JPH05502162A - 細菌ゲノムにおけるｄｎａの安定な組込み - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ４、前記遺伝子が遺伝子のＤＮＡ配列の１種又はそれ以上のヌクレオチドの欠失 、挿入又は置換により、又は転写もしくは翻記開始もしくは停止シグナルの欠失 もしくは他の改質により、改質されている、請求の範囲第３項記載の細胞。

５、前記ＤＮＡ作製体が、対象のＤＮＡ配列細胞の遺伝子の領域に相同性のＤＮ Ａ配列および一本鎖ＤＮＡプラスミドから複製のプラス起点を含んでなり、該Ｄ ＮＡ作製体が複製のプラス起点と同族の機能的１遺伝子を欠いている、請求の範 囲第１〜４項のいずれかに記載の細胞６、前記ＤＮＡ作製体が更に選択できるマ ーカーを含んでなる、請求の範囲第１〜５項のいずれかに記載の細胞。

７、前記対象のＤＮＡ配列が対象のポリペプチドを特徴とする請求の範囲第１〜 ５項のいずれかに記載の細胞。

８、グラム陽性細菌の細胞である、請求の範囲第１〜７項のいずれかに記載の細 胞。

９、前記グラム陽性細菌の細胞が、バチルス　Ｂａｃｊｌｌｏ、前記細胞が、バ チルス　リシェニフォーミス（１互（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｏａｇｕｌｕａｎｓ ）、バチルス胞。

１１、、ＤＮＡ作製体であって、（１）対象のＤＮＡ配列、（２）該ＤＮＡ作製 体の導入を意図されている細胞のゲノムの領域に相同性のＤＮＡ配列及び（３） 複製の起点を含んで成り、該ＤＮＡ作成体は、複製の起点かうの複製の開始のた めに必要とされる因子をコードする機能的遺伝子を欠いている、前記ＤＮＡ作製 体。

１２、複製因子をコードする遺伝子を欠失してしまっている、請求の範囲第１１ 項記載のＤＮＡ作製体。

１３、前記複製因子をコードする遺伝子が、不活性な複製因子をコードするよう に改質されているが、又は複製因子が遺伝子から発現されないように改質されて いる、請求の範囲第１１項記載のＤＮＡ作製体。

１４、前記遺伝子が、遺伝子のＤＮＡ配列の１種又はそれ以上のヌクレオチドの 欠失、挿入又は置換により、又は転写もしくは屈託開始もしくは停止シグナルの 欠失もしくは他の改質により、改質されている、請求の範囲第１３項記載のＤＮ Ａ作製体。

１５、対象のＤＮＡ配列、ＤＮＡ作製体の導入を意図されている細胞のゲノムの 領域に相同性のＤＮＡ配列及び−末鎖ＤＮＡプラスミドから複製のプラス起点を 含んで成り、ｙＤＮＡ作成体は、複製のプラス起点と同族の機能的１遺伝子を欠 いている、前記ＤＮＡ作製体。

１６、更に選択できるマーカーを含んでなる、請求の範囲第１１項に記載のＤＮ Ａ作製体。

１７、請求の範囲第１１〜１６項のいずれかに記載のＤＮＡ作製体を含んでなる 、Ｍｉ換え体ＤＮＡベクター。

１８、親プラスミドベクターであって、（ｉ）第１の複製起点；　（ｉｉ）該第 １の複製起点からの複製のために必要とされる複製因子をコードする１又は複数 の機能的遺伝子；　（＋＋＋）該第１の複製起点と同一の方向における第２の複 製起点；（ｉｖ）対象のＤＮＡ配列、及び（Ｖ）該ベクターの導入を意図する細 胞のゲノム領域に相同性のＤＮＡ配列、を含んで成り、該親ベクターは該第２及 び第１の複製起点（上記の順における）の間の領域にある、該第２の複製起点か らの複製のために必要とされる複製因子をコードする機能的遺伝子を欠いている 、前記親プラスミドベクター。

１９、複製の第二起点が、複製の第一起点と同じプラスミドから由来している、 請求の範囲第１８項記載のプラスミドベクター。

２０、複製の第２の起点と連結した複製因子をコードする遺伝子が欠失してしま っている、請求の範囲第１８項記載のプラスミドベクター。

２１、複製の第２の起点と連結した複製因子をコードする遺伝子が改質されてい る、請求の範囲第１８項記載のプラスミドベクター。

２２、前記遺伝子が、遺伝子のＤＮＡ配列の１種又はそれ以上のヌクレオチドの 欠失、挿入又は１換により、又は転写もしくは屈託開始もしくは停止シグナルの 欠失により、改質されている、請求の範囲第２１項記載のプラスミドベクター。

２３、親プラスミドベクターであって、（ｉ）−末鎖ＤＮＡプラスミドからの第 １のプラス起点；　（ｉｉ）第１のプラス起点と同族の機能的１遺伝子；　（ｉ ｉｉ）該第１のプラス起点と同じ方向における一本ＭＤＮＡプラスミドからの第 ２のプラス起点；　（ｉｖ）対象のＤＮＡ配列、及び（Ｖ）該プラスミドベクタ ーの導入を意図する細胞のゲノム領域に相同性のＤＮＡ配列を含んで成り、該親 ベクターは該第２及び第１の複製起点（上記の方向における）の間の領域にある 、該第２の複製起点からの複製のために必要とされる複製因子をコードする機能 的遺伝子を欠いている、前記親プラスミドヘクタ２４、前記複製の第２のプラス 起点が、複製の第１のプラス起点と同じ一末鎖ＤＮＡプラスミドから由来する、 請求の範囲第２３項記載のプラスミドベクター。

２５、更に、選択性マーカーを含んでなる、請求の範囲第１８〜２４項のいずれ かに記載のプラスミドベクター。

２６、細菌細胞であって、第１の複製起点および該複製の第１起点からのプラス ミド複製に必要とされる（複数の）因子をコードする１又は複数の機能的遺伝子 を含んで成る、第１のＤＮＡベクター並びに第２の複製起点（この第２の複製起 点からのプラスミド複製に必要とされる因子をコードする機能的遺伝子を欠いて いる）、対象のＤＮＡ配列、及び該プラスミドベクターの導入を意図する細胞の ゲノムのＭ域に相同性のＤＮＡ配列を含んで成る、第２のＤＮＡベクターを含ん でなる、前記細菌細胞。

２７、前記複製の第２起点が、複製の第１起点と同じプラスミドから由来する、 請求の範囲第２６項記載の細胞。

２８、前記第２のＤＮＡベクターが、複製の第２起点と同族の複製因子をコード する遺伝子を欠失している、請求の範囲第２６項記載の細胞。

２９、前記複製の第２の起点と同族の復製因子をコードする遺伝子が改質されて いる、請求の範囲第２６項記載の細胞。

３０、前記遺伝子が遺伝子のＤＮＡ配列の１種又はそれ以上のヌクレオチドの欠 失、挿入又は置換により、又は転写もしくは屈託開始もしくは停止シグナルの欠 失もしくは他の改質により、改質されている、請求の範囲第２９項記載の細胞。

３１、前記第１のＤＮＡベクターが、更に複製の第２の起点と同族の複製因子を コードする機能的遺伝子を含んでなる、請求の範囲第２６項記載の細胞。

３２、前記第２のＤＮＡベクターが更に選択できるマーカーを含んでなる、請求 の範囲第２６項に記載の細胞。

３３、−末鎖ＤＮＡプラスミドからの複製の第１のプラス起点および機能的１遺 伝子を含んでなる第１のＤＮＡベクター、並びに一本ｌＤＮＡプラスミドからの 複製の第２のプラス起点（これは、複製の第２のプラス起点と同族の機能的１遺 伝子を欠いている）、対象のＤＮＡ配列および該細胞のゲノムの領域に相同性の ＤＮＡ配列を含んでなる第２のＤＮＡベクターを含んでなる、請求の範囲第２６ 〜３２項のいずれかに記載の細胞。

３４、前記複製の第２のプラス起点が、複製の第１のプラス起点と同じ１本鎖Ｄ ＮＡプラスミドから由来する、請求の範囲第３３項記載の細胞。

３５、グラム陽性細菌の細胞である、請求の範囲第２６〜３４項のいずれかに記 載の細胞。

３６、前記グラム陽性細菌の細胞が、バチルスＢａｃｉｌｌｕｓ　［又はストレ プトマイシス　Ｓむ「ｅｔｏｍ　ｃｅｓ　＠に属する株である、請求の範囲第３ ５項記載の細胞。

３７、前記細胞が、バチルス　リシエニフォーミス（Ｂａ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　 ｃｏａｇｕｌｕａｎｓ）、バチルス細胞。

３８、請求の範囲第１〜１０項のいずれかに記載の細菌細胞の調製方法であって 、該方法が、請求の範囲第１８〜２５項のいずれかに記載の親プラスミドベクタ ーを用いて細菌細胞を形質転換し、次いで選択的条件下で形質転換された細胞を 培養し、該プラスミドベクターの複製が、第１の複製起点および該第１の複製起 点からのプラスミドの複製に対して要求される（複数の）因子をコードする１種 又はそれ以上の機能的遺伝子を含んでなる第１の子孫ベクター並びに第２の複製 起点（該第２の復製起点からプラスミド複製に対して要求される因子をコードす る機能的遺伝子を欠いている）および対象のＤＮＡ配列および細胞のゲノムの領 域に相同性のＤＮＡ配列を含んでなる第２の子孫ベクターの形成をもたらし、次 いで選択的条件下変質転換された細胞の培養を継続し、相同性組換えにより該第 ２の子孫ベクターを細菌ゲノム内に組込み更に細胞からの第１の子孫ベクターお よび親ヘクターの消失をもたらす、前記方法。

３９゜前記親プラスミドヘクターが、まだ宿主細胞を増殖せしめるような増加せ しめられた温度では複製できないものであり、更に細菌細胞をプラスミドの複製 を許容する温度で最初に培養し、第二の子孫ベクターを細菌ゲノムに組込んだ後 、プラスミドの複製を許容しない温度で培養し、その結果第１の子孫ベクターお よび親ベクターが細胞から消失している、請求の範囲第３８項記載の方法。

４０、請求の範囲第１〜１０項のいずれかに記載の細菌細胞の製造方法であって 、第１の複製起点および該第１の複製起点からのプラスミドの複製に対して要求 される（複数の）因子をコードする１種又はそれ以上の機能的遺伝子を含んでな る第１の子孫ベクター並びに第２の複製起点（該第２の復製起点からプラスミド 複製に対して要求される因子をコードする機能的遺伝子を欠いている）および対 象のＤＮＡ配列および細胞のゲノムの領域に相同性のＤＮＡ配列を含んでなる第 ２の子孫ベクターを用いて細菌細胞を形質転換し、次いで選択的条件下得られた 細胞を培養し、相同性組換えにより該第２の子孫ベクターを細菌ゲノム内に組込 み更に第１の子孫ベクターの消失をもたらす、前記方法。

４１、前記第１のＤＮＡベクターが、まだ宿主細胞を増殖せしめるような増加せ しめられた温度では複製できないものであり、更に細菌細胞をプラスミドの複製 を許容する温度で最初に培養し、第二のＤＮＡベクターを細菌ゲノムに組込んだ 後、プラスミドの複製を許容しない温度で培養し、その結果第１のＤＮＡベクタ ー細胞から失われている請求の範囲第４０項記載の方法。

４２、前記第１のＤＮＡベクターが、更に第２の複製起点から複製に対して要求 される複製因子をコードする機能的遺伝子を１種又はそれ以上含んでなる請求の 範囲第４０項記載の方法。

４３、対象のポリペプチドの調製方法であって、該ポリペプチドに対しコードす る組込まれたＤＮＡ配列を有する請求の範囲第１〜１０項のいずれかに記載の細 菌細胞を、ポリペプチドの生産に導びく条件下で培養し、次いで得られたポリペ プチドを培養物から回収することを含んでなる、前記方法。

４４、ポリペプチドが、酵素、すなわちプロテアーゼ、アミラーゼ又はリパーゼ である、請求の範囲第４３項記載の方法。

明　細　書 細菌ゲノムにおけるＤＮＡの安定な組込み発明の分野 本発明は、ゲノムに組込まれているＤＮＡ作製体を含んで成る細菌細胞、細菌細 胞のゲノムに組込まれることを目的とされるＤＮＡ作製体、該ＤＮＡ作製体を含 んで成るプラスミドベクター、及び細菌ゲノムの中にＤＮＡ作製体を組込む方法 に関する。

発明の背景 組換えＤＮＡ方法による所望するポリペプチドの生産の目的のため、該ポリペプ チドをコードする挿入されている遺伝子情報を保有する組換えプラスミドベクタ ーによって細菌細胞を形質転換せしめる場合、このようなプラスミドはたとえそ れら自体はこの細胞において安定的に遺伝されうるとしても不安定になることが ある。この不安定さは細胞において該プラスミドが不安定に維持されることによ って該プラスミドが事実上細胞集団から消失するか、又は対象のタンパク質をコ ードするＤＮＡが該プラスミドから欠失されうるかのいづれかの形をとる。先の 問題を解決するための伝統的な方法は、淘汰圧のもとで、即ち、典型的には、該 細胞に形質転換されているプラスミド上の抗生物質に対する耐性を授ける生成物 をコードする遺伝子の存在に基づいて対象の細胞が耐性となっている抗生物質の 存在下においてこの形質転換細胞を増殖せしめることであった。しかしながら、 この手法は対象の抗生物質の高価格に基づき大量生産において経済的に実施でき ず、又は環境的理由により所望されていない。培養培地における抗生物質の利用 は衛生局等により認可される生成物を得ることをより困難にもする。

プラスミドを安定化させるためにそれらに、細胞分裂における子孫細胞へのプラ スミドの均等な分配を確実にせしめる分配機能をコードするＤＮＡ配列を挿入せ しめることが従来提案されている。クローン化ＤＮＡ配列の安定な遺伝を達成せ しめる他の方法は、このようなりＮＡ配列の組込みを宿主細菌のゲノムに施すこ とである。現状のプラスミドベクターへのＤＮＡ配列の組込みは、例えばＡ、　 Ｃａｍｐ　ｂ　ｅ　１１゜Ａｄｖａｎｃｅｓ　Ｇｅｎｅｔ−土工、１９６２、頁 １０１−１４５に詳細されているいわゆる「交差」方法により行なわれうる。こ の方法に従ってプラスミドベクターに、細菌ゲノム上の領域と相同性のＤＮＡ配 列、又は他方で、組込む異種ＤＮＡ配列の両側に置かれる２つの相同性配列が付 与される。その後の組込え操作において、このベクター上相同性配列及び隣接配 列は宿主ゲノムの中に相同性領域にて組込まれる。ところである場合において、 組込まれたＤＮＡ配列は淘汰圧の非存在下において、例えばＤＮＡの組込みに重 要な類似のタイプの相同性組換現象によってこの細胞から消失されることが思い 出されている。特に、相同性のＤＮＡ配列間の組換えは宿主細胞ゲノムに組込ま れているＤＮＡ上、又はその付近に存在する複製型ＤＮＡの近傍において刺激さ れることが既に観察されている。Ｐｈ、Ｎｏ１ｒｏｔ　５．Ｊ。

Ｍｏｌ、Ｂｉｏｌ、１９６，１９８７、頁３９−４８；及びＭ、ＹｏｕｎｇとＳ 、Ｄ、Ｅｈｒｌｉｃｈ、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１７１　（５）、１９８９年 ５月、頁２６５３−２６５６を参照のこと。

従って本発明の目的はゲノムＤＮＡ、例えば細菌宿主細胞の染色体の中へのＤＮ Ａ配列の安定な組込みの提供にある。

発明の概要 本発明は、宿主細菌のゲノムの中へのＤＮＡ配列の安定な組込みが、咳組込むＤ ＮＡにおける機能的なプラスミド複製システムの存在を追い出すことにより得ら れうることの発見に基づく。

従って、一つの観点において、本発明は細菌細胞であって、そのゲノム中に（１ ）対象のＤＮＡ配列、（２）該細胞のゲノム領域に相同性のＤＮＡ配列及び（３ ）複製の起点を含んで成る組込み非複製型ＤＮＡ作製体を保有している細胞に関 する。ここで該ＤＮＡ作製体は前記の複製起点からの複製の開始に必要とされる 因子をコードする機能的遺伝子を欠いている。

他の観点において、本発明はＤＮＡ作製体であって、（１）対象のＤＮＡ配列、 （２）該ＤＮＡ作製体の導入を意図されている細胞のゲノムの領域に相同性のＤ ＮＡ配列及び（３）複製の起点を含んで成り、該複製の起点からの複製の開始の ために必要とされる因子をコードする機能的遺伝子を欠いているＤＮＡ作製体に 関する。

本明細書において、「非複製型ＤＮＡ作製体」なる語は、自立的に複製すること ができず、従って宿主細胞ゲノムと一緒に複製されるＤＮＡ配列を意味すること を意図している。

該ゲノムは染色体及び安定的に遺伝される染色体外因子を含んで成る。「対象の ＤＮＡ配列」なる語は、所望のＲＮＡもしくはタンパク質生成物（宿主細胞に異 種又は天然のもの）をコードしうる配列、又はそれ自体が宿主細胞に所望の性質 、例えば以降に記載の突然変異表現型を授ける配列を表わすために用いている。

該相同性ＤＮＡ配列は一般に宿主細胞のゲノムに由来するものであり、そして該 宿主細胞の生存又は適切な□機能のために本質的でないゲノムの領域に相同性の ものでありうる。他方、該相同性ＤＮＡ配列は、相同性組換えによる本発明のＤ ＮＡ作製体の組込みは細胞に突然変異表現型（該ＤＮＡ作製体が組込まれている 細胞の選択のためのマーカーとして働きうるちの）を発現させることをもたらし うるように選ばれることもできる。例えばもしこのＤＮＡ作製体を転写ユニット を分断しながらその中に組込む場合、この転写ユニット内に含まれる１又は複数 の遺伝子はこれによって発現されなくなる。他方、該相同性ＤＮＡ配列は、宿主 ゲノムにとって天然ではないが、その他の生物からクローンされ、又は合成され 、そしてその後本発明のＤＮＡ作製体の組込みの前に任意の常用の方法、例えば 交差によって該宿主ゲノムの中に導入されうるちのでありうる。該相同性ＤＮＡ 配列は問題の宿主細胞にとって天然であるか異種であるかは関係なく、対象のＤ ＮＡ配列を含んで成る又はそれより構成されるものでありうる（例えば、細胞に おいて対象のＤＮＡ配列のコピー数の増幅を所望する場合における細胞にとって の性質については以下を参照のこと）。本明細書において「相同性」なる語は少 なくとも９個の連続塩基対が同一である配列として定義されうることか理解され るべきである。

本発明の詳細な説明 本発明に関して、細菌ゲノムの中へのＤＮＡの安定な組込みを特定のタイプの複 製システム（いわゆるローリングサークル型複製；以下参照）を有するプラスミ ドについて示しているが、プラスミド上のシス作用配列（このようなシス作用Ｄ ＮＡ配列は複製起点と総称されている）からの複製の開始のために１又は複数の トランス作用因子（即ち、ＲＮＡもしくはタンパク質因子）を必要とするメカニ ズムにより複製される全てのプラスミドが本目的に有用でありうることも通常予 測される。プラスミド複製のために不可決な因子を以下、複製因子と称する。該 ＤＮＡ作製体が、該ＤＮＡ作製体上に含まれている複製起点により必要とされる 複製因子をコードする機能的な遺伝子を欠く場合、活性複製因子は生産されず、 その結果としてこの起点からの複製は開始されない。

必要とされる複製因子をコードする機能的遺伝子を欠く本発明のＤＮＡ作製体を 得るため、該遺伝子全体を削除すること又はそれが不活性な複製因子をコードす るようにこれを改質せしめることのいづれかを行うことができる。該遺伝子のこ のような改質は、周知の方法における該遺伝のＤＮＡ配列の１又は複数のヌクレ オチドの欠失、挿入又は置換によるか、あるいは転写又は翻訳の開始もしくは停 止シグナルの同様の改質により実施されうる。

上述した複製システムは本発明の細菌細胞の作製方法に利用されうる。本発明の 一態様において、親ヘクターと称する本目的のためのプラスミドベクターをまず 作製する。該親ベクターは（ｉ）第１の複製起点；　（ｉｉ）該第１の複製起点 からの複製のために必要とされる複製因子をコードする１又は複数の機能的遺伝 子＋　（１１１）該第１の複製起点と同一の方向における第２の複製起点；　（ ｉｖ）対象のＤＮＡ配列、及び（Ｖ）該ベクターの導入を意図する細胞のゲノム 領域に相同性のＤＮＡ配列、を含んで成り、該親ベクターは該第２及び第１の複 製起点（上記の順における）の間の領域にある、該第２の複製起点からの複製の ために必要とされる複製因子をコードする機能的遺伝子を欠いている。本明細書 における「プラスミド」なる語は、自立複製型体外染色体因子として機能できる バクテリオファージ又はその他のＤＮＡ分子を表わすことを意図していることも 理解されるべきである。

本発明に従い、この親ベクターを次に細菌細胞の中に形質転換せしめ、そしてこ の形質転換細胞を該ベクターの複製を可能とする条件のもとて培養せしめる。

該形質転換細胞における該親ヘクターの複製は２種類の異なる子孫ベクターの形 成を発生せしめる。

第１の子孫ベクターは（ｉ）第１の複製起点；　ｌｉ）該起点からの複製に必要 とされる（複数の）複製因子をコードする１又は複数の遺伝子、を含んで成る。

第２の子孫ベクターは、（ｉ　ｉ　ｉ　）第２の複製起点；（ｉｖ）対象のＤＮ Ａ配列、及び該プラスミドベクターの導入を意図する細胞のゲノムの領域に相同 性のＤＮＡ配列を含んで成り、該第２子孫ベクターはこれが保有する該第２の複 製起点からの複製に必要とされる複製因子をコードする機能的遺伝子を欠いてい る。親ベクターからの２種類の子孫ベクター分子の形成は種々のメカニズムによ り行なわれる。即ち、該プラスミドの複製の方法、例えば一本積Ｄ　Ｎ　Ａプラ スミドのローリングサークル複製（以降参照）の結果であるか、又は該プラスミ ドベクター上に存在する２つの複製起点を含む及び／もしくはそれらに隣接する ＤＮＡ領域間の相同性組換えの結果として行なわれる。

該第２起点が該親プラスミド上に該第１起点と同一の方向性において置かれてい る場合、該細菌ゲノムの中に組込んで該第２起点の下流ではあるが該第１起点の 上流に位置せしめることを意図する種々のＤＮＡ配列（即ち、対象のＤＮＡ配列 及び細胞のゲノムの領域に相同性のＤＮＡ配列）はプラスミド複製の後に第２の 子孫ベクター上に存在しているであろう。形質転換細胞の培養を続けることは相 同性組換えによる該細菌ゲノムへの前記の第２子孫ヘクターの組込み及び該細胞 からの第１子孫ベクターの消失を、一定の頻度により自発的にもたらしうる。

該第２子孫ベクターを組込んだゲノムにおける細胞についての選別を促進せしめ るため、このベクターは選択マーカーが好適に付与されている。この場合におい て、該細胞を選択条件、即ち、該選択マーカーの保持されている細胞のみが生存 しうる条件のもとで培養することができる。この選択マーカーは細胞に抗生物質 耐性を授ける、又は栄養要求変異株に原栄養株性を授ける生成物をコードする遺 伝子でありうる（例えば、ｄａ１株に導入されているｄａｌ遺伝子；Ｂ、Ｄｉｄ ｅｒｉｃｈｓｅｎ１９８６、頁３５−４６を参照のこと）。これらの条件のもと で生存する細胞は親プラスミドベクターを含むか、もしくは細胞における親ベク ターの複製に基づいて形成される両方の子孫ベクターを含む細胞であるか、又は 本発明のＤＮＡ作製体を含んで成る第２子孫ベクターが組込まれている細胞のい づれかである。該親ヘクター及び第１子孫ベクターは事実上消失しており、そし て本発明のＤＮＡ作製体を含んで成る該第２子孫ベクターは高頻度でこの宿主ゲ ノムの中に自発的に組込まれていることが驚くべきことに見い出せた。

該ＤＮＡ作製体の組込みが行なわれる効率を高めることを所望する場合、該親ベ クターとして、一定（許容）条件のもとて複製でき、且つ他（非許容）の条件の もとでは複製できないプラスミドが利用されうる。このプラスミドは例えば複製 に関して温度感受性のものでありうる。従って、本発明の方法の態様において、 該親ベクターは高い温度では複製できないが、しかし宿主の増殖は可能とするも のである。該細菌細胞をまず室温で培養してプラスミド複製及び二種類の子孫ベ クターの形成を行い、その後、細菌ゲノムの中への本発明のＤＮＡ作製体を含ん で成る第２子孫ヘクターの組込みを行なった後に、該第１子孫ヘクター及び該親 ベクターが該細胞から消失するようプラスミド複製が可能でない温度で培養する 。非許容温度での培養は、適当な選択マーカーを含む組込まれたＤＮＡ作製体を 含む細胞のみが生存することを確実にせしめる選択条件のもとで行う。

組込みの効率及び細胞からの第１子孫ベクターのその後の消失を高める他の方法 は、前記の通りの選択条件下で宿主細胞を培養せしめた後に、この親ベクターに より形質転換されている細胞をプラスミドキユアリング剤、例えばノボビオシン （ｎｏｖｏｂｉｏｃｉｎ）（Ｇａｄｏ、Ｉ、ら、１９８７゜ｚｂｌ、Ｂａｋｔ、 Ｈｙｇ、Ａ、２６５．１３６−１４５）により処理することでありうる。

同一の親ヘクター上に２種類の異なるプラスミドに由来する複製起点を利用する ことが可能である。これは該第１及び第２複製起点の両方からの複製を開始させ ることができる同一の（複数のン複製因子により機能化されるために互いに十分 に類似していることを条件とする。他方、該プラスミドベクターは前記した相同 性組換えがなされるために相同性領域を含むべきである。しかしながら、第１の 複製起点（及びそれに結合している、複製因子をコードする遺伝子）は、本発明 が基礎とする複製メカニズムが最大に機能することを確実にするために第２複製 起点と同一のプラスミドに由来することが好ましい。

実用的な理由により、該第１及び第２の複製起点がらの複製が開始されることの できない、又はこれらの起点からの複製の速度が非常に遅い生物において、該プ ラスミドベクターの初期作製を行うことが好ましいことがある。従ってこのプラ スミドベクターは、該ベクターが２種類の異なる生物において複製されることが できるようにする、更なる複製起点の付与されているシャトルベクターでありう る。この更なる複物はよく詳細されており、そして組換えＤＮＡ実験のために常 用されており、それ数組換えＤＮＡ操作によってプラスミドを作製するために適 切である。更にこのシャトルベクターは更なる選択マーカー、例えば抗生物質耐 性遺伝子を、旦。

ユニにおけるベクターの選別のために含んで成りうる。更なる複製起点及び選択 マーカーは第１起点及び／又は複製因子の後ではあるが第２起点を超えないこと が好ましく、これによってこの第１及び第２起点からのベクターの複製に基づき 、これらの更なる配列は、親ベクターにより形質転換されている細菌細胞から事 実上消失する第１子孫ヘクターに保有されるであろう。

本発明の細菌細胞の生産の他の方法において、宿主細胞を、第１ｏ：）複製起点 からのプラスミド複製のために必要とされる因子をコードする機能的遺伝子が結 合している第１の複製起点を含んで成る第１ＤＮＡベクターにより形質転換せし め、そしてその後又はそれと同時に、第２の複製起点からのプラスミド複製のた めに必要とされる因子をコードする結合した機能的遺伝子を欠き、第２の複製起 点並びに対象のＤＮＡ配列及び該細胞のゲノムの領域に相同性のＤＮＡ配列を含 んで成る第２ＤＮＡヘクターによる共形質転換によって形質転換せしめる。該第 ２ベクターは選択マーカーも付与されていることが好ましい。次に該第１及び第 ２ＤＮＡベクターを含む得られる細胞を好ましくは前記の選択条件下で培養せし め、このことは相同性組換えによる細菌ゲノムの中への該第２ベクターの組込み 及び該第１ベクターの消失を事実上もたらし、従って選別は必要とされない。上 記の方法においてはまず一種類のプラスミドベクターを利用するため、この第１ ＤＮＡベクターはその複製が該ベクターにより形質転換されている細胞を培養す るための許容及び非許容条件に依存するものでありうる。従って本発明の方法に おける該第１ＤＮＡヘクターは、高い温度で複製することはできないかしがし宿 主細胞の増殖は可能とするものであり、それ放線菌細胞をまずプラスミド複製の 可能な温度で培養し、その後、該細菌ゲノムの中に、該第２ＤＮＡベクターを組 込んだ後に、プラスミド復製のできない温度で培養して該第１ＤＮＡヘクターを この細胞から消失させ、そして選択条件のもとで培養して該第２ＤＮＡベクター の組込まれた細胞のみが生存できるようにする。

同様に、この形質転換細胞を前記したプラスミドキユアリング剤により処理する ことがある。

組込まれた上記の非複製型ＤＮＡ作製体を含む細胞の両方の作製方法において形 成される中間体は、第１複製起点からのプラスミド複製のために必要とされる（ 複数の）因子をコードする１又は複数の機能的遺伝子が結合している第１の複製 起点を含んで成る第１ＤＮＡベクター、更には第２の複製起点、並びに対象のＤ ＮＡ配列及び該細胞のゲノムの領域に相同性であるＤＮＡ配列を含んで成る第２ ＤＮＡベクターを含んで成り、該第２ヘクターはこれが保有する複製起点からの 複製のために必要な複製因子をコードする機能的遺伝子を欠いている。

第２ＤＮＡベクター上の複製起点であって、該起点からの複製のために必要とさ れる複製因子をコードする機能的遺伝子を欠いているものを得るため、この遺伝 子を該ベクターから欠失せしめること、又はそれを前記した方法において改質せ しめることが可能である。特に２種類の異なる複製起点を利用する場合、該第１ ベクターは該第２複製起点からの複製を開始せしめるのに必要な複製因子をコー ドする遺伝子をも付与されることがありうる。この方法において、該第２ＤＮＡ ベクターの複製は該第１ＤＮＡベクターから生産された第２の複製因子に依存し 、従って該第１ベクターがこの細胞から消失した場合該第２ベクターは非複製型 となる。しかしながら、この第１及び第２の複製起点は同一のプラスミドに由来 することもでき、この場合においては完全な複製因子をコードする１種の遺伝子 のみがこの第１ベクター上に必要とされる。

本発明の目的のため、該プラスミドベクター又は該第１と第２ＤＮＡベクターが 中に形質転換される細菌細胞はグラム陰性及びグラム陽性の両者でありうるが、 グラム陽性細菌の細胞が好ましく、なぜならゲノム陰性菌からよりもゲノム陽性 菌からポリペプチドの細胞外発現を得ることが一般的ムこ容易であるからである 。従って、該細菌はバチルス（Ｂａｃｉｆｌｕｓ）又はストレプトマイシス（旦 ｒｅ　ｔｏｍ　ｃ１且）属に属する株、特にバチルス　リシェニフォーミスラン ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｏａｇｕｌｕａｎｓ）、ｚ＜土木発明は、現状ではコ ンピテントにすることによっても形質転換できない（又は少なくとも、その天然 の受容メカニズムが未だ明らかにされていないもの）が、例えばプロトプラスト 形成モしくはエレクトロポレーションを含む操作により形質転換されうる細菌、 例えばバチルス　リシエニフォーミス又はバチルス　レングスの一定の株のゲノ ムに対象のＤＮＡ配列の安定な相同性組込みを提供する唯一の有効な方法と考え られる。従って本方法は、このような生物における有効な形質転換及びＤＮＡの 安定な組込みが特に重視される。形質転換率が低い、典型的にはＤＮＡｕｇ当り １０〜５０個の形質転換体（ＤＮＡｕｇ当りの形質転換体が典型的に１０６−１ ０′′個のオーダーである例えばコンビテンＩ−Ｅ、２１Ｊ又は旦、スブチリス と比較して）におけるような生物に関して特に注目される。

本発明の細菌細胞において、対象のＤＮＡ配列は便宜上対象のポリペプチドをコ ードするものであり、そしてこの結果として本発明は対象のポリペプチドを生産 する方法であって、該ポリペプチドの生産を助成する条件のもとで、該ポリペプ チドをコーしする組込まれているＤＮＡ配列を含む本発明に関する細菌細胞を培 養せしめ、そして得られるポリペプチドをこの培養物から回収せしめることを含 んで成る方法に関する。本方法により生産されるポリペプチドは細菌において有 利に生産されるあらゆるポリペプチド、例えば酵素、例えばプロテアーゼ、アミ ラーゼ又はリパーゼでありうる。

本発明の好ましい態様の説明 グラム陽性菌由来のプラスミドの大集団を、複製中間体として一本鎖ＤＮＡを作 り上げるいわゆる「ローリングサークル型複製」メカニズムにより複製せしめる 。複製は、プラスミドコード化タンパク質Ｒｅｐが復製起点配列（プラス起点） を認識し、そしてのＤＮＡ鎖の一方に（プラスＭ）ニックを生じた場合に開始さ れる。このプラス鎖を次に追い出し、そして新たなプラス鎖を３’　−ＯＨ伸長 によってこのニックから重合せしめる。このＲｅｐタンパク質がその後終止配列 （これはプラス起点に重複している）を認識した時、完全に複製された鎖及び追 い出された鎖の一末鎖ＤＮＡ七ツマーを作り上げるための最初の箇所と同し位置 にて第２のニックが作られ、これらの末端は環状分子を形成するためにリゲート する。次いで宿主因子は一本鎖ＤＮＡ分子の二本鎖ＤＮＡへの変換を確実にする （このタイプのプラスミドのより詳細な説明については、Ａ、ＧｒｕｓｓとＳ、 Ｄ、ＥｈｒｉｃｈのＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏ　１ｃａｌ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　５３（ ２）、１９８９年６月、頁２３１−２４．１を参照のこと）。

本目的に関し、この複製システムを伴うプラスミドを一本鎖ＤＮＡプラスミドと 称する。

ローリングサークル型複製メカニズムは、対象のＤＮＡ配列及び細胞のゲノムの 領域に相同性であるＤＮＡ配列とは別に、プラス複製起点と同族の機能的工！且 遺伝子を欠いた、一本１ｊ（Ｄ　Ｎ　Ａプラスミド由来のプラス複製起点を含ん で成るＤＮＡ作製体を保有する本発明に関する細菌細胞を生産するために、本発 明に従って利用できうることが驚くべきことに見い出せた。

この細菌細胞は、親プラスミドベクターであって（ｉ）　一本ｔＪＭ　Ｄ　Ｎ　 Ａプラスミド由来の第１のプラス起点；　（ｉｉ）該第Ｉのプラス起点と同族の 機能的１遺伝子；　（ｉｉｉ）該第１のプラス起点と同一の方向性における、一 本ＩＱＤＮＡプラスミド由来の第２のプラス起点；（ｉν）対象のＤＮＡ配列、 及び（ｖ）該プラスミドヘクターの導入を意図する細胞のゲノムの領域に相同性 であるＤＮＡ配列、を含んで成る親プラスミドベクターを用いる本発明の方法に より作製されることができ、該親ベクターは該第２と該第１プラス起点との間の 上記と同一の方向における領域において該第２プラス起点と同族の機能的ｒｅｐ 遺伝子を欠いている。

該親ヘクターの複製に基づき、第１及び第２子孫ＤＮＡヘクターが、おそらく以 下のメカニズムに従って形成される：Ｒｅｐタンパク質は該第１プラス起点に二 ツクを作り上げることにより複製を開始させ、そして該第２のプラス起点にてニ ックを作り上げるために進む。追い出された鎖は再すゲートして、−末鎖Ｄ　Ｎ 　Ａプラスミド由来の第１プラス複製起点及び該第１プラス起点と同族の機能的 上皇り遺伝子を含んで成る第１子孫ヘクターを形成する。同様に、このＲｅｐタ ンパク質はこの第２プラス起点から進行してこの第１プラス起点にニシクを作り 上げ、このようにして、追い出された鎖の再すゲーション及び−末鎖ＤＮＡから 二本鎖ＤＮＡへの変換に基づき、第２プラス複製起点と同族の機能的１二１遺伝 子を欠く、−末鎖ＤＮＡプラスミド由来の第２プラス複製起点、並びに対象のＤ ＮＡ配列及び該細胞のゲノムの領域に相同性であるＤＮＡ配列を含んで成る第２ 子孫ヘクターが形成される。この第２子孫ベクターは機能的工Ｕ遺伝子を含まな いため、この分子の複製は該第１子孫ベクター又は親ベクターのいづれかからの 翻訳において供給されるＲｅｐタンパク質に全体的に依存する。

他方、この２種類の子孫ベクターは親ベクター上に存在する２つの起点を含む及 び／又はそれに近傍の相同性Ｄ　Ｎ　Ａ　ｉＮ域間の組換えの結果としても形成 されうる。

前記の親プラスミドにおける第１プラス起点が、プラスミド複製の終結を確実に するには十分であるが機能的な起点を構成するには小さすぎる、起点領域由来の 小さなりＮＡフラグメントによって置換されている場合、機能的複製起点を有さ ない第２子孫ベクターが形成されうる。このようなフラグメントはｐＵＢｌ　１ ０　（Ｂｏｅら、１９８９．Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、１７１．３３６６−３ ３７２）及びｐｃ１９４（Ｇｒｏｓら、１９８７．ＥＭＢＯＪ、、６．３８６３ −３８６９）において同定されている。

該細菌細胞は、機能的なエエＬ遺伝子の結合した一本鎖ＤＮＡプラスミド由来の 第１プラス復製起点を含んで成る第１ＤＮＡベクターにより宿主細胞を形質転換 せしめ、そしてその後又は同時に、共形質転換によって該宿主細胞を、第２プラ ス複製起点に同族の機能的工Ｕ遺伝子は欠くが、対象のＤＮＡ配列及び該細胞の ゲノムの領域に相同性であるＤＮＡ配列は含んで成る、一本領ＤＮＡプラスミド 由来の第２プラス複製起点を含んで成る第２ＤＮＡベクターにより形質転換せし めること、を含んで成る本発明の方法によって択一的に作製されうる。この第２ ＤＮＡベクターはこの第１　ＤＮＡベクターから供給されるＲｅｐタンパク質の 存在に基づいて細胞に維持される。

該親ヘクター又は第２ＤＮＡベクターが改質Ｕ遺伝子を含んで成る場合、第２プ ラス起点はこの改’ｌ工１ｚ遺伝子の前方に置くか又はその中に置くことができ る。前記した通り、この第２プラス起点は第１プラス起点と同−又は異なるプラ スミドに由来しうる。この第１及び第２プラス起点が異なるプラスミドに由来し 、従って複製が同一のＲｅｐタンパク質によって両方の起点から開始されない場 合、この第１ＤＮＡベクターはこの第２プラス起点からの複製を開始せしめるこ とができる活性Ｒｅｐタンパク譬をコードするｌ遺伝子を更に含むことができる 。この親ヘクター又は第２ＤＮＡヘクターは前記した選択マーカーも含んで成る ことができる。

組込み工程を向上させる好ましい態様において、ベクターであってその複製が宿 主を培養せしめる温度を含む許容条件に依存するものが利用できる。従って、該 第１及び第２ＤＮＡベクターを含む宿主細菌をプラスミド複製のための許容温度 で培養せしめる場合、この第１ＤＮＡヘクターから作られるＲｅｐタンパク質は 該細胞において第２ＤＮＡヘクターを維持させるために働くであろう。しかしな がら、該第１ＤＮＡヘクターが複製することのできない非許容温度では、この第 １ヘクター及びその結果それより作られるＲｅｐタンパク質はこの細胞から消失 し、従ってこの第２ＤＮＡヘクターはもはや複製することができなくなるであろ う。淘汰圧、例えば抗生物質の存在下のもとて培養を続けることにより、選択マ ーカーをコードする遺伝子を含む本発明の挿入ＤＮＡ作製体をゲノムの中に含む 細胞のみが生存し続ける。

１ＤＮＡ作製体が宿主細胞のゲノムに組込まれたなら、これらは淘汰圧の非存在 下において細胞からの該ＤＮＡ作製体又はその一部の結果的な消失を伴うことな く培養されうろことに注目すべきである。このことは、この組込まれたＤＮＡが 自立複製できないが、宿主ゲノムと一緒では複製される事実に起因すると考えら れている。この組込まれたＤＮＡの自立複製の欠如は、組換えプロセスに重要で あると考えられている一本鎖ＤＮＡ中間体の形成がなされず、従って組込まれた ＤＮＡは該宿主ゲノムから除去されていることを意味する（参照文献：Ｐｈ、Ｎ ｏ１ｒｅｔら、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ。

１９６．１９８７、頁３９−４８；及びＭ、ＹｏｕｎｇとＳ。

Ｄ、Ｅｈｒｌｉｃｈ、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１７１　（５Ｌ１９８９年５月 、頁２６５３−２６５６）。

この組込まれたＤＮＡ作製体を、高めた淘汰圧、例えば高い濃度の抗生物質のも とて形質転換細胞を培養せしめることにより増幅することが可能であることが見 い出されている。

淘汰圧の非存在下において、このような増幅コピーはしばしば細胞から消失する ことが見い出されている（参照文献）。

これに比べ、本発明は細菌細胞であってその中に組込まれているＤＮＡ配列の増 幅コピーが宿主において安定に維持されている細胞を提供し、なぜなら前記した 通りこの組込まれているＤＮＡは非複製型であるからである。本発明を主として 異種ＤＮＡ配列の組込みに適するものとして上述してきたが、本発明は特定の遺 伝子生成物の生産を高めるため、宿主細胞に相同性である遺伝子の増幅されたコ ピー数を得るためにも適切であることを注目すべきである。

図面の簡単な説明 本発明を添付した図面を参照しながら更に説明する。ここで： 図１はプラスミドｐＤＮ３０００の制限地図を示し、図２はプラスミドｐＥ１９ ４の制限地図を示し、図３はプラスミドｐＰＬ１９７５の制限地図を示し、図４ はプラスミドｐｓＸ１２０の制限地図を示し、図５はプラスミドｐＰＬ２００２ の制限地図を示し、図６はプラスミドｐＤＮ３０６０の制限地図を示し、図７は プラスミドｐｓＪ１０８５の制限地図を示し、図８はプラスミドｐＵｃＩ９の制 限地図を示し、図９はプラスミドｐｓＪ１１０３の制限地図を示し、図１０はプ ラスミドｐｓＪ１１３０の制限地図を示し、図１１はプラスミドｐｓＪ１１３６ の制限地図を示し、図１２はプラスミドｐｓＪ１１３７の制限地図を示し、図１ ３はプラスミドｐＰＬ１４８４の制限地図を示し、図１４はプラスミドｐｓＪ１ １５５の制限地図を示し、図１５はプラスミドｐｓＪ１１５７の制限地図を示し 、図１６はプラスミドｐｓＪ１２５９の制限地図を示し、図１７はプラスミドｐ ＤＮ２９０４の制限地図を示し、図１８はプラスミドｐｓＪ１１３９の制限地図 を示し、図１９はプラスミドｐｓＪ１１３９ａの制限地図を示し、図２０はプラ スミドｐｓＪ１１３９ｂの制限地図を示し、図２１はプラスミドｐｄｎ３０２０ の制限地図を示し、図２２はプラスミドｐＰＬ１８７８の制服地図を示し、図２ ３はプラスミドｐＰＬ１８９６の制限地図を示し、図２４はプラスミドｐＳＪ９ ９３の制限地図を示し、図２５はプラスミドｐｓＪ１１６３の制限地図を示し、 図２６はプラスミドｐｓＪ１１３６ａの制限地図を示し、図２７はプラスミドｐ ｓＪ１１６３ｂの制限地図を示し、図２８はプラスミドｐｓＪ１２５９ａの制限 地図を示し、図２９はプラスミドｐｓＪ１５５５の制限地図を示し、図３０はプ ラスミドｐｓＪ１５５５ａの制限地図を示し、そして 図３１はプラスミドｐｓＪ１５５５ｂの制限地図を示す。

全ての図面において、矢印は転写の方向を示す。

見易くするため、複製起点（＋ｏｒｉ　ｐＵＢ　１１０゜＋ｏｒｉ　ｐＥ　１９ ４．ｏｒｉ　ｐＵＣ１９）は、たとえ機能的な起点が大きめのＤ　Ｎ　Ａ　領域 より構成されているとしても、複製に関する事実上の開始部位により表示した。

本発明を以下の実施例において更に説明する。これらは本発明の範囲を限定する 意図はない。

材料及び方法 プラスミド ｐＢＤ６４　：Ｇｒｙｃｚａｎら、１９８０に詳細。

ｐＤＮ３０６０：多数の有用な制限部位を含む合成オリゴヌクレオチドの挿入に よってバチルス属プラスミドｐＤＮ１０５０　（Ｄｉｄｅｒｉｃｈｓｅｎ、Ｂ、 、１９８６）より得られるクローニングベクター。制限地図を図６に示す。

ｐＤＮ２９０４：クロラムフェニコール耐性遺伝子及びカナマイシン耐性遺伝子 の両方を含む、バチルス属プラスミドｐＵ８１．１０　＜Ｇｒｙｃｚａｎら、１ ９７８）の誘導体。制限地図は図１７に示す。

ｐ　Ｐ　Ｌ　１４８４　：カナマイシン耐性遺伝子を含むｐＤＮ２９０４由来の １．４ｋｂのＢａｍＨＩ７ラグメントの挿入されている改質ポリリンカー領域を 含む、ｐｌＪｃ１９　（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎら、１９８５）誘導体。

制限地図は図１３に示す。

ｐＰＬ１８７８：サーモアナエロハクター（Ｔｈ、ｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃ ｔｅｒ）種ＡＴＣＣ５３６２７を起源とするシクロデキストリングリコジルトラ ンスフェラーゼ（ＣＧＴａｓｅ）をコードする２、４ｋｂのＨａｅｌｌ−３ｐｔ フラグメントを含むρＤＮ１３８０（ＤｉｄｅｒｉｃｈｓｅｎとＣｈｒｉｓｔｉ ａｎｓｅｎ、１．９８８に詳細）。この遺伝子は１２．８ｋｂのＥｃ　ｏＲＩフ ラグメント上において、Ｅ、ｒ’ＪプラスミドｐＢＲ３２２の中にクローンされ ている（Ｓ　ｔ　ａｒｎｅｓら、１９８９）。この制限地図は図２２に示す。

抹 呈、葺　ＳＪ６：ＭＣ１００Ｏの制限欠失誘導体（Ｄ　ｉ　ｄｅｒｉｃｈｓｅｎ ら、１９９０）。

バチルス　スプチリス　ＤＮ１８８５：Ｂ、スブチリスの１ｇ２−　Ｅ　、　エ エＬＲ２、１Ｌ〔、Ｐ　ｒ　ｏ　゛誘導体（Ｄｉｄｅｒｉｃｈｓｅｎら、１て染 色体欠損を含むＤＮ１２８０の二 Ａ二誘導体。

バチルス　リシェニホーミス　ＡＴＣＣ９７８９バチルス　上ヱ叉ス　ＮＣｌＢ １０３０９絶壇二 ＴＹ：　トリブチカーゼ　２０ｇ／ｌ 酵母抽出物　５ｇ／Ｉ Ｆ　ｅ　Ｃｌｚ　４　Ｈ２０６ｎｇ／　ＩＭｎ　Ｃｌｘ　４　Ｈｚ　Ｏ１ｍｇ／ 　ｌＭｇＳＯ４７ＨｚＯ１５ｎ＋ｇ／ｌ ｐＨ７，３ ＴＹ９　：　ＴＹ培地と同じであるが、但しｐＨをＮａＨＣＯ３（０，ＬＭ）を 加えることによって８．５に調製。

ＴＹ９　アガーニトリブチカーゼ　２０　ｇ　／　１酵母抽出物　５ｇ／ｌ ＦｅＣ１ｚ　４Ｈｚ　０　６ｍｇ／Ｉ Ｍｎ　Ｃｌｚ　４　Ｈ２０１ｍｇ／　ｌＭｇ５Ｏ，−７Ｈｚ　０　１５ｍｇ／ｌ パクトアガー　５ｇ／Ｉ Ｎ　ａ　ＨＣＯ３（０、１Ｍ　）によりｐ）１８．５に調製 ＢＰＸ：　ポテトスターチ　１００ｇ／］バーレーフラワー　５０　ｇ　／　Ｉ ＢＡＮ５０００ＳＫＢ　０．１ｇ／ｌ カゼイン酸ナトリウム　１０ｇ／ｌ ダイズ食品　２０　ｇ／　Ｉ Ｎａｚ　ＨＰＯａ　、Ｌ　２Ｈ２０９ｇ／ｌプルロニック　Ｏ，ｉｇ／Ｉ ＬＢアガー：　バクトドリプトン　１０ｇ／ｌバクト酵母抽出物　５　ｇ　／　 １ −船方法 プラスミドを作製するために用いる実験技術は組換えＤＮＡ技術の分野における 標準的な技術であった。参照文献、Ｔ。

Ｆ１ａｎ１ａｔｉｓらのＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　：Ａ　Ｌａｂｏｒ ａｔｏｒ　Ｍａｎｕａｌ。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９８２゜制 限エンドヌクレアーゼをＮｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ及びＢｏｅｈ ｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍより購入し、この製造業者により推奨される通 りに使用した。

Ｔ４　ＤＮＡリガーゼはＮｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓより購入し、 そしてこの製造業者により推奨される通りに使用した。

全ての株からのプラスミドＤＮＡの調製はＫｉｅｓｅｒ。

１９８４に詳細の方法によって行った。

Ｅ、コリの形質転換： Ｅ、コリの細胞をコンピテントにし、そしてＭａｎｄｅｌとＨｉｇａ、１９７０ に詳細の通りに形質転換せしめるか、又はＢＩＯ−ＲＡＤシーンパルサー（Ｇｅ ｎｅ　Ｐｕ１ｓｅｒ）エレクトロポレーション装置に関する仕様書において詳細 の通りにエレクトロポレーションによって形質転換せしめた。

Ｂ、スブチリスの形質転換： コンビテント細胞を調製し、そしてＹａｓｂｉｎら、工９７５に詳細の通りに形 質転換せしめた。

Ｂ、リシェニホーミスの形質転換ニ ブラスミドをＢ、リシエニホーミスの中に、Ａｋａｍａｔｚｕ、１９８４に詳細 の通、りにポリエチレングリコール中介プロトプラスト形質転換によって導入せ しめた。

旦−２１叉スの形質転換 プラスミドを一司一−ｋｊ嘗乞り、の中に、Ａｋａｍａ　ｔ　ｚ　ｕ　（１９８ ４）による方法を若干改良した方法に従ってプロトプラスト形質転換によって導 入せしめた。この改良は、再生培地における高めのｐＨである。例えばＨＣＰｌ 、５培地を、この培地に０．１ＭのＮ　ａ　ＨＣＯｆｆを加えることによりｐＨ ８，５に緩衝化せしめた。

実施例１ バチルスレンタス力色体における非　＋１刑ＤＮＡ　子の一定星■五立 スブチリシン３０９の遺伝子のクローニンゲスブチリシン３０９と命名されてい るプロテアーゼをコードする遺伝子を、ｗｏ８９１０６２７９に詳細の通り、Ｂ −２７１１株ＮＣｒＢ１０３０９の単離体からクローン化した。

更なるサブクローニングは、ｐＵＢｌｌｏの複製起点、ｐｃ１９４由来のクロラ ムフェニコール耐性遺伝子（ｃａｔ）、２つのプロモーターＰＡｆｆｉ、Ｍ及び ＰＡ＃ｙＱ並びにズブチリシン３０９プロテアーゼをコードする遺伝子を含むプ ラスミドｐｓＸ１２０をもたらした。（図４及び国際特許出願ＰＣＴ／ＤＫ９０ １００１６４号を参照のこと） 組込みプラスミドｐＰＬ２００２の作製ｐＵｃ１９　（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒ ｒｏｎら）をＥｃ。

Ｒ１により制限せしめ、そして以下のオリゴヌクレオチド配列（Ｂｅａｕｃａｇ ｅとＣａｒｕｔｈｅｒｓ、　Ｔｅｔｒｅｈｅｄｒｏｎ　１ｅｔｔｅｒｓ　２２＋ 　１９８１゜頁１８５９−１８６９により詳細のホスホアミダイト法により、自 動ＤＮＡ合成装置において調製） ＡＡＴＴＧＡＴＣＡＡＧＣＴＴＴＡＡＡＴＧＣＡＴＧＣＴＡＧＣＡＡＣＧＣＧＧ ＣＣＧＣＣＡＡＣＣＴＣＧＡＧＡＴＣＴＡＴＧ ＣＴＡＧＴＴＣＧＡＡＡＴＴＴＡＣＧＴＡＣＧＡＴＣＧＴＴＧＣＧＣＣＧＧＣＧ ＧＴＴＧＧＡＧＣＴＣＴＡＧＡＧＴＡＣＴＡＡ を直鎖状のｐＵｃ１９の中に挿入せしめ、その後リゲーシゴンを行うことにより 、プラスミドｐＤＮ３０００を作製した。

このリゲーシゴン混合物を次にコンピテントＥ、コリＳＪ６細胞を形質転換せし めるために用い、そして１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢプレート上 で形質転換体を選別した。ｐＤＮ３０００に挿入されたリンカ−の方向性は図１ における制限部位の方向により示した通りである。

ＢｇｌｌｌによってｐＤＮ３０００を制限化せしめ、その後のこの直鎖状のプラ スミドとｐＥ１９４　（図２、ＨｏｒｉｎｏｕｃｈｉとＷｅｉｓｂｌｕｍ）のＭ ｂｏｌによる制限化により得られる位置１から１５８５迄のＤＮＡを含むＭｂｏ ｌフラグメントとのりゲーションにより、プラスミドｐＰＬ１９７５を作製した 。このリゲーション混合物を次にコンピテントＥ、コリＳＪ６細胞を形質転換せ しめるために用い、１１００ｕ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢプレート上で形 質転換体を選別した。これら２つのフラグメントの連結の方向は図３に示す通り である。従ってｐＰＬ１９７５は機能的なＥ。

コリ複製起点、並びに完全なプラス起点（＋ｏｒｉ　ＰＥｌ９４）及び不完金工 Ａ１ヱ遺伝子（ｒｅｐＦ’　）（Ｖｉ　１１ａｆａｎｅら、１９８７）を含んで 成るＰＥ１９４ＤＮＡフラグメントを含む。

ｐＰＬ１９７５　（図３）をＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩにより制限化せしめ、そ してこの直鎖状のプラスミドを、ズブチリシン３０９遺伝子及びｃａｔ耐性遺伝 子を含む、ｐｓＸ１２０（図４）由来の３．３ｋｂのＥｃｏＲＩ　（部分的）、 ＢｇＩＩＩフラグメントにリゲートせしめることにより、プラスミドｐＰＬ２０ ０２　（図５）を作製した。このリゲーション混合物を次にコンピテントＥ、コ リＳＪ６細胞の形質転換のために用い、そしてｌｏ　Ｏｕ　ｇ／＋ｎｌのアンピ シリンを含むＬＢプレート上でこの形質転換体を選別した。

Ｂ、レンタスの染色体へのｐＰＬ２００２プラスミドの安定な組込み Ｂ、レンタス株ＮＣｌＢ１０３０９の単離体を、温度感受性プラスミドｐＥ１９ ４　（図１参照）によるプロトプラスト形質転換により形質転換せしめ、３０° Ｃ（許容温度）でエリスロマイシン耐性（５μｇ／ｍｌ）について選別した。得 られる株をＰＬ２１５６と命名した。

次にＰＬ２１５６をプラスミドｐＰＬ２００２によりプロトプラスト形質転換せ しめ、３０°Ｃにてクロラムフェニコール耐性（８μｇ／ｍ）及びエリスロマイ シン耐性（５μｇ／ｍｌ）について選別し、２種類のプラスミドｐＥ１９４及び ｐＰＬ２００２を含む株ＰＬ２１５７が得られた。これらの細胞において、プラ スミドｐＰＬ２００２の複製は、ｐＰＬ２００２複製に必須なる複製タンパク質 ｒｅｐＦをコードするプラスミドｐＥ１９４の存在に完全に依存した。

株ＰＬ２１５７をＴＹ９培地中でオーバーナイト増殖させ、そしてその希釈物を ４５°Ｃ（非許容温度）でＴＹ９プレート上において平板培養し、クロラムフェ ニコール耐性（１０μｇ／ｍｌ）について選別した。

これらのクロラムフェニコール耐性コロニーのうちの１つをＰＬ２１５８と命名 した。

ササンハイブリダイゼーションは、株ＰＬ２１５８においてプラスミドｐＰＬ２ ００２がこの受け入れられるプラスミドと染色体スジチリシン３０９遺伝子との 間の相同性組換えによってその染色体の中に組込まれ、そしてその後約４コピー に迄増幅されることを示した。完全なｐＥ１９４プラスミド配列の形跡は全つく 検出されなかった。

染色体的に組込んだ株ＰＬ２１５８におけるｐＰＬ２００２のコピーの安定性を 、抗生物質を全つく用いないで大量スケール発酵（１５００１）において試験し た。

発酵後、サンプルを希釈し、そしてＴＹ９プレート上で平板培養し、１０μｇ／ ａ＋１のクロラムフェニコールを含むＴＹ９プレートに１００個のコロニーをレ プリケートさせた。試験コロニーのうちの９８個が未だクロラムフェニコールに 耐性であり、プラスミドｐＰＬ２００２がまだこの染色体に組込まれていること を示唆する。これらのコロニーのうちの２０個を次にサザンハイプリダイゼーシ ョンにより試験し、試験したコロニーの全てにおいて、明らかに同じコピー数（ 約４コピー）でプラスミドｐＰＬ２００２が未だ組込まれていることが示された 。

実施例２ ２つの　ＵＢｌｌｏ　′＋　占を１も・プラスミドベクターの■ プラスミドｐｓＪ１０８５　（図７）を、ＢａｍＨｒ及びＥｃｏＲＩによりｐＤ Ｎ３０６０　（これはｐＵＢＩＬＯに由来する複製起点（＋ｏｒｉ　ｐＵＢｌｌ ｏ）及び工互且遺伝子（１二■）、並びにｐｃ１９４に由来するクロラムフェニ コール耐性遺伝子（ｃａｔ）を含む）を制限化し、そして以下のオリゴヌクレオ チド配列（Ｂｅａｕ、ｃａｇｅとＣａｒｕｔｈｅｒｓ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ 　Ｌｅｔｔｅｒｓ　２２゜１９８１、頁１８５９−１８６９に詳細のホスホアミ ダイト方法により、自動ＤＮＡ合成装置において調製）ＡＡＴＴＣＴＧＣＡＧＡ ＴＡＴＣＡＡＧＡＴＡＡＧＡＡＡＧＡＡＣＡＡＧＴＴＣＣＧＧＡＣＧＴＣＴＡＴ ＡＧＴＴＣＴＡＴＴＣＴＴＴＣＴＴＧＴＴＣＡＡＧＧＣＣＴＡＧをこの直鎖状ｐ ＤＮ３０６０の中に挿入せしめることにより作製し、その後リゲーション及びＢ 、スブチリスＤＮ１８８５への形質転換を行った。

プラスミドｐＪ５１１．０３（図９）を、ＥｃｏＲＩによりｐｓＪ１０８５　（ 図７）を制限化せしめ、そしてこの直鎖状プラスミド全体を、同様に制限化せし めたプラスミドｐＵＣ１９（図８）の中に挿入せしめることにより作製し、その 後リゲーション及びＥ、コリＳＪ６への形質転換を行った。得られるプラスミド ｊｐｓＪ１１０３はｐＵＢ１１Ｑ由来のプラス起点及びｌ遺伝子、ＰＣ１９４由 来のｃａし遺伝子、ｐＵｃ１９複製起点（ｏｒｉ　ＰＵＣ１９）並びにβ−ラク タマーゼ（アンピシリン耐性）遺伝子（ｂｌａ）を含む。

プラスミドｐｓＪ１１３０　（図１０）はｐｓＪ１１０３（図９）に由来し、１ ．６ｋｂのＮ５ｉｌ−ＰｓｔＩフラグメントを削除することにより、ｐＵＢ１１ ０プラス起点及び不完全なｍ遺伝子（ｒｅｐ’）を含むｐＵｃ１９プラスミドが 本質的に得られる。このプラスミドをＥ、コリＳＪ６に形質転換せしめた。

プラス起点とその後に続く完全１遺伝子を含むｐＤＮ３０６０　（図６）由来の １．４ｋｂのＨｉｎｄｒＩＩフラグメントを次にｐｓＪ１１３ｃｌ　（図１０） の固有Ｈｉｎｄｌ１１部位に挿入せしめ、そしてこのリゲートせしめたプラスミ ドを↓ユＤ　ＩＪ　Ｓ　Ｊ　５の中に形質転換せしめ、ｐｓＪ１１３６が得られ た（図１１）。この実験において、このフラグメントは２つの直列コピーにおい てｐｓＪ１１３６の中に挿入された。その後これらのコピーのうちの１つをＮ５ ｉｌによるｐＳＪ　１１３６の消化によって除去し、５．１ｋｂのフラグメント の再すゲーション及びＥ、コＩＪ　Ｓ　Ｊ　６の形質転換を行い、不完全二！■ 遺伝子と並んだ１つのｐＵＢ１１０起点及び完全−ｒｅ−１遺伝子と並んだ１つ のｐＵＰ１１０起点を含むｐｓＪ１１３７（図１２）が得られた。

カナマイシン耐性をコードする遺伝子（ｋａｎ）を１．４ｋｂの５ｐｈｌフラグ メント上においてプラスミドｐＰＬ１４日４（図１３）から切り出し、そしてｐ ｓＪ１１３７の５ｐｈｌ部位（図１２）の中に２つの考えられる方向性それぞれ においで挿入せしめた。その後のＥ、コリＳＪ６への形質転換によりｐｓＪ１１ ５５　（図１４）及びｐｓＪ１１５７　（図１５）のそれぞれが得られた。ｐｓ Ｊ１１５７はｋａｎ遺伝子を２つの直列コピーにおいて含んだ。１方のコピーを ＢａｍＨＩにより切り出し、そしてこの６．５ｋｂのフラグメントを再すゲート し、そしてＥ、コリＳＪ６に形質転換せしめ、ｐｓＪ１２５９を形成せしめた（ 図１６）。

プラスミドｐｓＪ１１３９　（図１８）は以下の通りに作製した：クロラムフェ ニコール耐性遺伝子（ｃａｔ）、カナマイシン耐性遺伝子（ｋａｎ）及び関連の 二Ｕ遺伝子を伴うｐＵＢ１１０プラス起点を含むバチルスプラスミドｐＤＮ２９ ０４（図１７）を５ｐｈｌにより消化し、そして既に５ｐｈｌにより消化せしめ たｐｓＪ１１３０　（図１０）にリゲートせしめた。得られるプラスミドｐｓＪ １１３９は不完金工ｎ遺伝子に連結しているｐＵＢ１１０起点及び完全１±上遺 伝子に連結しているｐＵＢ１１０起点を含んでいた。

実施炎ユ バ゛チルスズブチリスにおける２つの　ＵＢＩＩＯ’　占を４むプラスミドから の　７、ＤＮＡベクターのノブラスミドｐｓＪ１１３９　（図１８〕　（本質的 に周知の方法においてＥ、コリ５Ｊ１１３９より調製）をカナマイシン耐性（１ ０μｇ／＋１）の選別のためにＢ、スブチリスＤＮＩ８８５に形質転換せしめた 。プラスミドＤＮＡは複数の形質転換体より調製された。これらのプラスミドの アガロースゲル電気泳動（種々の制限酵素により消化していようがしていまいが ）は、５．１ｋｂ及び２．４ｋｂのそれぞれの小さなりＮＡ分子の存在並びに少 量の７．５ｋｂの全長プラスミドｐＳＪ１】３９の存在を示した。得られる制限 パターンは、ｐＳＪ１１３９上の２つの１±■配列間の相同性交差によるか、又 はＡ、ＧｒｕｓｓとＳ、Ｄ、Ｅｒ１ｉｃｈ　（前記）に詳細の通り、後に追い出 され、そして再循環化されるプラスＤＮＡ鎖におけるｐＵＢＬ１０プラス起点に てニックを生じせしめるＲｅｐタンパク質の作用のいづれかによる、予測される ２種類の子孫ベクターｐｓＪ１１３９ａ　（図１９）及びｐｓＪ１１３９ｂ（図 ２０）の形成に関するものであった（これらのメカニズムは両者とも同じ２種類 の子孫ベクターをもたらしうる）。

これらのベクターをＢ、ズブチリス株ＤＮ１８８５に再形質転換せしめ、そして １０μｇ／ｍｌのカナマイシン又は６μｇ／ｒｓｌのクロラムフェニコールのい づれかを含むＬＢプレート上で平板培養し、その後各プレートのレプリカを他の 抗生物質を含む新たなプレート上に平板培養せしめることにより更に分析した。

次いでベクターを各タイプの形質転換体から単離し、そしてアガロースゲル電気 泳動により分析し、以降の結果を得た： クロラムフェニコール及びカナマイシン両者に耐性な形質転換体は３種類の全て のベクター片を含んでいた（７．５ｋｂのｐｓＪ１１３９，２．４ｋｂのｐｓＪ １４３９ａ及び５．１ｋｂのｐｓ、ｚ１３９ｂ）。クロラムフェニコールに耐性 且つカナマイシンに感受性の形質転換体はｐｓＪ１１３９ｂのみを含んでいた。

カナマイシンには耐性であるがクロラムフェニコールに感受性の形質転換体は得 られなかった。２．４ｋｂの小さな子孫ベクターＰＳＪ１１３９ａは従ってＢ、 スブチュスにおいて自立的に複製できなかった。

実施例４ Ｂ、ズブチリスカ色　におけるｌ　’ｌｌＤＮＡ＼　の６星凪込立 シクロデキストリングリコジルトランスフェラーゼ（ＣＯＴａ　ｓ　ｅ）遺伝子 の２つの染色体コピーを含むＢ、ズブチリス株の作製 ＣＴＧａ　ｓ　ｅ遺伝子（ＣＯＴ）を２．５ｋｂのＢａｍＨＩ−３ｐｈｌフラグ メント上においてプラスミドｐＰＬ１８７８（図２２）から切り出し、そしてＢ ａｍＨＩ−３ｐｈ、Ｉ消化プラスミドｐＤＮ３０２０（図２１）にリゲートせし めてプラスミドｐＰＬ１８９６　（図２３）を形成せしめた。ｐＤＮ３０２０は ｐＤＮ１３１３　（Ｄｉｄｅｒｉｃｈｓｅｎ、１９８６）の誘導体であり、合成 ５ｐｈｒ含有オリゴヌクレオチドリンカー（前記の実施例１の通りに調製）をプ ラスミドＰＤＮ１３８０　（Ｄｉｄｅｒ　１ｃｈｓｅｎとＣｈｒｉｓＬｉａｎｓ ｅｎ、１９８８）のＥｃ　ｏＲ１部位に挿入せしめテフラスミドｐＤＮ１６２０ を得ることにより作製される。ｐＤＮ１６２０　（Ｂ、Ｄｉｄｅｒｉｃｈｓｅｎ とり、Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ；前記）上に存在するＢ、ステアロサーモフィ ルス由来のマルトジ−ニック（ｍａｌｔｏｇｅｎｉｃ）アミラーゼ（ＰａｍｙＭ ）からのプロモーター領域を次に約２００ｂｐのＢａｍＨｌ−３ｐ　ｈ　Ｉフラ グメント上においてＳｐｈｌ−ＢａｍＨＩ消化ｐＵｃ１９に導入し、プラスミド ｐＤＮ２９７７を得た。このプロモーター領域を約２ｏｏｂｐのＢｇ　ｌｌｌ− ３ａ　ｃ　Ｉフラグメント上においてｐＤＮ２９７７から切り出し、これをｐＤ Ｎ１３１３のボクリンカー領域に挿入せしめ、これによってプラスミドｐＤＮ３ ０２０を作り上げた。ｐＰＬ１８９６上のＣＴＧａ　ｓ　ｅ遺伝子は図２３に示 すｄａｌ及びｄｆｓとして示すＢ、スブチリス染色体［）ＮＡの２本のフラグメ ントと隣り合っている。ｄａｌはＢ、ス１土ユ久のり、Ｌ−アラニンラセマーゼ をコードする遺伝子である（Ｄｉｄｅｒｉｃｈｓｅｎ　１９８６）。

プラスミドｐＰＬ１８９６をＢ、ズブチリス株ＤＮ１６８６に形質転換せしめた 。Ｄａ　１”形質転換体について単に選別した場合、クロラムフェニコール感受 性ＣＧＴａ　５　ｅ”である複数の株が得られた。これらはＤｉｄｅｒｉｃｈｓ ｅｎ。

１９８６に詳細の通りのｐＰＬ１８９６とＤＮ１６８６染色体の二重相同性交差 反応により形成される。このような株の１つはＣＧＴａ　ｓ　ｅ遺伝子の染色体 に組込まれたコピーを含むｐＬ１８９７である。

ＣＧＴａ　ｓ　ｅｉ　云　を４む　入みベクターの　ｉ丁ＣＧＴａ　ｓ　ｅを２ ．５ｋｂのＢａｍＨｌ−Ｎｏ　ｔ　１７ラグメント上においてｐＰＬ１８７８　 （図２２）から切り出した。

発現ベクターは、常用の突然変異誘発処理により得られる一旦一すシェニホーミ スＡＴＣＣ９７８９のアミラーゼ過剰生産誘導体よりクローン化したアルファー アミラーゼ遺伝子のプロモーター領域を含む０，６ｋｂの５ｐｈｌ−Ｐｓｔｌフ ラグメントを、ｐＵＢ１１０起点及びカナマイシン耐性をコードする遺伝子を含 むｐＵＢ１１０由来のベクターに挿入せしめることにより作製した。このＣＧＴ ａ　ｓ　ｅ遺伝子（ｎ↓）をＢａｍＨＩとＮｏｔ１部位の間でこのプロモーター の下流に挿入せしめ、ｐＳＪ９９３が得られた（図２４）。

ｐｓＪ９９３由来の４ｋｂのＢｇｌＩＩフラグメントをｐＳＪ１１５５（前記の 実施例１に詳細；図１４）のＢｇｌＩＩ部位に挿入せしめ、得られるプラスミド をＥ、コリ株ＳＪ６に形質転換せしめ、アンピシリン耐性のＥ、コ’Ｊ　Ｓ　Ｊ 　６のＣＧＴａｓｅ生産形質転換体を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン及び０ ．５％の可溶性デンプンを含むＬＢプレート上で形質転換体を平板培養すること により単離し、ヨウ素蒸気によるプレートの染色の後でのコロニーのまわりでの 透明な円の形成についてスクリーンした。カナマイシン耐性遺伝子が再生されて いるプラスミドｐｓＪ１１６３　（図２５）を保有する形質転換体を更なる実験 のために保存した。Ｂ、ズブチリス株ＤＮ１８８５及びＰＬ１８９７におけるｐ ｓＪ１１６３由来の子孫ベクターの形成 ｐｓＪ１１６３　（図２５）をＤＮ１８８５に形質転換せしめ、そしてベクター ＤＮＡをカナマイシン耐性形質転換体から調製してアガロースゲル電気泳動によ って分析した。これはｐｓＪ１１６３に相当する微量の１０．５ｋｂのプラスミ ド分子を示し、更におよそ等量且つ大量において４．１ｋｂのｐＳＪ１１６３ｂ （図２７）及び６．４ｋｂのｐｓＪ１１６３ａの２種類の子孫ベクター分子のそ れぞれが示された。これらはｐｓＪＩ１６３の２つの工１■配列間の相同性組換 え又は前記したローリングサークル複製における各プラス起点でのＲｅｐタンパ ク質の作用のいづれかにより得られる子孫ベクターに相当する。上記のこの子孫 ベクターの形成はｐｓＪ１１６３をＰＬ１８９７に形質転換せしめた場合も見ら れ、そしてこのような２種類の形質転換体を５Ｊ１１６８及び５Ｊ１１７０とし て更なる実験のために保存した。

非複製型ＤＮＡ分子を含む組込み体の単離株５Ｊ１１６８及び５Ｊ１１７０を５ μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む１０ｍ１のＴＹ培地に植え付け、そして３７° Ｃでオーバーナイトインキュベートした。次いで各培養物１００μｍを新鮮なＴ Ｙ培地に植え付け、そしてインキユベーシヨンを繰り返した。このようなオーバ ーナイトインキュベージジンを４回繰り返した後、この２種類の培養物からプラ スミドＤＮＡを調製し、そしてアガロースゲル電気泳動により分析した。プラス ミド分子は見られなかった。アンピシリン耐性についてのＥ、コリ選別のために 形質転換させるようこのプラスミド調製物を利用した場合は形質転換体は得られ ず、もとの１０．５ｋｂのｐｓＪ１１６３又は４．１ｋｂの子孫ベクター分子ｐ ｓＪ１１６３ｂのいづれもが存在していないことを示唆した。カナマイシン耐性 の無プラスミド株を５Ｊ１２２３及び５Ｊ１２３７として更なる実験のために保 存した。

組込まれたＤＮＡの増幅 徐々に増加するカナマイシン濃度を有するＴＹ培地中での増殖を選択することに より、２０．５０，１００，２００゜４００，６００，８００，１０００．　ノ ２００、および１４００μｇ／ｒａＩのカナマイシン中で増殖できる株を単離し た。

上記の約４００μｇ／ｍｌのカナマイシンに抵抗性の株から染色ＤＮＡにおいて 、Ｎｈｅｌ又はＮｏｔｒによる消化により、これらの酵素による６、４ｋｂ子孫 ベクターｐｓＪ１１６３ａの消化から期待される大きさのＤＮＡ帯が認められた 。この帯は、より少ない程度のカナマイシン抵抗性を有する株から製型されるＤ ＡＡの消化中には現われなかった。控え目に予測すると、組込まれたＤＮＡの少 なくとも５〜１０個のコピーがこの帯が現われると存在するであろう。

組込まれたＤＮＡの安定性 ４００μｇ／ｍｌのカナマイシンに抵抗する株を、カナマイシンを添加すること なく　ＢＰＸ培地含有振とうフラスコ中３７°Ｃで１時間増殖させた。次いでそ れらをＬＢブレー上に塗布し、引き続き１０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有す るプレート上にレプリカ培養した。約１００個のコロニーについて、全てカナマ イシン抵抗性であり、選択圧の非存在下、組込まれたＤ　Ｎ　Ａに関し存在する カナマイシン抵抗性遺伝子の安定な遺伝質を示した。

Ｂ、スブチリスにおけるプラスミド−産生ＣＧＴアーゼ遺伝子の安定性 プラスミドｐＰ１１８９２は、ｐｓＧ９９３　（図２４）と本質的に同一であり 、唯一の差異は、異なるポリリンカー頭載がＣＯＴアーゼ遺伝子の下流に存在す る。このプラスミドは、ＤＮＩ８８５に導入され、得られた株５Ｊ９８４を、カ ナマイシン添加することなく、ＢＰＸ培地を含有する振とうフラスコ中で３７° Ｃで１週間増殖させた。カナマイシン含有プレート（１０μｇ／ｍｌ）上に塗布 し、カナマイシンを有しないプレートよりも１０倍少ない細胞数を得、９０％の 細胞がそれらのプラスミドを失っていたことが示される。このことは又、カナマ イシンを有しないプレート上のコロニーの１０％未満がＣＧＴアーゼを生産した 。

実施例５ Ｂ、リケニホルミスＡＴＣＣ９７８９中、ｐｓＪ１１５６からプロゲニーヘクタ ーの形成 プラスミドｐｓＪ１１５６は、図１５に示すｐｓＧ１１５７と同一である。ｐｓ Ｇ１１５６はプロトプラスト形質転換によりＢ、リケニホルミスＡＴＣＣ９７８ ９に導入し、カナマイシン抵抗性を選択し、株５Ｊ１１９９を得た。制限酵素の 消化およびアガロースゲル電気泳動による５Ｊ１１９９のプラスミド含量の分析 により、２個のプラスミド分子の存在が明らかになんだ。一方でプラスミド分子 は、ｐｓＪ１２５９（図１６）に同一であり、相同性組換えによりｋａｎ遺伝子 の一つのコピーの欠損により殆ど同様に形成された。他の上記の如くローリング サークル複製における各プラス起点でＲｅｐ蛋白質の作用により形成されうる２ 個の子孫分子の一方である。

実施例６ Ｂ、リケニホルミスＡＴＣＣ，９７８９染色体中の非複製型ＤＮＡ分子の安定な 組込み 組込みヘクターの構築 プラスミドρ５Ｇ１２６０は、図１６に示すｐｓＧ１２５９と同一である。Ｂ、 リケニホルミスＡＴＣＣ９７８９からの染色体ＤＮＡを、ＰｓｔｌおよびＢａｍ Ｈｒで消化し、次いで２ｋｂおよびｄｋｂ間のフラグメントをアガロースゲルか ら単離した。これらのフラグメントを、ＰｓｔｌおよびＢａｍＨｒで消化したｐ ｓＪ１２６０に結合せしめ、次いで選択的アンピシリン抵抗性を有するＥ、コリ ーＳＪ６に形質転換した。得られた１つの形質転換体は、２．１ｋｂの挿入断片 を有し、更にプラスミドはｐｓＪ１５５５　（図２９）を示した。

Ｅ、コリーＳＪ６含有ｐｓＪ１５５５を、ナショナルコレンクション　オブ　イ ンダストリアル　アンド　マリーネ　バクテリア（英国、スコツトランド、ＡＢ ２　１ＲＹ、マーチヤードライブストリート）に、特許手続上の微生物の寄託の 匡際的承認に関するブダペスト条約に従って１９９０年］２月１２日に寄託し、 寄託番号ＮＣＩＭＢ４０３４６を得た。

このプラスミドは、２個の子孫分子ｐｓＪ１５５５ａ　（図３０）およびｐｓＧ １５５５ｂ　（図３１）を形成する能力を有している。

非複製型ＤＮＡ分子を含有するＢ、リケニホルミス組込み体の単離 ｐｓＪ１５５５を、プラスミド形質転換によりＢ、リケニホルミスＡＴＣＣ９７ ８９に導入し、カナマイシン抵抗性に対し選択した。１種の再生のカナマイシン 抵抗性形質転換体（ＳＪ１６１３）を該形質転換体からのプラスミド調製品のゲ ル電気泳動に示される如くプラスミドを有さす、プラスミド調製品はＢ、スブチ リスをカナマイシン抵抗性に形質転換できなかった。

組換えＤＮＡの増幅 株５Ｊ１６１３を、１０，２０，５０，１００，２００゜４００．６００．８０ ０，１０００．１５００，２０００゜２５００．３０００．４０００および５０ ００μｇ／＋ｏｌでカナマイシンを含有する、１０ｎ＋１の連続的なＴＹ培地中 で増殖せしめ、次いでこれらの種々の濃度の各々で増殖する株を更に研究するた めに保持した。２０，２００、および１５００μｇ／ｍｌのカナマイシンに抵抗 する株を更に分析した。２種の後者の株から得た染色体ＤＮＡは、染色体中で組 込まれたｐｓＪ１５５５ａの多数のコピーを含有する株に対し期待される如く、 第一の株のＤＮＡは存在せず、ＢａｍＨＩで消化して４．５ｋｂの明確な帯を示 した。全ての株を、カナマイシンなしでＢＰＸ振とうフラスコ中、３７°Ｃで７ 日間増殖せしめ、次いでＬＢプレート上に画線した。ＬＢプレートからカナマイ シンプレート（１０μｇ／ｍｌ）にレプリカプレートすると、カナマイシン感受 性コロニーは現われなかった。カナマイシン（１０μｇ／ｍｌ）と共に、および カナマイシンを有しないプレート上の集落数を、２０，２００および１５００μ ｇ／ｍｌのカナマイシンに抵抗する３種の株に対して得、さらにそれらは全ての 場合１０　”ｍｌ−’であり、組込まれたｋａ且遺伝子の安定性を示した。

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（特許法第１８４条の８） 平成４年６月（８日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．細菌細胞であって、そのゲノム内に該細菌細胞が（１）対象のＤＮＡ配列、 （２）該細胞のゲノム領域に相同性のＤＮＡ配列及び（３）複製の起点を含んで 成る組込み非複製型ＤＮＡ作製体を保有しており、該ＤＮＡ作製体は前記の複製 起点からの複製の開始に必要とされる因子をコードする機能的遺伝子を欠いてい る、前記細菌細胞。 ２．前記ＤＮＡ作製体が、複製因子をコードする遺伝子を欠失してしまっている 、請求の範囲第１項記載の細菌細胞。 ３．前記複製因子をコードする遺伝子が、不活性な複製因子をコードするように 改質されているか、又は複製因子が遺伝子から発現されないように改質されてい る、請求の範囲第１項記載の細胞。 ４．前記遺伝子が遺伝子のＤＮＡ配列の１種又はそれ以上のヌクレオチドの欠失 、挿入又は置換により、又は転写もしくは翻記開始もしくは停止シグナルの欠失 もしくは他の改質により、改質されている、請求の範囲第３項記載の細胞。 ５．前記ＤＮＡ作製体が、対象のＤＮＡ配列細胞の遺伝子の領域に相同性のＤＮ Ａ配列および一本鎖ＤＮＡプラスミドから複製のプラス起点を含んでなり、該Ｄ ＮＡ作製体か複製のプラス起点と同族の機能的ｒｅｐ遺伝子を欠いている、請求 の範囲第１〜４項のいずれかに記載の細胞６．前記ＤＮＡ作製体が更に選択でき るマーカーを含んでなる、請求の範囲第１〜５項のいずれかに記載の細胞。 ７．前記対象のＤＮＡ配列が対象のポリペプチドをコードする、請求の範囲第１ 〜５項のいずれかに記載の細胞。 ８．グラム陽性細菌の細胞である、請求の範囲第１〜７項のいずれかに記載の細 胞。 ９．前記グラム陽性細菌の細胞が、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属又はストレ ブトマイシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する株である、請求の範囲第 ８項記載の細胞。 １０．前記細胞が、バチルス　リシェニフォーミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｌｉｃ ｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルスレンタス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｌｅｎｔｕｓ ）、バチルスブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｂｒｅｖｉｓ）、バチルスステアロ サーモブイリス　（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ）、バチルス　アルカロフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｌｋａｌｏｐｈｉｉｌ ｕｓ）、バチルスアミロリケファシエンス　（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌ ｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス　コアギュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃ ｏａｇｕｌｕａｎｓ）、バチルススブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌ ｉｓ）又はストレブトマイシス　リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｌｉｖ ｉｄａｎｓ）の株である、請求の範囲第９項記載の細胞。 １１．ＤＮＡ作製体であって、（１）対象のＤＮＡ配列、（２）該ＤＮＡ作製体 の導入を意図されている細胞のゲノムの領域に相同性のＤＮＡ配列及び（３）複 製の起点を含んで成り、該ＤＮＡ作成体は、複製の起点からの複製の開始のため に必要とされる因子をコードする機能的遺伝子を欠いている、前記ＤＮＡ作製体 。 １２．複製因子をコードする遺伝子を欠失してしまっている、請求の範囲第１１ 項記載のＤＮＡ作製体。 １３．前記複製因子をコードする遺伝子が、不活性な複製因子をコードするよう に改質されているか、又は複製因子が遺伝子から発現されないように改質されて いる、請求の範囲第１１項記載のＤＮＡ作製体。 １４．前記遺伝子が、遺伝子のＤＮＡ配列の１種又はそれ以上のヌクレオチドの 欠失、挿入又は置換により、又は転写もしくは翻記開始もしくは停止シグナルの 欠失もしくは他の改質により、改質されている、請求の範囲第１３項記載のＤＮ Ａ作製体。 １５．対象のＤＮＡ配列、ＤＮＡ作製体の導入を意図されている細胞のゲノムの 領域に相同性のＤＮＡ配列及び一本鎖ＤＮＡプラスミドから複製のプラス起点を 含んで成り、該ＤＮＡ作成体は、複製のプラス起点と同族の機能的ｒｅｐ遺伝子 を欠いている、前記ＤＮＡ作製体。 １６．更に選択できるマーカーを含んでなる、請求の範囲第１１項に記載のＤＮ Ａ作製体。 １７．請求の範囲第１１〜１６項のいずれかに記載のＤＮＡ作製体を含んでなる 、組換え体ＤＮＡベクター。 １８．親プラスミドベクターであって、（ｉ）第１の複製起点；（ｉｉ）該第１ の複製起点からの複製のために必要とされる複製因子をコードする１又は複数の 機能的遺伝子；（ｉｉｉ）該第１の複製起点と同一の方向における第２の複製起 点；（ｉｖ）対象のＤＮＡ配列、及び（ｖ）該ベクターの導入を意図する細胞の ゲノム領域に相同性のＤＮＡ配列、を含んで成り、該親ベクターは該第２及び第 １の複製起点（上記の順における）の間の領域にある、該第２の複製起点からの 複製のために必要とされる複製因子をコードする機能的遺伝子を欠いている、前 記親プラスミドベクター。 １９．複製の第二起点が、複製の第一起点と同じプラスミドから由来している、 請求の範囲第１８項記載のプラスミドベクター。 ２０．複製の第２の起点と連結した複製因子をコードする遺伝子が欠失してしま っている、請求の範囲第１８項記載のプラスミドベクター。 ２１．複製の第２の起点と連結した複製因子をコードする遺伝子が改質されてい る、請求の範囲第１８項記載のプラスミドベクター。 ２２．前記遺伝子が、遺伝子のＤＮＡ配列の１種又はそれ以上のヌクレオチドの 欠失、挿入又は置換により、又は転写もしくは翻記開始もしくは停止シグナルの 欠失により、改質されている、請求の範囲第２１項記載のプラスミドベクター。 ２３．親プラスミドベクターであって、（ｉ）一本鎖ＤＮＡプラスミドからの第 １のプラス起点；（ｉｉ）第１のプラス起点と同族の機能的ｒｅｐ遺伝子；（ｉ ｉｉ）該第１のプラス起点と同じ方向における一本鎖ＤＮＡプラスミドからの第 ２のプラス起点；（ｉｖ）対象のＤＮＡ配列、及び（ｖ）該プラスミドベクター の導入を意図する細胞のゲノム領域に相同性のＤＮＡ配列を含んで成り、該親ベ クターは該第２及び第１の複製起点（上記の方向における）の間の領域にある、 該第２の複製起点からの複製のために必要とされる複製因子をコードする機能的 遺伝子を欠いている、前記親プラスミドベクター。 ２４．前記複製の第２のプラス起点が、複製の第１のプラス起点と同じ一本鎖Ｄ ＮＡプラスミドから由来する、請求の範囲第２３項記載のプラスミドベクター。 ２５．更に、選択性マーカーを含んでなる、請求の範囲第１８〜２４項のいずれ かに記載のプラスミドベクター。 ２６．細菌細胞であって、第１の複製起点および該複製の第１起点からのプラス ミド複製に必要とされる（複数の）因子をコードする１又は複数の機能的遺伝子 を含んで成る、第１のＤＮＡベクター並びに第２の複製起点（この第２の複製起 点からのプラスミド複製に必要とされる因子をコードする機能的遺伝子を欠いて いる）、対象のＤＮＡ配列、及び該プラスミドベクターの導入を意図する細胞の ゲノムの領域に相同性のＤＮＡ配列を含んで成る、第２のＤＮＡベクターを含ん でなる、前記細菌細胞。 ２７．前記複製の第２起点が、複製の第１起点と同じプラスミドから由来する、 請求の範囲第２６項記載の細胞。 ２８．前記第２のＤＮＡベクターが、複製の第２起点と同族の複製因子をコード する遺伝子を欠失している、請求の範囲第２６項記載の細胞。 ２９．前記複製の第２の起点と同族の複製因子をコードする遺伝子が改質されて いる、請求の範囲第２６項記載の細胞。 ３０．前記遺伝子が遺伝子のＤＮＡ配列の１種又はそれ以上のヌクレオチドの欠 失、挿入又は置換により、又は転写もしくは翻記開始もしくは停止シグナルの欠 失もしくは他の改質により、改質されている、請求の範囲第２９項記載の細胞。 ３１．前記第１のＤＮＡベクターが、更に複製の第２の起点と同族の複製因子を コードする機能的遺伝子を含んでなる、請求の範囲第２６項記載の細胞。 ３２．前記第２のＤＮＡベクターが更に選択できるマーカーを含んでなる、請求 の範囲第２６項に記載の細胞。 ３３．一本鎖ＤＮＡプラスミドからの複製の第１のプラス起点および機能的ｒｅ ｐ遺伝子を含んでなる第１のＤＮＡベクター、並びに一本鎖ＤＮＡプラスミドか らの複製の第２のプラス起点（これは、複製の第２のプラス起点と同族の機能的 ｒｅｐ遺伝子を欠いている）、対象のＤＮＡ配列および該細胞のゲノムの領域に 相同性のＤＮＡ配列を含んでなる第２のＤＮＡベクターを含んでなる、請求の範 囲第２６〜３２項のいずれかに記載の細胞。 ３４．前記複製の第２のプラス起点が、複製の第１のプラス起点と同じ１本鎖Ｄ ＮＡプラスミドから由来する、請求の範囲第３３項記載の細胞。 ３５．グラム陽性細菌の細胞である、請求の範囲第２６〜３４項のいずれかに記 載の細胞。 ３６．前記グラム陽性細菌の細胞が、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属又はスト レブトマイシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する株である、請求の範囲 第３５項記載の細胞。 ３７．前記細胞が、バチルス　リシェニフォーミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｌｉｃ ｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルスシンタス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｌｅｎｔｕｓ ）、バチルスプレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｂｒｅｖｌｓ）、バチルスステアロ サーモティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ） 、バチルス　アルカロフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ ）、バチルス　アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑ ｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス　コアギュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｏａ ｇｕｌｕａｎｓ）、バチルススブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ ）又はストレプトマイシス　リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｌｉｖｉｄ ａｎｓ）の株である、請求の範囲第３６項記載の細胞。 ３８．請求の範囲第１〜１０項のいずれかに記載の細菌細胞の調製方法であって 、該方法が、請求の範囲第１８〜２５項のいずれかに記載の親プラスミドベクタ ーを用いて細菌細胞を形質転換し、次いで選択的条件下で形質転換された細胞を 培養し、該プラスミドベクターの複製が、第１の複製起点および該第１の複製起 点からのプラスミドの複製に対して要求される（複数の）因子をコードする１種 又はそれ以上の機能的遺伝子を含んでなる第１の子孫ベクター並びに第２の複製 起点（該第２の複製起点からプラスミド複製に対して要求される因子をコードす る機能的遺伝子を欠いている）および対象のＤＮＡ配列および細胞のゲノムの領 域に相同性のＤＮＡ配列を含んでなる第２の子孫ベクターの形成をもたらし、次 いで選択的条件下変質転換された細胞の培養を継続し、相同性組換えにより該第 ２の子孫ベクターを細菌ゲノム内に組込み更に細胞からの第１の子孫ベクターお よび親ベクターの消失をもたらす、前記方法。 ３９．前記親プラスミドベクターが、まだ宿主細胞を増殖せしめるような増加せ しめられた温度では複製できないものであり、更に細菌細胞をプラスミドの複製 を許容する温度で最初に培養し、第二の子孫ベクターを細菌ゲノムに組込んだ後 、プラスミドの複製を許容しない温度で培養し、その結果第１の子孫ベクターお よび親ベクターが細胞から消失している、請求の範囲第３８項記載の方法。 ４０．請求の範囲第１〜１０項のいずれかに記載の細菌細胞の製造方法であって 、第１の複製起点および該第１の複製起点からのプラスミドの複製に対して要求 される（複数の）因子をコードする１種又はそれ以上の機能的遺伝子を含んでな る第１の子孫ベクター並びに第２の複製起点（該第２の複製起点からプラスミド 複製に対して要求される因子をコードする機能的遺伝子を欠いている）および対 象のＤＮＡ配列および細胞のゲノムの領域に相同性のＤＮＡ配列を含んでなる第 ２の子孫ベクターを用いて細菌細胞を形質転換し、次いで選択的条件下得られた 細胞を培養し、相同性組換えにより該第２の子孫ベクターを細菌ゲノム内に組込 み更に第１の子孫ベクターの消失をもたらす、前記方法。 ４１．前記第１のＤＮＡベクターが、まだ宿主細胞を増殖せしめるような増加せ しめられた温度では複製できないものであり、更に細菌細胞をプラスミドの複製 を許容する温度で最初に培養し、第二のＤＮＡベクターを細菌ゲノムに組込んだ 後、プラスミドの複製を許容しない温度で培養し、その結果第１のＤＮＡベクタ ー細胞から失われている請求の範囲第４０項記載の方法。 ４２．前記第１のＤＮＡベクターが、更に第２の複製起点から複製に対して要求 される複製因子をコードする機能的遺伝子を１種又はそれ以上含んでなる請求の 範囲第４０項記載の方法。 ４３．対象のポリペプチドの調製方法であって、該ポリペプチドに対しコードす る組込まれたＤＮＡ配列を有する請求の範囲第１〜１０項のいずれかに記載の細 菌細胞を、ポリペプチドの生産に導びく条件下で培養し、次いで得られたポリペ プチドを培養物から回収することを含んでなる、前記方法。 ４４．ポリペプチドが、酵素、すなわちプロテアーゼ、アミラーゼ又はリパーゼ である、請求の範囲第４３項記載の方法。