JPH0518556B2 - - Google Patents
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- JPH0518556B2 JPH0518556B2 JP59198055A JP19805584A JPH0518556B2 JP H0518556 B2 JPH0518556 B2 JP H0518556B2 JP 59198055 A JP59198055 A JP 59198055A JP 19805584 A JP19805584 A JP 19805584A JP H0518556 B2 JPH0518556 B2 JP H0518556B2
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- JP
- Japan
- Prior art keywords
- enzyme
- activity
- benzoylglycine
- activity against
- buffer
- Prior art date
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Description
（産業上の利用分野）
本発明は特定の芳香族アシルアミノ酸を特異的
に分解する新規なアミノアシラーゼに関するもの
である。 アミノアシラーゼは各種のものが知られている
が、そのほとんどは脂肪族アシルアミノ酸に対し
て高分解活性を示し、芳香族アシルアミノ酸を分
解するものは微生物起源のものがいくつか知られ
ているにすぎない。 本発明者らは、サルコイド−シスの診断などに
利用されるアンジオテンシン変換酸素の活性測定
法（特公昭58−23080号公報など）、あるいはカル
ボキシペプチダーゼＡの活性測定法（特開昭59−
85299号公報など）にアミノアシラーゼを利用す
るために、芳香族アシルアミノ酸を分解する活性
の高いアミノアシラーゼを取得するべく広く微生
物を探索し、先にコリネバクテリウム・エクイ
（Corynebacterium equi）Ｈ−７株がＮ−ベンゾ
イル−Ｌ−アラニンに高分解活性を有するアミノ
アシラーゼを産生することを見出した（特開昭57
−86292号）。そして、さらに研究を進め、Ｎ−ベ
ンゾイルグリシンに高分解活性を有する新規なア
ミノアシラーゼをシユードモナス・プチダ
（Pseudomonas putida No.C692−３が産生する
ことも見出した（特願昭58−120255号）。 （発明が解決しようとする問題点） コリネバクテリウム・エクイの産生するアミノ
アシラーゼはシユードモナス・プチダの産生する
アミノアシラーゼに比して相対的に活性が低く、
一方、シユードモナス・プチダの産生するアミノ
アシラーゼはPH7.5〜9.0のアルカリ側で不安定な
ため、至適PHがアルカリ側にある前記のアンジオ
テンシン変換酵素やカルボキシペプチダーゼＡ
の活性測定用共役酵素としては適さない。 （問題点を解決するための手段） そこで、本発明者らは芳香族アシルアミノ酸を
分解する活性が高くかつアルカリPH域で安定なア
ミノアシラーゼを取得するべく広く自然界を探索
した結果、シユードモナス属に属する前記と異な
る微生物がこの目的に適合する酵素を産生するこ
とを見出し、これに基いて本発明を完成するに至
つた。 本発明のアミノアシラーゼの精製酵素標品の理
化学的性質を次に示す。 (1) 作用 本酵素はＮ−ベンゾイルグリシンを加水分解
して安息香酸とグリシンを生成する。 (2) 基質特異性 各種アミノ酸のＮ−アシル誘導体を基質とし
て酵素活性を測定した結果を第１表に示す。表
中の酵素活性はＮ−ベンゾイルグリシンに対す
る活性を100とした相対活性で表示してある。
この表に示すように本酵素はＮ−ベンゾイルグ
リシン及びＮ−ベンゾイル−Ｌ−アラニンをよ
く分解し、特にＮ−ベンゾイルグリシンを分解
する活性が大きく、かつＮ−アセチルグリシン
を分解する活性がＮ−ベンゾイルグリシンを分
解する活性の1/100以下である。
に分解する新規なアミノアシラーゼに関するもの
である。 アミノアシラーゼは各種のものが知られている
が、そのほとんどは脂肪族アシルアミノ酸に対し
て高分解活性を示し、芳香族アシルアミノ酸を分
解するものは微生物起源のものがいくつか知られ
ているにすぎない。 本発明者らは、サルコイド−シスの診断などに
利用されるアンジオテンシン変換酸素の活性測定
法（特公昭58−23080号公報など）、あるいはカル
ボキシペプチダーゼＡの活性測定法（特開昭59−
85299号公報など）にアミノアシラーゼを利用す
るために、芳香族アシルアミノ酸を分解する活性
の高いアミノアシラーゼを取得するべく広く微生
物を探索し、先にコリネバクテリウム・エクイ
（Corynebacterium equi）Ｈ−７株がＮ−ベンゾ
イル−Ｌ−アラニンに高分解活性を有するアミノ
アシラーゼを産生することを見出した（特開昭57
−86292号）。そして、さらに研究を進め、Ｎ−ベ
ンゾイルグリシンに高分解活性を有する新規なア
ミノアシラーゼをシユードモナス・プチダ
（Pseudomonas putida No.C692−３が産生する
ことも見出した（特願昭58−120255号）。 （発明が解決しようとする問題点） コリネバクテリウム・エクイの産生するアミノ
アシラーゼはシユードモナス・プチダの産生する
アミノアシラーゼに比して相対的に活性が低く、
一方、シユードモナス・プチダの産生するアミノ
アシラーゼはPH7.5〜9.0のアルカリ側で不安定な
ため、至適PHがアルカリ側にある前記のアンジオ
テンシン変換酵素やカルボキシペプチダーゼＡ
の活性測定用共役酵素としては適さない。 （問題点を解決するための手段） そこで、本発明者らは芳香族アシルアミノ酸を
分解する活性が高くかつアルカリPH域で安定なア
ミノアシラーゼを取得するべく広く自然界を探索
した結果、シユードモナス属に属する前記と異な
る微生物がこの目的に適合する酵素を産生するこ
とを見出し、これに基いて本発明を完成するに至
つた。 本発明のアミノアシラーゼの精製酵素標品の理
化学的性質を次に示す。 (1) 作用 本酵素はＮ−ベンゾイルグリシンを加水分解
して安息香酸とグリシンを生成する。 (2) 基質特異性 各種アミノ酸のＮ−アシル誘導体を基質とし
て酵素活性を測定した結果を第１表に示す。表
中の酵素活性はＮ−ベンゾイルグリシンに対す
る活性を100とした相対活性で表示してある。
この表に示すように本酵素はＮ−ベンゾイルグ
リシン及びＮ−ベンゾイル−Ｌ−アラニンをよ
く分解し、特にＮ−ベンゾイルグリシンを分解
する活性が大きく、かつＮ−アセチルグリシン
を分解する活性がＮ−ベンゾイルグリシンを分
解する活性の1/100以下である。
【表】
(3) 至適PH及び安定PH範囲
Ｎ−ベンゾイルグリシンを基質として、
0.1M酢酸緩衝液PH4.0〜5.5（三角）0.1Mリン酸
緩衝液PH6.0〜7.5（黒丸）、0.2Mトリス−塩酸緩
衝液7.5〜8.5（白丸）及び0.1M炭酸緩衝液PH9.0
〜10.0（四角）を用いて、37℃で10分間反応さ
せて至適PHを測定した結果を第１図に示す。図
から明らかなように本酵素の至適PHは8.0〜8.5
にある。 次に、本酵素を0.1M酢酸緩衝液PH4.0〜5.0
（三角）、0.1Mリン酸緩衝液PH5.5〜8.5（黒丸）、
0.2M HEPES緩衝液PH6.0〜10.0（白丸）及び
0.1M炭酸緩衝液PH9.0〜10.0（四角）の各緩衝液
中で37℃１時間加熱し、残存する酵素活性を測
定した結果を第２図に示す。本酵素はPH6.5〜
8.5の範囲において最も安定である。 一方、シユードモナス・プチダの産生するア
ミノアシラーゼについてPH安定性を同様に測定
した結果を第３図に示す。図に示すようにこの
酵素はPH7.0の近傍において最も安定である。 (4) 力価の測定法 酵素液0.05mlに100ｍＭリン酸ナトリウム緩
衝液（PH8.0）0.45mlを加え、37℃で５分間予
熱した後、30ｍＭ Ｎ−ベンゾイルグリシン溶
液1.0mlを加えて37℃で10間反応させる。反応
液にトリクロル酢酸1.0mlを加えて反応を停止
させ、生成したグリシンをニンヒドリン法で定
量する。 ニンヒドリン法による定量はムーアらの方法
（S.Moore and W.H.Stein、J.Biol.Chem.、
vol.211、P907（1954））に準じて下記のように
行なつた。すなわち、反応液を遠心分離し、そ
の上清1.0mlにニンヒドリン試薬0.2mlを加え煮
沸水浴中で15分間加熱し、ただちに50％エタノ
ール2.0mlを加える。水冷後、575nｍで比色し、
同様にして求めたグリシンの標準曲線からグリ
シンの生成量を定量した。 酵素活性は、１分間に1μmolのグリシンを生
成する酵素量を１単位とした。 (5) PH、温度などによる失活の条件 本酵素は第２図に示したように、37℃１時間
の処理で酢酸緩衝液におけるPH４未満及び炭酸
緩衝液におけるPH10以上でほぼ完全に失活す
る。また、リン酸緩衝液におけるPH5.5及び炭
酸緩衝液におけるPH9.0で活性がほぼ半分にな
る。 次に、本酵素を、0.1Mリン酸ナトリウム緩
衝液PH7.0中で各温度で30分間加熱後、残存活
性を測定した結果を第４図に示す。図に示すよ
うに、本酵素は40℃30分間の加熱では失活しな
いが、50℃30分間の処理で80％が失活し、55℃
30分間の処理でほぼ完全に失活する。 本酵素とシユードモナス・プチダの産生する
アミノアシラーゼを各々12U／mlになるように
10ｍM4−アミノアンチピリンを含むHEPES
−（Ｎ−２−hydroxyethylpiperazine−N′−２
−ethanesulfonicacid）緩衝液（PH7.8）に溶解
した。これを一旦凍結乾燥後直ちに水で復元し
て６℃に保存し、活性の経時変化を測定した。
得られた結果を第５図に示す。図における黒丸
は本酵素を、そして白丸はシユードモナス・プ
チダの酵素をそれぞれ表わしている。 (6) 阻害、活性化及び安定化 各種金属イオン、金属キレート剤及びSH阻
害剤を終濃度が第２表に示す濃度になるように
反応液に加えたときの本酵素の活性に及ぼす影
響を第２表にまとめて示す。この表の相対活性
は無添加の場合の活性を100として表示してあ
る。
0.1M酢酸緩衝液PH4.0〜5.5（三角）0.1Mリン酸
緩衝液PH6.0〜7.5（黒丸）、0.2Mトリス−塩酸緩
衝液7.5〜8.5（白丸）及び0.1M炭酸緩衝液PH9.0
〜10.0（四角）を用いて、37℃で10分間反応さ
せて至適PHを測定した結果を第１図に示す。図
から明らかなように本酵素の至適PHは8.0〜8.5
にある。 次に、本酵素を0.1M酢酸緩衝液PH4.0〜5.0
（三角）、0.1Mリン酸緩衝液PH5.5〜8.5（黒丸）、
0.2M HEPES緩衝液PH6.0〜10.0（白丸）及び
0.1M炭酸緩衝液PH9.0〜10.0（四角）の各緩衝液
中で37℃１時間加熱し、残存する酵素活性を測
定した結果を第２図に示す。本酵素はPH6.5〜
8.5の範囲において最も安定である。 一方、シユードモナス・プチダの産生するア
ミノアシラーゼについてPH安定性を同様に測定
した結果を第３図に示す。図に示すようにこの
酵素はPH7.0の近傍において最も安定である。 (4) 力価の測定法 酵素液0.05mlに100ｍＭリン酸ナトリウム緩
衝液（PH8.0）0.45mlを加え、37℃で５分間予
熱した後、30ｍＭ Ｎ−ベンゾイルグリシン溶
液1.0mlを加えて37℃で10間反応させる。反応
液にトリクロル酢酸1.0mlを加えて反応を停止
させ、生成したグリシンをニンヒドリン法で定
量する。 ニンヒドリン法による定量はムーアらの方法
（S.Moore and W.H.Stein、J.Biol.Chem.、
vol.211、P907（1954））に準じて下記のように
行なつた。すなわち、反応液を遠心分離し、そ
の上清1.0mlにニンヒドリン試薬0.2mlを加え煮
沸水浴中で15分間加熱し、ただちに50％エタノ
ール2.0mlを加える。水冷後、575nｍで比色し、
同様にして求めたグリシンの標準曲線からグリ
シンの生成量を定量した。 酵素活性は、１分間に1μmolのグリシンを生
成する酵素量を１単位とした。 (5) PH、温度などによる失活の条件 本酵素は第２図に示したように、37℃１時間
の処理で酢酸緩衝液におけるPH４未満及び炭酸
緩衝液におけるPH10以上でほぼ完全に失活す
る。また、リン酸緩衝液におけるPH5.5及び炭
酸緩衝液におけるPH9.0で活性がほぼ半分にな
る。 次に、本酵素を、0.1Mリン酸ナトリウム緩
衝液PH7.0中で各温度で30分間加熱後、残存活
性を測定した結果を第４図に示す。図に示すよ
うに、本酵素は40℃30分間の加熱では失活しな
いが、50℃30分間の処理で80％が失活し、55℃
30分間の処理でほぼ完全に失活する。 本酵素とシユードモナス・プチダの産生する
アミノアシラーゼを各々12U／mlになるように
10ｍM4−アミノアンチピリンを含むHEPES
−（Ｎ−２−hydroxyethylpiperazine−N′−２
−ethanesulfonicacid）緩衝液（PH7.8）に溶解
した。これを一旦凍結乾燥後直ちに水で復元し
て６℃に保存し、活性の経時変化を測定した。
得られた結果を第５図に示す。図における黒丸
は本酵素を、そして白丸はシユードモナス・プ
チダの酵素をそれぞれ表わしている。 (6) 阻害、活性化及び安定化 各種金属イオン、金属キレート剤及びSH阻
害剤を終濃度が第２表に示す濃度になるように
反応液に加えたときの本酵素の活性に及ぼす影
響を第２表にまとめて示す。この表の相対活性
は無添加の場合の活性を100として表示してあ
る。
【表】
(7) 精製方法
培養後、菌体から抽出した酵素液を、0.01M
リン酸ナトリウム緩衝液で平衡化したジエチル
アミノエチルセルロースのカラムに流して酵素
を吸着させ、0.2M塩化ナトリウムを含む同緩
衝液で溶出し、活性区分を集める。この活性区
分に硫酸アンモニウムを0.25飽和になるように
加え、沈澱を除去する。上清にさらに硫酸アン
モニウムを0.35飽和になるように加え、生成し
た沈澱を集めて同緩衝液に対して一夜透析す
る。この透析液を同緩衝液で平衡化したハイド
ロキシアパタイト（水酸化リン灰石）のカラム
に流して酵素を吸着させ、0.2Mリン酸ナトリ
ウム緩衝液（PH7.0）で溶出して精製酵素標品
を得る。 (8) 分子量 ゲル過法によつて求めた分子量は17万であ
つた。 (9) 等電点 アンホライン（PH３〜10）（LKB社製）を用
いて測定した結果、等電点は4.4であつた。 (10) 電気泳動 デイビスの方法（Ann.N.M.Acad.Sci.、
vol.21、P404.1964）に従つて、標準アクリル
アミドゲルデイスク、50ｍＭトリス−グリシン
緩衝液（PH8.3）を使用し、１カラム当り３ｍ
Ａの定電流で泳動を行なつた。その結果、本酵
素のブロムフエノールブルーに対する相対移動
度は0.65であつた。 以上の理化学的性質のうち、本酵素は特に基質
特異性が従来のアミノアシラーゼと異なる。すな
わち、従来のアミノアシラーゼのほとんどは脂肪
族アシルアミノ酸に対してのみ高分解活性を示
し、芳香族アシルアミノ酸を分解するものは微生
物起源のものにいくつか知られているにすぎな
い。そして、この芳香族アシルアミノ酸を分解す
るものはいずれもアシル−Ｄ−アミノ酸をも分解
する。 一方、本酵素はＮ−ベンゾイルグリシンなどの
芳香族アシルアミノ酸に対しては高分解活性を示
すが、Ｎ−アセチルグリシンなどの脂肪族アシル
アミノ酸及びＮ−ベンゾイル−Ｄ−アラニンなど
のアシル−Ｄ−アミノ酸に対する分解活性は低
い。 次に、本発明者らの既出願のうちコリネバクテ
リウム・エクイが産生するものは芳香族アシルア
ミノ酸に対して高分解活性を有するが、この酵素
はそのうちで特にＮ−ベンゾイル−Ｌ−アラニン
に対する分解活性が高く、Ｎ−ベンゾイルグリシ
ンに対する活性はあまり大きくない。しかるに、
本酵素は、芳香族アシルアミノ酸のなかでも特に
Ｎ−ベンゾイルグリシンに対する分解活性が大き
い。一方、シユードモナス・プチタが産生するも
のは以上の諸性質については本酵素と共通してい
るが、PH7.5〜9.0のアルカリ側の安定性が悪く、
例えばPH8.5、37℃で１時間加温すると残存活性
が50未満になつてしまう。しかるに本酵素はアル
カリ側においても安定であり、上記の条件で50％
以上の活性が残存する点で相違する。そこで、本
酵素は新規であると判断するに至つた。 本発明の酵素は、例えば本発明者らが沖縄県の
土壤から分離した微生物シユードモナス・エスピ
ー（Pseudomonas sp.）No.C684−２から産生さ
せることができる。このシユードモナス・エスピ
ーNo.C684−２は工業技術院微生物工業技術研究
所に微工研菌寄第7716号（FERM Ｐ−7716）と
して寄託されている。 シユードモナス・エスピーNo.C684−２の菌学
的性質を次に示す。 １ 形態 (1) 細胞の形及び大きさ 細胞は桿状（0.8〜1.0×1.3〜1.6μｍ）であ
り、多形性は示さない。 (2) 運動性あり (3) 胞子：形成しない (4) グラム染色性：陰性 ２ 各種培地における生育状態 (1) 肉汁寒天平板培養 コロニーは円板状で、全縁、半透明、軟質
であり、表面は光沢がある。可溶性色素は産
生しない。コロニーの大きさは直径1.2〜1.5
mmである。 (2) 肉汁寒天斜面培養 線状に良好に生育し、軟質である。表面は
光沢がある。凝縮水でも良く生育する。可溶
性色素は産生しない。 (3) 肉汁液体培養 良好に生育し、混濁する。沈渣を生じな
い。菌膜は形成しない。 (4) 肉汁ゼラチン穿刺培養 上層部でよく生育する。液化しない。沈渣
を生じない。 (5) リトマスミルク 凝固及びペプトン化しない。PHは微アルカ
リ性。 ３ 生理学的性質 (1) 硝酸塩の還元：陰性 (2) MRテスト：陰性 (3) VPテスト：陰性 (4) インドールの生成：陰性 (5) 硫化水素の生成：陰性（SIM培地上） (6) デンプンの加水分解：陰性 (7) クエン酸塩の利用：Koser培地：陽性 Christensen培地：陽性 (8) 色素の生成：KingA培地では生成しない。 KingB培地では黄色螢光色素を生成する。 (9) オキシダーゼ：陽性 (10) カタラーゼ：陽性 (11) 酸素に対する態度：好気性 (12) OFテスト：酸化的 (13) 糖からの酸及びガスの生成 Ｄ−グルコース、Ｄ−ガラクトース、Ｌ−
アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−フラク
トース、Ｄ−マンノース及びグリセロールか
ら酸を生成する。マルトース、トレハロー
ス、シヨ糖、イノシトール、Ｄ−マンニトー
ル、乳糖、Ｄ−ソルビトール及び可溶性デン
プンからは酸を生成しない。ガスの生成は認
められない。 以上の諸性質をバージエイズ・マニユアル・オ
ブ・デタ−ミネイテイブ・バクテリオロジー
（Bergey′s Mannual of Determinative
Bacteriology）第８版、1974版の記載と照合し
た結果、本菌はシユードモナス属の微生物の性質
と極めてよく一致するところから、本菌をシユー
ドモナス属に属する微生物であると同定した。 このような微生物を培養して本発明の酵素を産
生させる方法は微生物を培養する一般的な方法に
準じて行なうことができる。すなわち、培地には
炭素源、窒素源、無機塩類、その他の栄養物質な
どを含有するものを用いる。炭素源としては、グ
ルコース、麦芽糖のような糖類、グリセロールの
ようなアルコール類を使用できるが、馬尿酸とか
Ｎ−ベンゾイルアラニンのような本酵素の誘導基
質が特に効果的である。窒素源としては硫酸アン
モニウム、塩化アンモニウム、硝酸ナトリウムな
どの無機態のものでもよく、酵母エキス、肉エキ
ス、ペプトンのような有機態のものでもよい。無
機塩類としては塩化ナトリウムのほかには、リン
酸１カリウム、リン酸２ナトリウム、硫酸マグネ
シウム等の通常の無機塩を使用することができ
る。 培養方法としては、通常は液体培養が好まし
く、15〜37℃、好ましくは25〜35℃、PH５〜８で
10〜50時間好気的条件下で培養する。この培養に
よつて本酵素の大部分は菌体内に蓄積される。 培養終了後は培養物をそのまま酵素源として利
用してもよいが、通常は分離精製を行なう。分離
方法としては、まず菌体を遠心等の常法により分
離し、磨砕、リゾチーム等の溶菌酵素による溶
菌、超音波処理、圧力シヨツク法、自己消化法等
によつて菌体を破壊し、酵素を抽出する。破壊し
た菌体残渣を分離して酵素抽出液を得、硫酸アン
モニウム等を用いる塩析法、アセトン、エタノー
ル等を用いる溶媒沈澱法、セフアデツクス、セフ
アロースゲル等を用いるゲル過法、イオン交換
樹脂等を用いる吸着法等を適宜組合せて精製を行
ない、目的とする純度の酵素標品を得る。 （作用及び発明の効果） 本発明の酵素はＮ−ベンゾイルグリシン及びＮ
−ベンゾイル−Ｌ−アラニンをよく分解するとと
もにアルカリ側においても安定なところに特徴が
あり、アンジオテンシン変換酵素の活性測定法及
びカルボキシペプチダーゼＡの活性測定法などに
有用である。 （実施例） 馬尿酸１％、酵母エキス0.3％、硝酸ナトリウ
ム0.2％、リン酸２カリウム0.1％、硫酸マグネシ
ウム0.05％、および塩化ナトリウム0.05％からな
るPH7.0の培地60を90容ジヤーフアーメンタ
ーに入れ、120℃で20分間滅菌した。冷却後、シ
ユードモナス・エスピーNo.684−２（FERM Ｐ−
7716）を接種し、28℃で10時間通気撹拌培養を行
なつた。その間の通気量は0.5vvmとし、撹拌羽
根の回転数は200rpmとした。培養終了後、培養
液を遠心して約１Kgの湿菌体を得た。この菌体を
10ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（PH7.0）３に
懸濁し、ダイノーミル（KDL型）を用いて、
3000rpm流量30ml／minで菌体を破砕した。遠心
して菌体残渣を除き、酵素抽出液3.5を得た。
この酵素抽出液に10ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液
で平衡化したジエチルアミノエチルセルロース１
Kgを加え、６℃で２時間撹拌し、酵素を吸着させ
た。このジエチルアミノエチルセルロースを同緩
衝液で充分洗浄し、0.2M塩化ナトリウムを含む
同緩衝液で本酵素を溶出した。溶出液に0.25飽和
になるよう硫酸アンモニウムを加え、生じた沈澱
を除去し、さらにその上清に0.35飽和になるよう
に硫酸アンモニウムを加え、生じた沈澱を集め
た。この沈澱を同緩衝液に対して一夜透析した。
透析物を同緩衝液で平衡化したハイドロキシアパ
タイトのカラムに吸着させ、0.2Mリン酸ナトリ
ウム緩衝液（PH7.0）で溶出した。 溶出画分に、0.35飽和になるように硫酸アンモ
ニウムを加え、生じた沈澱を集め、同緩衝液に対
し、一夜透析して比活性150U／mgの精製標品を
収率27％で得た。
リン酸ナトリウム緩衝液で平衡化したジエチル
アミノエチルセルロースのカラムに流して酵素
を吸着させ、0.2M塩化ナトリウムを含む同緩
衝液で溶出し、活性区分を集める。この活性区
分に硫酸アンモニウムを0.25飽和になるように
加え、沈澱を除去する。上清にさらに硫酸アン
モニウムを0.35飽和になるように加え、生成し
た沈澱を集めて同緩衝液に対して一夜透析す
る。この透析液を同緩衝液で平衡化したハイド
ロキシアパタイト（水酸化リン灰石）のカラム
に流して酵素を吸着させ、0.2Mリン酸ナトリ
ウム緩衝液（PH7.0）で溶出して精製酵素標品
を得る。 (8) 分子量 ゲル過法によつて求めた分子量は17万であ
つた。 (9) 等電点 アンホライン（PH３〜10）（LKB社製）を用
いて測定した結果、等電点は4.4であつた。 (10) 電気泳動 デイビスの方法（Ann.N.M.Acad.Sci.、
vol.21、P404.1964）に従つて、標準アクリル
アミドゲルデイスク、50ｍＭトリス−グリシン
緩衝液（PH8.3）を使用し、１カラム当り３ｍ
Ａの定電流で泳動を行なつた。その結果、本酵
素のブロムフエノールブルーに対する相対移動
度は0.65であつた。 以上の理化学的性質のうち、本酵素は特に基質
特異性が従来のアミノアシラーゼと異なる。すな
わち、従来のアミノアシラーゼのほとんどは脂肪
族アシルアミノ酸に対してのみ高分解活性を示
し、芳香族アシルアミノ酸を分解するものは微生
物起源のものにいくつか知られているにすぎな
い。そして、この芳香族アシルアミノ酸を分解す
るものはいずれもアシル−Ｄ−アミノ酸をも分解
する。 一方、本酵素はＮ−ベンゾイルグリシンなどの
芳香族アシルアミノ酸に対しては高分解活性を示
すが、Ｎ−アセチルグリシンなどの脂肪族アシル
アミノ酸及びＮ−ベンゾイル−Ｄ−アラニンなど
のアシル−Ｄ−アミノ酸に対する分解活性は低
い。 次に、本発明者らの既出願のうちコリネバクテ
リウム・エクイが産生するものは芳香族アシルア
ミノ酸に対して高分解活性を有するが、この酵素
はそのうちで特にＮ−ベンゾイル−Ｌ−アラニン
に対する分解活性が高く、Ｎ−ベンゾイルグリシ
ンに対する活性はあまり大きくない。しかるに、
本酵素は、芳香族アシルアミノ酸のなかでも特に
Ｎ−ベンゾイルグリシンに対する分解活性が大き
い。一方、シユードモナス・プチタが産生するも
のは以上の諸性質については本酵素と共通してい
るが、PH7.5〜9.0のアルカリ側の安定性が悪く、
例えばPH8.5、37℃で１時間加温すると残存活性
が50未満になつてしまう。しかるに本酵素はアル
カリ側においても安定であり、上記の条件で50％
以上の活性が残存する点で相違する。そこで、本
酵素は新規であると判断するに至つた。 本発明の酵素は、例えば本発明者らが沖縄県の
土壤から分離した微生物シユードモナス・エスピ
ー（Pseudomonas sp.）No.C684−２から産生さ
せることができる。このシユードモナス・エスピ
ーNo.C684−２は工業技術院微生物工業技術研究
所に微工研菌寄第7716号（FERM Ｐ−7716）と
して寄託されている。 シユードモナス・エスピーNo.C684−２の菌学
的性質を次に示す。 １ 形態 (1) 細胞の形及び大きさ 細胞は桿状（0.8〜1.0×1.3〜1.6μｍ）であ
り、多形性は示さない。 (2) 運動性あり (3) 胞子：形成しない (4) グラム染色性：陰性 ２ 各種培地における生育状態 (1) 肉汁寒天平板培養 コロニーは円板状で、全縁、半透明、軟質
であり、表面は光沢がある。可溶性色素は産
生しない。コロニーの大きさは直径1.2〜1.5
mmである。 (2) 肉汁寒天斜面培養 線状に良好に生育し、軟質である。表面は
光沢がある。凝縮水でも良く生育する。可溶
性色素は産生しない。 (3) 肉汁液体培養 良好に生育し、混濁する。沈渣を生じな
い。菌膜は形成しない。 (4) 肉汁ゼラチン穿刺培養 上層部でよく生育する。液化しない。沈渣
を生じない。 (5) リトマスミルク 凝固及びペプトン化しない。PHは微アルカ
リ性。 ３ 生理学的性質 (1) 硝酸塩の還元：陰性 (2) MRテスト：陰性 (3) VPテスト：陰性 (4) インドールの生成：陰性 (5) 硫化水素の生成：陰性（SIM培地上） (6) デンプンの加水分解：陰性 (7) クエン酸塩の利用：Koser培地：陽性 Christensen培地：陽性 (8) 色素の生成：KingA培地では生成しない。 KingB培地では黄色螢光色素を生成する。 (9) オキシダーゼ：陽性 (10) カタラーゼ：陽性 (11) 酸素に対する態度：好気性 (12) OFテスト：酸化的 (13) 糖からの酸及びガスの生成 Ｄ−グルコース、Ｄ−ガラクトース、Ｌ−
アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−フラク
トース、Ｄ−マンノース及びグリセロールか
ら酸を生成する。マルトース、トレハロー
ス、シヨ糖、イノシトール、Ｄ−マンニトー
ル、乳糖、Ｄ−ソルビトール及び可溶性デン
プンからは酸を生成しない。ガスの生成は認
められない。 以上の諸性質をバージエイズ・マニユアル・オ
ブ・デタ−ミネイテイブ・バクテリオロジー
（Bergey′s Mannual of Determinative
Bacteriology）第８版、1974版の記載と照合し
た結果、本菌はシユードモナス属の微生物の性質
と極めてよく一致するところから、本菌をシユー
ドモナス属に属する微生物であると同定した。 このような微生物を培養して本発明の酵素を産
生させる方法は微生物を培養する一般的な方法に
準じて行なうことができる。すなわち、培地には
炭素源、窒素源、無機塩類、その他の栄養物質な
どを含有するものを用いる。炭素源としては、グ
ルコース、麦芽糖のような糖類、グリセロールの
ようなアルコール類を使用できるが、馬尿酸とか
Ｎ−ベンゾイルアラニンのような本酵素の誘導基
質が特に効果的である。窒素源としては硫酸アン
モニウム、塩化アンモニウム、硝酸ナトリウムな
どの無機態のものでもよく、酵母エキス、肉エキ
ス、ペプトンのような有機態のものでもよい。無
機塩類としては塩化ナトリウムのほかには、リン
酸１カリウム、リン酸２ナトリウム、硫酸マグネ
シウム等の通常の無機塩を使用することができ
る。 培養方法としては、通常は液体培養が好まし
く、15〜37℃、好ましくは25〜35℃、PH５〜８で
10〜50時間好気的条件下で培養する。この培養に
よつて本酵素の大部分は菌体内に蓄積される。 培養終了後は培養物をそのまま酵素源として利
用してもよいが、通常は分離精製を行なう。分離
方法としては、まず菌体を遠心等の常法により分
離し、磨砕、リゾチーム等の溶菌酵素による溶
菌、超音波処理、圧力シヨツク法、自己消化法等
によつて菌体を破壊し、酵素を抽出する。破壊し
た菌体残渣を分離して酵素抽出液を得、硫酸アン
モニウム等を用いる塩析法、アセトン、エタノー
ル等を用いる溶媒沈澱法、セフアデツクス、セフ
アロースゲル等を用いるゲル過法、イオン交換
樹脂等を用いる吸着法等を適宜組合せて精製を行
ない、目的とする純度の酵素標品を得る。 （作用及び発明の効果） 本発明の酵素はＮ−ベンゾイルグリシン及びＮ
−ベンゾイル−Ｌ−アラニンをよく分解するとと
もにアルカリ側においても安定なところに特徴が
あり、アンジオテンシン変換酵素の活性測定法及
びカルボキシペプチダーゼＡの活性測定法などに
有用である。 （実施例） 馬尿酸１％、酵母エキス0.3％、硝酸ナトリウ
ム0.2％、リン酸２カリウム0.1％、硫酸マグネシ
ウム0.05％、および塩化ナトリウム0.05％からな
るPH7.0の培地60を90容ジヤーフアーメンタ
ーに入れ、120℃で20分間滅菌した。冷却後、シ
ユードモナス・エスピーNo.684−２（FERM Ｐ−
7716）を接種し、28℃で10時間通気撹拌培養を行
なつた。その間の通気量は0.5vvmとし、撹拌羽
根の回転数は200rpmとした。培養終了後、培養
液を遠心して約１Kgの湿菌体を得た。この菌体を
10ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（PH7.0）３に
懸濁し、ダイノーミル（KDL型）を用いて、
3000rpm流量30ml／minで菌体を破砕した。遠心
して菌体残渣を除き、酵素抽出液3.5を得た。
この酵素抽出液に10ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液
で平衡化したジエチルアミノエチルセルロース１
Kgを加え、６℃で２時間撹拌し、酵素を吸着させ
た。このジエチルアミノエチルセルロースを同緩
衝液で充分洗浄し、0.2M塩化ナトリウムを含む
同緩衝液で本酵素を溶出した。溶出液に0.25飽和
になるよう硫酸アンモニウムを加え、生じた沈澱
を除去し、さらにその上清に0.35飽和になるよう
に硫酸アンモニウムを加え、生じた沈澱を集め
た。この沈澱を同緩衝液に対して一夜透析した。
透析物を同緩衝液で平衡化したハイドロキシアパ
タイトのカラムに吸着させ、0.2Mリン酸ナトリ
ウム緩衝液（PH7.0）で溶出した。 溶出画分に、0.35飽和になるように硫酸アンモ
ニウムを加え、生じた沈澱を集め、同緩衝液に対
し、一夜透析して比活性150U／mgの精製標品を
収率27％で得た。
第１図は実施例で得られた酵素の至適PHを示す
曲線であり、第２図はPH安定性を示す曲線であ
る。第３図は同じ条件で測定して得られた先願の
酵素のPH安定性を示す曲線である。第４図は実施
例で得られた酵素の熱安定性を示す曲線であり、
第５図は実施例で得られた酵素と先願の酵素のPH
7.8における保存安定性を比較した結果を示すも
のである。
曲線であり、第２図はPH安定性を示す曲線であ
る。第３図は同じ条件で測定して得られた先願の
酵素のPH安定性を示す曲線である。第４図は実施
例で得られた酵素の熱安定性を示す曲線であり、
第５図は実施例で得られた酵素と先願の酵素のPH
7.8における保存安定性を比較した結果を示すも
のである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 下記の理化学的性質を有するアミノアシラー
ゼ。 作用：Ｎ−ベンゾイルグリシンを加水分解して安
息香酸とグリシンを生成する。 基質特異性：Ｎ−ベンゾイルグリシン、Ｎ−ベン
ゾイル−Ｌ−アラニンを特異的に分解するが、
前者に対する活性は後者に対する活性より高
く、Ｎ−アセチルグリシン及びＮ−ベンゾイル
−Ｄ−アラニンに対する活性はＮ−ベンゾイル
グリシンに対する活性の1/100以下である。 至適PH：PH8.0〜8.5 安定PH：PH6.5〜8.5 作用適温：約37℃ 失活条件：PH４未満及びPH10以上でほぼ完全に失
活する。 阻害、活性化及び安定化：α，α′−ジピリジル１
ｍＭ及びエチレンジアミン四酢酸10ｍＭ溶液で
は活性は変らず、８−ヒドロキシキノリン、モ
ノヨード酢酸、ｐ−クロロ水銀安息香酸、
Hg++、Cu++、Ni++、Mn++及びBa++の各１ｍ
Ｍ溶液では阻害される。 分子量：ゲル濾過法により求めた分子量は17万ダ
ルトンである。 等電点：4.4。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59198055A JPS6174584A (ja) | 1984-09-21 | 1984-09-21 | アミノアシラ−ゼ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59198055A JPS6174584A (ja) | 1984-09-21 | 1984-09-21 | アミノアシラ−ゼ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6174584A JPS6174584A (ja) | 1986-04-16 |
| JPH0518556B2 true JPH0518556B2 (ja) | 1993-03-12 |
Family
ID=16384777
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59198055A Granted JPS6174584A (ja) | 1984-09-21 | 1984-09-21 | アミノアシラ−ゼ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6174584A (ja) |
-
1984
- 1984-09-21 JP JP59198055A patent/JPS6174584A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6174584A (ja) | 1986-04-16 |
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| EXPY | Cancellation because of completion of term |