JPH05184393A - １，５−アンヒドログルシトールの定量法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】体液中の１，５−アンヒドログルシトールの濃
度を簡便に定量する方法の開発 【構成】髄液、血漿、血清又は尿を、１，５−アンヒド
ログルシトール濃度を測定しやすいように処理し、その
処理液に、電子受容体の存在下、１，５−アンヒドログ
ルシトールに対し脱水素による酸化能を有する酵素を作
用させ、試料中の酸素の消費量を測定するか、又は生成
する過酸化水素もしくは電子受容体の還元体を定量する
ことを特徴とする１，５−アンヒドログルシトールの定
量法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明の糖尿病の診断マーカーと
して期待される１，５−アンヒドログルシトール（以下
「１，５−ＡＧ」という）の定量方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】１，５−ＡＧはヒト髄液及び血漿中に存
在しある種の疾患、特に糖尿病において血漿中の量が低
下することが報告されている化合物である。この１，５
−ＡＧを酸化する酵素の存在は知られておらず、従来、
１，５−ＡＧの測定は主にガスクロマトグラフィーによ
りおこなわれていた。

【０００３】

【発明が解決すべき課題】しかし、従来の方法で試料の
前処理及び分析機器の維持、管理に高度の技術を必要と
し、簡便な１，５−ＡＧの測定法が要望されていた。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは１，５−Ａ
Ｇの簡便な測定法を鋭意研究した結果、ピクノポラス
（Pycnoporus) 属又はコリオラス（Coriolus) 属に属す
る微生物及び土壌より分離したシュードモナス（Pseudo
monas)属のある種の菌株より得た酵素が１，５−ＡＧに
作用し、１，５−ＡＧが下記式（１）

【０００５】

【化１】

【０００６】で表わされる化合物に酸化され、又この化
合物は水中で容易に下記式（２）

【０００７】

【化２】

【０００８】で表わされる化合物になることを見い出し
た。本発明は上記知見に基づいて完成されたものであ
る。即ち本発明は前記酵素が次の反応（ａ）を行うこと
に基づいている。

【０００９】

【化３】

【００１０】本反応は脱水素による酸化反応であり反応
液中の酵素濃度の変化を酸素電極その他により測定する
ことにより、又、脱水素による酸化反応により生成した
過酸化水素の量を、過酸化水素電極による方法、ペルオ
キシダーゼを用いる比色法その他の方法により測定する
ことにより、あるいは反応液中にフエリシアニドなどの
電子受容体を共存させその還元体の量を測定することに
より１，５−ＡＧの量を測定することが出来る。又本反
応で生成する式（１）の化合物はカルボニル基を有する
ため種々のカルボニル試薬例えば２，４−ジニトロフエ
ニルヒドラジンなどと反応してヒドラゾンを生成するの
でそのヒドラゾン量を測定することにより、１，５−Ａ
Ｇ量を測定することが出来る。さらに、本反応で生成す
る式（１）又はその水付加体である式（２）の化合物量
を測定することによっても１，５−ＡＧ量を測定するこ
とが出来る。

【００１１】従って本発明は髄液、血漿、血清又は尿を
１，５−ＡＧ濃度を測定しやすいように処理し、その処
理的に電子受容体の存在下、１，５−アンヒドログルシ
トールに対し脱水素による酸化能を有する酵素を作用さ
せ、試料中の酸素の消費量を測定するか、又は生成する
過酸化水素もしくは電子受容体の還元体を定量すること
を特徴とする１，５−アンヒドログルシトールの定量法
に関する。

【００１２】本発明で用いられる試料としては、１，５
−ＡＧの濃度を測定したいものであれば特に制限はな
く、例えば髄液、血漿、血清や尿及び１，５−ＡＧ濃度
を測定しやすいようにこれらの試料を処理した処理液な
どがあげられる。その処理法としては、例えば過塩素酸
水溶液処理や、ホウ酸型強塩基性樹脂処理などがあげら
れる。前者は試料中のタンパク質を消去する処理であ
り、後者は試料中のグルコースを消去する処理である。
本発明で用いられる電子受容体としては、１，５−ＡＧ
の脱水素による酸化反応に関与するものであれば、特に
制限なく、例えば、酸素、フエナジンメトサルフエー
ト、ジクロルフエノールインドフエノール、フエリシア
ン化カリウム、フエリシアン化ナトリウムなどのフエリ
シアン化化合物、チトクロムＣ、ＮＡＤ⁺ 、ＮＡＤ
Ｐ⁺ 、ＦＭＮなどの補酵素などがあげられる。

【００１３】本発明で用いられる、１，５−ＡＧを「式
（１）の化合物等」に脱水素により酸化する能力を有す
る酵素（以下「１，５−ＡＧ酸化酵素」という）は、そ
れを産生する微生物より得られる。そのような微生物と
しては、例えばシュードモナス（Pseudomonas) sp.ＮＫ
−85001 〔微工研条寄第1037号(FermBP-1037) 〕、ピク
ノポラス・コクシネウス（Pycnoporus coccineus) IFO4
923 、同 IFO6490や、コリオラス・コンソルス（Coriol
us consors)IFO9087などがあげられる。これらの微生物
のうち、シュードモナス属に属する微生物は本発明者ら
が昭和58年６月に埼玉県大宮市吉野町で採取した土壌中
より分離した新菌株でありその菌学的性質は下記のとお
りである。

【００１４】１．形態（肉汁寒天培地27℃、16時間培
養） （１）細胞の大きさ 0.7〜0.8 ×1.0 〜1.7 μｍ、桿状 （２）細胞の多形性 認められない （３）運動性 極毛を有し運動性有り （４）胞子の有無 認められない （５）グラム染色性 陰性 （６）抗酸性 陰性 ２．各種培地における生育状態 （１）肉汁寒天平培養：ユロニーは光沢のある不透明の
円形で辺縁は全縁で色は茶白を示す。 （２）肉汁寒天斜面位培養：培地の表面を拡散増殖し不
透明で光沢のある発育を示す。色は茶白 （３）肉汁液体培養：培養１日目で全体が濁り３日間で
試験管底部に菌体が沈澱する。菌膜が認められる。 （４）肉汁ゼラチン穿刺培養：20℃で培養で表面にのみ
生育を認め20日間の培養でゼラチンの液化を認めず。 （５）リトマスミルク：変化を認めず。

【００１５】３．生理的性質（27℃培養） （１）硝酸塩の還元 陽性 （２）脱窒反応 陽性 （３）ＭＲテスト 陰性 （４）ＶＰテスト 陰性 （５）インドールの生成 陰性 （６）硫化水素の生成 陰性 （７）デンプンの加水分解 陰性 （８）クエン酸の利用 クリステンセン及びシモンの培
地でクエン酸を利用するがコーザーの培地では利用しな
い （９）無機窒素源の利用 アンモニア利用するが硝酸塩
を利用しない。 （10) 色素の生成 陰性 （11) ウレアーゼ 陽性 (12) オキシターゼ 陽性 (13) カタラーゼ 陽性 (14) 生育の範囲 10〜37℃ pH7−8.5 (15) 酸素に対する態度 好気性

【００１６】(16) Ｏ−Ｆテスト 酸化性 (17) 炭水化物の利用 グルコース、グリセリン、コハ
ク酸ナトリウム、クエン酸ナトリウムを利用し酢酸ナト
リウムパラヒドロキシ安息香酸を利用しなかった。 (18) 糖類からの酸及びガスの生成 酸の生成 ガスの生成 Ｌ−アラビノース ＋ − Ｄ−キシロース ＋ − Ｃ−グルコース ＋ − Ｄ−フラクトース ＋ − Ｄ−ガラクトース ＋ − グリセリン ＋ − ラムノース ＋ − Ｄ−マンノース − − 麦芽糖 − − 庶 糖 − − 乳 糖 − − トレハロース − − Ｄ−ソルビット − − Ｄ−マンニット − − イノシット − − ラフイノース − − デンプン − −

【００１７】(19) 塩化ナトリウムの耐性 トリプトン10g 、蒸溜水１リットルpH7.0 の基礎培地へ
それぞれ２％、５％、７％濃度となるよう塩化ナトリウ
ムを加え菌液を接種後静置培養した。２％、５％の培地
では生育を認めたが７％の培地では生育を認めなかっ
た。 (20) フエニルピルビン酸試験 陰性 (21) チロシン溶解性試験 陰性 以上の性状をもとに本菌の分類学的性質を「バージー
ズ、マニュアル・オブ・デイターミネーテイブ・、バク
テリオロジー」第８版（1974年) の分類と対比すると22
0 頁シュードモナス属のシュードモナス・スタトゼリ
（Pseudomonas stu-tzeri)が近縁の種として挙げられ
る。しかし、本菌株はデンプンを加水分解せず、又麦芽
糖より酸を生成しないという性質を有しており、これら
の点でシュードモナス・スタトリゼリと異なっている。
以上の理由から本菌をシュードモナス・sp. ＮＫ−8500
1 と命名した。

【００１８】上記菌体を培養する培地としては１，５−
ＡＧ、無機窒素源、無機塩を含む培地が用いられるが生
成を促進する目的で有機栄養源を添加することができ
る。無機窒素源としては硫酸アンモニウム、塩化アンモ
ニウム等が、無機塩としてはナトリウム、カリウム、マ
グネシウム、カルシウム、鉄、亜鉛等の塩類が、有機栄
養源としてペプトン、カザミノ酸、肉エキス、コーンス
チープリカー、酵母エキス等が使用できる。培養は振盪
あるいは通気攪拌など好気的条件が良くpH６〜８、温度
25〜35℃で行われる。本発明で使用するシュードモナス
属由来の１，５−ＡＧ酸化酵素は次の方法により単離さ
れる。即ちこの酵素は菌体の膜画分に存在するので、ま
ず培養物から菌体を分離し適当な緩衝液中で菌体を破壊
してその処理液から膜画分を得る。

【００１９】菌体破壊の方法はダイノミル、フレンチプ
レス、超音波等の物理的方法や、トリトンＸ−100 、Ｅ
ＤＴＡ等の化学的方法、リゾチーム等の酵素的方法を単
独又は併用して用いることができる。膜画分は菌体破壊
液から異なる遠心力を複数回利用することにより細胞壁
成分、核酸、菌体内可溶性蛋白質等から分離したサスペ
ンジョンの状態で得ることができる。

【００２０】次いでトリトンＸ−100 （ポリオキシエチ
レンオクチルフエニルエーテル）、コール酸、デオキシ
コール酸等の膜成分可溶化剤などにより活性成分を抽出
し不溶分を遠心分離により除去して、１，５−ＡＧ酸化
酵素抽出液を得、この抽出液からポリエチレングリコー
ル分画や硫安分画などの酵素の精製に一般に使われてい
る方法を用いて、１，５−ＡＧ酸化酵素を単離すること
ができる。

【００２１】次にシユードモナス属由来の１，５−ＡＧ
酸化酵素の諸性質について述べる。 １ 作用 １，５−ＡＧを酸化し、上記式（１）の化合物を生成す
る。 ２ 基質特異性 １，５−ＡＧに特異的に作用する。 ３ 至適pH pH６〜7.5 ４ 至適温度 25〜41℃ ５ 安定pH 6.5 〜８

【００２２】又、本発明で使用するピクノポラス属及び
コリオラス属由来の１，５−ＡＧ酸化酵素は、次の方法
により単離される。即ち、この酵素は菌体の細胞質画分
に存在するので、まず培養物から菌体を分離し、適当な
緩衝液中で菌体を破壊して、その処理液から細胞質画分
を得る。菌体破壊の方法としては、前記のシュードモナ
ス属菌の場合と同様の操作により行うことができる。細
胞質画分は菌体破壊液を遠心することにより、沈澱物と
して膜画分及び細胞壁成分等から分離し得ることができ
る。

【００２３】次に、この遠心上澄液をポリエチレングリ
コール分画や硫安分画など一般に酵素の精製に使われて
いる方法を用いて、１，５−ＡＧ酸化酵素を単離するこ
とができる。さらに、高純度の酵素を必要とする場合
は、必要に応じて通常用いられているイオン交換クロマ
トグラフィー及びゲルろ過等のカラムクロマトグラフィ
ーにより精製することができる。次にピクノポラス属及
びコリオラス属に属する微生物から得られる１，５−Ａ
Ｇ酸化酵素の諸性質を示す。

【００２４】

【００２５】本発明では、単離した１，５−ＡＧ酸化酵
素のみならず、１，５−ＡＧ酸化酵素抽出液や膜画分の
サスペンジョンなどの菌体処理物も利用しうる。また、
これらを樹脂又は膜等の担体に固定化されたものも利用
しうる。次に１，５−ＡＧ酸化酵素又はそれを含む膜画
分サスペンジヨンあるいは１，５−ＡＧ酸化酵素抽出液
に１，５−ＡＧを添加して反応させ反応液中に生成する
物質について述べる。

【００２６】シュードモナス属に属する微生物の膜画分
サスペンジヨン（蛋白質濃度10mg/ml 、トリス・塩酸緩
衝液0.05Ｍ pH７）中へ１，５−ＡＧを２mg/ml 程度添
加し30℃、16時間振盪しながら反応すると１，５−ＡＧ
は消失し物質（Ａ）が生成蓄積する。これはＴＬＣ分析
により確認出来る。反応液をシリカゲルプレート上へス
ポットしisoPrOH-H₂O(95:5) の溶媒で展開後良く乾燥し
アニスアルデヒド硫酸試薬を噴霧して90〜100 ℃にて５
〜10分加熱すると物質（Ａ）はRf0.4 付近に青色スポッ
トとして観察出来る。反応終了液から超遠心により膜画
分を除き、上澄液を凍結真空乾燥して白色粉末を得る。
白色粉末を少量のエタノールに溶解し不溶物を除去した
ろ液へ２，４−ジニトロフエニルヒドラジン飽和エタノ
ール溶液と微量の濃塩酸を添加し熱湯中で加熱後冷却し
水を濁りの出るまで加え放置すると褐色沈澱が得られ
る。この沈澱をろ取しエタノール水から再結晶し必要な
場合はシリカゲルクロマトにより精製すると黄褐色針状
結晶が得られる。

【００２７】この結晶の物理化学的性状は次の通りであ
る。 １ 融点 192℃ ２ 分子量 342 （マススペクトル） ３ 分子式 C₁₂H₁₄N₄O₈ マススペクトルによる実測値 343（Ｍ＋Ｈ) ⁺ 計算値 342 、272 ４ ＵＶスペクトル max ・n m （E_1cm ^1% ） （メタノール中） 231（416.2)、255sh(313.5)、28
0sh(178.4)、364(659.4) ５ ＩＲスペクトル 赤外線スペクトルは試料をKBr による錠剤法を用いて測
定する。 3600〜3000cm^-1（ブロード）、1622、1584、1518、150
4、1415、1333、1273、1224、1137、1073、1050、102
8、993 、925 、878 、740

【００２８】６ ¹³CNMR化学シフト スペクトルはＤＭＳＯ−d₆溶媒中で測定する。化学シフ
トはテトラメチルシランを内部基準としてOppmとし、こ
れとの比較値、実験条件下で溶媒ＤＭＳＯ−d₆のシグナ
ルは40.40ppmに発現。マススペクトルのデーターと一致
して12個の炭素が観察された。 61.9(t)、71.2(t) 、73.6(d) 、78.4(d) 、82.3(d) 、1
16.2(d)、124.0(d)、130.1(s) 、130.8(d)、137.6(s)、
145.5(s)、153.2(s) ７ ¹HNMR スペクトル スペクトルはＤＭＳＯ−d₆中で測定。化学シフトはテト
ラメチルシランを内部基準としてOppmとしてこれとの比
較値。 3.69ppm(1H、dd) 、4.14〜4.15(2H 、ABq)、4.62〜4.65
(2H 、t 、d)、5.63〜5.65(1H 、d)、7.24(1H 、broa
d)、7.87-7.90(1H、d)、8.33〜8.37(1H 、dd) 、8.86〜
8.87(1H 、d)、4.62〜4.65（H 、t-ＯＨ）、5.63〜5.65
(1H 、d-ＯＨ）、7.24(1Ｈ、brＮＨ） これらの値から前記の黄色針状結晶は次の化学式（３）
を有すると推定され、

【００２９】

【化４】

【００３０】このことから物質（Ａ）の前記式（１）の
化学式を有するものと推定した。又、ピクノポラス属及
びコリオラス属に属する微生物から得られる酵素を用い
て前記シュードモナス属に属する微生物の膜画分サスペ
ンジョンの場合と同様に１，５−ＡＧを処理しても上記
式（３）の化合物が得られた。

【００３１】次に、生成物の構造を確認するため、式
（１）の化合物を化学的に合成したところ、式（１）の
化合物は、水存在下において容易に水和し、式（２）で
表わされる化合物になることを見い出した。この化学的
に合成した式（１）の化合物の水和物式（２）を、前記
１，５−ＡＧのシュードモナス属に属する微生物膜画分
サスペンジョン処理物に２，４−ジニトロフェニルヒド
ラジンを反応させた場合と同様の操作により反応させた
ところ、上記式（３）と全く同一の化合物が得られた。
このことにより、１，５−ＡＧ酸化酵素の生成物式
（１）の化合物は、水和物式（２）となって存在してい
るものと推定された。そこで、ガスクロマトグラフィー
により、１，５−ＡＧ酸化酵素の生成物と化学合成した
水和物式（２）の同定を行った。両化合物をトリメチル
シリル（ＴＭＳ）化しカラムにより分析したことろ、両
者は全く同一の保持時間に検出された。また、ガスクロ
マトグラフィー・マススペクトロメトリ−（ＧＣ−Ｍ
Ｓ）により、ピーク化合物のフラグメントパターンを分
析したところ、全く同一のパターンであった。以上のこ
とから上記の推定は正しいものと考えられた。従って本
発明で用いられる酵素あるいは膜画分サスペンジョンは
下の反応を触媒していると考えられる。

【００３２】

【化５】

【００３３】又、本発明における反応は前記（ａ）の反
応式で示される反応をおこなうと考えられる。なお、化
学的に合成した水和物式（２）の物理化学的性状は次の
通りである。 １ 熱分析（窒素気流中） ・脱水温度 86℃（水１分子の重量減少有り） ・融 点 63〜74℃ ２ 分子量 180 （マススペクトル） ３ 分子式 C₆H₁₂O₆ マススペクトルによる実測値 ４ IRスペクトル ν_KBr ^cm-1：3400、2950、2875、1090、1040、840 ５ ¹³C-NMR(100MHz) δ_ppm ^D20 ：93.45(s)、81.47(d)、77.75(d)、72.56
(t)、69.85(d)、62.03(t) ６ ¹H-NMR(400MHz) δ_ppm ^D20 ：3.89(1H 、dd) 、3.75(1H 、d)、3.67(1H
、dd) 、3.56(1H 、d)、3.45(1H、d)、3.44(1H 、t)、
3.40(1H 、m) ７ 結晶形 無定形白色粉末 式（１）及び式（２）の化合物は新規化合物であり、又
１，５−ＡＧが脱水素され式（１）の化合物を与える反
応も新規反応である。

【００３４】本発明の１，５−ＡＧの測定法は上の反応
に基づいており、反応過程あるいは反応生成物を利用し
て各種の測定法が可能であり次にその内容を説明する。 （１）酸素消費に基づく方法 密閉型反応容器に0.05Ｍトリス−塩酸緩衝液・（pH7)１
ml、30 m Ｍフエナジンメトサルフエート20μl 、１，
５−ＡＧ酸化酵素又は膜画分スペンジョンあるいは１，
５−ＡＧ酸化酵素抽出液0.3 mlを加え酸素電極を挿入し
反応容器内を34℃で攪拌しながらこれに１，５−ＡＧ溶
液50μl を加えて反応を開始し経時的に酸素の消費量を
オキシゲンモニター測定する。既知濃度の１，５−ＡＧ
溶液で検量線を作成しておき試料の酸素消費量から１，
５−ＡＧの濃度を算出する。

【００３５】（２）電子受容体の着色度変化を利用する
方法 トリスー塩酸緩衝液（0.05ＭpH7)0.7 ml、0.1 Ｍフエリ
シアン化カリウム溶液0.1ml 、シュードモナス属に属す
る微生物より得られる１，５−ＡＧ酸化酵素又はその抽
出液 0.1ml及び１，５−ＡＧ溶液0.1ml を容器に入れ34
℃で10分間反応させた後、硫酸第二鉄−デュバノール試
薬（硫酸第二鉄５ｇ、ラウリル硫酸ナトリウム３ｇ、85
％リン酸95ml、蒸溜水900ml)0.5ml 、蒸溜水3.5ml を加
え10分間放置して660nm における吸光度を測定する。既
知濃度の１，５−ＡＧ溶液で検量線を作成しておき試料
の吸光度より１，５−ＡＧの濃度を算出する。電子受容
体としては上記のフエリシアン化カリウムやフエリシア
ン化ナトリウム、フエリシアン化アンモニウムなどのフ
エリシアニドの他ジクロルフエノールインドフエノール
などが利用出来る。

【００３６】（３）H₂O₂を検出する方法 リン酸ナトリウム緩衝液（１／15Ｍ、pH5.6)0.3ml 、４
m Ｍ、２，２′−アジノジ〔３−エチルベンツチアゾリ
ンスルホネイト（６）〕（ＡＢＴＳ）と12u/mlのホース
ラデイッシュペルオキシダーゼを含む発色液0.5ml 、
１，５−ＡＧ酸化酵素又はその抽出液0.1ml 及び１，５
−ＡＧ溶液0.1ml を容器に入れ、37℃で30分間反応させ
た後、氷冷下に反応を止め、405nm における吸光度を測
定する。既知濃度の１，５−ＡＧ溶液で検量線を作成し
ておき、試料の吸光度より１，５−ＡＧの濃度を算出す
る。ホースラディッシュペルオキシダーゼの基質として
は、ＡＢＴＳの外、５−アミノサリチル酸、４−アミノ
アンチピリンとフェノール、ｏ−トルイジン等の発色基
質や、ｐ−ヒドロキシ酢酸、ｐ−ヒドロキシプロピオン
酸等のケイ光基質が利用できる。また、１，５−ＡＧの
酸化反応により生成したH₂O₂の検出法としては、この他
に、H₂O₂電極を用いて直接測定する方法や、ルミノール
化合物、ルシゲニン、アリルシュウ酸エステル類のH₂O₂
酸化による化学発光を利用する方法なども利用し得る。

【００３７】（４）式（１）又は式（２）の化合物を分
析する方法 １，５−ＡＧ溶液にシュードモナス菌由来の膜画分サス
ペンジョンを加え30℃、16時間反応する。反応終了後超
遠心により膜画分を除き、上澄液を凍結真空乾燥して白
色粉末を得る。この粉末をカルボニル基のラベル化剤又
は水酸基の保護剤で処理することにより、分析すること
ができる。たとえばカルボニル基のラベル化剤として
２，４−ジニトロフェニルヒドラジンを用いる場合に
は、凍結乾燥した粉末を少量のエタノールに溶解し、不
溶物を除去したろ液へ２，４−ジニトロフェニルヒドラ
ジン飽和エタノール溶液と微量の濃塩酸を添加し熱湯中
で加熱反応させる。この生成物を逆相系のＨＰＬＣ（液
体クロマドグラフィー）により分析することにより、生
成物式（１）を検出することができる。また、水酸基の
保護剤としてトリメチルシリルクロライド（ＴＭＳ）を
用いる場合には、凍結乾燥した粉末を少量のピリジンに
溶解後、ＴＭＳを添加し、室温下に攪拌することによ
り、生成物式（２）の全ての水酸基を保護した化合物に
することかができる。この溶液の一部を、ガスクロマト
グラフィーで分析すれば式（２）の化合物を検出するこ
とができる。

【００３８】

【発明の効果】次に本発明の効果について説明する。 実験例１ （基質特異性）後記参考例１で得られる１，５−ＡＧ酸
化酵素抽出液を用い前記フエリシアニド法のうち基質を
糖及び糖アルコールに置きかえて反応させ基質特異性を
調べた結果、シュードモナス属に属する微生物の産生す
る１，５−ＡＧ酸化酵素は表２に示される如く１，５−
ＡＧに対し高い特異性を示す。

【００３９】

【００４０】実験例２ （反応至適ｐＨ、温度条件）後記参考例１で得られる抽
出液を用いて、シュードモナス属に属する微生物の産生
する１，５−ＡＧ酸化酵素の１，５−ＡＧ変換反応にお
ける至適pH及び至適温度を調べ図１及び図２に示される
結果を得る。これらの図より至適pHはpH６〜pH7.5 至適
温度は25〜41℃程度である。又pH安定性を調べる為異っ
たpH値を有するリン酸バツファー（pH６〜７）トリスー
塩酸バッファー（pH7.2 〜９）中へ抽出液を加え４℃で
一日保存した後変換活性を調べたところpH6.5 〜８の範
囲で安定であった。

【００４１】実験例３ （１，５−ＡＧの測定） （１）損素電極法の検量線 後記参考例１で得た抽出液（蛋白質濃度５mg/ml)を用い
た。酸素濃度計（米国ギルソル社製オキシグラフ）の反
応容器中へ次の反応液を加え攪拌しつつ34℃とした。 トリスー塩酸緩衝液（0.05Ｍ pH７） １ml 可溶化液（蛋白量５mg/ml) 0.3ml 30m Ｍフエナジメトサルフェート 20μl 反応器に栓をして密閉した後マイクロシリンジを用いて
既知濃度の１，５−ＡＧ溶液50μl を反応器中へ注入し
て酸素消費速度を記録した。その結果図３に示す如く
１，５−ＡＧ濃度と酸素消費速度の間に比例関係が認め
られた。 （２）フェリシアニドを電子受容体として用いる方法の
検量線 後記参考例１で得た抽出液（蛋白質５mg/ml)を用いる。
次の組成の反応液を試験管中で34℃10分間反応させる。 トリスー塩酸緩衝液（0.05Ｍ pH８） 0.7ml フェリシアン化カリウム溶液（0.1 Ｍ） 0.1ml 抽出液 0.1ml １，５−ＡＧ溶液 0.1ml （ブランクには蒸溜水を使用） 反応後硫酸第二鉄−デエバノール試薬0.5ml 及び蒸溜水
3.5ml を加えて反応を停止させる。10分間放置すると緑
色に呈色するので660nm で吸光度を測定する。既知濃度
の１，５−ＡＧ溶液につき試験すると１，５−ＡＧ濃度
と660nm における吸光度の間には図４に示す如く比例関
係が認められた。

【００４２】（３）ジクロルフェノールインドフェノー
ル （ＤＣＩＰ）を電子受容体として用いる方法の検量線後
記参考例１で用いた抽出液（蛋白質５mg/ml)を用いる。
次の組成の反応液を分光光度計のセル中へ入れ34℃に保
つ トリスー塩酸緩衝液（0.05Ｍ pH８） 1.8ml １m ＭＤＣＩＰ 0.3ml 10m ＭＫＣＮ 0.3ml 抽出液 0.3ml 34℃に保温した１，５−ＡＧ溶液をセル中に添加し攪拌
して600nm における吸光度を経時的に記録する。既知濃
度の１，５−ＡＧにつき試験すると１，５−ＡＧ濃度と
600nm における吸光度変化速度、即ちＤＣＩＰの還元速
度には図５に示す如く比例関係が認められた。 （４）H₂O₂を発色により検出する方法の検量線 後記参考例６で得た酵素（3.2u/ml)を用いる。次の組成
の反応液を試験管中で37℃２時間反応させる。 ・リン酸ナトリウム緩衝液（1/15Ｍ、pH5.6) 0.3ml ・発色試験 0.5ml ４m Ｍ ＡＢＴＳ 12u/ml ペルオキダーゼ を含む上記リン酸緩衝液 ・酵素 0.1ml ・１，５−ＡＧ溶液（ブランクには蒸溜水を使用）
0.1ml 反応後、氷冷して反応を止め、405nm における吸光度を
測定する。既知濃度の１，５−ＡＧ溶液につき試験する
と、１，５−ＡＧ濃度と405nm における吸光度の間に
は，図６に示す如く比例関係が認められた。

【００４３】（５）H₂O₂をケイ光により検出する方法の
検量線 後記参考例６で得た酵素（1.5u/ml)を用いる。次の組成
の反応液を試験管中で37℃２時間反応させる。 ・ケイ光試薬 0.2ml 0.1％ ｐ−ヒドロキシフエニルプロピオン酸 4u/ml ペルオキシダーゼ を含む 酢酸ナトリウム緩衝液（0.05Ｍ、pH5.0) ・酵素 0.1ml ・１，５−ＡＧ溶液 0.1ml （ブランクには蒸溜水を使用） 反応後、グリシン・ナトリウム緩衝液（0.1 Ｍ、pH10.
3) を2.5ml 加えて反応を止め、レイ起波長315nm 、ケ
イ光波長405nm で相対ケイ光強度を測定する。既知濃度
の１，５−ＡＧ溶液につき試験すると１，５−ＡＧ濃度
と相対ケイ光強度の間には、図７に示す如く比例関係が
認められた。

【００４４】（６）H₂O₂電極法の検量線 後記参考例７で得た１，５−ＡＧの酸化酵素固定化カラ
ムの上流にポンプ、インジェクター、下流にH₂O₂電極
（石川製作所、ＢＨ型）を接続する。H₂O₂電極には過酸
化水素計（石川製作所、モデルＡＩ−1006型）とレコー
ダーをセットする。１，５−ＡＧ固定化カラムとH₂O₂電
極部を37℃に保った恒温槽に漬ける。ポンプから１ml／
分の流速でリン酸緩衝液（１／15Ｍ、pH5.6)を流し、安
定化させる。この流路系へインジェクターから１，５−
ＡＧ溶液50μl を流し、１，５−ＡＧ酸化反応によって
生じたレコーダー上のピーク面積を測定する。既知濃度
の１，５−ＡＧ溶液につき試験すると、１，５−ＡＧ濃
度とピーク面積の間には、図８に示す様な検量線が得ら
れた。以上から明らかなように本発明の方法によると
１，５−ＡＧが極めて簡便に定量しうる。

【００４５】実施例１ 次の組成の試料を実験例３に示した３種の方法で１，５
−ＡＧの含量を測定したところ下に示す如くそれぞれの
方法で１，５−ＡＧの測定が可能であった。 試料液組成 １，５−ＡＧ 100μg/ml グルコース 1000μg/ml ソルビトール 1000μg/ml 表３ 測定方法 １，５−ＡＧ実測値 酸素電極法 109μg/ml フエリシアニド法 107μg/ml ＤＣＩＰ法 98μg/ml

【００４６】実施例２ ヒト血清0.4ml へ過塩素系酸水溶液（60％w/v)30μl を
加え、振盪の後遠心分離（除タンパク）して得た上澄液
0.2ml をホウ酸型強塩基性樹脂ＡＧ１−Ｘ８（Bio-Rad
社製）0.8ml を充填した前処理カラムへ通し（グルコー
ス消去）、水３mlで洗浄して通過液３mlを得た。このカ
ラム通過液３mlを濃縮乾固してから、蒸溜水を加え、正
確に0.5ml に調整した。この様にして得られた除タンパ
ク質と前処理を施した試料を、前記、実験例３に示した
３種のH₂O₂を検出する方法で測定したところ下に示す如
く、それぞれの方法で、血清中の１，５−ＡＧの測定が
可能であった。なお、検量線は、既知濃度の１，５−Ａ
Ｇを含む標準溶液を用いて前記と全く同一の処理を施
し、それぞれの方法で測定して作成した。 表４ 測定方法 血清の1,5-AG実測値＊ H₂O₂の発色検出 28.0μg/ml H₂O₂のケイ光検出 27.6μg/ml H₂O₂の電極法 30.4μg/ml ＊ガスクロ法での実測値は28.5μg/mlであった。

【００４７】参考例１ （シュードモナス属に属する微生物由来の１，５−ＡＧ
変換活性微生物処理物の取得） カザミノ酸 １％、１，５−ＡＧ0.2 ％、（NH₄)₂SO₄
0.1％、K₂HPO₄ 0.1％、NaCl 0.1％、MgSO₄ ・7H₂O 0.02
％、酵母エキス0.1 ％、pH７蒸溜水から成る培地100ml
宛を500ml 容三角フラスコに分注し115 ℃、15分間殺
菌しPseudomonassp.NK-85001 〔微工研菌寄第8100号（F
erm p-8100)〕の斜面培養物の一白金耳を接種し30℃で
回転振盪培養機(220rpm)上で16時間培養する。培養液か
ら遠心分離により菌体を分離しトリス・塩酸緩衝液（0.
05Ｍ、pH７）で洗浄して出発液量の1/10容の菌体けんだ
く液とする。この菌体けんだく液を冷却してフレンチプ
レスにより菌体破壊液を得、これを10分間遠心分離(100
00×g)して、沈澱する細胞壁を除去した後、さらに１時
間遠心分離（100000×g)して沈澱物を得、トリス塩酸緩
衝液（0.05Ｍ、pH７）で洗浄し、同緩衝液中に懸濁して
膜画分懸濁液を得る。この懸濁液にトリトンＸ−100 を
１％（w/v)となるように添加し、４℃で１時間攪拌した
後、不溶物を遠心分離（100000×g)して除去し、１，５
−ＡＧ酸化酵素抽出液を得る。

【００４８】参考例２ 参考例１で得られる活性成分可溶化液を冷却しつつ硫酸
アンモニウム粉末を加え析出する蛋白質を遠心分離（10
000 ×g 、10分）で分離し本文記載のフェリシアニド法
で活性を測定すると活性は硫酸アンモニウム40％飽和区
分に主に回収されることが分る。 ＊酵素一単位をフェリシアニド２μmoles を10分間に還
元する活性とし、蛋白１mg当り換算した値

【００４９】参考例３ （ピクノボラスIFO 4923由来の１，５−ＡＧ酸化酵素の
取得）１，５−ＡＧ0.3 ％、酵母エキス0.4 ％、麦芽エ
キス0.5 ％、水道水からなる培地100ml 宛を500ml 容三
角フラスコに分注し、115 ℃、15分間殺菌しピクノボラ
ス・コクシネウス（IFO 4923) の斜面培養物の一白金耳
を接種し27℃で回転振盪培養機（220rpm) 上で６日間培
養する。培養液から遠心分離により菌体を分離し、リン
酸ナトリウム緩衝液（0.1 Ｍ、pH６）で洗浄して、湿菌
体重量の7.5 倍容の菌体けんだく液とする。この菌体け
んだく液を冷却してフレンチプレスにより菌体破壊液を
得、冷却下にこれを10分間遠心分離(10000×g)して、沈
澱する細胞壁を除去した後、さらに１時間遠心分離（10
0000×g)して膜画分を除き、細胞質上清を得る。冷却
下、この上清に硫酸アンモニウム粉末を加えて攪拌しな
がら溶解する。この時析出するタンパク質を遠心分離
（10000 ×g 、10分）で分離し、各硫酸アンモニウム画
分を本文記載のH₂O₂を検出する方法（１，５−ＡＧ溶液
として１％濃度のものを使用）で１，５−ＡＧ酸化活性
を測定すると、活性は、主に40〜60％飽和画分に存在す
る。酵素一単位を、１分間当り１，５−ＡＧを酸化して
H₂O₂１μmoleを発生する量と定義すると、この硫安画分
の比活性は4.0 である。湿菌体１ｇ当りから11単位の酵
素を得る。

【００５０】参考例４ 参考例３において、菌株をピクノボラス・コクシネウス
（IFO 6490) に変え、参考例３と同じ培地組成を有する
培地で４日間培養する。参考例３と同様の精製操作をへ
て、比活性3.6 の１，５−ＡＧ酸化酵素を得る。 参考例５ （コリオラス・コンソルス(IFO 9078)由来１，５−ＡＧ
酸化酵素の取得）参考例３において菌株をコリオラス・
コンソルス（IFO 9078) に変え、参考例３と同じ培地組
成を有する培地で10日間培養する。参考例３と同様の精
製操作をへて、比活性2.8.の１，５−ＡＧ酸化酵素を得
る。

【００５１】参考例６ （高純度酵素の取得）参考例３で得られた１，５−ＡＧ
酸化酵素の60％飽和硫安沈澱物を蒸溜水に溶解したもの
を用い、全操作を４℃に冷却下にＤＥＡＥ−トヨバール
（東洋ソーダ社製）クロマトを行い精製した。酵素4100
単位／20ml溶液を100 倍容のリン酸緩衝液(0.01 Ｍ、pH
6.0)で透析し、同緩衝液で平衡化されたＤＥＡＥ−Toyo
pearlカラム（2.5cm ×40cm) にチャージする。カラム
をリン酸緩衝液（0.01Ｍ、pH6.0)で十分洗浄の後、リン
酸緩衝液で0.01Ｍから0.5 Ｍ（pH6.0)の濃度勾配を付け
溶出する。活性は0.1 Ｍから0.2 Ｍ濃度の間に溶出され
るので、活性フラクションを集めＰＭ10限外ろ過膜（ア
ミコン社製）を用いて濃縮すると、比活性18の酵素溶液
(360単位/ml) 6.5mlが得られる。

【００５２】参考例７ （固定化カラムの製法）■多孔質ガラスＣＰＧ−10(200
/400メッシュ、平均ポアサイズ 500Å、エレクトロヌク
レオニック社製）0.5gをγ−アミノプロピルトリエトキ
シシラン0.5gにて、常法によりカップリング処理し、続
いて無水コハク酸0.5gにてカルボキシル化を行う。乾燥
した多孔質ガラスは、クロロホルム中で、過剰のチオニ
ルクロライドにてカルボキシル基を酸クロライドとす
る。得られた酸クロライド化多孔質ガラス１g に前記参
考例６で作成した１，５−ＡＧ酸化酵素溶液2.5ml を加
え、pHを６〜７に保ちながら25℃にて12時間ゆっくり攪
拌しながら反応させ、縮合反応を完結させる。得られた
１，５−ＡＧ酸化酵素固定化多孔質ガラスを内径2.3mm
×長さ70mmのカラム（１mlの注射筒）に充填する。１Ｍ
食塩を含有するリン酸緩衝液（１／15Ｍ、pH5.6)20mlを
流し、共有結合していない酵素を除き、さらにリン酸緩
衝液（１／15Ｍ、pH5.6)を流して洗浄し、１，５−ＡＧ
酸化酵素固定化カラムを得る。

【図面の簡単な説明】

図１は本発明で使用する酵素の至適pHを示す曲線であ
り、図２は該酵素の至適温度を示す曲線であり、図３は
酵素電極法における検量線を、図４はフェリシアニド法
における検量線を、図５はジクロルフェノールインドフ
ェノール法における検量線を、図６はH₂O₂の発色法によ
る検量線を、図７はH₂O₂のケイ光法による検量線を、図
８はH₂O₂電極法による検量線をそれぞれ示したものであ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 高橋 昭 東京都北区志茂２−16−16 (72)発明者 田島 茂 群馬県藤岡市藤岡675−11 (72)発明者 橋場 正 群馬県新田郡笠懸村阿左美804−12 (72)発明者 加藤 和夫 埼玉県浦和市辻８−21−15

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】髄液、血漿、血清又は尿を、１，５−アン
   ヒドログルシトール濃度を測定しやすいように処理し、
   その処理液に、電子受容体の存在下、１，５−アンヒド
   ログルシトールに対し脱水素による酸化能を有する酵素
   を作用させ、試料中の酸素の消費量を測定するか、又は
   生成する過酸化水素もしくは電子受容体の還元体を定量
   することを特徴とする１，５−アンヒドログルシトール
   の定量法。