JPH0523747B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

技術分野 本発明は、Ｌ−リンゴ酸の製造法に関する物で
ある。 本発明の方法によれば高い収率でＬ−リンゴ酸
を製造することができる。 Ｌ−リンゴ酸は現在医薬用等に用いられるもの
であり、又将来食品用としての利用も期待される
ものである。 先行技術 Ｌ−リンゴ酸の製造法としてえは、フマラーゼ
活性を有する微生物をフマール酸を含有する培地
に培養し、培養物からＬ−リンゴ酸を採取する醗
酵法（例えば特公昭41−16547号等参照）、及びフ
マラーゼ活性を有する微生物中の酵素フマラーゼ
を用いてフマール酸またはその塩からＬ−リンゴ
酸を製造する酵素法〔例えばThe Journal of
Genersl and Applind Microbiology、６、108
〜116（1960）、European Journal of Applied
Microbiology、３、169〜183（1976）など参照〕
が知られている。 しかしながら、醗酵法によるＬ−リンゴ酸の製
造では、大規模な醗酵設備を要し、さらにＬ−リ
ンゴ酸の生成収率が極めて低いため、高価となる
などの問題がある。公知の酵素法によるＬ−リン
ゴ酸の製法は、微生物のフマラーゼを利用してフ
マール酸からＬ−リンゴ酸を得るものであり、従
つて強力なフマラーゼ活性を有する微生物を得る
ことが工業的生産への重要要素となつているが、
このような目的に合致する微生物を自然界から分
離することは多くの困難を伴ない工業化への障害
となつていた。 発明の概要 本発明者らは、上記問題点を解消すべく鋭意検
討を行つた結果、α−アミノ−ｎ−酪酸耐性を有
するブレビバクテリウム属に属する微生物が、強
力なフマラーゼ活性を有することを見い出し、本
発明を完成した。 即ち、本発明は、α−アミノ−ｎ−酪酸耐性を
有するブレビバクテリウム・フラバムを好気的に
培養して得られる培養物若しくはその処理物の存
在下フマール酸またはその塩を水溶媒中で酸素反
応させてＬ−リンゴ酸を生成させ、該水溶液より
Ｌ−リンゴ酸を採取することを特徴とするＬ−リ
ンゴ酸の製造法を提供するものである。 発明の具体的説明 本発明の方法に用いられる微生物は、ブレビバ
クテリウム属に属し、α−アミノ−ｎ−酪酸耐性
を有する微生物である。この微生物は、該耐性機
構を人為的に付与された微生物に限定されるもの
ではなく、自然界における偶発的変位によつて該
耐性機構を取得した微生物であつてもよい。この
様な微生物の例としては、例えば特公昭57−
26755号公報に開示されているブレビバクテリウ
ム・フラバムMJ−233（微工研条寄第1497号）等
がある。 本発明の方法に用いられるα−アミノ−ｎ−酪
酸耐性を有する微生物は、上述の天然から取得さ
れたそのままの微生物でも用いられるが、好まし
くはブレビバクテリウム属に属しα−アミノ−ｎ
−酪酸耐性を積極的に付与された及び／又は高め
られて有する微生物が用いられる。この様な微生
物としては例えば特公昭59−28398号公報に開示
されているブレビバクテリウム・フラバムMJ−
233−AB−41（微工研条寄第1498号）等がある。 本発明の方法に好ましく使用される上述の、ブ
レビバクテリウム属に属しα−アミノ−ｎ−酪酸
耐性を積極的に付与された及び／又は高められて
有する微生物は、ブレビバクテリウム属に属しα
−アミノ−ｎ−酪酸耐性を有する微生物を公知の
方法、例えば次の操作により誘導することができ
る。即ち、赤外線照射、あるいは化学的薬剤（例
えばＮ−メチル−N′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグ
アニジン等）処理により例えばブレビバクテリウ
ム・フラバムMJ−233に変異を誘起せしめた後、
この菌懸濁液をDL−α−アミノ−ｎ−酪酸10
mg／ml含有する平板培地（尿素0.2％、硫安0.7
％、KH₂PO₄0.05％、K₂HPO₄0.05％、MgSO₄・
7H₂O0.05％、NaCl ２mg／、CaCl₂・2H₂Ｏ
２mg／、FeSO₄・7H₂Ｏ ２mg／、
MnSO₄・４〜6H₂Ｏ、ZnSO₄・7H₂Ｏ ２mg／
、ビチオン200μｇ／、チアミン塩酸塩100μ
ｇ／、DL−α−アミノ−ｎ−酪酸1.0％、寒天
2.0％、エタノール３容量％〔滅菌後添加〕）に、
30℃にて数日間培養し、生じた大コロニーを分離
することにより耐性変異株を得ることができる。 ここで、本願発明において使用する微生物のα
−アミノ−ｎ−酪酸耐性は、DL−α−アミノ−
ｎ−酪酸２％を（注−１）の培地に加え、30℃、
３日間振盪培養した時の相対生育度で定義され、
α−アミノ−ｎ−酪酸耐性を積極的に付与された
及び／又は高められて有する微生物の前記相対生
育度は15以上、好ましくは30以上である。 なお、前記相対生育度は次式で示される。 相対生育度＝
α−AB2％添加時の生育度O.D₆₁₀／α−AB無添加時の生
育度O.D₆₁₀×100 （上式中、α−ABはDL−α−アミノ−ｎ−
酪酸の略号である） （注−１）使用培地組成及び培養方法 尿素0.2％、硫安0.7％、KH₂PO₄ 0.05％、K₂
HPO₄ 0.05％、MgSO₄・7H₂Ｏ 0.05％、酵母
エキス0.01％、カザミノ酸0.01％、FeSO₄・7H₂
Ｏ ２mg／、MnSO₄・４〜6H₂Ｏ ２mg／、
ZnSO₄・7H₂Ｏ ２mg／、ビチオン200μｇ／
、チアミン塩酸塩100μｇ／からなる培地
（DL−α−アミノ−ｎ−酪酸は、表１に示す量を
加える）10mlを口径24mmの大型試験管に分注、
120℃、10分間滅菌後、微生物例えばブレビバク
テリウム・フラバムMJ−233−AB−41株を各々
接種し、エタノールを無菌条件にて0.3ml（３容
量％）添加し、30℃で３日間振盪培養を行なつ
た。 （注−２）生育度O.D₆₁₀、相対生育度 生育度O.D₆₁₀は、610mμの波長における吸光度
を示し、この吸光度測定は東京大学農学部農芸化
学教室実験農芸化学上巻212項、朝倉書店（1975）
に従い測定した。また、DL−α−アミノ−ｎ−
酪酸無添加時の生育度O.D₆₁₀を100とし、相対生
育度で表わす。 上述の定義に従い測定したブレビバクテリウ
ム・フラバムMJ−233及びブレビバクテリウム・
フラバムMJ−233−AB−41のDL−α−アミノ
−ｎ−酪酸に対する相対生育度は表１に示す通り
であつた。

【表】 上述したブレビバクテリウム属に属しα−アミ
ノ−ｎ−酪酸耐性を有する微生物を好気的に培養
する。この時培養に使用される炭素源、窒素源、
無機塩等の培地組成は特に限定されるものではな
く、例えば炭素源としてエタノール、メタノー
ル、ｎ−パラフイン、糖蜜等が、窒素源としては
アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウ
ム、硝酸アンモニウム、尿素等が、無機塩として
はリン酸−水素カリウム、リン酸二水素カリウ
ム、硫酸マグネシウム等が用いられる。これらの
炭素源、窒素源および無機塩はそれぞれ単独又は
混合して用いることができる。 更に、これらの他に菌の生育に必要であれば、
ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンステイ
ープリカー、カザミノ酸、各種ビタミン等の栄養
素を培地に添加することができる。 培養は通気攪拌、振盪等の好気的条件下で行な
い、培養温度は20〜40℃、好ましくは25〜35℃で
行なう。培養途中のPHは５〜10、好ましくは７〜
８付近にて行ない、培養液中のPHの調整には酸、
アルカリを添加して行なう。 培養開始時の炭素源例えばエタノール濃度は１
〜５容量％、好ましくは２〜３容量％が適する。
培養期間は２〜８日間、好ましくは４〜５日間で
ある。 かくして得られた培養物は、活性の高いフマラ
ーゼを含有しているので、フマール酸またはその
ナトリウム塩、カルシウム塩等のフマール酸塩を
原料として、これを酵素反応によりＬ−リンゴ酸
を収率よく製造することができる。 ここで、酵素反応には上述の様にして得られた
培養物若しくはその処理物が用いられるが、これ
らには上述の培養液そのものの他、それに含まれ
ている菌体、菌体の破壊物、磨砕物および自己消
化液等、培養で得られる全てのものを含むもので
あり、更に菌体、菌体の破壊物、磨砕物等を固定
化したものも含むものである。 本発明における酵素反応は、上記培養物若しく
はその処理物の存在下フマール酸またはその塩を
水溶媒中で反応させることにより行われる。 該酵素反応は水溶媒中、PH４〜10、反応温度約
15〜約60℃、好ましくは約20〜約50℃で、通常約
0.5〜約48時間行われる。 この酵素反応は水溶媒中で行われるが、水の他
にリン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液等の溶媒10〜
500mMの濃度で用いることもできる。又、反応
液のPHを４〜10に調節する為水酸化ナトリウム、
水酸化カリウム、水酸化アンモニウム等のアルカ
リ類、塩酸、硫酸等の無機酸を添加することもで
きる。 フマール酸またはその塩の反応時の使用量には
特に制限はないが、一般には0.5〜30％（wt／
vol）の範囲で使用するのが適当である。また、
該培養物若しくはその処理物の使用量も特に制限
されるものではないが、一般に0.5〜10％（wt／
vol）の範囲で使用することができる。 培養物若しくはその処理物を用いてフマール酸
と水を反応せしめて得られる反応液中に生成した
Ｌ−リンゴ酸の分離・精製は、イオン交換樹脂、
活性炭素による吸着、脱着処理等の公知の方法に
より行なうことができる。 実験例 実施例１及び２ 尿素4.0ｇ、硫安14.0ｇ、KH₂PO₄ 0.5ｇ、K₂
HPO₄ 0.5ｇ、MgSO₄・7H₂Ｏ 0.5ｇ、
FeSO₄・7H₂Ｏ ６mg、MnSO₄・４〜6H₂Ｏ ６
mg、酵母エキス1.0ｇ、カザミノ酸1.0ｇ、ビオチ
ン200μｇ、チアミン塩酸塩100μｇ、水道水１
からなる培地10mlを口径24mmの大型試験管に分注
し、120℃、10分間加圧滅菌し、無菌的にエタノ
ール0.3mlを添加して前培養用培地とした。この
培地にブレビバクテリウム・フラバムMJ−233
（実施例２）とブレビバクテリウム・フラバムMJ
−233−AB−41（実施例１）を各々１白金耳量植
菌し、30℃で２日間振盪培養を行なつた。 次に、上記の前培養用培地組成と同一なる培地
100mlづつ500ml容量の２個の三角コルベンに分注
し、120℃、10分間加圧滅菌し、無菌的にエタノ
ール３mlをそれぞれ添加して本培養用培地とし、
上記２種の微生物の前培養液1.0mlをそれぞれ植
菌して30℃で３日間振盪培養を行つた。 かくして得られたそれぞれの培養物から一定量
の菌体を集菌する為に、比濁法（O.D₆₁₀）により
O.D₆₁₀の値を10.0に水にて調整し、該調製液それ
ぞれ100mlから遠心分離（4000rpm、15分間）に
より集菌した。 一方、フマール酸10ｇを水70mlに加え、5N−
NaOH溶液にてPH6.2に調整後水で全量を100mlと
した後100ml容三角フラスコに50mlを分注した。
この様な原料溶液を２個作製し、これらにさらに
上記集菌体をそれぞれ添加し、45℃で２時間振と
うを行つた。反応終了後、遠心分離（400rpm、
15分間）にて菌体を除去した上清液中に生成した
Ｌ−リンゴ酸量を高速液体クロマトグラフにて測
定した結果、親株であるブレビバクテリウム・フ
ラバムMJ−233の集菌体を使用の場合、40mg／ml
（実施例２）、また積極的にα−アミノ−ｎ−酪酸
耐性を付与した菌株であるブレビバクテリウム・
フラバムMJ−233−AB−41の集菌体を使用の場
合、82mg／ml（実施例１）であつた。 また、各反応終了液50mlに6N−HCl溶液を添
加しPHを約２に調整後、強塩基性樹脂（ローム・
アンド・ハース社製「アンバーライトIRA−
400」、R₂CO₃型）を充填したカラムに通しＬ−リ
ンゴ酸を樹脂に吸着させた。次に1N−炭酸アン
モニウムにて溶出後濃縮し、Ｌ−リンゴ酸の粗結
晶を析出させた。これをアセトンで洗浄し、乾燥
した。ブレビバクテリウム・フラバムMJ−233集
菌体を使用の反応液50mlからはＬ−リンゴ酸の結
晶を1.2ｇ、一方、ブレビバクテリウム・フラバ
ムMJ−233−AB−41の集菌体を使用の反応液50
mlからはＬ−リンゴ酸の結晶を2.6ｇ得た。 発明の効果 フマール酸またはその塩を水溶媒中で酵素反応
によりＬ−リンゴ酸を製造する方法において、酵
素源としてブレビバクテリウム属に属しα−アミ
ノ−ｎ−酪酸耐性を有する微生物、特に積極的に
α−アミノ−ｎ−酪酸耐性を付与された及び／又
はα−アミノ−ｎ−酪酸耐性が高められたブレビ
バクテリウム属に属する微生物を好気的に培養し
て得られる培養物若しくはその処理物を用いるＬ
−リンゴ酸が高い収率で製造することが可能とな
つた。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ α−アミノ−ｎ−酪酸耐性を有するブレビバ
   クテリウム・フラバムを好気的に培養して得られ
   る培養物若しくはその処理物の存在下フマール酸
   またはその塩を水溶媒中で酵素反応させてＬ−リ
   ンゴ酸を生成させ、該水溶液よりＬ−リンゴ酸を
   採取することを特徴とするＬ−リンゴ酸の製造
   法。