JPH0536031B2 - - Google Patents
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- JPH0536031B2 JPH0536031B2 JP59041205A JP4120584A JPH0536031B2 JP H0536031 B2 JPH0536031 B2 JP H0536031B2 JP 59041205 A JP59041205 A JP 59041205A JP 4120584 A JP4120584 A JP 4120584A JP H0536031 B2 JPH0536031 B2 JP H0536031B2
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明はポリペプチドホルモン、ヒト神経成長
因子（NGF）、組換え技術を用いたその調製法、
およびそれを含有する組成物に関する。 本発明の背景 Ａ 神経成長因子 分子量〜130000の多成分系蛋白質がマウスの唾
液腺から分離された。この蛋白質は特に雄マウス
の唾液腺に豊富に存在しており、通常神経成長因
子（Nerve Growth Factor）と呼ばれている。
この蛋白質が演じる主要な神経活性は、感覚レセ
プター（受容体）から脳へインパルスを伝える神
経細胞、感覚ニユーロンの大きさおよび循環系、
腺、平滑筋およびその他の器官の機能的活性を調
節している自律神経系を構成している２種の内の
１つ、交感神経ニユーロンの大きさを増大させる
能力を有する点にある。 マウスの唾液腺から、中性PHで抽出して得られ
るNGFは7S NGFとして知られており、α，β
およびγサブユニツトと呼ばれる３つのサブユニ
ツトで構成されている。7S NGFの全体としての
神経活性は、非共有結合性の力で互いに結合して
いる２個の同一の118アミノ酸ペプチドのダイマ
ーであるβサブユニツトによつてもたらされる。
このサブユニツトは2.5S NGFとも呼ばれる。γ
サブユニツトは生物活性を持つていない。しか
し、このγサブユニツトはアルギニンエステロペ
プチダーゼである。NGFの合成における初期の
遺伝子産物は、γサブユニツトで開裂されるプレ
プロ−NGFポリペプチドである。このγサブユ
ニツトは、マウスに於いて傷の治療を促進させる
ことがわかつた。 最近、第３のNGF成分（分子量〜116000）が
マウスの唾液腺から分離され、プラスミノーゲン
活性化剤としての性質を有することが報告され
た。即ち、この成分はプラスミノーゲンをプラス
ミンに変換するので、血餅の溶解に利用し得るこ
とを示唆している（欧州特許出願78300656.2（公
開番号0002139A1）参照：発明の名称、「神経成
長因子およびその調製法」、出願日、1978年11月
22日、公開、1979年５月30日）。 既述した様に、NGFの神経活性はβサブユニ
ツト（以下、βNGFと言う）によつてもたらされ
る。これは、中枢性アドレナリン作用性ニユーロ
ンの切断された軸索の再生性再発芽を顕著に促進
し、損傷を受けた軸索の修復に有用な性質を持つ
ていることがわかつた。 Ｂ 組換えDNA技術 組換えDNA技術は、一応成熟期に達したと言
える。分子生物学者は、各種のDNA配列をある
程度容易に組換え、形質転換された微生物および
細胞培養株中で多量の外来性蛋白質産物を生産し
得る新しいDNA体をつくることができる。一般
的な手技手法は、各種のDNAの平滑末端あるい
は粘着末端フラグメントをインビトロで結合さ
せ、特定の生物に形質転換するのに有用な強力な
発現ベクターを調製し、所望の外来性産物を効率
的に合成させることである。しかし、産物によつ
ては、それを生産する方法は依然として回りくど
いものであり、常に成功を予見し得る程には、こ
の科学は進歩していない。事実、基礎的な実感に
基づくことなく、成功すると予想する者は、著し
い実施不能の危険をおかしてそうするのである。 主要な要素、即ち複製起源、１種またはそれ以
上の表現型選択特性、発現プロモーター、外来性
遺伝子の挿入および残留ベクターのDNA組換え
は、通常宿主細胞の外で行なう。得られた組換え
複製可能発現ベクターまたはプラスミドを形質転
換によつて細胞に導入し、その形質転換体を増殖
させることによつて多量の組換えビヒクルを得
る。暗号化されているDNA情報の転写および翻
訳を支配している部分に関して適切な位置にこの
遺伝子が挿入された場合は、この得られた発現ベ
クターは、挿入された遺伝子が暗号化しているポ
リペプチド配列を生産するのに有用である。この
過程は発現と呼ばれる。要すれば宿主細胞を溶解
させ、他の蛋白質から分離精製して生産物を回収
することできる。 実際には、組換えDNA技術を使つて全て外来
性のペプチドを発現させることができ（いわゆる
直接発現）、あるいはまた、ホモローガス（同種
の）ポリペプチドのアミノ酸配列の一部と融合し
たヘテロローガス（異種の）ポリペプチドを発現
させることもできる。後者の場合、目的とする生
物活性産物は、細胞外環境で開裂されるまで、融
合したホモローガス／ヘテロローガスポリペプチ
ド内で不活性化されていることがある。 同様に、遺伝および細胞生理を研究するための
細胞培養または組織培養の技術も非常に進歩して
いる。単離した正常細胞から、続々と継代（移
植）して調製した耐久セルラインを保持する手技
手法を使用することができる。研究に使用するに
は、この様なセルラインは液体培地中の固形担体
上に保持するか、あるいは支持栄養物を含んでい
る懸濁中で発育させて保持する。大量生産のため
のスケールアツプには機械的な問題があるだけで
ある。 同様に、生物工学に於いて、蛋白質の生化学は
有用な、実は必要な補助学問である。所望の蛋白
質を生産する細胞は、何百という他の蛋白質、細
胞代謝の内性産物をも生産する。これらの夾雑蛋
白質は、所望の蛋白質から分離しておかないと、
他の化合物と同様、所望の蛋白質による治療過程
でヒトや動物に投与されると毒性を現わすことが
ある。従つて、当面の特定の系に適した分離法を
計画し、所望の用途に使用できる均質な安全な生
産物を得るのに蛋白質生化学の技術が必要となつ
てくる。蛋白質生化学はまた、所望の生産物の同
定に、そしてそれを特定化して、細胞が確実に、
変化したり変異することなく、忠実にそれを生産
したことを確かめるにも必要である。この科学分
野は更に、バイオアツセイや安定性試験を計画し
たり、臨床試験やマーケテイングを行なう前にや
らなければならないその他の手続きにも関係して
いる。 本発明の要約 本発明は、従来、抽出技術や合成によつて、実
質的に純粋な形で単離されたことのないヒト
NGFのβサブユニツトを提供するものである。
本発明者らは、意外にも、融合したホモローガス
蛋白質（自己蛋白質）を含んでいない成熟
（mature）ポリペプチドの形で、β−NGFをE.
coli（大腸菌）でヘテロローガス蛋白質（外来性
蛋白質）として発現させ得ることを見い出した
（これは、外来性蛋白質として認識する細胞酵素
から保護する必要があるかも知れないものであ
る）。本発明者らは、NGFのβサブユニツトは、
E.coli中で成熟蛋白質として直接発現される最も
小さな蛋白質であると信じている。 本発明に係るβ−NGFは、神経障害の治療ま
たはそれに関連するその他の有用な目的に使用す
ることができる。天然に分泌されるヒトβ−
NGFと同じであり、しかも哺乳動物由来の他の
蛋白質を含んでいないので、ヒト以外の動物由来
のペプチドホルモンをヒトの病気の治療に使う場
合と違つて、本発明のβ−NGFが治療中に免疫
原性反応をひき起すということはない。更に、組
織抽出物として得たβ−NGFに附随しており、
それを含む組成物に望ましくない生物活性を示す
哺乳動物起源の他の蛋白質を実質的に含んでいな
いのが本発明のβ−NGFであり、これは外来性
蛋白質として得られるからである。 更に本発明は、このポリペプチドを発現し得る
形で暗号化している遺伝子配列を含んでいる複製
可能なDNA発現ベクターを提供するものである。
更にまた本発明は、この様なベクターで形質転換
された微生物株またはセルラインの様な組換え宿
主細胞、およびそれらの培養物を提供するもので
ある。さらに本発明は、得られたこのポリペプチ
ドを含有している非経口投与用の組成物を提供す
るものである。 従つて、本発明の目的は、他の哺乳動物蛋白質
を実質的に含んでいないヒトβ−NGFを得るこ
とにあり、もう一つの目的は、天然資源から抽出
によつて得ることができる量より多量のヒトβ−
NGFを得ることにある。 図面の説明 第１図はマウスNGFのβサブユニツトのアミ
ノ酸配列、それを暗号化している遺伝子配列、お
よびその遺伝子の特定の断片（セグメント）の相
補DNA鎖を示している。第２図は、β−
NGFmRNAの断片を含んでいるクローンのノー
ザンブロツト分析を示している。第３図は、マウ
スNGF遺伝子の部分的制限地図、および本発明
によつて組み立てられたプラスミドのヌクレオチ
ド配列とマウスNGF遺伝子のヌクレオチド配列
とのおおよその一致を示している。第４図は、組
換えフアージλhN8の物理的地図およびヒトゲノ
ムを囲つている領域を示している。第５図はヒト
βNGF染色体遺伝子のヌクレオチド配列を示して
いる。第６図は、ヒトおよびマウスのプレプロ−
βNGF遺伝子のヌクレオチド配列およびアミノ酸
配列の比較を示している。第７図は、ヒトβNGF
の発現のために組み立てられた遺伝子を示してい
る。第８図は、ヒトβNGFを発現するための、E.
coliを形質転換するためのプラスミド
phNGFtrp1の組み立て工程の一部を示している。 詳細な説明 Ａ 宿主細胞の培養およびベクター DNA配列を、それを発現することのできる他
の配列に有効に結合した場合、そのDNA配列を
発現することができるベクターを発現ベクターと
言う。常にはつきりと記載することはしないが、
この発現ベクターは、エピソームとして、あるい
は染色体DNAの組込み部分として、宿主生物中
で複製できるものでなければならない。言うまで
もなく、複製能を持たないものは有効に使用でき
ない。結局、発現ベクターとは機能的な定義であ
り、この用語は特定の配列に用いられるだけでな
く、その用語には、そこに含まれる特定のDNA
暗号を発現することができる全ゆるDNA配列が
含まれている。一般に、組換えDNA技術で用い
られる発現ベクターはプラスミドの形であること
が多い。このプラスミドは、環状の２本鎖DNA
ループであつて、そのベクターの形では、染色体
に結合していないものを言う。プラスミドは、ベ
クターの最も普通に用いられる形であるので、本
明細書に於いては、プラスミドとベクターを交換
可能な用語として用いる。しかし本発明に於いて
は、同じ機能を有する、当技術分野で知られてい
る、あるいは今後知られ得る他の形の発現ベクタ
ーも含まれると解釈すべきである。 本明細書に於いて組換え宿主細胞とは、組換え
DNA技術を用いて組み立てられたベクターで形
質転換された細胞を意味する。 本明細書に記載した方法およびベクターは、広
範囲の真核性および原核性の生物の宿主細胞に使
用することができる。 勿論、一般的に、本発明に有用なベクターを組
み立てるに際し、DNA配列をクローニングする
のに原核生物が好ましい。特にE.coliK12株294
（ATCCNo.31446）が特に好ましい。使用し得るそ
の他の微生物株として、E.coliB、E.coli X1776
（ATTCNo.31537）などのE.coli株が含まれる。こ
れらは限定する意味で挙げたのではなく、単なる
例示に過ぎないことは言うまでもない。 原核生物は発現にも使用することができる。上
記の菌株の他、E.coli W3110（F-，λ-，原栄養
性、ATTCNo.27325）、Bacillus subtilusの様な大
腸菌類、Salmonella typhmuriumやSerratia
marcesansの様な腸内細菌群および各種のシユー
ドモナス種を使用することができる。 一般に、これらの宿主に関しては、その宿主細
胞と適合し得る種由来のレプリコンおよび調節配
列を含んでいるプラスミドベクターが使用され
る。このベクターはもともと、形質転換細胞に表
現形質（表現型）の選択性を付与することのでき
る標識化配列と共に複製部位を持つている。例え
ば、E.coliは、E.coli種由来のpBR322を使つて形
質転換される（Bolivarら、Gene2：95（1977））。
pBR322はアンピシリンおよびテトラサイクリン
耐性のための遺伝子を含んでおり、従つて、これ
は形質転換細胞を同定するための簡単な手段とな
る。このpBR322プラスミドやその他の微生物プ
ラスミドは、その微生物がそれ自身の蛋白質を発
現するのに使用することのできるプロモーターを
含んでいなければならず、あるいは含む様に改良
されなくてはならない。組換えDNAの組み立て
に通常用いられるプロモーターにはβ−ラクタマ
ーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトースプロモ
ーター系（Changら、Nature275：615（1978）；
Itakuraら、Science198：1056（1977）；Goeddel
ら、Nature281：544（1979））およびトリプトフ
アン（trp）プロモーター系（Goeddelら、
Nucleic Acids Res.8：4057（1980）；EPO Appl
Publ No.0036776）がある。これらが最も普通に
用いられているが、その他の微生物プロモーター
も発見され、使用されており、それらのヌクレオ
チド配列は詳細に発表されているので、当業者で
あれば、それらをプラスミドベクターに機能的に
結合させることができる（Siebenlistら、
Gell20：269（1980））。 原核生物の他、酵母培養株の様な真核性微生物
も使用することができる。Saccharomyces
cerevisiae、普通のパン酵母は、真核微生物中最
もよく使用されるものであるが、その他の多くの
株も使用される。Saccharomyces中で発現させ
るには、例えばプラスミドYRp7（Stinchcomb
ら、Nature282：39（1979）；Kingsmanら、Gene
７：141（1979）；Tschemperら、Gene10：157
（1980））がよく用いられる。このプラスミドは、
トリプトフアンを生産する能力を欠いている酵母
の突然変異株、例えばATTCNo.44076または
PEP4−１（Jones，Genetics85：12（1977））にと
つて選択マーカーとなるtrp1遺伝子をもともと含
んでいる。酵母宿主細胞ゲノムの特徴としての
trp1損傷が存在することは、トリプトフアンの非
存在下に発育させることによつて形質転換体を検
出する有効な環境を提供することになる。 酵母ベクター中の適切な促進（promoting）配
列には、３−ホスホグリセレートキナーゼ
（Hitzemanら、J.Biol.Chem.255：2073（1980））
または他の解糖酵素（Hessら、J.Adv.Enzyme
Reg.7：149（1968）；Hollandら、
Biochemistry17：4900（1978））、例えばエノラー
ゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフエートデヒ
ドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルベートデカ
ルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グル
コース−６−ホスフエートイソメラーゼ、３−ホ
スホグリセレートムターゼ、ピルベートキナー
ゼ、トリオースホスフエートイソメラーゼ、ホス
ホグルコースイソメラーゼおよびグルコキナーゼ
などのプロモーターが含まれる。好適な発現プラ
スミドを組み立てるに際し、これらの遺伝子の終
了（termination）配列もまた、発現ベクターに、
発現しようとする配列の3′に結合させてmRNA
のポリアデニル化および終了を提供する。発育条
件によつてコントロールされる、もう１つの転写
における有利性を持つた他のプロモーターは、ア
ルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクローム
Ｃ、酸性ホスフアターゼ、窒素の代謝に関与する
分解酵素、上記のグリセルアルデヒド−３−ホス
フエートデヒドロゲナーゼ、およびマルトースお
よびガラクトース利用に関与する酵素
（Holland、前記）などのプロモーター領域であ
る。酵母に適合するプロモーター、複製起源およ
び終了配列を含んでいる全てのプラスミドベクタ
ーが適している。 微生物の他、多細胞生物由来の細胞培養も宿主
として使用することができる。原則として、脊椎
動物および無脊椎動物のいずれかの細胞培養も使
用できる。しかし、脊椎動物細胞が最も興味があ
り、脊椎動物細胞の培養増殖（組織培養）が細菌
では常套手段となつて来た（Tissue Culture，
Academic Press，KruseおよびPatterson，
editors（1973））。この様な有用な宿主細胞系の例
は、VEROおよびHeLa細胞、チヤイニーズ・ハ
ムスター卵巣（CHO）細胞系、W138、BHK、
COS−７およびMDCK細胞系などである。この
様な細胞の発現ベクターは、通常、（要すれば）
複製起源、発現しようとする遺伝子の前に位置す
るプロモーター、必要なリボソーム結合部位、
RNA組み継ぎ（スプライス）部位、ポリアデニ
ル化部位、転写終了配列などを含んでいる。本明
細書では、好ましい態様を記載したが、本発明が
その様な例示した配列に限定されるものと解釈し
てはならない。 哺乳動物細胞中で用いるには、発現ベクター上
の調節機能はウイルスから提供されることが多
い。例えば、通常使用されるプロモーターは、ポ
リオーマ、アデノウイルス２から誘導され、シミ
アンウイルス40（SV40）から導かれることが最も
多い。古い、そして新しいSV40ウイルスのプロ
モーターは、共にこのウイルスから、SV40ウイ
ルスの複製起源を含んでいるフラグメトとして簡
単に得られるという理由で特に有用である
（Fiersら、Nature273：113（1978））。Hindサ
イト（部位）からウイルスの複製起源内に存在し
ているBglサイトに至る約250bp配列を含んで
いるならば、それより小さいあるいは大きい
SV40フラグメントも使用することができる。更
に、所望の遺伝子配列と正常通り結合しているプ
ロモーターまたは調節配列を、この様な調節配列
が宿主細胞に適合する限り、使用することがで
き、またそれが好ましいことが多い。 複製起源は、SV40または他のウイルス（例え
ばポリオーマ、アデノ、VSV，BPVなど）が誘
導される様に、外来性の起源を含む様にベクター
を組み立てることにより、あるいは宿主細胞の染
色体の複製機構により提供することができる。こ
のベクターが宿主細胞染色体に組み込まれたら、
後者は十分であることが多い。 Ｂ 使用した方法 強力な細胞壁バリアーのない細胞を宿主細胞と
して使用する場合は、Grahamらの燐酸カルシウ
ム沈澱法（GrahamおよびVan der Eb，
Virology52：546（1978））によつてトランスフエ
クシヨンを行なう。しかし、核注入またはプロト
プラスト融合などの、DNAを細胞に導入する他
の方法も使用することができる。 原核細胞または実質的な細胞壁構造を持つた細
胞を使用する場合、好ましいトランスフエクシヨ
ンの方法は、Cohenらの塩化カルシウムを用いた
カルシウム処理である（Cohen，F.N.ら、Proc.
Natl.Acad.Sci.（USA），69：2110（1972））。 所望の暗号配列および調節配列（control
sequence）を含んでいる好適なベクターを組み
立てるには標準的な結合技術を用いる。分離した
プラスミドまたはDANフラグメントを開裂し、
修復（テイラー）し、所望のプラスミドを形成す
る様に、希望の形に再結合する。 開裂は、適当な緩衝液中、制限酵素で処理する
ことにより行なう。通常、約1μｇのプラスミド
またはDNAフラグメント、約20μの緩衝液、
約１単位の酵素を使用する（特定の制限酵素に対
する適切な緩衝液および基質の量は製造業者が指
定している）。37℃で約１時間インキユベートす
る。インキユベートした後、フエノールおよびク
ロロホルムで抽出して蛋白質を除き、水性分画か
らエタノールで沈澱させて核酸を回収する。 平滑末端が必要な場合は、E.coliDNAポリメ
ラーゼ（Klenow）10単位で、15℃で15分間処
理し、フエノール−クロロホルム抽出し、エタノ
ール沈澱に付す。 開裂したフラグメントの大きさによる分離は、
Goddelらの方法（Goeddel，Ｄら、Nucleic
Acids Res.8：4057（1980））に従い、６％ポリア
クリルアミドゲルを使つて行なう。 結合（ライゲーシヨン）には、正しく符号する
様に末端を適当に修復したほぼ等モル量の所望の
成分を、DAN0.5μｇ当たり約10単位のT4DNA
リガーゼを用いて処理する（開裂したベクターを
成分として用いる場合は、細菌性アルカリ性ホス
フアターゼで予め処理して開裂したベクターの再
結合を防ぐのがよい）。 ライゲーシヨン混合物を使つてE.coliK12株294
（ATLC31446）を形質転換し、成功した形質転換
体をアンピシリン耐性について選択する。形質転
換体からプラスミドを調製し、Messingらの方法
（Messingら、Nucleic Acids Res.9：309（1981））
またはMaxamらの方法（Maxamら、Methods
in Eezymology65：499（1980））に従つて、制限
酵素分析し、そして／または配列を決定する。 Ｃ 好ましい実施態様 以下に、E.coli中でポリペプチドを発現させる
好ましい態様について記載するが、これは本発明
を例示するものであつて、本発明がこれに限定さ
れるものと解釈してはならない。 C.1 マウスのプローβNGFを暗号化している
cDNAクローンの分離 ヒトNGFのβサブユニツトを暗号化している
遺伝子を得るために、ハイブリダイゼーシヨン・
ブローブとして、マウスのβNGFを暗号化してい
るクローンされたcDNAを用いることにした。 cDNAクローニング・アプローチには、合成オ
リゴヌクレオチドプライマーを使用して、第１図
に示したマウスのβNGFサブユニツトの既知のア
ミノ酸配列を利用した：雄および雌のマウスの唾
液腺に存在するNGFレベルの違いを、同定のも
う１つの手段として用いた。マウスのβNGFアミ
ノ酸配列の３つの小さな部分を選び、それらを暗
号化している全ての可能性のある配列に相補的な
オリゴヌクレオチド・プールをCrea等の方法
（Nucleic Acids Res.，８：2331（1980））で合成
した。この暗号鎖および相補鎖のヌクレオチド配
列を第１図に示す。 合成オリゴヌクレオチドをハイブリダイゼーシ
ヨン・プローブとして用いて、マウス
βNGFcDNAクローンを、雄マウス唾液腺からの
オリゴdT−プライム化cDNAバンクから分離同
定する試みは失敗した。この結果は、βNGFは雄
マウス唾液腺蛋白質の0.1％を占めているが、そ
のmRNAは同じ様に豊富ではないことを示して
いる。従つて、まずβNGF特異ヌクレオチド配列
を豊富にするために、この蛋白質のカルボキシ末
端に近接した配列を表わしているプライマー・プ
ールを使つて、雄の唾液腺からのポリＡ−含有
（Ａ＋）RNAの逆転写を特異的にプライムした。
長さ200bp以上のcDNA分子を、よく知られたプ
ラスミドpBR322にクローンした。cDNAのプラ
イミングにハイブリダイゼーシヨン・プローブと
して最初に使つた5′−32p−標識NGFプライマ
ー・プールを使つて、全部で10000個のクローン
をスクリーニングした結果、その内0.8％が、非
常に厳重なハイブリダイゼーシヨン条件下で陽性
信号を与えた。残りの99.2％の「プライム化」さ
れたcDNAバンクは、ポリA+MSG RNAの調製
中に溶離した痕跡量のオリゴdTによるプライミ
ングおよび自己プライミングにより生じたと思わ
れる。クローニング操作の際のS1ヌクレアーゼ
処理が末端プライマー配列を傷付け、従つて検出
された陽性クローンが少なかつたのかも知れな
い。 この最初のスクリーニングで陽性となつたクロ
ーンを、ハイブリダイゼーシヨン・プローブとし
て、第１図に示したオリゴヌクレオチドプール１
より上流のDNA配列から誘導した放射線標識化
プライマー・プール２および３を使つてスクリー
ニングした。更に雄または雌マウスの唾液腺のい
ずれかからのポリA+RNAから、プール１でプラ
イム化した32p−cDNAを二重フイルター上のプ
ローブとして用いた。再びpBR322中、オリゴヌ
クレオチド・プール２および３とハイブリツドを
形成した全部で10個の雄−特異的クローンを同定
した。制限酵素分析の結果、10個は全て共通の
HaeおよびHinfフラグメントを持つている
ことがわかつた。本発明者らがpmβN−9G1と名
付けた、最も長いDNA挿入体（〜700bp）を発
現するプラスミドを含んでいるクローンの全配列
を決定した。このヌクレオチド配列から推定され
るアミノ酸配列は、NH2−末端プロ−配列に加
えて、１つの翻訳フレーム中に期待するNGF配
列を含んでいた（第４図参照）。マウスの
NGFcDNA配列を含んでいる細菌クローンの組
み立ておよび同定について、以降に詳述する。 完全なNGFmRNAの大きさを決定するため
に、ノーザン・ブロツト・ハイブリダイゼーシヨ
ンおよびプライマー・エクステンシヨン分析法を
用いた。NGFおよびプロペプチド配列を含んで
いる長さ470bpの32p−標識DNAフラグメント
（Rea−Res789，第３図参照）を、雄マウス
唾液腺に特異な長さ約1300ヌクレオチドのRNA
種と雑種形成させた。２つの短い、２本鎖の、
5′末端−標識化制限フラグメトを用いたプライマ
ー・エクステンシヨン実験（第３図の説明参照）
により、βNGFmRNAの5′末端は、本発明者らの
クローンの3′末端から下流の約370塩基を残して、
pmβN−9G1cDNAフラグメントの5′末端から上
流に約230塩基の所に位置づけられた。欠失5′配
列の〜30ヌクレオチドを除く全てが、本発明者ら
がpmβN−16F7およびpmβN−21B5と名付けた
クローンに含まれており、これらは、第３図に示
す様に、互いに、そしてクローンpmβN−9G1と
重複している。これらは、cDNA合成をプライム
するため、制限フラグメントの使用についてのよ
り詳細な以下に記載の方法で分離する。 プライマー配列の3′末端から下流へ3′ポリＡ配
列までの配列を含んでいるクローン化したcDNA
を得るために、プレパラテイブ尿素アガロースゲ
ル上で、全ポリA+雄マウス唾液腺RNAを分画す
ることにより、βNGFmRNAを豊富化した。最
も大きいサイズのフラクシヨン、βNGFcDNAプ
ローブとハイブリダイズ（雑種形成）する配列を
含むフラクシヨンを、オリゴdT−プライム化
cDNA合成およびクローニングに使用した。3700
のクローンをスクリーニングした結果、４つの腸
性ハイブリダイゼーシヨンシグナルが得られた。
本発明者がpmβN−12E4と名付けたクローンの
ヌクレオチド配列分析、および3′暗号化および非
翻訳配列に239ヌクレオチドを添加したpmβN−
8B3oオリゴdTプライム化であるが、本発明者ら
のクローンはいずれも、第２のDNA鎖の不完全
な合成または広範なS1ヌクレアーゼ処理のため
に、βNGFmRNAの全3′非翻訳領域を含んでいな
かつた。ノーザン ブロツト分析により、ポリＡ
配列は本発明者らがクローンした配列から離れて
いないことがわかつた（第２図参照）。豊富化し
たmRNAからのオリゴdTプライム化cDNAクロ
ーンの調製について以下に詳述する。 C.2 ヒト染色体βNGF遺伝子の分離および特性
化 ヒト遺伝子ライブラリー（λCharon4Aベクタ
ーに挿入された、15−20kbの、部分的Hae／
Aluヒト胎児肝臓DNAフラグメントからなる）
を、放射活性ハイブリダイゼーシヨン・プローブ
として、既述した470bpマウスNGFクローン化
cDNAフラグメント（pmβN−9G1RsaIフラグメ
ント）を用いてスクリーニングした。全部で27組
み換えフアージをプラーク純化し、EcoRI消化に
より部分的に特性化した：27個のフアージは６つ
の異なるタイプの制限パターンを示した。各パタ
ーン種は、制限フラグメントを共有しており、従
つて同じゲノム領域を重複していると思われる。
γhβN8と名づけたフアージの特性を、物理的マ
ツピングおよびヌクレオチド配列決定により調べ
た。第４図は、フアージ・マツピング、配列決定
およびゲノム・サザーン・ブロツテイング実験に
よつて得た、クローンγhβN8の物理的地図およ
びヒトゲノム中のその配列を画している領域を示
している。サブクローンした、重複している
EcoRIおよびHindフラグメントから誘導され
た12000bpのヌクレオチド配列の部分を第５図に
示す。 C.3 マウスβNGFcDNAとヒトβNGF遺伝子の
配列の比較 マウスのβNGFcDNA配列は、成熟βNGFを暗
号化する可能性を持つた解読わくを含有してお
り、予想されたアミノ酸配列は、マウスβNGFの
既知の配列に相当している（Angeletti等、
Biochemistry，12：90（1973）および12：100
（1973））。意外にも、このcDNA配列は、マウス
βNGFの報告されている配列の末端に結合した、
Ｃ−末端、アルギニン−グリシンジペプチド延長
部を予測している。 ヒトβNGF遺伝子は、成熟マウスβNGFアミノ
酸配列と約90％が相同（ホモローガス）なアミノ
酸配列を予測している領域を含んでおり、従つて
これは、ヒトβNGFの遺伝子のための遺伝子でな
ければならない。ヒトβNGF蛋白質もまた、Ｃ−
末端ジペプチド延長部を持つている。 ヒトとマウスのβNGF配列を並べると（第６
図）、成熟マウス蛋白質の既知の配列からかなり
の遠くの上流まで広範な相同性が延びていること
がわかる。22000ダルトンの生合成プロ−βNGF
プリカーサー（前駆体）の存在が証明されており
（BergerおよびShooter，Proc.Nat.Acad.Sci.
（USA），74：3647，（1977））、これは成熟蛋白質
からヌクレオチド位置419および420（第６図参照）
の潜在的なアルギニン−アルギニン開裂部位にま
で延びているかもしれない。このヌクレオチド配
列で予測される前駆体は、既に以前に検出された
ものより長い：後述する様に、全プレプロ−β−
NGF配列は分子量27000と予測され、プロー配列
は25000ダルトンと予測され、特異なアルギニン
残基対が存在することを考えると、21500および
18000ダルトンのプロセツシング中間体が細胞内
に存在する。 C.4 開始メチオニンコドンおよび信号配列の位
置づけ 蛋白質合成開始コドンであると指定するための
候補として３つのメチオニン残基が挙げられる
（第６図のアミノ酸−187、−121および−119）。し
かし、いくつかの要因から、本発明者らの配列の
−121アミノ酸が実際の開始コドンとして使われ
ていることを強く暗示している。βNGFは分泌さ
れた蛋白質であるので、開始コドンの後には、こ
のポリペプチドを小胞体の内腔へと共同翻訳転移
させる信号配列が続いていると考えられる。アミ
ノ酸−121から−104は、優れた信号配列の候補で
ある。これらの18個のアミノ酸は正しい長さであ
り、一続きの６個の完全に疎水性のアミノ酸
（ala−phe−leu−ile−gly−val）を含んでいる。
信号ペプチダーゼによる開裂は、小さいアミノ酸
であるala−104と、−103位のglu残基の間で起り
得る。プレーアルフア・ラクトアルブミンの場
合、信号ペプチダーゼは同一のgln−ala配列
（後）を開裂させ、同一のＮ−末端glu残基を残す
ことが知られている。−187位のmet残基に続く一
連のアミノ酸は、極性および荷電アミノ酸を高率
で含んでおり、これまで報告されている信号配列
のいずれにも似ていない。 従つて、−121のメチオニンがヒトおよびマウス
のプレプロ−βNGFの翻訳開始に使われる可能性
が最も高く、この場合27000ダルトンのプレプロ
ホルモンが生成する。もし信号ペプチドプロセツ
シングが残基−104で起つたら、25000ダルトンの
プロ−βNGFが生成するであろう。 C.5 E.coli中でのヒトβNGFの直接発現 λhβN8からのEcoRフラグメントをpBR322
でサブクローンした。本発明者らがphβN8−B9
と命名したサブクローンプラスミドは、ヒト
βNGFサブユニツトを暗号化している配列の大部
分を含んでいる2kbヒトDNA挿入体を含有して
いた。配列決定の結果、10個のNH2−末端アミ
ノ酸だけがこの配列から除かれていることがわか
つた。βNGF暗号配列をE.coliで発現させるため
の本発明者らの方法は、phβN8−B9のβNGF暗
号部分から最も大きい可能なフラグメントを切り
取り、次いで欠失コドンを満たし、その配列の
5′および3′末端を、E.coli発現プラスミドに挿入
するのに適する様に修飾することであつた。使用
した発現系は、米国特許出願第307473号（1981年
10月１日出願）に記載されているTrpプロモータ
ー系であり、これは、M.Mateucciの配列変換と
共に、各種の遺伝子について以前から用いられて
来たものである。 プラスミドphβN8−B9をEcoRIおよびHgiAI
で消化し、〜300bpフラグメントを消化混合物か
ら分離した。このフラグメントを第７図に示す。
２工程の消化により生じる粘着末端も示してあ
る。発現のためのヒトβNGF配列の5′末端を組み
立てるために、10個の欠失アミノ酸のためのコド
ン、開始メチオニンコドン（ATG）、およびリボ
ソーム結合サイトの一部であり、制限エンドヌク
レアーゼXbaIの開裂サイトを含んでいる、該
ATGに先行するヌクレオチド群を付加した。こ
の目的の為に４つのオリゴヌクレオチドを化学的
に合成した。これらをオリゴヌクレオチド−
として第７図に示す。 βNGF暗号領域の3′末端は以下の如く修正し
た：第７図に示した１個のHgiAI部位（成熟ヒト
βNGFの111位（Val）と112位（Leu）のアミノ
酸）から下流の両DNA鎖のヌクレオチド配列を、
Arg118およびSalI粘着末端に続く終止コドン
（TAG）を含む様に化学的に合成した。これらの
オリゴヌクレオチドは第７図のフラグメントお
よびである。 合成オリゴヌクレオチド１−をT4ポリヌク
レオチドキナーゼおよびγ−32p−ATPで放射活
性標識し、その放射活性オリゴヌクレオチドを、
T4DNAリガーゼ緩衝液中、〜300bphβNGF
DNAフラグメトと混合した。10単位のT4DNA
リガーゼを用い、12℃で12時間ライゲーシヨン
（結合）した。この混合物をフエノール抽出し、
DNAを70％エタノール中で沈殿させた。沈殿を
乾燥し、制限エンドヌクレアーゼ緩衝液に溶解
し、酵素XbaIおよびSaIIを添加し、２時間消化
した。 DNA混合物のプレパラテイブゲル電気泳動お
よびオートラジオグラフイーにより、放射活性の
ある二重体（ダブレツト）が〜370bpに存在する
ことがわかつた。溶離したDNAフラグメントを、
XbaIおよびSaIIで消化した後細菌性アルカリホ
スフアターゼで処理したpHGH207−１と命名さ
れたHGH−Trp発現プラスミドに結合させた
（T4DNAリガーゼ）。このアルカリホスフアター
ゼ処理は、HGHフラグメントがTrp発現ベクタ
ーに再挿入されるのを防ぐ為に行なつた。このラ
イゲーシヨン混合物を使つてE.coliK12／294を形
質転換した。寒天平板上、アンピシリン耐性でテ
トラサイクリン感受性のコロニーを選択した：
200のコロニーを、放射活性の300bpEcoRI／
HgiAIプローブとのハイブリダイゼーシヨンによ
り、ヒトβNGF配列の存在についてスクリーニン
グした。12個の陽性コロニーを、ウエスタン・ブ
ロツト上、ウサギの抗マウスβNGF抗体を使つ
て、その細胞抽出物中に免疫反応性βNGF分子が
存在するかどうかについて分析した。１個を除く
全てのクローンが、陰性の対照抽出物と比較し
て、期待される分子量の陽性信号を示した。これ
らのクローンの１個のDNA配列を分析した結果、
本発明者らによつてPhβNGFtrp1と命名された、
ヒトβNGFを発現した最終的なプラスミドが、当
初に計画した構造を持つていることが証明され
た。 プラスミドPhβN8−B9のEcoRIおよびHgiAI
による消化からプラスミドPhβNGFtrp1の組み立
てに至る一連の操作を第８図に示した。プラスミ
ドPHGH207−１は、上記出願番号第307473号に
記載されているプラスミドPHGH207をBamHI
で消化し、次いでEcoRIで部分消化することによ
り得られた。trpプロモーターを含んでいる最も
大きいフラグメントを分離した。pBr322から最
も大きいEcoRI−BamHIフラグメントを分離し、
この２つのフラグメントを結合させ、E.
coliK12／194の形質転換に使用した。アンピシ
リンおよびテトラサイクリンの両者に耐性のある
クローンがPHGH207−１を含んでいた。 C.6 mNGFcDNA配列を含んでいる細菌クロー
ンの組み立ておよび同定 各（14塩基の）８つのプライマーのプール２種
を化学的に合成した。各プライマーは、アミノ酸
93−96および97の１部のための潜在的mRNA配
列と相補的である。ポリ（A+）RNAで特異的に
cDNAの合成をプライムするのに16オリゴヌクレ
オチドの混合物を用いた。100ミリモル（ｍモル）
のKC150μ中、８プライマーの各プール200ピ
コモル（ｐモル）（1μｇ）（総計440pモル、2μｇ）
を、ポリ（A+）RNA40μｇと、90℃、68℃、42
℃および37℃で４分間づつインキユベートするこ
とにより、アニーリングした。32p−標識cDNA
を、50mMトリス（PH8.3）、10mM MgCl2、
10mM DTT、50mM KClの反応（系）100μ
中で合成した。この反応系はアニーリングした混
合物の他に、500μMのdATP、TTP、dGTP、
100μMのdCTP、20μCiの〔γ−32p〕dCTP
（2000Ci／ｍモル、Amersham）、0.5単位／μ
のRNAsinおよび90単位の逆転写酵素を含んでい
た。最初の鎖の合成は37℃で60分間であつた。反
応系を３分間煮沸し、１分間氷でクエンチング
し、マイクロフユージ中で回転させた。上澄を同
容量のddH2Ｏで希釈し、Klenow PolI15単位を
加え、12℃で18時間、de cDNAを合成した。フ
エノール／クロロホルム抽出し、エタノール沈殿
を行なつた後、標品を150μ中のS1ヌクレアー
ゼ103単位を用いて37℃で１時間消化した。フエ
ノール／クロロホルム抽出およびエタノール沈殿
の後、５％ポリアクリルアミドゲル上の電気泳動
によりcDNAを分画した。２つのサイズ範囲の
cDNAを電気溶離した。長さ〜550bp（上）は
132ngm回収され、長さ200〜550bp（下）は
182ngm回収された。全量20ngmの各フラクシヨ
ンの3′−末端を、末端ヌクレオチジル・トランス
フエラーゼを用いて20−40d(c)残基で延長させ
た。このｄ(c)−尾部形成cDNAを、同様にPstI部
位でｄ（Ｇ）残基を用いて延長させたpBR322
（150ngm）とアニーリングした。アニーリングは
50μの100mM NaCl、10mM トリス（PH
7.5）、250mM EDTA中で行なつた。混合物を70
℃に加熱し、徐々に37℃に冷却し（16時間）、次
いで４℃に冷却した（６時間）。アニーリング混
合物の半分を使つてE.coliK−12株294を形質転換
した。各サイズフラクシヨン（上と下）からの
500コロニーをフイルター・ハイブリダイゼーシ
ヨンによりスクリーニングした。32p−標識プロ
ーブは16プライマーの混合物（全1μｇ）から、
公表されている方法により、ポリヌクレオチドキ
ナーゼ（Ｐ−LBiochmicals）および200μCiの
〔γ−32p〕ATP（5000Ci／ｍモル、Amersham）
を用いた燐酸化により調製した。10000のクロー
ンを含んでいるフイルターを、プライマー・ハイ
ブリダイゼーシヨン・ミツクス（100mMトリス
PH7.5、0.9MNaCl、6mMEDTA、1XDennardt′s
溶液、100μMrATP、1mMNaH2PO4−Naピロ
ホスフエート、0.5％NonidetP−40、0.1mg／ml酵
母RNA（SigmaR−6750））中、〜１×108cpmの
32p−標識プローブと、室温で18時間ハイブリツ
ド形成させた。フイルターを、42℃で６×ssc中
で30分間（３回）洗浄し、強化スクリーン
（Dupont）を用いて−70℃で16時間、Ｘ線フイル
ムに感光させた。約0.7−0.9％（上370、下460）
のコロニーを選択し、もとのプライミング部位に
対して5′である２つの追加の合成プライマーによ
る２回目のスクリーニングにかけた。アミノ酸74
−77のための全ての潜在的mRNA配列に相補的
な12量体を各４プライマーの２プールに合成し
た。各々８個の14量体２プール（アミノ酸52−58
および56の一部のための潜在的mRNA配列に相
補的）を同様にして合成した。第１回のスクリー
ニングで選択した「上」および「下」のコロニー
から、３セツトの同一のフイルターを作成した。
４つの合成オリゴヌクレオチドから、既述した様
にして32p−標識プローブを作成した。プライマ
ー・ハイブリダイゼーシヨン・ミツクス中、フイ
ルターを0.5×108cpmとハイブリツド形成させ、
洗浄し、Ｘ線フイルムに感光させた。5′オリゴヌ
クレオチド全てとハイブリツド形成を行なつた９
つの陽性群（下から３つ、上から６つ）がみつか
つた。ミニスクリーン手法でプラスミドDNAを
分離し、最も大きい挿入体を持つたクローンを制
限分析により決定した。pmβN−9G1と名付けた
プラスミドの塩基配列を、Maxam−Gilbert法に
よつて完全に決定した。このcDNA挿入体は、14
塩基のプライマー配列（第１図、プール１）およ
び全量716bpを含んでいた。 C.7 βNGFメツセージに富むmRNAから調製さ
れたオリゴdT−プライム化cDNAクローン 0.025Mのクエン酸ナトリウム（PH3.8）中の２
％アガロースおよび6M尿素からなる変性アガロ
ースゲルにより、電気泳動によつて200μｇのポ
リ（A+）RNAを分画した。リボソームバン
（帯）は、垂直のスライスをエチジウムブロマイ
ドで染色することにより肉眼観察し得る様にし
た。ゲルを0.5cmのスライスに切断し、70℃で融
解し、フエノールで２回、クロロホルムで１回、
強力に抽出した。２回のエタノール沈殿の後、そ
のペレツトをddH2O30μに溶解した。各フラク
シヨン（4M酢酸アンモニウム5μ（PH7.0）中）
1μを乾燥ニトロセルロースフイルターにスポ
ツトし、厳重な条件下でドツト・ハイブリダイゼ
ーシヨンによりスクリーニングした。Klenow
Pol1反応系中、プライマーとして牛胸腺DNAフ
ラグメントを用いて既知の方法により、32p−標
識プローブをpmβN−9G1挿入体から調製した。
このフイルターを、50mMNaPO4（PH7.0）、５×
Dennart′s溶液、５×sec、50μｇ／mlの超音波処
理したニシン精子DNA、100μMのrATP、
1mMNaH2PO4−ナトリウムピロホスフエート、
および50％ホルムアミド中、42℃で18時間、〜
107cpmとハイブリツド形成させた。このフイル
ターを0.2×sec−0.1％SDS中、42℃で20分間洗浄
し（３回）、フイルムに感光させた。ハイブリダ
イゼーシヨンの結果、NGFメツセージはフラク
シヨン11および12にあることがわかつた。フラク
シヨン11および12のそれぞれ10μを用い、標準
的な方法でオリゴdT−プライム化cDNAを調製
した。５％ポリアクリルアミドゲル上の電気泳動
の後、ゲルスライスから600bpより長いcDNAを
溶離した。フラクシヨン11から約40ngmの
cDNA、およびフラクシヨン12からの20ngmをｄ
(C)−尾部形成し、ｄ（Ｇ）−尾部形成したpBR322
とアニーリングした。フラクシヨン11から約3300
クローン、フラクシヨン12からの1500クローン
を、pmβN−9G1からの32p−標識内部Hpaフ
ラグメント（216bp）を使つて、厳重な条件下の
フイルターハイブリダイゼーシヨンにより、コロ
ニーとしてスクリーニングした。フイルターを42
℃で18時間、50×106cpmとハイブリツド形成さ
せ、洗浄し、既述した様にＸ線フイルムに感光さ
せた。フラクシヨン12からの５つのクローンがこ
のプローブについて陽性であつた。制限分析によ
り、それらは同胞であることがわかつた。pmβN
−12E4を、Maxam−Gilbert法により完全に塩
基配列決定した。フラクシヨン11からの２つのク
ローンが陽性であつた。最大のpmβN−8B3の塩
基配列をMaxam−Gilbert法により完全に決定し
た。 C.8 医薬組成物 本発明に係るヒトのβ−NGFは、このβ−
NGFを適当な担体と混合して、既知の方法で、
有用な医薬組成物に製剤化することができる。好
適な担体、および他のヒトの蛋白質、例えばヒト
の血清アルブミンを含んでいてもよい製剤の調製
法は、例えばRemingtonのPharmacentical
Sciences（E.W.Martinによる）に記載されてい
る。この様な医薬組成物は、本発明の蛋白質の有
効量を適当な量の担体と共に含んでおり、患者に
非経口投与することができる。 このヒトβ−NGFは、神経障害またはその他
の、この物質が治療効果を発揮し得る疾患にかか
つている患者に非経口投与することができる。投
与量および投与割合は、例えばマウスの唾液腺か
ら得られる同様の製剤の臨床実験に現在使用され
ているものと同じである。 以上の記載は本発明の好ましい態様を述べたも
のであり、本発明がこれに限定されると解釈して
はならない。
因子（NGF）、組換え技術を用いたその調製法、
およびそれを含有する組成物に関する。 本発明の背景 Ａ 神経成長因子 分子量〜130000の多成分系蛋白質がマウスの唾
液腺から分離された。この蛋白質は特に雄マウス
の唾液腺に豊富に存在しており、通常神経成長因
子（Nerve Growth Factor）と呼ばれている。
この蛋白質が演じる主要な神経活性は、感覚レセ
プター（受容体）から脳へインパルスを伝える神
経細胞、感覚ニユーロンの大きさおよび循環系、
腺、平滑筋およびその他の器官の機能的活性を調
節している自律神経系を構成している２種の内の
１つ、交感神経ニユーロンの大きさを増大させる
能力を有する点にある。 マウスの唾液腺から、中性PHで抽出して得られ
るNGFは7S NGFとして知られており、α，β
およびγサブユニツトと呼ばれる３つのサブユニ
ツトで構成されている。7S NGFの全体としての
神経活性は、非共有結合性の力で互いに結合して
いる２個の同一の118アミノ酸ペプチドのダイマ
ーであるβサブユニツトによつてもたらされる。
このサブユニツトは2.5S NGFとも呼ばれる。γ
サブユニツトは生物活性を持つていない。しか
し、このγサブユニツトはアルギニンエステロペ
プチダーゼである。NGFの合成における初期の
遺伝子産物は、γサブユニツトで開裂されるプレ
プロ−NGFポリペプチドである。このγサブユ
ニツトは、マウスに於いて傷の治療を促進させる
ことがわかつた。 最近、第３のNGF成分（分子量〜116000）が
マウスの唾液腺から分離され、プラスミノーゲン
活性化剤としての性質を有することが報告され
た。即ち、この成分はプラスミノーゲンをプラス
ミンに変換するので、血餅の溶解に利用し得るこ
とを示唆している（欧州特許出願78300656.2（公
開番号0002139A1）参照：発明の名称、「神経成
長因子およびその調製法」、出願日、1978年11月
22日、公開、1979年５月30日）。 既述した様に、NGFの神経活性はβサブユニ
ツト（以下、βNGFと言う）によつてもたらされ
る。これは、中枢性アドレナリン作用性ニユーロ
ンの切断された軸索の再生性再発芽を顕著に促進
し、損傷を受けた軸索の修復に有用な性質を持つ
ていることがわかつた。 Ｂ 組換えDNA技術 組換えDNA技術は、一応成熟期に達したと言
える。分子生物学者は、各種のDNA配列をある
程度容易に組換え、形質転換された微生物および
細胞培養株中で多量の外来性蛋白質産物を生産し
得る新しいDNA体をつくることができる。一般
的な手技手法は、各種のDNAの平滑末端あるい
は粘着末端フラグメントをインビトロで結合さ
せ、特定の生物に形質転換するのに有用な強力な
発現ベクターを調製し、所望の外来性産物を効率
的に合成させることである。しかし、産物によつ
ては、それを生産する方法は依然として回りくど
いものであり、常に成功を予見し得る程には、こ
の科学は進歩していない。事実、基礎的な実感に
基づくことなく、成功すると予想する者は、著し
い実施不能の危険をおかしてそうするのである。 主要な要素、即ち複製起源、１種またはそれ以
上の表現型選択特性、発現プロモーター、外来性
遺伝子の挿入および残留ベクターのDNA組換え
は、通常宿主細胞の外で行なう。得られた組換え
複製可能発現ベクターまたはプラスミドを形質転
換によつて細胞に導入し、その形質転換体を増殖
させることによつて多量の組換えビヒクルを得
る。暗号化されているDNA情報の転写および翻
訳を支配している部分に関して適切な位置にこの
遺伝子が挿入された場合は、この得られた発現ベ
クターは、挿入された遺伝子が暗号化しているポ
リペプチド配列を生産するのに有用である。この
過程は発現と呼ばれる。要すれば宿主細胞を溶解
させ、他の蛋白質から分離精製して生産物を回収
することできる。 実際には、組換えDNA技術を使つて全て外来
性のペプチドを発現させることができ（いわゆる
直接発現）、あるいはまた、ホモローガス（同種
の）ポリペプチドのアミノ酸配列の一部と融合し
たヘテロローガス（異種の）ポリペプチドを発現
させることもできる。後者の場合、目的とする生
物活性産物は、細胞外環境で開裂されるまで、融
合したホモローガス／ヘテロローガスポリペプチ
ド内で不活性化されていることがある。 同様に、遺伝および細胞生理を研究するための
細胞培養または組織培養の技術も非常に進歩して
いる。単離した正常細胞から、続々と継代（移
植）して調製した耐久セルラインを保持する手技
手法を使用することができる。研究に使用するに
は、この様なセルラインは液体培地中の固形担体
上に保持するか、あるいは支持栄養物を含んでい
る懸濁中で発育させて保持する。大量生産のため
のスケールアツプには機械的な問題があるだけで
ある。 同様に、生物工学に於いて、蛋白質の生化学は
有用な、実は必要な補助学問である。所望の蛋白
質を生産する細胞は、何百という他の蛋白質、細
胞代謝の内性産物をも生産する。これらの夾雑蛋
白質は、所望の蛋白質から分離しておかないと、
他の化合物と同様、所望の蛋白質による治療過程
でヒトや動物に投与されると毒性を現わすことが
ある。従つて、当面の特定の系に適した分離法を
計画し、所望の用途に使用できる均質な安全な生
産物を得るのに蛋白質生化学の技術が必要となつ
てくる。蛋白質生化学はまた、所望の生産物の同
定に、そしてそれを特定化して、細胞が確実に、
変化したり変異することなく、忠実にそれを生産
したことを確かめるにも必要である。この科学分
野は更に、バイオアツセイや安定性試験を計画し
たり、臨床試験やマーケテイングを行なう前にや
らなければならないその他の手続きにも関係して
いる。 本発明の要約 本発明は、従来、抽出技術や合成によつて、実
質的に純粋な形で単離されたことのないヒト
NGFのβサブユニツトを提供するものである。
本発明者らは、意外にも、融合したホモローガス
蛋白質（自己蛋白質）を含んでいない成熟
（mature）ポリペプチドの形で、β−NGFをE.
coli（大腸菌）でヘテロローガス蛋白質（外来性
蛋白質）として発現させ得ることを見い出した
（これは、外来性蛋白質として認識する細胞酵素
から保護する必要があるかも知れないものであ
る）。本発明者らは、NGFのβサブユニツトは、
E.coli中で成熟蛋白質として直接発現される最も
小さな蛋白質であると信じている。 本発明に係るβ−NGFは、神経障害の治療ま
たはそれに関連するその他の有用な目的に使用す
ることができる。天然に分泌されるヒトβ−
NGFと同じであり、しかも哺乳動物由来の他の
蛋白質を含んでいないので、ヒト以外の動物由来
のペプチドホルモンをヒトの病気の治療に使う場
合と違つて、本発明のβ−NGFが治療中に免疫
原性反応をひき起すということはない。更に、組
織抽出物として得たβ−NGFに附随しており、
それを含む組成物に望ましくない生物活性を示す
哺乳動物起源の他の蛋白質を実質的に含んでいな
いのが本発明のβ−NGFであり、これは外来性
蛋白質として得られるからである。 更に本発明は、このポリペプチドを発現し得る
形で暗号化している遺伝子配列を含んでいる複製
可能なDNA発現ベクターを提供するものである。
更にまた本発明は、この様なベクターで形質転換
された微生物株またはセルラインの様な組換え宿
主細胞、およびそれらの培養物を提供するもので
ある。さらに本発明は、得られたこのポリペプチ
ドを含有している非経口投与用の組成物を提供す
るものである。 従つて、本発明の目的は、他の哺乳動物蛋白質
を実質的に含んでいないヒトβ−NGFを得るこ
とにあり、もう一つの目的は、天然資源から抽出
によつて得ることができる量より多量のヒトβ−
NGFを得ることにある。 図面の説明 第１図はマウスNGFのβサブユニツトのアミ
ノ酸配列、それを暗号化している遺伝子配列、お
よびその遺伝子の特定の断片（セグメント）の相
補DNA鎖を示している。第２図は、β−
NGFmRNAの断片を含んでいるクローンのノー
ザンブロツト分析を示している。第３図は、マウ
スNGF遺伝子の部分的制限地図、および本発明
によつて組み立てられたプラスミドのヌクレオチ
ド配列とマウスNGF遺伝子のヌクレオチド配列
とのおおよその一致を示している。第４図は、組
換えフアージλhN8の物理的地図およびヒトゲノ
ムを囲つている領域を示している。第５図はヒト
βNGF染色体遺伝子のヌクレオチド配列を示して
いる。第６図は、ヒトおよびマウスのプレプロ−
βNGF遺伝子のヌクレオチド配列およびアミノ酸
配列の比較を示している。第７図は、ヒトβNGF
の発現のために組み立てられた遺伝子を示してい
る。第８図は、ヒトβNGFを発現するための、E.
coliを形質転換するためのプラスミド
phNGFtrp1の組み立て工程の一部を示している。 詳細な説明 Ａ 宿主細胞の培養およびベクター DNA配列を、それを発現することのできる他
の配列に有効に結合した場合、そのDNA配列を
発現することができるベクターを発現ベクターと
言う。常にはつきりと記載することはしないが、
この発現ベクターは、エピソームとして、あるい
は染色体DNAの組込み部分として、宿主生物中
で複製できるものでなければならない。言うまで
もなく、複製能を持たないものは有効に使用でき
ない。結局、発現ベクターとは機能的な定義であ
り、この用語は特定の配列に用いられるだけでな
く、その用語には、そこに含まれる特定のDNA
暗号を発現することができる全ゆるDNA配列が
含まれている。一般に、組換えDNA技術で用い
られる発現ベクターはプラスミドの形であること
が多い。このプラスミドは、環状の２本鎖DNA
ループであつて、そのベクターの形では、染色体
に結合していないものを言う。プラスミドは、ベ
クターの最も普通に用いられる形であるので、本
明細書に於いては、プラスミドとベクターを交換
可能な用語として用いる。しかし本発明に於いて
は、同じ機能を有する、当技術分野で知られてい
る、あるいは今後知られ得る他の形の発現ベクタ
ーも含まれると解釈すべきである。 本明細書に於いて組換え宿主細胞とは、組換え
DNA技術を用いて組み立てられたベクターで形
質転換された細胞を意味する。 本明細書に記載した方法およびベクターは、広
範囲の真核性および原核性の生物の宿主細胞に使
用することができる。 勿論、一般的に、本発明に有用なベクターを組
み立てるに際し、DNA配列をクローニングする
のに原核生物が好ましい。特にE.coliK12株294
（ATCCNo.31446）が特に好ましい。使用し得るそ
の他の微生物株として、E.coliB、E.coli X1776
（ATTCNo.31537）などのE.coli株が含まれる。こ
れらは限定する意味で挙げたのではなく、単なる
例示に過ぎないことは言うまでもない。 原核生物は発現にも使用することができる。上
記の菌株の他、E.coli W3110（F-，λ-，原栄養
性、ATTCNo.27325）、Bacillus subtilusの様な大
腸菌類、Salmonella typhmuriumやSerratia
marcesansの様な腸内細菌群および各種のシユー
ドモナス種を使用することができる。 一般に、これらの宿主に関しては、その宿主細
胞と適合し得る種由来のレプリコンおよび調節配
列を含んでいるプラスミドベクターが使用され
る。このベクターはもともと、形質転換細胞に表
現形質（表現型）の選択性を付与することのでき
る標識化配列と共に複製部位を持つている。例え
ば、E.coliは、E.coli種由来のpBR322を使つて形
質転換される（Bolivarら、Gene2：95（1977））。
pBR322はアンピシリンおよびテトラサイクリン
耐性のための遺伝子を含んでおり、従つて、これ
は形質転換細胞を同定するための簡単な手段とな
る。このpBR322プラスミドやその他の微生物プ
ラスミドは、その微生物がそれ自身の蛋白質を発
現するのに使用することのできるプロモーターを
含んでいなければならず、あるいは含む様に改良
されなくてはならない。組換えDNAの組み立て
に通常用いられるプロモーターにはβ−ラクタマ
ーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトースプロモ
ーター系（Changら、Nature275：615（1978）；
Itakuraら、Science198：1056（1977）；Goeddel
ら、Nature281：544（1979））およびトリプトフ
アン（trp）プロモーター系（Goeddelら、
Nucleic Acids Res.8：4057（1980）；EPO Appl
Publ No.0036776）がある。これらが最も普通に
用いられているが、その他の微生物プロモーター
も発見され、使用されており、それらのヌクレオ
チド配列は詳細に発表されているので、当業者で
あれば、それらをプラスミドベクターに機能的に
結合させることができる（Siebenlistら、
Gell20：269（1980））。 原核生物の他、酵母培養株の様な真核性微生物
も使用することができる。Saccharomyces
cerevisiae、普通のパン酵母は、真核微生物中最
もよく使用されるものであるが、その他の多くの
株も使用される。Saccharomyces中で発現させ
るには、例えばプラスミドYRp7（Stinchcomb
ら、Nature282：39（1979）；Kingsmanら、Gene
７：141（1979）；Tschemperら、Gene10：157
（1980））がよく用いられる。このプラスミドは、
トリプトフアンを生産する能力を欠いている酵母
の突然変異株、例えばATTCNo.44076または
PEP4−１（Jones，Genetics85：12（1977））にと
つて選択マーカーとなるtrp1遺伝子をもともと含
んでいる。酵母宿主細胞ゲノムの特徴としての
trp1損傷が存在することは、トリプトフアンの非
存在下に発育させることによつて形質転換体を検
出する有効な環境を提供することになる。 酵母ベクター中の適切な促進（promoting）配
列には、３−ホスホグリセレートキナーゼ
（Hitzemanら、J.Biol.Chem.255：2073（1980））
または他の解糖酵素（Hessら、J.Adv.Enzyme
Reg.7：149（1968）；Hollandら、
Biochemistry17：4900（1978））、例えばエノラー
ゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフエートデヒ
ドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルベートデカ
ルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グル
コース−６−ホスフエートイソメラーゼ、３−ホ
スホグリセレートムターゼ、ピルベートキナー
ゼ、トリオースホスフエートイソメラーゼ、ホス
ホグルコースイソメラーゼおよびグルコキナーゼ
などのプロモーターが含まれる。好適な発現プラ
スミドを組み立てるに際し、これらの遺伝子の終
了（termination）配列もまた、発現ベクターに、
発現しようとする配列の3′に結合させてmRNA
のポリアデニル化および終了を提供する。発育条
件によつてコントロールされる、もう１つの転写
における有利性を持つた他のプロモーターは、ア
ルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクローム
Ｃ、酸性ホスフアターゼ、窒素の代謝に関与する
分解酵素、上記のグリセルアルデヒド−３−ホス
フエートデヒドロゲナーゼ、およびマルトースお
よびガラクトース利用に関与する酵素
（Holland、前記）などのプロモーター領域であ
る。酵母に適合するプロモーター、複製起源およ
び終了配列を含んでいる全てのプラスミドベクタ
ーが適している。 微生物の他、多細胞生物由来の細胞培養も宿主
として使用することができる。原則として、脊椎
動物および無脊椎動物のいずれかの細胞培養も使
用できる。しかし、脊椎動物細胞が最も興味があ
り、脊椎動物細胞の培養増殖（組織培養）が細菌
では常套手段となつて来た（Tissue Culture，
Academic Press，KruseおよびPatterson，
editors（1973））。この様な有用な宿主細胞系の例
は、VEROおよびHeLa細胞、チヤイニーズ・ハ
ムスター卵巣（CHO）細胞系、W138、BHK、
COS−７およびMDCK細胞系などである。この
様な細胞の発現ベクターは、通常、（要すれば）
複製起源、発現しようとする遺伝子の前に位置す
るプロモーター、必要なリボソーム結合部位、
RNA組み継ぎ（スプライス）部位、ポリアデニ
ル化部位、転写終了配列などを含んでいる。本明
細書では、好ましい態様を記載したが、本発明が
その様な例示した配列に限定されるものと解釈し
てはならない。 哺乳動物細胞中で用いるには、発現ベクター上
の調節機能はウイルスから提供されることが多
い。例えば、通常使用されるプロモーターは、ポ
リオーマ、アデノウイルス２から誘導され、シミ
アンウイルス40（SV40）から導かれることが最も
多い。古い、そして新しいSV40ウイルスのプロ
モーターは、共にこのウイルスから、SV40ウイ
ルスの複製起源を含んでいるフラグメトとして簡
単に得られるという理由で特に有用である
（Fiersら、Nature273：113（1978））。Hindサ
イト（部位）からウイルスの複製起源内に存在し
ているBglサイトに至る約250bp配列を含んで
いるならば、それより小さいあるいは大きい
SV40フラグメントも使用することができる。更
に、所望の遺伝子配列と正常通り結合しているプ
ロモーターまたは調節配列を、この様な調節配列
が宿主細胞に適合する限り、使用することがで
き、またそれが好ましいことが多い。 複製起源は、SV40または他のウイルス（例え
ばポリオーマ、アデノ、VSV，BPVなど）が誘
導される様に、外来性の起源を含む様にベクター
を組み立てることにより、あるいは宿主細胞の染
色体の複製機構により提供することができる。こ
のベクターが宿主細胞染色体に組み込まれたら、
後者は十分であることが多い。 Ｂ 使用した方法 強力な細胞壁バリアーのない細胞を宿主細胞と
して使用する場合は、Grahamらの燐酸カルシウ
ム沈澱法（GrahamおよびVan der Eb，
Virology52：546（1978））によつてトランスフエ
クシヨンを行なう。しかし、核注入またはプロト
プラスト融合などの、DNAを細胞に導入する他
の方法も使用することができる。 原核細胞または実質的な細胞壁構造を持つた細
胞を使用する場合、好ましいトランスフエクシヨ
ンの方法は、Cohenらの塩化カルシウムを用いた
カルシウム処理である（Cohen，F.N.ら、Proc.
Natl.Acad.Sci.（USA），69：2110（1972））。 所望の暗号配列および調節配列（control
sequence）を含んでいる好適なベクターを組み
立てるには標準的な結合技術を用いる。分離した
プラスミドまたはDANフラグメントを開裂し、
修復（テイラー）し、所望のプラスミドを形成す
る様に、希望の形に再結合する。 開裂は、適当な緩衝液中、制限酵素で処理する
ことにより行なう。通常、約1μｇのプラスミド
またはDNAフラグメント、約20μの緩衝液、
約１単位の酵素を使用する（特定の制限酵素に対
する適切な緩衝液および基質の量は製造業者が指
定している）。37℃で約１時間インキユベートす
る。インキユベートした後、フエノールおよびク
ロロホルムで抽出して蛋白質を除き、水性分画か
らエタノールで沈澱させて核酸を回収する。 平滑末端が必要な場合は、E.coliDNAポリメ
ラーゼ（Klenow）10単位で、15℃で15分間処
理し、フエノール−クロロホルム抽出し、エタノ
ール沈澱に付す。 開裂したフラグメントの大きさによる分離は、
Goddelらの方法（Goeddel，Ｄら、Nucleic
Acids Res.8：4057（1980））に従い、６％ポリア
クリルアミドゲルを使つて行なう。 結合（ライゲーシヨン）には、正しく符号する
様に末端を適当に修復したほぼ等モル量の所望の
成分を、DAN0.5μｇ当たり約10単位のT4DNA
リガーゼを用いて処理する（開裂したベクターを
成分として用いる場合は、細菌性アルカリ性ホス
フアターゼで予め処理して開裂したベクターの再
結合を防ぐのがよい）。 ライゲーシヨン混合物を使つてE.coliK12株294
（ATLC31446）を形質転換し、成功した形質転換
体をアンピシリン耐性について選択する。形質転
換体からプラスミドを調製し、Messingらの方法
（Messingら、Nucleic Acids Res.9：309（1981））
またはMaxamらの方法（Maxamら、Methods
in Eezymology65：499（1980））に従つて、制限
酵素分析し、そして／または配列を決定する。 Ｃ 好ましい実施態様 以下に、E.coli中でポリペプチドを発現させる
好ましい態様について記載するが、これは本発明
を例示するものであつて、本発明がこれに限定さ
れるものと解釈してはならない。 C.1 マウスのプローβNGFを暗号化している
cDNAクローンの分離 ヒトNGFのβサブユニツトを暗号化している
遺伝子を得るために、ハイブリダイゼーシヨン・
ブローブとして、マウスのβNGFを暗号化してい
るクローンされたcDNAを用いることにした。 cDNAクローニング・アプローチには、合成オ
リゴヌクレオチドプライマーを使用して、第１図
に示したマウスのβNGFサブユニツトの既知のア
ミノ酸配列を利用した：雄および雌のマウスの唾
液腺に存在するNGFレベルの違いを、同定のも
う１つの手段として用いた。マウスのβNGFアミ
ノ酸配列の３つの小さな部分を選び、それらを暗
号化している全ての可能性のある配列に相補的な
オリゴヌクレオチド・プールをCrea等の方法
（Nucleic Acids Res.，８：2331（1980））で合成
した。この暗号鎖および相補鎖のヌクレオチド配
列を第１図に示す。 合成オリゴヌクレオチドをハイブリダイゼーシ
ヨン・プローブとして用いて、マウス
βNGFcDNAクローンを、雄マウス唾液腺からの
オリゴdT−プライム化cDNAバンクから分離同
定する試みは失敗した。この結果は、βNGFは雄
マウス唾液腺蛋白質の0.1％を占めているが、そ
のmRNAは同じ様に豊富ではないことを示して
いる。従つて、まずβNGF特異ヌクレオチド配列
を豊富にするために、この蛋白質のカルボキシ末
端に近接した配列を表わしているプライマー・プ
ールを使つて、雄の唾液腺からのポリＡ−含有
（Ａ＋）RNAの逆転写を特異的にプライムした。
長さ200bp以上のcDNA分子を、よく知られたプ
ラスミドpBR322にクローンした。cDNAのプラ
イミングにハイブリダイゼーシヨン・プローブと
して最初に使つた5′−32p−標識NGFプライマ
ー・プールを使つて、全部で10000個のクローン
をスクリーニングした結果、その内0.8％が、非
常に厳重なハイブリダイゼーシヨン条件下で陽性
信号を与えた。残りの99.2％の「プライム化」さ
れたcDNAバンクは、ポリA+MSG RNAの調製
中に溶離した痕跡量のオリゴdTによるプライミ
ングおよび自己プライミングにより生じたと思わ
れる。クローニング操作の際のS1ヌクレアーゼ
処理が末端プライマー配列を傷付け、従つて検出
された陽性クローンが少なかつたのかも知れな
い。 この最初のスクリーニングで陽性となつたクロ
ーンを、ハイブリダイゼーシヨン・プローブとし
て、第１図に示したオリゴヌクレオチドプール１
より上流のDNA配列から誘導した放射線標識化
プライマー・プール２および３を使つてスクリー
ニングした。更に雄または雌マウスの唾液腺のい
ずれかからのポリA+RNAから、プール１でプラ
イム化した32p−cDNAを二重フイルター上のプ
ローブとして用いた。再びpBR322中、オリゴヌ
クレオチド・プール２および３とハイブリツドを
形成した全部で10個の雄−特異的クローンを同定
した。制限酵素分析の結果、10個は全て共通の
HaeおよびHinfフラグメントを持つている
ことがわかつた。本発明者らがpmβN−9G1と名
付けた、最も長いDNA挿入体（〜700bp）を発
現するプラスミドを含んでいるクローンの全配列
を決定した。このヌクレオチド配列から推定され
るアミノ酸配列は、NH2−末端プロ−配列に加
えて、１つの翻訳フレーム中に期待するNGF配
列を含んでいた（第４図参照）。マウスの
NGFcDNA配列を含んでいる細菌クローンの組
み立ておよび同定について、以降に詳述する。 完全なNGFmRNAの大きさを決定するため
に、ノーザン・ブロツト・ハイブリダイゼーシヨ
ンおよびプライマー・エクステンシヨン分析法を
用いた。NGFおよびプロペプチド配列を含んで
いる長さ470bpの32p−標識DNAフラグメント
（Rea−Res789，第３図参照）を、雄マウス
唾液腺に特異な長さ約1300ヌクレオチドのRNA
種と雑種形成させた。２つの短い、２本鎖の、
5′末端−標識化制限フラグメトを用いたプライマ
ー・エクステンシヨン実験（第３図の説明参照）
により、βNGFmRNAの5′末端は、本発明者らの
クローンの3′末端から下流の約370塩基を残して、
pmβN−9G1cDNAフラグメントの5′末端から上
流に約230塩基の所に位置づけられた。欠失5′配
列の〜30ヌクレオチドを除く全てが、本発明者ら
がpmβN−16F7およびpmβN−21B5と名付けた
クローンに含まれており、これらは、第３図に示
す様に、互いに、そしてクローンpmβN−9G1と
重複している。これらは、cDNA合成をプライム
するため、制限フラグメントの使用についてのよ
り詳細な以下に記載の方法で分離する。 プライマー配列の3′末端から下流へ3′ポリＡ配
列までの配列を含んでいるクローン化したcDNA
を得るために、プレパラテイブ尿素アガロースゲ
ル上で、全ポリA+雄マウス唾液腺RNAを分画す
ることにより、βNGFmRNAを豊富化した。最
も大きいサイズのフラクシヨン、βNGFcDNAプ
ローブとハイブリダイズ（雑種形成）する配列を
含むフラクシヨンを、オリゴdT−プライム化
cDNA合成およびクローニングに使用した。3700
のクローンをスクリーニングした結果、４つの腸
性ハイブリダイゼーシヨンシグナルが得られた。
本発明者がpmβN−12E4と名付けたクローンの
ヌクレオチド配列分析、および3′暗号化および非
翻訳配列に239ヌクレオチドを添加したpmβN−
8B3oオリゴdTプライム化であるが、本発明者ら
のクローンはいずれも、第２のDNA鎖の不完全
な合成または広範なS1ヌクレアーゼ処理のため
に、βNGFmRNAの全3′非翻訳領域を含んでいな
かつた。ノーザン ブロツト分析により、ポリＡ
配列は本発明者らがクローンした配列から離れて
いないことがわかつた（第２図参照）。豊富化し
たmRNAからのオリゴdTプライム化cDNAクロ
ーンの調製について以下に詳述する。 C.2 ヒト染色体βNGF遺伝子の分離および特性
化 ヒト遺伝子ライブラリー（λCharon4Aベクタ
ーに挿入された、15−20kbの、部分的Hae／
Aluヒト胎児肝臓DNAフラグメントからなる）
を、放射活性ハイブリダイゼーシヨン・プローブ
として、既述した470bpマウスNGFクローン化
cDNAフラグメント（pmβN−9G1RsaIフラグメ
ント）を用いてスクリーニングした。全部で27組
み換えフアージをプラーク純化し、EcoRI消化に
より部分的に特性化した：27個のフアージは６つ
の異なるタイプの制限パターンを示した。各パタ
ーン種は、制限フラグメントを共有しており、従
つて同じゲノム領域を重複していると思われる。
γhβN8と名づけたフアージの特性を、物理的マ
ツピングおよびヌクレオチド配列決定により調べ
た。第４図は、フアージ・マツピング、配列決定
およびゲノム・サザーン・ブロツテイング実験に
よつて得た、クローンγhβN8の物理的地図およ
びヒトゲノム中のその配列を画している領域を示
している。サブクローンした、重複している
EcoRIおよびHindフラグメントから誘導され
た12000bpのヌクレオチド配列の部分を第５図に
示す。 C.3 マウスβNGFcDNAとヒトβNGF遺伝子の
配列の比較 マウスのβNGFcDNA配列は、成熟βNGFを暗
号化する可能性を持つた解読わくを含有してお
り、予想されたアミノ酸配列は、マウスβNGFの
既知の配列に相当している（Angeletti等、
Biochemistry，12：90（1973）および12：100
（1973））。意外にも、このcDNA配列は、マウス
βNGFの報告されている配列の末端に結合した、
Ｃ−末端、アルギニン−グリシンジペプチド延長
部を予測している。 ヒトβNGF遺伝子は、成熟マウスβNGFアミノ
酸配列と約90％が相同（ホモローガス）なアミノ
酸配列を予測している領域を含んでおり、従つて
これは、ヒトβNGFの遺伝子のための遺伝子でな
ければならない。ヒトβNGF蛋白質もまた、Ｃ−
末端ジペプチド延長部を持つている。 ヒトとマウスのβNGF配列を並べると（第６
図）、成熟マウス蛋白質の既知の配列からかなり
の遠くの上流まで広範な相同性が延びていること
がわかる。22000ダルトンの生合成プロ−βNGF
プリカーサー（前駆体）の存在が証明されており
（BergerおよびShooter，Proc.Nat.Acad.Sci.
（USA），74：3647，（1977））、これは成熟蛋白質
からヌクレオチド位置419および420（第６図参照）
の潜在的なアルギニン−アルギニン開裂部位にま
で延びているかもしれない。このヌクレオチド配
列で予測される前駆体は、既に以前に検出された
ものより長い：後述する様に、全プレプロ−β−
NGF配列は分子量27000と予測され、プロー配列
は25000ダルトンと予測され、特異なアルギニン
残基対が存在することを考えると、21500および
18000ダルトンのプロセツシング中間体が細胞内
に存在する。 C.4 開始メチオニンコドンおよび信号配列の位
置づけ 蛋白質合成開始コドンであると指定するための
候補として３つのメチオニン残基が挙げられる
（第６図のアミノ酸−187、−121および−119）。し
かし、いくつかの要因から、本発明者らの配列の
−121アミノ酸が実際の開始コドンとして使われ
ていることを強く暗示している。βNGFは分泌さ
れた蛋白質であるので、開始コドンの後には、こ
のポリペプチドを小胞体の内腔へと共同翻訳転移
させる信号配列が続いていると考えられる。アミ
ノ酸−121から−104は、優れた信号配列の候補で
ある。これらの18個のアミノ酸は正しい長さであ
り、一続きの６個の完全に疎水性のアミノ酸
（ala−phe−leu−ile−gly−val）を含んでいる。
信号ペプチダーゼによる開裂は、小さいアミノ酸
であるala−104と、−103位のglu残基の間で起り
得る。プレーアルフア・ラクトアルブミンの場
合、信号ペプチダーゼは同一のgln−ala配列
（後）を開裂させ、同一のＮ−末端glu残基を残す
ことが知られている。−187位のmet残基に続く一
連のアミノ酸は、極性および荷電アミノ酸を高率
で含んでおり、これまで報告されている信号配列
のいずれにも似ていない。 従つて、−121のメチオニンがヒトおよびマウス
のプレプロ−βNGFの翻訳開始に使われる可能性
が最も高く、この場合27000ダルトンのプレプロ
ホルモンが生成する。もし信号ペプチドプロセツ
シングが残基−104で起つたら、25000ダルトンの
プロ−βNGFが生成するであろう。 C.5 E.coli中でのヒトβNGFの直接発現 λhβN8からのEcoRフラグメントをpBR322
でサブクローンした。本発明者らがphβN8−B9
と命名したサブクローンプラスミドは、ヒト
βNGFサブユニツトを暗号化している配列の大部
分を含んでいる2kbヒトDNA挿入体を含有して
いた。配列決定の結果、10個のNH2−末端アミ
ノ酸だけがこの配列から除かれていることがわか
つた。βNGF暗号配列をE.coliで発現させるため
の本発明者らの方法は、phβN8−B9のβNGF暗
号部分から最も大きい可能なフラグメントを切り
取り、次いで欠失コドンを満たし、その配列の
5′および3′末端を、E.coli発現プラスミドに挿入
するのに適する様に修飾することであつた。使用
した発現系は、米国特許出願第307473号（1981年
10月１日出願）に記載されているTrpプロモータ
ー系であり、これは、M.Mateucciの配列変換と
共に、各種の遺伝子について以前から用いられて
来たものである。 プラスミドphβN8−B9をEcoRIおよびHgiAI
で消化し、〜300bpフラグメントを消化混合物か
ら分離した。このフラグメントを第７図に示す。
２工程の消化により生じる粘着末端も示してあ
る。発現のためのヒトβNGF配列の5′末端を組み
立てるために、10個の欠失アミノ酸のためのコド
ン、開始メチオニンコドン（ATG）、およびリボ
ソーム結合サイトの一部であり、制限エンドヌク
レアーゼXbaIの開裂サイトを含んでいる、該
ATGに先行するヌクレオチド群を付加した。こ
の目的の為に４つのオリゴヌクレオチドを化学的
に合成した。これらをオリゴヌクレオチド−
として第７図に示す。 βNGF暗号領域の3′末端は以下の如く修正し
た：第７図に示した１個のHgiAI部位（成熟ヒト
βNGFの111位（Val）と112位（Leu）のアミノ
酸）から下流の両DNA鎖のヌクレオチド配列を、
Arg118およびSalI粘着末端に続く終止コドン
（TAG）を含む様に化学的に合成した。これらの
オリゴヌクレオチドは第７図のフラグメントお
よびである。 合成オリゴヌクレオチド１−をT4ポリヌク
レオチドキナーゼおよびγ−32p−ATPで放射活
性標識し、その放射活性オリゴヌクレオチドを、
T4DNAリガーゼ緩衝液中、〜300bphβNGF
DNAフラグメトと混合した。10単位のT4DNA
リガーゼを用い、12℃で12時間ライゲーシヨン
（結合）した。この混合物をフエノール抽出し、
DNAを70％エタノール中で沈殿させた。沈殿を
乾燥し、制限エンドヌクレアーゼ緩衝液に溶解
し、酵素XbaIおよびSaIIを添加し、２時間消化
した。 DNA混合物のプレパラテイブゲル電気泳動お
よびオートラジオグラフイーにより、放射活性の
ある二重体（ダブレツト）が〜370bpに存在する
ことがわかつた。溶離したDNAフラグメントを、
XbaIおよびSaIIで消化した後細菌性アルカリホ
スフアターゼで処理したpHGH207−１と命名さ
れたHGH−Trp発現プラスミドに結合させた
（T4DNAリガーゼ）。このアルカリホスフアター
ゼ処理は、HGHフラグメントがTrp発現ベクタ
ーに再挿入されるのを防ぐ為に行なつた。このラ
イゲーシヨン混合物を使つてE.coliK12／294を形
質転換した。寒天平板上、アンピシリン耐性でテ
トラサイクリン感受性のコロニーを選択した：
200のコロニーを、放射活性の300bpEcoRI／
HgiAIプローブとのハイブリダイゼーシヨンによ
り、ヒトβNGF配列の存在についてスクリーニン
グした。12個の陽性コロニーを、ウエスタン・ブ
ロツト上、ウサギの抗マウスβNGF抗体を使つ
て、その細胞抽出物中に免疫反応性βNGF分子が
存在するかどうかについて分析した。１個を除く
全てのクローンが、陰性の対照抽出物と比較し
て、期待される分子量の陽性信号を示した。これ
らのクローンの１個のDNA配列を分析した結果、
本発明者らによつてPhβNGFtrp1と命名された、
ヒトβNGFを発現した最終的なプラスミドが、当
初に計画した構造を持つていることが証明され
た。 プラスミドPhβN8−B9のEcoRIおよびHgiAI
による消化からプラスミドPhβNGFtrp1の組み立
てに至る一連の操作を第８図に示した。プラスミ
ドPHGH207−１は、上記出願番号第307473号に
記載されているプラスミドPHGH207をBamHI
で消化し、次いでEcoRIで部分消化することによ
り得られた。trpプロモーターを含んでいる最も
大きいフラグメントを分離した。pBr322から最
も大きいEcoRI−BamHIフラグメントを分離し、
この２つのフラグメントを結合させ、E.
coliK12／194の形質転換に使用した。アンピシ
リンおよびテトラサイクリンの両者に耐性のある
クローンがPHGH207−１を含んでいた。 C.6 mNGFcDNA配列を含んでいる細菌クロー
ンの組み立ておよび同定 各（14塩基の）８つのプライマーのプール２種
を化学的に合成した。各プライマーは、アミノ酸
93−96および97の１部のための潜在的mRNA配
列と相補的である。ポリ（A+）RNAで特異的に
cDNAの合成をプライムするのに16オリゴヌクレ
オチドの混合物を用いた。100ミリモル（ｍモル）
のKC150μ中、８プライマーの各プール200ピ
コモル（ｐモル）（1μｇ）（総計440pモル、2μｇ）
を、ポリ（A+）RNA40μｇと、90℃、68℃、42
℃および37℃で４分間づつインキユベートするこ
とにより、アニーリングした。32p−標識cDNA
を、50mMトリス（PH8.3）、10mM MgCl2、
10mM DTT、50mM KClの反応（系）100μ
中で合成した。この反応系はアニーリングした混
合物の他に、500μMのdATP、TTP、dGTP、
100μMのdCTP、20μCiの〔γ−32p〕dCTP
（2000Ci／ｍモル、Amersham）、0.5単位／μ
のRNAsinおよび90単位の逆転写酵素を含んでい
た。最初の鎖の合成は37℃で60分間であつた。反
応系を３分間煮沸し、１分間氷でクエンチング
し、マイクロフユージ中で回転させた。上澄を同
容量のddH2Ｏで希釈し、Klenow PolI15単位を
加え、12℃で18時間、de cDNAを合成した。フ
エノール／クロロホルム抽出し、エタノール沈殿
を行なつた後、標品を150μ中のS1ヌクレアー
ゼ103単位を用いて37℃で１時間消化した。フエ
ノール／クロロホルム抽出およびエタノール沈殿
の後、５％ポリアクリルアミドゲル上の電気泳動
によりcDNAを分画した。２つのサイズ範囲の
cDNAを電気溶離した。長さ〜550bp（上）は
132ngm回収され、長さ200〜550bp（下）は
182ngm回収された。全量20ngmの各フラクシヨ
ンの3′−末端を、末端ヌクレオチジル・トランス
フエラーゼを用いて20−40d(c)残基で延長させ
た。このｄ(c)−尾部形成cDNAを、同様にPstI部
位でｄ（Ｇ）残基を用いて延長させたpBR322
（150ngm）とアニーリングした。アニーリングは
50μの100mM NaCl、10mM トリス（PH
7.5）、250mM EDTA中で行なつた。混合物を70
℃に加熱し、徐々に37℃に冷却し（16時間）、次
いで４℃に冷却した（６時間）。アニーリング混
合物の半分を使つてE.coliK−12株294を形質転換
した。各サイズフラクシヨン（上と下）からの
500コロニーをフイルター・ハイブリダイゼーシ
ヨンによりスクリーニングした。32p−標識プロ
ーブは16プライマーの混合物（全1μｇ）から、
公表されている方法により、ポリヌクレオチドキ
ナーゼ（Ｐ−LBiochmicals）および200μCiの
〔γ−32p〕ATP（5000Ci／ｍモル、Amersham）
を用いた燐酸化により調製した。10000のクロー
ンを含んでいるフイルターを、プライマー・ハイ
ブリダイゼーシヨン・ミツクス（100mMトリス
PH7.5、0.9MNaCl、6mMEDTA、1XDennardt′s
溶液、100μMrATP、1mMNaH2PO4−Naピロ
ホスフエート、0.5％NonidetP−40、0.1mg／ml酵
母RNA（SigmaR−6750））中、〜１×108cpmの
32p−標識プローブと、室温で18時間ハイブリツ
ド形成させた。フイルターを、42℃で６×ssc中
で30分間（３回）洗浄し、強化スクリーン
（Dupont）を用いて−70℃で16時間、Ｘ線フイル
ムに感光させた。約0.7−0.9％（上370、下460）
のコロニーを選択し、もとのプライミング部位に
対して5′である２つの追加の合成プライマーによ
る２回目のスクリーニングにかけた。アミノ酸74
−77のための全ての潜在的mRNA配列に相補的
な12量体を各４プライマーの２プールに合成し
た。各々８個の14量体２プール（アミノ酸52−58
および56の一部のための潜在的mRNA配列に相
補的）を同様にして合成した。第１回のスクリー
ニングで選択した「上」および「下」のコロニー
から、３セツトの同一のフイルターを作成した。
４つの合成オリゴヌクレオチドから、既述した様
にして32p−標識プローブを作成した。プライマ
ー・ハイブリダイゼーシヨン・ミツクス中、フイ
ルターを0.5×108cpmとハイブリツド形成させ、
洗浄し、Ｘ線フイルムに感光させた。5′オリゴヌ
クレオチド全てとハイブリツド形成を行なつた９
つの陽性群（下から３つ、上から６つ）がみつか
つた。ミニスクリーン手法でプラスミドDNAを
分離し、最も大きい挿入体を持つたクローンを制
限分析により決定した。pmβN−9G1と名付けた
プラスミドの塩基配列を、Maxam−Gilbert法に
よつて完全に決定した。このcDNA挿入体は、14
塩基のプライマー配列（第１図、プール１）およ
び全量716bpを含んでいた。 C.7 βNGFメツセージに富むmRNAから調製さ
れたオリゴdT−プライム化cDNAクローン 0.025Mのクエン酸ナトリウム（PH3.8）中の２
％アガロースおよび6M尿素からなる変性アガロ
ースゲルにより、電気泳動によつて200μｇのポ
リ（A+）RNAを分画した。リボソームバン
（帯）は、垂直のスライスをエチジウムブロマイ
ドで染色することにより肉眼観察し得る様にし
た。ゲルを0.5cmのスライスに切断し、70℃で融
解し、フエノールで２回、クロロホルムで１回、
強力に抽出した。２回のエタノール沈殿の後、そ
のペレツトをddH2O30μに溶解した。各フラク
シヨン（4M酢酸アンモニウム5μ（PH7.0）中）
1μを乾燥ニトロセルロースフイルターにスポ
ツトし、厳重な条件下でドツト・ハイブリダイゼ
ーシヨンによりスクリーニングした。Klenow
Pol1反応系中、プライマーとして牛胸腺DNAフ
ラグメントを用いて既知の方法により、32p−標
識プローブをpmβN−9G1挿入体から調製した。
このフイルターを、50mMNaPO4（PH7.0）、５×
Dennart′s溶液、５×sec、50μｇ／mlの超音波処
理したニシン精子DNA、100μMのrATP、
1mMNaH2PO4−ナトリウムピロホスフエート、
および50％ホルムアミド中、42℃で18時間、〜
107cpmとハイブリツド形成させた。このフイル
ターを0.2×sec−0.1％SDS中、42℃で20分間洗浄
し（３回）、フイルムに感光させた。ハイブリダ
イゼーシヨンの結果、NGFメツセージはフラク
シヨン11および12にあることがわかつた。フラク
シヨン11および12のそれぞれ10μを用い、標準
的な方法でオリゴdT−プライム化cDNAを調製
した。５％ポリアクリルアミドゲル上の電気泳動
の後、ゲルスライスから600bpより長いcDNAを
溶離した。フラクシヨン11から約40ngmの
cDNA、およびフラクシヨン12からの20ngmをｄ
(C)−尾部形成し、ｄ（Ｇ）−尾部形成したpBR322
とアニーリングした。フラクシヨン11から約3300
クローン、フラクシヨン12からの1500クローン
を、pmβN−9G1からの32p−標識内部Hpaフ
ラグメント（216bp）を使つて、厳重な条件下の
フイルターハイブリダイゼーシヨンにより、コロ
ニーとしてスクリーニングした。フイルターを42
℃で18時間、50×106cpmとハイブリツド形成さ
せ、洗浄し、既述した様にＸ線フイルムに感光さ
せた。フラクシヨン12からの５つのクローンがこ
のプローブについて陽性であつた。制限分析によ
り、それらは同胞であることがわかつた。pmβN
−12E4を、Maxam−Gilbert法により完全に塩
基配列決定した。フラクシヨン11からの２つのク
ローンが陽性であつた。最大のpmβN−8B3の塩
基配列をMaxam−Gilbert法により完全に決定し
た。 C.8 医薬組成物 本発明に係るヒトのβ−NGFは、このβ−
NGFを適当な担体と混合して、既知の方法で、
有用な医薬組成物に製剤化することができる。好
適な担体、および他のヒトの蛋白質、例えばヒト
の血清アルブミンを含んでいてもよい製剤の調製
法は、例えばRemingtonのPharmacentical
Sciences（E.W.Martinによる）に記載されてい
る。この様な医薬組成物は、本発明の蛋白質の有
効量を適当な量の担体と共に含んでおり、患者に
非経口投与することができる。 このヒトβ−NGFは、神経障害またはその他
の、この物質が治療効果を発揮し得る疾患にかか
つている患者に非経口投与することができる。投
与量および投与割合は、例えばマウスの唾液腺か
ら得られる同様の製剤の臨床実験に現在使用され
ているものと同じである。 以上の記載は本発明の好ましい態様を述べたも
のであり、本発明がこれに限定されると解釈して
はならない。
第１図はマウスNGFのβサブユニツトのアミ
ノ酸配列、それを暗号化している遺伝子配列、お
よびその遺伝子の特定の断片の相補DNA鎖を示
す模式図、第２図はβ−NGFmRNA断片を含ん
でいるクローンのノーザン・ブロツト分析の結果
を示すグラフ、第３図はマウスNGF遺伝子の部
分的制限地図、および本発明のプラスミドのヌク
レオチド配列とマウスNGF遺伝子のヌクレオチ
ド配列との対比を示す模式図、第４図は組換えフ
アージλhN8の物理的地図、第５図はヒトβNGF
染色体遺伝子のヌクレオチド配列を示す模式図、
第６図はヒトおよびマウスのプレプロ−βNGF遺
伝子のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の比
較を示す模式図、第７図はヒトβNGFの発現のた
めに組み立てられた遺伝子を示す模式図、第８図
はヒトβNGFを発現するための、E.coliを形質転
換するためのプラスミドphNGFtrp1の組み立て
工程の１部を示す工程図である。
ノ酸配列、それを暗号化している遺伝子配列、お
よびその遺伝子の特定の断片の相補DNA鎖を示
す模式図、第２図はβ−NGFmRNA断片を含ん
でいるクローンのノーザン・ブロツト分析の結果
を示すグラフ、第３図はマウスNGF遺伝子の部
分的制限地図、および本発明のプラスミドのヌク
レオチド配列とマウスNGF遺伝子のヌクレオチ
ド配列との対比を示す模式図、第４図は組換えフ
アージλhN8の物理的地図、第５図はヒトβNGF
染色体遺伝子のヌクレオチド配列を示す模式図、
第６図はヒトおよびマウスのプレプロ−βNGF遺
伝子のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の比
較を示す模式図、第７図はヒトβNGFの発現のた
めに組み立てられた遺伝子を示す模式図、第８図
はヒトβNGFを発現するための、E.coliを形質転
換するためのプラスミドphNGFtrp1の組み立て
工程の１部を示す工程図である。
１ リパーゼの存在下、C7−C36モノ又はジカル
ボン酸とC2−C8モノアルコールを反応させるこ
とによりエステルを製造する方法において、反応
水を、C2−C8モノアルコール及び水の混合物の
共沸蒸留により除去することを特徴とする方法。 ２ アルコールの共沸蒸留とアルコールの添加を
実質的に同じ速度で行うことを特徴とする請求項
１に記載の方法。 ３ 共沸蒸留を減圧下で行うことを特徴とする請
求項１又は請求項２に記載の方法。 ４ エステル化及び共沸蒸留を単一容器系で80℃
より低い温度で行うことを特徴とする請求項１、
請求項２又は請求項３に記載の方法。 ５ エステル化及び共沸蒸留を別の容器で行うこ
とを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１請求
項に記載の方法。 ６ エステル化を充填カラム反応器中でリパーゼ
触媒を用いて行うことを特徴とする請求項５に記
ボン酸とC2−C8モノアルコールを反応させるこ
とによりエステルを製造する方法において、反応
水を、C2−C8モノアルコール及び水の混合物の
共沸蒸留により除去することを特徴とする方法。 ２ アルコールの共沸蒸留とアルコールの添加を
実質的に同じ速度で行うことを特徴とする請求項
１に記載の方法。 ３ 共沸蒸留を減圧下で行うことを特徴とする請
求項１又は請求項２に記載の方法。 ４ エステル化及び共沸蒸留を単一容器系で80℃
より低い温度で行うことを特徴とする請求項１、
請求項２又は請求項３に記載の方法。 ５ エステル化及び共沸蒸留を別の容器で行うこ
とを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１請求
項に記載の方法。 ６ エステル化を充填カラム反応器中でリパーゼ
触媒を用いて行うことを特徴とする請求項５に記
Claims (1)
- 【表】 【表】 【表】
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
| US47196283A | 1983-03-03 | 1983-03-03 | |
| US471962 | 1983-03-03 |
Related Child Applications (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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| JP4346116A Division JP2898494B2 (ja) | 1983-03-03 | 1992-12-25 | ヒト神経成長因子の遺伝子組換えによる調製法 |
| JP4346109A Division JPH067169A (ja) | 1983-03-03 | 1992-12-25 | ヒト神経成長因子の遺伝子組換えによる調製法 |
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|---|---|
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| JPH0536031B2 true JPH0536031B2 (ja) | 1993-05-28 |
Family
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Family Applications (4)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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| JP4346116A Expired - Lifetime JP2898494B2 (ja) | 1983-03-03 | 1992-12-25 | ヒト神経成長因子の遺伝子組換えによる調製法 |
| JP4346109A Pending JPH067169A (ja) | 1983-03-03 | 1992-12-25 | ヒト神経成長因子の遺伝子組換えによる調製法 |
Family Applications After (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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| JP4346116A Expired - Lifetime JP2898494B2 (ja) | 1983-03-03 | 1992-12-25 | ヒト神経成長因子の遺伝子組換えによる調製法 |
| JP4346109A Pending JPH067169A (ja) | 1983-03-03 | 1992-12-25 | ヒト神経成長因子の遺伝子組換えによる調製法 |
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| JPH01102096A (ja) * | 1987-10-15 | 1989-04-19 | Sanwa Kagaku Kenkyusho Co Ltd | モチリン様活性を有するポリペプチド、その発現用微生物及び該ポリペプチドの製法 |
| JPH01211490A (ja) * | 1988-02-19 | 1989-08-24 | Tosoh Corp | ヒト神経成長因子遺伝子セグメント |
| IT1219874B (it) * | 1988-03-18 | 1990-05-24 | Fidia Farmaceutici | Utilizzazione del fattore di crescita nervoso umano e sue composizioni farmaceutiche |
| US5134121A (en) * | 1988-03-28 | 1992-07-28 | Regents Of The University Of California | Nerve growth factor peptides |
| US5683894A (en) * | 1988-04-29 | 1997-11-04 | University Of California | Recombinant nerve growth factor |
| JPH0771509B2 (ja) * | 1988-07-12 | 1995-08-02 | 工業技術院長 | ヒトβ−ＮＧＦの発現法 |
| US5082774A (en) * | 1988-08-30 | 1992-01-21 | The General Hospital Corporation | Recombinant human nerve growth factor |
| US5272063A (en) * | 1988-11-22 | 1993-12-21 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Process of making human nerve growth factor |
| US6709837B1 (en) * | 1989-03-10 | 2004-03-23 | Takeda Chemical Industries, Inc. | Polypeptide and production thereof |
| SE8901715L (sv) * | 1989-05-12 | 1990-11-13 | Lope Medicine Ab | En plasmid dna-konstruktion innehaallande dna-sekvenser |
| IT1232157B (it) * | 1989-07-20 | 1992-01-25 | Fidia Farmaceutici | Purificazione del fattore di crescita nervoso tramite cromatografia a scambio di subunita' |
| ATE119938T1 (de) * | 1989-08-21 | 1995-04-15 | Takeda Chemical Industries Ltd | Produktion von menschlichen nervenwachstumsfaktoren. |
| US5656435A (en) * | 1989-08-28 | 1997-08-12 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Antibodies to peptides having NGF-like activity, said antibodies having no substantial cross-reactivity with NGF, and use thereof |
| US6933276B1 (en) | 1989-08-30 | 2005-08-23 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods of treating peripheral neuropathies using neurotrophin-3 |
| IL95511A (en) | 1989-08-30 | 2000-10-31 | Max Planck Gesellschaft | Neurotrophin-3 a novel neurotrophic factor related to nerve growth and brain derived neurotrophic factor |
| US5180820A (en) * | 1989-08-30 | 1993-01-19 | Barde Yves Alain | Brain-derived neurotrophic factor |
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