JPH0526467B2 - - Google Patents
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- JPH0526467B2 JPH0526467B2 JP58170006A JP17000683A JPH0526467B2 JP H0526467 B2 JPH0526467 B2 JP H0526467B2 JP 58170006 A JP58170006 A JP 58170006A JP 17000683 A JP17000683 A JP 17000683A JP H0526467 B2 JPH0526467 B2 JP H0526467B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- dna
- histidine
- plasmid
- coryneform
- medium
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
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- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
本発明は、発酵法によるＬ−ヒスチジンの製造
法に関する。 Ｌ−ヒスチジン生成に関与する酸素の内、ヒス
チジノールホスフアターゼ（以下「HP」と記
す）は、Ｌ−ヒスチジン生成の最終中間代謝物で
あるＬ−ヒスチジノールをヒスチジノールホスフ
エイトより生成する反応を触媒する酸素である。 我々は、大量のＬ−ヒスチジンを生産すること
が知られているコリネ型細菌に着目し、これを
DNA細換え技術を利用して更に生産性を高める
べく研究を開始した。そして、ついに上記Ｌ−ヒ
スチジン生産に関与するHPをコードする遺伝子
（以下「HP遺伝子」と記す）をコリネ型細菌よ
り分離することに成功し、更にこれをコリネ型細
菌細胞内で増殖できるプラスミドベクターに接続
せしめて、コリネ型細菌細胞内に導入し、コリネ
型細菌のＬ−ヒシチジン生産性を著しく高めるこ
とに成功した。 すなわち本願発明は、コリネホルム・グルタミ
ン酸生産菌に属するDNA供与菌より得られ、ヒ
スチジノールホスフアイターゼをコードする遺伝
子を含むDNA断片が、コリネホルム・グルタミ
ン酸生産菌の菌体内で自立複製できるベクタープ
ラスミドに接続されて、コリネホルム・グルタミ
ン酸生産菌に属し１，２，４−トリアゾール−３
−アラニンに耐性を示すDNA受容菌に導入され
て得られるＬ−ヒスチジン生産能を有する微生物
を培養し、培養液中に蓄積されたＬ−ヒスチジン
を採取することを特徴とするＬ−ヒスチジンの製
造法である。 コリネ型細菌は好気性、グラム陽性桿菌であ
り、非抗酸性でバーヂース・マニユアル・オブ・
デターミネテイブバクテリオロジー第８版599頁
（1974）に記載されている。その内、特に以下に
例示するようなＬ−グルタミン酸を大量に生産す
るものが知られていて、これらはいずれも同一属
に属するものと考えられる。
法に関する。 Ｌ−ヒスチジン生成に関与する酸素の内、ヒス
チジノールホスフアターゼ（以下「HP」と記
す）は、Ｌ−ヒスチジン生成の最終中間代謝物で
あるＬ−ヒスチジノールをヒスチジノールホスフ
エイトより生成する反応を触媒する酸素である。 我々は、大量のＬ−ヒスチジンを生産すること
が知られているコリネ型細菌に着目し、これを
DNA細換え技術を利用して更に生産性を高める
べく研究を開始した。そして、ついに上記Ｌ−ヒ
スチジン生産に関与するHPをコードする遺伝子
（以下「HP遺伝子」と記す）をコリネ型細菌よ
り分離することに成功し、更にこれをコリネ型細
菌細胞内で増殖できるプラスミドベクターに接続
せしめて、コリネ型細菌細胞内に導入し、コリネ
型細菌のＬ−ヒシチジン生産性を著しく高めるこ
とに成功した。 すなわち本願発明は、コリネホルム・グルタミ
ン酸生産菌に属するDNA供与菌より得られ、ヒ
スチジノールホスフアイターゼをコードする遺伝
子を含むDNA断片が、コリネホルム・グルタミ
ン酸生産菌の菌体内で自立複製できるベクタープ
ラスミドに接続されて、コリネホルム・グルタミ
ン酸生産菌に属し１，２，４−トリアゾール−３
−アラニンに耐性を示すDNA受容菌に導入され
て得られるＬ−ヒスチジン生産能を有する微生物
を培養し、培養液中に蓄積されたＬ−ヒスチジン
を採取することを特徴とするＬ−ヒスチジンの製
造法である。 コリネ型細菌は好気性、グラム陽性桿菌であ
り、非抗酸性でバーヂース・マニユアル・オブ・
デターミネテイブバクテリオロジー第８版599頁
（1974）に記載されている。その内、特に以下に
例示するようなＬ−グルタミン酸を大量に生産す
るものが知られていて、これらはいずれも同一属
に属するものと考えられる。
【表】
フイラム
コリネ型細菌には上記のようなグルタミン酸生
産性を有するもののほかに、グルタミン酸生産性
を失つた変異株及び他の変異株も含まれる。 HP遺伝子を分離する方法は、コリネ型細菌の
HP遺伝子を有している株より、まず染色体遺伝
子を抽出し（例えばH.Saito and K.Miura，
Biocham Biophys Acta72619（1963）の方法が
使用できる）、これを適当な制限酸素で切断する。
ついでリネ型細菌で増殖し得るプラズミドベクタ
ーに接続し、得られた組換えDNAを用いてコリ
ネ型細菌のHP欠損変異株を形質転換せしめ、
PH生成活性を保有するにいたつた菌株を分離
し、それよりHP遺伝子を分離できる。 染色体遺伝子を切断するには、切断反応時間等
を調節して、切断の程度を調節すれば、巾広い種
類の制限酸素が使用できる。 本発明にて使用されるプラスミドベクターは、
コリネ型細菌細胞内において増殖し得るものであ
ればどのようなものでも良い。具体的に例示すれ
ば以下のものがある。 (1) pAM330 特開昭58−67699参照 (2) pAM1519 特開昭58−77895参照 (3) pAJ655 (a) 宿主菌：エシエリヒア・コリAJ11882
（FERM−P6517＝FERM−BP136など） (b) 分子量：6.6メガダルトン (c) 制限酸素切断地図：第１図参照 (d) 性質：pAM330とpBR325（Gene４121
（1978）の複合プラスミド。クロラムフエニ
コール耐性に与る。 (4) pAJ611 (a) 宿主菌：エシエリヒア・コリAJ11884
（FERM−P6519＝FERM−BP138など） (b) 分子量：6.6メガダルトン (c) 制限酸素切断地図：第２図参照 (d) 性質：pAM281とpBR325の複合プラスミ
ド。クロラムフエニコール耐性に与る。 (5) pAJ440 (a) 宿主菌：バチルスズブチリスAJ11901
（FERM−BP140＝ATCC39139など） (b) 分子量：6.0メガダルトン (c) 制限酸素切断地図：第４図参照 (d) 性質：pAM330とpUB110（J.Bacteriol.，
134318（1978））複合プラスミド。カナマイシ
ン耐性に与る。 (6) pAJ1844 (a) 宿主菌：エシエリヒア・コリAJ11883
（FERM−P6518＝FERM−BP137など） (b) 分子量：5.4メガダルトン (c) 制限酸素切断地図：第３図参照 (d) 性質：pHM1519とpBR325の複合プラス
ミド。クロラムフエニコール耐性に与る。 (7) pAJ3148 (a) 宿主菌：コリネバクテリウム・グルタミカ
ムSR8203、ATCC39137など (b) 分子量：6.6メガダルトン (c) 制限酸素切断地図：第５図参照 (d) 性質：pHM1519とpUB110との複合プラ
スミド。カナマイシン耐性に与る。 コリネ型細菌細胞内で増殖可能なプラスミドの
その他の例としてはpCG1（特開昭57−134500）、
pCG2（特開昭58−35197）、pCG4，pCG11（特開昭
57−183799）があり、これらはいずれも当然使用
可能であろう。 ベクターDNAは、染色体遺伝子を切断した際
に用いられた制限酸素により切断され、または染
色体DNA切断フラグメント及び切断されたベク
ターDNAのそれぞれの両端に相補的な塩基配列
を有するオリゴヌクレオチドを接続せしめて、つ
いでプラスミドベクターと染色体DNAフラグメ
ントとのライゲーシヨン反応に付される。 このようにして得られた、染色体DNAとベク
タープラスミドとの組換えDNAをコリネ型細菌
に属する受容菌へ導入するには、エシエリヒア・
コリＫ−12について報告されている様な
（Mandel，M.and Higa，A.，J.Mol.Biol.，53
159（1970））受容細菌胞を塩化カルシウムで処理
してDNAの透過性を増す方法、またバチルス・
スブチリスについて報告されている様に
（Duncan，C.H.，Wilson，G.A.and Yaung，F.
E.，Gene，１，153（1977））細胞がDNAを取り
込み得る様になる増殖段階（いわゆるコンビテン
トセル）に導入する方法により可能である。ある
いは、バチルス・ズブチリス、放線菌類および酵
母について知られている様に（Chang，S.and
Choen，S.N.，Molec.Gen.Genet.，168，111
（1979）；Bibb，M.J.，Ward，J.M.and
Hopwood，O.A，Nature，274，398（1978）；
Hinnen，A.，Hicks，J.B.and Fink，G.R.，
Proc.Natl.Acad.Sci.USA，751929（1978））、
DNA受容菌を、プラスミドDNAを容易に取り込
むプロトプラストまたはスフエロプラストにして
プロスミドをDNA受容菌に導入することも可能
である。 プロトプラスト法では上記のバチルス・ズブチ
リスにおいて使用されている方法でも充分高い頻
度を得ることができるし、特開昭57−183799に記
載されたコリネバクテリウム属またはブレビバク
テリウム属のプロトプラストにポリエチレングリ
コールまたはポリビニルアルコールと二価金属イ
オンとの存在下にDNAをとり込ませる方法も当
然利用できる。ポリエチレングリコールまたはポ
リビニルアルコールのかわりに、カルボキシメチ
ルセルロース、デキストラン、フイコール、プル
ロニツクF68（セルバ社）などの添加によつて
DNAのとり込みを促進させる方法でも同等の結
果が得られる。 形質転換の後、HP生産性を獲得し、または、
さらにプラスミドベクターが有しているマーカー
としての性質を発現する菌株を所望の形質転換株
として分離する。このような形質転換株は、HP
遺伝子が組み込まれている組換えDNAを有して
いる。組換えDNAを単離する方法は、例えば菌
株をリゾチームSDS処理により溶菌させ、フエノ
ール処理ののち、２容のエタノールを加えて
DNAを沈澱回収する。 得られたＬ−ヒスチジン生産菌を培養する方法
は、従来のＬ−ビスチジン生産菌の培養方法と特
に変らない。即ち、培地としては、炭素源、窒素
源、無機イオン、更に必要に応じアミノ酸、ビタ
ミン等の有機微量栄養素を含有する通常のもので
ある。炭素源としては、グルコース、シユクロー
ス、ラクトース等及びこれらを含有する澱粉加水
分解液、ホエイ、糖密等が用いられる。窒素源と
しては、アンモニアガス、アンモニア水、アンモ
ニウム塩その他が使用できる。 培養は好気的条件下で培地のPH及び温度を適宜
調節しつつ、実質的にＬ−ヒスチジンの生産蓄積
が停止するまで行なわれる。 かくして培養中には著量のＬ−ヒスチジンが生
成蓄積される。培養液よりＬ−ヒスチジンを採取
するには、通常の方法が適用できる。 実施例 (1) HP遺伝子を含む染色体DNAの調整 ブレビバクテリウム・ラクトフアーメンタム
ATCC13869より変異誘導されたストレプトマ
イシン耐性変異株AJ12036を１のCMG培地
（ペプトン１ｇ／dl、酵母エキス１ｇ／dl、グ
ルコース0.5ｇ／dl、及びNaCl0.5ｇ／dlを含
み、PH7.2に調整したもの）に植菌し、30℃で
約３時間振盪培養を行ない、対数増殖期の菌体
を集めた。この菌体をリゾチーム・SDSで溶菌
させたのち、通常のフエノール処理法により、
染色体DNAを抽出精製し、最終的に3.2mgの
DNAを得た。 (2) ベクターDNAの調製 ベクターとしてpAJ1844（分子量5.4メガダル
トン）を用い、そのDNAを次の様にして調製
した。 まずpAJ1844をプラスミドとして保有するブ
レビバクテリウム・ラクトフアームンタム
AJ12037（FERM Ｐ−7234，FERM BP−577）
を100mlのCMG培地に接種し、30℃で対数増殖
期後期まで培養したのち、リゾチームSDS処理
により溶菌させ、30000×ｇ30分の超遠心によ
り上清を得た。フエノール処理ののち、２容の
エタノールを加えてDNAを沈澱回収した。こ
れを少量のTEN緩衝液（20ｍＭトリス塩酸塩、
20ｍＭ NaCl、１ｍＭ EDTA（PH8.0）に溶
解後、アガロースゲル電気泳動にかけ分離後、
切り出してpAJ1844プラスミドDNA約15μｇを
得た。 (3) 染色体DNA断片のベクターへの挿入 (1)で得た染色体DNA20μｇと(2)で得たプラ
スミドDNA10μｇとを制限エンドヌケレアー
ゼPstIでそれぞれを37℃、１時間処理し、完全
に切断した。65℃、10分の熱処理後、両反応液
を混合し、ATP及びジチオスレイトール存在
下、T4フアージ由来のDNAリガーゼによつて
10℃、24時間DNA鎖の連結反応を行つた。65
℃、５分の熱処理後、反応後に２倍容のエタノ
ールを加えて連結反応終了後のDNAを沈澱採
取した。 (4) HP遺伝子のクローニング HP遺伝子が欠損したブレビバクテリウム・
ラクトフアーメンタムAJ12074を受容菌として
用いた。 形質転換の方法としては、プロトプラストト
ランスフオーメーシヨン法を用いた。まず、菌
株を５mlのCMG液体倍地で対数増殖期の初期
まで培養し、ペニシリンＧを0.6ユニツト／ml
添加後、さらに1.5時間振盪培養し、遠心分離
により菌体を集め、菌体を0.5Mシユークロー
ス、20ｍＭマレイン酸、20ｍＭ塩化マグネシウ
ム、3.5％ペナツセイブロス（Difco）からなる
SMMP培地（PH6.5）0.5mlで洗浄した。次いで
10mg／mlのリゾチームを含むSMMP培地に懸
濁し30℃で20時間プロトプラスト化を図つた。
6000×ｇ、10分間遠心分離後、プロトプラスト
をSMMPで洗浄し0.5mlのSMMPに再度懸濁し
た。この様にして得られたプロトプラストと(3)
で調製したDNA10μｇを５ｍMEDTA存在下
で混合し、ポリエチレングリコールを最終濃度
が30％になる様に添加した後、DNAをプロト
プラストに取り込ませる為に室温に２分間放置
した。このプロトプラストをSMMP培地１ml
で洗浄後、SMMP培地１mlに再懸濁し、形質
発現の為、30℃で２時間培養した。この培養液
をPH7.0のプロトプラスト再生培地上に塗布し
た。プロトプラスト再生培地は蒸留水１あた
りトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン12
ｇ、KCl0.5ｇ、グルコース10ｇ、MgCl2・
6H2O8.1ｇCaCal2・2H2O2.2ｇ、ペプトン４
ｇ、粉末酵母エキス４ｇ、カザミノ酸（Difco
社）１ｇ、K2HPO40.2ｇ、コハク酸ナトリウ
ム135ｇ、寒天８ｇ及びクロラムフエニコール
3μｇ／mlを含む。 30℃で２週間培養後、約10000個のクロラム
フエニコール耐性コロニーが出現してきたので
これをヒスチジンを含まない培地（His欠培
地：２％グルコース、１％硫酸アンモニウム、
0.25％尿素、0.1％りん酸二水素カリウム、0.04
％硫酸マグネシウム７水塩、2ppm鉄イオン、
2ppmマンガンイオン、200μｇ／サイアミン
塩酸塩、50μｇ／ビオチン、PH7.0、寒天1.8
％）にレプリカし、クロラムフエニコール耐性
でかつヒスチジン要求性の消失した９株を得
た。 (5) 形質転換株のプラスミド解析 これらの株より(2)で述べた方法により、溶菌
液を調製し、アガロースゲル電気泳動法によ
り、プラスミドDNAを検出したところ、２株
でベクターのpAJ1844よりも明らかに大きなプ
ラスミドが検出された。これらのうちの代表株
をAJ12075（FERM−P7235）と名付けた。 (6) 再トランスホーメーシヨン AJ12075が有するプラスミド（pAJ715）上
にHP遺伝子が存在することを確認するため、
このプラスミドDNAを用いブレビバクテリウ
ム・ラクトフアーメンタムAJ 12074を再度、
形質転換した。 生じたクロラムフエニコール耐性コロニーの
うちそれぞれ10個を釣り上げヒスチジン要求性
をテストしたところ、これらのいずれも要求性
が消失しており、上記組換えプラスミド上に
HP遺伝子が存在することが明らかとなつた。 (7) 形質転換株のヒスチジン生産能 上に示したプロトプラスト形質転換法を用い
て、ヒスチジン生産能を有し、１，２，４−ト
リアゾール−３−アラニン耐性突然変異株ブレ
ビバクテリウム・ラクトフアーメータム
AJ12076にpAJ715を導入した。形質転換株を
クロラムフエニコール耐性で選択し、得られた
AJ12077（FERM−P7236）及び上記のAJ12075
をヒスチジン生産培地（グルコース10ｇ／dl，
（NH4）2SO45ｇ／dl、KH2PO40.1ｇ／dl、
MgSO4・7H2O0.2ｇ／dl、FeSO4・7H2O10
mg／、MnSO4・7H2O10mg／、チアミン・
HCl50μｇ／、ビオチン50μｇ／、大豆蛋白
酸加水分解液（「味液」）128mg／dl（全窒素と
して）、PH7.2，CaCO35ｇ／dl）20mlに植菌し、
30℃72時間振盪培養した。培養後、遠心上清上
のＬ−ヒスチジンをマイクロバイオアツセイ法
により定量した。結果を第１表に示した。 第１表 菌株 Ｌ−ヒスチジン蓄積量 AJ12076 50mg／dl AJ12077 130mg／dl AJ12074 ０mg／dl AJ12075 ３mg／dl ブレビバクテリウム・ラクトフアーメンタム
AJ12074は、ブレビバクテリウム・ラクトフアー
メンタムATCC13869を2000μｇ／mlのＮ−メチ
ル−N′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンに０
℃にて20分間接触せしめて変異処理し、His欠培
地で生育しえずHis欠培地にＬ−ヒスチジノール
10mg／dlを加えた培地で生育しうる菌株として分
離したものである。ブレビバクテリウム・ラクト
フアーメンタムAJ12076は、ブレビバクテリウ
ム・ラクトフアーメンタムATCC13869を1000μ
ｇ／mlのＮ−メチル−N′−ニトロ−Ｎ−ニトロ
ソグアニジンに０℃にて20分間接触せしめて変異
処理し、最小培地（グルコース２ｇ／dl、硫安１
ｇ／dl、尿素0.25ｇ／dl、KH2PO40.1ｇ／dl、
MgSO4.7H2O0.04ｇ／dl、サイアミン塩酸塩200μ
ｇ／、ビオチン50μｇ／、寒天1.5ｇ／dlを含
み、PH7.0に調整したもの）にDL−１，２，４−
トリアゾール−３−アラニン１mg／mlを加えた培
地で生育しうる菌株として分離したものである。 AJ12075及びAJ12076は、それぞれAJ12075又
はAJ12077より宿主細胞を損うことなく宿主細胞
中の複合プラスミドを除去することにより容易に
得られる。即ち、プラスミドは宿主より自然に失
なわれることもあるし、「除去」操作によつて除
くこともできる（Bact.Rev.，36，p361−405
（1972））。除去操作の一例は以下の通りである：
宿主の生育を不完全に阻害する濃度（２−50μ
ｇ／ml）のアクリジンオレンジを含む培地に、１
ml当り約104細胞程度をなる様に少量の菌株を接
種し宿主菌の生育を不完全に阻害してから27−37
℃で一夜培養する（J.Bacteriol.，88，261
（1964））。培養液を寒天培地に塗布し、27−37℃
で一夜培養する。 培地上に出現したコロニーのうち、クロラムフ
エンコール（10μｇ／ml）に感受性を示す株プラ
スミドが除去されている株で即ち、AJ12074及び
AJ12076である。
コリネ型細菌には上記のようなグルタミン酸生
産性を有するもののほかに、グルタミン酸生産性
を失つた変異株及び他の変異株も含まれる。 HP遺伝子を分離する方法は、コリネ型細菌の
HP遺伝子を有している株より、まず染色体遺伝
子を抽出し（例えばH.Saito and K.Miura，
Biocham Biophys Acta72619（1963）の方法が
使用できる）、これを適当な制限酸素で切断する。
ついでリネ型細菌で増殖し得るプラズミドベクタ
ーに接続し、得られた組換えDNAを用いてコリ
ネ型細菌のHP欠損変異株を形質転換せしめ、
PH生成活性を保有するにいたつた菌株を分離
し、それよりHP遺伝子を分離できる。 染色体遺伝子を切断するには、切断反応時間等
を調節して、切断の程度を調節すれば、巾広い種
類の制限酸素が使用できる。 本発明にて使用されるプラスミドベクターは、
コリネ型細菌細胞内において増殖し得るものであ
ればどのようなものでも良い。具体的に例示すれ
ば以下のものがある。 (1) pAM330 特開昭58−67699参照 (2) pAM1519 特開昭58−77895参照 (3) pAJ655 (a) 宿主菌：エシエリヒア・コリAJ11882
（FERM−P6517＝FERM−BP136など） (b) 分子量：6.6メガダルトン (c) 制限酸素切断地図：第１図参照 (d) 性質：pAM330とpBR325（Gene４121
（1978）の複合プラスミド。クロラムフエニ
コール耐性に与る。 (4) pAJ611 (a) 宿主菌：エシエリヒア・コリAJ11884
（FERM−P6519＝FERM−BP138など） (b) 分子量：6.6メガダルトン (c) 制限酸素切断地図：第２図参照 (d) 性質：pAM281とpBR325の複合プラスミ
ド。クロラムフエニコール耐性に与る。 (5) pAJ440 (a) 宿主菌：バチルスズブチリスAJ11901
（FERM−BP140＝ATCC39139など） (b) 分子量：6.0メガダルトン (c) 制限酸素切断地図：第４図参照 (d) 性質：pAM330とpUB110（J.Bacteriol.，
134318（1978））複合プラスミド。カナマイシ
ン耐性に与る。 (6) pAJ1844 (a) 宿主菌：エシエリヒア・コリAJ11883
（FERM−P6518＝FERM−BP137など） (b) 分子量：5.4メガダルトン (c) 制限酸素切断地図：第３図参照 (d) 性質：pHM1519とpBR325の複合プラス
ミド。クロラムフエニコール耐性に与る。 (7) pAJ3148 (a) 宿主菌：コリネバクテリウム・グルタミカ
ムSR8203、ATCC39137など (b) 分子量：6.6メガダルトン (c) 制限酸素切断地図：第５図参照 (d) 性質：pHM1519とpUB110との複合プラ
スミド。カナマイシン耐性に与る。 コリネ型細菌細胞内で増殖可能なプラスミドの
その他の例としてはpCG1（特開昭57−134500）、
pCG2（特開昭58−35197）、pCG4，pCG11（特開昭
57−183799）があり、これらはいずれも当然使用
可能であろう。 ベクターDNAは、染色体遺伝子を切断した際
に用いられた制限酸素により切断され、または染
色体DNA切断フラグメント及び切断されたベク
ターDNAのそれぞれの両端に相補的な塩基配列
を有するオリゴヌクレオチドを接続せしめて、つ
いでプラスミドベクターと染色体DNAフラグメ
ントとのライゲーシヨン反応に付される。 このようにして得られた、染色体DNAとベク
タープラスミドとの組換えDNAをコリネ型細菌
に属する受容菌へ導入するには、エシエリヒア・
コリＫ−12について報告されている様な
（Mandel，M.and Higa，A.，J.Mol.Biol.，53
159（1970））受容細菌胞を塩化カルシウムで処理
してDNAの透過性を増す方法、またバチルス・
スブチリスについて報告されている様に
（Duncan，C.H.，Wilson，G.A.and Yaung，F.
E.，Gene，１，153（1977））細胞がDNAを取り
込み得る様になる増殖段階（いわゆるコンビテン
トセル）に導入する方法により可能である。ある
いは、バチルス・ズブチリス、放線菌類および酵
母について知られている様に（Chang，S.and
Choen，S.N.，Molec.Gen.Genet.，168，111
（1979）；Bibb，M.J.，Ward，J.M.and
Hopwood，O.A，Nature，274，398（1978）；
Hinnen，A.，Hicks，J.B.and Fink，G.R.，
Proc.Natl.Acad.Sci.USA，751929（1978））、
DNA受容菌を、プラスミドDNAを容易に取り込
むプロトプラストまたはスフエロプラストにして
プロスミドをDNA受容菌に導入することも可能
である。 プロトプラスト法では上記のバチルス・ズブチ
リスにおいて使用されている方法でも充分高い頻
度を得ることができるし、特開昭57−183799に記
載されたコリネバクテリウム属またはブレビバク
テリウム属のプロトプラストにポリエチレングリ
コールまたはポリビニルアルコールと二価金属イ
オンとの存在下にDNAをとり込ませる方法も当
然利用できる。ポリエチレングリコールまたはポ
リビニルアルコールのかわりに、カルボキシメチ
ルセルロース、デキストラン、フイコール、プル
ロニツクF68（セルバ社）などの添加によつて
DNAのとり込みを促進させる方法でも同等の結
果が得られる。 形質転換の後、HP生産性を獲得し、または、
さらにプラスミドベクターが有しているマーカー
としての性質を発現する菌株を所望の形質転換株
として分離する。このような形質転換株は、HP
遺伝子が組み込まれている組換えDNAを有して
いる。組換えDNAを単離する方法は、例えば菌
株をリゾチームSDS処理により溶菌させ、フエノ
ール処理ののち、２容のエタノールを加えて
DNAを沈澱回収する。 得られたＬ−ヒスチジン生産菌を培養する方法
は、従来のＬ−ビスチジン生産菌の培養方法と特
に変らない。即ち、培地としては、炭素源、窒素
源、無機イオン、更に必要に応じアミノ酸、ビタ
ミン等の有機微量栄養素を含有する通常のもので
ある。炭素源としては、グルコース、シユクロー
ス、ラクトース等及びこれらを含有する澱粉加水
分解液、ホエイ、糖密等が用いられる。窒素源と
しては、アンモニアガス、アンモニア水、アンモ
ニウム塩その他が使用できる。 培養は好気的条件下で培地のPH及び温度を適宜
調節しつつ、実質的にＬ−ヒスチジンの生産蓄積
が停止するまで行なわれる。 かくして培養中には著量のＬ−ヒスチジンが生
成蓄積される。培養液よりＬ−ヒスチジンを採取
するには、通常の方法が適用できる。 実施例 (1) HP遺伝子を含む染色体DNAの調整 ブレビバクテリウム・ラクトフアーメンタム
ATCC13869より変異誘導されたストレプトマ
イシン耐性変異株AJ12036を１のCMG培地
（ペプトン１ｇ／dl、酵母エキス１ｇ／dl、グ
ルコース0.5ｇ／dl、及びNaCl0.5ｇ／dlを含
み、PH7.2に調整したもの）に植菌し、30℃で
約３時間振盪培養を行ない、対数増殖期の菌体
を集めた。この菌体をリゾチーム・SDSで溶菌
させたのち、通常のフエノール処理法により、
染色体DNAを抽出精製し、最終的に3.2mgの
DNAを得た。 (2) ベクターDNAの調製 ベクターとしてpAJ1844（分子量5.4メガダル
トン）を用い、そのDNAを次の様にして調製
した。 まずpAJ1844をプラスミドとして保有するブ
レビバクテリウム・ラクトフアームンタム
AJ12037（FERM Ｐ−7234，FERM BP−577）
を100mlのCMG培地に接種し、30℃で対数増殖
期後期まで培養したのち、リゾチームSDS処理
により溶菌させ、30000×ｇ30分の超遠心によ
り上清を得た。フエノール処理ののち、２容の
エタノールを加えてDNAを沈澱回収した。こ
れを少量のTEN緩衝液（20ｍＭトリス塩酸塩、
20ｍＭ NaCl、１ｍＭ EDTA（PH8.0）に溶
解後、アガロースゲル電気泳動にかけ分離後、
切り出してpAJ1844プラスミドDNA約15μｇを
得た。 (3) 染色体DNA断片のベクターへの挿入 (1)で得た染色体DNA20μｇと(2)で得たプラ
スミドDNA10μｇとを制限エンドヌケレアー
ゼPstIでそれぞれを37℃、１時間処理し、完全
に切断した。65℃、10分の熱処理後、両反応液
を混合し、ATP及びジチオスレイトール存在
下、T4フアージ由来のDNAリガーゼによつて
10℃、24時間DNA鎖の連結反応を行つた。65
℃、５分の熱処理後、反応後に２倍容のエタノ
ールを加えて連結反応終了後のDNAを沈澱採
取した。 (4) HP遺伝子のクローニング HP遺伝子が欠損したブレビバクテリウム・
ラクトフアーメンタムAJ12074を受容菌として
用いた。 形質転換の方法としては、プロトプラストト
ランスフオーメーシヨン法を用いた。まず、菌
株を５mlのCMG液体倍地で対数増殖期の初期
まで培養し、ペニシリンＧを0.6ユニツト／ml
添加後、さらに1.5時間振盪培養し、遠心分離
により菌体を集め、菌体を0.5Mシユークロー
ス、20ｍＭマレイン酸、20ｍＭ塩化マグネシウ
ム、3.5％ペナツセイブロス（Difco）からなる
SMMP培地（PH6.5）0.5mlで洗浄した。次いで
10mg／mlのリゾチームを含むSMMP培地に懸
濁し30℃で20時間プロトプラスト化を図つた。
6000×ｇ、10分間遠心分離後、プロトプラスト
をSMMPで洗浄し0.5mlのSMMPに再度懸濁し
た。この様にして得られたプロトプラストと(3)
で調製したDNA10μｇを５ｍMEDTA存在下
で混合し、ポリエチレングリコールを最終濃度
が30％になる様に添加した後、DNAをプロト
プラストに取り込ませる為に室温に２分間放置
した。このプロトプラストをSMMP培地１ml
で洗浄後、SMMP培地１mlに再懸濁し、形質
発現の為、30℃で２時間培養した。この培養液
をPH7.0のプロトプラスト再生培地上に塗布し
た。プロトプラスト再生培地は蒸留水１あた
りトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン12
ｇ、KCl0.5ｇ、グルコース10ｇ、MgCl2・
6H2O8.1ｇCaCal2・2H2O2.2ｇ、ペプトン４
ｇ、粉末酵母エキス４ｇ、カザミノ酸（Difco
社）１ｇ、K2HPO40.2ｇ、コハク酸ナトリウ
ム135ｇ、寒天８ｇ及びクロラムフエニコール
3μｇ／mlを含む。 30℃で２週間培養後、約10000個のクロラム
フエニコール耐性コロニーが出現してきたので
これをヒスチジンを含まない培地（His欠培
地：２％グルコース、１％硫酸アンモニウム、
0.25％尿素、0.1％りん酸二水素カリウム、0.04
％硫酸マグネシウム７水塩、2ppm鉄イオン、
2ppmマンガンイオン、200μｇ／サイアミン
塩酸塩、50μｇ／ビオチン、PH7.0、寒天1.8
％）にレプリカし、クロラムフエニコール耐性
でかつヒスチジン要求性の消失した９株を得
た。 (5) 形質転換株のプラスミド解析 これらの株より(2)で述べた方法により、溶菌
液を調製し、アガロースゲル電気泳動法によ
り、プラスミドDNAを検出したところ、２株
でベクターのpAJ1844よりも明らかに大きなプ
ラスミドが検出された。これらのうちの代表株
をAJ12075（FERM−P7235）と名付けた。 (6) 再トランスホーメーシヨン AJ12075が有するプラスミド（pAJ715）上
にHP遺伝子が存在することを確認するため、
このプラスミドDNAを用いブレビバクテリウ
ム・ラクトフアーメンタムAJ 12074を再度、
形質転換した。 生じたクロラムフエニコール耐性コロニーの
うちそれぞれ10個を釣り上げヒスチジン要求性
をテストしたところ、これらのいずれも要求性
が消失しており、上記組換えプラスミド上に
HP遺伝子が存在することが明らかとなつた。 (7) 形質転換株のヒスチジン生産能 上に示したプロトプラスト形質転換法を用い
て、ヒスチジン生産能を有し、１，２，４−ト
リアゾール−３−アラニン耐性突然変異株ブレ
ビバクテリウム・ラクトフアーメータム
AJ12076にpAJ715を導入した。形質転換株を
クロラムフエニコール耐性で選択し、得られた
AJ12077（FERM−P7236）及び上記のAJ12075
をヒスチジン生産培地（グルコース10ｇ／dl，
（NH4）2SO45ｇ／dl、KH2PO40.1ｇ／dl、
MgSO4・7H2O0.2ｇ／dl、FeSO4・7H2O10
mg／、MnSO4・7H2O10mg／、チアミン・
HCl50μｇ／、ビオチン50μｇ／、大豆蛋白
酸加水分解液（「味液」）128mg／dl（全窒素と
して）、PH7.2，CaCO35ｇ／dl）20mlに植菌し、
30℃72時間振盪培養した。培養後、遠心上清上
のＬ−ヒスチジンをマイクロバイオアツセイ法
により定量した。結果を第１表に示した。 第１表 菌株 Ｌ−ヒスチジン蓄積量 AJ12076 50mg／dl AJ12077 130mg／dl AJ12074 ０mg／dl AJ12075 ３mg／dl ブレビバクテリウム・ラクトフアーメンタム
AJ12074は、ブレビバクテリウム・ラクトフアー
メンタムATCC13869を2000μｇ／mlのＮ−メチ
ル−N′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンに０
℃にて20分間接触せしめて変異処理し、His欠培
地で生育しえずHis欠培地にＬ−ヒスチジノール
10mg／dlを加えた培地で生育しうる菌株として分
離したものである。ブレビバクテリウム・ラクト
フアーメンタムAJ12076は、ブレビバクテリウ
ム・ラクトフアーメンタムATCC13869を1000μ
ｇ／mlのＮ−メチル−N′−ニトロ−Ｎ−ニトロ
ソグアニジンに０℃にて20分間接触せしめて変異
処理し、最小培地（グルコース２ｇ／dl、硫安１
ｇ／dl、尿素0.25ｇ／dl、KH2PO40.1ｇ／dl、
MgSO4.7H2O0.04ｇ／dl、サイアミン塩酸塩200μ
ｇ／、ビオチン50μｇ／、寒天1.5ｇ／dlを含
み、PH7.0に調整したもの）にDL−１，２，４−
トリアゾール−３−アラニン１mg／mlを加えた培
地で生育しうる菌株として分離したものである。 AJ12075及びAJ12076は、それぞれAJ12075又
はAJ12077より宿主細胞を損うことなく宿主細胞
中の複合プラスミドを除去することにより容易に
得られる。即ち、プラスミドは宿主より自然に失
なわれることもあるし、「除去」操作によつて除
くこともできる（Bact.Rev.，36，p361−405
（1972））。除去操作の一例は以下の通りである：
宿主の生育を不完全に阻害する濃度（２−50μ
ｇ／ml）のアクリジンオレンジを含む培地に、１
ml当り約104細胞程度をなる様に少量の菌株を接
種し宿主菌の生育を不完全に阻害してから27−37
℃で一夜培養する（J.Bacteriol.，88，261
（1964））。培養液を寒天培地に塗布し、27−37℃
で一夜培養する。 培地上に出現したコロニーのうち、クロラムフ
エンコール（10μｇ／ml）に感受性を示す株プラ
スミドが除去されている株で即ち、AJ12074及び
AJ12076である。
第１図：複合プラスミドpAJ655の制限酵素切
断地図、第２図：複合プラスミドpAJ611の制限
酵素切断地図、第３図：複合プラスミドpAJ1844
の制限酵素切断地図、第４図：複合プラスミド
pAJ440の制限酵素切断地図、第５図：複合プラ
スミドpAJ3148の制限酵素切断地図。
断地図、第２図：複合プラスミドpAJ611の制限
酵素切断地図、第３図：複合プラスミドpAJ1844
の制限酵素切断地図、第４図：複合プラスミド
pAJ440の制限酵素切断地図、第５図：複合プラ
スミドpAJ3148の制限酵素切断地図。
Claims (1)
- １ コリネホルム・グルタミン酸生産菌に属する
DNA供与菌より得られ、ヒスチジノールホスフ
アターゼをコードする遺伝子を含むDNA断片が、
コリネホルム・グルタミン酸生産菌の菌体内で自
律複製できるベクタープラスミドに接続されて、
コリネホルム・グルタミン酸生産菌に属し１，
２，４−トリアゾール−３−アラニンに耐性を示
すDNA受容菌に導入されて得られるＬ−ヒスチ
ジン生産能を有する微生物を培養し、培養液中に
蓄積されたＬ−ヒスチジンを採取することを特徴
とするＬ−ヒスチジンの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17000683A JPS6062983A (ja) | 1983-09-14 | 1983-09-14 | 発酵法によるｌ―ヒスチジンの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17000683A JPS6062983A (ja) | 1983-09-14 | 1983-09-14 | 発酵法によるｌ―ヒスチジンの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6062983A JPS6062983A (ja) | 1985-04-11 |
| JPH0526467B2 true JPH0526467B2 (ja) | 1993-04-16 |
Family
ID=15896837
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP17000683A Granted JPS6062983A (ja) | 1983-09-14 | 1983-09-14 | 発酵法によるｌ―ヒスチジンの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6062983A (ja) |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS58126789A (ja) * | 1981-12-29 | 1983-07-28 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | レースレオニンの製造法 |
-
1983
- 1983-09-14 JP JP17000683A patent/JPS6062983A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6062983A (ja) | 1985-04-11 |
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