JPH0561908B2 - - Google Patents
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- JPH0561908B2 JPH0561908B2 JP61227189A JP22718986A JPH0561908B2 JP H0561908 B2 JPH0561908 B2 JP H0561908B2 JP 61227189 A JP61227189 A JP 61227189A JP 22718986 A JP22718986 A JP 22718986A JP H0561908 B2 JPH0561908 B2 JP H0561908B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- medium
- serum
- cells
- lymphoid cells
- composition according
- Prior art date
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- Expired - Lifetime
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Description
産業上の利用分野
本発明は、リンパ系細胞を増殖するための組成
物およびリンパ系細胞の増殖方法の製造法に関す
る。 従来の技術 リンパ系細胞を用いて有用な生理活性物質、た
とえばインターフエロンなどのリンホカイン類や
モノクローナル抗体などを効率よく生産させるた
めの研究が、種々の面から活発に進められてい
る。一方、血しょう増量剤として使用されるポリ
ビニールピロリドンが、ヘパトーマ細胞（ザ・ジ
ヤパニーズ・ジヤーナル・オブ・エキスペリメン
タル・メデイスン（The Japanese Journal of
Experi−mental Medicine）29巻 45頁 1959
年）、繊維芽細胞（ザ・ジヤパニーズ・ジヤーナ
ル・オブ・エキスペリメンタル・メデイスン 29
巻 191頁1959年）やヒーラー細胞（ザ・ジヤパ
ニーズ・ジヤーナル・オブ・エキスペリメンタ
ル・メデイスン 30巻 147頁 1960年）などの
増殖を促進することが古く勝田らによつて報告さ
れているが、リンパ系細胞の増殖にも影響を及ぼ
すことは全く知られていなかつた。さらに本化合
物を添加した培地で培養すると生理活性物質が効
率よく生産出来ることも全く未知であつた。従来
リンパ系細胞の培養には、他の細胞の場合と同様
血清を約10％程度添加した培地が主として用いら
れ、とりわけ牛胎児血清（FCS）含有培地が賞用
されて来た。 発明が解決しようとする問題点 しかしながら、血清は非常に高価であり、かつ
原因不明のロツト差があるため、細胞を大量に培
養するには問題が多い。さらに血清には多種類の
異種蛋白質が含まれるため、生産される有用物質
を培養液から回収精製する際にも不都合が生ず
る。これらの不都合を解消しようとして、血清を
含まない培地（無血清培地）も種々開発されて来
たが、一般に汎用性が低く、増殖性および生理活
性物質生産性の面でも血清含有培地に比べると必
ずしも十分なものとはいえない。また無血清培地
では、血清の代替として、各種細胞増殖因子、ホ
ルモン類などが添加されるが、これらの因子類に
は高価なものも多く、血清含有培地より、むしろ
高価な場合もしばしば認められる。 いずれにしても従来知られている培地は、細胞
培養によつて有用物質を大量に効率よく得るため
には必ずしも十分満足できるものではなかつた。 このように、安価で大量供給が可能で、しかも
血清等に由来する性質不明の蛋白質を出来るだけ
含まないリンパ系細胞増殖用培地を開発すること
が望まれる。該培地としては、無血清で汎用性が
あり、しかも細胞増殖能が高い培地が理想的であ
るが、血清含有培地でもその血清の使用量を大巾
に減らすことが出来れば、培地の経済性およ培養
液中の不純物含量の面での問題点を大巾に改善す
ることが可能である。 問題点を解決するための手段 上記した事情に鑑み、本発明者らは、リンパ系
細胞の増殖を促進する物質の探索を進めたとこ
ろ、ポリビニールピロリドンを含有したリンパ系
細胞増殖用組成物による培地でリンパ系細胞また
は生理活性物質を生産するリンパ系細胞を培養す
ると、リンパ系細胞が著しく増殖され、またこれ
により、産生される生理活性物質の量が増大され
ることを見い出し、これに基づいてさらに研究し
た結果、本発明を完成した。 本発明は、(1)ポリビニールピロリドンを含有し
てなるリンパ系細胞増殖用組成物、(2)ポリビニー
ルピロリドンを含有してなるリンパ系細胞増殖用
組成物を加えた培地でリンパ系細胞を培養するこ
とを特徴とするリンパ系細胞の増殖方法である。 本明細書においては、ポリビニールピロリドン
をPVPと略記することもある。 本発明の組成物は、基礎培地およびポリビニー
ルピロリドンからなる。 該基礎培地としては、リンパ系細胞の培養に用
いることのできるものであればいずれのものでも
よい。 本発明に用いられる基礎培地としては、たとえ
ば市販されている各種基礎培地［たとえば、イー
グルの最小必須培地（MEM）（サイエンス
（Science）130巻 432頁 1959年）、イーグルの
基礎培地（BME）（プロシーデイングス・オブ・
ザ・ソサイエテイ・フオア・エキスペリメンタ
ル・バイオロジー・アンド・メデイスン
（Procee−dings of the Society for
Experimental Biology and Medicine）89巻
362頁 1965年）、ダルベツコ改変イーグル培地
（DME）（バイロロジー（Virology）８巻 396
頁 1959年）、イスコフ改変ダルベツコ培地
（IMDM）（ザ・ジヤーナル・オブ・エキスペリ
メンタル・メデイスン（The Journal of
Experimental Medicine）147巻 923頁 1978
年）、Ｌ−15培地（アメリカン・ジヤーナル・オ
ブ・ハイジーン（American Journal of
Hygiene）78巻 173頁 1963年）、マツコイ５ａ
培地（プロシーデイングス・オブ・ザ・ソサイエ
テイ・フオア・エキスペリメンタル・バイオロジ
ー・アンド・メデイスン100巻 115頁 1959年）、
ハムF12培地（プロシーデイングス・オブ・ナシ
ヨナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユー・
エス・エー（Proceedings of National
Academy of Science.USA）53巻 288頁 1965
年）、RPMI1640培地（ジヤーナル・オブ・ザ・
アメリカン・メデイカル・アソシエーシヨン
（Journal of the American Medical
Association）199巻 519頁 1967年）など］あ
るいはこれらを混合した培地が挙げられる。該基
礎培地にそれぞれの細胞の増殖に必須な因子（補
助増殖因子）たとえばホルモン類（たとえばイン
スリン、トランスフエリン、ステロイドホルモン
など）、蛋白性増殖因子［たとえば上皮細胞増殖
因子（EGF）、血小板由来増殖因子（PDGF）、繊
維芽細胞増殖因子（FGF）など］、重金属類（た
とえば亜セレン酸ナトリウムなど）やリン脂質
（たとえばエタノールアミン、ホスフアチジルエ
タノールアミンなど）を必要により添加した無血
清培地が挙げられる。さらに、これらに通常の使
用量またはそれ以下の血清代替物質［たとえば
GFS（第２回次世代産業基盤技術シンポジウム−
バイオテクノロジー 予講集161頁、1984年）、
NU−シーラム（コラボレーテイブリサーチ社
製）、シーラムプラス（KCバイオロジカルズ社
製）など］が添加された培地や、通常の使用量以
下の血清［たとえば牛胎児血清（FCS）、新生子
牛血清、仔牛血清、ブタ血清、ヤギ血清、ニワト
リ血清など］を添加した培地などが挙げられる。
また市販の無血清培地［たとえばハイブリテイ−
１（日本薬品開発製）、HB−102（ハナ・メデイア
社製）、HL−１（ベントレツド社製）など］も本
発明の基礎培地として用いることが可能であり、
市販の基礎培地に準じてアミノ酸などの濃度を最
適化した培地を作成して用いることも可能であ
る。 本発明で用いられるポリビニールピロリドン
は、
物およびリンパ系細胞の増殖方法の製造法に関す
る。 従来の技術 リンパ系細胞を用いて有用な生理活性物質、た
とえばインターフエロンなどのリンホカイン類や
モノクローナル抗体などを効率よく生産させるた
めの研究が、種々の面から活発に進められてい
る。一方、血しょう増量剤として使用されるポリ
ビニールピロリドンが、ヘパトーマ細胞（ザ・ジ
ヤパニーズ・ジヤーナル・オブ・エキスペリメン
タル・メデイスン（The Japanese Journal of
Experi−mental Medicine）29巻 45頁 1959
年）、繊維芽細胞（ザ・ジヤパニーズ・ジヤーナ
ル・オブ・エキスペリメンタル・メデイスン 29
巻 191頁1959年）やヒーラー細胞（ザ・ジヤパ
ニーズ・ジヤーナル・オブ・エキスペリメンタ
ル・メデイスン 30巻 147頁 1960年）などの
増殖を促進することが古く勝田らによつて報告さ
れているが、リンパ系細胞の増殖にも影響を及ぼ
すことは全く知られていなかつた。さらに本化合
物を添加した培地で培養すると生理活性物質が効
率よく生産出来ることも全く未知であつた。従来
リンパ系細胞の培養には、他の細胞の場合と同様
血清を約10％程度添加した培地が主として用いら
れ、とりわけ牛胎児血清（FCS）含有培地が賞用
されて来た。 発明が解決しようとする問題点 しかしながら、血清は非常に高価であり、かつ
原因不明のロツト差があるため、細胞を大量に培
養するには問題が多い。さらに血清には多種類の
異種蛋白質が含まれるため、生産される有用物質
を培養液から回収精製する際にも不都合が生ず
る。これらの不都合を解消しようとして、血清を
含まない培地（無血清培地）も種々開発されて来
たが、一般に汎用性が低く、増殖性および生理活
性物質生産性の面でも血清含有培地に比べると必
ずしも十分なものとはいえない。また無血清培地
では、血清の代替として、各種細胞増殖因子、ホ
ルモン類などが添加されるが、これらの因子類に
は高価なものも多く、血清含有培地より、むしろ
高価な場合もしばしば認められる。 いずれにしても従来知られている培地は、細胞
培養によつて有用物質を大量に効率よく得るため
には必ずしも十分満足できるものではなかつた。 このように、安価で大量供給が可能で、しかも
血清等に由来する性質不明の蛋白質を出来るだけ
含まないリンパ系細胞増殖用培地を開発すること
が望まれる。該培地としては、無血清で汎用性が
あり、しかも細胞増殖能が高い培地が理想的であ
るが、血清含有培地でもその血清の使用量を大巾
に減らすことが出来れば、培地の経済性およ培養
液中の不純物含量の面での問題点を大巾に改善す
ることが可能である。 問題点を解決するための手段 上記した事情に鑑み、本発明者らは、リンパ系
細胞の増殖を促進する物質の探索を進めたとこ
ろ、ポリビニールピロリドンを含有したリンパ系
細胞増殖用組成物による培地でリンパ系細胞また
は生理活性物質を生産するリンパ系細胞を培養す
ると、リンパ系細胞が著しく増殖され、またこれ
により、産生される生理活性物質の量が増大され
ることを見い出し、これに基づいてさらに研究し
た結果、本発明を完成した。 本発明は、(1)ポリビニールピロリドンを含有し
てなるリンパ系細胞増殖用組成物、(2)ポリビニー
ルピロリドンを含有してなるリンパ系細胞増殖用
組成物を加えた培地でリンパ系細胞を培養するこ
とを特徴とするリンパ系細胞の増殖方法である。 本明細書においては、ポリビニールピロリドン
をPVPと略記することもある。 本発明の組成物は、基礎培地およびポリビニー
ルピロリドンからなる。 該基礎培地としては、リンパ系細胞の培養に用
いることのできるものであればいずれのものでも
よい。 本発明に用いられる基礎培地としては、たとえ
ば市販されている各種基礎培地［たとえば、イー
グルの最小必須培地（MEM）（サイエンス
（Science）130巻 432頁 1959年）、イーグルの
基礎培地（BME）（プロシーデイングス・オブ・
ザ・ソサイエテイ・フオア・エキスペリメンタ
ル・バイオロジー・アンド・メデイスン
（Procee−dings of the Society for
Experimental Biology and Medicine）89巻
362頁 1965年）、ダルベツコ改変イーグル培地
（DME）（バイロロジー（Virology）８巻 396
頁 1959年）、イスコフ改変ダルベツコ培地
（IMDM）（ザ・ジヤーナル・オブ・エキスペリ
メンタル・メデイスン（The Journal of
Experimental Medicine）147巻 923頁 1978
年）、Ｌ−15培地（アメリカン・ジヤーナル・オ
ブ・ハイジーン（American Journal of
Hygiene）78巻 173頁 1963年）、マツコイ５ａ
培地（プロシーデイングス・オブ・ザ・ソサイエ
テイ・フオア・エキスペリメンタル・バイオロジ
ー・アンド・メデイスン100巻 115頁 1959年）、
ハムF12培地（プロシーデイングス・オブ・ナシ
ヨナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユー・
エス・エー（Proceedings of National
Academy of Science.USA）53巻 288頁 1965
年）、RPMI1640培地（ジヤーナル・オブ・ザ・
アメリカン・メデイカル・アソシエーシヨン
（Journal of the American Medical
Association）199巻 519頁 1967年）など］あ
るいはこれらを混合した培地が挙げられる。該基
礎培地にそれぞれの細胞の増殖に必須な因子（補
助増殖因子）たとえばホルモン類（たとえばイン
スリン、トランスフエリン、ステロイドホルモン
など）、蛋白性増殖因子［たとえば上皮細胞増殖
因子（EGF）、血小板由来増殖因子（PDGF）、繊
維芽細胞増殖因子（FGF）など］、重金属類（た
とえば亜セレン酸ナトリウムなど）やリン脂質
（たとえばエタノールアミン、ホスフアチジルエ
タノールアミンなど）を必要により添加した無血
清培地が挙げられる。さらに、これらに通常の使
用量またはそれ以下の血清代替物質［たとえば
GFS（第２回次世代産業基盤技術シンポジウム−
バイオテクノロジー 予講集161頁、1984年）、
NU−シーラム（コラボレーテイブリサーチ社
製）、シーラムプラス（KCバイオロジカルズ社
製）など］が添加された培地や、通常の使用量以
下の血清［たとえば牛胎児血清（FCS）、新生子
牛血清、仔牛血清、ブタ血清、ヤギ血清、ニワト
リ血清など］を添加した培地などが挙げられる。
また市販の無血清培地［たとえばハイブリテイ−
１（日本薬品開発製）、HB−102（ハナ・メデイア
社製）、HL−１（ベントレツド社製）など］も本
発明の基礎培地として用いることが可能であり、
市販の基礎培地に準じてアミノ酸などの濃度を最
適化した培地を作成して用いることも可能であ
る。 本発明で用いられるポリビニールピロリドン
は、
【式】（ｎは重合度を表す。）
の構造を持つ高重合体であり、市販の平均分子量
約10000ないし1200000のものが有利に使用され
る。 より具体的には平均分子量25000のPVP Ｋ−
25、40000のPVP Ｋ−30または1200000のPVP
Ｋ−90などが使用される。 本発明で用いられるポリビニールピロリドンの
量としては、使用時の濃度が約0.001％（Ｗ／Ｖ）
ないし10％、より好ましくは約0.01％ないし５％
（Ｗ／Ｖ）、さらに好ましくは約0.1％ないし５％
（Ｗ／Ｖ）となる量である。 ポリビニールピロリドンは、あらかじめ組成物
中に混合されていても良いし、培地として使用す
る際に混入しても良い。 本発明のリンパ系細胞増殖用組成物は、固体状
態のものおよび水溶液であるもののいずれでもよ
い。固体状態のものは、それをたとえば水に溶解
あるいは懸濁して用いられる。 また、該組成物をリンパ系細胞増殖用の培地と
して用いることができるが、培地として用いる場
合には、血清を含まない培地としても良く、さら
に、通常の使用量以下の血清を含む培地としても
良い。ここで、通常の使用量としては、たとえば
約10％（Ｖ／Ｖ）が挙げられる。 本発明の組成物を培地として用いる場合には、
通常の使用量またはそれ以下の血清代替物を含む
培地としてもよい。ここで、通常の使用量として
は、たとえば、GFSの場合は約３〜４ｇ／
（蛋白質として）であり、NU−シーラムの場合
は約10％Ｖ／Ｖであり、シーラムプラスの場合は
約10％Ｖ／Ｖである。 本発明方法によつて培養されるリンパ系細胞と
しては、ヒト、マウス、ラツト、ウシ、ハムスタ
ーなどの哺乳動物のリンパ球または白血病由来細
胞であつて初代培養細胞、リンパ腫、白血病、骨
髄腫瘍由来の細胞株、リンパ球を片方の親細胞と
するハイブリドーマやウイルス等で変異したリン
パ球細胞株などを挙げることが出来る。 より具体的には、ヒトリンパ系細胞としては、
Namalva（ATCC CRL1432）（インターナシヨナ
ル・ジヤーナル・オブ・キヤンサー
（International Journal of cancer）12巻 396
頁 1973年）、Raji（ATCC CCL86）（ランセツト
（Lancet）１巻 238頁 1964年）、EB−３
（ATCC CCL85）（ランセツト１巻 252頁
1964年）、WI−L2（キヤンサー（Cancer）22巻
517頁 1968年）、Daudi（ATCC CCL213）（キヤ
ンサー・リサーチ（Cancer Research）28巻
1300頁 1968年）、RPMI 8226（ATCC CCL155）
（プロシーデイングス・オブ・ザ・ソサイエテ
イ・フオア・エキスペリメンタル・バイオロジ
ー・アンド・メデイスン 125巻 1246頁 1967
年）、CCRF−CEM（ATCC CCL119）（キヤンサ
ー18巻 522頁 1965年）、RPMI 1788（ATCC
CCL156）（ジヤーナル・オブ・ザ・ナシヨナ
ル・キヤンサー・インステイチユート（ユナイテ
イド・ステーツ）（Journal of the National
Cancer Institute （United States）43巻
1119頁 1969年）、CRCF−SB（ATCC CCL120）
（キヤンサー・リサーチ 27巻 2479頁 1967
年）、Jurkat（イムノジエネテイクス
（Immunogenetics）10巻 247頁 1980年）など
が、マウスリンパ系細胞としては、たとえば、
MPC−11（ATCC CCL 167）（ザ・ジヤーナル・
オブ・エキスペリメンタル・メデイスン131巻
515頁 1970年）、NS−１（ATCC TIB18）（ユー
ロピアン・ジヤーナル・オブ・イムノロジー
（European Journal of Immuno−logy）６巻
511頁 1976年）、P3X63Ag8U・１（P3U1）
（ATCC CRL1597）（カレント・トピツクス・オ
ブ・マイクロバイオロジー・アンド・イムノロジ
ー（Current Topics of Microbiology and
Immunology）81巻 １頁 1978年）などが、ハ
イブリドーマとしては、たとえばマウスハイブリ
ドーマCEA（第２回次世代産業基盤技術シンポジ
ウム−バイオテクノロジー 予稿集 175頁 昭
和59年）、HS−（同上）E235163（ハイブリド
ーマ（Hybridoma）４巻 47頁 1985年）、マウ
ス・ヒト・ヒトヘテロハイブリドーマN12−16・
63（第２回次世代産業基盤技術シンポジウム−バ
イオテクノロジー 予稿集 175頁 昭和59年）、
112−22・25（バイオケミカル・アンド・バイオフ
イジカル・リサーチ・コミユニケーシヨン
（Biochemical and Biophysical Research
Communication）129巻 26頁 1985年）、HB
−43・１（同士）などがそれぞれ挙げられる。 本発明の生理活性物質の製造法において用いら
れる生理活性物質を生産するリンパ系細胞として
は、たとえばマウスモノクローナル抗体を産生す
るCEA，HS−，E235163など、ヒトモノクロ
ーナル抗体を産生するN12−16・63、I12−22・
25、HB−43・１などが、白血球インターフエ
ロンを産生するNamalva細胞、インターロイキ
ン−２を産生するJurkat細胞などが挙げられる。 本発明方法の培養には通常培養に用いられる容
器または装置が用いられる。例えば、マルチウエ
ルプレート、培養フラスコ、スピナーフラスコ、
ジヤーフアーメンター、フアーメンター、さらに
ホローフアイバー培養装置、セラミツクマトリツ
クスを用いた培養装置やマイクロカプセル培養法
などが適宜採用される。 本発明の培養は、用いられるリンパ系細胞の培
養に適した条件が採用される。一般的には、培養
温度約37℃前後で、PH約6.5〜7.5で、数日〜３か
月培養される。たとえば、本発明の培地に通常
0.1〜５×105個／m1の細胞を播種し、マルチウ
エルプレートやフラスコの場合には約37℃，５％
炭酸ガス培養器（炭酸ガス濃度５％の培養器）中
でPH約6.5〜7.5で約１〜20日間培養される。ジヤ
ーフアーメンターやフアーメンターなどでは通気
撹拌培養が行われる。またこれらの培養槽やホロ
ーフイアバーセラミツクマトリツクス、マイクロ
カプセルなどを用いた培養においては培地を回分
的、または連続的に交換することにより生理活性
物質を向上させることができる。連続灌流培養の
場合には１ないし数ケ月（約３か月）も続ける場
合がある。また、必要により通気される。 培養液から細胞を採取するには、培養液を直接
遠心分離機やろ過機にかけて集める。またリンパ
系細胞の培養によつて生産される生理活性物質
は、その物質が培養液中に蓄積される場合、ろ過
または遠心分離によつて上澄液を得、これから採
取される。また細胞内に蓄積される物質の場合に
は、ろ過または遠心分離によつて得た細胞を物理
的方法（例、超音波、フレンチプレス、ダイノミ
ルなど）または化学的方法（例、塩酸グアニジン
等）にて処理し、生産物を抽出したのち、上澄液
を得る。 上記上澄液から生理活性物質を分離、精製する
には自体公知の分離、精製法を適宜組み合わせて
行うことができる。たとえば生理活性物質が蛋白
質またはペプチドの場合には、塩析や溶媒沈澱法
などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過
法、ゲルろ過法、SDS−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動法などの主として分子量の差を利用する
方法、イオン交換クロマトグラフイーなどの荷電
の差を利用する方法、アフイニテイクロマトグラ
フイーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相
高速液体クロマトグラフイーなどの疎水性の差を
利用する方法、等電点電気泳動などの等電点の差
を利用する方法などが通用される。 本発明の方法に従つて増殖させたリンパ系細胞
は、各種リンフオカイン類（たとえば白血病イン
ターフエロン、免疫インターフエーロン，インタ
ーロイキン−２など）や各種モノクローナル抗体
（例、マウスモノクローナル抗体やヒトモノクロ
ーナル抗体など）などの生産に利用される。また
正常リンパ球をたとえばインターロイキン−２で
刺激しつつ本発明の方法に従つて増殖し、集めた
細胞を直接ヒトの血液中にもどすアドプテイブ・
イムノ・テラピー（Adoptive Immunotherapy）
などにも利用することが出来る。 本発明方法により、リンパ系細胞を効率良く増
殖させることができるので、リンパ系細胞を工業
的に大量に増殖させる方法として有利に用いるこ
とができる。 本発明方法において、生理活性物質を生産する
リンパ系細胞を培養した場合には、該細胞が効率
良く増殖されるので、生理活性物質を効率良く生
産することができ、工業的生産上有利である。 実施例 以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説
明する。PVPの添加％はＷ／Ｖ％を表わす。血
清の添加％はＶ／Ｖ％を表わす。 実施例 １ IMDM、ハムF12およびＬ−15培地を１：１：
２の比率で混合した培地に、２mg／インスリ
ン、２mg／トランスフエリン、２×10-6Ｍエタ
ノールアミン、2.5×10-8Ｍ亜セレン酸ナトリウ
ム（４つを合せてITESと称する。）を添加し、こ
れに各種濃度のPVP Ｋ−90（平均分子量
1200000）を添加した無血清培地を調製し、これ
を24穴マルチウエルプレートへ１ml宛分注した。
これにヒトリンパ芽球由来のWI−L2細胞を１×
105個／mlの割合で播種し、37℃、５％炭酸ガス
培養器中で４日間培養後、コールターカウンター
にて細胞数を測定し、第１図の結果を得た。この
図から明らかなように、PVPを添加しない培地
での細胞数は4.2×105個／mlであつたのに対し、
PVPを添加した場合にはその濃度の増加に供な
つて細胞数が増加し、0.2〜0.8％の添加で約1.5×
106個／mlにも達した。 実施例 ２ 実施例１と同じ基礎培地にITESを添加し、更
に各種濃度のPVP Ｋ−90（平均分子量1200000）
を添加した無血清培地および各種濃度のPVP Ｋ
−30（平均分子量40000）を添加した無血清培地を
調製し、これを24穴マルチウエルプレートへ１ml
宛分注した。これにマウス・ヒト・ヒトヘテロハ
イブリドーマN12−16・63の細胞を１×105個／
mlでの割合で播種し、37℃、５％炭酸ガス培養器
中で５日間培養後、コールターカウンターにて細
胞数を測定し、第２図の結果を得た。PVP Ｋ−
90の場合 （―・―で示される。）至適濃度は0.4％付近であ
つたが、PVP Ｋ−30の場合（〓〓で示される。）
には、0.2〜6.4％の広い範囲で特に有効であつ
た。 実施例 ３ 実施例１と同じ基礎培地にITESを添加した培
地１、更にこれに0.2％PVP Ｋ−30（平均分子量
40000）を添加した培地２、および0.2％PVP Ｋ
−90（平均分子量1200000）を添加した培地３を用
意し、これらを24穴マルチウエルプレートへ１ml
宛分注した。これに表１に示す各種リンパ系細胞
を１×105個／mlの割合で播種し、37℃、５％炭
酸ガス培養器中で４日間培養したのちコールター
カウンターで細胞数を計数し表１の結果を得た。
約10000ないし1200000のものが有利に使用され
る。 より具体的には平均分子量25000のPVP Ｋ−
25、40000のPVP Ｋ−30または1200000のPVP
Ｋ−90などが使用される。 本発明で用いられるポリビニールピロリドンの
量としては、使用時の濃度が約0.001％（Ｗ／Ｖ）
ないし10％、より好ましくは約0.01％ないし５％
（Ｗ／Ｖ）、さらに好ましくは約0.1％ないし５％
（Ｗ／Ｖ）となる量である。 ポリビニールピロリドンは、あらかじめ組成物
中に混合されていても良いし、培地として使用す
る際に混入しても良い。 本発明のリンパ系細胞増殖用組成物は、固体状
態のものおよび水溶液であるもののいずれでもよ
い。固体状態のものは、それをたとえば水に溶解
あるいは懸濁して用いられる。 また、該組成物をリンパ系細胞増殖用の培地と
して用いることができるが、培地として用いる場
合には、血清を含まない培地としても良く、さら
に、通常の使用量以下の血清を含む培地としても
良い。ここで、通常の使用量としては、たとえば
約10％（Ｖ／Ｖ）が挙げられる。 本発明の組成物を培地として用いる場合には、
通常の使用量またはそれ以下の血清代替物を含む
培地としてもよい。ここで、通常の使用量として
は、たとえば、GFSの場合は約３〜４ｇ／
（蛋白質として）であり、NU−シーラムの場合
は約10％Ｖ／Ｖであり、シーラムプラスの場合は
約10％Ｖ／Ｖである。 本発明方法によつて培養されるリンパ系細胞と
しては、ヒト、マウス、ラツト、ウシ、ハムスタ
ーなどの哺乳動物のリンパ球または白血病由来細
胞であつて初代培養細胞、リンパ腫、白血病、骨
髄腫瘍由来の細胞株、リンパ球を片方の親細胞と
するハイブリドーマやウイルス等で変異したリン
パ球細胞株などを挙げることが出来る。 より具体的には、ヒトリンパ系細胞としては、
Namalva（ATCC CRL1432）（インターナシヨナ
ル・ジヤーナル・オブ・キヤンサー
（International Journal of cancer）12巻 396
頁 1973年）、Raji（ATCC CCL86）（ランセツト
（Lancet）１巻 238頁 1964年）、EB−３
（ATCC CCL85）（ランセツト１巻 252頁
1964年）、WI−L2（キヤンサー（Cancer）22巻
517頁 1968年）、Daudi（ATCC CCL213）（キヤ
ンサー・リサーチ（Cancer Research）28巻
1300頁 1968年）、RPMI 8226（ATCC CCL155）
（プロシーデイングス・オブ・ザ・ソサイエテ
イ・フオア・エキスペリメンタル・バイオロジ
ー・アンド・メデイスン 125巻 1246頁 1967
年）、CCRF−CEM（ATCC CCL119）（キヤンサ
ー18巻 522頁 1965年）、RPMI 1788（ATCC
CCL156）（ジヤーナル・オブ・ザ・ナシヨナ
ル・キヤンサー・インステイチユート（ユナイテ
イド・ステーツ）（Journal of the National
Cancer Institute （United States）43巻
1119頁 1969年）、CRCF−SB（ATCC CCL120）
（キヤンサー・リサーチ 27巻 2479頁 1967
年）、Jurkat（イムノジエネテイクス
（Immunogenetics）10巻 247頁 1980年）など
が、マウスリンパ系細胞としては、たとえば、
MPC−11（ATCC CCL 167）（ザ・ジヤーナル・
オブ・エキスペリメンタル・メデイスン131巻
515頁 1970年）、NS−１（ATCC TIB18）（ユー
ロピアン・ジヤーナル・オブ・イムノロジー
（European Journal of Immuno−logy）６巻
511頁 1976年）、P3X63Ag8U・１（P3U1）
（ATCC CRL1597）（カレント・トピツクス・オ
ブ・マイクロバイオロジー・アンド・イムノロジ
ー（Current Topics of Microbiology and
Immunology）81巻 １頁 1978年）などが、ハ
イブリドーマとしては、たとえばマウスハイブリ
ドーマCEA（第２回次世代産業基盤技術シンポジ
ウム−バイオテクノロジー 予稿集 175頁 昭
和59年）、HS−（同上）E235163（ハイブリド
ーマ（Hybridoma）４巻 47頁 1985年）、マウ
ス・ヒト・ヒトヘテロハイブリドーマN12−16・
63（第２回次世代産業基盤技術シンポジウム−バ
イオテクノロジー 予稿集 175頁 昭和59年）、
112−22・25（バイオケミカル・アンド・バイオフ
イジカル・リサーチ・コミユニケーシヨン
（Biochemical and Biophysical Research
Communication）129巻 26頁 1985年）、HB
−43・１（同士）などがそれぞれ挙げられる。 本発明の生理活性物質の製造法において用いら
れる生理活性物質を生産するリンパ系細胞として
は、たとえばマウスモノクローナル抗体を産生す
るCEA，HS−，E235163など、ヒトモノクロ
ーナル抗体を産生するN12−16・63、I12−22・
25、HB−43・１などが、白血球インターフエ
ロンを産生するNamalva細胞、インターロイキ
ン−２を産生するJurkat細胞などが挙げられる。 本発明方法の培養には通常培養に用いられる容
器または装置が用いられる。例えば、マルチウエ
ルプレート、培養フラスコ、スピナーフラスコ、
ジヤーフアーメンター、フアーメンター、さらに
ホローフアイバー培養装置、セラミツクマトリツ
クスを用いた培養装置やマイクロカプセル培養法
などが適宜採用される。 本発明の培養は、用いられるリンパ系細胞の培
養に適した条件が採用される。一般的には、培養
温度約37℃前後で、PH約6.5〜7.5で、数日〜３か
月培養される。たとえば、本発明の培地に通常
0.1〜５×105個／m1の細胞を播種し、マルチウ
エルプレートやフラスコの場合には約37℃，５％
炭酸ガス培養器（炭酸ガス濃度５％の培養器）中
でPH約6.5〜7.5で約１〜20日間培養される。ジヤ
ーフアーメンターやフアーメンターなどでは通気
撹拌培養が行われる。またこれらの培養槽やホロ
ーフイアバーセラミツクマトリツクス、マイクロ
カプセルなどを用いた培養においては培地を回分
的、または連続的に交換することにより生理活性
物質を向上させることができる。連続灌流培養の
場合には１ないし数ケ月（約３か月）も続ける場
合がある。また、必要により通気される。 培養液から細胞を採取するには、培養液を直接
遠心分離機やろ過機にかけて集める。またリンパ
系細胞の培養によつて生産される生理活性物質
は、その物質が培養液中に蓄積される場合、ろ過
または遠心分離によつて上澄液を得、これから採
取される。また細胞内に蓄積される物質の場合に
は、ろ過または遠心分離によつて得た細胞を物理
的方法（例、超音波、フレンチプレス、ダイノミ
ルなど）または化学的方法（例、塩酸グアニジン
等）にて処理し、生産物を抽出したのち、上澄液
を得る。 上記上澄液から生理活性物質を分離、精製する
には自体公知の分離、精製法を適宜組み合わせて
行うことができる。たとえば生理活性物質が蛋白
質またはペプチドの場合には、塩析や溶媒沈澱法
などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過
法、ゲルろ過法、SDS−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動法などの主として分子量の差を利用する
方法、イオン交換クロマトグラフイーなどの荷電
の差を利用する方法、アフイニテイクロマトグラ
フイーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相
高速液体クロマトグラフイーなどの疎水性の差を
利用する方法、等電点電気泳動などの等電点の差
を利用する方法などが通用される。 本発明の方法に従つて増殖させたリンパ系細胞
は、各種リンフオカイン類（たとえば白血病イン
ターフエロン、免疫インターフエーロン，インタ
ーロイキン−２など）や各種モノクローナル抗体
（例、マウスモノクローナル抗体やヒトモノクロ
ーナル抗体など）などの生産に利用される。また
正常リンパ球をたとえばインターロイキン−２で
刺激しつつ本発明の方法に従つて増殖し、集めた
細胞を直接ヒトの血液中にもどすアドプテイブ・
イムノ・テラピー（Adoptive Immunotherapy）
などにも利用することが出来る。 本発明方法により、リンパ系細胞を効率良く増
殖させることができるので、リンパ系細胞を工業
的に大量に増殖させる方法として有利に用いるこ
とができる。 本発明方法において、生理活性物質を生産する
リンパ系細胞を培養した場合には、該細胞が効率
良く増殖されるので、生理活性物質を効率良く生
産することができ、工業的生産上有利である。 実施例 以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説
明する。PVPの添加％はＷ／Ｖ％を表わす。血
清の添加％はＶ／Ｖ％を表わす。 実施例 １ IMDM、ハムF12およびＬ−15培地を１：１：
２の比率で混合した培地に、２mg／インスリ
ン、２mg／トランスフエリン、２×10-6Ｍエタ
ノールアミン、2.5×10-8Ｍ亜セレン酸ナトリウ
ム（４つを合せてITESと称する。）を添加し、こ
れに各種濃度のPVP Ｋ−90（平均分子量
1200000）を添加した無血清培地を調製し、これ
を24穴マルチウエルプレートへ１ml宛分注した。
これにヒトリンパ芽球由来のWI−L2細胞を１×
105個／mlの割合で播種し、37℃、５％炭酸ガス
培養器中で４日間培養後、コールターカウンター
にて細胞数を測定し、第１図の結果を得た。この
図から明らかなように、PVPを添加しない培地
での細胞数は4.2×105個／mlであつたのに対し、
PVPを添加した場合にはその濃度の増加に供な
つて細胞数が増加し、0.2〜0.8％の添加で約1.5×
106個／mlにも達した。 実施例 ２ 実施例１と同じ基礎培地にITESを添加し、更
に各種濃度のPVP Ｋ−90（平均分子量1200000）
を添加した無血清培地および各種濃度のPVP Ｋ
−30（平均分子量40000）を添加した無血清培地を
調製し、これを24穴マルチウエルプレートへ１ml
宛分注した。これにマウス・ヒト・ヒトヘテロハ
イブリドーマN12−16・63の細胞を１×105個／
mlでの割合で播種し、37℃、５％炭酸ガス培養器
中で５日間培養後、コールターカウンターにて細
胞数を測定し、第２図の結果を得た。PVP Ｋ−
90の場合 （―・―で示される。）至適濃度は0.4％付近であ
つたが、PVP Ｋ−30の場合（〓〓で示される。）
には、0.2〜6.4％の広い範囲で特に有効であつ
た。 実施例 ３ 実施例１と同じ基礎培地にITESを添加した培
地１、更にこれに0.2％PVP Ｋ−30（平均分子量
40000）を添加した培地２、および0.2％PVP Ｋ
−90（平均分子量1200000）を添加した培地３を用
意し、これらを24穴マルチウエルプレートへ１ml
宛分注した。これに表１に示す各種リンパ系細胞
を１×105個／mlの割合で播種し、37℃、５％炭
酸ガス培養器中で４日間培養したのちコールター
カウンターで細胞数を計数し表１の結果を得た。
【表】
リドーマ
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ ポリビニールピロリドンを含有してなるリン
パ系細胞増殖用組成物。 ２ 固体状態にある特許請求の範囲第１項記載の
組成物。 ３ 水溶液である特許請求の範囲第１項記載の組
成物。 ４ 基礎培地の成分がイスコフ培地、ハム培地、
Ｌ−15培地またはそれらの２種以上の混合培地の
成分と同じである特許請求の範囲第１項記載の組
成物。 ５ インスリン、トランスフエリン、エタノール
アミンおよび亜セレン酸の１種以上を添加した特
許請求の範囲第１項または第４項記載の組成物。 ６ 血清を含まない特許請求の範囲第３項記載の
組成物。 ７ 通常の使用量以下の血清を含む特許請求の範
囲第３項記載の組成物。 ８ ポリビニールピロリドンを含有するリンパ系
細胞増殖用組成物を加えた培地でリンパ系細胞を
培養することを特徴とするリンパ系細胞の増殖方
法。 ９ 血清を含まない培地である特許請求の範囲第
８項記載の増殖方法。 １０ 培地が通常の使用量以下の血清を含む特許
請求の範囲第８項記載の増殖方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61227189A JPS6384487A (ja) | 1986-09-27 | 1986-09-27 | リンパ系細胞増殖用組成物及び増殖方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61227189A JPS6384487A (ja) | 1986-09-27 | 1986-09-27 | リンパ系細胞増殖用組成物及び増殖方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6384487A JPS6384487A (ja) | 1988-04-15 |
| JPH0561908B2 true JPH0561908B2 (ja) | 1993-09-07 |
Family
ID=16856884
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61227189A Granted JPS6384487A (ja) | 1986-09-27 | 1986-09-27 | リンパ系細胞増殖用組成物及び増殖方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6384487A (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2635008B1 (fr) * | 1988-08-05 | 1990-11-16 | Sanofi Sa | Agent activateur de la productivite specifique des cellules animales recombinantes a base de polyvinylpyrrolidone et milieu de culture defini le contenant |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0728729B2 (ja) * | 1986-02-05 | 1995-04-05 | 帝人株式会社 | 動物細胞の培養方法 |
-
1986
- 1986-09-27 JP JP61227189A patent/JPS6384487A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6384487A (ja) | 1988-04-15 |
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