのヒドラジド官能基の少なくとも一部がカルボキシル基に変換されて いる、請求項８に記載の方法。
13. １３．上記ポリアクリルアミド支持体の分子量の排除限界が約２，０００から４ ００，０００ドルトンである、請求項６に記載の方法。
14. １４．上記ポリアクリルアミド支持体の分子量の排除限界が約２×１０７ドルト ンである、請求項６に記載の方法。
15. １５．上記チオールで誘導化されたオリゴヌクレオチドの少なくとも約９５％が それらの５′末端において上記ポリアクリルアミドに付着している、請求項６に 記載の方法。
16. １６．ブロモアセチル基で誘導化されたオリゴヌクレオチドをポリアクリルアミ ド支持体にカップリングし、末端の付着前に上記ポリアクリルアミド支持体のア ミド基の少なくとも一部がチオール基に変換されることからなる、実質的にそれ らの５′末端においてオリゴヌクレオチドを固形支持体に付着させる方法。
17. １７．上記ブロモアセチルで誘導化されたオリゴヌクレオチドをＮ−ヒドロキシ サクシンイミド臭化酢酸エステルを用いて５′−アミノヘキシルーホスホアミデ ートオリゴヌクレオチドを反応させることにより調製される、請求項１６に記載 の方法。
18. １８．上記５′−アミノヘキシルーホスホアミデートオリゴヌクレオチドのブロ モアセチルで誘導化された上記オリゴヌクレオチドヘの変換が少なくとも約６０ ％である、請求項１７に記載の方法。
19. １９．上記ポリアクリルアミド支持体の第一級アミド基を最初にヒドラジンで修 飾し、得られたヒドラジド官能基の少なくとも一部がチオール基に変換されてい る、請求項１６に記載の方法。
20. ２０．上記の変換をＮ−アセチルホモシステインチオラクトンを用いて行う、請 求項１９に記載の方法。
21. ２１．上記ヒドラジド官能基の少なくとも約４％が上記チオール基に変換されて いる、請求項１９に記載の方法。
22. ２２．残りのヒドラジド官能基の少なくとも一部が１以上の他の官能基に変換さ れている、請求項１９に記載の方法。
23. ２３．上記他の官能基がカルボキシル基である請求項２２に記載の方法。
24. ２４．上記他の官能基がトリニトロフェニル基である請求項２２に記載の方法。
25. ２５．上記ポリアクリルアミド支持体の分子量の排除限界が約２，０００から約 ４００，０００ドルトンである、請求項１６に記載の方法。
26. ２６．上記ポリアクリルアミド支持体がそれぞれ３つのヒドロキシメチル基およ び１つの第二級アミノ基を含む繰り返しユニットを持つ、請求項１６に記載の方 法。
27. ２７．上記第二級アミド基を最初に同一の二官能性アミンを用いてアミド基を転 移させ、末端のアミノ基が実質的に少なくとも一部チオールに変換されている、 請求項２６に記載の方法。
28. ２８．未変換の末端のアミノ基の少なくとも一部がカルボキシルに変換させるた めにアシル化されている、請求項２７に記載の方法。
29. ２９．上記ブロモアセチルで誘導化されたオリゴヌクレオチドを用いたカップリ ングの後、未反応のチオール基の少なくとも一部がそれらをカルボキシルに変換 させるためにハロアセチル化されている、請求項２７に記載の方法。
30. ３０．上記ポリアクリルアミド支持体の分子量の排除限界が約２×１０７である 、請求項２６に記載の方法。
31. ３１．上記ブロモアセチルで誘導化された上記オリゴヌクレオチドの少なくとも 約９５％がそれらの５′末端において上記チオールーポリアクリルアミド支持体 に付着している、請求項１６に記載の方法。
32. ３２．上記ブロモアセチルで誘導化されたオリゴヌクレオチドがＴＡＳ　ＲＮＡ 転写物を用いたサンドウィッチフォーマットにおいて上記チオールーポリアクリ ルアミド支持体に付着している、請求項１６に記載の方法。
33. ３３．上記チオールーポリアクリルアミド支持体が少なくとも約２×１０７の分 子量の排除限界を持つ、請求項３２に記載の方法。
34. ３４．それらの５′末端においてブロモアセチル基に誘導化されたオリゴヌクレ オチド。
35. ３５．チオールーポリアクリルアミド支持体上に固定化された請求項３４に記載 のオリゴヌクレオチド。
36. ３６．ブロモアセチルで誘導化されたポリアクリルアミド支持体の上に固定化さ れたチオール基を用いてそれらの５′末端において誘導化されたオリゴヌクレオ チド。