JPH0568233B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 この発明は多糖体プルランおよびでん粉のα−
1.4およびα−1.6グルコシド結合を切断する能力
をもつ新規酵素ネオプルラナーゼに関するもので
ある。

従来の技術及び本発明が解決しようとする問
題点 本酵素の作用する基質の１つであるプルランと
は、その構成単位が稀にマルトテトラオースが存
在する他は、すべてマルトトリオースよりなり、
かかる構成単位がα−1.6グルコシド結合で結合
した多糖体である。また、でん粉はグルコースが
α−1.4グルコイド結合で結合したアミロースと、
一部がα−1.6−グルコシド結合による枝岐れを
含むアミロペクチンとから成つている。

プルランに作用する酵素としては、プルランの
末端からグルコース単位で作用するグルコアミラ
ーゼ、α−1.6グルコシド結合だけを切断するプ
ルラナーゼ、プルラン中のα−1.4グルコシド結
合を切断しイソパノースを与えるイソプルラナー
ゼ及びパノース（6²−α−glucosyl maltose）を
生成するサーモアクチノミセスヴルガリカス
（Thermoactinomyces vulgaricus）のアミラー
ゼ（TVA）などが知られている。

これら従来公知の酵素に対し、本発明酵素はプ
ルランの他でん粉にも作用し、パノース、グルコ
ース、マルトース等を与える上、耐熱性にすぐれ
ているので、でん粉糖化産業をはじめ種々な食品
加工に広く利用でき、今後も新用途が更に期待で
きるものである。

問題点を解決するための手段及び作用 本発明は、堆肥等の試料から60℃で生育し、か
つ、プルラン分解能を有する細菌群の中から選ば
れたものの１つであり、パチルスステアロサーモ
フイルスに属する細菌を可溶性でん粉等を含む培
地で培養し、培養液からネオプルラナーゼを採取
することによりなる。ステアロサーモフイルスの
うち殊にバチルスステアロサーモフイルス
TRS40株（微工研菌寄託第9609号）がネオプル
ラナーゼ生産能が高く好適に利用される。この菌
株は発明者等により、大阪市鶴見区の堆肥より分
離されたものであつて、次のような菌学的性質を
有している。

一 形態学的性質 (1) 細胞の形及び大きさ……（0.6×1.0）×（２
〜3.5）μの桿菌。連鎖性なく莢膜は少い。
加糖肉汁寒天培地では肉汁寒天培地と同一の
桿菌の形を示す。

(2) 運動性……あり。

(3) 胞子……（0.4〜0.5）×（0.5×0.6）μの長
円形で末端付近に存在し膜壁はうすい。60
℃・16時間で形成するものが多い。胞子のう
のふくらみは認められる。

(4) グラム染色性……陽性。

二 生育状態 (1) 肉汁寒天平板培養……生育良好。表面はや
や乾き白色に近い。

(2) 肉汁寒天斜面培養……拡布状となり表面の
光沢なし。

(3) 肉汁液体培養……PH7.0で育成良好。液は
混濁する。

(4) ゼラチン穿刺培養……ゼラチンを液化す
る。

(5) 食塩肉汁液体培養……７％の食塩水濃度で
は生育しない。

(6) グルコース・アスパラギン寒天培地……育
成不良。

(7) グルコース・ナイトレイト寒天培地……僅
かに育成。

三 生理学的性質 (1) 硝酸塩の還元……陽性。

(2) でん粉の加水分解……でん粉を含むシヤー
レ上で育成させるとヨード呈色は陰性。

(3) クエン酸の醗酵性……陽性。

(4) カタラーゼ生成……陰性。

(5) 生育の範囲……トリプシン、酵母エキス、
食塩を含む培地で65℃まで生育。最適生育温
度は60℃。

(6) 糖の醗酵性……グルコース、ラクトース、
しよ糖から酸を形成。ただし、ガス発生を伴
わない。

(7) アセチルメチルカルビノールの生成……陽
性。

(8) ゼラチンの分解……陽性。

以上の結果をバージエーのマニユアル・オブ・
システマテイツク・バクテリオデターミネーシヨ
ン第２巻（Bergey′s Manual of Systematic
Bac−teriodetermination vol 2.（1986））と照合
して本菌はバチルスステアロサーモフイルス
（Ba−cillus stearothermophilus）と同定した。

つぎに本菌株の生産する酵素を詳細に説明す
る。

一 作用及び基質特異性 本酵素はプルランに作用し、最終的にパノー
ス、グルコース、マルトースを生じる。量的に
はパノースが最も多い。

でん粉に作用させると主としてマルトースと
グルコースを生じるが、反応後期には分枝デキ
ストリンとしてパノース及びイソマルトシルマ
ルトース（isomaltosyl maltose、略称IMM）
を生成する。還元糖の生成に較べてヨード呈色
の減少が速やかでα−アミラーゼの一種と考え
られる。一般にα−アミラーゼは比較的でん粉
をよく加水分解する糖化型と、でん粉の液化速
度は大きいが糖化度の低い液化型に大別され
る。そして前者をでん粉に作用させた場合、得
られる最小の低分子リミツトデキストリは
IMMである。本発明の酵素はでん粉に作用さ
せると最初からグルコースやマルトースを生成
し、糖化型のグループに属するが、最小のリミ
ツトデキストリンはIMMではなくパノースで
ある。この点において著だ特異なα−アミラー
ゼである。更に、本酵素はプルランとでん粉に
同濃度、同条件で作用させると、プルランに対
してでん粉に対すると同等もしくはそれ以上に
作用する。TVAはでん粉への作用の方がプル
ランへの作用より著しく大きい。この意味で
TVAはα−アミラーゼの一種と考えられるの
に対し、本酵素はプルラン分解酵素の一種でネ
オプルラナーゼと命名された由縁である。

また本酵素をβサイクロデキストリンにマル
トースがα−1.6グルコシル結合で結合したマ
ルトシル−β−サイクロデキストリンに作用さ
せると、まずそのα−1.6結合を切断し、マル
トースとβサイクロデキストリンを生じる。つ
いでβサイクロデキストリンも再分解を受け、
グルコース、マルトール及びマルトトリオース
を与える。

即ち、本酵素は主としてマルトースを認識
し、マルトールがα−1.4結合で結合していて
もα−1.6結合で結合していても、その結合を
切断する新しい作用特異性をもつ酵素と考える
ことができる。

二 作用PH PH5.0〜7.5。測定は0.05M酢酸ナトリウム−
酢酸緩衝液（PH４〜６）又はリン酸２ナトリウ
ム−リン酸１カリウム緩衝液（PH6〜８）を
用い、0.5％プルラン中で60℃、15分間反応さ
せる。生成した還元糖はDNS法で測定。

三 作用最適PH 前記二の条件でおよそPH6.0。

四 作用温度 0.1Mリン酸緩衝液（PH6.0）、0.5％プルラン
中で各種温度下15分間反応させたところ、75℃
まで反応した。

五 作用最適温度 前記の条件下60〜65℃であつた。

六 熱安定性 0.2M酢酸緩衝液（PH6.0）中で各種温度で60
分間加熱し残存活性を測定したところ、65℃に
おいて60％の活性が残存していた。更にこの系
に１ｍＭ・EDTAを加えると90％以上活性は
残存した。

七 PH安定性 PH5.5より9.0の間で安定（各種緩衝液を用い
PHを調整し、60℃・60分放置後、PH6.0に調整
し残存活性を測定した）。

八 精製方法 培養上澄液を硫安分画（35〜60％飽和）した
後、沈でん物を少量の水に溶解し透析後、PH
8.0でDEAE−celluloseに吸着させた。ついで
食塩濃度を0.6Mまで漸次上昇させて酵素を溶
出した。さらにセフアデツクスＧ−200のカラ
ムクロマトグラフイーを２回繰返した後、α−
サイクロデキストリンを結合したセフアロース
6B（Sepharose6B）カラムでアフイニテイクロ
マトグラフイを行つた。

溶出液の蛋白質の吸収は１個のピークを示
し、酵素活性のピークと完全に一致した。この
活性区分をSDS−PAGEにより電気泳動を行う
と単一バンドを示した。

九 分子量 62000dalton（SDS−PAGE法） 十 生産物 プルランからはパノースの他グルコース、マ
ルトースを与えた。また、でん粉からグルコー
ス、マルトール、パノース、IMMを与えた。

十一 力価測定方法 １％プルラン（0.2M酢酸緩衝液（PH6.0）に
溶解）0.25mlに酵素液0.25mlを加え、60℃・15
分間反応させ、生ずる還元力の増加をDNS法
により定量した。上記反応で１分間当り1μｍol
の還元糖を生ずる酵素力を１単位とした。

以上の理化学的性質から、本発明酵素はこれま
でに報告されたことのない新規なプルラナーゼで
あるといえる。

本発明では、かかるバチルスステアロサーモフ
イルス菌ないしバチルスステアロサーモフイルス
TRS−40株を培養し、これからネオプルラナー
ゼを採取するものである。

培養法としては、たとえば2.5％でん粉、１％
トリプトン、0.5％酵母抽出物、0.5％食塩を基本
培地としたらよい。プルランを添加する必要はな
いが、炭素源としてでん粉の他、グルコース、マ
ルトース、デキストリン、しよ糖などを、窒素源
としてはポリペプトン、カザアミノ酸、コーンス
テイ−プリカー、酵母エキス、蛋白加水分解物な
どを0.5〜２％程度使用する。

培養温度は40〜60℃程度、就中60℃付近がもつ
ともよいようである。

培養時間は植菌量その他の条件により特定では
ないがおおよそ８〜30時間、就中16時間位が通常
である。

このようにして培養された培養物からネオプル
ラナーゼを採取するには、酵素は菌体外に分泌集
積するので、まず遠心分離、過等により菌体等
の不溶物を除去して透明な培養液を得る。つい
で、硫安による分画沈澱、アルコール沈澱、膜濃
縮法などの通常の精製手段により、濃縮・精製す
る。

実施例 実施例 １ 2.5％でん粉、１％トリプトン、0.5％酵母エキ
ス、0.5％食塩を含む培地をPH7.0に調整し、殺菌
後、バチルスステアロサーモフイルスTRS40株
を接種し、60℃・16時間振盪培養した。培養後、
遠心分離により菌体を除去した上澄液にはネオプ
ルラナーゼ0.2u／mlを含んでいた。硫安により塩
析し、その0.35〜0.6飽和沈澱区分に目的の酵素
は沈でんした。沈でんを別し、乾燥して得られ
た粉末にはネオプルラナーゼのほか少量のα−グ
ルコシダーゼを含んでいた。

培養液10から乾燥酵素粉末50ｇを得た。本
酵素は32u／ｇの活性を示した。なお、酵素の回
収率は80％であつた。

実施例 ２ 実施例１より得た酵素粉末を少量の水に溶解し
透析後、DEAEセルロース、セフアデツクスＧ−
200、α−サイクロデキストリンをリガンドとす
るアフイニテイクロマトグラフイーにより精製酵
素を得た。この酵素活性から算出された酵素回収
率は４％であり、SDS−PAGEにより単一のバン
ドを与えた。

本発明の効果 本発明の酵素は、プルランに作用しパノース、
マルトース、グルコースを生成する新規な酵素で
ある。そのほか本酵素は、でん粉に作用しグルコ
ース、マルトースのほかパノースを生成する。パ
ノースは齲歯形成菌のグルカン合成を防止するほ
か、人間の腸内でビヒダス菌を活性化する糖質と
いわれており、今後の長寿社会において広く利用
されると考えられる。本酵素はパノースを含む水
飴製造も可能とするものである。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ プルランからパノース、マルトース等を生産
   する能力を有する酵素（以下、ネオプルラナーゼ
   という）の生産菌であるバチルスステアロサーモ
   フイルス（Bacillus stearothermophilus）
   TRS40（微工研菌寄託第9609号）を培養し、これ
   からネオプルラナーゼを採取することを特徴とす
   る耐熱性の新規プルラナーゼの製造法。